KR20200003370A - 림프구를 형질도입 및 팽창시키고 이들의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

림프구를 형질도입 및 팽창시키고 이들의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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그레고리 이안 프로스트
제임스 조셉 오누퍼
기아베 에이치 구이빈가
파자드 헤리자드
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에프1 온콜로지, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 림프구를 유전자 변형시키는 방법 및 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 림프증식성 요소, 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR), 예를 들어, 미세환경 제한된 생물학적 CAR(MRB-CAR)을 포함할 수 있는 억제성 RNA 분자(들) 및/또는 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 및 패키징 세포주 및 이의 제조 방법뿐만 아니라 증식 및 이의 조절 요소를 유도하는 것들과 같은 이러한 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 추가의 요소가 본원에 제공된다. 리보스위치, MRB-CAR, 인식 도메인, 및/또는 pH-조절제를 포함하는 것들과 같은 형질도입된 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 조절하기 위한 다수의 요소 및 방법이 제공된다.

Description

림프구를 형질도입 및 팽창시키고 이들의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 2017년 3월 19일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2017/023112의 일부 계속; 2017년 7월 8일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2017/041277의 일부 계속; 2017년 3월 19일 출원된 미국 출원 번호 15/462,855의 일부 계속; 및 2017년 7월 8일 출원된 미국 출원 번호 15/644,778의 일부 계속이고; 그리고 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039; 2017년 9월 18일 출원된 미국 가출원 번호 62/560,176; 2017년 9월 27일 출원된 미국 가출원 번호 62/564,253; 및 2017년 9월 28일 출원된 미국 가출원 번호 62/564,991의 이점을 주장하고; 국제 출원 번호 PCT/US2017/023112는 2016년 3월 19일 출원된 미국 가출원 번호 62/390,093; 2016년 7월 8일 출원된 미국 가출원 번호 62/360,041; 및 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039의 이점을 주장하고; 국제 출원 번호 PCT/US2017/041277은 2017년 3월 19일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2017/023112; 2017년 3월 19일 출원된 미국 특허 출원 번호 15/462,855; 2016년 7월 8일 출원된 미국 가출원 번호 62/360,041; 및 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039의 이점을 주장하고; 미국 출원 번호 15/462,855는 2016년 3월 19일 출원된 미국 가출원 번호 62/390,093; 2016년 7월 8일 출원된 미국 가출원 번호 62/360,041; 및 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039의 이점을 주장하고; 그리고 미국 출원 번호 15/644,778은 2017년 3월 19일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2017/023112의 일부 계속 및 2017년 3월 19일 출원된 미국 특허 출원 번호 15/462,855의 일부 계속이고 그리고 2016년 7월 8일 출원된 미국 가출원 번호 62/360,041 및 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039의 이점을 주장한다. 이들 출원은 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입된다.
서열 목록
본원은 이로써 이와 동반하여 출원된 전자 서열분석 목록의 물질을 참고로 편입한다. 본 전자 서열목록에서의 물질은 526 KB의 파일 크기를 갖는, 2018년 3월 3일 만들어진 텍스트 (.txt) 파일명 "F1_001_WO_03_Sequence_Listing_2018_03_03.txt"로 제출되고, 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다.
발명의 분야
본 개시내용은 면역학의 분야, 또는 더 구체적으로, T 림프구 또는 다른 면역 세포의 유전자 변형, 및 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하고 그 안에서 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
대상체 (예를 들어 환자)로부터 단리된 림프구는 편입된 유전적 프로그램에 기반한 다른 세포 및 환경으로 재지향된 참여를 가능하게 하는 합성 단백질을 발현하도록 시험관내에서 활성화되고 유전자적으로 변형될 수 있다. 이러한 합성 단백질의 예는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 현재 사용되는 하나의 CAR은 세포외 인식 도메인 (예를 들어, 항원-결합 도메인), 막관통 도메인, 및 복제불능 재조합 레트로바이러스에 의해 인코딩된 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합이다.
재조합 레트로바이러스가 비-분열 세포를 감염시키는데 효능을 나타내지만, 휴면 중인 CD4 및 CD8 림프구는 이들 벡터에 의한 유전적 형질도입에 대해 난치이다. 이 어려움을 극복하기 위해, 이들 세포는 전형적으로 CAR 유전자 벡터로 유전자 변형이 발생할 수 있기 이전에 자극 시약을 사용하여 시험관내에서 활성화된다. 자극 및 형질도입에 따라, 유전적으로 변형된 세포는 시험관내에서 팽창되고 후속으로 림프구 고갈된 환자에게 재도입된다. 생체내에서 항원 참여에 의해, CAR의 세포내 신호전달 부분은 면역 세포에서 활성화-관련된 반응 및 세포용해 분자의 방출을 개시할 수 있어 종양 세포사를 유도한다.
이러한 현행 방법은 T 세포 생착을 촉진하기 위해 사이토카인을 유리시키고 경쟁 수용체를 고갈시키기 위해 림프구 고갈 화학요법뿐만 아니라 환자 안으로의 그것의 재주입 이전에 신체 외부에서 T 세포를 증식시키는 광범위한 조작 및 제조를 필요로 한다. 그와 같은 CAR 요법은 신체 내로 일단 도입된 생체내 전파 속도를 제어할 수도 없거나, 종양 외부에서도 또한 발현된 표적에 대해 안전하게 지향될 수 없다. 그 결과, CAR 요법은 오늘날 1 x 105 내지 1 x 108 세포/kg의 용량을 사용하여 12 내지 28일 생체외 팽창된 세포로부터 전형적으로 주입되고, 표적 독성에 대해 벗어난 종양이 일반적으로 허용가능한, 표적, 예를 들어 종양 표적으로 지향된다. 이들 상대적으로 긴 생체외 팽창 시간은 확장성의 문제에 부가하여 세포 생존력 및 멸균뿐만 아니라 샘플 동일성의 문제를 일으킨다. 따라서, 더 안전하고, 더 효과적인 확장가능한 T 세포 또는 NK 세포 요법에 대한 상당한 요구가 있다.
림프구의 형질도입, 증식 및 생존을 유도하는 과정에 대한 본 발명자들의 이해는 면역학적 과정을 포함하는 다양한 잠재적인 상업적 용도에 대해 집중하기 때문에, 림프구를 연구하기 위한 개선된 방법 및 조성물이 필요하다. 예를 들어, 림프구가 어떻게 유전자 변형될 수 있는지와 그것의 생존 및 증식에 영향을 미치는 요인을 더 잘 특징화하고 이해하는 데 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 확인하는 것이 도움이 될 것이다. 게다가, 림프구 증식 및 생존을 유도하는 조성물을 확인하는 것이 도움이 될 것이다. 그와 같은 조성물은 그러한 과정의 조절을 연구하는데 사용될 수 있다. 림프구를 연구하기 위한 방법 및 조성물에 부가하여, 개선된 바이러스 포장 세포주 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 예를 들어, 그러한 세포주 및 방법은 재조합 바이러스의 상이한 성분, 예컨대 재조합 레트로바이러스 입자를 분석하는데 유용할 것이며, 재조합 레트로바이러스 입자의 생산을 위한 포장 세포주를 사용하는 방법에 유용할 것이다.
림프구 예컨대 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하고 및/또는 유전자적으로 변형시키는 방법의 유효성 및 안전성에 관련된 쟁점을 극복하는 데 도움이 되는 방법, 조성물, 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 그러한 방법의 특정 구현예는 이들 세포로 입양 세포 요법을 수행하는데 유용하다. 따라서, 일부 양태에서, 림프구, 특히 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자적으로 변형시키고 및/또는 형질도입하고, 및/또는 형질도입된 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 활성을 조절하기 위한 방법, 조성물, 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 그와 같은 방법, 조성물, 및 키트는, 특히 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 예시적인 구현예에서 미세환경 제한된 생물학적 CAR을 발현하는 T 세포 및/또는 NK 세포에 관하여, 현행 기술보다 개선된 효능 및 안전성을 제공한다. 본 명세서에 제공된 방법에 의하여 생산되고 및/또는 방법에 사용되는 형질도입된 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는, 예시적인 구현예에서 그러한 세포 및 그러한 세포를 이용하는 방법, 예컨대 연구 방법, 상업 생산 방법, 및 입양 세포 요법에 대해 개선된 특징을 제공하는, 레트로바이러스 (예를 들어 렌티바이러스) 입자를 통해 레트로바이러스 (예를 들어 렌티바이러스) 게놈으로부터 전달된 기능성 및 기능성의 조합을 포함한다. 예를 들어, 그러한 세포는 더 짧은 시간내에 생체외에서 생산될 수 있고, 그리고 더 잘 조절될 수 있는 개선된 성장 특성을 갖는다.
일부 양태에서, 림프구 예컨대 B 세포, T 세포 및 NK 세포에서 CAR들, mRNA, 억제성 RNA(들), 및/또는 림프 증식성 요소, 예를 들어 키메라 림프 증식성 요소의 발현을 조절하는 조절 인자가 본 명세서에 제공된다. 게다가, 일부 양태에서 다양한 기능적 요소를 발현하고 그것의 표면 상에 다양한 기능적 요소를 담지하는 재조합 레트로바이러스, 및 상기 재조합 레트로바이러스를 생산하는 방법 및 포장 세포주가 본 명세서에 제공된다. 이들 재조합 레트로바이러스 및 이를 생산하는 방법과 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포 안으로 전달될 때 이점을 제공하는 상이한 기능적 요소의, 게놈에서 수와 크기에 관하여 선행 기술 한계를 극복한다.
일부 양태에서, 림프구 예컨대 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하고 및/또는 유전자적으로 변형시키는 방법, 그리고 예시적인 구현예에서, 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하고 및/또는 유전자적으로 변형시키는 생체외 방법이 제공된다. 이들 양태의 일부는 이전의 방법보다 훨씬 더 빠르게 수행될 수 있어, 보다 효율적인 연구, 더 효과적인 상업 생산, 및 환자 관리의 개선된 방법을 용이하게 할 수 있다. 게다가, 일부 구현예에서 형질도입된 및/또는 유전자 변형된 림프구 예컨대T 세포 및/또는 NK 세포의 활성을 조절하는데 도움이 되는 개선된 안전성 기전을 제공하기 위해, 약리적 제제와 함께 일부 양태에서 본 명세서에 제공된 재조합 레트로바이러스를 이용하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 그와 같은 방법, 조성물, 및 키트는 CAR을 발현하는 형질도입된 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포로 상업 생산, 및 입양 세포 요법에서 연구 도구로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 양태 및 구현예에 관한 추가의 세부사항은 이 특허 출원 전반에 걸쳐 제공된다. 부문 및 부문 표제는 그 안에서의 방법, 조성물, 및 키트 또는 기능적 요소의 조합에 한정하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 포장 세포 (100)에 의해 생산된 본 개시내용의 하나의 예시적인, 비제한적인 구현예의 포장 세포 (100) 및 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)를 포함하는 예시적 조성물의 개략도를 도시한다. 도 1에서, 본 발명의 양태를 인코딩할 수 있는 다양한 벡터 (재조합 폴리뉴클레오타이드 (110)로 칭함)는 그것의 게놈에 하나 이상의 림프 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체, 또는 CAR인 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자 (200) 안으로 포장된다. 본 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그것의 막 상에, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표적 세포에 결합하고 이와 융합하도록 하는 슈도타이핑 요소 (비-제한적인 구현예에서, 홍역 바이러스 혈구 응집소 (H) 폴리펩타이드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩타이드, 또는 이들의 세포질 도메인 결실 변이체) (240); 휴면 중인 T 세포에 결합하고 활성화할 수 있는 활성화 요소 (비-제한적인 구현예에서 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 갖는 활성화 요소) (각각, 210 및 220); 및 막-결합 사이토카인 (비-제한적인 구현예에서, IL-7 DAF 융합 폴리펩타이드) (230)을 발현한다. (250), (260), (270), (280), 및 (290)으로 라벨링된 부분은 각각 Src-FLAG-Vpx, HIV gag 매트릭스, HIV gag 캡시드, RNA, 및 HIV pol이다.
도 2는 포장 세포 (100)에 의해 생산된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200) 및 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)에 의해 형질감염된 휴면 중인 T 세포 (300)를 포함하는 예시적 조성물의 개략도를 도시한다. 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)의 표면상의 요소는 휴면 중인 T 세포의 표면상의 수용체 및/또는 리간드에 결합한다. 슈도타이핑 요소는, 비-제한적인 구현예에서, T 세포에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)의 결합 및 융합을 촉진하는 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드 (비-제한적인 구현예에서, 홍역 바이러스 혈구 응집소 (H) 폴리펩타이드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩타이드, 또는 이들의 세포질 도메인 결실 변이체)를 포함할 수 있다. 비-제한적인 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)는 그것의 표면상에 T-세포 수용체 복합체 및 선택적으로 공-수용체 (320)를 계합함에 의해 휴면 중인 T 세포를 활성화할 수 있는 활성화 요소 (비-제한적인 구현예에서 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 갖는 활성화 요소)를 포함한다. 게다가, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)의 표면상에 존재하는 막-결합 사이토카인 (비-제한적인 구현예에서, IL-7 DAF 융합 폴리펩타이드)는 휴면 중인 T 세포의 표면상의 IL-7Rα (310)에 결합한다. 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)는 T 세포와 융합하고, 그리고 림프 증식성 요소 (예시적인 구현예에서, 구성적으로 활성 IL-7Rα)(370)를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 활성화된 T 세포의 DNA 안으로 편입되도록 핵으로 이동하기 이전에 사이토졸에서 역 전사된다. 이론에 제한됨이 없이, 일부 비제한적인 구현예에서, 바이러스로 포장된 Src-FLAG-Vpx (250)는 휴면 중인 T 세포의 사이토졸에 도입되어 SAMHD1 (350)의 열화를 촉진하여, 역전사에 이용가능한 세포질 dNTP들의 증가된 풀을 초래한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 또한 CAR (360)을 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프 증식성 요소는 그것의 발현을 조절하는 조절 요소 (비-제한적인 예에서, 본 조절 요소는 뉴클레오사이드 유사체를 결합하는 리보스위치임)에 화합물이 결합하는 경우 발현된다. 일부 구현예에서, CAR의 발현은 또한 본 조절 요소에 의해 조절된다. 부분 (330)은 SLAM 및 CD46이다. 부분 (340)은 CD3이다.
도 3A-3E는 본 명세서에 기재된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하도록 포장 세포를 형질감염하는 비제한적인, 예시적인 벡터 작제물의 도식을 도시한다. 도 3A는 NFκB p65 활성제 도메인 (p65 AD)에 융합된 FRB 도메인 및 구성적으로 발현된 3개의 FKBP 반복에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 작제물을 도시한다. 도 3A에서의 작제물은 또한 라파마이신-유도성 ZFHD1/p65 AD 프로모터 하에서 SrcFlagVpx 융합으로서 HIV1 REV 및 Vpx를 포함한다. 도 3B는 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에서 rtTA 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물을 도시한다. 도 3C는 loxP 부위에 의해 측접된 퓨로마이신 저항 유전자 및 lox2272 부위에 의해 측접된 세포외 MYC 태그를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물을 도시한다. 양 선별 마커는 FRT 부위에 의해 측접된 BiTRE 프로모터의 제어하에 있다. 도 3D는 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 및 TRE 프로모터와 RFP의 5' loxP 부위 사이의 단일 FRT 부위에 의해 측접된 RFP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물을 도시한다. 도 3E는 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 및 TRE 프로모터와 GFP의 5' loxP 부위 사이의 단일 FRT 부위에 의해 측접된 GFP를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물을 도시한다. 도 3C-3E에서의 상기 작제물은 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포장 세포주의 게놈 안으로 삽입하기 위한 랜딩 패드로서 기능한다.
도 4A-4C는 본 명세서에 기재된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하도록 포장 세포를 형질감염하는 비제한적인, 예시적인 벡터 작제물의 도식을 도시한다. 도 4A는 CD14 GPI 앵커 부착 부위를 갖는 항-CD3 (클론 UCHT1) scFvFc를 인코딩하는 트리시스트로닉 폴리뉴클레오타이드, CD16B GPI 앵커 부착 부위를 갖는 CD28에 결합할 수 있는 CD80 추가의 세포 도메인(ECD) 및 HEK293S 게놈 안으로 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드 영역을 측접하는 트랜스포존 서열을 갖는 붕괴-촉진 인자(DAF)에 융합된 IL-7을 함유하는 작제물을 도시한다. 도 4B는 BiTRE 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 일 방향으로 gag와 pol 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역 그리고 다른 방향으로 홍역 바이러스 FΔx와 HΔy 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역을 함유하는 작제물을 도시한다. 도 4C는 HEK293S 세포에서 활성이 없는 CD3Z 프로모터의 제어하에서 림프증식성 요소 IL7Rα-insPPCL과 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 작제물을 도시하고, 상기 CAR 및 IL7Rα-insPPCL은 T2A 리보솜 스킵 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리되고 그리고 IL7Rα-insPPCL은 아사이클로비르 리보스위치 제어된 리보자임을 갖는다. CAR-함유 작제물은 추가로 cPPT/CTS, RRE 서열, 및 HIV-1 Psi (Ψ)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 게놈 안으로 통합된 CAR-함유 작제물 상의 전체 폴리뉴클레오타이드 서열은 FRT 부위에 측접된다.
도 5A-5C는 선택적 리보스위치 대조군에 대해 대표적인 뉴클레오사이드 유사체로서 아사이클로비르 (도5A), 펜시클로비르 (도5B), 및 2'-데옥시구아논신 (도5C)의 분자 구조를 도시한다.
도 6은 메소플라즈마 플로럼 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 조절 영역 및 연관된 유전자 산물을 나타낸다. 서열은 M. 플로럼 W37 게놈 DNA (CP006778.1) nt636277 내지 nt 637550과 같은 M. 플로럼 L1 게놈 DNA (AE017263.1) nt624396 내지 nt625670의 역 보체이다. 초기 스크린을 위해 사용된 압타머 서열을 결합하는 데옥시구아노신은 굵은 글씨로 밑줄쳐져 표시되었다. 다운스트림 유전자 산물 (부류 Ib (호기성)의 리보뉴클레오타이드 환원효소, 베타 서브유닛)은 대문자로 표시되어 있다.
도 7은 지향된 진화 전략을 위해 표적화된 M. 플로럼 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 영역을 나타낸다. 비어있는 타원형 내의 뉴클레오타이드는 무작위화를 위해 표적화되었다. 줄무늬 타원형 내의 뉴클레오타이드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화되었다.
도 8A 및 8B는 M. 플로럼 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 스크리닝 라이브러리를 나타낸다. 도 8A에서, 실선으로 된 박스 내의 뉴클레오타이드는 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이고 파선으로 된 박스 내의 뉴클레오타이드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이다. 도 8B는 돌연변이 ("랜덤 뉴클레오타이드 ("N")) 및 결실/삽입을 통해 생성된 가능한 서열을 도시한다.
도 9는 라이브러리 스크리닝을 위한 시험관내 전사에 대해 T7 프로모터 첨가와 PCR 증폭을 허용하도록 첨가된 추가의 염기 쌍을 갖는 역 보체로서 합성된 M. 플로럼 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 올리고 라이브러리를 나타낸다. 상응하는 T7 프로모터 증폭 프라이머 및 역 증폭 프라이머가 또한 도시되어 있다.
도 10은 바실러스 서브틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 조절 영역 및 연관된 유전자 산물을 나타낸다. 서열은 B. 서브틸리스 subsp. 서브틸리스 6051-HGW 게놈 DNA (CP003329.1) nt2319439 내지 nt2320353의 역 보체이다. 초기 스크린을 위해 사용된 압타머 서열을 결합하는 구아노신은 굵은 글씨로 밑줄쳐져 표시되었다. 다운스트림 유전자 산물 (잔틴 포스포리보실전달효소 xpt)은 대문자로 표시되어 있다.
도 11은 지향된 진화 전략을 위해 표적화된 B. 서브틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 영역을 나타낸다. 비어있는 타원형 내의 뉴클레오타이드는 무작위화를 위해 표적화되었다. 줄무늬 타원형 내의 뉴클레오타이드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화되었다.
도 12A 및 12B는 B. 서브틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 스크리닝 라이브러리를 나타낸다. 도 12A에서, 실선으로 된 박스 내의 뉴클레오타이드는 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이고 파선으로 된 박스 내의 뉴클레오타이드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이다. 도 12B는 돌연변이 ("랜덤 뉴클레오타이드 ("N")) 및 결실/삽입을 통해 생성된 가능한 서열을 도시한다.
도 13은 라이브러리 스크리닝을 위한 시험관내 전사에 대해 T7 프로모터 첨가와 PCR 증폭을 허용하도록 첨가된 추가의 염기 쌍을 갖는 역 보체로서 합성된 B. 서브틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 올리고 라이브러리를 나타낸다. 상응하는 T7 프로모터 증폭 프라이머 및 역 증폭 프라이머가 또한 도시되어 있다.
도 14는 선택 라이브러리 구축을 도시한다. 라이브러리는 알려진 구아노신- 및 데옥시구아노신-결합 RNA에 기반하여 구축되었다 (Pikovskaya, 2013).
도 15는 그래핀 옥사이드(GrO) 압타머 선택의 예시를 도시한다. 단계 (1)에서, RNA가 전사되고 정제되었다. 단계 (2)에서, 정제된 RNA가 용출되었다. 단계 (3)에서, 압타머는 반대-표적 및 완충액으로 인큐베이션되었다. 단계 (4)에서, 반대-표적 및 완충액 성분에 결합된 서열이 그래핀 옥사이드로 제거되었다. 단계 (5)에서, 원심분리가 상청액 내의 비-특이적으로-반응성인 종을 분할하고, 이것은 그런 다음 폐기되었다. 2번의 추가의 5-분 세정이 대부분의 잔존 반대-표적 결합 및 완충액-결합 서열을 제거했다. 단계 (6)에서, 1X 선택 완충액에서 아사이클로비르의 용액이 양성 선택을 위해 GrO-결합된 라이브러리에 첨가되고 그래서 잠재적 압타머 서열이 양성 표적과 상호작용을 통해 GrO로부터 제거된다. 단계 (7)에서, 최종 원심분리 단계는 GrO에 여전히 흡착된 비-반응성 서열로부터 상청액에서 표적 결합 서열을 분리한다. 단계 (8)에서 선택된 서열은 역-전사되고, 그런 다음 라이브러리는 PCR을 통해 증폭되고, 그 다음 전사되어 다음 선택 라운드에 대한 라이브러리를 생성한다.
도 16은 그래핀 옥사이드 평행한 평가의 예시를 도시한다. 평행한 평가를 수행한 풍부한 라이브러리는 4개의 동등한 부분으로 분할되었다. 라이브러리 샘플은 그 다음 그래핀 옥사이드에 첨가되고 인큐베이션되도록 하여 그래핀 옥사이드 상에 라이브러리를 장입한다. 2번의 5-분 세적을 사용하여 비-결합 물질을 제거하였다. 양성 (아사이클로비르) 및 특별한 표적 (펜시클로비르) 샘플에 대해, 각각의 표적은 1X 선택 완충액에서 1 μM으로 별도로 제조되었다; 반대 표적은 양성 표적을 용액 내 10 μM의 각각의 반대-표적으로 대체했다; 음성 샘플은 양성 표적을 동등 용적의 뉴클레아제-자유수로 대체했다. 샘플은 그 다음 그것의 각각의 그래핀 옥사이드와 조합되고 인큐베이션되었다. 인큐베이션-후, 샘플은 원심분리되어 그것의 상청액을 회수하고, 라이브러리 회수는 NanoDrop-1000 분광측정기 판독 (Thermo Fisher Scientific; Wilmington, DE)에 의해 결정되었다. 나머지 라이브러리 샘플은 변성 PAGE 상에서 분석되었다. 겔의 이미지는 Gel-Star로 염색/탈염색 후 취해졌다. 기대된 라이브러리 크기에 상응하는 밴드는 음성이고, 반대인, 특별한 표적 샘플의 사전-장입 인큐베이션에 대한 반대-표적을 대체하는 양성 표적 아사이클로비르로, 평행한 평가의 후속 조치 라운드를 위해 회수되었다. 제2 평행한 평가로부터 회수된 물질은 서열분석과 분석을 위해 사용되었다.
도 17은 아사이클로비르에 대한 7개의 압타머 후보를 도시한다. 각각의 압타머에 대한 자유 에너지는 37℃ 및 1 M Na+에서 Quikfold 3.0 (Zuker 2003)에 의해 계산되었다. 서열은 전매 알고리즘을 사용하여 확인되었다. 각각의 서열에서 밑줄친 영역은 PCR 프라이머 어닐링 영역이다.
도 18은 펜시클로비르에 대한 7개의 압타머 후보를 도시한다. 각각의 압타머에 대한 자유 에너지는 37℃ 및 1 M Na+에서 Quikfold 3.0 (Zuker 2003)에 의해 계산되었다. 서열은 전매 알고리즘을 사용하여 확인되었다. 각각의 서열에서 밑줄친 영역은 PCR 프라이머 어닐링 영역이다.
도 19A는 PBMC에서 발현되는 경우 림프증식성/생존 활성에 대해 시험된 IL7Rα 변이체의 개략도를 제공한다. 도 19B는 IL-2의 존재 및 부재에서 PBMC의 생존력 백분위를 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 20은 GFP를 인코딩하는 렌티바이러스 발현 벡터, 항-CD19 키메라 항원 수용체, 및 F1-0-03으로 본 명세서에서 지칭된 eTAG의 개략도를 도시한다.
도 21A 및 도 21B는 표시된 렌티바이러스 입자로 14h 동안 공여체 12M로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 각각 3, 6, 9, 13 및 17일에서, 총 CD3+ 모집단 내 백분율 (%) CD3+GFP+ 세포의 히스토그램 및 절대적인 세포수/CD3+GFP+ 모집단의 웰의 히스토그램을 도시한다. 각각의 막대는 중복의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 22A 및 도 22B는 표시된 렌티바이러스 입자로 14h 동안 공여체 13F로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 각각 3 및 6일에서, 총 CD3+ 모집단 내 (%) CD3+GFP+ 세포의 히스토그램 및 절대적인 세포수/CD3+GFP+ 모집단의 웰의 히스토그램을 도시한다. "A"는 VSV-G 모조타이핑된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과 (삼중 실험)를 도시하고; "B"는 형질도입 배지에 첨가된 OKT3 Ab (1ug/mL)로 VSV-G 모조타이핑된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과 (중복 실험)를 도시하고; "C"는 그것의 표면상에 GPI-고정된 UCHT1scFvFc를 발현하는 VSV-G 모조타이핑된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과 (삼중 실험)를 도시하고; 그리고 "D"는 그것의 표면상에 GPI 고정된 UCHT1scFvFc 및 GPI-고정된 CD80, 또는 이의 기능적 세포외 단편을 발현하는 VSV-G 모조타이핑된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과 (중복 실험)를 도시한다는 것을 나타낸다. 각각의 막대는 도 22A에서 지시된 바와 같이, 중복 또는 삼중의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 23A 및 도 23B는 표시된 렌티바이러스 입자로 표시된 노출 시간 (2-20h) 동안 공여체 12M로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 각각 3, 6 및 9일에서, 총 CD3+ 모집단 내 백분율 (%) CD3+GFP+ 세포의 히스토그램 및 절대적인 세포수/CD3+GFP+ 모집단의 웰의 히스토그램을 도시한다. 형질도입은 표시된 바와 같이 플레이트 또는 진탕기 플라스크에서 수행되었다. 각각의 막대는 VSV-G로 모조타이핑된 렌티바이러스 입자 ("[VSV-G]")에 대한 중복의 평균 +/- SD를 나타내고; 다른 실험은 중복하지 않았다.
도 24A는 GFP 및 eTag의 발현을 유도하는 이식 유전자 발현 카세트 및 GFP의 합성 EF-1 알파 프로모터 및 인트론 A 업스트림을 포함하는 렌티바이러스 벡터 백본 F1-0-02의 개략도이다. 도 24B는 F1-0-02 백본의 EF1 알파 인트론 A 안으로 miRNA의 삽입을 도시한다. "1"은 EF1 알파 중첩을 나타내고; "2"는 5' 아암을 나타내고; "3"은 miRNA1 5' 줄기를 나타내고; "4"는 루프를 나타내고; "5"는 miRNA1 3' 줄기를 나타내고; "6"은 3' 아암을 나타내고; "7"은 링커를 나타내고; "8"은 miRNA2 5' 줄기를 나타내고; "9"는 miRNA2 3' 줄기를 나타내고; "10"은 miRNA3 5' 줄기를 나타내고; "11"은 miRNA3 3' 줄기를 나타내고; "12"는 miRNA4 5' 줄기를 나타내고; 그리고 "13"은 miRNA4 3' 줄기를 나타낸다.
도 25는 EF-1 알파 프로모터 인트론 안에 있는 CD3zeta를 표적화하는 miRNA가 CD3 복합체의 발현을 녹다운시킬 수 있는 것을 도시하는 그래프이다.
도 26은 복제불능 렌티바이러스 입자를 함유하는 miR-TCRα로 형질도입된 샘플의 ΔΔCt를 도시하는 히스토그램이다. ΔΔCt 값은 비-형질도입된 대조군에 대비하여 각각의 형질도입된 샘플에서 가공된 miR-TCRa miRNA의 대표적인 양이다.
도 27A-C는 pH-조정 약리적 제제로 치료를 한 및 하지 않은 CHO-표적 1 세포의 퍼센트 특이적 용해를 나타내는 그래프이다. 도 27A에서, CHO-표적 1 세포는 초기에 pH 6.7이였고 실험적 웰들 (실선) 및 대조군 세포 (파선)는 각각 화살표에 의해 표시된 시간에서 NaHCO3으로 또는 없이 처리되었다. 도 27B에서, CHO-표적 1 세포는 초기에 pH 6.7이였고 실험적 웰들 (실선) 및 대조군 세포 (파선)는 각각 화살표에 의해 표시된 시간에서 NaOH로 또는 없이 처리되었다. 도 27C에서, CHO-표적 1 세포는 초기에 pH 7.4이였고 실험적 웰들 (실선) 및 대조군 세포 (파선)는 각각 HCl로 또는 없이 처리되었다.
도 28은 DSC에 의해 측정될 때 아사이클로비르의 부재 (원) 또는 존재 (정사각형)에서 F1A-795의 열 유속 대 시간을 도시하는 그래프이다.
도 29는 PBS 또는 바이카보네이트의 투여 전 및 후 CHO-이종이식 종양 담지 마우스에서 ProSense FAST 프로브로부터 RFU 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 30은 라이브러리 1A, 1.1A, 및 1.1B의 후보 키메라 림프증식성 요소 (CLE)와 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적인, 예시적인 이식유전자 발현 카세트의 개략도이다.
도 31은 라이브러리 2B 및 2.1B의 후보 CLE를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적인, 예시적인 이식유전자 발현 카세트의 개략도이다.
도 32는 라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 및 3.1B의 후보 CLE와 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적인, 예시적인 이식유전자 발현 카세트의 개략도이다.
도 33은 라이브러리 4B 및 4.1 B의 후보 CLE를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적인, 예시적인 이식유전자 발현 카세트의 개략도이다.
도 34는 표시된 렌티바이러스입자로 공여체 18로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 각각 3일에서, 살아있는 CD3+ 모집단 내 백분율 (%) CD3+GFP+ 세포의 히스토그램 도 34A, 및 절대적인 세포수/총 살아있는 모집단의 uL의 히스토그램 34B를 도시한다. 각각의 막대는 중복의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 35는 개별 CLE를 인코딩하는 렌티바이러스 입자로 형질도입되고 외인성 사이토카인의 부재에서 35일 동안 배양된 PBMC의 팽창의 배를 도시하는 그래프이다.
도 36은 항-CD19 CAR 작제물 및 개별 CLE를 인코딩하는 렌티바이러스 입자로 형질도입되고 공여체 매칭된 PBMC의 존재에서 그러나 외인성 사이토카인의 부재에서 35일 동안 배양된 PBMC의 팽창의 배를 도시하는 그래프이다.
도 37은 표시된 렌티바이러스 입자가 4시간에서 휴면 중인 PBMC에 형질도입되는 효율을 도시하는 그래프이다. 형질도입 효율은 FACS에 의해 결정될 때 외인성 사이토카인의 부재에서 배양물에서 6일 후 % CAR+ PBMC로 측정되었다. 각각의 렌티바이러스 입자는 CAR 및 CLE를 인코딩했다. F1-1-228U 및 F1-3-219U로 형질도입된 렌티바이러스 입자는 그것의 표면상에 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다.
도 38A 및 도 38B는 휴면 중인 PBMC가 4시간 동안 표시된 렌티바이러스 입자로 형질도입되고 6일 동안 외인성 사이토카인의 부재에서 시험관내 배양된 후 생존가능 세포의 총 수의 시간 경과를 도시하는 그래프이다. 각각의 렌티바이러스 입자는 CAR 및 CLE를 인코딩했다. F1-1-228U 및 F1-3-219U로 형질도입된 렌티바이러스 입자는 그것의 표면상에 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다.
도 39A, 39B, 및 39C는 4시간 동안 표시된 렌티바이러스 입자로 형질도입되고 생체외 팽창된 PBMC 없이 정맥내로 주사된 인간 PBMC가 투약된 종양-담지 NSG 마우스의 혈액으로부터 게놈 DNA의 μg당 렌티바이러스 게놈의 복제의 시간 경과를 도시하는 그래프이다. 각각의 렌티바이러스 입자는 CAR을 인코딩했다. F1-1-228, F1-1-228U, F1-3-219, 및 F1-3-219U 또한 CLE를 인코딩했다. F1-1-228U 및 F1-3-219U로 형질도입된 렌티바이러스 입자는 그것의 표면상에 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다.
도 40은 4시간 동안 표시된 렌티바이러스 입자로 형질도입되고 생체외 팽창된 PBMC 없이 정맥내로 주사된 인간 PBMC가 투약된 종양-담지 NSG 마우스의 200μl의 혈액당 CAR+ 세포의 수를 도시하는 그래프이다. 혈액은 마우스가 안락사될 때에 샘플링되었다. 각각의 렌티바이러스 입자는 CAR을 인코딩했다. F1-1-228, F1-1-228U, F1-3-219, 및 F1-3-219U 또한 CLE를 인코딩했다. F1-1-228U 및 F1-3-219U로 형질도입된 렌티바이러스 입자는 그것의 표면상에 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다.
도 41A는 생체외 팽창된 PBMC 없이 4시간 동안 항-ROR2 MRB CAR 및 CLE를 인코딩하는 표시된 렌티바이러스 입자로 형질도입된 인간 PBMC 또는 PBS로 정맥내로 투약된 NSG 마우스에서 CHO-ROR2 종양의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다. 41B는 생체외 팽창된 PBMC 없이 4시간 동안 항-CD19 CAR 및 CLE를 인코딩하는 표시된 렌티바이러스 입자로 형질도입된 인간 PBMC 또는 PBS로 정맥내로 투약된 NSG 마우스에서 Raji 종양의 평균 종양 부피를 도시하는 그래프이다. F1-1-228U 및 F1-3-219U로 형질도입된 렌티바이러스 입자는 그것의 표면상에 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CAR들"은 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포, 대식세포, 및 줄기 세포 상에 항원 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR들은 적어도 하나의 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인 (TM), 및 세포내 활성화 도메인 (IAD)을 포함하고 줄기, 및 하나 이상의 공통자극 도메인 (CSD)을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR은 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적인 이중특이적 CAR이다. ASTR이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, IAD는 세포내 신호전달을 활성화시킨다. 예를 들어, IAD는 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T 세포 특이성 및 반응성을 재지향할 수 있어, 항체의 항원-결합 특성을 개척한다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에 항원 가공에 독립적인 항원을 인식하는 능력을 제공하고, 따라서 종양 탈출의 주요한 기전을 우회한다. 나아가, T 세포에서 발현될 때, CAR들은 유익하게는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬로 이합체화하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "미세환경"은 다른 조직의 영역 또는 신체의 영역과 일정한 또는 일시적, 물리적, 또는 화학적 차이를 갖는 조직 또는 신체의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "종양 미세환경"은 종양이 존재하고, 종양 내의 비-세포 영역 및 종양성 조직에 직접적으로 외부인 영역이지만 암세포 자체의 세포내 구획에 속하지 않는 환경을 지칭한다. 종양 미세환경은 악성 과정이 생존 및/또는 팽창 및/또는 확산하는 구조적 및 또는 기능적 환경을 만드는 조건을 포함하여 종양 환경의 임의의 및 모든 조건을 지칭한다. 예를 들어, 종양 미세환경은 비제한적으로, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질의 농도, 글루코스의 농도, 하이알루로난의 농도, 락트산 또는 락테이트의 농도, 알부민의 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 피루베이트의 농도, 산소의 농도, 및/또는 산화제 , 환원제, 또는 보조 인자의 존재뿐만 아니라 숙련가가 이해할 다른 조건과 같은 조건에서의 변경을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나의, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는, 비제한적으로, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 및 항원에 대한 특이적 결합을 보유하는 항체의 단편을 포함한, 다클론성 및 단클론성 항체를 포함한다. 항체 단편은, 비제한적으로, 단일-사슬 가변성 단편 (scFv), 2가 scFv's, 3가 scFv's, 및 단일 도메인 항체 단편 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디)을 비롯한, 단편 항원 결합 (Fab) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, Fab'-SH 단편, (Fab')2 Fv 단편, Fd 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일-사슬 항체 단편일 수 있다. 본 용어는 항체 및 비-항체 단백질의 항원-특이적 표적화 영역, 헤테로콘주게이트 항체, 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적, 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탠덤 di-scFv's, 및 탠덤 tri-scFv's를 비롯하여, 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 단일-사슬 항체, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 융합 단백질의 유전자적으로 조작된 및/또는 달리는 변형된 형태를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 이들의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 본 용어는 또한 IgG 및 이들의 하위-부류, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 비롯한 임의의 부류 또는 하위-부류의 항체를 포함한, 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 부분, 예를 들어, 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata 등, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하고, 각각은 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 지정인, 단일 항원-결합 부위, 및 잔존 "Fe" 단편을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 가지고 여전히 항원을 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어들 "단일-사슬 Fv", "scFv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하되, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커 또는 스페이서를 추가로 포함하여, sF가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 검토에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag , New York, pp. 269-315 (1994)]을 참고한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "자연 발생" VH 및 VL 도메인은, 미국 특허 8709755 B2 및 출원 WO/2016/033331A1에 개시된 것들과 같은 특이적 조건 하에서 scFv 형식으로 생성될 때 그것의 친화성을 변경하기 위한 추가의 분자 진화 없이 숙주로부터 단리된 VH 및 VL 도메인을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 2종의 제제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하고 해리 상수 (Kd)로 표현된다. 친화성은 관련 없는 아미노산 서열에 대한 항체의 친화성보다 적어도 1-배 크거나, 적어도 2-배 크거나, 적어도 3-배 크거나, 적어도 4-배 크거나, 적어도 5-배 크거나, 적어도 6-배 크거나, 적어도 7-배 크거나, 적어도 8-배 크거나, 적어도 9-배 크거나, 적어도 10-배 크거나, 적어도 20-배 크거나, 적어도 30-배 크거나, 적어도 40-배 크거나, 적어도 50-배 크거나, 적어도 60-배 크거나, 적어도 70-배 크거나, 적어도 80-배 크거나, 적어도 90-배 크거나, 적어도 100-배 크거나, 또는 적어도 1000-배 크거나 그 이상일 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화성은, 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 또는 그 초과일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합능"은 희석 후 해리에 대한 2개 또는 그 초과 제제의 복합체의 저항을 지칭한다. 용어들 "면역반응" 및 "우선적으로 결합한다"는 항체 및/또는 항원-결합 단편에 관하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은, 예를 들어, 공유, 정전, 소수성, 및 상호작용 예컨대 염 다리 및 물 브릿지를 비롯한 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용에 기인한, 두 분자 사이의 직접적인 회합을 지칭한다. 비-특이적 결합은 약 10-7 M 미만의 친화성으로 결합, 예를 들어, 10-6 M, 10-5 M, 10-4M, 등의 친화성으로 결합을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포 표면 발현 시스템" 또는 "세포 표면 디스플레이 시스템"은 세포의 표면상에 단백질 또는 이들의 일부분의 디스플레이 또는 발현을 지칭한다. 전형적으로, 세포-표면 단백질에 융합된 관심 있는 단백질을 발현하는 세포가 생성된다. 예를 들어, 단백질은 막관통 도메인을 갖는 융합 단백질로 발현된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "인자"는 폴리펩타이드의 융합, 폴리펩타이드의 영역, 및 기능적 돌연변이체 또는 이의 단편을 포함한 폴리펩타이드 및, 마이크로RNA 및 shRNA, 및 기능적 돌연변이체 또는 이의 단편을 포함한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "영역"은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 분절이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "도메인"은 기능적 및/또는 구조적 특성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 영역이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "줄기" 또는 "줄기 도메인"은 측접하는 폴리펩타이드 영역에 구조적 가요성 및 간격을 제공하는 가요성 폴리펩타이드 커넥터 영역을 지칭하고, 천연 또는 합성 폴리펩타이드로 구성될 수 있다. 줄기는 인간 IgGl의 Glu216 내지 Pro230의 스트레칭으로 일반적으로 정의된 면역글로불린 (예를 들어, IgGl)의 힌지 또는 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다 (Burton (1985) Molec. Immunol ., 22:161-206). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역은 동일한 위치 내의 제1 및 마지막 시스테인 잔기 형성 인터-중쇄 디설파이드 (S-S) 결합을 대체함에 의해 IgG1 서열로 정렬될 수 있다. 본 줄기는, 미국 특허 번호 5,677,425에서 개시된 바와 같이, 비제한적으로 변경된 힌지 영역을 포함한, 천연 발생 또는 비-천연 발생의 것일 수 있다. 본 줄기는 임의의 부류 또는 서브클래스로부터 유래된 완벽한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 본 줄기는 또한 CD8, CD28, 또는 측접하는 영역에 대해 가요성 및 간격을 제공함에 있어 유사한 기능을 제공하는 다른 수용체로부터 유래된 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 물질이 그것의 최초 환경 (예를 들어, 자연 발생인 경우 천연 환경)으로부터 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 천연 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 그와 같은 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고 및/또는 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고, 그리고 그러한 벡터 또는 조성물이 그것의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 단일 사슬이다. 폴리펩타이드는 고정된 구조로 접혀질 수 없거나 이것이 임의의 후번역 변형을 할 수 없게 된다. "단백질"은 고정된 구조로 접혀진 폴리펩타이드이다. "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 천연 환경의 오염물질 성분, 예를 들어 폴리펩타이드 예컨대, 예를 들어, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 수 있는 물질을 제거하기 위해 "정제될" 수 있다. 폴리펩타이드는 (1) Lowry 방법에 의해 결정될 때 항체의 중량으로, 90% 초과, 95% 초과, 또는 98% 초과, 예를 들어, 99 중량% 초과로, (2) 회전 컵 서열분석기의 사용에 의한 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마씨 청색 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의한 균질성으로 정제될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 세포"는 일반적으로 골수에서 생산된 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 유래된 백혈구 (백혈구들)를 포함한다. "면역 세포"는, 예를 들어, 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포) 및 골수-유래된 세포 (중성구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식 세포, 수지상 세포)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "T 세포"는 T-도움 세포 (CD4+ 세포), 세포 독성 T 세포 (CD8+ 세포), T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함한, CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포독성 세포"는, 세포독성 반응을 조정할 수 있는 세포인, CD8+ T 세포, 천연-살해 (NK) 세포, NK-T 세포, γδT 세포, CD4+ 세포의 부분모집단, 및 중성구를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 일반적으로 만능 또는 다분화능 줄기 세포를 포함한다. "줄기 세포"는, 예를 들어, 배아 줄기 세포 (ES); 간엽 줄기 세포 (MSC); 유도된-만능 줄기 세포 (iPS); 및 수임된 선조 세포 (조혈 줄기 세포 (HSC); 골수 유래된 세포, 등)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "치료", "치료하는" 및 동종의 것은 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 예방적 관점에서 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것일 수 있고 및/또는 치료적 관점에서 질환 및/또는 질환에 기인하는 역효과에 대한 부분적인 또는 완전한 치유일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고: (a) 질환에 취약할 수 있지만, 아직 그것을 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉, 그것의 발달을 저지하는 것; 및(c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 용어들 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 비제한적으로, 인간, 쥣과 (예를 들어, 랫트, 마우스), 토끼목 (예를 들어, 토끼), 비-인간 영장류, 인간, 갯과, 고양이, 유제류 (예를 들어, 말, 소과, 양, 돼지, 염소), 등을 포함한 포유동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "치료적 유효량" 또는 "유효한 양"은 질환을 치료하기 위해 포유동물 또는 다른 대상체에 투여될 때 질환에 대한 그러한 치료에 영향을 주기에 충분한 제제의 양, 또는 2종의 제제의 조합된 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제(들), 질환 및 그것의 중증도 및 치료되어 지는 대상체의 연령, 체중, 등에 의존하여 다양할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "진화" 또는 "진화하는"은 자체로 개선된 생물학적 분자이며 및/또는 또 다른 개선된 생물학적 분자의 생성에 기여하는 상이한 폴리펩타이드를 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오타이드를 생성시키는 하나 이상의 돌연변이 유발의 방법을 사용하는 것을 지칭한다. "생리적" 또는 "정상" 또는 "정상 생리적" 조건은, 비제한적으로, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질의 농도, 글루코스의 농도, 하이알루로난의 농도, 락트산 또는 락테이트의 농도, 알부민의 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 피루베이트의 농도, 산소의 농도, 및/또는 산화제 , 환원제, 또는 보조 인자의 존재와 같은 조건뿐만 아니라 대상체에 대한, 투여 부위에서, 또는 작용 부위에서의 조직 또는 장기에서 정상 범위 내로 간주될 수 있는 조건이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유전자 변형된 세포"는 외인성 핵산이 세포의 게놈 안으로 통합되거나 또는 되지 않은 외인성 핵산을 함유하는 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "폴리펩타이드"는 일부 또는 전체의 단백질 분자뿐만 아니라 임의의 후번역 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 슈도타이핑 요소는 표적 숙주 세포를 확인하고 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드, 전형적으로는 당단백질을 포함하는 "결합 폴리펩타이드" 및 레트로바이러스와 표적 숙주 세포막의 융합을 조정하는 하나 이상의 "융합유도 폴리펩타이드"를 포함할 수 있고, 그것에 의해 레트로바이러스 게놈을 표적 숙주 세포에 도입할 수 있게 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 폴리펩타이드"는 또한 "T 세포 및/또는 NK 세포 결합 폴리펩타이드" 또는 "표적 참여 요소"로 지칭될 수 있고 "융합유도 폴리펩타이드"는 또한 "융합유도 요소"로 지칭될 수 있다.
"휴면 중인" 림프구, 예컨대 예를 들어, 휴면 중인 T 세포는 활성화 마커 예컨대 Ki-67을 발현하지 않는 세포 주기의 G0 단계에 있는 림프구이다. 휴면 중인 림프구는 마주치는 특이적 항원을 결코 가지지 않는 미접촉 T 세포 및 항원과 이전의 조우에 의해 변경된 메모리 T 세포를 포함할 수 있다. "휴면 중인" 림프구는 또한 "휴지기" 림프구로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "림프구 고갈"은, 예를 들어 림프구 고갈 제제의 투여에 의해 대상체에서 림프구의 수를 감소시키는 방법을 포함한다. 림프구 고갈은 또한 부분적인 신체 또는 전신 분획화된 방사선 요법에 의해 획득될 수 있다. 림프구 고갈 제제는 포유동물에 대해 투여될 때 포유동물에서 기능적 림프구의 수를 감소시킬 수 있는 화합물 또는 조성물일 수 있다. 그러한 제제의 일 예는 하나 이상의 화학치료제이다. 그와 같은 제제 및 투약량은 알려져 있고, 치료되는 대상체에 의존하여 치료하는 의사에 의해 선택될 수 있다. 림프구 고갈 제제의 예는, 비제한적으로, 플루다라빈, 사이클로포스파마이드, 클라드리빈, 데닐류킨디프티톡스, 또는 이들의 조합을 포함한다.
RNA 간섭 (RNAi)은 RNA 분자가 표적화된 RNA 분자를 중화함에 의해 유전자 발현 또는 번역을 억제하는 생물학적 과정이다. RNA 표적은 mRNA일 수 있거나, 또는 이것은 RNAi에 의한 기능적 억제에 민감한 임의의 다른 RNA일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "억제성 RNA 분자"는 세포 내에서 그의 존재가 RNAi를 초래하고 억제성 RNA 분자가 표적화된 전사체의 감소된 발현을 유발시키는 RNA 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 억제성 RNA 분자는 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 5' 줄기 및 3' 줄기를 갖는다. 억제성 RNA 분자는, 예를 들어, miRNA (내인성 또는 인공 중 어느 하나) 또는 shRNA, miRNA의 전구체 (즉 Pri-miRNA 또는 Pre-miRNA) 또는 shRNA의 전구체, 또는 세포 또는 대상체에 단리된 핵산으로 직접적으로 도입되거나 또는 전사된 dsRNA일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA" 또는 "RNA 듀플렉스"는 2개의 가닥으로 구성되는 RNA 분자를 지칭한다. 이중-가닥 분자는 듀플렉스 RNA 구조를 형성하기 위해 혼성화되는 2개의 RNA 가닥 또는 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 자체 상에서 뒤로 이중화하는 단일 RNA 가닥으로 구성된 것들을 포함한다. 반드시 그렇지는 않지만, 대부분 이중 영역 내의 모든 염기는 염기 쌍으로 된다. 이중 영역은 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함한다. 표적 RNA에 상보적인 서열은 안티센스 서열이고, 빈번하게 18 내지 29, 19 내지 29, 19 내지 21, 또는 25 내지 28 뉴클레오타이드 길이, 또는 일부 구현예에서 하단으로 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 내지 상단으로 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 29, 또는 30 사이이고, 여기서 주어진 영역은 항상 높은 종단보다는 낮은 하단을 갖는다. 그와 같은 구조는 전형적으로 5' 줄기, 루프, 및 3' 줄기를 포함하고 이것은 각각의 줄기와 인접하고 듀플렉스의 일부가 아닌 루프에 의해 연결된다. 루프는, 특정 구현예에서, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서 루프는 2 내지 40, 3 내지 40, 3 내지 21, 또는 19 내지 21 뉴클레오타이드, 또는 일부 구현예에서 하단으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 상단으로 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40 사이를 포함하되, 주어진 영역은 항상 높은 종단보다는 낮은 하단을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "마이크로RNA 측접 서열"은 마이크로RNA 처리 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 마이크로RNA 처리 요소는 전구체 마이크로RNA로부터 성숙한 마이크로RNA의 생산에 기여하는 최소 핵산 서열이다. 종종 이들 요소는 마이크로RNA 스템-루프 구조에 측접하는 40개의 뉴클레오타이드 서열 내에 위치된다. 일부 사례에서 마이크로RNA 처리 요소는 마이크로RNA 스템-루프 구조에 측접하는 5 내지 4,000개의 뉴클레오타이드 사이의 뉴클레오타이드 서열의 범위 내에서 발견된다.
다중 억제성 RNA 분자와 관련하여 사용될 때 용어 "링커"는 2개의 억제성 RNA 분자를 결합하는 연결 수단을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "재조합 레트로바이러스"는, 명백하게 복제가능 레트로바이러스로 지시되지 않는 한, 비-복제가능, 또는 "복제불능", 레트로바이러스를 지칭한다. 용어들 "재조합 레트로바이러스" 및 "재조합 레트로바이러스 입자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 그와 같은 레트로바이러스/레트로바이러스 입자는, 예를 들어, 감마 레트로바이러스, 및 예시적인 구현예에서, 렌티바이러스를 포함한, 임의의 유형의 레트로바이러스 입자일 수 있다. 알려진 바와 같이, 그러한 레트로바이러스 입자, 예를 들어 렌티바이러스 입자는 포장 구성요소 예컨대 Gag, Pol 및 Rev, 슈도타이핑 요소를 인코딩하는 외피 또는 슈도타이핑 플라스미드, 및 전달, 게놈, 또는 관심 있는 유전자(들) 또는 다른 코딩 서열이 인코딩되어 지는 전형적으로 플라스미드인 레트로바이러스 (예를 들어 렌티바이러스) 발현 벡터를 포함하는 플라스미드로 팩킹 세포를 형질감염시킴에 의해 포장 세포에 전형적으로 형성된다. 따라서, 레트로바이러스 (예를 들어 렌티바이러스) 발현 벡터는 세포 안으로 형질감염 후 발현 및 패키징을 증진하는 서열 (예를 들어 psi 패키징 요소 및 표적 이종성 코딩 서열을 측접하는, 예를 들어 5' LTR 및 3' LTR)을 포함한다. 용어들 "렌티바이러스" 및 "렌티바이러스 입자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
miRNA의 "프레임워크"는 miRNA를 둘러싸는 "5' 마이크로RNA 측접 서열" 및/또는 "3' 마이크로RNA 측접 서열" 및, 일부 경우에, miRNA에서 스템-루프 구조의 줄기를 분리하는 루프 서열로 구성된다. 일부 예에서, "프레임워크"는 자연 발생 miRNA들, 예컨대, 예를 들어, miR-155로부터 유래된다. 용어들 "5' 마이크로RNA 측접 서열" 및 "5' 아암"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 용어들 "3' 마이크로RNA 측접 서열" 및 "3' 아암"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA 전구체"는 miRNA, 예컨대 일차 RNA 전사체, pri-miRNA, 또는 pre-miRNA로 효소적으로 가공될 수 있는 임의의 길이의 RNA 분자를 지칭한다.
본 개시내용 및 본 명세서에서 제공된 양태 및 구현예는 개시된 특정 실시예에 제한되지 않고, 물론, 이와 같이, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예 및 구현예를 개시할 목적이고, 그리고 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구항들에 의해서만 제한될 것이기 때문에 한정하기 위한 것이 아니다는 것이 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이의, 하한 단위의 10분의 1까지 각각의 개재하는 값 및 그 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재하는 값이 개시내용 내에 포괄된다는 것이 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 언급된 범위에서 임의로 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 또한 포괄된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 또한 본 발명에 포함된다. 중첩되는 범위에 대해 다수의 낮은 값과 다수의 높은 값이 주어지는 경우, 숙련가는 선택된 범위가 높은 값보다 적은 낮은 낮은 값을 포함할 것이다는 것을 인식할 것이다. 본 명세서의 모든 제목은 독자의 편리를 위한 것이며 제한적이지 않다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에서 기재된 것에 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공보는 공보가 인용된 것과 연관된 방법 및/또는 물질를 개시하고 설명하기 위해 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 인지되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "키메라 항원 수용체"에 대한 언급은 복수의 그러한 키메라 항원 수용체 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 그의 등가물, 등을 포함한다. 청구항은 임의의 선택적인 요소를 배제하도록 작성될 수 있음을 추가로 인지해야 한다. 이와 같이, 이 서술은 청구항 구성요소의 인용 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 및 기타 동종의 것과 같은 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기준으로서의 역할을 하기 위해 의도된다.
명백하게 하기 위해 별개의 구현예와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인정된다. 반대로, 간결하게 하기 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 속하는 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 조합이 개별적으로 그리고 명백하게 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다. 또한, 다양한 구현예의 모든 하위-조합 및 이들의 요소는 본 발명에 의해 또한 구체적으로 포함되며, 각각의 모든 그러한 하위-조합이 개별적으로 그리고 명백하게 본 명세서에 개시된 것처럼 본 명세서에 개시된다.
상세한 설명
본 개시내용은 림프구, 예를 들어 NK 세포 및 예시적인 구현예에서, T 세포를 유전자적으로 변형시키기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공하에 의해 선행 기술 문제를 극복한다. 예를 들어, 이들 방법의 일부는 림프구의 사전-활성화를 포함하지 않고, 이들 방법의 일부는 종래의 방법보다 더 짧은 시간 내에 수행된다. 게다가, 이들 개선된 방법에서 이의 용도를 포함한, 많은 용도를 갖는 조성물이 제공된다. 이들 조성물의 일부는, 예를 들어 성장 인자의 부재에서 시험관내에서 배양을 포함하여, 개선된 증식성 및 생존 품질을 갖는 유전자 변형된 림프구이다. 그와 같은 유전자 변형된 림프구는, 예를 들어, T 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 인자를 보다 잘 이해하기 위한 연구 도구로서, 그리고 상업 생산을 위해, 예를 들어 특정 인자, 예컨대 수확 및 시험되거나 또는 상품에 사용될 수 있는 성장 인자 및 면역조절 제제의 생산을 위해 유용성이 있을 것이다.
본 명세서에서 제공된 일부 구현예는, 생체외에서 훨씬 적은 시간, 예를 들어, 24, 12, 또는 8시간 또는 그 미만을 요하고, 일부 구현예에서 사전 생체외 자극을 요하지 않는, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 입양 세포 요법을 수행하는 방법이다. 이들 방법은 대상체로부터 혈액을 폐쇄계 생체외 가공하는데 매우 적합하고 방법의 수행 동안 그것의 혈액 또는 이들의 단리된 혈구의 그것의 시야 라인과 동일한 실에서 및/또는 일부 구현예에서 그 내에 존재하는 대상체로 수행될 수 있다. 더 구체적으로, 본 명세서에서 개시내용의 양태 및 구현예는, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전자 변형을 촉진하도록, 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 결합 및 융합을 촉진하는 슈도타이핑 요소를 전형적으로 이용하는, 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입하는 방법을 제공함에 의해 현행 입양 세포 요법과 연관된 문제를 극복한다. 게다가, 본 명세서에 제공된 방법은 예시적인 구현예에서, 조절 요소를 결합하는 화합물에 대한 대상체의 노출 또는 그러한 노출의 종결이 생체내 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 팽창을 촉진하도록, 그 발현이 조절 요소의 제어하에 있는 키메라 항원 수용체 및 하나 이상의 림프증식성 요소를 이용함에 의해 당해 기술의 문제를 극복한다.
본 명세서에서 상세히 개시된 이들 및 다른 개선의 결과로, 일 양태에서, 대상체, 예컨대 질환 또는 장애가 있는 환자의 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 유전자적으로 변형시키는 방법이 본 명세서에 제공되되, 대상체로부터의 혈액이 수집되고; 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포는 이들을 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시킴에 의해 유전자적으로 변형되고; 그리고 유전자 변형된 세포는 전형적으로 종래의 방법보다 더 짧은 기간, 예를 들어 24시간 이내 그리고 일부 비제한적인 구현예에서, 12시간 이내에 및/또는, 예를 들어 유전자 변형된 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포가 생체외에서 4번 초과의 세포분열을 하지 않도록 생체외에서 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 모집단을 추가로 팽창시킴이 없이 상기 대상체로 재도입된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 방법은 현행 CAR 요법보다 훨씬 적은 시간 내에 수행될 수 있고, 그것에 의해 대상체가 생체외 단계의 전체 시간 동안 클리닉에 남아있을 수 있는 공정을 제공한다. 이것은 폐쇄계에서 생체외 단계의 성능을 촉진하여, 오염 및 환자 샘플의 혼합에 대한 기회를 감소시키고 임상 실험에 의해 보다 쉽게 수행될 수 있다.
따라서, 도 1 및 2는 본 명세서에 제공된 방법에서 사용된 예시적 조성물의 개략도를 제공한다. 도 1은 포장 세포 (100) 및 그러한 포장 세포에 의해 생산된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)의 다이어그램을 제공한다. 포장 세포 (100)는 리간드에 결합하고 활성화된, 교차활성인자에 의해 조절된 유도성 프로모터의 제어하에서 레트로바이러스 단백질 및 다양한 상이한 막-결합 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 전사 요소를 포함하는 그것의 게놈안으로 편입된 재조합 폴리뉴클레오타이드 (110)를 포함한다. 이들 교차활성인자, 유도성 프로모터, 및 리간드는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 패키징 및 어셈블리를 위해 필요한 레트로바이러스 성분뿐만 아니라 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 안으로 편입될 세포막-결합된 폴리펩타이드의 순차적인 발현 및 축적을 유도하기 위해 사용된다.
하기 본 명세서에서 상세히 논의된 바와 같이 다양한 폴리뉴클레오타이드의 순차적 유도된 발현의 결과로, 도 1에 설명된 예시적 포장 세포(100) 생산되고, 본 명세서에 제공된 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포(도 2에서 (300))를 형질감염시키는 방법에서 사용된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 예시적 방법에 사용될 수 있다. 비제한적인 예시적 구현예에서, 포장 세포 (100)는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (비제한적인 예시로, 레트로바이러스 psi 요소, 레트로바이러스 gag 폴리펩타이드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩타이드)의 패키징 및 어셈블리를 위해 필요한 레트로바이러스 게놈의 요소의 적어도 일부를 포함하는 패키지가능한 레트로바이러스 RNA 게놈을 인코딩하는 그것의 게놈 핵산을 포함한다.
포장 세포의 세포막으로 편입되거나 또는 이와 연관된 일부 막결합된 폴리펩타이드는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 안으로 편입 또는 연관될 것이지만, 레트로바이러스 게놈에 의해 인코딩되지 않는다. 예를 들어, 이들로부터 형성된 포장 세포 및 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는, 비제한적인 예시에서 막연관된 융합 단백질, 예를 들어 Src-Flag-Vpx 폴리펩타이드로 발현될 수 있는 레트로바이러스 Vpx 폴리펩타이드 (250); 비-제한적인 구현예에서 홍역 바이러스 혈구 응집소 (H) 폴리펩타이드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩타이드, 또는 이들의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드 (240)를 포함할 수 있는 슈도타이핑 요소; 선택적으로, 비-제한적인 구현예에서 CD3에 결합할 수 있는 막-결합 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 막-결합 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 활성화 요소 (210, 220); 및/또는 선택적으로, 그것의 비제한적인 구현예는 DAF에 융합된 IL-7, 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드인, 막-결합 사이토카인 (230)을 포함할 수 있다. 이들 막결합된 폴리펩타이드의 다양한 다른 특이적 유형이 본 명세서에 제공된다.
포장 세포에 의한 전사 요소의 순차적인 발현의 결과로, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자가 생산된다. 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 게놈이 되는 포장 세포의 내측이고 게놈 안으로 전형적으로 통합된 RNA 레트로바이러스 게놈은 전형적으로 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포인, 숙주 세포의 게놈 안으로 레트로바이러스 생산, 감염 및 통합을 위해 필요한 레트로바이러스 성분 (비제한적인 예시로서, 레트로바이러스 Gag 및 Pol 폴리뉴클레오타이드)을 포함한다. 게다가, 레트로바이러스 게놈은 더욱이 본 명세서에 제공된 1 또는 전형적으로 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 하나는 전형적으로 적어도 하나의 림프증식성 요소 (비-제한적인 예에서 구성적 인터류킨 7 수용체 돌연변이체)를 인코딩하고 다른 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 전형적으로 키메라 항원 수용체를 인코딩한다.
복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)는 그런 다음 본 명세서에 제공된 방법에서 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포 (300)를 형질도입하기 위해 사용된다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)와 접촉된 후, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에서 상기에 논의된 막 폴리펩타이드가 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 표면상에서의 수용체 및/또는 리간드에 결합한다. 예를 들어, 상기에서 나타낸 바와 같이 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포의 표면상에서 분자에 결합하는 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 슈도타이핑 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포 막에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200)의 결합 및 융합을 용이하게 한다. 활성화 요소(들) (210, 220)는, 접촉의 시간 경과에 걸쳐 일어나는 과정인, T-세포 수용체 복합체를 계합함에 의하거나 또는 그 이후의 인큐베이션에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)를 활성화시킨다. 게다가, 막-결합 사이토카인 (230)은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 존재할 수 있고 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 표면상에 사이토카인 수용체 (310)에 결합할 수 있고, 따라서 결합 및 활성화를 추가로 증진한다. 따라서, 이론에 제한되지 않고, 본 명세서에서 제공된 예시적 구현예에서, 이들 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200) 성분 중 하나 이상의 결과로서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 (200) 내 또는 그 위에 이미 없는 요소에 의한 생체외 자극 또는 활성화는 요구되지 않는다. 이것은 차례로, 본 명세서에 제공된 이들 예시적인 방법에서 방법을 완료하기 위해 요구된 생체외 시간을 줄이는 것을 돕는다.
T 세포 및/또는 NK 세포 (200)에 대한 결합에 의해, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그런 다음 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)와 융합하고, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 내 폴리펩타이드 및 핵산은 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)로 도입된다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 내 이들 폴리펩타이드 중 하나는 Vpx 폴리펩타이드 (250)이다. 본 Vpx 폴리펩타이드 (250)는 SAMHD1 제한 인자 (350)에 결합하고 그것의 분해를 유도하여, 세포질 내 유리 dNTP를 분해한다. 따라서, 세포질 내 유리 dNTP의 농도는 Vpx가 SAMHD1을 분해함에 따라 증가하고, 역전사 활성이 증가되고, 따라서 레트로바이러스 게놈의 역전사 및 T 세포 및/또는 NK 세포 게놈 안으로 통합을 용이하게 한다.
T 세포 및/또는 NK 세포 (200) 안으로 레트로바이러스 게놈의 통합 후, T 세포 및/또는 NK 세포 게놈은 림프증식성 요소 (370)를 인코딩하는 신호전달 폴리펩타이드 및 선택적으로 CAR (360)을 인코딩하는 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 림프증식성 요소 및 선택적으로 CAR의 발현은 조절 요소의 제어하에 있다. T 세포 및/또는 NK 세포 (300)가 형질도입된 대상체에게 이를 투여함에 의해 시험관내 또는 생체내 발생할 수 있는, 조절 요소를 결합하는 화합물에 노출은 림프증식성 요소를 발현함에 의해 그리고 선택적으로 CAR의 발현과 그것의 표적 세포에 CAR의 결합의 결과로 시험관내 또는 생체내 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 증식을 촉진한다. 따라서, 본 명세서에서의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 증식을 유도하고 및/또는 세포사를 억제하는 하나 이상의 신호를 가져, 차례로 예시적인 구현예에서, 대상체로 다시 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 복귀시키기 전에 숙주를 림프고갈시키는 이전의 방법의 요건을 회피한다. 이것은 차례로, 예시적인 구현예에서, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체 안으로 재도입되기 전에 처리 일수에 대한 요건을 추가로 감소시킨다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 36시간, 24시간, 12시간 이하, 또는 일부 사례에서 더욱이 8시간의 시간이 대상체로부터 혈액의 수집으로부터 상기 대상체에게 혈액의 재도입까지 요구되어, 이전의 방법으로부터의 CAR-T 과정을 근본적으로 변화시킨다. 게다가, 조절 요소는 또한 본 명세서에 제공된 안전성 기전 중 하나를 제공한다. 예를 들어, 화합물의 투여 중단은 림프증식성 요소 및 선택적으로 CAR의 발현을 하향-조절하거나 심지어 종결시킬 수 있어, 따라서 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포 및 그것의 자손에 대한 증식 및/또는 생존 신호를 종결시킨다.
림프구를 형질도입 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한 방법
특정 양태에서, 림프구를 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 것을 포함하는, 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포, 및 전형적으로 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한 방법이 본 명세서에 제공되되, 상기 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 전형적으로 그것의 표면상에 슈도타이핑 요소를 포함하되, 상기 접촉시키는 것 (및 접속시키는 조건 하에서 인큐베이션)은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산한다. 슈도타이핑 요소는 전형적으로 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 결합할 수 있고 그리고 전형적으로 독자적으로 또는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 다른 단백질(들)과 공조하여 막 융합을 용이하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본 명세서에 제공된 임의의 활성화 요소일 수 있는 활성화 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3, 예컨대 항-CD3 scFv, 또는 항-CD3 scFvFc일 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉은 1 내지 24시간, 예를 들어, 1 내지 12시간, 또는 1 내지 6시간 동안 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉은 24시간 미만, 예를 들어, 12시간 미만, 8시간 미만, 또는 4시간 미만 동안 수행될 수 있다. 팩킹세포, 및 예시적인 구현예에서 포장 세포주, 그리고 특히 예시적 구현예에서 본 명세서에서 특정 양태에서 제공된 포장 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 사용된다. 그러한 방법의 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 CAR에 의해 인식된 표적 항원의 부재에서 그리고 사이토카인 예컨대 IL-2, IL-15, 또는 IL-7의 부재에서 적어도 7, 14, 21, 28, 35, 42, 또는 60일 동안 생체외 배양에서 생존할 수 있다. 그러한 방법의 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 적어도 7, 14, 또는 28일 동안 마우스에서 생체내 생착 및/또는 마우스에서 생체내 강화할 수 있다. 숙련가는 그러한 마우스가 처리 또는 달리는 유전자 변형될 수 있어서 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 사이의 임의의 면역학적 차이는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 도입된 림프구 형질의 임의의 성분에 대해 마우스에서 유발되는 면역 반응을 초래하지 않는다는 것을 인지할 것이다. 일부 구현예에서, 포장 세포주는 현탁액 세포주일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 포장 세포주는 무혈청 배지에서 성장될 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구는 대상체로부터의 것일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프구는 대상체의 혈액으로부터의 것일 수 있다.
림프구, 예를 들어 NK 세포 또는 예시적인 구현예에서, T 세포를 형질도입 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한 임의의 상기 양태의 추가의 구현예는 본 명세서에서 개시된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자, 림프증식성 요소, CAR, 슈도타이핑 요소, 리보스위치, 활성화 요소, 막-결합 사이토카인, miRNA, 및/또는 다른 요소의 임의의 구현예를 포함할 수 있고, 포장 세포를 사용하여 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 본 명세서에서의 방법과 조합될 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다. T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하기 위한 그와 같은 방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 숙련가는 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)를 형질도입 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위해 본 명세서에 제공된 세부사항은 림프구 예컨대 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)을 형질도입 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한 방법에 대해 양태를 포함한, 그러한 단계(들)을 포함하는 임의의 양태에 적용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
따라서, 일 양태에서 하기를 포함하는, 단리된 혈액으로부터 림프구, 전형적으로 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입하기 위한 (및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한) 방법이 본 명세서에서 제공된다:
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하는 단계; 및
C. 생체외에서 대상체의 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 결합할 수 있고 여기에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 용이하게 할 수 있는 슈도타이핑 요소를 그것의 표면상에 포함하되, 상기 접촉은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포의 적어도 5%의 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하고, 그것에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는, 단계.
T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는 본 명세서에서 임의의 방법의 일부 구현예에서, 세포는 이전의 활성화 없이 레트로바이러스 입자와 접촉될 수 있다. T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는 본 명세서에서 임의의 방법의 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 형질도입 전에 일 구현예에서 4시간 초과 동안, 또는 또 다른 구현예에서 6시간 초과 동안, 또는 또 다른 구현예에서 8시간 초과 동안 단핵구에 부착하는 기질 상에서 인큐베이션되지 않는다. 하나의 예시적 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 형질도입 전에 단핵구를 제거하기 위해 부착 기질 상에서 밤새 인큐베이션된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 형질도입 전에 30분, 1시간, 또는 2시간 이하 동안 단핵구를 결합하는 부착 기질 상에 T 세포 및/또는 NK 세포를 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 상기 형질도입 단계 전에 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의해 단핵구를 제거하는 무 단계에 노출된다. 또 다른 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 형질도입 이전 또는 도중 소과 혈청, 예컨대 세포 배양 소과 혈청, 예를 들어 우태 혈청으로 인큐베이션되지 않거나 또는 이에 노출되지 않는다.
따라서, 또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 그것의 게놈에 포함하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와, 전형적으로 생체외 대상체의 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)를 접촉시키는 것을 포함하는, 대상체의 림프구, 예시적인 구현예에서, T 세포 및/또는 및 NK 세포 또는 T 세포 또는 NK 세포의 모집단을 유전자적으로 변형시키기 위한 또는 형질도입하기 위한 방법이 본 명세서에서 제공되되, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자를 인코딩하고, 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하되, 상기 접촉은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 또는 그것의 적어도 일부의 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성한다.
또 다른 양태에서 대상체의 림프구 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 또는 이들의 모집단을 유전자적으로 변형시키기 위한 또는 형질도입하기 위한 방법이 본 명세서에 제공되고, 상기 방법은 림프구 (예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포)에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 그것의 게놈에 포함하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와, 생체외 대상체의 림프구 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 또는 이들의 모집단을 접촉시키는 것을 포함하되, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하고, 그리고 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하되, 상기 접촉은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 림프구 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포), 또는 림프구 (예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포)의 적어도 일부의 유전자 변형 및/또는 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구 (예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포)를 생성한다.
바로 위에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구 (예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포) 또는 이들의 모집단은 대상체로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구 (예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포) 또는 이들의 모집단은 대상체로 도입 또는 재도입되기 전에 4 또는 그 미만의 생체외 세포분열을 한다. 일부 구현예에서, 림프구(들)는 1시간 내지 12시간 동안 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉하는 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 혈액이 대상체로부터 수집된 시간과 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 도입된 시간 사이에는 8시간 이하가 경과한다. 일부 구현예에서, 혈액이 수집된 후와 혈액이 도입되기 전의 모든 단계는 사람이 과정 전반에 걸쳐 폐쇄계를 모니터링하는 폐쇄계에서 수행된다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하고, 그리고 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소를 인코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 폴리펩타이드, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성이다. 특정 구현예에서, 림프증식성 요소는 IL-7 수용체 또는 이의 단편일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 또는 구성적으로 활성인 이의 단편일 수 있다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 억제성 RNA 분자는 일부 구현예에서 서로에 대해 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 5' 가닥 및 3' 가닥을 포함할 수 있되, 상기 5' 가닥 및 상기 3' 가닥은 18-25개의 뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥은 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드일 수 있고, 3' 가닥은 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥 및 3' 가닥은 동일 또는 상이한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 듀플렉스는 하나 이상의 부정합을 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, RNA 듀플렉스는 부정합을 갖지 않는다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 억제성 RNA 분자는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 분자는 miRNA의 전구체, 예컨대 예를 들어, Pri-miRNA 또는 Pre-miRNA, 또는 shRNA의 전구체일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 분자는 인공적으로 유래된 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 다른 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 siRNA로 가공된 또는 siRNA 자체인 dsRNA (전사되거나 또는 인공적으로 도입됨)일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 자연에서 발견되지 않는 서열을 갖거나 또는 자연에서 발견되지 않는 적어도 하나의 기능적 분절을 갖거나 또는 자연에서 발견되지 않는 기능적 분절의 조합을 갖는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나 또는 모두는 miR-155이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 억제성 RNA 분자는, 일부 구현예에서, 5'에서 3' 방향으로: 5' 아암, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전하게 상보적인 3' 줄기, 및 3' 아암을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 이 배열을 갖는다. 다른 구현예에서, 2 또는 그 초과의 억제성 분자의 모두가 이 배열을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 줄기는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 줄기는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암, 또는 둘 모두는 자연 발생 miRNA로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암, 또는 둘 모두는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 자연발생 miRNA로부터 유래된다: miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122, 및 miR-21. 예시적인 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암, 또는 둘 모두는 miR-155로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암, 또는 둘 모두는 Mus 무스큘러스 miR-155 또는 호모사피엔스 miR-155로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' 아암은 서열번호:256에 제시된 서열을 갖거나 또는 이들의 기능적 변이체, 예컨대, 예를 들어, 서열번호:256과 동일한 길이, 또는 서열번호: 256과 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 또는 50% 만큼 길거나 또는 100개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 95 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 90개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 85 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 80개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 75 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 70개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 65 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 60개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 55 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 45 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 40개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 35 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 30개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 또는 25 뉴클레오타이드 또는 그 미만이고; 그리고 서열번호:256에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 서열이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 서열번호:260에 제시된 서열을 갖거나 또는 이들의 기능적 변이체, 예컨대, 예를 들어, 서열번호:260과 동일한 길이, 또는 서열번호: 260과 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 또는 50% 만큼 길거나 또는 100개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 95 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 90개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 85 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 80개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 75 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 70개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 65 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 60개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 55 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 45 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 40개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 35 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 30개의 뉴클레오타이드 또는 그 미만, 또는 25 뉴클레오타이드 또는 그 미만이고; 그리고 서열번호:260에 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일한 서열이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 Mus 무스큘러스 BIC의 뉴클레오타이드 221-283을 포함한다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자는, 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열에 직렬식으로 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 직접적으로 또는 비-기능적 링커 서열(들)에 의해 간접적으로 서로에 대해 인접될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 5 내지 120개의 뉴클레오타이드, 또는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열은 2 내지 4개의 억제성 RNA 분자를 인코딩한다. 예시적인 구현예에서, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 5, 또는 3 내지 6개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 포함된다. 예시적인 구현예에서, 4개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 포함된다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자는 인트론에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 인트론은 프로모터에 있을 수 있다. 예시적인 구현예에서, 인트론은 EF-1알파 인트론 A이다. 일부 구현예에서, 인트론은, 예시적인 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 사용된 포장 세포에서 불활성, 프로모터에 인접하고 그의 다운스트림이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자는, 일부 구현예에서, 상이한 표적에 대해 지향될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 2 또는 그 초과의 억제성 RNA 분자는 동일한 표적에 대해 지향된다. 일부 구현예에서, RNA 표적은 T 세포 예컨대 비제한적으로 PD-1 (불활성화를 예방); CTLA4 (불활성화를 예방); TCRa (안전성 - 자가 면역을 예방); TCRb (안전성 - 자가 면역을 예방); CD3Z (안전성 - 자가 면역을 예방); SOCS1 (불활성화를 예방); SMAD2 (불활성화를 예방); miR-155 표적 (활성화를 증진); IFN 감마 (CRS를 감소); cCBL (신호전달을 연장); TRAIL2 (사망을 예방); PP2A (신호전달을 연장); ABCG1 (콜레스테롤의 청소능을 제한함에 의해 콜레스테롤 마이크로도메인 함량을 증가)에 의해 발현된 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 일부 구현예에서, RNA 표적은 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 성분을 인코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자의 2종 이상 중 적어도 하나는 T 세포 수용체, 예시적인 구현예에서, T 세포의 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체(들)의 발현을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 표적은 그의 게놈이 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 T 세포의 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자로부터 전사된 mRNA일 수 있다. 예시적인 구현예에서, RNA 표적은 TCRα 유전자로부터 전사된 mRNA이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하고, 그리고 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 임의의 방법에 있어서, 일부 구현예에서, CAR은 미세환경 제한된 생물학적 (MRB)-CAR이다. 다른 구현예에서, CAR의 ASTR는 종양 연관된 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR의 ASTR은 미세환경-제한된 생물학적 (MRB)-ASTR이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바로 위에서 제공된 양태로서, 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지향된 하나 이상의 (예를 들어 2 또는 그 초과의) 억제성 RNA 분자를 인코딩하고, 그리고 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하고 그리고 일부 사례에서 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 제3 핵산 서열인 임의의 방법에 있어서, 일부 구현예에서, 임의의 또는 모든 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열, 및 제3 핵산 서열은 리보스위치에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스 약물이다.
일부 구현예에서, 휴면 중인 T세포 또는 NK 세포, 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포를, 본 명세서에서 개시된 레트로바이러스 입자 및 가용성 항-CD3 항체와 25-200, 50-150, 75-125, 또는 100 ng/ml에서 상기 세포와 접촉시킴에 의해 활성화 및/또는 유전자적으로 변형시키기 위한, 그리고 전형적으로 형질도입하기 위한 방법이 제공된다. 예시적인 구현예에서, 그러한 방법은 이전 활성화 없이 수행되고, 예를 들어, 8시간 또는 그 미만, 4시간 또는 그 미만, 또는 2 내지 8시간, 2 내지 4시간, 또는 2 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.
특정양태에서, 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법이 본 명세서에 제공되고, 예시로서, 상기 방법은 하기를 포함할 수 있다:
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하는 단계;
C. 생체외에서 대상체의 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 결합할 수 있고 여기에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 용이하게 할 수 있는 슈도타이핑 요소를 그것의 표면상에 포함하되, 상기 접촉은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
D. 유전자 변형된 세포를 대상체로부터 혈액을 수집한 36, 24, 12, 또는 더욱이 8시간 이내에 상기 대상체로 재도입하고, 그것에 의해 대상체에서 입양 세포 요법을 수행하는 단계.
본 명세서에 제공된 일부 양태에서, 유사한 단계를 갖는 방법은 대상체의 림프구를 유전자적으로 변형시키고 팽창시키기 위한 방법으로 지칭된다. 숙련가는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 및 조성물에 적용되는 본 명세서에서의 논의는 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고 팽창시키기 위한 방법에도 또한 적용된다는 것을 이해할 것이다.
전형적으로, 본 개시내용의 입양 세포 요법 방법은, 세포가 세포 요법을 받는 대상체로부터, 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리는 제조되는, 자가 이전에 의해 수행된다. 따라서, 일부 양태에서, 세포는 대상체, 예를 들어, 치료의 필요성이 있는 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공에 따른 세포는 동일한 대상체에게 투여된다. 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 질환 또는 장애가 있는 대상체는 대상체의 혈액이 알려진 방법, 예컨대 정맥 천자를 사용하여 채취되는 의료 설비로 들어간다. 특정 구현예에서, 대상체로부터 채혈의 용적은 범위의 하단으로 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 또는 100 ml 내지 범위의 상단으로 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, 2000, 또는 2500 ml 사이이다. 일부 구현예에서, 10 내지 400 ml 사이가 대상체로부터 채취된다. 일부 구현예에서, 20 내지 250 mL 사이의 혈액이 대상체로부터 채취된다. 일부 구현예에서, 혈액은 가공시에 신선하다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 신선한 혈액은 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180분 미만 이전에 대상체로부터 채취된 혈액일 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액은 저장 없이 본 명세서에 제공된 방법으로 가공된다.
T 세포 및/또는 NK 세포와 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 간의 접촉은 전형적으로 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진한다. 본 개시내용 전반에 걸쳐, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외 형질도입 동안 세포 안으로 편입된 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부를 보유하는 생체외 형질도입된 세포의 자손을 포함한다. 형질도입된 세포를 "재도입하는 것"을 인용하는 본 명세서에서의 방법에서, 그러한 세포는 대상체의 혈액으로부터 수집될 때 전형적으로형질도입된 상태가 아니다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에서 개시된 임의의 양태에서 대상체는 예를 들어, 동물, 포유동물, 예시적인 구현예에서 인간일 수 있다.
이론에 의해 제한되지 않고, 비제한적인 예시적 방법에서, T 세포 또는 NK 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있는, 생체외 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포에 림프증식성 요소, 예컨대 IL7 구성적으로 활성 돌연변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전달은 숙주를 림프구 고갈할 필요 없이 생체내 팽창을 위한 드라이버를 갖는 그 세포를 제공한다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 대상체는 접촉 수행의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 이내, 또는 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월 이내, 접촉 동안, 및/또는 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 다시 재도입된 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 이내, 또는 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월 이내에 림프구 고갈 유도제에 노출되지 않는다. 게다가, 비제한적인 예시적 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자가 대상체의 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포와 접촉하는 단계 동안 및/또는 전체 생체외 방법 동안 림프구 고갈 유도제에 대상체를 노출함이 없이 수행될 수 있다.
그러므로, 대상체 생체내에서 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 팽창시키는 방법은 본 개시내용의 일부 구현예의 특징이다. 예시적인 구현예에서, 그러한 방법은 생체외 번식-없는 또는 실질적으로 번식-없는이다.
T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 대상체로 다시 혈액의 재도입을 위해 대상체로부터 채취된 혈액로부터의 이 전체 방법/과정은, 본 명세서에 비제한적인 예시적 구현예에서, 48시간 미만, 36시간 미만, 24시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간, 또는 2시간 미만의 기간에 걸쳐 발생할 수 있다. 다른 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 대상체로 다시 혈액의 재도입을 위해 대상체로부터 채취/수집된 혈액로부터의 전체 방법/과정은, 본 명세서에 비제한적인 예시적 구현예에서, 1시간 내지 12시간 사이, 또는 2시간 내지 8시간 사이, 또는 1시간 내지 3시간 사이, 또는 2시간 내지 4 시간 사이, 또는 2시간 내지 6시간 사이, 또는 4시간 내지 12시간 사이, 또는 4시간 내지 24시간 사이, 또는 8시간 내지 24시간 사이, 또는 8시간 내지 36시간 사이, 또는 8시간 내지 48시간 사이, 또는 12시간 내지 24시간 사이, 또는 12시간 내지 36시간 사이, 또는 12시간 내지 48시간 사이의 기간에 걸쳐, 또는 범위의 하단으로 15, 30, 60, 90, 120, 180, 및 240분과 범위의 상단으로 120, 180, 및 240, 300, 360, 420, 및 480분 사이의 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 대상체로 다시 혈액의 재도입을 위해 대상체로부터 채취/수집된 혈액로부터의 전체 방법/과정은, 범위의 하단으로 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 및 12시간 내지 범위의 상단으로 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 36, 또는 48시간 사이의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 접촉이 발생하는 기간 후 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로부터 분리된다.
림프구, 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포 및 NK 세포를 포함한 T 세포 및/또는 NK 세포의 채혈의 단계 및 형질도입의 단계를 포함하는 본 명세서에 임의의 방법의 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 채혈부터 형질도입까지의 방법은 일 구현예에서 4시간 초과, 또는 또 다른 구현예에서 6시간 초과, 또는 또 다른 구현예에서 8시간 초과의 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 단계를 포함하지 않는다. 일 예시적 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 채혈부터 형질도입까지의 방법은 단핵구를 제거하기 위해 부착 기질 상에서 밤새 인큐베이션을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 채혈부터 형질도입까지의 방법은 30분, 1시간, 또는 2시간 이하 동안 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 림프구, 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, T 세포 및/또는 NK 세포의 대상체로부터 채혈부터 형질도입까지의 방법은 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 무 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 림프구, 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, T 세포 및/또는 NK 세포의 대상체로부터 채혈부터 형질도입까지의 방법은, T 세포 및/또는 NK 세포가 본 방법 동안 소과 혈청, 예컨대 세포 배양 소과 혈청, 예를 들어 우태 혈청으로 인큐베이션되지 않거나 또는 이에 노출되지 않는 것을 포함한다.
림프구, 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는, T 세포 및/또는 NK 세포의 채혈의 단계 및 형질도입의 단계를 포함하는 본 명세서에 임의의 방법의 일부 구현예에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 대상체로 T 세포 및/또는 NK 세포의 재도입까지의 방법은 일 구현예에서 4시간 초과, 또는 또 다른 구현예에서 6시간 초과, 또는 또 다른 구현예에서 8시간 초과 동안의 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 단계를 포함하지 않는다. 일 예시적 구현예에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 대상체로 T 세포 및/또는 NK 세포의 재도입까지의 방법은 단핵구를 제거하기 위해 부착 기질 상에서 밤새 인큐베이션을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 대상체로 T 세포 및/또는 NK 세포의 재도입까지의 방법은 30분, 1시간, 또는 2시간 이하 동안 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 대상체로 T 세포 및/또는 NK 세포의 재도입까지의 방법은 부착 기질 상에서 인큐베이션에 의한 단핵구를 제거하는 무 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 대상체로 T 세포 및/또는 NK 세포의 재도입까지의 방법에서, T 세포 및/또는 NK 세포가 본 방법 동안 소과 혈청, 예컨대 세포 배양 소과 혈청, 예를 들어 우태 혈청으로 인큐베이션되지 않거나 또는 이에 노출되지 않는다.
생체외 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 생체내에서 이들을 팽창시키기 전에 변형시키기 위한 입양 세포 요법 및 관련된 방법에 대해 제공된 본 명세서에의 방법은 이전의 방법보다 상당히 적은 시간에 수행될 수 있기 때문에, 환자 치유 및 안전성에서의 근본적인 개선뿐만 아니라 생성물 제조성이 가능하게 된다. 따라서, 그러한 과정은 치료적 목적을 위해 생체내에서 수행될 때 그러한 과정을 승인하는 책임이 있는 관리 기관의 관점에서 양호한 것으로 기대된다. 예를 들어, 비-제한적인 예에서 대상체는, 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 환자에게 재도입되기 전에 샘플이 처리되는 전체의 시간 동안 그것의 혈액 또는 샘플을 처리하는 기기와 같은 빌딩 (예를 들어 주입 클리닉) 또는 실에 남아 있을 수 있다. 비제한적인 예시적 구현예에서, 대상체는, 대상체로부터의 혈액 채취/수집으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 상기 대상체로 혈액의 재도입까지의 전체 방법/과정 동안 가공되는 그것의 혈액 또는 세포의 부위의 라인 내에 및/또는 100, 50, 25, 또는 12피트 또는 팔의 거리 내에 남아 있다. 다른 비제한적인 예시적 구현예에서, 대상체는 깨어 있고 및/또는 적어도 하나의 사람이 가공되는 대상체의 혈액 또는 세포를, 대상체로부터의 혈액 채취/수집으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 상기 대상체로 혈액의 재도입까지의 전체 방법/과정 전반에 걸쳐 및/또는 계속해서 지속적으로 모니터링할 수 있다. 본 명세서에 제공된 개선 때문에, 대상체로부터의 혈액 채취/수집으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 상기 대상체로 혈액의 재도입까지의 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하기 위한 및/또는 입양 세포 요법에 대한 전체 방법/과정은 인간에 의한 연속적 모니터링으로 수행될 수 있다. 다른 비제한적인 예시적 구현예에서, 대상체로부터의 혈액 채취/수집으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 상기 대상체로 혈액의 재도입까지의 전체 방법/과정 어느 지점에서도 사람이 존재하지 않는 실에서 혈구 인큐베이션되지 않는다. 다른 비제한적인 예시적 구현예에서, 대상체로부터의 혈액 채취/수집으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후 상기 대상체로 혈액의 재도입까지의 전체 방법/과정은 대상체 옆 및/또는 대상체와 동일한 실 및/또는 대상체의 침대 또는 의자 옆에서 수행된다. 따라서, 샘플 동일성 섞임이 회피될 수 있을 뿐만 아니라 일 또는 주의 기간에 걸친 길고 비싼 인큐베이션이 회피될 수 있다. 이것은 본 명세서에 제공된 방법이, 대상체로 재도입될 혈액 샘플 및 그것의 성분이 단지 일회용, 단일-사용 성분과 접촉하는 폐쇄된 및 자동화 혈액 처리 시스템에 쉽게 적응할 수 있다는 사실에 의해 추가로 제공된다.
본 명세서에 제공된 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법은 전형적으로 1) 림프구, 예컨대 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)인, T 세포(들) 또는 NK 세포(들)를 형질도입하는 방법을 포함하고, 및/또는 2) 림프구, 예컨대 예시적인 구현예에서 휴면 중인 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)인, T 세포(들) 또는 NK 세포(들)를 유전자적으로 변형시키는 방법을 포함하고, 이들 둘 모두 (1 및 2)는 자체로 각각의 본 개시내용의 뚜렷한 양태를 형성한다. 그와 같은 방법은 입양 세포 요법을 수행하기 위해 본 명세서에서 확인된 다른 단계와 함께 또는 없이 수행될 수 있다. 생체외 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 본 명세서에 제공된 임의의 방법 및 입양 세포 요법을 위한 방법에서, 전형적으로, 중성구/과립구는 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전에 혈구로부터 분리된다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 말초 혈액 림프구 (PBL)를 포함한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 예를 들어, 분리반출법, 및/또는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 혈액 샘플의 다른 성분으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 중성구는 PBMC 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 가공되고, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되고, 형질도입, 또는 형질감염되기 전에 제거된다. 치료되는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다.
비-제한적인 예로서, 본 명세서에서 형질도입 또는 유전자적으로 변형시키는 방법에 대한 일부 구현예에서, PBMC는 Sepax 또는 Sepax 2 세포 가공 시스템 (BioSafe)을 사용하여 단리된다. 일부 구현예에서, PBMC는 CliniMACS Prodigy 세포 처리기 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리된다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 혈액을 채취하고, 특정 세포 유형 (예컨대, 예를 들어, PBMC)을 분리하는 장치를 통해 혈액을 통과시키고, 나머지는 대상체로 다시 복귀시키는 자동화 분리반출법 분리기가 사용된다. 밀도 구배 원심분리는 분리반출법 후에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 백혈구 감소 필터 디바이스를 사용하여 단리된다. 일부 구현예에서, 세포 표현형 (즉 양성 선택)에 따라, 예를 들어, PBL 또는 이들의 서브셋과 같은 PBMC로부터 특이적 세포 모집단을 정제하기 위해 자기 비드 활성화된 세포 분류가 그런 다음 사용된다. 정제를 위한 다른 방법, 예컨대, 예를 들어, T 세포가 동원 동안 직면하는 환경을 모방한 기질을 이용하여, 이들이 접착하고 이동하고, 또는 음성 선택되도록 하여, 원치 않는 세포가 원치 않는 세포를 표적화하는 항체 복합체로 제거를 위해 표적화되는, 기질 접착이 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 정제하기 위해 적혈구 로셋팅이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 임의의 관련된 양태의 일부 예시적 구현예에서, PBL은 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 본 명세서에서 특정 구현예 동안, 예를 들어 림프구를 변형시키는 방법 및 입양 세포 요법을 수행하는 방법에서 본 개시내용의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 접촉된 T 세포 및/또는 NK 세포는 주로 휴면 중인 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 95 내지 100% 휴지기 세포 (Ki-67-)로 구성된다. 일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 접촉되는 T 세포 및/또는 NK 세포는 범위의 하단으로 90, 91, 92, 93, 94, 및 95% 휴지기 세포 내지 범위의 상단으로 96, 97, 98, 99, 또는 100% 휴지기 세포 사이를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 미접촉 세포를 포함한다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 생체외 접촉되어 대상체로 재도입된 경우 대상체에서 표적화된 면역 반응을 이끌어내기 위해 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자적으로 변형한다. 접촉의 기간 동안, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포를 확인하고 결합하며 이시점에서 레트로바이러스 및 숙주 세포막은 융합하기 시작한다. 그런 다음 형질도입의 과정에 걸쳐, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로부터의 유전 물질은 T 세포 및/또는 NK 세포 안으로 도입되고 숙주 세포 DNA 안으로 편입된다. 렌티바이러스 형질도입의 방법이 공지되어있다. 예시적인 방법은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다: [Wang 등 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701]; [Cooper 등 (2003) Blood. 101:1637-1644]; [Verhoeyen 등 (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114]; 및 [Cavalieri 등 (2003) Blood. 102(2): 497-505].
본 명세서에 제공된 많은 방법은 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 포함한다. 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자, 예컨대 복제불능 재조합 렌티바이러스 입자로 생체외 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 본 명세서에 제공된 방법은, 예시적인 구현예에서, 생체외 자극 또는 활성화를 요하지 않는다. 따라서, 이전의 방법에서의 이 일반 단계는, 생체외 자극 분자(들) 예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 비드가 형질도입 동안 존재할 수 있지만, 본 방법에서는 회피될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 제공된 예시적 방법에는, 생체외 자극이 요구되지 않는다. 특정 예시적인 방법에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자, 예를 들어 렌티바이러스의 3 내지 10 사이의 감염의 다중도 (MOI), 및 일부 구현예에서, 5 내지 10 사이의 MOI 단위가 사용될 수 있다.
형질도입 반응은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 폐쇄계, 예컨대 Sepax 시스템에서 수행될 수 있되, 형질도입 반응은 시스템 상에 장입된 일회용 백에서 수행될 수 있다. 대상체로부터 수집된 혈액 샘플로부터의 혈구, 예컨대 PBMC는 이들 혈구가 전형적으로 접촉 단계 (즉 형질도입 반응) 동안 존재하지 않는, 중성구를 포함한 과립구로부터 분리, 단리, 및/또는 정제되고 바로 백에서, 본 명세서에서 개시된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉될 수 있다.
복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 단리된 PBMC를 함유하는 백안으로 도입될 수 있고, 그것에 의해 PBMC와 접촉한다. 대상체로부터의 채혈에서부터 혈구, 예컨대 PBMC가 형질도입 반응 백에 첨가되는 시간까지의 시간은 30분 내지 4시간 사이, 30분 내지 2시간 사이, 또는 일부 예에서 대략 1시간일 수 있다. 첨가제 예컨대 배지, 인간 혈청 알부민, 인간 AB+ 혈청, 및/또는 대상체로부터 유래된 혈청이 형질도입 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 생체외 과정에 대해 당해 분야에서 알려진 것들과 같은 배지 (비-제한적인 예로서, X-VIVO 15 (Lonza) 또는 CTS 배지 (Thermo Fisher Scientific)가 전형적으로 존재한다. IL2, IL7, 또는 IL15, 또는 HSA에서 발견된 것들과 같은, 지지적 사이토카인이 형질도입 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
형질도입 반응 혼합물은 23 내지 39℃, 그리고 일부 예시적 구현예에서 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 특정 구현예에서, 형질도입 반응은 더 빠른 융합/형질도입을 위해 37-39℃에서 수행될 수 있다. dGTP는 형질도입 반응에 첨가될 수 있다. 형질도입 반응 혼합물은 그러한 세포 시험관내, 생체외 연구될지 또는 대상체로 도입될 지에 무관하게 세척이 수행되기 전 1 내지 12시간, 그리고 일부 구현예에서, 6 내지 12시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 따라서, 세포가 형질도입 후 대상체로 주입되는 특정 구현예에서, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 다시 주입되기 전, 세포는 대상체로 다시 주입되기 전에 형질도입 반응 혼합물을 제거하기 위해 세정된다. 예를 들어, 시스템, 예컨대 Sepax 기기가, 형질도입된 세포가 대상체로 다시 주입되기 전, 예를 들어 10-50 mL의 세정액으로 세포를 세정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 중성구는 PBMC 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 가공되고, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되고, 형질도입되거나, 또는 형질감염되기 전에 제거된다.
입양 세포 요법을 수행하기 위한 예시적인 구현예에서, 혈액은 대상체로부터 혈액 백으로 수집되고 그리고 혈액 백은 세포 가공 시스템 예컨대 Sepax 세포 가공 시스템에 부착된다.
세포 가공 시스템을 사용하여 단리된 PBMC는 백으로 수집되고, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질전환하기에 충분한 조건에서 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되고, 그리고 인큐베이션된다. 인큐베이션 후, PBMC와 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 혼합물을 함유하는 백은 세포 가공 시스템에 부착되고 PBMC는 세정된다. 세정된 PBMC는 백으로 수집되고 대상체로 재주입된다. 일부 구현예에서, 혈액을 수집하는 것으로부터 형질도입된 T 및/또는 NK 세포를 재주입하는 것까지의 전체 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간 이내에 수행된다. 예시적인 구현예에서, 전체 방법은 12시간 이내에 수행된다.
일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 대한 표적 세포는 PBL이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 헬퍼 T 세포 및/또는 킬러 T 세포이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 여기에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 용이하게 할 수 있는 슈도타이핑 요소를 그것의 표면상에 갖는다. 다른 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있는 활성화 요소를 그것의 표면상에 갖는다. 또 다른 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 막-결합 사이토카인을 그것의 표면상에 갖는다. 일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 그 중 하나 이상은 하나 이상의 림프증식성 요소를 포함한다. 다른 구현예에서, 2개의 신호전달 폴리펩타이드가 이용되는 경우, 하나는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하고 다른 것은 전형적으로 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 본 명세서에서 나타난 바와 같이, 본 명세서에 제공된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면과 전형적으로 연관된 활성화 요소(들)은 충분한 기간 동안 적절한 조건하에서 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포와 접촉할 수 있고, 접촉하는 결과로 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킨다. 그러한 활성화는 본 명세서에서 방법의 접촉 단계 동안 경시적으로 발생하는 것이 이해될 것이다. 게다가, 본 명세서에서 방법에서, 슈도타이핑 요소가 T 세포 및/또는 NK 세포를 결합하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 발견되는 일부 구현예에서, 활성화는 슈도타이핑 요소의 결합에 의해 유도될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 활성화 요소는 이들 구현예에서 선택적이다.
슈도타이핑 요소, 활성화 요소, 막-결합 사이토카인, 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 림프증식성 요소, 및 CAR에 관한 추가의 세부사항은 본 명세서에서 다른 부문에 제공되어 있다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 혈액으로부터 수집된 총 림프구 중 5% 내지 90%가 형질도입된다. 일부 구현예에서, 형질도입되는 림프구의 퍼센트는 범위의 하단으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60% 내지 범위의 상단으로 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 및 90% 사이이다. 일부 구현예에서, 형질도입되는 림프구의 퍼센트는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60%이다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 추가의 생체외 조작, 예컨대 T 세포 및/또는 NK의 자극 및/또는 활성화 없이 대상체로 다시 도입되거나, 재도입되거나, 또는 재주입된다. 선행 기술 방법에서, 대상체로 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 도입하기에 앞서 T 세포 및/또는 NK 세포의 자극/활성화를 위해, 및 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 팽창을 위해 생체외 조작이 사용된다. 선행 기술 방법에서, 이것은 일반적으로 일 또는 주 동안 일어나고 초기 혈액 채취 일 또는 주 후 혈액 주입을 위해 클리닉으로 대상체가 되돌아올 것을 필요로 한다. 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는, T 세포 및/또는 NK 세포를 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키기 전에, 항-CD3/항-CD28 고형 지지체 예컨대, 예를 들어, 항-CD3/항-CD28로 코팅된 비드에 대한 노출에 의해 생체외 자극되지 않는다. 그와 같이 생체외 번식-없는 방법이 본 명세서에 제공된다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외 팽창되지 않거나, 또는 단지 작은 수의 세포 분열 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 라운드의 세포 분열)을 위해서만 팽창되지만, 생체내, 즉 대상체 내에서 더욱 팽창, 또는 우세하게 팽창된다. 일부 구현예에서, 세포의 추가의 팽창을 허용하기 위한 추가의 배지는 첨가되지 않는다. 일부 구현예에서, PBL이 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되는 동안 PBL의 세포 제조는 일어나지 않는다. 예시적인 구현예에서, PBL이 생체외에 있는 동안 PBL의 세포 제조는 일어나지 않는다. 입양 세포 요법의 이전의 방법에서, 대상체는 유전자 변형된 T 세포 및또는 NK 세포로 재주입 이전에 림프구 고갈되었다. 일부 구현예에서, 환자 또는 대상체는 혈액이 채취되기 이전에 림프구 고갈되지 않는다. 일부 구현예에서, 환자 또는 대상체는 유전자 변형된 T 세포 및또는 NK 세포로 재주입 이전에 림프구 고갈되지 않는다.
본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 대상체로 재주입되는 T 세포 및/또는 NK 세포의 수는 범위의 하단으로 1 x 103, 2.5 x 103, 5 x 103, 1 x 104, 2.5 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 및 1 x 107 세포/kg 내지 범위의 상단으로 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 및 1 x 108 세포/kg 사이일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 대상체로 재주입되는 T 세포 및/또는 NK 세포의 수는 범위의 하단으로 1 x 104, 2.5 x 104, 5 x 104, 및 1 x 105 세포/kg 내지 범위의 상단으로 2.5 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 및 1 x 106 세포/kg 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체로 재주입되는 PBL의 수는 범위의 하단으로 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 및 1 x 108 세포 및 범위의 상단으로 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2.5 x 108, 5 x 108, 및 1 x 109 세포보다 적을 수 있다. 일부 구현예에서, 70kg 대상체 또는 환자에게로 재주입에 대해 이용가능한 T 세포 및/또는 NK 세포의 수는 7 x 105 내지 2.5 x 108 세포 사이이다. 다른 구현예에서, 형질도입에 대해 이용가능한 T 세포 및/또는 NK 세포의 수는 대략 7 x 106 플러스 또는 마이너스 10%이다.
본 명세서에서 개시된 방법에서, 채혈로부터 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 재주입까지 전체 입양 세포 요법 절차는 유익하게는 이전의 방법보다 단시간에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 입양 세포 요법 절차는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간 미만에서 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 전체 입양 세포 요법 절차는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 미만에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 입양 세포 요법 절차는 범위의 하단으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 15시간 내지 범위의 상단으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간 사이에서 수행될 수 있다.
본 명세서에서의 일부 구현예에서, PBMC를 처리하기 위해, 예를 들어 PBMC, NK 세포 및 예시적인 구현예에서 T 세포를 예를 들어 PBMC 또는 이들의 서브셋(들)을 형질도입함에 의해, 유전자적으로 변형시키는 것을 포함하는 방법에서 폐쇄계가 사용된다. 그와 같은 방법은 과학적 연구, 상업 생산, 또는 치료 방법에서 사용되는 림프구를 유전자적으로 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 방법은 NK 세포, T 세포, 또는 둘 모두, 그리고 일부 구현예에서 휴면 중인 T 세포, 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 용기로부터 폐쇄계 내의 형질도입 반응 혼합물 안으로 이송시키는 것을 포함할 수 있고, 따라서 환경 노출 없이 된다. 용기는, 예를 들어, 튜브, 백, 주사기, 또는 다른 컨테이너일 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 연구 설비에서 사용되는 용기이다. 일부 구현예에서, 용기는 상업 생산에서 사용되는 용기이다. 다른 구현예에서, 용기는 채혈 과정에 사용된 수집 용기일 수 있다. 본 명세서에서 유전자적으로 변형시키기 위한 방법은 전형적으로 림프구가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되는 접촉 단계를 포함한다. 접촉은 일부 구현예에서 용기에서, 예를 들어, 혈액 백 내에서 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, PBMC 또는 이들의 아분획은 접촉을 위해 폐쇄계 내에서 일 용기로부터 또 다른 용기로 (예를 들어 제1 용기로부터 제2 용기로) 이전될 수 있다. 제2 용기는 폐쇄된 디바이스, 예컨대 G-Rex 디바이스의 세포 가공 구획일 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉 후 유전자 변형된 (예를 들어 형질도입된) 세포는 폐쇄계 내의 상이한 용기로 (즉 환경에 대한 노출 없이) 이전될 수 있다. 이 이전 전 또는 후, 세포는 폐쇄계에서 전형적으로 세정되어 실질적으로 전부 또는 모든 레트로바이러스 입자를 제거한다. 일부 구현예에서, 접촉 (예를 들어 형질도입)이 접촉 후 세포를 세정하는 것을 통해 일어날 용기 안으로, PBMC 또는 이들의 분획의 이전으로부터 이 단락에서 개시된 과정은 12시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서 이것은 범위의 하단으로 1, 2, 3, 또는 4시간 내지 범위의 상단으로 4, 8, 10, 또는 12시간 사이에서 수행된다.
본 명세서에서 제공된 일부 구현예에서, 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하는 단계, T 세포 및/또는 NK 세포를 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계, 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체로 도입하는 단계는 폐쇄계에서 일어난다. 폐쇄계는 오염에 대해 일반적으로 폐쇄되거나 또는 완전하게 폐쇄된 배양물 과정이다. 이와 같이, 그러한 시스템 또는 과정은 세포를 환경에 대해 노출시키지 않는다. 본 발명의 이점은 폐쇄계에서 CAR 요법을 수행하는 방법이 본 명세서에 제공된다는 것이다. 세포 가공 절차에서 안전성 및 규제 제어에 대해 가장 큰 위험 중 하나는 전통적 개방 세포 배양 시스템에서 발견되는 바와 같이 환경에 대한 빈번한 노출을 통한 오염의 위험이다. 특히 항생제의 부재에서, 이 위험을 완화시키기 위해, 일회용 (단일-사용) 장비의 사용에 초점을 맞춘 일부 상업적 과정이 개발되었다. 그러나 무균성 조건하에서 이의 사용 조차도, 샘플링하거나 또는 추가의 성장 배지를 부가하기 위한 플라스크의 개방으로부터 오염의 위험이 항상있다. 이 문제를 극복하기 위해, 폐쇄된-시스템 과정이 본 명세서에 제공되고, 본 과정은 생성물이 외부의 환경에 노출되지 않도록 설계되고 작동될 수 있다. 이것은 외부 환경이 전형적으로 멸균되지 않기 때문에 중요하다. 물질 이송은 멸균 연결부 또는 튜브 용접을 통해 일어난다. 가스 교환용 공기는 가스 투과막을 통하거나 또는 다른 첨가와 마찬가지로, 0.2 μm 필터를 통해 일어나 환경 노출을 방지한다.
일부 구현예에서, 폐쇄계는 혈액이 채취되고 그 다음 대상체로 다시 도입되기 전에 생체외 순환계로 순환되도록 대상체의 생체내 순환계에 연결된 생체외 순환 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 생체외 순환계는, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 세포를 노출시키기 위한 시스템 또는 장치와 조합하여, PBL을 분리하기 위한 시스템 또는 장치 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 분리하기 위한 시스템 또는 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 폐쇄계는 T 세포 및/또는 NK 세포가 공기에 노출되도록 하지 않는다.
그러한 폐쇄계 방법은 상업적으로 입수가능한 디바이스로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 폐쇄계 T 세포 생산에 적합한 디바이스에서 수행될 수 있다. 그와 같은 디바이스는 G-Rex™, WAVE 생물반응기™, OriGen PermaLife™ 백, 및 VueLife® 백을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 대상체 내에서 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 그 안에 존재하는 생체내 조절 요소에 결합하는 화합물에 노출되되, 상기 조절 요소는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 도입된 유전 물질의 일부이다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 리보스위치일 수 있고 화합물은 리보스위치의 압타머 도메인에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 분자 차페론일 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 화합물은 뉴클레오사이드 유사체일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물일 수 있되, 항바이러스 약물은 항바이러스 치료를 위해 식품의약품국에 의해 승인된 화합물이거나 또는 미국에서 항바이러스 임상 시험에 있는 화합물이다. 예시적인 구현예에서, 화합물은 아사이클로비르 또는 펜시클로비르일 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 팜사이클로비르, 펜시클로비르, 또는 발라시클로비르의 경구 전구약물, 아사이클로비르의 경구 전구약물일 수 있다. 조절 요소에 화합물의 결합은 도입된 유전물질의 발현 및 그러므로, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 번식에 영향을 준다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물, 예를 들어 아사이클로비르, 발라시클로비르, 펜시클로비르 또는 팜사이클로비르는 대상체의 혈액으로부터 단리된 PBL 이전에, 이와 동반하여 및/또는 이후에 그리고 T 세포 및/또는 NK 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전에 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물은 혈액으로부터 단리된 PBL 이전에 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 이전에 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 사이에 대상체에 투여된다. 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물은 PBL이 혈액으로부터 단리되고 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법으로 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 사이에 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물은 PBL이 혈액으로부터 단리되고 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법으로 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물은 PBL이 대상체로 재주입된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 또는 규정되지 않은 기간 동안 대상체에 투여된다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 또는 전구약물은 PBL의 재주입 전 및/또는 동안 및/또는 PBL이 재주입된 후 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 조절 요소에 결합하는 화합물은 대상체에게 매일 1회, 2회, 3회, 또는 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체가 질환이 없는, 예컨대 암이 없거나, 또는 규정되지 않게 될 때까지, 화합물의 1일 용량이 1주, 2주, 4주, 3개월, 6개월, 1년 동안 제공된다. 약물은, 예시적인 구현예에서, 본 명세서에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 리보스위치에 결합하는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물이다.
소분자이든 생물제제이든 약물을 전달하기 위한 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 임의의 그러한 방법이 본 발명의 방법에 사용하기 위한 약물 또는 후보 화합물 또는 항체를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일반 투여 경로는 비-침습성 경구 (입을 통함), 국소 (피부), 경점막 (비강, 볼/설하, 질, 안구 및 직장) 및 흡입 경로를 포함한다. 많은 단백질 및 펩타이드 약물, 예컨대 단클론성 항체는 주사 또는 나노니들 어레이로 전달되어야 한다. 예를 들어, 많은 면역화가 단백질 약물의 전달에 기반되고 종종 주사로 수행된다.
조작된 신호전달 폴리펩타이드(들)
일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 접촉하기 위해 사용된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, 하나 이상의 세포내 활성화 도메인, 하나 이상의 조절 도메인 (예컨대 공통 자극 도메인), 및 하나 이상의 T 세포 생존 모티프와 조합된, 세포외 도메인 (예를 들어 항원-특이적 표적화 영역 또는 ASTR), 선택적인 줄기 및 막관통 도메인의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나, 두 개, 또는 모든 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 키메라 림프증식성 요소 (CLE)를 포함한 림프증식성 요소이다. 일부 구현예에서, 2개의 신호전달 폴리펩타이드가 이용된 경우, 하나는 림프증식성 요소를 인코딩하고 다른 것은 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩한다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물에 대해 유사한 또는 비유사 조절 요소를 갖는 뚜렷한 폴리뉴클레오타이드 상에 림프증식성 요소 및 CAR을 두는 시스템을 구상할 수 있을 것이다. 숙련가는 그러한 조작된 폴리펩타이드가 또한 재조합 폴리펩타이드로 지칭될 수 있음을 인지할 것이다.
세포외 도메인
일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 특이적 결합 쌍의 구성원인 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 사이토카인 수용체, 또는 이들의 돌연변이체, 또는 호르몬 수용체, 또는 이들의 돌연변이체의 세포외 도메인일 수 있다. 그와 같은 돌연변이체 세포외 도메인은 일부 구현예에서 적어도 일부 세포 유형으로 발현될 때 구성적으로 활성인 것으로 보고되었다. 예시적인 구현예에서, 그러한 세포외 및 막관통 도메인은 리간드 결합 영역을 포함하지 않는다. 그러한 도메인은 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 존재하고 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 발현될 때 리간드를 결합하지 않는 것으로 여겨진다. 그러한 수용체 돌연변이체에서의 돌연변이는 세포외 병치막 영역에서 발생할 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 본 명세서에 제공된 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 적어도 일부 세포외 도메인 (및 일부 세포외-막관통 도메인)에서 돌연변이는 정상적으로 함께 하지 않는 활성화 사슬을 함께 이동함에 의해, 리간드의 부재에서 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 신호전달을 책임진다. 세포외 도메인에 돌연변이를 포함하는 세포외 도메인에 관한 추가의 구현예는, 예를 들어 본 명세서에서 림프증식성 요소 부문에서 볼 수 있다.
특정 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. 예시적인 구현예에서 이량체화 모티프는 류신 지퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어 c-jun으로부터의 것이다. 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인에 관한 추가의 구현예는, 예를 들어 본 명세서에서 림프증식성 요소 부문에서 볼 수 있다.
특정 구현예에서, 세포외 도메인은, 때때로 본 명세서에서 항원 결합 도메인으로 불리는, 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR)이다. 특이적 결합 쌍은, 비제한적으로, 항원-항체 결합 쌍; 리간드-수용체 결합 쌍; 및 동종의 것을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 특이적 결합 쌍의 구성원은 항체, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 수용체의 리간드 결합 도메인, 및 아피바디인 ASTR을 포함한다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 ASTR은 임의의 항원-결합 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 구현예에서, ASTR은 항체 예컨대 전장 항체, 단일-사슬 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일-사슬 항체 또는 디아바디이다.
일부 구현예에서, ASTR은 단일 사슬 Fv (scFv)이다. 일부 구현예에서, 중쇄는 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 경쇄의 N-말단에 배치된다. 다른 구현예에서, 경쇄는 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 중쇄의 N-말단에 배치된다. 임의의 개시된 구현예에서, 중쇄 및 경쇄는 본 명세서에서 더 상세히 논의된 바와 같이 링커에 의해 분리될 수 있다. 임의의 개시된 구현예에서, 중쇄 또는 경쇄는 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 수 있고, 전형적으로 또 다른 도메인, 예컨대 신호서열 또는 펩타이드의 C-말단에 있다.
다른 항체-기반 인식 도메인 (cAb VHH (낙타과 항체 가변 도메인) 및 인간화된 버전, IgNAR VH (샤크 항체 가변 도메인) 및 인간화된 버전, sdAb VH (단일 도메인 항체 가변 도메인) 및 "낙타화된" 항체 가변 도메인은 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 사용한 방법 및 조작된 신호전달 폴리펩타이드로 사용하기에 적합하다. 일부사례에서, T 세포 수용체 (TCR)계 인식 도메인 예컨대 단일 사슬 TCR (scTv, 단일 사슬 2-도메인 TCR 함유 VαVβ)이 또한 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, ASTR은 다중 특이적, 예를 들어 이중 특이적 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 일 표적 항원에 대한 것이고 다른 것은 또 다른 표적 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중 특이적 항체는 ta 표적 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중 특이적 항체는 또한 표적 항원을 발현하는 세포로 세포독성 약물을 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중 특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 ASTR은 다양한 항원-결합 특이성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 항원-결합 도메인은 표적 세포에 의해 발현된 (합성된) 항원에 존재하는 에피토프에 대해 특이적이다. 일 예에서, 표적 세포는 암 세포 연관된 항원이다. 암 세포 연관된 항원은, 예를 들어, 유방암 세포, B 세포 림프종, 호지킨림프종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종, 폐암 세포 (예를 들어, 소세포폐암 세포), 비-호지킨 B-세포 림프종 (B-NHL) 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종 세포, 폐암 세포 (예를 들어, 소세포폐암 세포), 흑색종 세포, 만성림프구성 백혈병 세포, 급성림프구성 백혈병 세포, 신경교세포종 세포, 신경아교종, 교모세포종, 수모세포종, 결장직장암 세포, 등과 연관된 항원일 수 있다. 암 세포 연관된 항원은 또한 비-암성 세포에 의해 발현될 수 있다.
조작된 신호전달 폴리펩타이드의 ASTR이 결합할 수 있는 항원의 비-제한적인 예는, 예를 들어, CD19, CD20, CD38, CD30, ERBB2, CA125, MUC-1, 전립선-특이적 막항원 (PSMA), CD44 표면 접착 분자, 메소텔린, 암종배아 항원 (CEA), 표피성장 인자 수용체 (EGFR), EGFRvIII, 혈관내피성장 인자 수용체-2 (VEGFR2), 고분자량-흑색종 연관된 항원 (HMW-MAA), MAGE-Al, IL-13R-a2, GD2, Axl, Ror2, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 특이적 결합 쌍의 구성원은 수용체에 대한 리간드인 ASTR이다. 리간드는, 비제한적으로, 호르몬 (예를 들어 에리트로포이에틴, 성장 호르몬, 렙틴, 등); 사이토카인 (예를 들어, 인터페론, 인터류킨, 특정 호르몬, 등); 성장 인자 (예를 들어, 헤레굴린; 혈관내피성장 인자 (VEGF); 등); 인테그린-결합 펩타이드 (예를 들어, 서열 Arg-Gly-Asp을 포함하는 펩타이드); 및 기타 동종의 것을 포함한다.
조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 특이적 결합 쌍의 구성원이 리간드인 경우, 본 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 특이적 결합 쌍의 제2 구성원의 존재에서 활성화될 수 있되, 상기 특이적 결합 쌍의 제2 구성원은 리간드에 대한 수용체이다. 예를 들어, 리간드가 VEGF인 경우, 특이적 결합 쌍의 제2 구성원은 가용성 VEGF 수용체를 포함한 VEGF 수용체일 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 포함된 특이적 결합 쌍의 구성원은 수용체, 예를 들어, 리간드에 대한 수용체, 공-수용체, 등인 ASTR이다. 수용체는 수용체의 리간드-결합 단편일 수 있다. 적합한 수용체는, 비제한적으로, 성장인자 수용체 (예를 들어, VEGF 수용체); 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 K, 구성원 1 (NKG2D) 폴리펩타이드 (마이카, MICB, 및 ULB6에 대한 수용체); 사이토카인 수용체 (예를 들어, IL-13 수용체; IL-2 수용체; 등); CD27; 천연 세포독성 수용체 (NCR) (예를 들어, NKP30 (NCR3/CD337) 폴리펩타이드 (HLA-B-연관된 전사체 3 (BAT3) 및 B7-H6); 등에 대한 수용체); 등을 포함한다.
ASTR을 포함하는 본 명세서에 제공된 임의의 양태의 특정 구현예에서, ASTR은 표적 세포 상에 발현된 표적 분자와 ASTR을 연결하는 중간 단백질에 대해 지향될 수 있다. 중간 단백질은 내인성으로 발현되거나 또는 외인성으로 도입될 수 있고 천연일 수 있거나, 조작될 수 있거나, 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예에서 적어도 하나의 태깅된 중간체, 전형적으로 항체-태그 콘주게이트가 ASTR에 의해 인식된 태그와 표적 세포 상에 발현된 표적 분자, 전형적으로 단백질 표적 사이에 포함되도록, ASTR은 항-태그 ASTR일 수 있다. 따라서, 그와 같은 구현예에서, ASTR은 태그를 결합하고 및 상기 태그는 표적 세포, 예컨대 암세포 상의 항원에 대하여 지향된 항체에 접합된다. 태그의 비-제한적인 예는 플루오레세인이소티오시아네이트 (FITC), 스트렙타비딘, 바이오틴, 히스티딘, 디니트로페놀, 페리디닌클로로필 단백질 복합체, 녹색 형광 단백질, 파이코에리트린 (PE), 말무페록시다아제, 팔미토일화, 니트로실화, 알칼리성포스파타제, 글루코스옥시다제, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다. 이와 같이, ASTR은 태그를 결합하는 분자를 포함한다.
줄기
일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 세포 외부에 있고 ASTR과 막관통 도메인 사이에 개재된 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 일부분 내에 위치한 줄기를 포함한다. 일부 경우에, 줄기는 야생형 CD8 줄기 영역 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA (서열번호:79)에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 가지거나, 야생형 CD28 줄기 영역 (FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열번호:80))에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 가지거나, 또는 야생형 면역글로불린 중쇄 줄기 영역에 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일성을 가진다. 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서, 이용된 줄기는 항원-특이적 표적화 영역, 및 전형적으로 전체 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 표적 항원에 대한 증가된 결합을 보유하게 한다.
줄기 영역은 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산, 예를 들어, 약 4 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa 내지 약 50 aa의 길이를 가질 수 있다.
일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 줄기는 적어도 하나의 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 줄기는 서열 Cys-Pro-Pro-Cys (서열번호:62)을 포함할 수 있다. 존재할 경우, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 줄기 내 시스테인은 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서의 줄기와 디설파이드 결합을 형성하도록 이용가능할 수 있다.
줄기는 당해 기술에 공지되어 있는 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Tan 등 (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:162]; 및 [Huck 등 (1986) Nucl . Acids Res. 14:1779] 참고. 비-제한적인 예로서, 면역글로불린 힌지 영역은 임의의 하기 아미노산 서열 중 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: DKTHT (서열번호:63); CPPC (서열번호:62); CPEPKSCDTPPPCPR (서열번호:64) (예를 들어, 문헌 [Glaser 등 (2005) J. Biol . Chem . 280:41494] 참고); ELKTPLGDTTHT (서열번호:65); KSCDKTHTCP (서열번호:66); KCCVDCP (서열번호:67); KYGPPCP (서열번호:68); EPKSCDKTHTCPPCP (서열번호:69) (인간 IgGl 힌지); ERKCCVECPPCP (서열번호:70) (인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열번호:71) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ (서열번호:72) (인간 IgG4 힌지); 및 기타 동종의 것. 줄기는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역인, 힌지 영역을 포함할 수 있다. 줄기는 야생형 (자연발생) 힌지 영역에 비교될 때 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG 1 힌지의 His229는 Tyr으로 치환될 수 있고, 따라서 줄기는 서열 EPKSCDKTYTCPPCP (예를 들어, 문헌 [Yan 등 (2012) J. Biol . Chem . 287:5891] 참고)을 포함한다. 줄기는 인간 CD8로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다; 예를 들어, 줄기는 아미노산 서열: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열번호:73), 또는 그것의 변이체를 포함할 수 있다.
막관통 도메인
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 진핵 세포막으로 삽입을 위한 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 ASTR과 공통 자극 도메인 사이에 개재될 수 있다. 막관통 도메인은 키메라 항원 수용체가 아미노 말단 (N-말단)으로부터 카복실 말단 (C-말단)으로: ASTR; 줄기; 막관통 도메인; 및 활성화 도메인 순서로 포함하도록 줄기와 공통 자극 도메인 사이에 개재될 수 있다.
진핵 (예를 들어, 포유동물) 세포의 세포막 안으로 폴리펩타이드의 삽입을 제공하는 임의의 막관통 (TM) 도메인은 본 명세서에서 개시된 양태 및 구현예에서 사용하기에 적합하다. 본 명세서에서 제공된 임의의 양태 또는 구현예에 적합한 TM 도메인의 비-제한적인 예는 임의의 하기 TM 도메인 또는 조합된 줄기와 TM 도메인 중 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함한다: a) CD8 알파 TM (서열번호:46); b) CD8 베타 TM (서열번호:47); c) CD4 줄기 (서열번호:48); d) CD3Z TM (서열번호:49); e) CD28 TM (서열번호:50); f) CD134 (OX40) TM: (서열번호:51); g) CD7 TM (서열번호:52); h) CD8 줄기 및 TM (서열번호:75); 및i) CD28 줄기 및 TM (서열번호:76).
비-제한적인 예로서, 본 발명의 양태의 막관통 도메인은 서열번호:46 막관통 도메인, CD8 베타 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD3 제타 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CD134 막관통 도메인, 또는 CD7 막관통 도메인에 대해 적어도 80, 90, 또는 95% 서열 동일성을 가질 수 있다.
세포내 활성화 도메인
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 활성화될 때, 전형적으로 하나 이상의 사이토카인의 생산; 증가된 세포사; 및/또는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, NKT세포, γδ T 세포, 및/또는 중성구의 증가된 증식을 유도한다. 도메인을 활성화시키는 것은 또한 본 명세서에서 활성화 도메인으로 지칭될 수 있다. 도메인을 활성화시키는 것은 본 명세서에 제공된 CAR 또는 림프증식성 요소에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 아래에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 등) ITAM 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 양태의 세포내 활성화 도메인은 아래에 기재된 바와 같이 CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCERlG, FCGR2A, FCGR2C. DAP10/CD28, 또는 ZAP70 도메인에 적어도 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)-함유 세포내 신호전달 폴리펩타이드를 포함한다. ITAM 모티프는 YX1X2L/I로서, X1및 X2는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 세포내 활성화 도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 경우에, ITAM 모티프는 세포내 활성화 도메인에서 2회 반복되되, ITAM 모티프의 제1 및 제2 사례는 6 내지 8개의 아미노산, 예를 들어, (YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I)에 의해 서로로부터 분리되되, n은 6 내지 8의 정수이고, 각각의 6 내지 8개의 X3은 임의의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 세포내 활성화 도메인은 3개 ITAM 모티프를 포함한다.
적합한 세포내 활성화 도메인은 ITAM 모티프를 함유하는 폴리펩타이드로부터 유래된 ITAM 모티프-함유 부분일 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 임의의 ITAM 모티프-함유 단백질로부터의 ITAM 모티프-함유 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 그것이 유래되는 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요는 없다. 적합한 ITAM 모티프-함유 폴리펩타이드의 예는, 비제한적으로: CD3Z (CD3 제타); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD79A (항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬); DAP12; 및 FCERlG (Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬)를 포함한다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬 (CD3Z, T 세포수용체 T3 제타 사슬, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, 등으로도 알려짐)로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나 (2 동형체)의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI ] GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR(서열번호:11)또는MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:12), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:13); RVKFSRSADAPAYQQGQNQL[YNELNLGRREEYDVL]DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMKGERRRGKGHDGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQALPPR (서열번호:81); NQL[YNELNLGRREEYDVL]DKR 서열번호:14); EGL[YNELQKDKMAEAYSEI]GMK (서열번호:15);또는 DGL[YQGLSTATKDTYDAL]HMQ (서열번호:16), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬 (CD3D; CD3-델타; T3D; CD3 항원, 델타 서브유닛; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩타이드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타사슬; T 세포 수용체 T3 델타 사슬; T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬; 등으로도 알려짐)로부터 유래된다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK (서열번호:17) 또는 MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRTADTQALLRNDQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGNWARNK (서열번호:18), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 델타 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: DQV[YQPLRDRDDAQYSHL]GGN(서열번호:19), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬 (CD3e, T 세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 사슬, T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬, AI504783, CD3, CD3 엡실론, T3e, 등으로도 알려짐)으로부터 유래된다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPD[YEPIRKGQRDLYSGL]NQRRI (서열번호:20), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 엡실론 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: NPD[YEPIRKGQRDLYSGL ] NQR(서열번호:21), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 T 세포 표면 당단백질 CD3 감마 사슬 (CD3G, T 세포 수용체 T3 감마 사슬, CD3-감마, T3G, 감마 폴리펩타이드 (TiT3 복합체), 등으로도 알려짐)로부터 유래된다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL[YQPLKDREDDQYSHL]QGNQLRRN (서열번호:22), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD3 감마 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: DQL[YQPLKDREDDQYSHL ] QGN(서열번호:23), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 CD79A (B-세포 항원 수용체 복합체-연관된 단백질 알파 사슬; CD79a 항원 (면역글로불린-연관된 알파); MB-1 막 당단백질; Ig-알파; 막-결합 면역글로불린-연관된 단백질; 표면 IgM-연관된 단백질; 등으로도 알려짐)로부터 유래된다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열번호:24) 또는 MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL[YEGLNLDDCSMYEDI]SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (서열번호:25), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 CD79A 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: ENL[YEGLNLDDCSMYEDI ] SRG (서열번호:26), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 DAP12 (또한 TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-연관된 단백질; TYRO단백질 티로신 키나제-결합 단백질; 킬러 활성화 수용체 연관된 단백질; 킬러-활성화 수용체-연관된 단백질; 등으로 알려짐)로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 하기 아미노산 서열 (4 동형체) 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:27), MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQ (서열번호:28), MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:29), 또는 MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKQRITETESP[YQELQGQRSDVYSDL]NTQRPYYK (서열번호:30), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 DAP12개의 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: ESP[YQELQGQRSDVYSDL ] NTQ(서열번호:31), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
일부 경우에, 세포내 활성화 도메인은 FCERlG (FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬; Fc 수용체 감마-사슬; fc-엡실론 RI-감마; fcR감마; fceRI 감마; 고친화도 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유닛 감마; 면역글로불린 E 수용체, 고친화도, 감마 사슬; 등으로도 알려짐)로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 하기 아미노산 서열의 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산 (aa), 약 60 aa 내지 약 70 aa, 약 70 aa 내지 약 80 aa, 또는 약 80 aa 내지 약 88 aa의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV[YTGLSTRNQETYETL]KHEKPPQ (서열번호:32), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
마찬가지로, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩타이드는 전장 FCER1G 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다: DGV[YTGLSTRNQETYETL ] KHE(서열번호:33), 여기서 ITAM 모티프는 괄호로 제시되어 있다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 DAP10/CD28 유형 신호전달 사슬을 포함한다. DAP10 신호전달 사슬의 예는 아미노산 서열번호:34이다. 일부 구현예에서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 서열번호:34에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함한다.
CD28 신호전달 사슬의 예는 아미노산 서열가 서열번호:35인 것이다. 일부 구현예에서, 적합한 세포내 도메인은 서열번호:35의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 ZAP70 폴리펩타이드를 포함하고, 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장 또는 서열번호:36의 약 300개의 아미노산 내지 약 400개의 아미노산, 약 400개의 아미노산 내지 약 500개의 아미노산, 또는 약 500개의 아미노산내지 619개의 아미노산의 인접 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다.
조절 도메인
조절 도메인은 활성화 도메인의 다운스트림 효과를 향상 또는 약화시키는 것 또는 반응의 특성을 변화시키는 것을 포함하여, 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 세포내 활성화 도메인의 효과를 변화시킬 수 있다. 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 사용하기에 적합한 조절 도메인은 공통자극 도메인을 포함한다. 조작된 신호전달 폴리펩타이드에 봉입하기에 적합한 조절 도메인은 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산 (aa)의 길이를 가질 수 있고, 예를 들어, 조절 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 가질 수 있다. 다른 사례에서, 조절 도메인은 약 70 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 또는 200 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.
공통자극 도메인은 전형적으로 활성화 도메인에 대한 반응의 특성을 고양 및/또는 변화시킨다.　본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩타이드에서 사용하기에 적합한 공통자극 도메인은 일반적으로 수용체로부터 유래된 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 공통자극 도메인은 동종이량체화한다. 대상체 공통자극 도메인은 막관통 단백질의 세포내 부분일 수 있다 (즉, 공통자극 도메인은 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다). 적합한 공통자극 폴리펩타이드의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, 4-lBB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합을 위해 결실된 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 및 HVEM을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 양태의 공통자극 도메인은 4-lBB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합을 위해 결실된 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 또는 HVEM의 공통자극 도메인에 적어도 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 양태의 공통자극 도메인은, 비제한적으로, 4-lBB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합을 위해 결실된 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 및 HVEM을 포함하는 적합한 공통자극 폴리펩타이드의 비-제한적인 예의 공통자극 도메인에 적어도 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 양태의 공통자극 도메인은 4-lBB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합을 위해 결실된 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 또는 HVEM의 공통자극 도메인에 적어도 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가질 수 있다.
조작된 신호전달 폴리펩타이드에 봉입하기에 적합한 공통자극 도메인은 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산 (aa)의 길이를 가질 수 있고, 예를 들어, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 가질 수 있다. 다른 사례에서, 공통자극 도메인은 약 70 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 또는 200 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 CD137 (TNFRSF9; CD137; 4-lBB; CDwl37; ILA; 등으로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:1에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 CD28 (Tp44로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:2에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통 자극도메인은 막관통 단백질 Lck 결합을 위해 결실된 CD28 (ICΔ)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:3에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통 자극도메인은 막관통 단백질 ICOS (AILIM, CD278, 및 CVIDl로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:4에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통 자극도메인은 막관통 단백질 OX40 (TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX-40, TXGPlL로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:5에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 CD27 (S 152, T 14, TNFRSF7, 및 Tp55로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:6에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 또는 약 45 aa 내지 약 50 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 BTLA (BTLAl 및 CD272로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:7에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 CD30 (TNFRSF8, DlS166E, 및 Ki-1로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:8의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 또는 약 160 aa 내지 약 185 aa의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 GITR (TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357, 및 GITR-D로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:9에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
일부 경우에, 공통자극 도메인은 막관통 단백질 HVEM (TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, 및 TR2로도 알려짐)의 세포내 부분으로부터 유래했다. 예를 들어, 적합한 공통자극 도메인은 서열번호:10에서의 적어도 10, 15, 20, 또는 모든 아미노산의 신장에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함할 수 있다. 이들 구현예들 중 일부에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 둘 모두의 공통자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 갖는다.
링커
일부 경우에, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 임의의 2개의 인접한 도메인 사이에 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 막관통 도메인과 제1 공통자극 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, ASTR은 항체일 수 있고 링커는 중쇄와 경쇄 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 막관통 도메인 및 공통자극 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 공통자극 도메인과 제2 폴리펩타이드의 세포내 활성화 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 세포내 신호전달 도메인 사이에 있을 수 있다.
링커 펩타이드는 임의의 다양한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 단백질은, 비록 다른 화학적 연결기가 배제되지는 않지만, 일반적으로 가요성 특성의 스페이서 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 링커는 약 1 내지 약 100개 길이의 아미노산, 또는 약 1 내지 약 25개 길이의 아미노산의 펩타이드일 수 있다. 이들 링커는 단백질을 연결하기 위한 합성, 링커-인코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생산될 수 있다. 어느 정도의 가요성을 갖는 펩타이드 링커가 사용될 수 있다. 펩타이드를 연결하는 것은 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있어, 적합한 링커는 일반적으로 가요성 펩타이드를 초래하는 서열을 가질 것이라는 것을 명심하여야 한다. 작은 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌의 사용은 가요성 펩타이드를 생성하는데 사용하는 것이다. 그러한 서열의 창출은 당해 분야의 숙련가에게 일상적인 것이다.
적합한 링커가 쉽게 선택될 수 있고, 임의의 적합한 상이한 길이, 예컨대 4개의 아미노산 내지 10개의 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9개의 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8개의 아미노산, 또는 7개의 아미노산 내지 8개의 아미노산을 포함한, 1개의 아미노산 (예를 들어, Gly) 내지 20개의 아미노산, 2개의 아미노산 내지 15개의 아미노산, 3개의 아미노산 내지 12개의 아미노산일 수 있고, 그리고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산일 수 있다.
예시적인 가요성 링커는 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머 (예를 들어, (GS)n, GSGGSn, GGGSn, 및 GGGGSn를 포함하고 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 당 업계에서 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 폴리머는 이들 아미노산 둘 모두가 상대적으로 비구조적이고, 따라서 성분 사이에 중성 연결기로 작용할 수 있기 때문에 관심이 있다. 글리신 폴리머는 글리신이 더욱이 알라닌보다 상당히 많은 phi-psi 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 갖는 잔기들보다 매우 덜 제한되기 때문에 특히 관심의 대상이다 (문헌 [Scheraga, Rev. Computational Chem . 11173-142 (1992)] 참고). 예시적인 가요성 링커는, 비제한적으로 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호:53), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호:54), GGGGSGGGSGGGGS (서열번호:55), GGSG (서열번호:56), GGSGG (서열번호:57), GSGSG (서열번호:58), GSGGG (서열번호:59), GGGSG (서열번호:60), GSSSG (서열번호:61), 및 기타 동종의 것을 포함한다. 당업자는 링커가 가요성 링커뿐만 아니라 덜 가요성 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있도록, 상기에 기재된 임의의 요소에 접합된 펩타이드의 디자인은 전체 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
조합
일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 제공된 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 특정 조합을 인코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 갖는다. 본 명세서에 제공된 일부 방법 및 조성물에서, 유전자 변형된 T 세포는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 T 세포의 형질도입 후 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 조합을 포함한다. 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 제3 폴리펩타이드, 등의 언급은 편의를 위한 것이고 "제1 폴리펩타이드"에 대한 요소 및 "제2 폴리펩타이드"에 대한 요소는 상기 요소가, 전형적으로 그 특이적 폴리펩타이드에 대해 추가의 요소 또는 단계인, 단지 참조 및 관습을 위해 제1 및 제2로 언급된 상이한 폴리펩타이드이다는 것이 이해될 것이다
일부 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 항원을 결합할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 또한 T 세포 생존 모티프 및/또는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 공통자극 도메인을 포함하지 않고, 반면 다른 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 공통자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 림프증식성 유전자 산물 및 선택적으로 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 또한 하기 중 하나 이상을 포함한다: T 세포 생존 모티프, 세포내 신호전달 도메인, 및 하나 이상의 공통자극 도메인. 다른 구현예에서, 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 사용되는 경우, 적어도 하나는 CAR이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, 전사체에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 내부 리보솜 유입부위 (IRE) 또는 하나 이상의 프로테아제 절단 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 의해 분리되는, 동일한 전사체하에서 T 세포 특이적 프로모터 또는 일반적인 프로모터 하에서 발현된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하고 여기서 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 제1 항원을 결합할 수 있는 제1 세포외 항원 결합 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 공통자극 도메인은 포함하지 않고, 그리고 제2 폴리펩타이드는 VEGF를 결합할 수 있는 제2 세포외 항원 결합 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 예를 들어, 공통자극 분자의 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항원은 PSCA, PSMA, 또는 BCMA이다. 특정 구현예에서, 제1 세포외 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, scFv), 예를 들어, PSCA, PSMA, 또는 BCMA에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, VEGF를 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인은 VEGF에 대한 수용체, 즉, VEGFR이다. 특정 구현예에서, VEGFR은 VEGFR1, VEGFR2, 또는 VEGFR3이다. 특정 구현예에서, VEGFR은 VEGFR2이다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하고 여기서 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 세포외 종양 항원 결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, 항원이 혈관신생 또는 혈관성 신생 인자인 항원-결합 도메인, 및 하나 이상의 공통자극 분자 신호전달 도메인을 포함한다. 혈관신생 인자는, 예를 들어, VEGF일 수 있다. 하나 이상의 공통자극 분자 신호전달 모티프는, 예를 들어, 각각의 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB로부터 공통자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하고 여기서 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 세포외 종양 항원-결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, VEGF에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인, 및 각각의 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB로부터의 공통자극 신호전달 도메인을 포함한다. 추가 구현예에서, 제1 신호전달 폴리펩타이드 또는 제2 신호전달 폴리펩타이드는 또한 T 세포 생존 모티프를 갖는다. 일부 구현예에서, T 세포 생존 모티프는 IL-7 수용체 (IL-7R)의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-15 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 또는 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 수용체 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β―우세한-음성 수용체 II (DNRII))의 세포내 신호전달 도메인이거나, 또는 이들로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하고 여기서 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 세포외 종양 항원 결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, VEGF에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인, IL-7 수용체 세포내 T 세포 생존 모티프, 및 각각의 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB로부터의 공통자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 2개 초과의 신호전달 폴리펩타이드가 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 단 하나는 종양-연관된 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다; 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 나머지 각각은 종양-연관된 항원 또는 종양 특이적 항원이 아닌 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 2종 이상은 하나 이상의 종양-연관된 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하되, 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 종양-연관된 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양-연관된 항원 또는 종양 특이적 항원은 Her2, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), PSMA (전립선-특이적 막 항원), B 세포 성숙 항원 (BCMA), 알파-태아단백 (AFP), 암종배아 항원 (CEA), 암 항원-125 (CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피성 막 단백질 (EMA), 상피성 종양 항원 (ETA), 티로시나제, 흑색종-연관된 항원 (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 신경교원섬유성 산성 단백질 (GFAP), 육안적 낭포질환 유체 단백질 (GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A (T 림프구에 의해 인식된 흑색종 항원; MART-1), myo-D1, 근육-특이적 액틴 (MSA), 신경 필라멘트, 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 스냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 유형 M2의 이량체성 형태 (종양 M2-PK), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (강글리오사이드 G2), EphA2, CSPG4, CD138, FAP (섬유모세포 활성화 단백질), CD171, 카파, 람다, 5T4, αvβ6 인테그린, 인테그린 ανβ3 (CD61), 갈락틴, K-Ras (V-Ki-ras2 Kirsten 랫트 육종 바이러스 종양 유전자), Ral-B, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD20, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, EGFR, EGP2, EGP40, EpCAM, 태아 AchR, FRα, GD3, HLA-A1+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, Lewis-Y, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, ROR1, 서바이빈, TAG72, TEMs, VEGFR2, EGFRvIII (표피 성장 인자 변이체 III), 정자 단백질 17 (Sp17), 메소텔린, PAP (전립선 산 포스파타제), 프로스테인, TARP (T 세포 수용체 감마 대안적 해독틀 단백질), Trp-p8, STEAP1 (전립선 1의 6-막관통 상피성 항원), 비정상 ras 단백질, 또는 비정상 p53 단백질이다.
일부 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 제1 항원을 결합하는 제1 세포외 항원 결합 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 제2 항원을 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인 또는 제2 항원을 결합하는 수용체; 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 공통자극 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인은 독립적으로 수용체의 항원-결합부 또는 항체의 항원-결합부이다. 특정 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인 또는 제2 항원 결합 도메인 둘 중 하나 또는 모두는 scFv 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 추가로 막관통 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 T 세포 생존 모티프, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 T 세포 생존 모티프를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 HER2를 결합하는 제1 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 MUC-1을 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 제2 세포외 항원 결합 도메인은 인터류킨을 결합한다.
또 다른 구현예에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 제2 세포외 항원 결합 도메인은 손상 연관된 분자 패턴 분자 (DAMP; 알라민으로도 알려짐)을 결합한다. 다른 구현예에서, DAMP는 열 충격 단백질, 염색질-연관된 단백질 고이동도 그룹 박스 1 (HMGB1), S100A8 (MRP8, 또는 칼그라눌린 A로도 알려짐), S100A9 (MRP14, 또는 칼그라눌린 B로도 알려짐), 혈청 아밀로이드 A (SAA), 데옥시리보핵산, 아데노신삼인산, 요산, 또는 헤파린 설페이트이다.
특정 구현예에서, 상기 제2 항원은 종양 세포에 의해 제시된 항원에 결합하는 항체 상의 항원이다.
일부 구현예에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 통한 신호 형질도입 활성화는 비-항원성이지만, 저산소증과 연관된다. 특정 구현예에서, 저산소증은 저산소증-유도성 인자-1α (HIF-1α), HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF-3α, 또는 HIF-3β의 활성화에 의해 유도된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현은 본 명세서에서 더 상세히 개시되어 있는 조절 요소에 의해 조절된다.
추가의 서열
조작된 신호전달 폴리펩타이드, 예컨대 CAR은 추가로 하나 이상의 추가의 폴리펩타이드 도메인을 포함할 수 있되, 그러한 도메인은, 비제한적으로, 신호 서열; 에피토프 태그; 친화성 도메인; 및 폴리펩타이드를 포함하고 그의 존재 또는 활성은 예를 들어 항체 검정에 의하거나 또는 이것이 검출가능한 신호를 생성하는 폴리펩타이드이기 때문에 검출될 수 있다 (검출가능한 마커). 본 명세서에서 제공된 임의의 양태 또는 구현예에 대한 추가의 도메인의 비-제한적인 예는 아래에 기재된 바와 같은 임의의 하기 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함한다: 신호 서열, 에피토프 태그, 친화성 도메인, 또는 검출가능한 신호를 생성하는 폴리펩타이드.
대상체 CAR, 예를 들어, 대상체 CAR의 제1 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 신호 서열은 자연발생 신호 서열, 합성 (예를 들어, 인공) 신호 서열, 등을 포함한 임의의 진핵 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 신호 서열은 CD8 신호 서열 MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열번호:74)일 수 있다.
적합한 에피토프 태그는, 비제한적으로, 혈구응집소 (HA; 예를 들어, YPYDVPDYA; 서열번호:37); FLAG (예를 들어,DYKDDDDK; 서열번호:38); c-myc (예를 들어, EQKLISEEDL; 서열번호:39), 및 기타 동종의 것을 포함한다.
친화성 도메인은, 예를 들어, 확인 또는 정제를 위해 유용한, 고형 지지체 상에 고정된 것과 같은, 결합 파트너와 상호작용할 수 있는 펩타이드 서열을 포함한다. 다중 연속적인 단일 아미노산, 예컨대 히스티딘을 인코딩하는 DNA 서열은, 발현된 단백질에 융합될 때, 수지 칼럼, 예컨대 니켈 세파로스에 대한 고친화도 결합에 의해 재조합 단백질의 1-단계 정제에 사용될 수 있다. 예시적인 친화성 도메인은 His5 (HHHHH; 서열번호:40), HisX6 (HHHHHH; 서열번호:41), c-myc (EQKLISEEDL; 서열번호:39), Flag (DYKDDDDK; 서열번호:38), Strep Tag (WSHPQFEK; 서열번호:42), 혈구응집소, 예를 들어, HA Tag (YPYDVPDYA; 서열번호:37), GST, 티오레독신, 셀룰로스 결합 도메인, RYIRS (서열번호:43), Phe-His-His-Thr (서열번호:44), 키틴 결합 도메인, S-펩타이드, T7 펩타이드, SH2 도메인, C-말단 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열번호:45), 금속 결합 도메인, 예를 들어, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인 예컨대 칼슘-결합 단백질로부터의 것, 예를 들어, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시뉴린 B, 미오신 경쇄, 레코베린, S-모둘린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프레쿠에닌, 칼트락틴, 칼페인 큰-서브유닛, S100단백질, 파브알부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K, 및 칼레티닌, 인테인스, 바이오틴, 스트렙타비딘, MyoD, Id, 류신 지퍼 서열, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다.
적합한 검출가능한 신호-생성 단백질은, 예를 들어, 형광 단백질; 생성물로서 검출가능한 신호를 생성하는 반응을 촉매하는 효소; 및 기타 동종의 것을 포함한다.
적합한 형광 단백질은, 비제한적으로, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 이들의 변이체, GFP의 청색 형광 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광 변이체 (YFP), 향상된 GFP (EGFP), 향상된 CFP (ECFP), 향상된 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드, 토파즈 (TYFP), 비너스, 시트린, 엠시트린, GFPuv, 탈안정화된 EGFP (dEGFP), 탈안정화된 ECFP (dECFP), 탈안정화된 EYFP (dEYFP), mCFPm, 세룰리안, T-사파이어, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-단량체, J-레드, 다이머2, t-다이머2(12), mRFPl, 포실로포린, 레닐라 GFP, 몬스터 GFP, paGFP, 캐데 단백질 및 킨들링 단백질, B-파이코에리트린, R-파이코에리트린 및 알로피코시아닌을 포함한 파이코빌리 단백질 및 파이코빌리 단백질 콘주게이트를 포함한다. 형광 단백질의 다른 예는 엠허니듀, 엠바나나, 엠오렌지, 디토마토, 티디토마토, 엠탄제린, 엠딸기, 엠체리, 엠그라펠, 엠랩스베리, mGrape2, mPlum (문헌 [Shaner 등 (2005) Nat. Methods 2:905-909]), 및 기타 동종의 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Matz 등 (1999) Nature Biotechnol . 17:969-973]에서 기재된 바와 같은 산호충 종으로부터의 임의의 다양한 형광 및 착색된 단백질이 사용하기에 적합하다.
적합한 효소는, 비제한적으로, 말무 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 베타-갈락토시다아제 (GAL), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 베타-N-아세틸글루코사미니다제, β-글루쿠로니다제, 인버타제, 잔틴 옥시다제, 개똥벌레 루시퍼라제, 글루코스 옥시다제 (GO), 및 기타 동종의 것을 포함한다.
인식 및/또는 제거 도메인
본 명세서에 제공된 임의의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본 명세서에 제공된 임의의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 일부로, 또는 이와 별도로 인식 또는 제거 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 임의의 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 인식 또는 제거 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 임의의 CAR들은 인식 또는 제거 도메인을 포함할 수 있다. 나아가, 인식 또는 제거 도메인은 본 명세서에서 개시된 임의의 림프증식성 요소와 함께, 또는 더욱이는 융합되어 발현될 수 있다. 인식 또는 제거 도메인은 T 세포 및/또는 NK 세포 상에서 발현되지만, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 상에서는 발현되지 않는다.
일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은 단순 포진 바이러스-유래된 효소 티미딘 키나제 (HSV-tk) 또는 유도성 카스파제-9로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은, 예를 들어 미국 특허 8,802,374호에서 개시된 바와 같은 변형된 내인성 세포-표면 분자를 포함할 수 있다. 변형된 내인성 세포-표면 분자는 임의의 세포-표면 관련된 수용체, 리간드, 당단백질, 세포 유착 분자, 항원, 인테그린, 또는 변형된 분화의 클러스터 (CD)일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 내인성 세포-표면 분자는 절단된 티로신 키나제 수용체이다. 일 양태에서, 절단된 티로신 키나제 수용체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 계열의 구성원 (예를 들어, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4)이다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인식하는 항체에 의해 인식된 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR 패밀리 일원의 적어도 20개 인접 아미노산, 또는 예를 들어, EGFR 패밀리 일원의 20 내지 50개 인접 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 서열번호:78은 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인지하는 항체에 의해, 그리고 이에 구속된 적절한 조건하에서 인식된 예시적인 폴리펩타이드이다. 그와 같은 세포외 EGFR 에피토프는 때때로 본 명세서에서 eTag로 언급된다. 예시적인 구현예에서, 그러한 에피토프는 상업적으로 입수가능한 항-EGFR 단클론성 항체에 의해 인식된다.
EGFR, ErbB1 및 HER1로도 알려진, 표피 성장 인자 수용체는 세포외 리간드의 표피 성장 인자 계열의 구성원에 대한 세포-표면 수용체이다. EGFR 활성에서의 변경은 특정 암에 연루된다. 일부 구현예에서, 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 포함한 EGFR 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자는 막원위 EGF-결합 도메인 및 세포질 신호전달 꼬리를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열의 제거에 의해 구축되지만, 항-EGFR 항체에 의해 인식된 세포외 막근위 에피토프를 보유한다. 바람직하게는, 항체는 알려진, 상업적으로 입수가능한 항-EGFR 단클론성 항체, 예컨대 세툭시맙, 마투주맙, 네시투무맙 또는 파니투무맙이다.
다른 연구자들은 항-바이오틴 마이크로비드와 조합하여 면역자기 선택에 대한 바이오티닐화된-세툭시맙의 적용은 세포 제제에 대한 관측가능한 독성 없이 90% 초과의 순도로 모집단의 2%만큼 낮은 EGFRt-함유 작제물로 렌티바이러스로 형질도입된 T 세포를 성공적으로 풍부하게 한다는 것을 보여 주었다. 게다가, 다른 연구자들은 이 불활성 EGFR 분자의 구성적 발현이 대등하게 발현된 키메라 항원 수용체 (CAR), CD19R에 의해 지향된 바와 같이 T 세포 표현형 또는 효과기 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여 주었다. 또한, 다른 연구자들은 유세포측정 분석을 통해, EGFR이 마우스에서 T 세포 생착에 대한 생체내 추적 마커로서 성공적으로 이용되었다는 것을 보여 주었다. 게다가, EGFR은 Erbitux® 매개된 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC) 경로를 통해 자살 유전자 잠재성을 갖는 것으로 실증되었다. 본 개시내용의 발명자들은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 PBMC에서 eTag를 성공적으로 발현시켰고, 세툭시맙에 노출된 PBMC에 의한 시험관내 eTag의 발현은 PBMC에 대한 효과적인 제거 기전을 제공했다는 것을 발견하였다. 따라서, EGFR은 면역 치료적 잠재성을 갖는 형질도입된 T 세포에 대한 비-면역원성 선택 도구, 추적 마커, 및 자살 유전자로서 사용될 수 있다. EGFR 핵산은 또한 당해 분야에서 잘 알려진 수단에 의해 검출될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 일부 구현예에서, EGFR은 CAR을 또한 포함하는 단일 폴리펩타이드의 일부 또는 림프증식성 요소를 포함하는 단일 폴리펩타이드의 일부로 발현된다. 일부 구현예에서, EGFR 인식 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열은 절단 신호 및/또는 리보솜 스킵 서열에 의해 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 아미노산 서열로부터 분리될 수 있다. 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호는 당 업계에서 알려진 임의의 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호일 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 리보솜 스킵 서열은, 예를 들어 아미노산 서열 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열번호:77)을 갖는 T2A (또한 본 명세서에서 일명 2A-1)일 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 절단 신호 및 리보솜 스킵 서열의 다른 예는 FMDV 2A (F2A); 말 비염 A 바이러스 2A (약칭 E2A); 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A); 및 토세아아시그나 바이러스 2A (T2A)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인식 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 CAR 또는 림프증식성 요소와 동일한 전사체 상에 있을 수 있지만 내부 리보솜 유입 부위에 의해 CAR 또는 림프증식성 요소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과는 별개이다.
본 명세서에서 실험적으로 예시된 바와 같은 다른 구현예에서, 인식 도메인은 림프증식성 요소에 융합된, 융합 폴리펩타이드의 일부로 발현될 수 있다. 그와 같은 작제물은, 특히 본 명세서에 제공된 다른 "공간 절감" 요소와 조합하여, 별개의 폴리펩타이드에 비교될 때 RNA 게놈상의 게놈 공간을 덜 차지하는 이점을 제공한다. 하나의 예시적 구현예에서, eTag는 본 명세서에서 실험적으로 실증된 바와 같이 IL7Rα돌연변이체에 융합된, 융합 폴리펩타이드로 발현된다.
키메라 항원 수용체
본 발명의 일부 양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드이고, 이것은 간단히 본 명세서에서 "CAR"로 언급된다. 본 개시내용의 CAR은 하기를 포함한다: a) 적어도 하나의 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR); b) 막관통 도메인; 및 c) 세포내 활성화 도메인. 예시적인 구현예에서, CAR의 항원-특이적 표적화 영역은 표적 항원에 대한 항체의 scFv 부분이다. 예시적인 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 CD3z으로부터의 것이다.
본 개시내용의 CAR은 진핵세포, 예를 들어, 포유동물 세포의 원형질막에 존재할 수 있되, 적합한 포유동물 세포는, 비제한적으로, 세포독성 세포, T 림프구, 줄기 세포, 줄기 세포의 자손, 선조 세포, 선조 세포의 자손, 및 NK 세포, NK-T 세포, 및 대식세포를 포함한다. 진핵세포의 원형질막에 존재하는 경우, 본 개시내용의 CAR은 특정 조건에서 ASTR을 결합하는 하나 이상의 표적 항원의 존재에서 활성이다. 표적 항원은 특이적 결합 쌍의 제2 구성원이다. 특이적 결합 쌍의 표적 항원은 가용성 (예를 들어, 세포에 결합되지 않음) 인자; 세포 예컨대 표적 세포의 표면상에 존재하는 인자; 단단한 표면상에 제시된 인자; 지질 이중층에 존재하는 인자; 및 기타 동종의 것일 수 있다. ASTR이 항체이고, 특이적 결합 쌍의 제2 구성원이 항원인 경우, 항원은 가용성 (예를 들어, 세포에 결합되지 않음) 항원; 세포 예컨대 표적 세포의 표면상에 존재하는 항원; 단단한 표면상에 제시된 항원; 지질 이중층에 존재하는 항원; 및 기타 동종의 것일 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 하나 이상의 표적 항원의 부재에서 핵산의 전사의 수준에 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과로, 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 증가시킨다.
예로서, 본 개시내용의 CAR은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)-함유 세포내 신호전달 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 일부 사례에서, 세포에 의해 하나 이상의 사이토카인의 증가된 생산을 초래할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 하나 이상의 표적 항원의 부재에서 세포에 의해 생산된 사이토카인의 양과 비교하여 적어도약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과로, 세포에 의한 사이토카인의 생산을 증가시킬 수 있다. 생산이 증가될 수 있는 사이토카인은, 비제한적으로 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-a), IL-2, IL-15, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10; 케모카인; 성장 인자; 및 기타 동종의 것을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 세포에서 핵산의 전사에서의 증가 및 세포에 의한 사이토카인의 생산에서의 증가 둘 모두를 초래할 수 있다.
일부 사례에서, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, CAR의 제1 폴리펩타이드의 항원-결합 도메인이 결합하는 항원을 그것의 세포 표면 상에 발현하는 표적 세포에 대한 세포에 의한 세포독성 활성을 초래한다. 예를 들어, 진핵세포가 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 세포독성 T 림프구)인 경우, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 하나 이상의 표적 항원을 그것의 세포 표면 상에 발현하는 표적 세포에 대한 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 예를 들어, 진핵세포가 NK 세포 또는 T 림프구인 경우, 본 개시내용의 CAR은, 세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 하나 이상의 표적 항원의 부재에서 세포의 세포독성 활성에 비교하여 적어도약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 2.5-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 10-배 초과로, 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 다른 CAR 활성화 관련된 사건 예컨대 증식 및 팽창 (증가된 세포 분할 또는 항-세포 자멸적 반응 중 어느 하나에 기인함)을 초래할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 CAR은, 진핵세포의 원형질막에 존재할 때, 그리고 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화될 때, 다른 CAR 활성화 관련된 사건 예컨대 세포내 신호전달 조절, 세포 분화, 또는 세포사를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 CAR들은 미세환경 제한적이다. 이 특성은 전형적으로 CAR의 ASTR 도메인의 미세환경 제한된 특성의 결과이다. 따라서, 본 개시내용의 CAR들은 보다 낮은 결합 친화도를 가질 수 있거나 또는, 예시적인 구현예에서, 정상 생리적 환경에서의 조건하에서보다 미세환경에서의 조건(들)하에서 하나 이상의 표적 항원에 대해 더 높은 결합 친화도를 가질 수 있다.
림프증식성 요소
주변 T 림프구 수는 가슴샘으로부터 이동과 항원 조우에 대한 반응에서의 증식에 기인한 세포의 지속적인 첨가 및 항원 청소능 후 항원-특이적 효과기의 제거에 기인한 세포의 손실에도 불구하고 성인기 전반에 걸쳐 현저하게 안정한 수준을 유지한다 (Marrak, P. 등 2000. Nat Immunol 1:107-111; Freitas, A.A. 등 2000. Annu Rev Immunol 18:83-111). 주변 T 세포 구획의 크기는 증식 및 생존 둘 모두에 영향을 미치는 다중 인자에 의해 조절된다. 그러나, 림프구감소 환경에서, T 림프구는 주변 T 세포 구획의 크기를 유지하는 "급성 항상성 증식" 기전에 기인하여 독립적으로 동족 항원으로 분할한다. 림프구감소증에 대한 병태는, 이전된 T 세포의 향상된 생착 및 항종양 기능을 초래하는, 시험관내 T 세포를 증식시키고 이것을 림프구 고갈된 대상체 안으로 도입함에 의한 입양 세포 요법 동안 대상체 또는 환자에서 확립되었다. 그러나, 대상체의 림프구 고갈은 이것이 면역기능 이상 및 사망을 비롯한 심각한 부작용을 야기할 수 있기 때문에 바람직하지 않다.
연구는 림프구고갈이 항상성 사이토카인에 대해 세포 침전으로 작용하는 내인성 림프구를 제거하고, 그것에 의해 입양으로 전달된 세포의 생존 및 증식을 유도하는 사이토카인을 유리한다는 것을 보여준다. 일부 사이토카인, 예컨대 예를 들어, IL-7 및 IL-15는 T 세포의 항원-독립적인 증식을 매개하고 따라서 비-림프구감소 환경에서 항상성 증식을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 사이토카인 및 그것의 수용체는 항상성으로 림프증식성 장애를 예방하는 고유 조절 기전을 갖는다.
본 명세서에 제공된 많은 양태는 림프증식성 요소, 또는 전형적으로 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 일부로, 이를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 림프증식성 요소 예컨대 키메라 림프증식성 요소 (CLE)이다. 전형적으로, CLE는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 증식을 유도하는 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 함유한다. CLE는 ASTR 및 활성화 도메인 둘 모두를 포함하지 않는다. 본 명세서에서 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 림프증식성 요소는 전형적으로, 그의 게놈이 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 일부로서 림프증식성 요소를 인코딩하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입함에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포 안으로 도입된다. 림프증식성 요소는 단일 세포내 도메인을 포함할 수 있거나 또는 1 초과 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 2개의 세포내 도메인을 포함한다. 본 명세서에 제공되고 실시예 17 및 18에서 논의된 표 7-23은 표 6에서 확인된 세포외 도메인과 세포내 도메인의 상이한 조합을 포함한 후보 키메라 폴리펩타이드를 시험한 그 안에 제공된 실험적 방법을 사용하여 확인된 1개의 세포내 도메인을 갖는 CLE 및 2개의 세포내 도메인을 갖는 CLE를 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 또는 추가의 예시적 구현예에서, 사이토카인 수용체, 또는 이들의 신호전달 도메인을 포함하고, STAT3 경로, STAT4 경로, 또는 더욱 추가의 예시적 구현예에서, Jak/STAT5 경로를 활성화시키는 단편일 수 있거나 포함할 수 있다. 이와 같이, 림프증식성 요소는, 비-제한적인 예에서, 사이토카인 수용체, 또는 이들의 신호전달 도메인, 예컨대 인터류킨 수용체를 포함하는 활성 단편 또는 이들의 신호전달 도메인을 포함하고, STAT5를 활성화시키는 활성 단편일 수 있다. 따라서, 림프증식성 요소는 증식, 및 선택적으로 생존 (항-세포자멸적)을 촉진하시키고, 선택적으로 분화 상태, 증식성 포텐셜 또는 림프구의 세포사에 대한 내성을 증진하는 공통자극 신호를 제공하는 폴리펩타이드이다. 특정 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 폴리펩타이드이다. 예시적 림프증식성 요소는 STAT5를 활성화시킴에 의해 증식을 유도한다. 따라서, 그러한 림프증식성 요소의 단편은, 예시적인 구현예에서, STAT5를 활성화시킴에 의해 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 능력을 보유한다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 유전자 변형된 PBMC에 존재할 때, 림프구, 또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 사이토카인 예컨대 IL-15, IL-7, 및 예시적인 구현예에서 IL-2 및 6, 7, 14, 21, 또는 35일 동안 배양하는 동안 세포에 의해 발현된 CAR의 ASTR에 대해 표적에 대한 세포의 노출의 부재에서 생체외 또는 시험관내 배양에서 림프구 증식/팽창 및 선택적으로 생존을 증진할 수 있다.
본 명세서에서 제시된 방법 및 조성물 중 일부에서, 림프증식성 요소는 대상체를 림프구고갈시킴이 없이 생체내 유전자 변형된 T 세포의 증식 또는 팽창을 증진하기 위해 사용된다. 이와 같이, 대상체의 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 안으로, 전형적으로 그러한 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입함에 의해 림프증식성 요소를 삽입하는 것을 포함하는 본 명세서에 제공된 방법의 비제한적인 예시적 구현예는 방법을 수행하기 전, 동안 및/또는 후에 대상체를 림프구고갈함이 없이, 또는 그러한 방법을 수행하기 대상체로부터 혈액을 채취하기 전, 동안 및/또는 후에 대상체를 림프구고갈함이 없이, 또는 대상체로부터 생체외 T 세포 또는 NK 세포를 유전자적으로 변형시키기 전, 동안 및/또는 후에, 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체로 재도입하기 전, 동안 및/또는 후에 대상체를 림프구고갈함이 없이 수행될 수 있다. 생체내 T 세포의 증식을 증진하는 인자는 사이토카인 및 그것의 수용체를 포함하되, 수용체는 전형적으로 리간드 결합 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물에서 사용된 림프증식성 요소는 사이토카인 및/또는 사이토카인 수용체이다. 사이토카인은 인터류킨일 수 있고, 사이토카인 수용체는 인터류킨 수용체일 수 있다. 림프증식성 요소는 사이토카인의 기능적 단편 및/또는 사이토카인 수용체의 기능적 단편, 예컨대 이들의 신호전달 도메인일 수 있되, 상기 단편은, 예를 들어 STAT5를 활성화시킴에 의해 T 세포의 증식을 증진할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 방법 및 조성물에서의 사이토카인 림프증식성 요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인터류킨-7 (IL-7) 또는 그것의 수용체 (IL-7R), 또는 그것의 신호전달 도메인; 인터류킨-12 (IL-12) 또는 그것의 수용체 (IL-12R), 또는 그것의 신호전달 도메인; IL-12R β1 및 IL-23R로 구성된 인터류킨-23 (IL-23) 또는 그것의 수용체, 또는 그것의 신호전달 도메인; 인터류킨-27 (IL-27) 또는 그것의 수용체 (IL-27R), 또는 그것의 신호전달 도메인; 인터류킨-15 (IL-15) 또는 그것의 수용체 (IL-15R), 또는 그것의 신호전달 도메인; 인터류킨-21 (IL-21) 또는 그것의 수용체 (IL-21R), 또는 그것의 신호전달 도메인; 또는 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 또는 그것의 수용체 (TGFβR) 또는 그것의 신호전달 도메인; 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β―우세한-음성 수용체 II (DNRII)). 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 IL-12R 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β―우세한-음성 수용체 II (DNRII))이다.
IL-7은 IL-7R 알파 및 일반 감마 사슬 수용체로 구성된 이종이량체인, IL-7 수용체에 결합한다. 결합은 가슴샘 내의 T 세포 발달과 주변 내의 생존에 중요한 신호의 캐스케이드를 초래한다. IL-7 수용체에 대한 IL-7의 결합은 Jak/STAT5 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.
IL-12는 Th1 세포로 미접촉 T 세포의 분화에 관여되고 (Hsieh CS 등 1993. Science. 260(5107):547-9) T 세포-자극 인자로 알려져 있다. IL-12는 IL-12R-β1 및 IL-12R-β2에 의해 형성된 헤테로이량체성 수용체인, IL-12 수용체에 결합한다. IL12는 STAT4를 활성화시킴에 의해 작용할 수 있지만, T 세포에서 또한 STAT5를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다 (Ahn, H., 등 1998. J. Immun . 161:5893-5900). IL-12 계열은 사이토카인 IL-12, IL-23, 및 IL-27로 구성된다. IL-23에 대한 수용체는 IL-12R β1 및 IL-23R로 구성된다. IL-27은 2개의 뚜렷한 유전자인, 엡슈타인-바르 바이러스-유도된 유전자 3(EBI3) 및 IL-27p28로 구성된 헤테로이량체성 사이토카인이다. IL-27은 IL-27 수용체와 상호작용한다.
IL-15는 구조에서 유사하고 IL-2에 대해 기능하는 T 및 NK 세포 자극 인자이다. 양 사이토카인은 T 세포의 증식을 유도하고; 그것의 공유된 기능은 IL-2/IL-15Rβ 및 일반 γ사슬을 사용한 양 수용체로부터의 결과로 생각된다. IL-15의 신호전달 경로는 그것의 세포 표면 상에 IL-15Rβγc 복합체를 담지하는 주위 세포에 대한 후속적인 제시로 IL-15Rα 수용체에 결합으로 개시한다. 결합에 의해 IL-15β 서브유닛은 야누스 키나제 1 (Jak1) 및 γc 서브유닛 야누스 키나제 3 (Jak3)을 활성화시켜, STAT3 및 STAT5의 인산화 및 활성화를 유발시킨다.
IL-21은 활성화된 인간 CD4+ T 세포 및 NKT 세포에서 발현되고, IL-21 발현은 T 도움 세포의 Th2 및 Th17 서브셋에서 상향조절된다. IL-21 수용체 (IL-21R)는 T, B 및 NK 세포의 표면상에 발현되고 IL-2R 또는 IL-15와 같은 다른 유형 I 사이토카인에 대한 수용체에 대해 구조상 유사하다. IL-21R은 IL-21을 결합하기 위해 일반 감마 사슬 (γc)로 이량체화를 요한다. IL-21에 결합될 때, IL-21 수용체는 Jak/STAT 경로를 통해 작용하여, STAT1, STAT3, 및 STAT5를 활성화시킨다.
TGFβ 유인 수용체 (TGF-β―우세한-음성 수용체 II (DNRII))는 TGFβ 결합에 대해 천연 수용체와 경쟁함에 의해 TGFβ 신호전달을 차단한다. TGFβ-DNRII는 세포외 TGFβ 결합 도메인을 함유하는 RII의 키나제-데드 절단된 형태 및 RII의 막관통 도메인이다. TGFβ-DNRII는 리간드를 결합하지만, 인산화하지 않고 RI를 활성화시켜, 그것에 의해 Smad 인산화를 감소하거나 제거한다
IL-7Rα에서의 기능획득 돌연변이는 B 및 T 세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL 및 T-ALL)이 있는 대상체에서 확인되었다 (Zenatti PP, 등 2011. Nat Genet 43:932-939; Snochat, C. 등 2011. J Exp Med 208:901-908; McElroy, C.A. 등 2012. PNAS 109(7):2503-2508). 본 돌연변이는 추가의 Cys 잔기를 함유하는 거의 모든 서열을 갖는 IL-7Rα TMD의 N-말단 영역에서의 삽입 및 결실, 및 S165-내지-C165 돌연변이를 포함했다. 시스테인은 수용체의 구성적 활성화를 초래했다. T-모든 그룹에서의 돌연변이의 일부는 JAK1을 활성화시켰다. 이들 기능획득 IL-7R 돌연변이체는 림프증식성 요소(들)의 하나로 본 명세서에 제공된 임의의 양태에 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 돌연변이된 IL-7 수용체이다. 다른 구현예에서, 돌연변이된 IL-7 수용체는 구성적으로 활성으로, 사이토카인 리간드의 부재에서 JAK-STAT5 경로를 활성화시킨다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이된 IL-7 수용체는 STAT5 경로를 구성적으로 활성화시키는 능력을 포함하는 시스테인 잔기를 포함하는 237 내지 254 사이 위치에서 1 내지 10개 아미노산 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 IL-7 수용체는 IL-7Rα-insPPCL (서열번호:82로 제시됨)이다. 게다가, 본 명세서에서 제공된 일부 키메라 림프증식성 요소 (CLE) 구현예에서, 도메인 중 전부가 아닌 하나 이상이 IL-7Rα-insPPCL로부터의 것이다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 키메라 사이토카인 수용체 예컨대 비제한적으로, 상응하는 활성화된 야생형 사이토카인 수용체 예컨대 STAT3, STAT4, 및 예시적인 구현예에서, STAT5와 동일한 STAT 경로를 전형적으로 구성적으로 활성화시키는 그것의 수용체에 결박된 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는, 링커를 통해 그것의 동족수용체, 또는 이의 단편에 결박되거나 또는 공유결합된 인터류킨, 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 IL-7Rα에 결박된 IL-7이다. 다른 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 IL-7Rα의 도메인, 예컨대 예를 들어, IL-7Rα의 세포외 도메인 및/또는 IL-7Rα의 막관통 도메인에 결박된 IL-7이다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인에 결박되지 않은 사이토카인 수용체이고, 그리고 사실상 예시적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 림프증식성 요소는 사이토카인에 결박되지 않은 구성적으로 활성 사이토카인 수용체이다. 이들 키메라 IL-7 수용체는 전형적으로 구성적으로 발현시 STAT5를 활성화시킨다.
림프증식성 요소가 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 폴리펩타이드, 또는 이의 단편인, 림프증식성 요소를 포함하는 본 명세서에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 링커를 통해 그것의 동족 인터류킨 수용체 폴리펩타이드의 부분에 공유결합된 인터류킨 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족 인터류킨 수용체의 이 부분은 인터류킨 사이토카인 및 막관통 도메인을 결합할 수 있는 세포외 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 동족 인터류킨 수용체의 세포내 부분이다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 림프구 증식을 증진할 수 있는 상이한 사이토카인 수용체의 세포내 부분이다. 일부 구현예에서 림프증식성 요소는 링커를 통해 그것의 전장 동족 인터류킨 수용체 폴리펩타이드에 공유결합된 인터류킨 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 이들의 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 수용체 또는 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토카인 수용체는 CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3R, EPOR, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR1, IFNGR2, IFNLR1, IL1R1, IL1RAP, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RG, IL2RB, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL6ST, IL7RA, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL12RB1, IL13RA2, IL15RA, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL20RB, IL21R, IL22RA1, IL23R, IL27R, IL31RA, LEPR, LIFR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18일 수 있다. 상기-열거된 사이토카인 수용체의 기능적 세포내 도메인을 포함하는 키메라 사이토카인 수용체의 예시적인 구현예가 포함된 이들 기능적 세포내 도메인이 림프증식성 요소로 기능할 수 있는 그 키메라 사이토카인 수용체를 확인하기 위해 실시예 17 및 18에서 시험되었다.
특정 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 Jak/STAT5 경로를 활성화시키는, 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 수용체, 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 그러한 림프증식성 요소는 IL21R, IL27R, IL31RA, LIFR, 및 OSMR의 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 실시예 17 및 18의 실험 및 표 7 내지 17에서 나타낸 바와 같이, 이들 유전자의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 림프증식성 요소는 외인성 사이토카인 예컨대 IL-2의 부재에서 배양된 PBMC에서 최고 규모의 증식을 유도한 후보 키메라 폴리펩타이드 중에서 발견되었다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 인터류킨 또는 인터류킨 수용체이고, 실시예 17 및 18 (표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B, 및/또는 4.1B에서 확인된 상위 구조체의 일부인 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 수용체이고 실시예 17 및 18 (표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B, 및/또는 4.1B에서 확인된 상위 구조체의 일부인 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함하고 실시예 17 및 18 (표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B, 및/또는 4.1B에서 확인된 상위 구조체의 일부인 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18 (표 19 내지 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 IL7R, IL12RB1, IL15RA, 또는 IL27RA로부터의 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18 (표 19 내지 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL1RL1, IL2RA, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RB, IL18R1, IL18RAP, IL20RB, IL22RA1, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함하고, 실시예 17 및 18 (표 19 내지 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A, 또는 FCGR2C로부터의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단지 단일 세포내 도메인을 갖는 구조체에서 활성인 것으로 실시예 17 및 18에서 나타난 이 단락에서의 림프증식성 요소는 2개 또는 그 초과의 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서 단일 세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소, 즉 림프증식성 요소가 2개 또는 그 초과의 세포내 도메인을 포함하지 않는, 림프증식성 요소의 세포내 도메인일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소에서 세포내 도메인은 단일 세포내 신호전달 도메인으로 실시예 18 (표 22 및 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, MYD88, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소에서 세포내 도메인은 실시예 18 (표 22 및 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 IL7R 또는 IL12RB1로부터의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소에서의 세포내 도메인은 사이토카인 수용체일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 단일세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소에서의 사이토카인 수용체는 실시예 18 (표 22 및 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소에서의 세포내 도메인은 적어도 하나의ITAM 모티프를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의ITAM 모티프를 포함하는 림프증식성 요소에서의 세포내 도메인은 실시예 18 (표 22)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 FCGR2A로부터의 도메인을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18 (표 19 내지 23)에서 상세히 된 바와 같이 초기 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타낸 구조체에 존재한 CD27, CD28, OX40 (또한 일명 TNFRSF4), GITR (또한 일명 TNFRSF18), 또는 HVEM (또한 일명 TNFRSF14)로부터의 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 작제물 M024-S190-S047, M025-S050-S197, M036-S170-S047, M012-S045-S048, M049-S194-S064, M025-S190-S050, M025-S190-S05, E013-T041-S186-S051, E013-T028-S186-S051, E014-T015-S186-S051, E011-T016-S186-S050, E011-T073-S186-S050, 또는 E013-T011-S186-S211 중 하나일 수 있고, 이들 모두는 실시예 21 (도 35 및 36)에서 나타낸 바와 같이 형질도입 후 휴면 중인 림프구의 증식을 자극했다. 특정 구현예에서, 림프증식성 요소는 CSF3R, IL3RA, ICOS, CRLF, CSF2RA, LIFR, 또는 CD40으로부터 세포외 도메인; MyD88, CD40, 또는 MPL로부터 제1 세포내 도메인, 및/또는 CD27 또는 MyD88로부터 제2 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 작제물 E013-T041-S186-S051일 수 있고, 이것은 실시예 22 (도 38A 및 B)에서 도시되고 분석된 바와 같이 UCHT1scFvFc-GPI를 나타내는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입 후 휴면 중인 림프구의 증식을 자극했다. 다른 구현예에서 림프증식성 요소는 실시예 22에서 도시되고 분석된 바와 같이 IL7-IL7RA-IL2RB이다.
실시예 17에서 상세히 된 바와 같이, 라이브러리 1A 및 1.1A의 경우, 사이토카인 수용체 CD27, IL1RL1, IL6R, IL31RA, TNFRSF4, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A 및 1.1A 양자에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타냈다 (표 19).
실시예 17에서 상세히 된 바와 같이, 라이브러리 2B 및 2.1B의 경우, 사이토카인 수용체 CD40, FCER1G, FCGR2C, IFNGR2, GHR, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RB, IL22RA1, TNFRSF14, 또는 TNFRSF9로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 2B 및 2.1B 양자에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)를 나타냈다 (표 20).
실시예 18에서 상세히 된 바와 같이, 라이브러리 3A 및 3.1A의 경우, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CSF2RA, FCGR2A, MPL, OSMR, TNFRSF4, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3A 및 3.1A 양자에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)을 나타냈다 (표 21).
실시예 18에서 상세히 된 바와 같이, 라이브러리 3B 및 3.1B의 경우, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1RL1, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL18RAP, IL20RB, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3B 및 3.1B 양자에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)을 나타냈다 (표 22).
실시예 18에서 상세히 된 바와 같이, 라이브러리 4B 및 4.1B의 경우, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL2RA, IL3RA, IL2RG, IL6R, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL31RA, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, MPL, OSMR, TNFRSF4, TNFRSF9, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 4B 및 4.1B 양자에서 특히 주목할만한 강화 (즉 유발된 최고 규모의 증식)을 나타냈다 (표 23).
특정 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 PBMC 증식을 증진하는 것으로 본 명세서에서의 실시예에서 실증된 CD40, MPL 및 IL2Rb의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 수용체 이외의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토카인 수용체 이외의 림프증식성 요소는 CD2, CD3D, CD3G, CD3Z, CD4, CD8RA, CD8RB, CD28,CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, 또는 ICOS로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 이들 인용된 유전자를 포함하는 키메라 림프증식성 요소의 예시적인 구현예는 실시예 17 및 18, 및 그 안에서 인용된 표에 제공되어 있다.
일부 구현예에서, CLE는 IL-2/IL-15 수용체에 결박된 IL-15 이외에 있다.
본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, 림프증식성 요소의 발현은, 비-제한적인 구현예에서 리보스위치인 조절 요소 (본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같음)에 화합물에 의해 유도되고 그리고 더욱이는 이에 의존적일 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터로부터 발현된다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에 대해, 숙련가는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성이고 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 또는 이들의 임의의 성분을 발현하기 위해 사용될 수 있는 프로모터가 알려져 있다는 것을 인지할 것이다. 예시적인 구현예에서, 그러한 프로모터는 포장 세포주, 예컨대 본 명세서에서 개시된 패키징 라인에서 활성이 없다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터 또는 쥣과 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다 (Jones 등, Human Gene Therapy (2009) 20: 630-40). 예시적인 구현예에서, 프로모터는 T 세포 특이적 CD3 제타 프로모터이다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 미세환경 제한적이다. 예를 들어, 림프증식성 요소는 비정상적인 상태 대 생리적 상태에서 차별적으로 그것의 각각의 사이토카인을 결합하는 돌연변이된 수용체일 수 있다. 예를 들어, 정상 생리적 환경에서보다 종양 환경에서 더 강하게 IL7을 결합할 수 있는 IL-7R이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 인식 또는 제거 도메인에 융합된다. 그와 같은 인식 또는 제거 도메인은 본 명세서에서 보다 상세히 개시되어 있다. 그와 같은 융합은, 특히 절단된 또는 다른 돌연변이된 림프증식성 요소가 사용되는 경우, 레트로바이러스 게놈에서 폴리뉴클레오타이드를 덜 요구하는 이점을 제공한다. 이것은 레트로바이러스 게놈에 포함되는 기능적 요소를 인코딩하는 핵산을 더 많이 허용하는데 도움이 되고, 그리고 그것의 증식이 더 이상 요구되지 않거나 또는 유기체에 해로운 경우 림프증식성 요소를 발현하는 세포가 사멸될 수 있는 기전을 부가하기 때문에 본 명세서에서 제공된 예시적 구현예에서 중요하다.
일부 구현예에서, CLE를 포함하는 림프증식성 요소는 본 명세서에서 상기에 개시된 바와 같이 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 일부 예시적 구현예에서 림프증식성 요소는 ITAM-함유 도메인을 포함한 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CLE이다. 이와 같이, CLE는 본 명세서에 제공된 CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, DAP12, FCERlG,FCGR2A, FCGR2C. DAP10/CD28, 또는 ZAP70 도메인에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 세포내 활성화 도메인은 CD3D, CD3G, CD3Z, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A, 또는 FCGR2C로부터의 ITAM-함유 도메인이다. 이들 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CLE는 외인성 사이토카인 예컨대 외인성 IL-2의 부재에서 생체외 배양에서 PBMC의 증식을 증진하는데 효과적인 것으로, 본 명세서에서의 실시예 17 및 18, 및 연관된 표 18-23에서 실증된다. 일부 구현예에서, CD3D, CD3G, CD3Z, CD79A, FCER1G로부터의 세포내 도메인을 포함하는 CLE가 본 명세서에 제공된다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소의 하나 이상의 도메인은 CAR의 공통자극 도메인 및/또는 세포내 활성화 도메인에 융합된다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이 키메라 림프증식성 요소는 이것이 ASTR을 포함하지 않기 때문에 키메라 항원 수용체 (CAR)가 아니다. 그러나, 일부 구현예에서, 림프증식성 요소의 하나 이상의 세포내 도메인은 CAR과 동일한 폴리펩타이드의 일부일 수 있거나 또는 CAR의 일부 성분에 융합될 수 있고 선택적으로 기능적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 림프증식성 요소는 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR)에 융합될 수 있고 그것의 항원에 ASTR의 결합에 의해 활성화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 ASTR, 세포내 활성화 도메인 (예컨대 CD3 제타 신호전달 도메인), 공통자극 도메인, 및 림프증식성 도메인을 포함할 수 있다. 공통자극 도메인, 세포내 활성화 도메인, ASTR 및 다른 CAR 도메인에 관한 추가의 세부사항은 본 명세서에서 다른 곳에 개시되어 있다.
본 명세서에서 예시적인 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소는, 전형적으로 그의 게놈이 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 일부로서 T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소를 인코딩하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포를 형질도입함에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 휴면 중인 NK 세포 안으로 도입된다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 또한 T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소이다. 상기에 논의된 바와 같이, 림프증식성 요소의 일부는 증식을 증진할 뿐만 아니라, 이들은 또한 세포 생존을 증진한다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 생존 세포 모티프는 림프증식성 요소가 아니다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포 생존 모티프는 CD28 T 세포 생존 모티프 또는 CD137 세포 생존 모티프일 수 있다. 그와 같은 T 세포 생존 모티프는 ASTR, 예컨대 scFv를 포함하는 조작된 신호전달 폴리펩타이드 상에서 발견될 수 있었다. 예시적인 구현예에서, T 세포 생존 모티프는 CD8a 막관통 도메인 또는 CD28 막관통 도메인을 통해 scFv에 연결된 CD28 T 세포 생존 모티프 또는 CD137 모티프이다. 특정 구현예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 폴리펩타이드 서열은 CD3ζ 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 폴리펩타이드가 아니고, 오히려 억제성 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 임의의 양태에 따른 과정의 방법, 용도, 조성물, 및 생성물은 억제성 RNA를 포함하는 림프증식성 요소와 조작된 신호전달 폴리펩타이드인 림프증식성 요소 둘 모두를 포함한다. 림프증식성 요소가 억제성 RNA인 구현예에서, 그 억제성 RNA는 전형적으로 SOCS 경로에서 음성 조절 인자의 다운-조절을 저하 또는 야기함에 의해 STAT5의 활성화를 강화함에 의해 STAT5 경로를 자극하는 miRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 비제한적으로 ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL, 및 PD1과 같이, 증식에 영향을 주는 단백질을 인코딩하는 mRNA에 대한 것이다. 예시적인 구현예에서, 본 명세서에서 예시된 바와 같이, 그러한 억제성 RNA (예를 들어 miRNAs)는, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 의해 유도된 발현으로, 포장 세포 및/또는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자 게놈 및/또는 레트로바이러스 벡터에 인트론에 위치될 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 전사 단위 안에 인트론의 봉입은 전사체의 더 높은 발현 및/또는 안정성을 초래하는 것으로 여겨진다. 이와 같이, 레트로바이러스 게놈의 인트론 내에 miRNA를 위치시키는 능력은 최대 활성을 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스 게놈의 크기 제한으로 하려고 시도하는 선행 기술에서의 문제를 극복하는 본 개시내용의 교시를 부가한다. 일부 구현예에서, 그 중 하나 이상이 각각 ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL, 및 PD1 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산을 결합하는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 miRNA, 예시적인 구현예에서 2 내지 5, 예를 들어 4 miRNA가 재조합레트로바이러스 게놈에 포함될 수 있고, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 표적 세포, 예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포로 전달될 수 있다.　사실상, 본 명세서에서 제공된 바와 같이 1, 2, 3, 또는 4 miRNA가 단일 인트론 예컨대 EF1a 인트론에 전달될 수 있다.
ABCG1은 흉선 세포 및 주변 림프구 증식을 부정적으로 조절하는 ATP-결합 카셋트 수송체이다 (Armstrong 등 2010. J Immunol 184(1):173-183).
SOCS1은 Jak/Stat 경로 예컨대 STAT5를 억제하는 사이토카인 신호 형질도입의 음성 조절 인자의 SOCS (사이토카인 신호전달의 억제제) 계열의 구성원이다. SOCS1은 JAB (야누스 키나제 결합 단백질), SSI-1 (Stat-유도된 Stat 억제제-1), 및 TIP3 (Tec-상호작용 단백질)으로도 알려져 있다.
TGFbR2는 그런 다음 핵에 도입하여 증식에 관련된 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 인산화하는 복합체를 형성하는, TGF-β를 결합하는 세린/트레오닌 단백질 키나제 계열의 구성원이다.
SMAD2는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β의 신호를 매개하고 다중 세포 과정, 예컨대 세포 증식, 세포자멸사, 및 분화를 조절한다.
cCBL은 ZAP-70의 탈인산화 및 불활성화에 의해 그리고 TCR의 내재화를 통해 TCR 신호전달을 억제하는 E3 유비퀴틴 리가제이다.
PD1 (CD279)은 T 세포 및 ProB 세포 상에 발현된 세포 표면 수용체이다. PD-1은 2개의 리간드인, PD-L1 및 PD-L2를 결합한다. PD-1을 통한 신호전달은 세포의 활성화를 방지하는 기능을 한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 림프증식성 요소는 표 18의 임의의 유전자의 세포내 영역을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 표 18에서 키메라 폴리펩타이드에서 확인된 세포내 도메인이거나 또는 이를 포함한다. 이들 구현예에서, 림프증식성 요소는 키메라 폴리펩타이드 (하기 CLE 참고)인 폴리펩타이드일 수 있거나, 또는 CLE는 아니지만 표 18의 P3 (제1 세포내 도메인) 위치에서 확인된 유전자의 세포내 도메인이거나 또는 이를 포함한다. 표 18은 7일째와 제2 세포내 도메인이 작제물 상에 존재하지 않는 마지막 일 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진한 CLE를 확인한다. 이 구현예의 일부 하위구현예에서, 림프증식성 요소는 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 갖거나 갖지 않는 막관통 도메인 및 세포내 도메인의 조합을 포함하는 키메라 폴리펩타이드 (즉 CLE - 하기 참조)이다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 MPL을 포함하거나, 또는 MPL, 또는 MPL의 막관통 및/또는 세포외 도메인을 갖거나 갖지 않는, MPL의 세포내 도메인의 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%를 포함하는, MPL의 막관통 및/또는 세포외 도메인을 갖거나 갖지 않는, MPL의 세포내 도메인에 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 변이체 및/또는 단편을 포함한, 변이체 및/또는 이의 단편이고, 여기서 변이체 및/또는 단편은 PBMC, 일부 구현예에서 T 세포의 세포 증식을 증진시키는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 조성물 및 방법에 포함된 MPL 단편은 JAK-2 결합 도메인을 가지고 및/또는 보유한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 포함된 MPL 단편은 STAT를 활성화시키는 능력을 가지거나 보유한다. MPL의 전체 세포내 도메인은 서열번호:491 (표 7 내지 18에서의 S186 부분)이다. MPL은 트롬보포이에틴에 대한 수용체이다. 몇개의 사이토카인 예컨대 트롬보포이에틴 및 EPO는 문헌 및 본 명세서에서 호르몬 또는 사이토카인 중 어느 하나로 언급된다.
본 개시내용의 별개의 양태를 제공하는 일부 구현예에서, 키메라 림프증식성 요소 (CLE), 뿐만 아니라 이것을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열인 키메라 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다. 예시적인 CLE는 도 30-33에 예시되어 있다. 본 명세서에서 CLE는 T 세포 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 증진하고 그리고 선택적으로 또한 T 세포 및/또는 NK 세포의 생존을 증진할 수 있다. 일부 CLE는 다른 유형의 PBMC, 예를 들어 B 세포의 증식 및 선택적으로 또한 생존을 증진한다. CLE 및 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에서 제공된 구현예는 편리를 도모하기 위해 본 명세서에서 CLE CAR 폴리뉴클레오타이드 구현예로 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, CLE는 막관통 도메인 및 제1 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 게다가, 예시적인 구현예에서, 도 30-33에서 나타낸 바와 같이, CLE는 세포외 도메인 및/또는 제2 세포내 도메인 (그리고 추가 구현예에서, 제3, 제4, 등의 세포내 도메인)을 포함한다. 본 명세서에서 키메라 폴리펩타이드는 키메라인데, 이는 적어도 하나의 도메인이 다른 도메인 중 적어도 하나와 상이한 폴리펩타이드로부터의 것이고 그러한 키메라는 인간 개입 없이 유기체에서 자연적으로 발견되지 않기 때문이다. 일부 CLE는 수용체에 대한 리간드를 포함하고 일부 CLE은 수용체에 대한 리간드를 포함하지 않는다.
이론에 의해 제한되지 않고, 그러한 CLE는 구성적 방식 (즉 활성화를 위한 리간드 결합의 요건 없이)에서 B 세포, NK 세포, 및/또는 T 세포에서의 증식 및 선택적으로 세포 생존을 증진하도록 설계되었다. CLE의 어느 것도 자연에서 발견되지 않고, 많은 CLE는 생체내 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 일반적으로 발현되지 않는 성분을 가지고 및/또는 일부 후보 CLE는 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 세포 증식 및/또는 세포 생존 신호전달을 구체적으로 증진하는 것으로 일반적으로 알려지지 않았다. 예를 들어, MPL은 B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에서 일반적으로 발현되지 않는다. 놀랍게도, 신규한 CLE은 PBMC 세포 증식을 촉진한, 실시예 17 및 18에서 제시된 다수의 후보 키메라 폴리펩타이드를 스크리닝함에 의해 확인되었다. 그와 같은 CLE은, 정의된 TCR을 발현하도록 유전자적으로 조작된 CAR-T 및 T-세포와 같이, 중요한 임상적으로-관련된 기술에 유익할 수 있는 것과 같이, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 증식 및 선택적으로 생존을 또한 자극하는 기전을 확인하는 오랫동안 느낀 욕구를 충족하는데 도움을 준다. 이와 같이, 일부 CLE은 숙주를 림프구고갈할 필요 없이 생체내 팽창하는 능력을 T 세포 및/또는 NK 세포에 제공할 것이라고 여겨진다.
본 명세서에 제공된 키메라 림프증식성 요소, 및 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 림프증식성 요소를 포함하는 본 명세서에 제공된 임의의 양태에 포함될 수 있다. 예를 들어, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 본 명세서에 제공된 양태에서의 CLE일 수 있거나, 또는 포함할 수 있다. 게다가, CLE를 구체적으로 포함하는 본 발명의 별개의 양태가 제공된다. 예를 들어, 그러한 양태는 단리된 키메라 림프증식성 폴리펩타이드, 이를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열, 및 그러한 핵산 서열 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한 벡터를 포함한다. 그와 같은 양태는 추가로 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 벡터로, PBMC, 예컨대 B 세포, 또는 특히 T 세포 및 NK 세포를 형질도입하거나 또는 형질감염하는 방법을 포함한다. 그와 같은 세포는 단리된, 변화되지 않은 세포일 수 있거나, 또는 이들은 정의된 TCR, 또는 CAR-T 세포를 발현하는 것과 같이, 유전자 변형된 세포와 같이 변형된 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, CLE는 동일한 단백질, 예시적인 구현예에서 동일한 수용체, 그 중 어느 하나는 예시적인 구현예에서 돌연변이체이고, 따라서 세포외 및 막관통 도메인을 형성하는 것으로부터의 것인 세포외 부분 및 막관통 부분 둘 모두를 포함한다. 이들 도메인은 일부 구현예에서 적어도 일부 세포 유형으로 발현될 때 구성적으로 활성인 것으로 보고된 사이토카인 수용체, 또는 이들의 돌연변이체, 또는 호르몬 수용체, 또는 이들의 돌연변이체로부터의 것일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 그러한 세포외 및 막관통 도메인은 리간드 결합 영역을 포함하지 않는다. 그러한 도메인은 CLE에 존재하고 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 발현될 때 리간드를 결합하지 않는 것으로 여겨진다. 그러한 수용체 돌연변이체에서의 돌연변이는 막관통 영역 또는 세포외 병치막 영역에서 발생할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 본 명세서에 제공된 CLE의 적어도 일부 세포외- 막관통 도메인에서의 돌연변이는 정상적으로 함께 있지 않은 사슬을 함께 활성화시킴에 의해, 또는 연결된 막관통 및/또는 세포내 도메인의 확인을 변화시킴에 의해 리간드의 부재에서 CLE의 신호전달을 담당한다.
본 명세서에 제공된, 수용체 돌연변이체의 그러한 막관통 도메인을 이용하는 일 측면은 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,:
하나 이상의 핵산 서열 중 제1 핵산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 하기를 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 인코딩한다;
(a) 사이토카인 수용체 또는 호르몬 수용체로부터 세포외 및 막관통 도메인으로서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인 중 적어도 하나는 사이토카인 수용체의 구성적으로 활성인 돌연변이체 상에서 발견된 돌연변이를 포함하고 그리고 여기서 세포외 서열은 사이토카인 수용체의 리간드를 결합하지 않고; 그리고
(b) 표7 내지 11에서 확인된 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 선택적으로 제2 도메인을 갖는 유전자의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진한다.
이들 구현예에서 그러한 세포외 및 막관통 도메인의 세포외 영역은 전형적으로 링커, 예시적인 구현예에서 막관통 도메인과 또 다른 기능적 펩타이드 영역, 예컨대 청소능 도메인 사이의 가요성 링커로, 일부 구현예에서, 세포외 영역의 아미노 말단에 연결된 링커를 형성하기에 충분히 길다. 따라서, 세포외 영역은 세포외 및 막관통 도메인을 형성하기 위해 존재하는 경우, 1 내지 1000개 아미노산일 수 있고, 전형적으로 4 내지 400개 아미노산. 4 내지 200개 아미노산, 4 내지 100개 아미노산, 4 내지 50개 아미노산, 4 내지 25개 또는 4 내지 20개 길이의 아미노산이다. 일 구현예에서, 세포외 영역은 본 발명의 양태의 세포외 및 막관통 도메인에 대해 GGGS이다.
아래에 더 상세히 논의된 바와 같이, 예를 들어 실시예 17의 라이브러리 1A, 1.1A, 1.1B, 2B 및 2.1B에서 나타낸 바와 같이 일 부분으로 세포외 및 막관통 도메인을 포함하는 구현예의 일부이거나, 또는 실시예 18의 라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 3.1B, 4B,및 4.1B에서 나타낸 바와 같이 세포외 이량체화 모티프를 포함하는 구현예의 일부로서 이든 간에 막관통 도메인은 전형적으로 적어도 원형질막을 가로지르기에 충분히 길다. 따라서, 막관통 도메인 또는 세포외 및 막관통 도메인의 막관통 영역은 10 내지 250개 아미노산일 수 있고, 그리고 더욱 전형적으로 적어도 15개 길이의 아미노산이고, 그리고 예를 들어 15 내지 100개, 15 내지 75개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 또는 15 내지 30개 아미노산일 수 있다.
그러한 도메인을 포함하는 구현예의 CLE에 대한 예시적인 세포외 및 막관통 도메인은, 예시적인 구현예에서, 구성적인 것으로 보고되고, 연관된 세포내 도메인의 활성화를 위한 리간드 결합을 요하지 않는 돌연변이체 수용체로부터 막관통 도메인을 따라 전형적으로 막-근위 세포외 도메인의 30개 아미노산 미만인, 세포외 영역이다. 예시적인 구현예에서, 그러한 세포외 및 막관통 도메인은 IL7RA Ins PPCL, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C, 및 MPL S505N을 포함한다. 그러한 세포외 및 막관통 도메인의 추가의 비-제한적인예는 표 6에 제공되고 실시예 17 및 상응하는 표에 예시된다. 일부 구현예에서, 세포외 및 막관통 도메인은 IL7RA, 또는 이들의 돌연변이체의 세포외 및/또는 막관통 도메인의 부분에 순차적으로 동일한 10, 20, 25 30 또는 50개 연속적인 아미노산보다 많이 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포외 및 막관통 도메인은 IL7RA Ins PPCL 이외에 있다. 일부 구현예에서, 세포외 및 막관통은 IL15R의 세포외 및/또는 막관통 도메인의 부분에 순차적으로 동일한 10, 20, 25, 30 또는 50개 연속적인 아미노산보다 많이 포함하지 않는다.
추가의 예시적인 막관통 도메인은 실시예 18에 제공되어 있다. 이들 막관통 도메인은 예시적인 구현예에서 유형 I 막관통 단백질로부터의 것이다.
따라서 일 양태에서 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 제공되되,:
하나 이상의 핵산 서열 중 제1 핵산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 하기를 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 인코딩한다;
a) 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 도메인; 및
b) 표 12 내지 17에서 확인된 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 갖는 유전자의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진한다.
예시적인 구현예에서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 PBMC, 예를 들어 B 세포 및/또는 NK 세포, 및/또는 예시적인 구현예에서 T 세포의 세포 증식을 촉진한다. 실시예 18에서 나타낸 바와 같이, 그러한 키메라 폴리펩타이드는 배양 동안 외인성 사이토카인 예컨대 IL-2, IL-15, 또는 IL-7에 대한 PBMC의 노출의 부재에서, 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 발현하는 PBMC (예를 들어 B 세포, T 세포, 또는NK 세포)의 배양 배지에 대한 IL-2을 첨가하는 것을 배제하여, PBMC의 세포 증식을 증진시킬 수 있다. 실시예 18에서 예시된 바와 같이, 그러한 구현예의 경우, IL-2는 PBMC의 형질도입 동안에 첨가될 수는 있지만, 후속적인 배양에서는 그렇지 않다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 키메라 폴리펩타이드는 림프증식성 요소인데, 이는 이들이 키메라 림프증식성 요소를 인코딩하는 핵산으로 PBMC의 형질도입 후 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 7일의 배양 후 PBMC (예를 들어 T 세포)의 배양 동안 IL-2를 부가함이 없이 PBMC, 및 예시적인 구현예에서, T 세포의 세포 증식 및 선택적으로 세포 생존을 증진할 수 있기 때문이다. 실시예 21은 림프증식성 요소를 확인하고 분석하는데 사용될 수 있는 방법의 또 다른 실시예를 제공한다. 그와 같은 분석은, 예를 들어 그러한 림프증식성 요소를 발현하지 않는 대조군 림프구에 비교하여 그러한 림프증식성 요소를 발현하는 유전자 변형된 림프구에 의해 제공된 강화의 규모를 분석함에 의해, 예를 들어, 그러한 림프증식성 요소의 상대적인 림프증식성 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
이 양태의 일 구현예에서, 제1 핵산 서열은 추가로 세포외 도메인을 인코딩하고, 그리고 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. 이 양태의 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어 c-jun으로부터의 것이다. 특정 구현예에서 c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드 영역이다.
임의의 이들 양태의 구현예 및 막관통 도메인이 유형 I 막관통 단백질인 구현예에서, 막관통 도메인은 유형 I 성장 인자 수용체, 호르몬 수용체, T 세포 수용체, 또는 TNF-계열 수용체일 수 있다. 임의의 양태의 일 구현예 및 키메라 폴리펩타이드가 세포외 도메인을 포함하고, 그리고 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 구현예에서, 막관통 도메인은 유형 I 사이토카인 수용체, 호르몬 수용체, T 세포 수용체, 또는 TNF-계열 수용체일 수 있다.
예시적인 막관통 도메인은 실시예 18에서 사용된 임의의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD4, CD8RB, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2C, GHR, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IFNGR2, IL1R1, IL1RAP, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6ST, IL7RA, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL22RA1, IL31RA, LEPR, PRLR, 및 TNFRSF8, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진, 이들의 돌연변이체로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40, ICOS, FCGR2C, PRLR, IL3RA, 또는 IL6ST로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 막관통은 표 12 내지 17 중 임의의 하나 이상의 작제물에서 이들 유전자에 대해 제공된 특이적 막관통 도메인 또는 이들 표의 제1 50, 25 또는 10 열거된 작제물에서 임의의 작제물로부터의 막관통 도메인이다. 예시적인 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40 또는 ICOS, 비-제한적인 예로서 표 6에 제공된 이들 유전자에 대한 막관통 도메인, 또는 막관통되는 능력을 보유하는 이의 단편, 및/또는 특정 세포 유형에서 구성적 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체로부터의 것이다.
이 양태로부터 예시적인 막관통 도메인은 표 12 내지 17에서 P2로 도시되어 있다. 라이브러리 3A에 대해, CD40, CD8B , CRLF2, CSF2RA, GCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA, LEPR, 및 PRLR, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인 (P2)은, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 막관통 도메인 위치 (P2)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 막관통 도메인을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 간주될 때 7일째와 마지막 일 사이에서 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 실시예 17 및 18에서 제공된 스크린에서, 세포는 라이브러리를 함유하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입되고 그 다음 실시예 17 및 18에서 논의된 바와 같이 PBMC가 공급되거나, 또는 PBMC가 공급되지 않았다. 세포에 PBMC가 공급된 스크린은 라이브러리 번호 후에 "A"로 확인되고, 예를 들어 라이브러리 1A이고 세포에 PBMC가 공급되지 않은 스크린은 라이브러리 번호 후에 "B"로 확인되고, 예를 들어 라이브러리 1.1B이다. 추가로, ".1"을 함유하는 라이브러리로 확인된 스크린, 예를 들어 라이브러리 1.1A는 ".1" 없는 상응하는 라이브러리의 스크린에 동일한 방식으로 수행되었고, 예를 들어 라이브러리 1.1A는 라이브러리 1A의 반복 스크린이었다. 라이브러리 3B의 경우, CD40, ICOS, CSF2RA, IL18R1, IL3RA, 및 TNFRSF14, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 구성적 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인은 세포 증식을 가장 잘 증진할 수 있었다. 라이브러리 4B의 경우, IL3RA, CSFR2RA, IL18R1, CD8B, CD40.ICOS, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 구성적 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인은 세포 증식을 가장 잘 증진할 수 있었다. 예시적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 CLE에서 막관통 도메인은 CD40 및 ICOS로부터의 막관통 도메인이다. 라이브러리 3A, 3B, 3,1A, 3,1B, 4B, 및 4.1B에 대한 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 막관통 도메인 또는 일부 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 실시예 18에 제공된 표에 제공되어 있다.
본 명세서에서 임의의 양태의 일부 구현예에서 키메라 폴리펩타이드는 CSF2RB의 막관통 도메인 돌연변이체 V449E 이외의 표 12 내지 17에 도시된 임의의 작제물에서 확인된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 및 막관통 도메인은 바이러스 단백질 LMP1, 또는 돌연변이체 및/또는 이의 단편이다. LMP1은 지질 뗏목을 표적화하거나 CD40에 융합될 때 리간드와 독립적으로 세포 신호전달을 활성화시키는 것으로 알려진 다중길이 막관통 단백질이다 (Kaykas 등 EMBO J. 20: 2641 (2001)). LMP1의 단편은 전형적으로 원형질막에 걸치고 연결된 세포내 도메인(들)을 활성화시키기에 충분히 길다. 예를 들어, LMP1은 15 내지 386, 15 내지 200, 15 내지 150, 15 내지 100, 18 내지 50, 18 내지 30, 20 내지 200, 20 내지 150, 20 내지 50, 20 내지 30, 20 내지 100, 20 내지 40, 또는 20 내지 25개 아미노산일 수 있다. LMP1의 돌연변이체 및/또는 단편은 본 명세서에 제공된 CLE에 포함될 때, 세포내 도메인을 활성화시키는 그것의 능력을 보유한다. 게다가, 존재할 경우, 세포외 도메인은 적어도 1, 그러나 전형적으로 적어도 4개 아미노산을 포함하고, 그리고 전형적으로 또 다른 기능적 폴리펩타이드, 예컨대 청소능 도메인, 예를 들어, eTag에 연결된다.
본 명세서에 제공된 CLE의 다른 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모이어티를 포함한다. 본 명세서에서 개시된 많은 상이한 이량체화 모이어티가 이들 구현예에 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 이량체화 모이어티는 동종이량체화일 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이량체화 모이어티는 막관통 도메인을 통해 여기에 연결된 세포내 도메인 상에 활성화 기능을 제공할 수 있다. 그와 같은 활성화는, 예를 들어, 이량체화 모이어티의 이량체화에 의해 제공될 수 있어, 막관통 도메인을 통해 여기에 연결된 세포내 도메인의 배향에서의 변화를 야기할 수 있거나, 또는 세포내 도메인이 근접하게 할 수 있다. 이량체화 모이어티를 갖는 세포외 도메인은 또한 CLE를 발현하는 세포에 인식 태그를 연결하는 기능을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 제제는 세포외보다는 세포내에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 1 초과 또는 다중의 이량체화 도메인이 사용될 수 있다.
세포외 도메인이 이량체화 모티프를 갖는 구현예에 대해 세포외 도메인은 이량체, 예컨대 류신 지퍼 이량체를 형성하기에 충분히 길다. 이와 같이, 이량체화 모이어티를 포함하는 세포외 도메인은, 예시적인 구현예에서 표 6에 제공된 c-Jun 세포외 도메인의 c-Jun 부분인, 15 내지 100, 20 내지 50, 30 내지 45, 또는 35 내지 40개 아미노산일 수 있다. 이량체화 모이어티를 포함하는 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 다른 작용기를 함유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 류신 지퍼 구현예의 경우, 그러한 류신 지퍼는 이들이 알파 나사선 구조를 따라 떨어진 류신 이격된 7개 잔기의 모티프를 보유하기 때문에 이량체를 형성할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 제공된 CLE의 특정 구현예의 류신 지퍼 모이어티는 그것의 DNA 결합 기능을 보유할 수 있거나 하지 않을 수 있다.
이 유형의 하나의 예시적인 세포외 도메인은 Jun 단백질, 예컨대 c-Jun으로부터의 류신 지퍼 도메인이다. 예를 들어, 세포외 도메인은 NM_002228_3에서 발견된 c-Jun의 변이체일 수 있다 (표 6). 그와 같은 세포외 도메인은 실시예 18에서 논의된 작제물에 사용되었다.
1 내지 4개 알라닌 잔기의 스페이서가 이량체화 모이어티를 갖는 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이의 CLE에 포함될 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 알라닌 스페이서는 세포내 도메인의 배향을 변화시킴에 의해 막관통 도메인을 통해 류신 지퍼 세포외 영역에 연결된 세포내 도메인의 신호전달에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 제공된 CLE의 제1 및 제2 세포내 도메인은 적어도 일부 세포 유형에서, 증식, 생존 (항-세포자멸적)을 증진시키고 및/또는 분화 상태, 증식성 포텐셜 또는 세포사에 대한 저항을 고양하는 공통자극 신호를 제공하는 것으로 알려진 유전자의 세포내 신호전달 도메인이다. 이와 같이, 이들 세포내 도메인은 본 명세서에 제공된 림프증식성 요소로부터의 세포내 도메인 및 공통자극 도메인일 수 있다. 후보 키메라 폴리펩타이드의 세포내 도메인 중 일부는 JAK1/JAK2 신호전달 및 STAT5를 활성화시키는 것이 알려져 있다. 제1 세포내 도메인에서 발견되는 유전자 및 이들의 세포내 도메인은 제2 세포내 도메인과 동일하지만, 단, 만일 제1 및 제2 세포내 도메인이 동일하면, 적어도 하나, 전형적으로 둘 모두가 막관통 도메인 및 세포외 도메인이 동일한 유전자로부터의 것이 아니다.
예시적인 세포내 도메인은 표 7 내지 11에 열거된 작제물로부터의 것들을 포함한다. 실시예 17의 실험에서 활성인 것으로 실험적으로 결정된 이들 유전자로부터의 예시적인 세포내 도메인이 실시예 17에서 제공된 표의 제1 세포내 도메인 (P3) 및 제2 세포내 도메인 (P4) 위치에 제공되어 있고 하기 이 부문에서 추가로 열거된 바와 같다. 실시예 17 스크린에 대해 최상부 히트에서 확인된 예시적 세포내 도메인은 CD40, CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL, 및 MyD88을 포함했다. 실시예 18 스크린에 대해 최상부 히트에서 확인된 예시적 세포내 도메인은 CD40, LEPR, MyD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R, 또는 CSF2RA를 포함했다. 특정 예시적인 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 MPL, LEPR, MyD88, 또는 IFNAR2이다. 이들 특정 예시적인 구현예의 경우 비제한적인 예시적인 제2 세포내 도메인 (P4) 도메인들은 표 12 내지 17에 제공된 상응하는 MPL, LEPR, MyD88, IFNAR2, CD40, CD79B, 또는 CD27 제1 세포내 도메인 (P3)에, 일부 비-제한적인 예에서 이들 표에서 제공된 이들 유전자에 대한 제1 및/또는 제2 세포내 도메인을 포함하여, 연결된 유전자의 것들이다. 이들 특정 예시적인 구현예의 경우 다른 비제한적인 예시적인 제2 세포내 도메인 (P4) 도메인들은 실시예 18에서 제공된 표에서 상응하는 MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2, CD40, CD79B, 또는 CD27 제1 세포내 도메인에, 비-제한적인 예에서 이들 표에서 제공된 이들 유전자의 제1 및/또는 제2 세포내 도메인을 포함하여, 연결된 유전자의 것들이다. 일부 구현예에서, 키메라 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18의 표 19-23에서의 임의의 폴리펩타이드일 수 있다.
특정 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4, 및 TNFRSF8, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체로부터의 것이다, 특정 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인은, 예시로 CD40, CD79B, 및 CD27의 세포내 도메인을 포함한, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G, 또는 CD27이다. 이들 특정 예시적인 구현예의 경우 비제한적인 예시적인 제1 세포내 도메인 (P3)은, 비-제한적인 예로서, 이들 표에 제공된 유전자들의 제1 및/또는 제2 세포내 도메인을 포함한, 예시로 표 12 내지 17에서 CD40, CD79B, 또는 CD27의 세포내 도메인을 포함하여, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G, 또는 CD27에 연결된 유전자의 것들이다. 이들 특정 예시적인 구현예의 경우, 다른 비제한적인 예시적인 제1 세포내 (P3) 도메인은, 비-제한적인 예로서, 이들 표에 제공된 유전자들의 제1 및/또는 제2 세포내 도메인을 포함한, 예시로 실시예 18에서 제공된 P3 같은 이들 유전자에 대해 표에서 CD40, CD79B, 및 CD27 제2 세포내 도메인의 세포내 도메인을 포함하여, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G, 또는 CD27에 연결된 유전자의 것들이다.
세포 생존 및 증식을 촉진한 작제물 내에서 실시예 17 및 18에서 확인된 상기 유전자의 서열 정보, 대략 예시적인 세포내 도메인을 포함한 상세한 정보가 표 6에 제공된다. 본 명세서에서 제공된 CLE 구현예에 포함될 수 있는 세포내 도메인은 그러한 돌연변이체 및/또는 단편이 증식, 생존 (항-세포자멸적)을 증진시키고 및/또는 분화 상태, 증식성 포텐셜 또는 세포사에 대한 저항을 향상시키는 공통자극 신호를 제공하는 능력을 보유한다면 인용된 유전자의 세포내 도메인의 돌연변이체 및/또는 단편을 포함한다. 이와 같이, 세포내 도메인은, 예를 들어, 10 내지 1000, 10 내지 750, 10 내지 500, 10 내지 250, 10 내지 100개 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, CLE의 모든 도메인은 IL-7 수용체, 또는 이들의 돌연변이체, 및/또는 IL-7 수용체의 적어도 10, 15, 20, 또는 25개 인접 아미노산을 갖는 이의 단편 이외의 것이거나, 또는 IL-15 수용체, 또는 이들의 돌연변이체, 및/또는 IL-15 수용체의 적어도 10, 15, 20, 또는 25개 인접 아미노산을 갖는 이의 단편 이외에 있다. 일부 구현예에서, CLE는 CD40 및 MyD88의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 조합을 포함하지 않는다.
예시적인 구현예에서, CLE는 인식 및/또는 제거 도메인을 포함한다. 인식 및/또는 제거 도메인에 관한 세부 사항은 본 명세서에서 다른 부문에 제공되어 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 인식 및/또는 제거 도메인은 CLE의 일부일 수 있다. 전형적으로 인식 도메인은 세포외 도메인의 N 말단에 연결된다. 이론에 의해 제한되지 않고, 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 링커, 예시적인 구현예에서 CLE를 발현하는 세포에 인식 도메인을 연결하는 가요성 링커를 제공하는 기능을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 도 30 및 도 32에 예시된 바와 같이, 본 명세서에 제공된 CLE는 본 명세서에서 제공되거나 또는 달리는 당 업계에서 알려진 임의의 CAR 구현예에 따라 설계될 수 있는 CAR과 공-발현된다.
본 명세서에서 제공된 일부 구현예는, 도 30-33에서 예시된 바와 같이, 본 명세서에 제공된 임의의 CLE를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열이다. 그와 같은 단리된 폴리뉴클레오타이드는 전사체, 예컨대 CLE를 인코딩하는 전사체의 발현을 제공하는 것에 대해 당 업계에서 알려진 임의의 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 적절한 그와 같은 프로모터는 당해 기술에 공지되어 있고, 그의 일부는 본 개시내용의 다른 부문에서 확인된다. 숙련가는 실시예 17 및 18에서 더 상세히 논의된 바와 같이, 예를 들어, 본 명세서에서 제공된 임의의 CLE 구현예를 발현하기 위해, 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 이를 함유하는 벡터를 어떻게 디자인할지를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 코작 서열이 CLE의 아미노 말단 아민산을 인코딩하는 ATG 개시 부위의 10개 뉴클레오타이드 업스트림 또는 동일한 전사 단위 상에 CLE에 업스트림 위치한 CAR 내에 제공된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 코작-관련된 서열, WPRE 요소, 및 다중 중지 서열, 예를 들어 이중 중지 서열 또는 삼중 중지 서열 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
게다가, 본 명세서에 제공된 CLE를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 전형적으로 원형질막에 대한 직접적인 발현을 위한 신호서열을 포함한다. 예시적인 신호서열은 본 명세서에 다른 부문에 제공된다. 요소는 CAR 및 CLE 둘 모두가 동일한 전사체로부터 발현되도록 전사체 상에 제공될 수 있다. 그와 같은 작제물은 이들 요소가 상이한 전사체로부터 발현되는 경우보다 적은 핵산을 필요로 하여 유리하며, 이는 그러한 작제물이 예를 들어 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포를 형질감염 또는 형질전환시키기 위해 사용된 벡터, 예컨대 레트로바이러스 게놈 안에 존재할 수 있게 하는 중요한 특징이다.
수많은 키메라 폴리펩타이드 후보가 본 명세서에서 실시예 17 및 18에서 림프증식성 요소로서 설계되고 확인되었다. 키메라 폴리펩타이드 및 CAR을 인코딩한 작제물을 포함한 라이브러리 1A의 경우, IL-2의 부재에서 배양될 때 7일째와 마지막일 사이에 PBMC 증식을 촉진한 172개 최상부 후보 키메라 폴리펩타이드가 확인되었다 (표 7 참고). 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하지만 CAR을 포함하지 않는 작제물을 포함한 라이브러리 2B의 경우, IL-2의 부재에서 배양될 때 7일째와 마지막일 사이에 PBMC 증식을 촉진한 167개 최상부 후보 키메라 폴리펩타이드가 확인되었다 (표 8 참고). 특정 예시적 CLE, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 인코딩하는 핵산 서열 및 이들 중 임의의 것을 포함하는 방법은 표 7 내지 11에서 제공된 작제물에 대한 매칭된 도메인을 갖는 유전자 (예를 들어 막관통 유전자 및 제1 세포내 유전자 및 선택적으로 제2 세포내 유전자)로부터 세포내 도메인, 뿐만 아니라, 비-제한적인 예에서, 이들 표에 제공된 특이적 매칭된 도메인을 포함하며, 이들의 일부는 본 명세서에서 예시적인 구현예 부문에서 제시되어 있다. 예시적인 구현예에서, 동일한 P1-P2, P3 및 P4 도메인, 예를 들어 라이브러리 1A 및 1.1A로 제1 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에 대한 매칭된 도메인 (예를 들어 막관통 유전자 및 제1 세포내 유전자 및 선택적으로 제2 세포내 유전자)를 갖는 CLE로부터의 세포내 도메인이 표 7 내지 11에서 나타낸 바와 같이 사용될 수 있다. 라이브러리 1A 및 1.1A의 경우, 작제물 M001-S116-S044, M024-S192-S045, M001-S047-S102, M048-S195-S043, M012-S216-S211, 및 M030-S170-S194가 양 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 가졌다.
양 라이브러리 1A 및라이브러리 1.1A의 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에서 제1 및 제2 세포내 도메인에 대한 추가 정보가, 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지 여부를 포함하여 표 19에 제공되어 있다. 실시예 17에서 나타낸 바와 같이, 제1 세포내 도메인 (P3)에 존재할 때, IL6R, MYD88, CD27, MYD88, TNFRSF18, 또는 IL31RA로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 존재할 때, CD8B, IL1RL1, CD8A, TNFRSF4, 또는 MYD88로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A 및 1.1A 양자에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 19). 제1 세포내 도메인 (P3)에 존재할 때 사이토카인 수용체 IL6R, CD27, TNFRSF18, 또는 IL31RA로부터 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 존재할 때 사이토카인 수용체 IL1RL1 또는 TNFRSF4로부터 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A 및 1.1A 양자에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 19).
라이브러리 2B 및 2.1B에 대해, 작제물 M007-S049-S051, M007-S050-S039, M012-S050-S043, M012-S161-S213, M030-S142-S049, M001-S145-S130, M018-S085-S039, M018-S075-S053, M012-S135-S074, 및 M007-S214-S077은 양 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 가졌다. 반복된 스크린의 목적에 대해, 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)/(7일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
양 라이브러리 2B 및 라이브러리 2.1B의 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에서 제1 및 제2 세포내 도메인에 대한 추가 정보가, 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지 여부를 포함하여 표 20에 제공되어 있다. 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 CD28, CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA, 또는 TNFRSF14로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD40, CD3G, CD8A, TNFRSF9, CD28, IL10RB, CD79B, FCER1G, 또는 GHR로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물이 라이브러리 2B 및 2.1B 둘 모두에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 20). 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 사이토카인 수용체 CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA, 또는 TNFRSF14로부터 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 사이토카인 수용체 TNFRSF9, IL10RB, FCER1G, GHR, 또는 CD40으로부터 도메인을 갖는 작제물이 라이브러리 2B 및 2.1B 둘 모두에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 20). 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때, FCGR2C로부터 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD3G, CD79B, 또는 FCER1G로부터 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물이 라이브러리 2B 및 2.1B 둘 모두에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 20).
초기의 중간 분석에서, 키메라 폴리펩타이드 및 CAR을 인코딩한 작제물을 포함한 라이브러리 3A의 경우, IL-2의 부재에서 배양될 때 실시예 18에서 제시된 형질도입되지 않은 PBMC로 자극된 형질도입된 PBMC에서 7일째와 마지막일 사이에서 PBMC 증식을 촉진한 126개의 최상부 후보 키메라 폴리펩타이드가 확인되었다 (표 12 참고). 키메라 폴리펩타이드 및 CAR을 인코딩한 작제물을 포함한 라이브러리 3B의 초기의 중간 분석의 경우, IL-2의 부재에서 배양될 때 실시예 18에서 제시된 형질도입되지 않은 PBMC로 자극되지 않은 형질도입된 PBMC에서 7일째와 마지막일 사이에서 PBMC 증식을 촉진한 127개의 최상부 후보 키메라 폴리펩타이드가 확인되었다 (표 13 참고). 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하지만 CAR은 하지 않는 작제물을 포함한 라이브러리 4B의 경우, IL-2의 부재에서 배양될 때 실시예 18에서 제시된 형질도입되지 않은 PBMC로 자극되지 않은 형질도입된 PBMC에서 7일째와 마지막일 사이에서 PBMC 증식을 촉진한 154개의 최상부 후보 키메라 폴리펩타이드가 확인되었다 (표 16 참고).
키메라폴리펩타이드 및 CAR을 인코딩한 작제물 및 신선한 형질도입되지 않은 PBMC가 보충된 (라이브러리3A) 또는 보충되지 않은 (라이브러리3B) 형질도입된 PBMC를 포함한, 라이브러리 3A 및 3B에서 심층 디코딩을 제공한, 추가의 디코딩 후, IL-2의 부재 (즉 IL-2는 초기 형질도입 후 배양 동안 배양 배지에 첨가되지 않음), IL-7의 부재, 또는 임의의 다른 외인성 사이토카인의 부재에서 배양될 때 7일째와 마지막일 사이에서 PBMC 증식을 촉진한 134개 최상부 후보가 21일째에 라이브러리 3A에 대해 확인되었고, 124개 최상부 후보가 35일째에 라이브러리 3A에 대해 확인되었고, 그리고 131개 최상부 후보가 21일째에 라이브러리 에3B 대해 확인되었다 (각각 표 12 및 13 참고).
특정 예시적 CLE, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 인코딩하는 핵산 서열 및 이들 중 임의의 것을 포함하는 방법은 표 12 내지 17에서 제공된 작제물에 대한 매칭된 도메인을 갖는 유전자 (예를 들어 막관통 유전자 및 제1 세포내 유전자 및 선택적으로 제2 세포내 유전자)로부터 세포내 도메인, 또는 신호전달 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체뿐만 아니라, 비-제한적인 예에서, 이들 표에 제공된 특이적 매칭된 도메인을 포함하며, 이들의 일부는 본 명세서에서 예시적인 구현예 부문에서 제시되어 있다. 제1 세포내 도메인 또는 제2 도메인 위치 중 어느 하나로부터, 실시예 17 및 실시예 18에 제공된 데이터에서 확인된 세포내 도메인은 제1 및 제2 세포내 도메인 중 어느 하나로 교환가능하게 예시적인 CLE 구현예에서 구상된다. 예시적인 구현예에서, 동일한 P1, P2, P3, 및 P4 도메인, 예를 들어 라이브러리 3A 및 3.1A로 제1 스크린 및 반복된 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물 상에 매칭된 도메인 (예를 들어 막관통 유전자 및 제1 세포내 유전자 및 선택적으로 제2 세포내 유전자)을 갖는 유전자로부터의 세포내 도메인이 사용될 수 있다. 라이브러리 3A 및 3.1A에 대해, 작제물 E008/E013-T041-S186-S050, E006/E011-T077-S186-S211, E007/E012-T021-S186-S051, E009/E014-T041-S186-S053, E007/E012-T073-S186-S053, E006/E011-T017-S186-S051, E006/E011-T031-S186-S211, E006/E011-T011-S186-S050, E006/E011-T011-S186-S047, E007/E012-T001-S186-S050, E006/E011-T041-S186-S051, E008/E013-T028-S186-S076, E009/E014-T029-S199-S053, E009/E014-T062-S186-S216, E007/E012-T006-S058-S051, E009/E014-T076-S186-S211, 및 E007/E012-T001-S186-S047이 양 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 가지고, 여기서 슬래시에 의해 분리된 P1 부분은 표 6, 12, 및 14에서 나타낸 바와 같이 라이브러리 3A 및 3.1A에 대한 상이한 태그를 포함했다. 반복된 스크린의 목적에 대해, 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)/(7일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
양 라이브러리 3A 및 라이브러리 3.1A의 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에서 제1 및 제2 세포내 도메인에 대한 추가 정보가, 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지 여부를 포함하여 표 21에 제공되어 있다. 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 MPL, OSMR, 또는 CSF2RA로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD40, TNFRSF4, CD79B, CD27, FCGR2A, 또는 TNFRSF18로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물은 양 라이브러리 3A 및 3.1A에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 21). 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 사이토카인 수용체 MPL, OSMR, 또는 CSF2RA로부터 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 사이토카인 수용체 CD40, TNFRSF4, CD27, FCGR2A, 또는 TNFRSF18로부터 도메인을 갖는 작제물은 양 라이브러리 3A 및 3.1A에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 21). 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 MPL 또는 OSMR로부터 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물은 양 라이브러리 3A 및 3.1A에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 21).
라이브러리 3B 및 3.1B의 경우, 작제물 E007/E012-T017-S186-S051, E007/E012-T073-S186-S053, E008/E013-T028-S186-S047, E006/E011-T011-S186-S047, E007/E012-T082-S176-S214, E006/E011-T046-S186-S052, E008/E013-T029-S186-S052, E009/E014-T011-S186-S053, E008/E013-T032-S186-S039, E007/E012-T034-S186-S051, E007/E012-T041-S192-S213, E006/E011-T014-S069-S213, E006/E011-T022-S186-S053, E006/E011-T023-S115-S075, E006/E011-T029-S106-S213, E006/E011-T032-S155-S080, E006/E011-T041-S186-S216, E006/E011-T057-S135-S080, E006/E011-T072-S191-X002, E006/E011-T077-S186-S216, E006/E011-T080-S141-S080, E007/E012-T001-X001-S214, E007/E012-T007-S059-S211, E007/E012-T016-S186-S052, E007/E012-T031-S186-S053, E007/E012-T044-S102-S052, E007/E012-T044-S142-X002, E007/E012-T055-S069-S053, E007/E012-T063-S176-S216, E007/E012-T065-S157-S075, E008/E013-T008-S085-X002, E008/E013-T011-S085-S048, E008/E013-T021-S109-X002, E008/E013-T021-S168-S211, E008/E013-T032-S064-S214, E008/E013-T037-S170-S215, E008/E013-T038-S176-S048, E008/E013-T039-S137-S216, E008/E013-T041-S141-S053, E008/E013-T045-S177-S048, E008/E013-T048-S109-S074, E008/E013-T073-S199-S075, E009/E014-T001-S157-S074, E009/E014-T005-S196-S049, E009/E014-T011-S130-X002, E009/E014-T013-S155-X002, E009/E014-T017-S186-S076, E009/E014-T021-S142-S080, E009/E014-T023-S082-S076, E009/E014-T038-S196-S037, E009/E014-T055-S186-S052, E009/E014-T060-S175-S053, E009/E014-T070-S085-S212, E008/E013-T026-S054-S213, E009/E014-T007-S120-S053, E007/E012-T045-S186-S211, E008/E013-T073-S186-X002, E008/E013-T074-S186-X002, E007/E012-T055-S186-S053, E008/E013-T036-S186-S053, E007/E012-T017-S058-S053, E008/E013-T030-S189-S080, E006/E011-T029-S081-S047, E009/E014-T044-S194-S050, E006/E011-T028-S121-X002, E008/E013-T028-S186-S053, E009/E014-T078-S142-S213, E009/E014-T041-S186-S051, E008/E013-T006-S186-S050, E006/E011-T028-S186-S075, E006/E011-T040-S120-S038, E007/E012-T044-S115-S211, E009/E014-T039-S176-S075, E007/E012-T028-S186-S050, E008/E013-T031-S202-S050, E007/E012-T072-S192-S053, E006/E011-T065-X001-S051, E007/E012-T030-S062-X002, E007/E012-T073-S186-X002, E009/E014-T056-S186-S053, E008/E013-T046-S137-X002, E006/E011-T016-S136-S076, E007/E012-T032-S142-S037, E007/E012-T065-S120-S215, E009/E014-T077-S186-S047, E009/E014-T001-S126-S051, E006/E011-T030-S121-S039, E008/E013-T006-S176-S213, E009/E014-T032-S130-S215, E008/E013-T041-S186-S039, E009/E014-T021-S186-S047, E008/E013-T026-S137-S214, E007/E012-T029-S116-S075, E008/E013-T026-S106-S049, 및 E007/E012-T032-S168-S075가 양 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 가지고, 여기서 슬래시에 의해 분리된 P1 부분은 표 6, 13, 및 15에서 나타낸 바와 같이 라이브러리 3B 및 3.1B에 대한 상이한 태그를 포함했다. 반복된 스크린의 목적에 대해, 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)/(7일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
양 라이브러리 3B 및 라이브러리 3.1B의 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에서 제1 및 제2 세포내 도메인에 대한 추가 정보가, 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지 여부를 포함하여 표 22에 제공되어 있다. 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 MPL, LEPR, MYD88, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R, 또는 IL15RA로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD40, CD79B, CD27, TNFRSF14, CD79A, CD3G, TNFRSF9, FCGR2C, ICOS, TNFRSF18, TNFRSF4, CD28, FCER1G, FCGR2A, CD3D, TNFRSF8, 또는 CD3E로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 3B 및 3.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 22). 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 사이토카인 수용체 MPL, LEPR, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R, 또는 IL15RA로부터 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 사이토카인 수용체 CD40, CD27, TNFRSF14, TNFRSF9, FCGR2C, TNFRSF18, TNFRSF4, FCER1G, FCGR2A, 또는 TNFRSF8로부터 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 3B 및 3.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 22). 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD79B, CD79A, CD3G, FCGR2C, FCER1G, FCGR2A, CD3D, 또는 CD3E로부터 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 3B 및 3.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 22).
라이브러리 4B 및 4.1B의 경우, 작제물 E007/E012-T078-S154-S047, E008/E013-T062-S186-X002, E008/E013-T055-S186-S050, E009/E014-T057-S186-S050, E007/E012-T077-S054-S053, E007/E012-T034-S135-S211, E009/E014-T071-X001-S216, E009/E014-T011-S141-S037, E008/E013-T041-S186-S037, E006/E011-T038-S106-S039, E006/E011-T011-S121-X002, E007/E012-T007-S085-S215, E006/E011-T041-S186-S050, E007/E012-T008-S064-S051, E006/E011-T041-S186-S047, E008/E013-T045-S186-S051, E008/E013-T003-S104-S216, E006/E011-T019-S186-S053, E008/E013-T071-S064-S080, E006/E011-T021-S054-X002, E006/E011-T003-S135-X002, E009/E014-T020-S199-S213, E008/E013-T027-S121-S211, E009/E014-T032-S195-X002, E009/E014-T050-S171-X002, E008/E013-T069-S083-X002, E008/E013-T026-S116-S038, E009/E014-T072-S195-X002, E007/E012-T047-S058-S211, E008/E013-T046-S142-S080, E006/E011-T065-S186-S076, E006/E011-T062-S069-X002, E007/E012-T047-S098-X002, E009/E014-T069-S099-S048, E008/E013-T039-S141-S050, E006/E011-T052-S130-S052, E008/E013-T041-S186-X002, E007/E012-T019-S120-X002, E008/E013-T045-S186-S053, E006/E011-T003-S170-S039, E007/E012-T047-S058-S051, E007/E012-T069-S109-X002, E009/E014-T019-S130-S075, 및 E006/E011-T047-S054-S053이 양 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 가지고, 여기서 슬래시에 의해 분리된 P1 부분은 표 6, 16, 및 17에서 나타낸 바와 같이 라이브러리 4B 및 4.1B에 대한 상이한 태그를 포함했다. 반복된 스크린의 목적에 대해, 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)/(7일에 대한 정규화된 카운트 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다. 양 라이브러리 4B 및 라이브러리 4.1B의 스크린에서 특히 주목할만한 강화를 갖는 작제물에서 제1 및 제2 세포내 도메인에 대한 추가 정보가, 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지 여부를 포함하여 표 23에 제공되어 있다. 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, MYD88, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB, 또는 IL3RA로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD27, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF18, CD3D, CD3G, CD27, ICOS, TNFRSF9, CD3E, FCGR2A, CD28, CD79A, 또는 FCGR2C로부터 세포내 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 4B 및 4.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 23). 제1 세포내 도메인 (P3)에 있을 때 사이토카인 수용체 IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB, 또는 IL3RA로부터 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 사이토카인 수용체 CD27, CD40, TNFRSF4, TNFRSF18, TNFRSF9, FCGR2A, 또는 FCGR2C로부터 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 4B 및 4.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 23). 제2 세포내 도메인 (P4)에 있을 때 CD79B, CD3D, CD3G, CD3E, FCGR2A, CD79A, 또는 FCGR2C로부터 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물이 양 라이브러리 4B 및 4.1B에서 특히 주목할만한 강화를 나타냈다 (표 23).
일부 예시적 구현예에서, CLE는 표 19-23의 임의의 작제물에서 사이토카인 수용체로부터 세포내 도메인을 포함한다. 일부 예시적 구현예에서, CLE는 단지 단일세포내 도메인 (다른 P3 또는 P4은 링커 또는 중지임)을 갖는 표 19-23의 임의의 작제물로부터 세포내 도메인을 포함한다.
본 명세서에 제공된 다양한 예시적인 CLE 도메인에 대한 정보는 표 6에서 발견된다. 예를 들어, 표 7에서 확인된 제1 CLE는 M008-S212-S075이다. 이 CLE의 경우, 세포외 및 막관통 도메인 (P1-2)은 M008이고, 제1 세포내 도메인 (P3)은 S212이고, 그리고 제2 세포내 도메인 (P4)은 S075이다. 이들 도메인 또는 이를 인코딩하는 핵산을 고려할 때 모듈, 예를 들어 M008의 동일성에 대한 상세한 정보는 표 6에서 발견된다. 표 6은 M008이 ECDTM-8이다는 것과 그리고 더 구체적으로 이것은 PPCL 삽입을 갖는 인터류킨 7 수용체 알파 (IL7RA) 돌연변이체이고 작제물은 eTag를 포함한다는 것을 개시한다.
라이브러리 1A의 경우, CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, 및 TNFRSF9로부터의 세포내 도메인, 또는 신호전달 활성을 가지는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 후보 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 위치 (P3)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인 (P3)을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 고려될 때 7일째와 마지막일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제2 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제1 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체를 포함하여, CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, 및 TNFRSF9로부터 세포내 도메인을 갖는다.
라이브러리 1A의 경우, CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS , IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9, 및 TNFRSF18로부터 세포내 도메인, 또는 신호전달 활성을 가지는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 후보 키메라 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인 위치 (P4)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인 (P4)을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 고려될 때 7일째와 마지막일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 실시예 17에서의 표에 제공된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제1 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체를 포함하여, CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS , IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9, 및 TNFRSF18로부터 세포내 도메인을 갖는다.
라이브러리 3A의 경우, CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL, 및 MyD88로부터 제1 세포내(P3) 도메인, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제1 세포내 도메인 위치 (P3)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 간주될 때 7일째와 마지막일 사이 또는 7일째와 21일째 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 이 결론은, 유전자에 대한 모든 작제물에 대한 결과가 조합될 때, 표에서 지시된 마지막일에서의 정규화된 카운트 플러스 1과 7일째에 정규화된 카운트 플러스 1 사이의 비의 베이스 2에서 로그로 계산된 강화가 라이브러리 3A에 대해 적어도 2가 되도록, 혼합 배양된 PBMC 세포 모집단에서의 작제물의 서열 카운트의 강화에 기반된다. 라이브러리 3B의 경우, CSF2RB, IL4R, 및 MPL로부터 제1 세포내 도메인, 또는 그러한 돌연변이체 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는 이런 식으로 분석될 때 최상의 수행자였다. 라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 및 3.1B에 대해 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 표 12-15에 제공된다.
라이브러리 3A의 경우, CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4, 및 TNFRSF8로부터 제2 세포내(P4) 도메인, 또는 그러한 돌연변이체가 실시예 18에서 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제2 세포내 도메인 위치 (P4)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 간주될 때 7일째와 21일째 사이 또는 7일째와 표에 지시된 마지막일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 이 결론은, 유전자에 대한 모든 작제물에 대한 결과가 조합될 때, 표에서 지시된 마지막일에서의 정규화된 카운트 플러스 1과 7일째에 정규화된 카운트 플러스 1 사이의 비의 베이스 2에서 로그로 계산된 강화가 라이브러리 3A에 대해 적어도 2가 되도록, 혼합 배양된 PBMC 세포 모집단에서의 작제물의 서열 카운트의 강화에 기반된다. 라이브러리3A 및 3B에 대해 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 표 12 내지 17에 제공된다.
초기의 중간 디코딩 분석 후, 라이브러리 3A의 경우, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R, 및 MPL로부터 제1 세포내(P3) 도메인, 또는 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제1 세포내 도메인 위치 (P3)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 간주될 때 7일째와 21일째 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 라이브러리 3B의 경우, IL21R, MPL, 및 OSMR로부터 제1 세포내 도메인, 또는 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 이런 식으로 분석될 때 최상의 수행자였다. 라이브러리 3A 및 3B에 대해 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 표 18에 제공된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제2 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제1 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유한 이들의 돌연변이체를 포함한, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R, 및 MPL F9로부터 세포내 도메인을 갖는다.
초기 디코딩 분석 후, 라이브러리 3A의 경우, CD27, CD3G, CD40, 및 CE79B로부터 제2 세포내(P4) 도메인, 또는 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제2 세포내 도메인 위치 (P4)에서 발견될 때, 데이터가 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인을 갖는 모든 작제물에 대해 조합된 방식으로 간주될 때 7일째와 표에 지시된 마지막일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 라이브러리 3B의 경우, CD40으로부터 제2 세포내 도메인, 또는 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 증진하는 것으로 알려진 이들의 돌연변이체는 이런 식으로 분석될 때 최상의 성능이었다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제1 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유한 이들의 돌연변이체를 포함한, CD27, CD3G, CD40, 및 CE79B로부터 세포내 도메인을 갖는다.
표 12 내지 17에서 나타낸 바와 같이, MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2로부터 제1 세포내(P3) 도메인, 또는 일부 경우에 신호전달 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 위치 (P3)에서 발견될 때, 최상부 후보 작제물에서 가장 빈번하게 발생하는 제1 세포내 도메인을 고려한 때 7일째와 실험의 종료 일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 라이브러리 3A, 3B에 대해 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 실시예 18에서의 표에 제공된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제2 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제1 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유한 이들의 돌연변이체를 포함한, MPL, LEPR, MYD88, IFNAR2로부터 세포내 도메인을 갖는다.
표 12 내지 17에서 나타낸 바와 같이, CD40, CD79B, CD27로부터 제2 세포내(P4) 도메인, 또는 일부 경우에 신호전달 활성을 보유하는 이들의 돌연변이체는, 본 명세서에서 후보 키메라 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인 위치 (P4)에서 발견될 때, 최상부 후보 작제물에서 가장 빈번하게 발생하는 제1 세포내 도메인을 고려한 때 7일째와 마지막일 사이에 PBMC의 증식을 촉진했다. 라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 3,1B, 4B, 및 4.1B에 대해 세포 증식을 촉진한 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 부분 및/또는 이들의 돌연변이체의 예는 실시예 18에서의 표에 제공된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 CLE의 예시적인 구현예는, 제1 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인 중 어느 하나로 신호전달 활성을 보유한 이들의 돌연변이체를 포함한, CD40, CD79B, CD27로부터 세포내 도메인을 갖는다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포 (즉 CLE)의 세포 증식을 촉진하는 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 항원-특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에서 제공된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 양태 및 구현예의 주목할만한 구현예에서, 상기 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다.
본 명세서에서 개시된 바와 같이, CLE로 본 명세서에서 예시된 바와 같은 림프증식성 요소는, 일부 예시적 구현예에서, 그 활성을 증진하고 및/또는 조절하는데 도움이 되는, 예를 들어 세포에서의 신호, 예컨대 단백질 활성 또는 유전자 발현에 영향을 주는 신호에 영향을 미치는 이량체화 모티프를 포함할 수 있다. 그와 같은 이량체화 모티프는 전형적으로 전체 세포외 도메인이거나 또는 그 일부이다. 일부 구현예에서, 이량체화 모이어티는 본 명세서에서 CLE의 세포외 도메인에서 인식 및 청소능 서열에 부착될 수 있다. 사실상, 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 세포외 도메인이 이량체화 모이어티를 포함하는 것을 제외하고 일 단백질로부터 전체 림프증식성 요소를 포함할 수 있다.
이량체화 제제, 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열을 포함하는 림프증식성 요소 및 CLE의 일부 구현예에서, 이량체화 모티프는 동종이량체로서 자연적으로 존재하는 막관통 동종이량체성 폴리펩타이드로부터의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이량체화 모티프는 본 명세서에서 실시예 18에서 예시된 바와 같이 류신 지퍼 폴리펩타이드, 예를 들어 Jun 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 막관통 동종이량체성 폴리펩타이드는 조기 활성화 항원 CD69 (CD69), 트랜스페린 수용체 단백질 1 (CD71), B-세포 분화 항원 (CD72), T-세포 표면 단백질 촉각체 (CD96), 엔도글린 (Cd105), 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (Cd161), P-셀렉틴 당단백질 리간드 1 (Cd162), 글루타밀 아미노펩티다아제 (Cd249), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 일원 16 (CD271), 카드헤린-1 (E-카드헤린) (Cd324), 또는 이들의 활성 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 모티프는 리간드 결합에 의해 이량체화하는 (또한 본 명세서에서 일명 이량체화제 또는 이량체화 제제) 막관통 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 모티프 및 이량체화제는 하기를 포함할 수 있다 (여기서 이량체화제는 이량체화제-결합쌍에 이어 괄호 안에 있음): FKBP 및 FKBP (라파마이신); GyrB 및 GyrB (코우메르마이신); DHFR 및 DHFR (메토트렉세이트); 또는 DmrB 및 DmrB (AP20187). 전술한 바와 같이, 라파마이신은 이량체화제로 작용할 수 있다. 대안적으로, 라파마이신 유도체 또는 유사체가 사용될 수 있다 (예를 들어, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; 및 문헌 [Ye et al (1999) Science 283:88-91] 참고). 예를 들어, 라파마이신에 구조적으로 관련된 유사체, 동족체, 유도체, 및 다른 화합물 ("라팔로그")은 그중에서도 라파마이신에 대비하여 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함한다: C7, C42 및/또는 C29에서 메톡시의 탈메틸화, 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 하이드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 5-원 프롤릴 고리로 6-원 피페콜레이트 고리의 대체; 및 사이클로헥실 고리에 대한 대안적인 치환 또는 치환된 사이클로펜틸 고리로 사이클로헥실 고리의 대체. 추가의 정보는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,525,610; 5,310,903 5,362,718; 및 5,527,907에 제시되어 있다. C-28 하이드록실기의 선택적 에피머화가 기재되었다 (예를 들어, WO 01/14387 참고). 라파마이신에 대한 대안적인 것으로 사용하기에 적합한 추가의 합성 이량체화 제제는 미국 특허 공보 번호 2012/0130076에 기재된 것들을 포함한다. 전술한 바와 같이, 코우메르마이신은 이량체화 제제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 코우메르마이신 유사체가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Farrar 등 (1996) Nature 383:178-181]; 및 미국 특허 번호 6,916,846 참고). 전술한 바와 같이, 일부 경우에, 이량체화 제제는 메토트렉세이트, 예를 들어, 비-세포독성, 호모-이중 작용성 메토트렉세이트 이량체이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,236,925 참고).
일부 구현예에서, 진핵세포의 원형질막에 존재하는 경우, 이량체화 모티프를 포함하는 림프증식성 요소, 예시적인 구현예에서 CLE는 이량체화 제제의 부재에서 활성일 수 있다. 예를 들어, 류신 지퍼-함유 이량체화 모티프를 포함하는, 또는 CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, Cd324, 이들의 활성 돌연변이체, 및/또는 이들의 활성 단편을 포함한 막관통 동종이량체성 폴리펩타이드로부터 이량체화 모티프를 포함하는 림프증식성 요소는 이량체화 제제의 부재에서 활성일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵세포의 원형질막에 존재하는 경우, 이량체화 모티프를 포함하는 림프증식성 요소는 이량체화제제의 존재에서 활성일 수 있다. 예를 들어, FKBP, GyrB, DHFR, 또는 DmrB로부터 이량체화 모티프를 포함하는 림프증식성 요소는 각각의 이량체화 제제 또는 그것의 유사체, 예를 들어 각각 라파마이신, 코우메르마이신, 메토트렉세이트, 및 AP20187의 존재에서 활성일 수 있다. 이량체화 모티프를 포함하는 폴리펩타이드를 이량체화하기 위한 이량체화제를 포함하는 림프증식성 요소, 예를 들어 CLE를 포함하는 방법 구현예에서, 이량체화제는 원하는 효과를 초래할 수 있는 임의의 편리한 수단을 사용하여 숙주 (대상체)에 투여될 수 있다. 따라서, 이량체화제는 투여를 위한 다양한 제형에 편입될 수 있다. 더 상세하게는, 이량체화제는 적절한 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제와 조합에 의해 약제학적 조성물에 제형화될 수 있고, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사, 흡입제 및 에어로졸인 제제에 제형화될 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 용량 수준이 특이적 이량체화제, 증상의 중증도, 및 부작용에 대한 대상체의 민감성의 기능에 따라 다양할 수 있다는 것을 쉽게 인정할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투약량은 다양한 수단에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
이량체화제는 생체내 및 생체외 방법뿐만 아니라 전신 및 국소화된 투여 경로를 포함하여 약물 전달에 대해 적합한 임의의 이용가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에 투여된다.
CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 임의의 양태 또는 구현예에서, 이량체화 모티프는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 류신 지퍼 모티프-함유 폴리펩타이드, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, 및 Cd324, 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 이들의 돌연변이체 및/또는 활성 단편. CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본 명세서에서 임의의 양태 및 구현예에서, 이량체화 모티프는 이량체화 제제를 요할 수 있고, 이량체화 모티프 및 연관된 이량체화 제제는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: FKBP 및 라파마이신 또는 그것의 유사체, GyrB 및 코우메르마이신 또는 그것의 유사체, DHFR 및 메토트렉세이트 또는 그것의 유사체, 또는 DmrB 및 AP20187 또는 그것의 유사체뿐만 아니라, 이량체화하는 능력을 보유하는 인용된 이량체화 단백질의 돌연변이체 및/또는 활성 단편.
CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본 명세서에서 임의의 양태 또는 구현예의 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼 모티프는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어 c-jun으로부터의 것이다. 특정 구현예에서 c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드 영역이다.
림프증식성 요소를 포함하는 본 명세서에서 제공된 임의의 양태 및 구현예에서, 림프증식성 요소는 막 표적화 영역, 이량체화 (또는 다량체화) 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 선택적으로 제2 세포내 도메인, 그리고 추가로 선택적으로 제3 세포내 도메인, 그리고 선택적으로 제4 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있되, 제1 및 선택적인 제2, 제3, 및 제4 세포내 도메인 중 적어도 하나는 표 7 내지 17에서 확인된 세포내 도메인을 갖는 임의의 유전자로부터의 것이거나, 또는 표 7 내지 17에서 확인된 임의의 제1 및 제2 세포내 도메인로부터 선택되고, 그리고 여기서 상기 내부적으로 이량체화 및/또는 다량체화 림프증식성 요소는 PBMC, 및 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진한다. 그와 같은 폴리펩타이드는 본 명세서에서 내부적으로 이량체화 및/또는 다량체화 림프증식성 요소로 언급된다. 특정 구현예에서, 링커는 임의의 도메인 사이에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 세포내 도메인은 MyD88 및 CD40 이외에 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 MPL이거나, 또는 PBMC 세포 증식을 증진하는 능력을 보유하는 세포내 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 PBMC 세포 증식을 증진하는 능력을 보유하는 MPL 또는 세포내 이의 단편 이외에 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 PBMC 세포 증식을 증진하는 능력을 보유하는 MyD88 또는 세포내 이의 단편 이외에 있다.
예시적인 구현예에서 그러한 내부적으로 이량체화 및/또는 다량체화 폴리펩타이드 림프증식성 요소의 이량체화 도메인은 막 표적화 영역과 제1 세포내 도메인 사이에 위치한다. 특정 구현예에서 이량체화 (또는 다량체화) 도메인은 다량체화 또는 이량체화 리간드 결합 부위, 예컨대, 예를 들어, FKBP 영역, 예를 들어 FKBP12를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 세포외 도메인, 예컨대 본 명세서에 제공된, 예를 들어 인식 및 청소능 도메인을 갖거나 갖지 않는, 실시예 17의 표 7 내지 11에서 또는 실시예 18의 표 12 내지 17에서의 임의의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막 표적화 영역은 미리스토일화 영역, 팔미토일화 영역, 프레닐화 영역, 및 수용체의 막관통 서열로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 막 표적화 영역은 미리스토일화 영역이다. 내부적으로 이량체화 및/또는 다량체화 림프증식성 요소는 전형적으로 막 표적화 영역을 통해 원형질막에 결박되고, 예를 들어 N-말단 미리스테이트를 갖는 막에 결박된다. 예시적 구현예에서, FKBP 영역은 FK506을 결합한다.
내부적으로 이량체화 및/또는 다량체화 림프증식성 요소는 일 구현예에서 FK506-결합 단백질, FKBP12에 유전자적으로 융합된 분자를 가교결합하는 능력을 얻으면서 그것의 정상적 생물활성을 상실하는, 지질 침투성 면역억제제 약물, FK506의 이량체성 유사체를 사용하는 시스템의 일체 부이다. 하나 이상의 FKBP 및 미리스토일화 서열을 표적 수용체의 세포질 신호전달 도메인에 융합함에 의해, 리간드 및 도메인외-독립 방식이 아닌 이량체화제 약물-의존적으로 신호전달을 자극할 수 있다. 이것은 단량체성 약물 유사체, 및 향상된 특이성을 사용하여 일시적 제어, 가역성을 시스템에 제공한다. 제3-세대 AP20187/AP1903 이량체화제 약물의 그것의 결합 도메인, FKBP12에 대한 고친화도는 내인성 FKBP12를 통한 비-특이적 부작용의 유도 없이 생체내 재조합 수용체의 특이적 활성화를 허용한다. 이량체화제 약물을 결합하는 아미노산 치환 및 결실을 갖는 FKBP12 변이체, 예컨대 FKBP12V36이 또한 사용될 수 있다. 또한, 합성 리간드는 프로테아제 열화에 저항성으로, 이들을 가장 많이 전달된 단백질 제제보다 생체내 수용체를 활성화하는데 보다 효율적으로 한다
슈도타이핑 요소
본 명세서에 제공된 많은 방법 및 조성물은 슈도타이핑 요소를 포함한다. 이종성 외피 당단백질을 갖는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 슈도타이핑은 전형적으로 바이러스의 굴성을 변경하고 숙주 세포의 형질도입을 촉진한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 슈도타이핑 요소는 레트로바이러스 및 표적 숙주 세포막의 융합을 조정하는 하나 이상의 "융합유도 폴리펩타이드"와 표적 숙주 세포를 확인하고 결합하는, 하나 이상의 폴리펩타이드, 전형적으로 당단백질을 포함하는 "결합 폴리펩타이드"를 포함할 수 있고, 그것에 의해 레트로바이러스 게놈이 표적 숙주 세포 안으로 도입하게 한다. 본 명세서에서 제공된 일부 구현예에서, 슈도타이핑 요소는 폴리펩타이드(들)/단백질(들)로, 또는 폴리펩타이드(들)/단백질(들)을 인코딩하는 핵산 서열로 제공된다.
일부 구현예에서, 슈도타이핑 요소는 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피막 단백질, 온코레트로바이러스 암포트로픽 외피막 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피막 단백질, 소포성 구내염 바이러스 외피막 단백질 (VSV-G), 및/또는 파라믹소바이러스 홍역 외피막 단백질 H 및 F이다.
일부 구현예에서, 슈도타이핑 요소는 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩타이드 및 융합 유도 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 홍역 바이러스 (MV), 비-제한적인 예로서, MV의 임상 야생형 균주, 및 에드몬스톤 균주 (MV-Edm)를 포함한 백신 균주 또는 이의 단편의 융합 (F) 및 혈구 응집소 (H) 폴리펩타이드로 모조타이핑될 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않고, 혈구 응집소 (H) 및 융합 (F) 폴리펩타이드 둘 모두는 숙주 세포 안으로 도입에서 역할을 하는 것으로 여겨지고 여기서 H 단백질은 표적 세포 상에 수용체 CD46, SLAM, 및 Nectin-4에 MV를 결합시키고 그리고 F는 레트로바이러스 및 숙주 세포막의 융합을 조정한다. 특히 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인, 예시적인 구현예에서, 결합 폴리펩타이드는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드이고 융합유도 폴리펩타이드는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드이다.
일부 연구에서, 절단된 F 및 H 폴리펩타이드로 모조타이핑된 렌티바이러스 입자는 역가 및 형질도입 효율에서 유의미한 증가를 가졌다 (Funke 등 2008. Molecular Therapy. 16(8):1427-1436), (Frecha 등 2008. Blood. 112(13):4843-4852). 최고 역가는 F 세포질 꼬리가 30 잔기로 절단될 때 (MV(Ed)-FΔ30 (서열번호:105)으로 지칭됨) 수득되었다. H 변이체의 경우, 비록 알라닌으로 절단된 잔기의 대체가 있는 및 없는 24개 잔기의 절단을 갖는 변이체 (MV(Ed)-HΔ24 (서열번호:235) 및 MV(Ed)-HΔ24+A)도 또한 최적의 역가를 초래했지만, 최적의 절단은 18 또는 19 잔기가 결실될 때 (MV(Ed)-HΔ18 (서열번호:106)또는 MV(Ed)-HΔ19) 일어났다.
T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 것에 대한 것들을 포함한 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 홍역 바이러스 융합 (F) 및 혈구 응집소 (H) 폴리펩타이드의 돌연변이된 또는 변이체 버전, 예시에서, 홍역 바이러스 F 및 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체로 모조타이핑된다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 F 및 H 폴리펩타이드는 "절단된 H" 또는 "절단된 F" 폴리펩타이드로, 그의 세포질 부분은 절단되었고, 즉 아미노산 잔기 (또는 단백질을 인코딩하는 상응하는 핵산 분자의 코딩 핵산)는 결실되었다. "HΔY" 및 "FΔX"는 각각 그러한 절단된 H 및 F 폴리펩타이드를 지정하되, "Y"는 아미노 말단으로부터 결실되는 1-34개 잔기를 지칭하고 "X"는 세포질 도메인의 카복시 말단으로부터 결실되는 1-35개 잔기를 지칭한다. 추가 구현예에서, "절단된 F 폴리펩타이드"는 FΔ24 또는 FΔ30이고 및/또는 "절단된 H 단백질"은 HΔ14, HΔ15, HΔ16, HΔ17, HΔ18, HΔ19, HΔ20, HΔ21+A, HΔ24 및 HΔ24+4A, 더 바람직하게는 HΔ18 또는 HΔ24로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적인 구현예에서, 절단된 F 폴리펩타이드는 MV(Ed)-FΔ30이고 절단된 H 폴리펩타이드는 MV(Ed)-HΔ18이다.
일부 구현예에서, 융합유도 폴리펩타이드는 하나의 폴리펩타이드로 발현된 다중 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드는 별개의 리보솜 결합 부위로부터가 아닌 동일한 전사체로부터 번역된다; 다른 구현예에서, 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드는 이론에 구속되지 않고 문헌에서 일반적인 바와 같이 번역 후 절단되는 절단 펩타이드 부위 또는 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 결합 폴리펩타이드 및 융합유도 폴리펩타이드의 번역은 결합 폴리펩타이드에 비교될 때 융합유도 폴리펩타이드의 더 높은 양을 초래한다. 일부 구현예에서, 융합유도 폴리펩타이드 대 결합 폴리펩타이드의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다. 일부 구현예에서, 융합유도 폴리펩타이드 대 결합 폴리펩타이드의 비는 범위의 하단으로 1.5:1, 2:1, 또는 3:1 내지 범위의 상단으로 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1. 9:1 또는 10:1 사이이다.
활성화 요소
본 개시내용의 많은 방법 및 조성물 양태는 활성화 요소, 또한 본 명세서에서 일명 T 세포 활성화 요소, 또는 활성화 요소를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 휴면 중인 T 세포 안으로 렌티바이러스 (LV) 형질도입과 연관된 제한은 일련의 사전-진입 및 사후-진입 장벽뿐만 아니라 세포 제한적인 인자에 기인한다 (Strebel et al 2009. BMC Medicine 7:48). 하나의 제한은 포텐셜 수용체를 인식하고 세포막과 융합을 매개하는 외피 모조타이핑된-LV 입자의 무능이다. 그러나, 특정 조건하에서, HIV-1-기반 렌티바이러스 벡터로 휴면 중인 T 세포의 형질도입은 대부분 T 세포 수용체 (TCR) CD3 복합체 및 CD28 공동-자극 (Korin & Zack. 1998. Journal of Virology. 72:3161-8, Maurice 등 2002. Blood 99:2342-50)에 의해서뿐만 아니라 사이토카인에 대한 노출을 통해 (Cavalieri et al 2003) 가능하다.
면역계 예컨대 T 림프구의 세포는 수용체 또는 수용체 복합체를 통해 특이적 항원을 인식하고 이들과 상호작용하여, 그러한 항원의 인식 또는 이와 상호작용에 의해, 신체에서 세포의 활성화 및 팽창을 야기한다. 그러한 수용체의 예는 항원-특이적 T 림프구 수용체 복합체 (TCR/CD3)이다. T 세포 수용체 (TCR)는 T 림프구의 표면상에 발현된다. 일 성분인 CD3은 리간드에 의한 TCR의 점유에 따라 세포내 신호전달을 담당한다. 항원-CD3 복합체 (TCR/CD3)에 대한 T 림프구 수용체는 주 조직적합성 복합체 (MHC)의 단백질에 의해 이것에 제시된 항원성 펩타이드를 인식한다. MHC 및 펩타이드의 복합체는 항원 제시 세포 및 다른 T 림프구 표적의 표면상에 발현된다. TCR/CD3 복합체의 자극은 T 림프구및 결과적인 항원-특이적 면역반응의 활성화를 초래한다. TCR/CD3 복합체는 면역계의 효과기 기능 및 조절에서 중추적 역할을 수행한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 활성화 요소는 T 세포 수용체 연관 복합체의 하나 이상의 성분에 결합함에 의해, 예를 들어 CD3에 결합함에 의해 T 세포를 활성화한다. 일부 경우에, 활성화 요소는 단독 활성화할 수 있다. 다른 사례에서, 활성화는 세포를 추가로 활성화하기 위해 TCR 수용체 복합체를 통한 활성화를 요한다.
T 림프구는 또한 완전하게 활성으로 되기 위해 제2의 공통자극 신호를 요한다. 그러한 신호 없이, T 림프구는 TCR에 대한 항원 결합에 비-반응성이거나, 또는 무력체질이 된다. 그와 같은 공통자극 신호는 예를 들어 항원-생산 세포 상에 CD80 및 CD86과 상호작용하는 T 림프구 단백질인 CD28에 의해 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, CD80의 기능적 세포외 단편은 CD28과 상호작용하는 그것의 능력을 보유한다. 또 다른 T 림프구 단백질인 ICOS (유도성 공동자극 인자)는 ICOS 리간드에 결합될 때 공통자극 신호를 제공한다.
T 세포 수용체 (TCR) CD3 복합체의 활성화 및 CD28로 공동-자극은 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 단단한 표면 (예를 들어 비드)에 생체외 노출에 의해 발생할 수 있다. 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 휴면 중인 T 세포는 생체외 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 단단한 표면에 노출에 의해 활성화된다. 다른 구현예에서, 휴면 중인 T 세포 또는 NK 세포, 예시적 구현예에서 T 세포는 가용성항-CD3 항체에 (예를 들어 50-150, 또는 75-125, 또는 100 ng/ml로) 노출에 의해 활성화된다. 예시적인 구현예에서 사전 활성화 없이, 유전자적으로 변형시키는 또는 형질도입하는 방법의 일부일 수 있는 그와 같은 구현예에서, 그러한 활성화 및/또는 접촉은 8 시간 또는 그 미만, 4 시간 또는 그 미만 또는 2 내지 8 시간, 2 내지 4 시간, 또는 2 내지 3시간 동안 수행될 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 특정 예시적인 구현예에서, CD3 및/또는 CD28을 결합할 수 있는 폴리펩타이드는, 또한 본 발명의 양태인 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물의 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 "활성화 요소"로 제시된다. CD3 및/또는 CD28을 결합하는 폴리펩타이드는 휴면 중인 T 세포를 활성화시키는 그것의 능력 때문에 "활성화 요소"로 지칭된다.
일부 구현예에서, 활성화 요소는 CD3을 결합할 수 있는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3 항체, 또는 CD3에 결합하는 능력을 보유한 이의 단편이다. 예시적인 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편은 단일 사슬 항-CD3 항체, 예컨대 비제한적으로, 항-CD3 scFv이다. 또 다른 예시적 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3scFvFc이다.
비제한적으로 UCHT1, OKT-3, HIT3A, TRX4, X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT31, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW24B6, OKT3D, M-T301, SMC2 및 F101.01을 포함한 수많은 항-인간 CD3 단클론성 항체 및 이들의 항체 단편이 본 발명에서 이용가능하고 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 활성화 요소는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD28 항체, 또는 CD28에 결합하는 능력을 보유하는 이의 단편이다. 다른 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 CD80, CD86, 또는 CD28에 결합할 수 있고 Akt의 CD28-매개된 활성화을 유도할 수 있는 이들의 기능적 단편, 예컨대 CD80의 외부 단편이다. 본 명세서에서 일부 양태에서, CD80의 외부 단편은 전형적으로 CD80의 정상 세포 위치에서 세포의 외측상에 존재하여, CD28에 결합하는 능력을 보유하는 단편을 의미한다. 예시적인 구현예에서, 항-CD28 항체 또는 이의 단편은 단일 사슬 항-CD28 항체, 예컨대, 비제한적으로, 항-CD28 scFv이다. 또 다른 예시적 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 CD80, 또는 CD80의 단편 예컨대 CD80의 외부 단편이다.
항-CD28 항체는 당해 기술에 공지되어 있고, 비-제한적인 예로서, 단클론성 항체 9.3, IgG2a 항체 (Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, Wash.), 단클론성 항체 KOLT-2, IgG1 항체, 15E8, IgG1 항체, 248.23.2, IgM 항체 및 EX5.3D10, IgG2a 항체를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 2개의 폴리펩타이드인, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 구현예에서, CD3 또는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항체, 단일사슬 단클론성 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 단일사슬 항체 단편이다. 따라서, 항체 단편은, 예를 들어, 단일사슬 단편 가변 영역 (scFv), 항체의 항체 결합 (Fab) 단편, 단일사슬 항원-결합 단편 (scFab), 시스테인 없는 단일사슬 항원-결합 단편 (scFabΔC), 단편 가변 영역 (Fv), 항원의 인접한 에피토프에 특이적인 작제물 (CRAb), 또는 단일 도메인 항체 (VH또는VL)일 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 활성화 요소, 또는 이를 인코딩하는 핵산은 이량체화 또는 고차 다량체화 모티프를 포함할 수 있다. 이량체화 및 다량체화 모티프는 당 업계에서 잘 알려져 있고 숙련가는 효과적인 이량체화 또는 다량체화를 위해 이들을 폴리펩타이드 안으로 어떻게 편입하는지를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이량체화 모티프를 포함하는 활성화 요소는 CD3 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3 항체, 또는 CD3에 결합하는 능력을 보유하는 이의 단편이다. 예시적인 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편은 단일사슬 항-CD3 항체, 예컨대 비제한적으로, 항-CD3 scFv이다. 또 다른 예시적 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3scFvFc이고, 이는 일부 구현예에서 항-CD3scFvFc 작제물이 별개의 이량체화 모티프에 대한 요구 없이 이량체화할 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 임의의 추가의 이량체화 모티프 없이 이량체화 모티프를 갖는 항-CD3으로 간주된다.
일부 구현예에서, 이량체화 또는 다량체화 모티프, 또는 이를 인코딩하는 핵산 서열은 동종이량체 또는 다량체로 자연적으로 존재하는 막관통 폴리펩타이드로부터 아미노산 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 또는 다량체화 모티프, 또는 이를 인코딩하는 핵산 서열은 천연 단백질 또는 조작된 단백질의 단편으로부터 아미노산 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 동종이량체성 폴리펩타이드는 류신 지퍼 모티프-함유 폴리펩타이드 (류신 지퍼 폴리펩타이드)이다. 예를 들어, 류신 지퍼 폴리펩타이드는 c-JUN으로부터 유래되었고, 그것의 비-제한적인 예는 본 명세서에서 키메라 림프증식성 요소 (CLE)에 관련하여 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 이들 막관통 동종이량체성 폴리펩타이드는 조기 활성화 항원 CD69 (CD69), 트랜스페린 수용체 단백질 1 (CD71), B-세포 분화 항원 (CD72), T-세포 표면 단백질 촉각체 (CD96), 엔도글린 (Cd105), 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1 (Cd161), P-셀렉틴 당단백질 리간드 1 (Cd162), 글루타밀아미노 펩티다아제 (Cd249), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 일원 16 (CD271), 카드헤린-1 (E-카드헤린) (Cd324), 또는 이들의 활성 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 모티프, 및 이를 인코딩하는 핵산은 리간드 결합에 의해 이량체화하는 (또한 본 명세서에서 일명 이량체화제 또는 이량체화 제제) 막관통 단백질로부터의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이량체화 모티프 및 이량체화제는 하기를 포함할 수 있다 (여기서 이량체화제는 이량체화제-결합쌍에 이어 괄호 안에 있음): FKBP 및 FKBP (라파마이신); GyrB 및 GyrB (코우메르마이신); DHFR 및 DHFR (메토트렉세이트); 또는 DmrB 및 DmrB (AP20187). 전술한 바와 같이, 라파마이신은 이량체화제로 작용할 수 있다. 대안적으로, 라파마이신 유도체 또는 유사체가 사용될 수 있다 (예를 들어, WO96/41865; WO 99/36553; WO 01/14387; 및 문헌 [Ye et al (1999) Science 283:88-91] 참고). 예를 들어, 라파마이신에 구조적으로 관련된 유사체, 동족체, 유도체, 및 다른 화합물 ("라팔로그")은 그중에서도 라파마이신에 대비하여 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함한다: C7, C42 및/또는 C29에서 메톡시의 탈메틸화, 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 하이드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 5-원 프롤릴 고리로 6-원 피페콜레이트 고리의 대체; 및 사이클로헥실 고리에 대한 대안적인 치환 또는 치환된 사이클로펜틸 고리로 사이클로헥실 고리의 대체. 추가의 정보는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,525,610; 5,310,903 5,362,718; 및 5,527,907에 제시되어 있다. C-28 하이드록실기의 선택적 에피머화가 기재되었다 (예를 들어, WO 01/14387 참고). 라파마이신에 대한 대안적인 것으로 사용하기에 적합한 추가의 합성 이량체화 제제는 미국 특허 공보 번호 2012/0130076에 기재된 것들을 포함한다. 전술한 바와 같이, 코우메르마이신은 이량체화 제제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 코우메르마이신 유사체가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Farrar 등 (1996) Nature 383:178-181]; 및 미국 특허 번호 6,916,846 참고). 전술한 바와 같이, 일부 경우에, 이량체화 제제는 메토트렉세이트, 예를 들어, 비-세포독성, 호모-이중 작용성 메토트렉세이트 이량체이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 8,236,925 참고).
일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 존재하는 경우, 이량체화 모티프를 포함한 활성화 요소는 이량체화 제제의 부재에서 활성일 수 있다. 예를 들어, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, Cd324, 이들의 활성 돌연변이체, 및/또는 이들의 활성 단편을 포함한 막관통 동종이량체성 폴리펩타이드로부터 이량체화 모티프를 포함하는 활성화 요소는 이량체화 제제의 부재에서 활성일 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 단일사슬 단편일 수 있고, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, Cd324, 이들의 활성 돌연변이체, 및/또는 이들의 활성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 이량체화 모티프를 포함한다
일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 존재하는 경우, 이량체화 모티프를 포함한 활성화 요소는 이량체화 제제의 존재에서 활성일 수 있다. 예를 들어, FKBP, GyrB, DHFR, 또는 DmrB로부터 이량체화 모티프를 포함하는 활성화 요소는 각각의 이량체화 제제 또는 그것의 유사체, 예를 들어 각각 라파마이신, 코우메르마이신, 메토트렉세이트, 및 AP20187의 존재에서 활성일 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 또는 항-CD28에 대한 단일사슬 항체 단편, 또는 CD3 또는 CD28을 결합하는 또 다른 분자일 수 있고, 이량체화 모티프 및 이량체화 제제는 FKBP 및 라파마이신 또는 그것의 유사체, GyrB 및 코우메르마이신 또는 그것의 유사체, DHFR 및 메토트렉세이트 또는 그것의 유사체, 또는 DmrB 및 AP20187 또는 그것의 유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 활성화 요소는 이종성 신호서열 및/또는 이종성 막 부착 서열에 융합되고, 이둘 모두는 활성화 요소가 막으로 향하는 것을 돕는다. 이종성 신호서열은 활성화 요소를 내형질망으로 표적화하게 하여, 여기서 이종성 막 부착 서열은 이종성 막 부착 서열에 융합된 활성화 요소가 원형질막의 지질 뗏목에 고정되도록 하나 또는 몇개의 지방산에 공유적으로 부착한다 (후번역 지질변형로도 알려짐). 일부 구현예에서, 후번역 지질변형은 미리스토일화, 팔미토일화, 또는 GPI 정착을 통해 발생할 수 있다. 미리스토일화는 진핵 또는 바이러스 단백질의 N-말단 글리신에 대한 14-탄소 포화된 지방산인 미리스트산의 공유결합에 상응하는 번역후 단백질 변형이다. 팔미토일화는 단백질의 시스테인에, 그리고 덜 빈번하게는 세린 및 트레오닌 잔기에 C16 아실 사슬의 공유결합에 상응하는 번역후 단백질 변형이다. GPI 정착은 후번역 변형 동안 단백질의 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨, 또는 GPI의 부착을 지칭한다.
일부 구현예에서, 이종성 막 부착 서열은 GPI 앵커 부착 서열이다. 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 임의의 알려진 GPI-고정된 단백질로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, 등, editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11]에서 검토됨). 일부 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD14, CD16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80, 및 CD87로부터의 GPI 앵커 부착 서열이다. 일부 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD16으로부터 유래된다. 예시적인 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 Fc 수용체 FcγRIIIb (CD16b) 또는, 달리는 보체 붕괴-촉진 인자 또는 CD55로 알려진 붕괴 촉진 인자 (DAF)로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 활성화 요소 중 하나 또는 둘 모두는 세포막에 대한 활성화 요소의 직접적인 발현에 도움이 되는 이종성 신호서열을 포함한다. 포장 세포주에서 활성인 임의의 신호서열이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 신호서열은 DAF 신호서열이다. 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 그것의 N 말단에서 DAF 신호서열 및 그것의 C 말단에서 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다.
예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 CD14로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 항-CD3 scFvFc 및 CD16b로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD80을 포함하고; 그리고 둘 모두는 본 명세서에 제공된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 발현된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 scFvFc는 그것의 N 말단에서 DAF 신호서열 및 그것의 C 말단에서 CD14로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합되고, 그리고 CD80은 그것의 N 말단에서 DAF 신호서열 및 그것의 C 말단에서 CD16b로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합되고; 그리고 둘 모두는 본 명세서에 제공된 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면상에 발현된다. 일부 구현예에서, DAF 신호서열은 DAF 단백질의 아미노산 잔기 1-30개를 포함한다.
막-결합 사이토카인
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물 양태의 일부 구현예는 막-결합 사이토카인, 또는 막-결합 사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 사이토카인은 항상 그렇지는 않지만 전형적으로 분비된 단백질이다. 자연적으로 분비된 사이토카인은 막-결합되는 융합 단백질로 조작될 수 있다. 막-결합 사이토카인 융합 폴리펩타이드는 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물에 포함되고, 또한 본 발명의 양태이다. 일부 구현예에서, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포를 결합할 수 있고 이들의 증식 및/또는 생존을 증진시킬 수 있는 막-결합 사이토카인융합 폴리펩타이드를 그것의 표면상에 갖는다. 전형적으로, 막-결합 폴리펩타이드는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 안으로 편입되고, 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 형질도입될 때, 레트로바이러스와 숙주 세포 막의 융합은 폴리펩타이드가 형질도입된 세포의 막에 결합되도록 한다.
일부 구현예에서, 사이토카인 융합 폴리펩타이드는 IL-7, IL-15, 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 막-결합 사이토카인 융합 폴리펩타이드는 전형적으로 이종성 신호서열 및/또는 이종성 막 부착 서열에 융합된 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 이종성 막 부착 서열은 GPI 앵커 부착 서열이다. 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 임의의 알려진 GPI-고정된 단백질로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, 등, editors. Essentials of Glycobiology . 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11]에서 검토됨). 일부 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD14, CD16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80, 및 CD87로부터의 GPI 앵커 부착 서열이다. 일부 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD16으로부터 유래된다. 예시적인 구현예에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 Fc 수용체 FcγRIIIb (CD16b)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, GPI 앵커는 DAF의 GPI 앵커이다.
예시적인 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 DAF에 융합된 사이토카인의 융합 폴리펩타이드이다. DAF는 포장 세포로부터 발아하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 안으로 편입된 지질 뗏목에 축적하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이론에 의해 제한되지 않고, DAF 융합 단백질은 재조합 레트로바이러스 막의 일부가 될 포장 세포의 막의 부분에 우선적으로 표적화된다고 여겨진다.
비제한적인 예시적 구현예에서, 사이토카인 융합 폴리펩타이드는 DAF에 융합된 IL-7, 또는 이의 활성 단편이다. 특이적 비제한적인 예시적 구현예에서, 융합 사이토카인 폴리펩타이드는 다음 순서로: DAF 신호서열 (DAF의 잔기 1-31), 그것의 신호서열 없이 IL-7, 및 DAF의 잔기 36-525를 포함한다.
리보스위치조절 요소
리보스위치
본 명세서에 제공된 조성물 및 방법 중 일부는 그 자체로 본 개시내용의 뚜렷한 양태를 형성하는 하나 이상의 리보스위치를 포함하는 하나 이상의 리보스위치 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리보스위치는 박테리아에서 유전자 발현을 조절하기 위한 일반적 특징이고 생물학적 기능의 RNA 제어를 달성하기 위한 수단이다. 리보스위치는 mRNA의 5'-미번역된 영역에 존재할 수 있고 리보스위치 활성을 유도 또는 억제하는 소분자 리간드의 결합을 통해 유전자 발현에 대한 조절 제어를 가능하게 하는 폴리뉴클레오타이드이다. 전형적으로, 리보스위치는 소분자 리간드의 생성에 관여된 유전자 산물을 제어하고, 따라서 피드백 루프를 형성한다. 비록 리보스위치는 트랜스-방식으로 작동하는 것이 확인되었지만, 리보스위치는 전형적으로 시스-방식으로 작동한다. 천연 리보스위치는 2개의 도메인인: 3차원 접혀진 RNA 구조를 통해 리간드를 결합하는 압타머 도메인 및 리간드의 부재 또는 존재에 기초하여 리보스위치에서 활성을 유도하거나 억제하는 기능 스위칭 도메인으로 구성된다. 따라서, 온 및 오프 상태를 나타내는, 리보스위치에 의해 달성된 2개의 리간드 감수성 형태가 있다 (Garst 등, 2011). 기능 스위칭 도메인은: 내부 리보솜 유입 부위, 레트로바이러스 유전자 작제물에서 pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성, pre-mRNA 스플라이싱, 번역, 전사의 종결, 전사체 열화, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현을 조절함에 의해 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 줄 수 있다 (Dambach and Winkler 2009). 압타머 및 기능 스위칭 도메인은 합성 RNA 디바이스가 천연 압타머, 돌연변이된/진화된 천연 압타머, 또는 랜덤 RNA 라이브러리를 스크리닝하는 것으로부터 확인된 전적으로 합성 압타머 중 어느 하나로서 유전자 발현을 조절하게 하는 모듈식 성분으로서 사용될 수 있다 (McKeague et al 2016).
퓨린 리보스위치 계열은 발견된 500 이상 서열을 갖는 최대 계열 중 하나를 나타낸다 (Mandal et al 2003; US20080269258; 및 WO2006055351). 퓨린 리보스위치는 개재하는 루프/접합 요소 (J1-2, L2, J2-3, L3, J3-1)를 갖는 3개의 보존된 나선 요소/줄기 구조 (P1, P2, P3)로 구성되는 유사한 구조를 공유한다. 리보스위치의 퓨린 계열의 압타머 도메인은 서열 변이에 기인하여 다양한 퓨린 화합물 예컨대 아데닌, 구아닌, 아데노신, 구아노신, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신 (도 5), 등에 의한 그것의 친화성/조절에서 자연적으로 다양하다 (Kim 등 2007).
일 양태에서, 프로모터 및 리보스위치에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 제공되되, 리보스위치는 하기를 포함한다: a.) 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물을 결합할 수 있고 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대비하여 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 대한 감소된 결합을 가질 수 있는 압타머 도메인; 및 b.) 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인으로서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오사이드 유사체의 결합은 기능 스위칭 도메인의 활성을 조절하는 발현을 유도하거나 억제하고, 그것에 의해 표적 유전자의 발현을 조절하는, 기능 스위칭 도메인. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드 인코딩 영역, miRNA, 또는 shRNA일 수 있다. 비-제한적인 예에서, 리보스위치는, 예를 들어, 질환을 치료하는데 효과적인 생체내 활성을 갖는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, miRNA, 또는 shRNA에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 그러한 비-제한적인 예에서, 리보스위치는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에 제공된 비제한적인 예시에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 다양한 다른 양태에 포함된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩한다. 이들 비제한적인 예시에서, 리보스위치 및 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 표적 폴리뉴클레오타이드는 아래에서 발견될 수 있다: 포장 세포의 게놈, 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자, T 세포 및/또는 NK 세포.
일부 구현예에서, 압타머 도메인은 범위의 하단으로 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 및 70개의 뉴클레오타이드 내지 범위의 상단으로 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오타이드 사이, 예를 들어 45 내지 80개의 뉴클레오타이드, 45 내지 60개의 뉴클레오타이드, 또는 45 내지 58개의 뉴클레오타이드 사이일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물은 약제학적 리간드 아사이클로비르 (아시클로비르 및 아사이클로구아노신으로도 알려짐) 또는 펜시클로비르 (도 5)일 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 대한 결합 친화도보다 큰, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 큰 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
조절요소, 예를 들어 리보스위치는, 일부 구현예에서 표적 유전자에 작동가능하게 연결되고 시험관내 및/또는 생체내 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있고, 생체내 형질도입된 T 세포의 팽창을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 팽창은 조절 요소의 존재에 대해 의존적이다. 그러나, 다른 구현예에서, 형질도입된 T 세포의 팽창은 다른 인자 예컨대 대상체 내에 인터류킨의 존재 및 그것의 리간드에 재조합 T 세포 상의 CAR의 ASTR의 결합에 의해 적어도 부분적으로 유도될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물, 예를 들어 아사이클로비르 또는 펜시클로비르는 PBL이 혈액으로부터 단리되기 전, 동안 및/또는 후, 그리고 T 세포 및/또는 NK 세포가, 예시적 비-제한적인 예는 리보스위치인 조절 요소를 포함하고, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 결합하고 그리고 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전에 대상체에 투여된다. 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드는 비제한적인 예시에서 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드인 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하고, 그 중 적어도 하나는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스약물, 예를 들어 아사이클로비르 또는 펜시클로비르는 PBL이 혈액으로부터 단리되기 전 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전, 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48, 또는 72시간 사이에 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물, 예를 들어 아사이클로비르 또는 펜시클로비르는 PBL이 혈액으로부터 단리된 후 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법으로 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후, 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 사이에 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물, 예를 들어 아사이클로비르 또는 펜시클로비르는 PBL이 혈액으로부터 단리된 후 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법으로 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물, 예를 들어 아사이클로비르 또는 펜시클로비르는 PBL이 대상체에게 재주입된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 또는 규정되지 않은 기간 동안 대상체에 투여된다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물은 PBL의 재주입 전 및/또는 동안, 및/또는 PBL이 재주입된 후 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물은 대상체가 표적 폴리뉴클레오타이드가 관련된 질환의 증상을 더 이상 겪지 않거나 또는 이에 의해 시달리지 않을 때까지 투여된다.
일부 구현예에서, 압타머 도메인은 수반되는 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미침이 없이 이용될 수 있도록, 아사이클로비르 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제보다 우선적으로 펜시클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 압타머 도메인이 아사이클로비르 또는 또 다른 항바이러스제를 결합하는 것보다 큰, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 큰 결합 친화도로 펜시클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 수반되는 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미침이 없이 이용될 수 있도록, 펜시클로비르 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제보다 우선적으로 아사이클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 압타머 도메인이 펜시클로비르 또는 또 다른 항바이러스제를 결합하는 것보다 큰, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 큰 결합 친화도로 아사이클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 펜시클로비르 (팜사이클로비르) 및 아사이클로비르 (발라시클로비르)의 경구 전구약물이 대상체에 주어질 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:87-93의 서열 중 임의의 하나에 동일할 수 있고 아사이클로비르에 결합하는 능력과 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대비하여 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합하는 감소된 능력을 보유하고, 그리고 여기서 압타머 도메인은 아사이클로비르에 의해 결합될 때 기능 스위칭 도메인의 활성을 조절하는 발현을 유도하거나 억제하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:94-100의 압타머 도메인에 동일할 수 있고 펜시클로비르에 결합하는 능력과 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대비하여 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합하는 감소된 능력을 보유하고, 그리고 여기서 압타머 도메인은 펜시클로비르에 의해 결합될 때 기능 스위칭 도메인의 활성을 조절하는 발현을 유도하거나 억제하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 영역 또는 리보스위치의 영역은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:87-100의 서열 중 임의의 하나에 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:108-221의 서열 중 임의의 하나에 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 영역은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:108-221의 서열 중 임의의 하나에 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 91.84%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:108에 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:147에 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.88%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:164에 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95. 83% 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:183에 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 91.84%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:198에 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 영역은 서열번호:222-226 중 임의의 하나의 공통 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드의 영역은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 공유할 수 있거나 또는 서열번호:222-226의 서열 중 임의의 하나에 동일할 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 아사이클로비르 및/또는 펜시클로비르를 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 87-100 또는 서열번호:108-221의 서열 중 임의의 하나의 역 보체일 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호:108-221의 DNA 서열 또는 서열번호:108-221에 상보적인 DNA 서열 중 어느 하나의 전사 또는 RNA 버전일 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호:87-100의 RNA 서열의 임의의 하나의 역전사 또는 DNA 버전 또는 서열번호:87-100의 RNA 서열의 임의의 하나의 역전사에 상보적 DNA 가닥일 수 있다.
본 명세서에서 제공된 일부 구현예에서, 리보스위치 스캐폴드가 돌연변이 분석 또는 분자 진화를 위해 사용될 수 있다. 돌연변이 분석 또는 분자 진화를 위해 선택된 리보스위치는 임의의 알려진 유기체, 예를 들어, 박테리아로부터의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 메소플라스마 플로럼으로부터 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치가 분자 진화를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유래된 압타머 도메인은 메소플라스마 플로럼으로부터 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 (서열번호:237)로부터 압타머 도메인에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 바실러스 서브틸리스로부터 xpt 리보스위치가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유래된 압타머 도메인은 바실러스 서브틸리스로부터 xpt 리보스위치 (서열번호:243)로부터 압타머 도메인에 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다.
압타머 도메인은 모듈식 성분으로서 사용될 수 있고, 임의의 기능 스위칭 도메인과 조합되어 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 리보스위치는 임의의 하기 활성: 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성, pre-mRNA 스플라이싱, 번역, 전사의 종결, 전사체 열화, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현을 조절함에 의해 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 기능 스위칭 도메인은 IRES에 대한 항-IRES의 결합을 조절할 수 있다 (예를 들어, 그것의 개시내용이 본 명세서에서 전체적으로 참고로 편입된, 문헌 [Ogawa, RNA (2011), 17:478-488] 참고). 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 소분자 리간드의 존재 또는 부재는 리보스위치가 RNA 전사체에 영향을 미치도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임을 갖는 리보스위치는 소분자 리간드의 존재에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 전사체 열화를 억제하거나 고양할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보자임은 리보자임의 피스톨 부류, 리보자임의 헤머헤드 부류, 리보자임의 비틀린 부류, 리보자임의 손도끼 부류, 또는 HDV (간염 델타 바이러스) 리보자임일 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 리보스위치는 리보스위치에 대해 일반적으로 알려진 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 다양한 위치에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성 또는 pre-mRNA 스플라이싱을 조절할 수 있고 그리고 표적 폴리뉴클레오타이드 전에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 폴리(A) 꼬리의 봉입을 조절할 수 있고 표적 폴리뉴클레오타이드 후에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 항-IRES를 조절할 수 있고 IRES의 업스트림에 위치될 수 있다. 비제한적인 예시적 구현예에서, 본 명세서에 제공된 리보스위치는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산에 대해 임의의 이들 위치에 위치될 수 있다.
리보스위치를 포함한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 폴리뉴클레오타이드는 코작-유형 서열, WPRE 요소, 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있되, 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈의 정지 코돈 중 하나 이상은 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나로부터 판독의 종결을 정의한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 CCACCAUG(G) (서열번호:515), CCGCCAT/UG(G)(서열번호:516), GCCGCCGCCAT/UG(G) (서열번호:517), 또는 GCCGCCGCCAT/UG로부터 선택된 코작-유형 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산 서열의 시작 코돈에 대비하여 -3 및 +4 뉴클레오타이드 둘 모두는 G를 포함한다. 코작-유형 서열을 포함하는 이전의 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 하기 구현예와 조합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE 요소는 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5'에서 3' LTR에 위치된다. 이전의 구현예 (즉 폴리뉴클레오타이드가 코작-유형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE을 포함한 구현예) 중 어느 하나 또는 둘 모두와 조합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈의 하나 이상의 정지코돈으로 종결한다.
일부 구현예에서, 리보스위치는 리보스위치가 리간드에 대해 더 이상 반응성이 아니도록 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 이상의 온도에서 탈안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 이상의 온도에서 탈안정화된 리보스위치를 선택하기 위해 분자 진화가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있되, 표적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 림프증식성 요소를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA 또는 shRNA는 STAT5 경로를 강력하게 할 수 있거나 또는 SOCS 경로를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA 또는 shRNA는 SOCS1, SMAD2, TGFb, 또는 PD-1로부터 전사체를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 miR-155이다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 인코딩하고 폴리펩타이드는 항원-특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 프로모터 및 리보스위치에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 제공되되, 리보스위치는 하기를 포함한다: a.) 압타머 도메인이 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신을 결합하는 것보다 친화성이 적어도 2-배 더 큰 결합 친화도로 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스약물을 결합할 수 있는 압타머 도메인; 및 b.) 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인으로서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오사이드 유사체의 결합은 기능 스위칭 도메인의 활성을 조절하는 발현을 유도하거나 억제하는, 기능 스위칭 도메인. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 압타머 도메인이 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신을 결합하는 것보다 친화성이 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 큰 결합 친화도로 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물을 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 범위의 하단으로 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 및 70개의 뉴클레오타이드 내지 범위의 상단으로 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 45 내지 80개의 뉴클레오타이드 또는 45 내지 58개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물은 약제학적 리간드 아사이클로비르 (아시클로비르 및 아사이클로구아노신으로도 알려짐) 또는 펜시클로비르일 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 대한 결합 친화도보다 더 큰, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 큰 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오사이드 유사체의 결합은 리보스위치에서 활성을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 압타머 도메인은 수반되는 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미침이 없이 이용될 수 있도록 펜시클로비르에 대해 특이적일 수 있고 아사이클로비르 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제에 대한 반응성을 결할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 압타머 도메인이 아사이클로비르 또는 또 다른 항바이러스제를 결합하는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 큰 결합 친화도로 펜시클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 수반되는 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미침이 없이 이용될 수 있도록 아사이클로비르에 대해 특이적일 수 있고 펜시클로비르 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제에 대한 반응성을 결할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 압타머 도메인이 펜시클로비르 또는 또 다른 항바이러스제를 결합하는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 큰 결합 친화도로 아사이클로비르를 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 펜시클로비르 (팜사이클로비르) 및 아사이클로비르 (발라시클로비르)의 경구 전구약물이 대상체에게 주어질 수 있다. 일부 구현예에서, 유래된 압타머 도메인은 메소플라스마 플로럼으로부터 유형 I-A 데옥시구아노신 리보스위치로부터의 압타머 도메인에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 유래된 압타머 도메인은 바실러스 서브틸리스로부터 xpt 리보스위치로부터의 압타머 도메인에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 리보스위치는 임의의 하기 활성을 조절함에 의해 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다: 내부 리보솜 유입 부위, 레트로바이러스 유전자 작제물에서 pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성, pre-mRNA 스플라이싱, 번역, 전사의 종결, 전사체 열화, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현. 일부 구현예에서, 기능 스위칭 도메인은 IRES에 대한 항-IRES의 결합을 조절할 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 소분자 리간드의 존재 또는 부재는 리보스위치가 RNA 전사체에 영향을 미치도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임을 갖는 리보스위치는 소분자 리간드의 존재에서 관심 있는 유전자의 전사체 열화를 억제하거나 고양할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보자임은 리보자임의 피스톨 부류, 리보자임의 헤머헤드 부류, 리보자임의 비틀린 부류, 리보자임의 손도끼 부류, 또는 HDV (간염 델타 바이러스) 리보자임일 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 리보스위치가 리간드에 대해 더 이상 반응성이 아니도록 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 이상의 온도에서 탈안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 이상의 온도에서 탈안정화된 리보스위치를 선택하기 위해 분자 진화가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있되, 표적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 림프증식성 요소를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 miRNA일 수 있고, 선택적으로, miRNA는 STAT5 경로를 자극할 수 있거나 또는 SOCS 경로를 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 SOCS1, SHP, SMAD2, TGFb, 또는 PD-1로부터 전사체를 표적화할 수 있다. 이들 구현예에서, miRNA는 miR-155일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 인코딩하고 폴리펩타이드는 항원-특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함한 CAR을 포함할 수 있다. CAR들의 추가의 구현예는 본 명세서에서 다른 곳에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 압타머의 진화는, 비제한적으로, 선택 과정 및 스크리닝에서 그래핀 옥사이드를 이용하는 이들 방법을 포함한 SELEX (지수 강화에 의한 리간드의 체계적인 진화) 방법을 사용한 무작위화된 천연 퓨린 또는 구아닌 압타머 라이브러리로부터 압타머 선택을 통해 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 시험관내 또는 포유동물 세포에서 스크리닝에 의해 본 명세서에 기재된 임의의 리보스위치 활성의 맥락에서 압타머가 편입된 압타머 작제물 또는 리보스위치 작제물을 진화시키기 위해 랜덤 돌연변이 유발 방법론 예컨대 오류 유발 PCR이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드의 랜덤 라이브러리가 리보스위치의 진화에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 리보스위치는 시험관내 또는 포유동물 세포 내에서 그러한 라이브러리를 스크리닝하는 것으로부터 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 진화된 또는 유래된 압타머 도메인은 천연 리간드의 유사체에 대한 증가된 결합과 천연 리간드에 대한 줄어든 결합을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 천연 리간드의 유사체에 대한 증가된 결합과 천연 리간드에 대한 줄어든 결합을 가지도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 도메인은 퓨린 리보스위치 계열로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 리간드는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드일 수 있고 유사체는 뉴클레오사이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스 약물이다. 예시적인 구현예에서, 압타머 도메인은 2'-데옥시구아노신 및 구아닌 리보스위치 스캐폴드로부터 유래될 수 있고 유래된 압타머 도메인은 야생형 리보스위치에 비하여 2'-데옥시구아노신 및 구아닌에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 리보스위치는 레트로바이러스 유전자 작제물에서 pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성을 조절할 수 있되, 레트로바이러스 작제물은 일반적인 프로모터 또는 T 세포 특이적 프로모터 하에서 역 가닥으로부터 관심 있는 CAR 유전자 또는 다른 유전자를 유도한다. 다른 구현예에서, 리보스위치는 레트로바이러스 유전자 작제물에서 IRES를 조절할 수 있되, 레트로바이러스 작제물은 관심 있는 CAR 유전자 또는 다른 유전자를 유도한다. 다른 구현예에서, 리보스위치는 RNA, miRNA, 또는 유전자 전사체의 전사 종결을 조절할 수 있거나 또는 전사체의 번역을 조절할 수 있다. 다른 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 리보스위치는 리보자임과 통합되어 뉴클레오사이드 유사체의 존재에서 관심 있는 CAR 유전자 또는 다른 유전자의 전사체 열화를 억제하거나 고양할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물을 결합하는 리보스위치와 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오타이드는 분자 클로닝 벡터이다. 분자 클로닝 벡터는 당 업계에서 알려진 임의의 유형의 분자 클로닝 벡터일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 복제불능 바이러스 입자, 레트로바이러스, 또는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자일 수 있고, 이들 중 어떤 것이 발현 벡터일 수 있다. 그와 같은 발현 벡터는 위에서 제공된 임의의 표적 폴리뉴클레오타이드를 인코딩할 수 있다. 하나 이상의 제한 및/또는 다중 클로닝 부위는 리보스위치가 제한 및/또는 다중 클로닝 부위 안으로 삽입된 표적 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되도록 본 명세서에 제공된 리보스위치에 5' 또는 3'으로 분자 클로닝 벡터 상에 포함될 수 있다.
분자 차페론
일 양태에서, 대상체의 림프구를 유전자적으로 변형시키고 팽창시키기 위한 방법이 본 명세서에 제공되고, 본 방법은 하기를 포함한다:
A. 하기를 포함하는 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와, 전형적으로 사전 생체외 자극을 요함이 없이, 생체외 대상체의 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포를 접촉시키는 단계:
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 여기에 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진할 수 있는, 그것의 표면상에 슈도타이핑 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 여기서 상기 하나 이상의 전사 단위는 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하되, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 적어도 하나의 림프 증식성 요소 및/또는 키메라 항원 수용체를 포함하고,
여기서 상기 접촉은 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의해 휴면 중인 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입을 촉진함으로써, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 폴리뉴클레오타이드;
B. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체로 도입하는 단계; 및
C. 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현에 영향을 주고 생체내 림프구의 팽창을 증진시키도록 조절 요소로 작용하는 화합물에 대해 생체내 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 노출시키고, 그것에 의해 대상체의 림프구를 유전자적으로 변형시키고 팽창시키는 단계.
예시적인 구현예에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다. 예시적인 구현예에서, 본 화합물은 분자 차페론, 예컨대 소분자 분자 차페론이다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소 및/또는 CAR 성분에 분자 차페론의 결합은 림프증식성 요소 및/또는 CAR의 증식성 활성을 증가시킨다. 분자 차페론은 혈액이 수집되기 전, 접촉 동안, 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 도입된 후 대상체에게 투여될 수 있다. 이 양태의 일부 구현예는 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계를 포함한다. 이들 구현예에서, 도입은 재도입 전에 수집되고 유전자 변형된 세포의 재도입이다. 전체 과정은, 예시적인 구현예에서, 본 명세서에서 다른 양태에 대해서와 같이, 선행 기술 방법보다 더 짧은 과정이다. 예를 들어, 전체 과정은 48시간 미만, 24시간 미만, 또는 12시간 미만에 완료될 수 있다. 전체 과정은 다른 구현예에서, 범위의 하단으로 2, 4, 6, 또는 8시간 내지 범위의 상단으로 12, 24, 36, 또는 48시간 내에 완료될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, 조절 요소는 분자 차페론이다. 림프증식성 요소 또는 본 명세서에서 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 다른 성분의 발현에 영향을 주는 화합물을 전형적으로 결합하는 다른 생체내 조절 요소, 예컨대 리보스위치를 갖는 본 명세서에서 다른 구현예에 비교될 때, 본 분자 차페론은 조절 요소인 화합물이고, 그리고 이와 같이, 전형적으로 본 명세서에서 림프증식성 요소 또는 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 다른 성분에 결합함에 의해 이들의 활성에 직접적으로 영향을 미친다. 분자 차페론, 림프증식성 요소, 막-결합 사이토카인, 및/또는 CAR 성분의 투여를 포함하는 본 명세서에서 방법의 그러한 구현예의 예시에서, 그것의 활성을 증가시키기 위해 분자 차페론에 의해 결합된 더 적은 활성 또는 불활성 림프증식성 요소, 막-결합 사이토카인, 및/또는 CAR 성분일 수 있다. 따라서, 분자 차페론에 의해 결합된 표적은 전형적으로 표적 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 지시된 바와 같이 폴리펩타이드는 제1 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 또는 이들의 폴리펩타이드 성분일 수 있고, 그의 활성은, 예시적인 구현예에서 소분자 분자 차페론인, 분자 차페론에 결합에 의해 영향을 받는다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 그것의 활성이 조절된, 예시적인 구현예에서, 분자 차페론, 바람직하게는 소분자 분자 차페론에 의해 상향조절된 림프증식성 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법에서 분자 차페론은 돌연변이체 림프증식성 요소 및/또는 불활성 CAR 성분을 결합하는 화합물일 수 있고, 따라서 이들에 활성을 부여한다.
다른 구현예에서, 림프증식성 요소 또는 다른 신호전달 도메인은 작은 분자 합성 차페론의 존재에서 단지 원형질막으로 전이를 허용하도록 돌연변이 되었다. 다른 구현예에서, 차페론은 림프증식성 요소 또는 다른 신호전달 도메인 또는 단백질 및 강화제로서 반감기의 안정성을 촉진한다.
본 발명의 양태 및 구현예는 본 명세서에서 상세하게 제공된 동일한 단계 및 조성물의 다수를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 이들 공통 요소와 관련된 본 명세서 전반에 걸친 교시는, 전형적으로 리보스위치에 결합하는 분자, 예컨대 약물을 이용하는 리보스위치와 같은 본 명세서에 제공된 다른 생체내 조절 요소에 부가하여, 또는 대신에, 전형적으로 림프증식성 요소 또는 다른 표적 분자에 직접적으로 결합하는 조절 요소로서 분자 차페론을 이용하는 양태 및 구현예에 적용되는 것으로 이해될 것이다.
일부 구현예에서, 분자 차페론은 표적의 하위-세포 편재화, 예를 들어, 내형질망으로부터 원형질막 또는 표면 상의 그것의 반감기로, 표적 단백질, 예컨대 림프증식성 요소 및/또는 CAR의 성분의 적절한 폴딩 및 전이를 조절할 수 있는 화합물이다. 다른 구현예에서, 분자 차페론은 기능 이상 표적의 기능적 형태를 증진시킬 수 있고, 따라서 강화제로서 작용한다. 자연적으로 돌연변이된 단백질에 대해 차페론 또는 강화제로서 작용하는 분자의 예는 루마카프터 및 이바카프토를 포함한다. 이들 단백질은 돌연변이체 CFTR 염화물 채널 변이체 예컨대 G551D 또는 F508del에 의해 작동한다. 이바카프토는 G551D 또는 F508del 돌연변이된 이온 통로의 활성을 강력하게 하고, 반면에 루마카프터는 돌연변이체 염화물 채널의 안정화 및 이바카프토에 의한 후속적인 강화 작용을 촉진한다. 그와 같은 차페론 의존적 단백질은 자연적으로 기능성 단백질 및 분자 차페론의 존재에서 단지 기능적 활성에 대한 스크리닝으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 그러한 단백질은 차페론이 존재하는 경우에만 활성이다. 특이적 차페론 활성을 위해 선별될 수 있는 그러한 분자의 예는 정상 인간 단백질에 대해 아무 활성도 나타내지 않는 소분자 항바이러스제 또는 항-감염 약을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 명세서에서의 방법에 사용된 분자 차페론은 정상 인간 단백질에 대해 아무 활성도 나타내지 않는 소분자 항바이러스 또는 항-감염성 화합물이다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 림프구는 노출될 수 있고 및/또는 대상체에게 분자 차페론이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 화합물은 PBL이 혈액으로부터 단리되기 전, 동안 및/또는 후, 그리고 T 세포 및/또는 NK 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전에 대상체에게 투여된다. 그와 같은 구현예에서 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자는 분자 차페론 화합물에 결합하고, 이에 의해 조절되는 더 적은 활성 또는 불활성 림프증식성 요소 및/또는 CAR 성분을 포함한다.
입양 세포 요법의 방법의 일부일 수 있는 림프구를 변형시키고 팽창시키기 위한 본 명세서에서 제공된 임의의 구현예의 경우, 본 화합물은 PBL이 혈액으로부터 단리되기 전, 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되기 전에 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 사이에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 화합물은 PBL이 혈액으로부터 단리된 후, 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법에서 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후에 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 사이 동안 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 화합물은 PBL이 혈액으로부터 단리된 후, 또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 본 명세서에 제공된 방법에서 복제불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉된 후에 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 화합물은 PBL이 대상체로 재주입된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 또는 규정되지 않은 기간 동안 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 개시된 구현예들 중 임의의 것에서, 본 화합물은 PBL의 재주입 전 및/또는 동안 및/또는 PBL이 주입된 후 투여될 수 있다.
본 명세서에서 임의의 구현예의 경우, 분자 차페론은 이들을 조절하고 및/또는 활성화시키는 화합물에 의해 결합된 조절 요소에 있지 않다. 분자 차페론은 조절 요소이고 림프증식성 요소 및/또는 CAR의 작용성 성분의 활성을 조절하는 화합물, 바람직하게는 소분자 화합물이다.
패키징 세포주/재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법
본 개시내용은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 포유동물 패키징 세포 및 패키징 세포주를 제공한다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 세포주는 또한 본원에서 패키징 세포주로서 지칭된다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 본원에서 실시예 7에 제공된다. 패키징 세포주의 세포는 부착 또는 현탁액 세포일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 패키징 세포주는 현탁액 세포주, 즉 성장 동안 표면에 부착하지 않는 세포주일 수 있다. 세포는 화학적으로-정의된 배지 및/또는 무혈청 배지에서 성장될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 부착 세포주로부터 유래된 현탁액 세포주일 수 있고, 예를 들어, HEK293 세포주는 당업계에 공지된 방법에 따라서 현탁액-적응된 HEK293 세포주를 생성하기 위한 조건에서 성장시킬 수 있다. 패키징 세포주는 전형적으로 화학적으로 정의된 배지에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 당업계에 공지된 있는 바와 같이, 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 무혈청 배지일 수 있다. 그와 같은 배지는 미국 식품 의약품국(FDA)의 현행 우수 제조 기준(CGMP)에 따라 제조된 화학적으로 정의된 무혈청 제형일 수 있다. 패키징 세포주 배지는 제노 비함유이고 완전할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주 배지는 생체외 세포 가공, 예를 들어, FDA 510(k) 허가 장치에 사용하기 위한 관리 기관에 의해 허가되었다. 배지는 배지 보충물을 포함하는 A1048501 또는 A1048503과 같은 카탈로그 번호의 배지 보충물과 기초 배지의 조성물을 포함함이 인용되고, 인용된 조성물이 첨가된 보충물과 배지의 조성물을 의미하도록 의도되는 것으로 본원에서 이해될 것이다. 전형적으로, 배지 및 보충물의 제조는 첨가된 보충물의 용적에 대한 지침을 제공한다.
따라서, 하나의 양태에서, 다음 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 제조 방법이 본원에 제공된다: A. 무혈청 배지 중 현탁액에서 패키징 세포를 배양하는 단계로서, 상기 패키징 세포가 복제 불능 레트로바이러스 입자의 패키징 가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 슈도타입화 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계; 및 B. 무혈청 배지로부터 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 수거하는 단계. 또 다른 양태에서, 다음 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 림프구를 형질도입하는 방법이 본원에 제공된다: A. 무혈청 배지 중 현탁액에서 패키징 세포를 배양하는 단계로서, 상기 패키징 세포가 복제 불능 레트로바이러스 입자의 패키징 가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 슈도타입화 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계; B. 무혈청 배지로부터 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 수거하는 단계; 및 C. 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉하여 림프구를 형질도입하는 단계로서, 상기 접촉 단계가 24시간, 20시간, 18시간, 12시간, 8시간, 4시간 또는 2시간 미만 동안(또는 상기 범위의 낮은 말단에서 1, 2, 3, 또는 4시간 동안 및 상기 범위의 높은 말단에서 4, 6, 8, 12, 18, 20, 또는 24시간 동안) 수행되는, 단계.
또 하나의 양태에서, a) 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위한 제1 유도성 프로모터 및 제1 리간드에 결합할 수 있는 제1 교차활성인자; b) 제2 리간드 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 존재 및 부재하에서 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 교차활성인자; 및 c) 레트로바이러스 입자에 대한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함하는 레트로바이러스 패키징 시스템으로서, 상기 제1 교차활성인자가 제2 교차활성인자의 발현을 조절하고, 상기 제2 교차활성인자가, 예를 들어, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및/또는 슈도타입화 요소와 같은 바이러스 패키징에 관여하는 레트로바이러스 폴리펩타이드, 및 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내로 또는 위에 도입될 것이고, 예를 들어, HEK-293와 같은 패키징 세포주에 독성인 것으로 간주되는 임의로 다른 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 것인, 레트로바이러스 패키징 시스템이 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 제2 교차활성인자 그 자체가 패키징 세포주에 대해 세포독성을 띤다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 본원에서 상세하게 논의된 바와 같이, 표적 세포의 세포 막에 결합할 수 있고, 그에의 융합을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 이론으로 제한되지 않으면서, 상기 시스템은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 제조되고, 수거되는 시점에 근접한 더 늦은 시점까지, 수일 동안 또는 무기한으로 포유동물 세포의 집단을 배양하고, 레트로바이러스 생성물을 위해서 요구되지만, 포유동물 세포의 생존 및/또는 증식에는 억제성을 띠거나, 억제성을 띨 수 있거나, 또는 억제성을 띠는 것으로 보고된 폴리펩타이드, 예를 들어, 독성 폴리펩타이드의 유도를 제어하면서, 포유동물 세포의 증식 또는 생존을 억제시키지 않거나, 또는 실질적으로 억제시키지 않거나, 또는 억제시키는 것으로 간주되지 않는 특정 폴리펩타이드/단백질, 예를 들어, 비독성 단백질을 축적시킬 수 있는 능력을 제공한다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 전형적으로, 본원에서 종종 편의상 제3 프로모터로 지칭되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되되,, 상기 제3 프로모터는 전형적으로 제1 교차활성인자 또는 제2 교차활성인자에 의해 유도가능하다. 예시적인 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되되,, 상기 제3 프로모터는 제2 교차활성인자에 의해 유도가능하다. 따라서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 수거될 시점에 근접한 더 늦은 시점에 제조될 수 있다.
당업자는 다수의 상이한 교차활성인자, 리간드, 및 유도성 프로모터가 레트로바이러스 패키징 시스템에 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 유도성 프로모터는 다수의 유기체, 예를 들어, 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고, 유래될 수 있다. 예를 들어, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등의 제2 유기체에 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 유도성 프로모터의 변형은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이러한 유도성 프로모터, 및 이러한 유도성 프로모터에 기반하고 추가의 조절 단백질을 또한 포함하는 시스템으로는 알콜 조절된 프로모터(예: 알콜 데히드로게나제 I(alcA) 유전자 프로모터, 알콜 교차활성인자 단백질(AlcR)에 대해 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린 조절된 프로모터(예: TetActivators, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터(예: 래트 글루코코티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병기전-관련 조절된 프로모터(예: 살리실산 조절된 프로모터, 에틸렌 조절된 프로모터, 벤조티아디아졸 조절된 프로모터 등), 온도 조절된 프로모터(예: 열 충격 유도성 프로모터(예: HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광 조절된 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 미페프리스톤-조절 시스템이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 자기조절 피드백 루프가 있는 미페프리스톤 유도성 시스템이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, GAL4 조절 융합 단백질은 트랜스포존 말단 반복체 및 lox 및 FRT 부위를 또한 함유하는 하나의 작제물로부터 발현된다. 일부 구현예에서, GAL4 조절 융합 단백질은 역 tet 교차활성인자(rtTA) 및 BiTRE의 발현을 제어한다. 일부 구현예에서, lox 및 FRT 부위를 포함하는 또 다른 작제물은 GAL4 상류 활성화 서열(UAS), 및 mCherry와 같은 리포터를 구동시키는 E1b TATA 박스 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, GAL4 조절 융합 단백질은 GAL4 조절 융합 단백질의 발현을 제어하는 프로모터, 및 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하는 프로모터 둘 다에서 GAL4 상류 활성화 서열(UAS)에 결합한다. 일부 구현예에서, 미페프리스톤, 독시사이클린, 및 퓨로마이신이 패키징 세포주의 유도 및 선택을 위해 사용될 것이다.
일부 구현예에서, 교차활성인자 중 어느 하나 또는 둘 모두는 2개 이상의 폴리펩타이드로 나뉘어질 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩타이드는 DNA 결합 도메인, 및 별개의 폴리펩타이드에서의 전사를 자극할 수 있는 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 "활성화 도메인"은 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 "활성화 요소", 예를 들어, CD3에 결합하는 폴리펩타이드와 혼동되지 않아야 하고, 전형적으로, 본원에서 상세하게 논의되는 바와 같이, 접촉시, 이러한 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킨다. 별개의 폴리펩타이드는 리간드의 첨가를 통해 이량체화할 수 있는 폴리펩타이드와의 융합물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 도메인은 p65 활성화 도메인 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 본원에서 패키징 시스템의 예시적인 구현예에서, DNA 결합 도메인은 ZFHD1로부터의 DNA 결합 도메인 또는 이의 기능적 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리펩타이드는 FKBP, 또는 이의 기능성 돌연변이체 및/또는 단편, 또는 다중 FKBP와의 융합물일 수 있고, 또 다른 폴리펩타이드는 mTOR의 FRB 도메인, 또는 이의 기능성 돌연변이체 및/또는 단편과의 융합물일 수 있고, 리간드는 라파마이신 또는 기능성 라팔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, FRB는 돌연변이 K2095P, T2098L, 및/또는 W2101F를 함유한다. 일부 구현예에서, 별개의 폴리펩타이드는 FKBP 또는 이의 기능적 단편, 및 칼시뉴린A, 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 이량체화제는 FK506일 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 폴리펩타이드는 FKBP 또는 이의 기능적 단편, 및 CyP-Fas 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 이량체화제는 FKCsA일 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 폴리펩타이드는 GAI 또는 이의 기능적 단편, 및 GID1 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 이량체화제는 지베렐린일 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 폴리펩타이드는 Snap-태그 및 HaloTag 또는 이의 기능적 단편일 수 있고, 이량체화제는 HaXS일 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 폴리펩타이드는 동일한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인은 FKBP 또는 GyrB와의 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 이량체화제는 각각 FK1012 또는 쿠메르마이신일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 DNA 결합 도메인이 전형적으로 결합하는 DNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 DNA 결합 도메인이 전형적으로 결합하는 DNA 서열로부터 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 교차활성인자 중 어느 하나는 rtTA일 수 있고, 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 유도성 프로모터는 TRE일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제1 교차활성인자는 FRB에 융합된 p65 활성화 도메인 및 3개의 FKBP 폴리펩타이드에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인이고, 제1 리간드는 라파마이신이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 제2 교차활성인자는 rtTA일 수 있고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 유도성 프로모터는 TRE일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 컨센서스 서열, 예를 들어, HIV Rev를 함유하는 전사체의 핵 외수송을 제어하는 요소의 발현을 조절할 수 있고, 컨센서스 서열은 Rev 반응 요소일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 표적 세포는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 슈도타입화 요소는 레트로바이러스 외피 폴리펩타이드이다. 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 슈도타입화 요소는 전형적으로 표적 세포에 결합하고, 표적 세포 및 바이러스 막의 막 융합 촉진을 위한 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 슈도타입화 요소는 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 및/또는 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G)이다. 예시적인 구현예에서, 슈도타입화 요소는 본원에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같이, 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 구현예에서, 특히, 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인 경우, 결합 폴리펩타이드는 홍역 바이러스의 헤마글루티닌(H) 폴리펩타이드(예: 홍역 바이러스의 에드먼스턴 균주), 또는 이의 세포질 도메인 결실 변이체이고, 다른 융합성 폴리펩타이드는 홍역 바이러스의 융합(F) 폴리펩타이드(예: 홍역 바이러스의 에드먼스턴 균주), 또는 이의 세포질 도메인 결실 변이체이다. 일부 구현예에서, 융합성 폴리펩타이드는 하나의 폴리펩타이드로서 발현되는 다중 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드는 동일한 전사체로부터, 단, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 번역될 수 있거나, 본원 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 폴리펩타이드는 번역 후 펩타이드 절단 신호 또는 리보솜 스킵 서열을 사용하여 절단되어 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩타이드가 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드, 또는 이의 세포질 도메인 결실이고, 융합성 폴리펩타이드가 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 또는 이의 세포질 도메인 결실인 경우, 별개의 리보솜 결합 부위로부터의 F 및 H 폴리펩타이드의 번역은 H 폴리펩타이드와 비교하여 더 많은 양의 F 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 구현예에서, F 폴리펩타이드 (또는 이의 세포질 도메인 결실) 대 H 폴리펩타이드 (또는 이의 세포질 도메인 결실)의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다.
일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 표적 세포, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 활성화 요소가 발현될 수 있다. 예를 들어, 이러한 구현예에서, 활성화 요소는 a.) CD3에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드; 및/또는 b.) CD28에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CD3에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드는 항-CD3 항체일 수 있다. 추가의 구현예에서, 항-CD3 항체는 항-CD3 scFvFc일 수 있다. 일부 구현예에서, CD28에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드는 CD80, CD86, 또는 이의 기능적 단편, 예를 들어, CD80의 세포외 도메인이다.
일부 구현예에서, 제2 교차활성인자는 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 임의의 것을 포함하는 하나 이상의 표적 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 RNA를 포함할 수 있는 패키징 가능한 RNA 게놈의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 패키징 시스템 양태, 및 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법 양태는 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스를 제조하는 것으로 제한되기보다는 복제 불능 재조합 레트로바이러스에 의해 형질도입될 수 있는 임의의 세포 유형에 대한 것으로 구상된다는 것에 주의하여야 한다. 특정 예시적인 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 비제한적인 예로서 본원에 개시된 임의의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 표적 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 레트로바이러스 성분, 예를 들어, gag 및 pol로부터 반대 배향으로 (예를 들어, 반대 가닥상에서 반대 배향으로 코딩하는) 발현하도록 설계되어 포함한다. 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3' 방향으로: 5' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 절단된 단편; 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열; 제1 및 임의로 제2 표적 폴리펩타이드, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 조작된 신호전달 폴리펩타이드(들)를, 일부 구현예에서, 표적 세포, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성이지만 예시적인 예에서는 패키징 세포에서 활성이 아니거나 패키징 세포에서 단지 유도성이거나 최소 활성인, 단지 편의상 "제4" 프로모터로 명명되는 (그리고 본원에서 때때로 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터로서 지칭되는) 5' 긴 말단 반복체 및 시스-작용성 RNA 패키징 요소와 관련하여 이러한 반대 배향으로 프로모터를 제거할 수 있는 반대 방향으로 코딩하는 핵산 서열; 및 3' 긴 말단 반복체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT)/중심 종결 서열 (CTS) 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 Rev 반응 요소일 수 있다. 5' 긴 말단 반복체로부터 반대 방향으로 프로모터에 의해 구동된 조작된 신호전달 폴리펩타이드는, 예시적인 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드이고, 임의로 본원에서 더욱 상세히 개시된 바와 같은 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 발현할 수 있다.
프로모터 번호, 예를 들어, 제1, 제2, 제3, 제4 등의 프로모터는 단지 편의를 위한 것임을 이해할 것이다. "제4" 프로모터로 명명되는 프로모터가, 이러한 다른 프로모터가 명확하게 언급되지 않는 한, 임의의 추가의 프로모터, 예를 들어, 제1, 제2, 제3 프로모터가 존재함을 암시하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 각각의 프로모터는 적절한 세포 유형에서 전사체의 발현을 유도할 수 있고, 이러한 전사체는 전사 단위를 형성함을 주의해야 한다.
일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 제1 림프증식성 요소를 포함할 수 있다. 적합한 림프증식성 요소는 본원 다른 섹션에 개시되어 있다. 비제한적인 예로서, 림프증식성 요소는 본원에 개시된 바와 같이, 인식 도메인, 예를 들어, eTag와의 융합물로서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원에 제공된 임의의 CAR 구현예를 코딩하는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 조작된 폴리펩타이드는 제1 항원 특이적 표적화 영역, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 표적 세포가 T 세포인 일부 구현예에서, 본원 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 세포에서 활성인 프로모터는 T 세포에서 활성이다.
일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 CAR을 포함할 수 있고, 핵산 서열은 본원에 제공된 임의의 CAR 구현예를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 조작된 폴리펩타이드는 제1 항원 특이적 표적화 영역, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제2 조작된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 조작된 폴리펩타이드는 림프증식성 요소일 수 있다. 표적 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 일부 구현예에서, 본원 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 세포에서 활성인 프로모터는 T 세포 또는 NK 세포에서 활성이다.
일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원 다른 섹션에서 논의된 바와 같이, 리보스위치를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 역 배향으로 존재할 수 있다. 추가의 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 리보스위치를 추가로 포함할 수 있고, 임의로, 리보스위치는 역 배향으로 존재할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 임의의 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 전사 차단제 또는 폴리A 서열은 비조절된 전사를 막거나 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, Vpx를 코딩하는 핵산 서열은 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 존재할 수 있다.
본원에서 또 하나의 양태에서, 복제 불능 레트로바이러스 입자를 위한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 패키징 세포주가 제공되고, 상기 패키징 가능한 RNA 게놈은
a. 5' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편;
b. 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
c. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 핵산의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
d. 3' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.
상기 양태에서 억제성 RNA 분자는 비제한적인 예로서 본 개시내용의 다른 섹션에서 본원에 제공된 shRNA 또는 miRNA와 같은 임의의 억제성 RNA 분자를 포함할 수 있다.
포유동물 패키징 세포주 양태의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(c)는 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소(b), 5' 긴 말단 반복체(a) 및/또는 3' 긴 말단 반복체(d)를 코딩하는 핵산 서열에 역 배향으로 존재할 수 있다.
포유동물 패키징 세포주 양태의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 개놈의 발현은 포유동물 패키징 세포주에서 활성인 유도성 프로모터에 의해 유도된다.
바로 상기에 제공된 이러한 양태에서 유도성 RNA 및 CAR의 발현을 유도하는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터는, 예시적인 구현예에서 패키징 세포주에서 활성이 아니거나 단지 최소 또는 유도성 활성이다. 예시적인 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 이 프로모터는 하나(예: 둘) 이상의 유도성 RNA 및 CAR을 코딩하는 핵산 및 3' LTR 사이의 패키징 가능한 RNA 게놈 상에 위치된다.
하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하는, 본원에서의 패키징 가능한 세포 또는 세포주에 지시된 임의의 양태에서, 적어도 하나 및 일부 구현예에서 모든 억제성 RNA 분자는 부분적으로 또는 완전히 서로 상보적인 5' 가닥 및 3' 가닥을 포함할 수 있고, 상기 5' 가닥 및 상기 3' 가닥은 18 내지 25 뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드이고, 3' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥 및 3' 가닥은 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 듀플렉스는 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, RNA 듀플렉스는 불일치를 갖지 않는다.
하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 억제성 RNA 분자를 코딩하는, 본원에서의 패키징 가능한 세포 또는 세포주에 지시된 바로 위에 제공된 임의의 양태에서, 억제성 RNA 분자는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 분자는 예를 들어, Pri-miRNA 또는 Pre-miRNA와 같은 miRNA의 전구체, 또는 shRNA의 전구체일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 억제성 RNA 분자는 인공적으로 유도된 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 다른 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 자체로 siRNA 또는 siRNA로 가공되는 (전사되거나 인공적으로 도입된) dsRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 자연에서 발견되지 않는 서열 또는 자연에서 발견되지 않는 적어도 하나의 기능적 세그먼트 또는 자연에서 발견되지 않는 기능적 세그먼트의 조합을 갖는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나 또는 모든 억제성 RNA 분자는 miR-155이다.
하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 억제성 RNA 분자를 코딩하는, 본원에서의 패키징 가능한 세포 또는 세포주에 지시된 바로 위에 제공된 임의의 양태에서, 하나 이상의 억제성 RNA 분자(들)는, 일부 구현예에서, 5'로부터 3' 배향으로 5' 아암, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 3' 줄기, 및 3' 아암을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 이 배열을 갖는다. 다른 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 모두가 이 배열을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 줄기는 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 줄기는 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 루프는 길이 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 천연 miRNA로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 및 miR-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 miR-155로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 무스 무스쿨러스(Mus musculus) miR-155 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens) miR-155로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암은 서열번호: 256에 제시된 서열을 갖거나, 예를 들어, 서열번호: 256과 동일한 길이이거나 서열번호: 256의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 길이이거나, 100개의 뉴클레오타이드 이하, 95 뉴클레오타이드 이하, 90개의 뉴클레오타이드 이하, 85 뉴클레오타이드 이하, 80개의 뉴클레오타이드 이하, 75 뉴클레오타이드 이하, 70개의 뉴클레오타이드 이하, 65 뉴클레오타이드 이하, 60개의 뉴클레오타이드 이하, 55 뉴클레오타이드 이하, 50개의 뉴클레오타이드 이하, 45 뉴클레오타이드 이하, 40개의 뉴클레오타이드 이하, 35 뉴클레오타이드 이하, 30개의 뉴클레오타이드 이하 또는 25 뉴클레오타이드 이하이고, 적어도 서열번호: 256과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열과 같은 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 서열번호: 260에 제시된 서열을 갖거나, 예를 들어, 서열번호: 260과 동일한 길이이거나 서열번호: 260의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 길이이거나, 100개의 뉴클레오타이드 이하, 95 뉴클레오타이드 이하, 90개의 뉴클레오타이드 이하, 85 뉴클레오타이드 이하, 80개의 뉴클레오타이드 이하, 75 뉴클레오타이드 이하, 70개의 뉴클레오타이드 이하, 65 뉴클레오타이드 이하, 60개의 뉴클레오타이드 이하, 55 뉴클레오타이드 이하, 50개의 뉴클레오타이드 이하, 45 뉴클레오타이드 이하, 40개의 뉴클레오타이드 이하, 35 뉴클레오타이드 이하, 30개의 뉴클레오타이드 이하 또는 25 뉴클레오타이드 이하이고, 서열번호: 260과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열과 같은 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 무스 무스쿨러스 BIC의 뉴클레오타이드 221-283을 포함한다.
또 다른 양태에서, 패키징 세포의 집단을 배양하여 제1 교차활성인자를 축적시키는 단계로서, 상기 패키징 세포가 구성적 프로모터로부터 발현되는 제1 교차활성인자를 포함하고, 상기 제1 교차활성인자가 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위해 제1 리간드 및 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 상기 제2 교차활성인자의 발현은 제1 교차활성인자에 의해 조절되는, 단계; 축적된 제1 교차활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에 배양하여 제2 교차활성인자를 축적시키는 단계로서, 상기 제2 교차활성인자가 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위해 제2 리간드 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있는, 단계; 및 축적된 제2 교차활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에 배양하여, 예를 들어, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및/또는 슈도타입화 요소와 같은, 바이러스 패키징에 관여하는 레트로바이러스 폴리펩타이드, 및 임의로, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내에 또는 위에 도입되게 될 포유동물 세포 증식 또는 생존을 억제시키는 것으로 간주되는 다른 폴리펩타이드의 발현을 유도하여 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은, 종종 편의상 "제3" 프로모터로서 지칭되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되되,, 상기 제3 프로모터는 구성적으로 활성이거나, 또는 제1 교차활성인자, 또는 예시적인 구현예에서, 제2 교차활성인자에 의해 유도성이어서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스를 제조한다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 표적 세포의 세포 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 막에의 융합을 촉진시킬 수 있다. 슈도타입화 요소는 당업계에 공지된 임의의 외피 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G), 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 및/또는 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질일 수 있다. 당업자는 다수의 상이한 교차활성인자, 리간드, 및 유도성 프로모터가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 교차활성인자, 리간드, 및 유도성 프로모터는 상기를 포함하여 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 당업자는 본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템 양태에 관한 상기 교시가 또한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 제조 방법 양태에 적용된다는 것, 및 그 반대의 경우도 추가로 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 컨센서스 서열, 예를 들어, HIV Rev를 함유하는 전사체의 핵 외수송을 제어하는 요소의 발현을 조절할 수 있고, 컨센서스 서열은 Rev 반응성 요소(RRE)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 표적 세포는 전형적으로 T 세포이다. 일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 각각 HIV-2 RRE 및 HIV-2 Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 각각 SIV RRE 및 SIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 각각 RemRE 및 베타레트로바이러스 Rem을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 각각 델타레트로바이러스 RexRRE 및 델타레트로바이러스 Rex를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Rev 유사 단백질은 요구되지 않고, RRE는 시스-작용성 RNA 요소, 예를 들어, 구성적 수송 요소(CTE)로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 슈도타입화 요소는 바이러스 외피 단백질이다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 바이러스 및 표적 세포 막에의 결합, 및 바이러스 및 표적 세포 막의 막 융합 촉진을 위해 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 슈도타입화 요소는 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 및/또는 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 슈도타입화 요소는 본원에서 추가로 상세하게 논의된 바와 같이, 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 구현예에서, 특히, 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인 경우, 결합 폴리펩타이드는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있고, 융합성 폴리펩타이드는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합성 폴리펩타이드는 하나의 폴리펩타이드로서 발현되는 다중 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드는 동일한 전사체로부터 번역되고, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 번역될 수 있거나, 폴리펩타이드는 본원 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 번역 후 펩타이드 절단 신호 또는 리보솜 스킵 서열을 사용하여 절단되어 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드의 번역은 결합 폴리펩타이드와 비교하여 더 많은 양의 융합성 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 구현예에서, 융합성 폴리펩타이드 대 결합 폴리펩타이드의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다.
일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 표적 세포, 예를 들어, T 세포에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 구현예에서, 활성화 요소는 a.) CD3에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드; 및/또는 b.) CD28에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CD28에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩타이드는 CD80, CD86, 또는 이의 기능적 단편이다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 레트로바이러스 막 상의 활성화 요소 및 뉴클레오캡시드 내의 레트로바이러스 RNA를 포함할 수 있고, 이로써, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 교차활성인자는, 5'에서 3' 방향으로: 5' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 절단된 단편; 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열; 제1 표적 폴리펩타이드 및 임의의 제2 표적 폴리펩타이드, 비제한적인 예로서, 1 또는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열; 표적 세포에서 활성인 프로모터; 및 3' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 절단된 단편을 포함하는 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 cPPT/CTS 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 Rev 반응성 요소일 수 있다. 본원의 개시된 임의의 구현예에서, RRE 및 Psi를 포함하는, RNA 상의 레트로바이러스 성분은 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 위치에 위치할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 본원에 개시된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 제1 림프증식성 요소를 포함할 수 있다. 적합한 림프증식성 요소는 본원 다른 섹션에 개시되어 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 인식 도메인, 예를 들어, eTag에 융합된 IL-7 수용체 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원에 제공된 임의의 CAR 구현예를 코딩하는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 조작된 폴리펩타이드는 제1 항원 특이적 표적화 영역, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 표적 세포가 T 세포인 일부 구현예에서, 본원 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 세포에서 활성인 프로모터는 T 세포에서 활성이다.
일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원 다른 섹션에서 논의된 바와 같이, 리보스위치를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 역 배향으로 존재할 수 있다. 추가의 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 리보스위치를 추가로 포함할 수 있고, 임의로, 리보스위치는 역 배향으로 존재할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 임의의 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 전사 차단제 또는 폴리A 서열은 비조절된 전사를 막거나 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, Vpx를 코딩하는 핵산 서열은 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 존재할 수 있다.
패키징 시스템, 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법 양태의 일부 구현예에서, 코딩된 RNA는 인트론을 포함할 수 있고, 이는, 예를 들어, 표적 폴리펩타이드(들)를 발현하기 위해 동일한 프로모터로부터 전사될 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 이러한 인트론은 1, 2, 3, 또는 4개의 miRNA를 코딩할 수 있다. 패키징 시스템, 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법 양태의 이러한 및 다른 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈의 크기는 11,000 KB 이하 및 일부 경우에서, 10,000 KB 이하이다.
일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 비독성인 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현에 영향을 줄 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 교차활성인자는 독성인 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 제1 교차활성인자는 패키징 세포의 세포 막으로 수송되는 폴리펩타이드 이외에도, 레트로바이러스 단백질 Rev 및 Vpx의 발현을 유도할 수 있고, 제2 교차활성인자는 레트로바이러스 단백질 GAG, POL, MV(Ed)-FΔ30, 및 MV(Ed)-HΔ18 또는 MV(Ed)-HΔ24 중 어느 하나의 발현, 및 렌티바이러스 게놈의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 교차활성인자는 독성인 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현에 영향을 줄 수 있고/있거나, 제2 교차활성인자는 비독성인 하나 이상의 폴리펩타이드의 발현에 영향을 줄 수 있다.
또 다른 양태에서,
a.) 제1 교차활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제1 전사 단위로서, 상기 제1 전사 단위가 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 교차활성인자가 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있고, 상기 제1 교차활성인자가 상기 제1 리간드에 결합할 수 있는 , 제1 전사 단위; b.) 레트로바이러스 REV 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 교차활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제2 및 임의의 제3 전사 단위로서, 상기 제2 교차활성인자가 제2 리간드에 결합할 수 있고, 상기 제2 및 임의의 제3 전사 단위는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제2 및 임의의 제3 전사 단위; c.) 레트로바이러스 gag 폴리펩타이드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩타이드, 및 표적 세포 막 및 레트로바이러스 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막 및 레트로바이러스 막의 융합을 촉진시킬 수 있는 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제4 및 임의의 제5 전사 단위로서, 상기 제4 및 임의의 제5 전사 단위가 제2 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제4 및 임의의 제5 전사 단위; 및 d) 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR, 또는 이의 활성 절단된 단편, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, cPPT/CTS 요소, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 역 상보체, 인트론, 표적 세포에서 활성인 프로모터, 및 3' LTR, 또는 이의 활성 절단된 단편을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제6 전사 단위로서, 상기 제6 전사 단위가 제2 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제6 전사 단위를 포함하는, 포유동물 패키징 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 1.) 패키징 세포 집단을 배양하여 제1 교차활성인자를 축적시키는 단계로서, 상기 패키징 세포가 a.) 제1 교차활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제1 전사 단위로서, 상기 제1 전사 단위는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 교차활성인자는 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있고, 상기 제1 교차활성인자가 상기 제1 리간드에 결합할 수 있는, 제1 전사 단위; b.) 레트로바이러스 REV 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 교차활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제2 및 임의의 제3 전사 단위로서, 상기 제2 교차활성인자가 제2 리간드에 결합할 수 있고, 상기 제2 및 임의의 제3 전사 단위가 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제2 및 임의의 제3 전사 단위; c.) 레트로바이러스 gag 폴리펩타이드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩타이드, 및 표적 세포 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막과 레트로바이러스 막의 융합을 촉진시킬 수 있는 결합 폴리펩타이드 및 융합성 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제4 및 임의의 제5 전사 단위로서, 상기 제4 및 임의의 제5 전사 단위가 제2 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제4 및 임의의 제5 전사 단위; 및 d.) 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR, 또는 이의 활성 절단된 단편, 프라이머 결합 부위(PBS), 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, cPPT/CTS 요소, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 역 상보체, 인트론, 표적 세포에서 활성인 표적 세포 프로모터, 및 3' LTR 또는 이의 활성 절단된 단편을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제6 전사 단위로서, 상기 제5 전사 단위가 제2 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 제6 전사 단위를 포함하는, 단계; 2.) 제1 교차활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에 배양하여 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 축적시키는 단계; 및 3.) 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에 배양하여 레트로바이러스 gag 폴리펩타이드, 레트로바이러스 pol 폴리펩타이드, 결합 폴리펩타이드, 융합성 폴리펩타이드, 및 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR 또는 이의 활성 단편, PBS, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소, 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 핵산 서열의 역 상보체, 표적 세포 프로모터, 및 3' LTR 또는 이의 활성 절단된 단편을 포함하는 레트로바이러스 RNA의 발현을 유도하여 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 단계로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 형성되고, 패키징 세포로부터 방출되고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 레트로바이러스 막 상의 결합 폴리펩타이드 및/또는 융합성 폴리펩타이드 및 뉴클레오캡시드 내의 레트로바이러스 RNA를 포함하는, 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 한 양태에서, 레트로바이러스 패키징 시스템은 1.) 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있는 제1 교차활성인자; 2.) 제2 리간드 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 이에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 교차활성인자; 및 3.) 레트로바이러스 입자에 대한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함할 수 있고, 상기 제1 교차활성인자는 제2 교차활성인자, HIV REV, IL7 GPI DAF, 및 활성화 요소의 발현을 조절하고, 상기 제2 교차활성인자는 gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소, 및 하나 이상의 외피 폴리펩타이드의 발현을 조절한다. 예시적인 구현예에서, 제1 교차활성인자는 p65 활성화 도메인에 융합된 FRB 도메인 및 ZFHD1 DNA 결합 도메인에 융합된 하나 이상의 FKBP 도메인일 수 있고, 제1 리간드는 라파마이신일 수 있고, 제1 유도성 프로모터는 하나 이상의 ZFHD1 결합 부위일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제2 교차활성인자는 rtTA 단백질일 수 있고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 제2 유도성 프로모터는 TRE 프로모터 또는 양방향 TRE 프로모터일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 외피 단백질은 홍역 바이러스의 F 및 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 전사 차단제 또는 폴리A 서열은 비조절된 전사를 막거나 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치를 포함하는 라파마이신-독시사이클린 유도성 렌티바이러스 게놈이 사용될 수 있다(서열번호: 83). 일부 구현예에서, 라파마이신-독시사이클린 유도성 GAG POL ENV가 사용될 수 있다(서열번호: 84). 일부 구현예에서, 라파마이신-유도성 TET 활성인자가 사용될 수 있다(서열번호: 85). 일부 구현예에서, 라파마이신 유도제 유도성 REV srcVpx가 사용될 수 있다(서열번호: 86).
본 개시내용의 일부 양태는 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위해 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 예를 들어, 렌티바이러스를 제조하기 위한 패키징 세포로서 사용되는 세포, 예시적인 예에서, 포유동물 세포를 포함하거나, 또는 이들 세포이다. 임의의 매우 다양한 세포는 본 발명에 따라 바이러스 또는 바이러스 입자, 예를 들어, 재지정된 재조합 레트로바이러스 입자의 시험관내 생산을 위해 선택될 수 있다. 진핵 세포, 특히, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말, 및 설치류 세포를 포함하는 포유동물 세포가 전형적으로 사용된다. 예시적인 예에서, 세포는 인간 세포이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 세포는 무기한으로 재생되고, 따라서, 불멸성이다. 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있는 세포의 예로는 NIH 3T3 세포, COS 세포, 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포, 인간 배아 293T 세포 및 상기 세포로부터 유래된 임의의 세포, 예를 들어, 293T 세포로부터 유래된 gpnlslacZ φNX 세포를 포함한다. 고도로 형질감염가능한 세포, 예를 들어, 인간 배아 신장 293T 세포가 사용될 수 있다. "고도로 형질감염가능한"이란 세포 중 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게 적어도 약 70%, 가장 바람직하게 적어도 약 80%가 도입된 DNA의 유전자를 발현할 수 있다는 것을 의미한다.
적합한 포유동물 세포는 1차 세포 및 불멸화 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류(예: 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유동물 세포주는 HeLa 세포(예: 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예: ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예: ATCC 번호 CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포(예: ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예: ATCC 번호 CCLlO), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RATl 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, 주르카트(Jurkat), HL-60, NK 세포주(예: NKL, NK92 및 YTS) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 임의의 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법은 포유동물 패키징 세포를 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 합류점 또는 합류점까지, 또는 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 피크 세포 밀도 또는 피크 세포 밀도까지 성장시킨 후, 세포를 나누거나 희석시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 교반식 탱크 반응기가 세포를 성장시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 당업자가 이해하는 방법을 사용하여 적어도 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 또는 1:20으로 나뉠 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 피크 세포 밀도로 희석될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 나누거나 희석시킨 후, 세포를 제1 리간드를 첨가하기 전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 또는 16시간 동안 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 성장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 제1 리간드의 존재하에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 또는 28일 동안, 예시적인 구현예에서, 라파마이신 또는 라팔로그일 수 있는 제1 리간드의 존재하에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 제2 리간드를 첨가할 수 있고, 세포를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21 또는 28일 동안, 예시적인 구현예에서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있는 것에서 성장시킬 수 있다. 배양 조건은 사용되는 세포 및 리간드에 의존할 것이며, 방법은 당업계에 공지되어 있다. HEK293S 세포를 배양 및 유도하기 위한 조건의 구체적인 예는 실시예 8에 제시되어 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 유전자 전달을 위한 일반적인 도구이다(참조: Miller, Nature (1992) 357:455-460). 재배열되지 않은 핵산 서열을 광범위한 설치류, 영장류 및 인간 체세포로 전달하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 능력은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 유전자를 세포로 전달하는데 충분히 적합하게 한다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 알파레트로바이러스 속, 베타레트로바이러스 속, 감마레트로바이러스 속, 델타레트로바이러스 속, 엡실론레트로바이러스 속, 렌티바이러스 속, 또는 스푸마바이러스 속으로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 다수의 레트로바이러스가 존재한다. 예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수세포증 바이러스-29(MC29), 및 조류 적아세포증 바이러스(AEV)가 사용될 수 있다. 레트로바이러스에 관한 상세한 목록은 문헌[참조: Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)]에서 발견될 수 있다. 일부 레트로바이러스의 게놈 구조에 관한 상세한 설명은 당업계에서 발견될 수 있다. 예로서, HIV에 관한 상세한 설명은 NCBI Genbank(즉, 게놈 수탁 번호 AF033819)로부터 발견될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 속으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 HIV, SIV, 또는 FIV로부터 유래될 수 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 속 중의 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스는 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에도, 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 잠복 감염 과정에서와 같이, 더 높은 복합도를 통해 렌티바이러스는 이의 라이프 사이클을 조정할 수 있다. 전형적인 렌티바이러스는, AIDS의 병인성 제제인 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다. 생체내에서, HIV는, 예를 들어, 림프구 및 대식세포와 같이, 거의 분열하지 않는 말단 분화된 세포를 감염시킬 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 Vpx 폴리펩타이드를 함유한다. Vpx 폴리펩타이드는, 예를 들어, 레트로바이러스 막 내로 도입되는 세포 막 결합 단백질과 같이, 이의 게놈 내로의 Vpx 코딩 핵산의 통합 이후, 패키징 세포주에서 발현될 수 있다(참조: Durand 등, J. Virol. (2013) 87: 234-242). 일단 바이러스 입자에 도입되면 유리 Vpx가 방출될 수 있도록 레트로바이러스 막 결합 Vpx는 바이러스 프로테아제에 대한 가공 서열과 함께 작제될 수 있다. 이러한 기능성을 갖는 상기 Vpx 융합물의 예로는 c-Src의 처음 11개의 아미노산의 막-표적화 도메인(MGSSKSKPKDP)(서열번호: 227), 이어서, 바이러스 프로테아제 절단 도메인 KARVLAEA(서열번호: 228), 이어서, Flag-태그화 Vpx를 포함하는 Src-Flag-Vpx가 있다.
이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, Vpx 폴리펩타이드는 제한 인자 SAMHD1을 분해하여 역전사 가공 효율을 자극시킴으로써 휴지 세포의 형질도입을 돕는다. 따라서, Vpx가 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 존재하는 본원에 제공된 방법에서, Vpx는 Vpx를 함유하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 세포의 형질도입시 휴지 T 세포 또는 휴지 NK 세포의 세포질로 방출되는 것으로 간주된다. 이어서, Vpx는 SAMHD1을 분해하고, 이는 유리 dNTP를 증가시키고, 이는 또한 레트로바이러스 게놈의 역전사를 자극시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 Vpu 폴리펩타이드를 포함하고/하거나 함유한다. Vpu 폴리펩타이드는 Vpu 코딩 핵산을 이의 게놈에 통합시킨 후, 예를 들어, 레트로바이러스 막에 혼입되는 바이러스 막 단백질로서 플라스미드 또는 패키징 세포주에서 발현될 수 있다. 인간에서의 발현을 위해 최적화된 서열 코돈을 갖는 Vpu의 재조합 형태가 작제되고, 유리 Vpu가 바이러스 입자 내로 혼입될 수 있도록 발현될 수 있다. Vpu는 HIV-1 및 SIVcpz, SIVgsn 및 SIVmon과 같은 일부 HIV-1 관련 시미안 면역결핍 바이러스(SIV) 단리물에서 발견되는 보조 단백질이지만, HIV-2 또는 대다수의 SIV 단리물에서는 발견되지 않는다. Vpu 단백질은 CD4의 하향 조절 및 입자 방출에 대한 테테린의 길항작용에 참여한다. 더욱 중요하게는, Vpu는 바이로포린, 특히 인플루엔자 A 바이러스(IAV)에서 유래된 바이로포린 단백질 M2와 구조적 유사성을 공유한다. 이와 같이, Vpu는 다양한 모델에서 양이온 선택적 이온 채널을 형성하고 막을 투과하는 것으로 나타났다. IAV-M2는 입자를 산성화시켜 유입에 사용되는 엔도솜 경로로부터의 초기 방출을 선호하여 막 다른 전이 제품의 양을 줄이는 데 도움이 되는 것으로 나타났다.
본원의 실시예 20은 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 PBMC의 형질도입이 레트로바이러스 입자 내에 Vpu의 존재에 의해 강화된다는 것을 입증한다. 이론에 의해 제한되지 않고, Vpu 폴리펩타이드는 렌티바이러스 슈도타입의 산성화를 촉진하여 휴지 세포의 형질도입을 도와 더 많은 캡시드가 세포질에 더 빨리 도달하도록 한다. 바이러스 내부의 산성화는 바이러스 구조 단백질 간의 정전기적 상호 작용을 약화시키고, 따라서 캡시드 및 바이러스 리보핵단백질(RNP) 복합체의 해리를 촉진한다. 따라서, Vpu가 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는데 사용되는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 막에 존재하는 본원에 제공된 방법에서, Vpu는 엔도솜 경로에서 렌티바이러스 입자의 산성화를 촉진시키고, Vpu를 함유하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 세포의 형질도입시 휴지 T 세포 또는 휴지 NK 세포의 세포질 내로의 캡시드 방출을 선호한다. 따라서, 일부 구현예에서, 휴지 PBMC 및 일부 구현예에서 휴지 T 세포의 형질도입을 촉진시키는 능력을 보유하는 Vpu의 단편을 포함하거나 Vpu의 단편인 Vpu 폴리펩타이드가 그 안에 포함된다. 단편은 야생형 Vpu에 대해 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% Vpu의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Vpu 폴리펩타이드는 엔도솜 경로에서 렌티바이러스 입자의 산성화를 촉진하는 능력을 보유하는 Vpu 단편을 포함한다.
레트로바이러스 게놈 크기
본원에 제공된 방법 및 조성물에서, 재조합 레트로바이러스 게놈, 비제한적인 예시적 예에서, 렌티바이러스 게놈은 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 개수에 제한이 있다. 본원에 제공된 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역이 야생형 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드 코딩 영역보다 더 적은 뉴클레오타이드에 의해 코딩되도록 기능성 활성을 보유하는 절단물 또는 다른 결실물일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 1개의 프로모터로부터 발현될 수 있는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 1개의 융합 폴리펩타이드 및 1개의 프로모터로부터 2개 이상의 기능적 폴리펩타이드를 생성하기 위해 절단 신호를 가질 수 있다. 추가로, 초기 생체외 형질도입 이후에 요구되지 않는 일부 기능은 레트로바이러스 게놈에 포함되지 않고, 이는 오히려 패키징 세포 막을 통해 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에 존재한다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내에 패키징되는 기능적 요소를 최대화하기 위해 이러한 다양한 전략이 본원에서 사용된다.
일부 구현예에서, 패키징되는 재조합 레트로바이러스 게놈은 범위의 하단으로 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000 및 8,000개의 뉴클레오타이드 내지 범위의 상단으로 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000 및 11,000개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 패키징되는 레트로바이러스 게놈은 본원에 상세하게 개시된 바와 같은 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징되는 재조합 레트로바이러스 게놈은 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000 또는 11,000개 미만의 뉴클레오타이드일 수 있다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바 있는, 패키징될 수 있는 기능으로는 레트로바이러스 어셈블리 및 패키징을 위해 필요한 레트로바이러스 서열, 예를 들어, 레트로바이러스 rev, gag, 및 pol 코딩 영역 뿐만 아니라, 5' LTR 및 3' LTR, 또는 이의 활성 절단된 단편, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, 및 cPPT/CTS 요소를 포함한다. 추가로, 예시적인 구현예에서, 본원의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 일부 구현예에서, 이러한 레트로바이러스 기능성 영역의 역 배향으로 하기 중 임의의 하나 이상 또는 모두를 포함할 수 있다: 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역으로서, 이중 적어도 하나가 림프증식성 요소를 포함하고, ASTR을 추가로 포함할 수 있는, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역; 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드; 전형적으로, 제1 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 조절 요소, 예를 들어, 리보스위치; 인식 도메인, 인트론, 표적 세포, 예를 들어, T 세포에서 활성인 프로모터, 2A 절단 신호 및/또는 IRES.
재조합 레트로바이러스 입자
재조합 레트로바이러스 입자는, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하기 위한, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 개시되어 있다. 재조합 레트로바이러스 입자는 그 자체가 본 발명의 양태이다. 전형적으로, 본원에 제공된 양태에 포함된 재조합 레트로바이러스 입자는 복제 불능인데, 이는 재조합 레트로바이러스 입자가 일단 패키징 세포를 떠나고 나면, 복제할 수 없다는 것을 의미한다. 예시적인 구현예에서, 재조합 레트로바이러스는 렌티바이러스 입자이다.
일부 양태에서, 세포, 전형적으로는 림프구 및 예시적인 구현예에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 데 사용하기 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본원의 다른 곳에서 논의된 임의의 슈도타입화 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본원의 다른 곳에서 논의된 임의의 활성화 요소를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, A. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 하나 이상의 전사 단위; 및 B. 표면 상의 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소로서, 상기 T 세포 활성화 요소가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 요소는 본원의 다른 곳에서 논의된 임의의 활성화 요소일 수 있다. 예시적인 구현예에서, T 세포 활성화 요소는 항-CD3 scFvFc일 수 있다. 또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공되며, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 키메라 림프증식성 요소일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 IL-7 수용체 알파 쇄 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 IL-2/IL-15 수용체 베타 쇄에 결박된 IL-15를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공되고, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 키메라 림프증식성 요소, 예를 들어, 구성적 활성 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩한다. 예시적인 구현예에서, 키메라 림프증식성 요소는 이의 동족체 수용체에 결박되거나 이의 동족체 수용체의 단편에 결박된 사이토카인을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, (i) T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 이에의 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소; (ii) T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 갖는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위는 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 갖는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현이 생체내 조절 요소에 의해 조절되는, 폴리뉴클레오타이드; 및 (iii) 표면 상의 활성화 요소로서, 상기 활성화 요소가 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 활성화 요소를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성 프로모터는 패키징 세포주에서 활성이 아니거나, 유도 가능한 방식으로 패키징 세포주에서 단지 활성이다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 어느 하나는 키메라 항원 수용체를 가질 수 있고, 나머지 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 가질 수 있다.
예를 들어, 슈도타입화 요소, 활성화 요소 및 막 결합 사이토카인과 같은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 포함되는 다양한 요소 및 요소의 조합뿐만 아니라, 예를 들어 CAR를 코딩하는 핵산; 림프증식성 요소를 코딩하는 핵산; 리보스위치와 같은 조절 요소를 코딩하는 핵산; 프로모터, 특히 T 세포에서 구성적으로 활성이거나 유도성인 프로모터; 및 억제성 RNA 분자를 코딩하는 핵산에 제한되지 않는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 게놈에 포함되는 핵산 서열이 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공된다. 또한, 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법, 양자 세포 요법을 수행하는 방법 및 T 세포를 형질도입하는 방법과 같은 본원에 제공된 다양한 양태는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하고/하거나 포함한다. 이러한 방법으로 생산되고/되거나 이에 포함되는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 자체는 분리된 형태일 수 있는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 조성물로서 본 발명의 별도의 양태를 형성한다. 이러한 조성물은 건조된(예: 동결건조된) 형태로 존재할 수 있거나, 레트로바이러스 입자의 저장 및 사용을 위한 당업계에 공지된 적합한 용액 또는 매질에 존재할 수 있다.
따라서, 비제한적인 예로서, 또 다른 양태에서, 일부 예에서 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 키메라 항원 수용체, 또는 본원에 기재된 바와 같이 CAR을 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 갖는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, 억제성 RNA 분자가 아닌 본원에서 앞서 기재된 적어도 하나의 림프증식성 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열이 존재한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 존재한다면, 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및/또는 제3 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에 제시된 바와 같은 하나 이상의 리보스위치를 포함한다. 이러한 작제물에서, 하나 이상의 억제성 RNA, CAR 및/또는 억제성 RNA가 아닌 하나 이상의 림프증식성 요소의 발현은 리보스위치에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 2 내지 10개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 의해 코딩된다. 추가의 구현예에서, 2 내지 6개의 억제성 RNA 분자는 제1 핵산 서열에 의해 코딩된다. 예시적인 구현예에서, 4개의 억제성 RNA 분자는 제1 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하고 인트론 내에 위치한다. 특정 구현예에서, 인트론은 프로모터의 전부 또는 일부를 포함한다. 프로모터는 Pol I, Pol II 또는 Pol III 프로모터일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 프로모터는 Pol II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 인트론은 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 측접하고 프로모터의 하류에 있다. 일부 구현예에서, 인트론은 EF1-α 인트론 A이다.
본원의 재조합 레트로바이러스 입자 구현예는 레트로바이러스 입자가 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 게놈을 포함하는 것들을 포함한다. 이러한 핵산과 억제성 RNA 분자 이외의 CAR 또는 림프증식성 요소를 코딩하는 다른 핵산과의 조합을 포함하는, 레트로바이러스 입자의 게놈에 포함될 수 있는 억제성 RNA 분자를 코딩하는 이러한 핵산의 다양한 대안적인 구현예는, 예를 들어, 본원에 제공된 억제성 RNA 섹션 뿐만 아니라 이러한 구현예를 결합하는 다양한 다른 단락에 포함된다. 또한, 이러한 복제 불능 재조합 재조합 레트로바이러스의 다양한 대안은 본원에 개시된 패키징 세포주 양태에서 개시된 예시적인 핵산에 의해 동정될 수 있다. 당업자는 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 게놈을 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자의 이 섹션에서의 개시내용은 본원의 다른 섹션에 제공된 억제성 RNA 분자를 코딩하는 이러한 핵산을 위한 다양한 대안과 결합될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 이러한 핵산이, 예를 들어, 억제성 RNA 분자 및 이러한 분자를 코딩하는 핵산에 초점을 맞추는 본원의 섹션에 개시된 바와 같이 본원에 제공된 다양한 다른 기능적 핵산 요소와 결합될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 다른 섹션에서 본원에 제공된 특이적 억제성 RNA 분자의 다양한 구현예는 본 개시내용의 재조합 레트로바이러스 입자 양태에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터와 같은 재조합 레트로바이러스 벡터의 필수 요소는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 요소는 패키징 세포주 섹션 및 실시예 섹션에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하기 위한 세부 사항에 포함된다. 예를 들어, 렌티바이러스 입자는 전형적으로 하나 이상의 패키징 플라스미드를 통해 패키징 세포주에 전달될 수 있는 패키징 요소 REV, GAG 및 POL, 다양한 예가 본원에 제공되고 슈도타입화 플라스미드를 통해 패키징 세포주로 전달될 수 있는 슈도타입화 요소, 및 전달 플라스미드를 통해 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 생성되는 게놈을 포함한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 바이러스성 LTR 및 psi 패키징 신호를 포함한다. 5' LTR은 이형 프로모터에 융합된 키메라 5' LTR일 수 있으며, Tat 상호활성화에 의존하지 않는 5'LTR을 포함한다. 전달 플라스미드는, 예를 들어, 3' LTR의 U3 영역을 제거함으로써 자체 불활성일 수 있다. 일부 비제한적인 구현예에서, Src-FLAG-Vpu를 포함하나 이에 제한되지 않는 Vpu를 포함하는 폴리펩타이드(본원에서 때때로 "Vpu 폴리펩타이드"로 칭명됨)와 같은 Vpu는 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법 양태 및 구현예를 위한 레트로바이러스 입자 내에 패키징된다. 일부 비제한적인 구현예에서, Src-FLAG-Vpx와 같은 Vpx는 레트로바이러스 입자 내에 패키징된다. 이론에 국한되지 않고, T 세포의 형질도입시, Vpx는 세포의 세포질로 들어가고 SAMHD1의 분해를 촉진하여 역전사에 이용가능한 세포질 dNTP 풀을 증가시킨다. 일부 비제한적인 구현예에서, Vpu 및 Vpx는 본원에 제공된 레트로바이러스 입자를 포함하는 임의의 조성물 또는 방법 양태 및 구현예를 위한 레트로바이러스 입자 내에 패키징된다.
본 발명의 다양한 양태에 포함되는 레트로바이러스 입자(예: 렌티바이러스 입자)는 예시적인 구현예에서 특히 이러한 레트로바이러스 입자로 형질도입된 세포를 대상체에게 도입하는 단계를 포함하는 구현예에 대한 안전성 이유 때문에 복제 불능이다. 복제 불능 레트로바이러스 입자가 세포를 형질도입하는 데 사용되는 경우, 레트로바이러스 입자는 형질도입된 세포로부터 생산되지 않는다. 레트로바이러스 게놈에 대한 변형은 게놈을 포함하는 레트로바이러스 입자가 복제 불능임을 보장하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 본원에서 제공된 임의의 양태를 위한 임의의 구현예에서, 복제 가능 재조합 레트로바이러스 입자가 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
당업자는 본원에서 논의된 기능적 요소가 발현 벡터와 같은 상이한 유형의 벡터를 사용하여 패키징 세포 및/또는 T 세포에 전달될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 예시적인 양태는 레트로바이러스 벡터, 일부 특정 예시적인 구현예에서는 렌티바이러스 벡터를 사용한다. 다른 적합한 발현 벡터가 본원의 특정 구현예를 달성하는데 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 바이러스 벡터(예: 백시니아 바이러스에 기초하는 바이러스 벡터; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(참조: 예를 들어, Li 등, Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras 등, Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto 등, H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655); 아데노-관련 바이러스(참조: 예를 들어, Ali 등, Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery 등, PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett 등, Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary 등, Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling 등, Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali 등, Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski 등, J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson 등, Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte 등, PNAS (1993) 90: 10613-10617); SV40; 단순 포진 바이러스; 또는 레트로바이러스 벡터(예: 뮤린 벡혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 루스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스와 같은 레트로바이러스 유래 벡터), 예를 들어, 감마 레트로바이러스; 또는 인간 면역결핍 바이러스(참조: 예를 들어, Miyoshi 등, PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi 등, J Virol 73:7812 7816, 1999) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다. 이러한 레트로바이러스 입자는 전형적으로 바이러스 외피 내에 위치하는 캡시드 내에 레트로바이러스 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, DNA 함유 바이러스 입자가 재조합 레트로바이러스 입자 대신에 사용된다. 이러한 바이러스 입자는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 사이토메갈로바이러스, 폭스바이러스, 아비폭스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 신드비스 바이러스일 수 있다. 당업자는 상이한 바이러스 및 레트로바이러스, 또는 레트로바이러스 입자와 함께 사용하기 위해 본원에 개시된 방법을 수정하는 방법을 이해할 것이다. DNA 게놈을 포함하는 바이러스 입자가 사용되는 경우, 당업자는 바이러스 입자의 DNA 게놈의 전부 또는 일부의 이러한 바이러스로 형질도입된 T 세포 게놈으로의 통합을 유도하기 위해 이러한 게놈에 기능적 단위가 포함될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 N-말단 RGG 박스 RNA 결합 모티프 및 ICP27을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역은 아데노바이러스 E1B 55-kDa 및 E4 Orf6을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 영역으로 대체될 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태에 따르는 단리된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 용기, 예를 들어, 상업용 용기 또는 패키지 또는 이를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 또한, 또 다른 양태에서, 본원에 제공된 임의의 패키징 세포 및/또는 패키징 세포주에 따라서 패키징 세포주로부터 단리된 패키징 세포, 예시적인 구현예에서 단리된 패키징 세포를 포함하는 용기, 예를 들어, 상업적 용기 또는 패키지, 또는 이를 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 제공된 방법에 사용되는 완충제 또는 시약과 같은 추가의 시약을 포함하는 추가의 용기를 포함한다. 또한, 특정 양태에서, 본원에 제공된 임의의 양태에 따르는 T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 키트의 제조에 있어서, 임의의 양태에서 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공된다. 또한, 특정 양태에서 본원에서 제공된 임의의 양태에 따르는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하기 위한 키트의 제조에서, 임의의 양태에서 본원에 제공된 임의의 패키징 세포 또는 패키징 세포주의 용도가 본원에 제공된다.
하나의 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 및 대상체에서 종양 성장을 치료하기 위한 이의 사용 설명서를 함유하는 상업용 용기가 본원에 제공되고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 이의 게놈에 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 서열의 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산 서열의 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 둘 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩할 수 있다.
재조합 레트로바이러스 입자를 함유하는 용기는 튜브, 바이알, 플레이트의 웰 또는 재조합 레트로바이러스 입자를 저장하기 위한 다른 용기일 수 있다. 키트는 제2 또는 다른 용기가, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위한 용액 또는 배지를 포함할 수 있고/있거나 제2 또는 다른 용기가 pH-조절 약리학적 제제를 포함할 수 있는 둘 이상의 용기를 포함할 수 있다. 임의의 이러한 용기는 산업 강도 및 등급이 될 수 있다. 억제성 RNA 분자를 코딩하는 핵산 및 키트를 포함하는 이러한 양태에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본원에서 제공되는 억제성 RNA에 대한 임의의 구현예를 포함하는 본원에 제공된 이러한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 대한 임의의 구현예일 수 있다.
또 다른 양태에서, T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 키트의 제조에 있어서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공되며, 상기 키트의 용도는 생체외 T 세포 또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시켜 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 단계를 포함하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면 상의 슈도타입화 요소 및 표면 상의 T 세포 활성화 요소를 포함하고, 상기 접촉 단계는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 T 세포 또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 대상체로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 요소는 막 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉은 범위의 하단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 및 범위의 상단에서 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 21 및 24시간 동안, 예를 들어, 1 내지 12시간 동안 수행될 수 있다. 키트의 제조에 사용하기 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본원의 다른 부분에서 논의된 임의의 양태, 구현예 또는 하위 구현예를 포함할 수 있다.
유전자 변형된 T 세포 및 NK 세포
본원의 방법 및 조성물의 구현예에서, 그 자체가 본 발명의 별개의 양태인 유전자 변형된 림프구가 제조된다. 이러한 유전자 변형된 림프구는 형질도입된 림프구일 수 있다. 하나의 양태에서, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공되고, 상기 T 세포 또는 NK 세포는 유전적으로 변형되어 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 림프증식성 요소 또는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 CAR 또는 림프증식성 요소일 수 있는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 키메라 림프증식성 요소일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 표면에 슈도타입화 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 또는 NK 세포는 표면에 활성화 요소를 추가로 포함할 수 있다. 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포의 CAR, 림프증식성 요소, 슈도타입화 요소 및 활성화 요소는 본원에 개시된 임의의 양태, 구현예 또는 하위구현예를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 scFvFc일 수 있다.
본원에서 제공되는 일부 양태는 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입함으로써 제조된 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 포함하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 표면 상의 슈도타입화 요소 및 표면 상의 막 결합 T 세포 활성화 요소를 포함하며, 상기 접촉 단계는 복제 불능 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하고, 상기 접촉은 범위의 하단에서 1, 2, 3, 4 또는 6시간 동안, 범위의 상단에서 4, 6, 8, 10, 12, 18, 20 또는 24시간 동안, 예를 들어, 1 내지 12시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 림프구는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 항원 특이적 표적화 부위(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포와 같은 림프구이다. 본원의 임의의 양태의 일부 구현예에서, NK 세포는 NKT 세포이다. NKT 세포는 CD3을 발현하고 전형적으로 αβ T-세포 수용체를 동시 발현하지만, 전형적으로 NK 세포(예: NK1.1 또는 CD56)와 관련된 다양한 분자 마커도 발현하는 T 세포의 서브세트이다.
본 개시내용의 유전자 변형된 림프구는 재조합 DNA 방법에 의해 림프구에 도입된 이종 핵산 서열을 보유한다. 예를 들어, 예시적인 구현예에서의 이종 서열은 본원에서 제공된 림프구를 형질도입하기 위한 방법 동안 림프구에 삽입된다. 이종 핵산은 림프구 내에서 발견되고, 일부 구현예에서는 유전자 변형된 림프구의 게놈에 통합되거나 통합되지 않는다.
예시적인 구현예에서, 이종 핵산은 유전자 변형된 림프구의 게놈에 통합된다. 이러한 림프구는 예시적인 구현예에서, 재조합 레트로바이러스 입자를 사용하는, 본원에서 제공된 림프구를 형질도입하기 위한 방법을 사용하여 생성된다. 이러한 재조합 레트로바이러스 입자는 전형적으로 적어도 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 다른 섹션에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 및 자체가 본 개시내용의 다른 양태를 형성하는 유전자 변형된 림프구를 생성하는데 사용될 수 있는, 복제 불능 레트로바이러스 입자의 게놈에서 코딩된 폴리뉴클레오타이드의 다양한 구현예가 본원에 제공된다.
본 개시내용의 유전자 변형된 림프구는 신체 외부에서 단리될 수 있다. 예를 들어, 이러한 림프구는 본원에 제공된 바와 같이 생체외 전달에 사용되는 배지 및 다른 용액에서 발견될 수 있다. 상기 림프구는 본원에서 제공된 방법으로 대상체로부터 수집된 유전자 비변형된 형태로 존재할 수 있고, 이어서 형질도입 방법 중 유전자 변형될 수 있다. 유전자 변형된 림프구는 그들이 도입된 후 대상체의 내부에서 발견될 수 있거나 그들이 유전자 변형된 후 대상체에 재도입될 수 있다. 유전자 변형된 림프구는 휴지 T 세포 또는 휴지 NK 세포일 수 있거나, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포는, 특히 본원에 개시된 바와 같이 형질도입 후 T 세포 또는 NK 세포에 삽입된 핵산에 제공된 기능적 요소의 일부를 발현한 후 활성적으로 분화될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 개시내용의 임의의 양태 및 구현예에 제공된 하나 이상의 기능적 요소들을 발현하는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 이의 게놈에 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질도입되고/되거나 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포이다. 예를 들어, 하나 이상의 전사 단위는 ASTR, 비제한적인 예로서 MBR-ASTR, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인과 같은 본원에 제공된 임의의 CAR 요소를 포함할 수 있고, 비제한적인 예로서 조절 도메인을 추가로 포함할 수 있는 CAR을 발현할 수 있다. 또한, 기능적 요소(들)는 형질도입되고/되거나 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포, 본원에서 제공된 하나 이상의 림프증식성 요소, 예를 들어, 구성적 활성 IL-7 수용체 돌연변이체 또는 억제성 RNA 분자(예: miRNA 또는 shRNA)가 아닌 다른 림프증식성 요소, 인식 및/또는 제거 도메인에서 발현된다.
한 양태에서,
a. 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자; 및
b. 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR),
및/또는 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 억제성 RNA 분자 및 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공되고, 상기 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산은 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전자 변형인 핵산 서열에 의해 코딩되거나 핵산 서열이다.
유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자 및 CAR을 포함하는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 집단일 수 있다.
T 세포 또는 NK 세포가 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 바로 위의 양태의 일부 구현예에서, CAR의 일부로서 포함될 수 있거나 림프증식성 요소와 함께 발현될 수 있거나 림프증식성 요소를 조절하는 데 사용될 수 있는 요소에 대해 본원에 제공된 임의의 특정 구현예가 포함될 수 있다.
T 세포 또는 NK 세포가 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 바로 위의 양태의 일부 구현예에서, CAR은 미세환경 제한된 생물학적 (MRB)-CAR이고/이거나 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포는 억성제 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소 및/또는 림프증식성 요소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 림프증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전자 변형인 핵산 서열에 의해 코딩된다. 본원에 개시된 임의의 림프증식성 요소는 이러한 구현예에서 사용되고/되거나 코딩될 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 림프증식성 요소는 구성적 활성 IL-7 수용체일 수 있다.
T 세포 또는 NK 세포가 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 바로 위의 양태의 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 miRNA 또는 shRNA이다. 이 양태의 일부 구현예에서, 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자는 폴리시스트론성이다. 이 양태의 일부 구현예에서, 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자는 동일하거나, 예시적인 구현예에서, 상이한 RNA 표적에 대해 지시된다. 이 양태의 일부 구현예에서, 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자 중 하나, 대부분 또는 모두가 내인성 TCR의 발현을 감소시킨다.
T 세포 또는 NK 세포가 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 바로 위의 양태의 일부 구현예에서, RNA 표적은 PD-1, CTLA4, TCR 알파, TCR 베타, CD3 제타, SOCS, SMAD2, miR-155 표적, IFN 감마, cCBL, TRAIL2, PP2A 및 ABCG1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 청구항 135 내지 140 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 표적이 TCR 알파 유전자로부터 전사된 mRNA인, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포. 이 양태의 일부 구현예에서, 하나(예: 2개) 이상의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 miR-155이다.
T 세포 또는 NK 세포가 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR, 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 바로 위의 양태의 일부 구현예에서, CAR의 ASTR은 MRB ASTR이고/이거나 CAR의 ASTR은 종양 관련 항원에 결합한다. 또한, 상기 양태의 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열은, 예를 들어, 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 예시적인 구현예에서 아사이클로비르와 같은 항바이러스제인 리보스위치에 작동가능하게 연결된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에서, 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현은 조절 요소에 의해 조절되고, 일부 구현예에서, 조절 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 특정 구현예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 뉴클레오사이드 유사체가 존재할 때, 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 하나 또는 모두가 발현된다.
본원에 개시된 유전자 변형된 림프구는 또한 본원에 제공된 형질도입 방법 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 융합의 나머지인 폴리펩타이드를 표면에 가질 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 활성화 요소, 슈도타입화 요소 및/또는 사이토카인을 포함하는 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 개시된 바와 같이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자, 또는 CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 억제성 RNA 분자가 아닌 본원에 개시된 적어도 하나의 림프증식성 요소를 추가로 발현한다. 특정 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 또한 하나 이상의 억제성 RNA 분자, CAR 및/또는 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소의 발현을 조절하는 하나 이상의 리보스위치를 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 2 내지 10개의 억제성 RNA 분자를 발현한다. 추가의 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 2 내지 6개의 억제성 RNA 분자를 발현한다. 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 4개의 억제성 RNA 분자를 발현한다.
핵산
본 개시내용은 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은, 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 포함하는 DNA일 것이다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA, 예를 들어, 시험관내에서 합성된 RNA일 것이다.
일부 경우에서, 핵산은, 예를 들어, 포유동물 세포에서 본 개시내용의 폴리펩타이드를 제조한다. 다른 경우에서, 대상 핵산은 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 증폭시킨다.
본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 전사 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 및 인핸서 등에 작동가능하게 연결될 수 있다.
적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터로는 lacl, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터로는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터; 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 조기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복체에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 당업계에 공지된 다양한 조직 특이적 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
가역적 유도성 프로모터를 포함하는 적합한 가역적 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터는 다수의 유기체, 예를 들어, 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고, 유래될 수 있다. 예를 들어, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등과 같이, 제2 유기체에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역적 프로모터의 변형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 가역적 프로모터, 및 추가의 제어 단백질을 또한 포함하는, 상기 가역적 프로모터에 기반한 시스템으로는 알콜 조절된 프로모터(예: 알콜 데하이드로게나제 I(alcA) 유전자 프로모터, 알콜 교차활성인자 단백질(AlcR)에 대해 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린 조절된 프로모터(예: TetActivator, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드 조절된 프로모터(예: 래트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병기전-관련 조절된 프로모터(예: 살리실산 조절된 프로모터, 에틸렌 조절된 프로모터, 벤조티아디아졸 조절된 프로모터 등), 온도 조절된 프로모터(예: 열 충격 유도성 프로모터(예: HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광 조절된 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 적합한 프로모터를 함유하는 유전자좌 또는 작제물 또는 도입유전자는 유도성 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 전환된다. 비가역적 스위치의 유도를 위해 적합한 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 비가역적 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합을 이용할 수 있다(참조: 예를 들어, Fuhrmann-Benzakein, 등, PNAS (2000) 28:e99, 이의 개시내용은 본원에서 참조로 인용된다). 당업계에 공지된 리콤비나제, 엔도뉴클레아제, 리가제, 재조합 부위 등의 임의의 적합한 조합이 비가역적으로 전환가능한 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원 다른 곳에 기재된, 부위 특이적 재조합을 수행하기 위한 방법, 기전 및 요건은 비가역적으로 전환된 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있고, 이는 당업계[참조: Grindley 등 (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605 및 Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA), 이의 개시내용은 본원에서 참조로 인용된다]에 익히 공지되어 있다.
일부 경우에서, 프로모터는 CD8 세포 특이적 프로모터, CD4 세포 특이적 프로모터, 호중구 특이적 프로모터, 또는 NK 특이적 프로모터이다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터가 사용될 수 있다[참조: 예를 들어, Salmon 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7739; 및 Marodon 등 (2003) Blood 101:3416]. 또 다른 예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포 특이적 발현은 Neri (p46) 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있다(참조; 예를 들어, Eckelhart 등 (2011) Blood 117:1565).
일부 구현예에서, 예를 들어, 효모 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 구성적 프로모터, 예를 들어, ADHl 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터, 예를 들어, GALI 프로모터, GALlO 프로모터, ADH2 프로모터, PH05 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1(예: 피치아(Pichia)에서 사용하기 위한)이다. 적절한 벡터 및 프로모터 선택은 당업자의 수준 내에서 충분하다.
원핵 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예를 들어, lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터 등; araBAD 프로모터; 생체내에서 조절된 프로모터, 예를 들어, ssaG 프로모터 또는 관련된 프로모터(참조: 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20040131637), pagC 프로모터(참조: Pulkkinen and Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda 등, PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), nirB 프로모터(참조: Harborne 등 (1992) Mal. Micro. 6:2805-2813]), 기타(참조: 예를 들어, Dunstan 등 (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie 등 (2004) Vaccine 22:3243-3255; 및 Chatfield 등 (1992) Biotechnol. 10:888-892); 시그마70 프로모터, 예를 들어, 컨센서스 시그마70 프로모터(참조: GenBank진뱅크 수탁 번호 AX798980, AX798961, 및 AX798183); 정지기 프로모터, 예를 들어, dps 프로모터, spv 프로모터 등; 병원성 섬 SPI-2로부터 유래된 프로모터(참조: 예를 들어, W096/17951); actA 프로모터(참조: 예를 들어, Shetron-Rama 등 (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); rpsM 프로모터(참조: 예를 들어, Valdivia and Falkow (1996). Mal. Microbial. 22:367); tet 프로모터(참조: 예를 들어, Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162); SP6 프로모터(참조: 예를 들어, Melton 등 (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 원핵생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 사용하기에 적합한 강력한 프로모터로는 Trc, Tac, T5, T7 및 P람다(PLambda)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 비제한적인 예로는 락토스 프로모터 오퍼레이터(Laci 리프레서 단백질은 락토스와의 접촉시 입체구조를 변화시킴으로써 Laci 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합하지 못하게 한다), 트립토판 프로모터 오퍼레이터(트립토판과 복합체를 형성하였을 때, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하는 입체구조를 갖고; 트립토판 부재하에서 TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 입체구조를 갖는다), 및 tac 프로모터 오퍼레이터(참조: 예를 들어, deBoer 등 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)를 포함한다.
본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 2개의 별개의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 동일한 또는 별개의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 선택가능한 마커, 복제의 기원, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다.
다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고; 대상체 재조합 작제물을 생성하기 위해 다수가 시판된다. 하기 박테리아 벡터가 예로서 제공된다: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, CA, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 하기 진핵 벡터가 예로서 제공된다: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL (Pharmacia).
발현 벡터는 일반적으로 이종성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 삽입시키기 위해 프로모터 서열 근처에 위치하는 편리한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동성인 선택가능한 마커가 존재할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 일부 구현예에서, RNA, 예를 들어, 시험관내 합성된 RNA일 것이다. RNA의 시험관내 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고; 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 합성하는 데 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 숙주 세포에 RNA를 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Zhao 등 (2010) Cancer Res. 15:9053]을 참조한다. 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포로 도입하는 것은 시험관내에서 또는 생체외에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포(예: NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 RNA로 시험관내 또는 생체외 전기천공될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 핵산 서열 및/또는 전사 단위, 및/또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 다양한 양태 및 구현예는 코작형 서열, 우드척 간염 바이러스 번역후 조절 요소(WPRE), 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈을 추가로 포함하고, 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈의 하나 이상의 정지 코돈은 하나 이상의 전사 단위로부터의 판독의 종결을 정의한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 핵산 서열 및/또는 전사 단위 및/또는 이를 포함하는 벡터는 하나 이상의 전사 단위의 적어도 하나의 개시 코돈의 10개 뉴클레오타이드 상류에 5' 뉴클레오타이드를 갖는 코작형 서열을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 코작형 서열은 CCACCAT/UG(G) (서열번호: 515), CCGCCAT/UG(G) (서열번호: 516), GCCGCCGCCAT/UG(G) (서열번호: 517) 또는 GCCGCCACCAT/UG(G) (서열번호: 515)이거나 이를 포함한다(괄호 안의 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드를 나타내고, 슬래시로 분리된 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 핵산이 DNA인지 또는 RNA인지 여부에 따라 그 위치에서 상이한 가능한 뉴클레오타이드를 나타낸다. AU/TG 개시 코돈을 포함하는 이러한 구현예에서, A는 위치 0으로 간주될 수 있다. 특정의 예시적인 구현예에서, -3 및 +4의 뉴클레오타이드는 동일하며, 예를 들어, -3 및 +4 뉴클레오타이드는 G일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 코작형 서열은 ATG의 3번 위치 상류에 A 또는 G를 포함하되, ATG는 개시 코돈이다. 또 다른 구현예에서, 코작형 서열은 AUG의 3번 위치 상류에 A 또는 G를 포함하며, 여기서 AUG는 개시 코돈이다. 예시적인 구현예에서, 코작 서열은 (GCC)GCCRCCATG이고, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다. 예시적인 구현예에서, 코작형 서열은 GCCGCCACCAUG (서열번호: 518)이다. 코작형 서열을 포함하는 선행 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 다음 구현예와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. WPRE는 당업계에서 특성화되었고(참조: 예를 들어, (Higashimoto 등, Gene Ther., 14:1298)), 본원의 실시예 17 및 18에서 예시된다. 일부 구현예에서, WPRE 요소는 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5'에서 3' LTR에 위치한다. 선행 구현예(즉, 폴리뉴클레오타이드가 코작형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE를 포함하는 구현예) 중 어느 하나 또는 모두와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈의 하나 이상의 정지 코돈으로 종결되고, 상기 이중 정지 코돈은 제1 판독 프레임에 제1 정지 코돈 및 제2 판독 프레임에 제2 정지 코돈을, 또는 제2 정지 코돈을 갖는 프레임에 제1 정지 코돈을 포함하고, 상기 삼중 정지 코돈은 제1 판독 프레임에 제1 정지 코돈, 제2 판독 프레임에 제2 정지 코돈 및 제3 판독 프레임에 제3 정지 코돈을, 또는 제2 정지 코돈 및 제3 정지 코돈을 갖는 프레임에 제1 정지 코돈을 포함한다.
본원의 삼중 정지 코돈은 서로 10개의 뉴클레오타이드 내에서 바람직하게는 중복 서열을 갖는 각 판독 프레임에 하나씩 3개의 정지 코돈을, 또는 바람직하게는 연속 코돈에서 동일한 판독 프레임 중 3개의 정지 코돈을 포함한다. 이중 종결 코돈은 서로 10개의 뉴클레오타이드 내에서 바람직하게는 중복 서열을 갖는 상이한 판독 프레임에 하나씩 2개의 정지 코돈을, 또는 바람직하게는 연속 코돈에서 동일한 판독 프레임 중 2개의 정지 코돈을 의미한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부에서, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포로의 DNA의 도입 및 임의로 숙주 세포 게놈으로의 DNA의 혼입은, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 이용하지 않는 방법을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 비제한적인 예로서, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 단순 포진 바이러스-1로부터 유래된 것들과 같은 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 비바이러스 벡터로 표적 세포를 형질감염시키고/시키거나 형질도입하는 단계를 포함할 수 있다. 비바이러스 벡터를 이용하여 표적 세포를 형질감염시키는 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 네이키드 DNA를 포함하는 비바이러스성 벡터를 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포좀 제형, 지질, 덴드리머, 폴리(에틸렌이민)(PEI) 및 폴리(l-리신)(PLL)와 같은 양이온성 중합체, 나노입자, 세포 침투성 펩타이드, 마이크로인젝션 및/또는 비통합성 렌티바이러스 벡터를 포함하는 방법을 사용하여, 예를 들어, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA는 리포좀 및 프로타민과의 복합체 중 표적 세포, 예를 들어, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에 도입될 수 있다. 본원에 제공된 방법의 구현예에 사용될 수 있는 생체외 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질감염시키고/시키거나 형질도입하기 위한 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Morgan and Boyerinas, Biomedicines, 2016 Apr 20;4(2). pii:E9, 그 전체가 본원에 참고로 인용됨).
본원에 제공된 방법의 일부 구현예에서, DNA는 목적하는 유전자의 5' 및 3' 말단에 트랜스포존 ITR 단편을 함유하는 플라스미드로서 표적 DNA의 동시 형질감염, 공동-뉴클레오펙션 또는 공동 전기천공에 의해 트랜스포존-기반 캐리어 시스템을 사용하여 게놈으로 통합될 수 있고, 인간 게놈의 슈도 attP 부위에 목적하는 유전자를 통합하는 phiC31과 같은 DNA 또는 mRNA 또는 단백질 또는 부위 특이적 세린 리콤비나제로서 트랜스포사제 캐리어 시스템, 이 경우에 DNA 벡터는 리콤비나제 효소용 인식 서열(참조: Bhaskar Thyagarajan 등 Site-Specific Genomic Integration in Mammalian 세포 Mediated by Phage φC31 Integrase, Mol 세포 Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-3934)이고 리콤비나제로 공동 형질감염된 34 내지 40bp attB 부위를 함유한다. T 세포 및/또는 NK 세포의 경우에, 본원에 제공된 특정 방법에서 사용될 수 있는 트랜스포존-기반 시스템은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) DNA 캐리어 시스템(참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,489,458호 및 미국 특허 출원 제15/434,595호), PiggyBac DNA 캐리어 시스템(참조: 예를 들어, Manuri 등, Hum Gene Ther. 2010 Apr;21(4):427-37, 그 전체가 본원에 참고로 인용 됨), 또는 DNA, mRNA 또는 단백질 형태의 Tol2 트랜스포존 시스템(참조: 예를 들어, Tsukahara 등, Gene Ther. 2015 Feb; 22(2):209-215, 그 전체가 본원에 참고로 인용됨)을 사용한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존-기반 벡터 시스템의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제는 T 세포 및/또는 NK 세포에 도입되기 전에 미니서클 DNA 벡터로서 생성될 수 있다(참조: 예를 들어, Hudecek 등, Recent Results Cancer Res. 2016;209:37-50 및 Monjezi 등, Leukemia., 2017 Jan;31(1):186-194). CAR 또는 림프증식성 요소는 또한 표적 부위의 통합 5' 및 3'에 상응하는 50-1000 bp 상동성 암을 첨가함으로써 CRISPR 또는 TALEN 매개된 통합을 이용하여 게놈의 정의된 특이적 부위에 통합될 수 있다(참조: Jae Seong Lee 등 Scientific Reports 5, Article number: 8572 (2015), Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway). CRISPR 또는 TALEN은 특이성 및 게놈-표적화 절단을 제공하고, 작제물은 상동성-매개된 말단 결합을 통해 통합될 것이다(참조: Yao X at al. 세포 Res. 2017 Jun;27(6):801-814. doi: 10.1038/cr.2017.76. Epub 2017 May 19). CRISPR 또는 TALEN은 DNA, mRNA 또는 단백질로서 표적 플라스미드와 함께 형질감염될 수 있다.
패키징 세포
본 개시내용은 표적 포유동물 세포를 유전적으로 변형시키는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는 패키징 세포주인 패키징 세포 및 포유동물 세포주 및 표적 포유동물 세포 그 자체를 제공한다. 예시적인 구현예에서, 패키징 세포는 복제 불능 레트로바이러스 입자의 패키징 가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드 및 슈도타입화 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
적합한 포유동물 세포로는 1차 세포 및 불멸화 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류(예: 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 HeLa 세포(예: 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예: ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), HEK293 세포(예: ATCC 번호 CRL-1573), 현탁액-적응된 HEK293 세포, 베로 세포, NIH 3T3 세포(예: ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK세포 (예: ATCC 번호 CCLlO), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), RATl 세포, 마우스 L 세포(ATCC 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, 주르카트, HL-60, NK 세포주(예: NKL, NK92, 및 YTS) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 세포는 불멸화 세포주가 아니고, 대신 개체 또는 생체외 세포로부터 수득된 세포(예: 1차 세포)이다. 예를 들어, 일부 경우에서, 세포는 개체로부터 수득된 면역 세포이다. 또 다른 예로서, 세포는 개체로부터 수득된 줄기 세포 또는 전구 세포이다. B 세포, T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예 및 양태에서, 세포는 자가 세포일 수 있거나, 그것은 동종 이형 세포(본원에서 동종 세포라고도 칭명됨)일 수 있다. 일부 구현예에서, 동종 이형 세포는 유전자 조작된 동종 세포일 수 있다. 동종 이형 세포, 예를 들어, 동종 T 세포 및 동종 이형 세포를 유전자 조작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 동종 이형 세포는 불멸화 세포일 수 있다. 동종 이형 세포가 T 세포인 일부 구현예에서, T 세포는 그의 T 세포 수용체 쇄 중 적어도 하나가 기능하지 않고/않거나 적어도 부분적으로 결실되도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 동종 이형 세포는 B2 마이크로글로불린 유전자의 전부 또는 일부가 결실되도록 변형될 수 있다. 동종 이형 세포가 본원의 방법에 사용되는 일부 구현예에서, 림프증식성 요소 및/또는 CLE는 본 발명을 실시하는데 필요한 세포의 수를 감소시키는 기능을 할 수 있고, 대상체로부터 T 세포, B 세포 또는 NK 세포의 세포 제조를 촉진할 수 있다.
면역 세포를 활성화시키는 방법
본 개시내용은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 면역 세포, 예시적인 구현예에서 림프구를 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 (시험관내, 생체내, 또는 생체외에서) 면역 세포를 활성화 요소, 또는 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계를 포함하되,, 면역 세포는 본 개시내용의 미세환경 제한된 CAR을 생산하도록 유전자 변형된다. 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서, 미세환경 제한된 CAR은 면역 세포를 활성화시킴으로써 활성화된 면역 세포를 생산한다. 면역 세포로는, 예를 들어, 세포독성 T 림프구, NK 세포, CD4+ T 세포, T 조절 (Treg) 세포, γδ T 세포, NK-T 세포, 호중구 등을 포함한다. 다른 구현예에서, T 세포를 T 세포 활성화제와 접촉시키는 단계는 T 세포를 활성화한다. 이러한 방법은 본원에 제공되고, 본원의 활성화 요소 섹션에서 논의된다.
유전자 변형된 면역 세포(예: T 림프구, NK 세포)를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키면, 면역 세포에 의한 사이토카인의 생산은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서 면역 세포에 의해 생산된 사이토카인의 양과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 이상 증가될 수 있다. 생산이 증가될 수 있는 사이토카인으로는 IL-2 및 IFN-γ를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 변형된 세포독성 세포(예: 세포독성 T 림프구)를 AAR과 접촉시키면, 세포독성 세포의 세포독성 활성은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하의 세포독성 세포의 세포독성 활성과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 이상 증가될 수 있다.
유전자 변형된 세포독성 세포(예: 세포독성 T 림프구)를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키면, 세포독성 세포의 세포독성 활성은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하의 세포독성 세포의 세포독성 활성과 비교하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 이상 증가될 수 있다.
다른 구현예에서, 예를 들어, 숙주 면역 세포에 따라, 유전자 변형된 숙주 세포를 항원과 접촉시키면 세포 증식, 세포 생존, 세포 사멸 등을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 제조하는 방법
일부 구현예에서, CAR의 항원 결합 도메인(본원에서 "항원 특이적 표적 영역" 또는 "ASTR"로서 지칭되기도 함)은 그들의 동족 항원에 구성적으로 결합한다. 다른 구현예에서, ASTR은 미세환경 제한되어 본원에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 종양 미세환경에 존재하는 것들과 같은 특정의 비정상적인 조건하에서 우선적으로 또는 오직 이의 동족 항원에 결합할 수 있다. 종양 미세환경의 비정상적인 조건하에서 우선적으로 또는 배타적으로 결합하는 미세환경 제한된 ASTR은 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 효과를 정상적인 생리적 조건하에서 항원에의 결합이 감소될 때, 일부 상황하에서는 면역검정법에 의한 검출 미만인 수준으로까지 감소시킬 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 제공된 CAR은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 미세환경 제한된 ASTR을 포함하되,, ASTR은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 단편이다.
본원에 개시된 양태의 특정 예시적인 구현예에서, 예를 들어, 본원에 개시된 방법, 세포, 세포주, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터는 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 포함하는 CAR을 포함한다.
따라서, 한 양태에서,
a) 정상적인 생리적 환경과 비교하여 비정상적인 조건에서 표적 항원에의 결합 증가를 보이는 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역으로서, 상기 항원 특이적 표적화 영역이 표적에 결합하는, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서,
a) 폴리펩타이드 라이브러리를 패닝함으로써 선택되고, 정상적인 생리적 조건과 비교하여 비정상적인 조건에서의 표적 항원 결합 검정에서 활성 증가를 보이는 적어도 하나의 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체가 본원에 제공된다.
본원에 개시된 임의의 양태의 일부 구현예에서, 임의의 키메라 항원 수용체 는 그들이 정상적인 생리적 조건과 비교하여 비정상적인 조건에서 결합 활성의 증가를 나타내도록 미세환경 제한될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 양태의 일부 예시적인 구현예에서, 미세환경 제한된 ASTR은 스크리닝/진화 이전에 라이브러리의 구성원을 돌연변이화/진화시키지 않고/않거나 스크리닝 동안 또는 스크리닝의 임의의 반복 라운드 사이에 돌연변이화시키지 않고 초기 폴리펩타이드 라이브러리로부터 동정된다. 예시적인 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인은 CAR에 대해 본원에 개시된 것들 중 어느 하나일 수 있다.
한 양태에서,
a. 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리의 폴리펩타이드에 대해 정상적인 생리적 조건하에서 표적 항원 결합 검정을, 그리고 비정상적인 조건하에서 표적 항원 결합 검정을 수행하는 단계; 및
b. 생리적 조건과 비교하여 비정상적인 조건에서 표적 항원 결합 활성 증가를 보이는 폴리펩타이드를 선택함으로써 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 선택하는 단계로 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리를 패닝하는 단계를 포함하는, 미세환경 제한된 ASTR을 선택하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서,
비정상적인 조건하에서 폴리펩타이드 라이브러리를 고체 지지체에 결합된 표적 항원과 접촉시키는 단계로서, 표적 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 발현하는 클론이 표적 항원을 통해 고체 지지체에 결합된 상태로 잔류하는, 단계;
생리적 조건하에서 고체 지지체를 결합된 폴리펩타이드와 함께 배양하는 단계; 및
생리적 조건하에서 고체 지지체로부터 용출되는 클론을 수집함으로써 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 단리시키는 단계로 폴리펩타이드 라이브러리를 패닝하는 단계를 포함하는, 미세환경 제한된 ASTR을 단리시키는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 임의의 양태의 일부 예시적인 구현예에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 스크리닝 이전에 라이브러리의 구성원을 돌연변이화/진화시키지 않고/않거나 스크리닝 또는 패닝 동안 또는 스크리닝 또는 패닝의 임의의 반복 라운드 사이에 돌연변이화/진화시키지 않고 초기 폴리펩타이드 라이브러리로부터 동정된다.
정상적인 생리적 조건은 대상체에게로의 투여 부위에서, 또는 작용 부위의 조직 또는 기관에서 정상적인 범위 내에 있을 것으로 간주되는 온도, pH, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 및 전해질 농도 조건을 포함할 수 있다. 비정상적인 조건은 상기 조건에 대하여 일반적으로 허용되는 범위에서 벗어난 것이다. 한 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역(즉, 폴리펩타이드)은 실제로 정상적인 조건에서는 불활성이지만, 정상적인 조건이 아닌 경우, 정상적인 조건에서와 동일하거나 더 우수한 수준으로 활성이다. 예를 들어, 한 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 실제로 체온에서는 불활성이지만, 더 낮은 온도에서는 활성이다. 또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 정상적인 조건에서는 가역적으로 또는 비가역적으로 불활성화된다. 추가의 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 치료적 단백질이다. 또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 약물, 또는 치료제로서 사용된다. 추가의 또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은, 예를 들어, 폐 통과 후, 또는 신장에서 발견되는 더 낮은 pH 환경에서와 같은 고도로 산소화된 혈액에서는 다소 활성이다.
일부 구현예에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 수득하기 위해 단일 라운드의 선택을 수행한다. 특정 구현예에서, 스크리닝 또는 패닝 방법은, 초기 또는 이전 라운드에서 비정상적인 조건하에서는 항원에 결합하고, 생리적 조건하에서 결합하지 않은 유리 폴리펩타이드, 또는 이러한 특성을 갖는 시험 폴리펩타이드를 발현하는 세포, 또는 이러한 특성을 갖는 시험 폴리펩타이드로 코팅된 파지를 동정한 후 반복된다. 일부 방법에서, 수집된 파지는 세포를 감염시키는 데 사용되고, 상기 세포는 또한 수집된 파지를 증폭시키기 위해 헬퍼 파지로 감염될 수 있다. 세포 표면 상의 폴리펩타이드가 시험되는 다른 방법에서, 수집된 세포를 성장시켜, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에서 증폭시킴으로써 세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 "증폭시킬" 수 있다. 일부 구현예에서, 라운드 사이에 동정된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 돌연변이화하는 프로세스를 수행하지 않고, 동정된 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 성장시킴으로써 증폭을 수행한다. 따라서, 이전 라운드에서 수집된 폴리펩타이드는 이러한 수집된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 세포를 증폭시킴으로써 농축된다.
패닝 또는 스크리닝 방법은 1회 수행될 수 있거나, 또는 1 내지 1,000회 반복될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 패닝은 1 내지 20회, 또는 2 내지 10회 또는 2 내지 5회 반복된다.
다른 방법에서, 관심의 대상이 되는 항원(즉, 표적 항원)에 대한 미세환경 제한된 ASTR은 패닝 라운드 사이에 1회 이상의 라운드의 돌연변이/진화를 사용하여 수행된다. 한 방법에서, 야생형 단백질은, 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 단백질 라이브러리를 생성하고, 표적 항원에 대하여 목적하는 결합 친화도를 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질에 대하여 폴리펩타이드 또는 단백질 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정된다. 야생형 단백질이 항체인 일부 구현예에서, 야생형 항체는 파지 디스플레이 항체 라이브러리, 예를 들어, 파지 디스플레이 인간화 항체 라이브러리를 포함하는, 다클론성 또는 단클론성 항체 라이브러리를 생성하고 스크리닝함으로써 발견될 수 있다.
진화된 ASTR은 야생형 단백질, 또는 야생형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 돌연변이유발 프로세스를 수행하여, 정상적인 생리적 환경과 비교하여 종양 환경에서 및/또는 시험관내 종양 대용물 검정 조건에서 증가된 활성(예: 표적 항원에 대하여 증진된 결합 친화도)을 갖는 돌연변이체 ASTR을 동정하기 위해 스크리닝될 수 있는 돌연변이체 폴리펩타이드 집단을 제조함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법의 예는 모두 그들 전문이 본원에 참조로 인용된 WO2016033331("CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS") 또는 미국 특허 제8,709,755호에 제공되어 있다. 이러한 미세환경 제한된 항체를 생성하는 방법은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다른 구현예에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 폴리펩타이드(즉, 표적화 영역, 예를 들어, 항체)는 비정상적 대 생리적 조건하에서 초기 폴리펩타이드 라이브러리를 스크리닝하고, 비정상적 대 생리적 조건하에서 우선적으로 또는 배타적으로 결합하는 초기 폴리펩타이드 라이브러리로부터 시험 폴리펩타이드를 동정함으로써 동정될 수 있다. 일부 예에서, 초기 폴리펩타이드 라이브러리 스크린에서 초기 폴리펩타이드 라이브러리로부터 동정된 동정되고 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 폴리펩타이드(즉, 표적화 영역, 예를 들어, 항체)는 비정상적 대 생리적 조건하에서 이의 동족 항원에 우선적으로 또는 배타적으로 결합한다. 이러한 예에서, 돌연변이/진화 라운드는 수행되지 않는다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 본 방법은 스크리닝 라운드(예: 패닝 라운드) 사이에서 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 돌연변이시키지 않고 수행되거나, 또는 미세환경 제한된 항원 특이적 폴리펩타이드(즉, 표적화 영역, 예를 들어, 항체)를 단리시키고 동정하기 위해 비정상적 대 생리적 조건하에서 단 1회의 결합 검정으로 수행된다. 본 방법은 스크리닝 및/또는 패닝 라운드 사이에 임의의 돌연변이/진화 없이, 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이를 포함하는 숙주 유기체를 배양하고, 고성능 방식으로 증폭시키고/시키거나 희석시킴으로써 수행될 수 있다. 추가로, 본 방법은 스크리닝 및/또는 패닝을 반복하지 않고 수행될 수 있고, 미세환경 제한된 항원 특이적 폴리펩타이드(즉, 표적 영역, 예를 들어, 항체)를 단리시킨 후, 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이/진화 없이 수행될 수 있다.
폴리펩타이드의 동족체 결합 파트너에의 결합을 검출하기 위한, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 검정으로는 세포 기반 검정, 및 특히, 세포 표면 디스플레이 시스템, 예를 들어, 포유동물 세포 표면 디스플레이 시스템을 사용하여 수행되는 검정을 포함한다. 예시적인 방법에서, 폴리펩타이드, 또는 변형된 폴리펩타이드의 라이브러리를 포함하는 변이체 폴리펩타이드의 라이브러리를 코딩하는 핵산은 세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 이어서, 세포는 벡터로 형질감염되고, 폴리펩타이드(들)는 세포에 의해 발현된다. 표면-발현된 폴리펩타이드를 함유하는 세포의 라이브러리를 가용성 또는 표면 결합된 동족체 결합 파트너를 함유하는 용액과 접촉시킬 수 있다. 결합 활성은 세포 표면에의 결합을 검출할 수 있는 임의의 검정을 사용하여 검출할 수 있다. 활성은 또한 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능성 활성을 평가함으로써 평가될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 세포 기반 검정이 세포 증식 검정, 세포사 검정, 유동 세포 계측법, 세포 분리 기술, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 위상 현미경법, 형광 현미경법, 수용체 결합 검정, 세포 신호전달 검정, 면역세포화학법 및 리포터 유전자 검정을 포함하는, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 일부 예에서, 검정은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 검정이다.
폴리펩타이드 또는 단백질은 분비된 포유동물 세포, 가용성 분자, 세포 표면 분자, 또는 세포내 항체에 의해 발현될 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포의 대부분 또는 모두가 세포 표면 상에 고정된 단백질 라이브러리의 구성원을 나타내는 조건하에서 세포를 단백질의 라이브러리로 형질감염시킬 수 있다. 임의로, 포유동물 세포 형질감염체의 대부분이 이들의 게놈 내에 통합된 단 1개의 플라스미드를 갖는발현 시스템이 사용될 수 있다. 따라서, 형질감염체의 대부분(즉, 적어도 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90%)은 하나의 폴리펩타이드의 하나 이상의 분자를 발현한다. 이는, 예를 들어, 개별 형질감염체를 단리시키고 배양하고; 발현된 서열을 서열분석하여 그들이 단일 서열을 갖는지의 여부를 결정함으로써 확인될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 예에서, 폴리펩타이드는 포유동물 세포의 표면 상에 나타낸 항체이다. 전장, 2가, 기능성 항체, 예를 들어, IgG 항체를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 항체는 포유동물 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 항체는 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 단편일 수 있다. 항체는 Fc 영역, 예를 들어, scFv-Fc 또는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 적합한 항체 단편을 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 제조된 ScFv-Fcs 및 전장 항체가 scFv's 또는 Fab 단편에 비하여 여러 가지 이점을 가질 수 있다.
본원에 제공된 결합 검정에서 사용될 수 있는 고체 지지체로는 폴리펩타이드의 결합 파트너, 예를 들어, 리간드, 수용체 또는 항원과 부착될 수 있는 임의의 캐리어를 포함한다. 전형적으로, 고처리량 스크리닝을 촉진시키기 위해, 동족체 결합 파트너를 고체 지지체에 부착시킨다. 본원에 제공된 방법에서 고체 지지체로서 사용하기 위한 캐리어의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자기 고체 지지체, 예를 들어, 마그네타이트를 포함하는 고체 지지체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체는 하나 이상의 비드 또는 입자, 미소구, 튜브 또는 플레이트의 표면, 필터 막, 및 당업계에 공지된 다른 고체 지지체일 수 있다. 예시적인 고체 지지체 시스템으로는, 다중웰 플레이트 또는 막을 포함하는, 예를 들어, 유리, 규소, 금속, 나일론, 셀룰로스, 플라스틱 또는 복합체로 작제된 평평한 표면을 포함하나, 이에 제한되지 않거나; 또는 비드, 예를 들어, 실리카 겔, 제어된 기공 유리, 자기 또는 셀룰로스 비드 형태일 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 현탁액으로 또는 칼럼 형태로의 사용을 위해 적합화될 수 있다. 일부 구현예에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 폴리펩타이드(즉, 표적 영역, 예를 들어, 항체)는 고정된 표적 항원을 이용하여 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이(참조: Colby 등, "Engineering Antibody Affinity by Yeast Surface Display," Meth. Enzym. 388, 26 (2004)) 항체(예: 인간화 항체) 라이브러리를 바이오패닝함으로써 동정되고, 단리된다. 예를 들어, 미접촉 인간화 항체 라이브러리 또는 합성 인간화 항체 라이브러리는 본원의 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이 방법을 사용하여 패닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 초기 파지 디스플레이 프로세스에서, 파지 클론은 포유동물 벡터로 전달될 수 있고, 포유동물 세포 표면 스크리닝 방법에 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, Yoon 등, BMC Biotechnology 12:62; 1472-6750 (2012)). 파지 디스플레이를 수행하여 미세환경 제한된 항원 특이적 표적 영역을 단리시키는 예시적인 방법은 실시예 2에 제공되어 있다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 동정된 미세환경 제한된 ASTR은 항체, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 애피바디(affibody)일 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR이 항체인 구현예에서, 이는 전장 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디일 수 있되, 항원 특이적 표적화 영역은 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 미세환경 제한된 ASTR은 단일 쇄 가변 단편이다. 이러한 단일 쇄 가변 단편은 링커에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄를 가질 수 있되, 링커의 길이는 6 내지 100개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 중쇄는 키메라 항원 수용체 상의 경쇄에 대하여 N 말단에 위치한다. 다른 구현예에서, 경쇄는 중쇄에 대하여 N 말단에 위치한다. 미세환경 제한된 ASTR은 이중특이적 ASTR일 수 있다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 동정된 미세환경 제한된 ASTR은 전형적으로 폴리펩타이드, 더욱 구체적으로 폴리펩타이드 항체, 예시적인 구현예에서, 단일 쇄 항체이다. 이들 폴리펩타이드는 비정상적인 조건 대 정상적인 조건하에서 더 높거나 더 낮은 친화도로 이의 동족 항원에 결합할 수 있지만, 예시적인 구현예에서, 정상적인 조건에서보다 비정상적인 조건하에서 더 높은 친화도로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 폴리펩타이드는 생리적 (즉, 정상적인) 조건에서보다 비정상적인 조건하에서 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 더 큰 친화도로 이의 동족 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 동정하는 ASTR은 정상적인 생리적 조건하에서는 음성 대조군, 예를 들어, 음성 대조군 항체를 사용하여 수득된 배경 수준을 초과하는 임의의 검출가능한 수준으로 이들의 동족 항원에 결합하지 않는다.
본원에 제공된 방법에 의해 단리된 미세환경 제한된 ASTR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화를 발현하는 수집된 세포의 뉴클레오타이드를 서열분석함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 이러한 뉴클레오타이드 서열 정보는, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역(MRB-ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 생성함으로써 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 제조하는 데 사용될 수 있다. 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역은 CAR 작제물 발현 시스템으로 클로닝될 수 있고, 이는 이들의 게놈 내에 CAR를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있고, 이어서, 재조합 렌티바이러스는 생리적 조건과 비교하여 종양 선택적 환경에서의 CAR 매개 종양 항원 발현 표적 세포 사멸에 대해 시험하기 위해 T 세포를 형질도입시키는 데 사용될 수 있다.
조건부 활성을 위한 조건
본원에 제공된 방법에서, 예를 들어, 단일 쇄 항체와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드의 활성은, 예를 들어, 이환된 미세환경 및 비이환된 미세환경의 정상적인 생리적 조건과 같은 2개의 상이한 생리적 환경에서의 조건 또는 조건들을 모의하는 2개의 상이한 조건 세트하에서 스크리닝되거나 시험된다. 전형적으로, 조건은 시험관내에서 모의되거나 복제될 수 있는 조건이다. 조건 세트는 질환과 연관된 미세환경을 모의하는 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다. 질환은 세포내 및 세포외 항상성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 이환된 미세환경은 종양 미세환경 또는 암 미세환경에서의 하나 이상의 조건을 모의할 수 있다. 전형적으로, 두 조건 세트하에서의 활성의 차이 또는 차이들이 분자의 조건부 활성을 초래할 수 있다. 따라서, 제2 조건 세트 (예를 들어, 정상적인 또는 비이환된 환경에서의 모의 조건)와 비교하여 제1 조건 세트 (예를 들어, 종양 미세환경에서의 모의 조건)하에서 더 큰 활성을 나타내는 분자는 미세환경 제한되는 후보 분자로서 동정된다.
두 조건 세트는 화학적 조건, 생물학적 조건 또는 생리적 조건을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 두 생리적 환경에서 상이한 하나 이상의 파라미터마다 다르게 선택될 수 있다. 두 조건 세트 사이에서 달라질 수 있는 파라미터로는 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 탁도, 광(UV, 적외선, 가시광선 포함)에의 노출, 하나 이상의 용질, 예를 들어, 전해질의 농도, 글루코스의 농도, 히알루로난의 농도, 락트산 또는 락테이트의 농도, 알부민의 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 피루베이트의 농도, 산소의 농도, 및/또는 산화제, 환원제 또는 보조 인자의 존재로부터 선택된 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다. 보정액 중 전해질 및 완충제 시스템을 달리함으로써, 생리적 조건, 예를 들어, pH, 완충제 용량, 이온 환경, 온도, 글루코스 농도, 및 이온 강도를 모의되는 생물학적 환경의 것들로 조정할 수 있다. 정상적인 생리적 환경을 모의하는 조건 세트는 이환된 미세환경, 예를 들어, 종양 미세환경을 모의하는 조건 세트와 본원에 기재된 하나 이상의 조건에 의해 상이하도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 하기 논의되는 바와 같이, 산소 농도, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도, 락테이트 농도, 알부민 농도, 아데노신의 수준, R-2-하이드록시글루타레이트의 수준, 및 피루베이트 농도를 포함하나, 이에 제한되지 않는 종양 미세환경의 다양한 파라미터가 비종양 미세환경과 비교하여 상이하다. 임의의 이러한 파라미터는 비종양 또는 정상적인 환경에 존재하는 조건과 비교하여 종양 또는 암 환경에 존재하는 하나 이상의 조건을 모의하기 위해 시험관내에서 복제될 수 있다. 모의될 수 있는 정상적인 생리적 조건은 신체의 임의 위치, 예를 들어, GI 관, 피부, 혈관구조, 혈액, 및 세포외 매트릭스의 건강한 또는 비이환된 조직에서 발견되는 환경을 포함한다. 전형적으로, 본원의 검정에서, 생리적 조건은 단백질의 활성을 평가하기 위해 사용되는 완충제를 선택함으로써 시험관내에서 모의될 수 있다. 예를 들어, 이환된 미세환경(예: 종양 미세환경) 및 비이환된 환경의 임의의 하나 이상의 조건은 검정에서 활성을 평가하는 데 사용되는 검정 완충제의 차이에 의해 모의될 수 있다. 따라서, 미세환경 제한된 폴리펩타이드를 동정하기 위한 본원의 방법에서, 검정 완충제의 성분 또는 성분들 또는 특징 또는 특징들은 제1 조건하에서 활성을 시험하는 제1 검정에서 및 제2 조건하에서 활성을 시험하는 제2 검정에서 상이하도록 변경되거나, 또는 그렇게 제조된다. 예를 들어, 본원에서 논의되는 바와 같이, 산소, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도(예: 증가되거나 감소된 히알루로난 농도), 락테이트 농도(예: 증가되거나 감소된 락테이트 농도), 알부민 농도(예: 증가되거나 감소된 알부민 농도), 아데노신의 수준(예: 증가되거나 감소된 아데노신 수준), R-2-하이드록시글루타레이트의 수준(예: 증가되거나 감소된 R-2-하이드록시글루타레이트 수준) 및 피루베이트 농도(증가되거나 감소된 피루베이트 농도 포함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 종양 미세환경의 다양한 파라미터는 비종양 환경과 비교하여 상이하다. 더욱 구체적으로, 종양 미세환경 내의 조건으로는 비종양 미세환경과 비교하여, 더 낮은 pH, 고농도의 히알루로난, 고농도의 락테이트 및 피루베이트, 고농도의 알부민, 증가된 아데노신 수준, 증가된 R-2-하이드록시글루타레이트 수준, 저산소, 저농도의 글루코스 및 약간 더 높은 온도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세환경 제한된 ASTR은 실제로 정상 체온에서는 불활성이지만, 종양 미세환경의 더 높은 온도에서는 활성이다. 추가의 또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항체는 정상적인 산소화된 혈액에서는 덜 활성이지만, 종양에 존재하는 덜 산소화된 환경하에서는 더욱 활성이다. 추가의 또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항체는 정상적인 생리적 pH 7.2-7.8에서는 덜 활성이지만, 종양 미세환경에 존재하는 산성 pH 5.8-7.0 또는 6.0-6.8하에서는 더욱 활성이다. 예를 들어, 미세환경 제한된 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.7에서 더욱 활성이다. 또한, 조건부로 활성인 ASTR이 상이한 결합 친화도를 갖는 본 발명에서의 조건으로서 또한 사용될 수 있는 분야의 당업자에게 공지된 종양 미세환경 내의 다른 조건이 존재한다. 이러한 생체내 종양 조건을 모방하는 시험관내 검정 조건은 본원에서 시험관내 종양 대용물 검정 조건으로 지칭된다.
이러한 조건 중 임의의 하나 이상은 특정 검정 완충제를 선택함으로써 시험관내에서 모의될 수 있다. 이환된 미세환경을 모의하는 검정 완충제의 조성은, 이환된 미세환경에서 변경된 공지되거나 본원에 기재된 하나 이상의 조건을 제외하고, 정상 환경을 모의하는 검정 완충제의 조성과 동일하도록 선택될 수 있다. 추가로, 2개의 상이한 조건 세트하에 하나 이상의 폴리펩타이드의 활성을 스크리닝하거나 동정하는 데 있어서 일반적으로 검정에서 변하는 유일한 조건은 생체내 미세환경을 모의하는 완충제 조건에 관한 것이다. 검정의 다른 조건, 예를 들어,시간, 온도 및 배양 조건은 두 조건 세트에 대하여 동일할 수 있다. 전형적으로, 이환된 미세환경을 모의하는 조건 및 정상적인 미세환경을 모의하는 조건 세트에는 동일한 기초 완충제가 사용되지만, 완충제 조성의 설계는 하나 이상의 파라미터, 예를 들어, pH, 산소, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도(예: 증가되거나 감소된 히알루로난 농도), 락테이트 농도(예: 증가되거나 감소된 락테이트 농도), 알부민 농도(예: 증가되거나 감소된 히알루로난 농도) 및/또는 피루베이트 농도(증가되거나 감소된 피루베이트 농도 포함)가 상이하도록 이루어질 수 있다. 이환된 미세환경을 모의하는 조건 및 정상적인 미세환경을 모의하는 조건에서, 당업자에게 공지된 임의의 기초 완충제가 사용될 수 있다.
미세환경 제한된 세포를 생성하는 방법
본 개시내용은 미세환경 제한된 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 본 개시내용의 미세환경 제한된 CAR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 발현 벡터(예: 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터), 또는 RNA( 예: 시험관내 전사된 RNA)로 포유동물 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서 미세환경 제한된다. 유전자 변형은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 세포는 면역 세포(예: T 림프구, T 헬퍼 세포 또는 NK 세포), 줄기 세포, 전구 세포 등일 수 있다.
일부 경우에서, 유전자 변형은 생체외에서 수행된다. 예를 들어, T 림프구, 줄기 세포, T 헬퍼 세포 또는 NK 세포는 개체로부터 수득되고; 개체로부터 수득된 세포는 본 개시내용의 CAR을 발현하도록 유전자 변형된다. 유전자 변형된 세포는 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서 미세환경 제한가능하다. 일부 경우에서, 유전자 변형된 세포는 생체외에서 활성화된다. 다른 경우에서, 유전자 변형된 세포는 개체(예: 세포가 수득된 개체) 내로 도입되고; 유전자 변형된 세포는 생체내에서 활성화된다. 예를 들어, 하나 이상의 표적 항원이 개체의 세포 표면 상에 존재하는 경우, 항원을 투여할 필요는 없다. 유전자 변형된 세포는 개체의 세포 표면 상에 존재하는 항원과 접촉하고, 유전자 변형된 세포는 활성화된다. 예를 들어, 유전자 변형된 세포가 T 림프구일 경우, 유전자 변형된 세포는 CAR이 결합하는 표면 상에서 하나 이상의 표적 항원을 발현하는 세포에 대하여 세포독성을 나타낼 수 있다.
pH를 변경하여 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포 활성을 조절하는 방법
특정 양태에서, 표적 세포(들)에서 그의 동족 항원에 대한 MRB-CAR의 결합을 조절하여 표적 조직 내 또는 하나 이상의 비표적(예: 건강한/정상) 조직 내에 표적 세포를 포함하는 미세환경 내에서 pH의 변화 또는 이동을 일으킴으로써 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 결합 및 생성되는 용해/사멸을 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 전형적으로 포유동물 세포(예: 인간 세포)와 같은 표적 세포를 미세환경에서 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포와 접촉시킨 다음, pH를 감소시키거나 전형적으로 증가시켜 미세환경의 pH를 변화시키는 단계를 포함한다. 미세환경은 표적 미세환경, 예를 들어, 종양 또는 오프-표적(off-target) 미세환경일 수 있되, 오프-표적 결합은 부작용을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 종양 미세환경 민감성 CAR-T 표적 결합의 일시적인 감소를 제공할 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 대상체에서 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR) 발현 T 세포 또는 NK 세포의 MRB-CAR의 동족 항원을 발현하는 세포에의 결합을 조절하는 방법으로서,
a. MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계 후 (및 임의로 및/또는 동안) MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현하고 대상체에서 동족 항원을 발현하는 세포에 결합하는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 투여가 상기 도입 단계 전, 동안 또는 후에 수행되고, 상기 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 증가된 pH가 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 또는 미세환경에서 동족 항원을 발현하는 세포에 대한 MRB-CAR 발현 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는, 단계를 포함하는, 조절 방법을 제공한다.
본 개시내용의 pH-조절 약리학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 양태에서의 pH의 변화/이동은 pH-조절 약리학적 제제에 표적 또는 비표적 세포/조직을 노출시킴으로써, 예를 들어, pH-조절 약리학적 제제를 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. pH-조절 약리학적 제제의 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, MRB-CAR의 그의 동족 항원에 대한 결합을 조절하거나 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포의 그의 동족 항원을 발현하는 세포에 대한 결합을 조절하거나 대상체에서 온 표적 오프 종양 독성(on target off tumor toxicity)을 감소시키거나 경감시키기 위한 방법에 사용하기 위한 약리학적 제제가 본원에 제공된다. 특정 구현예에서의 이러한 양태는 종양 성장, 암, 과다형성 또는 세포 증식성 장애의 치료에 관한 것이다.
다른 양태에서, 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 유전자 조작된 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 제어하기 위한 약제 또는 키트의 제조에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제의 용도가 본원에 제공된다. 다른 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 함유하는 용기 및 종양 성장을 치료하는 방법을 수행하기 위한 이의 사용 지침을 포함하는 키트로서, 상기 지침이 pH를 조절함으로써 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법을 지시하는, 키트가 본원에 제공된다. 이러한 방법은 pH를 변화시킴으로써 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포 결합 및/또는 활성을 조절하기 위한 본 절에 제공되는 임의의 방법일 수 있다. 재조합 레트로바이러스 입자를 함유하는 용기는 튜브, 바이알, 플레이트의 웰 또는 재조합 레트로바이러스 입자 및/또는 pH-조절 약리학적 제제를 저장하기 위한 다른 용기일 수 있다. 이들 중 임의의 것은 산업적 강도 및 등급일 수 있다. 키트는 특정 구현예에서 2개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 하나의 용기/용기는 재조합 레트로바이러스 입자를 포함할 수 있고 다른 용기/용기는 pH-조절 약리학적 제제를 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 약리학적 제제는 증가된 pH를 갖는 혈액 및/또는 조직에서 그의 동족 항원에 대한 MRB-CAR을 발현하는 변형된/재조합 T 세포 및/또는 NK 세포의 MRB-CAR의 결합을 조절하기 위해 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 전달/투여된다. 충분한 양 및 충분한 시간 동안 pH-조절 약리학적 제제를 투여하기 위한 비제한적인 예시적 세부 사항이 본원에 제공된다.
조직에 대해 온 표적이든 오프 표적이든 표적 세포는 대상체에게 MRB-CAR을 도입한 후, pH 조절 약리학적 제제와 같은 pH 조절제와 접촉될 수 있다. 따라서, MRB CAR-발현 T 세포의 결합 및/또는 세포독성 활성을 조절하기 위한, 예를 들어, 온 표적 오프 종양 활성을 완화시키고/시키거나 종양 세포 증식과 같은 표적 세포 증식을 억제하기 위한 본원에 제공된 예시적인 양태는 다음 단계를 포함할 수 있다:
a. MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계 후, MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키고, 선택적으로 대상체에서 동족 항원을 발현하는 세포에 결합하는, 단계; 및
b. 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 또는 미세환경에서 MRB CAR의 동족 항원을 발현하는 세포에 대한 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하기 위해 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 약리학적 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 T 세포 및/또는 NK 세포로 도입하는 데 사용되는 특정 방법에 따라 T 세포 및/또는 NK 세포는 대상체에게 도입되기 전에 MRB-CAR을 발현할 수도 있고 발현하지 않을 수도 있음을 이해할 것이다. 그러나, 대상체에 도입된 후 어느 시점에서, 예를 들어, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 1일, 2일, 4일 및/또는 7일 이상, MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포는 MRB-CAR을 발현한다. 이어서, 이러한 세포는 전형적으로 MRB-CAR에 대한 동족 항원을 발현하는 표적 세포에 결합한다.
대상체의 림프구를 유전자 변형시키고 임의로 확장시키기 위한 본원에 제공된 방법을 사용하여 MRB-CAR을 코딩하는 핵산 서열을 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포의 게놈에 도입하여 MRB CAR을 발현할 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성한 다음, 상기 MRB CAR을 발현할 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 상기 대상체에 도입할 수 있되, 상기 도입 후, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포는 표적 세포/조직과 MRB-CAR을 접촉시키기 위해 MRB-CAR을 발현시킨다. 본 개시내용은 림프구를 변형시키고 확장시키기 위한 다양한 대안과 함께 이러한 방법을 수행하기 위한 방법의 세부 사항을 제공하고, 이중 임의의 것은 MRB CAR에 대한 동족 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하기 위해 pH를 변화시키는 단계를 포함하는 개시내용의 양태에 사용될 수 있다.
림프구를 유전적으로 변형시키고 확장시키는 이러한 방법은 전형적으로 예시적인 구현예에서 휴지 세포일 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시켜 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함한다. 이러한 접촉은 전형적으로 림프구를 개체로부터 제거한 후에 생체외에서 발생한다. 이어서, T 세포 및/또는 NK 세포는 전형적으로 그들이 제거된 대상체로 도입/재도입된다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 MRB-CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 게놈을 포함한다. 이러한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 관한 많은 대안적인 구현예 및 추가의 세부 사항은 본원의 다른 섹션에 제공되며, MRB-CAR에 의해 인식되는 동족 표적 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 미세환경에서 pH를 조절함으로써 MRB-CAR의 결합 및 생성되는 용해/사멸을 pH 의존성 방식으로 조절하기 위한 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다.
상기 조합을 포함하는 특히 예시적인 양태는 다른 섹션에서 본원에 제공된 MRB CAR-발현 T 세포의 결합, 세포 사멸 활성 및/또는 생존을 조절하기 위한 다른 요소를 포함할 수 있다. pH의 변화뿐만 아니라 본원에 제공된 다른 구현예를 포함하는 방법에서 MRB CAR-발현과 결합될 수 있는 이러한 조절 요소는 리보스위치 및 제거 도메인을 포함한다. 따라서, 이러한 방법 및 본원에 제공된 조성물의 조합은 강력한 멀티 대상체에게 MRB CAR-발현 T 세포를 포함하는 CAR-발현 T 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 안전성을 보장하는 강력한 다양태 접근법을 형성한다.
이러한 조합을 포함하는 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 결합을 조절하기 위한 이러한 방법은, 예를 들어, 대상체에서 혈액 및/또는 비종양 조직(들)의 pH를 증가시킴으로써 표적 온 오프 종양 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체 내의 "정상적인" 조직 pH가 일시적으로 낮아지는 상황에서, pH 조절제는 정상 조직의 pH가 증가되지만 종양의 pH는 더 낮게 유지되고, MRB-CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포가 표적 종양 세포에 결합하는 pH로 유지되는 방식으로 전달될 수 있다. 이러한 구현예에서, pH 조절제는 더 낮은 농도로 또는 정상 조직으로 표적화된 방식으로 전달될 수 있다.
일부 구현 양태에서, 이는 종양 미세환경 내의 pH를 MRB-CAR T 세포 및/또는 NK 세포가 종양 내의 그의 동족 표적-발현 세포에 결합하기에 충분히 낮게 유지하면서 달성될 수 있다. 본원에 제공된 방법의 예시적인 양태에서, 조직의 pH는 MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포가 이의 동족 항원을 발현하는 세포와 접촉하고 이에 결합하기에 충분한 시간 동안(예: 2, 4, 8, 12 또는 24시간, 또는 2, 4, 7, 14, 28 또는 30일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24개월 이상) MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포가 이의 표적에 결합하는 pH에서 유지시킨 다음, pH는, 예를 들어, MRB CAR-발현 T 세포 및/또는 NK 세포의 표적 세포에 대한 결합에 영향을 미치는 정도로 조직의 pH를 증가시킴으로써 이동/변화시킨다.
따라서, 하나의 양태에서, 혈관 및 조직 pH의 약리학적 변형을 통해 종양 미세환경 민감성 CAR-T 세포 표적 결합의 일시적인 감소 방법이 본원에 제공된다. 상이한 조건에서 상이한 결합을 갖는 종양 미세환경 민감성 CAR-T 세포의 표적 결합 부분은 또한 미세환경 제한된 생물학, 미세환경 제한된, 미세환경 제어된 또는 조건부 활성으로 지칭되며, 전체 CAR 또는 이의 임의의 표적 결합 도메인, 예를 들어, ASTR, scFv 또는 scFvFc를 지칭할 수 있다. CAR-T 세포에서 이러한 미세환경적으로 제어된 ASTR는 T 세포 참여를 가능하게 하는 종양 국소 환경 조건을 필요로 하는 온-표적 오프 종양 독성에 대한 추가 수준의 보호를 제공한다. 일부 단클론성 항체 요법에 대해서는 매력적이지만, 입양 세포 요법은 CAR-T 표적에 일시적으로 허용되는 국소 환경을 생성할 수 있다. 예를 들어, 낮은 pH를 갖는 조직에서 활성화된 CAR-T 세포는 CAR 작제물에 존재하는 세포질 도메인에 따라 미세환경의 pH를 추가로 감소시킬 수 있다. 다른 경우에는, 사이토카인 방출 증후군 및 입양 세포 요법과 관련된 기타 이환율은 혈액의 중탄산염 완충 능력을 상실하여 유산증을 유발할 수 있다. 정맥내 주입에 의해 투여된 입양 세포 요법은 일시적인 폐 포착을 일으킨다는 것이 확립되었다. 일부 세포 요법의 경우, 주입 속도는 용해된 산소의 일정한 모니터링을 필요로 한다(참조: Fischer 등 Stem cells Dev. 2009 Jun; 18(5): 683-691). 폐 포착 정도는 세포 크기, 활성화 상태, 세포 용량 및 주입 속도에 의존한다. 문헌[참조: Cruz et al (Cytotherapy. 2010 Oct; 12(6): 743-749)]은 300 T 세포 주입으로부터 저용량 및 느린 주입이 폐 포착을 감소시킬 수 있다는 부작용을 보고한다. 그러나, 특정 고효율 CAR-T 세포의 경우, Her2와 같은 폐 내피에서 낮은 수준에서도 존재하는 표적(참조: Morgan 등 Mol Ther. 2010 Apr; 18(4): 843-851)은 제어될 수 없는 즉각적인 독성을 초래할 수 있고, 주입 후 폐의 초기 높은 CAR-T 세포 농도 및 이들 조직에서의 T 세포 표적의 존재로 인해 환자의 급격한 악화를 초래할 수 있다. 다른 경우에, 담관과 같은 다른 오프 표적 조직에서 T 세포 표적의 존재는 제어될 수 없는 온 표적 오프 종양 독성을 생성할 수 있고(참조: Lamers Mol Ther. 2013 Apr;21(4):904-12), 스테로이드 또는 세포 제거 에피토프와 같은 다른 약제가 사용될 수 있기 전에 심각한 장기 독성을 초래할 수 있다. 정맥 및 동맥 혈장은 산증에 대한 완충 능력이 강하지만, 호흡성 산증, 쇼크, 대사성 산증 및 허혈성 산증의 상태가 입양 세포 요법으로 치료된 암 환자에서 발생할 수 있다.
본원에서 제공된 일부 양태에서, 대상체에서의 MRB-CAR의 결합은 대상체에게 약리학적 제제를 투여하여 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH를 증가 또는 감소시킴으로써 조정할 수 있다. 일부 양태에서, 온-표적 오프 종양 독성은 대상체에게 약리학적 제제를 투여하여 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가 또는 감소시킴으로써 완화될 수 있다. 일부 양태에서, 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합은 약리학적 제제를 도입하여 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가 또는 감소시킴으로써 제어될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자 조작된 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체내 표적 포유동물 세포에 대한 결합은 대상체에게 pH 조절 약리학적 제제를 투여함으로써 제어될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 약리학적 제제는 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 미세환경은 생체내 미세환경일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 미세환경은 종양 미세환경일 수 있다. 일부 구현예에서, 미세환경은 표적 포유동물 세포를 포함할 수 있되, 상기 표적 포유동물 세포는 표면에서 표적 항원을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 약리학적 제제를 대상체에게 투여하면 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 또는 6.9 미만의 pH에서 적어도 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6의 pH로 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH를 증가시킬 수 있되, 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH는 약리학적 제제를 투여한 후보다 약리학적 제제를 투여하기 전에 더 낮다. 일부 구현예에서, 약리학적 제제를 대상체에게 투여하면 혈액, 조직 또는 미세환경의 pH를 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6 이상의 pH에서 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0 미만의 pH로 감소시킬 수 있되, 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH는 약리학적 제제를 투여한 후보다 약리학적 제제를 투여하기 전에 더 높다. 일부 구현예에서, 약리학적 제제를 대상체에게 투여하면 혈액, 조직 및/또는 미세환경에서 대상체의 pH 이동을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, pH 이동은 어느 하나의 방향에서 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8 pH 단위, 즉 약리학적 제제를 투여하기 전의 pH에 대한 약리학적 제제를 투여한 후 pH의 증가 또는 감소일 수 있다. 예시적인 구현예에서, pH 이동은 pH의 증가이다.
본 개시내용의 MRB-CAR은 상이한 pH에서보다 하나의 pH에서 동족 항원에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. MRB-CAR의 차별적인 결합에 대한 예시적인 pH 값이 상기 가장 넓은 양태에서 이미 제공되지 않고 대안적으로 이러한 양태에 대한 이러한 값 대신에 다른 구현예에 대해 제공되는 예시적인 양태에서, MRB-CAR은 낮은 pH에서보다 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0 이하의 pH에서보다 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 이상의 pH에서 동족 항원에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 낮은 pH에서보다 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 이상의 pH에서보다 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0 이하의 pH에서 동족 항원에 대한 결합을 감소시킬 수 있다 . 일부 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4 내지 7.6과 비교하여 6.5 내지 6.7의 pH에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4에 비해 pH 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 혈액 pH와 비교하여 종양의 pH에서 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 항원 특이적 표적화 영역, 줄기 및 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 또한 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 종양 관련 항원에 결합할 수 있다.
혈액, 조직 또는 미세환경의 pH를 조절하는 단계를 포함하는 방법에서, 미세환경의 pH는 7.0 이하의 pH에서 7.0 이상의 pH로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, pH는 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0 이하의 pH에서 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4 이상의 pH로 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 증가된 pH에서는 동족 항원에 결합할 수 있지만, 약리학적 제제를 도입하기 전의 미세환경의 pH에서는 결합할 수 없다. 특정 구현예에서, pH는 7.0 미만에서 pH 7.1 내지 8.0 또는 pH 7.1 내지 7.8 또는 pH 7.2 내지 7.8 또는 pH 7.2 내지 7.6 또는 pH 7.3 내지 7.6 또는 pH 7.4 내지 7.8 또는 pH 7.4 내지 7.6으로 증가될 수 있다. 이러한 pH의 증가는 투여되는 약리학적 제제의 종류 및 투여량에 따라 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 미만 동안 또는 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 이상 동안 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 약리학적 제제는 pH가 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5 이상으로; 또는 표적 조직, 예를 들어 종양에서, 예를 들어, 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 표면에서, 적어도 미세 환경의 표적 조직(예, 종양)의 일부에서, 그리고 예시적인 구현예에서는 표적 조직(예: 종양) 미세환경 전반에 걸쳐 범위의 하단에서 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 그 범위의 상단에서 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8 사이로 유지되도록 투여된다. 미세환경은 종양, 조직, 비 종양 조직, 정상 조직, 또는 pH의 일시적인 변화를 겪은 조직과 같은 생체내 미세환경일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 pH의 일시적인 이동을 겪는 조직은 혐기성 상태의 근육 조직 또는 운동을 하는 근육 조직 또는 염증성 조직 또는 염증을 겪는 조직을 포함한다. 표적 포유동물 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 표적 포유동물 세포는 종양 세포 또는 비종양 세포 또는 정상 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 미세환경적으로 제어된 MRB-CAR의 항원에 대한 친화성을 감소시키기 위해 일시적으로 혈관 pH를 증가시키는 방법이 제공된다. 혈액 pH의 0.4U 이동은 MRB-CAR의 일부를 형성하는 특정 scFv의 동족 항원에 대한 친화성을 10배 초과로 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료학적 pH 제어는 다양한 약리학적 제제의 IV 또는 경구 투여 경로를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 친화성의 불활성화는 중탄산염 또는 중탄산나트륨으로 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄(트로메타민, 트로메타몰 및 THAM으로도 공지됨) 및/또는 CarbicarbTM(중탄산나트륨 및 탄산나트륨의 등몰 고삼투압 용액)는 혈액의 pH를 증가시키기 위해 온-표적 오프 종양 독성을 완화시키기에 충분한 양으로 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 소분자 양성자 펌프 억제제를 온-표적 오프 종양 독성을 완화시키기에 충분한 양으로 사용하여 혈액 pH 및/또는 조직 pH를 증가시킬 수 있다. pH를 조절하는 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있는 양성자 펌프 억제제는 에소메프라졸(넥시움), 에소메프라졸 및 나프록센(비모보), 란소프라졸(프레바시드), 오메프라졸(프릴로섹 및 제거리드), 및 라베프라졸(악시펙스)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 양성자 펌프 억제제의 투여는 수일, 수주, 수개월 또는 수년간 그의 동족 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 친화성을 조절하기 위해 보다 긴시간 동안 효과적으로 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 이의 동족 항원에 대한 항원 결합 도메인의 친화성은 수송체 및 펌프의 전사, 번역, 막 발현 및 안정성을 제어하여 혈액 pH 및/또는 조직 pH를 변경함으로써 조정할 수 있다. 변형된 발현이 pH를 조절할 수 있는 이러한 수송체 및 펌프의 예로는 양성자 펌프, 나트륨 양성자 교환 계열의 구성원(NHE), 중탄산염 수송체 계열(BCT) 및 모노카복실레이트 수송체 계열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 예를 들어, 중탄산염, THAM 또는 CaricarbTM과 같은 pH 조절 약리학적 제제는 미세환경 제한된 생물학적 ASTR(예: scFv 또는 scFvFcs)를 발현하는 환자의 CAR-T 세포의 주입 전에 또는 동시에 투여된다. 이러한 치료는 달리 CAR-T 세포 주입의 일시적인 폐 포착과 관련이 있는 즉각적인 세포독성을 경감시킬 것이다. 따라서, 특정 양태에서 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 약리학적 제제를 대상체에게 투여하고, MRB CAR- 발현 T 세포 또는 NK 세포를 대상체에게 동시에 또는 후속적으로(예: 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간, 또는 1, 2, 3, 4 또는 7일 후) 도입함으로써 대상체의 정상적인 건강한 조직에 야기된 세포독성을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 이러한 도입 후 표적시간(예: 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간, 또는 1, 2, 3, 4 또는 7일 후)에 약리학적 제제의 투여는 대상체의 혈액, 조직 또는 미세환경의 pH를 변화시키고 MRB CAR-발현 T 세포의 결합/활성을 조절하기 위해 일정 기간 동안 또는 무기한 종결된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, pH를 조절할(대상체의 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가시킬) 수 있는 약리학적 제제를 투여하기 위한 다양한 효과적인 투약 섭생이 사용될 수 있다. 본원에서, 투여는 약리학적 제제를 IV를 통해 대상체에게 주사하거나 약리학적 제제의 경구 용량을 대상체 또는 약리학적 제제를 복용하는 대상체에게 제공함을 포함하여 대상체에게 약리학적 제제를 제공함을 의미할 수 있다. 약리학적 제제는 다양한 시간 동안, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11주; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 또는 18개월; 또는 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5년 또는 무기한 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약리학적 제제는 중탄산염, 중탄산나트륨(NaHCO3), 또는 중탄산나트륨 및 탄산나트륨의 용액일 수 있고, 비경구 또는 IV 투여량은 다음과 같을 수 있다: 0.2 x 대상체의 체중(kg) × 대상자의 기제 결핍; HCO3 (mEq) 요구량 = 0.5 x 체중 (kg) × [24 - 혈장 HCO3 (mEq/L)]; 또는 4 내지 8시간에 걸쳐 2 내지 5 mEq/kg IV 주입. 일부 구현예에서, 중탄산염, 중탄산나트륨 또는 중탄산나트륨 용액의 표준 투여 섭생은 산증의 중증도에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 물 중 5% 덱스트로스 1L로 희석된 50 내지 150mEq 중탄산염을 1 내지 1.5L/시간의 속도로 IV를 통해 투여할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 물 중의 5% 덱스트로스 1L로 희석된 90 내지 180 mEq 중탄산염을 1 내지 1.5L/시간의 속도로 IV를 통해 투여할 수 있다. 약리학적 제제가 중탄산염 또는 중탄산나트륨(NaHCO3)인 일부 구현예에서, 장관 또는 경구 투여량은, 예를 들어, 1 내지 4회/일 대상체에게 투여된 325 내지 2000mg 중탄산나트륨일 수 있다.
일부 구현예에서, 약리학적 제제는 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄(트로메타민, 트로메타몰 및 THAM으로도 공지됨)일 수 있고, 비경구 또는 IV 투여량은 다음과 같이 추정될 수 있다: 필요한 트로메타민 용액(0.3M의 mL)= 체중(kg) × 기제 결손(mEq/ℓ) x 1.1. 일부 구현예에서, 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄의 IV 투여량은 시가드-앤더슨 노모그램(Siggaard-Andersen nomogram)에 의해 결정된 세포외액의 완충제 기제 결손(mEq/L)으로부터 추정될 수 있다. 일부 구현예에서, 초기 용량은 최대 1000mL로 느린 IV 주입에 의해 주입된 500ml(150mEq)의 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄일 수 있으며, 여기서 최대 용량은 1시간 이상 동안 500mg/kg(227mg/lb)이다.
일부 구현예에서, 약리학적 제제는 소분자 양성자 펌프 억제제일 수 있고, 연장된 치료 길이 동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 소분자 양성자 펌프 억제제는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11주; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 또는 18개월; 또는 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5년 동안 또는 무기한으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 양성자 펌프 억제제는 에 소메프라졸(넥시움)일 수 있고, 20mg 또는 40mg의 에소메프라졸은 1일 1회 또는 2회 경구 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 양성자 펌프 억제제는 에소메프라졸 및 나프록센(비모보)의 조합일 수 있고, 375 또는 500mg 나프록센과 함께 20mg의 에소메프라졸이 1일 2회 경구 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 양성자 펌프 억제제는 란소프라졸(프레바시드)일 수 있고, 15, 30 또는 60mg의 란소프라졸이 1일 1회 또는 2회 경구 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 란소프라졸은 최대 7일 동안 1일 1회 30분 동안 주사된 30mg의 란소프라졸로 IV 투여될 수 있다. 이어서, 경구용 란소프라졸로 전환하여 치료를 계속할 수 있다. 일부 구현예에서, 양성자 펌프 억제제는 오메프라졸(프릴로섹 및 제거리드)일 수 있고, 10, 20 또는 40mg의 오메프라졸은 1일 1회 또는 2회 경구 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 양성자 펌프 억제제는 라베프라졸(악시펙스)일 수 있고, 20 또는 60mg의 라베프라졸은 1일 1회 또는 2회 경구 투여될 수 있거나, 100mg의 라베프라졸은 1일 1회 경구 투여될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 약리학적 약제는 서로 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 구현예에서, 대상체의 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH는 약리학적 제제의 투여 전, 도중 또는 후에 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, pH를 증가시키거나 감소시키기 위한 약리학적 제제를 대상체에게 투여하거나 계속 투여하기로 결정하는 것은 대상체의 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 pH 측정에 기초할 수 있다. 대상체의 혈액 pH 및/또는 혈액의 중탄산염 수준을 측정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 양전자 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 분광법(MRS), 자기 공명 영상(MRI) 및 광학 영상을 사용하여 미세환경, 예를 들어, 종양에서 생체내 pH를 측정할 수 있다(종양 pH를 측정하기 위한 세부사항은 문헌(참조: Zhang X, Lin Y, Gillies RJ. Tumor pH and its measurement. J Nucl Med. 2010 Aug;51(8):1167-70)을 참조한다).
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 대상체에서 온-표적 오프 종양 독성을 경감시키는 방법이 본원에 제공된다:
a. 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 대상체의 T 세포 또는 NK 세포에 도입하여 상기 MRB-CAR을 발현할 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산하는 단계;
b. MRB-CAR을 발현할 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체에서 MRB-CAR을 발현시키는, 단계; 및
c. 혈액에서 MRB-CAR의 그의 동족 항원에의 결합 및/또는 증가한 pH를 가진 미세환경을 조절하기 위해 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 온-표적 오프 종양 독성을 경감시키는 단계.
도입 단계에서, T 세포 또는 NK 세포는 MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 함유하도록 유전자 변형되기 때문에 MRB-CAR을 발현할 수 있다. 이 유전자 변형은 형질감염 또는 형질도입에 의해 T 세포 또는 NK 세포내부에 도입된 벡터 상에 MRB-CAR 코딩 서열의 존재일 수 있다. 예시적인 구현예에서, MRB-CAR을 코딩하는 핵산은 T 세포 또는 NK 세포의 게놈에 통합된다.
폴리뉴클레오타이드를 T 세포 및/또는 NK 세포로 도입시키는 당업계에 공지된 다양한 방법이 제제, 예를 들어, pH 조절 약리학적 제제(때로는 본원에서 "pH 스위치 양태"로서 지칭됨)를 사용하여 세포 상의 이의 동족 항원에 대한 MRB-CAR T 세포 또는 NK 세포의 결합에 영향을 미치기 위해 pH를 변화시키는 것을 포함하는 양태에 대해 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다는 것이 예상된다. 전형적으로, 벡터, 예시적인 예에서 발현 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 사용된다. 이러한 벡터는 T 세포 및/또는 NK 세포에 핵산을 전달하기 위한 당업계에 공지된 다양한 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 양태는 레트로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 입자를 사용하고, 일부 특정 구현예에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하고, 예시적인 구현예에서는 재조합 렌티바이러스 입자를 사용한다.
다른 적합한 발현 벡터가 본원에서 제공된 pH 스위치 양태에 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 바이러스 벡터(예: 백시니아 바이러스에 기초한 바이러스 벡터, 폴리오바이러스, 아데노바이러스(참조: 예를 들어, Li 등, Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras 등, Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto 등, H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655); 아데노-관련 바이러스(참조: 예를 들어, Ali 등, Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery 등, PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett 등, Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary 등, Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling 등, Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali 등, Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski 등, J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson 등, Virol. (1988) 166:154-165; and Flotte 등, PNAS (1993) 90: 10613-10617), SV40, 단순 포진 바이러스, 또는 레트로바이러스 벡터(예: 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들어, 루스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스), 예를 들어, 감마 레트로바이러스; 또는 인간 면역결핍 바이러스(참조: 예를 들어, Miyoshi 등, PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi 등, J Virol 73:7812 7816, 1999) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, DNA 함유 바이러스 입자가 재조합 레트로바이러스 입자 대신에 이용된다. 이러한 바이러스 입자는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 사이토메갈로바이러스, 폭스바이러스, 아비폭스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 신드비스 바이러스일 수 있다. 당업자는 상이한 바이러스 및 레트로바이러스, 또는 레트로바이러스 입자와 함께 사용하기 위해 본원에 개시된 방법을 수정하는 방법을 이해할 것이다. DNA 게놈을 포함하는 바이러스 입자가 사용되는 경우, 당업자는 바이러스 입자의 DNA 게놈 전체 또는 일부의 이러한 바이러스로 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포의 게놈 내로의 통합을 유도하기 위해 기능적 단위가 이러한 게놈에 포함될 수 있음을 인식할 것이다. 다르게는, 기능적 DNA는 세포에서 발현되지만 T 세포 및/또는 NK 세포의 게놈에 통합되지 않은 T 세포 및/또는 NK 세포에 전달될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 본 개시내용의 pH 스위치 양태에서 사용되는 벡터는 재조합 레트로바이러스 입자, 특정 구현예에서, 재조합 렌티바이러스 입자이다. 이러한 레트로바이러스 입자는 전형적으로 바이러스 외피 내에 위치하는 캡시드 내에 레트로바이러스 게놈을 포함한다. 본원의 다양한 섹션에서의 본 개시내용은 재조합 레트로바이러스 입자의 표면 또는 내부 및/또는 게놈에 포함될 수 있는 요소를 개시하는 재조합 레트로바이러스 입자의 다양한 구현예를 제공한다. 임의의 이러한 재조합 레트로바이러스 입자 구현예를 본원에서 제공되는 pH 스위치 양태에 사용할 수 있다.
억제성 RNA 분자
특정 구현예에서, 본 개시내용을 위해 본원에 제공된 방법은 T 세포 및/또는 NK 세포에서 발현된 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 본원에 제공된 방법은 이러한 방법에 사용될 수 있는 하나 이상, 예시적인 구현예에서 2개 이상의 억제성 RNA 분자, 예를 들어, miRNA 또는 shRNA를 발현하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 능력을 예시한다. 실제로, 본원에 제공된 방법은 이러한 억제성 RNA 분자가, 예를 들어, Ef1a 인트론을 포함하는 인트론 내에서 코딩될 수 있음을 예시한다. 이는 종래의 교시의 단점을 극복하고 입양 T 세포 요법에서 이러한 재조합 레트로바이러스 입자의 효과를 최대화하기 위해 패키징 가능한 레트로바이러스 게놈에 포함될 수 있는 기능적 요소를 최대화하는 방법의 본 교시를 이용한다.
일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 2개의 가닥이 세포 환경 내에서 18-25개 뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있도록 서로 부분적으로 또는 완전히 상보적인 5' 가닥 및 3' 가닥(일부 예에서는, 센스 가닥 및 안티센스 가닥)을 포함한다. 5' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있고, 3' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 5' 가닥 및 3' 가닥은 동일하거나 상이한 길이일 수 있고, RNA 듀플렉스는 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 대안적으로, RNA 듀플렉스에는 불일치가 없다.
본원에서 제공된 조성물 및 방법에 포함된 억제성 RNA 분자는, 특정 예에서, 게놈이 삽입된 T 세포에 존재하지 않고/않거나 자연적으로 발현되지 않는다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 miRNA 또는 shRNA이다. siRNA를 코딩하는 핵산, 특히 핵산이 게놈의 일부인 맥락에서 본원에서 또는 우선권 출원에서 참조가 수행되는 일부 구현예에서, 이러한 핵산이 DICER에 의해 처리되어 전형적으로 RISK 복합체와 상호작용하거나 RISK 복합체의 일부가 되는 이중 가닥 RNA를 형성하는 세포에서 siRNA 전구체, 예를 들어, miRNA 또는 shRNA를 형성할 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 구현예의 억제성 분자는, 예를 들어, Pri-miRNA 또는 Pre-miRNA와 같은 miRNA의 전구체, 또는 shRNA의 전구체이다. 일부 구현예에서, miRNA 또는 shRNA는 인공적으로 유도된다(즉, 인공적 miRNA 또는 siRNA). 다른 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 siRNA 또는 siRNA 자체로 가공되는 dsRNA(전사되거나 인공적으로 도입됨)이다. 일부 구현예에서, miRNA 또는 shRNA는 자연에서 발견되지 않는 서열을 갖거나, 자연에서 발견되지 않는 적어도 하나의 기능성 세그먼트를 갖거나, 자연에서 발견되지 않는 기능적 세그먼트의 조합을 갖는다.
일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 일련의 또는 다중 배열로 제1 핵산 분자 내에 위치되어 다수의 miRNA 서열이 단일 다중시스트론성 miRNA 전사체로부터 동시에 발현되도록 한다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 비작용성 링커 서열(들)에 의해 직접 또는 간접적으로 서로 측접할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 길이가 5 내지 120개의 뉴클레오타이드이고, 일부 구현예에서는 비제한적인 예로서 길이가 10 내지 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 CAR(예: MRB-CAR)을 코딩하는 제2 핵산 서열은 구성적으로 활성이거나 T 세포 또는 NK 세포에서 유도될 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 이와 같이, 억제성 RNA 분자(들)(예: miRNA)뿐만 아니라 CAR은 다중시트론성 방식으로 발현된다. 추가로, 기능 서열은 동일한 전사체로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 억제성 RNA 분자가 아닌, 본원에 제공된 임의의 림프증식성 요소는 CAR 및 하나 이상(예: 2개 이상)의 억제성 RNA 분자와 동일한 전사체로부터 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 miR-155에 제한되지 않는 것과 같은 천연 발생 miRNA이다. 대안적으로, 하이브리드화/상보적 줄기 구조를 형성할 수 있고 표적 RNA에 대해 지시되는 서열이 줄기 서열 사이에 마이크로RNA 프로세싱을 위한 마이크로RNA 측접 서열 및 측접 서열로서 동일한 천연 miRNA로부터 임의로 유래될 수 있는 루프를 포함하는 miRNA 프레임워크에 위치하는 인공 miRNA가 생성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 5'로부터 3' 배향으로 5' 마이크로RNA 측접 서열, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 3' 줄기, 및 3' 마이크로RNA 측접 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5'줄기(또한 본원에서 5' 아암이라 지칭됨)는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 3' 줄기(또한 본원에서 3'아암이라 지칭됨)는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 루프는 길이가 3 내지 40, 10 내지 40, 20 내지 40 또는 20 내지 30개의 뉴클레오타이드이고, 예시적인 구현예에서 루프는 길이가 18, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 줄기는 다른 줄기보다 2개의 뉴클레오타이드 더 길다. 더 긴 줄기는 5' 또는 3' 줄기일 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 마이크로RNA 측접 서열, 3' 마이크로RNA 측접 서열, 또는 둘 다는 miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 및 miR-21에 제한되지 않는 것과 같은 천연 miRNA로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 5' 마이크로RNA 측접 서열, 3' 마이크로RNA 측접 서열, 또는 둘 다는 무스 무스쿨러스 또는 호모 사피엔스로부터의 miR-155와 같은 miR-155로부터 유래된다. 합성 miRNA 줄기-루프를 miR-155 프레임워크(즉, 5' 마이크로RNA 측접 서열, 3' 마이크로RNA 측접 서열 및 miRNA 5'와 3' 줄기 사이의 루프)에 삽입하는 것은 당업자에게 공지되어 있다(참조: Chung, K. 등 2006. Nucleic Acids Research. 34(7):e53; US 7,387,896). SIBR(합성 억제성 BIC-유래된 RNA) 서열(상기 Chung 등, 2006)은 무스 무스쿨러스 BIC 비코딩 mRNA(Genbank ID AY096003.1)의 뉴클레오타이드 134-161 (서열번호: 256)로 이루어진 5' 마이크로RNA 측접 서열 및 무스 무스쿨러스 BIC 비코딩 mRNA(Genbank ID AY096003.1)의 뉴클레오타이드 223-283으로 이루어진 3' 마이크로RNA 측접 서열을 갖는다. 한 연구에서, SIBR 서열은 miRNA의 발현을 향상시키기 위해 변형되었다(참조: Fowler, D.K. 등 2015. Nucleic acids Research 44(5):e48). 본 개시내용의 일부 구현예에서, miRNA는 SIBR 또는 eSIBR miR-155 프레임워크에 위치될 수 있다. 본원의 예시적인 구현예에서, miRNA는 서열번호: 256으로 표시되는 miR-155의 5' 마이크로RNA 측접 서열, 서열번호: 260으로 표시되는 3' 마이크로RNA 측접 서열(무스 무스쿨러스 BIC 비코딩 mRNA의 뉴클레오타이드 221-265); 및 변형된 miR-155 루프(서열번호: 258)를 포함하는 miR-155 프레임워크에 위치된다. 따라서, 일부 구현예에서, miR-155의 5' 마이크로RNA 측접 서열은 서열번호: 256 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 서열번호: 256과 동일한 길이 또는 서열번호: 256의 길이의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50%이거나, 100개 이하의 뉴클레오타이드, 95개 이하의 뉴클레오타이드, 90개 이하의 뉴클레오타이드, 85개 이하의 뉴클레오타이드, 80개 이하의 뉴클레오타이드, 75개 이하의 뉴클레오타이드, 70개 이하의 뉴클레오타이드, 65개 이하의 뉴클레오타이드, 60개 이하의 뉴클레오타이드, 55개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 45개 이하의 뉴클레오타이드, 40개 이하의 뉴클레오타이드, 35개 이하의 뉴클레오타이드, 30개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 25개 이하의 뉴클레오타이드이거나; 서열번호: 256과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열이다. 일부 구현예에서, miR-155의 3' 마이크로RNA 측접 서열은 서열번호: 260 또는 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 서열번호: 260과 동일한 길이 또는 서열번호: 260의 길이의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50%이거나, 100개 이하의 뉴클레오타이드, 95개 이하의 뉴클레오타이드, 90개 이하의 뉴클레오타이드, 85개 이하의 뉴클레오타이드, 80개 이하의 뉴클레오타이드, 75개 이하의 뉴클레오타이드, 70개 이하의 뉴클레오타이드, 65개 이하의 뉴클레오타이드, 60개 이하의 뉴클레오타이드, 55개 이하의 뉴클레오타이드, 50개 이하의 뉴클레오타이드, 45개 이하의 뉴클레오타이드, 40개 이하의 뉴클레오타이드, 35개 이하의 뉴클레오타이드, 30개 이하의 뉴클레오타이드, 또는 25개 이하의 뉴클레오타이드이거나; 서열번호: 260과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열이다. 그러나, 그들이 결합되는 표적 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 성숙한 miRNA를 형성하기 위해 그 안에 삽입된 miRNA의 세포내에서 적절한 프로세싱을 제공하기 위해 기능적인 임의의 공지된 마이크로RNA 프레임워크가 본 개시내용 내에서 고려된다.
일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 폴리뉴클레오타이드에서 핵산 서열에 의해 코딩되는 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 또는 적어도 네개는 5'에서 3' 배향으로 다음 배열을 갖는다: 5' 마이크로RNA 측접 서열, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 3' 줄기, 및 3' 마이크로RNA 측접 서열. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자 모두는 5'에서 3' 배향으로 다음 배열을 갖는다: 5' 마이크로RNA 측접 서열, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 3' 줄기, 및 3' 마이크로RNA 측접 서열. 본원에 개시된 바와 같이, 억제성 RNA 분자는 하나 이상의 링커 서열에 의해 분리될 수 있으며, 이는 일부 구현예에서 억제성 RNA 분자 사이의 스페이서로서 작용하는 것을 제외하고는 기능을 갖지 않는다.
2개 이상의 억제성 RNA 분자(일부 예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 억제성 RNA 분자)가 포함되는 일부 구현예에서, 이러한 억제성 RNA 분자는 동일하거나 상이한 RNA 표적(예를 들어, 관심있는 유전자로부터 전사된 mRNA와 같음)에 대해 지시된다. 예시적인 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 3 내지 5개, 또는 3 내지 6개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 포함된다. 예시적인 구현예에서, 4개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 포함된다.
일부 구현예에서, RNA 표적은 제한되지는 않지만 PD-1(불활성화 방지); CTLA4 (불활성화 방지); TCRa (안전성 -자가면역 예방); TCRb (안전성 -자가면역 방지); CD3Z (안전성 - 자가면역 방지); SOCS1(불활성화 방지); SMAD2(불활성화 방지); miR-155 표적(활성화 촉진); IFN 감마 (CRS 감소); cCBL (신호전달 연장); TRAIL2 (사망 방지); PP2A (신호전달 연장); ABCG1 (콜레스테롤의 클리어런스를 제한하여 콜레스테롤 마이크로도메인 함량을 증가시킴)와 같은 T 세포에 의해 발현되는 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 예시적인 예에서, 본원에서 제공된 방법에서 T 세포의 게놈에 삽입된 miRNA는 T 세포의 증식이 유도되고/되거나 증진되고/되거나 아폽토시스가 억제되도록 표적에서 지시된다.
일부 구현예에서, RNA 표적은 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 이러한 성분은 T 세포 수용체 복합체의 생성 및/또는 형성을 위한 성분 및/또는 T 세포 수용체 복합체의 적절한 기능을 위한 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 TCR 복합체, 예시적인 구현예에서 T 세포의 하나 이상의 내인성 TCR 복합체의 형성 및/또는 기능의 감소를 야기한다. T 세포 수용체 복합체는 TCRa, TCRb, CD3d, CD3e, CD3g 및 CD3z를 포함한다. 임의의 하나의 서브유닛의 발현 감소가 복합체의 발현 및 기능의 감소를 초래하도록 이들 요소의 복잡한 상호의존성이 존재하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, RNA 표적은 형질도입된 T 세포에 내인성인 TCRa, TCRb, CD3d, CD3e, CD3g 및 CD3z 중 하나 이상을 발현시키는 mRNA이다. 특정 구현예에서, RNA 표적은 게놈이 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 T 세포의 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 예시적인 구현예에서, RNA 표적은 TCRα 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 특정 구현예에서, 유사한 기대 효용을 갖는 표적 유전자로부터 전사된 mRNA에 대해 지시된 억제성 RNA 분자가 결합될 수 있다. 다른 구현예에서, 상보적인 효용을 갖는 표적 유전자로부터 전사된 표적 mRNA에 대해 지시된 억제성 RNA 분자가 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 억제성 RNA 분자는 표적 유전자 CD3Z, PD1, SOCS1 및/또는 IFN 감마로부터 전사된 mRNA에 대해 지시된다.
본원에 제공된 일부 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자는 제한되지 않지만 EF1-αa 인트론 A와 같은 단일 인트론으로 전달될 수 있다. 본 개시내용을 위해 miRNA를 보유하는데 사용될 수 있는 인트론 서열은 T 세포내에서 처리되는 임의의 인트론을 포함한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 이러한 배열의 하나의 이점은 이것이 본원에 제공된 방법에서 T 세포에 이러한 서열을 전달하는데 사용되는 레트로바이러스 게놈의 크기 제한 내에서 miRNA 서열을 포함시키는 능력을 최대화하는 것을 돕는다는 것이다. 이것은 제1 핵산 서열의 인트론이 인트론, CAR 서열 및 본원에 제공되는 다른 기능적 서열, 예를 들어, 억제성 RNA 분자가 아닌 림프증식성 요소(들)를 다중시스트론성 방식으로 발현하는데 사용되는 프로모터 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 경우에 특히 그러하다. 인트론에 대한 서열 요구 조건은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 이러한 인트론 프로세싱은 본원에 개시된 임의의 리보스위치와 같은 리보스위치에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 리보스위치는 제1 핵산 서열 상의 하나 이상의 miRNA 서열의 발현을 제어하기 위한 조절 요소를 제공할 수 있다. 따라서, 예시적인 구현예에서 내인성 T 세포 수용체 서브유닛에 대해 지시된 miRNA의 조합이 본원에 제공되되, miRNA의 발현은 본원에서 논의된 임의의 리보스위치일 수 있는 리보스위치에 의해 조절된다.
일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 동일하거나 상이한 전사 단위에 포함될 수 있는 다중 핵산 서열 상에 제공될 수 있다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩할 수 있고 제1 프로모터로부터 발현될 수 있고, 제2 핵산 서열은 하나 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩할 수 있고 제2 프로모터로부터 발현될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자는 단일 프로모터로부터 발현되는 제1 핵산 서열 상에 위치된다. 이러한 miRNA를 발현하는데 사용되는 프로모터는 전형적으로 그의 게놈에서 miRNA를 표적 T 세포에 전달할 레트로바이러스 입자를 발현하는데 사용되는 패키징 세포에서 불활성인 프로모터이지만, 이러한 프로모터는 구성적으로 또는 유도성 방식으로, T 세포내에서 활성이다. 프로모터는 Pol I, Pol II 또는 Pol III 프로모터일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 프로모터는 Pol II 프로모터이다.
특성화 및 상업적 생산 방법
본 개시내용은 과학 실험 및 상업적 생산시 연구 시약으로 사용될 수 있는 다양한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 과학적 실험은 림프구, 예를 들어, NK 세포, 예시적인 구현예에서 T 세포를 본원에 제공된 림프구를 유전자 변형시키기 위한, 예를 들어, 형질도입하기 위한 방법을 사용하여 특성화하는 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 림프구의 활성화 및 활성화를 통해 이러한 세포를 형질도입성이도록 하는 상세한 분자 기전을 연구하는 데 사용할 수 있다. 또한, T 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 인자를 더 잘 이해하기 위한 연구 도구로서, 예를 들어, 유용성을 갖는 유전자 변형된 림프구가 본원에 제공된다. 이러한 유전자 변형된 림프구, 예를 들어, NK 세포, 예시적인 구현예에서 T 세포는 또한 상업적 생산을 위해, 예를 들어, 수거되어 상업적 제품의 생산에서 시험되거나 사용될 수 있는 성장 인자 및 면역 조절제와 같은 특정 인자의 생산을 위해 사용될 수 있다.
림프구의 과학적 실험 및/또는 특성화는 림프구를 분석하거나 비교하는데 유용한 본원에 제공된 임의의 양태, 구현예 또는 하위 구현예를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입은 본 개시내용의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 CAR, 림프증식성 인자 및/또는 활성화 인자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 억제성 RNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 인자는 키메라 림프증식성 인자일 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 CAR을 사용하는 다양한 치료 방법을 제공한다. T 림프구 또는 NK 세포에 존재할 때, 본 개시내용의 CAR은 표적 세포에 대한 세포독성을 매개할 수 있다. 본 개시내용의 CAR은 표적 세포 상에 존재하는 항원에 결합하여 CAR을 생산하도록 유전자 변형된 T 림프구 또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 사멸을 매개한다. CAR의 ASTR은 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원에 결합한다.
본 개시내용은 표적 세포를 사멸시키거나, 이의 성장을 억제시키는 방법으로서, 상기 방법이 대상 CAR을 생산하도록 유전자 변형된 세포독성 면역 이펙터 세포(예: 세포독성 T 세포, 또는 NK 세포)를 접촉시킴으로써 T 림프구 또는 NK 세포가 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원을 인식하고, 표적 세포의 사멸을 매개하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 개시내용은 질환 또는 장애를 갖는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 a. CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 대상체로부터 수득된 말초 혈액 세포로 도입하여 유전자 조작된 세포독성 세포를 생산하는 단계; 및 b. 유전자 조작된 세포독성 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특히 대상체가 암을 갖고 있거나 암을 갖는 것으로 의심되는 경우에 대상체에게 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는 본원에 제공된 방법에서, 상기 방법은 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 체크포인트 억제제 전달은 유전자 변형 T 세포 및/또는 NK 세포를 투여하기 전, 후 또는 동시에 발생할 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 공지되어 있고, 다양한 화합물이 승인되고 임상 개발 중에 있다. 다수가 체크포인트 억제제 화합물의 표적이 되는 체크포인트 분자에는 다음과 같은 것들이 포함되고, 일부 체크포인트 억제제가 주시된다.
CD27. 이 분자는 미접촉 T 세포의 항원 특이적 확장을 지원하며 T 세포 기억의 생성에 필수적이다. 셀덱스 테라퓨틱스(Celldex Therapeutics)는 효능적 항-CD27 단클론성 항체인 CDX-1127을 연구하고 있다.
CD28. 이 분자는 거의 모든 인간 CD4 + T 세포 및 모든 CD8 T 세포의 약 절반에서 구성적으로 발현된다. CD28은 TGN1412 '슈퍼효능제'의 표적이었다.
CD40. 항원 제시 세포를 포함하는 다양한 면역계 세포에서 발견되는 이 분자는 달리는 CD154로서 공지되어 있고 이의 리간드로서 활성화된 CD4+ T 세포의 표면에서 일시적으로 발현되는 CD40L을 갖고 있다. 항-CD40 효능제 단클론성 항체는 로슈(Roche)에 허가되었다.
CD122. 인터류킨-2 수용체 베타 서브유닛인 이 분자는 CD8 + 이펙터 T 세포의 증식을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 넥타르 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)는 CD122-편향된 면역 자극 사이토카인인 NKTR-214를 개발했다.
CD137. 4-1BB로 칭명되기도 하는 이 분자가 CD137 리간드에 의해 결합되면, 결과는 T 세포 증식이다. 피에리스 파마슈티칼스(Pieris Pharmaceuticals)는 CD137 및 HER2에 대해 이중특이적인 조작된 리포칼린을 개발했다.
OX40. CD134로 칭명되기도 하는 이 분자는 이의 리간드로서 OX40L 또는 CD252를 갖는다. CD27과 마찬가지로, OX40은 이펙터와 기억 T 세포의 확장을 촉진시키지만, T-조절 세포의 분화와 활성을 억제하는 능력 및 또한 이의 사이토카인 생산의 조절에도 주목된다. 아스트라제네카(AstraZeneca)는 OX40을 표적으로 하는 개발 중인 3가지 약물을 보유한다: MEDI0562는 인간화된 OX40 효능제이고; MEDI6469, 뮤린 OX4 효능제; 및 MEDI6383, OX40 효능제.
글루코코르티코이드-유도 TNFR 계열 관련 유전자의 약자인 GITR은 Treg 확장을 포함하여 T 세포 확장을 촉진한다. TG 테라퓨틱스(Therapeutics)는 항-GITR 항체를 연구하고 있다.
ICOS. 유도성 T-세포 보조 자극 인자의 약자이고 CD278이라 칭명되기도 하는 이 분자는 활성화된 T 세포 상에서 발현된다. 자운스 테라퓨틱스(Jounce Therapeutics)는 ICOS 효능제를 개발 중이다.
A2AR. 아데노신 A2A 수용체는 A2a 수용체의 활성화를 유도하는 면역 미세환경에서 아데노신은 부정적인 면역 피드백 루프이고 종양 미세환경은 비교적 높은 농도의 아데노신을 갖기 때문에 암 치료에서 중요한 체크포인트로서 간주된다.
CD276이라 칭명되기 하는 B7-H3은 본래 보조 자극 분자인 것으로 이해되었지만, 이제는 보조억제성으로 간주된다. 매크로제닉스(MacroGenics)는 B7-H3를 표적화하는 Fc 최적화된 단클론성 항체인 MGA271을 연구하고 있다.
VTCN1이라 칭명되기도 하는 B7-H4는 종양 세포 및 종양-관련 대식세포에 의해 발현되고, 종양 도피에서 역할을 한다.
BTLA. 이 분자는 B 및 T 림프구 감쇠제의 약자이고 CD272라고 칭명되기도 하는 이 분자는 이의 리간드로서 HVEM(헤르페스바이러스 유입 매개체)을 갖는다.
세포독성 T-림프구-관련 단백질 4의 약자이고 CD152로서 칭명되기도 하는 CTLA-4는 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb) 화합물 예르보이(Yervoy)의 표적이다.
인돌아민 2,3-디옥시게나제의 약자인 IDO는 면역억제성을 갖는 트립토판 이화작용 효소이다. 또 다른 중요한 분자는 TDO, 트립토판 2,3-디옥시게나제이다. IDO. Newlink Genetics and Incyte는 IDO 경로 억제제를 동정했다.
킬러-세포 면역글로블린-유사 수용체의 약자인 KIR은 천연 킬러 세포 상의MHC 부류 I 분자에 대한 수용체이다. 브리스톨-마이어스 스큅은 KIR에 대한 단클론성 항체인 리릴루맙을 개발했다.
림프구 활성화 유전자-3의 약자인 LAG3은 CD8+ T 세포에 대한 직접 효과뿐만 아니라 Tregs에 대한 작용에 의한 면역 반응을 억제하는 작용을 한다. 브리스톨-마이어스 스큅은 BMS-986016이라 칭명되는 항-LAG3 단클론성 항체를 개발했다.
프로그램된 사망 1(PD-1) 수용체의 약자인 PD-1은 두개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. 이 체크포인트는 머크 앤 캄파니(Merck & Co.)의 흑색종 약물인 키트루다(Keytruda)의 표적이다.
T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3의 약자인 TIM-3은 활성화된 인간 CD4+ T 세포 상에서 발현되고 Th1 및 Th17 사이토카인을 조절한다.
VISTA (단백질), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제의 약자로, VISTA는 주로 조혈 세포에서 발현된다.
치료에 적합한 대상체
다양한 대상체가 본원에 제공된 방법 및 조성물을 이용하는 치료에 적합하다. 적합한 대상체로는 임의의 개체, 예를 들어, 질환 또는 장애을 앓거나, 질환 또는 장애 진단을 받았거나, 질환 또는 장애가 발병할 위험이 있거나, 질환 또는 장애를 앓은 적이 있고, 질환 또는 장애가 재발할 위험이 있거나, 질환 또는 장애에 대한 제제로 치료를 받았고, 이러한 치료에 대해 반응하지는 못하였거나, 또는 질환 또는 장애에 대한 제제로 치료를 받았지만, 이러한 치료에 대한 초기 반응 후 재발된 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
면역조절 방법을 이용한 치료에 적합한 대상체로는 자가면역 장애를 앓는 개체; 기관 또는 조직 이식체 수혜자 등인 개체; 면역손상된 개체; 및 병원체로 감염된 개체를 포함한다.
예시적인 구현예
본 예시적인 구현예 섹션에서 본원에 제공된 예시적인 양태들 및 구현예가 제공되고, 본 명세서 전체에 걸쳐 추가로 논의된다. 간략화 및 편의를 위해, 개시된 양태들 및 구현예 모두 및 개시된 양태들 및 구현예의 가능한 조합 모두는 본 섹션에 열거되지 않는다. 이 전체 개시내용에서 논의된 바와 같이, 많은 양태에 대한 특정 구현예인 구현예가 제공되는 것으로 이해될 것이다. 본원의 전체 개시 내용을 고려하여, 이하 또는 이러한 전체 개시내용에서 인용된 임의의 개별적 구현예는 양태에 첨가될 수 있는 추가의 요소가 존재하는 경우 또는 양태에 이미 존재하는 요소에 대한 더 협소한 요소이기 때문에 이하 또는 이러한 전체 개시내용에 인용된 임의의 양태와 결합될 수 있음이 의도된다. 이러한 조합은 이 상세한 설명의 다른 섹션에서 더 자세한 사양을 논의한다.
한 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 제공되며,이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는
A. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 하나 이상의 전사 단위; 및
B. 표면 상의 슈도타입화 요소 및 활성화 요소(예: NK 세포 활성화 요소 또는 예시적인 구현예에서 T 세포 활성화 요소)로서, 상기 활성화 요소가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에서 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 슈도타입화 요소 및 활성화 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 제공되며, 여기서 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩한다. 제한되지 않지만, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 조절 요소, CAR 및 기타 요소와 같은 이러한 입자에 대한 다양한 구현예가 본 섹션 및 본 개시내용에서 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공되며, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 키메라 림프증식성 요소, 예를 들어, 구성적으로 활성인 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩한다. 예시적인 구현예에서, 키메라 림프증식성 요소는 그의 동족 수용체에 결박되거나 그의 동족 수용체의 단편에 결박된 사이토카인을 포함하지 않는다. 제한되지 않지만, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 조절 요소, CAR 및 기타 요소와 같은 이러한 입자에 대한 다양한 구현예가 본 섹션 및 본 개시내용에서 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서,
A. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
B. 표면 상의 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소로서, 상기 T 세포 활성화 요소가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않고, 상기 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc 항체인, 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가본원에 제공된다. 제한되지 않지만, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 조절 요소, CAR 및 기타 요소와 같은 이러한 입자에 대한 다양한 구현예가 본 섹션 및 본 개시내용에서 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서,
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 이에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 및 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현이 조절 요소에 의해 조절되는, 폴리뉴클레오타이드; 및
C. 표면 상의 활성화 요소로서, 상기 활성화 요소가 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 활성화 요소를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 제한되지 않지만, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 조절 요소, CAR 및 기타 요소와 같은 이러한 입자에 대한 다양한 구현예가 본 섹션 및 본 개시내용에서 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입함으로써 제조된 T 세포 또는 NK 세포와 같은 유전자 변형된 림프구가 본원에 제공되고, 상기 접촉 단계는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시킴으로써 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산한다. 하나의 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상에 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상에 막-결합된 T 세포 활성화 요소를 포함한다. 제한되지 않지만, 접촉 시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 세포에 대한 다양한 구현예가 본 섹션 및 본 개시내용에서 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 또는 NK 세포를 유전자 변형시키기 위한 키트를 제조하는데 있어서 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공되고, 상기 키트의 용도가 본원에 제공된 임의의 방법 양태 및 구현예의 단계를 포함한다. 예를 들어, 또 다른 양태에서, T 세포 또는 NK 세포를 유전자 변형시키기 위한 키트를 제조하는 데 있어서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공되며, 상기 키트의 용도는 생체외 T 세포 또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면 상의 슈도타입화 요소 및 전형적으로 표면 상의 T 세포 활성화 요소를 포함하며, 상기 접촉 단계는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 T 세포 또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시킴으로써 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 요소는 막 결합될 수 있다. 예시적인 구현예에서, T 세포 활성화 요소는 T 세포 수용체 관련 수용체 복합체를 통해 T 세포를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 접촉은 범위의 하단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 동안, 범위의 상단에서 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 21 및 24시간 동안, 예를 들어, 1 내지 12시간 동안 또는 1 내지 5시간 동안 수행될 수 있다. 본원의 이러한 용도 양태 및 다른 용도 양태에서, 키트를 제조하는데 사용하기 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태 및 구현예를 포함할 수 있다. 제한되지 않지만, 다른 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 다른 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 접촉시키는 단계를 포함하는, 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포, 전형적으로 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키기는 방법이 본원에 제공되고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 전형적으로 그 표면 상에 슈도타입화 요소를 포함하고, 상기 접촉 단계(접촉 조건하에서 배양하는 것으로 고려될 수 있음)는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시킴으로써 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성한다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 결합시킬 수 있으며, 전형적으로 그 자체로 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 다른 단백질(들)과 함께 막 융합을 촉진시킨다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 수용체 관련 복합체를 통해 T 세포를 활성화시키는 T 세포 활성화 요소와 같은 활성화 요소를 포함한다. 이러한 활성화 요소는 항-CD3 항체, 예를 들어, 항-CD3 scFv 또는 항-CD3 scFvFc일 수 있다. 다양한 예시적이고 예시적인 접촉시간이 본원에 제공된다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 생체외 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 림프구를 유전자 변형시키고/시키거나 형질도입하는 방법으로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면 상의 슈도타입화 요소 및 표면 상의 막-결합 T 세포 활성화 요소를 포함하고, 상기 접촉이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 림프구의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 림프구를 생산하는, 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 막-결합 T 세포 활성화 요소는 항-CD3 항체, 예를 들어, 항-CD3 scFv 또는 항-CD3 scFvFc이다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
본원의 또 다른 양태에서, 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 휴지 림프구를 형질도입하는 방법으로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 결합시킬 수 있고, 이에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 표면 상의 슈도타입화 요소를 포함하며, 상기 접촉이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성시키는, 방법이 제공된다. 이러한 양태의 예시적인 구현예에서, 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 10%, 20% 또는 25%, 또는 10% 내지 70%, 10% 내지 50%, 또는 20% 내지 50%의 T 세포 및/또는 NK 세포가 공정의 결과로서 형질도입된다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
본원의 또 다른 양태에서, 단리된 혈액으로부터 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입하는 방법으로서,
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리시키는 단계;
C. 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 결합할 수 있고 이에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 그들의 표면 상의 슈도타입화 요소를 포함하고, 상기 접촉이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포의 적어도 5%의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계를 포함하는, 방법이 제공된다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
전형적으로, 패키징 세포주는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 현탁액 세포주일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 패키징 세포주는 무혈청 배지에서 성장시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구는 대상체로부터 유래될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프구는 환자의 혈액으로부터 유래될 수 있다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 림프구를 형질도입하는 방법으로서,
A. 패키징 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 성분을 포함하는 벡터 그룹으로 형질감염시키는 단계로서, 상기 패키징 세포가 무혈청 배지 중 현탁액에서 성장시키는, 단계;
B. 무혈청 배지로부터 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 수확하는 단계; 및
C. 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
다른 양태에서, 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입하는 방법으로서,
A. 무혈청 배지 중의 현탁액에서 패키징 세포를 배양하는 단계로서, 상기 패키징 세포가 상기 복제 불능 레트로바이러스 입자의 패키징 가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드 및 슈도타입화 요소을 코딩하는 핵산 서열를 포함하는, 단계;
B. 무혈청 배지로부터 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 수확하는 단계; 및
C. 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시켜 림프구를 형질도입시키는 단계로서, 상기 접촉 단계가 12시간 미만 동안 수행되는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
제한되지 않지만, 다른 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 형질감염된/유전자 변형된 세포 퍼센트, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 다른 구현예가 본원에 제공된다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 예시적인 구현예에서, 패키징 세포는 패키징 가능한 RNA 게놈을 코딩하는 내부에 안정하게 통합된 DNA 핵산을 포함하는 불멸화된 세포이다. 일부 구현예에서, gag 폴리펩타이드 및 pol 폴리펩타이드는 하나 이상의 유도성 프로모터로부터 발현되며, 상기 방법은 배양 동안 교차활성인자를 첨가하여 하나 이상의 유도성 프로모터로부터 gag 폴리펩타이드 및 pol 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 제한되지 않지만, 접촉시간, 림프증식성 요소, 활성화 요소, 조절 요소 및 기타 요소와 같은 이러한 방법에 대한 다양한 구현예가 본원에 제공된다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프구, 예를 들어, T 림프구를 유전자 변형시키고/시키거나 형질도입하기 위한, 림프구, 예를 들어, T 림프구를 유전자 변형시키고 확장하기 위한, 또는 본원에서 세포 요법 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 접촉 단계는 범위의 하단에서 15, 30 또는 45분 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 동안 및 범위의 상단에서 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 및 72시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 접촉 단계는 2 내지 24시간, 2 내지 20시간, 2 내지 6시간, 1 내지 20시간, 1 내지 12시간, 1 내지 4시간, 4 내지 12시간, 또는 4 내지 8시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, PBMC, NK 세포 및 예시적인 구현예에서 T 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계는 본원에 제공된 임의의 방법, 생성물을 생산하는 방법 또는 언급하지 않는 한 또는 가장 광범위한 양태에서 다르게 언급되는 이들의 용도에서 1 내지 24시간, 예를 들어, 1 내지 12시간, 1 내지 6시간 동안 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 24시간 미만, 예를 들어, 12시간 미만, 8시간 미만, 또는 4시간 미만 동안 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 접촉 단계는 1 내지 14시간, 1 내지 12시간, 1 내지 6시간, 1 내지 4시간, 또는 2 내지 14시간 동안 수행된다. 이러한 방법은 사전 활성화없이 수행될 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프구, 예를 들어, NK 세포 또는 예시적인 구현예에서 T 세포를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키기 위한 공정 양태에 의한 임의의 상기 방법, 용도 또는 생성물의 추가의 구현예는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 림프증식성 요소, CAR, 슈도타입화 요소, 리보스위치, 활성화 요소, 막-결합 사이토카인, miRNA 및/또는 본원에 개시된 다른 요소의 임의의 구현예를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 본원에 제공된 임의의 방법, 키트, 용도 또는 조성물(예: 폴리뉴클레오타이드, 패키징 세포 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자)에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자(들)는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 표면 상의 활성화 요소를 포함하거나 추가로 포함한다. 전형적으로, T 세포 활성화 요소와 같은 활성화 요소는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 휴지 T 세포 또는 휴지 NK 세포를 인용하는, 본원에 제공된 임의의 방법, 키트, 용도 또는 조성물(예: 폴리뉴클레오타이드, 패키징 세포, 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자)에서, 특정 예시적인 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 전형적으로, 본원에 제공되는 임의의 방법, 키트, 용도 또는 조성물(예: 폴리뉴클레오타이드, 패키징 세포 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자) 중 재조합 레트로바이러스 입자는 복제 불능, 즉 복제할 수 없다. 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스는 복제 불능 또는 복제 결함 HIV 렌티바이러스와 같은 렌티바이러스이다. 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 복제 불능 또는 복제 결함 HIV 렌티바이러스 입자와 같은 렌티바이러스 입자이다. 따라서, 본원에 제공된 임의의 방법, 키트, 용도 또는 조성물(예: 폴리뉴클레오타이드, 패키징 세포 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자)의 예시적인 구현예에서, 이미 인용되지 않았거나 또는 이미 다르게 인용되지 않은 경우, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이고/이거나 유전자 변형된 세포는 유전자 변형된 T 세포이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 본원에 제공된 임의의 양태의 예시적인 구현예에서, 림프구는 T 세포 및/또는 NK 세포일 수 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포일 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프구를 형질도입하고, 유전자 변형시키고 확장시키기 위한, 또는 본원에서 입양 세포 요법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 10% 내지 75%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 10% 내지 25%, 또는 20% 내지 75%, 또는 20% 내지 50%, 또는 적어도 10%, 20%, 또는 25%의 휴지 T 세포가 형질도입되고, 0% 내지 75%의 NK 세포가 형질도입된다. 다른 구현예에서, 5% 내지 80%, 또는 10% 내지 80%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 10% 내지 25%, 또는 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 50%의 휴지 NK 세포가 형질도입된다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프구를 유전자 변형시키고 확장시키거나, 본원에서 입양 세포 요법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태, 또는 본원에 제공된 유사한 방법 또는 임의의 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 조절 요소에 의해 조절된다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원의 임의의 방법, 용도, 공정에 의한 제품 또는 조성물 양태에서, 이러한 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및/또는 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 구현예에서, CAR 및/또는 림프증식성 요소의 발현은 각각에 대한 조절 요소 또는 상이한 조절 요소의 제어하에 있다. 일부 구현예에서, CAR 및 림프증식성 요소는 동일한 폴리펩타이드 상에서 발현될 수 있고, 예시적인 구현예에서 CAR 및 림프증식성 요소는 별도의 폴리펩타이드로서 발현된다. 일부 구현예에서, CAR은 MRB CAR이다. 일부 구현예에서, 키메라 림프증식성 요소는 구성적으로 활성, 예를 들어, 구성적으로 활성인 키메라 사이토카인 수용체이다. 이러한 구현예에서, 구성적으로 활성인 키메라 사이토카인 수용체는 조절 요소의 제어하에 있을 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및/또는 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 코작 관련 서열, WPRE 요소 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈과 같은 다중 정지 서열을 추가로 포함할 수 있되, 이중 정지 코돈 또는는 삼중 정지 코돈의 정지 코돈 중 하나 이상은 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나로부터 판독 종결을 정의한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 CCACCAT/UG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G) 또는 GCCGCCACCAT/U(G)로부터 선택된 코작형 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산 서열의 개시 코돈에 대한 -3 및 +4 뉴클레오타이드는 모두 G를 포함한다. 코작형 서열을 포함하는 선행 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 하기 구현예와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE 요소는 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5' 내지 3' LTR에 위치한다. 선행 구현예(즉, 폴리뉴클레오타이드가 코작형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE를 포함하는 구현예) 중 어느 하나 또는 모두와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈인 하나 이상의 정지 코돈으로 종결된다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법, 용도 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 림프증식성 요소는 키메라 림프증식성 요소일 수 있다. 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 본원의 임의의 구현예에서, 상기 키메라 림프증식성 요소는 키메라 사이토카인 수용체일 수 있다. 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 임의의 구현예에서, 상기 키메라 림프증식성 요소는 IL-7 수용체 알파에 결박된 IL-7 또는 IL-7 수용체 알파에 결박된 IL-7 이외의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진하는 능력을 보유하는 IL-7 수용체 알파 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하며, 상기 키메라 사이토카인 수용체는 구성적으로 활성이다. 일부 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 IL-7에 결합할 수 있는 IL-7 수용체의 기능적 세포외 단편, IL-7 막관통 도메인 및 IL-7 신호전달 도메인에 공유 결합된 IL-7을 포함한다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 상기 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 본원의 임의의 양태 또는 구현예에서, 상기 키메라 림프증식성 요소는 키메라 사이토카인 수용체 이외의 것일 수 있다. 림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 키메라 림프증식성 요소는 키메라 사이토카인 수용체일 수 있다. 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 IL-7 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-15/IL-2 수용체, 예를 들어, IL-15/IL-2베타 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-23 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-27 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 유인 수용체 또는 CD28의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 사이토카인 수용체는 IL-7 수용체에 융합된 IL-7을 포함한다.
다르게 언급되지 않거나 이미 광범위한 양태로 언급되지 않는 한, 림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공되는 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 림프증식성 요소는 T 세포 생존 모티프를 포함할 수 있다. T 세포 생존 모티프는 IL-7 수용체, IL-15 수용체 또는 CD28의 전부 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 폴리펩타이드, 또는 신호전달 도메인을 포함하는 이의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 림프증식성 요소는 인터류킨 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 림프증식성 요소는 링커를 통해 공유 결합된 그의 동족 인터류킨 수용체 폴리펩타이드의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족 인터류킨 수용체의 이 부분은 인터류킨 사이토카인 및 막관통 도메인을 결합할 수 있는 세포외 도메인의 기능적 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 동족 인터류킨 수용체의 세포내 부분이다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 IL-15, IL-7 및 예시적인 구현예에서 IL-2와 같은 외인성 사이토카인에의 림프구의 노출 부재하 및 6, 7, 14, 21, 또는 35일 이상 동안 배양 동안 림프구에 의해 발현된 CAR의 ASTR에 대한 표적의 부재하의 배양물에서 림프구 증식 및 임의로 생체외 또는 시험관내 생존을 촉진할 수 있는 상이한 사이토카인 수용체의 세포내 부분이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 링커를 통해 이의 전장 동족 인터류킨 수용체 폴리펩타이드에 공유 결합된 인터류킨 폴리펩타이드이다. 대안적으로, 림프증식성 요소는 IL-7 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-23의 세포내 신호전달 도메인, IL-27의 세포내 신호전달 도메인, IL-15 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인 또는 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 유인 수용체의 세포내 신호전달 도메인일 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 일부 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성이다. 또한, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성인 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 구성적 활성 단편을 추가로 포함할 수 있는 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소 또는 키메라 사이토카인 수용체는 IL7 InsPPCL 돌연변이체를 포함한다. 양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 림프증식성 요소를 포함하는 임의의 양태에서, 림프증식성 요소는 본원의 림프증식성 요소 섹션에 인용된 임의의 CLE일 수 있다. 예를 들어, 예시적인 구현예에서, CLE는 본원의 실시예와 관련하여 특히 주목할 만하고/하거나 상위 작제물(Top Constructs)로서 구체적으로 언급된 유전자로부터의 도메인을 포함한다.
특정의 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 Jak/STAT5 경로를 활성화시키는 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 수용체 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 이러한 림프증식성 요소는 IL21R, IL27R, IL31RA, LIFR 및 OSMR의 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 실시예 17 및 18의 실험 및 표 7 내지 17에 나타낸 바와 같이, 이러한 유전자의 세포내 도메인을 포함하는 키메라 림프증식성 요소는 외인성 사이토카인, 예를 들어, IL-2의 부재하에 배양된 PBMC에서 최고 규모의 증식을 유도하는 후보 키메라 폴리펩타이드 중에서 발견되었다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 인터류킨 또는 인터류킨 수용체이고, 실시예 17 및 18(표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B 및/또는 4.1B에서 동정된 상위 작제물의 일부인 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 수용체이고, 실시예 17 및 18(표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B 및/또는 4.1B에서 동정된 상위 작제물인 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함하고, 실시예 17 및 18(표 7 내지 17)의 라이브러리 1A, 1.1A, 2B, 2.1B, 3A, 3.1A, 3B, 3.1B, 4B 및/또는 4.1B에서 동정된 상위 작제물의 일부인 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18(표 19 내지 표 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 IL7R, IL12RB1, IL15RA 또는 IL27RA로부터의 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18(표 19 내지 표 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, GHR, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL1RL1, IL2RA, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17RB, IL18R1, IL18RAP, IL20RB, IL22RA1, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함하고, 실시예 17 및 18(표 19 내지 표 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGR2A 또는 FCGR2C로부터의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 세포내 도메인만을 갖는 작제물에서 활성인 것으로 실시예 17 및 18에서 제시된 본 단락의 림프증식성 요소는 둘 이상의 세포내 도메인, 또는 예시적인 구현예에서 단일 세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소의 세포내 도메인일 수 있고, 즉 림프증식성 요소는 2개 이상의 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소의 세포내 도메인은 단일 세포내 신호전달 도메인(표 22 및 23)으로서 실시예 18에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, MYD88, TNFRSF14 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소의 세포내 도메인은 실시예 18(표 22 및 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 IL7R 또는 IL12RB1로부터의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소의 세포내 도메인은 사이토카인 수용체일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 단일 세포내 도메인을 갖는 림프증식성 요소의 사이토카인 수용체는 실시예 18(표 22 및 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL3RA, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA2, IL18RAP, IL31RA, MPL, TNFRSF14 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소의 세포내 도메인은 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의 ITAM 모티프를 포함하는 림프증식성 요소의 세포내 도메인은 실시예 18(표 22)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 FCGR2A로부터의 도메인을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 17 및 18(표 19 내지 23)에 상술된 바와 같은 초기 스크린 및 반복 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 나타내는(즉, 최고 수준의 증식을 유도함) 작제물에 존재하는 CD27, CD28, OX40 (TNFRSF4로도 지칭됨), GITR(TNFRSF18로도 지칭됨) 또는 HVEM(TNFRSF14로도 지칭됨)으로부터의 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 작제물 M024-S190-S047, M025-S050-S197, M036-S170-S047, M012-S045-S048, M049-S194-S064, M025-S190-S050, M025-S190-S05, E013-T041-S186-S051, E013-T028-S186-S051, E014-T015-S186-S051, E011-T016-S186-S050, E011-T073-S186-S050, 또는 E013-T011-S186-S211 중의 하나일 수 있고, 이들 모두는 실시예 21(도 35 및 도 36)에 나타낸 바와 같이, 형질도입 후의 휴지 림프구의 증식을 자극한다. 특정 구현예에서, 림프증식성 요소는 CSF3R, IL3RA, ICOS, CRLF, CSF2RA, LIFR 또는 CD40으로부터의 세포외 도메인; MyD88, CD40 또는 MPL로부터의 제1 세포내 도메인, 및/또는 CD27 또는 MyD88로부터의 제2 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 22(도 38a 및 b)에 도시되고 분석된 바와 같이 UCHT1scFvFc-GPI를 나타내는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입시킨 후 휴지 림프구의 증식을 자극하는 작제물 E013-T041-S186-S051일 수 있다. 다른 구현예에서, 림프증식성 요소는 실시예 22에 도시되고 분석된 바와 같이 IL7-IL7RA-IL2RB이다.
라이브러리 1A 및 1.1A에 대해 실시예 17에서 상세화된 바와 같이, CD27, IL1RL1, IL6R, IL31RA, TNFRSF4 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A 및 1.1A 둘 다에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(즉, 최고 수준의 증식을 유도함)(표 19).
라이브러리 2B 및 2.1B에 대해 실시예 17에 상세화된 바와 같이, 사이토카인 수용체 CD40, FCER1G, FCGR2C, IFNGR2, GHR, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RB, IL22RA1, TNFRSF14 또는 TNFRSF9로부터의 도메인을 갖는 작제물은 두 라이브러리 2B 및 2.1B에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(즉, 최고 수준의 증식을 유도함)(표 20).
라이브러리 3A 및 3.1A에 대해 실시예 18에 상세화된 바와 같이, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CSF2RA, FCGR2A, MPL, OSMR, TNFRSF4 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 두 라이브러리 3A 및 3.1A에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(즉, 최고 수준의 증식을 유도함)(표 21).
라이브러리 3B 및 3.1B에 대해 실시예 18에 상세화된 바와 같이, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCER1G, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR1, IFNAR2, IFNGR2, IL1RL1, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6R, IL7R, IL9R, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL18RAP, IL20RB, IL27RA, IL31RA, LEPR, MPL, OSMR, PRLR, TNFRSF4, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF14, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 두 라이브러리 3B 및 3.1B에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(즉, 최고 수준의 증식을 유도함(표 22).
라이브러리 4B 및 4.1B에 대해 실시예 18에서 상세화된 바와 같이, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2A, FCGR2C, IFNAR2, IFNGR2, IL1R1, IL2RA, IL3RA, IL2RG, IL6R, IL7R, IL10RB, IL11RA, IL31RA, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, MPL, OSMR, TNFRSF4, TNFRSF9, 또는 TNFRSF18로부터의 도메인을 갖는 작제물은 두 라이브러리 4B 및 4.1B에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(즉, 최고 수준의 증식을 유도함)(표 23).
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 기술되지 않는 한, 림프증식성 요소, 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 PBMC를 포함하는 방법, 용도, 조성물 및 공정에 의한 제품 양태와 같은 본원에 개시된 임의의 양태 및 구현예에서, 림프구 또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 IL-15, IL-7, 및 예시적인 구현예에서 IL-2와 같은 사이토카인 및 6, 7, 14, 21 또는 35일 이상 동안 세포에 의해 발현된 CAR의 ASTR에 대한 표적에의 세포의 노출 부재하에 배양물에서 림프구 증식/확장 및 임의로 생체외 또는 시험관내 생존을 촉진할 수 있다. CAR 및 림프증식성 요소를 포함하여 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 CAR에 의해 인식되는 표적에 노출되지 않고 마우스에서 생체내에서 생착할 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 기술되지 않는 한, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자(들)를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상에 활성화 요소를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 T 세포 수용체 관련 복합체를 통해 T 세포를 활성화시킨다. 일부 경우에, 활성화 요소는 T 세포만 활성화시킬 수 있다. 다른 경우에, 활성화 요소는 T 세포를 추가로 활성화시키기 위해 TCR 수용체 복합체를 통한 활성화를 필요로 한다. 따라서, 일부 구현예에서 활성화 요소는 다음을 포함한다:
A. CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드; 및/또는
B. CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드.
또한, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합될 수 있는 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드이고, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 가능한 폴리펩타이드 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD80의 세포외 도메인과 같은 Akt의 CD28-매개된 활성화를 유도할 수 있는 CD80, CD86 또는 이의 기능적 단편이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않는 한, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자이거나 이를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 scFv 또는 항-CD3 scFvFc와 같은 CD3에 결합할 수 있는 막 결합된 폴리펩타이드일 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 및 항-CD3을 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 항-CD3은 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 항-CD3 scFvFc일 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv일 수 있으며, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 CD80 또는 이의 세포외 도메인일 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상에 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv, CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 CD80 또는 이의 세포외 도메인, 및 IL-7 또는 이의 활성 단편의 융합 폴리펩타이드, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF를 포함할 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, IL-7 또는 이의 활성 단편, 및 DAF 융합체, 항-CD3 scFV 및 CD80 또는 이의 세포외 도메인은 각각 DAF 신호 서열을 포함한다.
달리 언급되지 않거나 가장 광범위한 양태에서 이미 언급되지 않는 한, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자(들)이거나 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자(들)를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상에 막-결합된 사이토카인을 포함할 수 있다. 막-결합된 사이토카인은 IL-7, IL-15 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 다른 구현예에서, 막-결합된 사이토카인은 IL-7 또는 이의 활성 단편과 DAF의 융합 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 DAF 신호 서열 (서열번호 286의 뉴클레오타이드 1-34), 그의 신호 서열 없는 IL-7(서열번호 286의 뉴클레오타이드 35-186), 및 GPI 앵커 부착 서열(서열번호 286의 뉴클레오타이드 187-532)을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물 양태의 예시적인 구현예에서, 슈도타입화 요소는 하나 이상의 이종성 외피 단백질을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 슈도타입화 요소는 T 세포에 의해 인식되는 하나 이상의 바이러스 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않는 한, 조절 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 상기 조절 요소는 림프증식성 요소를 조절할 수 있으며, 상기 림프증식성 요소는 화합물의 부재하에 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는데 불활성이거나 덜 활성이고, 상기 화합물은 림프증식성 요소에 결합하고 림프증식성 요소의 활성을 유도하는 분자 샤페론이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않는 한, 조절 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 조절 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 조절 요소에 결합하는 화합물은 뉴클레오사이드 유사체이다. 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제는 아사이클로비르(아사이클로비르) 또는 펜사이클로비르(펜시클로비르)일 수 있다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않는 한, 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 그것은 ASTR를 포함하고, 상기 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 어느 하나 둘 다의 ASTR은 종양 관련 항원에 결합할 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 제2 조작된 폴리펩타이드의 항원 특이적 표적화 영역은 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역이다.
양태와 양립불가능하지 않거나 양태에 이미 언급되지 않은 경우, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자(들)를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 가장 넓은 양태에서 명백하게 언급되지 않는다면, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 단클론성 항체 승인된 생물학에 대한 인식 도메인을 코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 도메인은 키메라 항원 수용체와 동일한 전사체 상에서 발현되고, 인식 도메인은 리보좀 스킵핑 및/또는 절단 신호에 의해 키메라 항원 수용체로부터 분리된다. 리보좀 스킵핑 및/또는 절단 신호는 2A-1일 수 있다. 인식 도메인은 EGFR 또는 이의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 인식 도메인은 EGFR 항체에 의해 인식되고 본원에 제공된 다른 조절 기전으로서 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 EGFR 돌연변이일 수 있다. 관련된 구현예에서, 인식 도메인은 EGFR 또는 이의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
양태, 임의의 방법, 용도, 공정에 의한 제품과 양립불가능하지 않거나 이미 언급되지 않은 경우, 상기 방법은 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 접촉시킨 후, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 재도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 접촉된 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포는 대상체의 혈액으로부터 유래하고, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장은 대상체 내에서 생체내 발생한다. 특정 구현예에서, 혈액 수집 단계와 유전자 변형 T 세포 및/또는 NK 세포를 재도입하는 단계 사이의 단계는 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간 또는 4시간 이하로 수행된다. 다른시간이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 대상체는 접촉 수행 7일 이내, 접촉 중 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 재도입된 후 7일 이내에 림프결핍성 제제에 노출되지 않는다.
한 양태에서, 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포), 예시적인 구현예서 휴지 림프구(예: 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포)를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키는 방법이 본원에 제공되고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상의 슈도타입화 요소와 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 결합하고 이에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진할 수 있는 그들의 표면 상의 막 결합된 항-CD3 scFvFc 항체를 포함하며, 상기 접촉은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생산한다.
하나의 양태에서, 단리된 혈액으로부터 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질전환하고/하거나 유전자 변형시키는 방법으로서, 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계; 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리하는 단계; 및 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 효과적인 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 그들 표면 상에 슈도타입화 요소 및 그들 표면 상의 막 결합된 항-CD3 scFvFc 항체를 포함함으로써 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성시켜 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는, 방법이 본원에 제공된다.
막-결합된 항-CD3 scFvFc 항체를 포함하는 T 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포)를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키는 본원의 양태에서, 특정 구현예에서 슈도타입화 요소는 소포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G)이다. 일부 구현예에서, 복제 불능 레트로바이러스 입자는 CD28에 결합할 수 있는 막 결합된 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 이는, 예를 들어, CD80의 세포외 도메인, CD86, 또는 CD28에 결합하는 능력을 보유하는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 scFvFc 항체는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 scFvFc 항체는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다.
막 결합된 항-CD3 scFvFc 항체를 포함하는 T 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포)를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키는 본원의 양태에서, 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있고, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막 결합된 폴리펩타이드는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 scFvFc 항체는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다.
또 다른 양태에서, 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 휴지 림프구를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키는 방법이 본원에 제공되며, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면 상에 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상에 CD28에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드가 아니라 그들의 표면 상에 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 접촉은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성시킨다.
또 다른 양태에서, 단리된 혈액으로부터 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키는 방법으로서, 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계; 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 단리하는 단계; 및 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 유효시간 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 그들의 표면 상에 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상에 CD28에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드가 아니라 그들의 표면 상에 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하여 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성시킴으로써 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는, 방법이 본원에 제공된다.
표면 상에서 CD28에 결합하고 CD28을 활성화시킬 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드가 아니라 표면 상에서 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하는 휴지 T 림프구를 형질도입하고/하거나 유전자 변형시키기 위한 본원의 양태에서, 슈도타입화 요소는, 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 항-CD3 scFvFc 항체이며, 이는 일부 구현예에서 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 이러한 양태의 일부 구현예에서, 접촉은 적어도 2시간 동안, 또는 2시간 내지 24시간, 또는 2시간 내지 6시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 마커는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 게놈에 의해 코딩되고 형질도입 후 T 세포 및/또는 NK 세포에서 검출된다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막 결합된 폴리펩타이드는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다. 일부 구현예에있어서, 검출 가능한 마커는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 게놈에 의해 코딩되고, 형질도입 후에 T 세포 및/또는 NK 세포에서 검출된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소; T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 표면 상의 슈도타입화 요소 및 표면 상의 활성화 요소로서, 상기 활성화 요소가 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않으며, 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc 항체인, 그의 표면 상의 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상의 활성화 요소를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진할 수 있는 하나 이상의 슈도타입화 요소;
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 그의 표면 상의 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상의 활성화 요소로서, 상기 활성화 요소가 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않으며, 상기 활성화 요소가 그 표면 상에서 CD28에 결합하고 활성화시킬 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드가 아니라 그들의 표면 상에서 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드인, 그의 표면 상의 슈도타입화 요소 및 그의 표면 상의 활성화 요소를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
본원의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태의 일부 구현예에서, 상기 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위는 키메라 항원 수용체를 코딩한다. 이러한 양태의 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다. 이러한 양태의 일부 구현예에서, 항-CD3 scFvFc 항체는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는다.
예를 들어, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에 존재하는 활성화 요소를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것들과 같은 본원의 임의의 양태 및 구현예에서, 상기 활성화 요소는, 예를 들어, CD28 또는 예시적인 구현예에서 CD3을 결합할 수 있는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 이량체화 제제의 부재하에 활성일 수 있는 이량체화 모티프를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 단일 쇄 항체일 수 있고, 이량체화 모티프는 류신 지퍼 폴리펩타이드, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, 및 Cd324 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 및/또는 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에 존재하는 활성화 요소를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것들과 같은 본원의 임의의 양태 및 구현예에서, 상기 활성화 요소는, 예를 들어, CD28 또는 예시적인 구현예에서 CD3을 결합할 수 있는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 이량체화 제제의 존재하에 활성일 수 있는 이량체화 모티프를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 요소는 항-CD3 단일 쇄 항체일 수 있고, 이량체화 모티프는 FKBP 및 라파마이신 또는 이의 유사체, GyrB 및 코우메르마이신 또는 이의 유사체, DHFR 및 메토트렉세이트 또는 이의 유사체, 또는 DmrB 및 AP20187 또는 이의 유사체뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 인용된 이량체화 단백질의 돌연변이체 및/또는 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에 존재하는 활성화 요소를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것들과 같은 본원의 임의의 양태 및 구현예에서, 상기 활성화 요소는 항CD3-scFvFc-GPI 모이어티(UCHT1) 및 임의로 VSV-G를 추가로 포함할 수 있다.
상기 양태의 하나의 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 코작형 서열, WPRE 요소 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈을 추가로 포함하되, 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈인 하나 이상의 정지 코돈은 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나로부터의 판독 종결을 정의한다. 특정의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 CCACCAT/UG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G), 또는 GCCGCCACCAT/U(G)로부터 선택된 코작형 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산 서열의 개시 코돈에 대해 -3 및 +4 뉴클레오타이드 둘 다는 G를 포함한다. 코작형 서열을 포함하는 선행 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 하기 구현예와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE 요소가 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5' 내지 3' LTR에 위치된다. 선행하는 구현예(즉, 폴리뉴클레오타이드가 코작형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE를 포함하는 구현예) 중 어느 하나 또는 둘 다로 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈인 하나 이상의 정지 코돈으로 종결된다.
ASTR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태의 특정 구현예에서, 상기 ASTR은 항-태그 ASTR일 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 표적 세포 상의 표적 분자, 예를 들어, 표적 단백질에 결합하는 태그-접합된 항체를 추가로 포함할 수 있다.
B 세포, T 세포, 또는 NK 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예 및 양태에서, 상기 세포는 동종이계 세포일 수 있거나, 그것은 동종이계 세포 이외의 것일 수 있다.
본원에 개시된 임의의 양태 및 구현예에서, DNA의 PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포로의 도입 및 임의로 DNA의 숙주 세포 게놈으로의 도입은 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 이용하지 않는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 예로서 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스 또는 단순 포진 바이러스-1로부터 유래된 것들과 같은 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 양태 및 구현예는 비바이러스 벡터로 표적 세포를 형질감염시키고/시키거나 형질도입함을 포함할 수 있다. 표적 세포를 형질감염시키기 위한 비바이러스 벡터를 이용하는 본원에 개시된 임의의 이러한 구현예에서, 네이키드 DNA를 포함하는 비바이러스 벡터는 전기천공, 뉴클레오펙셔느 리포좀 제형, 지질, 덴드리머, 양이온성 중합체, 예를 들어, 폴리(에틸렌이민)(PEI) 및 폴리(l-리신)(PLL), 나노입자, 세포 침투 펩타이드, 미세주입 및/또는 비통합 렌티바이러스 벡터를 포함하는 방법을 사용하여, 예를 들어, PBMC, B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 표적 세포로 도입될 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, DNA는 관심 있는 유전자의 5' 및 3' 말단에 트래스포존 ITR 단편을 함유하는 플라스미드로서 표적 DAN의 공동-형질감염, 공동-뉴클레오펙션 또는 공동-전기천공에 의한 트랜스포존 기반 담체 시스템 및 트랜스포사제 담체 시스템을 사용하여 게놈으로 통합될 수 있다. 이러한 방법에 사용된 트랜스포사제 또는 다른 효소, 예를 들어, CRISPR 또는 TALEN은 DNA, mRNA 또는 단백질로서 표적 플라스미드로 형질감염시킬 수 있다.
또 하나의 양태에서, 각각
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 이의 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 상기 슈도타입화 요소가 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드, 및 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현이 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물을 결합하는 리보스위치에 의해 조절되는, 폴리뉴클레오타이드; 및
C. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면 상에서 발현되고; T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고; 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 폴리펩타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 본 양태의 예시적인 구현예에서, 리보스위치에의 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물의 결합은 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시킨다.
하나의 양태에서, 대상체의 림프구를 유전자 변형시키고 확장시키는 방법으로서,
A. 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않고,
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레 트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 이의 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 조절 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계;
B. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계; 및
C. 조절 요소에 결합하여 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현에 영향을 주고, 생체내 림프구의 확장, 생착 및/또는 지속을 촉진시키고/시키거나 강력하게 하는 화합물에 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 노출시켜 대상체의 림프구를 유전자 변형시키고 확장시키는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다.
림프구를 유전자 변형시키고 확장시키거나 본원의 세포 요법을 수행하기 위한 임의의 양태 및 임의의 방법 양태에서, 양태에서 인용되지 않았거나 양태와 양립불가능한 경우, 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 전사 단위를 추가로 포함한다.
또 하나의 양태에서, 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법으로서,
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 대상체의 생체외 혈액으로부터 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레 트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 이의 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 발현이 조절 요소에 의해 조절되는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 접촉이 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부가 유전자 변형되도록 하는, 단계; 및
C. 유전자 변형된 T 세포 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 재도입하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착 및/또는 지속이 대상체 내에서 생체내 발생하고, 혈액을 수집하는 단계와 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 재도입하는 단계 사이의 방법이 24시간 미만 동안 수행되어 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
본원의 또 하나의 양태에서, 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법으로서,
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구(PBMC)를단리시키는 단계;
C. 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 그들의 표면 상의 슈도타입화 요소를 포함하고, 상기 접촉이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
D. 상기 유전자 변형된 세포를 대상체로부터 혈액을 수집하는 24시간 이내에 대상체에 재도입하여 대상체에서 입양 세포 요법을 수행하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
림프구를 유전자 변형시키고 확장하기 위하거나 본원의 입양 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 상기 방법은 생체내 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 조절 요소에 결합하여 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 임의로 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현에 영향을 주고 생체내 림프구의 확장, 생착 및/또는 지속을 촉진시키는 화합물에 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
림프구를 유전자 변형 및 확장시키거나 본원의 입양 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 대상체에 도입되거나 재도입되기 전에 8, 7, 6, 5, 4, 3회 이하의 생체외 세포 분열을 경험한다.
림프구를 유전자 변형 및 확장시키거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 생체내에서 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착 및/또는 지속은 조절 요소에 결합하는 화합물의 존재 또는 부재에 의존하고, 예시적인 구현예에서, 조절 요소에 결합하는 화합물의 존재에 의존한다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 입양 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 상기 대상체는 접촉을 수행하는 7, 14 또는 21일 이내, 접촉 동안 및/또는 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 도입된 후 7, 14, 또는 21일 이내에 림프고갈제에 노출되지 않는다. 다른 구현예에서, 대상체는 접촉 동안 림프고갈제에 노출되지 않는다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포는 15분 내지 12시간 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시킨다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 입양 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 본 방법은 접촉 후 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 T 세포 및/또는 NK 세포로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 도입 또는 재도입 단계를 포함하는 방법에서, 분리는 도입 단계 전에 수행된다. 림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 상기 노출 단계는 상기 화합물의 용량을 접촉 전 또는 접촉 동안 및/또는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체에게 도입된 후에 투여하는 단계를 포함한다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 입양 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 상기 방법은 생체외 T 세포 및/또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키기 전에 대상체로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 혈액을 수집하는 단계를 포함하고, 상기 도입 단계는 재도입 단계이다. 예를 들어, 20 내지 250ml의 혈액이 대상체로부터 인출된다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 혈액이 대상체로부터 수집되는 시간과 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 재도입되는 시간 사이에 8, 12, 24 또는 48시간 미만이 경과한다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 혈액이 대상체로부터 수집되는 시간과 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체로 재도입되는 시간 사이에 범위의 하단에서 4 또는 8시간 및 범위의 상단에서 12, 24, 36 또는 48시간이 경과한다.
특히 대상체가 암을 갖는 경우, 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 경우, 대상체에게 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는 본원에 제공된 양태 및 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 면역 체크포인트 억제제를 대상체에게 전달하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
림프구를 유전자 변형 및 확장하거나 본원의 세포 요법, 또는 유사한 방법을 수행하기 위한 임의의 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 명백하게 인용되지 않으면, 혈액이 수집된 후 및 혈액이 재도입되기 전 모든 단계가 사람이 프로세싱 전반에 걸쳐 폐쇄 시스템을 모니터링하는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 혈액이 수집된 후 및 혈액이 재도입되기 전에 대상체와 동일한 방에 잔류하는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
하나 이상의 전사 단위 또는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 가장 광범위한 양태에서 인용되지 않으면, 전사 단위 중 하나 또는 조작된 신호전달 폴리펩타이드 중 하나는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR) 및 ASTR을 림프증식성 요소에 연결시키는 막관통 도메인을 코딩하거나 포함하거나 또는 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 ASTR은 제1 종양 항원에 결합할 수 있고, 존재하는 경우, 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 ASTR은 제2 종양 항원에 결합할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다. 또한, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 스토크(stalk)를 추가로 포함한다. 또한, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 세포내 활성화 도메인을 추가로 포함한다. 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드 상의 세포내 활성화 도메인은 CD3 제타로부터 유래될 수 있다. 림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 MPL을 포함할 수 있거나, MPL, 또는 MPL의 막관통 및/또는 세포외 도메인을 포함하거나 포함하지 않고 MPL의 세포내 도메인의 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%를 포함하고/하거나 MPL의 막관통 및/또는 세포외 도메인을 포함하거나 포함하지 않고 MPL의 세포내 도메인과 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 서열 동일성을 갖는 변이체 및/또는 단편을 포함하는 이의 변이체 및/또는 단편을 포함할 수 있고, 상기 변이체 및/또는 단편은 PBMC, 일부 구현예에서 T 세포의 세포 증식을 촉진하는 능력을 보유한다.
림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 또는 조성물에서, 림프증식성 요소는 STAT5 경로를 자극하거나 SOCS 경로를 억제하는 억제성 RNA 분자, 예를 들어, miRNA 또는 shRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 억제성 RNA 분자는 ABCG1, SOCS, TGFbR2, SMAD2, cCBL 및 PD1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 핵산에 결합할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 또는 형질도입된 세포, 또는 이를 포함하는 방법의 예시적인 구현예에서, 이러한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 또는 형질도입된 세포는 인트론 내에서 2개 이상의 억제성 RNA 분자, 예를 들어, miRNA 또는 shRNA, 일부 구현예에서, 하기 표적 내인성 T 세포 발현 유전자 중 하나 이상을 코딩하는 핵산에 결합하는 1, 2, 3 또는 4개의 억제성 RNA 분자를 코딩할 수 있다: PD-1; CTLA4; TCR 알파; TCR 베타; CD3 제타; SOCS; SMAD2; miR-155; IFN 감마; cCBL; TRAIL2; PP2A; 또는 ABCG1. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 다음 중 어느 하나를 표적화하는 miRNA의 조합이 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 또는 형질도입된 세포의 게놈에 포함될 수 있다: TCR 알파, CD3 제타, IFN 감마 및 PD-1; 및 또 다른 구현예에서 SOCS1, IFN 감마, TCR 알파 및 CD3 제타.
본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 포유동물 세포 및/또는 패키징 세포는 Vpu 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. Vpu 폴리펩타이드는, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 일부 구현예에서는, 특히 패키징 세포에서, 막 결합된 Vpu 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 포유동물 세포 및/또는 패키징 세포는 Vpu 폴리펩타이드 및 Vpx 폴리펩타이드 모두를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자, 포유동물 세포 및/또는 패키징 세포는 Vpx 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. Vpx 폴리펩타이드는, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드일 수 있고, 일부 구현예에서는, 특히 패키징 세포에서, 막 결합된 Vpx 폴리펩타이드일 수 있다.
본원에 제공된 임의의 방법 또는 조성물에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 수포상 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G), 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양친매성 외피 단백질 또는 온코레트로바이러 스성 동종지향성 외피 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에서 제공되고, 상기 T 세포 또는 NK 세포는 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 변형된다.
또 다른 양태에서, T 세포 또는 NK 세포의 표면 상의 슈도타입화 요소 및 T 세포 또는 NK 세포의 표면 상의 활성화 요소를 포함하는 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포가 본원에 제공되고, 상기 T 세포 또는 NK 세포는 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 변형된다.
또 다른 양태에서,
A. 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드; 및
B. 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 IL-2의 부재하에 생체외 배양에서 생존할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 키메라 사이토카인 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 키메라 사이토카인 수용체를 포함하지 않는다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 상기 프로모터는 구성적으로 활성이거나 또는 제1 교차활성인자 또는 제2 교차활성인자에 의해 유도성이다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있고, 상기 프로모터는 제2 교차활성인자에 의해 유도성이다. 제1 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현을 유도하기 위해 본원에서 사용되는 프로모터는 전형적으로 표적 세포, 예를 들어, 림프구, PBL, T- 세포 및/또는 NK 세포에서 활성이지만, 예시적인 구현예에서 패키징 세포주에서 활성이 아니다. 제2 교차활성인자는 표적 세포에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈, 일부 구현예에서 패키징 가능한 RNA 게놈의 발현은 제2 교차활성인자에 의해 조절된다.
또한, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3'로 다음을 포함할 수 있다:
1) 5' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편;
2) 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
3) 제1 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및/또는 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하는 핵산 서열;
4) 표적 세포에서 활성인 프로모터; 및
5) 3' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편.
일부 구현예에서, 제1 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 패키징 및 조립을 위한 레트로바이러스 성분 및 5' LTR을 코딩하는 RNA에 대해 역 배향으로 존재한다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 제1 표적 폴리펩타이드는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함한다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 제2 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제2 표적 폴리펩타이드는 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
1) 제1 항원 특이적 표적화 영역;
2) 제1 막관통 도메인; 및
3) 제1 세포내 활성화 도메인.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 패키징 세포는 Vpu 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 포함할 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 패키징 세포는 Vpx 폴리펩타이드 및 Vpu 폴리펩타이드 모두를 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어, 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 포함할 수 있다. 패키징 세포일 수 있는 포유동물 세포는 293 세포일 수 있다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 패키징 세포는 Vpx를 코딩하는 핵산 서열을, 예를 들어, 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상, 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 포함할 수 있다. 패키징 세포일 수 있는 포유동물 세포는 293 세포일 수 있다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 패키징 시스템 양태 또는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는 방법을 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 제1 리간드는 라파마이신이고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신일 수 있거나, 제1 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신일 수 있고, 제2 리간드는 라파마이신일 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 제공되는 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입된 세포가 본원에서 제공된다. 세포는, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포와 같은 림프구일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 세포는 인간 세포이다.
하나의 양태에서, 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에서 확장시키는 방법으로서, 상기 방법이
A. 상기 대상체로부터 수득된 단리된 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 본원에 개시된 임의의 구현예의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계;
B. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 도입하는 단계; 및
C. 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 유효량을 상기 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 투여시 상기 대상체에서 증식하여 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에서 확장시키는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착 및/또는 지속을 정지시키는 방법으로서, 상기 방법이
A. 상기 대상체로부터 수득된 단리된 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 본원에 개시된 임의의 구현예의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계;
B. 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 도입하는 단계;
C. 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 유효량을 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키는 단계로서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 투여시 상기 대상체에서 증식하여 대상체에서 변형된 PBL을 확장시키는, 단계; 및
D. 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로 비르 프로드럭의 투여를 중단시키는 단계로서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 투여 중단시 상기 대상체에서 증식을 정지하여 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 확장 및/또는 지속을 제어하는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
A. 상기 대상체로부터 수득된 단리된 T 세포 및/또는 NK 세포를 본원에 개시된 임의의 구현예에 따른 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계;
B. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에 도입하는 단계; 및
C. 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로 비르 프로드럭의 유효량을 상기 대상체에게 투여하여 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키는 단계로서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 아사이클로비르, 아사이클로비르 프로드럭, 펜시클로비르 또는 펜시클로비르 프로드럭의 투여시 상기 대상체에서 증식되고, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 키메라 항원 수용체가 상기 대상체의 암 세포에 결합하여 대상체의 암을 치료하는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포가 본원에 제공되되, 하나 이상의 전사 단위는 조절 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 상기 조절 요소는 생체내 화합물에 결합할 수 있고/있거나 결합하도록 설계되고/되거나 구성될 수 있다.
또 하나의 양태에서, 레트로바이러스 패키징 시스템으로서,
A. 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드와 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 그것에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치기 위한 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있는 제1 교차활성인자;
B. 제2 리간드 및 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 그것에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위한 제2 교차활성인자; 및
C. 레트로바이러스 입자를 위한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함하고,
상기 제1 교차활성인자가 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현을 조절하고, 상기 제2 교차활성인자가 gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 표적 세포에 결합할 수 있고 그것에 막 융합을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 슈도타입화 요소의 발현을 조절하고, 상기 레트로바이러스 단백질이 레트로바이러스로부터 유래되는, 레트로바이러스 패키징 시스템이 본원에 제공된다. 이 양태의 구현예는 다른 양태에서 인용된 요소에 대해 본원에 제공된 임의의 구현예를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 제조방법으로서,
A. 패키징 세포의 집단을 배양하여 제1 교차활성인자를 축적하는 단계로서, 상기 패키징 세포가 제1 구성적 프로모터로부터 발현된 제1 교차활성인자를 포함하고, 상기 제1 교차활성인자가 제1 리간드와 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 그것에 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위한 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현이 제1 교차활성인자에 의해 조절되는, 단계;
B. 제1 리간드의 존재하에 축적된 제1 교차활성인자를 포함하는 패키징 세포의 집단을 배양하여 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 축적하는 단계로서, 상기 제2 교차활성인자는 제2 리간드와 제2 리간드의 존재하 대 부재하에 그것에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위한 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있는, 단계; 및
C. 제2 리간드의 존재하에 축적된 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포의 집단을 배양하여 gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 슈도타입화 요소의 발현을 유도함으로써 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는, 단계를 포함하고,
상기 패키징 가능한 RNA 게놈이 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 상기 제3 프로모터가 제1 교차활성인자 또는 제2 교차활성인자에 의해 구성적으로 활성이거나 유도성이고, 상기 하나 이상의 슈도타입화 요소가 표적 세포에 결합할 수 있고/있거나 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시키는, 방법이 본원에 제공된다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 표적 세포, 전형적으로 NK 세포, 또는 예시적인 구현예에서 T 세포와 같은 림프구에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소를 추가로 포함하고, 상기 제1 교차활성인자는 활성화 요소의 발현을 조절한다. 활성화 요소는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면 상에 존재하고, 상기 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드; 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드이고, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드이다. CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 일부 구현예에서 CD80, CD86, 또는 CD80의 세포외 도메인과 같은 Akt의 CD28-매개된 활성화를 유도할 수 있는 이의 기능적 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 항-CD3 scFv 또는 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFvFc이고, 상기 CD28에 결합될 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD80, 또는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 이의 세포외 단편이다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 막-결합된 사이토카인을 추가로 포함하고, 제1 교차활성인자는 막-결합된 사이토카인의 발현을 조절한다. 막-결합된 사이토카인은, 예를 들어, IL-7, IL-15, 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 구현예에서 막-결합된 사이토카인은 IL-7의 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 활성 단편, 및 DAF일 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 DAF 신호 서열 및 이의 신호 서열 없는 IL-7을 포함할 수 있고, DAF의 잔기 36-525가 뒤따른다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 이의 막과 결합하고, 항-CD3 scFV 또는 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFvFc를 포함하는 활성화 요소 및 CD80 결합된 또는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 대한 세포외 단편; 및 IL-7의 융합 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편과 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF를 포함하는 막-결합된 사이토카인을 포함하고, 상기 제1 교차활성인자는 활성화 요소 및 막-결합된 사이토카인 각각의 발현을 조절한다. 일부 구현예에서, IL-7 또는 이의 활성 단편, 및 DAF 융합, 항-CD3 scFV 또는 항-CD3 scFvFc 및 CD80 또는 이의 세포외 단편은 각각 DAF 신호 서열을 포함한다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 Vpu 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 Vpu 폴리펩타이드 및 Vpx 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 Vpx 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 이러한 또는 다른 구현예에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 T 세포에 의해 인식되는 하나 이상의 바이러스 폴리펩타이드를 포함한다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체이다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 상기 제3 프로모터는 제1 교차활성인자 또는 제2 교차활성인자에 의해 구성적으로 활성이거나 유도성이다. 예시적인 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 상기 제3 프로모터는 제2 교차활성인자에 의해 유도성이다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3'로 다음을 추가로 포함한다:
a) 5' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편;
b) 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
c) 제1 표적 폴리펩타이드 및 임의의 제2 표적 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열;
d) 제1 표적 폴리펩타이드 및 임의의 제2 표적 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된 제4 프로모터로서, 상기 제4 프로모터가 표적 세포에서 활성이지만 패키징 세포주에서 활성이 아닌, 제4 프로모터; 및
e) 3' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편.
바로 위의 작제물을 포함하는 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 제3 프로모터는 제4 프로모터로부터 촉진된 전사 또는 발현으로부터 반대 방향으로 전사 또는 발현을 촉진시킨다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본 개시내용에 개시된 임의의 구현예의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 코딩하고, 상기 제1 표적 폴리펩타이드 및 상기 제2 표적 폴리펩타이드는 각각 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제1 조작된 신호전달 ㅍ포폴리펩타이드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 추가로 포함한다. 예시적인 구현예에서 조절 요소는 리보스위치이다. 예시적인 구현예에서 리보스위치는 화합물에 결합할 수 있고, 조절 요소에 결합하는 상기 화합물은 뉴클레오사이드 유사체이고, 상기 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스 약물, 예를 들어, 아사이클로비르 또는 펜시클리비르일 수 있다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 miRNA 또는 shRNA와 같은 억제성 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 인트론을 추가로 포함한다. 인트론은 제4 프로모터에 인접하여 하류에 존재할 수 있다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포일 수 있다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(VSV-G), 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 암포트로픽 외피 단백질, 또는 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.
본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 크기가 11,000 KB 이하 또는 10,000 KB 이하이다. 본원에 제공된 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태를 제조하기 위한 레트로바이러스 패키징 시스템 및 방법의 일부 구현예에서, 제1 표적 폴리펩타이드는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드는 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하고, 제2 표적 폴리펩타이드는 CAR을 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
프로모터 및 리보스위치에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 리보스위치가
a.) 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물을 결합하고, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 비해 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 대해 감소된 결합을 갖는 압타머 도메인; 및
b.) 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오사이드 유사체의 결합이 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나 억제하여 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
조절 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 조절 요소에 결합하는 화합물은 뉴클레오사이드 유사체이다. 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제는 아사이클로비르 또는 펜시클로비르일 수 있다. 리보스위치는 펜시클로비르에 비해 우선적으로 아사이클로비르에 결합하거나, 아사이클로비르에 비해 우선적으로 펜시클로비르에 결합할 수 있다. 리보스위치는 37℃, 37.5℃, 38℃, 38.5℃ 또는 39℃ 이상, 예를 들어, 39℃ 이상의 온도에서 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 겸소된 결합을 가질 수 있다. 리보스위치는 범위의 하단에서 길이 35, 40, 45, 및 50개의 뉴클레오타이드 길이 및 범위의 상단에서 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 45 내지 80개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 리보스위치를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 리보스위치에 의해 조절되는 표적 폴리뉴클레오타이드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩타이드를 코딩하는 영역을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 림프증식성 요소를 코딩할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 코딩하는 영역을 포함할 수 있고, 상기 폴리펩타이드는 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인 및 세포내활성화 요소를 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있다. 리보스위치를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 기능 스위칭 도메인은 내부 리보솜 유입 부위, 바이러스 유전자 작제물에서 pre-mRNA 슬라이스 공여체 접근성, 번역, 전사의 종렬, 전사체 분해, miRNA 발현 또는 shRNA 발현을 조절하여 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절할 수 있다. 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보스위치를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 분자 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 리보스위치를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 게놈 또는 포유동물 염색체 또는 이의 단편으로 통합될 수 있다. 이러한 및 리보스위치를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예의 특정 구현예에서, 리보스위치는 pre-mRNA 스플라이싱을 조절한다. 예를 들어, 리보스위치는 전형적으로 본원의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 전사 단위 상의 두 개의 엑손 사이에 분기점 서열을 포함할 수 있다. 이와 같이, 리보스위치에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 화합물 또는 약물의 결합은 엑손 스플라이싱을 조절한다. 이러한 구현예는 제1 엑손, 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손 사이에 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 상기 리보스위치는 분기점 서열을 포함하고, 리보스위치에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 화합물 또는 약물(예: 아사이클로비르)의 결합은 제1 및 제2 엑손의 엑손 스플라이싱을 조절한다. 이러한 및 리보스위치를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예의 다른 구현예예서, 리보스위치는 pre-mRNA 트랜스스플라이싱을 조절함으로써 유전자 발현을 조절할 수 있다. 이러한 구현예에서, 리보스위치는 트랜스스플라이싱 인트론 내에 위치된다. 예를 들어, 하나의 양태는 제1 엑손, 제2 엑손, 및 제1 엑손과 제2 엑손 사이에 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 상기 리보스위치는 분기점 서열을 포함하고, 리보스위치에 대한 아사이클로비르의 결합은 제1 및 제2 엑손의 엑손 스플라이싱을 조절한다.
본원에 제공된 또 다른 양태는 대상체의 림프구를 유전자 변형시키고 확장하는 방법으로서,
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 대상체의 생체외 혈액으로부터 T 세포 및/또는 NK 세포를
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 이의 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 상기 슈도타입화 요소가 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 슈도타입화 요소;
ii. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에서 발현되고, T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 추가로 상기 폴리펩타이드가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드로 코딩되지 않는, 폴리펩타이드; 및
iii. T 세포 및/또는 NK 세포에 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서,
상기 하나 이상의 전사 단위가 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고,
상기 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현이 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 상기 리보스위치에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시키고,
상기 접촉 단계가 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부가 유전자 변형되도록 하는, 단계;
C. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 재도입하는 단계; 및
D. 생체내 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 노출시켜 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장을 촉진시키는 단계로서, 상기 혈액을 수집하는 단계와 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 재도입하는 단계 사이의 방법이 24시간 이하 내 및/또는 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않고 수행되어 대상체의 림프구를 유전자 변형시키고 확장시키는, 단계를 포함하는, 방법이다.
이 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포를 유전자 변형시킨다. 또 다른 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드가 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 DAF 신호 서열에 추가로 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면에 DAF에 공유 결합된 사이토카인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 사이토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩타이드는 DAF 신호 서열, 이의 신호 서열 없는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다.
바로 위의 이러한 방법 양태의 또 하나의 예시적인 구현예에서, 리보스위치는 일부 예에서 아사이클로비르 및/또는 펜시클로비르인 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 조절한다. 또 다른 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있거나 miRNA 또는 shRNA 및 IL-7을 코딩하는 핵산이 존재할 수 있다. 일부 예에서, miRNA 또는 shRNA은 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본원에 제공된 또 다른 양태는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서,
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 그것의 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 상기 슈도타입화 요소가 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 항원 특이적 표적화 영역, 막관통 도메인 및 세로내 활성화 요소를 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현이 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 상기 리보스위치에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시키는, 폴리뉴클레오타이드; 및
C. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면에서 발현되고, T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고; 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 폴리펩타이드를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자이다.
임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태의 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다. 상기 방법의 다른 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 DAF 신호 서열에 추가로 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그들의 표면에 DAF에 공유결합된 사이토카인을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 사이토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩타이드는 DAF 신호 서열, 이의 신호 서열 없는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다.
본원의 임의의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태의 또 다른 예시적인 구현예에서, 리보스위치는 일부 예에서, 아사이클로비르 및/또는 펜시클로비르인 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 조절한다. 또 다른 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있거나, miRNA 또는 shRNA 및 IL-7을 코딩하는 핵산이 존재할 수 있다. miRNA 또는 shRNA은 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본원에 제공된 또 다른 양태는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 제조방법으로서,
A. 패키징 세포의 집단을 배양하여 제1 교차활성인자를 축적시키는 단계로서, 상기 패키징 세포가 구성적 프로모터로부터 발현된 제1 교차활성인자를 포함하고, 상기 제1 교차활성인자가 제1 리간드와 제1 리간드의 존재하 대 부재하에 그것에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위한 제1 유도성 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현이 상기 제1 교차활성인자에 의해 조절되는, 단계;
B. 제1 리간드의 존재하에 축적된 제1 교차활성인자를 포함하는 패키징 세포의 집단을 배양하여 제2 교차활성 인자 및 레트로바이러스 REV 단백질 및 전형적으로 그들의 표면에 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 포함하는 활성화 요소를 축적시키는 단계로서, 상기 제2 교차활성인자는 제2 리간드와 제2 리간드의 존재하 대 부재하에서 그것에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기 위한 제2 유도성 프로모터에 결합할 수 있는, 단계; 및
C. 제2 리간드의 존재하에 축적된 제2 교차활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포의 집단을 배양하여 gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드 및 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소의 발현을 유도하는 단계로서, 상기 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 단계를 포함하고,
패키징 가능한 RNA 게놈이 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 상기 프로모터가 제2 교차활성인자에 의해 유도성이고,
상기 패키징 가능한 RNA 게놈이 5'로부터 3'로
i. 5' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편;
ii. 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
iii. 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 절단 신호에 의해 분리된 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열;
iv. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 제4 프로모터; 및
v. 3' 긴 말단 반복체 또는 이의 활성 단편을 포함하고,
상기 패키징 가능한 RNA 게놈이 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 결합하는 리보스위치를 추가로 포함하고, 리보스위치 대 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 대 리보스위치의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시킴으로써 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 제조하는, 제조방법이다.
상기 방법의 예시적인 구현예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 조절한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물은 아사이클로비르 및/또는 펜시클로비르이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 인식 도메인을 추가로 포함하고, 상기 인식 도메인은 EGFR 또는 이의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 제1 리간드는 라파마이신이고 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신이거나, 제1 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신이고 제2 리간드는 라파마이신이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 패키징 세포는 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 Vpu를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 패키징 세포는 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 Vpu 폴리펩타이드 및 임의로 Vpx 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 패키징 세포는 제2 또는 임의의 제3 전사 단위 상에 또는 제1 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 Vpx를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 예에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩타이드는 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 DAF 신호 서열에 추가로 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, DAF에 공유 결합된 사이토카인을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 발현이 또한 유도된다. 일부 예에서, 사이토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩타이드는 DAF 신호 서열, 이의 신호 서열 없는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 리보스위치는 일부 예에서 아사이클로비르 및/또는 펜시클로비르인 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 대한 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 조절한다. 또 다른 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있거나, miRNA 또는 shRNA 및 IL-7을 코딩하는 핵산이 존재할 수 있다. miRNA 또는 shRNA는 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다.
본원의 또 다른 양태에서,
A. 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드; 및
B. 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 변형된 림프구가 제공된다.
상기 유전자 변형된 림프구 양태의 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 림프구는 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 특정 구현예에서, 림프구는 T 세포이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 상기제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현은 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 리보스위치에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물의 결합은 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 림프구는 예를 들어, miRNA 또는 shRNA와 같은 적어도 하나(예: 2개)의 억제성 RNA 분자를 발현한다. 억제성 RNA 분자는 인트론 내의 핵산에 의해 추가로 코딩될 수 있다.
본원의 또 다른 양태에서,
a. 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드; 및
b. 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 제공된다.
유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 양태의 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성이고, 일부 예에서, 구성적으로 활성인 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 단편이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현은 조절 요소에 의해 조절된다. 일부 예에서, 조절 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 뉴클레오사이드 유사체가 존재할 경우, 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및/또는 제2 조작된 폴리펩타이드는 발현된다. 다른 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 그의 표면에 활성화 요소, 슈도타입화 요소 및/또는 막-결합된 사이토카인을 갖는다. 일부 예에서, 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화 요소는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 항-CD3 scFV 또는 항-CD3 scFvFc 및/또는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD80을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드, 및/또는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 막-결합된 사이토카인은 DAF에 융합된 IL-7 또는 이의 단편, 또는 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다.
하나의 양태에서, 대상체의 림프구를 유전자 변형 및 확장하는 방법으로서,
A. 대상체의 생체외 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않고
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 그것의 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하고, 임의로 조절 요소에 의해 임의로 조절되는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 세포내 활성화 도메인 및 임의로 CAR의 다른 성분을 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계;
A. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계; 및
생체내 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현에 영향을 미치고 생체내 림프구의 확장, 생착 및/또는 지속을 촉진시키는 조절 요소로서 작용하는 화합물에 노출시켜 대상체의 림프구를 유전자 변형 및 확장시키는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다. 예시적인 구현예에서, 화합물은 분자 샤페론, 예를 들어, 소분자 샤페론이다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소에 대한 분자 샤페론의 결합은 림프증식성 요소의 증식성 활성을 증가시킨다. 분자 샤페론은 혈액이 수집되기 전, 접촉 동안 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체에게 도입된 후 대상체에게 투여될 수 있다. 화합물이 조절 요소인 이 양태로 이러한 화합물이 전형적으로 림프증식성 요소 및/또는 CAR의 성분에 결합할 수 있고, 방법의 성능 동안 이러한 림프증식성 요소 또는 CAR 성분에 결합함이 이해될 것이다. T 세포 및/또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질감염시키는 단계를 포함하는 본원에 제공된 방법에 관련된 다른 구현예 및 교시는 또한 분자 샤페론 양태를 포함하는 이 양태에 적용한다.
또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 선택하는 방법으로서,
a. 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리의 폴리펩타이드를 정상적인 생리학적 상태하의 결합 검정 및 비정상적인 상태하의 결합 검정에 적용하는 단계; 및
b. 생리학적 조건과 비교하여 비정상적인 상태에서 결합 활성의 증가를 나타내는 폴리펩타이드를 선택하여 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 선택하는 단계에 의해 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리로 패닝하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 단리시키는 방법으로서,
a) 비정상적인 상태하의 폴리펩타이드 라이브러리를 고체 지지체에 결합된 표적 항원과 접촉시키는 단계로서, 표적 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 발현시키는 클론이 표적 항원을 통해 고체 지지체에 결합된 채로 잔류하는, 단계;
b) 고체 지지체를 생리학적 상태하의 결합된 폴리펩타이드와 함께 배양하는 단계; 및
c) 생리학적 상태하의 고체 지지체로부터 용출하는 클론을 수집하여 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 항원을 단리시키는 단계에 의해 폴리펩타이드 라이브러리를 패닝하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 항원에 결합하기 위한 키메라 항원 수용체로서,
a) 폴리펩타이드 라이브러리를 패닝하고 정상적인 생리학적 상태와 비교하여 비정상적인 상태에서 결합 검정에서 활성의 증가를 가짐으로써 선택된 적어도 하나의 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 표적 항원을 결합하기 위한 키메라 항원 수용체로서,
a) 정상적인 생리학적 환경과 비교하여 비정상적인 상태에서 표적 항원에 대한 결합의 증가를 나타내는 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역으로서, 상기 항원 특이적 표적화 영역이 표적에 결합하는, 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막관통 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체가 본원에 제공된다.
미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역(ASTR)을 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법 및 조성물의 예시적인 구현예에서, ASTR은 정상적인 상태와 비교하여 비정상적인 상태에서의 검정에서 표적 항원에 대한 결합 친화도에서 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 증가를 가질 수 있다. 비정상적인 조건은 저산소증, 산성 pH, 더 높은 농도의 락트산, 더 높은 농도의 히알루로난, 더 높은 농도의 알부민, 더 높은 농도의 아데노신, 더 높은 농도의 R-2-하이드록시글루타레이트, 더 높은 농도의 PAD 효소, 더 높은 압력, 더 높은 산화, 및 더 낮은 영양소 이용가능성일 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR은 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 항원 결합의 증가를 나타낼 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR은 상응하는 생리학적 조건에 비해 종양 환경 및/또는 시험관내 종양 대용물 검정 상태에서 항원 결합의 증가를 나타낼 수 있다. 표적은 4-1BB, ST4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, AXL, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산 탈수효소 9 (CA- IX), C-MET, CCR4, CD 152, CD 19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DRS, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 추가의 도메인-B, 엽산 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, Ll-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 nSP1, 인테그린 nvP3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N글리콜릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R a, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, ROR2 SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나스신 C, TGF 베타 2, TGF-P, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16. 88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 및 비멘틴일 수 있다. ASTR은 항체, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 리간드, 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 아피바디일 수 있다. ASTR은 전장 항체, 단일-쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일-쇄 항체 또는 디아바디일 수 있다. ASTR은 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일-쇄 가변 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄는 링커에 의해 분리될 수 있고, 상기 링커는 6 내지 100개 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 중쇄는 키메라 항원 수용체 상의 경쇄에 대한 N-말단에 위치될 수 있고, 일부 구현예에서, 경쇄는 키메라 항원 수용체 상의 중쇄에 대한 N-말단에 위치될 수 있다.
폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리를 포함하는 임의의 방법의 예시적인 구현예에서, 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 효모 디스플레이 라이브러리이다. 폴리펩타이드 디스플레이 라이브러리는 항체 디스플레이 라이브러리이다. 항체 디스플레이 라이브러리는 인간 또는 인간화 항체 디스플레이 라이브러리이다. 항체 디스플레이 라이브러리는 미접촉 라이브러리일 수 있다. 상기 방법은 박테리아 세포를 수집된 파지로 감염시켜 정제된 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 접촉, 배양 및 수집 단계를 이전 사이클로부터 생성된 정제된 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 1 내지 1000 사이클을 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
미세환경 제한된 ASTR을 단리시키거나 선택하는 단계를 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법의 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 미세환경 제한된 ASTR의 폴리펩타이드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 미세환경 제한된 ASTR, 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 생성함으로써 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 라이브러리는 단일 쇄 항체 라이브러리일 수 있다.
미세환경 제한된 ASTR을 단리시키는 방법은 1 내지 1000회 반복된 패닝을 포함할 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝 라운드 사이에 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 돌연변이시키지 않고 수행될 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR를 단리시키는 방법은 패닝 라운드 사이에 항원 특이적 표적화 영역 또는 이를 포함하는 숙주 유기체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 배양, 고충실도 증폭시키고/시키거나 희석시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 방법은 반복 단계 전에 선택된 및/또는 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역을 돌연변이화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 선택된 및/또는 단리된 미세환경 제한된 항원 특이적 표적화 영역의 서열, 및/또는 긴 판독 DNA 서열분석을 통해 패닝의 하나 이상의 라운드 후 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 단리된 미세환경 제한된 ASTR의 확장 전후 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝을 반복하지 않고 수행될 수 있다. 미세환경 제한된 ASTR을 단리시키는 방법은 미세환경 제한된 ASTR이 단리된 후 단리된 미세환경 제한된 ASTR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 돌연변이시키지 않고 수행될 수 있다.
미세환경 제한된 ASTR을 갖는 키메라 항원 수용체를 포함하는 본원에 제공된 임의의 조성물의 예시적인 구현예에서, 미세환경 제한된 ASTR은 항체 라이브러리를 패닝함으로써 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 미세환경 제한된 ASTR은 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 패닝함으로써 동정된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 이중특이적 ASTR을 포함한다.
또 하나의 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 상기 조절 요소가 시험관내 또는 생체내 화합물에 결합할 수 있거나 생체내 화합물에 결합하도록 구성된, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포가 본원에 제공된다.
또 하나의 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 생체내 조절 요소일 수 있는 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 상기 조절 요소가 생체내 화합물에 결합할 수 있거나 생체내 화합물에 결합하도록 구성된, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
또 하나의 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입 방법으로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 조절 요소에 의해 조절된 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드가 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 상기 생체내 조절 요소가 형질도입 조건하에 생체내 또는 시험관내 화합물에 결합하여 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는, T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입 방법이 본원에 제공된다.
선행 단락에 제공된 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포 양태, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 양태, 및 방법 양태의 예시적인 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 코딩하는 전사 단위를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 조절 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 다른 예시적인 구현예에서, 조절 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있고, 조절 요소에 결합하는 화합물은 뉴클레오사이드 유사체이다. 일부 예에서, 뉴클레오사이드 유사체는, 예를 들어, 아사이클로비르 또는 펜시클로비르이다. 특정 구현예에서, 항바이러스제는 아사이클로비르이다. 다른 예시적인 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체는 EGFR 또는 이의 에피토프에 융합된다. 다른 예시적인 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체는 eTag를 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체는 PPCL 삽입을 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 돌연변이체는 야생형 인간 IL-8 수용체의 위치 243과 동등한 위치에 PPCL 삽입을 포함한다. 다른 예시적인 구현예에서, 형질도입된 T 세포 또는 NK 세포는 형질도입된 T 세포이다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 MRB-CAR의 동족 항원을 발현하는 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)-발현 T 세포 또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법으로서,
a. MRB-CAR를 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 도입 단계 후, 상기 MRB-CAR를 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현하고 대상체에서 동족 항원을 발현하는 세포에 결합하는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 투여 단계가 상기 도입 단계 전, 동안 또는 후에 수행되고, 상기 혈액, 조직 및/또는 미세환경의 증가된 pH가 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 또는 미세환경에서 동족 항원을 발현시키는 세포에 대한 MRB-CAR 발현 T 세포 또는 NK 세포의 결합을 조절하는, 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 온 표적 오프 종양 독성을 경감시키는 방법으로서,
a. 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 코딩하는 핵산을 대상체의 T 세포 또는 NK 세포로 도입하여 MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는 단계;
a. MRB-CAR를 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 도입 단계 후, 상기 MRB-CAR를 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현하고 대상체에서 동족 항원을 발현하는 세포에 결합하는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직의 pH 및/또는 미세환경의 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하여 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 및/또는 미세환경에서 이의 동족 항원에 대한 MRB-CAR의 결합을 조절하여, 대상체에서 온 표적 오프 종양 독성을 경감시키는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 핵산은 벡터일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 입자이다.
또 다른 양태에서, 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법으로서,
a. 표적 포유동물 세포를 미세환경에서 T 세포 및/또는 NK 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 포유동물 세포가 동족 항원을 발현시키고, T 세포 및/또는 NK 세포는 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 동족 항원에 결합하는 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 미세환경에 충분한 양으로 도입하여 미세환경의 pH를 증가시킴으로써 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체 내에서 미세환경의 pH를 증가시키는 유효한 투여 섭생을 통해 대상체에게 pH 조절 약리학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법으로서, 상기 대상체가 MRB-CAR를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하고, 상기 MRB-CAR이 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 이의 동족 항원에 결합하고, 상기 미세환경이 표적 포유동물 세포를 포함하고, 상기 표적 포유동물 세포가 이의 표면에서 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 미세환경의 pH가 증가되기 전 대 후에 차별적으로 표적 포유동물 세포에 결합하여 생체내에서 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는, 방법이 본원에 제공된다.
약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, MRB-CAR은 상이한 pH에서보다 하나의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 결합을 감소시킬 수 있다. MRB-CAR의 차별적 결합에 대한 예시적 pH 값이 가장 광범위한 양태에서 이미 제공되지 않고, 대안적으로 이러한 양태에 대한 값들 대신 다른 구현예에 대해 제공되는 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서보다 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서보다 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서 이의 동종 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4 내지 7.6과 비교하여 pH 6.5 내지 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 혈액의 pH와 비교하여 종양의 pH에서 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 항원 특이적 표적화 영역, 스토크, 및 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 또한 공통 자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 종양 관련 항원에 결합할 수 있다.
약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 미세환경의 pH는 7,0 이하의 pH로부터 7.0 이상의 pH로 증가될 수 있다. 예를 들어, pH는 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH로부터 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 또는 7.4 이상의 pH로 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 약리학적 제제를 도입하기 전에 미세환경의 pH에서가 아니라 증가된 pH에서 동족 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, pH는 7.0 이하로부터 pH 7.1 내지 8.0으로 또는 pH 7.1 내지 7.8로 또는 pH 7.2 내지 7.8로 또는 pH 7.2 내지 7.6으로 또는 pH 7.3 내지 7.6으로 또는 pH 7.4 내지 7.8로 또는 pH 7.4 내지 7.6으로 증가될 수 있다. 이러한 pH의 증가는 투여된 약리학적 제제의 형태 및 용량에 따라 1, 2, 4, 6, 8, 12, 또는 24시간 미만 동안 또는 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 이상 동안 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 약리학적 제제는 종양과 같은 표적 조직에서, 예를 들어, 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 표면에서, 적어도 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 일부에서, 예시적인 구현예에서, 표적 조직(예: 종양) 미세환경 전반에 걸쳐 pH가 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상으로; 또는 범위의 하단에서 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 범위의 상단에서 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 또는 7.8 사이에서 잔류되도록 투여된다.
약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 미세환경은 생체내 미세환경, 예를 들어, 종양, 조직, 비종양 조직, 정상 조직, 또는 pH의 일시적인 이동을 겪은 조직일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 pH의 일시적인 이동을 겪는 조직은 혐기성 상태의 근육 조직 또는 운동을 하는 근육 조직 또는 염증성 조직 또는 염증을 겪고 있는 조직을 포함한다. 표적 포유동물 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 표적 포유동물 세포는 종양 세포 또는 비종양 또는 정상 세포일 수 있다.
약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 약리학적 제제는 중탄산나트륨, 트리스-하이드록시메틸 아미노메탄, 중탄산나트륨 및 탄산나트륨의 등몰 고장성 용액, 또는 양성자 펌프 억제제, 예를 들어, 에서메프라졸, 에소메프라졸 및 나프록센, 란소프라졸, 오메프라졸 및 라베프라졸일 수 있다.
본 개시내용의 MRB-CAR을 코딩하는 핵산은 다양한 수단을 통해 T 세포 및/또는 NK 세포로 도입될 수 있다. 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 도입 단계 또는 단계들은
a. 생체외 대상체의 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포를 사전 생체내 자극을 필요로 하지 않고
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 그것의 표면 상의 하나 이상의 슈도타입화 요소; 및
ii. MRB-CAR을 코딩하는, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서,
상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부의 형질도입을 촉진시킴으로써, 전형적으로 그들이 이제 MRB-CAR을 코딩하는, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하기 때문에, MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
b. MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 도입되기 직전에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 생체외 세포 분열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포는 범위의 한단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 및 범위의 상단에서 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉될 수 있되, 소정의 범위에서 낮은 값은 높은 값 이하이다. 일부 구현예에서, 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포는 대상체로부터 수집된 혈액으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 단지 12, 15. 16, 18, 21, 24, 30, 36, 42, 또는 48시간이 혈액이 대상체로부터 수집되는 시간 및 MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포가 대상체에게 도입되는 시간 사이를 지날 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액을 수집한 후 및 MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 도입하기 전의 모든 단계는 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, MRB-CAR을 코딩하는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 이러한 세포(들)가 MRB-CAR을 발현시킬 수 있도록 T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)에 의해 용해된다. 예시적인 구현예에서, T 세포(들) 및/또는 NK 세포(들)는 폴리뉴클레오타이드를 그들의 게놈에 통합한다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 그의 표면에 활성화 요소, 예를 들어, 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 활성화할 수 있는 활성화 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 요소는 본 개시내용에 제공된 임의의 활성화 요소를 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 표면 상에 활성화 요소를 포함하는 임의의 구현예에서, 하나 이상의 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 각각 CD3 또는 CD28에 결합하는 scFV 또는 scFvFc일 수 있다. 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD3에 결합하는 scFV 또는 scFvFc일 수 있다. 일부 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD80, CD86, 또는 Akt의 CD28-매개된 활성화를 유도할 수 있는 이의 기능적 단편의 세포외 도메인일 수 있다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, MRB-CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 리보스위치에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스 약물, 예를 들어, 아사이클로비르 또는 펜시클로비르일 수 있다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그것의 표면에 단클론성 항체 승인된 생물학적 인식 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인식 도메인은 EGFR, 또는 이의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드, 및/또는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포에 결합하는 능력을 보유하는 이의 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 VSV-G 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 그것의 표면에 IL-7의 융합 폴리펩타이드, 또는 이의 활성 단편, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF를 포함할 수 있다.
MRB-CAR 및 약리학적 제제를 포함하는 방법에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 게놈은 하나 이상의 억제성 RNA 분자, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 상이한 RNA 표적에 대해 지시될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 인트론 내에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 18-25 뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 형성하는 5' 줄기 및 3' 줄기를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 5'로부터 3' 배향으로 5' microRNA 측접 서열, 5' 줄기, 루프, 3' 줄기, 및 3' microRNA 측접 서열을 포함할 수 있고, 상기 5' 줄기 또는 3' 줄기는 RNA 표적에 결합할 수 있다. 추가의 구현예에서, 5' 줄기는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 상기 3' 줄기는 18 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 상기 루프는 3 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 5' microRNA 측접 서열 및 3' microRNA 측접 서열은 천연 miRNA, 예를 들어, mIR-155로부터 유래될 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체 내의 미세환경의 pH를 증가시키는 효과적인 투여 섭생을 통해 대상체에게 pH 조절 약리학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 생체내 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법에 사용하기 위한 pH 조절 약리학적 제제로서, 상기 대상체가 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 이의 동족 항원에 결합하는 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현하고, T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키고, 상기 미세환경이 표적 포유동물 세포를 포함하고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포는 pH-조절 약리학적 제제를 투여함으로써 미세환경의 pH가 증가되기 전 대 증가된 후에 차별적으로 표적 포유동물 세포에 결합하여 생체내 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는, pH-조절 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, T 세포 또는 NK 세포를 발현시키는 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)의 대상체의 동족 항원을 발현시키는 세포에의 결합을 조절하는 방법에 사용하기 위한 약리학적 제제로서, 상기 방법이
a. MRB-CAR을 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 MRB-CAR이 대상체의 동족 항원을 발현시키는 세포에 결합하고, 도입 단계 후, 상기 MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키고 대상체의 동족 항원을 발현시키는 세포에 결합하는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하여 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 또는 미세환경에서 동족 항원을 발현시키는 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포를 발현시키는 MRB-CAR의 결합을 조절하는 단계를 포함하는, 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 온 표적 오프 종양 독성을 경감시키는 방법에 사용하기 위한 약리학적 제제로서, 상기 방법이
a. 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 대상체의 T 세포 또는 NK 세포에 도입하여 MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는 단계;
b. MRB-CAR을 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계 후, 상기 MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키고 대상체의 동족 항원을 발현시키는 세포에 결합하는, 단계; 및
c. 약리학적 제제를 혈액 pH 및/또는 조직 pH 및/또는 미세환경 pH를 증가시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하여 증가된 pH를 갖는 혈액, 조직 또는 미세환경에서 동족 항원에 대한 MRB-CAR의 결합을 조절하여 대상체에서 온 표적 오프 종양 독성을 경감시키는 단계를 포함하는, 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 종양 성장을 치료하기 위한, 표적 포유동물 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법에 사용하기 위한 약리학적 제제로서, 상기 방법이
a. 표적 포유동물 세포를 미세환경 중 MRB-CAR를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 포유동물 세포가 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 동족 항원에 결합하는 MRB-CAR을 발현시키는, 단계; 및
b. 약리학적 제제를 미세환경에 충분한 양으로 도입함으로써 미세환경의 pH를 증가시켜 표적 포유동물 세포에 대한 MRB-CAR을 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 단계를 포함하는, 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 종양 성장을 치료하기 위한, 생체내 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법에 사용하기 위한 약리학적 제제로서, 상기 방법이 대상체 내의 미세환경의 pH를 증가시키는 유효한 투여 섭생을 통해 대상체에게 pH-조절 약리학적 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상체가 MRB-CAR를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하고, 상기 MRB-CAR이 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 이의 동족 항원에 결합하고, 상기 미세환경이 표적 포유동물 세포를 포함하고, 상기 표적 포유동물 세포가 이의 표면에서 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 미세환경의 pH가 증가되기 전 대 증가된 후 차별적으로 표적 포유동물 세포에 결합하는, 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 종양 성장을 치료하기 위한, 생체내 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제로서, 상기 방법이 대상체 내의 미세환경의 pH를 증가시키는 유효한 투여 섭생을 통해 대상체에게 pH-조절 약리학적 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상체가 MRB-CAR를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하고, 상기 MRB-CAR이 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 이의 동족 항원에 결합하고, 상기 미세환경이 표적 포유동물 세포를 포함하고, 상기 표적 포유동물 세포가 이의 표면에서 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 미세환경의 pH가 pH-조절 약리학적 제제를 투여함으로써 증가되기 전 대 증가된 후 차별적으로 표적 포유동물 세포에 결합하는, pH-조절 약리학적 제제가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 생체내 대상체의 표적 포유동물 세포에 대한 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하기 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제의 용도로서, 상기 pH-조절 약리학적 제제가 대상체 내의 미세환경의 pH를 증가시키는 유효한 투여 섭생을 통해 투여되어야 하고, 상기 대상체가 MRB-CAR를 발현시키는 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하고, 상기 MRB-CAR이 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 이의 동족 항원에 결합하고, 상기 미세환경이 표적 포유동물 세포를 포함하고, 상기 표적 포유동물 세포가 이의 표면에서 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포가 미세환경의 pH가 pH-조절 약리학적 제제를 투여함으로써 증가되기 전 대 증가된 후 차별적으로 표적 포유동물 세포에 결합하는, pH-조절 약리학적 제제의 용도가 본원에 제공된다.
방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제 또는 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하거나 pH-조절 약리학적 제제 및 MRB-CAR의 용도를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, MRB-CAR은 상이한 pH에서보다 하나의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. MRB-CAR의 차별적 결합에 대한 예시적인 pH 값이 가장 광범위한 양태에서 이미 제공되지 않고, 이러한 양태에 대한 값들 대신에 다른 구현예에 대해 제공된 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서보다 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서 이의 동족 항원에 대해 감소된 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서보다 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4 내지 7.6와 비교하여 pH 6.5 내지 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 혈액의 pH와 비교하여 종양의 pH에서 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 항원 특이적 표적화 영역, 스토크, 및 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 또한 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 종양 관련 항원에 결합할 수 있다.
방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제 또는 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하거나 pH-조절 약리학적 제제 및 MRB-CAR의 용도를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 미세환경의 pH는 7.0 이하의 pH로부터 7.0 이상의 pH로 증가될 수 있다. 예를 들어, pH는 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH로부터 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 또는 7.4 이상의 pH로 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 약리학적 제제를 도입하기 전에 미세환경의 pH가 아니라 증가된 pH에서 동족 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, pH는 7.0 이하로부터 pH 7.1 내지 8.0으로 또는 pH 7.1 내지 7.8로 또는 pH 7.2 내지 7.8로 또는 pH 7.2 내지 7.6으로 또는 pH 7.3 내지 7.6으로 또는 pH 7.4 내지 7.8로 또는 pH 7.4 내지 7.6으로 증가될 수 있다. 이러한 pH의 증가는 투여되는 약리학적 제제의 형태 및 용량에 따라 1, 2, 4, 6, 8, 12, 또는 24시간 미만 동안 또는 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 이상 동안 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 약리학적 제제는 pH가 종양과 같은 표적 조직에서, 예를 들어, 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 표면에서, 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 일부에서, 예시적인 구현예에서 표적 조직(예: 종양) 미세환경 전반에 걸쳐 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상으로; 또는 범위의 하단에서 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 범위의 상단에서 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 또는 7.8 사이에 유지되도록 투여된다.
방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제 또는 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하거나 pH-조절 약리학적 제제 및 MRB-CAR의 용도를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 미세환경은 생체내 미세환경, 예를 들어, 종양, 조직, 비종양 조직, 정상 조직, 또는 일시적인 pH 이동을 겪은 조직일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 일시적인 pH 이동을 겪은 조직은 혐기성 조건하의 근육 조직 또는 운동을 하고 있는 근육 조직 또는 염증성 조직 또는 염증을 겪고 있는 조직을 포함한다. 표적 포유동물 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 표적 포유동물 세포는 종양 세포 또는 비종양 또는 정상 세포일 수 있다.
방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제 또는 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하거나 pH-조절 약리학적 제제 및 MRB-CAR의 용도를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 약리학적 제제는 중탄산나트륨, 트리스-하이드록실메틸 아미노메탄, 중탄산나트륨과 탄산나트륨의 등몰 고장성 용액, 또는 양성자 펌프 억제제, 예를 들어, 에소메프라졸, 에소메프라졸 및 나프록센, 란소프라졸, 오메프라졸 및 라베프라졸일 수 있다.
방법에 사용하기 위한 pH-조절 약리학적 제제 또는 약리학적 제제 및 MRB-CAR을 포함하거나 pH-조절 약리학적 제제 및 MRB-CAR의 용도를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 약리학적 제제는 암, 종양, 종양 성장 또는 세포 증식성 장애의 치료 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 함유하는 용기, 및 종양 성장을 치료하기 위한 이의 사용을 위한 지침서를 함유하는 키트로서, 상기 지침서가 다음 단계를 포함하는 방법에서 표적 포유동물 세포에 대한 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합을 조절하는 방법을 지시하는, 키트가 본원에 제공된다:
a. T 세포 및/또는 NK 세포를 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 차별적으로 동족 항원에 결합하는 미세환경 제한된 생물학적 키메라 항원 수용체(MRB-CAR)를 이의 게놈에 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입하여 MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는 단계;
b. MRB-CAR을 발현시킬 수 있는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계 후, MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키고 대상체에서 동족 항원을 발현시키는 세포에 결합하는, 단계;
c. 상기 표적 포유동물 세포를 미세환경에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 발현시키는 MRB-CAR과 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 포유동물 세포가 MRB-CAR의 동족 항원을 발현시키고, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포가 MRB-CAR을 발현시키는, 단계; 및
d. 미세환경에 pH-조절 약리학적 제제를 충분한 양으로 도입함으로써 미세환경의 pH를 증가시켜 표적 포유동물 세포와 T 세포 및/또는 NK 세포의 결합에 영향을 미치는, 단계.
일부 구현예에서, 상기 키트는 pH-조절 약리학적 제제를 추가로 포함할 수 있다.
키트의 일부 구현예에서, MRB-CAR은 상이한 pH에서보다 하나의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. MRB-CAR의 차별적 결합에 대한 예시적인 pH 값이 가장 광범위한 양태에서 이미 제공되지 않고, 대안적으로 이러한 양태에 대한 값들 대신에 다른 양태에 대해 제공되는 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서보다 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서 이의 동족 항원에 대한 감소된 결합을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 더 낮은 pH에서보다 더 높은 pH에서 감소된 결합을 가질 수 있다. 예를 들어, MRB-CAR은 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상의 pH에서보다 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH에서 이의 동족 항원에 대해 감소된 결합을 가질 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4 내지 7.6와 비교하여 pH 6.5 내지 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 예시적인 구현예에서, MRB-CAR은 pH 7.4와 비교하여 pH 6.7에서 증가된 결합을 나타낸다. 다른 구현예에서, MRB-CAR은 혈액의 pH와 비교하여 종양의 pH에서 증가된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 항원 특이적 표적화 영역, 스토크, 및 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 또한 공통작극 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 종양 관련 항원에 결합할 수 있다.
키트의 일부 구현예에서, 미세환경의 pH는 7.0 이하의 pH로부터 7.0 이상의 pH로 증가될 수 있다. 예를 들어, pH는 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0 이하의 pH로부터 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 또는 7.4 이상의 pH로 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, MRB-CAR은 약리학적 제제를 도입하기 전 미세환경의 pH가 아니라 증가된 pH에서 동족 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, pH는 7.0 이하로부터 pH 7.1 내지 8.0 또는 pH 7.1 내지 7.8 또는 pH 7.2 내지 7.8 또는 pH 7.2 내지 7.6 또는 pH 7.3 내지 7.6 또는 pH 7.4 내지 7.8 또는 pH 7.4 내지 7.6으로 증가될 수 있다. 이러한 pH의 증가는 투여되는 약리학적 제제의 유형 및 용량에 따라서 1, 2, 4, 6, 8, 12, 또는 24시간 미만 동안 또는 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 이상 동안 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 약리학적 제제는 종양과 같은 표적 조직에서, 예를 들어, 표적 조직(예; 종양) 미세환경의 적어도 표면에서, 표적 조직(예: 종양) 미세환경의 적어도 일부에서, 및 예시적인 구현예에서 표적 조직(예: 종양) 미세환경 전반에 걸쳐 pH가 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 또는 7.5 이상으로; 또는 범위의 하단에서 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 범위의 상단에서 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 또는 7.8 사이로 유지되도록 투여된다. 일부 구현예에서, 미세환경은 생체내 미세환경, 예를 들어, 종양, 조직, 비종양 조직, 정상 조직, 또는 일시적 pH 이동을 겪은 조직일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 일시적인 pH 이동을 겪는 조직은 혐기성 조건하의 근육 조직 또는 운동을 하고 있는 근육 조직 또는 염증성 조직 또는 염증을 겪고 있는 조직을 포함한다. 표적 포유동물 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 상기 표적 포유동물 세포는 종양 세포 또는 비종양 또는 정상 세포일 수 있다.
키트의 일부 구현예에서, 약리학적 제제는 중탄산나트륨, 트리스-하이드록실메틸 아미노메탄, 중탄산나트륨과 탄산나트륨의 등몰 고장성 용액, 또는 양성자 펌프 억제제, 예를 들어, 에소메프라졸, 에소메프라졸 및 나프록센, 란소프라졸, 오메프라졸, 및 라베프라졸일 수 있다.
하나의 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서,
a. 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고,
b. 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다..
본원의 또 다른 양태에서, 복제 불능 레트로바이러스 입자를 위한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 패키징 세포주로서, 상기 패키징 가능한 RNA 게놈이
a. 5' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 단편;
b. 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
c. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 핵산의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
d. 3' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 단편을 포함하는, 포유동물 패키징 세포주가 제공된다.
포유동물 패키징 세포주 양태의 일부 구현예에서, 단계 (c)의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소(b), 5' 긴 말단 반복체(a), 및/또는 3' 긴 말단 반복체(d)를 코딩하는 핵산 서열에 대한 역 배향으로 존재할 수 있다.
포유동물 패키징 세포주 양태의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈의 발현은 포유동물 패키징 세포주에서 활성인 유도성 프로모터에 의해 구동된다.
포유동물 패키징 세포주 양태의 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 중심 폴리퓨린관(cPPT)/중심 종결 서열, HIV Psi, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본원의 또 다른 양태에서, 복제 불능 레트로바이러스 입자를 위한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 레트로바이러스 벡터로서, 상기 패키징 가능한 RNA 게놈이
a. 5' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 단편;
b. 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
c. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 핵산의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
d. 3' 긴 말단 반복체, 또는 이의 활성 단편을 포함하는, 레트로바이러스 벡터가 제공된다.
레트로바이러스 벡터 양태의 일부 구현예에서, 단계 (c)의 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소(b), 5' 긴 말단 반복체(a), 및/또는 3' 긴 말단 반복체(d)를 코딩하는 핵산 서열에 대한 역 배향으로 존재할 수 있다.
레트로바이러스 벡터 양태의 일부 구현예에서, 패키징 가능한 RNA 게놈의 발현은 포유동물 패키징 세포주에서 활성인 유도성 프로모터에 의해 구동된다.
레트로바이러스 벡터 양태의 일부 구현예에서, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소는 중심 폴리퓨린관(cPPT)/중심 종결 서열, HIV Psi, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 임의로 항생체내성 유전자 및/또는 검출 가능한 마커를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 생체외 대상체의 림프구(예: T 세포 또는 NK 세포) 또는 이의 집단을 림프구(예: T 세포 또는 NK 세포)에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체의 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포) 또는 이의 집단을 유전자 변형시키거나 형질도입하는 방법으로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵사 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 접촉 단계가 림프구(예: T 세포 또는 NK 세포), 또는 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포) 중 적어도 일부의 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 유전자 변형 및/또는 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포)를 생성하는, 방법이 본원에 제공된다.
바로 위에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포) 또는 이의 집단이 대상체에게 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 및/또는 형질도입된 림프구(예: T 세포 및/또는 NK 세포) 또는 이의 집단은 대상체에게 도입되거나 재도입되기 전에 4외 이하의 생체외 세포 분열을 겪는다. 일부 구현예에서, 림프구(들)는 1시간 내지 12시간 동안 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉되는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 혈액이 수집되는 시간과 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 대상체에게 재도입되는 시간 사이에 단지 8시간이 경과한다. 일부 구현예에서, 혈액이 수집된 후 및 혈액이 재도입되기 전의 모든 단계는 사람이 프로세싱 전반에 걸쳐 폐쇄 시스템을 모니터링하는 폐쇄 시스템에서 수행된다.
또 다른 양태에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포로서,
a. 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자; 및
b. 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 상기 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자 및 CAR은 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전자 변형인 핵산 서열에 의해 코딩되는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK세포가 본원에 제공된다.
유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 양태의 일부 구현예에서, 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 또한 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소를 포함하고, 상기 림프증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전자 변형인 핵산에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자, CAR, 및/또는 적어도 하나의 림프증식성 요소는 다중시스트론성 물질에서 발현된다. 예시적인 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 단일 다중시스트론성 전사체로부터 발현된다.
또 다른 양태에서, 종양 성장을 치료하기 위한, 대상체의 림프구를 유전자 변형시키는 방법에 사용하기 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 방법이 생체외 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
상기 바로 제공된 대상체 양태의 림프구를 유전자 변형시키는 방법에서, 일부 구현예에서, 약리학적 제제가 유전자 조작된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 사용된다.
또 다른 양태에서, 종양 성장을 치료하기 위한, T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키는 방법에 사용하기 위한 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서, 상기 방법이
a. 생체외 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
b. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하여 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다.
상기 바로 제공된 양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포의 집단을 접촉 단계에서 접촉시키고, 도입 단계에서 대상체에게 도입한다.
또 다른 양태에서, 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키기 위한 키트의 제조에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도로서, 상기 키트의 용도가
1. 생체외 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
2. 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하여 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키기 위한 약제의 제조에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도로서, 상기 약제의 용도가
A) 생체외 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 적어도 일부의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 단계; 및
B) 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 도입하여 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 및 대상체에서 종양 성장을 치료하기 위한 이의 사용을 위한 지침서를 함유하는 상업적인 용기로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열이 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 상업적 용기가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상업적 용기의 양태에서, 지침서는 사용자가 생체외 대상체의 T 세포 및/또는 NK 세포를 접촉시켜 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 대상체의 적어도 하나의 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하도록 지시한다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소를 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 폴리펩타이드, 또는 신호전달 도메인을 포함하는 이의 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성이다. 특정 구현예에서, 림프증식성 요소는 IL-7 수용체 또는 이의 단편일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 림프증식성 요소는 구성적으로 활성인 IL-7 수용체 또는 구성적으로 활성인 이의 단편일 수 있다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 억제성 RNA 분자는 일부 구현예에서 부분적으로 또는 완전히 서로 상보적인 5' 가닥 및 3' 가닥을 포함할 수 있고, 상기 5' 가닥 및 상기 3' 가닥은 18 내지 25 뉴클레오타이드 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드이고, 3' 가닥은 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 가닥 및 3' 가닥은 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 듀플렉스는 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, RNA 듀플렉스는 불일치를 갖지 않는다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 억제성 RNA 분자는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 분자는 예를 들어, Pri-miRNA 또는 Pre-miRNA와 같은 miRNA의 전구체, 또는 shRNA의 전구체일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 인공적으로 유도된 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 다른 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 자체로 siRNA 또는 siRNA로 가공되는 (전사되거나 인공적으로 도입된) dsRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 자연에서 발견되지 않는 서열 또는 자연에서 발견되지 않는 적어도 하나의 기능적 세그먼트 또는 자연에서 발견되지 않는 기능적 세그먼트의 조합을 갖는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나 또는 모든 억제성 RNA 분자는 miR-155이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 억제성 RNA 분자는, 일부 구현예에서, 5'로부터 3' 배향으로 5' 아암, 5' 줄기, 루프, 상기 5' 줄기에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 3' 줄기, 및 3' 아암을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 이 배열을 갖는다. 다른 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 모두가 이 배열을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 줄기는 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 3' 줄기는 길이 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 루프는 길이 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 천연 miRNA로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 miR-155, miR-30, miR-17-92, miR-122 및 miR-21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 천연 miRNA로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 miR-155로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암, 3' 아암 또는 둘 다는 무스 무스쿨러스 miR-155 또는 호모 사피엔스 miR-155로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 5' 아암은 서열번호: 256에 제시된 서열을 갖거나, 예를 들어, 서열번호: 256과 동일한 길이이거나 서열번호: 256의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 길이이거나, 100개의 뉴클레오타이드 이하, 95 뉴클레오타이드 이하, 90개의 뉴클레오타이드 이하, 85 뉴클레오타이드 이하, 80개의 뉴클레오타이드 이하, 75 뉴클레오타이드 이하, 70개의 뉴클레오타이드 이하, 65 뉴클레오타이드 이하, 60개의 뉴클레오타이드 이하, 55 뉴클레오타이드 이하, 50개의 뉴클레오타이드 이하, 45 뉴클레오타이드 이하, 40개의 뉴클레오타이드 이하, 35 뉴클레오타이드 이하, 30개의 뉴클레오타이드 이하 또는 25 뉴클레오타이드 이하이고, 적어도 서열번호: 256과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열과 같은 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 서열번호: 260에 제시된 서열을 갖거나, 예를 들어, 서열번호: 260과 동일한 길이이거나 서열번호: 260의 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 길이이거나, 100개의 뉴클레오타이드 이하, 95 뉴클레오타이드 이하, 90개의 뉴클레오타이드 이하, 85 뉴클레오타이드 이하, 80개의 뉴클레오타이드 이하, 75 뉴클레오타이드 이하, 70개의 뉴클레오타이드 이하, 65 뉴클레오타이드 이하, 60개의 뉴클레오타이드 이하, 55 뉴클레오타이드 이하, 50개의 뉴클레오타이드 이하, 45 뉴클레오타이드 이하, 40개의 뉴클레오타이드 이하, 35 뉴클레오타이드 이하, 30개의 뉴클레오타이드 이하 또는 25 뉴클레오타이드 이하이고, 서열번호: 260과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 서열과 같은 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 3' 아암은 무스 무스쿨러스 BIC의 뉴클레오타이드 221-283을 포함한다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 둘 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 둘 이상의 억제성 RNA 분자는, 일부 구현예에서, 일련의 제1 핵산 서열에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA 분자는 비기능적 링커 서열(들)에 의해 직접 또는 간접적으로 서로 인접될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 길이 5 내지 120개의 뉴클레오타이드 또는 길이 10 내지 40개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 둘 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열은 2 내지 4개의 억제성 RNA 분자를 코딩한다. 예시적인 구현예에서, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 3 내지 5개, 또는 3 내지 6개의 억제성 RNA 분자가 제1 핵산 서열에 포함된다. 예시적인 구현예에서, 4개의 억제성 RNA 분자는 제1 핵산 서열에 포함된다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자는 인트론일 수 있다. 일부 구현예에서, 인트론은 프로모터 내에 존재한다. 예시적인 구현예에서, 인트론은 EF-1α 인트론 A이다. 일부 구현예에서, 인트론은, 예시적인 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 생성하는데 사용되는 패키징 세포에 불활성인 프로모터에 인접하여 하류에 존재한다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 둘 이상의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 둘 이상의 억제성 RNA 분자는 상이한 표적에 지시될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자는 동일한 표적에 대해 지시된다. 일부 구현예에서, RNA 표적은 제한되지 않지만, PD-1 (불활성화 억제); CTLA4 (불활성화 억제); TCRa (안전성 - 자가면역 억제); TCRb (안전성 - 자가면역 억제); CD3Z (안전성 - 자가면역 억제); SOCS1 (불활성화 억제); SMAD2 (불활성화 억제); miR-155 표적(활성화 촉진); IFN γ (CRS 감소); cCBL (신호전달 연장); TRAIL2 (사망 억제); PP2A (신호전달 연장); ABCG1 (콜레스토롤의 클리어런스를 제한함으로써 콜레스테롤 마이크로도메인 함량 증가)과 같은 T 세포에 의해 발현되는 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 일부 구현예에서, RNA 표적은 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 성분을 코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 억제성 RNA 분자 중 적어도 하나는 T 세포 수용체, 예시적인 구현예에서, T 세포의 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체(들)의 발현을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 표적은 게놈이 하나 이상의 miRNA를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 T 세포의 내인성 TCRα 또는 TCRβ 유전자로부터 전사된 mRNA일 수 있다. 예시적인 구현예에서, RNA 표적은 TCRα 유전자로부터 전사된 mRNA이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 일부 구현예에서, 상기 CAR은 미세환경 제한된 생물학적(MRB)-CAR이다. 다른 구현예에서, CAR의 ASTR은 종양 관련 항원에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR의 ASTR은 미세환경 제한된 생물학적(MRB)-ASTR이다.
T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 표적에 대해 지시된 하나 이상(예: 둘 이상)의 억제성 RNA 분자를 코딩하고, 상기 하나 이상의 핵산 서열의 제2 핵산 서열은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하고, 일부 예에서, 억제성 RNA 분자가 아닌 적어도 하나의 림프증식성 요소를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 제3 핵산 서열은, 일부 구현예에서, 임의의 또는 모든 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 리보스위치에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 뉴클레오사이드 유사체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오사이드 유사체는 항바이러스 약물이다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 일부 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고 그것에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 그것의 표면에 포함한다. 일부 구현예에서, 슈도타입화 요소는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포에 결합하는 능력을 유지하는 홍역 바이러스 F 폴리펩타이드, 홍역 바이러스 H 폴리펩타이드, VSV-G 폴리펩타이드, 또는 임의의 이의 단편일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 슈도타입화 요소는 VSV-G이다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 일부 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드; 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드포함하는 활성화 요소를 그것의 표면에 포함한다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합될 수 있고/있거나 CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 항-CD3 scFV 또는 항-CD3 scFvFc이다. 예시적인 구현예에서, CD3에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 항-CD3 scFvFc이다. 예시적인 구현예에서, CD28에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드는 CD80, 또는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 이의 세포외 도메인이다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태에서, 일부 구현예에서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 단클론성 항체 승인된 생물학적으로 인식된 도메인을 코딩하는 핵산을 그것의 표면에 포함한다.
PBMC, 예를 들어, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 이하 제공된 양태에서 키메라 폴리펩타이드는 키메라 림프증식성 요소(CLE)로서 본원에서 지칭될 수 있다. CLE 및 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이하 제공된 구현예는 CLE CAR 폴리뉴클레오타이드 구현예로서 본원에서 지칭된다.
이 섹션에서 상기 단락에서의 것들을 포함하여 림프증식성 요소를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태 및 구현예의 구현예 및 하위 구현예에서, 림프증식성 요소는 이 섹션에서 이하를 포함하여 본원에 제공된 임의의 키메라 림프증식성 요소일 수 있다. CAR을 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예의 다른 구현예 및 하위 구현예에서, 특정 예시적인 구현예에서 림프증식성 요소는, 예를 들어, 이 섹션에서 이하 제시된 바와 같이, 본원에 제공된 CLE CAR 폴리뉴클레오타이드 (및 관련된 폴리펩타이드) 구현예에 의해 코딩된 임의의 키메라 림프증식성 요소이다.
하나의 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
a) 사이토카인 수용체 또는 호르몬 수용체로부터의 세포외 및 막관통 도메인으로서, 상기 세포외 도메인 및 막관통 도메인 중 적어도 하나가 a. 사이토카인 수용체의 구성적으로 활성인 돌연변이체에서 발견되고 상기 세포외 서열이 상기 사이토카인 수용체의 리간드에 결합하지 않는 돌연변이, 또는 b. LMP1로부터의 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는, 세포외 및 막관통 도메인; 및
b) 표 7 내지 10에서 동정된 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 갖는 유전자의 세포내 도메인으로부터 선택되는 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
상기 직전 단락에서의 양상의 하나의 구현예에서, 상기 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉, 5')일 수 있거나, 또는 예시적인 구현예에서 상기 제2 세포내 도메인은 상기 제1 세포내 도메인으로부터 하류이다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합을 포함한다. 따라서, 명확화를 위해, 비제한적인 예시적 구현예에서, 선택된 폴리펩타이드는 M008-S212-S075이다. 이러한 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인은 TNFRSF8 전사체 변이체 1 (NM_001243_4)(S212)를 포함하거나 TNFRSF8 전사체 변이체 1 (NM_001243_4)(S212)이고, 제2 폴리펩타이드는 FCGR2C (NM_201563_5)(S075)를 포함하거나, FCGR2C (NM_201563_5)(S075)이다.
이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 따라서, 명확화를 위해, 비제한적인 예시적 구현예에서, 선택된 폴리펩타이드는 M008-S212-S075이다. 이러한 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인은 Myc LMP1 (NC_007605_1) (M008)을 포함하거나 Myc LMP1 (NC_007605_1) (M008)이고, 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인은 TNFRSF8 전사 변이체 1 (NM_001243_4) (S212)을 포함하거나 TNFRSF8 전사 변이체 1 (NM_001243_4) (S212)이고, 키메라 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인은 FCGR2C (NM_201563_5) (S075)를 포함하거나 FCGR2C (NM_201563_5) (S075)이다.
관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함하거나 인식 또는 제거 도메인을 포함하지 않는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 선택된 폴리펩타이드의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 클리어런스 태그를 포함하는 것을 제외하고, 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 상기 단락에 제공된 양태의 또 다른 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 7 내지 10에서 임의의 후보 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인에서 동정된 임의의 유전자의 임의의 세포내 도메인과 함께 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 포함한다.
이 양태의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양태의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 이 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고, 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 인식 또는 제거 도메인이 선택된 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
a) 사이토카인 수용체 또는 호르몬으로부터의 세포외 및 막관통 도메인으로서, 상기 세포외 도메인 및 막관통 도메인 중 적어도 하나가 c. 사이토카인 수용체의 구성적으로 활성인 돌연변이체에서 발견되고 상기 세포외 서열이 상기 사이토카인 수용체의 리간드에 결합하지 않는 돌연변이, 또는 d. LMP1로부터의 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는, 세포외 및 막관통 도메인; 및
b) CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA, 또는 MyD88의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
상기 직전의 단락에서의 양태의 하나의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉. 5')일 수 있거나, 예시적인 구현예에서, 상기 제2 세포내 도메인은 상기 제1 세포내 도메인으로부터 하류이다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 0, 1, 또는 2일째 이상의 35일째 대 7일째 농축물을 생성할 때 실시예 17의 임의의 표에서 동정된 선택된 폴리펩타이드에서 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래되고, 상기 제1 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 이 하위 구현예 또는 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 0, 1, 또는 2일째 이상의 35일째 대 7일째 농축물을 생성할 때 실시예 17의 임의의 표에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인이다. 이 단락에서의 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 상기 제1 세포내 도메인은 표 7 내지 10에서 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제1 세포내 도메인의 제1 유전자로부터 유래되고, 상기 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제2 세포내 도메인의 제2 유전자로부터 유래된다. 이 단락에서의 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 7 내지 10의 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 상기 제2 세포내 도메인은 표 7 내지 10의 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다.
상기 제1 핵산 서열이 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하는 바로 위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 상기 제2 세포내 도메인은 상응하는 제1 세포내 도메인에 대해 0, 1, 또는 2일째 이상의 35일째 대 7일째 농축물을 생성할 때 실시예 17의 임의의 표에서 동정된 제2 세포내 도메인으로부터 선택된다. 이러한 구현예의 하위 구현예에서, 상기 제1 세포내 도메인은 CD27, CD40, 또는 CD79B의 세포내 도메인으로부터 선택된다. 이 구현예의 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 0, 1, 또는 2일째 이상의 35일째 대 7일째 농축물을 생성할 때 실시예 17의 임의의 표에서 동정된 CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA, 또는 MyD88의 세포내 도메인으로부터 선택된다. 이 단락에서의 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 7 내지 10의 선택된 키메라 폴리펩타이드의 제1 유전자로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 표 7 내지 10의 선택된 키메라 폴리펩타이드의 제2 유전자로부터 유래된다. 이 단락에서의 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 7 내지 10의 선택된 키메라 폴리펩타이드의 제1 유전자로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9, 및 TNFRSF18의 세포내 도메인으로부터 유래된다. 이 단락에서의 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 7 내지 10에서 동정된 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 표 7 내지 10에서 동정된 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 클리어런스 태그를 포함하거나 클리어런스 태그를 포함하지 않는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 선택된 폴리펩타이드의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다.
이 양태의 또 다른 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, 또는 TNFRSF9의 세포내 도메인으로부터 선택되고, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 이 양태의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인의 유전자로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래되고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 이 양태의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 본 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함하는 것 이외에는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 인식 또는 제거 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 7 내지 10에서 동정된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
(a) 사이토카인 수용체 또는 호르몬으로부터의 세포외 및 막관통 도메인으로서, 상기 세포외 도메인 및 막관통 도메인 중 적어도 하나가 i. 사이토카인 수용체의 구성적으로 활성인 돌연변이체에서 발견되고 상기 세포외 서열이 상기 사이토카인 수용체의 리간드에 결합하지 않는 돌연변이, 또는 ii. LMP1로부터의 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는, 세포외 및 막관통 도메인; 및
(b) CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9, 및 TNFRSF18의 세포내 도메인으로부터의 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
실시예 17에서, 바로 위 양태에서 인용된 세포내 도메인은 주목할만한 제2 세포내 도메인으로서 동정되었다. 그러나, 일부 구현예에서 주목할만한 제2 세포내 도메인으로서 동정된 세포내 도메인은 이러한 구현예의 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인임이 이해될 것이다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
a) 사이토카인 수용체 또는 호르몬으로부터의 세포외 및 막관통 도메인으로서, 상기 세포외 도메인 및 막관통 도메인 중 적어도 하나가 a. 사이토카인 수용체의 구성적으로 활성인 돌연변이체에서 발견되고 상기 세포외 서열이 상기 사이토카인 수용체의 리간드에 결합하지 않는 돌연변이, 또는 b. LMP1로부터의 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 포함하는, 세포외 및 막관통 도메인; 및
b) CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8, TNFRSF9, IL31RA, 또는 MyD88의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 PBMs, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키고, 상기 세포외 및 막관통 도메인이 IL7RA Ins PPCL, LMP1, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C, 및 MPL S505N의 세포외 도메인 및 막관통 도메인으로부터 선택되는, 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다.
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 지시된 임의의 상기 양태의 특정 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 CSF3R T640N 및 MPL S505N으로부터 선택된다. 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 CSF3R T640N으로부터 유래되고, 특정 하위 구현에에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 CAR을 포함하지 않는다. 특정 하위 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 인식 및 제거 도메인이 임의적인 것 이외에는 표 6에 제공된 CSF3R T640N이다. 특정 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인은 인용된 세포내 및 세포외 도메인 및 인용된 제1 세포내 도메인을 포함하는 실시예 17 및 그 안의 표에 제공된 임의의 폴리펩타이드로부터 유래된다. 다른 하위 구현예에서, 세포외 및 막관통 도메인은 MPL S505N, 특정 구현예에서, 인식 및 제거 도메인이 임의적인 것을 제외하고 표 6에 제공된 MPL S505N의 세포외 도메인 및 막관통 도메인으로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노로부터 카복시 배향으로
a) 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 도메인; 및
b) 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 갖는 유전자의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하고,
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 부착된 실시예 18에 제시된 바와 같이, 이러한 키메라 폴리펩타이드는 배양 동안 IL-2에의 PBMC의 노출 부재하에, 예를 들어, 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현하는 PBMC(예: B 세포, T 세포, 또는 NK 세포)의 배양 배지에 IL-2의 첨가 부재하에 PBMC의 세포 증식을 촉진시킬 수 있다.
바로 위 단락에서 양태의 하나의 구현예 및 이 단락에서 이하 본원의 본 양태의 임의의 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 11 내지 16에서 제1 세포내 도메인, 다른 예시적인 구현예에서 표 11 내지 16에 열거된 제1 50, 25 또는 10 작제물 중 하나, 추가의 예시적인 구현예에서 표 11 내지 16의 6개 표 중 2, 3, 4, 또는 5개, 또는 모두에 열거된 제1 50, 25 또는 10 작제물 중 하나를 갖는 유전자의 세포내 도메인이다. 하나의 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 17에서 동정된 세포내 도메인이다. 표 17은 제2 세포내 도메인이 작제물 상에 존재하지 않는 7일째 내지 21일째 또는 35일째 사이에 PBMC의 증식을 촉진시킨 작제물을 동정한다. 이 구현예의 일부 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하거나 포함하지 않고 표 17의 막관통 도메인 및 세포내 도메인의 조합을 포함한다.
바로 위 단락에서 양태의 하나의 구현예 및 이 단락에서 이하 본원의 본 양태의 임의의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 세포외 도메인을 추가로 코딩하고, 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 임의의 양태 또는 구현예에서, 이량체화 모티프는 류신 지퍼 모티프 함유 폴리펩타이드, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, 및 Cd324 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 돌연변이체 및/또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본원의 임의의 양태 또는 구현예에서, 이량체화 모티프는 이량체화 제제를 필요로 할 수 있고, 이량체화 모티프 및 관련된 이량체화 제제는 FKBP 및 라파마이신 또는 이의 유사체, GyrB 및 코우메르마이신 또는 이의 유사체, DHFR 및 메토트렉세이트 또는 이의 유사체, 또는 DmrB 및 AP20187 또는 이의 유사체 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 인용된 이량체화 단백질의 돌연변이체 및/또는 이의 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본원의 임의의 얀태 또는 구현예의 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼 모티프는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어, c-jun으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드 영역이다.
이 양태의 하나의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉, 5')일 수 있거나, 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 하류일 수 있다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16의 임의의 후보 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인에서, 예시적인 구현예에서 표 11 내지 16에서 동정된 임의의 유전자의 임의의 세포내 도메인을 갖는 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인, 다른 예시적인 구현예에서 표 11 내지 16에 나열된 제1 50, 25, 또는 10 작제물 중 하나, 추가의 예시적인 구현예에서, 표 11 내지 16의 표 중 2, 3, 4 또는 5개 또는 모두에 나열된 제1 50, 25, 또는 10 작제물 중 하나를 포함한다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합을 포함한다.
이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 세포외 도메인은 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함한다.
관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함하거나 인식 또는 제거 도메인을 포함하지 않는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 선택된 폴리펩타이드의 인식 또는 제거 도메인 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다.
본 양태의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양태의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서 동정되고, 다른 예시적인 구현예에서, 표 11 내지 16에 나열된 제1 50, 25 또는 10 작제물 중 하나이고, 추가의 예시적인 구현예에서, 표 11 내지 16의 표 중 2, 3, 4 또는 5개, 또는 모두에 나열된 제1 50, 25, 또는 10 작제물 중 하나이다. 본 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서, 예시적인 구현예에서, 표 11 내지 16에 나열된 제1 50, 25 또는 10 작제물 중 하나에서, 추가의 예시적인 구현예에서, 표 11 내지 16의 표 중 2, 3, 4 또는 5개, 또는 모두에 나열된 제1 50, 25, 또는 10 작제물 중 하나에서 동정된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 및 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고, 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 인식 또는 제거 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인이고, 상기 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서 동정된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
a) 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 도메인; 및
b) LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R, 또는 CSF2RA의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하고,
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 단리된 폴리펩타이드가 본원에 제공된다.
바로 위 단락의 양태의 하나의 구현예 및 이 단락에서 하기 본원의 이 양태의 임의의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 세포외 도메인을 추가로 코딩하고, 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. 이 양태의 예시적은 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어, c-jun으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드이다.
제1 세포내 도메인이 LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R, 또는 CSF2RA의 세포내 도메인으로부터 선택되는 본 양태의 또 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉, 5')일 수 있거나, 예시적인 구현예에서, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 하류이다. 본 구현예의 하위 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 0, 1 또는 2 위의 21일째 대 7일째에 농축물을 생성할 때 실시예 18의 임의의 표에서 동정된 선택된 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래되고, 상기 제1 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 하위 구현예 또는 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 0, 1 또는 2 위의 21일째 대 7일째에 농축물을 생성할 때 실시예 18의 임의의 표에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인이다. 본 단락에서 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 11 내지 16의 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제1 세포내 도메인의 제1 유전자로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제2 세포내 도메인의 제2 유전자로부터 유래된다. 이 단락에서 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 11 내지 16의 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다. 본원의 본 양태 또는 임의의 구현예의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다.
제2 세포내 도메인을 포함하는 직전 선행하는 단락에서 구현예 및 하위 구현예의 양태 또는 하나의 하위 구현예 또는 추가의 하위 구현예의 하나의 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 LEPR, MYD88, IFNAR2, 및 MPL의 세포내 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 LEPR, IFNAR2, 및 MPL로부터의 세포내 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 MyD88 이외의 것이다. 또 다른 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 MyD88 이외의 것이고, 제2 세포내 도메인은 CD40 이외의 것이다. 본 단락에서 이 구현예의 하위 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 본 양태의 하나의 구현예에서, MPL은 제1 세포내 도메인이고, 제2 세포내 도메인은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드 중 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 구현예의 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 배향은 제2 도메인의 카복시 말단 잔기가 제1 도메인에 또는 제2 도메인과 제1 도메인 사이의 스페이서에 결합되도록 역전된다.
본 발명의 본 양태의 하나의 구현예에서, LEPR는 제1 세포내 도메인이고, 제2 세포내 도메인은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드 중 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 구현예의 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 배향은 제2 도메인의 카복시 말단 잔기가 제1 도메인에 또는 제2 도메인과 제1 도메인 사이의 스페이서에 결합되도록 역전된다.
본 발명의 이 양태의 하나의 구현예에서, IFNAR2는 제1 세포내 도메인이고, 제2 세포내 도메인은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드에서 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 구현예의 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 배향은 제2 도메인의 카복시 말단 잔기가 제1 도메인에 또는 제2 도메인과 제1 도메인 사이의 스페이서에 결합되도록 역전된다.
본 발명의 이 양태의 하나의 구현예에서, MyD88은 제1 세포내 도메인이고, 제2 세포내 도메인은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드에서 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이러한 구현예의 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 배향은 제2 도메인의 카복시 말단 잔기가 제1 도메인에 또는 제2 도메인과 제1 도메인 사이의 스페이서에 결합되도록 역전된다.
상기 제1 세포내 도메인이 LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R, 및 MPL의 세포내 도메인으로부터 선택되는 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드 양태의 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40, CD8B, CRLF2, CSF2RA, GCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA, 및 PRLR의 막관통 도메인으로부터 선택된다. 일부 예시적인 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40 또는 ICOS의 막관통 도메인이다. 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 LEPR, MYD88, IFNAR2, 및 MPL로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 CD40으로부터의 막관통 도메인이고, 제1 세포내 도메인은 MPL로부터의 세포내 도메인이다.
상기 제1 세포내 도메인이 LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R, 및 MPL의 세포내 도메인으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오타이드 양태의 일부 구현에에서, 제2 세포내 도메인은 CD40, CD79B, 또는 CD27로부터 유래된다. 일부 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 LEPR, MYD88, IFNAR2, 및 MPL로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 MPL이고, 제2 세포내 도메인은 CD40이다. 이 단락의 모든 구현예에서, 폴리펩타이드 상의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인의 순서는 역전될 수 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
a) 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 도메인; 및
b) 표 11 내지 16에서 동정된 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 갖는 유전자의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 키메라 폴리펩타이드가 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키고,
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 NKT 세포이다.
바로 위 단락의 양태의 하나의 구현예 및 본 단락에서 하기 본원의 본 양태의 임의의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 세포외 도메인을 추가로 코딩하고, 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 임의의 양태 또는 구현예에서, 이량체화 모티프는 류신 지퍼 모티프 함유 폴리펩타이드, CD69, CD71, CD72, CD96, Cd105, Cd161, Cd162, Cd249, CD271, 및 Cd324 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 및/또는 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예에서, 이량체화 모티프는 이량체화 제제를 필요로 할 수 있고, 이량체화 모티프 및 관련 이량체화 제제는 FKBP 및 라파마이신 또는 이의 유사체, GyrB 및 코우메르마이신 또는 이의 유사체, DHFR 및 메토트렉세이트 또는 이의 유사체, 또는 DmrB 및 AP20187 또는 이의 유사체 뿐만 아니라 이량체화하는 능력을 보유하는 인용된 이량체화 단백질의 돌연변이체 및/또는 활성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
CLE의 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 본원의 임의의 양태 또는 구현예의 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼 모티프는 c-jun 폴리펩타이드, 예를 들어, c-jun으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드 영역이다.
이 양태의 하나의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉, 5')일 수 있거나, 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인의 하류이다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 표 11 내지 16의 임의의 후보 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인에서 동정된 임의의 유전자의 임의의 세포내 도메인을 갖는 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인을 포함한다. 이 구현예의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합을 포함한다.
이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 이 양태의 하나의 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 세포외 도메인은 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함한다.
관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 또는 제거 도메인을 포함하거나 인식 또는 제거 도메인을 포함하지 않는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함한다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 상기 세포외 및 막관통 도메인이 선택된 폴리펩타이드의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인, 및 제2 세포내 도메인을 포함한다.
본 양태의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이 양태의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합이고, 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서 동정된다. 본 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서 동정된다. 관련된 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 세포외 및 막관통 도메인이 임의로 인식 및 제거 도메인을 포함하는 것을 제외하고, 선택된 폴리펩타이드의 세포외 및 막관통 도메인, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인을 포함하고, 상기 인식 또는 제거 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 인식 또는 제거 도메인, 또는 또 다른 인식 또는 제거 도메인이고, 상기 선택된 폴리펩타이드는 표 11 내지 16에서 동정된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 하나 이상의 핵산 서열의 제1 핵산 서열이 아미노에서 카복시 배향으로
c) 유형 I 막관통 단백질로부터의 막관통 도메인; 및
d) LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R 및 MPL의 세포내 도메인으로부터 선택된 제1 세포내 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하고,
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는, 단리된 폴리펩타이드가 본원에 제공된다.
바로 위 단락의 양태의 하나의 구현예 및 이 단락에서 하기 본원의 이 양태의 임의의 구현예에서, 제1 핵산 서열은 세포외 도메인을 추가로 코딩하고, 예시적인 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프를 포함한다. 이 양태의 예시적은 구현예에서, 세포외 도메인은 류신 지퍼를 포함한다. 일부 구현예에서, 류신 지퍼는 jun 폴리펩타이드, 예를 들어, c-jun으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, c-jun 폴리펩타이드는 ECD-11의 c-jun 폴리펩타이드이다.
제1 세포내 도메인이 LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R 및 MPL의 세포내 도메인으로부터 선택되는 본 양태의 또 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 제2 세포내 도메인을 추가로 코딩하고, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 상류(즉, 5')일 수 있거나, 예시적인 구현예에서, 상기 제2 세포내 도메인은 제1 세포내 도메인으로부터 하류이다. 본 구현예의 하위 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 0, 1 또는 2 위의 21일째 대 7일째에 농축물을 생성할 때 실시예 18의 임의의 표에서 동정된 선택된 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인의 유전자로부터 유래되고, 상기 제1 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인의 유전자로부터 유래된다. 본 하위 구현예 또는 구현예의 추가의 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인 조합은 0, 1 또는 2 위의 21일째 대 7일째에 농축물을 생성할 때 실시예 18의 임의의 표에서 동정된 선택된 키메라 폴리펩타이드로부터의 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인이다. 본 단락에서 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 11 내지 16의 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제1 세포내 도메인의 제1 유전자로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드의 선택된 제2 세포내 도메인의 제2 유전자로부터 유래된다. 이 단락에서 구현예 또는 하위 구현예의 또 다른 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 표 11 내지 16의 선택된 폴리펩타이드로부터 유래되고, 제2 세포내 도메인은 선택된 폴리펩타이드로부터 유래된다. 본원의 본 양태 또는 임의의 구현예의 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다.
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원의 임의의 방법 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 구현예의 특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 세포내 도메인, 예시적인 구현예에서 제1 세포내 도메인은 LEPR, MYD88, IFNAR2, MPL, IL18R1, IL13RA2, IL10RB, IL23R, 또는 CSF2RA로부터의 세포내 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 MPL로부터 유래된다. 예시적인 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 본원에 제공된 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원의 임의의 방법 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 구현예의 특정 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40, ICOS, FCGR2C, PRLR, IL3RA, 또는 IL6ST로부터 유래된다. 일부 예시적인 구현예에서, 막관통 도메인은 CD40 또는 ICOS로부터 유래된다. 예시적인 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 본원에 제공된 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원의 임의의 방법 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 구현예의 특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 세포내 도메인, 예시적인 구현예에서 제2 세포내 도메인은 CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF9, TNFRSF14, FCGRA2, CD3G, 또는 CD27로부터의 세포내 도메인이다. 일부 예시적인 구현예에서, 제2 세포내 도메인은 CD40, CD79B, 또는 CD27로부터 유래된다. 예시적인 하위 구현예에서예시적인 하위 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 본원에 제공된 이량체화 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, 예시적인 구현예에서, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원의 임의의 방법 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드 구현예의 특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 세포내 도메인은 표 11 내지 16의 임의의 키메라 폴리펩타이드의 세포내 도메인(P3 또는 P4 요소)이다. 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 표 11 내지 16의 임의의 키메라 폴리펩타이드의 임의의 P2, P3, 및 P4 조합을 포함한다.
막관통 도메인이 유형 I 단백질인 임의의 양태 및 구현예의 구현예에서, 막관통 도메인은 유형 I 사이토카인 수용체, 호르몬 수용체, T 세포 수용체, 또는 TNF-계열 수용체일 수 있다. 상기 키메라 폴리펩타이드가 세포외 도메인을 포함하고, 상기 세포외 도메인이 이량체화 모티프를 포함하는 임의의 양태 및 구현예의 구현예에서, 막관통 도메인은 유형 I 사이토카인 수용체, 호르몬 수용체, T 세포 수용체, 또는 TNF-계열 수용체일 수 있다. 이 단락에서 임의의 이러한 구현예의 예시적인 하위 구현예에서, 제1 세포내 도메인은 LEPR, MYD88, IFNAR2, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R, 및 MPL의 세포내 도메인으로부터 선택된다.
세포외 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 지시된 임의의 양태 및 구현예의 구현예에서, 세포외 도메인은 세포외 도메인의 카복시 말단의 20개의 아미노산 내에, 예시적인 구현예에서 스페이서가 세포외 도메인과 막관통 도메인을 분리하도록 세포외 도메인의 카복시-말단에 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 스페이서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 스페이서는 알라닌 잔기를, 일부 경우에는 알라닌 잔기만을 포함한다. 상기 스페이서를 포함하는 구현예에 대한 예시적인 하위 구현예에서, 세포외 도메인은 이량체화 모티프, 예를 들어, 류신 지퍼 모티프를 포함한다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태 및 구현예에 대한 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인은 키메라 폴리펩타이드가 PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 이의 능력을 보유하는 한 인용된 유전자의 돌연변이체 및/또는 단편을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 돌연변이체 및/또는 단편은 전형적으로 키메라 폴리펩타이드가 이의 생존 및 증식 촉진 활성을 보유하도록 신호전달 활성을 보유한다. 제1 세포내 도메인 및 제2 세포내 도메인은 PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태 및 구현예에 대한 순서로 역전될 수 다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 이러한 도메인에서, 제1 세포내 도메인은 제2 세포내 도메인이고, 그 반대도 마찬가지임이 이해될 것이다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태 및 구현예에서, 핵산 서열은 인식 또는 제거 도메인을 추가로 코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은 단클론성 항체 승인된 생물학적 인식 도메인이다. 일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은 EGFR을 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드, 또는 이의 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 인식 또는 제거 도메인은 MYC를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드, 또는 이의 에피토프를 포함한다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원에 제공된 임의의 양태 및 구현예에서, 제1 핵산 서열 및/또는 제2 핵산 서열은 B 세포, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 제1 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 제1 프로모터는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성이다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 본원에 제공된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 양태 및 구현예의 구현예에서, 제2 세포내 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구현예의 경우, 링커는 막관통 도메인과 제1 세포내 도메인 사이 및/또는 제1 세포내 도메인과 제2 세포내 도메인 사이에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인을 포함하는 구현예의 경우, 1 내지 4개의 알라닌 사이의 링커는 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 존재한다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열, 및 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 본원에 제공된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 양태 및 구현예의 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다.
PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 본원에 제공된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 양태 및 구현예의 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 코작형 서열, WPRE 요소, 및 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈을 추가로 포함하고, 상기 이중 정지 코돈 또는 상기 삼중 정지 코돈인 정지 코돈 중 하나 이상은 하나 이상의 전사 단위 중 적어도 하나로부터 판독의 종결을 규정한다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 CCACCAUG(G), CCGCCAT/UG(G), GCCGCCGCCAT/UG(G), 또는 GCCGCCGCCAT/UG로부터 선택된 코작형 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 핵산 서열의 개시 코돈에 대한 -3 및 +4 뉴클레오타이드는 모두 G를 포함한다. 코작형 서열을 포함하는 선행 구현예 및/또는 삼중 정지 코돈을 포함하는 하기 구현예와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 WPRE 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE 요소는 하나 이상의 전사 단위의 정지 코돈의 3' 및 폴리뉴클레오타이드의 5' 내지 3' LTR에 위치한다. 선행 구현예(즉, 폴리뉴클레오타이드가 코작형 서열을 포함하는 구현예 및/또는 폴리뉴클레오타이드가 WPRE를 포함하는 구현예) 중 어느 하나 또는 모두와 결합될 수 있는 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 전사 단위는 이중 정지 코돈 또는 삼중 정지 코돈인 하나 이상의 정지 코돈으로 종결된다.
하나의 양태에서, PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 본원에 제공된 임의의 단리된 폴리뉴클레오타이드 양태 및 구현예의 단리된 폴리뉴클레오타이드,
a. 복제의 기원;
b. 항생제 내성 유전자; 및/또는
c. 레트로바이러스 긴 말단 반복체(LTR), 또는 이의 활성 단편, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소, 및/또는 레트로바이러스 중심 폴리퓨린 관/중심 종결 서열(CTS) 요소로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 및/또는 레트로바이러스 서열을 포함하는 핵산 벡터가 본원에 제공된다.
이 양태의 특정 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 벡터는 복제 불능 바이러스 벡터, 예를 들어, 복제 불능 레트로바이러스 벡터 또는 입자이다. 이러한 구현예에서, 복제 불능 레트로바이러스 벡터 또는 입자는 5' 레트로바이러스 LTR, 또는 이의 활성 단편, 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소, 및 3' 레트로바이러스 LTR, 또는 이의 활성 단편을 포함할 수 있고, 상기 5' 레트로바이러스 LTR 및 3' 레트로바이러스 LTR은 단리된 폴리뉴클레오타이드에 측접한다. 일부 구현예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 시스-작용성 RNA 패키징 요소, 5' 긴 말단 반복체, 및/또는 3' 긴 말단 반복체를 코딩하는 핵산 서열에 대한 역 배향으로 존재한다.
일부 양태에서, PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예를 포함하는 레트로바이러스 게놈을 포함하고, 캡시드 및 외피를 추가로 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 본원에 제공된다. 레트로바이러스 입자는 본 개시내용에 제시된 임의의 레트로바이러스 요소를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 레트로바이러스 게놈은 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 헥산 서열 및 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다. 이러한 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 전형적으로 동일한 전사 단위 상에 존재한다.
또 다른 양태에서, 포유동물 세포로서, 상기 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포가 PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예에 따라서 임의로 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 B 세포, T 세포 또는 NK 세포인, 포유동물 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포 중 단리된 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)을 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다. 이러한 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 전형적으로 동일한 전사 단위 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이고, 특정 예시적인 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다.
또 다른 양태에서, PBMC, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는, 임의로 세포의 게놈으로 통합될 수 있는, 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예에 따르는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 패키징 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 중 단리된 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다. 이러한 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 전형적으로 동일한 전사 단위 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포는 레트로바이러스 입자의 생성을 위해 본원에 제공된 세포이다.
하나의 양태에서, 림프증식성 요소, 예시적인 구현예에서 본원에 제공된 임의의 구현예에 따르는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터로 세포를 형질되입하고/하거나 유전자 변형시키는 단계를 포함하는, PBMC, 예를 들어, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 방법으로서, 상기 키메라 폴리펩타이드가 PBMC 증식을 촉진시키는, 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 적어도 7, 14, 21, 28, 35, 42, 또는 60일 동안 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이 배양 단계는 IL-2의 부재하에, 예를 들어, 일부 구현에에서 IL-2를 포함할 수 있는 배지로 형질도입 후 수행된다.
하나의 양태에서, 세포를 PBMC, 예를 들어, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포의 세포 증식을 촉진시키는 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본원의 임의의 양태 및 구현예에 따르는 단리된 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 일부 비제한적인 구현예에서, 동종이계 세포, 자가 세포, 또는 동종이계 세포 이외의 것일 수 있는 B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포를 형질감염, 형질도입 및/또는 유전자 변형시키기 위한 방법이 본원에 제공된다(CLE 양태 및 구현예). 이 방법 양태의 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이고, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열을 추가로 포함한다. 환언하면, B 세포, T 세포, 및/또는 NK 세포를 형질감염, 형질도입 및/또는 유전자 변형시키기 위한 방법은 세포를 본원의 임의의 CLE 또는 CLE CAR 구현예에 따르는 단리된 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 리보솜 스킵 서열로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스킵 서열은 F2A, E2A, P2A, 또는 T2A이다. 이러한 구현예에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 전형적으로 동일한 전사 단위 상에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이고, 특정 예시적인 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 접촉 단계는 세포를 형질감염, 형질도입 및/또는 유전자 변형시키기 위한 효과적인 조건하에 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉시 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본원에 제공된 임의의 벡터 양태 및 구현예에 따르는 벡터 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 접촉시 비복제 레트로바이러스 입자에 존재한다.
본원의 임의의 양태의 일부 구현예에서, NK 세포는 NKT 세포이다.
하기 비제한적인 예는 오직 예시적인 구현예의 예시로서 제공되고, 결코 본 개시내용의 범위 및 취지를 제한하지 않는다. 또한, 본원에 개시되거나 특허청구된 임의의 발명은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 특징들의 모든 변형, 조합, 및 치환을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 임의의 하나 이상의 특징들은, 비록 구체적인 배제가 본원에 명백하게 제시되지 않았더라도, 본 특허청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있다. 방법에서 사용하기 위한 시약에 관한 개시내용은 본원에 개시된 구체적인 방법, 또는 당업자가 달리 이해하지 않는 한, 당업계에 공지된 다른 방법에 따라 그 시약의 사용을 포함하는 방법과 같은 것을 의미하는 것으로 (및 이를 위한 지지체를 제공하는 것으로) 의도된다는 것 또한 이해하여야 한다. 추가로, 명세서 및/또는 특허청구범위가 방법을 개시하는 경우, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 시약은, 당업자가 달리 이해하지 않는 한, 본 방법에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1. 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물에 특이적으로 반응하는 리보스위치의 생성.
본 실시예는 구아노신 및 데옥시구아노신에 결합하는 천연 구조적 리보스위치를 기반으로 하는 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 리보스위치는 리간드 뉴클레오사이드 유사체에 특이적으로 결합하는 압타머의 선택을 위한 편향된 라이브러리를 개발하기 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있었다. 이전에, 등온 적정 열량 측정법은 이러한 천연 리보스위치가 이의 천연 리간드에 결합한다는 것을 밝히는 데 사용되어 왔다. 추가 시험은 데옥시구아노신 스위치가 또한 뉴클레오사이드 유사체인 아사이클로비르 및 펜시클로비르와 약하게 상호작용하여 이 서열의 새로운 라이브러리로의 재설계를 유도하였음을 보여주었다. 리보스위치의 단일-가닥 영역은 돌연변이에 대해 표적화되었고, 아사이클로비르 또는 펜시클로비르에 특이적으로 반응하는 변이체 서열이 선택되었다.
물질
선택 성분 구아닌, 구아노신, 데옥시구아노신, 아사이클로비르, 및 펜시클로비르는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 주문받았다. 아사이클로비르는 초기 표적이었던 반면, 펜시클로비르는 후반 라운드에서 사용된 특후 관심의 대상이 되는 피분석물이었고, 구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신은 카운터-표적으로서 사용되었다. 구획화 매체로서 사용되는 그래핀 옥사이드(GrO)는 옹스트론 머티리얼즈(Angstron Materials: 미국 오하이오주 데이턴)로부터 구입했다. HEPES (pH 7.3) 및 MgCl2는 아메르스코 LLC.(Amersco LLC.: 미국 오하이오주 솔론)로부터 구입했다. KCl은 테크노바(Teknova: 미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입했다. 선택 완충제는 5X (50 mM HEPES, 100 mM KCl, 20 mM MgCl2, pH 7.3으로서 1X)로 제조했다. 표적, 카운터-표적, 및 올리고는 예비 분석 및 압타머 스크리닝을 위해 뉴클레아제를 함유하지 않는 물 중에서 재구성했다. 모든 표적에 대하여 분취물을 제조하고, 저장 수명을 최대화시키기 위해 -20℃에서 보관했다.
압타머 라이브러리 생성
IBA 게엠베하(IBA GmbH: 독일 괴팅겐)에 의해 도 14의 서열의 역 상보체로서 초기 압타머 라이브러리 주형을 합성했다. 도 14에서, 박스 내의 뉴클레오타이드는 공지된 서열 중의 단일-가닥이고, 여기서, 합성 동안에 도입된 "돌연변이"를 통해 원래 표적의 유사체에 더욱 잘 결합할 수 있다. 실선으로 윤곽 표시된 박스 내의 뉴클레오타이드의 경우, 치환 돌연변이가 허용되었고; 파선으로 윤곽 표시된 박스 내의 뉴클레오타이드의 경우, 치환 돌연변이 뿐만 아니라, 삽입 또는 결실도 허용되었다. 프라이머는 IDT (미국 아이오와주 코럴빌)에 의해 단일-가닥 DNA로서 합성되었다. 티타늄 Taq DNA 폴리머라제 (클론테크(Clontech); 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용한 프라이머 연장을 위해 T7 프라이머 (서열번호: 240)를 라이브러리 주형 서열과 조합했다. 앰플리스크라이브 T7 하이 일드 트랜스크립션 키트(Ampliscribe T7 High Yield Transcription Kit) (에피센트르(Epicentre; 미국 위스콘신주 매디슨))를 사용하여 프라이머 연장된 물질을 전사시킨 후, 선택에 사용하기 전, 8 M 우레아를 이용하여 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 상에서 정제했다. 선택 동안, 역방향 프라이머 (서열번호: 241)를 사용하여 슈퍼스크립트 IV 리버스 트랜스크립타제(SuperScript IV Reverse Transcriptase) (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 라이브러리를 역전사시키고, 티타늄 Taq DNA 폴리머라제 (클론테크; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 증폭시켰다. 서열번호: 248의 압타머는 -3 내지 -1의 J2-3 루프 변이 및 약 2.25x1010의 다양도를 가졌다. 서열번호: 250의 압타머는 0 (천연) 내지 +5의 J2-3 루프 변이 및 약 9.38x1014의 다양도를 가졌다. 약 9.38x1013의 전체 다양도하에, 조합된 라이브러리 풀 중에서 등몰의 다양도를 얻기 위해 두 올리고뉴클레오타이드 (서열번호: 249 및 250)를 1:4,160의 비로 혼합했다.
라이브러리 스크리닝
그래핀 옥사이드에 단일-가닥 핵산에 대한 고친화성을 부여하는 π-π 상호작용을 이용하면서(참조: Zeng 등, 2015), 그래핀 옥사이드-지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (GO-SELEX) 접근법(도 15)(문헌: Park 등, 2012)을 사용하여 라이브러리 스크리닝을 수행했다. 본 목적은 1X 선택 완충제와, 또는 카운터-표적 (구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신)과는 상호작용을 하지 않지만, 양성 표적 아사이클로비르에는 결합한 서열을 선택하는 것이었다.
매 라운드마다, 제공된 양의 라이브러리를 먼저 1X 선택 완충제 중에서 리폴딩시켰다 (90℃에서 5분 변성, 4℃에서 5분, 이어서, 실온). 이어서, 카운터-표적을 리폴딩된 라이브러리에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양했다. 단 이는 라운드 1 및 2에서는 배제되었는데, 여기서 라이브러리를 GrO 상에 로딩시키는 것을 돕기 위해 단기간 동안 (< 1분) 카운터-표적을 포함시켰다. 라이브러리가 카운터-표적 및 완충제 성분과 상호작용할 수 있게 허용한 후, 비결합 라이브러리는 37℃에서의 10분 배양 기간에 걸쳐 GrO (질량은 라운드 출발시 라이브러리 질량의 100배와 같다) 상에 로딩시켰다. 이어서, 용액을 7,000 x g로 원심분리하여 GrO를 침강시켰다. 카운터-표적에 및/또는 완충제에 결합된 서열을 함유하는 상청액은 제거했다. 이어서, 침강물을 200 ㎕ 1X 선택 완충제로 2회 세척하고, 매회 세척 후에는 7,000 x g로 원심분리하고, 상청액은 제거했다. 이어서, 양성 표적 함유 용액을 첨가하고, 본질적으로, 표적이 라이브러리 결합에 대하여 그래핀 옥사이드와 경쟁할 수 있도록 허용하면서, 하기 표 1에 명시된 조건하에 37℃에서 최대 60분 동안 라이브러리가 GrO로부터 용출될 수 있게했다. 표적에 더욱 강력하게 결합한 서열은 그래핀 옥사이드으로부터 탈착될 것이며, 배양 종료시 표적에 결합된 상태 그대로 남아있게 될 것이다. 최종 원심분리 단계를 통해 상청액에 위치하는 방출 물질을 그래핀 옥사이드에 결합된 상태 그대로 남아 있는 비반응성 라이브러리로부터 분리시켰다.
양성 선택 후, 이어서, 8 M 우레아와 함께 10% 변성 PAGE를 이용하여 정제된 회수된 RNA를 분광광도계 판독을 사용하여 정량화하고(표 1), 슈퍼스크립트 IV를 이용하여 역전사시키고, 티타늄 Taq DNA 폴리머라제와 함께 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 증폭 생성물을 다음 라운드의 선택을 위해 RNA로 전사시켰다.
선택 과정 동안 3 단계의 엄격도를 실행했다(표 1). 처음 2회의 선택 라운드에서는 GrO 상에의 라이브러리 로딩을 최대화시키기 위해 카운터-표적에 대한 스크리닝을 포함시키지 않았다. 추가로, 라이브러리 회수를 최대화시키기 위해 양성 배양에서 다량의 아사이클로비르를 사용하였고, 따라서, 이는 저엄격도로 지칭된다. 라이브러리 회수 달성 후, 중간 엄격도 조건으로서 카운터-표적 배양을 도입했다. 또한, 표적에의 결합에 대한 라이브러리 경쟁을 증가시키기 위해 이러한 3회의 라운드 동안 아사이클로비르 대 라이브러리의 비를 감소시켰다. 일단 10% 초과의 회수율이 달성되면, 최종 라운드의 고엄격도 선택을 실행했다. 양성 배양 시간이 단축되는 동안, 카운터-표적/라이브러리 비는 높은 상태 그대로 유지되어 있고, 양성 표적/라이브러리 비는 1:1이 되었고, 이로써 더욱 신속하게 결합 서열을 선택할 수 있었다. 일단 라이브러리 회수율이 2회 이상의 라운드의 고엄격도 조건 이후에도 10% 초과로 유지된 것으로 나타났으면, 동시 평가을 수행했다.
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표 1. 선택 및 평가 조건. 각 라운드에 대해 회수된 샘플과 유입 라이브러리의 비로서의 회수율과 함께 선택 또는 배양의 각 라운드에 사용된 조건. 선택 과정에 걸쳐 라이브러리 농축을 모니터링했다. *카운터-표적은 로딩에 사용하였지만, 연장된 배양에는 사용하지 않았다. †풀링된 카운터-표적으로 수행된 프리-로딩 배양. ‡양성 표적 아사이클로비르로 수행된 프리-로딩 배양. 이는 교차 반응성 종의 회수를 최소화하기 위해 수행된다. 다음 약어가 본 표에 사용된다: "X-표적"은 카운터-표적이고; "(+) 표적"은 아사이클로비르 또는 펜시클로비르이고; "(+) 배양 시간(분)은 "라이브로리:(+) 표적" 용액이 Gro 상에서 배양된 시간이다. G0은 0세대 등이고; R1은 라운드 1 등이다. 동시 평가(동시 1 및 동시 2)의 경우, 배양은 (-) 1X 선택 완충제만, (X) 1X 선택 완충제 중 카운터-표적, (+) 1X 선택 완충제 중 아사이클로비르, 및 (P) 1X 선택 완충제 중 펜시클로비르.
2회의 동시 평가을 위해, 평가하고자 하는 라이브러리를 상기와 같이 제조 및 리폴딩을 위해 4개의 동량으로 나누었다(도 16). 각 조건마다, 50pmol의 라이브러리를 1X 선택 완충제와 조합하고, 리폴딩시킨 후 (90℃에서 5분 동안, 4℃에서 5분 동안), 37℃에서 30분 동안 1X 선택 완충제 중 200μL의 10 μM 조합된 카운터-표적과 함께 배양시켰다. 이어서, 이러한 샘플을, 샘플 중 라이브러리 질량의 100배량의 그래핀 옥사이드 상에 로딩시키고, 37℃에서 10분 동안 배양시킨 후, 상기와 같이 200 μL의 1X 선택 완충제로 2회 세척했다. 이어서, 로딩된 그래핀 옥사이드 샘플을 1X 선택 완충제 중 200 μL의 적절한 평가 조건 (1X 선택 완충제만, 10 μM 풀링된 카운터-표적, 1 μM 펜시클로비르, 제1 동시 평가을 위해 1 μM 아사이클로비르, 또는 제2 동시 평가을 위해 0.5 μM 아사이클로비르; 표 1에서 이러한 조건은 각각 (-); (X); (P); (+); 및 (+)로 제시되어 있다)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. 최종 원심분리 단계를 통해 탈착된 반응성 라이브러리를 비반응성 그래핀 옥사이드 결합 라이브러리로부터 분리시켰다. 분광광도 판독을 사용하여 반응성 라이브러리를 정량화하고(표 1), 8 M 우레아와 함께 10% 변성 PAGE를 이용하여 확인하고, 제2 동시 평가을 위해 제조했다. 본 추적 평가에서는 양성 샘플의 프리-로딩 배양을 위해 카운터-표적을 계속 사용하였지만, 각각의 다른 샘플의 프리-배양을 위해서는 양성 표적 아사이클로비르를 사용했다. 이는 소정의 샘플 중의 교차 반응성 서열 (즉, 양성 샘플 중 카운터-표적에 대하여 반응성, 음성, 카운터-표적, 또는 펜시클로비르 샘플 중 아사이클로비르에 대하여 반응성)의 표현을 최소화시키기 위해 수행했다. 제2 동시 평가로부터 회수된 물질을 분광광도 판독을 사용하여 정량화하고(표 1), 8 M 우레아와 함께 10% 변성 PAGE를 이용하여 확인하고, 이중 가닥 DNA를 생성하기 위해 역전사 및 PCR에 의한 서열분석을 위해 제조했다.
서열분석
초기 라이브러리에 대해 10회 초과 라운드의 GrO 기반 선택 및 동시 평가를 수행했다(표 1). GO-SELEX 프로세스는 다수회 라운드의 선택에 걸쳐 관심의 대상이 되는 소정의 표적에 결합하는 서열은 농축시키고, 비표적 화합물 또는 완충제 성분에 결합하는 서열은 제거하도록 설계된 것이다. 그 결과, 서열분석되는 집단은 다중 카피의 잠재적 압타머 후보를 함유할 것으로 예상된다.
단일 단부 리드 기술을 사용하여 동시 평가 후, 일루미나(Illumina) MiSeq 시스템 (미국 캘리포니아주 샌디에고)을 실행하여 압타머 라이브러리를 서열분석했다. 스크리닝 프로세스에 기인하여 오류 및 편차를 도입할 수 있는 종래 SELEX의 요건인 다수회의 스크리닝 라운드는 심층 서열분석 및 후속 데이터 분석을 통해 감소된다(문헌: Schutze 등, 2011). 다음 5개의 샘플을 서열분석했다: 아사이클로비르에 반응하는 최종 세대 라이브러리, 카운터-표적에 반응하는 최종 세대 라이브러리, 1X 선택 완충제에 반응하는 최종 세대 라이브러리(음성 조건), 아사이클로비르에 반응하는 끝에서 두 번째 세대 라이브러리, 및 관심 있는 추가의 표적인 펜시클로비르에 반응하는 최종 세대 라이브러리. 이러한 데이터 세트로부터, 서열 계열을 압타머 후보 확인을 위해 95%의 상동성(돌연변이, 결실, 및 삽입을 고려한 서열 유사성)에서 작제했다. 아사이클로비르에 반응하는 라이브러리로부터 1,711,535개의 원시 서열 (124,600개의 특이 서열) 및 펜시클로비르에 반응하는 라이브러리로부터 2,074,832개의 원시 서열 (110,149개의 특이 서열)이 존재했다.
압타머 후보 선택
서열 계열 작제는 주로 서열 유사성에 초점을 맞추었다. 이는 양성 표적 집단 중의 서열 빈도가 고려되기는 하지만, 유사한 서열 사이의 변이 정도가 더욱 크게 강조되었고, 여기서, 95%의 상동성이 최소 요건이라는 것을 의미한다 (전체 서열에 걸쳐 100% 일치되는 것이 계열을 합류시키는 데 반드시 필요한 것은 아니며, 최대 2개의 염기가 불일치, 삽입, 또는 결실될 수 있다). 따라서, 최대수의 구성원을 갖는 계열이 압타머 후보로서 높은 순위를 차지할 것으로 예상될 것이다. 계열을 작제한 후, 소정의 집단 중 계열의 상대적인 존재에 대하여 고려할 수 있고 - 음성 및 카운터-표적 집단에서 빈번하게 발생하는 계열은 완충제 또는 카운터-표적 성분에의 결합에서 어느 정도의 비특이적인 상호작용을 보이는 바, 더 약한 후보인 것으로 간주된다. 추가로, 농축 비율이 집단 중 나머지에 대한 후보의 결합 친화도와 연관이 있는 바, 높은 비율의 농축 (즉, 최종 양성 집단과 끝에서 두 번째 양성 집단 사이의 큰 비율)을 입증하는 계열은 이의 후보 자격을 개선시킨다(참조: Levay 등, 2015; Wang 등, 2014). 상기 조건하에서, 수개의 후보 계열은 아사이클로비르(표 2) 및 펜시클로비르를 결합하는 강력한 후보인 것으로 보였다.
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표 2. 아사이클로비르 및 펜시클로비르를 결합시키는 후보. 아사이클로비르 결합 RNA 리보스위치의 비줄기 영역에 상응하는 DNA 서열. 7개의 계열이 스크린에서 동정되었다: 각 계열에 1 내지 39개 서열을 갖는 582, 769, 795, 935, 946, 961 및 996. 계열 중 각 서열에 대한% 동일성은 각 계열 내에서 가장 일반적인 서열(582-1, 769-1, 795-1, 935-1, 946-1, 961-1 및 996-1)과 비교했다. 계열 중 각 서열에 대한% 동일성은 또한 야생형 서열과 비교했다.
양성 표적 아사이클로비르는 582-1 (서열번호: 108), 769-1 (서열번호: 147), 795-1 (서열번호: 164), 935-1 (서열번호: 183), 946-1 (서열번호: 198), 961-1 (서열번호: 220) 및 996-1(서열번호: 221)에 상응하는 7개의 강력한 후보(서열번호: 87-93; 줄기 영역을 포함하는 RNA 서열)을 생성했고, 각각 F1A로 지정했다(도 17). 이러한 서열은 각 계열에서 가장 일반적인 서열이었다(각 계열의 모든 구성원의 DNA 서열은 582 (서열번호: 108-146); 769 (서열번호: 147-163); 795 (서열번호: 164-182); 935 (서열번호: 183-197); 946 (서열번호: 198-219); 961 (서열번호: 220); 및 996 (서열번호: 221)이다). 컨센서스 서열은 각 계열에 대한 각 뉴클레오타이드 위치에서 모든 가능한 치환 또는 갭을 나타낸다(서열번호: 222-226). 본 목표가 데옥시구아노신에 결합하는 것으로 공지된 RNA에 기초하여 라이브러리로부터 압타머를 동정하고자 하는 것이기 때문에, 강력한 후보는 카운터-표적 집단에는 최소로 존재할 필요가 있다. 후보 F1A-795, F1A-935, 및 F1A-946은 카운터-표적 집단에서 검출되지 않았기 때문에, 상기 기준을 매우 잘 충족시켰다. F1A-996 및 F1A-961은 비록 카운터-표적 집단에서 최대 작은 정도로 나타나지만, 이와 관련해서는 그 다음으로 가장 우수한 후보인 것으로 간주된다. 또한, 후보는, 그러한 서열이 아사이클로비르의 영향 없이도 GrO로부터 탈착되었고, 거짓 양성을 나타낼 수 있기 때문에, 음성 집단에서 최소로 출현하여야 한다. F1A-935 및 F1A-946은 음성 집단에서는 발견되지 않았기 때문에, 이 기준하에서 또한 이상적으로 수행했다. 후보 F1A-769는 음성 집단에서 최소로 검출되었고, 후보 F1A-961, F1A-795 및 F1A-996은 조금 덜 수행했다. 농축 비율은 고려되어야 하는 마지막 조건이었고, F1A-935, F1A-946, 및 F1A-769는 적절하게 수행한다. 후보 F1A-582는 비록 다른 기준하에서는 잘 수행하지 않았지만, 가장 큰 농축 비율을 보였기 때문에 포함시켰다. 남은 후보는 이러한 4개와 비교하여 잘 수행하지 않았지만, 허용되는 특징들을 나타냈다.
추가의 표적 펜시클로비르는 7개의 강력한 후보(서열번호: 94-100)를 생성했고, 각각 F1P로 지정했다(도 18). 이전과 같이, 목표는 데옥시구아노신에 결합하는 것으로 공지된 RNA에 기초하여, 10 라운드 이후 아사이클로비르(아사이클로비르)에의 결합에 대하여 농축된 라이브러리로부터 분기되는 압타머를 라이브러리로부터 동정하는 것이었다. 강력한 후보는 교차 반응성을 최소화시키기 위해 아사이클로비르 및 카운터-표적 집단, 둘 모두에 최소로 존재할 필요가 있다. 후보 F1P-923은 제1 기준을 충족시켰고, 후보 F1P-710은 제2 기준을 충족시켰고, 후보 F1P-584는 어느 정도까지는 두 기준을 충족시켰다. 후보 F1P-584는 또한 음성 조건에 비하여 펜시클로비르에 대해 중간 정도의 호의성 뿐만 아니라, 아사이클로비르에 대한 이전 세대의 반응성 대비 중간 정도의 농축을 입증했다. 남은 후보는 아사이클로비르에 비하여 펜시클로비르에 대해 최소의 호의성, 또는 카운터-표적에 비하여 펜시클로비르에 대해 최소의 호의성을 입증했다(각각 F1P-837 및 F1P-932; F1P-991 및 F1P-718). 비록 이 기준은 후보가 이의 유사체에 비하여 펜시클로비르에 대해 선택성을 입증하지 않는 경우 유의적이지는 않지만, 이들 4개의 후보는 거짓 양성의 기회를 최소화하는 음성 조건에 비하여 펜시클로비르에 대해 약간의 호의성을 입증했다. 농축 비율은 고려되어야 하는 마지막 조건이었고, F1P-923, F1P-932, 및 F1P-584는 적절하게 수행한다.
선택된 압타머의 정성적 PAGE 평가를 수행했다. 개별적으로 합성되고, 전사된 압타머를 생리적 Mg++(0.5 mM)하에 그래핀 옥사이드(GrO) 상에서 선택을 진행하고, 아사이클로비르 (+) 또는 카운터-표적 (x)을 이용하여 용출시켰다. 각 샘플에 대해 특이적으로 용출된 압타머 분획에 대해 분석을 위해 PAGE에 적용했다.
100 pmol의 각 압타머 후보 (1 래인당 시험마다)를 1X 변형된 선택 완충제 (50 mM HEPES, 100 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, pH 7.3)에 재현탁시키고, (90℃에서 5분 동안, 이어서, 4℃에서 5분 동안) 재폴딩한 후, 이어서, 37℃에서 30분 동안 (각각) 200 pmol의 풀링된 카운터-표적 또는 표적과 함께 배양시켰다. 최종 라이브러리 농도는 0.5 μM이었고, 표적/카운터-표적 농도는 1 μM이었다 (배양 용적은 200 ㎕였다).
표적/카운터-표적 배양 후, 250 ㎍의 GrO (옹스트론 머터리얼즈: 미국 오하이오주 데이턴)를 첨가하여 비결합된 후보를 흡착시켰다(37℃에서 10분 배양).
샘플을 7,000 x g으로 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 회수하고, 40 mM EDTA와 함께 2X 포름아미드를 사용하여 변성시키고, 8 M 우레아를 사용하여 10% 변성 PAGE (공급업체: 아메리칸 바이오아날리티컬(American Bioanalytical); 카탈로그 번호 AB13021-01000. AB13022-01000) 상에서 작동시켰다. 작동 완충제는 1X TBE였다(공급업체: 암레스코(Amresco)/VWR; 카탈로그 번호 0658-20L, 탈이온수를 사용하여 희석됨). DNA 래더는 20/100 DNA 래더(IDT)였다. 겔을 겔 스타(Gel Star)(론자, 50535)로 염색하고, 청색광 투과조명기 상에서 영상화했다.
후보 F1A-769, F1A-795, F1A-946, 및 F1A-996은 본 정성적 PAGE 평가에서 선택적 양성 반응을 보이는 것으로 나타난다(아사이클로비르 표적에 의한 GrO로부터 압터머의 우수한 용출 및 카운터-표적에 의한 더 낮은 또는 최소 용출).
결론
12회 라운드의 반복된 스크리닝 및 동시 평가 이후에 아사이클로비르에 대한 강력한 후보가 동정되었고; 2회 라운드의 스크리닝 및 동시 평가 이후에 펜시클로비르에 대한 합리적인 후보가 동정되었다.
실시예 2: 조건부 scFv의 단리
잠재적 스플라이스 부위 취약부를 제거하고, 중복 올리고 합성에 의해 종양 항원 특이적 scFv를 합성하고, 아사이클로비르 반응성 요소 및 영장류 CD3ζ 프로모터를 함유하는 CAR 셔틀 작제물로 클로닝한다. 초기 프로토타입으로서, CD8-알파 신호 펩타이드, 스토크, 및 막관통 도메인을 포함하는 EPCAM 또는 ERBB2scFv의 항-ECD를 사용한다. 미국 특허 제8,709,755호 및 PCT 공개 번호 WO/2016/033331A1에 기재된 방법을 사용하여 또는 허용 및 비허용 조건하에서 인간 파지 라이브러리로부터의 직접적인 선택에 의해 고형 종양 미세환경 제한된 CAR 생성물을 생성한다. 간단히, 비오티닐화된 인간 IgG에 결합된 스트렙타비딘 자기 비드 (써모피셔(ThermoFisher: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 클리어런스 후, 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs: 미국 뉴욕주 셜리)로부터의 인간 VH x VL 라이브러리를 하기 종양 허용 조건하에서 패닝한다: 100 ㎍/ml 히알루로난, 100 kDa 분획 (라이프코어 바이오메디컬(Lifecore Biomedical: 미국 미네소타주 채스카)), 20 mg/ml 재조합 HSA (사이젠(Cyagen: 미국 캘리포니아주 산타 클라라)), 25 mM 중탄산나트륨 완충제 중 200 ng/ml 재조합 인간 VEGF, 2 μM 아데노신, 10 mM 나트륨 락테이트 pH 6.7. 37℃에서 허용 조건하에서 EPCAM 및 ERBB2 접합된 비드의 비오티닐화된 표적 수용체 ECD에의 결합을 수행한 후, 허용 조건하에서 연속 세척한다. 생리적 조건 (1 ㎍/ml 히알루로난, 20 mg/ml HSA, 25 mM 비카보네이트, 1 mM 나트륨 락테이트 pH 7.2)을 이용하여 파지를 방출시킨 후, 산 용출을 사용하여 견고한 변이체를 용출시키고, 1 M 트리스로 신속히 중화시킨다. 파지를 확장시키고, 긴 판독 서열분석 (팩바이오(PacBio: 미국 캘리포니아주 멘로 파크))을 사용하여 VH x VL 쇄의 심층 서열 분석을 위해 게놈 DNA를 나눈다. 농축을 위해 패닝을 반복할 수 있다. 표적에 대한 농축에 비하여 파지 배양 프로세스 동안 판독치의 차별적 증폭을 보이는 VH x VL 서열은 추가 분석을 위해 배제시킨다. 생리적 조건과 비교하여 종양 선택적 환경에서 CAR 매개 종양 항원 발현 표적 세포 사멸을 시험하기 위해, CAR 작제물 발현 시스템으로의 클로닝, 렌티바이러스의 생성, 및 T 세포로의 형질도입에 의한 추가의 특성화를 위해 종양 허용 조건하에서 농축되지만, 생리적 조건하에서는 방출되는 표적에 대하여 선택적으로 결합하는 파지를 선택한다.
실시예 3: 미세환경 제한된 scFv를 사용하는 MRB-CAR의 생성
출원 WO/2016/033331A1에 기재된 바와 같이, 낮은 pH 미세환경에 대하여 선택성이 낮은 VH 및 VL 서열을 진화에 의해 적용함으로써 제조된 미세환경 제한된 ASTR을 수득했다. 정상 조직 MRB-CAR의 미세환경과 비교하여 종양 미세환경의 감소된 pH에서 증가된 활성을 갖는 두개의 동족 종양 항원, 표적 1 및 표적 2 중 어느 하나에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)는 미세환경 제한된 단일 쇄 항체의 중쇄 및 경쇄를 다른 CAR 도메인과 함께 렌티바이러스 발현 벡터 내로 도입시켜 일련의 후보 MRB-CAR을 생성함으로써 제조되었다. 이러한 MRB-CAR은 모듈의 다양한 조합을 포함했다. MRB-CAR은 아미노로부터 카복시 말단으로 위치 1 내지 9에서, CD8 신호 펩타이드(sp)(P1)(서열번호: 74); 미세환경 제한된 항-표적 1 ASTR 및 항-표적 2 ASTR(P2-P4); T2A 및 T2B의 경우 CD8로부터의 스토크 및 막관통(TM) 도메인(서열번호: 75)(P5) 또는 CD 137로부터의 보조 자극성 도메인(P6)(서열번호: 1) 또는 T1A의 경우에 CD28로부터의 스토크 및 막관통(TM) 도메인(서열번호: 76)(P5) 및 ICΔ로부터의 보조 자극성 도메인(서열번호: 3)(P6); CD3Z(서열번호: 13)로부터의 활성화 도메인(P7); 2A-1 리보솜 스킵 서열(서열번호: 77)(P8); 및 예시적인 eTAG(서열번호: 78)(P9)를 포함한다.
Pan T 세포 (AllCells, Alameda, CA)를 재조합 렌티바이러스 입자로 형질도입하여 일련의 후보 MRB-CAR을 발현시키고, 형질도입된 세포 퍼센트는 FACS를 사용하여 eTag를 발현하는 세포의 퍼센트를 결정함으로써 계산했다. Pan T 세포는 후보 MRB-CAR을 코딩하는 재조합 렌티바이러스 입자로 성공적으로 형질도입되었다.
표적 1 또는 표적 2(각각 CHO-표적 1 및 CHO-표적 2)를 발현하는 표적 세포에 대한 후보 MRB-CAR의 세포독성 활성을 xCELLigence 시스템(ACEA)에 의해 pH 7.4 (정상 조직) 또는 pH 6.7(종양 미세환경의 감소된 pH)에서 분석했다. 간단히, 표적 1 또는 표적 2를 발현하는 표적 세포를 실험 하루 전에 종양 조건부 또는 정상 배지로 20,000 세포/웰로 96-웰 E-플레이트에 씨딩했다. 이펙터 세포를 100IU/mL의 IL-2를 함유하는 인간 T 세포 배지에서 2일 동안 휴지시키고, 3:1, 1:1 및 0.3:1의 이펙터 세포/표적 세포 비(E/T)에서 표적 세포를 함유하는 실험 웰에 첨가했다.
임피던스 판독치는 이펙터 세포 첨가 후 약 40시간 동안 5분 마다 취하고, 임피던스는 세포 지수(CI)로서 보고되었다. 특이적 세포용해의 백분율은 다음과 같이 계산했다; ((CI 표적 + 대조군 바이러스 형질도입된 이펙터 T 세포) - (표적 1 또는 표적 2에 지시된 CAR로 형질도입된 CI 표적 + 이펙터 T 세포))/(CI 표적 + 대조군 바이러스 형질도입된 이펙터 T 세포) × 100.
결과
후보 MRB-CAR의 다수는 pH 7.4에서보다 pH 6.7에서 표적 세포에 대해 보다 높은 세포독성 활성을 가졌다. pH 7.4에서보다 pH 6.7에서 표적 세포를 용해시키는데 보다 효과적인 예시적인 MRB-CAR은 MRB-CAR T1A, MRB-CAR T2A 및 MRB-CAR T2B를 포함했다. MRB-CAR T1A의 ASTR은 5'에서 3'로 링커 1(서열번호: 283)에 의해 분리된 표적 1 MRB VH (서열번호: 281) 및 표적 1 MRB VL(서열번호: 282)를 포함했다. MRB-CAR T2A의 ASTR은 5'에서 3'로 링커 2(서열번호: 291)에 의해 분리된 표적 2 MRB VH(서열번호: 289) 및 표적 2 MRB VL (서열번호: 290)을 포함했다. MRB-CAR T2B의 ASTR은 VH와 VL의 위치가 교환된 것을 제외하고는 MRB-CAR T2A의 ASTR과 동일했다.
실시예 4. 리간드-유도성 리보스위치의 작제
데옥시구아노신 리보스위치 압타머 및 구아닌 리보스위치 압타머(참조: Pikovskaya, 2014; Kim, 2007) 또는 다른 퓨린 리보스위치 압타머를 올리고뉴클레오타이드로서 합성한다. 한 예에서, 메조플라스마 플로럼(Mesoplasma florum)으로부터의 데옥시구아노신 IA 리보스위치(도 6에서 밑줄과 굵게; 도 7)를 아사이클로비르 반응성 리보스위치를 생성하기 위한 진화를 위해 선택한다. 또 다른 예에서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 구아닌 xpt 리보스위치(도 10에서 밑줄과 굵게; 도 11)를 아사이클로비르 반응성 리보스위치를 생성하기 위한 진화를 위해 선택한다. 각각의 이러한 두 예에서, P2, P3, J1-2, 및 J2-3 세그먼트 중 표적화된 서열 위치에 대안적 뉴클레오타이드를 포함하는 무작위 RNA 라이브러리를 생성한다(도 7 및 11). 각 세그먼트는 각각의 표적화된 서열 위치에서 3개의 대안적 핵산을 허용하거나, 또는 대안적으로, 도 8a-8b 및 9(M. 플로럼 IA) 및 도 12a-12b 및 13(B. 서브틸리스 xpt)에 명시된 바와 같이, 포화 돌연변이유발을 위해 각각의 표적화된 서열 위치에서 +1 부위에 4개의 뉴클레오타이드의 염기 결실 및 삽입을 허용한다. 프라이머 연장 및 시약 제조 후, RNA 전사를 수행한다. 생성되는 RNA 라이브러리를 구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신의 존재하에 그래핀 옥사이드 상에서 음성적으로 선택한 후, 아사이클로비르 또는 펜시클로비르를 이용하여 양성 선택을 수행한다. 음성 및 양성 선택 프로세스 동안, 인간 세포 생리적 마그네슘 수준(0.5 mM 내지 1.2 mM)을 사용하고, 온도는 37℃로 유지시킨다. 적어도 8회 연속 라운드의 선택 동안, 회수된 압타머를 역전사시키고, PCR 증폭 후, 전사시킨 후, 후속하여 스크리닝시킨다. 평행 접근법에서, 압타머를 40℃에서 추가의 음성 스크린을 이용하여 스크리닝한다. 생성된 양성 풀을 넥스트겐(NextGen) 서열분석 및 분석에 의해 시험한다. 개별 압타머를 합성하고, 인간 세포 생리적 마그네슘 수준하에 35-40℃에서 등온 열량측정법에 의해 친화도에 대하여 시험한다. 양성 아사이클로비르 및 펜시클로비르 특이적 압타머에 대하여 선택한 후, 압타머를 리보자임 해머헤드 및 피스톨 리보자임과 통합시킨다. 양성 아사이클로비르 선택적 압타머를 피스톨 리보자임과 조합하여 아사이클로비르 조절 리보자임을 동정한다(참조: Harris KA RNA. 2015 Nov;21(11):1852-8. doi: 10.1261/rna). 변이체를 아사이클로비르의 존재하 및 펜시클로비르의 부재하에서 겔 이동 기반 PAGE 정제를 수행한다. 추가로, 아사이클로구아노신 선택적 리보스위치는 CAR/IL-7 작제물의 스플라이스 수용체에 대한 루프에서 바로 3'에 위치된다. 아사이클로비르의 부재하에서, 스플라이스 부위 위치는 리보스위치 복합체에서 결합되지만, 아사이클로비르의 존재하에서는, 접근가능하게 되어 기능성 CAR 전사체를 생성한다.
실시예 5. 생체내 증식 도메인의 작제
T 세포 림프아구성 백혈병으로부터의 일련의 구성적으로 활성인 IL7 수용체 (IL7R) 막관통 돌연변이체(243 InsPPCL (서열번호: 82); 246 InsKCH (서열번호: 101); 241 InsFSCGP (서열번호: 102); 244 InsCHL (서열번호: 103); 및 244 InsPPVCSVT (서열번호: 104); 모두 문헌(참조: Shochat 등, 2011, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 5 901-908)으로부터 유래됨)를 중첩 올리고 뉴클레오타이드 합성(DNA2.0, 미국 캘리포니아주 뉴어크)에 의해 합성한다. 합성된 구성적으로 활성인 IL7R 막관통 돌연변이체를, CD8A 스토크 (서열번호: 79) 및 리더 펩타이드 (서열번호: 74)를 포함하는 항-CD19 CD3ζ 발현 카세트가 그 뒤로 이어지는 2A 리보솜 스킵 서열 바로 뒤의 구성적으로 발현하는 렌티바이러스 벡터 백본 내로 삽입한다. HEK293 패키징 세포를 IL7R 막관통 돌연변이체 렌티바이러스 벡터 및 렌티바이러스 패키징 작제물로 형질감염시키고, 성장시키고, 바이러스 상청액을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수거한다. CD3/CD28 자극된 T 세포를 바이러스 상청액으로 형질도입시키고, IL2 결핍 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM(CTS OpTmizer T 세포 Expansion SFM), 또는 X-VIVO 15 배지 중에서 4주 동안 성장시키고, 동일한 공여체로부터의 냉동된 PBMC를 매주 보충했다. IL7R 변이체를 발현하는 생성되는 확장된 형질도입된 T 세포를 FACS 분류에 의해 클로닝하고, RT-PCR 생성물을 서열분석하여 IL7R 작제물의 서열을 동정한다. 조건부로 활성인 CAR을 생성하기 위한 추가 진화를 위해 243 InsPPCL 변이체 (PPCL) (서열번호: 82)를 선택한다.
실시예 6. CAR-T 활성화 및 증식을 위한 보조 성분의 스크리닝.
CD3-프로모터 구동 CAR 카세트의 역 가닥 상의 합성 인트론 내로 도입시키기 위해 일련의 단백질 코딩 도메인(ABCG1, SOCS1, SMAD2, TGFBR2, cCBL, 및 PD1) 및 miRNA 서열을 작제한다. CD3-프로모터 구동 CAR 카세트 및 단백질 코딩 도메인 또는 miRNA 서열을 함유하는 각 작제물은 심층 서열분석을 위한 고유의 바코드를 포함하고, 이를 깁슨(Gibson) 어셈블리를 사용하여 어셈블리시킨 후, E. 콜라이(E. coli)에서 형질전환시키고, 라이브러리를 확장시킨다. 바이러스 스톡을 제조하고, 이를 사용하여 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM, 또는 IL2 무함유 X-VIVO 15 배지 중에서 CD3/CD28 자극된 T 세포를 형질도입시키고, 증폭을 위해 DNA를 연속 샘플링하고, 코드 확인을 위해 심층 서열분석을 수행하면서, 4주 동안 배양물 중에서 성장시킨다. 또한, 라이브러리를 PACBio 전장 서열분석에 적용하여 라이브러리 다양성을 결정하고, 바코드 성분을 해독한다. miRNA 서열 및 단백질 코딩 도메인은 CAR CD3ζ 도메인의 상승작용 활성화에 대하여 시험한다.
실시예 7. 선택적 T 세포 통합 및 PBMC로부터의 발현을 위한 휴지 T 세포를 표적화하기 위한 레트로바이러스 패키징 및 형질도입 시스템의 유전자 조작
일시적 형질감염에 의한 고역가 렌티바이러스 벡터 제조가 가능하기는 하지만, 이 방법은 복제 가능 레트로바이러스(RCR)를 생성할 위험을 수반하고, 임상적 적용으로는 확장가능하지 않다. 본원에서, 유도성 프로모터 및 이의 조절인자를 코딩하는 다중 작제물을 HEK293 현탁액 적응된 세포 (HEK293S) 내로 동시에 도입함으로써 바이러스 성분, CAR 유전자, 및 이의 조절 성분을 안정적으로 제조함으로써 안정적인 레트로바이러스 패키징 세포주가 생성된다. 2개의 별개의 유도성 시스템을 사용하여 유전자의 발현을 일시적으로 제어할 수 있다. 한 시스템은 두 전사 인자의 라파마이신- 또는 라팔로그-유도된 이량체화에 기초한다. 한 전사 인자는 ZFHD1 DNA 결합 도메인에 융합된 FKPB 단백질의 3개 카피로 구성되고, 다른 한 전사 인자는 p65 활성화 도메인에 융합된 FRB 단백질로 구성된다. 라파마이신 또는 라팔로그는 전사 인자를 이량체화하여 ZFHD1/p65 AD를 형성하고, 12xZFHD1 결합 부위에서 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다.
도 3a-3e에 도시된 바와 같은 일련의 벡터가 HEK293S 게놈 내로의 통합을 위한 측접 트랜스포존 서열로 생성된다. 일단 세포의 게놈 내로 통합되면, 이들 서열은 본원에서 랜딩 패드로서 지칭되는 Cre 및/또는 flp 리콤비나제를 사용하는 후속 통합을 위한 조절 성분 및 lox 및/또는 FRT 부위로서 기능한다. 초기 5개의 작제물은 퓨로마이신 내성, GFP, RFP, 및 N 말단 PLss(소 프로락틴 신호 펩타이드)를 통해 세포 막으로 표적화되고, 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) C 말단 막관통 고정 도메인을 통해 세포 막에 고정된 세포외 MYC 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 초기 5개의 작제물은 또한 구성적 최소 CMV 및 최소 IL-2 프로모터, 라파마이신-조절된 ZFHD1 기반 프로모터, 테트라사이클린 반응성 요소(TRE) 프로모터, 또는 양방향 TRE (BiTRE) 프로모터를 포함할 수 있다. 도 3a의 작제물은 NFκB p65 활성인자 도메인(p65 AD)에 융합된 FRB 도메인, 및 구성적으로 발현되는 3개의 FKBP 반복체에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 도 3a의 작제물은 또한 라파마이신 유도성 ZFHD1/p65 AD 프로모터하에 HIV1 REV 및 HSV VP65 도메인 SrcFlagVpx를 포함한다. 도 3b의 작제물은 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에 rtTA 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 도 3c의 작제물은 loxP 부위에 측접되는 퓨로마이신 내성 유전자 및 lox2272 부위에 측접되는 세포외 MYC 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 이러한 선택가능한 마커는 모두 FRT 부위에 측접되는 BiTRE 프로모터의 제어하에 있다. 도 3d의 작제물은 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위에 측접된 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 도 3d의 작제물은 또한 TRE 프로모터와 GFP의 5' loxP 부위 사이에 단일 FRT 부위를 포함한다. 도 3e의 작제물은 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위에 측접되는 RFP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 도 3e의 작제물은 또한 ZFHD1/p65 AD 프로모터와 RFP의 5' loxP 부위 사이에 단일 FRT 부위를 포함한다. 도 3c-3e의 작제물은 패키징 세포주의 게놈 내로 삽입시키기 위한 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 랜딩 패드로서 기능한다. 삽입되는 폴리뉴클레오타이드 서열은 lox 부위에 측접될 수 있고, Cre 리콤비나제 및 loxP 부위를 사용하여 게놈 내로 삽입될 수 있다. 이는 퓨로마이신 내성, 세포외 MYC 태그, GFP, 및 RFP를 코딩하는 게놈 영역의 삽입 및 동시 제거를 초래한다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 서열은 FRT 부위에 측접될 수 있고, flp 리콤비나제 및 FRT 부위를 사용하여 게놈 내로 삽입된 후, Cre 리콤비나제를 사용하여 퓨로마이신 내성, 세포외 MYC 태그, GFP, 및 RFP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제거할 수 있다.
게놈 내로 통합된 랜딩 패드를 포함하는 패키징 세포주를 생성하기 위해, HEK293S 세포를 등몰 농도의 5개의 플라스미드(도 3a 내지 3e) + 5㎍의 시험관내 전사된 피기백 트랜스포사제 mRNA 또는 2:1 또는 3:1 PEI 대 DNA (w/w)의 비로 PEI의 존재하에서 피기백 트랜스포사제를 발현시키기 위한 프로모터를 갖는 5㎍의 플라스미드 또는 양이온성 펩타이드 혼합물을 사용하여 2 내지 5㎍의 피기백 트랜스포사제 단백질로 공동 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 2 내지 5일 동안 100 nm 라파마이신 및 1 ug/mL 독시사이클린의 존재하에서 퓨로마이신을 이용하여 선택한 후, 형광 활성화 세포 분류에 의해 GFP 및 RFP를 발현하는 세포를 수집한다. 분류된 세포를 퓨로마이신, 라파마이신, 및 독시사이클린의 부재하에서 5일 동안 성장시키고, GFP 및 RFP를 발현하는 세포를 제거하고, 또한 myc 양성 세포도 myc 비드를 이용하여 제거한다. 이어서, 음성적으로 분류된 세포로부터의 개별적 클론을 라파마이신 및 독시사이클린에 의해 GFP 및 RFP의 유도에 대하여 스크리닝하고, 단일 세포를 클로닝한다. 클론으로부터의 DNA을 수거하고, 통합 분석을 위해 서열분석한다. 라파마이신 및 독시사이클린의 부재하에서는 제한된 배경 발현을 보이지만, 라파마이신 및 독시사이클린의 존재하에서 GFP 및 RFP의 강력한 유도성 발현에 대해 양성인 클론을 확장시키고, 뱅크화한다.
이어서, 게놈 내로 통합된 도 3a-3e로부터의 작제물을 포함하는 HEK293S 세포를 DAF 신호 서열/항-CD3 scFvFc (UCHT1)/CD14 GPI 앵커 부착 부위(서열번호: 287), CD28/CD16B GPI 앵커 부착 부위(서열번호: 286)와 결합시킬 수 있는 DAF 신호 서열/CD80 세포외 도메인, 및 HEK293S 게놈 내로의 통합을 위한 폴리뉴클레오타이드 영역에 측접하는 DAF 신호 서열/IL-7/DAF(서열번호: 286) 및 트랜스포존 서열을 코딩하는 트리시스트론성 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물로 형질감염시킨다(도 4a). 형질감염 후, 세포를 라파마이신 및 독시사이클린의 부재하에서 2일 동안 확장시키고, 구성적으로 레드인 콜로니를 선택한다. 이어서, 양성 콜로니를, Cre 리콤비나제를 발현하는 작제물로 일시적으로 형질감염시켜 잔류하는 게놈 DNA, 및 RFP 코딩 영역을 제거한다. BiTRE 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 한 방향으로 gag 및 pol 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역 및 다른 방향으로 홍역 바이러스 F 및 H 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 영역을 함유하는 또 다른 작제물(도 4b)을 동시에 형질감염시킨다. Cre 리콤비나제는 작제물을 게놈 내로 통합시켜 도 4b에 도시된 바와 같은 통합된 서열을 생성한다. 생성된 콜로니를 독시사이클린 및 라파마이신의 존재하에서 단백질 발현에 대해 평가하고, 게놈 통합에 대하여 심층 서열분석에 의해 분석한다. 잔류하는 TRE 반응성 GFP 부위는 렌티바이러스 게놈 삽입을 위해 유지된다.
실시예 8. 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 패키징 생성
실시예 7에서 생성된 레트로바이러스 패키징 안정한 세포주를, Flp 리콤비나제 발현을 위한 작제물(도 4c), 및 HEK293S 세포에서는 활성이 아닌 CD3Z 프로모터의 제어하에서 CAR 및 림프증식성 요소 IL7Rα-insPPCL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 작제물로 형질감염로 감염시키고, 이때 상기 CAR 및 IL7Rα-insPPCL은 T2A 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리되고, IL7Rα-insPPCL은 아사이클로비르 리보스위치 제어된 리보자임을 갖는다. CAR 함유 작제물은 cPPT/CTS 및 RRE 서열, 및 HIV-1 Psi를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 게놈 내로 통합되는 CAR 함유 작제물 상의 전체 폴리뉴클레오타이드 서열은 FRT 부위에 측접된다. CAR 함유 작제물의 성공적인 통합은 결과적으로 Cre 리콤비나제를 발현하는 작제물에 의한 일시적 형질감염에 의해 제거되는 GFP의 구성적 발현을 야기한다. HEK293S 세포주를 무혈청 배지 중에서 성장시킨다. 교반식 탱크 반응기에서 피크 세포 밀도까지 성장시킨 후, 세포를 70% 피크 세포 밀도로 희석하고, 2일 동안 100 nM 라파마이신으로 처리하여 조기 유전자 REV, Vpx, 및 CD3 scFv CD16B GPI, CD28 scFv CD16B GPI, 및 IL-7 SD GPI DAF의 발현을 유도한 후, 배지 중 1 ug/mL 독시사이클린을 첨가하여 구조적 요소, 예를 들어, Gag Pol, MV(Ed)-FΔ30, MV(Ed)-HΔ18, 및 치료적 표적을 포함하는 렌티바이러스 게놈의 발현을 유도한다. 패키징 서열의 qPCR 및 p24 ELISA에 의해 바이러스 제조 수준을 시험한다. 바이러스는 세포의 심층 여과 및 TFF 카트리지를 사용하는 농축/정용여과에 의해 수거한 후 바이알링을 위해 급속 동결시킨다.
실시예 9. 말초 혈액 단핵구(PBMC) 단리, 형질도입, 및 확장.
하기 실시예는 생체내 확장 이전에 PBMC의 생체외 프로세싱을 위해 폐쇄형 시스템을 사용하는 것을 예시한다. 한 예로서, 30 내지 200ml의 인간 혈액을 항응고제로서 산 시트레이트 덱스트로스 용액(ACD)을 사용하여 대상체로부터 혈액 수집 백 내로 채혈한다. 대안적으로, 혈액을 진공 채혈관, 시린지 또는 등가물 내로 채혈하고, 빈 혈액 수집 또는 IV 백으로 옮긴다. 전혈을 제조업자의 지침에 따라 세팍스 2 세포 프로세싱 시스템(바이오세이프) 상에서 순수한 세포 키트(카탈로그 번호 CS-900.2, 옴니아메드(Omniamed))를 사용하여 프로세싱한다. 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 배양 백 내로, 또는 대안적으로, 시린지 내로 수집한다. 세포를 계수하여 생존가능한 세포의 개수를 결정하기 위해 무균 방식으로 분취량을 취한다. PBMC를 최대 200ml의 최종 용적 중 10-300 IU/ml IL-2 (카탈로그 번호 202-IL-010, R&D 시스템즈(R&D Sytems))와 함께 X-VIVO 15 (카탈로그 번호 08-879H, 론자) 또는 CTS 옵트마이저 셀 익스펜션 SFM (카탈로그 번호 A1048501, 써모 피셔 사이언티픽) 배지 중 0.1 - 1.0 x 106개의 생존가능 세포/ml인 최종 농도로 G-Rex100MCS 가스 투과 세포 배양 시스템 장치(윌슨 울프(Wilson Wolf))로 옮긴다. IL-2 이외에도, CTS 면역 세포 SR(카탈로그 번호 A2596101, 써모 피셔 사이언티픽)을 배지에 첨가할 수 있다. 폐쇄형 G-Rex 가스 투과 세포 배양 시스템 장치를 제소업자의 지침에 따라 레트로넥틴(Retronectin)(카탈로그 번호 CH-296, 다카라(Takara)), 또는 유사한 피브로넥틴 유래 등가물로 미리 코팅시킬 수 있다.
말초 혈액으로부터 단리된 PBMC를 PALL PBMC 필터 상에 로딩하고, 필터를 통해 10ml의 AIM V(써모 피셔 사이언티픽), 또는 X-VIVO 15 배지로 1회 세척한 후, 37℃에서 5ml/hr로 10-60ml의 렌티바이러스 스톡(실시예 8에서 제조됨)을 관류시킨다. 이어서, PBMC를 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM, 또는 재조합 인간 DNase(풀모자임(Pulmozyme), 제넨테크(Genentech))를 함유하는 X-VIVO 15 배지로 다시 세척한 후, DNase 무함유 락테이트화 링거스(Lactated Ringers)(카탈로그 번호 L7500, 브라운(Braun))로 세척한다. 이어서, PBMC를 필터를 통해 시린지 내로 역 관류시킨다. 이어서, 세포(세포의 표적 수준은 5 x 105 내지 1 x 106개의 세포/kg이다)를 정맥내 주입을 통해 대상체 내로 재주입시킨다.
레트로바이러스 게놈 내에 함유된 리보스위치에 의존하여, 대상체는 각각의 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 프로드럭(아사이클로비르, 발라시클로비르, 펜시클로비르, 또는 팜시클로비르)이 제공된다. 대상체는 임의의 치료적 유효량, 예를 들어, 500mg의 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 경구적으로 1일 3회 제공될 수 있다. 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 이용한 처리는 바람직하게는 재주입 이전에, 예를 들어, 2시간 전에 시작하고, 또한 재주입 시점에, 또는 재주입 몇시간 후에 시작될 수 있다. 치료는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 120일, 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 또는 48개월 이상 동안 계속 진행될 수 있다. 치료는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 1일 1, 2, 3, 또는 4회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 재주입 및 치료 시작 후, 재주입 후 2, 5, 7, 11, 13, 18, 28, 및 56일째에 바이러스 게놈의 양을 정량화하는 qPCR을 사용하여 혈구수를 통해 감염된 세포의 개수를 측정한다. 발열 또는 사이토카인 방출 증후군을 경험한 대상체는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 용량 또는 빈도를 감소시키거나, 또는 중단할 수 있다. 감염된 T 세포가 18일째까지 10,000-100,000배 증폭되지 못했다면, 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 용량 또는 빈도를 증가시킬 수 있다. 대상체의 임상 반응은 FDG PET 영상화 및 연속 CT 스캔을 통해 측정될 수 있다. 장기간의 관해 이후에, 또는 전체 말초 T 세포 계수의 30% 초과로 과도한 T 세포 증식이 일어난 경우에는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 경구 투약은 감소되거나, 또는 중단될 수 있다.
실시예 10. 혈관 또는 조직 pH를 상승시키기 위한 치료적 개입.
항원 결합 도메인의 이의 동족 항원에의 결합을 감소시키기 위해, NaHCO3을 IV 볼루스로서, 또는 IV 주입에 의해 투여한다. 표준 투여량은 초기 용량으로서 체중 1 kg당 1 mg이고, 이후 10분마다 0.5 mg/kg이다. 50 ml의 NaHCO3 볼루스가 혈청 pH를 pH 단위로 대략 0.1씩 상승시킬 것이다. pH가 7.0이면, pH를 7.40으로 보정하기 위해 4개의 50 mEq의 NaHCO3 앰플이 요구된다.
실시예 11. PBMC에서 IL-7 수용체 림프증식성/생존 요소의 활성 시험
IL-7Rα 변이체를 T 세포의 사이토카인-독립적 생존을 매개하는 이의 능력에 대하여 시험하기 위해, 항응고제로서 산 시트레이트 덱스트로스(ACD)를 사용하여 30ml의 인간 혈액을 진공 채혈관 내로 채열했다. 제조업자의 지침에 따라 피콜-파크(Ficoll-Pacque)™(제너럴 일렉트릭(General Electric))를 이용하여 밀도 구배 원심분리를 사용함으로써 전혈을 프로세싱하여 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 수득했다. 분취량의 PBMC를 무균 방식으로 X-VIVO(X-Vivo)™ 15 배지(론자)와 함께 1 mL의 최종 용적 중 50만개의 생존가능 세포/mL인 최종 농도로 12 웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮겼다. 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2)(노보프로테인(Novoprotein))도 또한 일부 샘플에서 100 IU/ml의 농도로 첨가했다. 바이러스 형질도입을 위해 PBMC를 활성화시키기 위해, 활성화 항-CD3 Ab (OKT3, 노보프로테인)를 50ng/ml의 농도로 첨가했다. 플레이트를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양시켰다. 밤새 배양 후, 목적하는 시험 작제물(도 19a)을 함유하는 렌티바이러스 입자 제제를 감염 다중도(MOI) = 5로 개별 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양시켰다. 밤새 배양 후, 12 웰 플레이트의 각 웰의 내용물을 수집하고, 원심분리하여 펠릿을 수득했다. 샘플을 D-PBS + 2% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 1회 세척하고, X-VivoO15™ 배지 중에 재현탁시키고, G-Rex® 6-웰 가스 투과 세포 배양 장치(윌슨 울프)의 웰로 옮겼다. 추가의 X-Vivo™ 15 배지를 첨가하여 각 웰의 최종 용적이 30ml가 되도록 했다. 각 작제물에 대한 대응 대조군 샘플을 G-Rex® 6-웰 가스 투과 세포 배양 장치(윌슨 울프)의 웰로 옮키고, 일부 대조군 샘플의 경우, 100 IU/ml IL-2와 함께, 추가의 배지를 첨가하여 최종 용적이 30ml가 되도록 했다. G-Rex® 장치를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 7일 동안 배양시켰다. 배양 동안 2-3일마다 IL-2를 함유하는 대조군 샘플에 신선한 IL-2를 첨가했다. IL-2를 함유하지 않는, 대응 시험 샘플은 보충하지 않았다. 7일째에 확장 동안 세포 개수 및 생존능을 추적하기 위해(카운테스(Countess), 써모 피셔) 샘플을 제거했다.
도 19a는 시험된 IL7Rα 작제물의 개략도를 제공한다. 이러한 작제물을 재조합 렌티바이러스 게놈 내로 삽입했다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 사용하여 PBMC를 형질도입시켰다. 도 19a는 신호 서열(SS), 세포외 도메인(ECD), 막관통(TM), 및 세포내 도메인(ICD)으로 구성된 야생형 IL7Rα(서열번호: 229)의 개략도를 도시한다. "1"은 피브로넥틴 타입 III 도메인의 부위를 표시하고; "2"는 WSXWS 모티프의 부위를 표시하고; "3"은 박스 1 부위를 표시하고, "4"는 단백질 키나제 C(PKC) 인산화 부위의 부위를 표시하고, "5"는 박스 2 부위를 표시한다.
변이체 "A"는 이의 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩타이드, GSG 링커, 및 P2A 리보솜 스킵 서열과 함께 한 전사체 상에서 발현되는, 243번 위치에 InsPPCL을 포함하지만(참조: Shochat 등 2011, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 5 901-908), S185C 돌연변이는 포함하지 않는 IL-7Rα이다. 변이체 "B"는 신호 서열과 세포외 도메인 사이의 Myc Tag 뿐만 아니라, 이의 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩타이드, GSG 링커, 및 P2A 리보솜 스킵 서열을 갖는 IL-7Rα InsPPCL이다. 변이체 "C"는 이의 세포내 도메인이 292번 위치에서 절단되는 것 이외에는 변이체 "B"와 유사하다. 변이체 "D"는 이의 세포내 도메인이 292번 위치에서 절단되는 것 이외에는 변이체 "A"와 유사하다. 변이체 "E"는 신호 서열 및 대부분의 세포외 도메인(잔기 1-228)이 존재하지 않도록 이의 N 말단에서 절단된 IL-7Rα InsPPCL 변이체이고; 변이체 "E"는 또한 아미노 말단으로부터의 그 순서대로 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩타이드, GSG 링커, P2A 리보솜 스킵 서열, 및 eTag를 갖는다. 아미노산 잔기의 넘버링은 IL7Rα(NCBI GI 번호 002176.2)에 기초한다. 각 변이체를 함유하는 T 세포를 IL-2의 존재 또는 부재하에서 트리판 블루 배제를 사용하여 생존능에 대해 시험했다.
도 19b에 도시된 바와 같이, PBMC는 시험관내에서 생존을 위해 IL-2를 필요로 한다. 도 19b에 도시된 바와 같이, 형질감염되지 않은 PBMC는 IL-2의 존재하에 약 80%의 생존율을 갖고, 형질도입 후 7일째에 IL-2의 부재하에 0%의 생존율을 갖는다. IL-7Rα InsPPCL의 전장 변형을 갖는 PBMC(도 19a의 IL-7Rα 변이체 A 및 B)는 형질도입 후 7일째에 IL-2의 부재하에 20% 초과의 생존율을 가져 구성적으로 활성인 IL-7Rα InsPPCL 수용체의 발현이 이러한 세포에서 생존 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 추가로, 절단된 세포내 도메인(ICD)을 갖는 IL-7Rα InsPPCL 변이체(도 19a의 IL-7Rα 변이체 C 및 D)를 발현하는 T 세포는 야생형 IL-7 수용체와 비교하여 형질도입 후 7일째에 증가된 생존율을 보였다. 마지막으로, 도 19b에 도시된 바와 같은 N 말단 IL-7 수용체 돌연변이체(도 19a의 IL-7Rα 변이체 E)는 이러한 세포에서 생존 활성을 가졌다. 따라서, 본 실시예는 IL-7 수용체가 PBMC에서 발현되었을 때, 생존 활성을 갖는다는 것을 예시한다.
실시예 12. VSV-G로 슈도타입화되고 표면에서 항-CD3 scFvFc를 발현사키는 레트로바이러스 입자에 의한 새로 단리되고 비자극된 인간 T 세포의 형질도입 효율
재조합 렌티바이러스 입자는 gag/pol 및 rev를 코딩하는 별개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G를 코딩하는 슈도타입화 플라스미드로 293T 세포 (Lenti-XTM 293T, Clontech)의 일시적 형질감염에 의해 생성되었다. GFP, 항-CD19 키메라 항원 수용체 및 본원에서 F1-0-03(도 20)으로 지칭되는 eTAG를 코딩하는 3 세대 렌티바이러스 발현 벡터(자가불활성화를 유도하는 3'LTR에서의 결실을 함유함)는 패키징 플라스미드와 함께 형질감염시켰다. 세포를 FreestyleTM 293 발현 배지(써모피셔 사이언티픽)에서 연속 성장에 의해 현탁액 배양물에 적응시켰다. 현탁액 중의 세포를 125mL 삼각 플라스크에 1 × 106 세포/mL(30mL)로 씨딩하고, 약산에 용해된 폴리에틸렌이민(PEI)(폴리사이언시즈)을 사용하여 즉시 형질감염시켰다.
플라스미드 DNA를 30 mL의 세포에 대해 1.5ml의 Gibco™ Opti-MEM™ 배지로 희석시켰다. VSV-G로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 총 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음 몰 비를 갖는 4개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev 함유 플라스미드, 1x VSV-G 함유 플라스미드, 및 1x gag/pol 함유 플라스미드. VSV-G로 슈도타입화하고 그들의 표면에서 ㅎ항CD3-scFvFc-GPI를 발현하는 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 전체 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음 몰 비를 갖는 5개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev 함유 플라스미드, 1x VSV-G 함유 플라스미드, 1x 항-CD3-scFvFc-GPI 함유 플라스미드 및 1x gag/pol 함유 플라스미드. VSV-G로 슈도타입화되고 그들의 표면에서 항 CD3-scFvFc-GPI 및 CD80-GPI를 발현하는 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 전체 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음의 몰 비를 갖는 6개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev 함유 플라스미드, 1x VSV-G 함유 플라스미드, 1x 항-CD3-scFvFc 함유 플라스미드, 1x CD80 함유 플라스미드 및 1x gag/pol 함유 플라스미드. 별도로, PEI를 1.5ml Gibco™ Opti-MEM™에서 2㎍/mL(배양 용적, DNA이 대해 2:1 비율)로 희석시켰다. 5분 실온 배양 후, 두 용액을 완전히 함께 혼합하고, 실온에서 20분 동안 더 배양했다. 최종 용적(3 ml)을 세포에 첨가했다. 이어서, 세포를 37℃에서 72시간 동안 125rpm으로 회전시키고 8% CO2로 배양했다. 항CD3-scFvFc-GPI 함유 플라스미드는 OKT3 또는 UCHT1로부터 유래된 scFv 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함 했다. UCHT1scFvFc-GPI 벡터는 인간 DAF GPI 앵커 부착 서열(NCBI GI 번호 NP_000565의 아미노산 345-381)에 융합된 위치 115에서 A 내지 T로 치환을 갖는 인간 IgG1 Fc(NCBI GI 번호 AEV43323.1의 아미노산 1-231)에 융합된 UCHT1 scFv (NCBI GI 번호 CAH69219.1의 아미노산 21-264)에 융합된 인간 Ig 카파 신호 펩타이드(NCBI GI 번호 CAA45494.1의 아미노산 1-22)를 포함하는 펩타이드(서열번호: 278)를 코딩한다. OKT3scFvFc-GPI 벡터는 DAF GPI 앵커 부착 서열(NCBI GI 번호 NP_000565의 아미노산 345-381)에 융합된 인간 IgG1 Fc(NCBI GI 번호 AEV43323.1의 아미노산 1-231)에 융합된 OKT3 scFv(서열번호: 285)에 융합된 인간 Ig 카파 신호 펩타이드(NCBI GI 번호 CAA45494.1의 아미노산 1-22)를 포함하는 펩타이드(서열번호: 279)를 코딩한다. CD80-GPI 벡터는 인간 CD16b GPI 앵커 부착 서열(NCBI GI No. NP_000561의 아미노산 196-233)에 융합된 인간 CD80 신호 펩타이드 및 세포외 도메인(NCBI GI 번호 NP_005182의 아미노산 1-242)을 포함하는 펩타이드(서열번호: 280)를 코딩한다.
72시간 후, 상청액을 수거하고 1,200g에서 10분동안 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 렌티바이러스 입자는 4℃에서 3300g에서 밤새 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 제거하고, 렌티바이러스 입자 펠렛을 X-Vivo™ 15 배지(Lonza)의 초기 용적의 1:100에 재현탁시켰다. 렌티바이러스 입자를 연속 희석 및 유동 세포 계측법에 의해 형질전환 72시간 후, 293T 및 Jurkat 세포에서 GFP 발현의 분석에 의해 적정했다.
말초 혈액 단핵구(PBMC)는 먼저 공여체 12F 및 12M의 경우 ACD(산성 시트레이트 덱스트로스) 튜브의 신생 혈액으로부터 또는 공여체 13F의 경우 버피 코트로부터 단리시키고, 수집하고 캘리포니아주 샌디에고 블러드 뱅크(San Diego Blood Bank)에 의해 분포시켰다. 제조업자의 지침에 따라 Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare Life Sciences)에서 PBMC의 SepMate™ 50(Stemcell™) 기반 구배 밀도 분리를 수행했다. 각각의 SepMate™ 튜브 당 PBS-2% HIFCS(열 불활성화된 태아 송아지 혈청)에서 희석된 30mL의 혈액 또는 버피 코트를 적층시켰다. 실온, 1,200g에서 20분 동안 원심분리한 후, PBMC 층을 수집하고, 풀링하고, PBS-2% HIFCS 45mL로 3회 세척하고 실온에서 10분 동안 400g에서 원심분리했다. 이어서, 펠릿을 RBC 용해 완충제(Alfa Aesar) 10mL에서 실온에서 10분간 배양하고, PBS-2% HIFCS 45mL로 추가로 2회 세척하고, 실온에서 10분간 400g에서 원심분리했다. 최종 세척은 형질도입 및 배양 배지에서 수행했다: 공여체 13F의 경우, X-Vivo™ 15, 또는 공여체 12F 및 12M의 경우 RPMI-1640 + 10% HIFCS. 단핵구를 제거하기 위한 추가 단계는 취하지 않았다. 단리 후, 신선하고 자극되지 않은 PBMC를 각각의 배지에서 1 x 106/mL의 최종 농도로 재현탁시키고, 이전에 개시된 렌티바이러스 입자로 2회 또는 3회 형질도입했다. 형질도입은 공여체 13F의 경우 X-Vivo™ 15에서, 또는 공여체 12F 및 12M의 경우 RPMI-1640 + 10% HIFCS에서 14시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 수행했다. 형질도입은 대개 MOI 1에서 12 웰 플레이트 포맷에서, 1mL/웰로 수행했다. 운동 실험을 위해, 125rpm에서 회전 및 8% CO2로 2 내지 20시간 동안 37℃에서 배양된 125ml 진탕 플라스크에서, MOI 1에서 최종 7mL에서 0.5 x 106 PBMC/mL를 형질도입시켰다. 선택된 시간 동안 레트로바이러스 입자와 배양한 후, 세포를 공여체 13F의 경우 X-Vivo™ 15 배지로 또는 공여체 12F 및 12M의 경우 PBS + 2% HIFCS로 3회 세척하고, 최종적으로 1x106/mL의 세포 밀도로, 37℃, 5% CO2에서 공여체 13F의 경우 X-Vivo™ 15 배지 또는 공여체 12F 및 12M의 경우 RPMI-1640 + 10% HIFCS이서 배양했다. 형질도입 후 3일째에 시작하여 2 내지 3일마다 배지의 용적을 2배화하고, IL-2로 최종 농도 100U/mL로 보충했다. GFP 발현 수준에 의해 생성된 렌티바이러스의 각 유형의 형질도입 효율을 평가하기 위해, 형질도입 후 다양한 날(3 내지 17일째)에 샘플을 수집했다.
형질도입 후 다양한 날에, 1㎍/ml에서 OKT3 항체(Biolegend)를 포함하거나 포함하지 않는, VSV-G로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자; VSV-G로 슈도타입화되고 그들의 표면에서 항-CD3 scFvFc-GPI를 발현하는 렌티바이러스 입자; 또는 VSV-G로 슈도타입화되고 그들 표면에서 항-CD3 scFvFc-GPI 및 CD80-GPI를 발현하는 렌티바이러스 입자의 경우; 100μL의 세포를 수집하고 CD3 + 세포 집단에서 GFP 발현을 위해 유동 세포 계측법으로 분석했다.
도 21a 및 도 21b는 표시된 렌티바이러스 입자로 14시간 동안 공여체 12M으로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 3, 6, 9, 13 및 17일째에 각각 전체 CD3 + 집단의 CD3 + GFP + 세포 백분율(%)의 히스토그램 및 CD3 + GFP + 집단의 웰당 절대 세포 수의 히스토그램을 도시한다. 각 막대는 중복의 평균 +/- SD를 나타낸다. 도 21a 및 21b는 VSV-G에 의한 렌티바이러스 입자의 슈도타입화 및 렌티바이러스 입자의 표면 상에서 항CD3-scFvFc의 발현은 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC를 효과적으로 형질도입함을 보여준다. scFvFc-GPI 형태의 OKT3 또는 UCHT1에서 유래된 항-CD3 scFv가 효과적이었다.
도 22a 및도 22b는 표시된 렌티바이러스 입자로 14시간 동안 공여체 13F로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 후 3 및 6일째에 각각 전체 CD3 + 집단의 CD3 + GFP + 세포 백분율(%)의 히스토그램 및 CD3 + GFP + 집단의 웰당 절대 세포 수의 히스토그램을 도시한다. "A"는 VSV-G 슈도타입화 렌티바이러스 입자를 사용하는 결과(3회 실험)이고; "B"는 형질도입 배지에 첨가된 OKT3 항체(1ug/ml)를 갖는 VSV-G 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과(중복 실험)이고; "C"는 그들의 표면에서 GPI 고정된 UCHT1scFvFc를 발현하는 VSV-G 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 사용하는 결과(3회 실험)이고; "D"는 그들의 표면에서 GPI 고정된 UCHT1scFvFc 및 GPI-고정된 CD80을 발현하는 VSV-G 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 사용한 결과(중복 실험)이다. 각각의 막대는 도 22a에 나타낸 바와 같이, 중복 또는 삼중물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 도 22a 및 22b는 VSV-G에 의한 렌티바이러스 입자의 슈도타입화 및 그들의 표면에서 항CD3-scFvFc-GPI 및 CD80-GPI의 발현은 또한 형질도입이 14시간 동안 수행될 때 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC를 효과적으로 형질도입함을 보여준다.
도 23a 및 23b는 표시된 렌티바이러스 입자로 지시된 노출 시간(2 내지 20시간) 동안 공여체 12M으로부터 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입(세포를 형질도입 반응 혼합물 중 렌티바이러스 입자와 접촉시킨) 후 3, 6 및 9일째에 각각 전체 CD3 + 집단의 CD3 + GFP + 세포 백분율(%)의 히스토그램 및 CD3 + GFP + 집단의 웰당 절대 세포 수의 히스토그램을 도시한다. 형질도입은 표시된 바와 같이 플레이트 또는 진탕기 플라스크에서 수행했다. 각각의 막대는 VSV-G("[VSV-G]")로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자에 대한 복제물의 평균 +/- SD를 나타내고; 다른 실험은 복제물을 갖지 않았다. 도 23a 및 23b는 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PMBC가 VSV-G로 슈도타입화되고 그들의 표면에서 항-CD3 scFvFc 및 CD80을 발현시키는 렌티바이러스 입자로 2시간 이내에 효과적으로 형질도입될 수 있음을 보여준다.
후속 실험이 2.5시간 동안 가용성 항-CD3 항체(100ng/ml)의 존재하에 새롭게 단리된 휴지 PBMC를 형질도입하기 위해 단지 Rev, VSV-G, gag/pol 및 F1-0-03 (및 항CD3 또는 CD80을 코딩하는 벡터가 아닌)을 사용하여 생성된 렌티바이러스 입자를 사용하여 수행되었다는 것이 주목할 만하다. 형질도입은 3개의 상이한 가용성 항-CD3 항체 클론을 사용하여 달성되었다. 6일째에 CD3 + GFP + 세포에 의해 측정된 형질도입 효율은 각각 CD3 항체 클론 HIT3A, OKT3 및 UCHT1에 대해 4.31%, 3.27% 및 0.52%였다. 가용성 항체의 부재하에 배경 형질도입 효율은 0.06%였다.
실시예 13. EF-1알파 프로모터 인트론 내로 삽입된 miRNA의 기능성
각각 miR-155 5' 측접 서열 또는 "5' 아암"(서열번호: 256) 및 miR-155 3' 측접 서열 또는 "3' 아암"(서열번호: 260)을 포함하는 miR-155 프레임워크를 함유하는 4개의 별개의 g블록® 유전자 단편을 설계했다. 각 g블록®에 대하여, CD3제타 mRNA 전사체를 표적화하는 독특한 miRNA 단편을 사용하여 miR-155 줄기-루프 전구체를 대체시켰다. 각 g블록®은 단일 쇄로서 4개의 g블록® 모두의 EF-1알파 프로모터 인트론으로의 어셈블리를 촉진시키도록 설계된 40bp 중첩 서열을 함유했다. g블록®은 Gibson® 어셈블리 울트라(NEBuilder, 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.(New England Biolabs, Inc.))를 수행하기 위한 상업적 키트를 사용하여 어셈블리시켰다.
miRNA(서열번호: 255에)를 함유하는 합성 EF-1알파 프로모터 및 인트론 A는 렌티바이러스 벡터 백본에 함유되어 있는 GFP 및 eTag의 발현을 구동하는 도입유전자 발현 카세트의 일부분이었다(GFP, 및 세툭시맙에 의해 인식되는 예시적인 eTag를 포함하는 렌티바이러스 벡터 백본은 본원에서 F1-0-02로서 지칭된다: 도 24a 및 24b). 서열번호: 255 중의 각 g블록® 및 이의 각 성분들의 뉴클레오타이드 위치는 도 24b에서 각 "특징"의 위치와 같이 하기 표 3에 제시되어 있다. 4개의 miRNA의 렌티바이러스 벡터 백본으로의 적절한 어셈블리는 EF-1알파 프로모터의 인트론 영역의 철저한 서열분석에 의해 확인되었다.
Figure pct00009
Figure pct00010
그들의 게놈에서 CD3제타에 대해 지시된 4개의 miRNA를 코딩하는 핵산을 함유하는 복제 불능 렌티바이러스 입자는 다음 4개의 플라스미드의 현탁액 HEK293 세포로의 일시적인 동시 형질감염에 의해 생성되었다: CD3제타 mRNA 전사체를 표적화하는 4개의 miRNA를 포함하도록 변형된 F1-0-02를 코딩하는 핵산을 함유하는 플라스미드, VSV-G를 코딩하는 플라스미드, REV를 코딩하는 플라스미드 및 GAG-POL을 코딩하는 플라스미드. 렌티바이러스 입자 상청액을 48시간 후에 수거하고, 24시간 동안 PEG-침전시켰다. 상청액을 원심분리하고, 펠렛화된 렌티바이러스 입자를 IL-2 없이 완전 PBMC 성장 배지에 재현탁시켰다. 렌티바이러스 입자 역가는 주르카트 세포의 48시간 형질도입에 의해 계산되었다.
형질도입을 위해, PBMC는 0일째에 해동시키고 100U/mL의 hrIL-2와 함께 24시간 동안 배양했다. 1일째에, PBMC는 CD3/CD28 접합된 비드를 통해 활성화되었다. 2일째에, 활성화된 PBMC는 MOI 10에서 miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 게놈을 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질도입시켰다. 11일째까지 세포를 확장시키고, 새로운 hrIL-2를 2일마다 첨가했다. 7, 9 및 11일째에 1백만개의 세포를 FACS 분석을 위해 수거했다.
세포를 PE 접합된 OKT-3 항체(Biolegend)를 사용하여 CD3 엡실론 표면 발현을 위해 염색했다. 발현 수준은 GFP 양성 집단(형질도입된 세포)에서 PE의 평균 형광 강도(MF)에 의해 결정되었다. F1-0-02 유래 레트로바이러스 입자와 F1-0-02 유래 레트로바이러스 입자간에 형질도입된 세포의 발현 수준을 비교하였고, 이 때, 일련의 위치에 있는 CD3z miRNA를 코딩하는 핵산 서열은 EF-1α 프로모터 및 인트론 A에 삽입되었다.
결과는 도 25에 나타낸다. 이 데이터는 EF-1 알파 프로모터 인트론 A 내의 핵산 서열에 의해 코딩된 CD3제타를 표적화하는 일련의 miRNA가 CD3 복합체의 녹다운 발현에 효과적임을 보여준다.
실시예 14. EF-1알파 프로모터 인트론으로 삽입된 연속 억제성 RNA의 위치 독립성.
클로닝
4개의 miRNA-발현 렌티바이러스 벡터 작제물은 4개의 miRNA 전구체를 연속으로 포함하는 구조물에서의 개별적 miRNA 전구체의 프로세싱을 시험하기 위해 설계되었다. 표 4는 각 작제물에서 개별적 작제물의 명칭 및 miR-TCRα의 위치를 보여준다.
Figure pct00011
각각의 miRNA는 실시예 13에서 사용된 miR-155 프레임워크, 즉 miR-155 5' 아암(서열번호: 256), miR-155 3' 아암(서열번호: 260), 루프(서열번호: 258), 및 표 5에 제시된 바와 같은 특정 순서의 줄기 서열을 함유한다 유형 II 어셈블리 방법을 사용하여 렌티바이러스 벡터 작제물의 EF-1알파 인트론(F1-0-02; 실시예 13에 제공되고 도 24a에 제시됨) 내의 적합한 위치로 4개의 miRNA 단편의 어셈블리를 달성했다.
Figure pct00012
Figure pct00013
렌티바이러스 입자 생산
miRNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는 4개의 작제물 및 대조군 F1-0-02를 사용하여 293T 세포의 30mL 현탁 배양물에서 렌티바이러스 입자를 생성했다. 렌티바이러스 입자를 수거하고 PEG 침전에 의해 농축시켰다. 기능적 렌티바이러스 입자 역가는 다중 희석(1:1000, 1:10000, 1:100000)에서 주르카트 세포를 형질도입하고, 렌티바이러스 입자 및 세포를 37℃에서 2일 동안 배양하고, 세포를 FACS 완충제으로 2X 세척하고, 유동 세포 계측법에 의해 GFP를 분석함으로써 수득했다. 렌티바이러스 입자 생산에 관한 다른 세부 사항은 본원의 실시예 13에 제공된다.
형질도입
형질도입을 위해, PBMC를 해동시키고 100U/mL hrIL-2를 함유하는 완전한 배지에서 밤새 회수했다. 24시간 동안 CD3/CD28 접합된 비드에의 노출을 통해 1 x 105 PBMC를 활성화시켰다. 세포는 MOI 10에서 각각의 4개의 miRNA 작제물 또는 대조군 레트로바이러스 입자 F1-0-02로 이중 웰에서 형질도입했다. 세포는 3일 마다 100U/mL hrIL-2와 함께 제공하였고, 10일까지 확장시켰다.
FACS
세포가 복제 불능 렌티바이러스 벡테로 형질도입되었음을 확인하는 FACS 분석을 위해 세포를 수거했다. 결과는 실험에서 각 웰에 대략 동등한 양의 miRNA 함유 바이러스가 전달됨을 보여주었다.
세포 대 ct miRNA RT-qPCR 및 분석
RT-qPCR 검정은 성숙한 가공된 miR로의 miRNA 전구체의 발현 및 프로세싱을 검출하도록 설계되었다. 분석은 먼저 모든 miR-TCRa ct 값을 RNU48 내부 대조군으로 정규화하여 ΔCt 값을 생성함으로써 이루어졌다. 다음으로, 각각의 형질도입된 샘플의 ΔCt 값을 형질도입되지 않은 대조군의 ΔCt에서 빼서 ΔΔCt를 생성했다. 이 값은 형질도입되지 않은 대조군과 비교하여 각각의 형질도입된 샘플에서 가공된 miR-TCRα miRNA의 양을 나타낸다.
도 26에 도시된 바와 같이, RT-qPCR 검정은 복제 불능 렌티바이러스 입자를 함유하는 miR-TCRα로 형질도입 샘플에서 가공된 miR-TCRα를 성공적으로 검출했다. 또한, 결과는 시험된 4개의 위치 중 어느 하나에서 miRNA TCRα 프로세싱에 현저한 차이가 없음을 명확하게 나타낸다.
실시예 15. 미세환경 제한된 생물학적 CAR-발현 T 세포의 세포독성 활성은 pH를 변화시킴으로써 제어될 수 있다.
다음의 실시예는 MRB-CAR을 발현하는 형질도입된 T 세포(이펙터 세포로도 지칭됨)의 세포독성 활성이 미세환경의 pH 변화에 의해 조절될 수 있는 방법을 예시한다. 이 실시예에서, 동족 항원 표적 1(항-표적 1)에 결합할 수 있는 MRB-CAR을 코딩하는 핵산을 사용하여 복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자를 생성시켰다. Pan T 세포는 렌티바이러스 입자로 형질도입되고, 이펙터 세포의 세포독성 활성은 배지의 pH를 변화시키기 전후의 실시간 세포 분석(RTCA)을 사용하여 비교했다.
복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자의 생산
실시예 3의 일련의 후보 MRB-CAR로부터의 항-표적 1 MRB-CAR인 T1B를 코딩하는 핵산을 시험했다. 복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자는 렌티바이러스 발현 벡터 및 MRB-CAR 또는 GMCFsp 및 eTAG(서열번호: 284)를 함유하지만, 항-표적 1 MRB-CAR은 포함하지 않은 대조군 C1을 코딩하는 세그먼트를 포함한 핵산으로 Lenti-X 293T 세포(Clontech, Mountain View, CA)를 일시적으로 형질 감염시킴으로써 생성되었다. 세포를 Freestyle 293 발현 배지(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에서 연속 성장에 의해 현탁 배양물에 적응시켰다. 현탁액 중 세포는 약산에 용해된 PEI(Polysciences, Warminster, PA)를 사용하여 형질감염시켰다. 세포(30mL)를 125mL 삼각 플라스크에서 1 x 106 세포/mL로 성장시켰다.
총 DNA를 30mL의 세포에 대해 1.5mL의 Optimem 배지로 희석시켰다. 총 DNA(배양 용적 1μg/mL)는 렌티바이러스는 다음 몰 비를 갖는 4개의 플라스미드의 혼합물이었다: 렌티바이러스 패키징 요소를 포함하는 2x 게놈 플라스미드, LTR 및 T1B를 코딩하는 핵산, 1x Rev 코딩 플라스미드, 1x VSVg-코딩 플라스미드 및 1x Gagpol-코딩 플라스미드. 별도로, PEI를 1.5ml의 Optimem에서 2μg/mL(배양 용적, DNA에 대해 2:1의 비율)로 희석했다. 5분 실온 배양 후, 두 용액을 함께 잘 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 배양했다. 최종 용적(3ml)을 세포에 첨가했다. 이어서, 세포를 120rpm으로 회전하고 5-8% CO2로 72시간 동안 37℃에서 배양했다.
72시간 후, 상청액을 1,000g에서 10분간 원심분리하여 수거했다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, PEG 용액(PEG-IT, System Biosciences)의 상청액 용적의 1/4을 첨가했다. 복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자는 4℃에서 밤새 배양한 다음 4℃에서 20분 동안 1,500g에서 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 제거하고, 바이러스를 1:100 용적의 X-VIVO 15 배지에 재현탁시켰다. 바이러스는 주르카트 세포에서 eTAG 발현에 의해 적정되었다.
T 세포 형질도입/확장
Pan T 세포를 AllCells로부터 수득했다. 항-표적 1 MRB-CAR 복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자는 상기 논의된 바와 같이 제조했다. 렌티바이러스 형질도입 2일 전에, 세포를 해동시키고 5% 인간 AB 혈청(Valley Biomedical Inc., Winchester, VA) 및 10mM N-아세틸 L-시스테인(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 갖는 X-VIVO 15 배지(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양했다. 재조합 인간 IL-2(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 100IU/mL의 최종 농도로 첨가했다. 바이러스 형질도입 24시간 전에, 1차 인간 T 세포를 0.5 x 106 세포/웰로 12-웰 플레이트에 씨딩하고, Dynabeads Human T-활성화제 CD3/CD28(ThermoFisher Scientific)을 1:3 세포:비드 비로 사용하여 활성화시켰다. 형질도입 당일에, 렌티바이러스 입자 용액을 MOI 5로 웰에 첨가했다. 형질도입된 Pan T 세포를 3일 동안 X-VIVO 15 배지에서 약 106/mL로 유지시킨 다음, 100 IU/mL IL-2를 함유한 X-VIVO 15 배지 30mL/웰과 함께 6-웰 G-Rex 플레이트로 옮겼다. 실험을 수행하기 전에 적어도 10 일 동안 세포를 배양하고, 격일로 IL-2를 첨가했다.
pH 이동 세포독성 검정
NaHCO3 또는 NaOH의 첨가에 의한 pH 변화 전후의 형질도입된 T 세포의 세포독성 활성은 xCELLigence System을 사용하여 측정했다. 간단히, 실험 하루 전에, 표적 세포(세포 표면에서 표적 1을 발현하는 작제물로 안정하게 형질감염된 CHO 세포(CHO-표적 1 세포))을 96-웰 E-플레이트(ACEA; San Diego, CA)에 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 6.7을 함유하는 X-VIVO 15 배지와 함께 10,000 세포/웰로 씨딩했다. 상기 논의된 바와 같이 제조된 T1B 또는 C1(각각 T1BVP 및 C1VP)을 코딩하는 핵산을 함유하는 렌티바이러스 입자로 미리 형질도입된 동결보존된 이펙터 세포를 해동시키고, 100 IU/mL의 IL-2(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 함유하는 X-VIVO 15 배지에서 2일 동안 배양했다. 실험 당일에, T1BVP 또는 C1VP로 형질도입된 세포를 세척하고, 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 6.7을 함유하는 X-VIVO 15 배지에 재현탁시킨 다음, 이펙터 세포/표적 세포 비(E/T) 1:1에서 실험 웰에 첨가했다.
xCELLigence System(ACEA) 상에서 측정된 임피던스 판독치를 5분 마다 취하여 세포 지수(CI)로서 보고하여 세포 증식/세포 용해의 척도로서 세포 컨플루엔시를 정량화했다. 이펙터 세포 첨가 약 3시간 후, 7.5% NaHCO3 8μl 또는 0.5M NaOH 14μl를 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 6.7을 함유하는 X-VIVO 15 배지를 갖는 웰에 첨가하여 pH를 6.7에서 7.4로 증가시켰다. 임피던스 판독은 이펙터 세포 첨가 후 약 20시간 동안 지속되었다. 특이적 세포 용해의 백분율은 다음과 같이 계산했다: ((CI 표적 + C1VP 형질도입된 이펙터 T 세포) - (CI 표적 + T1BVP 형질도입된 이펙터 T 세포))/(CI 표적 + C1VP 형질도입된 이펙터 T 세포) × 100.
RTCA 사멸 검정에서 HCl 스위치
HCl 첨가에 의한 pH 변화 전후의 형질도입된 T 세포의 세포독성 활성을 xCELLigence System을 사용하여 측정했다. 간단히, 실험 하루 전에, CHO-표적 1 세포를 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 7.4를 함유하는 X-VIVO 15 배지로 10,000 세포/웰로 96 웰 E-플레이트에 씨딩했다. 이전에 C1VP 또는 T1BVP로 형질도입된 동결보존된 이펙터 세포를 해동시키고, 100 IU/mL의 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15 배지에서 2일 동안 배양했다. 실험 당일, T1BVP 또는 C1VP로 형질도입된 세포를 세척하고, 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 7.4를 함유하는 X-VIVO 15 배지에 재현탁시킨 다음, 이펙터 세포/표적 세포 비(E/T) 1:1로 실험 웰에 첨가했다.
임피던스 판독치를 5분 마다 취하고, 세포 지수(CI)로서 보고했다. 이펙터 세포 첨가 약 3시간 후에, 1M HCl 8㎕를 40mM HEPES 및 40mM PIPES, pH 7.4를 함유하는 X-VIVO 15 배지와 함께 웰에 첨가하여 pH를 7.4에서 6.7로 스위칭했다. 임피던스 판독은 이펙터 세포 첨가 후 약 20시간 동안 지속되었다. 특이적 세포 용해의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: ((CI 표적 + C1VP 형질되입된 이펙트 T 세포) - (CI 표적 + T1BVP 형질도입된 이펙트 T 세포))/(CI 표적 C1VP) × 100.
결과
감소된 pH에서 증가된 활성을 갖는 동족 항원 표적 1에 결합 할 수 있는 MRB-CAR의 세포독성 활성을 pH 6.7 및 pH 7.4에서 비교했다. 항-표적 1 MRB-CAR을 코딩하는 렌티바이러스 입자로 형질도입된 T 세포를 사용하여 표적 1을 발현하는 CHO 세포를 사멸시킨 다음, pH를 증가시켜 세포독성 활성이 pH 이동에 의해 억제될 수 있는지를 결정했다. 도 27a 및 27b에 도시된 바와 같이, 배지의 pH를 증가시키기 위해 활성 CAR-T 세포의 미세환경에 NaHCO3 또는 NaOH를 첨가하면 MRB-CAR을 발현하는 T 세포의 세포독성 활성을 억제했다. 이러한 결과는 활성 MRB-CAR 발현 T 세포가 표적 발현 세포를 사멸시킬 수 있고, 이어서, 이 사멸 활성은 미세환경의 pH를 증가시킴으로써 억제될 수 있음을 보여준다.
pH 변화에 의해 활성화되는 MRB-CAR을 발현하는 T 세포의 세포독성 활성의 능력도 또한 측정했다. 도 27c에 도시된 바와 같이, CHO-표적 1 세포에 상의 항-표적 1 MRB-CAR 발현 T 세포의 세포독성 활성은 pH 7.4에서 낮았고, HCl의 첨가에 의해 증가되어 미세환경의 pH를 감소시켰다. 누적적으로, 이들 결과는 MRB-CAR을 발현하는 T 세포의 세포독성 활성이 pH의 증가 후에 세포독성 활성을 감소시키고 pH의 감소 후에 세포독성 활성을 증가시킴으로써 미세환경 내의 pH 이동에 의해 조절될 수 있음을 입증한다. 이 비제한적 예에서, pH는 pH 6.7으로부터 증가하고, 7.4으로부터 감소했다.
실시예 16. 중탄산염 투여는 마우스의 종양 미세환경의 pH를 증가시킬 수 있다.
하기 실시예는 생체내 종양 미세환경의 pH가 약리학적 약제를 투여함으로써 조절될 수 있음을 입증한다. 이 실시예에서, 약리학적 제제는 중탄산나트륨이고, 종양 미세환경은 마우스의 CHO 이종이식 종양이다. 이 실시예는 생체내 및 생체외 모두에서 종양 미세환경의 pH를 측정하는 두 가지 방법을 포함한다.
대부분의 고형 종양의 세포외 미세환경은 산성이며, pH는 전형적으로 6.5 내지 6.9이다. 반대로, 정상 조직 pH는 염기성이며, 전형적으로 pH는 7.2 내지 7.5이다. 그러나, 종양 미세환경의 생체내 pH를 직접 측정하는 것은 어려울 수 있다. 다행히, 카텝신의 상대적 프로테아제 활성은 낮은 pH에서 더 높고, 높은 pH에서 더 낮다. 따라서, 종양내 카텝신 활성의 측정은 종양 미세환경의 pH의 대용물 척도로서 역할을 할 수 있다. 카텝신 B, L, S, K, V 및 D의 생체내 활성을 측정하기 위해, 근적외선 ProSense 750 FAST 프로브(PerkinElmer)를 사용했다. 중탄산나트륨의 투여에 의해 종양 미세환경에서 pH의 조절을 추가로 확인하기 위해, 절제된 종양을 페놀 레드(phenol red)로 처리하고, 색을 주시했다. 페놀 레드는 pH 의존적 색 전이를 겪는 pH 지시제이다. 페놀 레드의 나트륨 염은 pH 값을 확인하기 위해 세포 배양 배지에서 널리 사용된다. 페놀 레드의 용액은 pH 6.4 이하에서 황색, pH 7.0 부근에서 오렌지색, pH 7.4 부근에서 적색, pH 7.8 이상에서 자주색을 나타낸다.
마우스를 동물 관리 및 사용 위원회 승인된 프로토콜에 따라 처리했다. 피하(sc) 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 종양 이종이식편을 12 내지 14주령의 암컷 B-NSG 마우스(NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Bcgen(Beijing Biocytogen Co. Ltd.))의 뒷 옆구리에 확립했다. 간단히, 배양된 CHO 세포(ATCC, Manassas, VA)를 DPBS (ThermoFisher)로 세척하고, 계수하고, 차가운 DPBS 중에 재현탁시키고, 얼음 위에서 1.5 x 106 세포/200μl의 농도로 적절한 용적의 Matrigel ECM(Corning, 최종 농도 5mg/mL)과 혼합했다.
동물은 주사 전에 모발 제거(Nair)와 함께 표준 승인된 마취를 사용하여 주사를 위해 준비했다. ECM 중 세포 현탁액 200μl를 마우스의 뒤쪽 옆구리에 피하 주사했다. 종양이 촉지가능하면, 종양을 캘리퍼스를 사용하여 2회/주로 측정했다. 종양 용적은 다음 식을 사용하여 계산했다: (최장 직경* 최단 직경2)/2. 평균 종양 용적이 200mm3에 도달되면, 마우스를 무작위로 각각의 치료 그룹에 배정했다.
중탄산염 투여 2일 전에, B-NSG 마우스의 식수를 산성에서 규칙적인 pH 오토클레이브화 정제수로 변경했다. 다음 날, 750 ProSense FAST 프로브를 100μl 꼬리 정맥 주사(4 nmol ProSense 750 FAST 프로브/100μl PBS)를 통해 6마리의 CHO-이종이식 종양 보유 마우스에 투여했다. CHO-이종이식 종양 보유 마우스의 개별 그룹을 치료하지 않고 방치했다. 다음 날, 중탄산나트륨을 투여하고, ProSense 750 FAST 프로브로 치료한 마우스의 이미징을 Caliper IVIS Lumina XR을 사용하여 수행했다. 간단히, 마우스를 2L/분의 O2 운반 가스에서 3% O2 2L/분 이소플루란을 사용하여 마취시킨 다음, 이미징 동안 마취된 마우스에게 1.5% 이소플루란을 공급하는 노즈콘으로 배치했다. 이미지 획득은 근적외선 프로브(745/810nm 여기/방출 파장)에 대해 5초 노출로 구성된다. 형광 이미지가 마우스의 정상적인 광 이미지에 중첩된다. 시간 0 (전처리) 이미지를 PBS(대조군) 또는 중탄산나트륨 투여 전에 획득했다. 이어서, 마우스는 복강내 주사(ip)를 통해 1ml/마우스 PBS(대조군, ThermoFisher) 또는 1ml/마우스 1M 중탄산나트륨(Shanghai Experiment Reagent Co., LTD)을 투여했다. 이어서, 마우스를 PBS 또는 중탄산염 투여 30분 후에 영상화했다. 수집된 형광 이미지는 동일한 최소, 최대 및 임계 값을 갖도록 조정했다. 광자 수는 이 연구에서 상대적 형광 단위(RFU)로서 정의되었다. RFU는 각 마우스에서 30분 시점으로부터 전처리 시점(시간 0; 100 %)까지의 광자 수를 정규화함으로써 계산되었다. 시간 0 전처리 값에서 각 마우스의 형광 값 사이의 가변성으로 인해, 상이한 시점에서 관찰된 형광 강도 값을 평균 전처리 값이 아닌 개개 마우스에만 정규화했다.
실험의 별도 아암에서, NIR 카텝신 프로브를 받지 않은 6마리의 마우스를 PBS 또는 중탄산나트륨의 복강내 투여 후 1.5시간에 자궁경부 탈구에 의해 안락사시켰다. CHO 이종이식 종양을 각 마우스로부터 절제했다. 이종이식 종양을 메스로 2등분으로 나누어 페트리 접시에 놓았다. 종양 조직 절반을 메스를 사용하여 반복적으로 절단/슬라이싱했다. 각각, 각각의 종양 절반에 물 또는 0.05% 페놀 레드 용액(페놀 레드 50mg/물 100ml)을 적가했다. 종양 이종이식편 샘플이 제거되면, 색을 기록하고, 이미지는 처리된 종양 이종이식편 및 페트리 플레이트 상에 잔류하는 페놀 레드 용액을 촬영했다.
결과
도 29는 PBS(대조군; n = 3) 또는 중탄산염(n = 3)의 투여 전후의 CHO-이종이식 종양 보유 마우스에서 이미징 종양내 카텝신 활성으로부터의 RFU 결과(SEM에 의한 평균)를 나타낸다. 이러한 결과는 중탄산나트륨 투여가 중탄산나트륨 복강내 투여 후에 관찰된 감소된 카텝신 활성에 의해 입증되는 바와 같이 생체내 종양 미세환경의 pH를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
페놀 레드 지시제의 황색/오렌지색에서 적색으로의 색 변화는 PBS-처리된 마우스(n = 3)에 대해 중탄산나트륨 처리된 마우스(n = 3)로부터 절제된 종양 조직을 사용하여 관찰되었다. 이러한 결과는, 중탄산나트륨 투여가 페놀 레드 지시제의 황색/오렌지색에서 적색으로의 색 변화에 의해 입증되는 바와 같이 복강내 투여 후 생체내 종양 미세환경의 pH를 증가시킨다는 것을 시사한다.
실시예 17. 후보 키메라 폴리펩타이드 림프증식성 요소의 동정.
이 실시예에서, 후보 (추정) 키메라 림프증식성 요소의 2개의 키메라 폴리펩타이드 라이브러리(라이브러리 1 및 라이브러리 2)를 도 30 및 31에 제공된 키메라 폴리펩타이드-코딩 작제물에 따르는 세포외 막관통 블록 서열, 세포내 블록 서열 및 바코드 라이브러리의 풀로부터 바이러스 벡터로 조립했다. 라이브러리-형질도입된 PBMC의 증식은 시간이 지남에 따라 추적되었다: 게놈 DNA는 1주일 간격으로 PBMC로부터 추출되었고, 바코드 영역은 DNA 서열분석을 위해 증폭되어 각각의 시험 후보 키메라 림프증식성 요소를 함유하는 이러한 PBMC의 혼합 배양물에서 세포 수를 추정했다. 따라서, 스크린은 IL-2 또는 임의의 다른 외인성 사이토카인의 부재하에 PBMC 세포 증식을 촉진시키는 후보 키메라 림프증식성 요소의 능력을 시험했다.
이 연구에서 2개의 라이브러리를 제조하고 분석했다: 라이브러리 1(라이브러리 1A, 1.1A 및 1.1B로 동정된 스크린에 사용됨)의 작제물은 후보 키메라 폴리펩타이드의 5' 말단에서 CAR과 측접되는 반면, 라이브러리 2(라이브러리 2B 및 2.1B로 동정된 스크린에 사용됨)의 작제물은 CAR을 포함하지 않았다(도 30 및 도 31). 도 30은 렌티바이러스 벡터 백본에서 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 EF-1 알파 프로모터 및 코작형 서열 (GCCGCCACC (서열번호: 519))에 의해 구동된 라이브러리 1의 후보 키메라 림프증식성 요소(CLE)를 함유하는 비제한적이고 예시적인 도입유전자 발현 카세트의 개략도를 제공한다. CAR은 FLAG-태깅되었고, CD19에 지시된 ASTR, CD8의 스토크 및 막관통 부분, 및 CD3z로부터의 세포내 활성화 도메인을 함유했다. 라이브러리 1의 각 후보 림프증식성 요소는 3개의 모듈을 포함했다; 세포외/막관통 모듈(P1-2) 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4). P1-2 모듈은 또한 인식 및/또는 제거 도메인(TAG)을 코딩했다. 삼중 정지 서열(TAATAGTGA (서열번호: 520))은 P4를 DNA 바코드(P5)로부터 분리했다. WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (서열번호: 521))는 (마지막 정지 코돈의 마지막 뉴클레오타이드 후 4bp를 개시하는) 마지막 정지 코돈과 (WPRE의 마지막 뉴클레오타이드 후에 83개의 뉴클레오타이드를 개시하는) 3' LTR 사이에 존재했다.
라이브러리 1의 CAR 및 P1-2는 T2A 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리되었다.
도 31은 렌티바이러스 벡터 백본에서 EF-1 알파 프로모터 및 코작형 서열 (GCCGCCACC (서열번호 519))에 의해 구동된 라이브러리 2의 후보 CLE를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적이고 예시적인 도입유전자 발현 카세트의 개략도를 제공한다. 라이브러리 2의 각 후보 림프증식성 요소는 3개의 모듈을 포함했다; 세포외/막관통 모듈(P1-2) 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4). P1-2 모듈은 또한 인식 및/또는 제거 도메인(TAG)을 코딩했다. 삼중 정지 서열 (TAATAGTGA (서열번호 520))은 P4를 DNA 바코드(P5)로부터 분리했다. WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (서열번호: 521))은 (마지막 정지 코돈의 마지막 뉴클레오타이드 후 4bp를 개시하는) 마지막 정지 코돈과 (WPRE의 마지막 뉴클레오타이드 후에 83개의 뉴클레오타이드를 개시하는) 3' LTR 사이에 존재했다.
두 라이브러리의 어셈블리된 후보 키메라 폴리펩타이드 부분은 3개의 위치(1개의 세포외/막관통 모듈(P1-2) 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4))과 정확히 동일한 설계를 따르고, 그 중 하나는 조기 종결 신호일 수 있다). 각 도메인 사이의 핵산 서열에 의해 코딩된 GGS 링커를 작제물 어셈블리의 생성물로서 포함시켰다. Myc 또는 eTAG 인식 및/또는 제거 도메인(표 6에서 "eTAG" 또는 "Myc Tag"로 지칭됨)의 완전 또는 변형 버전을 코딩하는 핵산을 P1-2 모듈의 일부로서 각각의 절단된 사이토카인 수용체(또는 엄선된 LMP1 작제물들)의 세포외 도메인에 대한 5'에 삽입하여 코딩된 후보 키메라 폴리펩타이드가 세포외 도메인과 프레임 내에 인식 및/또는 제거 도메인을 포함하도록 했다. 신호 서열은 라이브러리 1의 CAR-코딩 서열의 5' 말단 및 라이브러리 2의 인식 및/또는 제거 도메인-코딩 서열의 5' 말단에 삽입되었다. 강화된 코작형 서열이기도 한 코작형 서열 (GCCGCCACC (서열번호: 519))은 라이브러리 1의 신호-서열 코딩 서열의 5' 말단 및 라이브러리 2의 인식 및/또는 제거 도메인-코딩 서열 (또는 선택 LMP1 작제물)의 5' 말단에 존재하는 ATG 개시 코돈 이전의 10개 뉴클레오타이드 내에 삽입되었다. 제4 모듈은 약 10,000 x 약 10,000 서브-바코드(약 1억 조합)의 무작위 PCR 어셈블리에 의해 생성된 무작위 바코드를 함유했다. 라이브러리 1 작제물에 대한 CAR의 코딩 서열은 신호 서열, FLAG 태그, 항-CD19 ASTR scFv, CD8a 스토크, CD8a 막관통 도메인 및 CD3ζ 세포내 활성화 도메인을 코딩했다. CAR (라이브러리 1만) 및 CLE (라이브러리 1 및 라이브러리 2)의 발현은 EF1 알파 프로모터에 의해 구동되었다. 라이브러리 1의 작제물에서, T2A 부위는 CAR과 키메라 폴리펩타이드 코딩 서열 사이에 위치했다. 라이브러리 1 및 2에서, 삼중 정지 코돈은 P4의 3' 말단에 존재했다.
바이러스 벡터의 합성
라이브러리 어셈블리에 대한 개별적인 부분은 각 부분의 5 '및 3' 말단에 글리신-글리신-세린 서열을 코딩하는 양립가능한 유형 II 효소(AarI) 오버행 및 커넥터를 갖는 DNA 블록으로서 설계되고 합성되었다. 이어서, 이러한 부분을 보편적 인 플라스미드 벡터로 개별적으로 클로닝했다. 각 부분에 대한 어셈블리는 0.04pmol의 부분, 0.04pmol 바코드 혼합물 및 0.04pmol 플라스미드 벡터 백본을 10ul 반응물에 첨가한 다음, 1 단위 AarI 효소, 10 단위 T4 DNA 리가제, 최적 ㄹ리리가제 활성을 위한 1X 리가제 완충제(50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM ATP, 10mM DTT)가 첨가되는 하나의 튜브 어셈블리로서 수행했다. 소화 및 결찰 사이클은 다음과 같이 열 순환기를 사용하여 수행했다: 2분 동안 37℃, 5분 동안 16℃에서 55사이클; 최종 소화를 위해 50℃에서 5분 배양; AarI 불활성화를 위해 80℃에서 10 분 배양; 4℃에서 최종 유지. 이어서, 어셈블리된 벡터를 통상적인 에탄올 침전에 의해 정제했다. 생성되는 정제된 벡터를 Top10 전기 반응능 세포(Thermo Fisher Scientific) 내로 전기천공시키고(Electro Micropulser, Bio-rad), 선택 및 확장을위한 카나마이신 항생제를 함유하는 액체 배양물에서 직접 회수했다. 배양물을 37 ℃에서 10 내지 12시간 동안 배양한 다음 수거하고, 플라스미드를 ZymoPure-EndoZero™ 플라스미드 기가프렙 키트를 사용하여 정제했다.
렌티바이러스 입자 생산
재조합 렌티바이러스 입자는 gag/pol 및 rev를 코딩하는 별개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G를 코딩하는 슈도타입화 플라스미드에 의한 293T 세포(Lenti-XTM 293T, Clontech)의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었다. 동시 발현된 키메라 항원 수용체를 포함하거나 포함하지 않는 후보 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 합성 바이러스 벡터를 패키징 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 세포를 Freestyle 293 발현 배지(ThermoFisher Scientific)에서 연속 성장시켜 현택 배양에 적응시켰다. 현탁액 중의 세포를 1L 삼각 플라스크에서 1 x 106 세포/mL(200 mL)로 씨딩하고 약산에 용해된 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences)을 사용하여 즉시 형질감염시켰다.
플라스미드 DNA를 200mL의 세포에 대해 10mL의 Gibco™ Opti-MEM™ 배지로 희석시켰다. VSV-G로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 총 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음의 몰 비를 갖는 4개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 결합된 바이러스 벡터, 1x Rev-함유 플라스미드, 1x VSV-G 함유 플라스미드 및 1x gag/pol-함유 플라스미드. 별도로, PEI를 10㎖ Gibco™ Opti-MEM™으로 2 μg/mL(배양 용적, DNA와 2:1 비율)로 희석시켰다. 5분 실온 배양 후, 두 용액을 함께 완전히 혼합하고, 실온에서 20분 동안 배양했다. 최종 용적(20 ml)을 세포에 첨가했다. 이어서, 세포를 37℃에서 48시간 동안 125rpm으로 회전시키고 8% CO2로 배양했다.
48시간 후, 상청액을 수거하고, 1,000g에서 10분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 이어서, 바이러스성 상청액을 저단백질 결합 Millex-HV 0.45μm PVDF 필터(Millipore, 카탈로그 번호 SLHVR25LS)를 통해 여과시켰다. 정화된 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 1용적의 Lenti-X PEG(Takara, 4x)를 3용적의 정화된 상청액과 혼합하고, 4℃에서 밤새 배양했다. 렌티바이러스 입자는 1,500g 및 4℃에서 90분 원심분리에 의해 침전시켰다. 상청액을 버리고, 렌티바이러스 입자 펠릿을 IL-2 없이 초기 용적의 완전 PBMC 성장 배지의 1:100에 재현탁시켰다. 렌티바이러스 입자를 Takara(# 632200)의 p24 검정 ELISA 키트를 사용하여 적정했다.
PBMC의 형질도입 및 배양
건강한 공여체(101ml)로부터의 전체 인간 혈액을 CDP 항응고제(Nanger; S-200)를 함유하는 200ml 혈액 백에 수집했다. 혈액을 제조업자의 지침에 따라 Sepax 2 S-100 장치(Biosafe; 14000) 및 키트 CS900.2(BioSafe; 1008)를 사용하는 Ficoll-Pacque™(General Electric)과 함께 밀도 구배 원심분리를 사용하여 가공하여 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 수득했다. 생존 가능한 PBMC의 수율은 7.3 x 107 세포였다. Complete OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM(제조업자의 지침에 따라 OpTmizerTM CTSTM T 세포 확장 보충제(Thermo Fisher, A10484-02) 26ml, CTS™ 면역 세포 SR(Thermo Fisher, A2596101) 25ml, 및 CTS™ GlutaMAX™-I 보충물(Thermo Fisher, A1286001) 10ml가 보충된 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 기본 배지 1L(Thermo Fisher, A10221)) 30ml의 최종 용적에 0.5 x 106 생존가능한 세포/ml의 최종 농도로 2개의 G-Rex 100M 세포 배양 장치(Wilson Wolf, 81100S)에 1.5 x 107 PBMC를 각각 첨가했다. 50ng/ml의 농도로 활성화 항-CD3 Ab(OKT3, Novoprotein)와 함께 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2)(Novoprotein)를 또한 100IU/ml의 농도로 첨가하여 바이러스 형질도입을 위한 PBMC를 활성화시켰다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 목적하는 시험 키메라 폴리펩타이드-코딩 작제물(라이브러리 1 또는 라이브러리 2)을 함유하는 렌티바이러스 입자 제제를 감염 다중도(MOI) 5로 개별 G-Rex 장치에 첨가했다. G-Rex 장치(라이브러리 1 및 라이브러리 2)를 37℃ 및 5% CO2에서 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 추가의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 추가하여 각각의 G-Rex 장치의 최종 용적을 500ml가 되게 했다. 이러한 또는 이후 세포 배양 단계에서 추가의 IL-2 또는 다른 외인성 사이토카인은 첨가하지 않았다. G-Rex® 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 PBMC 분리 후 7일 동안 배양했다. 7일째에, 라이브러리 1 또는 라이브러리 2로 형질도입된 2개의 G-Rex 장치로부터의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 1.25 x 107의 라이브러리 1 및 2.54 x 107의 라이브러리 2를 세포를 IL-2가 없는 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM 500ml를 함유하는 새로운 G-Rex 100M 장치에 넣었다. CD19 ASTR의 CD19 + B 세포 활성화를 제공하기 위해, 해동된 0일째 동결 공여체 일치된 PBMC(1.46 x 107 PBMC)의 한 병을 라이브러리 1로 형질도입된 세포를 함유하는 G-Rex 장치에 첨가했다. 이러한 스크린에서, PBMC가 공급된 세포는 라이브러리 번호 다음에 A로 지정되었고, 예를 들어, 라이브러리 1로 형질도입되고 PBMC가 공급된 세포로 수행된 스크린을 본원에서 라이브러리 1A로 언지칭된다. 라이브러리 2는 0일째 PBMC를 받지 못했다. 이 스크린에서, PBMC가 공급되지 않은 세포는 라이브러리 번호 다음에 B로 지정되었고, 예를 들어, 라이브러리 2로 형질도입되고, PBMC가 공급되지 않은 세포로 수행된 스크린은 본원에서 라이브러리 2B라 지칭된다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 14일째에, 2개의 G-Rex 장치(라이브러리 1A 및 라이브러리 2B)의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 이들은 각각 IL-2가 없는 30ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 함유하는 6-웰 G-rex 플레이트(Wilson-Wolf; 80240M)의 개별 웰에 위치되었다. 해동된 0일째 동결 공여체 일치된 PBMC의 한 병을 라이브러리 1A 세포를 함유하는 웰에 첨가하여 CD19 ASTR의 CD19 + B-세포 활성화를 제공 했다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 21일째에, 세포를 6-웰 G-rex 플레이트의 웰로부터 수집하고, 14일째에 수행된 과정을 반복했다. 샘플(1 x 105 내지 약 4 내지 5 x 106 세포)을 형질감염 후 다양한 날(7, 21, 28 및/또는 35일째)에 수집하고, 게놈 DNA를 키트 프로토콜에 따르는 GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep을 사용하여 정제했다. 일부 경우에, 샘플을 Ficoll-Pacque™(General Electric)를 사용하는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 정제하여 게놈 DNA 추출 전에 죽은 세포를 제거했다. 정제된 게놈 DNA는 Illumina HiSeq을 사용하여 서열분석하여 쌍을 이룬-말단 150 bp 판독치를 생성했다. 일반적으로, 각각 색인화된 fastq 파일에서 1천만 판독치의 서브셋을 추출하고, 일정한 영역의 존재에 따라 바코드 서열을 추출하도록 조작된 주문제작된 R 스크립트인 바코드_판독기를 사용하여 분석을 위해 가공시켰다. 정제된 게놈 DNA는 또한 PacBio 서열분석 시스템에서 서열분석하여 바코드와 작제물을 연관시키기 위한 더 긴 판독 길이를 수득했다. 이러한 스크린은 반복되었고, 라이브러리는 1.1A, 1.1B 및 2.1B로 지정되었고, 여기서 A 및 B는 세포에 상기 논의된 바와 같은 PBMC가 공급되었는지의 여부를 나타낸다.
데이터 분석
HiSeq 데이터가 모든 시점에서 수득되면, 바코드 계수 표는 바코드 ID에 기초하여 병합된다. 계수는 식: 1 x 106* 원시 계수/합계(샘플 중 모든 바코드에 대한 원시 계수)를 사용하여 유병률 값으로서 지칭되는 '백만당 계수'로 정규화되었다. 시점당 0.33cpm 이하의 평균 유병률을 갖는 바코드는 폐기했다. 선택 시점에서 SMRT 서열분석(Pacific Biosciences)에 의해 수득된 전장 작제물-바코드 관련성을 사용하여 관심 있는 어셈블리를 동정했다. 3개 파트를 갖지 않는 불완전한 작제물 또는 둘 이상의 작제물 호출을 갖는 모호한 작제물을 여과했다. 각 어셈블리에 대한 농축 값은 (최종 시점에서 정규화된 계수 + 1)/(초기 시점에서 정규화된 계수 + 1)로 계산되었다. 후보 키메라 폴리펩타이드 유전자는 각각의 라이브러리에 특이적인 임계 값 이상으로 농축된 작제물로서 동정되었다.
결과
키메라 폴리펩타이드 후보는 세포외 및 막관통 도메인(P1-2), 제1 세포내 도메인(P3) 및 제2 세포내 도메인(P4)을 포함하는 3개의 시험 도메인을 갖도록 설계되었다(도 30 및 도 31). 또한, 작제물에는 차세대 서열분석을 사용하여 작제물을 분석하고 동정하는 데 도움이 되는 DNA 바코드가 포함된다. 또한, 표 6에 나타낸 바와 같은 대부분의 작제물은 세포외 및 막관통 도메인과 프레임에 인식 및/또는 제거 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하였다. 그러나, LMP1의 세포외 또는 막관통 단편을 코딩하는 작제물의 인식 및/또는 제거 도메인은 이러한 인식 및/또는 제거 도메인을 함유하는 작제물에 대해 세포내였다. 라이브러리 1 작제물은 키메라 폴리펩타이드 후보의 CAR 상류를 코딩했다. 총 226,840개의 개념화된 가능한 조합이 20개의 상이한 세포외-막관통 도메인, 106개의 가능한 P3 도메인 및 107개의 가능한 P4 도메인을 기반으로 설계되었으며, 그 중 하나는 정지 코돈이었다. 모든 개념화된 작제물이 바이러스 벡터 어셈블리, 렌티바이러스 입자 생산, PMBC의 형질도입 및 배양 7일 후에 검출되었다. 라이브러리 1A의 경우, PBMC의 형질도입 후 및 배양 7일 후에 57,815개의 작제물이 존재했다. 라이브러리 2B의 경우, PBMC의 형질도입 및 배양 7일 후에 69,578개의 작제물이 존재했다. 분석된 후보들에 대한 상세한 정보뿐만 아니라 상세한 결과는 표 7 내지 11에 제공된다. 다양한 후보 부분에 대한 자세한 정보는 표 6에 제공된다. 표 7 내지 11의 헤더는 다음과 같다: 블록서열(BlockSequence)은 각 작제물에 사용된 표 6의 P1-P2, P3 및 P4 도메인의 코드이고; Norm_D7은 7일째에 정규화된 계수이고; Enrich_DXX는 XX째 대 7일째의 농축이며, 여기서, XX는 표에 표시된 일이고, 예를 들어, Enrich_D21은 21일째 대 7일째의 농축이고, Enrich_D35는 35일째 대 7일째의 농축이다. 작제물에 대한 데이터는 작제물의 바로 오른쫀 컬럼에 제시된다. 두개의 작제물에 대한 데이터는 각 열에 제시된다. 예를 들어, 표 7에서 동정된 첫 번째 후보는 M008-S212-S075이다. 이 후보의 경우, 세포외 및 막관통 도메인(P1-2)은 M008이고, 제1 세포내 도메인(P3)은 S212이며, 제2 세포내 도메인(P4)은 S075이다. 이러한 모듈, 예를 들어, M008의 동일성에 대한 상세한 정보는 표 6에서 찾을 수 있다. 표 6은 M008이 LMP1이고, 작제물이 Myc 태그를 포함한다는 것을 개시한다. 후보 도메인의 아미노산 서열은 표 6에 제공된다. 명료화를 위해, 표 6의 GenBank 식별자는 폴리펩타이드 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 일부 경우에, 핵산 서열은 클로닝 또는 코돈 최적화를 돕기 위해 변형되었지만, GenBank 서열과 동일한 폴리펩타이드를 코딩한다. 일부 경우에, 표 6에 제공된 아미노산 서열에 의해 명백한 바와 같이, GenBank 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 일부가 사용되었다.
후보 세포외 및 막관통 도메인은 적어도 일부 세포 유형에서 발현될 때 구성 적으로 활성인 것으로 보고된 사이토카인 또는 호르몬 수용체와 같은 공지된 돌연변이체 수용체로부터 선택되었다. 리간드 결합 영역은 후보 세포외 및 막관통 도메인에 포함되지 않았다. 이러한 수용체 돌연변이체의 돌연변이는 막관통 영역 또는 막근접(juxtamembrane) 영역에서 발생한다. 예시적인 후보 세포외 및 막관통 도메인은 IL7RA Ins PPCL, LMP1, CRLF2 F232C, CSF2RB V449E, CSF3R T640N, EPOR L251C I252C, GHR E260C I270C, IL27RA F523C 및 MPL S505N을 포함한다. 후보 세포외 및 막관통 도메인은 지질 래프트를 표적으로 하거나 CD40에 융합될 때 리간드와 독립적으로 세포 신호전달을 활성화시키는 것으로 공지된 다중스팬 막관통 단백질인 야생형 바이러스 단백질 LMP1을 포함한다(참조: Kaykas 등 EMBO J. 20: 2641 (2001)).
후보 키메라 폴리펩타이드의 제1 및 제2 세포내 도메인을 차지하도록 선택된 잠재적인 폴리펩타이드의 동일성은 동일했다. 이들 후보 세포내 도메인은 증식, 생존(항-세포자멸적)을 촉진하고/하거나 분화 상태, 증식 잠재력 또는 세포사에 대한 내성을 강화시키는 보조 자극 신호를 제공하기 위해 적어도 일부 세포 유형에서 공지된 유전자의 세포내 신호전달 도메인이었다. 후보 키메라 폴리펩타이드의 세포내 도메인 중 일부는 JAK1/JAK2 신호전달 및 STAT5를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 표 6에 열거된 일부 유전자의 세포내 도메인을 라이브러리에 포함시켰다. 이들 유전자의 예시적인 세포내 도메인은 표 7 내지 표 11의 P3 및 P4 위치에 제공된다. 이들 P3 및 P4 도메인에 관한 상세한 정보는 표 6에 제공된다.
키메라 폴리펩타이드 및 CAR을 코딩하는 적제물을 포함하는 라이브러리 1A의 경우, IL-2의 부재하에 배양될 때 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에서 가장 큰 수준으로 (그리고 생존가능성도 있음) PBMC의 증식을 촉진하는 172개의 상위 후보 키메라 폴리펩타이드가 동정되었다(참조: 표 7, 여기서 농축은 Log2(표에 표시된 최종 날의 정규화된 계수 +1) - log2(7일째 정규화된 계수 + 1)로서 계산된다). 실시예 17 및 18의 이러한 및 모든 스크리닝 실험이 경쟁적 실험임이 주목할 만하다. 따라서, 음성 결과는 IL-2와 같은 성장 인자의 부재하에 작제물이 T 세포의 증식을 촉진시키지 않는다는 것을 의미하지 않는다. 그것은 시험된 다른 작제물에 비해, 증식과 관련하여 성능이 뛰어나다는 것을 의미한다.
라이브러리 1A에 대해, 키메라 폴리펩타이드 작제물 중 일부는 P1-2 위치에서 시험된 모든 세포외 및 막관통 돌연변이체 도메인에 대해 표에 표시된 7일째 및 마지막 날 사이에 세포 증식을 촉진시켰다. 또한, 동일한 위치 P1-2 돌연변이체로부터 유래된 모든 작제물의 모든 결과가 결합되었을 때, 시험된 모든 세포외 및 막관통 도메인은 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 1보다 큰 세포 농축을 생성했다(즉, 세포 증식을 촉진시킨다). 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 세포외 및/또는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 7에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 1.1A로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 세포외 및/또는 막관통 도메인 또는 이의 부분 및/또는 돌연변이체의 예가 표 9에 제공된다. 세포 증식을 촉진시키는, PBMC를 공급받지 않은 라이브러리 1로 형질도입된 세포를 포함하는 라이브러리 1.1B로 지칭되는 반복 스크린에서 작제물에 존재하는 세포외 및/또는 막관통 도메인 또는 이의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 10에 제공된다.
라이브러리 1A의 경우, CD3D, CD3E, CD8A, CD27, CD40, CD79B, IFNAR1, IL2RA, IL3RA, IL13RA2, TNFRSF8 및 TNFRSF9로부터의 세포내 도메인, 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우 신호전달 활성을 갖는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 후보 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 위치(P3)에서 발견될 때, 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인(P3)과 결합된 방식으로 고려되었을 때, 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합 배양된 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 농축에 기초하여, 유전자에 대한 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 1A에 대해 7일째보다 표에 표시된 마지막 날에 이러한 도메인에 대한 적어도 3배 이상의 계수가 존재하도록 한다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 7에 제공된다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 1.1A로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 9에 제공된다. 세포 증식을 촉진시키는, PBMC가 공급되지 않은 라이브러리 1로 형질도입된 세포를 포함한, 라이브러리 1.1B로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 10에 제공된다.
라이브러리 1A의 경우, CD3D, CD3G, CD8A, CD8B, CD27, CD40, CD79B, CRLF2, FCGR2C, ICOS, IL2RA, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, TNFRSF9 및 TNFRSF18의 세포내 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 존재하는 경우 신호전달 활성을 가는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 후보 키메라 폴리펩타이드의 제2 세포내 도메인 위치(P4)에서 발견될 때, 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인(P4)와의 결합된 방식에서 고려될 때 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합 배양된 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 농축에 기초하여, 유전자에 대한 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 1A에 대해 7일째보다 35일째에 이러한 도메인에 대한 적어도 2.9배 이상의 계수가 존재하도록 했다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 7에 제공된다. 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 1.1A로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 9에 제공된다. 세포 증식을 촉진시키는, PBMC가 공급되지 않은 라이브러리 1로 형질도입된 세포를 포함한, 라이브러리 1.1B로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 10에 제공된다.
더욱 구체적으로, P1-P2 모듈로서 MPL S505N(MPL 원종양유전자, 아스파라긴으로 돌연변이된 세린 505를 갖는 트롬보포이에틴 수용체)을 갖는 5,996개의 작제물의 라이브러리 1A의 경우에, 165개는 양성이고, 이는 라이브러리 1A의 경우 2개 이상의 농축물을 갖는 작제물로서 정위되었다. P3 모듈로서 CD3D(CD3d 분자)를 갖는 436개의 작제물 중 24개가 양성이었다. P3 모듈로서 CD3E(CD3e 분자)를 갖는 528개의 작제물 중 17개가 양성이었다. P3 모듈로서 CD8A(CD8a 분자)를 갖는 261개의 작제물 중 14개가 양성이었다. P3 모듈로서 CD40(CD40 분자)을 갖는 1,022개의 작제물 중 50개가 양성이었다. P3 모듈로서 IL3RA(인터류킨 3 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 568개의 작제물 중 26개가 양성이었다. P3 모듈로서 CD79B(CD79b 분자)를 갖는 556개의 작제물 중 27개가 양성이었다. P3 모듈로서 IFNAR1(인터페론 알파 및 베타 수용체 서브유닛 1)을 갖는 131개의 작제물 중 7개가 양성이었다. P13 모듈로서 IL13RA2(인터류킨 13 수용체 서브유닛 α2)를 갖는 519개의 작제물 중 33개가 양성이었다. P3 모듈로서 IL2RA(인터류킨 2 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 571개의 작제물 중 28개가 양성이었다. P3 모듈로서 CD27(CD27 분자)을 갖는 618개의 작제물 중 30개가 양성이었다. P3 모듈로서 TNFRSF8(TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 8)을 갖는 573개의 작제물 중 15개가 양성이었다. P3 모듈로서 TNFRSF9(TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9)를 갖는 573개의 작제물 중 25개가 양성이었다. P4 모듈로서 IL13RA2(인터류킨 13 수용체 서브유닛 α2)를 갖는 360개의 작제물 중 25개가 양성이었다. P4 모듈로서 IL2RA(인터류킨 2 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 490개의 작제물 중 28개가 양성이었다. P4 모듈로서 IL15RA(인터류킨 15 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 489개의 작제물 중 22개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD8A(CD8a 분자)를 갖는 590개의 작제물 중 25개가 양성이었다. P4 모듈로서 IL13RA1(인터류킨 13 수용체 서브유닛 α1)을 갖는 619개의 작제물 중 25개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD3G(CD3g 분자)를 갖는 637개의 작제물 중 30개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD3D(CD3d 분자)를 갖는 618개의 작제물 중 37개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD27(CD27 분자)을 갖는 673개의 작제물 중 29개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD79B(CD79b 분자)를 갖는 654개의 작제물 중 33개가 양성이었다. P4 모듈로서 TNFRSF9(TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9)를 갖는 728개의 작제물 중 30개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD40(CD40 분자)을 갖는 1,169개의 작제물 중 53개가 양성이었다. P4 모듈로서 TNFRSF18(TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 18)을 갖는 1,324개의 작제물 중 54개가 양성이었다. P4 모듈로서 CD8B를 갖는 1,739개의 작제물 중, 73개가 양성이었다. P4 모듈로서 CRLF2를 갖는 286개의 작제물 중, 8개가 양성이었다. P4 모듈로 FCGR2C를 갖는 725개의 작제물 중 29개가 양성이었다. P4 모듈로서 ICOS를 갖는 602개의 작제물 중 24개가 양성이었다.
라이브러리 1A 및 1.1A의 경우, 작제물 M001-S116-S044, M024-S192-S045, M001-S047-S102, M048-S195-S043, M012-S216-S211 및 M030-S170-S194는 두 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는다. 반복된 스크린의 목적을 위해, 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물은 log2((마지막 날 정규화된 계수 데이터 + 1)/(7일째 정규화된 계수 데이터 + 1) 값이 2 이상인 작제물이었다.
라이브러리 1A 및 라이브러리 1.1A 모두의 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물 내의 제1 및 제2 세포내 도메인에 관한 추가 정보는 제1 및 제2 세포내 도메인이 유도된 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지의 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지의 여부를 포함하여 표 19에 제공된다. 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, IL6R, MYD88, CD27, MYD88, TNFRSF18 또는 IL31RA의 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, CD8B, IL1RL1, CD8A, TNFRSF4 또는 MYD88의 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A 및 1.1A 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 나타냈다(표 19). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 IL6R, CD27, TNFRSF18 또는 IL31RA로부터의 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우에, 사이토카인 수용체 IL1RL1 또는 TNFRSF4로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 1A와 1.1A 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 19).
키메라 폴리펩타이드를 코딩하고 CAR을 코딩하지 않은 작제물을 포함하는 라이브러리 2B에서, IL-2의 부재하에 배양될 때 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC 증식을 촉진시키는 167개의 상단 후보가 동정되었다(표 8 참조, 여기서, 농축은 Log2(표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1) - log2(7일째 정규화된 계수 + 1)로서 계산되었다). 일반적으로, 농축은 CAR을 포함하는 라이브러리 1A 작제물에서 발견된 것보다 적다는 것이 주목할 만하다.
라이브러리 2B의 경우, P1-2 위치의 CSF3R T640N은 다른 세포외 및 막관통 (P1-2) 도메인보다 우수하게 7일째 및 표에 표시된 마시막 날 사이에 세포 증식을 촉진시키고, 세포외 및 막관통 도메인으로부터 유래된 모든 작제물로부터의 모든 결과가 결합되면 2.5 초과의 농축 인자를 생성한다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 세포외 및/또는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 8에 제공된다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 2.1B로서 지칭된 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 세포외 및/또는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 11에 제공된다.
라이브러리 2B의 경우, CD8A, CD40, IFNAR1, IL31RA 및 MyD88의 세포내 도메인, 또는 그러한 돌연변이체가 표에 존재하는 경우 신호전달 활성을 갖는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 후보 키메라 폴리펩타이드의 제1 세포내 도메인 위치(P3)에서 발견될 때, 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인(P3)과 결합된 방식으로 고려될 때, 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합 배양된 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 농축에 기초하여, 유전자에 대한 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 2B에 대해 7일째보다 28일째에 이러한 도메인에 대한 적어도 2배 이상의 계수가 존재하도록 한다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 8에 제공된다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 2.1B로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 11에 제공된다.
라이브러리 2B의 경우, CD27로부터의 세포내 도메인, 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 키메라 폴리펩타이드 후보의 제2 세포내 도메인 위치(P4)에서 발견되는 경우, 데이터는 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인(P4)와 결합된 방식에서 고려되는 경우, 신호전달 활성을 갖는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합 배양된 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 농축에 기초하여, 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 2B의 경우 7일째보다 28일째에 이러한 도메인에 대해 11배 이상의 계수가 존재하도록 한다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예가 표 8에 제공된다. 최고 규모의 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 2.1B로서 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 11에 제공된다.
보다 구체적으로, 라이브러리 2B에 대해, 라이브러리 2B의 P1/P2 모듈로서 CSF3R T640N(아스파라긴으로 돌연변이된 트레오닌 640을 갖는 콜로니 자극 인자 3 수용체)을 갖는 6,909개 작제물 중 59개가 양성이었고, 이는 라이브러리 2B에 대한 2개 이상의 농축물을 갖는 작제물로서 정의되었다. 라이브러리 2B의 P3 모듈로서 IFNAR1(인터페론 알파 및 베타 수용체 서브유닛 1)을 갖는 184개의 작제물 중 3개가 양성이었다. 라이브러리 2B의 P3 모듈로서 CD40(CD40 분자)을 갖는 1,258개의 작제물 중 17개가 양성이었다. 라이브러리 2B의 P4 모듈로서 CD27(CD27 분자)을 갖는 851개의 작제물 중 11개가 양성이었다. 라이브러리 2B의 P3 모듈로서 CD8A를 갖는 418개의 작제물 중 10개가 양성이었다. 라이브러리 2B의 P3 모듈로서 IL31RA를 갖는 1,385개의 작제물 중 12개가 양성이었다. 라이브러리 2B의 P3 모듈로 MyD88을 갖는 5,757개의 작제물 중 56개가 양성이었다.
라이브러리 2B 및 2.1B의 경우, 작제물 M07-S049-S051, M007-S050-S039, M012-S050-S043, M012-S161-S213, M030-S142-S049, M001-S145-S130, M018-S085-S039, M018-S075-S053, M012-S135-S074 및 M007-S214-S077은 두 스크린 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 가졌다. 반복 스크린을 위해, 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물은 log2((마지막 날 정규화된 계수 데이터 + 1)/(7일째 정규화된 계수 데이터 + 1)) 값이 2 이상인 것들이었다.
라이브러리 2B 및 라이브러리 2.1B 모두의 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물 내의 제1 및 제2 세포내 도메인에 관한 추가 정보는 제1 및 제2 세포내 도메인이 유래되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지의 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 하나 이상의 ITAM 모티프를 갖는지의 여부를 포함하여 표 20에 제공된다. 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, CD28, CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA 또는 TNFRSF14로부터의 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, CD40, CD3G, CD8A, TNFRSF9, CD28, IL10RB, CD79B, FCER1G 또는 GHR로부터의 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 2B와 2.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 20). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 CD40, IL22RA1, IL13RA2, IL17RB, IFNGR2, FCGR2C, IL11RA 또는 TNFRSF14로부터의 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 TNFRSF9, IL10RB, FCER1G, GHR, 또는 CD40으로부터의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 2B와 2.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 20). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, FCGR2C로부터의 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, CD3G, CD79B 또는 FCER1G로부터의 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 2B와 2.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 20).
실시예 18. 후보 키메라 폴리펩타이드 림프증식성 요소의 동정.
이 실시예에서, 후보 (추정) 키메라 림프증식성 요소의 두개의 키메라 폴리펩타이드 라이브러리(라이브러리 3 및 라이브러리 4)는 도 32 및 33에 제공된 키메라 폴리펩타이드 코딩 작제물에 따라서 세포외-막관통 블록 서열, 세포내 블록 서열, 및 바코드 라이브러리의 풀로부터 바이러스 벡터로 조립된다. 라이브러리-형질도입된 PBMC의 증식은 시간이 지남에 따라 추적되었다: 게놈 DNA는 1주일 간격으로 PBMC로부터 추출되었고, 바코드 영역은 DNA 서열분석을 위해 증폭되어 각각의 시험 후보 키메라 폴리펩타이드를 함유하는 이러한 PBMC의 혼합 배양물에서 세포 수를 추정했다. 따라서, 스크린은 외성적으로 첨가된 IL-2 또는 임의의 다른 외인성 사이토카인의 부재하에 PBMC 세포 증식을 촉진시키는 후보 키메라 폴리펩타이드의 능력을 시험했다.
이 연구에서 2개의 라이브러리를 제조하고 분석했다: 라이브러리 3(라이브러리 3A, 3B, 3.1A 및 3.1B로서 동정된 스크린에 사용됨)은 키메라 폴리펩타이드의 5' 말단에서 CAR과 측접되는 반면, 라이브러리 4(라이브러리 44B 및 4.1B로 동정된 스크린에 사용됨)는 CAR을 포함하지 않았다. 도 32는 렌티바이러스 벡터 백본에서 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 EF-1 알파 프로모터 및 코작형 서열 (GCCGCCACC (서열번호: 519))에 의해 구동된 라이브러리 3의 후보 CLE를 함유하는 비제한적이고 예시적인 도입유전자 발현 카세트의 개략도를 제공한다. CAR은 FLAG-태깅되었고, CD19에 지시된 ASTR, CD8의 스토크 및 막관통 부분, 및 CD3z로부터의 세포내 활성화 도메인을 함유했다. 라이브러리 3의 각 후보 림프증식성 요소는 4개의 모듈을 포함했다; 세포외 모듈(P1), 막관통 모듈(P2) 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4). P1 모듈은 또한 Mye 인식 및/또는 제거 도메인을 코딩했다. 삼중 정지 서열(TAATAGTGA (서열번호: 520))은 P4를 DNA 바코드(P5)로부터 분리했다. WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (서열번호: 521))는 (마지막 정지 코돈의 마지막 뉴클레오타이드 후 4bp를 개시하는) 마지막 정지 코돈과 (WPRE의 마지막 뉴클레오타이드 후에 83개의 뉴클레오타이드를 개시하는) 3' LTR 사이에 존재했다.
라이브러리 3의 CAR 및 P1은 T2A 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리되었다.
도 33은 렌티바이러스 벡터 백본에서 EF-1 알파 프로모터 및 코작형 서열 (GCCGCCACC (서열번호 519))에 의해 구동된 라이브러리 4의 후보 CLE를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비제한적이고 예시적인 도입유전자 발현 카세트의 개략도를 제공한다. 라이브러리 4의 각 후보 림프증식성 요소는 4개의 모듈을 포함했다; 세포외 모듈(P1). 막관통 모듈(P2) 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4). P1 모듈은 또한 Myc 인식 및/또는 제거 도메인을 코딩했다. 삼중 정지 서열 (TAATAGTGA (서열번호 520))은 P4를 DNA 바코드(P5)로부터 분리했다. WPRE (GTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (서열번호: 521))은 (마지막 정지 코돈의 마지막 뉴클레오타이드 후 4bp를 개시하는) 마지막 정지 코돈과 (WPRE의 마지막 뉴클레오타이드 후에 83개의 뉴클레오타이드를 개시하는) 3' LTR 사이에 존재했다.
두 라이브러리의 어셈블리된 후보 키메라 폴리펩타이드 부분은 4개의 위치(1개의 세포외 모듈(P1), 1개의 막관통 모듈(P2) 및 2개의 세포내 부분(P3 및 P4))과 정확히 동일한 설계를 따르고, 그 중 하나는 조기 종결 신호일 수 있다)(도 32 및 33). Myc 태그 또는 eTAG 인식 및/또는 제거 도메인(표 6에서 "eTAG" 또는 "Myc Tag"로 지칭됨)의 완전 또는 변형 버전을 코딩하는 핵산을 라이브러리 3에서 CAR 코딩 서열의 5' 말단 및 라이브러리 4에서 P1 중 c-Jun 도메인의 5' 말단에 삽입되었다. 신호 서열은 라이브러리 3에서 CAR 코딩 서열의 5' 말단 및 라이브러리 4의 인식 및/또는 제거 도메인 코딩 서열의 5' 말단에 삽입되었다. 바코드를 포함하여 라이브러리의 일반적 설계 및 작제는 이 실시예에서 이후 보다 상세히 제시된 바와 같이 P1 및 P2 도메인 이외에 본원 실시예 17에 개시된 바와 같았다. 또한, 클리어런스 도메인은 표 6에 표시된 바와 같은 일부 작제물 상에 존재하고, 존재할 경우, eTag 변이체 또는 Myc 태그였다.
바이러스 벡터의 합성 및 렌티바이러스 생산
벡터를 합성하고, 실시예 17에 개시된 바와 같이 각 라이브러리에 대해 렌티바이러스 입자를 제조했다.
PBMC의 형질도입 및 배양
라이브러리 3A의 경우, 건강한 공여체로부터 전체의 인간 혈액(89.1ml)을 CDP 항응고제(Nanger; S-200)를 함유하는 200ml 혈액 백에 수집했다. 혈액을 제조업자의 지침 및 키트 CS900.2(BioSafe; 1008)에 따라 Sepax 2 S-100 장치(Biosafe; 14000)를 사용하는 Ficoll-PacqueTM(General Electric)과 함께 밀도 구배 원심분리를 사용하여 가공하여 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 수득했다. 생존가능한 PBMC의 수율은 8.4 x 107 세포였다. 바이알당 5 x 106 PBMC에서 세포의 바이알 10개를 라이브러리 3A 샘플을 함유하는 CD19-CAR에 대한 공급물 CD19+ B 세포에 이후 사용하기 위해 동결시켰다. 3 x 107 PBMC를 하나의 G-Rex 100M 세포 배양 장치(Wilson Wolf, 81100S)에 최종 농도 0.5 x 106 생존가능 세포/ml로 제조업자의 지침에 따라 OpTmizerTM CTSTM T 세포 확장 보충제(Thermo Fisher, A10484-02) ml, CTS™ 면역 세포 SR(Thermo Fisher, A2596101), 및 CTS™ GlutaMAX™-I 보충제(Thermo Fisher, A1286001)가 보충된 Complete OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM(OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 기본 배지 1L(Thermo Fisher, A10221)) 60ml의 최종 용적에 첨가했다. 50ng/ml의 농도로 첨가된 활성화 항-CD3 Ab(OKT3, Novoprotein)와 함께 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2)(Novoprotein)를 또한 100IU/ml의 농도로 첨가하여 바이러스 형질도입을 위한 PBMC를 활성화시켰다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 목적하는 시험 키메라 폴리펩타이드-코딩 작제물(라이브러리 3)을 함유하는 렌티바이러스 입자 제제를 감염 다중도(MOI) 5로 G-Rex 장치에 첨가했다. G-Rex 장치를 37℃ 및 5% CO2에서 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 추가의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 추가하여 최종 용적을 500ml가 되게 했다. 이러한 또는 이후 세포 배양 단계에 추가의 IL-2 또는 다른 외인성 사이토카인은 첨가하지 않았다. G-Rex® 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 PBMC 분리 후 7일 동안 배양했다. 7일째에, 라이브러리 3으로 형질도입된 G-Rex 장치로부터의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 5 x 107의 라이브러리 3 세포를 IL-2가 없는 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM 500ml를 함유하는 새로운 G-Rex 100M 장치에 넣고, 라이브러리 3A로서 표지했다. 1.1 x 108의 라이브러리 3 세포를 IL-2가 없는 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM 500ml를 함유하는 새로운 G-Rex 100M 장치에 넣고, 라이브러리 3B로서 표지했다. 이러한 스크린에서, PBMC가 공급된 세포를 라이브러리 번호 다음에 A로서 지정되었고, 예를 들어, 라이브러리 3으로 형질도입되고 PBMC가 공급된 세포로 수행된 스크린은 본원에서 라이브러리 3A로서 지칭된다. CD19 ASTR의 CD19 + B 세포 활성화를 제공하기 위해, 해동된 0일째 동결 공여체 일치된 PBMC(2 x 107 PBMC)의 4개의 바이알을 라이브러리 3A로 형질도입된 세포를 함유하는 G-Rex 장치에 첨가했다. 라이브러리 3B는 0일째 PBMC를 받지 못했다. 이 스크린에서, PBMC가 공급되지 않은 세포는 라이브러리 번호 다음에 B로 지정되었다. 예를 들어, 라이브러리 3으로 형질도입되고, PBMC가 공급되지 않은 세포로 수행된 스크린은 본원에서 라이브러리 3B라 지칭된다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 14일째에, 2개의 G-Rex 장치(라이브러리 3A, 라이브러리 3B)의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 이들은 각각 IL-2가 없는 30ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 함유하는 6-웰 G-Rex 플레이트(Wilson-Wolf; 80240M)의 개별 웰에 위치되었다. 해동된 0일째 동결 공여체 일치된 PBMC(5 x 106 PBMC)의 하나의 바이알을 라이브러리 3A G-Rex에 첨가하여 CD19 ASTR의 CD19 + B-세포 활성화를 제공했다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 동결된 0일째 PBMC의 두개의 바이알을 라이브러리 3A에 21일째에, 하나의 바이알을 28일째, 35일째 및 42일째에 첨가하는 것 이외에는 이 과정을 21일, 28일, 35일 및 42일째에 반복하였다. 라이브러리 3B는 21일 후 배양되지 않았다. P1 부분의 Myc 태그가 표 6, 14 및 15에 나타낸 바와 같이 eTag로 대체되고 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지정된 것을 제외하고는 이들 스크린을 반복하였고, 여기서 A 및 B는 상기 한 바와 같은 PBMC가 세포에 공급되었는지의 여부를 나타냈다.
라이브러리 3A로부터의 세포를 49일째에 유동 세포 계측법으로 분석하기 위해 제조했다. 세포를 원심분리(400g, 5분)로 수거하고, 제조업자의 지시에 따라 Ficoll(Ficoll-Paque Premium (GE, 카탈로그 번호 17-5442-02))에 적층시켰다. 1.7 x 106 세포를 450μl FAC 염색 완충제(554656, BD)에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 각각 50μl 또는 1.8 x 105 세포를 함유하는 9개의 에펜도르프 튜브에 분액화했다. 2.5μl의 인간 Fc 블록(564220, BD)을 각 튜브에 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 배양했다. 5색 염색된 샘플을 위해 다음 항체 레시피를 50μl 샘플에 첨가하여 CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, FLAG 태그 (CAR+)를 염색시켰다: 2.5μl 항-CD3-BV421 항체(클론 OKT3,317344, Biolegend), 2.5μl 항-CD8-BV510 항체(클론 RPT-T8(301048, Biolegend), 2.5μl 항-CD4-PE-Cy7 항체(클론 OKT4(317412, Biolegend), 2.5μl 항-CD56-BV785(362550, Biolegend) 및 0.5μl PE 항-FLAG 태그(항-DYKDDDDK, 클론 L5, 637310, Biolegend). 2색 염색 샘플을 위해 2.5μl BB515 CD19 항체(클론 HIB19, 564456, BD) 및 0.5ul PE 항-FLAG 태그 항체를 첨가했다. CD3, CD4, CD8, CD56 또는 FLAG 태그에 대해 단일 염색된 샘플도 또한 상기 항체 및 용적을 사용하여 제조했다. 2.5㎕의 BV410 IgG (마우스 IgG2a, 400259, Biolegend), 2.5μl PE/CY5 IgG(마우스 IgG2b, 400317, Biolegend), 2.5μl의 BV510 IgG(마우스 IgG1, 400171, Biolegend), 2.5μl의 BV785 IgG(마우스 IgG1, 400169, Biolegend) 및 10μl PE IgG(마우스 IgG1, 555749, BD)를 IgG 대조군 염색 샘플을 위해 첨가했다. 비염색된 대조군에는 항체가 첨가되지 않았다. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양했다. 샘플을 원심분리하고(400g, 5분), 상청액을 제거했다. 샘플을 0.5ml FACS 염색 완충제로 2회 세척했다. 염색된 세포 펠릿을 125μl FACS 염색 완충제에 재현탁시킨 다음, 125ul BD 고정 완충제(554655BD)를 첨가하여 고정시켰다. 샘플을 4℃에서 15분 동안 고정 완충제로 배양했다. 샘플을 500μl의 FACS 염색 완충제로 2회 세척하고 0.4ml의 FACS 염색 완충제로 재현탁시켰다. 샘플의 FACs 분석을 Novocyte 유동 세포 계측기(ACEA Biosciences)로 수행하고, 전방 및 측면 산란광에 근거한 림프구 게이트를 사용하여 분석했다.
라이브러리 4B의 경우, 건강한 공여체로부터 전체의 인간 혈액(70ml)을 CDP 항응고제(Nanger; S-200)를 함유하는 200ml 혈액 백에 수집했다. 혈액을 제조업자의 지침 및 키트 CS900.2(BioSafe; 1008)에 따라 Sepax 2 S-100 장치(Biosafe; 14000)를 사용하는 Ficoll-PacqueTM(General Electric)과 함께 밀도 구배 원심분리를 사용하여 가공하여 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 수득했다. 생존가능한 PBMC의 수율은 4.9 x 107 세포였다. 4.9 x 107 PBMC를 하나의 G-Rex 100M 세포 배양 장치(Wilson Wolf, 81100S)에 최종 농도 0.5 x 106 생존가능 세포/ml로 최종 용적 98ml의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 첨가했다. 50ng/ml의 농도로 첨가된 활성화 항-CD3 Ab(OKT3, Novoprotein)와 함께 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2)(Novoprotein)를 또한 100IU/ml의 농도로 첨가하여 바이러스 형질도입을 위한 PBMC를 활성화시켰다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 목적하는 시험 키메라 폴리펩타이드-코딩 작제물(라이브러리 4)을 함유하는 렌티바이러스 입자 제제를 감염 다중도(MOI) 5로 G-Rex 장치에 첨가했다. G-Rex 장치를 37℃ 및 5% CO2에서 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 추가의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 추가하여 최종 용적을 500ml가 되게 했다. 이러한 또는 이후 세포 배양 단계에 추가의 IL-2은 첨가하지 않았다. G-Rex® 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 PBMC 분리 후 7일 동안 배양했다. 7일째에, 라이브러리 4로 형질도입된 G-Rex 장치로부터의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 1.63 x 108의 라이브러리 4 세포를 IL-2가 없는 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM 500ml를 함유하는 새로운 G-Rex 100M 장치에 넣고, 라이브러리 4로서 표지했다. 라이브러리 4는 0일째 PBMC를 공급하지 않았다. 이러한 스크린에서, 상기 라이브러리는 라이브러리 번호 다음에 B로서 지정되었고, 예를 들어, 라이브러리 4로 형질도입되고 PBMC가 공급되지 않은 세포로 수행된 스크린은 본원에서 라이브러리 4B로서 지칭된다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 14일째에, G-Rex 장치(라이브러리 4)로부터의 세포를 원심분리로 수집하고, IL-2 없는 새로운 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 이러한 세포를 IL-2 없이 30ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 함유하는 6-웰 G-rex 플레이트(Wilson-Wolf; 80240M)의 개별 웰에 각각 위치시켰다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양했다. 라이브러리 4 샘플은 21일 후 배양하지 않았다. P1 부분의 Myc 태그가 표 6 및 16에 나타낸 바와 같이 eTag로 대체되고 라이브러리 4.1A로 지정된 것을 제외하고는 이들 스크린을 반복하였고, 여기서 B는 상기 한 바와 같은 PBMC가 세포에 공급되지 않았음 나타냈다.
샘플(7 x 104 내지 약 4-8 x 106 세포)을 형질도입 후 다양한 날(7일째 및 21일째)에 수집하고, 게놈 DNA는 키트 프로토콜에 따라 GenEluteTM 포유동물 게놈 DNA 미니프렙을 사용하여 정제했다. 일부 경우에, 샘플은 피콜-PacqueTM(General Electric)과 함께 밀도 구배 원심분리를 사용하여 정제시켜 계놈 DNA 추출 전에 죽은 세포를 제거했다. 정제된 게놈 DNA을 Illumina HiSeq를 사용하여 서열분석하여 쌍을 이룬-말단 150 bp 판독치를 생성했다. 일반적으로, 천만 판독치의 서브셋을 각각의 색인화된 fastq 파일로부터 추출하고, 일정 영역의 존재를 기반으로 하는 바코드 서열을 추출하도록 조작된 사용자 지정된 R 스크립트인 바코드_판독기를 사용하여 분석을 위해 가공했다. 정제된 게놈 DNA를 또한 PacBio 서열분석 시스템에서 서열분석하여 바코드를 작제물과 연관시켰다.
데이터 분석
데이터 분석은 시점이 상이한 것을 제외하고는 실시예 17에 개시된 바와 같이 수행했다.
결과
이 실험에서, 키메라 폴리펩타이드 후보는 세포외 도메인(P1), 막관통 도메인(P2), 제1 세포내 도메인(P3) 및 제2 세포내 도메인(P4)을 포함하는 4개의 시험 도메인을 갖도록 설계되었다(도 32 및도 33). 실시예 17에서 설명된 바와 같이, 작제물은 차세대 서열분석을 사용하여 작제물의 분석 및 동정을 돕기 위한 DNA 바코드를 포함했다. 또한, 모든 작제물은 세포외 도메인과 프레임 내에 인식 및/또는 제거 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함했다. 라이브러리 4에서가 아니라 라이브러리 3에서의 작제물은 라이브러리 1에서 사용된 CAR과 구조가 동일한 키메라 폴리펩타이드 후보의 상류에 CAR을 코딩한다(실시예 17).
라이브러리 3 및 라이브러리 4에 사용된 세포외 도메인은 이량체화 모티프인 것으로 공지된 류신 지퍼 모티프(NM_002228_3)를 포함하는 c-Jun의 변이체이다(참조: 예를 들어, Chinenov and Kerppola, Oncogene. 2001 Apr 30;20(1 9):2438-52). 0 및 4 알라닌 잔기 사이의 스페이서가 c-Jun 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이의 후보 키메라 폴리펩타이드에 포함되었다. 이론에 의해 제한되지 않고, 알라닌 스페이서는 연결 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인의 배향을 변화시킴으로써 막관통 도메인을 통해 류신 지퍼 세포외 영역에 연결된 세포내 도메인의 신호전달에 영향을 미칠 수 있다고 여겨진다.
후보 막관통 도메인은 야생형 및 돌연변이체 타입 I 수용체, 예를 들어, 사이토카인, 호르몬, 보조 자극 또는 적어도 일부 세포 유형에서 발현될 때 구성적으로 활성인 것으로 보고된 활성화 수용체로부터의 공지된 단일 스패닝 막관통 도메인으로부터 선택되었다. 라이브러리 3 및 라이브러리 4에 대해 선택된 그러한 수용체 돌연변이체의 돌연변이는 막관통 영역에서 발생한다. 라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 3.1B, 4B 및 4.1B에 대한 예시적인 막관통 도메인은 표 12 내지 표 17에서 동정될 수 있다. 표 12-17의 헤더는 다음과 같다: 블록서열은 각 작제물에 사용된 표 6의 P1, P2, P3 및 P4 도메인의 코드이고; Norm_D7은 7일째에 정규화된 계수이고; Enrich_DXX는 XX일째 대 7일째의 농축물이며, 여기서 XX는 표에 표시된 일이고, 예를 들어, Enrich_D21은 21일째 대 7일째의 농축물이고, Enrich_D35는 35일째 대 7일째의 농축물이다. 작제물에 대한 데이터는 작제물에 대한 바로 오른쪽 컬럼에 제시된다. 두 작제물에 대한 데이터는 각 열에 제시된다. 예를 들어, 표 12에서 동정되는 제1 작제물은 P1-P2-P3-P4를 나타내는 E013-T047-S158-S080이다. 그 작제물에서, 막관통 도메인(P2)은 이 작제물에 포함된 이 도메인의 아미노산 서열과 함께, 표 6에 제공된 IL7RA Ins PPCL(인터류킨 7 수용체)의 막관통 도메인인 T047이다. 실시예 17에 포함된 동일한 제1 세포내 도메인(P3) 및 제2 세포내 도메인(P4)은 P3 부분 중 하나가 스페이서인 것을 제외하고는 본 실시예의 라이브러리에 포함되었다(하기 참조).
총 5개의 개념화된 가능한 조합은 그것을 82개의 상이한 막관통 도메인, 81개의 가능한 P3 도메인(이 중 하나는 23개의 아미노산 스페이서였다), 21개의 가능한 P4 도메인(이 중 하나는 정지 코돈이었다)와 분리하는 0-4개의 알라닌 스페이서를 갖는 Jun 류신 지퍼 세포외 도메인을 기초로 하여 설계되었다. 모든 개념화된 작제물이 바이러스 벡터 어셈블리, 렌티바이러스 입자 생성, PMBC의 형질도입 및 배양 7일 후에 검출된 것은 아니었다. 라이브러리 3A 및 3B의 경우, PBMC의 형질도입 및 배양 7일 후에 68,951개의 작제물이 존재했다. 라이브러리 4B의 경우, PBMC의 형질도입 및 배양 7일 후에 50,652개의 작제물이 존재했다. 분석된 후보들에 관한 상세한 정보는 표 6 및 12 내지 17에서 결정될 수 있다. 작제물에 대한 코딩 시스템은 이전 단락에서 설명한 바와 같이, 실시예 17에서 설명된 것과 동일하다.
라이브러리 3A, 3B, 3.1A, 3.1B, 4B 및 4,1B의 경우, 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC 세포 증식을 촉진시키는 작제물이 동정되었다. CLE의 특정 모듈에 있는 특정 폴리펩타이드는 라이브러리 3A, 3B 및 4에 걸쳐 상단 히트 중 하나였다. 이러한 CLE는 증식을 최대 규모로 촉진시켰다. 예를 들어, P2 위치에 CD40 또는 ICOS; P3 위치에 MPL, MyD88, LEPR 또는 IFNAR2; 및/또는 P4 위치에 CD40, CD79B 또는 CD27을 함유하는 예시적인 작제물은 3개의 라이브러리 3A, 3B 및 4B 중 적어도 2개에서 상위 5개의 가장 빈번한 키메라 폴리펩타이드 중 하나였다(표 12, 13 및 16 참조). 놀랍게도, MPL은 3개의 라이브러리 모두에 대한 큰 마진에 의해 P3에서 가장 빈번한 키메라 폴리펩타이드였다. P3의 상위 히트(MPL, MyD88, LEPR 및 IFNAR2)는 이러한 작제물의 P4 위치에 포함되지 않았음을 주시한다.
키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 작제물을 포함하는 라이브러리 3A 및 3B 및 새로운 형질도입되지 않은 PBMC가 보충된(라이브러리 3A) 또는 보충되지 않은(라이브러리 3B) CAR 및 형질도입된 PBMC에서, IL-2의 부재하에 배양될 때 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC 증식을 촉진시키는 126 및 127개의 상위 후보가 각각 동정되었다(표 12 및 표 13 참조). 표 12와 표 13의 상위 후보 목록은 초기 중간 데이터 분석을 기반으로 하는 21일째 상위 100위의 가장 보편적인 후보를 초기 중간 데이터 분석을 기반으로 하는 21일째 및 7일째 사이의 상위 100개의 가장 농축된 후보 작제물을 결합함으로써 생성되었다. 초기 중간 데이터는 코딩된 라이브러리의 일부를 디코딩하여 상위 100개 작제물 중 66개 및 상위 1000개 작제물 중 538개가 라이브러리 3A에 대해 디코딩되고, 상위 100개 작제물 중 77개 및 상위 1000개 작제물 중 464개가 라이브러리 3B에 대해 디코딩되도록 생성되었다.
라이브러리 3A의 경우, CD40, CD8B, CRLF2, CSF2RA, FCGR2C, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IL10RB, IL18R1, IL18RAP, IL3RA, LEPR 및 PRLR 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인(P2)은 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 막관통 도메인과 결합된 방식으로 고려될 때 7일 및 21일 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다(데이터는 제시되지 않음). 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 21일째 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B의 경우, CD40, ICOS, CSF2RA, IL18R1, IL3RA 및 TNFRSF14의 막관통 도메인은 이러한 방식으로 분석될 때 최선의 수행자였다. 각각 35일째 및 21일째에 라이브러리 3A 및 3B에 대한 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이의 예는 표 12 및 표 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 표 15에 제공된다.
라이브러리 3A의 경우, IL17RD, IL17RE, IL1RAP, IL23R 및 MPL로부터의 제1 세포내(P3) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제1 세포내 도메인(P3)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체가 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째 및 21일째 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다 (데이터는 표시되지 않음). 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 21일째 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B의 경우, IL21R, MPL 및 IL2RB의 제1 세포내 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공되는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 이러한 방식으로 분석했을 때 최선의 수행자였다. 각각 35일째 및 21일째에 라이브러리 3A 및 3B에 대한 최대 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이의 예는 표 12 및 표 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 표 15에 제공된다.
라이브러리 3A의 경우, CD27, CD3G, CD40 및 CD79B로부터의 제2 세포내 (P4) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제2 세포내 도메인(P4)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체가 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째 및 21일째 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진시켰다(데이터는 표시되지 않음). 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 21일째 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B의 경우, CD40의 제2 세포내 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공되는 경우 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 이러한 방식으로 분석될 때 최선의 수행자였다. 각각 35일째 및 21일째에 라이브러리 3A 및 3B에 대한 최대 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이의 예는 표 12 및 표 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 표 15에 제공된다.
특정 유전자와 관련하여, P2 부분으로서 CD8B(CD8b 분자)를 갖는 798개 작제물 중 111개가 양성이었고, 이는 21일째에 라이브러리 3A 또는 3B에 대해 2개 이상의 농축물(log2)을 갖는 작제물로서 정의되었다. P2 부분으로서 CD40(CD40 분자)을 갖는 1,032개의 작제물 중 159개가 양성이었다. P2 부분으로서 CRLF2(인자 2와 같은 사이토카인 수용체)를 갖는 1,339개의 작제물 중 175개가 양성이었다. P2 부분으로서 CSF2RA(콜로니 자극 인자 2 수용체 알파 서브유닛)를 갖는 593개의 작제물 중 108개가 양성이었다. P2 부분으로서 FCGR2C(IgG 수용체 IIc의 Fc 단편(유전자/슈도유전자))를 갖는 714개의 작제물 중 88개가 양성이었다. P2 부분으로서 ICOS(유도성 T 세포 보조 자극인자)를 갖는 788개의 작제물 중 108개가 양성이었다. P2 부분으로서 IFNAR1(인터페론 알파 및 베타 수용체 서브유닛 1)을 갖는 882개의 작제물 중 106개가 양성이었다. P2 부분으로서 IFNGR1(인터페론 감마 수용체 1)을 갖는 806개의 작제물 중 104개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL3RA(인터류킨 3 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 938개의 작제물 중 132개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL10RB(인터류킨 10 수용체 서브유닛 베타)를 갖는 746개의 작제물 중 99개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL18R1(인터류킨 18 수용체 1)을 갖는 814개의 작제물 중 131개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL18RAP(인터류킨 18 수용체 보조 단백질)을 갖는 552개의 작제물 중 83개가 양성이었다. P2 부분으로서 LEPR(렙틴 수용체)을 갖는 1,390개의 작제물 중 184개가 양성이었다. P2 부분으로서 PRLR(프로락틴 수용체)을 갖는 795개의 작제물 중 123개가 양성이었다.
P3 부분으로서 IL1RAP(인터류킨 1 수용체 보조 단백질)를 갖는 1,259개의 작제물 중 158개가 양성이었고, 이는 21일째 라이브러리 3A 또는 3B에 대해 2 이상의 농축물을 갖는 작제물로서 정의되었다. P3 부분으로서 IL17RD(인터류킨 17 수용체 D)를 갖는 200개의 작제물 중 31개가 양성이었다. P3 부분으로서 IL17RE(인터류킨 17 수용체 E)를 갖는 11개의 작제물 중 3개가 양성이었다. P3 부분으로서 IL23R(인터류킨 23 수용체)를 갖는 538개의 작제물 중 86개가 양성이었다. P3 부분으로서 MPL(MPL 원종양유전자, 트롬보포이에틴 수용체)을 갖는 1,531개의 작제물 중 509개가 양성이었다.
P4 부분으로서 CD3G(CD3g 분자)를 갖는 3,124개 작제물 중, 458개가 양성이었고, 이는 21일째에 라이브러리 3A 또는 3B에 대해 2 이상의 농축물을 갖는 작제물로 정의되었다. P4 부분으로서 CD27(CD27 분자)를 갖는 3,293개의 작제물 중 443개가 양성이었다. P4 부분으로서 CD4(CD40 분자)를 갖는 5,163개의 작제물 중 724개가 양성이었다. P4 부분으로서 CD79B(CD79b 분자)를 갖는 4,486개의 작제물 중 663개가 양성이었다. 이것이 경쟁적 검정이기 때문에 "부정적"은 잘제물이 증식을 촉진시키는 것과 관련하여 경쟁하고 있음을 의미하지만, 작제물이 증식을 촉진할 수 없다는 것을 의미하는 것이 아님은 임의의 작제물에 대해 주목할 만하다.
라이브러리 3A 및 3.1A의 경우, 작제물 E008/E013-T041-S186-S050, E006/E011-T077-S186-S211, E007/E012-T021-S186-S051, E009/E014-T041-S186-S053, E007/E012-T073-S186-S053, E006/E011-T017-S186-S051, E006/E011-T031-S186-S211, E006/E011-T011-S186-S050, E006/E011-T011-S186-S047, E007/E012-T001-S186-S050, E006/E011-T041-S186-S051, E008/E013-T028-S186-S076, E009/E014-T029-S199-S053, E009/E014-T062-S186-S216, E007/E012-T006-S058-S051, E009/E014-T076-S186-S211, 및 E007/E012-T001-S186-S047은 두 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 가졌고, 여기서 슬래시로 분리된 P1 부분은 표 6, 12 및 14에 제시된 바와 같이, 라이브러리 3A 및 3A.1에 대해 상이한 태그를 포함했다. 반복 스크린을 위해, 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막 날 정규화된 계수 데이터 + 1 )/(7일째에 정규화된 계수 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
라이브러리 3A 및 라이브러리 3.1A 모두의 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물 내의 제1 및 제2 세포내 도메인에 관한 추가 정보는 제1 및 제2 세포내 도메인이 유도되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지의 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지의 여부를 포함하여 표 21에 제공된다. 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우 MPL, OSMR 또는 CSF2RA의 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우 CD40, TNFRSF4, CD79B, CD27, FCGR2A 또는 TNFRSF18의 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3A와 3.1A 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 21). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우 사이토카인 수용체 MPL, OSMR 또는 CSF2RA의 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우 사이토카인 수용체 CD40, TNFRSF4, CD27, FCGR2A 또는 TNFRSF18의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3A 및 3.1A 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다 (표 21). 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, MPL 또는 OSMR의 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3A와 3.1A 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 21).
라이브러리 3B 및 3.1B의 경우, 작제물 E007/E012-T017-S186-S051, E007/E012-T073-S186-S053, E008/E013-T028-S186-S047, E006/E011-T011-S186-S047, E007/E012-T082-S176-S214, E006/E011-T046-S186-S052, E008/E013-T029-S186-S052, E009/E014-T011-S186-S053, E008/E013-T032-S186-S039, E007/E012-T034-S186-S051, E007/E012-T041-S192-S213, E006/E011-T014-S069-S213, E006/E011-T022-S186-S053, E006/E011-T023-S115-S075, E006/E011-T029-S106-S213, E006/E011-T032-S155-S080, E006/E011-T041-S186-S216, E006/E011-T057-S135-S080, E006/E011-T072-S191-X002, E006/E011-T077-S186-S216, E006/E011-T080-S141-S080, E007/E012-T001-X001-S214, E007/E012-T007-S059-S211, E007/E012-T016-S186-S052, E007/E012-T031-S186-S053, E007/E012-T044-S102-S052, E007/E012-T044-S142-X002, E007/E012-T055-S069-S053, E007/E012-T063-S176-S216, E007/E012-T065-S157-S075, E008/E013-T008-S085-X002, E008/E013-T011-S085-S048, E008/E013-T021-S109-X002, E008/E013-T021-S168-S211, E008/E013-T032-S064-S214, E008/E013-T037-S170-S215, E008/E013-T038-S176-S048, E008/E013-T039-S137-S216, E008/E013-T041-S141-S053, E008/E013-T045-S177-S048, E008/E013-T048-S109-S074, E008/E013-T073-S199-S075, E009/E014-T001-S157-S074, E009/E014-T005-S196-S049, E009/E014-T011-S130-X002, E009/E014-T013-S155-X002, E009/E014-T017-S186-S076, E009/E014-T021-S142-S080, E009/E014-T023-S082-S076, E009/E014-T038-S196-S037, E009/E014-T055-S186-S052, E009/E014-T060-S175-S053, E009/E014-T070-S085-S212, E008/E013-T026-S054-S213, E009/E014-T007-S120-S053, E007/E012-T045-S186-S211, E008/E013-T073-S186-X002, E008/E013-T074-S186-X002, E007/E012-T055-S186-S053, E008/E013-T036-S186-S053, E007/E012-T017-S058-S053, E008/E013-T030-S189-S080, E006/E011-T029-S081-S047, E009/E014-T044-S194-S050, E006/E011-T028-S121-X002, E008/E013-T028-S186-S053, E009/E014-T078-S142-S213, E009/E014-T041-S186-S051, E008/E013-T006-S186-S050, E006/E011-T028-S186-S075, E006/E011-T040-S120-S038, E007/E012-T044-S115-S211, E009/E014-T039-S176-S075, E007/E012-T028-S186-S050, E008/E013-T031-S202-S050, E007/E012-T072-S192-S053, E006/E011-T065-X001-S051, E007/E012-T030-S062-X002, E007/E012-T073-S186-X002, E009/E014-T056-S186-S053, E008/E013-T046-S137-X002, E006/E011-T016-S136-S076, E007/E012-T032-S142-S037, E007/E012-T065-S120-S215, E009/E014-T077-S186-S047, E009/E014-T001-S126-S051, E006/E011-T030-S121-S039, E008/E013-T006-S176-S213, E009/E014-T032-S130-S215, E008/E013-T041-S186-S039, E009/E014-T021-S186-S047, E008/E013-T026-S137-S214, E007/E012-T029-S116-S075, E008/E013-T026-S106-S049, 및 E007/E012-T032-S168-S075는 두 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 가졌고, 여기서 슬래시로 분리된 P1 부분은 표 6, 12 및 14에 제시된 바와 같이, 라이브러리 3B 및 3.1B에 대해 상이한 태그를 포함했다. 반복 스크린을 위해, 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막 날 정규화된 계수 데이터 + 1 )/(7일째에 정규화된 계수 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
라이브러리 3B 및 라이브러리 3.1B 모두의 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물 내의 제1 및 제2 세포내 도메인에 관한 추가 정보는 제1 및 제2 세포내 도메인이 유도되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지의 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지의 여부를 포함하여 표 22에 제공된다. 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우 MPL, LEPR, MYD88, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R, 또는 IL15RA의 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우 CD40, CD79B, CD27, TNFRSF14, CD79A, CD3G, TNFRSF9, FCGR2C, ICOS, TNFRSF18, TNFRSF4, CD28, FCER1G, FCGR2A, CD3D, TNFRSF8, 또는 CD3E로부터의 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3B와 3.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 22). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 MPL, LEPR, EPOR, IL5RA, IL2RG, IL18RAP, IL11RA, IL13RA1, CSF2RA, IL1RL1, IL13RA2, IL20RB, IFNGR2, IL3RA, IL27RA, CSF3R, IL31RA, IL12RB1, OSMR, IL10RB, IFNAR2, CRLF2, IL7R, IFNAR1, PRLR, IL9R, IL6R, 또는 IL15RA의 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 CD40, CD27, TNFRSF14, TNFRSF9, FCGR2C, TNFRSF18, TNFRSF4, FCER1G, FCGR2A, 또는 TNFRSF8의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 3B와 3.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 22). CD79B, CD79A, CD3G, FCGR2C, FCER1G, FCGR2A, CD3D 또는 CD3E의 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물은 제2 세포내 도메인(P4)에 존재할 경우, 라이브러리 3B 및 3.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 22).
FAC 분석은, 49일째의 라이브러리 3A 확장된 세포가 주로 CD3+, CD8+, CD56+ 및 FLAG-Tag+였음을 나타냈다. 바로 아래 표는 표시된 마커와 마커 조합에 대해 양성으로 염색된 림프구의 백분율을 보여준다. 이 데이터는 이 라이브러리 스크린에서 동정된 드라이버가 주로 CD3+ T 세포 성분을 확장하고 있음을 보여준다.
Figure pct00014
CAR이 아니라 키메라 폴리펩타이드를 코딩하는 작제물 및 새로운 비형질도입된 PBMC가 보충되지 않은 형질도입된 PBMC를 포함하는 라이브러리 4B의 경우, IL-2의 부재하에 배양될 때 7일째 및 표에 표시된 마지막 날 사이에 최대 PBMC 증식을 촉진시키는 154개의 상위 후보가 동정되었다(표 16 참조).
라이브러리 4B의 경우, CD40, CD8B, CSF2RA, IL18R1, 및 IL3RA 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 막관통 도메인 위치(P2)에서 발견될 때, 특정 세포 유형에서 구성적 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인(P2)은 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 막관통 도메인과 결합된 방식으로 고려될 때 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 4B의 경우에 적어도 2이도록 했다. 세포 증식을 촉진시키는 작제물 중 라이브러리 4B에 존재하는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 16에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 4.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 17에 제공된다.
라이브러리 4B의 경우, CRLF2, CSF2RA, IFNGR2, IL4R, MPL, 및 OSMR로부터의 제1 세포내(P3) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제1 세포내 도메인(P3)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체가 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 4B의 경우에 0 이상이도록 했다. 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 4B 중 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 16에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 4.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 17에 제공된다.
라이브러리 4의 경우, CD27, CD40 및 CD79B로부터의 제2 세포내(P4) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제2 세포내 도메인(P4)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 이러한 도메인에 대한 더 많은 계수가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 4B에 대해 7일째보다 마지막 날 존재하도록 했다. 세포 증식을 촉진시키는 라이브러리 4B 중 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 16에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 4.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 17에 제공된다.
라이브러리 4B 및 4.1B의 경우, 작제물 E007/E012-T078-S154-S047, E008/E013-T062-S186-X002, E008/E013-T055-S186-S050, E009/E014-T057-S186-S050, E007/E012-T077-S054-S053, E007/E012-T034-S135-S211, E009/E014-T071-X001-S216, E009/E014-T011-S141-S037, E008/E013-T041-S186-S037, E006/E011-T038-S106-S039, E006/E011-T011-S121-X002, E007/E012-T007-S085-S215, E006/E011-T041-S186-S050, E007/E012-T008-S064-S051, E006/E011-T041-S186-S047, E008/E013-T045-S186-S051, E008/E013-T003-S104-S216, E006/E011-T019-S186-S053, E008/E013-T071-S064-S080, E006/E011-T021-S054-X002, E006/E011-T003-S135-X002, E009/E014-T020-S199-S213, E008/E013-T027-S121-S211, E009/E014-T032-S195-X002, E009/E014-T050-S171-X002, E008/E013-T069-S083-X002, E008/E013-T026-S116-S038, E009/E014-T072-S195-X002, E007/E012-T047-S058-S211, E008/E013-T046-S142-S080, E006/E011-T065-S186-S076, E006/E011-T062-S069-X002, E007/E012-T047-S098-X002, E009/E014-T069-S099-S048, E008/E013-T039-S141-S050, E006/E011-T052-S130-S052, E008/E013-T041-S186-X002, E007/E012-T019-S120-X002, E008/E013-T045-S186-S053, E006/E011-T003-S170-S039, E007/E012-T047-S058-S051, E007/E012-T069-S109-X002, E009/E014-T019-S130-S075, 및 E006/E011-T047-S054-S053은 두 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 가졌고, 여기서 슬래시로 분리된 P1 부분은 표 6, 16 및 17에 제시된 바와 같이, 라이브러리 4B 및 4.1B에 대해 상이한 태그를 포함했다. 반복 스크린을 위해, 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물은 2 이상의 log2((마지막 날 정규화된 계수 데이터 + 1 )/(7일째에 정규화된 계수 데이터 + 1)) 값을 갖는 것들이었다.
라이브러리 4B 및 라이브러리 4.1B 모두의 스크린에서 특히 주목할만한 농축물을 갖는 작제물 내의 제1 및 제2 세포내 도메인에 관한 추가 정보는 제1 및 제2 세포내 도메인이 유도되는 유전자(들), 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 사이토카인 수용체인지의 여부, 및 제1 및/또는 제2 세포내 도메인이 적어도 하나의 ITAM 모티프를 갖는지의 여부를 포함하여 표 23에 제공된다. 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우 IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, MYD88, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB, 또는 IL3RA의 세포내 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우 CD27, CD40, CD79B, TNFRSF4, TNFRSF18, CD3D, CD3G, CD27, ICOS, TNFRSF9, CD3E, FCGR2A, CD28, CD79A, 또는 FCGR2C로부터의 세포내 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 4B와 4.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 23). 제1 세포내 도메인(P3)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 IL18R1, MPL, CRLF2, IL11RA, IL13RA1, IL2RG, IL7R, IFNGR2, CSF3R, IL2RA, OSMR, IL31RA, IFNAR2, IL6R, CSF2RA, IL13RA2, EPOR, IL1R1, IL10RB, 또는 IL3RA의 도메인을 갖는 작제물, 및 제2 세포내 도메인(P4)에 존재하는 경우, 사이토카인 수용체 CD27, CD40, TNFRSF4, TNFRSF18, TNFRSF9, FCGR2A, 또는 FCGR2C의 도메인을 갖는 작제물은 라이브러리 4B와 4.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 23). CD79B, CD3D, CD3G, CD3E, FCGR2A, CD79A, 또는 FCGR2C의 ITAM 모티프를 함유하는 도메인을 갖는 작제물은 제2 세포내 도메인(P4)에 존재할 경우, 라이브러리 4B 및 4.1B 모두에서 특히 주목할만한 농축물을 보였다(표 23).
라이브러리 4B의 경우, P2 부분으로서 CD8B(CD8b 분자)를 갖는 572개의 작제물 중 21개가 양성이었고, 이는 라이브러리 4B에 대해 2 이상의 농축물을 갖는 작제물로서 정의되었다. P2 부분으로서 CD40(CD40 분자)를 갖는 897개의 작제물 중 50개가 양성이었다. P2 부분으로서 CSF2RA(콜로니 자극 인자 2 수용체 알파 서브유닛)를 갖는 551개의 작제물 중 25개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL3RA(인터류킨 3 수용체 서브유닛 알파)를 갖는 732개의 작제물 중 47개가 양성이었다. P2 부분으로서 IL18R1(인터류킨 18 수용체 1)을 갖는 738개의 작제물 중 44개가 양성이었다. P3 부분으로서 MPL(MPL 원종양유전자, 트롬보포이에틴 수용체)을 갖는 1,683개의 작제물 중 305개가 양성이었다.
21일째 라이브러리 3A에 대한 초기 중간 분석에서, 상위 100개 히트 중 66개 및 상위 1000개 히트 중 538개가 디코딩되었다. 추가 디코딩은 라이브러리 3A의 상위 100개 히트 중 99개 및 상위 1000개 히트 중 992개의 심도 디코딩 및 동일성 을 제공하고, 데이터를 35일 동안 수집하고 분석을 21일째에 업데이트했다. 21일째 라이브러리 3B에 대한 초기 분석에서, 상위 100개 히트 중 77개 및 상위 1000개 히트 중 464개가 초기 중간 분석에서 디코딩되었다. 추가 디코딩은 라이브러리 3B의 상위 100개 히트 중 100개 및 상위 1000개 히트 중 708개의 심도 디코딩 및 동일성을 제공했다. 라이브러리 3A에 대한 35일째 데이터와 라이브러리 3B에 대한 21일째 데이터를 갖는 라이브러리 3A 및 3B에대한 상위 작제물은 각각 표 12 및 표 13에 제시된다.
키메라 폴리펩타이드 및 CAR을 코딩하는 작제물 및 새롭고 형질도입되지 않은 PBMC이 보충되거나(라이브러리 3A) 또는 보충되지 않은(라이브러리 3B) 형질도입된 PBMC를 포함하는 라이브러리 3A 및 3B에서, 심도 디코딩 후에, IL-2의 부재하에(즉, IL-2는 초기 형질도입 후 배양 동안 배양 배지에 첨가되지 않았다) 배양될 때 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 최대 규모의 PBMC 증식을 촉진시키는 124개의 상위 후보가 35일째 라이브러리 3A에 대해 동정되었고, 131개의 상위 후보가 21일째에 라이브러리 3B에 대해 동정되었다(참조: 각각 표 12 및 13). 표 12(35일째 라이브러리 3A) 및 13(21일째 라이브러리 3B)의 상위 후보 목록은 21일째(라이브러리 3B) 또는 21일 또는 35일째(라이브러리 3A)에 상위 100개의 가장 보편적인 후보를 심도 디코딩 후에 21일 및 7일 사이(라이브러리 3B) 또는 21일 및 7일 또는 35일 및 7일 사이(라이브러리 3A)의 상위 100개의 가장 풍부한 후보 작제물을 결합함으로써 생성되었다.
CLE의 특정 모듈에서 특정 폴리펩타이드를 심도 디코딩에 의한 결과를 사용하는 상위 히트 표로부터, 라이브러리 3A 및 3B 중 적어도 하나에 걸쳐 및 21일 및 35일(라이브러리 3A) 또는 21일(라이브러리 3B)의 시점 중 적어도 하나 동안 상위 히트 사이에 있었다. 예를 들어, P2 위치에 CD40(구체적으로, 예를 들어, 코드 T011을 갖는 막관통 도메인), ICOS(구체적으로, 예를 들어, 코드 T028을 갖는 막관통 도메인), FCGR2C(구체적으로, 예를 들어, 코드 T024를 갖는 막관통 도메인), PRLR(구체적으로, 예를 들어, 코드 T077을 갖는 막관통 도메인), IL3RA(구체적으로, 예를 들어, 코드 T041을 갖는 막관통 도메인), IL6ST(구체적으로, 예를 들어, 코드 T045를 갖는 막관통 도메인), P2 위치에 IL18R1(구체적으로, 예를 들어, 코드 T062를 갖는 막관통 도메인);
P3 위치에 MPL(구체적으로, 예를 들어, 코드 S186을 갖는 세포내 도메인), IL18R1(구체적으로, 예를 들어, 코드 S154를 갖는 세포내 도메인), IL13RA2(구체적으로, 예를 들어, 코드 S142를 갖는 세포내 도메인), IL10RB(구체적으로, 예를 들어, 코드 S176을 갖는 세포내 도메인), IFNAR2(구체적으로, 예를 들어, 코드 S083을 갖는 세포내 도메인), IL23R(구체적으로 예를 들어, 코드 S165를 갖는 세포내 도메인), MyD88(구체적으로는, 예를 들어, 코드 S194를 갖는 세포내 도메인), 및 CSF2RA(구체적으로, 예를 들어, 코드 S058을 갖는 세포내 도메인); P4 위치에 CD40(구체적으로, 예를 들어, 코드 S050 또는 S051을 갖는 세포내 도메인), CD79B(구체적으로, 예를 들어, 코드 S053을 갖는 세포내 도메인), TNFRSF4(구체적으로, 예를 들어, 코드 S211을 갖는 세포내 도메인), TNFRSF9(구체적으로, 예를 들어, 코드 S213을 갖는 세포내 도메인), TNFRSF14(구체적으로, 예를 들어, 코드 S214를 갖는 세포내 도메인), FCGRA2 (구체적으로 예를 들어 코드 S076을 갖는 세포내 도메인), CD3G(구체적으로, 예를 들어, 코드 S039를 갖는 세포내 도메인) 또는 CD27(구체적으로, 예를 들어, 코드 S047을 갖는 세포내 도메인)을 함유하는 예시적인 작제물은 상위 5개의 가장 빈번한 키메라 폴리펩타이드 중 하나였다(표 12 및 표 13 참조). 놀랍게도, MPL은 라이브러리 3A와 3B 모두에 대한 큰 마진에 의해 P3에서 가장 빈번한 키메라 폴리펩타이드였다. P3으로부터 상위 히트 부분은 라이브러리 3A 또는 3B의 이러한 작제물에 대한 P4 위치에 포함되지 않았음을 주시한다.
하기 추가의 관찰이 주목할 만하다: P2_CD40, P2_ICOS, P3_MPL, P4_CD40 및 P4_CD79BP4_CD27은 표 12 및 표 13 각각의 상위 히트에서 가장 빈번한 부분으로 나타났다. P4_CD27은 표 12 및 표 13에서 가장 빈번한 부분으로 나타났다. CSF2RB는 P2에서 상위 123개의 가장 풍부하고 대부분의 rep에서 4번 나타났지만, 돌연변이체 V449E 돌연변이체는 이러한 상위 히트에서 나타나지 않았다(표 12). 따라서, 본원의 일부 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드는 CSF2RB의 막관통 도메인 돌연변이체 V449E 이외의 표 12 및 표 13에 나타낸 임의의 작제물에서 동정된 막관통 도메인을 포함한다. 8개의 MyD88 변이체가 라이브러리 3A 상위 123에서 적어도 한번 P3 위치에서 발생했다(표 12). 라이브러리에서 시험된 CD40의 두개의 변이체는 라이브러리 3A(표 12)의 상위 123 목록에 있는 P4 위치에서 적어도 한 번 발생했다. P3에서의 MPL과 P4에서의 CD40의 조합은 라이브러리 3A(표 12)의 상위 123개 작제물 목록 중 26개 작제물에서 나타났다.
유전자 분석에 의한 유전자의 경우, 라이브러리 3A의 경우, CD4, CD8B, CD40, CRLF2, CSF2RA, CSF3R, EPOR, FCGR2C, GHR, ICOS, IFNAR1, IFNGR1, IFNGR2, IL1R1, IL1RAP, IL2RG, IL3RA, IL5RA, IL6ST, IL7RA, IL10RB, IL11RA, IL13RA2, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL18R1, IL18RAP, IL20RA, IL22RA1, IL31RA, LEPR, PRLR, 및 TNFRSF8 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인(P2)은 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 막관통 도메인과 결합된 방식으로 고려될 때 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다(표 12). 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B(표 13)의 경우, CD40, ICOS, 및 IL18R1, 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체로부터의 막관통 도메인은 이러한 방식으로 분석될 경우 최선의 수행자였다. 라이브러리 3A 및 3B에 대한 최대 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 막관통 도메인 또는 그것의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 12 및 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 막관통 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 15에 제공된다.
라이브러리 3A의 경우, CSF2RA, IFNAR1, IL1RAP, IL4R, IL6ST, IL11RA, IL12RB2, IL17RA, IL17RD, IL17RE, IL18R1, IL21R, IL23R, MPL, 및 MyD88로부터의 제1 세포내(P3) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제1 세포내 도메인(P3)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제1 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 세포 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B의 경우, CSF2RB, IL4R, 및 MPL, 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체로부터의 제1 세포내 도메인은 이러한 방식으로 분석될 경우 최선의 수행자였다. 라이브러리 3A 및 3B에 대한 최대 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그것의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 12 및 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 15에 제공된다.
라이브러리 3A의 경우, CD3D, CD3G, CD27, CD40, CD79A, CD79B, FCER1G, FCGRA2, ICOS, TNFRSF4, 및 TNFRSF8로부터의 제2 세포내(P3) 도메인 또는 그러한 돌연변이체가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 본원의 후보 키메라 폴리펩타이드 요소의 제2 세포내 도메인(P4)에서 발견되는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지된 이의 돌연변이체는 데이터가 모든 작제물이 그 유전자로부터 유래된 제2 세포내 도메인과 결합된 방식으로 고려되는 경우, 7일째 및 21일째 사이 또는 7일째와 표에 표시된 마지막 날 사이에 PBMC의 증식을 촉진시켰다. 이 결론은 혼합된 배양 PBMC 세포 집단에서 작제물의 서열 계수의 강화에 기초하여, 표에 표시된 마지막 날 정규화된 계수 + 1 및 7일째 정규화된 계수 + 1의 비의 베이스 2의 대수로 계산된 강화가 유전자의 모든 작제물에 대한 결과가 결합될 때 라이브러리 3A의 경우에 적어도 2이도록 했다. 라이브러리 3B의 경우, CD40으로부터의 제2 세포내 도메인, 또는 그러한 돌연변이가 표에 제공된 작제물에 존재하는 경우, 특정 세포 유형에서 신호전달 활성을 촉진시키는 것으로 공지되어 있는 이들의 돌연변이체는 2배 log2 강화를 달성하지는 않지만, 이러한 방식으로 분석될 경우 최선의 수행자였다. 라이브러리 3A 및 3B에 대한 최대 규모의 세포 증식을 촉진시키는 작제물에 존재하는 제2 세포내 도메인 또는 그것의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 12 및 13에 제공된다. 세포 증식을 촉진하는 라이브러리 3.1A 및 3.1B로 지칭되는 반복된 스크린에서 작제물 내에 존재하는 제1 세포내 도메인 또는 그의 부분 및/또는 돌연변이체의 예는 표 14 및 15에 제공된다.
실시예 19. 아사이클로비르의 부재하 및 존재하에 시차 주사 열량측정(DSC)에 의한 F1A-795의 열적 변성.
이 실시예에서, 리보스위치(서열번호: 87)의 압타머 도메인에 대한 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물의 결합은 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 아사이클로비르의 부재하 대 존재하의 압타머 도메인의 열적 변성을 비교함으로써 입증되었다.
압타머 제조
동정된 후보 서열의 T7 프라이머(서열번호: 246)뿐만 아니라 주형(역 보체)은 단일 가닥 DNA로서 IDT(Coralville, IA)에 의해 합성하였다. 후보는 성분을 1μM 주형, 2μM T7 프라이머, 200μM dNTP, 1X 티타늄 Taq DNA 폴리머라제 및 1X 티타늄 Taq 완충제(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)에 결합시킨 다음, 95℃에서 3분 동안, 55℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안 가열하여(사이클링 없음) 프라이머 확장시켰다. 표준 키트 지침(1X 반응 완충제, 7.5mM의 각 NTP, 10mM의 DTT, 1X RivboGuard RNase 억제제, 1X Ampliscribe T7 효소 용액)에 따라서 Ampliscribe T7 고수율 전사 키트(Lucigen, Middleton, WI)를 사용하는 12개의 20μl 반응에 대해 42pmol의 이중 가닥 DNA를 사용했다. 반응물을 밤새 42℃에서 배양한 다음, 1μl의 DNase I를 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양하여 정지시켰다. 전사 생성물을 8M 우레아로 10% 변성 PAGE에서 정제하였다. 적어도 10nmol의 각 후보를 동결건조시키고, 결합 평가 당일에 1X 결합 완충제(50mM HEPES, 100mM KCl, 0.5mM MgCl2, pH 7.3)에 재현탁시켰다.
간단히, DSC를 사용하여 아사이클로비르의 부재하에 F1A-795(7.2μM) 또는 아사이클로비르(29.4μM)의 존재하에 F1A-795(2.77μM)를 분석했다. 모든 분석은 1X 결합 완충제에서 수행되었으며, 사용된 모든 물은 DEPC로 처리되었다. 모든 분석물은 먼저 DEPC 처리된 물에 재현탁시킨 다음, 1X 결합 완충제에서 최종 나열된농도로 희석시켰다. DSC(GE Healthcare MicroCal VP-DSC)를 로딩하기 전에, 샘플을 25℃에서 10분 동안 탈기시켰다. 아사이클로비르 없는 샘플은 1℃/분의 속도로 10℃에서 115℃로 스캐닝했다. 아사이클로비르를 갖는 샘플은 1℃/분의 속도로 10℃에서 105℃로 스캐닝했다.
결과
DSC에 의해 측정된 아사이클로비르의 부재하에 F1A-795의 열 변성은 약 60℃를 중심으로 전이한다(도 28). 이 전이는 압타머 도메인이 아사이클로비르의 부재하에 구조화된다는 것을 시사한다. 아사이클로비르의 존재하에, F1A-795는 약 75 ℃를 중심으로 전이한다(도 28). 이 안정화 효과는 뉴클레오사이드 유사체 항바이러스 약물 아사이클로비르가 압타머 도메인 F1A-795에 결합함을 나타낸다. 따라서, 이 실험은 F1A-795가 아사이클로비르에 의해 결합된다는 것을 확인했다.
실시예 20. VSV-G 슈도타입화 요소 및 막-결합 활성화 요소를 함유하고, 임의로 Vpu 단백질을 함유하는 레트로바이러스 입자에 의한 새롭게 단리되고 자극되지 않은 인간 T 세포의 형질도입 효율.
재조합 렌티바이러스 입자는 gag/pol 및 rev를 코딩하는 별개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G를 코딩하는 슈도타입화 플라스미드에 의한 293T 세포(Lenti-XTM 293T, Clontech)의 일시적인 형질감염에 의해 생성되었다. GFP, 항-CD19 키메라 항원 수용체, 및 본원에서 F1-0-03(도 20)으로 지칭되는 eTAG를 코딩하는 3세대 렌티바이러스 발현 벡터를 패키징 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 styleTM 293 발현 배지(ThermoFisher Scientific)에서 연속 성장시켜 현탁 배양에 적응시켰다. 현탁액 중의 세포를 125mL 삼각 플라스크에 1 x 106 세포/mL(30mL)로 씨딩하고, 약산에 용해된 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences)을 사용하여 즉시 형질감염시켰다.
플라스미드 DNA를 30mL의 세포에 대해 1.5ml의 Gibco™ Opti-MEM™ 배지로 희석시켰다. VSV-G로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 총 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음의 몰 비를 갖는 4개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev 함유 플라스미드, 1x VSV-G-함유 플라스미드, 및 1x gag/pol-함유 플라스미드. VSV-G로 슈도타입화되고 그들의 표면에서 항 CD3-scFvFc-GPI를 표시하는 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 총 DNA(배양 용적 1μg/mL)는 다음의 몰 비를 갖는 5개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev-함유 플라스미드, 1x VSV-G-함유 플라스미드, 1x 항-CD3-scFvFc-GPI-함유 플라스미드, 및 1x gag/pol-함유 플라스미드. VSV-G로 슈도타입화되고 항-CD3-scFvFc-GPI를 나타내고, 보조 단백질 Vpu를 함유하는 렌티바이러스 입자를 수득하기 위해, 사용된 총 DNA(배양 용적 1㎍/mL)는 다음의 몰 비를 갖는 6개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드(F1-0-03), 1x Rev-함유 플라스미드, 1x VSV-G-함유 플라스미드, 1x 항-CD3-scFvFc-GPI 함유 플라스미드, 1x Vpu-CH-함유 플라스미드 및 1x gag/pol 함유 플라스미드. 별도로, PEI를 1.5 ㎖ Gibco™ Opti-MEM™에서 2μg/mL(배양 용적, DNA에 대해 2:1의 비율)로 희석시켰다. 5분 동안 실온 배양 후, 두 용액을 함께 완전히 혼합하고, 실온에서 20분 동안 더 배양하였다. 최종 용적(3ml)을 세포에 첨가했다. 그 후, 세포를 37℃에서 72시간 동안 125rpm으로 회전시키고 8% CO2로 배양했다. 항-CD3-scFvFc-GPI 함유 플라스미드는 UCHT1로부터 유래된 scFv 및 DAF(CD55)로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열을 포함한다. UCHT1scFvFc-GPI 벡터는 UCHT1 scFv (NCBI GI 번호 CAH69219.1의 아미노산 21-264)에 융합된, 인간 IgG1 Fc (NCBI GI 번호 AEV43323.1의 아미노산 1-231)에 융합된, 인간 DAF GPI 앵커 부착 서열(NCBI GI 번호 NP_000565의 아미노산 345-381)에 융합된 인간 Ig 카파 신호 펩티드(NCBI GI 번호 CAA45494.1의 아미노산 1-22)를 포함하는 펩타이드(서열번호: 278)를 코딩한다. Vpu-CH 함유 플라스미드는 HIV-1 M CH167-CC 단리물(아미노산 1-84, GenBank: AGF30946.1)의 Vpu 서열을 포함하는 펩타이드(MFDFIARVDYRVGVVALVVALIIAIIVWSIVYIEYRKLLKQRKIDWLIKRIRERAEDSGNESDGEIEELSTMVDMEHLRLLDDL*)를 코딩한다.
72시간 후, 상청액을 수거하고, 1,200g에서 10분 동안 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 렌티바이러스 입자는 4℃에서 3300g에서 밤새 원심분리하여 침전시켰다. 상청액을 버리고, 렌티바이러스 입자 펠렛을 초기 부피의 X-Vivo ™ 15 배지(Lonza)의 1:100에 재현탁시켰다. 렌티바이러스 입자를 유동 세포 계측법에 의한 형질전환 72시간 후, 293T 및 주르카트 세포에서 연속 희석 및 GFP 발현의 분석에 의해 적정하였다.
말초 혈액 단핵구(PBMC)는 버피 코트(buffy coat)로부터 단리되고, 캘리포니아 샌디에고 혈액 은행으로부터 수집되어 분포되었다. 제조업자의 지침에 따라 Ficoll-Paque PLUS®(GE Healthcare Life Sciences)에서 PBMC의 SepMate™ 50(Stemcell™) 기반 구배 밀도 분리가 수행되었다. 각 SepMate™ 튜브당 X-Vivo™ 15 배지로 희석된 30mL의 버피-코트를 중첩시켰다. 실온, 1,200g에서 20분 동안 원심분리한 후, PBMC 층을 수집하고, 풀링하고 X-Vivo™ 15 배지 45mL로 3회 세척하고 실온에서 10분 동안 400g에서 원심분리했다. 이어서, 펠릿을 10mL의 RBC 용해 완충제(Alfa Aesar)에서 실온에서 10분 동안 배양하고, 45mL의 X-Vivo™ 15 배지로 추가로 2회 세척하고 실온에서 10분 동안 400g에서 원심분리했다. 단핵구를 제거하기 위한 추가 단계는 취하지 않았다. 단리 후, 새롭고 자극되지 않은 PBMC를 X-Vivo™ 15 배지에 1 x 106/mL의 최종 농도로 재현탁시키고, 이전에 개시된 렌티바이러스 입자로 이중으로 형질도입했다. 형질도입은 X-Vivo™ 15 배지에서 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 수행되었다. 형질도입은 [VSV-g]pp의 경우 MOI 10에서, [VSV-G + UCHT1]pp 및 [VSV-G + UCHT1 + Vpu-CH]pp의 경우 MOI 1에서 12웰 플레이트 포맷으로, 1mL/웰, 이중으로 수행했다. 형질도입 3일 후에, 샘플을 수집하고, CD3 + 집단에서 절대 세포 계수 및 GFP 발현 수준에 대해 FACS로 분석하였다.
또한, 도 34a 및 도 34b는 지시된 렌티바이러스 입자에 의한 새롭게 단리되고 자극되지 않은 PBMC의 형질도입 3일 후에 각각 전체 CD3 + 집단(도 3a)에서의 CD3 + GFP + 세포 백분율(%)의 히스토그램 및 살아 있는 CD3 + 집단(도 34b)의 웰당 절대 세포 계수의 히스토그램을 도시한다. 각각의 막대는 이중의 평균 +/- SD를 나타낸다. 도 34a는 VSV-G 슈도타입화된 렌티바이러스 입자에 항-CD3-scFvFc-GPI 부분(UCHT1)을 첨가하면 [VSV-G]pp 단독과 비교하여 새롭게 단리된 자극되지 않은 PBMC의 높은 형질도입 효율을 유도한다는 것을 보여준다. 도 34a는 또한 Vpu-CH의 첨가가 이중으로 슈도타입화된 벡터 [VSV-G + UCHT1]pp의 형질도입 효율을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여준다. 도 34b는 UCHT1 잔기가 VSV-G 단독과 비교하여 uL당 절대 세포 계수에 의한 세포 자극을 증가시킨다는 것을 보여준다. Vpu 및 UCHT1의 첨가는 VSV-G 단독과 비교하여 절대 세포 계수에 의한 세포 자극을 유사하게 향상시킨다.
실시예 21. 개별 림프증식성 요소의 특성화.
이 실시예에서, 실시예 17 및 실시예 18에 기재된 라이브러리 스크린에서 동정된 선택 키메라 림프증식성 요소(CLE)를 개별적으로 평가하였다. 라이브러리 2B의 스크린에서 동정된 CLE를 추가로 분석하기 위해, 활성화된 PBMC를 CLE만을 코딩하는 렌티바이러스 입자로 밤새 형질도입하고, 외인성 사이토카인의 부재하에 배양했다. 라이브러리 3A의 스크린에서 동정된 CLE를 추가로 분석하기 위해, 활성화된 PBMC를 5' 말단에 항-CD19 CAR과 측접된 CLE를 코딩하는 렌티바이러스 입자로 밤새 형질도입하고, 7일 마다 배양물에 첨가된 공여체-일치된 CD19+ B 세포의 존재하에, 그러나 외인성 사이토카인의 부재하에 배양했다. 세포를 PBMC 증식을 촉진시키는 CLE의 능력을 평가하기 위해 최대 35일 동안 배양했다. 이 실시예는 임의의 개별적인 추정성 림프증식성 요소를 특성화하고 몇 개의 매우 활성인 CLE의 동일성을 추가로 확인하는 방법을 추가로 제공한다.
재조합 렌티바이러스 입자는 Freestyle™ 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific) 무혈청 화학적으로 정의된 배지에서 현탁 배양에 적응시킨 293T 세포(Lenti-XTM 293T, Clontech)에서 생성되었다. 실시예 20에서 설명된 바와 같이, 게놈 플라스미드 및 gag/pol, rev를 코딩하는 3개의 별개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G를 코딩하는 슈도타입화 플라스미드를 갖는 PEI를 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 실시예 17 및 18에 기재된 라이브러리 스크린에서 동정된 선택된 CLE는 그들의 부분(P1-2, P3 및 P4 또는 P1, P2, P3 및 P4)으로부터 개별적으로 재생시키고, 그들이 처음 동정된 라이브러리의 것과 동일한 도입유전자 발현 카세트에 삽입시켰다. 선택된 CLE 각각의 모듈 부분은 도 35 및 36에 도시되고, 유전자 명칭 및 아미노산 서열은 표 6에 제시된다. 도 31 및 32는 각각 라이브러리 2 및 3을 위한 카세트를 도시한다. 라이브러리 스크린을 통해 동정된 작제물을 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질도입된 세포는 라이브러리 번호에 따르는 "DL"로 지칭된다. 예를 들어, 라이브러리 2의 작제물을 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질도입된 세포를 DL2로서 지칭된다. 따라서, 접두사 "DL2"및 "DL3"을 갖는 CLE는 각각 도 31 및 32에 도시된 카세트에서 작제되었다. 유사하게, "DC1-5"및 "DC1-6"은 도 30에 도시된 바와 같이 라이브러리 1에 사용된 도입유전자 발현 카세트에 삽입된 CLE를 포함한다. DCl-5의 키메라 림프증식성 요소는 아미노로부터 카복시 말단으로, 인간 IL-7(서열번호: 511), 가요성 링커(서열번호: 53) 및 신호 펩타이드 없는 전장 IL-7Rα인 인간 IL-7Rα(서열번호: 229)의 잔기 21-458을 코딩했다. DCl-6의 CLE는 아미노로부터 카복시 말단으로, IL-7(서열번호: 511), 가요성 링커(서열번호: 53), IL-7Rα(CD127)의 세포외 및 막관통 부분(서열번호: 513), 및 IL-2Rβ(CD122)의 세포내 도메인(서열번호: 514)을 코딩한다. 키메라 단백질 IL-7-IL-7Rα 및 IL-7-IL-7Rα-IL-2Rβ는 이전에 기재되어 있다(참조: Hunter et al, Molecular Immunology 56 (2013):1-11). IL-7 "DC2-5" 및 "DC2-6"은 도 31에 도시된 바와 같이 라이브러리 2에 사용된 도입유전자 발현 카세트에 삽입된 CLE를 포함한다. DC2-5 및 DC2-6의 CLE은 각각 DC1-5 및 DC1-6과 동일한 CLE였다. 형질도입되지 않은 PBMC(NT), CLE(F1-0-01)가 아니라 eTag를 코딩하는 벡터로 형질도입된 PMBC, CLE(F1-3-23)가 아니라 항-CD19 CAR 및 eTag를 코딩하는 벡터로 형질도입된 PMBC를 음성 대조군으로서 포함시켰다.
본 실시예에서 사용된 라이브러리 2B로부터의 작제물은 DL2-1 (M024-S190-S047), DL2-2 (M025-S050-S197), DL2-3 (M036-S170-S047), DL2-4 (M012-S045-S048), DL2-5 (M049-S194-S064), DL2-6 (M025-S190-S050) 및 DL2-7 (M025-S190-S051)이었다.
본 실시예에서 사용된 라이브러리 3A로부터의 작제물은 DL3A-1 (E013-T047-S158-S080), DL3A-2 (E011-T024-S194-S039), DL3A-3 (E014-T040-S135-S076), DL3A-4 (E013-T041-S186-S051), DL3A-5 (E013-T064-S058-S212), DL3A-6 (E013-T028-S186-S051), DL3A-7 (E014-T015-S186-S051), DL3A-8 (E011-T016-S186-S050), DL3A-9 (E011-T073-S186-S050), 및 DL3A-10 (E013-T011-S186-S211)이었다.
0일째에, 제조업자의 지침에 따라 Ficoll-Paque PREMIUMR(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하는 밀도 구배 원심분리에 이어, 적혈구의 용해에 의해 버피 코트(San Diego Blood Bank)로부터 PBMC를 농축시켰다. 1.5 x 106개의 생존 가능한 PBMC를 100IU/ml (IL-2) 및 50ng/ml 항-CD3 항체(317326, Biolegend)가 보충된 3ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에서 G-Rex 6 웰 플레이트(Wilson Wolf, 80240M)의 웰에 씨딩하여 바이러스 형질도입을 위한 PBMC를 활성화시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양한 후, 상기 기재된 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 입자를 MOI 5에서 활성화된 PBMC에 직접 첨가하고 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 다음날, 각 웰 중 배지 용적을 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM으로 30ml가 되도록 하고, 플레이트를 인큐베이터로 반환시켰다. IL-2, IL-7 또는 다른 외인성 사이토카인은 이러한 또는 후속적 세포 배양 단계에서 첨가되지 않았다. 각 웰로부터의 세포를 7일째에 수집하여 FACS 분석에 의해 FLAG-Tag+ 또는 E-Tag+ 세포의 퍼센트로 정의된 세포 수, 생존율 및 형질도입된 세포 %를 결정했다. 이어서, 세포를 원심분리하고, 신선한 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁하고, 각각의 샘플에 대해 0.5 x 106 세포를 30ml의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 중 G-Rex 6 웰 플레이트의 웰에 재씨딩했다. CD19 ASTR의 CD19 + B 세포 활성화를 제공하기 위해 0.5x106 CD19 + B 세포(0일째 FACS로 측정)를 함유하는 이전에 저온보존된 0일째 공여체 일치된 PBMC를 "DL3A-"의 배양물에 첨가했다. 이 과정을 세포가 35일째에 수거되기 전에 14일째, 20일째 및 28일째에 반복했다.
결과
CLE를 코딩하는 렌티바이러스 입자로 형질도입된 PBMC를 외인성 사이토카인의 부재하에 35일 동안 배양했다. 증식은 총 세포 수를 그 시점 동안 씨딩된 세포의 수로 나눔으로써 계산된 배수 확장으로 나타난다. 도 35에 도시된 각각의 개별적인 선택된 CLE로 형질도입된 PBMC는 형질도입되지 않은 PBMC 및 CLE가 아니라 eTag를 코딩하는 벡터로 형질도입된 PMBC를 포함하는 음성 대조군보다 더 많이 증식되었다(도 35). 또한, 다음의 CLE는 14일, 21일, 28일 및 35일쩨에 23보다 큰 배수 확장을 나타내지만, 음성 대조군의 배수 확장은 이들 시점에 대해 0에 가까웠다: DL2-7, DC2-6, DL2-6, DL2-2, DL2-1 및 DC2-5. 항-CD19 CAR 및 다양한 CLE(도 36에 도시됨)를 코딩하는 작제물로 형질도입되고 7일 마다 첨가된 새로운 공여체 일치된 PBMC의 존재하에, 그러나 외인성 사이토카인의 부재하에 배양된 PBMC는 형질도입되지 않은 PBMC 및 CLE가 아니라 항--CD19 CAR 및 eTag를 코딩하는 벡터로 형질도입된 PMBC를 포함하는 음성 대조군보다 더 증식되었다. 도 36에 도시된 모든 CLE는 35일째에 23보다 큰 배수 확장을 나타냈지만, 음성 대조군의 배수 확장은 35일째에 0에 가까웠다. DL3A-1 (E013-T047-S158-S080), DL3A-2 (E011-T024-S194-S039), DL3A-3 (E014-T040-S135-S076), 및 DL3A-5 (E013-T064-S058-S212)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질도입된 PBMC의 증식은 음성 대조군에 필적할만했고, 도 36에 도시되지 않는다.
실시예 22. 유전자 변형된 림프구의 생체내 확장을 포함하여 본원에 제공된 다양한 예시적인 방법의 개념 증명.
본 실시예는 생체외 T 세포를 포함하는 PBMC를 형질도입하고, 생체내 T 세포ㄹ를 포함하는 형질도입된 PBMC를 확장시키는 예시적인 방법을 제공한다. 이러한 방법은 특정의 예시적인 키메라 림프증식성 요소를 발현시키는 예시적인 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용하는 예시적인 4시간 형질도입 방법을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 예시적인 구현예에서 전형적으로 T 세포인 PBMC를 4시간 이내에 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입하는 추가의 예시적인 방법을 제공하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 패키징 세포를 무혈청 화학적으로 정의된 배지 중 현탁액에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 다양한 성분을 코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써 생성된다.
물질 및 방법
재조합 렌티바이러스 입자는 Freestyle™ 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific) 무혈청 화학적으로 한정된 배지에서 현탁 배양에 적응된 293T 세포(Lenti-XTM 293T, Clontech)에서 생산되었다. 실시예 20에서 설명된 바와 같이, 3개의 게놈 플라스미드(이하 상세화됨) 중 1개 및 gag/pol, rev를 코딩하는 3개의 별개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드 및 VSV-G를 코딩하는 슈도타입화 플라스미드로 PEI를 사용하여 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 또한, 막-결합된 활성화 요소를 또한 나타내는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해, CD3(UCHT1scFvFc-GPI)에 결합할 수 있는 막-결합된 폴리펩타이드를 코딩하는 제4 패키징 플라스미드 를 실시예 20에 기재된 바와 같이 공동 형질감염시켰다. 게놈 플라스미드는 3'LTR에서 결실을 함유하여 자기 불활성화를 유도하는 3세대 렌티바이러스 발현 벡터였고, 상기 플라스미드는 다음을 코딩했다:
(1) 항-ROR2 MRB-CAR:T2A:eTag (F1-1-27): 이 게놈 플라스미드는 항-CD19　CAR을 코딩하는 서열이 인간 ROR2, CD8 스토크 및 막관통 서열(서열번호: 75), CD137(서열번호: 1), 및 CD3z(서열번호: 13)를 인식하는 scFv를 갖는 MRB-ASTR로 대체된 것 외에는 도 20에 도시된 것과 동일하다. 이 작제물을 코딩하는 재조합 렌티바이러스 입자는 F1-1-27로 칭명된다;
(2) 플래그-항-ROR2 MRB-CAR:T2A:CLE (F1-1-228 및 F1-1-228U): 이 게놈 플라스미드는 항-CD19　CAR을 코딩하는 서열이 상기 (1)에 기재된 항-ROR2 MRB-CAR에 공유결합된 플래그-태그로 대체되고, GMCSFR ss:eTag가 CLE로 대체된 것 이외에는 도 20에 도시된 것과 동일하다. CLE는 세포외 이량체화 모듈(P1), 막관통 모듈(P2), 및 2개의 세포내 모듈(P3 및 P4)을 포함하는 유형 I 막관통 단백질이었다. 위치 P1-P2-P3-P4의 유전자는 MycTag 2A Jun-IL13RA-MPL-CD40이었다. 이러한 모듈의 코드는 E013-T041-S186-S051이다(참조: 표 6). 이 CLE는 라이브러리 3A, 3B, 및 4B에서 먼저 동정되었고, 라이브러리 3A에서 7일 및 35일 사이에 6th 가장 풍부한 CLE였다. 이 작제물을 코딩하는 재조합 렌티바이러스 입자는 F1-1-228라 칭명되고, 이 작제물을 코딩하고 UCHT1scFvFc-GPI를 나타내는 재조합 렌티바이러스는 F1-1-228U라 칭명되고; 또는
(3) 플래그-항-CD19 CAR:T2A:CLE(F1-3-219 및 F1-3-219U): 이 게놈 플라스미드는 플래그-태그가 CD8ss와 CAR 사이에 삽입되고 GMCSFRss:eTag를 코딩하는 서열이 CLE로 대체된 것 이외에는 도 20에 도시된 항-인간 CD19 CAR과 동일하다. CLE는 가요성 링커를 통해 동족 인터류킨 수용체의 세포외 및 막관통 도메인에 공유결합되고 유사하지 않은 사이토카인 수용체의 세포내 도메인에 공유결합된 인터류킨 폴리펩타이드를 포함하는 유형 I 막관통 단백질이었다. 특히, 아미노로부터 카복시 말단으로, 플라스미드는 IL-7(서열번호: 511), 가요성 링커(서열번호: 53), IL-7Rα(CD127)의 세포외 및 막관통 부분(서열번호: 513), 및 IL-2Rβ(CD122)의 세포내 도메인(서열번호: 514)을 코딩했다. 이 작제물을 코딩하는 재조합 렌티바이러스 입자는 F1-3-219라 칭명되고, 이 작제물을 코딩하고 UCHT1scFvFc-GPI를 나타내는 재조합 렌티바이러스 입자는 F1-3-219U로 칭명된다.
PBMC 단리, 생체외 자극 후 PBMC의 밤새 형질도입, 이어서 조작된 림프구의 15일 생체외 확장
0일째에, PBMC는 제조업자의 지침에 따라서 Sepax 2 S-100 장치(Biosafe; 14000)에서 CS-900.2 키트(BioSafe; 1008)를 사용하여 Ficoll-Pacque™(General Electric)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 고지에 의한 동의하에 건강한 지원자의 ACD 말초 혈액으로부터 단리시켰다. 3.0 x 107개의 생존 가능한 PBMC를 1L G-Rex(Wilson-Wolf)에 씨딩하고, 용적으로 100IU/ml IL-2(Novoprotein, GMP-CD66), 10ng/ml IL-7(Novoprotein, GMP-CD47) 및 50ng/ml 항-CD3 항체(OKT3, Novoprotein)가 보충된 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 사용하여 60ml가 되도록 하여 바이러스 형질도입을 위한 T 세포와 NK 세포를 포함한 PBMC를 활성화시켰다. 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양한 후, 항-ROR2 MRB-CAR, F1-1-27을 코딩하는 렌티바이러스 입자를 MOI 5(440ul)로 활성화된 PBMC에 직접 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양 후, 세포는 G-Rex 배지의 총 용적을 NAC(Sigma)가 보충된 완전 OpTmizerTM CTSTM T 세포 확장 SFM으로 100ml가 되도록 공급하여 100IU/ml 재조합 인간 IL-2 및 10ng/ml 재조합 인간 IL-7와 함께 최종 농도를 10mM로 증가시켰다. G-Rex 장치를 표준 가습화 조직 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 마다 100IU/ml 재조합 인간 IL-2 및 10ng/ml 재조합 인간 IL-7 용액을 첨가하여 배양했다. 세포를 수거하기 전에 15일째까지 확장시켰다. 이러한 형질도입된 세포는 동결 배지(70% RPMI 1640, 20% 열 불활성화 FBS, 10% DMSO)로 세척하고, 이후 사용을 위해 5.0 x 107 세포/ml로 1ml 분량으로 저온보존하였다. 아래의 이 실시예의 실험의 그룹 A에 사용하기 2일 전에, 이러한 저온보존된 F1-1-27 형질도입된 PBMC의 8개 바이알(4.0 x 108)을 해동시키고, 100 IU/ml의 IL-2(Novoprotein), 10ng/ml IL-7(Novoprotein) 및 최종 농도를 10mM만큼 증가시키기에 충분한 NAC가 보충된 377ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM(제조업자의 지침에 따라 26ml OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 보충물(Thermo Fisher, A10484-02), 25ml CTSTM 면역 세포 SR (Thermo Fisher, A2596101), 및 10ml CTSTM GlutaMAXTM-I 보충물(Thermo Fisher, A1286001)이 보충된 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 기저 배지 1L(Thermo Fisher, A10221))을 함유하는 G-Rex 100M에서 2일 동안 휴지시켰다.
사전 생체외 자극 없이 및 생체외 세포 확장 없이 휴지 림프구의 PBMC 단리 및 유리하게는 빠른 형질도입
고지에 의한 동의하에 2명의 건강한 지원자로부터의 전체 인간 혈액을 산 시트레이트 덱스트로스 용액 A 항응고제(ACD 말초 혈액) 1.5ml를 함유하는 다수의 100mm 진공채혈기 튜브(Becton Dickenson; 364606)에 수집했다. 각 지원자의 경우, 진공채혈기 튜브의 혈액을 풀링하고(그룹 B는 185.2ml, 그룹 C는 182.5ml), 2개의 표준 500ml 혈액 수집 백에 분배했다. 형질도입을 통한 PBMC 농축의 다음 단계는 폐쇄형 시스템에서 수행되었다.
각 자원자로부터의 2개의 혈액 백 중의 혈액을 제조업자의 지침에 따르는 2회 세척 사이클을 사용하여 Sepax 2 S-100 장치(Biosafe; 14000) 상에서 CS-900.2 키트(BioSafe; 1008)를 사용하여 Ficoll-PaqueTM(General Electric)과 함께 밀도 구배 원심분리를 사용하여 순차적으로 가공하여 각 작동으로부터 45ml의 단리된 PBMC를 수득했다. Sepax 2 공정에서 사용된 세척 용액은 정상 식염수(Chenixin Pharm) + 2% 인간 혈청 알부민(HSA)(Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical)이었다. 최종 세포 재현탁 용액은 45ml 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM(26mL OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 보충제(Thermo Fisher, A10484-02), 25ml CTS™ 면역 세포 SR(Thermo Fisher, A10221-03) 및 및 10ml CTS™ GlutaMAX™-I 보충제(Thermo Fisher, A1286001)이 보충된 OpTmizerTM CTSTM T 세포 확장 기본 배지 1L(Thermo Fisher, A10221-03))이었다. Sepax 2 기기의 각 프로세싱 단계는 약 1시간 12분이었다. 2회 프로세싱 작업에서 수득된 농축된 PBMC를 B 그룹 및 C 그룹을 위해 별도로 풀링하고, 세포를 계수했다.
5.5 x 107개의 새롭게 농축된 생존 가능한 PBMC를 B 그룹을 위한 4개의 표준 혈액 수집 백 각각에 씨딩하고, 세포가 1.0 x 106/ml의 밀도에 존재하도록 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 사용하여 용적이 55㎖가 되도록 했다. 1.12 x 108개의 새롭게 농축된 생존 가능한 PBMC를 C 그룹을 위한 2개의 표준 혈액 수집 백 각각에 씨딩하고, 세포가 1.0 x 106/ml의 밀도가 되도록 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM을 사용하여 용적이 110ml가 되도록 했다. 항-CD3, 항-CD28, IL-2, IL-7 또는 다른 외인성 사이토카인은 형질도입 전 림프구를 생체외 활성화시키거나 다르게는 자극시키기 위해 첨가되지 않았다. 렌티바이러스 입자는 다음과 같이 MOI 1로 혈액 수집 백 중 비자극된 PBMCdp 직접 첨가했다: 0.779ml의 F1-1-228을 하나의 백에 첨가하고, 3.11ml의 F1-1-228U를 그룹 B PBMC의 다른 백에 첨가하였고; 0.362ml의 F1-3-219를 하나의 백에 첨가하고, 3.52ml의 F1-3-219U를 그룹 C PBMC의 다른 백에 첨가했다. 형질도입 반응 혼합물을 부드럽게 마사지하여 내용물을 혼합한 후, 37℃ 및 5% CO2에서 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터 중 혈액 수집 백에서 4시간 동안 배양했다. 이어서, 각 백으로부터 PBMC는 50ml 원추형 튜브로 옮키고 (따라서, 개념 실험의 이 증명에서 폐쇄형 시스템에서 세포를 제거하고), DPBS + 2 % HSA에서 3번 세척한 후 5ml DPBS + 2% HSA에 재현탁시키고 계수했다. 이하 표는 공정에서 각 단계의 지속시간 및 경과한 총 시간을 보여준다. 이 실시예의 실험에서 이들 PBMC를 사용하기 전에 이들 PBMC에 대해서 추가의 프로세스는 수행되지 않았다.
Figure pct00015
상기 방법에 의해 형질도입된 PBMC의 시험관내 형질도입 효율 및 사이토카인-독립적 생존/증식
T 세포 및 NK 세포를 포함하는 2.0 x 106개의 PBMC를 각 샘플에 대해 6 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 2회 또는 3회 씨딩했다. 플레이트를 원심분리하고 각 샘플을 2ml의 완전 OpTmizerTM CTSTM T-세포 확장 SFM에 재현탁시켰다. 사이토카인은 첨가하지 않았다. 플레이트를 표준 가습화 조직 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 6일 동안 배양했다. 각 웰로부터의 세포 현탁액의 절반(1ml)을 3일째에 제거하고, 나머지 세포를 6일째에 제거하여 FACS 분석에 의한 FLAG-Tag + 세포의 퍼센트로서 정의된 세포 수, 생존력 % 및 형질도입된 세포 %를 결정했다. 6일째 총 세포 계수를 2배로 늘려 3일째에 세포의 절반을 제거했다.
상기 방법에 의해 형질도입된 이펙터 PBMC에 의한 생체내 종양의 증식/생존 및 표적 사멸
NSG 또는 NOD Scid 감마 마우스를 사용하는 이종이식 모델을 선택하여 생체내에서 동족 항원 발현 종양을 생존하고, 증식하고 사멸시키는 F1-1-27, F1-1-228, F1-1-228U, F1-3-219 및 F1-3-219U로 형질도입된 인간 PBMC의 능력을 프로빙했다. NSG는 성숙한 T 세포, NK 세포 및 B 세포가 결핍된 마우스의 균주이고, 현재까지 기재된 가장 면역결핍성 마우스 균주 중 하나이다. 면역계의 이러한 세포 성분의 제거를 전형적으로 수행하여 인간 PBMC가 숙주로부터의 선척적, 체액성 또는 적응성 면역 반응 없이 혼합되도록 한다. 일반적으로 인간의 방사선 또는 림프구고갈 화학요법 후에만 제공되는 항상성 사이토카인의 농도는 뮤린 세포외 공통 감마 쇄의 부재로 인해 달성되며, 이는 입양 전달된 인간 세포가 그러한 사이토카인을 수용하도록 할 수 있다. 동시에, 이러한 동물들은 종양 이종이식편 표적에 혼합되어 표적 발현 종양을 사멸시키는 CAR의 효능을 시험하는데 또한 사용될 수 있다. 이펙터 세포 생성물에 이종반응성 T 세포 수용체 항원의 존재가 결국 이식편 대 숙주 질환을 일으키지만, 이러한 모델은 동물 약리학 및 급성 내성의 단기 평가를 가능하게 한다.
내인성 인간 CD19를 발현하는 Raji 세포(ATCC, Manassas, VA) 및 인간 ROR2 (CHO-ROR2)를 안정적으로 발현하도록 형질감염된 CHO 세포(ATCC, Manassas, VA)를 이용하여 CAR 이펙터 세포를 자극하는 항원을 제공하고, 균일한 표적 종양을 생성하여 동족 항원 발현 종양을 사멸하는 CAR 이펙터 세포의 효능을 결정하였다. Raji 세포와 유전자도입된 CHO 변이체는 Matrigel 인공 기저막과 함께 NSG 마우스에게 피하 투여 후 파종성 악성 종양과 함께 빠르게 성장했다.
마우스를 동물 관리 및 사용위원회 승인 프로토콜에 따라 처리하였다. 여성 NOD-PrkdcscidIl2rgtm1/Begen(B-NSG) 마우스(Beijing Biocytogen Co. Ltd.)의 뒷발에 피하(sc) 종양 이종이식편이 확립되었다. 간단히, 배양된 Raji 세포 및 배양된 CHO-ROR2 세포를 DPBS(Thermo Fisher)에서 개별적으로 세척하고, 계수하고, 차가운 DPBS 중에 재현탁시키고 적절한 용적의 Matrigel ECM(Corning; 최종 농도 5mg/mL)과 얼음 위에서 0.5 x 106 세포/200μl의 농도로 혼합했다. 동물들은 주사 전에 모발 제거(Nair)와 함께 표준 승인 마취제를 사용하여 주사용으로 준비했다. ECM 중 어느 하나의 세포 현탁액 200μl를 각각 Raji 및 CHO-ROR2 세포의 9 또는 10주령 마우스의 뒷쪽 옆구리에 피하 주사했다.
종양 접종 5일 후, 평균 77mm3의 용적을 갖는 CHO-ROR2 종양을 갖는 마우스에게 다음과 같이 꼬리 정맥 주사로 정맥내(IV) 투여했다: 그룹 A의 NSG 마우스에게 200μl의 DPBS(n = 4) 중의 F1-1-27 렌티바이러스 입자로 형질도입된 1 x 107 PBMC 또는 200μl의 DPBS(n = 2)만을 투여하고, 그룹 B의 NSG 마우스는 200㎕ DPBS (n = 2) 중의 F1-1-228 렌티바이러스 입자로 형질도입된 0.85 x 107 PBMC, 200㎕ DPBS(n = 2) 중의 F1-1-228U 렌티바이러스 입자로 형질도입된 0.85 x 107 PBMC, 또는 200㎕ DPBS 단독(n = 2)을 투여했다. 유사하게, 종양 접종 후 5일째에, 평균 76mm3 용적의 Raji 종양을 보유한 그룹 C의 마우스에게 200㎕ DPBS 단독(n = 4) 또는 200μl DPBS (n = 3) 중의 F1-3-219 렌티바이러스 입자 또는 200μl DPBS (n = 3) 중의 F1-3-219U 렌티바이러스 입자로 형질도입된 1 x 107 PBMC를 꼬리 정맥 주사로 정맥내(IV) 투여했다. 생체외 활성화 전에 및 생체외 세포 확장 없이 휴지 림프구의 유리하게 빠른 형질도입을 위한 프로토콜을 사용하여 이러한 마우스에 투여하기 위해 사용되는 F1-228, F1-1-228U, F1-3-219 및 F1-3-219U로 PBMC를 형질도입 하였다. 전체 인간 혈액 수집으로부터 형질도입된 PBMC를 갖는 마우스의 IV 투여가지 경과된 총 시간은 F1-1-228 및 F1-1-228U의 경우 14.5시간, F1-3-219 및 F1-3-219U의 경우 11.5시간이었다.
종양을 캘리퍼스를 사용하여 일주일에 2회 측정하였고, 종양 용적은 다음의 방정식을 사용하여 계산하였다: (최장 직경* 최단 직경2)/2. FACS 및 qPCR에 의한 분석을 위해 7, 14 및 21일째에 각 마우스로부터 약 100㎕의 혈액을 수집하였다. 혈액, 비장 및 종양은 또한 마우스가 종양 부담에서 검시 지침에 따라 안락사되었을 때 수집되었다.
유동 세포 계측법
시험관내 배양으로부터 수거된 세포에 대해, 세포를 회전시키고 0.5ml FACS 염색 완충제(554656, BD)에 재현탁시켰다. 2.5μl 인간 Fc 블록(BD, 564220)을 각 샘플에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양했다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 0.5μl 항-FLAG Tag PE((항-DYKDDDDK) 637310, Biolegend) 및 0.5μl 살아 있는/죽은 고정 가능한 녹색 죽은 세포 얼룩(L34970, Thermo Fisher)으로 염색하였다. 세포를 FACS 완충제에서 2번 세척하고, FACS 완충제 및 BD Cytofix(554655, BD)의 1:1 혼합물에 고정시키고, Novocyte(ACEA)로 처리하고, 생성되는 데이터는 전방 및 측면 산란광 및 생사 얼룩을 기반으로 하는 살아있는 게이트를 사용하여 NovoExpress 소프트웨어(ACEA)로 분석했다. 형질도입된 림프구를 FLAG Tag + 세포로서 측정했다.
혈액으로부터 수득된 세포의 경우, 새롭게 수집된 혈액 중의 적혈구를 용해 완충제(555899, BD)를 사용하여 용해시키고, 나머지 세포를 100μl의 FACS 염색 완충제에 재현탁시켰다. 2.5μl 인간 Fc 블록(BD, 564220)을 각 샘플에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양했다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 바이오티닐화된 세툭 맙으로 염색했다. 염색된 세포를 FACS 완충제로 세척하고, 5㎕ 항-인간 CD45-PE-Cy7 및 0.5㎕ 항-마우스 CD45-FITC로 추가로 염색했다. F1-1-27, F1-1-228, F1-1-228U 및 이러한 그룹을 위한 PBS 대조군으로 형질도입된 세포가 투여된 마우스의 샘플에 0.4μl SA-PE를 첨가했다. F1-3-219 및 F1-3-219U 및 이 그룹을 위한 PBS 대조군으로 형질도입된 세포가 투여된 마우스의 샘플에 1μl 항-FLAG 태그 PE((항 -DYKDDDDK) 637310, Biolegend)를 첨가했다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양하고, FACS 완충제에서 2번 세척하고, 1μl 7-AAD(420404, Biolegend)를 갖는 100μl의 FACS 염색 완충제에 재현탁시켰다. 새롭게 염색된 샘플을 Novocyte(ACEA)로 처리하고, 생성되는 데이터를 전방 및 측면 산란광을 기반으로 하는 라이브 게이트, 7-AAD, 인간 CD45+를 기반으로 하는 라이브 게이트를 사용하여 NovoExpress 소프트웨어(ACEA)로 분석하고, FLAG 또는 eTag의 발현에 대해 시험했다.
qPCR
혈액 샘플로부터 단리된 게놈 DNA(gDNA)를 생체분석적 qPCR에 의해 형질도입된 림프구의 존재에 대해 평가했다. QIAamp DNA Blood Mini 키트(Qiagen 51106)를 사용하여 50μl의 혈액 샘플로부터 게놈 DNA를 단리시키고, QIAamp DNA 마이크로 키트 (56304)를 사용하여 DNA를 추가로 깨끗하게 했다. TaqMan 검정(Thermo Fisher)을 렌티바이러스의 5'LTR에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 단리된 게놈 DNA 상에서 수행하여 형질도입된 세포를 검출하였다.
결과
이 실험에서는 VSV-G로 슈도타입화되고 CAR 및 림프증식성 인자를 코딩하는 렌티바이러스 입자가 사용되었다. 렌티바이러스 입자 F1-1-228 및 F1-1-228U는 MRB-CAR을 ROR2로, 렌티바이러스 입자 F1-2-219 및 F1-3-219U는 CAR을 CD19로 코딩했다. 렌티바이러스 입자 F1-1-228U 및 F1-3-219U는 또한 표면에서 UCHT1scFvFc-GPI를 나타냈다. PBMC는 Ficoll-Paque™을 이용하는 밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 혈액으로부터 단리되었다. 신선한 PBMC는 생체외에서 세포의 사전 활성화 없이 표준 혈액 백에서 렌티바이러스 입자로 형질도입되었다. 4시간 형질도입 후, 세포를 세척하고 기 실험에서 사용했다. 당업자는 혈액 수집에서 세척된 세포까지의 전체 공정이 폐쇄형 시스템에서 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 대조군으로서, PBMC를 밤새 활성화시키고, 림프증식성 요소 또는 UCHT1scFvFc-GPI없이 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 입자로 형질도입하고, 15일 동안 생체외에서 확장시켰다(F1-1-27).
형질도입된 PBMC는 사이토카인의 부재하에 시험관내에서 배양되었다. 도 37은 6일째 형질도입 효율을 도시한다. UCHT1scFvFc-GPI는 F1-1-228 및 F1-3-219 둘 다의 형질도입 효율을 증가시켰다. 휴지 PBMC는 F1-1-228U 또는 F1-3-219U에 4시간 노출되었을 때 각각 34% 및 73%의 형질도입 효율을 보였다. 도 38은 3일과 6 일 사이의 이들 배양물에서 생존 가능한 세포의 총 수를 도시한다. F1-1-228U 또는 F1-3-219U로 형질도입된 휴지 PBMC는 외인성 사이토카인의 부재하에 3일과 6일 사이에 생존하고, 심지어 증식되는 반면, F1-1-228 또는 F1-3-219로 형질도입된 PBMC는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 활성화 요소를 나타내고 림프증식성 요소를 코딩하는 레트로바이러스 입자가 4시간 내에 휴지 PBMC를 형질도입할 수 있고, 이러한 형질되입된 PBMC가 외인성 사이토카인의 부재하에 6일 동안 배양될 때 시험관내에서 증식하여 생존할 수 있음을 입증한다.
ROR2 또는 CD19 종양을 갖는 면역결핍성 마우스에게 CAR을 각각 ROR2 또는 CD19로 발현하는 1 x 107 PBMC를 정맥내 투여했다. 생체내 생존 및 증식하는 형질 도입된 PBMC의 능력을 경시적으로 시험했다. 도 39a 내지 39c는 형질도입된 세포에 대한 판독치로서 qPCR에 의한 게놈 DNA 1㎍ 당 렌티바이러스 카피를 나타낸다. 도 39a는 림프증식성 요소를 코딩하지 않는 F1-1-27에 대한 게놈 DNA 1㎍ 당 렌티바이러스 카피가 7일째 평균 884에서 21일째 정량 하한치(LLOQ) 이하로 감소함을 보여준다. 도 39b는 F1-1-228U에 대한 렌티바이러스 카피가 7일과 14일째에 LLOQ 이하였지만, 21일째까지 LLOQ 이상으로 증가하고 25일째에 평균 1,939로 증가하였음을 보여준다. 도 39c는 F1-3-219U에 대한 렌티바이러스 카피가 마우스가 안락사되었을 때 7일째 LLOQ 이하에서 14일째에 20,430으로 증가함을 보여준다. 대조군 샘플, F1-1-228 및 F1-3-219에 있는 렌티바이러스 카피는 LLOQ 이하로 잔류했다. 도 40은 CAR 작제물의 eTag 또는 FLAG-Tag에 대한 FACS 분석에 의해 결정된 바와 같이, 마우스를 안락사시킨 시점에서 혈액 200ul당 형질도입된 세포 수를 나타낸다(마지막 시점은 도 39에 도시된다). F1-1-228U (5,857) 및 F1-3-219U (121,324)로 형질도입된 세포가 투여된 마우스로부터의 200ul의 혈액당 CAR + 세포의 상당수가 검출되었다. F1-1-228U 또는 F1-3-219U로 형질도입된 림프구는 생체내에서 표적 항원을 발현하는 종양을 사멸시켰다(도 41a 및 b). 두 경우에, 림프구는 종양 용적을 지연된 방식으로 감소시켰다. 이론에 의해 제한되지는 않지만, 이러한 지연은 주입된 세포가 확장될 필요성과 일치하며, 이는 qPCR에서 볼 때 시간이 걸린다. ROR2 종양을 갖는 마우스가 종양 부담에 대한 안락사 지침에 도달하고, Raji 종양이 있는 마우스가 마우스에서 상당한 수의 형질도입되고 확장된 림프구에 의해 유발된 이식편 대 숙주 질환을 발생시켰기 때문에 이 실험에서 이후의 시점을 연구 할 수 없었다. 이들 데이터를 합치면, 활성화 요소를 나타내고 림프증식성 요소를 코딩하는 레트로바이러스 입자가 4시간 내에 휴지 PBMC를 형질도입할 수 있고, 이러한 형질도입된 PMBC가 생체 내에서 증식하여 생존할 수 있음을 보여준다. 이 실험에서 시험된 림프증식성 요소인 MycTag 2A Jun-IL13Ra-MPL-CD40 및 IL-7-IL-7Rα-IL-2Rβ는 생체내 생존 및 증식을 촉진시키는 능력을 나타냈다. 또한, MRB-CAR (F1-1-228U) 또는 전통적인 CAR (F1-3-219U)을 발현하는 이러한 방식으로 형질도입된 이들 림프구는 생체 내에서 종양 세포를 인식하고 사멸시킬 수 있었다.
개시된 구현예, 실시예, 및 실험은 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하지 않거나 본 하기 실험이 수행되는 모든 실험 또는 유일한 실험임을 나타내고자 하지 않는다. 사용된 수치(예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 약간의 실험상의 오차 및 편차를 감안하여야 한다. 기재된 바와 같은 방법은 실험이 예시하고자 하는 기본적 양태는 변화시키지 않으면서 변형될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
당업자는 본 개시내용의 범주 및 정신 내에서 다수의 변형 및 다른 구현예를 고안해 낼 수 있다. 실제로, 당업자는 본 개시내용의 기본적 양태는 변화시키지 않으면서 기재된 물질, 방법, 도면, 실험, 실시예 및 구현예를 변형시킬 수 있다. 개시된 구현예 중 임의의 것은 임의의 다른 개시된 구현예와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 일부 개념은 구체적인 구현예를 참조로 하여 기술되었다. 그러나, 당업자는 하기의 청구범위에 기술된 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변경될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 명세서 및 도면은 제한적 의미보다는 예시적인 것으로 간주되어야 하고, 상기와 같은 변형은 모두 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> F1 ONCOLOGY, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TRANSDUCING AND EXPANDING LYMPHOCYTES AND REGULATING THE ACTIVITY THEREOF <130> IPA191205-US <150> US 62/467,039 <151> 2017-03-03 <150> US 15/462,855 <151> 2017-03-19 <150> US PCT/US2017/023112 <151> 2017-03-19 <150> US 15/644,778 <151> 2017-07-08 <150> US PCT/US2017/041277 <151> 2017-07-08 <150> US 62/560,176 <151> 2017-09-18 <150> US 62/564,253 <151> 2017-09-27 <150> US 62/564,991 <151> 2017-09-28 <160> 521 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 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catggagttt aagatatagt gtattttccc aaggtttgaa ctagctcttc 8280 atttctttat gttttaaatg cactgacctc ccacattccc tttttagtaa aatattcaga 8340 aataatttaa atacatcatt gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat 8400 gctcaaggcc cttcataata tcccccagtt tagtagttgg acttagggaa caaaggaacc 8460 tttaatagaa attggacagc aagaaagcga gcttagtgat acttgtaaaa agagacgcgt 8520 ctctaaaagt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 8580 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 8640 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 8700 tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 8760 cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact 8820 cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 8880 gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 8940 cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 9000 tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta 9060 ttcagtattt 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Artificial sequence <220> <223> synthetic Evolved aptamer <400> 90 gggcggcacu uauacagcgu agcauaaugg gcugcagacg ccgucaaacc uauuugcaga 60 cuauaagugu cgcgcg 76 <210> 91 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Evolved aptamer <400> 91 gggcggcacu uauacaccgu agcauaaugg gcuacugccg ccgucgaccu uuuggagacu 60 auaagugucg cgcg 74 <210> 92 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Evolved aptamer <400> 92 gggcggcacu uauacagguc agcauaaugu gcuagugcgc cuucaaaccu auuuagagac 60 uauaaguguc gcgcg 75 <210> 93 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Evolved aptamer <400> 93 gggcggcacu uauacagcuu agcguaaugg cuacugacgc cguccaaacc uauuuacaga 60 cuauaagugu cgcgcg 76 <210> 94 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Evolved aptamer <400> 94 gggcggcacu uauacagggg agcauaaugg gcuacugacg ccuuuaaacc uauuugagga 60 cuauaagugu cgcgcg 76 <210> 95 <211> 74 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic 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Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp 100 105 110 Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro 115 120 125 Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg 145 150 155 160 Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln 165 170 175 Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys 180 185 190 Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala 195 200 205 Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Leu Ala Arg Arg Pro Arg Gly Gly Cys 210 215 220 Arg Arg Met Val Val Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu 225 230 235 240 Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His 245 250 255 Gln Lys Arg Pro Ile Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe 260 265 270 Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys 275 280 285 Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro 290 295 300 <210> 500 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S197 <400> 500 Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr 35 40 45 Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu 50 55 60 Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly 65 70 75 80 Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu 85 90 95 Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp 100 105 110 Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro 115 120 125 Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg 145 150 155 160 Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln Phe Val Gln 165 170 175 Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu Lys Leu Cys 180 185 190 Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp Ser Ile Ala 195 200 205 Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val Val Val Ser 210 215 220 Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr Lys Phe Ala 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Pro Ile Pro Ile Lys 245 250 255 Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg Phe Ile Thr 260 265 270 Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe Trp Thr Arg 275 280 285 Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro 290 295 <210> 501 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S198 <400> 501 Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr 35 40 45 Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu 50 55 60 Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly 65 70 75 80 Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu 85 90 95 Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Gly His Met 100 105 110 Pro Glu Arg Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile Gln 115 120 125 Phe Val Gln Glu Met Ile Arg Gln Leu Glu Gln Thr Asn Tyr Arg Leu 130 135 140 Lys Leu Cys Val Ser Asp Arg Asp Val Leu Pro Gly Thr Cys Val Trp 145 150 155 160 Ser Ile Ala Ser Glu Leu Ile Glu Lys Arg Cys Arg Arg Met Val Val 165 170 175 Val Val Ser Asp Asp Tyr Leu Gln Ser Lys Glu Cys Asp Phe Gln Thr 180 185 190 Lys Phe Ala Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala His Gln Lys Arg Pro Ile 195 200 205 Pro Ile Lys Tyr Lys Ala Met Lys Lys Glu Phe Pro Ser Ile Leu Arg 210 215 220 Phe Ile Thr Val Cys Asp Tyr Thr Asn Pro Cys Thr Lys Ser Trp Phe 225 230 235 240 Trp Thr Arg Leu Ala Lys Ala Leu Ser Leu Pro 245 250 <210> 502 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S199 <400> 502 Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro 1 5 10 15 Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His 20 25 30 Leu Ile Ile Met Asn Val Ser Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val 35 40 45 Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys 50 55 60 Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Pro Thr Glu Lys Asn His Ser Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu 85 90 95 Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His 100 105 110 Val Pro Val Ser Pro Lys Ala Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser 115 120 125 Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu 130 135 140 Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu 145 150 155 160 Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val 165 170 175 Glu Ala Pro His Cys Ser Glu Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu 180 185 190 Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile 195 200 205 Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu His Tyr Cys 210 215 <210> 503 <211> 364 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S202 <400> 503 Lys Gly Tyr Ser Met Val Thr Cys Ile Phe Pro Pro Val Pro Gly Pro 1 5 10 15 Lys Ile Lys Gly Phe Asp Ala His Leu Leu Glu Lys Gly Lys Ser Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Cys Gln Asp Phe Pro Pro Thr Ser Asp 35 40 45 Tyr Glu Asp Leu Leu Val Glu Tyr Leu Glu Val Asp Asp Ser Glu Asp 50 55 60 Gln His Leu Met Ser Val His Ser Lys Glu His Pro Ser Gln Gly Met 65 70 75 80 Lys Pro Thr Tyr Leu Asp Pro Asp Thr Asp Ser Gly Arg Gly Ser Cys 85 90 95 Asp Ser Pro Ser Leu Leu Ser Glu Lys Cys Glu Glu Pro Gln Ala Asn 100 105 110 Pro Ser Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Val Ile Glu Lys Pro Glu Asn Pro 115 120 125 Glu Thr Thr His Thr Trp Asp Pro Gln Cys Ile Ser Met Glu Gly Lys 130 135 140 Ile Pro Tyr Phe His Ala Gly Gly Ser Lys Cys Ser Thr Trp Pro Leu 145 150 155 160 Pro Gln Pro Ser Gln His Asn Pro Arg Ser Ser Tyr His Asn Ile Thr 165 170 175 Asp Val Cys Glu Leu Ala Val Gly Pro Ala Gly Ala Pro Ala Thr Leu 180 185 190 Leu Asn Glu Ala Gly Lys Asp Ala Leu Lys Ser Ser Gln Thr Ile Lys 195 200 205 Ser Arg Glu Glu Gly Lys Ala Thr Gln Gln Arg Glu Val Glu Ser Phe 210 215 220 His Ser Glu Thr Asp Gln Asp Thr Pro Trp Leu Leu Pro Gln Glu Lys 225 230 235 240 Thr Pro Phe Gly Ser Ala Lys Pro Leu Asp Tyr Val Glu Ile His Lys 245 250 255 Val Asn Lys Asp Gly Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Gln Arg Glu Asn 260 265 270 Ser Gly Lys Pro Lys Lys Pro Gly Thr Pro Glu Asn Asn Lys Glu Tyr 275 280 285 Ala Lys Val Ser Gly Val Met Asp Asn Asn Ile Leu Val Leu Val Pro 290 295 300 Asp Pro His Ala Lys Asn Val Ala Cys Phe Glu Glu Ser Ala Lys Glu 305 310 315 320 Ala Pro Pro Ser Leu Glu Gln Asn Gln Ala Glu Lys Ala Leu Ala Asn 325 330 335 Phe Thr Ala Thr Ser Ser Lys Cys Arg Leu Gln Leu Gly Gly Leu Asp 340 345 350 Tyr Leu Asp Pro Ala Cys Phe Thr His Ser Phe His 355 360 <210> 504 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S211 <400> 504 Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 20 25 30 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 35 40 <210> 505 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S212 <400> 505 His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys 1 5 10 15 Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg 20 25 30 Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu 35 40 45 Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr 50 55 60 Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp 65 70 75 80 Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro 85 90 95 Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile 100 105 110 Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro 115 120 125 Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu 130 135 140 Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro 145 150 155 160 Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly 165 170 175 Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys 180 185 <210> 506 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S213 <400> 506 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 507 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S214 <400> 507 Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val 1 5 10 15 Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile 20 25 30 Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu 35 40 45 Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His 50 55 60 <210> 508 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S215 <400> 508 Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro 1 5 10 15 Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala 20 25 30 Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu 35 40 45 Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val 50 55 <210> 509 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide S216 <400> 509 Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Lys Thr Gln Leu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu 20 25 30 Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp 35 40 45 Leu Trp Val 50 <210> 510 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide X001 <400> 510 Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 <210> 511 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide IL7 <400> 511 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 512 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide Flexible linker <400> 512 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 513 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide IL7RA ECD and TM <400> 513 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln 20 25 30 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Ile Thr Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu 85 90 95 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro 100 105 110 Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val 115 120 125 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met 130 135 140 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His 145 150 155 160 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln 165 170 175 Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr 180 185 190 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro Ile Leu Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala 225 230 235 240 Cys Val Leu Trp <210> 514 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic polypeptide IL2RB ICD <400> 514 Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn 1 5 10 15 Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly 20 25 30 Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe 35 40 45 Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu 50 55 60 Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu 65 70 75 80 Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn 85 90 95 Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala 100 105 110 Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp 115 120 125 Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln 130 135 140 Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro 165 170 175 Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro 180 185 190 Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly 195 200 205 Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro 210 215 220 Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro 225 230 235 240 Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu 245 250 255 Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu 260 265 270 Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val 275 280 285 <210> 515 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide Kozak-type sequence <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = T or U <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = G may or may not be present <400> 515 ccaccangn 9 <210> 516 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide Kozak-type sequence 2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n = T or U <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = G may or may not be present <400> 516 ccgccangn 9 <210> 517 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide Kozak-type sequence 3 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n = T or U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n = G may or may not be present <400> 517 gccgccgcca ngn 13 <210> 518 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide Kozak-type sequence 4 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n = T or U <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n = G may or may not be present <400> 518 gccgccacca nn 12 <210> 519 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide Kozak sequence <400> 519 gccgccacc 9 <210> 520 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide triple stop sequence <400> 520 taatagtga 9 <210> 521 <211> 191 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic nucleotide WPRE <400> 521 gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg 60 ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct 120 gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc 180 ctccccgcct g 191

Claims (71)

  1. 대상체의 휴지 T 세포 또는 휴지 NK 세포를 유전자 변형시키기 위한 키트를 제조하는데 있어서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자의 용도로서, 상기 키트의 용도가 생체외 T 세포 또는 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 슈도타입화 요소와 표면에 막-결합 T 세포 활성화 요소를 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 T 세포 또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포를 생성하고, 상기 접촉 단계가 1 내지 12시간 동안 수행되는, 용도.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 접촉 단계가 1 내지 6시간 동안 수행되는, 용도.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 막-결합 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc인, 용도.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 CAR의 ASTR에 대한 표적의 부재하에 및 외인성 사이토카인의 부재하에 적어도 7일 동안 생체외 배양물에서 생존할 수 있는, 용도.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 T 세포 림프증식성 요소가 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는, 용도.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 능력을 유지하는 IL-7 수용체 알파, 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하고, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 구성적으로 활성인, 용도.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 IL-7에 결합할 수 있는 IL-7 수용체의 기능적 세포외 단편, IL-7 수용체 막관통 도메인 및 IL-7 수용체 신호전달 도메인에 공유 결합된 IL-7을 포함하는, 용도.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 CAR이 MRB-CAR인, 용도.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 유전자 변형된 세포가 유전자 변형된 T 세포인, 용도.
  10. 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입함으로써 제조된 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 슈도타입화 요소와 표면에 막-결합 T 세포 활성화 요소를 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하고, 상기 접촉 단계가 1 내지 12시간 동안 수행되는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 접촉 단계가 1 내지 6시간 동안 수행되는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 막 결합 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc인, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 CAR의 ASTR에 대한 표적의 부재하에 및 외인성 사이토카인의 부재하에 적어도 7일 동안 생체외 배양물에서 생존할 수 있는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 CAR이 MRB-CAR인, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 코작(Kozak)-관련 서열, WPRE 요소, 및 다중 정지 서열을 추가로 포함하는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 T 세포 림프증식성 요소가 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  17. 청구항 10 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 유전자 변형된 세포가 T 세포인, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  18. 림프구를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 형질도입하는 방법으로서,
    A. 무혈청 배지 중 현탁액에서 패키징 세포를 배양하는 단계로서, 상기 패키징 세포가 상기 복제 불능 레트로바이러스 입자의 패키징가능한 RNA 게놈, REV 단백질, gag 폴리펩타이드, pol 폴리펩타이드, 및 슈도타입화 요소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계;
    B. 무혈청 배지로부터 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 수거하는 단계; 및
    C. 림프구를 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시킴으로써 상기 림프구를 형질도입하는 단계로서, 상기 접촉 단계가 12시간 미만 동안 수행되는, 단계를 포함하는, 형질도입하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 패키징 세포가 활성화 요소를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 활성화 요소가 항-CD3 항체인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 항-CD3 항체가 항-CD3 scFvFc인, 방법.
  22. 청구항 18에 있어서, 상기 패키징 세포가 패키징 가능한 RNA 게놈을 코딩하는 내부에 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 불멸화된 세포인, 방법.
  23. 청구항 18에 있어서, 상기 gag 폴리펩타이드 및 상기 pol 폴리펩타이드가 하나 이상의 유도성 프로모터로부터 발현되고, 상기 방법이 배양 동안 교차활성인자를 첨가하여 하나 이상의 유도성 프로모터로부터 상기 gag 폴리펩타이드 및 상기pol 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 청구항 18에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드를 코딩하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 CAR이 MRB-CAR인, 방법.
  26. 청구항 18에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 림프증식성 요소를 코딩하는, 방법.
  27. 청구항 18에 있어서, 상기 접촉 단계가 1 내지 12시간 동안 수행되는, 방법.
  28. 청구항 18에 있어서, 상기 림프구가 임의의 외인성 사이토카인의 부재하에 시험관내에서 확장될 수 있는, 방법.
  29. 청구항 18 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 림프구가 휴지 T 세포이고, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자인, 방법.
  30. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서,
    A. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드; 및
    B. 표면 상의 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소로서, 상기 T 세포 활성화 요소가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않고, 상기 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc 항체인, 슈도타입화 요소 및 T 세포 활성화 요소를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 복제 불능 레트로바이러스 입자가 CD28에 결합할 수 있는 막-결합 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  32. 청구항 30에 있어서, 상기 항-CD3 scFvFc 항체가 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합되는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  33. 청구항 30에 있어서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 림프증식성 요소를 추가로 코딩하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 CAR 및 상기 림프증식성 요소가 별개의 폴리펩타이드로서 발현되는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 림프증식성 요소가 키메라 림프증식성 요소인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 키메라 림프증식성 요소가 구성적으로 활성 키메라 사이토카인 수용체이고, 상기 구성적으로 활성 키메라 사이토카인 수용체의 발현이 조절 요소의 제어하에 존재하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 IL-7 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-15 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-23 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-27 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 유인 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 또는 CD28을 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  38. 청구항 35에 있어서, 상기 키메라 림프증식성 요소가 사이토카인 수용체를 포함하고, 상기 사이토카인 수용체가 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 능력을 보유하는 IL-7 수용체 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하고, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 구성적으로 활성인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 IL-7에 결합할 수 있는 IL-7 수용체의 기능적 세포외 단편, IL-7 수용체 막관통 도메인, 및 IL-7 수용체 신호전달 도메인에 공유결합된 IL-7을 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  40. 청구항 30에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 코작-관련 서열, WPRE 요소 및 다중 정지 서열을 추가로 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  41. 청구항 30 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 프로모터가 T 세포에서 활성인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  42. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로서, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 구성적으로 활성 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 키메라 림프증식성 요소가 이의 동족 수용체에 결박되거나 이의 동족 수용체의 단편에 결박된 사이토카인을 포함하지 않는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 키메라 림프증식성 요소가 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  44. 청구항 42에 있어서, 상기 구성적으로 활성 키메라 림프증식성 요소의 발현이 조절 요소의 조절하에 존재하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  45. 청구항 42에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 슈도타입화 요소를 추가로 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  46. 청구항 42에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 T 세포 활성화 요소를 추가로 포함하고, 상기 T 세포 활성화 요소가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 중 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되지 않는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 항체인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  49. 청구항 42 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 프로모터가 T 세포에서 활성인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자.
  50. 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포로서, 상기 T 세포 또는 NK 세포가 동족 수용체에 결박되거나 동족 수용체의 단편에 결박된 사이토카인을 포함하지 않는 구성적으로 활성 키메라 림프증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드 및 항원-특이적 표적화 영역(ASTR), 막관통 도메인 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 발현하는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩타이드의 발현이 조절 요소의 제어하에 존재하는, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  52. 청구항 50에 있어서, 상기 세포가 T 세포인, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  53. 청구항 50에 있어서, 상기 CAR이 MRB-CAR인, 유전자 변형된 T 세포 또는 NK 세포.
  54. 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입하는 방법으로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 슈도타입화 요소와 표면에 막-결합 T 세포 활성화 요소를 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하고, 상기 접촉 단계가 1 내지 12시간 동안 수행되는, 형질도입하는 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 상기 접촉 단계가 1 내지 6시간 동안 수행되는, 방법.
  56. 청구항 54에 있어서, 상기 막 결합 T 세포 활성화 요소가 항-CD3 scFvFc인, 방법.
  57. 청구항 54에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 CAR의 ASTR에 대한 표적의 부재하에 및 외인성 사이토카인의 부재하에 적어도 7일 동안 생체외 배양물에서 생존할 수 있는, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 상기 T 세포 림프증식성 요소가 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는, 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 능력을 유지하는 IL-7 수용체 알파 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하고, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 구성적으로 활성인, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 IL-7에 결합할 수 있는 IL-7 수용체의 기능적 세포외 단편, IL-7 수용체 막관통 도메인, 및 IL-7 수용체 신호전달 도메인에 공유결합된 IL-7을 포함하는, 방법.
  61. 청구항 57에 있어서, 상기 CAR이 MRB-CAR인, 방법.
  62. 청구항 54 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 유전자 변형된 세포가 유전자 변형된 T 세포인, 방법.
  63. 청구항 57에 있어서, 상기 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포의 10% 내지 50%가 형질도입된, 방법.
  64. 생체외 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입 반응 혼합물에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자와 접촉시키는 단계를 포함하는 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입하는 방법으로서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 표면에 슈도타입화 요소와 표면에 막-결합 항-CD3 scFvFc 항체를 포함하고, 상기 접촉 단계가 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에 의한 휴지 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시켜 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 생성하는, 형질도입하는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 형질도입이 1시간 내지 20시간 동안 수행되는, 방법.
  66. 청구항 64에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 전사 단위가 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 T 세포 림프증식성 요소를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 코딩하고, 상기 유전자 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포가 CAR의 ASTR에 대한 표적의 부재하에 및 외인성 사이토카인의 부재하에 적어도 7일 동안 생체외 배양물에서 생존할 수 있는, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 T 세포 림프증식성 요소가 키메라 사이토카인 수용체를 포함하는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 능력을 유지하는 IL-7 수용체 알파 또는 이의 단편에 결박된 IL-7을 포함하고, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 구성적으로 활성인, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 상기 키메라 사이토카인 수용체가 IL-7에 결합할 수 있는 IL-7 수용체의 기능적 세포외 단편, IL-7 수용체 막관통 도메인, 및 IL-7 수용체 신호전달 도메인에 공유결합된 IL-7을 포함하는, 방법.
  70. 청구항 64 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자가 렌티바이러스 입자이고, 상기 유전자 변형된 세포가 유전자 변형된 T 세포인, 방법.
  71. 청구항 66에 있어서, 상기 휴지 T 세포 및/또는 휴지 NK 세포의 10% 내지 50%가 형질도입된, 방법.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2020047527A2 (en) 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
IL278044B2 (en) * 2018-04-19 2024-04-01 Baylor College Medicine Reprogramming of CD4 T cells to CD8 T cells through forced expression of CD8AB and type 1-restricted T cell receptors
US20220133792A1 (en) * 2019-02-01 2022-05-05 The Trustees Of Dartmouth College Signaling platforms for chimeric antigen receptor t cells
JP2022519704A (ja) * 2019-02-08 2022-03-24 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） キメラサイトカイン受容体
MX2021010444A (es) 2019-03-01 2021-09-21 Allogene Therapeutics Inc Receptores de citocinas quimericos que tienen un ectodominio de pd-1.
EP3715368A1 (en) * 2019-03-28 2020-09-30 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Chimeric antigen receptors, vectors coding for such receptors and their use in the modification of t cells
CN110244612B (zh) * 2019-06-06 2020-05-26 西安交通大学 一种基于化学扩散机理的二元数字通信系统
CN112500492B (zh) * 2019-09-13 2023-08-04 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 一种嵌合抗原受体及其用途
WO2021073626A1 (zh) * 2019-10-17 2021-04-22 北京门罗生物科技有限公司 嵌合抗原受体和其中表达有嵌合抗原受体的t细胞
JP2023504081A (ja) * 2019-11-27 2023-02-01 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 神経膠芽細胞腫及び他の癌を処置するためのナチュラルキラー細胞免疫療法
US20230111159A1 (en) * 2020-03-05 2023-04-13 Exuma Biotech Corp Methods and compositions for the delivery of modified lymphocyte aggregates
CN111662900B (zh) * 2020-05-13 2023-06-27 重庆师范大学 一种磺胺二甲嘧啶核酸适配体筛选方法、试剂盒及应用
CN111549044B (zh) * 2020-07-13 2020-10-23 北京市肿瘤防治研究所 靶向trbc1 car-t细胞的制备方法与应用
CA3204357A1 (en) * 2021-01-28 2022-08-04 Todd LUMAN Methods for transducing immune cells
WO2022187289A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for the delivery of retroviral particles
WO2023168305A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase
CN117683139A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 信达细胞制药(苏州)有限公司 组成型嵌合细胞因子受体及表达其的免疫细胞及应用

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5310903A (en) 1993-03-05 1994-05-10 Merck & Co., Inc. Imidazolidyl rapamycin derivatives
JP3532566B2 (ja) 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
CN1263864C (zh) 1993-10-25 2006-07-12 坎吉公司 重组腺病毒载体及其使用方法
US5527907A (en) 1993-11-19 1996-06-18 Abbott Laboratories Macrolide immunomodulators
US5525610A (en) 1994-03-31 1996-06-11 American Home Products Corporation 42-Epi-rapamycin and pharmaceutical compositions thereof
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
US20030036654A1 (en) 1994-08-18 2003-02-20 Holt Dennis A. Synthetic multimerizing agents
ES2178101T3 (es) 1994-12-09 2002-12-16 Imp College Innovations Ltd Genes de virulencia en la region vgc2 de salmonella.
CA2219080A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
JP2002508971A (ja) 1998-01-15 2002-03-26 アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレーテッド 多量体キメラ蛋白質を使用する生物学的イベントの調節
AU783158B2 (en) 1999-08-24 2005-09-29 Ariad Pharmaceuticals, Inc. 28-epirapalogs
US20040005561A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6916846B2 (en) 2000-05-12 2005-07-12 Merck & Co. Inc. Coumermycin analogs as chemical dimerizers of chimeric proteins
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
US7387896B2 (en) 2003-03-26 2008-06-17 The Regents Of The University Of Michigan MicroRNA vectors
US20060239966A1 (en) * 2003-10-20 2006-10-26 Tornoee Jens In vivo gene therapy of parkinson's disease
WO2006007539A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-19 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
SG160326A1 (en) 2004-11-08 2010-04-29 Univ Yale Structure-based compound design involving riboswitches
US8236925B1 (en) 2005-08-26 2012-08-07 University Of Minnesota Protein nanorings
NO2406399T3 (ko) 2009-03-09 2018-07-14
EP4049674A1 (en) 2009-11-03 2022-08-31 City of Hope Truncated epidermal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
JP6066991B2 (ja) * 2011-04-08 2017-01-25 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ キメラサイトカイン受容体を用いて、腫瘍微小環境の影響を逆転する方法
EP3783098A1 (en) * 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
EP4074735A1 (en) 2014-08-28 2022-10-19 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
GB201503500D0 (en) * 2015-03-02 2015-04-15 Ucl Business Plc Cell
JP7108551B2 (ja) * 2016-03-19 2022-07-28 エクスマ バイオテック コーポレイション リンパ球に形質導入を行うための方法及び組成物、並びにその制御された増加
EP3472318B1 (en) * 2016-07-08 2023-09-06 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
GB201614093D0 (en) * 2016-08-17 2016-09-28 Autolus Ltd Vector

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