KR102457098B1 - 림프구를 형질도입시키기 위한 방법 및 조성물, 및 이의 조절된 확장 - Google Patents

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기아베 에이치 구이빈가
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Abstract

본 개시내용은 사전 생체외 자극 없이 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는, 림프구를 유전적으로 변형시키는 방법, 및 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공한다. 본 방법은 전형적으로 림프구 증식성 요소, 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR), 예를 들어, 미세환경 제한 CAR을 포함할 수 있는 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서는 상기 조작된 신호전달 폴리펩티드의 추가의 요소 뿐만 아니라, 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터, 패키징 세포주 및 상기를 제조하는 방법도 제공한다. 추가로, 재조합 레트로바이러스 및 상기를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 생체내에서 뉴클레오시드 유사체에 의해 제어되는 리보스위치를 비롯한 다수의 제어 장치를 제공한다.

Description

림프구를 형질도입시키기 위한 방법 및 조성물, 및 이의 조절된 확장
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 19일 출원된 미국 가출원 번호 62/390,093; 2016년 7월 8일 출원된 미국 가출원 번호 62/360,041; 및 2017년 3월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/467,039의 이익을 주장한다. 상기 출원들은 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 본원과 함께 공동으로 출원된 전자식 서열 목록 자료를 참조로 포함한다. 전자식 서열 목록 내의 상기 자료는 2017년 3월 16일 작성된, 파일 크기가 230 KB인 파일명 "F1_001_Sequence_listing.txt"의 텍스트 (.txt) 파일로서 제출된 것이며, 이는 그의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 개시내용은 면역학 분야, 또는 더욱 구체적으로, T 림프구 또는 다른 면역 세포의 유전적 변형, 및 레트로바이러스를 제조하는 방법 및 유전자의 발현을 제어하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 배경
대상체 (예컨대, 환자)로부터 단리된 림프구는 시험관내에서 활성화될 수 있고, 도입된 유전 프로그램에 기초하여 다른 세포 및 환경과의 재지정된 체결을 가능하게 하는 합성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 상기와 같은 합성 단백질의 예로는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 있다. 현재 사용되고 있는 한 CAR은 세포외 인식 도메인 (예컨대, 항원 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 복제 불능 레트로바이러스에 의해 코딩되는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합체이다.
레트로바이러스는 비-분열 세포를 감염시키는 데에서는 효능을 보였지만, 휴지기 CD4 및 CD8 림프구는 이들 벡터에 의한 유전자 형질도입에 대해서는 무반응성이다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, CAR 유전자 벡터에 의한 유전적 변형이 발생하기 이전에 이들 세포는 전형적으로는 시험관내에서 자극 시약을 사용함으로써 활성화된다. 자극 및 형질도입 후, 유전적으로 변형된 세포는 시험관내에서 확장된 후, 이어서, 림프구가 제거된 환자 내로 재도입된다. 생체내에서 항원 결합시, CAR의 세포내 신호전달 부분은 면역 세포에서 활성화 관련 반응 및 세포용해 분자의 방출을 개시함으로써 종양 세포 사멸을 유도할 수 있다.
상기와 같은 현행 방법은 그의 환자 내로의 재주입 이전에 신체 밖에서의 증식성 T 세포의 광범위한 조작 및 제조 뿐만 아니라, T 세포 생착을 촉진시키기 위하여 시토카인을 제거하고, 경쟁 수용체를 고갈시키는 림프구 고갈 화학요법을 필요로 한다. 상기 CAR 요법은 추가로 일단 체내로 도입되고 나면, 생체내에서의 증식 속도에 대해 제어될 수 없고, 종양 밖에서도 또한 발현되는 표적에 대하여 안전하게 유도되지 못한다. 그 결과, 오늘날 CAR 요법은 전형적으로 1 x 105 내지 1 x 108개의 세포/kg의 용량을 사용하여 12 내지 28일 동안 생체외에서 확장된 세포로부터 주입되고, 표적, 예를 들어, 종양 표적에 대해 유도되고, 그러한 경우, 표적 독성에 관하여 종양 이외의 것은 일반적으로 허용된다. 상기의 비교적 장기간 동안의 생체외에서의 확장 기간은 확장가능성에 관한 도전 과제 이외에도 세포 생존가능성 및 멸균성에 관한 문제 뿐만 아니라, 샘플 아이덴티티에 관한 문제를 일으킨다. 따라서, 더욱 안전하고, 더욱 효과적이며 확장가능한 T 세포 또는 NK 세포 요법이 크게 요구되고 있다.
요약
한 측면에서, 본원에서는
A. 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않으면서, 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를,
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 슈도타입화 요소(pseudotyping element); 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서,
여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입이 촉진되는 것인 단계;
B. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계; 및
C. 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물에 노출시켜 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현에 영향을 미치고, 생체내에서 림프구의 확장, 생착, 및/또는 지속을 촉진 및/또는 증강시킴으로써 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 단계를 포함하는, 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다.
상기 측면에서, 및 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 본원의 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면 중 임의의 것에서, 가장 광범위한 측면에서 언급되지 않는다면, 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 전사 단위를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 생체외에서 대상체의 혈액으로부터의 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는, 그의 발현이 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 것인 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
여기서, 상기 접촉으로 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부가 유전적으로 변형되는 것인 단계; 및
C. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시켜 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 단계로서, 여기서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착, 및/또는 지속이 대상체내의 생체내에서 일어나고, 여기서, 혈액을 수집하는 단계와 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 재도입시키는 단계 사이의 방법은 24시간 이내에 수행되는 것인 단계를 포함하는, 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 단리시키는 단계;
C. 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 재조합 레트로바이러스 표면 상에 포함하고,
여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입이 촉진되는 것인 단계; 및
D. 유전적으로 변형된 세포를, 대상체로부터의 혈액 수집으로부터 24시간 이내에 대상체 내로 재도입시킴으로써 대상체에서 입양 세포 요법을 수행하는 단계를 포함하는, 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 그의 표면 상에 포함하고, 여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입이 촉진되는 것인 단계를 포함하는, 대상체의 휴지기 림프구를 형질도입시키는 방법을 제공한다. 상기 측면의 예시적인 실시양태에서, 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 10, 20, 또는 25%, 또는 T 세포 및/또는 NK 세포 중 10% 내지 70%, 또는 20% 내지 50%가 상기 프로세스의 결과로서, 상기 프로세스의 결과로서 형질도입된다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 단리시키는 단계;
C. 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하여 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 그의 표면 상에 포함하고, 여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포 중 적어도 5%의 형질도입이 촉진되는 것인 단계를 포함하는, 단리된 혈액으로부터의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원에서는
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는, 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 림프구 증식성 요소를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
C. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 것인, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 활성화 요소를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 여기서, 상기 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는 것인 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는, 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, IL-7 수용체 돌연변이체의 발현은 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
C. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발현되고; T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고; 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 것인, 재조합 레트로바이러스를 제공한다. 본 측면의 예시적인 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물의 리보스위치에의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시킨다.
본원에서 제공되는 방법 또는 조성물 측면 중 임의의 것에서, 가장 광범위한 측면에서 이미 언급되지 않았다면, 재조합 레트로바이러스 또는 레트로바이러스는 그의 표면 상에 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소를 포함하거나, 또는 추가로 포함한다.
T 세포 및/또는 NK 세포, 또는 휴지기 T 세포 또는 휴지기 NK 세포를 언급하는 본원의 방법 또는 조성물 중 임의의 것에서, 특정 예시적인 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.
전형적으로, 본원에서 제공되는 방법 및 조성물 중 임의의 것에서 재조합 레트로바이러스는 복제 결함성인 것이다. 즉, 바이러스는 복제를 할 수 없다. 예시적인 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스, 예컨대, 복제 결함성 HIV 렌티바이러스이다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 휴지기 T 세포 중 10% 내지 75%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 10% 내지 25%, 또는 20% 내지 75%, 또는 20% 내지 50%, 또는 적어도 10%, 20%, 또는 25%가 형질도입되고, NK 세포 중 0% 내지 75%가 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 휴지기 NK 세포 중 5% 내지 80%, 또는 10% 내지 80%, 또는 10% 내지 70%, 또는 10% 내지 60%, 또는 10% 내지 50%, 또는 10% 내지 25%, 또는 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 50%가 형질도입된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 또는 본원에서 제공된 임의의 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 생체내 제어 요소에 의해 조절된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 접촉 방법은 범위 하단으로 15, 30 또는 45분 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8시간 내지 범위 상단으로 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 실시양태에서, 접촉은 2 내지 24시간, 또는 4 내지 12시간, 또는 4 내지 8시간 동안 수행된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 본 방법은 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물에 노출시켜 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및 임의적으로 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현에 영향을 미치고, 생체내에서 림프구의 확장, 생착, 및/또는 지속을 촉진시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 대상체 내로의 도입 또는 재도입 이전에 생체외에서 8, 7, 6, 5, 4, 3회 또는 그 미만의 세포 분열을 겪게 된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 생체내에서의 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착, 및/또는 지속은 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물의 존재 또는 부재에 의존하고, 예시적인 실시양태에서, 이는 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물의 존재에 의존한다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 대상체는 접촉 수행 7, 14, 또는 21일 이내에, 접촉하는 동안, 및/또는 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입한 후 7, 14, 또는 21일 이내에 림프구 고갈제에 노출되지 않는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 접촉하는 동안 림프구 고갈제에 노출되지 않는다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포는 15분 내지 12시간 동안 재조합 레트로바이러스와 접촉된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 본 방법은 접촉 이후이되, 도입 이전에 재조합 레트로바이러스를 T 세포 및/또는 NK 세포로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 상기 노출 단계는 접촉 이전 또는 그 동안에, 및/또는 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입한 이후에, 일정 용량의 화합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 본 방법은 생체외에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함하는 혈액을 대상체로부터 수집하는 단계를 포함하고, 여기서, 도입은 재도입이다. 예를 들어, 20 내지 250 ml의 혈액을 대상체로부터 채혈한다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 혈액을 대상체로부터 수집한 시점과 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시키는 시점 사이에 8, 12, 24, 또는 48시간 이하의 시간이 경과된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 혈액을 대상체로부터 수집한 시점과 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시키는 시점 사이에 하단으로 4 또는 8시간 내지 범위의 상단으로 12, 24, 36, 또는 48시간이 경과된다.
본원의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키기 위한, 또는 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 측면, 또는 유사한 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 혈액 수집 이후, 및 혈액 재도입 이전의 모든 단계는 프로세싱 전 기간 동안에 걸쳐 사람이 폐쇄형 시스템을 모니터링하게 되는 것인 폐쇄형 시스템에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 혈액 수집 이후, 및 혈액 재도입 이전에는 대상체와 함께 같은 실내에 남아 있는 폐쇄형 시스템에서 수행된다.
하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하는 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 언급되지 않는다면, 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 및 ASTR을 림프구 증식성 요소에 연결하는 막횡단 도메인을 포함하거나, 또는 추가로 포함한다. 상기 조작된 신호전달 폴리펩티드의 ASTR은 제1 종양 항원에 결합할 수 있고, 존재할 경우, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 ASTR은 제2 종양 항원에 결합할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 공동자극성 도메인을 추가로 포함한다. 추가로, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 스토크(stalk)를 추가로 포함한다. 추가로, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 세포내 활성화 도메인을 추가로 포함한다. 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드 상의 세포내 활성화 도메인은 CD3 제타로부터 유래된 것일 수 있다.
림프구 증식성 요소를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 T 세포 생존 모티프를 포함할 수 있다. T 세포 생존 모티프는 IL-7 수용체, IL-15 수용체, 또는 CD28 모두, 또는 그의 기능성 단편을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 시토카인 또는 시토카인 수용체 폴리펩티드, 또는 신호전달 도메인을 포함하는 그의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 림프구 증식성 요소는 링커를 통해 그의 동족 인터류킨 수용체 폴리펩티드에 공유적으로 부착된 인터류킨 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 림프구 증식성 요소는 IL-7 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-23의 세포내 신호전달 도메인, IL-27의 세포내 신호전달 도메인, IL-15 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 또는 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 유인 수용체의 세포내 신호전달 도메인일 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 구성적으로 활성을 띠는 것이다. 추가로, 림프구 증식성 요소는 돌연변이화된 IL-7 수용체 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, 이는 구성적으로 활성을 띠는 돌연변이화된 IL-7 수용체 또는 구성적으로 활성을 띠는 그의 단편을 추가로 포함할 수 있다.
재조합 레트로바이러스 또는 레트로바이러스들을 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에
A. CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는
B. CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함하는 활성화 요소를 포함할 수 있다.
추가로, CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합될 수 있는 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드이고, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD80, CD86, 또는 Akt의 CD28 매개 활성화를 유도할 수 있는 그의 기능성 단편, 예컨대, CD80의 세포외 도메인이다.
재조합 레트로바이러스를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된, CD80, 또는 그의 세포외 도메인일 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv, CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된, CD80, 또는 그의 세포외 도메인, 및 IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 DAF 융합물, 항-CD3 scFV, 및 CD80, 또는 그의 세포외 도메인은 각각 DAF 신호 서열을 포함한다.
재조합 레트로바이러스 또는 레트로바이러스들을 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 막 결합 시토카인을 포함할 수 있다. 막 결합 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 그의 활성 단편일 수 있다. 다른 실시양태에서, 막 결합 시토카인은 IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 DAF의 융합 폴리펩티드이다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 DAF 신호 서열 (서열 번호: 107의 뉴클레오티드 1-31), 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7 (서열 번호: 107의 뉴클레오티드 32-187), 및 그의 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DNA의 단편 (서열 번호: 107의 뉴클레오티드 188-527)을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물 측면 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 하나 이상의 이종성 외피 단백질을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 슈도타입화 요소는 T 세포에 의해 인식되는 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드, 홍역 바이러스 H 폴리펩티드, 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있다.
생체내 제어 요소를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 림프구 증식성 요소이고, 여기서, 림프구 증식성 요소는 화합물의 부재하에서는 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 촉진시키는 데 있어서 불활성이거나, 또는 더 작은 활성을 띠고, 여기서, 화합물은 림프구 증식성 요소에 결합하고, 림프구 증식성 요소의 활성을 유도하는 분자 샤페론 이다.
생체내 제어 요소를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체에 결합할 수 있고, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물은 뉴클레오시드 유사체이다. 뉴클레오시드 유사체는 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제는 아시클로버(acyclovir) 또는 펜시클로버(penciclovir)일 수 있다.
ASTR을 포함하는 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두의 ASTR은 종양 연관 항원에 결합할 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 제2 조작된 폴리펩티드의 항원 특이적 표적화 영역은 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역이다.
재조합 레트로바이러스 또는 레트로바이러스들을 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 가장 광범위한 측면에서 명백하게 언급되지 않는다면, 재조합 레트로바이러스는 단일클론 항체 승인 생물학적 제제의 인식 도메인을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 도메인은 키메라 항원 수용체와 동일한 전사체 상에서 발현되고, 여기서, 인식 도메인은 리보솜 스키핑 및/또는 절단 신호에 의해 키메라 항원 수용체로부터 분리된다. 리보솜 스키핑 및/또는 절단 신호는 2A-1일 수 있다. 인식 도메인은 EGFR, 또는 그의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 인식 도메인은 본원에서 제공되는 또 다른 제어 기전으로서 EGFR 항체에 의해 인식되고, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 EGFR 돌연변이체일 수 있다. 관련된 실시양태에서, 인식 도메인은 EGFR, 또는 그의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
림프구 증식성 요소를 포함하는, 본원에 제공된 방법 또는 조성물 중 임의의 것에서, 림프구 증식성 요소는 STAT5 경로를 자극시키거나, 또는 SOCS 경로를 억제시키는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 예를 들어, 상기 miRNA 또는 shRNA는 ABCG1, SOCS, TGFbR2, SMAD2, cCBL, 및 PD1로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 핵산에 결합하는 miRNA이다. 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스, 또는 형질도입된 세포, 또는 상기를 포함하는 방법 중 임의의 것에 대한 예시적인 실시양태에서, 상기 재조합 레트로바이러스 또는 형질도입된 세포는 예를 들어, 인트론 내에서, 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 또는 4개의 실시양태에서, 하기 표적 내인성 T 세포 발현 유전자: PD-1; CTLA4; TCR 알파; TCR 베타; CD3 제타; SOCS; SMAD2; miR-155; IFN 감마; cCBL; TRAIL2; PP2A; 또는 ABCG1 중 하나 이상의 것을 코딩하는 핵산에 결합하는 miRNA 또는 shRNA를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 하기 miRNA의 조합이 재조합 레트로바이러스 또는 형질도입된 세포의 게놈 내에 포함될 수 있다: TCR 알파, CD3 제타, IFN 감마, 및 PD-1; 및 또 다른 실시양태에서, SOCS 1, IFN 감마, TCR 알파, 및 CD3 제타.
본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스, 포유동물 세포, 및/또는 패키징 세포는 Vpx 폴리펩티드를 포함할 수 있다. Vpx 폴리펩티드는 예를 들어, 융합 폴리펩티드일 수 있고, 일부 예에서, 특히 패키징 세포에서는 막 결합 Vpx 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질, 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성(amphotropic) 외피 단백질, 또는 온코레트로바이러스 동종지향성(ecotropic) 외피 단백질, 또는 그의 기능성 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a. 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드; 및
b. 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 을 포함하는, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제공한다.
재조합 레트로바이러스 패키징 시스템 측면을 비롯한, 포유동물 패키징 세포를 포함하는, 본원에 제공된 방법, 또는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 중 임의의 것에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 프로모터는 구성적으로 활성을 띠거나, 또는 제1 전사활성인자 또는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있고, 여기서, 상기 프로모터는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다. 본원에서 제1 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현을 구동시키기 위해 사용되는 프로모터는 전형적으로 표적 세포, 예를 들어, 림프구, PBL, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠지만, 예시적인 실시양태에서, 패키징 세포주에서는 활성을 띠지 않는다. 제2 전사활성인자는 표적 세포에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 재조합 레트로바이러스 패키징 시스템 측면을 비롯한, 포유동물 패키징 세포를 포함하는, 본원에 제공된 방법, 또는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 중 임의의 것에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈, 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈의 발현은 제2 전사활성인자에 의해 조절될 수 있다.
추가로, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3' 방향으로:
1.) 5' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편;
2.) 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
3.) 제1 표적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
4.) 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터; 및
5.) 3' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 표적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 패키징 및 어셈블리를 위한 레트로바이러스 성분을 코딩하는 RNA와 역 배향으로 존재한다.
재조합 레트로바이러스 패키징 시스템 측면을 비롯한, 포유동물 패키징 세포를 포함하는, 본원에 제공된 방법, 또는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 중 임의의 것에서, 예를 들어, 제1 표적 폴리펩티드는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소를 포함한다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 제2 표적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제2 표적 폴리펩티드는
1.) 제1 항원 특이적 표적화 영역;
2.) 제1 막횡단 도메인; 및
3.) 제1 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
재조합 레트로바이러스 패키징 시스템 측면을 비롯한, 포유동물 패키징 세포를 포함하는, 본원에 제공된 방법, 또는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 중 임의의 것에서, 예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 패키징 세포는 예를 들어, 제2 또는 임의적 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에, Vpx를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 패키징 세포일 수 있는 포유동물 세포는 293 세포일 수 있다.
재조합 레트로바이러스 패키징 시스템 측면을 비롯한, 포유동물 패키징 세포를 포함하는, 본원에 제공된 방법, 또는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 중 임의의 것에서, 제1 리간드는 라파마이신일 수 있고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신일 수 있거나, 제1 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신일 수 있고, 제2 리간드는 라파마이신일 수 있다.
일부 측면에서, 본원에서는 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스 중 임의의 것이 형질도입된 세포를 제공한다. 세포는 예를 들어, 림프구, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 세포는 예시적인 실시양태에서, 인간 세포이다.
한 측면에서, 본원에서는
a.) 대상체로부터 수득된, 단리된 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를, 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것의 재조합 레트로바이러스와 접촉시키는 단계;
b.) 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계; 및
c.) 유효량의 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭을 상기 대상체에게 제공함으로써 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭 투여시, 상기 대상체에서 증식하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a.) 대상체로부터 수득된, 단리된 정지 T 세포 및/또는 NK 세포를, 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것의 재조합 레트로바이러스와 접촉시키는 단계;
b.) 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계;
c.) 유효량의 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭을 상기 대상체에게 투여하여 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시킴으로써 대상체에서 변형된 PBL을 확장시키는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭 투여시, 상기 대상체에서 증식하는 것인 단계; 및
d.) 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭의 투여를 중단하여 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 확장, 및/또는 지속을 제어하는 것인 단계로서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭의 투여 중단시, 상기 대상체에서 증식을 중단하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장, 생착, 및/또는 지속을 정지시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a. 대상체로부터 수득된, 단리된 정지 T 세포 및/또는 NK 세포를, 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에 따른 재조합 벡터와 접촉시키는 단계;
b. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계; 및
c. 유효량의 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭을 상기 대상체에게 투여하여 대상체에서 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시킴으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계로서, 여기서, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 아시클로버, 아시클로버 프로드럭, 펜시클로버, 또는 펜시클로버 프로드럭 투여시, 상기 대상체에서 증식하고, 상기 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 중의 키메라 항원 수용체는 상기 대상체에서 암 세포에 결합하는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 여기서, 생체내 제어 요소는 생체내에서 화합물에 결합할 수 있고/거나, 결합하도록 디자인되고/거나, 구성된 것인, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 제1 전사활성인자;
B. 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 전사활성인자; 및
C. 레트로바이러스 입자에 대한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함하는 레트로바이러스 패키징 시스템으로서,
여기서, 제1 전사활성인자는 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현을 조절하고, 여기서, 제2 전사활성인자는 gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 및 표적 세포에 결합할 수 있고, 그에의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 슈도타입화 요소의 발현을 조절하고, 여기서, 레트로바이러스 단백질은 레트로바이러스로부터 유래된 것인, 레트로바이러스 패키징 시스템을 제공한다. 본 측면의 실시양태는 다른 측면에서 언급된 요소에 대한 본원에 제공된 실시양태 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 패키징 세포 집단을 배양하여 제1 전사활성인자를 축적시키는 단계로서, 여기서, 패키징 세포는 제1 구성적 프로모터로부터 발현되는 제1 전사활성인자를 포함하고, 여기서, 제1 전사활성인자는 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것이고, 여기서, 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현은 제1 전사활성인자에 의해 조절되는 것인 단계;
B. 축적된 제1 전사활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에서 인큐베이션시켜 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 축적시키는 단계로서, 여기서, 제2 전사활성인자는 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것인 단계; 및
C. 축적된 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에서 인큐베이션시킴으로써 gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 및 하나 이상의 슈도타입화 요소의 발현을 유도하여 재조합 레트로바이러스를 제조하는 단계로서,
여기서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 구성적으로 활성을 띠거나, 또는 제1 전사활성인자 또는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하고, 여기서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 표적 세포에 결합할 수 있고/거나, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 것인, 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 표적 세포에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소를 추가로 포함하고, 제1 전사활성인자는 활성화 요소의 발현을 조절한다. 활성화 요소는 레트로바이러스의 표면 상에 존재하고, 여기서, 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드이고, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD80, CD86, 또는 Akt의 CD28 매개 활성화를 유도할 수 있는 그의 기능성 단편, 예컨대, CD80의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv이고, 여기서, CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드는 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 CD80, 또는 그의 세포외 단편이다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 막 결합 시토카인을 추가로 포함하고, 제1 전사활성인자는 막 결합 시토카인의 발현을 조절한다. 막 결합 시토카인은 예를 들어, IL-7, IL-15, 또는 그의 활성 단편일 수 있다. 실시양태에서, 막 결합 시토카인은 IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 DAF의 융합 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 DAF 신호 서열 및 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7, 이어서, DAF의 잔기 36-525를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 그의 막과 결합된, CD14 GPI 앵커 부착 서열에 결합된 항-CD3 scFv, 및 CD16B GPI 앵커 부착 서열에 결합된 CD80, 또는 그의 세포외 단편을 포함하는 활성화 요소; 및 IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 융합 폴리펩티드를 포함하는 막 결합 시토카인을 포함하고, 여기서, 제1 전사활성인자는 활성화 요소 및 막 결합 시토카인, 각각의 발현을 조절한다. 일부 실시양태에서, IL-7, 또는 그의 활성 단편, 및 DAF 융합물, 항-CD3 scFV, 및 CD80, 또는 그의 세포외 단편은 각각 DAF 신호 서열을 포함한다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 Vpx 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 상기 또는 다른 실시양태에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 T 세포에 의해 인식되는 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드, 홍역 바이러스 H 폴리펩티드, 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체이다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 구성적으로 활성을 띠거나, 또는 제1 전사활성인자 또는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다. 예시적인 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3' 방향으로:
a) 5' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편;
b) 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
c) 제1 표적 폴리펩티드 및 임의적 제2 표적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
d) 제1 표적 폴리펩티드 및 임의적 제2 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 제4 프로모터로서, 상기 제4 프로모터는 표적 세포에서는 활성을 띠지만, 패키징 세포주에서는 활성을 띠지 않는 것인 제4 프로모터; 및
e) 3' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편을 추가로 포함한다.
바로 앞의 구축물을 포함하는, 본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 제3 프로모터는 제4 프로모터로부터 촉진되는 전사 또는 발현과 반대 방향으로 전사 또는 발현을 촉진시킨다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본 개시내용에서 개시된 임의의 실시양태의 재조합 레트로바이러스를 코딩하고, 여기서, 제1 표적 폴리펩티드 및 제2 표적 폴리펩티드는 각각 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 생체내 제어 요소를 추가로 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치이다. 예시적인 실시양태에서, 리보스위치는 화합물에 결합할 수 있고, 생체내 제어 요소가 결합하는 화합물은 뉴클레오시드 유사체이고, 뉴클레오시드 유사체는 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버일 수 있다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 miRNA 또는 shRNA을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인트론을 추가로 포함한다. 인트론은 제4 프로모터 하류에 인접하게 있을 수 있다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 표적 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포일 수 있다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 슈도타입화 요소는 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질, 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 또는 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 또는 그의 기능성 단편을 포함한다.
본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈 크기는 11,000 KB 이하 또는 10,000 KB 이하이다. 본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 제1 표적 폴리펩티드는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소를 포함하고, 제2 표적 폴리펩티드는 CAR을 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함한다.
한 측면에서, 본원에서는
프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 리보스위치를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 리보스위치는
a.) 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합할 수 있고, 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 대비 감소된 결합을 보일 수 있는 압타머 도메인; 및
b.) 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인으로서, 여기서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오시드 유사체의 결합이 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나, 또는 억제시킴으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 것인 기능 스위칭 도메인을 포함하는 것인, 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위한, 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
생체내 제어 요소를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체에 결합할 수 있고, 생체내 제어 요소가 결합하는 화합물은 뉴클레오시드 유사체이다. 뉴클레오시드 유사체는 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제는 아시클로버 또는 펜시클로버일 수 있다. 리보스위치는 펜시클로버보다 아시클로버에 우선적으로 결합할 수 있거나, 또는 아시클로버보다 펜시클로버에 우선적으로 결합할 수 있다. 리보스위치는 37℃, 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 또는 39℃ 초과, 예를 들어, 39℃ 초과인 온도에서 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 대하여 감소된 결합을 보일 수 있다. 리보스위치 길이는 범위의 하단으로 35, 40, 45, 및 50개의 뉴클레오티드 길이 내지 범위의 상단으로 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 리보스위치를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 리보스위치에 의해 조절되는 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 영역을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 림프구 증식성 요소를 코딩할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 영역을 포함할 수 있고, 폴리펩티드는 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있다. 리보스위치를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 기능 스위칭 도메인은 내부 리보솜 진입 부위, 바이러스 유전자 구축물에서의 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현을 조절함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있다. 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보스위치를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 분자 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 리보스위치를 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 게놈 내로, 또는 포유동물 염색체, 또는 그의 단편 내로 통합될 수 있다.
본원에서 제공되는 또 다른 측면은
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 생체외에서 대상체의 혈액으로부터의 T 세포 및/또는 NK 세포를,
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 재조합 레트로바이러스의 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 여기서, 상기 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는 것인 슈도타입화 요소;
ii. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발현되고, T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 추가로, 여기서, 상기 폴리펩티드는 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 것인 상기 두 폴리펩티드; 및
iii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
여기서, 하나 이상의 전사 단위는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고,
여기서, IL-7 수용체 돌연변이체의 발현은 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 여기서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물의 리보스위치에의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시키는 단계로서,
여기서, 상기 접촉으로 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부가 유전적으로 변형되는 것인 단계;
C. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시키는 단계; 및
D. 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 노출시켜 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장을 촉진시킴으로써 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 단계를 포함하고, 여기서, 혈액을 수집하는 단계와 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 재도입시키는 단계 사이의 방법은 24시간 이내에 및/또는 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않으면서 수행되는 것인, 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법이다.
본 방법 측면의 예시적인 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 T 세포를 유전적으로 변형시킨다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 경우에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 추가로 DAF 신호 서열에 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 DAF에 공유적으로 부착된 시토카인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 시토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩티드는 DAF 신호 서열, 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다.
바로 앞의 본 방법 측면의 또 다른 예시적인 실시양태에서, 리보스위치는, 일부 경우에서, 아시클로버 및/또는 펜시클로버인 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에의 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 제어한다. 또 다른 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있다. 일부 경우에서, miRNA 또는 shRNA는 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본원에서 제공되는 또 다른 측면은
A. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 재조합 레트로바이러스의 표면 상의 슈도타입화 요소로서, 여기서, 상기 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는 것인 슈도타입화 요소;
B. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고; 여기서, IL-7 수용체 돌연변이체의 발현은 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 여기서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물의 리보스위치에의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시키는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
C. CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드로서, 여기서, 상기 폴리펩티드는 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발현되고; T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고; 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 것인 상기 두 폴리펩티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스이다.
바로 앞의 재조합 레트로바이러스 측면의 예시적인 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 본 방법의 다른 예시적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 경우에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 추가로 DAF 신호 서열에 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 DAF에 공유적으로 부착된 시토카인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 시토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩티드는 DAF 신호 서열, 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다.
바로 앞의 재조합 레트로바이러스 측면의 또 다른 예시적인 실시양태에서, 리보스위치는, 일부 경우에서, 아시클로버 및/또는 펜시클로버인 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에의 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 제어한다. 또 다른 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있다. miRNA 또는 shRNA는 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본원에서 제공되는 또 다른 측면은
A. 패키징 세포 집단을 배양하여 제1 전사활성인자를 축적시키는 단계로서, 여기서, 패키징 세포는 제1 구성적 프로모터로부터 발현되는 제1 전사활성인자를 포함하고, 여기서, 제1 전사활성인자는 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것이고, 여기서, 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질의 발현은 제1 전사활성인자에 의해 조절되는 것인 단계;
B. 축적된 제1 전사활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에서 인큐베이션시켜 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질, 및 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는, 전형적으로 재조합 레트로바이러스 표면 상의 활성화 요소를 축적시키는 단계로서, 여기서, 제2 전사활성인자는 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것인 단계; 및
C. 축적된 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에서 인큐베이션시킴으로써 gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 및 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소의 발현을 유도하여 재조합 레트로바이러스를 제조하는 단계로서, 여기서, 상기 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는 것인 단계를 포함하고,
여기서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 프로모터는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하고,
여기서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 5'에서 3' 방향으로:
i. 5' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편;
ii. 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열;
iii. 절단 신호에 의해 이격되어 있는, 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열;
iv. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 제4 프로모터; 및
v. 3' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 단편을 포함하고,
여기서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치를 추가로 포함하고, 여기서, 리보스위치에의 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에의 리보스위치의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시키는 것인, 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법이다.
본 방법의 예시적인 실시양태에서, 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에의 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 제어한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물은 아시클로버 및/또는 펜시클로버이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 인식 도메인을 추가로 포함하고, 여기서, 인식 도메인은 EGFR, 또는 그의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 제1 리간드는 라파마이신이고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신이거나, 또는 제1 리간드는 테트라사이클린 또는 독소루비신이고, 제2 리간드는 라파마이신이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 패키징 세포는 제2 또는 임의적 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에, Vpx를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 각각 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다. 일부 경우에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv, 또는 항-CD3 scFv일 수 있고, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 CD80일 수 있다. 항-CD3 scFvFc 또는 항-CD3 scFv 및 CD80은 각각 추가로 DAF 신호 서열에 융합될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, DAF에 공유적으로 부착된 시토카인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 발현 또한 유도된다. 일부 경우에서, 시토카인은 IL-7 또는 IL-15일 수 있고, 융합 폴리펩티드는 DAF 신호 서열, 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7, 및 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF의 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 리보스위치는, 일부 경우에서, 아시클로버 및/또는 펜시클로버인 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에의 리보스위치의 결합에 의해 조절되는 방식으로 키메라 항원 수용체의 발현을 추가로 제어한다. 또 다른 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7은 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있다. miRNA 또는 shRNA는 인트론 내의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제조되는 레트로바이러스는 렌티바이러스이다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
A. 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드; 및
B. 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 림프구를 제공한다.
상기 유전적으로 변형된 림프구 측면의 예시적인 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 특정 실시양태에서, 림프구는 T 세포이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 상기 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치에 의해 조절되고, 여기서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물의 리보스위치에의 결합이 IL-7 수용체 돌연변이체의 발현을 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체는 miRNA 또는 shRNA로 대체될 수 있다. miRNA 또는 shRNA는 인트론 내의 핵산에 의해 추가로 코딩될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a. 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드; 및
b. 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하는, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제공한다.
유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 측면의 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 구성적으로 활성을 띠는 것이고, 일부 경우에서, 이는 구성적으로 활성을 띠는 돌연변이화된 IL-7 수용체 또는 그의 단편이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 생체내 제어 요소에 의해 조절된다. 일부 경우에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체에 결합할 수 있고, 뉴클레오시드 유사체가 존재할 때, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 폴리펩티드가 발현된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 그의 표면 상에 활성화 요소, 슈도타입화 요소, 및/또는 막 결합 시토카인을 가진다. 일부 경우에서, 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 활성화 요소는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 항-CD3 scFv 및/또는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 CD80을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드, 홍역 바이러스 H 폴리펩티드, 및/또는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드 및/또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 막 결합 시토카인은 GPI 앵커 부착 서열을 포함하는 DAF, 또는 그의 단편에 융합된 IL-7, 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
한 측면에서, 본원에서는
A. 전형적으로 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않으면서, 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를,
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소를 포함하고, 임의적으로, 임의적으로 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 세포내 활성화 도메인 및 임의적으로 CAR의 다른 성분을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서,
여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입이 촉진되는 것인 단계;
B. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계; 및
C. 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현에 영향을 미치고, 생체내에서 림프구의 확장, 생착, 및/또는 지속을 촉진시키는 생체내 제어 요소로서 작용하는 화합물에 노출시킴으로써 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 단계를 포함하는, 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법을 제공한다.
예시적인 실시양태에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다. 예시적인 실시양태에서, 화합물은 분자 샤페론, 예컨대, 소형 분자 샤페론이다. 예시적인 실시양태에서, 분자 샤페론의 림프구 증식성 요소에의 결합이 림프구 증식성 요소의 증식 활성을 증가시킨다. 분자 샤페론은 혈액 수집 이전, 접촉 동안에, 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입한 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 화합물이 생체내 제어 요소인 본 측면의 경우, 상기 화합물은 전형적으로 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR의 성분에 결합할 수 있고, 본 방법을 수행하는 동안 상기 림프구 증식성 요소 또는 car 성분에는 결합하지 않는다는 것을 이해할 것이다. T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 본원에 제공된 방법과 관련된 다른 실시양태 및 교시는 또한 분자 샤페론 실시양태를 포함하는 본 측면에 적용된다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a. 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리의 폴리펩티드에 대해 정상적인 생리적 조건하에서 결합 검정법, 및 비정상적인 조건하에서 결합 검정법을 수행하고;
b. 생리적 조건에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서 결합 활성 증가를 보이는 폴리펩티드를 선별함으로써 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리를 패닝하여 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 선별하는 단계를 포함하는, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 선별하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a) 비정상적인 조건하에서 폴리펩티드 라이브러리를, 고체 지지체에 결합된 표적 항원과 접촉시키고, 여기서, 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현하는 클론은 표적 항원을 통해 고체 지지체에 결합된 상태 그대로 남아 있고;
b) 생리적 조건하에서 폴리펩티드가 결합된 고체 지지체를 인큐베이션시키고;
c) 생리적 조건하에서 고체 지지체로부터 용리되는 클론을 수집함으로써 폴리펩티드 라이브러리를 패닝하여 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 단리시키는 단계를 포함하는, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 단리시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a) 폴리펩티드 라이브러리를 패닝함으로써 선별되고, 정상적인 생리적 조건에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서의 결합 검정법에서 활성 증가를 보이는 적어도 하나의 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막횡단 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a) 정상적인 생리적 환경에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서 표적 항원에의 결합 증가를 보이는 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역으로서, 여기서, 항원 특이적 표적화 영역은 표적에 결합하는 것인 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막횡단 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체를 제공한다.
미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR)을 포함하는, 본원에 제공된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, ASTR은 정상적인 조건에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서의 검정법에서 표적 항원에의 결합 친화도가 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 증가를 보일 수 있다. 비정상적인 조건은 저산소, 산성 pH, 더 높은 고농도의 락트산, 더 높은 고농도의 히알루로난, 더 높은 고농도의 알부민, 더 높은 고농도의 아데노신, 더 높은 고농도의 R-2-히드록시글루타레이트, 더 높은 고농도의 PAD 효소, 더 높은 고압, 더 높은 산화, 및 더 낮은 영양 유용성일 수 있다. 미세환경 제한 ASTR은 pH 7.4에서의 것과 비교하여 pH 6.7에서 항원 결합 증가를 보일 수 있다. 미세환경 제한 ASTR은 상응하는 생리적 조건과 비교하여 종양 환경에서 및/또는 시험관내 종양 대용물 검정 조건에서 항원 결합 증가를 보일 수 있다. 표적은 4-1BB, ST4, 선암종 항원, 알파-태아단백질, AXL, BAFF, B-림프종 세포, C242 항원, CA-125, 카보닉 안히드라제 9 (CA-IX), C-MET, CCR4, CD 152, CD 19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DRS, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 엑스트라도메인-B, 폴레이트 수용체 1, GD2, GD3 강글리오시드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, L1-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 nSP1, 인테그린 nvP3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N글리코릴뉴라민산, NPC-1C, PDGF-R a, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, ROR2 SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타 2, TGF-P, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16. 88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 및 비멘틴일 수 있다. ASTR은 항체, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 애피바디(affibody)일 수 있다. ASTR은 전장 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디일 수 있다. ASTR은 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일 쇄 가변 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 일커에 의해 이격되어 있을 수 있고, 여기서, 링커 길이는 6 내지 100개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 키메라 항원 수용체 상에서 경쇄에 대하여 N 말단에 위치해 있을 수 있고, 일부 실시양태에서, 경쇄는 키메라 항원 수용체 상에서 중쇄에 대하여 N 말단에 위치해 있을 수 있다.
폴리펩티드 디스플레이 라이브러리를 포함하는, 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 효모 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리는 항체 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 항체 디스플레이 라이브러리는 인간 또는 인간화 항체 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 항체 디스플레이 라이브러리는 나이브 라이브러리일 수 있다. 본 방법은 박테리아 세포를 수집된 파지로 감염시켜 정제된 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 단계, 및 이전 사이클로부터 생성된 정제된 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 1 내지 1,000회 사이클 동안 접촉, 인큐베이션 및 수집을 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
미세환경 제한 ASTR을 단리시키거나, 또는 선별하는 것을 포함하는, 본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 본 방법은 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 미세환경 제한 ASTR의 폴리펩티드 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 미세환경 제한 ASTR, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 미세환경 제한 생물학적 제제 키메라 항원 수용체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 라이브러리는 단일 쇄 항체 라이브러리일 수 있다.
미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝을 1 내지 1,000회 동안 반복하는 것을 포함할 수 있다. 미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝 라운드 사이에 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이화시키지 않고 수행될 수 있다. 미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝 라운드 사이에 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 유기체를 배양, 고성능 방식으로 증폭, 및/또는 희석시킴으로써 수행될 수 있다. 본 방법은 반복 이전에, 선별 및/또는 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 돌연변이화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 1회 이상의 패닝 라운드 이후에 긴 리드 DNA 서열분석을 통해, 선별 및/또는 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역, 및/또는 상기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 단리된 미세환경 제한 ASTR의 확장 이전 및 이후에 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법은 패닝을 반복하지 않고 수행될 수 있다. 미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법은 미세환경 제한 ASTR 단리 이후에, 단리된 미세환경 제한 ASTR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이화시키지 않고 수행될 수 있다.
미세환경 제한 ASTR을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는, 본원에 제공된 조성물 중 임의의 것의 예시적인 실시양태에서, 미세환경 제한 ASTR은 항체 라이브러리를 패닝함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세환경 제한 ASTR은 파지 디스플레이 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 패닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 이중특이적 ASTR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 여기서, 생체내 제어 요소는 생체내에서 화합물에 결합할 수 있거나, 생체내에서 화합물에 결합하도록 구성된 것인, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 여기서, 생체내 제어 요소는 생체내에서 화합물에 결합할 수 있거나, 생체내에서 화합물에 결합하도록 구성된 것인, 재조합 레트로바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 형질도입 조건하에서 T 세포 및/또는 NK 세포를, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체를 포함하고, 여기서, 생체내 제어 요소는 생체내에서 화합물에 결합할 수 있는 것인 단계를 포함하는, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 방법을 제공한다.
상기 단락에서 제공된, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포 측면, 재조합 레트로바이러스 측면, 및 방법 측면의 예시적인 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 전사 단위를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 돌연변이화된 IL-7 수용체 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체에 결합할 수 있고, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물은 뉴클레오시드 유사체이다. 일부 경우에서, 뉴클레오시드 유사체는 항바이러스제, 예컨대, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버이다. 특정 실시양태에서, 항바이러스제는 아시클로버이다. 다른 예시적인 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체는 EGFR, 또는 그의 에피토프에 융합된 것이다. 다른 예시적인 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체는 eTag를 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체는 PPCL 삽입을 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7 수용체 돌연변이체는 야생형 인간 IL-8 수용체에서 243번 위치와 등가인 위치에 PPCL 삽입을 포함한다. 다른 예시적인 실시양태에서, 형질도입된 T 세포 또는 NK 세포는 형질도입된 T 세포이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 패키징 세포 (100), 및 패키징 세포 (100)에 의해 제조된 재조합 레트로바이러스 (200)를 비롯한 예시적인 조성물의 개략도를 보여주는 것이다. 도 1에서, 본 발명의 측면을 코딩할 수 있는 다양한 벡터 (재조합 폴리뉴클레오티드 (110)로 지칭)는, 그의 게놈 내에 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체, 또는 CAR인 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스 (200) 내로 패키징된다. 재조합 레트로바이러스는 그의 막 상에, 레트로바이러스가 표적 세포에 결합할 수 있고, 그와 융합할 수 있도록 허용하는 슈도타입화 요소 (비제한적인 실시양태에서, 홍역 바이러스 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실 변이체) (240); 휴지기 T 세포에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소 (비제한적인 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 가지는 활성화 요소) (각각 (210) 및 (220)); 및 막 결합 시토카인 (비제한적인 실시양태에서, 및 IL-7 DAF 융합 폴리펩티드) (230)을 발현한다. (250), (260), (270), (280), 및 (290)으로 표지화된 파트는 각각 Src-FLAG-Vpx, HIV gag 매트릭스, HIV gag 캡시드, RNA, 및 HIV pol이다.
도 2는 패키징 세포에 의해 제조된 재조합 레트로바이러스 (200) 및 재조합 레트로바이러스 (200)에 의해 형질감염된 휴지기 T 세포 (300)를 비롯한 예시적인 조성물의 개략도를 보여주는 것이다. 레트로바이러스 표면 상의 요소는 휴지기 T 세포 표면 상의 수용체 및/또는 리간드에 결합한다. 슈도타입화 요소는 레트로바이러스의 T 세포에의 결합 및 융합을 촉진시키는 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드 (비제한적인 실시양태에서, 홍역 바이러스 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩티드), 또는 그의 세포질 도메인 결실 변이체)를 포함할 수 있다. 비제한적인 실시양태에서, 레트로바이러스는 그의 표면 상에, T 세포 수용체 복합체 및 임의적으로 공동 수용체 (320)를 체결시켜 휴지기 T 세포를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소 (비제한적인 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 가지는 활성화 요소)를 포함한다. 추가로, 레트로바이러스 표면 상에 존재하는 막 결합 시토카인 (비제한적인 실시양태에서, IL-7 DAF 융합 폴리펩티드)은 휴지기 T 세포 표면 상의 IL-7Rα (310)에 결합한다. 레트로바이러스는 T 세포와 융합하고, 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 (예시적인 실시양태에서, 구성적으로 활성을 띠는 IL-7Rα) (370)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 핵으로 이동하여 활성화된 T 세포의 DNA 내로 도입되기 이전에 세포질에서 역전사된다. 일부 실시양태에서, 바이러스와 함께 패키징되는 Src-FLAG-Vpx (250)는 휴지기 T 세포의 세포질로 진입하여 SAMHD1 (350)의 분해를 촉진시킴으로써 역전사에 이용가능한 세포질 dNTP의 풀을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 또한 CAR을 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드 (360)를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 화합물이 그의 발현을 조절하는 생체내 제어 요소에 결합하였을 때 발현된다 (비제한적인 예에서, 생체내 제어 요소는 뉴클레오시드 유사체에 결합하는 리보스위치이다). 일부 실시양태에서, CAR의 발현은 또한 생체내 제어 요소에 의해 조절된다. 파트 (330)은 SLAM 및 CD46이다. 파트 (340)은 CD3이다.
도 3a-3e는 벡터 시스템의 개략도를 보여주는 것이다. 도 3a는 구성적으로 발현되는, NFκB p65 활성인자 도메인 (p65 AD)에 융합된 FRB 도메인, 및 3개의 FKBP 반복부에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 3a의 구축물은 또한 라파마이신 유도가능한 ZFHD1/p65 AD 프로모터하에 HIV1 REV 및 SrcFlagVpx 융합물로서 Vpx도 포함한다. 도 3b는 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에 rtTA 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 3c는 loxP 부위 측면에 위치하는 퓨로마이신 내성 유전자 및 lox2272 부위 측면에 위치하는 세포외 MYC 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 두 선별가능한 마커 모두 FRT 부위 측면에 위치하는 BiTRE 프로모터의 제어하에 있다. 도 3d는 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 및 TRE 프로모터와 5' RFP 사이의 단일 FRT 부위 측면에 위치하는 RFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 3e는 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 및 TRE 프로모터와 5' GFP 사이의 단일 FRT 부위 측면에 위치하는 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 3c-3e의 구축물은 패키징 세포주의 게놈 내로 삽입시키기 위한 다른 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 랜딩 패드로서의 기능을 한다.
도 4a-4c는 구축물의 개략도를 보여주는 것이다. 도 4a는 CD14 GPI 앵커 부착 부위, CD28을 CD16B GPI 앵커 부착 부위와 결합시킬 수 있는 CD80 세포외 도메인 (ECD), 및 HEK293S 게놈 내로의 통합을 위한 폴리뉴클레오티드 영역 측면에 위치하는 트랜스포존 서열과 함께 분해-가속 인자 (DAF)에 융합된 IL-7과 함께 항-CD3 (클론 UCHT1) scFvFc를 코딩하는 트리시스트로닉 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 4b는 BiTRE 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 한 방향으로 gag 및 pol 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역 및 다른 방향으로 홍역 바이러스 FΔx 및 HΔy 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 함유하는 구축물을 보여주는 것이다. 도 4c는 HEK293S 세포에서는 활성을 띠지 않는 CD3Z 프로모터의 제어하에 있는 CAR 및 림프구 증식성 요소 IL7Rα-insPPCL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 구축물을 보여주는 것으로서, 여기서, CAR 및 IL7Rα-insPPCL은 T2A 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 이격되어 있고, IL7Rα-insPPCL은 아시클로버 리보스위치 제어식 리보자임을 가진다. CAR 함유 구축물은 cPPT/CTS, RRE 서열, 및 HIV-1 Psi (ψ)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 게놈 내로 통합되는 CAR 함유 구축물 상의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 FRT 부위 측면에 위치한다.
도 5a-5c는 선택적 리보스위치 제어를 위한 대표 뉴클레오시드 유사체로서 아시클로버 (도 5a), 펜시클로버 (도 5b), 및 2'-데옥시구아노신 (도 5c)의 분자 구조를 보여주는 것이다.
도 6은 메조플라스마 플로럼(Mesoplasma florum) 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 조절 영역 및 연관된 유전자 생성물을 나타내는 것이다. 서열은 M. 플로럼 W37 게놈 DNA (CP006778.1) nt636277 내지 nt 637550과 동일한 M. 플로럼(M. florum) L1 게놈 DNA (AE017263.1) nt624396 내지 nt625670의 역 상보체이다. 초기 스크린에 사용된 데옥시구아노신 결합 압타머 서열은 굵은 밑줄체로 표시되어 있다. 하류 유전자 생성물 (부류 Ib (호기성)의 리보뉴클레오티드 리덕타제, 베타 서브유니트)은 대문자로 표시되어 있다.
도 7은 유도 진화 전략법을 위해 표적화된 M. 플로럼 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 영역을 나타내는 것이다. 빈 타원형 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 무작위화를 위해 표적화되었다. 줄무늬 타원형 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화되었다.
도 8a 및 8b는 M. 플로럼 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 스크리닝 라이브러리를 나타내는 것이다. 도 8a에서, 실선 박스 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이고, 파선 박스 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이다. 도 8b는 돌연변이 ("무작위 뉴클레오티드 ("N")) 및 결실/삽입을 통해 생성될 가능성이 있는 서열을 보여주는 것이다.
도 9는 라이브러리 스크리닝을 위한, PCR 증폭, 및 시험관내 전사를 위한 T7 프로모터 부가를 허용하기 위해 추가의 염기쌍이 부가된, 역 상보체로서 합성된 M. 플로럼 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치 압타머 올리고 라이브러리를 나타내는 것이다. 상응하는 T7 프로모터 증폭 프라이머 및 역 증폭 프라이머 또한 제시되어 있다.
도 10은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 구아노신 xpt 리보스위치 조절 영역 및 연관된 유전자 생성물을 나타내는 것이다. 서열은 B. 섭틸리스 아종. 섭틸리스(B. subtilis subsp. subtilis) 6051-HGW 게놈 DNA (CP003329.1) nt2319439 내지 nt2320353의 역 상보체. 초기 스크린에 사용된 구아노신 결합 압타머 서열은 굵은 밑줄체로 표시되어 있다. 하류 유전자 생성물 (크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 xpt)은 대문자로 표시되어 있다.
도 11은 유도 진화 전략법을 위해 표적화된 B. 섭틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 영역을 나타내는 것이다. 빈 타원형 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 무작위화를 위해 표적화되었다. 줄무늬 타원형 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화되었다.
도 12a 및 12b는 B. 섭틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 스크리닝 라이브러리를 나타내는 것이다. 도 12a에서, 실선 박스 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이고, 파선 박스 표시 내에 있는 뉴클레오티드는 삽입/결실 및 무작위화를 위해 표적화된 서열 영역이다. 도 12b는 돌연변이 ("무작위 뉴클레오티드 ("N")) 및 결실/삽입을 통해 생성될 가능성이 있는 서열을 보여주는 것이다.
도 13은 라이브러리 스크리닝을 위한, PCR 증폭, 및 시험관내 전사를 위한 T7 프로모터 부가를 허용하기 위해 추가의 염기쌍이 부가된, 역 상보체로서 합성된 B. 섭틸리스 구아노신 xpt 리보스위치 압타머 올리고 라이브러리를 나타내는 것이다. 상응하는 T7 프로모터 증폭 프라이머 및 역 증폭 프라이머 또한 제시되어 있다.
도 14는 선별 라이브러리 구축을 보여주는 것이다. 공지된 구아노신- 및 데옥시구아노신-결합 RNA에 기초하여 라이브러리를 구축하였다 (문헌 [Pikovskaya, 2013]).
도 15는 산화그래핀 (GrO) 압타머 선별을 도시한 것을 보여주는 것이다. 단계 (1)에서, RNA를 전사시키고, 정제하였다. 단계 (2)에서, 정제된 RNA를 용리시켰다. 단계 (3)에서, 압타머를 카운터-표적 및 완충제와 함께 인큐베이션시켰다. 단계 (4)에서, 카운터-표적 또는 완충제 성분에 결합된 서열을 산화그래핀으로 제거하였다. 단계 (5)에서, 원심분리하여 상청액 내의 비특이적 반응성 종을 구분하여 나누었고, 이어서, 이를 폐기한다. 2회에 걸친 추가의 5분 세척을 통해 잔류 카운터-표적 결합 및 완충제 결합 서열 대부분을 제거하였다. 단계 (6)에서, 양성 선별을 위해 1X 선별 완충제 중 아시클로버 용액을 GrO 결합 라이브러리에 첨가하였고, 이로써, 잠재적인 압타머 서열은 양성 표적과의 상호작용을 통해 GrO로부터 탈착된다. 단계 (7)에서, 최종 원심분리 단계는 상청액 중의 표적 결합 서열을, GrO에 여전히 흡착되어 있는 비반응성 서열로부터 분리시킨다. 단계 (8)에서, 선별된 서열을 역전사시킨 후, PCR을 통해 라이브러리를 증폭시킨 후, 전사시켜 다음 선별 라운드를 위한 라이브러리를 생성하였다.
도 16은 산화그래핀 동시 사정을 도시한 것을 보여주는 것이다. 동시 사정되는 농축된 라이브러리를 같은 분량 4개로 나누었다. 이어서, 라이브러리 샘플을 산화그래핀에 첨가하고, 인큐베이션시켜 산화그래핀 상의 라이브러리에 로딩시켰다. 2회에 걸친 5분 세척을 통해 비결합 물질을 제거하였다. 양성 (아시클로버) 및 특수 표적 (펜시클로버) 샘플을 위해, 각 표적을 별개로 1X 선별 완충제 중에서 1 μM로 제조하였고; 카운터 표적의 경우, 양성 표적을 10 μM의, 용액 중의 각 카운터-표적으로 대체하였고; 음성 샘플은 양성 표적을 동일한 부피의 뉴클레아제 무함유 물로 대체하였다. 이어서, 샘플을 그의 각 산화그래핀 제제와 조합하고, 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리하여 그의 상청액을 회수하고, 나노드롭-1000(NanoDrop-1000) 분광광도계 판독 (써모 피셔 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴)에 의해 라이브러리 회수를 측정하였다. 남은 라이브러리 샘플을 변성 PAGE 상에서 분석하였다. Gel-Star로 염색/탈색시킨 후, 겔의 영상을 촬영하였다. 음성, 카운터, 및 특수 표적 샘플의 사전 로딩 인큐베이션을 위해 양성 표적 아시클로버를 카운터-표적으로 대체하면서, 동시 사정의 후속 라운드를 위해 예상된 라이브러리 크기에 상응하는 밴드를 회수하였다.
도 17은 아시클로버에 대한 7개의 압타머 후보물질을 보여주는 것이다. 각 압타머에 대한 자유 에너지를 퀵폴드(Quikfold) 3.0 (주커(Zuker) 2003)에 의해 37℃ 및 1 M Na+에서 컴퓨팅하였다. 사유 알고리즘을 사용하여 서열을 확인하였다. 각 서열에서 밑줄로 표시된 영역은 PCR 프라이머 어닐링 영역이다.
도 18은 펜시클로버에 대한 7개의 압타머 후보물질을 보여주는 것이다. 각 압타머에 대한 자유 에너지를 퀵폴드 3.0 (주커 2003)에 의해 37℃ 및 1 M Na+에서 컴퓨팅하였다. 사유 알고리즘을 사용하여 서열을 확인하였다. 각 서열에서 밑줄로 표시된 영역은 PCR 프라이머 어닐링 영역이다.
도 19a는 PBMC에서 발현되었을 때의 림프구 증식성/생존 활성에 대하여 시험된 IL7Rα 변이체의 개략도를 제공하는 것이다. 도 19b는 IL-2의 존재 및 부재하에서의 PBMC의 생존율(%)을 보여주는 막대 그래프를 제공하는 것이다.
도 20은 VSV-G 또는 말단절단된 버전의 MV(Ed) F 및 H 폴리펩티드로 슈도타입화된 렌티바이러스를 사용하여 형질도입된 음성적으로 선별된 및 비자극 T 세포에 대한 MOI 대비 형질도입율의 플롯을 보여주는 것이다. 기호는 명료성 향상을 위해 엇갈리게 배열되어 있다.
도 21은 EF-1알파 프로모터 인트론 중에 있는 CD3제타를 표적화하는 miRNA가 CD3 복합체의 발현을 넉다운시킬 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다.
정의
본원에서 사용되는 바, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CAR들"이라는 용어는 항원 특이성을 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 및 줄시 세포 상에 접목시킨, 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR은 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR) 및 세포내 활성화 도메인 (IAD)을 포함하고, 스토크, 막횡단 도메인 (TM), 및 하나 이상의 공동자극성 도메인 (CSD)을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CAR은 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적인, 이중특이적 CAR이다. ASTR이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, IAD는 세포내 신호전달을 활성화시킨다. 예를 들어, IAD는 항체의 항원 결합 특성을 이용하여, 비MHC-제한 방식으로, 선택된 표적에 대한 T 세포 특이성 및 반응성을 재유도할 수 있다. 비-MHC-제한 항원 인식은 항원 프로세싱과 상관없이 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원을 인식할 수 있는 능력을 제공하며, 이로써, 중요한 종용 회피 기전을 우회할 수 있다. 또한 T 세포에서 발현되었을 때, CAR은 이롭게는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체를 형성하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "미세환경"이라는 용어는 조직의 다른 부위, 또는 신체 다른 부위와 지속적인 또는 일시적인, 물리적 또는 화학적 차이를 보이는 조직 또는 신체의 임의 부분 또는 부위를 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바, "종양 미세환경"은 종양이 존재하는 환경으로, 이는 종양 내의 비세포 부위이지만, 종양성 조직 바로 밖에 있는 부위는 암 세포 그 자체의 세포내 구획과는 관련이 없다. 종양 미세환경은 악성 돌기가 생존 및/또는 확장 및/또는 퍼지는 구조적 및/또는 기능적 환경을 형성하는 조건을 비롯한, 종양 환경의 임의의 모든 조건을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 종양 미세환경은 조건, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질 농도, 글루코스 농도, 히알루로난 농도, 락트산 또는 락테이트 농도, 알부민 농도, 아데노신 수준, R-2-히드록시글루타레이트 수준, 피루베이트 농도, 산소 농도, 및/또는 산화제, 환원제 또는 보조 인자의 존재 뿐만 아니라, 당업자가 이해하는 다른 조건과 같은 조건의 변경을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 임의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 무손상 항체, 및 항원에의 특이적 결합을 보유하는, 항체의 단편을 비롯한, 다중클론 및 단일클론 항체를 포함한다. 항체 단편은 제한하는 것은 아니지만, 단편 항원 결합 (Fab) 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, Fab'-SH 단편, (Fab')2 Fv 단편, Fd 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일 쇄 가변 단편 (scFv), 2가 scFv, 3가 scFv를 비롯한, 단일 쇄 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 단편 (예컨대, sdAb, sdFv, 나노바디)일 수 있다. 본 용어는 면역글로불린의 유전적으로 조작된 및/또는 다르게 변형된 형태, 예컨대, 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 항체의 항원 특이적 표적화 영역 및 비항체 단백질을 포함하는 융합 단백질, 이종접합체 항체, 다중특이적, 예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 및 탠덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, "항체"라는 용어는 그의 기능성 항체 단편을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 본 용어는 또한 임의 부류 또는 서브부류의 항체 (IgG 및 그의 서브부류, IgM, IgE, IgA, 및 IgD 포함)를 비롯한, 무손상 또는 전장 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "항체 단편"이라는 용어는 무손상 항체의 일부분, 예를 들어, 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]); 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 항체의 파파인 분해를 통해, 각각 단일 항원 결합 부위를 포함하는, "Fab" 단편으로 명명되는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 쉽게 결정화될 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fe" 단편이 생성된다. 펩신 처리를 통해 2개의 항원 조합 부위를 가지고, 여전히 항원과 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바, "단일 쇄 Fv," "scFv," 또는 "sFv" 항체 단편은, 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 것인 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는, sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 링커 또는 스페이서를 VH와 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. sFv에 관한 리뷰를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "자연적으로 발생된" VH 및 VL 도메인이란, 예컨대, 미국 특허 8709755 B2 및 출원 WO/2016/033331A1에 개시된 것과 같은, 특이적 조건하에서 scFv 포맷으로 생성되었을 때, 그의 친화도를 변화시키기 위한 추가의 분자적 진화 없이 숙주로부터 단리된, VH 및 VL 도메인을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "친화도"라는 용어는 두 작용제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며, 이는 해리 상수 (Kd)로 표현된다. 친화도는 비관련 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 적어도 1배 더 크거나, 적어도 2배 더 크거나, 적어도 3배 더 크거나, 적어도 4배 더 크거나, 적어도 5배 더 크거나, 적어도 6배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 8배 더 크거나, 적어도 9배 더 크거나, 적어도 10배 더 크거나, 적어도 20배 더 크거나, 적어도 30배 더 크거나, 적어도 40배 더 크거나, 적어도 50배 더 크거나, 적어도 60배 더 크거나, 적어도 70배 더 크거나, 적어도 80배 더 크거나, 적어도 90배 더 크거나, 적어도 100배 더 크거나, 또는 적어도 1000배 더 크거나, 또는 그 초과로 더 클 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화도는 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 이상일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "결합도"라는 용어는 2개 이상의 작용제로 이루어진 복합체의 희석 후 해리에 대한 저항력을 지칭한다. "면역반응성" 및 "우선적으로 결합한다"라는 용어는 항체 및/또는 항원 결합 단편과 관련하여 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "결합"이라는 용어는 예를 들어, 공유, 정전기적, 소수성, 및 이온 및/또는 수소 결합 상호작용 (상호작용, 예컨대, 염 브릿지 및 워터 브릿지 포함)에 기인한, 두 분자 사이의 직접적인 회합을 지칭한다. 비특이적인 결합이란, 약 10-7 M 미만의 친화도로, 결합하는 것, 예컨대, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 등의 친화도로 결합하는 것을 지칭할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "세포 표면 발현 시스템" 또는 "세포 표면 디스플레이 시스템"이라고 언급한 것은 세포의 표면 상의 단밸질 또는 그의 일부의 디스플레이 또는 발현을 지칭한다. 전형적으로, 세포는 세포 표면 단백질에 융합된 관심 단백질을 발현하는 세포가 생성된다. 예를 들어, 단백질은 막횡단 도메인과의 융합 단백질로서 발현된다.
본원에서 사용되는 바, "요소"라는 용어는 폴리펩티드의 융합물, 폴리펩티드의 영역, 및 그의 기능적 돌연변이체 또는 단편을 비롯한, 폴리펩티드, 및 마이크로RNA 및 shRNA, 및 그의 기능적 돌연변이체 또는 단편을 비롯한, 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "영역"이라는 용어는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 임의의 세그먼트이다.
본원에서 사용되는 바, "도메인"은 기능적 및/또는 구조적 특성을 가진 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 영역이다.
본원에서 사용되는 바, "스토크" 또는 "스토크 도메인"이라는 용어는 구조적 가요성을 제공하고, 측면 폴리펩티드 영역에 간격을 두는, 가용성 폴리펩티드 연결자 영역을 지칭하고, 이는 천연 또는 합성 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 스토크는 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230에 펼쳐져 있는 것으로 정의되는 면역글로불린 (예컨대, IgG1)의 힌지 또는 힌지 영역으로부터 유래될 수 있다 (문헌 [Burton (1985) Molec . Immunol ., 22:161-206]). 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 동일 위치에서 중쇄간 이황화 (S-S) 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다. 스토크는 미국 특허 번호 5,677,425에 개시된 바와 같이, 천연적으로 발생된 것, 또는 변경된 힌지 영역을 포함하나, 이에 제한되지 않는 비천연적으로 발생된 것일 수 있다. 스토크는 임의 부류 또는 서브부류의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 스토크는 또한 CD8, CD28, 또는 가요성을 제공하고, 측면 영역에 간격을 두는 데 있어 유사한 기능을 제공하는 다른 수용체로부터 유래된 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 물질이 그의 원래의 환경 (예컨대, 물질이 자연적으로 발생된 것이라면, 자연 환경)으로부터 제거된 것임을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 중에 존재하는 자연적으로 발생된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 공존 물질 중 일부 또는 그 모두로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부일 수 있고/거나, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일 수 있고, 상기 벡터 또는 조성물은 그의 천연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 상태일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 단일 쇄이다. 폴리펩티드는 고정된 구조로 폴딩되지 않거나, 어떤 번역후 변형을 가지지 않는다. "단백질"은 고정된 구조로 폴딩된 폴리펩티드이다. "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 환경의 오염 성분, 예컨대, 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질, 예컨대, 예를 들어, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 제거하기 위해 "정제"될 수 있다. 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 바, 항체 중량의 90% 초과, 95%, 또는 98% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석장치의 사용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색 사용시 환원 또는 비환원 조건하에서 소듐 도세실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 균질한 정도까지 정제될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역 세포"라는 용어는 일반적으로 골수에서 생산된 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 유래된 백혈구(white blood cell) (백혈구(leukocyte))를 포함한다. "면역 세포"는 예컨대, 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포) 및 골수양 유래 세포 (호중구, 호산구, 호염구, 단핵구, 대식세포, 수지장 세포)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T 세포 (CD8+ 세포), T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 비롯한, CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "세포독성 세포"는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 세포인 CD8+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NK-T 세포, γδ T 세포, CD4+ 세포의 서브집단, 및 호중구를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "줄기 세포"라는 용어는 일반적으로 만능성 또는 다능성 줄기 세포를 포함한다. "줄기 세포"로는 예컨대, 배아 줄기 세포 (ES); 중간엽 줄기 세포 (MSC); 유도 만능성 줄기 세포 (iPS); 및 수임 전구 세포 (조혈 줄기 세포 (HSC); 골수 유래 세포 등)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "치료," "치료하는"이라는 용어 등은 원하는 약리적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적인 것일 수 있고/거나, 질환 및/또는 질환의 원인이 될 수 있는 유해한 효과를 부분적 또는 완전히 치유한다는 점에서 치료적인 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료"는 포유동물, 예컨대, 인간에서의 질환의 임의 치료를 포함하고; (a) 질환에 취약할 수 있지만, 질환에 걸린 것으로 진단을 받은 것은 아닌 대상체에서 질환이 발생하지 않게 예방하는 것; (b) 질환을 억제시키는 것, 즉, 그의 발병을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환을 퇴행시키는 것을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바, "개체," "대상체," "숙주," 및 "환자"라는 용어는 인간, 뮤린 (예컨대, 래트, 마우스), 토끼목 (예컨대, 토끼), 비인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류 (예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등을 비롯한 포유동물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량" 또는 "효과적인 양"이라는 용어는, 질환 치료를 위해 포유동물 또는 다른 대상체에게 투여되었을 때, 질환을 치료하는 데 충분한, 한 작용제의 양, 또는 두 작용제의 조합된 양을 지칭한다. "치료학상 유효량"은 작용제(들), 질환 및 그의 중증도 및 치료하고자 하는 대상체의 연령, 체중 등에 의존하여 달라질 것이다.
본원에서 사용되는 바, "진화" 또는 "진화하는"이라는 용어는 그 자체가 개선된 생물 분자이고/거나, 또 다른 개선된 생물 분자 생성에 기여하는 것인 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 하나 이상의 돌연변이유발 방법을 사용하는 것을 지칭한다. "생리적" 또는 "정상" 또는 "정상적인 생리적" 조건은 조건, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 하나 이상의 용질의 농도, 전해질 농도, 글루코스 농도, 히알루로난 농도, 락트산 또는 락테이트 농도, 알부민 농도, 아데노신 수준, R-2-히드록시글루타레이트 수준, 피루베이트 농도, 산소 농도, 및/또는 산화제, 환원제 또는 보조 인자의 존재 뿐만 아니라, 대상체에게로의 투여 부위에서, 또는 대상체에게로의 작용 부위의 조직 또는 기관에서 정상 범위 내에 있을 것으로 간주되는 다른 조건과 같은 조건이다.
본원에서 사용되는 바, "유전적으로 변형된 세포"는 외인성 핵산이 세포의 게놈 내로 통합되는지 여부와 상관없이 외인성 핵산을 함유하는 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"는 단백질 분자의 일부 또는 그 전체 뿐만 아니라, 임의의 번역 후 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 슈도타입화 요소는 표적 숙주 세포를 확인하고, 그에 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드, 전형적으로, 당단백질을 포함하는 "결합 폴리펩티드," 및 레트로바이러스 및 표적 숙주 세포 막의 융합을 매개하여 레트로바이러스 게놈이 표적 숙주 세포 내로 진입할 수 있게 허용하는 하나 이상의 "융합유도 폴리펩티드"를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "결합 폴리펩티드"는 또한 "T 세포 및/또는 NK 세포 결합 폴리펩티드" 또는 "표적 체결 요소"로서 지칭될 수 있고, "융합유도 폴리펩티드"는 또한 "융합유도 요소"로서 지칭될 수 있다.
"휴지기" 림프구, 예컨대, 예를 들어, 휴지기 T 세포는 활성화 마커, 예컨대, Ki-67을 발현하지 않는, 세포 주기 중 G0 기에 있는 림프구이다. 휴지기 림프구는 특이적 항원과 조우한 적이 없는 나이브 T 세포, 및 이전의 항원과의 조우에 의해 변경된 기억 T 세포를 포함할 수 있다. "휴지기" 림프구는 또한 "정지" 림프구로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "림프구고갈"은 예를 들어, 림프구고갈제를 투여하여 대상체에서 림프구의 개수를 감소시키는 방법을 포함한다. 림프구고갈은 또한 신체 일부 또는 전시 분할 방사선 조사 요법에 의해 달성될 수 있다. 림프구고갈제는 포유동물에게 투여되었을 때, 포유동물에서 기능성 림프구의 개수를 감소시킬 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물일 수 있다. 상기 작용제의 한 예는 하나 이상의 화학요법제이다. 상기 작용제 및 투여량은 공지되어 있고, 치료하고자 하는 대상체에 따라 주치의에 의해 선택될 수 있다. 림프구고갈제의 예로는 플루다라빈, 사이클로포스파미드, 클라드리빈, 데닐류킨 디피톡스, 또는 그의 조합을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
본원에서 제공된 본 개시내용 및 측면 및 실시양태는 개시된 특정 예로 제한되지 않으며, 따라서, 이는 당연히 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 예 및 실시양태를 개시하기 위한 것이고, 본 개시내용의 범주는 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 바, 이에 상기 용어는 제한적인 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
값이 범위로 제공되는 경우, 문맥상 달리 명백하게 언급되지 않는다면, 각각의 그 사이의 중간 값은 상기 범위의 상한 및 하한 및 언급된 범위 중의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값 사이의 하한 단위의 1/10까지 본 개시내용에 포함된다는 것을 이해한다. 언급된 범위 중에서 한계가 구체적으로 배제되지 않는다면, 상기 더 작은 범위의 상한 및 하한이 독립적으로 작은 범위에 포함될 수 있고, 이 또한 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 그 둘 모두를 배제시키는 범위 또한 본 발명에 포함된다. 범위에 대하여 다수의 낮은 값 및 다수의 높은 값이 제공될 때, 당업자는 선택된 범위는 높은 값보다 작은 낮은 값을 포함할 것이다. 본 명세서에서 표제들은 모두 판독자의 편의를 위한 것이며, 제한하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가가가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기술한다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 상기 공개문헌이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고, 기술하기 위해 본원에서 참조로 포함된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, 단수 형태 "하나"("a," "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 명백하게 언급되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다는 점에 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "키메라 항원 수용체"를 지칭하는 것은 복수 개의 상기 키메라 항원 수용체 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다. 추가로, 특허청구범위는 초안 작성되어 임의의 임의적 요소를 배제시킬 수 있다는 점에 주의한다. 따라서, 상기와 같은 진술은 청구항 요소 언급과 관련하여, "단독으로," "오직" 등과 같은 배제 용어 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용을 위한 선행 기준로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.
명료성을 위한 개별 실시양태들의 문맥에서 기술되는 본 발명의 특정 특징 또한 단일 실시양태와 조합하여 제공될 수 있다는 것을 이해한다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시양태의 문맥에서 기술되는 본 발명의 다양한 특징 또한 별개로, 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다는 것을 이해한다. 본 발명에 관한 실시양태의 조합들은 모두 구체적으로 본 발명에 의해 포함되고, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 명백하게 개시된 것과 같이 본원에서 개시된다. 추가로, 다양한 실시양태 및 그의 요소의 하위 조합들도 모두, 이 또한 구체적으로 본 발명에 의해 포함되고, 마치 각각의 모든 하위 조합이 본원에 개별적으로 명백하게 개시된 것과 같이 본원에서 개시된다.
상세한 설명
본 개시내용은 림프구를 유전적으로 변형시키기 위한 방법 및 조성물, 및 생체외에서 훨씬 더 적은 시간, 예를 들어, 24, 12, 또는 8시간 이하인 시간이 소요되고, 일부 실시양태에서, 사전 생체외 자극 없이, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공함으로써, 상기 선행 기술의 도전과제를 극복한다. 본 방법은 대상체로부터의 혈액의 폐쇄형 시스템 생체외 프로세싱을 위해 잘 적합화된 것이고, 이는 대상체가 본 방법을 수행하는 동안에는 항상 그의 혈액 또는 그의 단리된 혈액 세포와 동일한 실내에서 및/또는 일부 실시양태에서, 그의 가시선 범위 내에 존재하는 경우에 수행될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본원의 본 개시내용의 측면 및 실시양태는, 전형적으로, 재조합 레트로바이러스의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포에의 결합 및 융합을 촉진시켜 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포의 유전적 변형을 촉진시키는 슈도타입화 요소ㄹㄹ 이용하는, 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시키는 방법을 제공함으로써 현행 입양 세포 요법과 연관된 문제를 극복한다. 추가로, 본원에 제공된 방법은 예시적인 실시양태에서, 키메라 항원 수용체, 및 그의 발현이 생체내 제어 요소의 제어하에 있는 림프구 증식성 요소를 이용하고, 그 결과로서, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물에의 대상체의 노출, 상기 노출의 종료가 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장을 촉진시키게 함으로써 당업계의 문제를 극복한다.
본원에 상세하게 개시된 상기 및 다른 개선의 결과로서, 한 측면에서, 본원에서는 대상체로부터 혈액을 수집하고; 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시켜 상기 세포를 유전적으로 변형시키고; 유전적으로 변형된 세포를 대상체 내로 재도입시키는 것인, 전형적으로, 선행 방법보다 더 짧은 기간 내에 예를 들어, 24시간 이내에, 및 일부 비제한적인 실시양태에서, 12시간 이내에 및/또는 생체외에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포 집단을 추가로 확장시키지 않고, 예를 들어, 이로써, 유전적으로 변형된 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외에서 세포 분열이 4회 초과로 일어나지 않고 수행되는, 대상체, 예컨대, 질환 또는 장애를 앓는 환자의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 변형시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 현행 CAR 요법보다 훨씬 더 짧은 단기간에 수행될 수 있고, 이로써, 생체외 단계가 수행되는 전체 기간 동안 대상체가 진료소에 그대로 머물러 있을 수 있는 프로세스를 제공할 수 있다. 이는 폐쇄형 시스템에서 생체외 단계의 성능을 촉진시키며, 이는 오염 및 환자 샘플의 혼합 기회를 감소시키고, 이는 임상 실험실에 의해 더욱 쉽게 수행될 수 있다.
따라서, 도 1 및 2는 본원에 제공된 방법에서 사용된 예시적인 조성물의 개략적 다이어그램을 제공한다. 도 1은 패키징 세포 (100), 및 패키징 세포에 의해 제조된 재조합 레트로바이러스 (200)의 다이어그램을 제공한다. 패키징 세포 (100)는 그의 게놈 내로 도입된, 재조합 폴리뉴클레오티드 (110)를 포함하고, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 리간드에 결합하고, 그에 의해 활성화되는 전사활성인자에 의해 조절되는 유도가능한 프로모터의 제어하에서 레트로바이러스 단백질 및 각종 상이한 막 결합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 전사 요소를 포함한다. 상기 전사활성인자, 유도가능한 프로모터, 및 리간드는 재조합 레트로바이러스의 막 내로 도입되게 되는 세포 막 결합 폴리펩티드 뿐만 아니라, 레트로바이러스의 패키징 및 어셈블리에 필요한 레트로바이러스 성분의 순차적인 발현 및 축적을 유도하는 데 사용된다.
본원 하기에서 상세하게 논의되는 바와 같이 다양한 폴리뉴클레오티드의 순차적인 유도 발현의 결과로서, 도 1에 도시된 예시적인 패키징 세포 (100)가 제조되고, 이는 본원에 제공된 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 (도 2에서 (300))를 형질감염시키는 방법에서 사용되는 재조합 레트로바이러스를 제조하는 예시적인 방법에서 사용될 수 있다. 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 패키징 세포 (100)는 그의 게놈 내에, 레트로바이러스의 패키징 및 어셈블리에 필요한 레트로바이러스 게놈의 요소 중 적어도 일부 (비제한적인 예시적인 예로서, 레트로바이러스 psi 요소, 레트로바이러스 gag 폴리펩티드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩티드)를 포함하는 패키징 가능한 레트로바이러스 RNA 게놈을 코딩하는 핵산을 포함한다.
패키징 세포의 세포 막에 도입 또는 그와 회합되어 있는 일부 막 결합 폴리펩티드는 레트로바이러스 내로 도입 또는 회합되겠지만, 레트로바이러스 게놈에 의해 코딩되지 않는다. 예를 들어, 패키징 세포 및 그로부터 형성된 재조합 레트로바이러스는, 비제한적인 예시적인 예에서, 막 회합 융합 단백질, 예를 들어, Src-Flag-Vpx 폴리펩티드로서 발현될 수 있는 레트로바이러스 Vpx 폴리펩티드 (250); 비제한적인 실시양태에서, 홍역 바이러스 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드 및 홍역 바이러스 융합 (F) 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함하는, 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드 (240)를 포함할 수 있는 슈도타입화 요소; 임의적으로, 비제한적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 활성화 요소 (210, 220); 및/또는 임의적으로, 비제한적인 실시양태가 DAF, 또는 그의 단편에 융합된 IL-7을 포함하는 융합 폴리펩티드인 것인 막 결합 시토카인 (230)을 포함할 수 있다.
패키징 세포에 의한 전사 요소의 순차적인 발현의 결과로서, 재조합 레트로바이러스가 제조된다. 재조합 레트로바이러스의 게놈이 되는, 패키징 세포의 내부에 있고, 전형적으로, 그 내부로 통합되는 RNA 레트로바이러스 게놈은 레트로바이러스 제조, 감염, 및 전형적으로는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포인 숙주 세포의 게놈 내로의 통합에 필요한 레트로바이러스 성분 (비제한적인 예시적인 예로서, 레트로바이러스 Gag 및 Pol 폴리뉴클레오티드)을 포함한다. 추가로, 레트로바이러스 게놈은 추가로 본원에 제공된 1개 또는 전형적으로 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나는 림프구 증식성 요소 (비제한적인 예에서, 구성적 인터류킨 7 수용체 돌연변이체)를 코딩하고, 나머지 다른 하나의 조작된 신호전달 폴리펩티드 전형적으로 키메라 항원 수용체를 코딩한다.
이어서, 재조합 레트로바이러스 (200)는 본원에 제공된 방법에서 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포 (300)를 형질도입시키는 데 사용된다. 도 2에 제시된 바와 같이, 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)는 재조합 레트로바이러스 (200)와의 접촉 후, 레트로바이러스의 표면 상의, 상기 논의된 막 폴리펩티드는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 표면 상의 수용체 및/또는 리간드에 결합한다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포의 표면 상의 분자에 결합하는 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함할 수 있는 슈도타입화 요소는 레트로바이러스 (200)의 T 세포 및/또는 NK 세포 막에의 결합 및 융합을 촉진시킨다. 활성화 요소(들) (210, 220)는, 접촉 또는 그 이후 인큐베이션의 시간이 경과함에 따라 일어나는 프로세싱인, T 세포 수용체 복합체와의 체결에 의해 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)를 활성화시킨다. 추가로, 막 결합 시토카인 (230)은 레트로바이러스의 표면 상에 존재할 수 있고, 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 표면 상의 시토카인 수용체 (310)에 결합할 수 있고, 이는 결합 및 활성화를 추가로 촉진시킬 수 있다. 따라서, 이론에 의해 제한하지 않으면서, 본원에 제공된 예시적인 실시양태에서, 상기 재조합 레트로바이러스 (200) 성분 중 하나 이상의 것의 결과로서, 레트로바이러스 (200) 중에 또는 그 상에 이미 존재하고 있지 않은 요소에 의한 생체외 자극 또는 활성화는 요구되지 않는다. 결국 이는 본원에 제공된 상기 예시적인 방법에서 방법을 완료하는 데 소요되는 생체외 시간을 단축시키는 데 도움이 된다.
이어서, T 세포 및/또는 NK 세포 (200)에의 결합시, 레트로바이러스는 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)와 융합되고, 레트로바이러스 중의 폴리펩티드 및 핵산은 T 세포 및/또는 NK 세포 (300) 내로 진입한다. 상기 명시한 바와 같이, 레트로바이러스 중의 상기 폴리펩티드 중 하나는 Vpx 폴리펩티드 (250)이다. Vpx 폴리펩티드 (250)는 세포질에서 유리 dNTP를 분해하는 SAMHD1 제한 인자 (350)에 결합하고, 그의 분해를 유도한다. 따라서, 세포질 내의 유리 dNTP의 농도는 Vpx가 SAMHD1을 분해함에 따라 증가하고, 역전사 활성은 증가됨으로써, 레트로바이러스 게놈의 역전사 및 T 세포 및/또는 NK 세포 게놈 내로의 통합은 촉진된다.
레트로바이러스 게놈의 T 세포 및/또는 NK 세포 (200) 내로의 통합 이후, T 세포 및/또는 NK 세포 게놈은 림프구 증식성 요소 (370)를 코딩하는 신호전달 폴리펩티드, 및 임의적으로, CAR (360)을 코딩하는 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 림프구 증식성 요소 및 임의적으로, CAR의 발현은 생체내 제어 요소의 제어하에 있다. 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물을 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)가 형질도입된 대상체에게 투여함으로써 생체내에서 일어나게 되는 상기 화합물에의 노출이 림프구 증식성 요소를 발현함으로써, 및 임의적으로, CAR의 발현, 및 CAR의 그의 표적 세포에의 결합의 결과로서, 생체내에서 T 세포 및/또는 NK 세포 (300)의 증식을 촉진시킨다. 따라서, 본원의 재조합 레트로바이러스가 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 증식을 구동시키고/거나, 세포 사멸을 억제시키는 하나 이상의 신호를 가지며, 예시적인 실시양태에서, 결국 이로써, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 다시 대상체 내로 복귀시키기 이전에 숙주에서 림프구를 고갈시키는 선행 방법의 요건을 피할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 결국 이는 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시키기 이전에 수일 소요되는 프로세싱을 추가로 단축시킨다. 따라서, 예시적인 실시양태에서, 대상체로부터의 혈액 수집부터 혈액의 대상체 내로의 재도입까지 36시간, 24시간, 12시간 이하, 또는 일부 경우에서, 심지어 8시간이 소요되고, 이는 근복적으로 선행 방법으로부터 CAR-T 프로세스에 변화를 준다. 추가로, 생체내 제어 요소는 또한 본원에 제공된 안전성 기전 중 하나를 제공한다. 예를 들어, 화합물 투여 중단은 림프구 증식성 요소 및 임의적으로, CAR의 발현을 하향 조절하거나, 또는 심지어 그를 종료시킬 수 있고, 이로써, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포 및 그의 자손으로의 증식 및/또는 생존 신호를 종료하게 된다.
입양 세포 요법을 수행하는 방법
특정 측면에서, 본원에서는 대상체에 대해 입양 세포 요법을 수행하는 방법을 제공한다. 예시적인 예로서, 본 방법은 하기:
A. 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계;
B. 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 포함하는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 단리시키는 단계;
C. 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 그의 표면 상에 포함하고, 여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입이 촉진되는 것인 단계; 및
D. 유전적으로 변형된 세포를, 대상체로부터의 혈액 수집으로부터 36, 24, 12시간, 또는 심지어 8시간 이내에 대상체 내로 재도입시킴으로써 대상체에서 입양 세포 요법을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 일부 측면에서, 유사 단계를 포함하는 본 방법은 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법으로 지칭된다. 입양 세포 요법을 수행하기 위한 방법 및 조성물에 적용되는 바와 같이, 본원의 논의는 또한 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법에도 적용된다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
전형적으로, 본 개시내용의 입양 세포 요법 방법은, 세포가 세포 요법을 받을 대상체로부터, 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고/거나, 다르게는 제조되는 것인 자기 이식에 의해 수행된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 환자로부터 유래된 것이고, 단리 및 프로세싱 후, 세포는 동일 대상체에게 투여된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애를 앓는 대상체는 공지된 방법, 예컨대, 예컨대, 정맥채혈을 사용하여 대상체의 혈액을 채혈하는 의료 시설에 들어간다. 특정 실시양태에서, 대상체로부터 채혈되는 혈액의 부피는 범위의 하단으로 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 또는 100 ml 내지 범위의 상단으로 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1,000, 2,000, 또는 2,500 ml 이다. 일부 실시양태에서, 10 내지 400 ml가 대상체로부터 채혈된다. 일부 실시양태에서, 20 내지 250 ml의 혈액이 대상체로부터 채혈된다. 일부 실시양태에서, 혈액은 프로세싱 시점에 신선한 것이다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 신선한 혈액은 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 또는 180분 미만인 시간 전에 대상체로부터 채혈된 혈액일 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액은 본원에 제공된 방법에서 보관 없이 프로세싱된다.
T 세포 및/또는 NK 세포와 재조합 레트로바이러스 사이의 접촉이 전형적으로 재조합 레트로바이러스에 의한 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시킨다. 본 개시내용 전역에 걸쳐, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외 형질도입 동안 세포 내로 도입된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 일부를 보유하는 생체외 형질도입된 세포의 자손을 포함한다. 형질도입된 세포를 "재도입시키는" 단계를 열거한, 본원의 방법에서, 상기 세포가 대상체의 혈액으로부터 수집되었을 때에는 전형적으로 형질도입된 상태가 아니라는 것을 이해할 것이다. 본원에 개시된 측면 중 임의의 것에서 대상체는 예를 들어, 동물, 포유동물, 및 예시적인 실시양태에서, 인간일 수 있다.
이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 비제한적인 예시적인 방법에서, T 세포 또는 NK 세포의 게놈 내로 통합될 수 있는, 림프구 증식성 요소, 예컨대, 구성적으로 활성을 띠는 IL7 돌연변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생체외에서 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포에 전달하는 것은 숙주에서 림프구를 고갈시킬 필요 없이 생체내 확장을 위한 구동자를 상기 세포에 전달한다. 따라서, 예시적인 실시양태에서, 대상체는 접촉 수행 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 이내에, 또는 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월 이내에, 접촉하는 동안, 및/또는 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 다시 재도입시킨 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 이내, 또는 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월 이내에 림프구 고갈제에 노출되지 않는다. 추가로, 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 재조합 레트로바이러스를 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포와 접촉시키는 단계 동안 및/또는 전체 생체외 방법 동안 대상체를 림프구 고갈제에 노출시키지 않고 수행될 수 있다.
그러므로, 생체내에서 대상체에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 확장시키는 방법은 본 개시내용의 일부 실시양태의 특징이다. 예시적인 실시양태에서, 상기 방법은 생체외 증식이 없는 또는 실질적으로 증식이 없는 방법이다.
본원의 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체로부터의 채혈에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 다시 재도입시키는 것까지인 것인 상기 전체 방법/프로세스는 48시간 미만, 36시간 미만, 24시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 또는 2시간 미만인 기간에 걸쳐 진행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원의 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 다시 재도입시키는 것까지인 것인 전체 방법/프로세스는 1시간 내지 12시간 사이, 또는 2시간 내지 8시간 사이, 또는 4시간 내지 12시간 사이, 또는 4시간 내지 24시간 사이, 또는 8시간 내지 24시간 사이, 또는 8시간 내지 36시간 사이, 또는 8시간 내지 48시간 사이, 또는 12시간 내지 24시간 사이, 또는 12시간 내지 36시간 사이, 또는 12시간 내지 48시간 사이인 기간에 걸쳐, 또는 범위의 하단으로 15, 30, 60, 90, 120, 180, 및 240분 내지 범위의 상단으로 120, 180, 및 240, 300, 360, 420, 및 480분 사이인 기간에 걸쳐 진행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 다시 재도입시키는 것까지인 것인 전체 방법/프로세스는 범위의 하단으로 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 및 12시간 내지 범위의 상단으로 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 36, 또는 48시간 사이인 기간에 걸쳐 진행된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 접촉이 진행된 기간 이후에 재조합 레트로바이러스로부터 분리된다.
본원에 제공된 입양 세포 요법 방법 및 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 생체내에서 확장시키기 이전에 그를 생체외에서 변형시키는 관련된 방법은 선행 방법에서보다 유의적으로 더 짧은 시간 내에 수행될 수 있기 때문에, 생성물의 제조가능성 뿐만 아니라, 환자 관리 및 안전성에서도 근본적인 개선이 이루어질 수 있다. 그러므로, 상기 프로세스는 치료 목적으로 생체내에서 수행될 때, 상기와 같은 프로세스의 승인을 담당하는 규제 기관의 관점에서 바람직할 것으로 예상된다. 예를 들어, 비제한적인 예에서, 대상체는, 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 환자 내로 재도입시키기 이전에 샘플을 프로세싱하는 전기간 동안 그의 혈액 또는 샘플을 프로세싱하는 장치와 동일한 건물 (예컨대, 주입 진료소) 또는 실내에 머물러 있을 수 있다. 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체는 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 재도입시키는 것인 전체 방법/프로세스 동안, 가시선 범위 내에, 또는 프로세싱되는 그의 혈액 또는 세포로부터 100, 50, 25, 또는 12 피트 이내 또는 한 팔 정도의 거리 이내에 머물러 있다. 다른 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체는 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 재도입시키는 것인 전체 방법/프로세스 전기간 동안 및/또는 계속해서, 계속하여 깨어있는 상태이고/거나, 적어도 1명은 프로세싱되는 대상체의 혈액 또는 세포를 계속해서 모니터링할 수 있다. 본원에 제공된 개선에 기인하여, 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 재도입시키는 것인, 입양 세포 요법을 위한 및/또는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키기 위한 전체 방법/프로세스는 인간에 의한 연속 모니터링과 함께 수행될 수 있다. 다른 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 재도입시키는 것인 전체 방법/프로세스 중 어느 시점에서도 사람이 없는 실내에서 혈액 세포는 인큐베이션되지 않는다. 다른 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 대상체로부터의 채혈/혈액 수집에서부터 T 세포 및/또는 NK 세포의 생체외 형질도입 후, 혈액을 대상체 내로 재도입시키는 것인 전체 방법/프로세스는 다음 대상체에서 및/또는 상기 대상체와 같은 실내에 있는 대상체 및/또는 대상체의 옆 침대 또는 의자에 있는 대상체에서 수행된다. 따라서, 수일 또는 수주 동안에 걸친 장기간 및 값비싼 인큐베이션 뿐만 아니라, 샘플 아이덴티티 뒤섞임을 피할 수 있다. 이는 추가로 본원에 제공된 방법이, 대상체 내로 재도입되는 혈액 샘플 및 그의 성분은 오직 사용 후 버릴 수 있는 1회용 성분과 접촉이 이루어지는 것인 폐쇄형 및 자동화된 혈액 프로세싱 시스템에 맞게 쉽게 적합화될 수 있다는 사실에 의해 제공된다.
본원에 제공된 입양 세포 요법을 수행하는 방법은 전형적으로, 그 자체가 본 개시내용의 상이한 측면을 형성하는 것인, 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 방법을 포함한다. T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키기 위한 것으로서 본원에서 제공되는 세부 사항은 상기 단계(들)를 포함하는 임의 측면에 적용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 특정 측면에서, 본원에서는 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 전형적으로 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 그의 표면 상에 포함하고, 여기서, 상기 접촉 (및 접촉 조건하에서의 인큐베이션)은 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 촉진시키는 것인 단계를 포함하는, T 세포 및/또는 NK 세포, 전형적으로, 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시키는 방법을 제공한다. 상기 방법의 추가의 실시양태는 레트로바이러스, 림프구 증식성 요소, CAR, 슈도타입화 요소, 리보스위치, 활성화 요소, 막 결합 시토카인, miRNA, 및/또는 본원에 개시된 다른 요소의 실시양태 중 임의의 것을 포함할 수 있다. T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 상기 방법은 시험관내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
입양 세포 요법 방법 및 생체외에서 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시키는 것을 포함하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 전형적으로, 호중구/과립구는 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 혈액 세포로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 말초 혈액 림프구 (PBL), 예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포를 비롯한, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)는 예를 들어, 성분채집술, 및/또는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 혈액 샘플의 다른 성분으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 호중구는, PBMC 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 프로세싱하거나, 재조합 레트로바이러스와 접촉시키거나, 형질도입시키거나, 또는 형질감염시키기 이전에 제거된다. 치료하고자 하는 대상체와 관련하여, 세포는 동종 이계 및/또는 자기 유래 세포일 수 있다.
수행을 위한 비제한적인 예로서, 일부 실시양태에서, PBMC는 세팍스(Sepax) 또는 세팍스 2 세포 프로세싱 시스템 (바이오세이프(BioSafe))을 사용하여 단리된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 CliniMACS 프로디지(CliniMACS Prodigy) 세포 프로세서 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec))를 사용하여 단리된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 혈액을 채취하고, 특정 세포 유형 (예컨대, 예를 들어, PBMC)을 분류하는 장치를 통해 혈액을 통과시키고, 남은 잔류물을 다시 대상체로 복귀시키는 것인 자동화된 성분채집술 분리기가 사용된다. 성분채집술 이후에 밀도 구배 원심분리가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC는 백혈구 감소 필터 장치를 사용하여 단리된다. 일부 실시양태에서, 이어서, 세포 표현형에 따라 PBMC, 예컨대, 예를 들어, PBL 또는 그의 서브세트로부터 특정 세포 집단을 정제하기 위해 (즉, 양성 선별) 자기 비드 활성화 세포 분류가 사용된다. 예컨대, 예를 들어, 동원 동안 T 세포가 조우하게 되는 환경을 모방하는 기판으로서, T 세포가 부착 및 이동할 수 있게 하는 기판을 이용하는 기판 부착, 또는 원치않는 세포를 표적화하는 항체 복합체를 이용하는 제거를 위해 원치않는 세포가 표적화되는 것인 음성 선별과 같은 다른 정제 방법 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 정제하는 데 적혈구 로젯팅이 사용될 수 있다.
본원의 관련된 측면 중 임의의 것의 일부 예시적인 실시양태에서, PBL은 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한다. 본원의 특정 실시양태 동안, 예를 들어, 림프구를 변형시키는 방법 및 입양 세포 요법을 수행하는 방법에서, 본 개시내용의 재조합 레트로바이러스에 의해 접촉되는 T 세포 및/또는 NK 세포는 주로 휴지기 T 세포. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 95 내지 100%의 휴지기 세포 (Ki-67-)로 구성된다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스에 의해 접촉되는 T 세포 및/또는 NK 세포는 범위의 하단으로 90, 91, 92, 93, 94, 및 95%의 휴지기 세포 내지 범위의 상단으로 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 휴지기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 나이브 세포를 포함한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 생체외에서 재조합 레트로바이러스와 접촉시켜 T 세포 및/또는 NK 세포를 유전적으로 변형시킴에 따라, 상기 세포는 대상체 내도 재도입되었을 때, 대상체에서 표적화된 면역 반응을 유도해낸다. 접촉 기간 동안, 재조합 레트로바이러스는 T 세포 및/또는 NK 세포를 확인하고 그에 결합하고, 그 지점에서 레트로바이러스 및 숙주 세포 막은 융합하기 시작한다. 이어서, 형질도입 프로세스를 통해 재조합 레트로바이러스로부터의 유전 물질은 T 세포 및/또는 NK 세포로 진입하여 숙주 세포 DNA 내로 도입된다. 렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예컨대, 문헌 [Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701]; [Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644]; [Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114]; 및 [Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기술되어 있다.
다수의 본원에 제공된 방법들은 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 포함한다. 생체외에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로 형질도입시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 생체외 자극 또는 활성화를 필요로 하지 않는다. 따라서, 비록 생체외 자극 분자(들), 예컨대, 항-CD3 및/또는 항-CD28 비드가 형질도입 동안 존재할 수 있지만, 선행 방법에서 상기의 공통 단계는 본 방법에서 지양될 수 있다. 그러나, 본원에 제공된 예시적인 방법의 경우, 생체외 자극은 요구되지 않는다. 특정 예시적인 방법에서, 3 내지 10의 감염 다중도 (MOI), 및 일부 실시양태에서, 5 내지 10 MOI 단위의 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스가 사용될 수 있다.
형질도입 반응은 본원에서 논의된 바와 같은, 폐쇄형 시스템, 예컨대, 세팍스 시스템에서 수행될 수 있고, 여기서, 형질도입 반응은 상기 시스템에 로딩된 사용 후 버릴 수 있는 백에서 수행될 수 있다. 대상체로부터 수집된 혈액 샘플로부터의 혈액 세포, 예컨대, PBMC는, 전형적으로 접촉 단계 (즉, 형질도입 반응) 동안에는 존재하지 않는 호중구를 비롯한 과립구로부터 상기 혈액 세포가 분리, 단리 및/또는 정제되면 바로, 백에서 본원에 개시된 재조합 레트로바이러스와 접촉하게 될 수 있다.
레트로바이러스는 단리된 PBMC를 함유하는 백 내로 도입될 수 있고, 이로써, PBMC와 접촉하게 될 수 있다. 대상체로부터의 혈액 수집 시점부터 혈액 세포, 예컨대, PBMC를 형질도입 반응 백에 첨가하는 시점까지의 시간은 30분 내지 4시간, 30분 내지 2시간, 또는 일부 예에서 약 1시간일 수 있다. 첨가제, 예컨대, 배지, 인간 혈청 알부민, 인간 AB+ 혈청, 및/또는 대상체로부터 유래된 혈청이 형질도입 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 배지, 예컨대, 생체외 프로세스용으로 당업계에 공지되어 있는 배지 (비제한적인 예로서, X-비보(X-VIVO) 15 (론자(Lonza)) 또는 CTS 배지 (써모 피셔 사이언티픽)가 전형적으로 존재한다. 보조 시토카인, 예컨대, IL2, IL7, 또는 IL15, 또는 HSA에서 발견되는 것이 형질도입 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
형질도입 반응 혼합물은 23 내지 39℃에서, 일부 예시적인 실시양태에서, 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질도입 반응은 더욱 신속한 융합/형질도입을 위해 37-39℃에서 수행될 수 있다. dGTP가 형질도입 반응 첨가될 수 있다. 형질도입 반응 혼합물은 1 내지 12시간 동안, 및 일부 실시양태에서, 6 내지 12 hr 동안 인큐베이션될 수 있다. 형질도입 후, 형질도입된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 다시 주입시키기 이전에, 세포를 형질도입 반응 혼합물로 세척한다. 예를 들어, 형질도입된 세포를 대상체 내로 다시 주입시키기 이전에, 시스템, 예컨대, 세팍스 장치를 사용하여 세포를 예를 들어, 10-50 ml의 세척액으로 세척할 수 있다. 일부 실시양태에서, 호중구는, PBMC 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 프로세싱하거나, 재조합 레트로바이러스와 접촉시키거나, 형질도입시키거나, 또는 형질감염시키기 이전에 제거된다.
입양 세포 요법을 수행하는 예시적인 실시양태에서, 혈액을 대상체로부터 혈액 백 내로 수집하고, 혈액 백을 세포 프로세싱 시스템 예컨대, 세팍스 세포 프로세싱 시스템에 부착시킨다. 세포 프로세싱 시스템을 사용하여 단리된 PBMC를 백 내로 수집하고, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 데 충분한 조건에서 재조합 레트로바이러스와 접촉시키고, 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, PBMC 및 재조합 레트로바이러스의 혼합물을 함유하는 백을 세포 프로세싱 시스템에 부착시키고, PBMC를 세척한다. 세척된 PBMC를 백 내로 수집하고, 대상체 내로 재주입한다. 일부 실시양태에서, 혈액 수집부터 형질도입된 T 및/또는 NK 세포의 재주입까지인 것인 전체 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간 이내에 수행된다. 예시적인 실시양태에서, 전체 방법은 12시간 이내에 수행된다.
일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스에 대한 표적 세포는 PBL이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 헬퍼 T 세포 및/또는 살해 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소를 가진다. 다른 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있는 활성화 요소를 가진다. 추가의 다른 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에 막 결합 시토카인을 가진다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는, 그 중 하나 이상의 것이 림프구 증식성 요소를 포함하는 것인 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개의 신호전달 폴리펩티드가 사용될 때, 하나는 림프구 증식성 요소를 포함하고, 나머지 다른 하나는 전형적으로 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 본원에 명시된 바와 같이, 전형적으로 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스의 표면과 회합되어 있는 활성화 요소(들)는 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킬 수 있고, 적절한 조건하에서 및 충분한 시간 동안 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포와 접촉한 결과로서 그를 활성화시킨다. 상기 활성화는 본원 방법의 접촉 단계 동안 시간 경과에 따라 진행된다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본원 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포에 결합하는 슈도타입화 요소가 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발견되는 것인 일부 실시양태에서, 활성화는 슈도타입화 요소의 결합에 의해 유도될 수 있다. 활성화 요소는 상기 실시양태에서 임의적이다.
슈도타입화 요소, 활성화 요소, 막 결합 시토카인, 조작된 신호전달 폴리펩티드, 림프구 증식성 요소, 및 CAR에 관한 추가의 상세한 설명은 본원 다른 섹션에서 제공된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 혈액으로부터 수집된 전체 림프구 중 5% 내지 90%가 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 형질도입되는 림프구의 비율(%)은 범위의 하단으로 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 및 60% 내지 범위의 상단으로 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 및 90%이다. 일부 실시양태에서, 형질도입되는 림프구의 비율(%)은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 또는 적어도 60%이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 T 세포 및/또는 NK의 추가의 생체외 조작, 예컨대, 자극 및/또는 활성화 없이, 대상체로 다시 도입되거나, 재도입되거나, 또는 재주입된다. 선행 기술의 방법에서, 생체외 조작은 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키기 전에 T 세포 및/또는 NK 세포의 자극/활성화를 위해, 및 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 확장을 위해 사용된다. 선행 기술의 방법에서, 이는 일반적으로 수일 또는 수주 소요되고, 대상체는 최초 채혈 후 수일 또는 수주 경과하였을 때, 혈액 주입을 위해 진료소로 복귀하여야 한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에, 항-CD3/항-CD28 고체 지지체, 예컨대, 예를 들어, 항-CD3/항-CD28로 코팅된 비드에의 노출에 의해 자극을 받지 않는다. 따라서, 본원에서는 생체외 증식이 없는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 생체외에서 확장되지 않거나, 또는 오직 소수의 세포 분열 동안만 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 라운드의 세포 분열) 확장되지만, 생체내에서는, 즉, 대상체 내에서는 약간 확장되거나, 또는 대부분이 확장된다. 일부 실시양태에서, 세포가 추가로 확장될 수 있도록 하기 위해 어떤 추가의 배지도 첨가되지 않는다. 일부 실시양태에서, PBL이 재조합 레트로바이러스와 접촉하는 동안, PBL의 세포 제조는 일어나지 않는다. 예시적인 실시양태에서, PBL이 생체외에 있는 동안, PBL의 세포 제조는 일어나지 않는다. 이전 입양 세포 요법 방법에서, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 재주입 하기 이전에 대상체에서 림프구가 제거되었다. 일부 실시양태에서, 채혈 이전에 환자 또는 대상체에서 림프구가 제거된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 T 세포및/또는 NK 세포를 재주입 하기 이전에 환자 또는 대상체에서 림프구가 제거된다.
본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 대상체 내로 재주입되는 T 세포 및/또는 NK 세포의 개수는 범위의 하단으로 1 x 103, 2.5 x 103, 5 x 103, 1 x 104, 2.5 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 및 1 x 107개의 세포/kg 내지 범위의 상단으로 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 및 1 x 108개의 세포/kg일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 대상체 내로 재주입되는 T 세포 및/또는 NK 세포의 개수는 범위의 하단으로 1 x 104, 2.5 x 104, 5 x 104, 및 1 x 105개의 세포/kg 내지 범위의 상단으로 2.5 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 2.5 x 105, 5 x 105, 및 1 x 106개의 세포/kg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체 내로 재주입되는 PBL의 개수는 5 x 105, 1 x 106, 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 및 1 x 108개의 세포 및 범위의 하단 미만 내지 범위의 상단으로 2.5 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2.5 x 108, 5 x 108, 및 1 x 109개의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 70 kg 대상체 또는 환자 내로의 재주입을 위해 이용가능한 T 세포 및/또는 NK 세포의 개수는 7 x 105 내지 2.5 x 108개의 세포이다. 다른 실시양태에서, 형질도입을 위해 이용가능한 T 세포 및/또는 NK 세포의 개수는 대략 7 x 106개 ± 10%이다.
본원에 개시된 방법에서, 채혈에서부터 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 재주입까지인 것인 전체 입양 세포 요법 방법은 이롭게는 이전 방법보다 단시간에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 입양 세포 요법 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간 미만으로 수행될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 전체 입양 세포 요법 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12시간 미만으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 입양 세포 요법 방법은 범위의 하단으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 15시간 내지 범위의 상단으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 또는 24시간에 수행될 수 있다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, 대상체로부터 혈액 샘플을 채혈하는 단계, T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키는 단계, 및/또는유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계는 폐쇄형 시스템에서 이루어진다. 폐쇄형 시스템은 일반적으로 오염에 대해 폐쇄되어 있거나, 또는 완전히 폐쇄되어 있는 배양 프로세스이다. 본 발명의 이점은 폐쇄형 시스템에서 CAR 요법을 수행하는 방법이 본원에서 제공된다는 점이다. 세포 프로세싱 방법에서 안전성 및 조절 제어에 대한 가장 큰 위험 중 하나는 전통 개방형 세포 배양 시스템에서 발견되는 것과 같은, 환경에의 빈번한 노출을 통한 오염 위험이다. 특히, 항생제 부재하에서의 상기와 같은 위험을 완화시키기 위해, 사용 후 버릴 수 있는 (1회용) 장비 사용에 주력한 일부 상업적 프로세스가 개발되었다. 그러나, 심지어 무균 조건하에서 사용한 경우에도, 플라스크의 개봉에서부터 샘플링까지 또는 추가의 성장 배지를 첨가할 때까지 오염의 위험은 항상 존재한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 본원에서는 생성물이 외부 환경에 노출되지 않도록 디자인되고, 그렇게 작동될 수 있는 폐쇄형 시스템 프로세스를 제공한다. 이는, 외부 환경이 전형적으로 멸균 상태가 아니기 때문에 중요하다. 물질 전달은 멸균 연결부 또는 관 용접부를 통해 이루어진다. 가스 교환을 위한 대기는 가스 투과 막 또는 유사한 다른 부가물을 통해, 환경 노출을 막는 0.2 ㎛ 필터를 통해 이루어진다.
일부 실시양태에서, 폐쇄형 시스템은 혈액 채혈한 후, 혈액을 대상체 내로 다시 도입시키기 이전에 생체외 순환 시스템으로 순환시키기 위해 대상체의 생체내 순환 시스템에 연결된 생체외 순환 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체외 순환 시스템은 세포를 재조합 레트로바이러스에 노출시키기 위한 시스템 또는 장치와 함께 조합하여, PBL을 단리시키기 위한 시스템 또는 장치, 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 단리시키기 위한 시스템 또는 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폐쇄형 시스템은 T 세포 및/또는 NK 세포가 대기에 노출되는 것을 허용하지 않는다.
상기 폐쇄형 시스템 방법은 상업적으로 이용가능한 장치를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 폐쇄형 시스템 T 세포 제조를 위해 적합화된 장치에서 수행될 수 있다. 상기 장치로는 G-렉스(G-Rex)™, 웨이브 바이오리액터(WAVE Bioreactor)™, 오리진 페르마라이프(OriGen PermaLife)™ 백, 및 뷰라이프(VueLife)® 백을 포함한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 대상체 내의 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포는 그 안에 존재하는 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물에 노출되고, 여기서, 생체내 제어 요소는 재조합 레트로바이러스에 의해 도입된 유전 물질 중 일부분이다. 일부 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치일 수 있고, 화합물은 리보스위치의 압타머 도메인에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 분자 샤페론일 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 화합물은 뉴클레오시드 유사체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물일 수 있고,　여기서, 항바이러스성 약물은 항바이러스 치료용으로서 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration) 승인을 받은 화합물, 또는 미국에서 임상 시험 중인 화합물이다. 예시적인 실시양태에서, 약물은 아시클로버 또는 펜시클로버일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 팜시클로버, 경구용 펜시클로버의 프로드럭, 또는 발라시클로버, 경구용 아시클로버의 프로드럭일 수 있다. 화합물의 생체내 제어 요소에의 결합이 도입된 유전 물질의 발현을 영향을 주고, 이로써, 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식에 영향을 미치게 된다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭, 예를 들어, 아시클로버, 발라시클로버, 펜시클로버 또는 팜시클로버는 PBL을 대상체의 혈액으로부터 단리시키기 이전에, 그와 동시에, 및/또는 그 이후에, 및 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭은 대상체의 혈액으로부터 단리시키기 이전에 또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 동안 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭은 본원에 제공된 방법에서 PBL을 혈액으로부터 단리시키고, T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭은 본원에 제공된 방법에서 PBL을 혈액으로부터 단리시키고, T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭은 PBL을 대상체 내로 재주입한 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 동안, 또는 무기한으로 대상체에게 투여된다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭은 PBL의 재주입 이전 및/또는 그 동안 및/또는 PBL을 재주입한 이후에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체내 제어 요소에 결합하는 화합물은 대상체에게 1일 1, 2, 3회 또는 4회 투여된다. 일부 실시양태에서, 화합물의 1일 용량은 1주, 2주, 4주, 3개월, 6개월, 1년 동안, 대상체가 무질환 상태가 될 때까지, 예컨대, 암이 없어질 때까지, 또는 무기한으로 제공된다. 예시적인 실시양태에서, 약물은 본원에서 추가로 상세하게 개시된 바와 같이, 뉴클레오시드 유사체, 예컨대, 리보스위치에 결합하는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물이다.
소형 분자인지 또는 생물제제인지 상관없이, 약물을 전달하는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이는 본원에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 임의의 상기 방법은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 약물 또는 후보 화합물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 공통 투여 경로로는 비침습적 경구 (구강을 통한 것), 국부 (피부), 경점막 (비강, 협측/설하, 질, 안구 및 직장) 및 흡입 경로를 포함한다. 다수의 단백질 및 펩티드 약물, 예컨대, 단일클론 항체는 주사 또는 나노니들 어레이에 의해 전달되어야 한다. 예를 들어, 다수의 면역화는 단백질 약물 전달에 기초하여, 대개는 주사에 의해 수행된다.
조작된 신호전달 폴리펩티드(들)
일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포를 접촉시키는 데 사용되는 재조합 레트로바이러스는, 하나 이상의 것이 림프구 증식성 요소를 포함하는 것인 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 가지는 폴리뉴클레오티드를 가진다. 일부 실시양태에서, 신호전달 폴리펩티드는 하기: 세포외 항원 결합 도메인 (또는 항원 특이적 표적화 영역 또는 ASTR), 스토크, 막횡단 도메인, 세포내 활성화 도메인, 림프구 증식성 요소, 조정 도메인 (예컨대, 공동자극성 도메인), 및 T 세포 생존 모티프의 임의 조합을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 적어도 1, 2개 또는 그들 모두 CAR이다. 일부 실시양태에서, 2개의 신호전달 폴리펩티드가 사용될 때, 하나는 림프구 증식성 요소를 코딩하고, 나머지 다른 하나는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩한다. 다른 실시양태에서, CAR은 항원 특이적 표적화 영역에 융합된 림프구 증식성 요소를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 림프구 증식성 요소가 구성적으로 활성을 띠는 인터류킨 수용체, 예컨대, 공지된 IL-7Rα의 변이체일 때, 결합이 리간드의 존재에 의존하지 않기 때문에, 항원 특이적 표적화 영역은 요구되지 않는다. 당업계의 숙련가는 본원에 개시된 방법 및 조성물을 위해 유사하거나, 또는 상이한 제어 요소와 함께 상이한 폴리뉴클레오티드 상에 림프구 증식성 요소 및 CAR을 놓는 시스템을 재구성할 수 있을 것이다. 당업자는 상기 조작된 폴리펩티드는 또한 재조합 폴리펩티드로서 지칭될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
항원 특이적 표적화 영역
일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 전형적으로는, 본원에서 종종 항원 결합 도메인으로 명명되는 ASTR인 특이적 결합 쌍의 구성원을 포함한다. 특이적 결합 쌍은 항원-항체 결합 쌍; 리간드-수용체 결합 쌍 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서의 사용에 적합한 특이적 결합 쌍의 구성원으로는 항체인 ASTR, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 수용체의 리간드 결합 도메인, 및 애피바디를 포함한다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서의 사용에 적합한 ASTR은 임의의 항원 결합 폴리펩티드일 수 있다. 특정 실시양태에서, ASTR은 항체, 예컨대, 전장 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디이다.
일부 실시양태에서, ASTR은 단일 쇄 Fv (scFv)이다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 경쇄의 N 말단에 위치한다. 다른 실시양태에서, 경쇄는 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 중쇄의 N 말단에 위치한다. 본 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 중쇄 및 경쇄는 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 링커에 의해 이격되어 있을 수 있다. 본 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 중쇄 또는 경쇄는 조작된 신호전달 폴리펩티드의 N 말단에 있을 수 있고, 전형적으로는 또 다른 도메인, 예컨대, 신호 서열 또는 펩티드의 C 말단에 있다.
다른 항체-기반 인식 도메인 (cAb VHH (카멜리드 항체 가변 도메인) 및 인간화 버전, IgNAR VH (상어 항체 가변 도메인) 및 인간화 버전, sdAb VH (단일 도메인 항체 가변 도메인) 및 "낙타화" 항체 가변 도메인은 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드 및 조작된 신호전달 폴리펩티드를 사용하는 방법과 함께 사용하는 데 적합하다. 일부 경우에서, T 세포 수용체 (TCR) 기반 인식 도메인 예컨대, 단일 쇄 TCR (scTv, VαVβ를 함유하는 단일 쇄 2-도메인 TCR) 또한 사용하는 데 적합하다.
일부 실시양태에서, ASTR은 다중특이적, 예컨대, 이중특이적 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 가진다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 한 표적 항원에 대한 것이고, 나머지 다른 하나는 또 다른 표적 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 표적 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 표적 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는 데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 ASTR은 다양한 항원 결합 특이성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인은 표적 세포에 의해 발현되는 (합성된) 항원에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 한 예에서, 표적 세포는 항원이 회합되어 있는 암 세포이다. 암 세포 연관 항원은 예컨대, 유방암 세포, B 세포 림프종, 호지킨 림프종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종, 폐암 세포 (예컨대, 소세포 폐암 세포), 비호지킨 B-세포 림프종 (B-NHL) 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종 세포, 폐암 세포 (예컨대, 소세포 폐암 세포), 흑색종 세포, 만성 림프구 백혈병 세포, 급성 림프구 백혈병 세포, 신경아세포종 세포, 신경교종, 교모세포종, 수모세포종, 결장직장암 세포 등과 회합되어 있는 항원일 수 있다. 암 세포 연관 항원은 또한 비암성 세포에 의해서도 발현될 수 있다.
조작된 신호전달 폴리펩티드의 ASTR의 결합 대상이 될 수 있는 항원의 비제한적인 예로는 예컨대, CD19, CD20, CD38, CD30, ERBB2, CA125, MUC-1, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD44 표면 부착 분자, 메소텔린, 암배아 항원 (CEA), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 (VEGFR2), 고분자량-흑색종 연관 항원 (HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, Axl, Ror2 등을 포함한다.
일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 특이적 결합 쌍의 구성원은 수용체에 대한 리간드인 ASTR이다. 리간드는 시토카인 (예컨대, IL-13 등); 성장 인자 (예컨대, 헤레굴린; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 등); 인테그린 결합 펩티드 (예컨대, 서열 Arg-Gly-Asp를 포함하는 펩티드) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
조작된 신호전달 폴리펩티드 중의 특이적 결합 쌍의 구성원이 리간드인 경우, 조작된 신호전달 폴리펩티드는, 특이적 결합 쌍의 제2 구성원이 리간드에 대한 수용체인 것인 특이적 결합 쌍의 제2 구성원의 존재하에서 활성화될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 VEGF인 경우, 특이적 결합 쌍의 제2 구성원은 가용성 VEGF 수용체를 비롯한, VEGF 수용체일 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드에 포함되어 있는 특이적 결합 쌍의 구성원은 수용체, 예컨대, 리간드에 대한 수용체, 공동 수용체 등인 ASTR이다. 수용체는 수용체의 리간드 결합 단편일 수 있다. 적합한 수용체는 성장 인자 수용체 (예컨대, VEGF 수용체); 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 K, 구성원 1 (NKG2D) 폴리펩티드 (MICA, MICB, 및 ULB6에 대한 수용체); 시토카인 수용체 (예컨대, IL-13 수용체; IL-2 수용체 등); CD27; 자연 세포독성 수용체 (NCR) (예컨대, NKP30 (NCR3/CD337) 폴리펩티드 (HLA-B-연관 전사체 3 (BAT3) 및 B7-H6에 대한 수용체) 등) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
스토크
일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는, 세포 밖에 놓여 있고, ASTR과 막횡단 도메인 사이에 끼여있는, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 일부분에 위치하는 스토크를 포함한다. 일부 경우에서, 스토크는 야생형 CD8 스토크 영역 (TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA (서열 번호: 79)과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성을 가지거나, 야생형 CD28 스토크 영역 (FCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (서열 번호: 80))과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성을 가지거나, 또는 야생형 면역글로불린 중쇄 스토크 영역과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 동일성을 가진다. 조작된 신호전달 폴리펩티드에서, 사용되는 스토크를 통해 항원 특이적 표적화 영역, 및 전형적으로, 전체 조작된 신호전달 폴리펩티드는 표적 항원에의 증가된 결합을 유지할 수 있다.
스토크 영역의 길이는 약 4개의 아미노산 내지 약 50개의 아미노산 길이, 예컨대, 약 4 aa 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa 내지 약 50 aa일 수 있다.
일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 스토크는 적어도 하나의 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 스토크는 서열 Cys-Pro-Pro-Cys (서열 번호: 62)를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드의 스토크 중의 시스테인은 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드 중의 스토크과 이황화 결합을 형성하는 데 이용가능할 수 있다.
스토크는 당업계에 공지된 면역글로불린 힌지 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있다; 예컨대, 문헌 [Tan et al. (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:162]; 및 [Huck et al. (1986) Nucl . Acids Res. 14:1779]를 참조한다. 비제한적인 예로서, 면역글로불린 힌지 영역은 하기 아미노산 서열: DKTHT (서열 번호: 63); CPPC (서열 번호: 62); CPEPKSCDTPPPCPR (서열 번호: 64) (예컨대, 문헌 [Glaser et al. (2005) J. Biol . Chem . 280:41494] 참조); ELKTPLGDTTHT (서열 번호: 65); KSCDKTHTCP (서열 번호: 66); KCCVDCP (서열 번호: 67); KYGPPCP (서열 번호: 68); EPKSCDKTHTCPPCP (서열 번호: 69) (인간 IgG1 힌지); ERKCCVECPPCP (서열 번호: 70) (인간 IgG2 힌지); ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열 번호: 71) (인간 IgG3 힌지); SPNMVPHAHHAQ (서열 번호: 72) (인간 IgG4 힌지) 등 중 임의의 것의 아미노산 중 적어도 10, 15, 20개, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 스토크는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 스토크는 야생형 (자연적으로 발생된) 힌지 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG 1 힌지의 His229는 Tyr로 치환될 수 있고, 이로써, 스토크는 서열 EPKSCDKTYTCPPCP를 포함한다 (예컨대, 문헌 [Yan et al. (2012) J. Biol . Chem . 287:5891] 참조). 스토크는 인간 CD8로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 예컨대, 스토크는 아미노산 서열: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (서열 번호: 73), 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
막횡단 도메인
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드는 진핵 세포 막 내로의 삽입을 위해 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 막횡단 도메인은 ASTR과 공동자극성 도메인 사이에 끼여있을 수 있다. 막횡단 도메인은 스토크와 공동자극성 도메인 사이에 끼여있을 수 있으며, 이로써, 키메라 항원 수용체는 아미노 말단 (N 말단)에서부터 카복실 말단 (C 말단)으로의 순서대로 ASTR; 스토크; 막횡단 도메인; 및 활성화 도메인을 포함한다.
폴리펩티드를 진핵 (예컨대, 포유동물) 세포의 세포 막 내로 삽입시키는 임의의 막횡단 (TM) 도메인은 본원에 개시된 측면 및 실시양태에서 사용하는 데 적합하다. 본원에 제공된 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 적합한 TM 도메인의 비제한적인 예로는 하기 TM 도메인: a) CD* 알파 (IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열 번호: 46)); b) CD8 베타 (LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (서열 번호: 47)); c) CD4 (ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (서열 번호: 48)); d) CD3Z (LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (서열 번호: 49); e) CD28 (FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열 번호: 50)); f) CD134 (OX40): (VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (서열 번호: 51)); g) CD7 (ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (서열 번호: 52)), h) CD8 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열 번호: 75), 및 i) CD28 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (서열 번호: 76) 중 임의의 것의 아미노산 중 적어도 10, 15, 20개, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함한다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 측면의 막횡단 도메인은 서열 번호: 46 막횡단 도메인, CD8 베타 막횡단 도메인, CD4 막횡단 도메인, CD3 제타 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD134 막횡단 도메인, 또는 CD7 막횡단 도메인과 적어도 80, 90, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
세포내 활성화 도메인
활성화되었을 때, 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 전형적으로 하나 이상의 시토카인의 생산; 세포 사멸 증가; 및/또는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 자연 살해 T 세포, γδ T 세포, 및/또는 호중구의 증식 증가를 유도한다. 활성화 도메인은 또한 본원에서 활성화 도메인으로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포내 활성화 도메인은 하기 기술되는 바와 같이 적어도 1개의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 등) ITAM 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 활성화 도메인은 DAP10/CD28 타입 신호전달 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 활성화 도메인은 막 결합 조작된 신호전달 폴리펩티드에 공유적으로 결합되지 않고, 대신 세포질에서 확산된다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 측면의 세포내 활성화 도메인은 하기 기술되는 바와 같이 CD3Z, CD3D, CD3E, CD3G, CD79A, DAP12, FCERIG, DAP10/CD28, 또는 ZAP70 도메인과 적어도 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM) 함유 세포내 신호전달 폴리펩티드를 포함한다. ITAM 모티프는 YX1X2L/I이고, 여기서, X1 및 X2는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 세포내 활성화 도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 ITAM 모티프를 포함한다. 일부 경우에서, ITAM 모티프는 세포내 활성화 도메인에서 2회 반복되고, 여기서, ITAM 모티프의 제1 및 제2 예는 6 내지 8개의 아미노산, 예컨대, (YX1X2L/I)(X3)n(YX1X2L/I) (여기서, n은 정수 6 내지 8이고, 6-8개의 X3은 각각 임의의 아미노산일 수 있다)에 의해 서로 이격되어 있다. 일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 세포내 활성화 도메인은 3개의 ITAM 모티프를 포함한다.
적합한 세포내 활성화 도메인은 ITAM 모티프는 ITAM 모티프를 함유하는 폴리펩티드로부터 유래된 ITAM 모티프 함유 부분일 수 있다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 임의의 ITAM 모티프 함유 단백질로부터의 ITAM 모티프 함유 도메인일 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 그의 유래 기점이 되는 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요가 없다. 적합한 ITAM 모티프 함유 폴리펩티드의 예로는 CD3Z (CD3 제타); CD3D (CD3 델타); CD3E (CD3 엡실론); CD3G (CD3 감마); CD79A (항원 수용체 복합체-결합 단백질 알파 쇄); DAP12; 및 FCERIG (Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3Z, T 세포 수용체 T3 제타 쇄, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ 등으로도 또한 공지된) T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 쇄로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열 (2개의 이소폼) 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00001
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00002
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3D; CD3-DELTA; T3D; CD3 항원, 델타 서브유니트; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리펩티드 (TiT3 복합체); OKT3, 델타 쇄; T 세포 수용체 T3 델타 쇄; T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄 등으로도 또한 공지된) T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 쇄로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00003
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 델타 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: DQV YQPL RDRDDAQ YSHL GGN (서열 번호: 19) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3e, T 세포 표면 항원 T3/Leu-4 엡실론 쇄, T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄, AI504783, CD3, CD3엡실론, T3e 등으로도 또한 공지된) T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 쇄로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00004
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 엡실론 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: NPD YEPI RKGQRDL YSGL NQR (서열 번호: 21) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (CD3G, T 세포 수용체 T3 감마 쇄, CD3-GAMMA, T3G, 감마 폴리펩티드 (TiT3 복합체) 등으로도 또한 공지된) T 세포 표면 당단백질 CD3 감마 쇄로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00005
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 CD3 감마 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: DQL YQPL KDREDDQ YSHL QGN (서열 번호: 23) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (B 세포 항원 수용체 복합체-결합 단백질 알파 쇄; CD79a 항원 (면역글로불린-결합 알파); MB-1 막 당단백질; Ig-알파; 막 결합 면역글로불린-결합 단백질; 표면 IgM-결합 단백질 등으로도 또한 공지된)CD79A로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00006
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 CD79A 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: ENL YEGL NLDDCSM YEDI SRG (서열 번호: 26) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-결합 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질; 살해 활성화 수용체 회합 단백질; 살해-활성화 수용체-결합 단백질 등으로도 또한 공지된) DAP12로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열 (4개의 이소폼) 중 어느 하나의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00007
(여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 DAP12 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: ESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQ (서열 번호: 31), (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
일부 경우에서, 세포내 활성화 도메인은 (FCRG; Fc 엡실론 수용체 I 감마 쇄; Fc 수용체 감마 쇄; fc-엡실론 RI-감마; fcR감마; fceRI 감마; 고친화성 면역글로불린 엡실론 수용체 서브유니트 감마; 면역글로불린 E 수용체, 고친화성, 감마 쇄 등으로도 또한 공지된) FCERIG로부터 유래된 것이다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열의 약 50개의 아미노산 내지 약 60개의 아미노산 (aa), 약 60 aa 내지 약 70 aa, 약 70 aa 내지 약 80 aa, 또는 약 80 aa 내지 약 88 aa로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV YTGL STRNQET YETL KHEKPPQ (서열 번호: 32) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
유사하게, 적합한 세포내 활성화 도메인 폴리펩티드는 전장 FCERIG 아미노산 서열의 ITAM 모티프 함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: DGV YTGL STRNQET YETL KHE (서열 번호: 33) (여기서, ITAM 모티프는 굵은 밑줄체로 표시되어 있다).
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 DAP10/CD28 타입 신호전달 쇄를 포함한다. 아미노산 서열 중 DAP10 신호전달 쇄의 예는 RPRRSPAQDGKV YINM PGRG (서열 번호: 34)이다. 일부 실시양태에서, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: RPRRSPAQDGKV YINM PGRG (서열 번호: 34).
아미노산 서열 중 CD28 신호전달 쇄의 예는 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호: 35)이다. 일부 실시양태에서, 적합한 세포내 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNM TPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호: 35).
본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 세포내 활성화 도메인은 ZAP70 폴리펩티드이고, 예를 들어, 적합한 세포내 활성화 도메인은 하기 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와, 또는 하기 아미노산 서열의 약 300개의 아미노산 내지 약 400개의 아미노산, 약 400개의 아미노산 내지 약 500개의 아미노산, 또는 약 500개의 아미노산 내지 619개의 아미노산로 이루어진 연속 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00008
림프구 증식성 요소
말초 T 림프구 개수는, 흉선으로부터의 이주 및 항원 조우에 대한 반응으로 이루어진 증식에 기인한, 계속되는 세포 추가, 및 항원 제거 이후 항원 특이적 이펙터의 제거에 기인한 세포 손실에도 불구하고, 성년기 전기간 동안에 걸쳐 현저히 안정적인 수준으로 유지된다 (문헌 [Marrak, P. et al. 2000. Nat Immunol 1:107-111]; [Freitas, A.A. et al. 2000. Annu Rev Immunol 18:83-111]). 말초 T 세포 구획의 크기는 증식 및 생존, 둘 모두에 영향을 주는 다중 인자에 의해 조절된다. 그러나, 림프구 감소 환경에서, T 림프구는 말초 T 세포 구획의 크기를 유지하는 "급성 항상성 증식" 기전에 기인하여, 동족 항원과는 독립적으로 분열한다. 림프구 감소증에 대한 상태는 시험관내에서 T 세포를 증식하고, 그를 림프구가 제거된 대상체 내로 도입시켜 이식된 T 세포의 생착 및 항종양 기능을 증진시킴으로써 입양 세포 요법 동안 대상체 또는 환자에서 확립되었다. 그러나, 대상체의 림프구고갈은 면역 기능장애 및 사망을 비롯한 심각한 부작용을 유발할 수 있기 때문에 바람직하지 않다.
연구 결과, 림프구고갈은, 항상성 시토카인을 위한 세포 싱크로서 작용하는 내인성 림프구를 제거함으로써 시토카인을 제거하여 입양 방식으로 이식된 세포의 생존 및 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 일부 시토카인, 예컨대, 예를 들어, IL-7 및 IL-15는 T 세포의 항원 비의존적 증식을 매개하는 것으로 공지되어 있고, 따라서, 비림프구감소 환경에서 항상성 증식을 유도할 수 있다. 그러나, 상기 시토카인 및 그의 수용체는 항상성 상태에서 림프구 증식성 장애를 막는 내인성 제어 기전을 가진다.
본원에 제공된 다수의 측면은 전형적으로는 조작된 신호전달 폴리펩티드의 일부로서, 림프구 증식성 요소, 또는 상기를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에서 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 전형적으로, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 일부로서 림프구 증식성 요소를 코딩하는 게놈을 가지는 레트로바이러스로 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시킴으로써 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포 내로 도입된다. 림프구 증식성 요소는 시토카인, 또는 추가의 예시적인 실시양태에서, STAT3 경로, STAT4 경로, 또는 또한 추가의 예시적인 실시양태에서, Jak/STAT5 경로를 활성화시키는 시토카인 수용체, 또는 그의 신호전달 도메인을 포함하는 단편일 수 있다. 따라서, 림프구 증식성 요소는 비제한적인 예레서, 시토카인 수용체, 또는 그의 신호전달 도메인을 포함하는 활성 단편, 예컨대, STAT5를 활성화시키는 인터류킨 수용체, 또는 그의 신호전달 도메인을 포함하는 활성 단편일 수 있다. 따라서, 림프구 증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 유도하는 폴리펩티드이다. 예시적인 림프구 증식성 요소는 STAT5를 활성화시킴으로써 증식을 유도한다. 따라서, 상기 림프구 증식성 요소의 단편은 예시적인 실시양태에서, STAT5를 활성화시킴으로써 T 세포 및/또는 NK 세포의 증식을 유도할 수 있는 능력을 보유한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물 중 일부에서, 림프구 증식성 요소는 대상체에서 림프구를 고갈시켜야 할 필요 없이, 생체내에서의 유전적으로 변형된 T 세포의 증식 또는 확장을 촉진시키는 데 사용된다. 따라서, 전형적으로 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시킴으로써 상기 T 세포 및/또는 NK 세포 내로 림프구 증식성 요소를 삽입시키는 단계를 포함하는 본원에 제공된 방법의 비제한적인 예시적인 실시양태는 본 방법의 수행 이전, 그 동안 및/또는 그 이후에 대상체에서 림프구를 고갈시키지 않고, 또는 대상체로부터 혈액을 수집하기 전, 그 동안, 및 그 이후, 상기 방법을 수행하기 전에 림프구 고갈 없이, 또는 생체외에서 대상체로부터 T 세포 또는 NK 세포를 유전적으로 변형시키기 전, 그 동안 및/또는 그 이후에, 및/또는 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 재도입시키기 전, 그 동안 및/또는 그 이후에 림프구 고갈 없이 수행될 수 있다. 생체내에서 T 세포의 증식을 촉진시키는 인자는 시토카인 및 그의 수용체를 포함하고, 여기서, 수용체는 전형적으로 리간드 결합 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용되는 림프구 증식성 요소는 시토카인 및/또는 시토카인 수용체이다. 시토카인은 인터류킨일 수 있고, 시토카인 수용체는 인터류킨 수용체일 수 있다. 림프구 증식성 요소는 시토카인의 기능성 단편 및/또는 시토카인 수용체의 기능성 단편, 예컨대, 그의 신호전달 도메인일 수 있고, 여기서, 상기 단편은 예를 들어, STAT5를 활성화시킴으로써 T 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법 및 조성물에서 시토카인 림프구 증식성 요소는 하기: 인터류킨-7 (IL-7) 또는 그의 수용체 (IL-7R), 또는 그의 신호전달 도메인; 인터류킨-12 (IL-12) 또는 그의 수용체 (IL-12R), 또는 그의 신호전달 도메인; 인터류킨-23 (IL-23) 또는 IL-12Rβ1 및 IL-23R로 구성된, 그의 수용체, 또는 그의 신호전달 도메인; 인터류킨-27 (IL-27) 또는 그의 수용체 (IL-27R), 또는 그의 신호전달 도메인; 인터류킨-15 (IL-15) 또는 그의 수용체 (IL-15R), 또는 그의 신호전달 도메인; 인터류킨-21 (IL-21) 또는 그의 수용체 (IL-21R), 또는 그의 신호전달 도메인; 또는 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 또는 그의 수용체 (TGFβR) 또는 그의 신호전달 도메인; 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β-우성 음성 수용체 II (DNRII)) 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 IL-12R 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β-우성 음성 수용체 II (DNRII))이다.
IL-7은, IL-7R 알파 및 공동 감마 쇄 수용체로 구성된 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합한다. 결합하면, 흉선 내에서의 T 세포 발생 및 말초부 내에서의 생존에 중요한 신호 캐스캐이드가 일어난다. IL-7의 IL-7 수용체에의 결합이 Jak/STAT5 경로를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다.
IL-12는 나이브 T 세포의 Th1 세포로의 분화에 관여하고 (문헌 [Hsieh CS et al. 1993. Science. 260(5107):547-9]), T 세포 자극 인자로서 공지되어 있다. IL-12는, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2에 의해 형성된 이종이량체 수용체인 IL-12 수용체에 결합한다. IL12는 STAT4를 활성화시킴으로써 작용할 수 있지만, 이는 또한 T 세포에서 STAT5를 활성화시키는 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Ahn, H., et al. 1998. J. Immun . 161:5893-5900]). IL-12 패밀리는 시토카인 IL-12, IL-23, 및 IL-27로 구성된다. IL-23에 대한 수용체는 IL-12R β1 및 IL-23R로 구성된다. IL-27은 2개의 상이한 유전자, 엡스타인바 바이러스-유도 유전자 3 (EBI3) 및 IL-27p28로 구성된 이종이량체 시토카인이다. IL-27은 IL-27 수용체와 상호작용한다.
IL-15는 구조 및 기능이 IL-2와 유사한 T 및 NK 세포 자극 인자이다. 두 시토카인 모두 T 세포의 증식을 유도하고; 그의 공유 기능은 IL-2/IL-15Rβ 및 공통 γ 쇄를 사용하는 두 수용체 모두로부터 일어나는 것으로 간주된다. IL-15의 신호전달 경로는 IL-15Rα 수용체에의 결합에서부터 시작하고, 이어서, 그의 세포 표면 상의 IL-15Rβγc 복합체를 보유하는 주변 세포로 전해진다. 결합시, IL-15β 서브유니트는 야누스 키나제 1 (Jak1) 및 γc 서브유니트 야누스 키나제 3 (Jak3)을 활성화시키고, 이는 STAT3 및 STAT5의 인산화 및 활성화를 일으킨다.
IL-21은 활성화된 인간 CD4+ T 세포에서 및 NK T 세포에서 발현되고, IL-21 발현은 T 헬퍼 세포의 Th2 및 Th17 서브세트에서 상향 조절된다. IL-21 수용체 (IL-21R)는 T, B 및 NK 세포의 표면 상에서 발현되고, 이는 구조가 다른 타입 I 시토카인에 대한 수용체, 예컨대, IL-2R 또는 IL-15에 대한 수용체와 유사하다. IL-21R은 IL-21에 결합하기 위해 공통 감마 쇄 (γc)와의 이량체화를 필요로 한다. IL-21에의 결합시, IL-21 수용체는 STAT1, STAT3, 및 STAT5를 활성화시키면서, Jak/STAT 경로를 통해 작용한다.
TGFβ 유인 수용체 (TGF-β-우성 음성 수용체 II (DNRII))는 TGFβ 결합에 대하여 천연 수용체와 경쟁함으로써 TGFβ 신호전달을 차단한다. TGFβ-DNRII는 RII의 세포외 TGFβ 결합 도메인 막횡단 도메인을 함유하는, RII의 키나제 기능이 정지된(dead) 말단절단된 형태이다. TGFβ-DNRII는 리간드에 결합하지만, RI를 인산화 및 활성화시키지 않음으로써 Smad 인산화를 감소시키거나, 또는 그를 제거한다.
IL-7Rα의 기능 획득 돌연변이는 B 및 T 세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL 및 T-ALL)을 앓는 대상체에서 확인되었다 (문헌 [Zenatti PP, et al. 2011. Nat Genet 43:932-939]; [Snochat, C. et al. 2011. J Exp Med 208:901-908]; [McElroy, C.A. et al. 2012. PNAS 109(7):2503-2508]). 돌연변이는, 서열 거의 모두 추가의 Cys 잔기를 함유하는 IL-7Rα TMD의 N 말단 영역에 삽입 및 결실, 및 S165에서 C165로의 돌연변이를 포함하였다. 시스테인은 수용체의 구성적 활성화를 일으켰다. T-all 군에서 돌연변이 중 일부는 JAK1을 활성화시켰다. 상기 기능 획득 IL-7R 돌연변이체는 본원에 제공된 측면 중 임의의 것에서 림프구 증식성 요소(들)의 하나로서 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 돌연변이화된 IL-7 수용체이다. 다른 실시양태에서, 돌연변이화된 IL-7 수용체는 시토카인 리간드의 부재하에서 JAK-STAT5 경로를 활성화시키면서, 구성적으로 활성을 띤다. 추가의 다른 실시양태에서, 돌연변이화된 IL-7 수용체는 구성적으로 STAT5 경로를 활성화시킬 수 있는 능력을 포함하는, 시스테인 잔기를 포함하는 237 내지 254번 위치에 1 내지 10개의 아미노산 삽입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이화된 IL-7 수용체는 IL-7Rα-insPPCL (서열 번호: 82로 표시)이다.
일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 키메라 시토카인 수용체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 전형적으로 상응하는 활성화된 야생형 시토카인 수용체, 예컨대, STAT3, STAT4, 및 예시적인 실시양태에서, STAT5와 동일한 STAT 경로를 활성화시키는 그의 수용체에 테더링된 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 키메라 시토카인 수용체는 링커를 통해 그의 동족 수용체, 또는 그의 단편에 테더링, 또는 공유적으로 부착된 인터류킨, 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 키메라 시토카인 수용체는 IL-7Rα에 테더링된 IL-7이다. 다른 실시양태에서, 키메라 시토카인 수용체는 IL-7Rα의 도메인, 예컨대, 예를 들어, IL-7Rα의 세포외 도메인 및/또는 IL-7Rα의 막횡단 도메인에 테더링된 IL-7이다. 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 시토카인에 테더링되지 않은 시토카인 수용체이고, 실제로, 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 림프구 증식성 요소는 시토카인에 테더링되지 않은 구성적으로 활성을 띠는 시토카인 수용체이다. 이들 키메라 IL-7 수용체는 전형적으로, 발현되었을 때, STAT5를 구성적으로 활성화시킨다.
일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 시토카인 또는 시토카인 수용체가 아니라, 전형적으로, SOCS 경로에서 음성 조절인자를 분해하여 STAT5의 활성화를 증강시킴으로써 STAT5 경로를 자극시키는 miRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 증식에 영향을 주는 단백질, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL, 및 PD1에 대한 것이다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 예시된 바와 같이, 상기 miRNA는 패키징 세포 및/또는 재조합 레트로바이러스 게놈 중의 인트론 중에 위치할 수 있고, 전형적으로, 발현은 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 의해 구동된다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 전사 단위 중 인트론을 포함한다는 것을 전사체의 발현 및/또는 안정성을 더 높게 증가시킨다는 것으로 간주된다. 따라서, 레트로바이러스 게놈의 인트론 내에 miRNA를 배치시킬 수 있는 능력이 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스 게놈의 크기 제한으로부터 최대 활성을 얻고자 하는 선행 기술의 도전과제를 극복하는 본 개시내용의 교시에 추가된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 것이 각각 ABCG1, SOCS1, TGFbR2, SMAD2, cCBL, 및 PD1 중 하나 이상의 것을 코딩하는 핵산에 결합할 수 있는 것인, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 miRNA, 예시적인 실시양태에서, 2 내지 5개, 예를 들어, 4개의 miRNA는 본원에 제공된 방법을 사용하여 재조합 레트로바이러스 게놈에 포함될 수 있고, 표적 세포, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포로 전달될 수 있다. 실제로, 본원에 제공된 바와 같이, 1, 2, 3, 또는 4개의 miRNA가 단일 인트론 예컨대, EF1a 인트론에 전달될 수 있다.
ABCG1은 흉선세포 및 말초 림프구 증식을 음성적으로 조절하는 ATP 결합 카세트 수송체이다 (문헌 [Armstrong et al. 2010. J Immunol 184(1):173-183]).
SOCS1은 Jak/Stat 경로 예컨대, STAT5를 억제시키는 시토카인 신호 형질도입의 음성 조절인자의 SOCS (시토카인 신호전달의 억제인자) 패밀리의 구성원이다. SOCS1은 또한 JAB (야누스 키나제 결합 단백질), SSI-1 (Stat 유도 Stat 억제제-1), 및 TIP3 (Tec-상호작용 단백질)로서도 공지되어 있다.
TGFbR2는 TGF-β에 결합하여, 이후에 핵 내로 진입하고, 증식과 관련된 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 인산화시키는 복합체를 형성하는, 세린/트레오닌 단백질 키나제 패밀리의 구성원이다.
SMAD2는 형질전환 성장 인자 (TGF)-β의 신호를 매개하고, 다중 세포 프로세스, 예컨대, 세포 증식, 아폽토시스, 및 분화를 조절한다.
cCBL은 ZAP-70의 탈인산화 및 불활성화에 의해, 및 TCR의 내재화를 통해 TCR 신호전달을 억제시키는 E3 유비퀴틴 리가제이다.
PD1 (CD279)은 T 세포 및 ProB 상에서 발현되는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 두 리간드, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. PD-1을 통한 신호전달은 세포의 활성화를 방해하는 기능을 한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물 중 일부에서, 림프구 증식성 요소의 발현은, 비제한적인 실시양태에서, 리보스위치인 (본원 다른 곳에서 논의되는 것과 같은) 생체내 제어 요소에의 화합물의 결합에 의해 유도되고, 심지어는 그에 의존할 수 있다. 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터로부터 발현된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 경우, 당업자는 T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠고, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드, 또는 그의 임의 성분을 발현시키는 데 사용될 수 있는 프로모터가 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 실시양태에서, 상기 프로모터는 패키징 세포주, 예컨대, 본원에 개시된 패키징 세포주에서는 활성을 띠지 않는다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 EF1a 프로모터 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다 (문헌 [Jones et al., Human Gene Therapy (2009) 20: 630-40]). 예시적인 실시양태에서, 프로모터는 T 세포 특이적 CD3 제타 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 미세환경 제한적이다. 예를 들어, 림프구 증식성 요소는 생리적 조건 대비 비정성적인 조건하에서 차별적으로 그의 각 시토카인에 결합하는 돌연변이화된 수용체일 수 있다. 예를 들어, 정상적인 생리적 환경에서보다 종양 환경에서 더욱 강력하게 IL7에 결합할 수 있는 IL-7R이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 인식 또는 제거 도메인에 융합된다. 상기 인식 또는 제거 도메인은 본원에서 더욱 상세하게 개시된다. 상기와 같은 융합은, 특히 말단절단된 또는 다른 돌연변이화된 림프구 증식성 요소가 사용될 때, 레트로바이러스 게놈에서 더 적은 폴리뉴클레오티드를 필요로 한다는 이점을 제공한다. 본원에 제공된 예시적인 실시양태에서, 이는 기능성 요소를 코딩하는 핵산이 더 많이 레트로바이러스 게놈에 포함될 수 있게 하는 데 도움을 주기 때문에 중요하다. 다른 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 공동자극성 도메인 및/또는 세포내 활성화 도메인에 융합된다. 본원에 개시된 림프구 증식성 요소는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 세포내 활성화 도메인 또는 그의 공동자극성 도메인이 아니다. 그러나, 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR)에 융합될 수 있고, ASTR의 그의 항원에의 결합에 의해 활성화될 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 ASTR, 세포내 활성화 도메인 (예컨대, CD3 제타 신호전달 도메인), 공동자극성 도메인, 및 림프구 증식성 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극성 도메인, 세포내 활성화 도메인, ASTR 및 다른 CAR 도메인에 관한 추가의 상세한 설명은 본원 다른 곳에 개시되어 있다.
본원 예시적인 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소는, 전형적으로, 그의 게놈이 T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소를 조작된 신호전달 폴리펩티드의 일부로서 코딩하는 것인 레트로바이러스로 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포를 형질도입시킴으로써 휴지기 T 세포 및/또는 휴지기 NK 세포 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 또한 T 세포 및/또는 NK 세포 생존 요소이다. 상기 논의된 바와 같이, 림프구 증식성 요소 중 일부는 증식을 촉진시킬 뿐만 아니라, 그들은 또한 세포 생존도 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 생존 모티프는 림프구 증식성 요소가 아니다. 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포 생존 모티프는 CD28 T 세포 생존 모티프 또는 CD137 세포 생존 모티프일 수 있다. 상기 T 세포 생존 모티프는 ASTR, 예컨대, scFV를 포함하는 조작된 신호전달 폴리펩티드 상에서 발견될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, T 세포 생존 모티프는 CD8a 막횡단 도메인 또는 CD28 막횡단 도메인을 통해 scFv에 연결된 CD28 T 세포 생존 모티프 또는 CD137 모티프이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 서열은 CD3ζ 신호전달 도메인이다.
조정 도메인
조정 도메인은, 활성화 도메인의 하류 효과를 증진시키거나, 또는 감소시키거나, 또는 반응의 성질을 변경시키는 것과 같이, 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 세포내 활성화 도메인의 효과를 변경시킬 수 있다. 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 조정 도메인은 공동자극성 도메인을 포함한다. 조작된 신호전달 폴리펩티드 중에 포함시키는 데 적합한 조정 도메인의 길이는 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산 (aa) 길이일 수 있고, 예컨대, 조정 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa 길이일 수 있다. 다른 경우에서, 조정 도메인의 길이는 약 70 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 또는 200 aa 초과인 길이일 수 있다.
공동자극성 도메인은 전형적으로 활성화 도메인에 대한 반응의 성질을 증진시키고/거나, 그를 변경시킨다. 본 개시내용의 조작된 신호전달 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 공동자극성 도메인은 일반적으로 수용체로부터 유래된 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 공동자극성 도메인은 동종이량체화된다. 대상 공동자극성 도메인은 막횡단 단백질의 세포내 부분일 수 있다 (즉, 공동자극성 도메인은 막횡단 단백질로부터 유래된 것일 수 있다). 적합한 공동자극성 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 4-1BB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합 결실 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 및 HVEM을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 측면의 공동자극성 도메인은 4-1BB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합 결실 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 또는 HVEM의 공동자극성 도메인과 적어도 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 측면의 공동자극성 도메인은 공동자극성 도메인과 적어도 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 적합한 공동자극성 폴리펩티드의 비제한적인 예는 4-1BB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합 결실 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 및 HVEM을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 측면의 공동자극성 도메인은 4-1BB (CD137), CD27, CD28, Lck 결합 결실 CD28 (ICΔ), ICOS, OX40, BTLA, CD27, CD30, GITR, 또는 HVEM의 공동자극성 도메인과 적어도 80%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
조작된 신호전달 폴리펩티드 중에 포함시키는 데 적합한 공동자극성 도메인의 길이는 약 30개의 아미노산 내지 약 70개의 아미노산 (aa) 길이일 수 있고, 예컨대, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa 길이일 수 있다. 다른 경우에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 70 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 또는 200 aa 초과인 길이일 수 있다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDwl37; ILA 등으로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 CD137의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (서열 번호: 1) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (Tp44로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 CD28의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (서열 번호: 2) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 막횡단 단백질 Lck 결합 결실 CD28 (ICΔ)의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQAYAAARDFAAYRS (서열 번호: 3) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (AILIM, CD278, 및 CVIDl로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 ICOS의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (서열 번호: 4) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX-40, TXGPlL로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 OX40의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (서열 번호: 5) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (S 152, T 14, TNFRSF7, 및 Tp55로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 CD27의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (서열 번호: 6) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (BTLA1 및 CD272로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 BTLA의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00009
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (TNFRSF8, DlS166E, 및 Ki-1로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 CD30의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열의 약 100개의 아미노산 내지 약 110개의 아미노산 (aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 또는 약 160 aa 내지 약 185 aa로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다:
Figure 112018099692761-pct00010
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357, 및 GITR-D로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 GITR의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (서열 번호: 9) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
일부 경우에서, 공동자극성 도메인은 (TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR,CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, 및 TR2로도 또한 공지된) 막횡단 단백질 HVEM의 세포내 부분으로부터 유래된 것이다. 예를 들어, 적합한 공동자극성 도메인은 하기 아미노산 서열: CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH (서열 번호: 10) 중 적어도 10, 15, 20개의 아미노산, 또는 그들 모두로 이루어진 스트레치와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함할 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, 제1 및 제2 폴리펩티드, 둘 모두의 공동자극성 도메인의 길이는 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa이다.
링커
일부 경우에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 인접한 임의의 두 도메인 사이의 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 막횡단 도메인과 제1 공동자극성 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, ASTR은 항체일 수 있고, 링커는 중쇄와 경쇄 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 막횡단 도메인과 공동자극성 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 제2 폴리펩티드의 공동자극성 도메인과 세포내 활성화 도메인 사이에 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 ASTR과 세포내 신호전달 도메인 사이에 있을 수 있다
링커 펩티드는 다양한 아미노산 서열 중 임의의 것을 가질 수 있다. 단백질은, 비록 다른 화학적 결합이 배제되는 것은 아니지만, 일반적으로는 가요성 성질을 가지는 스페이서 펩티드에 의해 연결될 수 있다. 링커의 길이는 약 1 내지 약 100개의 아미노산 길이, 또는 약 1 내지 약 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 상기 링커는 단백질을 커플링하는 합성, 링커 코딩 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 제조될 수 있다. 어느 정도의 가용성을 가지는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 적합한 링커는 일반적으로 가용성 펩티드를 생성하는 서열을 가질 것이라는 것을 유념하면서, 연결 펩티드는 실제로 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 작은 아미노산, 예컨대, 글리신 및 알라닌을 사용하는 것이 가용성 펩티드를 생성하는 데 유용하다. 상기와 같은 서열의 생성은 당업자에게 통상적인 것이다.
적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있고, 상이한 길이, 예컨대, 1개의 아미노산 (예컨대, Gly) 내지 20개의 아미노산, 2개의 아미노산 내지 15 아미노산, 3개의 아미노산 내지 12 아미노산 (4개의 아미노산 내지 10 아미노산, 5개의 아미노산 내지 9 아미노산, 6개의 아미노산 내지 8 아미노산, 또는 7개의 아미노산 내지 8 아미노산 포함) 길이의 적합한 것 중 임의의 것일 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산 길이일 수 있다.
예시적인 가요성 링커로는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, GSGGSn, GGGSn, 및 GGGGSn (여기서, n은 1 이상의 정수이다) 포함), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 관심의 대상이 되는데, 그 이유는 상기 두 아미노산 모두 비교적 비구조적이고, 이에, 성분들 사이의 중성 테더로서 작용할 수 있기 때문이다. 글리신 중합체가 특히 관심의 대상이 되는데, 그 이유는 글리신이 심지어 알라닌보다 유의적으로 더욱 많은 phi-psi 공간에 접근할 수 있고, 긴 측쇄를 가진 잔기보다 제한이 훨씬 더 적기 때문이다 (문헌 [Scheraga, Rev. Computational Chem . 11173-142 (1992)] 참조). 예시적인 가요성 링커로는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 53), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호: 54), GGGGSGGGSGGGGS (서열 번호: 55), GGSG (서열 번호: 56), GGSGG (서열 번호: 57), GSGSG (서열 번호: 58), GSGGG (서열 번호: 59), GGGSG (서열 번호: 60), GSSSG (서열 번호: 61) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당업계의 숙련가는 상기 기술된 임의 요소에 접합된 펩티드 디자인은 모두가 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있고, 이로써, 링커는 가요성 링커 뿐만 아니라, 가요성이 더 적은 구조를 제공하는 하나 이상의 부분도 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
키메라 항원 수용체
본 발명의 일부 측면에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 간결하게 하기 위해 본원에서 "CAR"로 지칭되는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR은 a) 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR); b) 막횡단 도메인; 및 c) 세포내 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, CAR의 항원 특이적 표적화 영역은 표적 항원에 대한 항체의 scFv 부분이다.
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포의 원형질 막에 존재할 수 있고, 여기서, 적합한 포유동물 세포는 세포독성 세포, T 림프구, 줄기 세포, 줄기 세포의 자손, 전구 세포, 전구 세포의 자손, 및 NK 세포,NK-T 세포, 및 대식세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 본 개시내용의 CAR은 특정 조건하에서 ASTR에 결합하는 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서 활성을 띤다. 표적 항원은 특이적 결합 쌍의 제2 구성원이다. 특이적 결합 쌍의 표적 항원은 가용성 (예컨대, 세포에 결합하지 않은) 인자; 세포, 예컨대, 표적 세포의 표면 상에 존재하는 인자; 고체 표면 상에 존재하는 인자; 지질 이중층에 존재하는 인자 등 일 수 있다. ASTR이 항체인 경우, 특이적 결합 쌍의 제2 구성원은 항원이고, 항원은 가용성 (예컨대, 세포에 결합하지 않은) 항원; 세포, 예컨대, 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원; 고체 표면 상에 존재하는 항원; 지질 이중층에 존재하는 항원 등 일 수 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 세포에서 적어도 하나의 핵산의 발현을 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서의 핵산의 전사 수준과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 초과만큼 증가시킨다.
예로서, 본 개시내용의 CAR은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM) 함유 세포내 신호전달 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 일부 경우에서, 세포에 의한 하나 이상의 시토카인의 생산을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 세포에 의한 하나 이상의 시토카인의 생산을 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서 세포에 의해 생산되는 시토카인의 양과 비교하였을 때, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 초과만큼 증가시킬 수 있다. 그의 생산이 증가될 수 있는 시토카인으로는 인터페론 감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-a), IL-2, IL-15, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10; 케모카인; 성장 인자 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 세포에서의 핵산의 전사를 증가시키고, 세포에 의한 시토카인의 생산을 증가시키는, 이 두 모두를 일으킬 수 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, CAR의 제1 폴리펩티드의 항원 결합 도메인의 결합 대상이 되는 세포 표면 항원을 그의 세포 표면 상에서 발현하는 표적 세포에 대하여 세포에 의한 세포독성 활성을 일으킨다. 예를 들어, 진핵 세포가 세포독성 세포 (예컨대, NK 세포 또는 세포독성 T 림프구)일 경우, 본 개시내용의 CAR은 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 그의 세포 표면 상에 하나 이상의 표적 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 예를 들어, 진핵 세포가 NK 세포 또는 T 림프구일 경우, 본 개시내용의 CAR은 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 세포의 세포독성 활성을 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서의 세포의 세포독성 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 초과만큼 증가시킨다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 다른 CAR 활성화 관련 이벤트, 예컨대, (세포 분열 또는 항-아폽토시스 반응 증가에 기인한) 증식 및 확장을 일으킬 수 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포의 원형질 막에 존재할 때, 및 하나 이상의 표적 항원에 의해 활성화되었을 때, 다른 CAR 활성화 관련 이벤트, 예컨대, 세포내 신호전달 조정, 세포 분화, 또는 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에 존재할 수 있고, 여기서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서로 공유적으로 연결되어 있지 않다. 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에서 임의의 다른 폴리펩티드에 공유적으로 연결되어 있지 않은 단일 이종이량체로서 상기 막에 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 제1 CAR은 본 개시내용의 제2 CAR에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되어 있는 이종이량체로서 진핵 세포 막에 존재할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 및 제2 CAR은 제1 CAR의 제1 폴리펩티드 및 제2 CAR의 제1 폴리펩티드, 둘 모두에 존재하는 스토크에 존재하는 시스테인 사이에 형성된 이황화 결합을 통해 공유적으로 연결되어 있다.
일부 경우에서, 본 개시내용의 CAR은 진핵 세포 막에 존재할 수 있고, 여기서, CAR의 제1 폴리펩티드는 CAR의 제1 폴리펩티드를 포함하는 CAR의 제2 폴리펩티드는 시토카인 수용체로부터 유래된 신호 신호전달 도메인을 포함하고, 이로써, 이량체화시, CAR은 이종이량체-시그널로바디 CAR, 예컨대, 적어도 2개의 비의존성 폴리펩티드로 구성된 시그널로바디를 나타낼 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, "시그널로바디"는 시토카인 수용체로부터 유래된 신호 신호전달 도메인으로 구성된 단일 키메라 거대분자이다. 특정 경우에서, 본 개시내용의 이종이량체-시그널로바디 CAR은 세포의 세포 막에 존재하고, 이량체화제에 의해 이량체화되고, 항원, 예컨대, 올리고머화된 항원에 의해 활성화되었을 때, 이종이량체-시그널로바디 CAR의 올리고머화를 유도할 수 있다. 이종이량체-시그널로바디 CAR의 상기 리간드 유도 올리고머화는 신호 신호전달을 활성화, 예컨대, 증가시킬 수 있거나, 또는 영구화, 예컨대, 유지시킬 수 있고, 예컨대, 이종이량체-시그널로바디 CAR의 리간드 유도 올리고머화는 세포 반응을 유도하는 신호를 전송할 수 있다. 일부 경우에서, 복수 개의 이종이량체-시그널로바디 CAR은 원하는 세포 반응을 유도하기 위해 조합적으로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR은 미세환경 제한적이다. 상기 특성은 전형적으로 CAR의 ASTR 도메인의 미세환경 제한 성질의 결과이다. 따라서, 본 개시내용의 CAR은 정상적인 생리적 환경 중에서의 조건하에서보다 미세환경에서의 조건(들)하에서 하나 이상의 표적 항원에 대하여 더 낮은 결합 친화도를 가질 수 있거나, 또는 예시적인 실시양태에서, 더 높은 결합 친화도를 가질 수 있다.
서열의 재조합
특정 경우에서, 본원에서 재조합 폴리펩티드로서 지칭될 수 있는 조작된 신호전달 폴리펩티드의 서열은 부위 특이적 재조합 기술의 사용을 통해 세포에서 재배열되거나, 또는 결실될 수 있다. 특정 실시양태에서, 특정 조작된 신호전달 폴리펩티드에 대한 세포 활성화 관련 반응은 부위 특이적 재조합에 의해 변경될 수 있고, 예컨대, 제1 활성화 관련 반응을 유도하는, 조작된 신호전달 폴리펩티드의 제1 세포내 활성화 도메인은 제2 활성화 관련 반응을 유도하는 제2 세포내 활성화 도메인 대신으로 교체될 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 부위 특이적 재조합은 조작된 신호전달 폴리펩티드의 임의의 도메인 또는 서열을 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 도메인 또는 서열로 교체시키는 데 세포에서 사용될 수 있다. 또한 당업자에게 자명한 바와 같이, 부위 특이적 재조합은 조작된 신호전달 폴리펩티드의 임의의 도메인 또는 서열을 결실시키는 데 세포에서 사용될 수 있다. 서열 및 도메인의 상기와 같은 교체 및 절제는 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Tone et al. (2013) Biotechnology and Bioengineering, 3219-3226] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 개시된다)에 기술된 바와 같은 시그널로바디에서의 도메인 스위칭을 참조한다. 부위 특이적 재조합을 수행하기 위한 기전 및 요건은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605] 및 [Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA)] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 상기 논의된 상이한 도메인들 모두를 함께 융합시켜 융합 단백질을 형성함으로써 생성된다. 조작된 신호전달 폴리펩티드는 전형적으로 본원에서 논의된 바와 같은 조작된 신호전달 폴리펩티드의 상이한 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 전사 단위에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 표적 세포 상의 항원을 인식하고, 그와 결합하는 기능을 하는, 본 발명의 ASTR은 미세환경 제한적이다.
본 발명에서 ASTR은 단백질 라이브러리를 생성하고, 표적 항원에 대하여 원하는 결합 친화도를 가지는 단백지에 대하여 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견될 수 있는 것과 같이, 사용에 적합한 야생형 또는 천연 단백질은 전체적으로 또는 부분적으로 표적 항원에 대한 적어도 그의 결합 도메인에 대하여 발견될 수 있다. 야생형 단백질은 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. cDNA 라이브러리는 유기체의 트랜스크립톰의 부분 일부를 함께 구성하는, 숙주 세포 집단 내로 삽입되는 클로닝된 cDNA (상보성 DNA) 단편의 조합이다. cDNA는 완전히 전사된 mRNA로부터 제조되고, 이에, 유기체의 발현된 단백질에 대한 코딩 서열을 함유한다. cDNA 라이브러리에 있는 정보는 표적 항원에 대하여 원하는 결합 친화도를 가지는 단백질에 대한 라이브러리를 스크리닝함으로써 원하는 특성을 가지는 단백질을 발견하기 위한 것으로서 강력하고, 유용한 도구가 된다.
조합물
일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스에 의해 제공되는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드의 특정 조합을 코딩하는 하나 이상의 전사 단위를 가진다. 본원에 제공된 일부 방법 및 조성물에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 재조합 레트로바이러스에 의한 T 세포의 형질도입 이후에 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드의 조합을 포함한다. 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드 등으로 언급하는 것은 편의상 그러한 것이며, "제1 폴리펩티드" 상의 요소 및 "제2 폴리펩티드" 상의 요소라는 것은 전형적으로는 단지 추가 요소 또는 단계에서 상기 구체적인 폴리펩티드에 대한 언급 및 관례상 제1 또는 제2로 언급되는 상이한 폴리펩티드 상에 존재한다는 것을 의미한다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 항원에 결합할 수 있는 세포외 항원 결합 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 또한 T 세포 생존 모티프 및/또는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 공동자극성 도메인을 포함하지 않는 반면, 다른 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 공동자극성 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 유전자 생성물 및 임의적으로 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 또한 T 세포 생존 모티프, 세포내 신호전달 도메인, 및 하나 이상의 공동자극성 도메인 중 하나 이상의 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드가 사용될 때, 적어도 하나는 CAR이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드는, 전사체에서 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRE) 또는 하나 이상의 프로테아제 절단 펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 분리되어 있는 것인, 동일한 전사체하에 T 세포 특이적 프로모터 또는 일반 프로모터하에서 발현된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 제1 항원에 결합할 수 있는 제1 세포외 항원 결합 도메인, 및 공동자극성 도메인이 아닌 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 VEGF에 결합할 수 있는 제2 세포외 항원 결합 도메인, 및 제2 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 예를 들어, 공동자극성 분자의 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항원은 PSCA, PSMA, 또는 BCMA이다. 특정 실시양태에서, 제1 세포외 항원 결합 도메인은 항체 또는 그의 단편 (예컨대, scFv), 예컨대, PSCA, PSMA, 또는 BCMA에 특이적인 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, VEGF에 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인은 VEGF에 대한 수용체, 즉, VEGFR이다. 특정 실시양태에서, VEGFR은 VEGFR1, VEGFR2, 또는 VEGFR3이다. 특정 실시양태에서, VEGFR은 VEGFR2이다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 세포외 종양 항원 결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는, 항원이 혈관신생 또는 혈관형성 인자인 것인 항원 결합 도메인, 및 하나 이상의 공동자극성 분자 신호전달 도메인을 포함한다. 혈관신생 인자는 예컨대, VEGF일 수 있다. 하나 이상의 공동자극성 분자 신호전달 모티프는 예컨대, CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB 각각으로부터의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 세포외 종양 항원 결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 VEGF에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인, 및 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB 각각으로부터의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 제1 신호전달 폴리펩티드 또는 제2 신호전달 폴리펩티드는 또한 T 세포 생존 모티프를 가진다. 일부 실시양태에서, T 세포 생존 모티프는 IL-7 수용체 (IL-7R)의 세포내 신호전달 도메인, IL-12 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-15 수용체의 세포내 신호전달 도메인, IL-21 수용체의 세포내 신호전달 도메인, 또는 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 수용체 또는 TGFβ 유인 수용체 (TGF-β-우성 음성 수용체 II (DNRII))의 세포내 신호전달 도메인이거나, 또는 그로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 세포외 종양 항원 결합 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 VEGF에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인, IL-7 수용체 세포내 T 세포 생존 모티프, 및 CD27, CD28, OX40, ICOS, 및 4-1BB 각각으로부터의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 2개 초과의 신호전달 폴리펩티드는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 단 하나의 조작된 신호전달 폴리펩티드가 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고; 나머지 조작된 신호전달 폴리펩티드들은 각각 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원이 아닌 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드는 하나 이상의 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서, 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 적어도 하나는 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양 연관 항원 또는 종양 특이적 항원은 Her2, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), PSMA (전립선 특이적 막 항원), B 세포 성숙 항원 (BCMA), 알파-태아단백질 (AFP), 암배아 항원 (CEA), 암 항원-125 (CA-125), CA19-9, 칼레티닌, MUC-1, 상피 막 단백질 (EMA), 상피 종양 항원 (ETA), 티로시나제, 흑색종 연관 항원 (MAGE), CD34, CD45, CD99, CD117, 크로모그라닌, 시토케라틴, 데스민, 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP), 육안적 낭포증 유체 단백질 (GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A (T 림프구에 의해 인식되는 흑색종 항원; MART-1), 미오-D1, 근육 특이적 액틴 (MSA), 신경잔섬유, 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE), 태반 알칼리성 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루베이트 키나제 동종효소 타입 M2의 이량체 형태 (종양 M2-PK), CD19, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (강글리오시드 G2), EphA2, CSPG4, CD138, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), CD171, 카파, 람다, 5T4, ανβ6 인테그린, 인테그린 ανβ3 (CD61), 갈락틴, K-Ras (V-Ki-ras2 키르스텐(Kirsten) 래트 육종 바이러스 온코진), Ral-B, B7-H3, B7-H6, 미국 CAIX, CD20, CD33, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, EGFR, EGP2, EGP40, EpCAM, 태아 AchR, FRα, GD3, HLA-A1+MAGE1, HLA-A1+NY-ESO-1, IL-11Rα, IL-13Rα2, 루이스(Lewis)-Y, Muc16, NCAM, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, PRAME, ROR1, Survivin, TAG72, TEMs, VEGFR2, EGFRvIII (표피 성장 인자 변이체 III), 정자 단백질 17 (Sp17), 메소텔린, PAP (전립선 산성 포스파타제), 프로스테인, TARP (T 세포 수용체 감마 교대 리딩 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1 (전립선 1의 6-막횡단 상피 항원), 비정상 ras 단백질, 또는 비정상 p53 단백질이다.
일부 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 제1 항원에 결합하는 제1 세포외 항원 결합 도메인, 및 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고; 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 제2 항원에 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인, 또는 제2 항원에 결합하는 수용체; 및 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 공동자극성 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인 및 제2 항원 결합 도메인은 독립적으로 수용체의 항원 결합부 또는 항체의 항원 결합부이다. 특정 실시양태에서, 제1 항원 결합 도메인 또는 제2 항원 결합 도메인 중 어느 하나 또는 그 둘 모두 scFv 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 추가로 막횡단 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 T 세포 생존 모티프, 예컨대, 본원에 기술된 T 세포 생존 모티프 중 임의의 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 HER2에 결합하는 제1 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드는 MUC-1에 결합하는 제2 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 제2 세포외 항원 결합 도메인은 인터류킨에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 제2 세포외 항원 결합 도메인은 손상 연관 분자 패턴 분자 (DAMP; 알라르민으로도 또한 공지)에 결합한다. 다른 실시양태에서, DAMP는 열 충격 단백질, 크로마틴-결합 단백질 고이동성 군 박스 1 (HMGB1), S100A8 (MRP8, 또는 칼그라뉼린 A로도 또한 공지), S100A9 (MRP14, 또는 칼그라뉼린 B로도 또한 공지), 혈청 아밀로이드 A (SAA), 데옥시리보핵산, 아데노신 트리포스페이트, 요산, 또는 헤파린 술페이트이다.
특정 실시양태에서, 상기 제2 항원은 종양 세포에 의해 제시되는 항원에 결합하는 항체 상의 항원이다.
일부 실시양태에서, 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 통한 신호 신호전달 활성화는 비항원성이지만, 저산소증과는 연관이 있다. 특정 실시양태에서, 저산소증은 저산소증 유도가능한 인자-1α (HIF-1α), HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF-3α, 또는 HIF-3β의 활성화에 의해 유도된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 본원에 더욱 상세하게 개시된 생체내 제어 요소에 의해 조절된다.
추가의 서열
조작된 신호전달 폴리펩티드, 예컨대, CAR은 하나 이상의 추가의 폴리펩티드 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 상기 도메인은 신호 서열; 에피토프 태그; 친화성 도메인; 및 검출가능한 신호를 생성하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 제공된 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 대한 추가의 도메인의 비제한적인 예는 하기에서 기술되는 바와 같은 하기 서열: 신호 서열, 에피토프 태그, 친화성 도메인, 또는 검출가능한 신호를 생성하는 폴리펩티드와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 도메인을 포함한다.
대상 CAR에서, 예컨대, 대상 CAR의 제1 폴리펩티드에서 사용하기에 적합한 신호 서열로는 자연적으로 발생된 신호 서열, 합성 (예컨대, 인공) 신호 서열 등을 비롯한, 임의의 진핵 신호 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 신호 서열은 CD8 신호 서열 MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열 번호: 74)일 수 있다.
적합한 에피토프 태그로는 헤마글루티닌 (HA; 예컨대, YPYDVPDYA; 서열 번호: 37); FLAG (예컨대, DYKDDDDK; 서열 번호: 38); c-myc (예컨대, EQKLISEEDL; 서열 번호: 39) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
친화성 도메인은 확인 또는 정제에 유용한, 결합 파트너, 예컨대, 예로서, 고체 지지체 상에 고정화되어 있는 것과 상호작용할 수 있는 펩티드 서열을 포함한다. 다중 연속 단일 아미노산, 예컨대, 히스티딘을 코딩하는 DNA 서열은 발현된 단백질에 융합되었을 때, 수지 칼럼, 예컨대, 니켈 세파로스에의 고친화성 결합에 의한 재조합 단백질의 1 단계 정제를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 친화성 도메인은 His5 (HHHHH; 서열 번호: 40), HisX6 (HHHHHH; 서열 번호: 41), c-myc (EQKLISEEDL; 서열 번호: 39), Flag (DYKDDDDK; 서열 번호: 38), Strep Tag (WSHPQFEK; 서열 번호: 42), 헤마글루티닌, 예컨대, HA Tag (YPYDVPDYA; 서열 번호: 37), GST, 티오레독신, 셀룰로스 결합 도메인, RYIRS (서열 번호: 43), Phe-His-His-Thr (서열 번호: 44), 키틴 결합 도메인, S-펩티드, T7 펩티드, SH2 도메인, C-단부 RNA 태그, WEAAAREACCRECCARA (서열 번호: 45), 금속 결합 도메인, 예컨대, 아연 결합 도메인 또는 칼슘 결합 도메인, 예컨대, 칼슘 결합 단백질, 예컨대, 칼모듈린, 트로포닌 C, 칼시뉴린 B, 미오신 경쇄, 리코베린, S-모듈린, 비시닌, VILIP, 뉴로칼신, 히포칼신, 프리쿠에닌, 칼트락틴, 칼파인 큰 서브유니트, S100단백질, 파르브알부민, 칼빈딘 D9K, 칼빈딘 D28K, 및 칼레티닌으로부터의 것, 인테인, 비오틴, 스트렙트아비딘, MyoD, Id, 류신 지퍼 서열, 및 말토스 결합 단백질을 포함한다
적합한 검출가능한 신호 생성 단백질로는 예컨대, 형광성 단백질; 생성물로서 검출가능한 신호를 생성하는 반응을 촉매화시키는 효소를 포함한다.
적합한 형광성 단백질로는 녹색 형광성 단백질 (GFP) 또는 그의 변이체, GFP의 청색 형광성 변이체 (BFP), GFP의 청록색 형광성 변이체 (CFP), GFP의 황색 형광성 변이체 (YFP), 증강된 GFP (EGFP), 증강된 CFP (ECFP), 증강된 YFP (EYFP), GFPS65T, 에메랄드(Emerald), 토파즈(Topaz) (TYFP), 비너스(Venus), 시트린(Citrine), m시트린, GFPuv, 탈안정화된 EGFP (dEGFP), 탈안정화된 ECFP (dECFP), 탈안정화된 EYFP (dEYFP), mCFPm, 세룰리언(Cerulean), T-사파이어(T-Sapphire), CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-단량체, J-레드(J-Red), 다이머2(dimer2), t-다이머2(12), mRFPl, 포실로포린, 레닐라(Renilla) GFP, 몬스터(Monster) GFP, paGFP, 카에데(Kaede) 단백질 및 발화(kindling) 단백질, 피코빌리단백질 및 B-피코에리트린, R-피코에리트린 및 알로피코시아닌을 포함하는 피코빌리단백질 접합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 형광성 단백질의 다른 예로는 m허니듀(mHoneydew), m바나나(mBanana), m오렌지(mOrange), d토마토(dTomato), td토마토(tdTomato), m탄제린(Tangerine), m스트로베리(Strawberry), m체리(Cherry), m그라펠(mGrapel), m라스베리(mRaspberry), m그레이프2(mGrape2), m플럼(mPlum) (문헌 [Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2:905-909]) 등을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973]에 기술된 바와 같은, 산호충류 종으로부터의 다양한 형광성 및 착색 단백질 중 임의의 것이 사용하기에 적합하다.
적합한 효소로는 호오스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 베타-갈락토시다제 (GAL), 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 베타-N-아세틸글루코사미니다제, β-글루쿠로니제, 인버타제, 크산틴 옥시다제, 반딧불이 루시페라제, 글루코스 옥시다제 (GO) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
인식 및/또는 제거 도메인
본원에 제공된 재조합 레트로바이러스 중 임의의 것은 본원에 제공된 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산의 일부로서, 또는 그로부터 분리된 인식 또는 제거 도메인을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 임의의 것은 인식 또는 제거 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 CAR 중 임의의 것은 인식 또는 제거 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 인식 또는 제거 도메인은 본원에 개시된 림프구 증식성 요소와 함께 발현되거나, 또는 심지어는 그와 함께 융합될 수 있다. 인식 또는 제거 도메인은 T 세포 및/또는 NK 세포 상에서 발현되지만, 레트로바이러스 상에서는 발현되지 않는다.
일부 실시양태에서, 인식 또는 제거 도메인은 헤르페스 심플렉스 바이러스 유래 효소 티미딘 키나제 (HSV-tk) 또는 유도가능한 카스파제-9로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 또는 제거 도메인은 예를 들어, 미국 특허 8,802,374에 개시된 바와 같이, 변형된 내인성 세포 표면 분자를 포함할 수 있다. 변형된 내인성 세포 표면 분자는 임의의 세포 표면 관련 수용체, 리간드, 당단백질, 세포 부착 분자, 항원, 인테그린, 또는 변형된 분화 클러스터 (CD)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 내인성 세포 표면 분자는 말단절단된 티로신 키나제 수용체이다. 한 측면에서, 말단절단된 티로신 키나제 수용체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 패밀리 (예컨대, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 인식 도메인은 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 도메인은 EGFR 패밀리 구성원의 적어도 20개의 연속 아미노산, 또는 예를 들어, EGFR 패밀리 구성원의 20 내지 50개의 연속 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 78은 EGFR 구성원의 세포외 도메인을 인식하는 항체에 의해 인식되고, 적절한 조건하에서 그에 의해 결합이 이루어지는 예시적인 폴리펩티드이다. 상기 세포외 EGFR 에피토프는 종종 본원에서 eTag로서 지칭된다. 예시적인 실시양태에서, 상기 에피토프는 상업적으로 이용가능한 항-EGFR 단일클론 항체에 의해 인식된다.
EGFR, ErbB1 및 HER1로도 또한 공지된 표피 성장 인자 수용체는 세포외 리간드의 표피 성장 인자 패밀리의 구성원에 대한 세포 표면 수용체이다. EGFR 활성 변경이 특정 암에 연루되어 왔다. 일부 실시양태에서, 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 비롯한 EGFR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 막 원위 EGF 결합 도메인 및 세포질 신호전달 테일을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 제거에 의해 구축되지만, 항-EGFR 항체에 의해 인식되는 세포외 막 근위 에피토프는 보유한다. 바람직하게, 항체는 공지된, 상업적으로 이용가능한 항-EGFR 단일클론 항체, 예컨대, 세툭시맙, 마투주맙, 네시투무맙 또는 파니투무맙이다.
다른 발명자들을 통해, 항-비오틴 마이크로비드와 함께 조합하여 면역자기 선별에 비오티닐화된 세툭시맙을 적용시키는 것이 렌티바이러스에 의해 EGFRt 함유 구축물로 형질도입된 T 세포를 세포 제제에 대한 관찰가능한 독성 없이 집단의 2% 정도로 낮은 순도에서부터 90% 초과의 순도까지 성공적으로 농축시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 다른 발명자들을 통해 상기 불활성 EGFR 분자의 구성적 발현은 협조된 방식으로 발현된 키메라 항원 수용체 (CAR), CD19R의 지시에 따라 T 세포 표현형 또는 이펙터 기능에 영향을 주는 것이 아닌 것으로 밝혀졌다. 추가로, 유세포 분석법에 의한 분석을 통해, EGFR은 마우스에서 T 세포 생착에 대한 생체내 추적 마커로서 성공적으로 사용되었다는 것이 다른 발명자들을 통해 밝혀졌다. 추가로, EGFR은 얼비툭스(Erbitux)® 매개 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 경로를 통해 자살 유전자 잠재능을 가지는 것으로 입증되었다. 본 개시내용의 발명자들은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 PBMC에서 eTag를 성공적으로 발현시켰고, 세툭시맙에 노출된 PBMC에 의한 시험관내에서의 eTag의 발현이 PBMC에 대하여 효과적인 제거 기전을 제공하였다는 것을 밝혀 내었다. 따라서, EGFR은 형질도입된 T 세포에 대하여, 면역치료적 잠재능을 가지는, 비면역원성 선별 도구, 추적 마커, 및 자살 유전자로서 사용될 수 있다. EGFR 핵산은 또한 당업계에 널리 공지된 수단에 의해 검출될 수 있다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, EGFR은 CAR 또한 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부로서, 또는 림프구 증식성 요소를 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부로서 발현된다. 일부 실시양태에서, EGFR 인식 도메인을 코딩하는 아미노산 서열은 절단 신호 및/또는 리보솜 스킵 서열에 의해 키메라 항원 수용체를 코딩하는 아미노산 서열로부터 이격되어 있을 수 있다. 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호는 당업계에 공지된 임의의 임의의 리보솜 스킵 및/또는 절단 신호일 수 있다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 리보솜 스킵 서열은 예를 들어, 아미노산 서열 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호: 77)를 포함하는 2A-1일 수 있다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 절단 신호 및 리보솜 스킵 서열의 다른 예로는 FMDV 2A (F2A); 말 비염 A 바이러스 2A (E2A로 약칭); 돼지 테스코바이러스-1 2A (P2A); 및 토세아아시그나(Thoseaasigna) 바이러스 2A (T2A)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인식 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CAR 또는 림프구 증식성 요소와 동일한 전사체 상에 존재할 수 있지만, 내부 리보솜 진입 부위에 의해 CAR 또는 림프구 증식성 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 이격되어 있을 수 있다.
본원에 실험적으로 예시된 바와 같은 다른 실시양태에서, 인식 도메인은 림프구 증식성 요소에 융합된, 융합 폴리펩티드의 일부로서 발현될 수 있다. 상기 구축물은 특히 본원에 제공된 다른 "공간 절약" 요소와 함께 조합되었을 때, 분리된 폴리펩티드와 비교하였을 때, RNA 게놈 상에서 게놈 공간을 덜 차지한다는 이점을 제공한다. 한 예시적인 실시양태에서, eTag는 본원에서 실험적으로 입증된 바와 같이, IL7Rα 돌연변이체에 융합된 융합 폴리펩티드로서 발현된다.
슈도타입화 요소
본원에 제공된 다수의 방법 및 조성물은 슈도타입화 요소를 포함한다. 이종성 외피 당단백질로 레트로바이러스를 슈도타입화하는 것은 전형적으로 바이러스의 향성을 변경시키고, 숙주 세포의 형질도입을 촉진시킨다. 본원에서 사용되는 바, 슈도타입화 요소는 표적 숙주 세포를 확인하고 그에 결합하는 하나 이상의 폴리펩티드, 전형적으로 당단백질을 포함하는 "결합 폴리펩티드," 및 레트로바이러스 및 표적 숙주 세포 막의 융합을 매개하여 레트로바이러스 게놈이 표적 숙주 세포 내로 진입할 수 있게 허용하는 하나 이상의 "융합유도 폴리펩티드"를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 폴리펩티드(들)/단백질(들)로서, 또는 폴리펩티드(들)/단백질(들)을 코딩하는 핵산 서열로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질, 및/또는 파라믹소바이러스 홍역 외피 단백질 H 및 F이다.
일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 레트로바이러스는 홍역 바이러스 (MV), 비제한적인 예로서, MV의 임상 야생형 균주, 및 에드먼스턴(Edmonston) 균주 (MV-Edm)를 비롯한 백신 균주의 융합 (F) 및 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드, 또는 그의 단편으로 슈도타입화될 수 있다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 헤마글루티닌 (H) 및 융합 (F) 폴리펩티드, 둘 모두 숙주 세포 내로의 진입에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주되며, 여기서, H 단백질은 MV를 표적 세포 상의 수용체 CD46, SLAM, 및 넥틴(Nectin)-4에 결합시키고, F는 레트로바이러스 및 숙주 세포 막의 융합을 매개한다. 예시적인 실시양태에서, 특히 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인 경우, 결합 폴리펩티드는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드이고, 융합유도 폴리펩티드는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드이다.
일부 연구에서, 말단절단된 F 및 H 폴리펩티드로 슈도타입화된 렌티바이러스 입자는 역가 및 형질도입율이 현저히 증가되어 있었다 (문헌 [Funke et al. 2008. Molecular Therapy. 16(8):1427-1436]), (문헌 [Frecha et al. 2008. Blood. 112(13):4843-4852]). F 세포질 테일이 30개의 잔기만큼 말단절단된 상태일 때 (MV(Ed)-FΔ30 (서열 번호: 105)으로 지칭), 최고 역가를 수득하였다. H 변이체의 경우, 비로가 결실된 잔기의 알라닌으로의 대체를 포함하는, 및 포함하지 않는 24개의 잔기의 말단절단을 가지는 변이체 (MV(Ed)-HΔ24 (서열 번호: 235) 및 MV(Ed)-HΔ24+A)도 또한 최적의 역가를 가져왔지만, 18 또는 19개의 잔기가 결실되었을 때 (MV(Ed)-HΔ18 (서열 번호: 106) 또는 MV(Ed)-HΔ19), 최적의 말단절단이 일어났다.
T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 것에 대한 것을 포함하는 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 레트로바이러스는 돌연변이화된 또는 변이체 버전의 홍역 바이러스 융합 (F) 및 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드, 예시적인 예에서, 홍역 바이러스 F 및 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체로 슈도타입화된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이화된 F 및 H 폴리펩티드는 그의 세포질 부분이 말단절단된 것인, 즉, 아미노산 잔기 (또는 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 분자의 코딘 핵산)가 결실된 것인, "말단절단된 H" 또는 "말단절단된 F" 폴리펩티드이다. "HΔY" 및 "FΔX"는 각각 말단절단된 H 및 F 폴리펩티드를 나타내고, 여기서, "Y"는 아미노 말단으로부터 결실된 1-34개의 잔기를 나타내고, "X"는 세포질 도메인의 카르복시 말단으로부터 결실된 1-35개의 잔기를 나타낸다. 추가 실시양태에서, "말단절단된 F 폴리펩티드"는 FΔ24 또는 FΔ30이고/거나, "말단절단된 H 단백질"은 HΔ14, HΔ15, HΔ16, HΔ17, HΔ18, HΔ19, HΔ20, HΔ21+A, HΔ24 및 HΔ24+4A, 더욱 바람직하게 HΔ18 또는 HΔ24로 구성된 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 말단절단된 F 폴리펩티드는 MV(Ed)-FΔ30이고, 말단절단된 H 폴리펩티드는 MV(Ed)-HΔ18이다.
일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드는 1개의 폴리펩티드로서 발현된 다중 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드는 동일한 전사체이지만, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 번역되지만; 다른 실시양태에서, 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드는, 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 문헌상 일반적인 것과 같이, 번역 후 절단되는 절단 펩티드 부위, 또는 리보솜 스킵 서열에 의해 이격되어 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 리보솜 결합 부위로부터의 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드의 번역 결과, 결합 폴리펩티드와 비교하였을 때, 융합유도 폴리펩티드가 더 높은 양으로 생성된다. 일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드 대 결합 폴리펩티드의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다. 일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드 대 결합 폴리펩티드의 비는 범위의 하단으로 1.5:1, 2:1, 또는 3:1 내지 범위의 상단으로 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1. 9:1 또는 10:1이다.
활성화 요소
본 개시내용의 다수의 방법 및 조성물 측면은 활성화 요소, 또는 활성화 요소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 휴지기 T 세포 내로의 렌티바이러스 (LV) 형질도입과 관련된 제한은 연속된 진입 전 및 진입 후 장벽 뿐만 아니라, 세포 제한 인자에 기인하는 것이다 (문헌 [Strebel et al., 2009. BMC Medicine 7:48]). 한 제한은 외피 슈도타입화된 LV 입자가 잠재적 수용체를 인식하지 못하고, 세포 막과의 융합을 매개하지 못하는 무능력함이다. 그러나, 특정 조건하에서, HIV-1-기반 렌티바이러스 벡터에 의한 휴지기 T 세포의 형질도입은 가능하게는 대개 T 세포 수용체 (TCR) CD3 복합체 및 CD28 공동 자극시에 (문헌 [Korin & Zack. 1998. Journal of Virology. 72:3161-8], [Maurice et al. 2002. Blood 99:2342-50]) 뿐만 아니라, 시토카인에의 노출을 통해 (문헌 [Cavalieri et al., 2003]) 이루어진다.
면역계의 세포, 예컨대, T 림프구는 수용체 또는 수용체 복합체를 통해 특이적 항원을 인식하고, 그와 상호작용하고, 상기 항원 인식 또는 그와의 상호작용시, 체내에서 세포의 활성화 및 확장을 유발한다. 상기 수용체의 한 예로 항원 특이적 T 림프구 수용체 복합체 (TCR/CD3)가 있다. T 세포 수용체 (TCR)는 T 림프구의 표면 상에서 발현된다. 한 성분인 CD3은 리간드에 의한 TCR 점유 이후, 세포내 신호전달을 담당한다. 항원-CD3 복합체 (TCR/CD3)의 T 림프구 수용체는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 단백질에 의해 그에 제시되는 항원성 펩티드를 인식한다. MHC 및 펩티드의 복합체는 항원 제시 세포 및 다른 T 림프구 표적의 표면 상에서 발현된다. TCR/CD3 복합체 자극은 T 림프구를 활성화시키고, 이어서, 항원 특이적 면역 반응을 일으킨다. TCR/CD3 복합체는 이펙터 기능 및 면역계 조절에서 중요한 역할을 한다.
T 림프구는 또한 완전한 활성을 띠기 위해서는 제2의 공동자극성 신호를 필요로 한다. 상기 신호 부재하에서, T 림프구는 TCR에의 항원 결합에 대해 비반응성이거나, 또는 무반응 상태가 된다. 상기 공동자극성 신호는 예를 들어, 항원 생산 세포 상에서 CD80 및 CD86과 상호작용하는 T 림프구 단백질인 CD28에 의해 제공된다. 또 다른 T 림프구 단백질인 ICOS (유도가능한 공동자극인자)는 ICOS 리간드에의 결합시에 공동자극성 신호를 제공한다.
T 세포 수용체 (TCR) CD3 복합체의 활성화 및 CD28에 의한 공동자극은 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 고체 표면 (예컨대, 비드)에의 생체외 노출에 의해 이루어질 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 휴지기 T 세포는 생체외에서의 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 고체 표면에의 노출에 의해 활성화된다.
본원에 제공된 특정 방법 및 조성물의 예시적인 실시양태에서, CD3 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는, 이 또한 본 발명의 측면인 본원에 개시된 방법 및 조성물의 재조합 레트로바이러스의 표면 상의 "활성화 요소"로서 제시된다. CD3 및/또는 CD28에 결합하는 폴리펩티드는 휴지기 T 세포를 활성화시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여 "활성화 요소"로서 지칭된다.
일부 실시양태에서, 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD3 항체, 또는 CD3에 결합할 수 있는 능력을 보유하는, 그의 단편이다. 예시적인 실시양태에서, 항-CD3 항체 또는 그의 단편은 단일 쇄 항-CD3 항체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 항-CD3 scFv이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD3scFvFc이다.
UCHT1, OKT-3, HIT3A, TRX4, X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT31, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW24B6, OKT3D, M-T301, SMC2 및 F101.01을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 항-인간 CD3 단일클론 항체 및 그의 항체 단편이 이용가능하고, 본 발명에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성화 요소는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항-CD28 항체, 또는 CD28에 결합할 수 있는 능력을 보유하는, 그의 단편이다. 다른 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 CD80, CD86, 또는 CD28에 결합할 수 있고, Akt의 CD28 매개 활성화를 유도할 수 있는, 그의 기능성 단편, 예컨대, CD80의 외부 단편이다. 예시적인 실시양태에서, 항-CD28 항체 또는 그의 단편은 단일 쇄 항-CD28 항체, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 항-CD28 scFv이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 CD80, 또는 CD80의 단편, 예컨대, CD80의 외부 단편이다.
항-CD28 항체는 당업계에 공지되어 있고, 비제한적인 예로서, 단일클론 항체 9.3, IgG2a 항체 (제프리 레드베터 박사(Dr. Jeffery Ledbetter), 브리스톨 마이어스 스큅 코포레이션(Bristol Myers Squibb Corporation: 미국 워싱턴주 시애틀), 단일클론 항체 KOLT-2, IgG1 항체, 15E8, IgG1 항체, 248.23.2, IgM 항체 및 EX5.3D10, IgG2a 항체를 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 활성화 요소는 2개의 폴리펩티드, CD3에 결합할 수 있는 폴리펩티드 및 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, CD3 또는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 항체, 단일 쇄 단일클론 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 쇄 항체 단편이다. 따라서, 항체 단편은 예를 들어, 단일 쇄 단편 가변 영역 (scFv), 항체의 항체 결합 (Fab) 단편, 단일 쇄 항원 결합 단편 (scFab), 시스테인이 없는 단일 쇄 항원 결합 단편 (scFabΔC), 단편 가변 영역 (Fv), 항원의 인접 에피토프에 특이적인 구축물 (CRAb), 또는 단일 도메인 항체 (VH 또는 VL)이다.
일부 실시양태에서, 활성화 요소는, 둘 모두가 활성화 요소의 막으로의 유도에 도움을 주는 것인, 이종성 신호 서열 및/또는 이종성 막 부착 서열에 융합된다. 이종성 신호 서열은 활성화 요소를 소포체로 표적화하고, 이종성 막 부착 서열은 (하나 또는 수개의 지방산에 공유적으로 부착됨으로써 (이는 또한 번역 후 지질 변형으로도 공지) 이종성 막 부착 서열에 융합된 활성화 요소는 원형질 막의 지질 래프트 중에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 번역 후 지질 변형은 미리스토일화, 팔미토일화, 또는 GPI 앵커리지를 통해 이루어진다. 미리스토일화는 14-탄소 포화 지방산인 미리스트산의 진핵 또는 바이러스 단백질의 N 말단 글리신에의 공유 결합에 상응하는 번역 후 단백질 변형이다. 팔미토일화는 C16 아실 쇄의 단백질의 시스테인에의, 및 덜 빈번하게는, 세린 및 트레오닌 잔기에의 공유 결합에 상응하는 번역 후 단백질 변형이다. GPI 앵커리지란, 번역 후 변형 동안의 글리코실포스파티딜이노시톨, 또는 GPI의 단백질의 C 말단으로의 부착을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 이종성 막 부착 서열은 GPI 앵커 부착 서열이다. 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 (문헌 [Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology . 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11]에서 리뷰된) 임의의 공지된 GPI 부착 단백질로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD14, CD16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80, 및 CD87로부터의 GPI 앵커 부착 서열이다. 일부 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD16으로부터 유래된 것이다. 예시적인 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 Fc 수용체 FcγRIIIb (CD16b), 또는 다르게는 보체 분해-가속 인자 또는 CD55로도 공지된 분해 가속 인자 (DAF)로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 활성화 요소 중 하나 또는 그 둘 모두는 활성화 요소의 발현을 세포 막으로 유도하는 데 도움을 주는 이종성 신호 서열을 포함한다. 패키징 세포주에서 활성을 띠는 임의의 신호 서열이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 DAF 신호 서열이다. 예시적인 실시양태에서, 활성화 요소는 그의 N 말단에서 DAF 신호 서열에, 및 그의 C 말단에서 GPI 앵커 부착 서열에 융합된다.
예시적인 실시양태에서, 활성화 요소는 CD16b로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합된, CD14 및 CD80로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합된 항-CD3 scFvFc를 포함하고; 둘 모두는 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 항-CD3 scFvFc는 그의 N 말단에서 DAF 신호 서열에, 및 그의 C 말단에서 CD14로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합되고, CD80은 그의 N 말단에서 DAF 신호 서열에, 및 그의 C 말단에서 CD16b로부터 유래된 GPI 앵커 부착 서열에 융합되고; 둘 모두는 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시양태에서, DAF 신호 서열은 DAF 단백질의 아미노산 잔기 1-30을 포함한다.
막 결합 시토카인
본원에 제공된 방법 및 조성물 측면의 일부 실시양태는 막 결합 시토카인, 또는 막 결합 시토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 시토카인은 전형적으로 분비된 단백질이지만, 항상 그러한 것은 아니다. 자연적으로 분비된 시토카인은 막 결합되는 융합 단백질로서 조작될 수 있다. 막 결합 시토카인 융합 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법 및 조성물에 포함되고, 이 또한 본 발명의 측면이다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 그의 표면 상에, T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그의 증식 및/또는 생존을 촉진시킬 수 있는 막 결합 시토카인 융합 폴리펩티드를 가진다. 전형적으로, 막 결합 폴리펩티드는 재조합 레트로바이러스의 막 내로 도입되고, 세포가 재조합 레트로바이러스에 의해 형질도입되었을 때, 레트로바이러스 및 숙주 세포 막의 융합의 결과로서, 폴리펩티드가 형질도입된 세포의 막에 결합하게 된다.
일부 실시양태에서, 시토카인 융합 폴리펩티드는 IL-7, IL-15, 또는 그의 활성 단편을 포함한다. 막 결합 시토카인 융합 폴리펩티드는 전형적으로 이종성 신호 서열 및/또는 이종성 막 부착 서열에 융합된 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 이종성 막 부착 서열은 GPI 앵커 부착 서열이다. 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 (문헌 [Ferguson MAJ, Kinoshita T, Hart GW. Glycosylphosphatidylinositol Anchors. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 11]에 리뷰된) 임의의 공지된 GPI 고정된 단백질로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD14, CD16, CD48, CD55 (DAF), CD59, CD80, 및 CD87로부터의 GPI 앵커 부착 서열이다. 일부 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 CD16으로부터 유래된 것이다. 예시적인 실시양태에서, 이종성 GPI 앵커 부착 서열은 Fc 수용체 FcγRIIIb (CD16b)로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, GPI 앵커는 DAF의 GPI 앵커이다.
예시적인 실시양태에서, 막 결합 시토카인은 DAF에 융합된 시토카인의 융합 폴리펩티드이다. DAF는 패키징 세포로부터 출아하는 레트로바이러스의 막 내로 도입되는 지질 래프트에 축적되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이론으로 제한하지 않으면서, DAF 융합물 단백질은 재조합 레트로바이러스 막의 일부가 되는 패키징 세포의 막의 일부분으로 차별적으로 표적화되는 것으로 간주된다.
비제한적인 예시적인 실시양태에서, 시토카인 융합 폴리펩티드는 DAF에 융합된 IL-7, 또는 그의 활성 단편이다. 구체적인 비제한적 예시적 실시양태에서, 융합 시토카인 폴리펩티드는 순서대로 DAF 신호 서열 (DAF의 잔기 1-31), 그의 신호 서열을 포함하지 않는 IL-7, 및 DAF의 잔기 36-525를 포함한다.
생체내 제어 요소
리보스위치
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 일부는, 그 자체가 본 개시내용의 상이한 측면을 형성하는 것인 하나 이상의 리보스위치, 또는 하나 이상의 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리보스위치는 박테리아에서의 유전자 발현을 조절하는 공통된 특징이고, 이는 생물학적 기능의 RNA 제어를 달성하기 위한 수단이다. 리보스위치는 mRNA의 5'-비번역 영역에 존재할 수 있고, 리보스위치 활성을 유도하거나, 또는 억제하는 소형 분자 리간드의 결합을 통해 유전자에 대한 제어를 허용하는 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로, 리보스위치는 소형 분자 리간드의 생성에 관여하는 유전자 생성물을 제어하고, 이로써, 피드백 루프를 형성한다. 비록 트랜스-방식으로 작용하는 리보스위치도 확인되기는 하였지만, 리보스위치는 전형적으로는 시스-방식으로 작용하다. 천연 리보스위치는 2개의 도메인: 3차원으로 폴딩된 RNA 구조를 통해 리간드에 결합하는 압타머 도메인 및 리간드의 존재 또는 부재에 기초하여 리보스위치에서 활성을 유도하거나, 또는 억제시키는 기능 스위칭 도메인으로 구성된다. 따라서, 작동(on) 및 비작동(off) 상태를 나타내는, 리보스위치에 의해 달성되는 2개의 리간드 감수성 입체구조가 존재한다 (문헌 [Garst et al., 2011]). 기능 스위칭 도메인은 내부 리보솜 부위, 레트로바이러스 유전자 구축물 중의 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현을 조절함으로써 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 줄 수 있다 (문헌 [Dambach and Winkler 2009]). 압타머 및 기능 스위칭 도메인은 합성 RNA 장치가 천연 압타머, 돌연변이화된/진화된 천연 압타머, 또는 무작위 RNA 라이브러리 스크리닝으로부터 확인된, 전적으로 합성된 압타머와 같이 유전자를 제어할 수 있도록 허용하는 모듈식 성분으로서 사용될 수 있다 (문헌 [McKeague al 2016]).
퓨린 리보스위치 패밀리는 500개 초과의 서열이 발견되는, 가장 패밀리들 중 하나를 나타낸다 (문헌 [Mandal et al., 2003]; US20080269258; 및 WO2006055351). 퓨린 리보스위치는 개재 루프/연접 요소 (J1-2, L2, J2-3, L3, J3-1)와 함께 3개의 보존된 나선 요소/줄기 구조 (P1, P2, P3)로 구성된, 유사한 구조를 공유하다. 퓨린 리보스위치 패밀리의 압타머 도메인은 천연적으로 서열 변이에 기인하는 각종의 퓨린 화합물, 예컨대, 아데닌, 구아닌, 아데노신, 구아노신, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신에 의해 그의 친화도/조절을 달리한다 (문헌 [Kim et al. 2007]).
한 측면에서, 본원에서는 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 a.) 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합할 수 있고, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 대비 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 대하여 감소된 결합을 보이는 압타머 도메인; 및 b.) 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인을 포함하는 리보스위치로서, 여기서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오시드 유사체의 결합이 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나, 또는 억제시킴으로써 표적 유전자의 발현을 조절하는 것인 리보스위치를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 코딩 영역, miRNA, 또는 shRNA일 수 있다. 비제한적인 예에서, 리보스위치는 생체내 활성을 가진, 예를 들어, 질환을 치료하는 데 효과적인 것인, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, miRNA, 또는 shRNA에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 상기 비제한적인 예에서, 리보스위치는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 본원에 제공된 비제한적인 예시적인 예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 다양한 다른 측면에 포함된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩한다. 상기 비제한적인 예시적인 예에서, 리보스위치 및 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 표적 폴리뉴클레오티드는 패키징 세포, 재조합 레트로바이러스, T 세포 및/또는 NK 세포의 게놈 중에서 발견될 수 있다.
일부 실시양태에서, 압타머 도메인의 길이는 범위의 하단으로 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 및 70개의 뉴클레오티드 길이 내지 범위의 상단으로 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 45 내지 80개의 뉴클레오티드 길이, 45 내지 60개의 뉴클레오티드 길이, 또는 45 내지 58 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물은 제약 리간드 (아시클로버(aciclovir) 및 아시클로구아노신으로도 또한 공지된) 아시클로버(acyclovir) 또는 펜시클로버 (도 5)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 대한 결합 친화도보다 더 큰, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
생체내 제어 요소는 형질도입된 T 세포의 생체내에서의 확장을 촉진시킨다. 일부 실시양태에서, 확장은 제어 요소의 존재에 의존한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 형질도입된 T 세포의 확장은 적어도 부분적으로는 다른 인자, 예컨대, 대상체 내의 인터류킨의 존재, 및 재조합 T 세포의 CAR의 ASRT의 그의 리간드에의 결합에 의해 구동될 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버는 PBL을 혈액으로부터 단리시키기 이전, 그 동안, 및/또는 그 이후에 및 T 세포 및/또는 NK 세포를, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하고, 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는, 비제한적인 예시적인 예에서, 리보스위치인 생체내 제어 요소를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 대상체에게 투여된다. 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드는 비제한적인 예시적인 예에서, 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드인 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 그 중 적어도 하나는 림프구 증식성 요소를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버는 PBL을 혈액으로부터 단리시키기 이전 또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48, 또는 72시간에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버는 PBL을 혈액으로부터 단리시킨 후, 또는 본원에 제공된 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버는 PBL을 혈액으로부터 단리시킨 후, 또는 본원에 제공된 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물, 예를 들어, 아시클로버 또는 펜시클로버는 PBL을 대상체 내로 재주입한 후, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 동안 또는 무기한으로 대상체에게 투여된다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물은 PBL의 재주입 이전 및/또는 그 동안 및/또는 PBL을 재주입한 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물은 대상체가 표적 폴리뉴클레오티드와 관련이 있는 질환의 증상을 더 이상 고생하지 않거나, 상기 질환을 앓지 않을 때까지 투여된다.
일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 아시클로버 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제보다는 우선적으로 펜시클로버에 결합할 수 있고, 이로써, 병용 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미치지 않으면서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은, 압타머 도메인이 아시클로버 또는 또 다른 항바이러스제에 결합하는 것보다 더욱 큰, 예를 들어, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰 결합 친화도로 펜시클로버에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 펜시클로버 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제보다는 우선적으로 아시클로버에 결합할 수 있고, 이로써, 병용 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미치지 않으면서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은, 압타머 도메인이 펜시클로버 또는 또 다른 항바이러스제에 결합하는 것보다 더욱 큰, 예를 들어, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰 결합 친화도로 아시클로버에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펜시클로버 (팜시클로버) 및 아시클로버 (발라시클로버)의 경구용 프로드럭이 대상체에게 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인은 서열 번호: 87-93의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있고, 아시클로버에 결합할 수 있는 능력, 및 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 대비 감소된, 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합할 수 있는 능력을 보유하고, 여기서, 압타머 도메인은 아시클로버가 결합하였을 때, 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나, 또는 억제시킬 수 있는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인은 서열 번호: 94-100의 압타머 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있고, 펜시클로버에 결합할 수 있는 능력, 및 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 대비 감소된, 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합할 수 있는 능력을 보유하고, 여기서, 압타머 도메인은 펜시클로버가 결합하였을 때, 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나, 또는 억제시킬 수 있는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 영역 또는 리보스위치의 영역은 서열 번호: 87-100의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 108-221의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 영역은 서열 번호: 108-221의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 108과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 91.84%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 147과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 164와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 93.88%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 183과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 압타머 도메인의 영역을 함유하는 DNA 서열은 서열 번호: 198과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 91.84%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 영역은 서열 번호: 222-226의 컨센서스 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드의 영역은 서열 번호: 222-226의 서열 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.83%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 또는 그와 동일할 수 있다.
본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 아시클로버 및/또는 펜시클로버에 결합할 수 있는 능력을 보유할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 87-100 또는 서열 번호: 108-221의 서열 중 어느 하나의 역 상보체일 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 108-221의 DNA 서열, 또는 서열 번호: 108-221에 상보적인 DNA 서열의 전사 또는 RNA 버전일 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 87-100의 RNA 서열 중 어느 하나의 역전사 또는 DNA 버전, 또는 서열 번호: 87-100의 RNA 서열 중 어느 하나의 역전사에 상보적인 DNA 가닥일 수 있다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, 리보스위치 스캐폴드는 돌연변이 분석 또는 분자적 진화를 위해 사용될 수 있다. 돌연변이 분석 또는 분자적 진화를 위해 선택된 리보스위치는 임의의 공지된 유기체, 예를 들어, 박테리아로부터인 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 메조플라스마 플로럼으로부터의 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치는 분자적 진화를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유래된 압타머 도메인은 메조플라스마 플로럼으로부터의 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치로부터의 압타머 도메인 (서열 번호: 237)과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, 바실러스 섭틸리스로부터의 xpt 리보스위치가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유래된 압타머 도메인은 바실러스 섭틸리스로부터의 xpt 리보스위치로부터의 압타머 도메인 (서열 번호: 243)과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다.
압타머 도메인은 모듈식 성분으로서 사용될 수 있고, 기능 스위칭 도메인 중 임의의 것과 조합되어 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 리보스위치는 하기 활성: 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현 중 임의의 것을 조절함으로써 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능 스위칭 도메인은 항-IRES의 IRES에의 결합을 제어할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Ogawa, RNA (2011), 17:478-488] (상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 소형 분자 리간드의 존재 또는 부재가 리보스위치가 RNA 전사체에 영향을 미치게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임을 포함하는 리보스위치는 소형 분자 리간드의 존재하에서 표적 폴리뉴클레오티드의 전사체 분해를 억제시키거나, 또는 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보자임은 피스톨 부류의 리보자임, 해머헤드 부류의 리보자임, 트위스트 부류의 리보자임, 해치트 부류의 리보자임, 또는 HDV (간염 델타 바이러스) 리보자임일 수 있다.
본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 리보스위치는 리보스위치에 대하여 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드 대비 다양한 위치에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성을 조절할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드 앞에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 폴리(A) 테일을 포함하는 것을 조절할 수 있고, 표적 폴리뉴클레오티드 뒤에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 항-IRES를 조절할 수 있고, IRES 상류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 리보스위치는 본원에 제공된 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 대비 상기 위치 중 임의의 것에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리보스위치는 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 초과인 온도에서 탈안정화될 수 있고, 이로써, 리보스위치는 리간드에 대하여 더 이상이 반응성을 띠지 않게 된다. 일부 실시양태에서, 분자적 진화를 사용하여 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 초과인 온도에서 탈안정화되는 리보스위치를 선별할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 여기서, 표적 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 림프구 증식성 요소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, miRNA 또는 shRNA는 STAT5 경로를 증강시킬 수 있거나, 또는 SOCS 경로를 억제시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, miRNA 또는 shRNA는 SOCS1, SMAD2, TGFb, 또는 PD-1로부터의 전사체를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, miRNA는 miR-155이다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 폴리펩티드는 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 a.) 압타머 도메인이 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합하는 것보다 적어도 2배 더 큰 친화도의 결합 친화도로 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합할 수 있는 압타머 도메인; 및 b.) 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절할 수 있는 기능 스위칭 도메인을 포함하는 리보스위치로서, 여기서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오시드 유사체의 결합이 기능 스위칭 도메인의 발현 조절 활성을 유도하거나, 또는 억제시키는 것인 리보스위치를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은, 압타머 도메인이 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 결합하는 것보다 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰 친화도의 결합 친화도로 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인의 길이는 범위의 하단으로 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 및 70개의 뉴클레오티드 길이 내지 범위의 상단으로 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 및 100개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 45 내지 80개의 뉴클레오티드 길이, 또는 45 내지 58 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물은 제약 리간드 (아시클로버 및 아시클로구아노신으로도 또한 공지된) 아시클로버 또는 펜시클로버일 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 대한 결합 친화도보다 더 큰, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오시드 유사체의 결합은 리보스위치의 활성을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 펜시클로버에 대해 특이적일 수 있고, 아시클로버 또는 대안적으로 또 다른 항바이러스제에 대해서는 반응성이 결여되어 있을 수 있고, 이로써, 병용 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미치지 않으면서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은, 압타머 도메인이 아시클로버 또는 또 다른 항바이러스제에 결합하는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰 결합 친화도로 펜시클로버에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 아시클로버에 대해 특이적일 수 있고, 펜시클로버 또는 대안적으로, 또 다른 항바이러스제에 대해서는 반응성이 결여되어 있을 수 있고, 이로써, 병용 항바이러스 요법이 리보스위치에 영향을 미치지 않으면서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은, 압타머 도메인이 펜시클로버 또는 또 다른 항바이러스제에 결합하는 것보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100배 더 큰 결합 친화도로 아시클로버에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펜시클로버 (팜시클로버) 및 아시클로버 (발라시클로버)의 경구용 프로드럭이 대상체에게 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유래된 압타머 도메인은 메조플라스마 플로럼으로부터의 타입 I-A 데옥시구아노신 리보스위치로부터의 압타머 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유래된 압타머 도메인은 바실러스 섭틸리스로부터의 xpt 리보스위치로부터의 압타머 도메인과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 리보스위치는 하기 활성: 내부 리보솜 진입 부위, 레트로바이러스 유전자 구축물 중의 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현, 또는 shRNA 발현 중 임의의 것을 조절함으로써 RNA 전사체에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능 스위칭 도메인은 항-IRES의 IRES에의 결합을 제어할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 소형 분자 리간드의 존재 또는 부재가 리보스위치가 RNA 전사체에 영향을 미치게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임을 포함하는 리보스위치는 소형 분자 리간드의 존재하에서 관심의 대상이 되는 유전자의 전사체 분해를 억제시키거나, 또는 증진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보자임은 피스톨 부류의 리보자임, 해머헤드 부류의 리보자임, 트위스트 부류의 리보자임, 해치트 부류의 리보자임, 또는 HDV (간염 델타 바이러스) 리보자임일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치는 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 초과인 온도에서 탈안정화될 수 있고, 이로써, 리보스위치는 리간드에 대하여 더 이상이 반응성을 띠지 않게 된다. 일부 실시양태에서, 분자적 진화를 사용하여 37.5℃, 38℃, 38.5℃, 39℃, 39.5℃, 또는 40℃ 초과인 온도에서 탈안정화되는 리보스위치를 선별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA, shRNA, 및/또는 폴리펩티드를 코딩할 수 있고, 여기서, 표적 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 림프구 증식성 요소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 miRNA일 수 있고, 임의적으로 miRNA는 STAT5 경로를 자극시킬 수 있거나, 또는 SOCS 경로를 억제시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, miRNA는 SOCS1, SHP, SMAD2, TGFb, 또는 PD-1로부터의 전사체를 표적화할 수 있다. 상기 실시양태에서, miRNA는 miR-155일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하고, 폴리펩티드는 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. CARs의 추가 실시양태는 본원 다른 곳에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 압타머 진화는 선별 프로세스 및 스크리닝에서 산화그래핀을 사용하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는, SELEX (지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 사용하여 무작위화된 천연 퓨린 또는 구아닌 압타머 라이브러리로부터의 압타머 선별을 통해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 무작위 돌연변이유발 방법 예컨대, 오류 빈발 PCR이 압타머 구축물 또는 리보스위치 구축물을 진화시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서, 압타머는 시험관내에서 또는 포유동물 세포에서의 스크리닝에 의해 본원에 기술된 리보스위치 활성 중 임의의 것과 관련하여 도입된다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드의 무작위 라이브러리는 리보스위치의 진화에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 리보스위치는 시험관내에서 또는 포유동물 세포에서의 상기 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, 진화된 또는 유래된 압타머 도메인은 천연 리간드의 유사체에 대하여 증가된 결합, 및 천연 리간드에 대하여 감소된 결합을 보일 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 천연 리간드의 유사체에 대하여 증가된 결합, 및 천연 리간드에 대하여 감소된 결합을 보이도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 압타머 도메인은 퓨린 리보스위치 패밀리로부터 유래된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 리간드는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드일 수 있고, 유사체는 뉴클레오시드 유사체 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체는 항바이러스성 약물이다. 예시적인 실시양태에서, 압타머 도메인은 2'-데옥시구아노신 및 구아닌 리보스위치 스캐폴드로부터 유래된 것일 수 있고, 유래된 압타머 도메인은 야생형 리보스위치 대비 2'-데옥시구아노신 및 구아닌에 대하여 감소된 결합을 보일 수 있다.
일부 실시양태에서, 리보스위치는 레트로바이러스 유전자 구축물 중의 프리-mRNA 스플라이스 도너 접근가능성을 조절할 수 있고, 여기서, 레트로바이러스 구축물은 일반 프로모터 또는 T 세포 특이적 프로모터하에 역 가닥으로부터 CAR 유전자, 또는 관심의 대상이 되는 다른 유전자를 구동시킨다. 다른 실시양태에서, 리보스위치는 레트로바이러스 유전자 구축물 중의 IRES를 조절할 수 있고, 여기서, 레트로바이러스 구축물은 CAR 유전자, 또는 관심의 대상이 되는 다른 유전자의 번역을 구동시킨다. 다른 실시양태에서, 리보스위치는 RNA, miRNA, 또는 유전자 전사체의 전사 종결을 제어할 수 있거나, 또는 전사체의 번역을 제어할 수 있다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오시드 유사체 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체의 존재하에서 CAR 유전자, 또는 관심의 대상이 되는 다른 유전자의 전사체 분해를 억제시키거나, 또는 증진시키기 위해 리보자임과 통합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 결합하는 리보스위치를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드는 분자 클로닝 벡터이다. 분자 클로닝 벡터는 당업계에 공지된 임의 유형의 분자 클로닝 벡터일 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 레트로바이러스일 수 있고, 그 중 임의의 것은 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 본원에서 상기에 제공된 표적 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 코딩할 수 있다. 하나 이상의 제한 및/또는 다중 클로닝 부위는 분자 클로닝 벡터 상에서 본원에 제공된 리보스위치에 대해 5' 또는 3'에 포함될 수 있고, 이로써, 리보스위치는 제한 및/또는 다중 클로닝 부위 내로 삽입된 표적 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다.
분자 샤페론
한 측면에서, 본원에서는
A. 전형적으로 사전 생체외 자극을 필요로 하지 않으면서, 생체외에서 대상체의 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포를,
i. T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 슈도타입화 요소; 및
ii. T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서, 상기 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소 및/또는 키메라 항원 수용체를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 레트로바이러스와 접촉시킴으로써 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하는 단계로서,
여기서, 상기 접촉으로 재조합 레트로바이러스에 의한 휴지기 T 세포 및/또는 NK 세포 중 적어도 일부의 형질도입이 촉진되는 것인 단계;
B. 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입시키는 단계; 및
C. 생체내에서 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현에 영향을 미치고, 생체내에서 림프구의 확장을 촉진시키는 생체내 제어 요소로서 작용하는 화합물에 노출시킴으로써 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 단계를 포함하는, 대상체의 림프구를 유전적으로 변형시키고, 확장시키는 방법을 제공한다.
예시적인 실시양태에서, 형질도입은 생체외 자극 없이 수행된다. 예시적인 실시양태에서, 화합물은 분자 샤페론, 예컨대, 소형 분자 분자 샤페론이다. 예시적인 실시양태에서, 분자 샤페론의 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR 성분에의 결합이 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR의 증식 활성을 증가시킨다. 분자 샤페론은 혈액 수집 이전, 접촉 동안에, 및/또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체 내로 도입한 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 측면의 일부 실시양태는 대상체로부터 혈액을 수집하는 단계를 포함한다. 본 실시양태에서, 도입은 수집되고, 재도입 이전에 유전적으로 변형된 세포를 재도입시키는 것이다. 예시적인 실시양태에서, 전체 프로세스는 본원 다른 측면에서와 같이, 선행 기술의 방법보다 더 짧은 프로세스이다. 예를 들어, 전체 프로세스는 48시간 미만, 24시간 미만, 또는 12시간 미만 이내에 완료될 수 있다. 다른 실시양태에서, 전체 프로세스는 범위의 하단으로 2, 4, 6, 또는 8시간 내지 범위의 상단으로 12, 24, 36, 또는 48시간 이내에 완료될 수 있다.
따라서, 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 분자 샤페론이다. 전형적으로 화합물에 결합하여 림프구 증식성 요소 또는 본원의 제1 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 다른 성분의 발현에 영향을 미치는 다른 생체내 제어 요소, 예컨대, 리보스위치를 포함하는 본원의 다른 실시양태와 비교하여, 분자 샤페론은 생체내 제어 요소이고, 따라서, 전형적으로 림프구 증식성 요소 또는 본원의 제1 또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 다른 성분에 결합함으로써 그의 활성에 직접적으로 영향을 미치는 화합물이다. 분자 샤페론을 투여하는 것을 포함하는, 본원의 방법의 상기 실시양태의 예시적인 예에서, 림프구 증식성 요소, 막 결합 시토카인, 및/또는 CAR 성분은, 그의 활성을 증가시키기 위해 분자 샤페론에 의해 결합된, 더 작은 활성을 띠거나, 또는 불활성인 림프구 증식성 요소, 막 결합 시토카인, 및/또는 CAR 성분일 수 있다. 따라서, 분자 샤페론에 의해 결합된 표적은 전형적으로 표적 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 명시된 바와 같이, 폴리펩티드는, 그의 활성이 분자 샤페론, 예시적인 실시양태에서, 소형 분자 분자 샤페론에의 결합에 의해 영향을 받는 것인 제1 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드, 또는 그의 폴리펩티드 성분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 그의 활성이 분자 샤페론, 바람직하게, 소형 분자 분자 샤페론에 의해 조절되는, 예시적인 실시양태에서, 상향 조절되는 림프구 증식성 요소를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 분자 샤페론은 돌연변이체 림프구 증식성 요소 및/또는 불활성 CAR 성분에 결합하여 그를 활성인 상태로 만드는 화합물일 수 있다.
다른 실시양태에서, 림프구 증식성 요소 또는 다른 신호전달 도메인은 오직 소형 분자 합성 샤페론의 존재하에서만 원형질 막으로 이동할 수 있도록 돌연변이화된다. 다른 실시양태에서, 샤페론은 증강제로서 림프구 증식성 요소 또는 다른 신호전달 도메인 또는 단백질의 안정성, 및 반감기를 촉진시킨다.
본 발명의 측면 및 실시양태는 본원에서 상세하게 제공된 다수의 동일한 단계 및 조성물을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서 전역에서의, 상기 공통된 요소에 관한 교시가 본원에 제공된 다른 생체내 제어 요소, 예컨대, 전형적으로, 리보스위치에 결합하는 분자, 예컨대, 약물을 사용하는 리보스위치 이외의, 또는 그 대신의, 전형적으로 림프구 증식성 요소 또는 다른 표적 분자에 직접 결합하는 생체내 제어 요소로서 분자 샤페론을 이용하는 측면 및 실시양태에 적용된다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 분자 샤페론은 표적의 세포내 국재화, 예를 들어, 적절한 폴딩, 및 표적 단백질, 예컨대, 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR의 다른 성분의 소포체로부터 원형질 막으로의 이동 또는 표면 상에서의 그의 반감기를 조절할 수 있는 화합물이다. 다른 실시양태에서, 분자 샤페론은 제대로 기능을 하지 않는 표적의 기능적 입체구조를 촉진시킬 수 있고, 이로써, 증강제로서 작용할 수 있다. 자연적으로 돌연변이화된 단백질에 대한 샤페론 또는 증강제로서 작용하는 분자의 예로는 루마캐프토 및 이바캐프토를 포함한다. 상기 단백질은 돌연변이체 CFTR 클로라이드 채널 변이체, 예컨대, G551D 또는 F508del에 대해 작용한다. 이바캐프토는 G551D 또는 F508del 돌연변이화된 이온 채널의 활성을 증강시키는 반면, 루마캐프토는 돌연변이체 클로라이드 채널의 안정화, 및 이어서, 이바캐프토에 의한 증강을 촉진시킨다. 상기 샤페론 의존성 단백질은 자연적 기능성 단백질, 및 오직 분자 샤페론의 존재하에서만 가지는 기능적 활성에 대한 스크리닝으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 상기 단백질은 오직 샤페론이 존재할 때에만 활성을 띤다. 특이적 샤페론 활성에 대하여 스크리닝될 수 있는 상기 분자의 예로는 정상적인 인간 단백질에 대해서는 활성을 보이지 않는 소형 분자 항바이러스제 또는 항감염제를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원의 방법에서 사용되는 분자 샤페론은 정상적인 인간 단백질에 대해서는 활성을 보이지 않는 소형 분자 항바이러스제 또는 항감염성 화합물이다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는 노출될 수 있고/거나, 대상체는 분자 샤페론을 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 PBL을 혈액으로부터 단리시키기 이전, 그 동안, 및/또는 그 이후에, 및 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 분자 샤페론 화합물에 결합하고, 그에 의해 조절되는, 더 작은 활성을 띠거나, 또는 불활성인 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR 성분을 포함한다.
입양 세포 요법의 방법의 일부일 수 있는, 림프구를 변형시키고, 확장시키기 위한, 본원에 제공된 실시양태 중 임의의 것에서, 화합물은 PBL을 혈액으로부터 단리시키기 이전, 또는 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시키기 이전에 범위의 하단으로 5, 10, 15, 30, 및 60분 내지 범위의 상단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 동안 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 PBL을 혈액으로부터 단리시킨 후, 또는 본원에 제공된 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 범위의 하단으로 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간 내지 범위의 상단으로 ½, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 PBL을 혈액으로부터 단리시킨 후, 또는 본원에 제공된 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 재조합 레트로바이러스와 접촉시킨 후, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 또는 28일 동안 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 PBL을 대상체 내로 재주입한 후, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 또는 120일 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120개월 동안 또는 무기한으로 대상체에게 투여된다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 화합물은 PBL의 재주입 이전 및/또는 그 동안 및/또는 PBL을 재주입한 후에 투여될 수 있다.
본원의 실시양태 중 임의의 것에서, 분자 샤페론은 생체내 제어 요소를 조절하고/거나, 활성화시키는 화합물에 의해 결합되는 생체내 제어 요소 중에 존재하지 않는다. 분자 샤페론은 생체내 제어 요소이고, 림프구 증식성 요소 및/또는 CAR의 기능성 성분의 활성을 조절하는 화합물, 바람직하게 소형 분자 화합물이다.
패키징 세포주/재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법
한 측면에서, 본원에서는 a) 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 제1 전사활성인자; b) 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 전사활성인자; 및 c) 레트로바이러스 입자에 대한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함하는 레트로바이러스 패키징 시스템으로서, 여기서, 제1 전사활성인자는 제2 전사활성인자의 발현을 조절하고, 여기서, 제2 전사활성인자는 바이러스 패키징에 관여하는 레트로바이러스 폴리펩티드, 예컨대, 예를 들어, gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 및/또는 슈도타입화 요소, 및 재조합 레트로바이러스 안으로, 또는 그 상에 도입될 예정이고, 패키징 세포주, 예컨대, 예를 들어, HEK-293에 대해 독성인 것으로 간주되는 임의적으로 다른 폴리펩티드의 발현을 조절하는 것인, 레트로바이러스 패키징 시스템을 제공한다. 특정 측면에서, 제2 전사활성인자 그 자체가 패키징 세포주에 대해 세포독성을 띤다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 본원에서 상세하게 논의된 바와 같이, 표적 세포의 세포 막에 결합할 수 있고, 그에의 융합을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 이론으로 제한하지 않으면서, 시스템은 레트로바이러스를 제조하고, 수거하게 되는 시점에 근접한 더 늦은 후속 시점까지, 수일 동안 또는 무기한으로 포유동물 세포의 집단을 배양하고, 레트로바이러스 생성물을 위해서는 요구되지만, 포유동물 세포의 생존 및/또는 증식에는 억제성을 띠거나, 억제성을 띨 수 있거나, 또는 억제성을 띠는 것으로 보고된 폴리펩티드, 예를 들어, 독성 폴리펩티드의 유도를 제어하면서, 포유동물 세포의 증식 또는 생존을 억제시키지 않거나, 또는 실질적으로 억제시키지 않거나, 또는 억제시키는 것으로 간주되지 않는 특정 폴리펩티드/단백질, 예를 들어, 비독성 단백질을 축적시킬 수 있는 능력을 제공한다. 패키징 가능한 RNA 게놈은 전형적으로, 본원에서 종종 편의상 제3 프로모터로 지칭되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 전형적으로 제1 전사활성인자 또는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다. 예시적인 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 제3 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하다. 따라서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 레트로바이러스 가 수거되는 시점에 근접한, 더 늦은 후속 시점에 제조될 수 있다.
당업자는 다수의 상이한 전사활성인자, 리간드, 및 유도가능한 프로모터가 레트로바이러스 패키징 시스템에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 유도가능한 프로모터는 다수의 유기체, 예컨대, 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고, 유래될 수 있다. 예컨대, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등과 같이, 제2 유기체에서의 사용을 위한 제1 유기체로부터 유래된 유도가능한 프로모터의 변형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 유도가능한 프로모터, 및 추가의 제어 단백질 또한 포함하는, 상기 유도가능한 프로모터에 기반한 시스템으로는 알콜에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 알콜 데히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터, 알콜 전사활성인자 단백질 (AlcR)에 대해 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린에 의해 조절되는 프로모터, (예컨대, TetActivators, TetON, TetOFF 등을 비롯한 프로모터 시스템), 스테로이드에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 래트 글루코코티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병기전과 관련하여 그에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 살리실산에 의해 조절되는 프로모터, 에틸렌에 의해 조절되는 프로모터, 벤조티아디아졸에 의해 조절되는 프로모터 등), 온도에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 열 충격 유도가능한 프로모터 (예컨대, HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광에 의해 조절되는 프로모터, 합성 유도가능한 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 미페프리스톤에 의해 조절되는 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기조절 피드백 루프가 있는 미페프리스톤 유도가능한 시스템이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, GAL4 조절 융합 단백질은 트랜스포존 말단 반복부 및 lox 및 FRT 부위 또한 함유하는 하나의 구축물로부터 발현된다. 일부 실시양태에서, GAL4 조절 융합 단백질은 역 tet 전사활성인자 (rtTA) 및 BiTRE의 발현을 제어한다. 일부 실시양태에서, lox 및 FRT 부위를 포함하는 또 다른 구축물은 GAL4 상류 활성화 서열 (UAS), 및 m체리와 같은 리포터를 구동시키는 E1b TATA 박스 프로모터를 함유한다. 일부 실시양태에서, GAL4 조절 융합 단백질은 GAL4 조절 융합 단백질의 발현을 제어하는 프로모터, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 프로모터, 둘 모두에서 GAL4 상류 활성화 서열 (UAS)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 패키징 세포주의 유도 및 선별을 위해 미페프리스톤, 독시사이클린, 및 퓨로마이신이 사용될 것이다.
일부 실시양태에서, 두 전사활성인자 중 어느 하나, 또는 그 둘 모두는 2개 이상의 폴리펩티드로 나뉘어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 폴리펩티드는 DNA 결합 도메인, 및 별개의 폴리펩티드에서의 전사를 자극시킬 수 있는 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 상기 "활성화 도메인"은 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킬 수 있는, "활성화 요소," 예컨대, CD3에 결합하는 폴리펩티드와 혼동하지 않아야 하고, 이는 전형적으로, 본원에서 상세하게 논의되는 바와 같이, 접촉시, 상기 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키지 않는다. 별개의 폴리펩티드는 리간드 결합을 통해 이량체화할 수 있는 폴리펩티드와의 융합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 도메인은 p65 활성화 도메인 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 본원의 패키징 시스템의 예시적인 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 ZFHD1로부터의 DNA 결합 도메인 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 한 폴리펩티드는 FKBP, 또는 그의 기능성 돌연변이체 및/또는 단편, 또는 다중 FKBP와의 융합물일 수 있고, 또 다른 폴리펩티드는 mTOR의 FRB 도메인, 또는 그의 기능성 돌연변이체 및/또는 단편과의 융합물일 수 있고, 리간드는 라파마이신 또는 기능성 라팔로그일 수 있다. 일부 실시양태에서, FRB는 돌연변이 K2095P, T2098L, 및/또는 W2101F를 함유한다. 일부 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 FKBP, 또는 그의 기능성 단편, 및 칼시뉴린A, 또는 그의 기능성 단편일 수 있고, 이량체화 작용제는 FK506일 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 FKBP, 또는 그의 기능성 단편, 및 CyP-Fas, 또는 그의 기능성 단편일 수 있고, 이량체화 작용제는 FKCsA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 GAI, 또는 그의 기능성 단편, 및 GID1, 또는 그의 기능성 단편일 수 있고, 이량체화 작용제는 지베렐린일 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 Snap-tag 및 HaloTag, 또는 그의 기능성 단편일 수 있고, 이량체화 작용제는 HaXS일 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인은 FKBP 또는 GyrB와의 융합 단백질로서 발현될 수 있고, 이량체화 작용제는 각각 FK1012 또는 쿠메르마이신일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도가능한 프로모터는, 전형적으로 DNA 결합 도메인이 그에 결합되어 있는 DNA 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도가능한 프로모터는 , 전형적으로 DNA 결합 도메인이 그에 결합되어 있는 DNA 서열마다 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 전사활성인자 중 어느 하나는 rtTA일 수 있고, 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 유도가능한 프로모터는 TRE일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 FRB에 융합된 p65 활성화 도메인 및 3개의 FKBP 폴리펩티드에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인이고, 제1 리간드는 라파마이신이다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 제2 전사활성인자는 rtTA일 수 있고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 유도가능한 프로모터는 TRE일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 컨센서스 서열, 예컨대, HIV Rev를 함유하는 전사체의 핵 외수송을 제어하는 요소의 발현을 조절할 수 있고, 컨센서스 서열은 Rev 반응 요소일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 표적 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 레트로바이러스 외피 폴리펩티드이다. 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 슈도타입화 요소는 전형적으로 표적 세포에의 결합, 및 표적 세포 및 바이러스 막의 막 융합 촉진을 위해 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 및/또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질이다. 예시적인 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 본원에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같이, 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 실시양태에서, 특히, 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인 경우, 결합 폴리펩티드는 홍역 바이러스 (예컨대, 홍역 바이러스의 에드먼스턴 균주)의 헤마글루티닌 (H) 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실 변이체이고, 다른 융합유도 폴리펩티드는 홍역 바이러스 (예컨대, 홍역 바이러스의 에드먼스턴 균주)의 융합 (F) 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실 변이체이다. 일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드는 하나의 폴리펩티드로서 발현되는 다중 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드는 동일한 전사체로부터, 단, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 번역될 수 있거나, 본원 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 폴리펩티드는 번역 후 펩티드 절단 신호 또는 리보솜 스킵 서열을 사용하여 절단됨으로써 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드로 생성된다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드가 홍역 바이러스 H 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실이고, 융합유도 폴리펩티드가 홍역 바이러스 F 폴리펩티드, 또는 그의 세포질 도메인 결실인 경우, 별개의 리보솜 결합 부위로부터의 F 및 H 폴리펩티드의 번역을 통해 H 폴리펩티드 대비 더 많은 양의 F 폴리펩티드가 생성된다. 일부 실시양태에서, F 폴리펩티드 (또는 그의 세포질 도메인 결실) 대 H 폴리펩티드 (또는 그의 세포질 도메인 결실)의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다.
일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 표적 세포, 예컨대, T 세포에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 본원에 개시된 활성화 요소 중 임의의 것이 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 실시양태에서, 활성화 요소는 a.) CD3에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는 b.) CD28에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 CD28에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드 CD80, CD86, 또는 그의 기능성 단편, 예컨대, CD80의 세포외 도메인이다.
일부 실시양태에서, 제2 전사활성인자는 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함하는, 하나 이상의 표적 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 패키징 시스템 측면, 및 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면은 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위한 재조합 레트로바이러스를 제조하는 것으로 제한되기보다는 재조합 레트로바이러스에 의해 형질도입될 수 있는 임의의 세포 유형에 대한 것으로 구상된다는 것에 주의하여야 한다. 특정 예시적인 실시양태에서, RNA는 레트로바이러스 성분, 예컨대, gag 및 pol을 반대 배향으로 (예컨대, 반대 가닥상의 것 및 반대 배향으로 코딩)을 포함한다. 예를 들어, RNA는 5'에서 3' 방향으로: 5' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 말단절단된 단편; 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열; 제1 및 임의적으로 제2 표적 폴리펩티드, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 일부 실시양태에서, 단지 편의상 "제4" 프로모터로 명명되는 프로모터로부터 비작동 구동될 수 있는 조작된 신호전달 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산 서열; 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터; 및 3' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 말단절단된 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 중심 폴리퓨린 트랙 (cPPT)/중심 종결 서열 (CTS) 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소는 Rev 반응 요소일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 본원에 개시된 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나 이상의 것이다.
프로모터 번호, 예컨대, 제1, 제2, 제3, 제4 프로모터 등은 단지 편의를 위한 것임을 이해할 것이다. "제4" 프로모터로 명명되는 프로모터가, 이는 상기 다른 프로모터가 명확하게 언급되지 않는 한, 임의의 추가의 프로모터, 예컨대, 제1, 제2, 제3 프로모터가 존재함을 암시하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 제1 림프구 증식성 요소를 포함할 수 있다. 적합한 림프구 증식성 요소는 본원 다른 섹션에 개시되어 있다. 비제한적인 예로서, 림프구 증식성 요소는 본원에 개시된 바와 같이, 인식 도메인, 예컨대, eTag와의 융합물로서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원에 제공된 임의의 CAR 실시양태를 코딩하는, 키메라 항원 수용체를 비롯한 제2 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 조작된 폴리펩티드는 제1 항원 특이적 표적화 영역, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 표적 세포가 T 세포인 일부 실시양태에서, 본원 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터는 T 세포에서 활성을 띤다.
일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원 다른 섹션에서 논의된 바와 같이, 리보스위치를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 역 배향으로 존재할 수 있다. 추가 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 리보스위치를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로, 리보스위치는 역 배향으로 존재할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 상기 요소 중 임의의 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 전사 블로커 또는 폴리A 서열은 비조절되는 전사를 막기 위해 또는 그를 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, Vpx를 코딩하는 핵산 서열은 제2 또는 임의적 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 패키징 세포 집단을 배양하여 제1 전사활성인자를 축적시키는 단계로서, 여기서, 패키징 세포는 제1 구성적 프로모터로부터 발현되는 제1 전사활성인자를 포함하고, 여기서, 제1 전사활성인자는 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것이고, 여기서, 제2 전사활성인자의 발현은 제1 전사활성인자에 의해 조절되는 것인 단계; 축적된 제1 전사활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에서 인큐베이션시켜 제2 전사활성인자를 축적시키는 단계로서, 여기서, 제2 전사활성인자는 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 것인 단계; 및 축적된 제2 전사활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에서 인큐베이션시킴으로써 바이러스 패키징에 관여하는 레트로바이러스 폴리펩티드, 예컨대, 예를 들어, gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 및/또는 슈도타입화 요소, 및 임의적으로, 재조합 레트로바이러스 안으로, 또는 그 상에 도입될 예정인, 포유동물 세포 증식 또는 생존을 억제시키는 것으로 간주되는 다른 폴리펩티드의 발현을 유도하여 재조합 레트로바이러스를 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은, 종종 편의상 "제3" 프로모터로서 지칭되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 여기서, 상기 제3 프로모터는 구성적으로 활성을 띠거나, 또는 제1 전사활성인자, 또는 예시적인 실시양태에서, 제2 전사활성인자에 의해 유도가능하고, 이로써, 재조합 레트로바이러스를 제조한다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 표적 세포의 세포 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막의 재조합 레트로바이러스 막에의 융합을 촉진시킬 수 있다. 슈도타입화 요소는 당업계에 공지된 임의의 외피 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질, 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 및/또는 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질일 수 있다. 다수의 상이한 전사활성인자, 리간드, 및 유도가능한 프로모터가 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 적합한 전사활성인자, 리간드, 및 유도가능한 프로모터는 상기를 비롯한, 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 본원에 제공된 레트로바이러스 패키징 시스템 측면에 관한 본원의 상기 교시 또한 재조합 레트로바이러스 제조 방법 측면에 적용된다는 것, 및 그 반대의 경우로 적용된다는 것도 당업자는 추가로 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 컨센서스 서열, 예컨대, HIV Rev를 함유하는 전사체의 핵 외수송을 제어하는 요소의 발현을 조절할 수 있고, 컨센서스 서열은 Rev 반응성 요소 (RRE)일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 표적 세포는 전형적으로 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 각각 HIV-2 RRE 및 HIV-2 Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 각각 SIV RRE 및 SIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 각각 RemRE 및 베타레트로바이러스 Rem을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 각각 델타레트로바이러스 RexRRE 및 델타레트로바이러스 Rex를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, Rev 유사 단백질은 요구되지 않고, RRE은 시스-작용 RNA 요소, 예컨대, 구성적 수송 요소 (CTE)로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 바이러스 외피 단백질이다. 슈도타입화 요소는 전형적으로 표적 세포에의 결합, 및 바이러스 및 표적 세포 막의 막 융합 촉진을 위해 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 고양이 내인성 바이러스 (RD114) 외피 단백질, 온코레트로바이러스 양종향성 외피 단백질, 온코레트로바이러스 동종지향성 외피 단백질, 및/또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피 단백질일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 슈도타입화 요소는 본원에서 추가로 상세하게 논의된 바와 같이, 상이한 단백질로부터 유래된 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 실시양태에서, 특히, 표적 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포인 경우, 결합 폴리펩티드는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있고, 융합유도 폴리펩티드는 홍역 바이러스 F 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드는 하나의 폴리펩티드로서 발현되는 다중 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드는 동일한 전사체로부터 번역되고, 별개의 리보솜 결합 부위로부터 번역될 수 있거나, 본원 다른 곳에서 개시된 바와 같이, 폴리펩티드는 번역 후 펩티드 절단 신호 또는 리보솜 스킵 서열을 사용하여 절단됨으로써 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드로 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 리보솜 결합 부위로부터의 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드의 번역을 통해 결합 폴리펩티드 대비 더 많은 양의 융합유도 폴리펩티드가 생성된다. 일부 실시양태에서, 융합유도 폴리펩티드 대 결합 폴리펩티드의 비는 적어도 2:1, 적어도 3:1, 적어도 4:1, 적어도 5:1, 적어도 6:1, 적어도 7:1, 또는 적어도 8:1이다.
일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 표적 세포, 예컨대, T 세포에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 활성화 요소의 발현을 조절할 수 있다. 본 실시양태에서, 활성화 요소는 a.) CD3에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는 b.) CD28에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 CD28에 결합하고, 그를 활성화시킬 수 있는 막 결합 폴리펩티드 CD80, CD86, 또는 그의 기능성 단편이다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 레트로바이러스 막 상의 활성화 요소 및 뉴클레오캡시드 내의 레트로바이러스 RNA를 포함할 수 있고, 이로써, 재조합 레트로바이러스를 제조할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 전사활성인자는, 5'에서 3' 방향으로: 5' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 말단절단된 단편; 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열; 제1 표적 폴리펩티드 및 임의적 제2 표적 폴리펩티드, 비제한적인 예로서, 1 또는 2개의 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열; 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터; 및 3' 긴 말단 반복부, 또는 그의 활성 말단절단된 단편을 포함하는 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 cPPT/CTS 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소는 Rev 반응성 요소일 수 있다. 본원의 개시내용 중 임의의 것에서, RRE 및 Psi를 비롯한, RNA 상의 레트로바이러스 성분은 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의 위치에 위치할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 신호전달 폴리펩티드는 본원에 개시된 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나 이상의 것이다.
일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드는 제1 림프구 증식성 요소를 포함할 수 있다. 적합한 림프구 증식성 요소는 본원 다른 섹션에 개시되어 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 림프구 증식성 요소는 인식 도메인, 예컨대, eTag에 융합된 IL-7 수용체 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원에 제공된 임의의 CAR 실시양태를 코딩하는, 키메라 항원 수용체를 비롯한 제2 조작된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 조작된 폴리펩티드는 제1 항원 특이적 표적화 영역, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 세포내 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인의 예는 본원 다른 곳에 개시되어 있다. 표적 세포가 T 세포인 일부 실시양태에서, 본원 다른 곳에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터는 T 세포에서 활성을 띤다.
일부 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 본원 다른 섹션에서 논의된 바와 같이, 리보스위치를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 역 배향으로 존재할 수 있다. 추가 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈은 리보스위치를 추가로 포함할 수 있고, 임의적으로, 리보스위치는 역 배향으로 존재할 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 상기 요소 중 임의의 것을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 전사 블로커 또는 폴리A 서열은 비조절되는 전사를 막기 위해 또는 그를 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, Vpx를 코딩하는 핵산 서열은 제2 또는 임의적 제3 전사 단위 상에, 또는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 추가의 전사 단위 상에 존재할 수 있다.
패키징 시스템, 또는 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 일부 실시양태에서, 코딩된 RNA는 인트론을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 표적 폴리펩티드(들)를 발현하기 위해 동일한 프로모터로부터 전사될 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 상기 인트론은 1, 2, 3, 또는 4개의 miRNA를 코딩할 수 있다. 패키징 시스템, 또는 레트로바이러스를 제조하는 방법 측면의 상기 및 다른 실시양태에서, 패키징 가능한 RNA 게놈의 크기는 11,000 KB 이하 및 일부 경우에서, 10,000 KB 이하이다.
일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 비독성인 하나 이상의 폴리펩티드의 발현에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 전사활성인자는 독성인 하나 이상의 폴리펩티드의 발현에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 제1 전사활성인자는 패키징 세포의 세포 막으로 수송되는 폴리펩티드 이외에도, 레트로바이러스 단백질 Rev 및 Vpx의 발현을 유도할 수 있고, 제2 전사활성인자는 레트로바이러스 단백질 GAG, POL, MV(Ed)-FΔ30, 및 MV(Ed)-HΔ18 또는 MV(Ed)-HΔ24 중 어느 하나의 발현, 및 렌티바이러스 게놈의 발현을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 독성인 하나 이상의 폴리펩티드의 발현에 영향을 줄 수 있고/거나, 제2 전사활성인자는 비독성인 하나 이상의 폴리펩티드의 발현에 영향을 줄 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a.) 제1 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제1 전사 단위로서, 여기서, 상기 제1 전사 단위는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서, 상기 전사활성인자는 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있고, 여기서, 상기 제1 전사활성인자는 상기 제1 리간드에 결합할 수 있는 것인, 제1 전사 단위; b.) 레트로바이러스 REV 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제2 및 임의적 제3 전사 단위로서, 여기서, 제2 전사활성인자는 제2 리간드에 결합할 수 있고, 여기서, 제2 및 임의적 제3 전사 단위는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 제2 및 임의적 제3 전사 단위; c.) 레트로바이러스 gag 폴리펩티드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩티드, 및 표적 세포 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막 및 레트로바이러스 막의 융합을 촉진시킬 수 있는 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제4 및 임의적 제5 전사 단위로서, 여기서, 제4 및 임의적 제5 전사 단위는 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 제4 및 임의적 제5 전사 단위; 및 d) 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, cPPT/CTS 요소, 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 역 상보체, 인트론, 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터, 및 3' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제6 전사 단위로서, 여기서, 제6 전사 단위는 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 제6 전사 단위를 포함하는, 포유동물 패키징 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 1.) 패키징 세포 집단을 배양하여 제1 전사활성인자를 축적시키는 단계로서, 여기서, 패키징 세포는 a.) 제1 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제1 전사 단위로서, 여기서, 상기 제1 전사 단위는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서, 상기 전사활성인자는 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있고, 여기서, 상기 제1 전사활성인자는 상기 제1 리간드에 결합할 수 있는 것인, 제1 전사 단위; b.) 레트로바이러스 REV 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 전사활성인자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제2 및 임의적 제3 전사 단위로서, 여기서, 제2 전사활성인자는 제2 리간드에 결합할 수 있고, 여기서, 제2 및 임의적 제3 전사 단위는 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 제2 및 임의적 제3 전사 단위; c.) 레트로바이러스 gag 폴리펩티드 및 레트로바이러스 pol 폴리펩티드, 및 표적 세포 막에 결합할 수 있고, 표적 세포 막과 레트로바이러스 막의 융합을 촉진시킬 수 있는 결합 폴리펩티드 및 융합유도 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제4 및 임의적 제5 전사 단위로서, 여기서, 제4 및 임의적 제5 전사 단위는 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 제4 및 임의적 제5 전사 단위; 및 d.) 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편, 프라이머 결합 부위 (PBS), 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, cPPT/CTS 요소, 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 역 상보체, 인트론, 표적 세포에서 활성을 띠는 프로모터, 및 3' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편을 포함하는, 포유동물 패키징 세포의 게놈 중의 제6 전사 단위로서, 여기서, 제5 전사 단위는 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 제6 전사 단위를 포함하는 것인 단계; 및 2.) 제1 전사활성인자를 포함하는 패키징 세포 집단을 제1 리간드의 존재하에서 인큐베이션시켜 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질를 축적시키는 단계; 및 3.) 제2 전사활성인자 및 레트로바이러스 REV 단백질을 포함하는 패키징 세포 집단을 제2 리간드의 존재하에서 인큐베이션시킴으로써 레트로바이러스 gag 폴리펩티드, 레트로바이러스 pol 폴리펩티드, 결합 폴리펩티드, 융합유도 폴리펩티드, 및 5'에서 3' 방향으로, 5' LTR, 또는 활성 단편, PBS, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소, 신호전달 폴리펩티드의 핵산 서열의 역 상보체, 표적 세포 프로모터, 및 3' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편을 포함하는 레트로바이러스 RNA의 발현을 유도하여 재조합 레트로바이러스를 제조하는 단계로서, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 패키징 세포로부터 형성되고, 방출되고, 여기서, 재조합 레트로바이러스는 레트로바이러스 막 상에 결합 폴리펩티드 및/또는 융합유도 폴리펩티드 및 뉴클레오캡시드 내에 레트로바이러스 RNA를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에 제공된 한 측면에서, 레트로바이러스 패키징 시스템은 1.) 구성적 프로모터로부터 발현되고, 제1 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제1 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 주기 위해 제1 리간드 및 제1 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있는 제1 전사활성인자; 2.) 제2 리간드 및 제2 유도가능한 프로모터에 결합할 수 있고, 제2 리간드의 부재 대비 그의 존재하에서 제2 유도가능한 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 제2 전사활성인자; 및 3.) 레트로바이러스 입자에 대한 패키징 가능한 RNA 게놈을 포함하는 포유동물 세포를 포함할 수 있고, 여기서, 제1 전사활성인자는 제2 전사활성인자, HIV REV, IL7 GPI DAF, 및 활성화 요소의 발현을 조절하고, 여기서, 제2 전사활성인자는 gag 폴리펩티드, pol 폴리펩티드, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소, 및 하나 이상의 외피 폴리펩티드의 발현을 조절한다. 예시적인 실시양태에서, 제1 전사활성인자는 p65 활성화 도메인에 융합된 FRB 도메인 및 ZFHD1 DNA 결합 도메인에 융합된 하나 이상의 FKBP 도메인일 수 있고, 제1 리간드는 라파마이신일 수 있고, 제1 유도가능한 프로모터는 하나 이상의 ZFHD1 결합 부위일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제2 전사활성인자는 rtTA 단백질일 수 있고, 제2 리간드는 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있고, 제2 유도가능한 프로모터는 TRE 프로모터 또는 양방향 TRE 프로모터일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소는 HIV Psi일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 하나 이상의 외피 단백질은 홍역 바이러스의 F 및 H 폴리펩티드의 세포질 도메인 결실 변이체를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 전사 블로커 또는 폴리A 서열은 비조절되는 전사를 막기 위해 또는 그를 감소시키기 위해 유전자에 근접하게 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스위치를 포함하는 라파마이신-독시사이클린 유도가능한 렌티바이러스 게놈이 사용될 수 있다 (서열 번호: 83). 일부 실시양태에서, 라파마이신-독시사이클린 유도가능한 GAG POL ENV가 사용될 수 있다 (서열 번호: 84). 일부 실시양태에서, 라파마이신-유도가능한 TET 활성인자가 사용될 수 있다 (서열 번호: 85). 일부 실시양태에서, 라파마이신 유도제 유도가능한 REV srcVpx가 사용될 수 있다 (서열 번호: 86).
본 개시내용의 일부 측면은 T 세포 및/또는 NK 세포의 형질도입을 위해 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스를 제조하기 위한 패키징 세포로서 사용되는 세포, 예시적인 예에서, 포유동물 세포를 포함하거나, 또는 상기 세포이다. 매우 다양한 세포들 중 임의의 것은 본 발명에 따라 바이러스, 예컨대, 재지정된 레트로바이러스의 시험관내 제조를 위해 선택될 수 있다. 진핵 세포, 특히, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말, 및 설칠 세포를 비롯한 포유동물 세포가 전형적으로 사용된다. 예시적인 예에서, 세포는 인간 세포이다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 세포는 무기한으로 재생되고, 따라서, 불멸이다. 본 발명에서 이롭게 사용될 수 있는 세포의 예로는 NIH 3T3 세포, COS 세포, 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포, 인간 배아 293T 세포 및 상기 세포로부터 유래된 임의의 세포, 예컨대, 293T 세포로부터 유래된 것인 gpnlslacZ φNX 세포를 포함한다. 고도로 형질감염가능한 세포, 예컨대, 인간 배아 신장 293T 세포가 사용될 수 있다. "고도로 형질감염가능한"이라는 것은 세포 중 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게 적어도 약 70% 및 가장 바람직하게 적어도 약 80%가 도입된 DNA의 유전자를 발현할 수 있다는 것을 의미한다.
적합한 포유동물 세포는 1차 세포 및 무한증식 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류 (예컨대, 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 HeLa 세포 (예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포 (예컨대, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예컨대, 수탁 번호 CRL-1573), 베로(Vero) 세포, NIH 3T3 세포 (예컨대, 수탁 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예컨대, 수탁 번호 CCLlO), PC12 세포 (수탁 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (수탁 번호 CRL1651), RATl 세포, 마우스 L 세포 (수탁 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (수탁 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, 주르카트(Jurkat), HL-60, NK 세포주 (예컨대, NKL, NK92, 및 YTS) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 재조합 레트로바이러스를 제조하는 방법은 포유동물 패키징 세포를 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 전면생장 또는 전면생장까지, 또는 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 최고 세포 밀도 또는 최고 세포 밀도까지 성장시킨 후, 세포를 나누거나, 또는 희석시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 성장시키는 교반식 탱크 반응장치가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 당업자가 이해하는 방법을 사용하여 적어도 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 또는 1:20으로 나뉠 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 최고 세포 밀도로 희석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 나누거나, 또는 희석시킨 후, 제1 리간드를 첨가하기 전에 세포를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 또는 16시간 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 성장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 제1 리간드의 존재하에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 또는 28일 동안, 예시적인 실시양태에서, 라파마이신 또는 라팔로그일 수 있는 제1 리간드의 존재하에서 성장시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 리간드를 첨가할 수 있고, 세포를 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 또는 28일 동안, 예시적인 실시양태에서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린일 수 있는 것에서 성장시킬 수 있다. 배양 조건은 사용되는 세포 및 리간드에 의존할 것이며, 방법은 당업계에 공지되어 있다. HEK293S 세포를 배양 및 유도하기 위한 조건에 관한 구체적인 예는 실시예 8에 제시되어 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 재조합 레트로바이러스는 유전자 전달을 위한 일반적인 도구이다 (문헌 [Miller, Nature (1992) 357:455-460]). 재배열되지 않은 핵산 서열을 광범위한 설치류, 영장류 및 인간 체세포로 전달할 수 있는 재조합 레트로바이러스의 능력을 통해서 재조합 레트로바이러스는 유전자를 세포로 전달할 수 있도록 잘 적합화된다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 알파레트로바이러스 속, 베타레트로바이러스 속, 감마레트로바이러스 속, 델타레트로바이러스 속, 엡실론레트로바이러스 속, 렌티바이러스 속, 또는 스푸마바이러스 속으로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하는 데 적합한 레트로바이러스는 다수 존재한다. 예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스 (FuSV), 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 (Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스 (FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (Mo-MSV), 아벨손(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스 (A-MLV), 조류 골수세포증 바이러스-29 (MC29), 및 조류 적아세포증 바이러스 (AEV)가 사용될 수 있다. 레트로바이러스에 관한 상세한 목록은 문헌 [Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)]에서 살펴볼 수 있다. 일부 레트로바이러스의 게놈 구조에 관한 상세한 설명은 당업계에서 살펴볼 수 있다. 예로서, HIV에 관한 상세한 설명은 NCBI 진뱅크(NCBI Genbank) (즉, 게놈 수탁 번호 AF033819)로부터 살펴볼 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 렌티바이러스 속으로부터 유래될 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 HIV, SIV, 또는 FIV로부터 유래될 것일 수 있다. 추가의 예시적인 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 렌티바이러스 속 중의 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV)로부터 유래된 것이다. 렌티바이러스는 공통된 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에도, 조절 또는 구조적 기능을 가지는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 잠복 감염 과정에서와 같이, 더 높은 복합도를 통해 렌티바이러스는 그의 생활사를 조정할 수 있다. 전형적인 렌티바이러스는, AIDS의 병인체인 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV)이다. 생체내에서 HIV는 예컨대, 림프구 및 대식세포와 같이, 거의 분열하지 않는 최종 분화된 세포를 감염시킬 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 재조합 레트로바이러스는 Vpx 폴리펩티드를 함유한다. Vpx 폴리펩티드는, 예를 들어, 레트로바이러스 막 내로 도입되는 세포 막 결합 단백질과 같이, 그의 게놈 내로의 Vpx 코딩 핵산의 통합 이후, 패키징 세포주에서 발현될 수 있다 (문헌 [Durand et al., J. Virol. (2013) 87: 234-242]). 일단 바이러스 입자에 도입되고 나면 유리 Vpx는 방출될 수 있도록 하기 위해, 레트로바이러스 막 결합 Vpx는 바이러스 프로테아제에 대한 프로세싱 서열과 함께 구축될 수 있다. 이러한 기능을 가지는 상기 Vpx 융합물의 예로는 c-Src의 처음 11개의 아미노산으로 이루어진 막-표적화 도메인 (MGSSKSKPKDP) (서열 번호: 227), 이어서, 바이러스 프로테아제 절단 도메인 KARVLAEA (서열 번호: 228), 이어서, Flag-태그부착된 Vpx를 포함하는 Src-Flag-Vpx가 있다.
이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, Vpx 폴리펩티드는 제한 인자 SAMHD1을 분해하여 역전사 프로세스의 효율을 자극시킴으로써 휴지기 세포의 형질도입을 지원한다. 따라서, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시키는 데 사용되는 재조합 레트로바이러스에 Vpx에 존재하는 본원에 제공된 방법에서, Vpx는 Vpx를 함유하는 재조합 레트로바이러스에 의한 세포의 형질도입시 휴지기 T 세포 또는 휴지기 NK 세포의 세포질 내로 방출되는 것으로 간주된다. 이어서, Vpx는 SAMHD1을 분해하고, 이는 유리 dNTP를 증가시키고, 결국에는 레트로바이러스 게놈의 역전사를 자극시킨다.
레트로바이러스 게놈 크기
본원에 제공된 방법 및 조성물에서, 재조합 레트로바이러스 게놈, 비제한적인 예시적인 예에서, 렌티바이러스 게놈은 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 개수에 제한이 있다. 본원에 제공된 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드는 기능성 활성을 보유하는 말단절단물 또는 다른 결실물일 수 있고, 이로써, 폴리뉴클레오티드 코딩 영역은 야생형 폴리펩티드에 대한 야생형 폴리펩티드보다 더 적은 개수의 뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 코딩 영역에 의해 코딩된 폴리펩티드는 1개의 프로모터로부터 발현될 수 있는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 1개의 융합 폴리펩티드 및 1개의 프로모터로부터 2개 이상의 기능성 폴리펩티드를 생성하기 위해 절단 신호를 가질 수 있다. 추가로, 초기 생체외 형질도입 이후에 요구되지 않는 일부 기능은 레트로바이러스 게놈에 포함되지 않지만, 이는 오히려 패키징 세포 막을 통해 바이러스 또는 레트로바이러스의 표면 상에 존재한다. 레트로바이러스 내로 패키징되는 기능성 요소를 최대화시키기 위해 이러한 다양한 전략법이 본원에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 패키징되는 재조합 레트로바이러스 게놈은 범위의 하단으로 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 및 8,000개의 뉴클레오티드 내지 범위의 상단으로 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 및 11,000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 패키징되는 레트로바이러스 게놈은 본원에 상세하게 개시된 바와 같은 제1 및 제2 조작 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 패키징되는 재조합 레트로바이러스 게놈은 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 또는 11,000개 미만의 뉴클레오티드일 수 있다. 본원 다른 곳에서 논의된 바 있는, 패키징될 수 있는 기능으로는 레트로바이러스 어셈블리 및 패키징을 위해 필요한 레트로바이러스 서열, 예컨대, 레트로바이러스 rev, gag, 및 pol 코딩 영역 뿐만 아니라, 5' LTR 및 3' LTR, 또는 활성 말단절단된 단편, 레트로바이러스 시스-작용 RNA 패키징 요소를 코딩하는 핵산 서열, 및 cPPT/CTS 요소를 포함한다. 추가로, 예시적인 실시양태에서, 본원의 재조합 바이러스 또는 레트로바이러스는 일부 실시양태에서, 이들 레트로바이러스 기능성 영역의 역 배향으로 하기: 그 중 적어도 하나가 림프구 증식성 요소를 포함하고, ASTR을 추가로 포함할 수 있는 것인 제1 및 제2 조작 신호전달 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 영역; 키메라 항원 수용체를 포함할 수 있는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드; 전형적으로, 제1 및/또는 제2 조작 신호전달 폴리펩티드의 발현을 조절하는 생체내 제어 요소, 예컨대, 리보스위치; 인식 도메인, 인트론, 표적 세포, 예컨대, T 세포에서 활성을 띠는 프로모터, 2A 절단 신호 및/또는 IRES 중 임의의 하나 이상의 것 또는 그들 모두를 포함할 수 있다.
재조합 레트로바이러스
재조합 레트로바이러스는 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입시켜 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포를 제조하기 위한, 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 개시되어 있다. 재조합 레트로바이러스 그 자체가 본 발명의 측면이다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 복제 불능인데, 이는 레트로바이러스가 일단 패키징 세포를 떠나고 나면, 복제를 할 수 없다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 재조합 레트로바이러스는 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스바이러스, 사이토메갈로바이러스, 폭스바이러스, 조류폭스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 신드비스 바이러스일 수 있다. 당업자는 상이한 상이한 레트로바이러스와의 사용을 위해 본원에 개시된 방법을 변형시키는 방법을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, HIV RRE 및 HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 N 말단 RGG 박스 RNA 결합 모티프 및 ICP27을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, HIV Rev를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역은 아데노바이러스 E1B 55-kDa 및 E4 Orf6을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 영역으로 대체될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서는 (i) T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 그에의 재조합 레트로바이러스의 막 융합을 촉진시킬 수 있는 슈도타입화 요소; (ii) T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 하나 이상의 전사 단위는, 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드, 및 림프구 증식성 요소를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 코딩하고; 여기서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드의 발현은 생체내 제어 요소에 의해 조절되는 것인 폴리뉴클레오티드; 및 (iii) T 세포 및/또는 NK 세포에 결합할 수 있고, 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 것인, 재조합 레트로바이러스 표면 상의 활성화 요소를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포에서 활성을 띠는 것은 패키징 세포주에서는 활성을 띠지 않는다. 본원에 개시된 실시양태 중 임의의 것에서, 제1 및 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 어느 하나는 키메라 항원 수용체를 가질 수 있고, 나머지 다른 조작된 신호전달 폴리펩티드는 림프구 증식성 요소를 가질 수 있다.
유전적으로 변형된 T 세포 및 NK 세포
본원의 방법 및 조성물의 실시양태에서, 그 자체가 본 발명의 별개의 측면인 유전적으로 변형된 림프구가 제조된다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는 림프구, 예컨대, 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드 및/또는 항원 특이적 표적화 영역 (ASTR), 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 T 세포 및/또는 NK 세포이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에서, 두 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나 또는 그 둘 모두의 발현은 전형적으로 생체내 제어 요소에 의해 조절되고, 일부 실시양태에서, 생체내 제어 요소는 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 리보스위치는 뉴클레오시드 유사체에 결합할 수 있고, 뉴클레오시드 유사체가 존재할 때, 두 조작된 신호전달 폴리펩티드 중 하나 또는 그 둘 모두가 발현된다.
본원에 개시된 유전적으로 변형된 림프구는 또한 그의 표면 상에 발현된 폴리펩티드, 예컨대, 활성화 요소로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩티드, 슈도타입화 요소로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 시토카인을 포함하는 하나 이상의 융합 폴리펩티드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는 그의 표면 상에 활성화 요소를 가진다. 활성화 요소는 CD3에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드; 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 막 결합 폴리펩티드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 요소는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 부착된 항-CD3 scFvFc 및/또는 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 부착된 CD80이다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는 그의 표면 상에 슈도타입화 요소를 가진다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 림프구는, 융합 폴리펩티드가 DAF에 공유적으로 부착된 시토카인인 것인 융합 폴리펩티드를 그의 표면 상에 가진다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 IL-7 또는 IL-15이다. 예시적인 실시양태에서, 시토카인은 IL-7이다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 그의 신호 서열이 없는 것이다. 예시적인 실시양태에서, 시토카인은 그의 신호 서열 뒤 DAF 내로 삽입된다.
핵산
본 개시내용은 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 예컨대, 재조합 발현 벡터를 비롯한, DNA일 것이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA, 예컨대, 시험관내에서 합성된 RNA일 것이다.
일부 경우에서, 핵산은 예컨대, 포유동물 세포에서 본 개시내용의 폴리펩티드를 제조한다. 다른 경우에서, 대상 핵산은 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭시킨다.
본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 전사 제어 요소, 예컨대, 프로모터, 및 인핸서 등에 작동가능하게 연결될 수 있다.
적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터로는 lacl, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 진핵 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터로는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소; 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터; 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 조기 및 후기 SV40 프로모터; 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부에 존재하는 프로모터; 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터; 및 당업계에 공지된 각종의 조직 특이적 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
가역성 유도가능한 프로모터를 비롯한, 적합한 가역성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 가역성 프로모터는 다수의 유기체, 예컨대, 진핵생물 및 원핵생물로부터 단리되고, 유래될 수 있다. 예컨대, 제1 원핵생물 및 제2 진핵생물, 제1 진핵생물 및 제2 원핵생물 등과 같이, 제2 유기체에서의 사용을 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역성 프로모터의 변형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 가역성 프로모터, 및 추가의 제어 단백질 또한 포함하는, 상기 가역성 프로모터에 기반한 시스템으로는 알콜에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 알콜 데히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터, 알콜 전사활성인자 단백질 (AlcR)에 대해 반응성인 프로모터 등), 테트라사이클린에 의해 조절되는 프로모터, (예컨대, TetActivator, TetON, TetOFF 등을 포함하는 프로모터 시스템), 스테로이드에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 래트 글루코코티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 발병기전과 관련하여 그에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 살리실산에 의해 조절되는 프로모터, 에틸렌에 의해 조절되는 프로모터, 벤조티아디아졸에 의해 조절되는 프로모터 등), 온도에 의해 조절되는 프로모터 (예컨대, 열 충격 유도가능한 프로모터 (예컨대, HSP-70, HSP-90, 대두 열 충격 프로모터 등), 광에 의해 조절되는 프로모터, 합성 유도가능한 프로모터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 적합한 프로모터를 함유하는 유전자좌 또는 구축물 또는 트랜스진은 유도가능한 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 전환된다. 비가역적 스위치의 유도를 위해 적합한 시스템은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예컨대, 비가역적 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합을 이용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Fuhrmann-Benzakein, et al., PNAS (2000) 28:e99] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 당업계에 공지된 리콤비나제, 엔도뉴클레아제, 리가제, 재조합 부위 등의 임의의 적합한 조합이 비가역적으로 전환가능한 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원 다른 곳에 기술된, 부위 특이적 재조합을 수행하기 위한 방법, 기전, 및 요건은 비가역적으로 전환되는 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있고, 이는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예컨대, 문헌 [Grindley et al. (2006) Annual Review of Biochemistry, 567-605] 및 [Tropp (2012) Molecular Biology (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, MA)] (상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.
일부 경우에서, 프로모터는 CD8 세포 특이적 프로모터, CD4 세포 특이적 프로모터, 호중구 특이적 프로모터, 또는 NK 특이적 프로모터이다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터가 사용될 수 있고; 예컨대, 문헌 [Salmon et al. (1993) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90:7739]; 및 [Marodon et al. (2003) Blood 101:3416]을 참조한다. 또 다른 예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포 특이적 발현은 Neri (p46) 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있고; 예컨대, 문헌 [Eckelhart et al. (2011) Blood 117:1565]를 참조한다.
일부 실시양태에서, 예컨대, 효모 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대, ADHl 프로모터, PGK1 프로모터, ENO 프로모터, PYK1 프로모터 등; 또는 조절가능한 프로모터, 예컨대, GALI 프로모터, GALlO 프로모터, ADH2 프로모터, PH05 프로모터, CUP1 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYC1 프로모터, HIS3 프로모터, ADH1 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADC1 프로모터, TRP1 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TP1 프로모터, 및 AOX1 (예컨대, 피치아(Pichia)에서 사용하는 경우)이다. 적절한 벡터 및 프로모터 선택은 당업계의 숙련가의 수준 내에 잘 포함되어 있다.
원핵 숙주 세포에서의 사용에 적합한 프로모터로는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터; 하이브리드 프로모터, 예컨대, lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터 등; araBAD 프로모터; 생체내에서 조절되는 프로모터, 예컨대, ssaG 프로모터 또는 관련된 프로모터 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 20040131637 참조), pagC 프로모터 (문헌 [Pulkkinen and Miller, J. Bacterial., 1991: 173(1): 86-93]; [Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83]), nirB 프로모터 (문헌 [Harborne et al. (1992) Mal . Micro. 6:2805-2813]) 등 (예컨대, 문헌 [Dunstan et al. (1999) Infect. Immun . 67:5133-5141]; [McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255]; 및 [Chatfield et al. (1992) Biotechnol . 10:888-892] 참조); 시그마70 프로모터, 예컨대, 컨센서스 시그마70 프로모터 (예컨대, 진뱅크 수탁 번호 AX798980, AX798961, 및 AX798183 참조); 정지기 프로모터, 예컨대, dps 프로모터, spv 프로모터 등; 병원성 유전자군 SPI-2로부터 유래된 프로모터 (예컨대, W096/17951 참조); actA 프로모터 (예컨대, 문헌 [Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun . 70:1087-1096] 참조); rpsM 프로모터 (예컨대, 문헌 [Valdivia and Falkow (1996). Mal . Microbial. 22:367] 참조); tet 프로모터 (예컨대, 문헌 [Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) In Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162] 참조); SP6 프로모터 (예컨대, 문헌 [Melton et al. (1984) Nucl . Acids Res. 12:7035] 참조) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 원핵생물, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 사용을 위해 적합한 강력한 프로모터로는 Trc, Tac, T5, T7, 및 P람다(PLambda)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 비제한적인 예로는 락토스 프로모터 오퍼레이터 (Laci 리프레서 단백질은 락토스와의 접촉시 입체구조를 변화시킴으로써 Laci 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합하지 못하게 막는다), 트립토판 프로모터 오퍼레이터 (트립토판과 복합체를 형성하였을 때, TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하는 입체구조를 가지고; 트립토판 부재하에서 TrpR 리프레서 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 입체구조를 가진다), 및 tac 프로모터 오퍼레이터 (예를 들어, 문헌 [deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25] 참조)를 포함한다.
본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 및/또는 클로닝 벡터에 존재할 수 있다. 2개의 별개의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 또는 별개의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 선별가능한 마커, 복제 기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 제공하는 다른 특징부를 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다.
다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고; 대상 재조합 구축물을 생성하는 데 다수가 상업적으로 이용가능하다. 하기 박테리아 벡터가 예로서 제공된다: pBs, 파지스크립트, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (스트라타진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야)); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (파마시아(Pharmacia: 스웨덴 웁살라)). 하기 진핵 벡터가 예로서 제공된다: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (스트라타진) pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL (파마시아).
발현 벡터는 일반적으로 이종성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 삽입시키기 위해 프로모터 서열 인근에 위치하는 알맞은 제한 부위를 가진다. 발현 숙주에서 작동하는 선별가능한 마커가 존재할 수 있다. 적합한 발현 벡터로는 바이러스 벡터 (예컨대, 백시니아 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스 (예컨대, 문헌 [Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994]; [Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999]; [Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995]; [Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조); 아데노 연관 바이러스 (예컨대, 문헌 [Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998], [Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997]; [Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997]; [Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997], [Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999]; [Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996]; WO 93/09239 (Srivastava), [Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828]; [Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165]; 및 [Flotte et al., PNAS (1993) 90: 10613-10617] 참조); SV40; 헤르페스 단순 바이러스; 감마 레트로바이러스; 인간 면역결핍증 바이러스 (예컨대, 문헌 [Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997]; [Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999] 참조)에 기반한 바이러스 벡터); 레트로바이러스 벡터 (예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대, 라우스 육종 바이러스, 하비(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 일부 실시양태에서, RNA, 예컨대, 시험관내에서 합성된 RNA일 것이다. RNA의 시험관내 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고; 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 합성하는 데 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 숙주 세포 내로 RNA를 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Zhao et al. (2010) Cancer Res. 15:9053]을 참조한다. 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 시험관내에서 또는 생체외에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 (예컨대, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 시험관내에서 또는 생체외에서 본 개시내용의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA로 전기천공될 수 있다.
세포
본 개시내용은 표적 포유동물 세포를 유전적으로 변형시키는 재조합 레트로바이러스를 생산하는 포유동물 세포주 및 표적 포유동물 세포 그 자체를 제공한다.
적합한 포유동물 세포로는 1차 세포 및 무한증식 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 인간 세포주, 비인간 영장류 세포주, 설치류 (예컨대, 마우스, 래트) 세포주 등을 포함한다. 적합한 포유동물 세포주로는 HeLa 세포 (예컨대, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포 (예컨대, ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예컨대, 수탁 번호 CRL-1573), 베로 세포, NIH 3T3 세포 (예컨대, 수탁 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK세포 (예컨대, 수탁 번호 CCLlO), PC12 세포 (수탁 번호 CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (수탁 번호 CRL1651), RATl 세포, 마우스 L 세포 (수탁 번호 CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (수탁 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, 주르카트, HL-60, NK 세포주 (예컨대, NKL, NK92, 및 YTS) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에서, 세포는 무한증식 세포주가 아니고, 대신 개체 또는 생체외 세포로부터 수득된 세포 (예컨대, 1차 세포)이다. 예를 들어, 일부 경우에서, 세포는 개체로부터 수득된 면역 세포이다. 또 다른 예로서, 세포는 개체로부터 수득된 줄기 세포 또는 전구 세포이다.
면역 세포를 활성화시키는 방법
본 개시내용은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 면역 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 (시험관내, 생체내, 또는 생체외에서) 면역 세포를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 면역 세포는 본 개시내용의 미세환경 제한 CAR을 생산하도록 유전적으로 변형된 것이다. 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서, 미세환경 제한 CAR은 면역 세포를 활성화시킴으로써 활성화된 면역 세포를 생산한다. 면역 세포로는 예컨대, 세포독성 T 림프구, NK 세포, CD4+ T 세포, T 조절 (Treg) 세포, γδ T 세포, NK-T 세포, 호중구 등을 포함한다.
유전적으로 변형된 면역 세포 (예컨대, T 림프구, NK 세포)를 하나 이상의 표적 항원와 접촉시키면, 면역 세포에 의한 시토카인의 생산은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서의 면역 세포에 의한 시토카인의 생산량과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다. 생산이 증가될 수 있는 시토카인으로는 IL-2 및 IFN-γ를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유전적으로 변형된 세포독성 세포 (예컨대, 세포독성 T 림프구)를 AAR과 접촉시키면, 세포독성 세포의 세포독성 활성은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서의 세포독성 세포의 세포독성 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포독성 세포 (예컨대, 세포독성 T 림프구)를 하나 이상의 표적 항원과 접촉시키면, 세포독성 세포의 세포독성 활성은, 하나 이상의 표적 항원의 부재하에서의 세포독성 세포의 세포독성 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 또는, 또는 10배 초과만큼 증가될 수 있다.
다른 실시양태에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포를 항원과 접촉시키는 것은 예컨대, 숙주 면역 세포에 따라 세포 증식, 세포 생존, 세포 사멸 등을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 제조하는 방법
일부 실시양태에서, CAR의 항원 결합 도메인 (이는 또한 본원에서 "항원 특이적 표적 영역" 또는 "ASTR")로도 지칭)은 구성적으로 그의 동족 항원에 결합한다. 다른 실시양태에서, ASTR은 본원에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같이, 특정의 비정상적인 조건, 예컨대, 종양 미세환경에 존재하는 것과 같은 조건하에서 차별적으로 또는 오직 그의 동족 항원에 결합하는, 미세환경 제한적인 것일 수 있다. 차별적으로 또는 배타적으로 종양 미세환경의 비정상적인 조건하에서 결합하는 미세환경 제한 ASTR은 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 효과를 정상적인 생리적 조건하에서 항원에의 결합이 감소되는 것만큼, 일부 상황하에서는 면역검정법에 의하면, 검출 미만인 수준으로까지 감소시킬 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 CAR은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 미세환경 제한 ASTR을 포함하고, 여기서, ASTR은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv 단편이다.
본원에 개시된 측면의 특정 예시적인 실시양태에서, 예를 들어, 본원에 개시된 방법, 세포, 세포주, 레트로바이러스, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터는 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 포함하는 CAR을 포함한다.
따라서, 한 측면에서, 본원에서는
a) 정상적인 생리적 환경에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서 표적 항원에의 결합 증가를 보이는 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역으로서, 여기서, 항원 특이적 표적화 영역은 표적에 결합하는 것인 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막횡단 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
a) 폴리펩티드 라이브러리를 패닝함으로써 선별되고, 정상적인 생리적 조건에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서의 표적 항원 결합 검정법에서 활성 증가를 보이는 적어도 하나의 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역;
b) 막횡단 도메인; 및
c) 세포내 활성화 도메인을 포함하는, 표적 항원에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본원에 개시된 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체 중 임의의 것은 미세환경 제한인 것일 수 있고, 이로써, 정상적인 생리적 조건하에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서 결합 활성 증가를 보일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 측면의 일부 예시적인 실시양태에서, 미세환경 제한 ASTR은 스크리닝/진화 이전에 라이브러리의 구성원을 돌연변이화/진화시키지 않고, 및/또는 스크리닝 동안 또는 스크리닝의 임의적 반복 라운드 사이에 돌연변이화시키지 않고, 초기 폴리펩티드 라이브러리로부터 확인된다. 예시적인 막횡단 도메인 및 세포내 활성화 도메인은 CAR에 대한 본원에 개시된 것 중 임의의 것일 수 있다.
한 측면에서, 본원에서는
a. 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리의 폴리펩티드에 대해 정상적인 생리적 조건하에서 표적 항원 결합 검정법, 및 비정상적인 조건하에서 표적 항원 결합 검정법을 수행하고;
b. 생리적 조건에서의 것과 비교하여 비정상적인 조건에서 표적 항원 결합 활성 증가를 보이는 폴리펩티드를 선별함으로써 폴리펩티드 디스플레이 라이브러리를 패닝하여 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 선별하는 단계를 포함하는, 미세환경 제한 ASTR을 선별하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에서는
비정상적인 조건하에서 폴리펩티드 라이브러리를, 고체 지지체에 결합된 표적 항원과 접촉시키고, 여기서, 표적 항원에 결합하는 폴리펩티드를 발현하는 클론은 표적 항원을 통해 고체 지지체에 결합된 상태 그대로 남아 있고;
생리적 조건하에서 폴리펩티드가 결합된 고체 지지체를 인큐베이션시키고;
생리적 조건하에서 고체 지지체로부터 용리되는 클론을 수집함으로써 폴리펩티드 라이브러리를 패닝하여 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 단리시키는 단계를 포함하는, 미세환경 제한 ASTR을 단리시키는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 임의의 측면의 일부 예시적인 실시양태에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 스크리닝 이전에 라이브러리의 구성원을 돌연변이화/진화시키지 않고, 및/또는 스크리닝 또는 패닝 동안 또는 스크리닝 또는 패닝의 임의적 반복 라운드 사이에 돌연변이화/진화시키지 않고, 초기 폴리펩티드 라이브러리로부터 확인된다.
정상적인 생리적 조건은 대상체에게로의 투여 부위에서, 또는 작용 부위의 조직 또는 기관에서 정상적인 범위 내에 있을 것을 간주되는 온도, pH, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 및 전해질 농도 조건을 포함할 수 있다. 비정상적인 조건은 상기 조건에 대하여 일반적으로 허용되는 범위에서 벗어난 것이다. 한 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역 (즉, 폴리펩티드)은 실제로 정상적인 조건에서는 불활성이지만, 정상적인 조건이 아닌 경우, 정상적인 조건에서의 것과 동일하거나, 또는 그보다 우수한 수준으로 활성을 띤다. 예를 들어, 한 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 실제로 체온에서는 불활성이지만, 더 낮은 온도에서는 활성을 띤다. 또 다른 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 정상적인 조건에서는 가역적으로 또는 비가역적으로 불활성화된다. 추가의 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 치료적 단백질이다. 또 다른 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 약물, 또는 치료제로서 사용된다. 추가의 또 다른 측면에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 고도로 산소를 공급받은 혈액에서는, 예컨대, 예를 들어, 폐 통과 후, 또는 신장에서 발견되는 더 낮은 pH 환경에서 더 높거나, 또는 더 낮은 활성을 띤다.
일부 실시양태에서, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 수득하기 위해 1 라운드의 선별을 수행한다. 특정 실시양태에서, 스크리닝 또는 패닝 방법은, 초기 또는 이전 라운드에서 비정상적인 조건하에서는 항원에 결합하고, 생리적 조건하에서 결합하지 않은 유리 폴리펩티드, 또는 상기 특성을 가진 시험 폴리펩티드를 발현하는 세포, 또는 상기 특성을 가진 시험 폴리펩티드로 코팅된 파지를 확인한 후 반복된다. 일부 방법에서, 수집된 파지는 세포를 감염시키는 데 사용되고, 상기 세포는 또한 수집된 파지를 증폭시키기 위해 헬퍼 파지로 감염될 수 있다. 세포 표면 상의 폴리펩티드가 시험되는 것인 다른 방법에서, 수집된 세포를 성장시켜, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에서 증폭시킴으로써 세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 "증폭시킬 수 있다." 일부 실시양태에서, 라운드 사이에 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이화하는 프로세스를 수행하지 않고, 확인된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 성장시킴으로써 증폭을 수행한다. 이로써, 상기 수집된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 증폭시킴으로써 이전 라운드에서 수집된 폴리펩티드가 농축된다.
패닝 또는 스크리닝 방법은 1회 수행될 수 있거나, 또는 1 내지 1,000회 반복될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 패닝은 1 내지 20회, 또는 2회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 반복된다.
다른 방법에서, 관심의 대상이 되는 항원 (즉, 표적 항원)에 대한 미세환경 제한 ASTR은 패닝 라운드 사이에 1회 이상의 라운드의 돌연변이화/진화를 사용하여 수행된다. 한 방법에서, 야생형 단백질은 예를 들어, 폴리펩티드 또는 단백질 라이브러리를 생성하고, 표적 항원에 대하여 원하는 결합 친화도를 가지는 폴리펩티드 또는 단백질에 대하여 폴리펩티드 또는 단백질 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인된다. 야생형 단백질이 항체인 일부 실시양태에서, 야생형 항체는 파지 디스플레이 항체 라이브러리, 예를 들어, 파지 디스플레이 인간화 항체 라이브러리를 비롯한, 다중클론 또는 단일클론 항체 라이브러리를 생성하고, 스크리닝함으로써 발견될 수 있다.
진화된 ASTR은 야생형 단백질, 또는 야생형 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 의하여 돌연변이유발 프로세스를 수행하여, 정상적인 생리적 환경과 비교하여 종양 환경에서 및/또는 시험관내 종양 대용물 검정 조건에서 증가된 활성을 보이는 (예컨대, 표적 항원에 대하여 증진된 결합 친화도를 보이는) 돌연변이체 ASTR을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있는 돌연변이체 폴리펩티드 집단을 제조함으로써 생성될 수 있다. 상기 방법의 예는 WO2016033331 (발명의 명칭: "CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T CELLS") 또는 미국 특허 번호 8,709,755 (상기 두 특허 모두 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다. 상기의 미세환경 제한 항체를 생성하는 방법은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
다른 실시양태에서, 미세환경 제한 항원 특이적 폴리펩티드 (즉, 표적화 영역, 예컨대, 항체)는 생리적 조건 대비 비정상적인 조건하에서 초기 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하고, 생리적 조건 대비 비정상적인 조건하에서 차별적으로 또는 배타적으로 결합하는 시험 폴리펩티드를 초기 폴리펩티드 라이브러리로부터 확인함으로써 확인될 수 있다. 일부 예에서, 초기 폴리펩티드 라이브러리 스크린에서 초기 폴리펩티드 라이브러리로부터 확인된, 확인되고, 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 폴리펩티드 (즉, 표적화 영역, 예컨대, 항체)는 생리적 조건 대비 비정상적인 조건하에서 그의 동족 항원에 차별적으로 또는 배타적으로 결합한다. 상기 경우에서, 돌연변이화/진화 라운드는 수행되지 않는다. 따라서, 예시적인 실시양태에서, 본 방법은 스크리닝 라운드 (예컨대, 패닝 라운드) 사이에 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이화시키지 않고 수행되거나, 또는 미세환경 제한 항원 특이적 폴리펩티드 (즉, 표적화 영역, 예컨대, 항체)를 단리시키고, 확인하기 위해 생리적 조건 대비 비정상적인 조건하에서 단 1회의 결합 검정법으로 수행된다. 본 방법은 스크리닝 및/또는 패닝 라운드 사이에 임의의 돌연변이화/진화 없이, 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 유기체를 배양하고/거나, 고성능 방식으로 증폭시키고/거나, 희석시킴으로써 수행될 수 있다. 추가로, 본 방법은 스크리닝 및/또는 패닝 반복 없이 수행될 수 있고, 미세환경 제한 항원 특이적 폴리펩티드 (즉, 표적 영역, 예컨대, 항체)를 단리시킨 후, 단리된 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이화/진화 없이 수행될 수 있다.
폴리펩티드의 동족 결합 파트너에의 결합을 검출하기 위한, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 검정법으로는 세포 기반 검정법, 및 특히, 세포 표면 디스플레이 시스템, 예컨대, 포유동물 세포 표면 디스플레이 시스템을 사용하여 수행되는 검정법을 포함한다. 예시적인 방법에서, 폴리펩티드, 또는 변형된 폴리펩티드의 라이브러리를 비롯한, 변이체 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 핵산은 세포, 예컨대, 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 이어서, 세포는 벡터로 형질감염되고, 폴리펩티드(들)는 세포에 의해 발혀된다. 표면에 발현된 폴리펩티드를 함유하는 세포의 라이브러리를 가용성 또는 표면 결합 동족 결합 파트너를 함유하는 용액과 접촉시킬 수 있다. 세포 표면에의 결합을 검출할 수 있는 임의의 검정법을 사용하여 결합 활성을 검출할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 기능성 활성을 사정함으로써 활성 또한 사정할 수 있다. 세포 증식 검정법, 세포 사멸 검정법, 유세포 분석법, 세포 분리 기술, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 위상 현미경법, 형광 현미경법, 수용체 결합 검정법, 세포 신호전달 검정법, 면역세포화학법 및 리포터 유전자 검정법을 비롯한, 당업자에게 공지된 임의의 세포 기반 검정법이 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 일부 예에서, 검정법은 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 검정법이다.
폴리펩티드 또는 단백질은 분비형, 가용성 분자, 세포 표면 분자, 또는 세포내 항체로서 포유동물 세포에 의해 발현될 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포 대부분 또는 그들 모두가 세포 표면 상에 부착된 단백질 라이브러리의 구성원을 디스플레이하는 조건하에서, 세포를 단백질의 라이브러리로 형질감염시킬 수 있다. 임의적으로, 포유동물 세포 형질감염체 대부분이 그의 게놈 내에 단 1개의 플라스미드가 통합되어 있는 것인 발현 시스템이 사용될 수 있다. 그러므로, 형질감염체 중 대부분 (즉, 적어도 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90%)은 한 폴리펩티드의 하나 이상의 분자를 발현한다. 이는 예를 들어, 개별 형질감염체를 단리시키고, 배양하고; 발현된 서열을 증폭시키고, 서열분석함으로써 단일 서열을 가지는지 여부를 측정함으로써 확인될 수 있다.
본원에 제공된 방법의 일부 예에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포의 표면 상에 디스플레이된 항체이다. 전장, 2가, 기능성 항체, 예컨대, IgG 항체를 비롯한, 본원에 기술된 임의의 항체는 포유동물 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다. 항체는 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 단편일 수 있다. 항체는 Fc 영역, 예컨대, scFv-Fc 또는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 전장 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 적합한 항체 단편을 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 제조된 ScFv-Fcs 및 전장 항체가 scFv 또는 Fab 단편에 비하여 여러 가지 이점을 가질 수 있다.
본원에 제공된 결합 검정법에서 사용될 수 있는 고체 지지체로는 폴리펩티드의 결합 파트너, 예컨대, 리간드, 수용체 또는 항원과 부착될 수 있는 임의의 캐리어를 포함한다. 전형적으로, 고처리량 스크리닝을 촉진시키기 위해, 동족 결합 파트너를 고체 지지체에 부착시킨다. 본원에 제공된 방법에서 고체 지지체로서 사용하기 위한 캐리어의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 개질된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자기 고체 지지체, 예컨대, 자철석을 포함하는 고체 지지체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 고체 지지체는 하나 이상의 비드 또는 입자, 미소구, 튜브 또는 플레이트의 표면, 필터 막, 및 당업계에 공지된 다른 고체 지지체일 수 있다. 예시적인 고체 지지체 시스템으로는, 다중웰 플레이트 또는 막을 비롯한, 예를 들어, 유리, 실리콘, 금속, 나일론, 셀룰로스, 플라스틱 또는 합성물로 구축된 평평한 표면을 포함하나, 이에 제한되지 않거나; 또는 비드, 예컨대, 실리카 겔, 조절형 포어 유리, 자기 또는 셀룰로스 비드 형태일 수 있다. 추가로, 상기 방법은 현탁액에서의 또는 칼럼 형태로의 사용을 위해 적합화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세환경 제한 항원 특이적 폴리펩티드 (즉, 표적 영역, 예컨대, 항체)는 고정화된 표적 항원을 이용하여 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이 (문헌 [Colby et al., "Engineering Antibody Affinity by Yeast Surface Display," Meth . Enzym . 388, 26 (2004)]) 항체 (예컨대, 인간화 항체) 라이브러리를 바이오패닝함으로써 확인되고, 단리된다. 예를 들어, 나이브 인간화 항체 라이브러리 또는 합성 인간화 항체 라이브러리는 본원의 파지 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이 방법을 사용하여 패닝될 수 있다. 일부 실시양태에서, 초기 파지 디스플레이 프로세에서, 파지 클론은 포유동물 벡터로 전달될 수 있고, 포유동물 세포 표면 스크리닝 방법에서 사용될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Yoon et al., BMC Biotechnology 12:62; 1472-6750 (2012)] 참조). 파지 디스플레이를 수행하여 미세환경 제한 항원 특이적 표적 영역을 단리시키는 예시적인 방법은 실시예 2에 제공되어 있다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 확인된 미세환경 제한 ASTR은 항체, 항원, 리간드, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체, 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 애피바디일 수 있다. 미세환경 제한 ASTR이 항체인 실시양태에서, 이는 전장 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 및 2가 단일 쇄 항체 또는 디아바디일 수 있고, 여기서, 항원 특이적 표적화 영역은 항체로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미세환경 제한 ASTR은 단일 쇄 가변 단편이다. 상기 단일 쇄 가변 단편은 링커에 의해 이격되어 있는 중쇄 및 경쇄를 가질 수 있고, 여기서, 링커의 길이는 6 내지 100개의 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 키메라 항원 수용체에서 경쇄에 대하여 N 말단에 위치한다. 다른 실시양태에서, 경쇄는 중쇄에 대하여 N 말단에 위치한다. 미세환경 제한 ASTR은 이중특이적 ASTR일 수 있다.
본원에 제공된 방법을 사용하여 확인된 미세환경 제한 ASTR은 전형적으로 폴리펩티드, 및 더욱 구체적으로, 폴리펩티드 항체, 및 예시적인 실시양태에서, 단일 쇄 항체이다. 이들 폴리펩티드는 정상적인 조건 대비 비정상적인 조건하에서 더 높거나, 또는 더 낮은 친화도로 그의 동족 항원에 결합할 수 있지만, 예시적인 실시양태에서, 정상적인 조건에서보다 비정상적인 조건하에서 더 높은 친화도로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 폴리펩티드는 생리적 (즉, 정상적인) 조건에서보다 비정상적인 조건하에서 10%, 20%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 더 큰 친화도로 그의 동족 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법을 사용하여 확인된 ASTR은 정상적인 생리적 조건하에서는 음성 대조군, 예컨대, 음성 대조군 항체를 사용하여 수득된 배경 수준을 초과하는 임의의 검출가능한 수준으로 그의 동족 항원에 결합하지 않는다.
본원에 제공된 방법에 의해 단리된 미세환경 제한 ASTR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 미세환경 제한 항원 특이적 표적화를 발현하는 수집된 세포의 뉴클레오티드를 서열분석함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 상기 뉴클레오티드 서열 정보는, 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 미세환경 제한 생물학적 제제 키메라 항원 수용체 (MRB-CAR)를 제조하는 데 사용될 수 있다. 미세환경 제한 항원 특이적 표적화 영역은 CAR 구축물 발현 시스템으로 클로닝될 수 있고, 이는 그의 게놈 내에 CAR를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있고, 이어서, 재조합 렌티바이러스는 생리적 조건과 비교하여 종양 선택적 환경에서의 CAR 매개 종양 항원 발현 표적 세포 사멸에 대해 시험하기 위해 T 세포를 형질도입시키는 데 사용될 수 있다.
조건부 활성을 위한 조건
본원에 제공된 방법에서, 2개의 상이한 생리적 환경, 예컨대, 예를 들어, 이환된 미세환경에서의 조건 또는 조건들 및 비이환된 미세환경의 정상적인 생리적 조건을 모의하는 2개의 상이한 조건 세트하에서 하나 이상의 폴리펩티드, 예컨대, 예를 들어, 단일 쇄 항체의 활성을 스크리닝하거나, 또는 시험한다. 전형적으로, 조건은 시험관내에서 모의될 수 있거나, 또는 복제될 수 있는 조건이다. 조건 세트는 질환과 연관된 미세환경을 모의하는 하나 이상의 조건을 포함할 수 있다. 질환은 세포내 및 세포외 항상성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 이환된 미세환경은 종양 미세환경 또는 암 미세환경에서의 하나 이상의 조건을 모의할 수 있다. 전형적으로, 두 조건 세트하에서의 활성의 차이 또는 차이들이 분자의 조건부 활성을 초래할 수 있다. 따라서, 제2 조건 세트 (예컨대, 정상적인 또는 비이환된 환경에서의 모의 조건)와 비교하여 제1 조건 세트 (예컨대, 종양 미세환경에서의 모의 조건)하에서 더욱 큰 활성을 보이는 분자는 미세환경 제한성인 후보물질 분자로서 확인된다.
두 조건 세트는 예컨대, 본원에 기술되거나, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이, 두 생리적 환경에서 차이를 보이는 하나 이상의 파라미터마다 다르게 선택될 수 있고, 제한하는 것은 아니지만, 화학적 조건, 생물학적 조건, 또는 생리적 조건을 포함한다. 두 조건 세트 사이에서 달라질 수 있는 파라미터로는 압력, 온도, pH, 이온 강도, 삼투압, 오스몰 농도, 산화적 스트레스, 탁도, 광 (UV, 적외선, 가시광선 포함)에의 노출, 하나 이상의 용질, 예컨대, 전해질의 농도, 글루코스 농도, 히알루로난 농도, 락트산 또는 락테이트 농도, 알부민 농도, 아데노신 수준, R-2-히드록시글루타레이트 수준, 피루베이트 농도, 산소 농도, 및/또는 산화제, 환원제 또는 보조 인자의 존재를 포함할 수 있다. 보정액 중 전해질 및 완충제 시스템을 달리함으로써, 생리적 조건, 예컨대, pH, 완충제 용량, 이온 환경, 온도, 글루코스 농도, 및 이온 강도를 모의되는 생물학적 환경의 것으로 조정할 수 있다. 정상적인 생리적 환경을 모의하는 조건 세트는 이환된 미세환경, 예컨대, 종양 미세환경을 모의하는 조건 세트와 본원에 기술된 하나 이상의 조건에 의해 상이한 것이 선택될 수 있다.
예를 들어, 하기 논의되는 바와 같이, 산소 농도, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도, 락테이트 농도, 알부민 농도, 아데노신 수준, R-2-히드록시글루타레이트 수준, 및 피루베이트 농도를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 종양 미세환경의 다양한 파라미터가 비종양 미세환경과 비교하여 상이하다. 상기 파라미터 중 임의의 것은 비종양 또는 정상적인 환경에 존재하는 조건과 비교하여 종양 또는 암 환경에 존재하는 하나 이상의 조건을 모의하기 위해 시험관내에서 복제될 수 있다. 모의될 수 있는 정상적인 생리적 조건은 신체의 임의 위치, 예컨대, GI 관, 피부, 혈관구조, 혈액, 및 세포외 기질의 건강한 또는 비이환된 조직에서 발견되는 환경을 포함한다. 전형적으로, 본원의 검정법에서, 생리적 조건은 단백질의 활성을 사정하기 위해 사용되는 완충제를 선택함으로써 시험관내에서 모의될 수 있다. 예를 들어, 이환된 미세환경 (예컨대, 종양 미세환경) 및 비이환된 환경의 임의의 하나 이상의 조건은 검정법에서 활성을 사정하는 데 사용되는 검정용 완충제의 차이에 의해 모의될 수 있다. 그러므로, 미세환경 제한 폴리펩티드를 확인하기 위한 본원의 방법에서, 검정용 완충제의 성분 또는 성분들 또는 특징 또는 특징들은 제1 조건하에서 활성을 시험하는 제1 검정법에서 및 제2 조건하에서 활성을 시험하는 제2 검정법에서 상이하도록 변경되거나, 또는 그렇게 제조된다. 예를 들어, 본원에서 논의되는 바와 같이, 산소, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 히알루로난 농도), 락테이트 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 락테이트 농도), 알부민 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 알부민 농도), 아데노신 수준 (예컨대, 증가 또는 감소된 아데노신 수준), R-2-히드록시글루타레이트 수준 (예컨대, 증가 또는 감소된 R-2-히드록시글루타레이트 수준) 및 피루베이트 농도 (증가 또는 감소된 피루베이트 농도 포함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 종양 미세환경의 다양한 파라미터는 비종양 환경과 비교하여 상이하다. 더욱 구체적으로, 종양 미세환경 내의 조건으로는 비종양 미세환경과 비교하여, 더 낮은 pH, 더 높은 농도의 히알루로난, 더 높은 농도의 락테이트 및 피루베이트, 더 높은 농도의 알부민, 증가된 아데노신 수준, 증가된 R-2-히드록시글루타레이트 수준, 저산소, 더 낮은 농도의 글루코스, 및 약간 더 높은 온도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세환경 제한 ASTR은 실제로 정상 체온에서는 불활성이지만, 종양 미세환경의 더 높은 온도에서는 활성을 띤다. 추가의 또 다른 측면에서, 미세환경 제한 항체는 정상적인 산소를 공급받은 혈액에서는 더 작은 활성을 띠지만, 종양에 존재하는, 산소를 더 적게 공급받은 환경하에서는 더욱 큰 활성을 띤다. 추가의 또 다른 측면에서, 미세환경 제한 항체는 정상적인 생리적 pH 7.2-7.8에서는 더 작은 활성을 띠지만, 종양 미세환경에 존재하는 산성 pH 5.8-7.0, 또는 6.0-6.8하에서는 더욱 큰 활성을 띤다. 예를 들어, 미세환경 제한 항체는 pH 7.4에서보다 pH 6.7에서 더욱 큰 활성을 띤다. 또한, 조건부로 활성을 띠는 ASTR이 상이한 결합 친화도를 보이게 되는 조건으로서 본 발명에서 사용될 수 있는, 본 분야의 당업자에게 공지된 종양 미세환경 내의 다른 조건도 존재한다. 이러한 생체내 종양 조건을 모방하는 시험관내 검정 조건은 본원에서 시험관내 종양 대용물 검정 조건으로 지칭된다.
상기 조건 중 임의의 하나 이상의 것은 특정 검정용 완충제를 선택함으로써 시험관내에서 모의될 수 있다. 이환된 미세환경을 모의하는 검정용 완충제의 조성물은, 이환된 미세환경에서는 변경된 것으로 공지된, 또는 본원에 기술된 하나 이상의 조건을 제외하면, 정상 환경을 모의하는 검정용 완충제의 조성과 동일하도록 선택될 수 있다. 추가로, 2개의 상이한 조건 세트하에서 하나 이상의 폴리펩티드의 활성을 스크리닝하거나, 또는 확인할 때에는 일반적으로 검정법에서 달리하는 유일의 조건은 생체내 미세환경을 모의하는 완충제 조건에 관한 것이다. 검정법의 다른 조건, 예컨대, 시간, 온도 및 인큐베이션 조건은 두 조건 세트에 대하여 동일할 수 있다. 전형적으로, 이환된 미세환경을 모의하는 조건 및 정상적인 미세환경을 모의하는 조건 세트에서 동일한 기초 완충제가 사용되지만, 완충제 조성은 하나 이상의 파라미터, 예컨대, pH, 산소, 압력, 보조 인자의 존재, pH, 히알루로난 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 히알루로난 농도), 락테이트 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 락테이트 농도), 알부민 농도 (예컨대, 증가 또는 감소된 히알루로난 농도) 및/또는 피루베이트 농도 (증가 또는 감소된 피루베이트 농도 포함)에서 차이가 나도록 디자인될 수 있다. 이환된 미세환경을 모의하는 조건 및 정상적인 미세환경을 모의하는 조건에서, 당업자에게 공지된 임의의 기초 완충제가 사용될 수 있다.
미세환경 제한 세포를 생성하는 방법
본 개시내용은 미세환경 제한 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 본 개시내용의 미세환경 제한 CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 발현 벡터 (예컨대, 플라스미드 또는 레트로바이러스), 또는 RNA (예컨대, 시험관내에서 전사된 RNA)로 포유동물 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서 미세환경 제한적이다. 유전적 변형은 생체내, 시험관내, 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 세포는 면역 세포 (예컨대, T 림프구, T 헬퍼 세포, 또는 NK 세포), 줄기 세포, 전구 세포 등일 수 있다.
일부 경우에서, 유전적 변형은 생체외에서 수행된다. 예를 들어, T 림프구, 줄기 세포, T 헬퍼 세포, 또는 NK 세포는 개체로부터 수득되고; 개체로부터 수득된 세포는 본 개시내용의 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 표적 항원의 존재하에서 미세환경 제한가능한 것이다. 일부 경우에서, 유전적으로 변형된 세포는 생체외에서 활성화된다. 다른 경우에서, 유전적으로 변형된 세포는 개체 (예컨대 세포가 수득된 개체) 내로 도입되고; 유전적으로 변형된 세포는 생체내에서 활성화된다. 예를 들어, 하나 이상의 표적 항원이 개체의 세포 표면 상에 존재하는 경우, 항원이 투여될 필요는 없다. 유전적으로 변형된 세포는 개체의 세포 표면 상에 존재하는 항원과 접촉하고, 유전적으로 변형된 세포는 활성화된다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포가 T 림프구일 경우, 유전적으로 변형된 세포는 CAR의 결합 대상이 되는, 세포 표면 상의 하나 이상의 표적 항원을 발현하는 세포에 대하여 세포독성을 보일 수 있다.
종양 미세환경 감수성 CAR-T 표적 결합을 일시적으로 감소시키는 방법
본원에서는 혈관 및 조직 pH의 약리적 변형을 통해 종양 미세환경 감수성 CAR-T 표적 결합을 일시적으로 감소시키는 방법을 제공한다. CAR-T 세포에서 미세환경적으로 조절되는 scFv는, 종양 국소 환경 조건이 T 세포는 관여할 수 있게 하면서, 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 독성으로부터 추가 수준으로 보호한다. 일부 단일클론 항체 요법의 경우, 관심의 대상이 되지만, 입양 세포 요법은 그의 CAR-T 표적에 대하여 일시적으로 허용되는 국소 환경을 생성할 수 있다. 예를 들어, 국소 조직에서 활성화된 CAR-T 세포는 CAR 구축물에 존재한 세포질 도메인에 의존하여 국소 pH를 추가로 감소시킬 수 있다. 다른 경우에서, 시토카인 방출 증후군 및 입양 세포 요법과 연관된 다른 질병은 혈액의 비카보네이트 완충 능력을 상실시켜 락트산 산증을 유발할 수 있다. 정맥내 주입에 의해 투여된 입양 세포 요법은 일시적인 폐 죄임을 유발하는 것으로 확립되어 있다. 일부 세포 요법의 경우, 주입 속도는 용존 산소의 일정한 모니터링을 요한다 (문헌 [Fischer et al. Stem Cells Dev. 2009 Jun; 18(5): 683-691]). 폐 죄임 정도는 세포 크기, 활성화 상태, 세포 용량 및 주입 속도에 의존한다. 크루즈(Cruz) 등 (문헌 [Cytotherapy. 2010 Oct; 12(6): 743-749])은 300회 초과로 수행한 T 세포 주입으로부터 저용량 및 저속 주입이 폐 죄임을 감소시킬 수 있다는 불리한 관찰결과를 보고한 바 있다. 그러나, 특정의 고효능의 CAR-T 세포의 경우, 폐 내피 상에 심지어 낮은 수준으로 존재하는 표적, 예컨대, Her2 (문헌 [Morgan et al. Mol Ther . 2010 Apr; 18(4): 843-851)도 제어가 불가능한 즉각적인 독성을 유발할 수 있고, 주입 후 초기의 폐 내의 높은 CAR-T 세포 농도 및 사이 조직 내의 T 세포 표적의 존재에 기인하여 환자를 빠르게 악화시킨다. 표적 이외의 다른 조직, 예컨대, 담관에서의 T 세포 표적의 존재는 제어가 불가능한, 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 독성을 일으킬 수 있고 (문헌 [Lamers Mol Ther. 2013 Apr;21(4):904-12]) 및 다른 작용제, 예컨대, 스테로이드제에 앞서 심각한 기관 독성을 유발할 수 있거나, 세포 제거 에피토프가 사용될 수 있다. 정맥 및 동맥 혈장이 산증에 대하여 강력한 완충 능력을 가지지만, 호흡성 산증, 쇼크, 대사성 산증 및 허혈성 산증과 같은 병태가 입양 세포 요법으로 치료받은 암 환자에서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 미세환경적으로 조절되는 scFv의 그의 항원에 대한 친화도를 감소시키기 위해 특정 조건에서 혈관 pH를 일시적으로 증가시키는 방법을 제공한다. 혈액 pH의 0.4 U 변화가 특정 scFv의 친화도를 10배 초과만큼 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료적 pH 조절은 IV 또는 경구적 투여 경로를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도의 불활성화는 비카보네이트 사용으로 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 트리스-히드록실메틸 아미노메탄 (이는 또한 트로메타민, 트로메타몰, 및 THAM으로도 또한 공지), 및 카르비카르브( Carbicarb)™ (및 동몰량의 중탄산나트륨 및 탄산나트륨의 고장성 용액)는 혈액 pH를 증가시키기 위해 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 독성을 완화시키는 데 충분한 양으로 사용된다. 추가의 다른 실시양태에서, 소형 분자 양성자 펌프 억제제 또한 혈액 pH 및/또는 조직 pH를 증가시키기 위해 표적에 대한, 종양 외의 것에 미치는 독성을 완화시키는 데 충분한 양으로 사용된다. 양성자 펌프 억제제로는 에소메프라졸 (넥시움(Nexium)), 에소메프라졸 및 나프록센 (비모보(Vimovo)), 란소프라졸 (프레바시드(Prevacid)), 오메프라졸 (프릴로섹(Prilosec) 및 제그리드(Zegerid)), 및 라베프라졸 (아시펙스(Aciphex))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 양성자 펌프 억제제 투여는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년 동안 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에의 결합 친화도를 조정하기 위해 장기간 동안에 걸쳐 효과적으로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대힌 친화도는 또한 수송체 및 펌프의 전사, 번역, 막 발현, 및 안정성을 조절함으로써 혈액 pH 및/또는 조직 pH를 변경하여 조정될 수 있다. pH를 조정하는 상기 수송체 및 펌프의 예로는 양성자 펌프, 나트륨 양성자 교환 패밀리 (NHE)의 구성원, 비카보네이트 수송체 패밀리 (BCT), 및 모노카르복실레이트 수송체 패밀리를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 비카보네이트, THAM, 또는 카르비카르브™는 pH 조절 scFv를 발현하는 CAR-T 세포를 환자에 주입하기 이전에, 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 상기 치료법은 다르게는 CAR-T 세포 주입의 일시적인 폐 죄임과 연관된 즉각적인 세포독성을 완화시킬 것이다.
추가 실시양태
특정 실시양태에서, 본 개시내용을 위한 본원에 제공된 방법은 T 세포 및/또는 NK 세포에서 발현되는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 억제시키는 것을 포함한다. 본원에 제공된 방법은 예를 들어, 상기 방법을 위해 사용될 수 있는 miRNA 또는 shRNA를 발현하는 재조합 레트로바이러스를 제조할 수 있는 능력을 예시한다. 실제로, 본원에 제공된 방법은 상기 miRNA 또는 shRNA은 예를 들어, Ef1a 인트론을 비롯한, 인트론 내에서 코딩될 수 있다는 것을 예시한다. 이는 선행 교시의 단점을 극복하고, 입양 T 세포 요법에서 상기 재조합 레트로바이러스의 효과를 최대화시키기 위해 패키징 가능한　레트로바이러스 게놈 내에 포함될 수 있는 기능성 요소를 최대화시키는 방법의 본 교시를 이용한다.
일부 실시양태에서, 하기 표적 내인성 T 세포 발현 유전자 중 하나 이상의 것을 코딩하는 핵산에 결합하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 miRNA, 예시적인 실시양태에서, 2 내지 5개, 예를 들어, 4개 miRNA는 본원에 제공된 방법을 사용하여 재조합 레트로바이러스 게놈 내에 포함될 수 있고, T 세포 및/또는 NK 세포로 전달될 수 있다. 실제로, 본원에 제공된 바와 같이, 1, 2, 3, 또는 4개의 miRNA가 단일 인트론, 예컨대, EF1a 인트론에 전달될 수 있다. T 세포 상에 발현된 표적 내인성　유전자는 하기를 포함하며, 여기서, 괄호 안에는 비제한적으로, 상기 불활성화시 예상되는 이점이 기재되어 있다: PD-1 (불활성화 방지); CTLA4 (불활성화 방지); TCRa (안전성 - 자가면역 방지); TCRb (안전성 - 자가면역 방지); CD3Z (안전성　- 자가면역 방지); SOCS (불활성화 방지); SMAD2 (불활성화 방지); miR-155 (활성화 촉진); IFN 감마 (CRS 감소); cCBL (신호전달 연장); TRAIL2 (사멸 방지); PP2A (신호전달 연장); ABCG1 (콜레스테롤 제거를 제한함으로써 콜레스테롤 마이크로도메인 함량을 증가시킴).
특정 실시양태에서, 예상되는 유용성이 유사한 표적 유전자에 대한 miRNA는 조합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상보적인 유용성을 가지는 표적 유전자에 대한 miRNA는 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합은 CD3Z, PD1, SOCS1, 및/또는 IFN 감마를 포함할 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 CAR을 사용하는 다양한 치료 방법을 제공한다. T 림프구 또는 NK 세포에 존재할 때, 본 개시내용의 CAR은 표적 세포에 대한 세포독성을 매개할 수 있다. 본 개시내용의 CAR은 표적 세포 상에 존재하는 항원에 결합하여 CAR을 생산하도록 유전적으로 변형된 T 림프구 또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 사멸을 매개한다. CAR의 ASTR은 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원에 결합한다.
본 개시내용은 대상 CAR을 생산하도록 유전적으로 변형된 세포독성 면역 이펙터 세포 (예컨대, 세포독성 T 세포, 또는 NK 세포)를 접촉시킴으로써 T 림프구 또는 NK 세포가 표적 세포의 표면 상에 존재하는 항원을 인식하고, 표적 세포의 사멸을 매개하는 것을 포함하는, 표적 세포를 사멸시키거나, 또는 그의 성장을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 a. CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 대상체로부터 수득된 말초 혈액 세포 내로 도입하여 유전적으로 조작된 세포독성 세포를 제조하는 단계; 및 b. 유전적으로 조작된 세포독성 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 앓는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
치료에 적합한 대상체
다양한 대상체가 본원에 제공된 방법 및 조성물을 이용한 치료법에 적합하다. 적합한 대상체로는 임의의 개체, 예컨대, 질환 또는 장애을 앓거나, 질환 또는 장애 진단을 받았거나, 질환 또는 장애가 발병할 위험이 있거나, 질환 또는 장애를 앓은 적이 있고, 질환 또는 장애가 재발할 위험이 있거나, 질환 또는 장애에 대하여 작용제로 치료를 받았고, 상기 치료에 대해 반응하지는 못하였거나, 또는 질환 또는 장애에 대하여 작용제로 치료를 받았지만, 상기 치료에 대한 초기 반응 후 재발한 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
면역조절 방법을 이용한 치료에 적합한 대상체로는 자가면역 장애를 개체; 기관 또는 조직 이식 수혜자 등인 개체; 면역손상된 개체; 및 병원체로 감염된 개체를 포함한다.
하기 비제한적인 예는 전적으로 예시적인 실시양태의 예시로서 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 개시내용의 범주 및 정신을 제한하고자 하는 것은 아니다. 추가로, 본원에 개시되거나, 또는 본원에서 청구되는 임의의 발명은 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 특징들의 모든 변형, 조합, 및 치환을 포함한다. 임의의 하나 이상의 특징들은, 비록 구체적인 배제가 본원에 명백하게 기술되지 않았더라도, 본 특허청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있다. 방법에서 사용하기 위한 반응물에 관한 개시내용은 본원에 개시된 구체적인 방법, 또는 당업계의 숙련가가 달리 이해하지 않는 한, 당업계에 공지된 다른 방법에 따라 상기 반응물의 사용을 포함하는 방법과 같은 것을 의미하는 것으로 (및 그를 뒷받침하는 것으로) 의도된다는 것 또한 이해하여야 한다. 추가로, 명세서 및/또는 특허청구범위가 방법을 개시하는 경우, 본원에 개시된 반응물 중 임의의 하나 이상의 것은 당업계의 숙련가가 달리 이해하지 않는 한, 본 방법에서 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1. 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물에 특이적으로 반응하는 리보스위치 생성.
본 실시에는 구아노신 및 데옥시구아노신에 결합하는 천연 구조적 리보스위치에 기반하여 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 리보스위치는 리간드 뉴클레오시드 유사체에 특이적으로 결합하는 압타머 선별을 위한 편향 라이브러리 개발을 위한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 앞서, 등온 적정 열량 측정법은 상기 천연 리보스위치가 그의 천연 리간드에 결합한다는 것을 밝히는 데 사용되어 왔다. 추가 시험 결과, 데옥시구아노신 스위치 또한 뉴클레오시드 유사체 아시클로버 및 펜시클로버와 약하게 상호작용하는 것으로 나타났고, 이로써, 상기 서열을 재디자인함으로써 새로운 라이브러리를 얻었다. 리보스위치의 단일-가닥 영역은 돌연변이화에 대해 표적화되었고, 아시클로버 또는 펜시클로버에 특이적으로 반응하는 변이체 서열이 선별되었다.
물질
선별 성분 구아닌, 구아노신, 데옥시구아노신, 아시클로버, 및 펜시클로버는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 주문받았다. 아시클로버는 초기 표적이었던 반면, 펜시클로버는 후반 라운드에서 사용된 특후 관심의 대상이 되는 피분석물이었고, 구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신은 카운터-표적으로서 사용되었다. 구획화 매체로서 사용되는 산화그래핀 (GrO)은 옹스토론 매테리얼즈(Angstron Materials: 미국 오하이오주 데이턴)로부터 구입하였다. HEPES (pH 7.3) 및 MgCl2는 아메르스코 LLC.(Amersco LLC.: 미국 오하이오주 솔론)로부터 구입하였다. KCl은 테크노바(Teknova: 미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하였다. 선별 완충제는 5X (50 mM HEPES, 100 mM KCl, 20 mM MgCl2, pH 7.3로서 1X)로 제조하였다. 표적, 카운터-표적, 및 올리고는 예비 분석 및 압타머 스크리닝을 위해 뉴클레아제를 함유하지 않는 물 중에서 재구성하였다. 모든 표적에 대하여 분취물을 제조하고, 보관 수명을 최대화시키기 위해 -20℃에서 보관하였다.
압타머 라이브러리 생성
IBA 게엠베하(IBA GmbH: 독일 괴팅겐)에 의해 도 14의 서열의 역 상보체로서 초기 압타머 라이브러리 주형을 합성하였다. 도 14에서, 박스 내의 뉴클레오티드는 공지된 서열 중의 단일-가닥이고, 여기서, 합성 동안에 도입된 "돌연변이"를 통해 원래 표적의 유사체에 더욱 잘 결합할 수 있다. 실선으로 윤곽 표시된 박스 내의 뉴클레오티드의 경우, 치환 돌연변이가 허용되었고; 파선으로 윤곽 표시된 박스 내의 뉴클레오티드의 경우, 치환 돌연변이 뿐만 아니라, 삽입 또는 결실도 허용되었다. 프라이머는 IDT (미국 아이오와주 코럴빌)에 의해 단일-가닥 DNA로서 합성되었다. 티타늄 Taq DNA 폴리머라제 (클론테크(Clontech); 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용한 프라이머 연장을 위해 T7 프라이머 (서열 번호: 240)를 라이브러리 주형 서열과 조합하였다. 앰플리스크라이브 T7 하이 일드 트랜스크립션 키트(Ampliscribe T7 High Yield Transcription Kit) (에피센트르(Epicentre; 미국 위스콘신주 매디슨))를 사용하여 프라이머 연장된 물질을 전사시킨 후, 이어서, 선별에 사용하기 전, 8 M 우레아를 이용하여 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 상에서 정제하였다. 선별 동안, 역방향 프라이머 (서열 번호: 241)를 사용하여 슈퍼스크립트 IV 리버스 트랜스크립타제(SuperScript IV Reverse Transcriptase) (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 라이브러리를 역전사시키고, 티타늄 Taq DNA 폴리머라제 (클론테크; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 증폭시켰다. 서열 번호: 248을 가지는 압타머는 -3 내지 -1의 J2-3 루프 변이 및 ~2.25x1010의 다양도를 가졌다. 서열 번호: 250을 가지는 압타머는 0 (천연) 내지 +5의 J2-3 루프 변이 및 ~9.38x1014의 다양도를 가졌다. ~9.38x1013인 전체 다양도하에, 조합된 라이브러리 풀 중에서 등몰의 다양도를 얻기 위해 두 올리고뉴클레오티드 (서열 번호: 249 및 250)를 1:4,160의 비로 혼합하였다.
라이브러리 스크리닝
산화그래핀에게 단일-가닥 핵산에 대한 고친화성을 부여하는 π-π 상호작용을 이용하면서 (문헌 [Zeng et al., 2015]), 산화그래핀-지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화 (GO-SELEX) 접근법 (도 15) (문헌 [Park et al., 2012])을 사용하여 라이브러리 스크리닝을 수행하였다. 본 목적은 1X 선별 완충제와, 또는 카운터-표적 (구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신)와는 상호작용을 하지 않지만, 양성 표적 아시클로버에는 결합한 서열을 선별하고자 하는 것이었다.
매 라운드마다, 제공된 양의 라이브러리를 먼저 1X 선별 완충제 중에서 리폴딩시켰다 (90℃에서 5분 변성, 4℃에서 5분, 이어서, 실온). 이어서, 카운터-표적을 리폴딩된 라이브러리에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 단 이는 라운드 1 및 2에서는 배제되었는데, 여기서는 라이브러리를 GrO 상에 로딩시키는 것을 돕기 위해 단기가 동안 (< 1분) 카운터-표적을 포함시켰다. 라이브러리가 카운터-표적 및 완충제 성분과 상호작용할 수 있게 허용한 후, 비결합 라이브러리는 37℃에서의 10분 동안의 인큐베이션 기간에 걸쳐 GrO (질량은 라운드 출발시 라이브러리 질량의 100배와 같다) 상에 로딩시켰다. 이어서, 용액을 7,000 x g로 원심분리하여 GrO를 침전시켰다. 카운터-표적에 및/또는 완충제에 결합된 서열을 함유하는 상청액은 제거하였다. 이어서, 침전물을 200 ㎕ 1X 선별 완충제로 2회에 걸쳐 세척하고, 매회 세척 후에는 7,000 x g로 원심분리하고, 상청액은 제거하였다. 이어서, 양성 표적 함유 용액을 첨가하고, 본질적으로, 표적인 라이브러리 결합에 대하여 산화그래핀과 경쟁할 수 있도록 허용하면서, 하기 표 1에 명시된 조건하에 37℃에서 최대 60분 동안 라이브러리가 GrO로부터 용리될 수 있게 하였다. 표적에 더욱 강력하게 결합한 서열은 산화그래핀으로부터 탈착될 것이며, 인큐베이션 종료시 표적에 결합된 상태 그대로 남아있게 될 것이다. 최종 원심분리 단계를 통해 상청액에 위치하는 유리 물질을 산화그래핀에 결합된 상태 그대로 남아 있는 비반응성 라이브러리로부터 분리시켰다.
양성 선별 후, 이어서, 8 M 우레아를 사용하여 10% 변성 PAGE를 이용하여 정제된 회수된 RNA를 분광광도계 판독을 사용하여 정량화하고 (표 1), 슈퍼스크립트 IV를 이용하여 역전사시키고, 티타늄 Taq DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 증폭 생성물을 다음 라운드의 선별을 위해 RNA로 전사시켰다.
선별 과정 동안 3 단계의 엄격도를 실행하였다 (표 1). 처음 2회의 선별 라운드에서는 GrO 상에의 라이브러리 로딩을 최대화시키기 위해 카운터-표적에 대한 스크리닝을 포함시키지 않았다. 추가로, 라이브러리 회수를 최대화시키기 위해 양성 인큐베이션에서 다량의 아시클로버를 과량으로 사용하였고, 따라서, 이는 저엄격도로 지칭된다. 라이브러리 회수 달성 후, 중간 엄격도 조건으로서 카운터-표적 인큐베이션을 도입하였다. 또한, 표적에의 경쟁에 대하여 라이브러리 경쟁을 증가시키기 위해 상기 3회의 라운드 동안 아시클로버 대 라이브러리의 비를 감소시켰다. 일단 10% 초과의 회수율을 달성하고 나면, 최종 라운드의 고엄격도 선별을 실행하였다. 양성 인큐베이션 시간이 단축되는 동안, 카운터-표적/라이브러리 비는 높은 상태 그대로 유지되어 있고, 양성 표적/라이브러리 비는 1:1이 되었고, 이로써 더욱 신속하게 결합 서열을 선별할 수 있었다. 일단 라이브러리 회수율이 2회 초과의 라운드의 고엄격도 조건 이후에도 10% 초과 그대로 유지된 것으로 나타났으면, 동시 사정을 수행하였다.
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2회의 동시 사정을 위해, 사정하고자 하는 라이브러리를 상기와 같이 제조 및 리폴딩을 위해 4개의 동량으로 나누었다 (도 16). 각 조건마다, 50 pmole의 라이브러리를 1X 선별 완충제와 조합하고, 리폴딩시킨 후 (90℃에서 5분 동안, 4℃에서 5분 동안), 이어서, 37℃에서 30분 동안 1X 선별 완충제 중 200 ㎕의 10 μM 조합된 카운터-표적과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기 샘플을, 샘플 중 라이브러리의 질량의 100배인 양의 산화그래핀 상에 로딩시키고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 상기와 같이 200 ㎕의 1X 선별 완충제로 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 로딩된 산화그래핀 샘플을 1X 선별 완충제 중 200 ㎕의 적절한 사정 조건 (1X 선별 완충제만 오직, 10 μM 풀링된 카운터-표적, 1 μM 펜시클로버, 제1 동시 사정을 위해 1 μM 아시클로버, 또는 제2 동시 사정을 위해 0.5 μM 아시클로버; 표 1에서 상기 조건은 각각 (-); (X); (P); (+); 및 (+)로 제시되어 있다)과 함께 동시에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종 원심분리 단계를 통해 탈착된 반응성 라이브러리를 비반응성 산화그래핀 결합 라이브러리로부터 분리시켰다. 분광광도 판독을 사용하여 반응성 라이브러리를 정량화하고 (표 1), 8 M 우레아를 사용하여 10% 변성 PAGE를 이용하여 확인하고, 제2 동시 사정을 위해 준비하였다. 본 후속 사정에서는 양성 샘플의 프리-로딩 인큐베이션을 위해 카운터-표적을 계속 사용하였지만, 각각의 다른 샘플의 프리-인큐베이션을 위해서는 양성 표적 아시클로버를 사용하였다. 이는 주어진 샘플 중의 교차 반응성 서열 (즉, 양성 샘플 중 카운터-표적에 대하여 반응성, 음성, 카운터-표적, 또는 펜시클로버 샘플 중 아시클로버에 대하여 반응성)의 출현을 최소화시키기 위해 수행하였다. 제2 동시 사정으로부터 회수된 물질을 분광광도 판독을 사용하여 정량화하고 (표 1), 8 M 우레아를 사용하여 10% 변성 PAGE를 이용하여 확인하고, 이중 가닥 DNA 생성을 위해 역전사 및 PCR함으로써 서열분석하기 위해 준비하였다.
서열분석
초기 라이브러리에 대해 10회 초과 라운드의 GrO 기반 선별 및 동시 사정을 수행하였다 (표 1). GO-SELEX 프로세스는 다회 라운드의 선별에 걸쳐 주어진 관심의 대상이 되는 표적에 결합하는 서열은 농축시키고, 비표적 화합물 또는 완충제 성분에 결합하는 서열은 제거하도록 디자인된 것이다. 그 결과, 서열분석되는 집단은 다중 카피의 잠재적 압타머 후보물질을 함유할 것으로 예상된다.
동시 사정 후, 일루미나(Illumina) MiSeq 시스템 (미국 캘리포니아주 샌디에고)을 실행하여 단일 단부 리드 기술을 사용하여 압타머 라이브러리의 서열분석을 수행하였다. 스크리닝 프로세스에 기인하여 오류 및 편차를 도입할 수 있는 종래 SELEX의 요건인 다회에 걸친 스크리닝 라운드는 심층 서열분석 및 후속 데이터 분석을 통해 감소된다 (문헌 [Schutze et al., 2011]). 5개의 샘플을 서열분석하였고: 아시클로버에 반응하는 최종 세대 라이브러리, 카운터-표적에 반응하는 최종 세대 라이브러리, 1X 선별 완충제에 반응하는 최종 세대 라이브러리 (음성 condition), 아시클로버에 반응하는 끝에서 두 번째 세대 라이브러리, 및 추가의 관심 표적인 펜시클로버에 반응하는 최종 세대 라이브러리. 압타머 후보물질 확인을 위해 상기 데이터 세트로부터 서열 패밀리를 95%의 상동성 (돌연변이, 결실, 및 삽입을 고려한 서열 유사성)으로 구축하였다. 아시클로버에 반응하는 라이브러리로부터 1,711,535개의 원시 서열 (124,600개의 특이 서열) 및 펜시클로버에 반응하는 라이브러리로부터 2,074,832개의 원시 서열 (110,149개의 특이 서열)이 존재하였다.
압타머 후보물질 선별
서열 패밀리 구축은 주로 서열 유사성에 초점을 맞추었다. 이는 양성 표적 집단 중의 서열 빈도가 고려되기는 하지만, 유사한 서열 사이의 변이 정도가 더욱 크게 강조되었고, 여기서, 95%의 상동성이 최소 요건이라는 것을 의미한다 (전체 서열에 걸쳐 100% 매칭되는 것이 패밀리로 합류시키는 데 반드시 필요한 것은 아니며, 최대 2개의 염기가 미스매칭, 삽입, 또는 결실될 수 있다). 그러므로, 구성원 수가 가장 많은 패밀리가 압타머 후보물질로서 높은 순위를 차지할 것으로 예상될 것이다. 패밀리 구축 후, 주어진 집단 중 패밀리의 상대적인 존재비에 대하여 고려할 수 있고 - 음성 및 카운터-표적 집단 중 빈번하게 존재하는 패밀리는 완충제 또는 카운터-표적 성분에의 결합에서 어느 정도의 비특이적인 상호작용을 보이는 바, 더 약한 후보물질인 것으로 간주된다. 추가로, 농축 비율이 집단 중 후보물질을 제외한 나머지 부분 대비 후보물질의 결합 친화도와 연관이 있는 바, 높은 비율의 농축 (즉, 최종 양성 집단과 끝에서 두 번째 양성 집단 사이의 큰 비율)을 보인 패밀리는 그의 후보 자격을 개선시킨다 (문헌 [Levay et al., 2015]; [Wang et al., 2014]). 상기 조건하에서, 수개의 후보물질 패밀리는 아시클로버 (표 2) 및 펜시클로버에 결합하는 강력한 후보물질인 것으로 보였다.
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양성 표적 아시클로버를 통해 582-1 (서열 번호: 108), 769-1 (서열 번호: 147), 795-1 (서열 번호: 164), 935-1 (서열 번호: 183), 946-1 (서열 번호: 198), 961-1 (서열 번호: 220), 및 996-1 (서열 번호: 221))에 상응하는 7개의 강력한 후보물질 (서열 번호: 87-93; 줄기 영역을 포함하는 RNA 서열) (각각 F1A로 지칭 (도 17)이 생성되었다. 상기 서열이 각 패밀리 중에서 가장 일반적인 서열이었다 (각 패밀리의 모든 구성원의 DNA 서열은 582 (서열 번호: 108-146); 769 (서열 번호: 147-163); 795 (서열 번호: 164-182); 935 (서열 번호: 183-197); 946 (서열 번호: 198-219); 961 (서열 번호: 220); 및 996 (서열 번호: 221)이다). 컨센서스 서열은 각 패밀리에 대한 각 뉴클레오티드 위치에서의 모든 가능한 치환 또는 갭을 보여준다 (서열 번호: 222-226). 본 목적은 데옥시구아노신에 결합하는 것으로 공지된 RNA에 기초하여 라이브러리로부터 압타머를 확인하고자 하는 것이기 때문에, 강력한 후보물질은 카운터-표적 집단에는 최소로 존재하여야 했다. 후보물질 F1A-795, F1A-935, 및 F1A-946은 카운터-표적 집단에서 검출되지 않았는 바, 이는 상기 기준을 매우 잘 충족시키는 것이었다. F1A-996 및 F1A-961은 비록 카운터-표적 집단에서 최대로도 작은 정도로만 나타남에도 불구하고, 상기와 관련해서는 그 다음으로 가장 우수한 후보물질인 것으로 간주된다. 추가로, 후보물질은, 상기 서열이 아시클로버의 영향 없이도 GrO로부터 탈착되었고, 위 양성을 나타낼 수 있는 바, 음성 집단에서는 최소로 출현하여야 한다. F1A-935 및 F1A-946은 음성 집단에서는 발견되지 않았는 바, 이는 상기 기준하에서도 또한 이상적으로 우수한 성능을 보였다. 후보물질 F1A-769는 음성 집단에서 최소로 검출되었고, 후보물질 F1A-961, F1A-795 및 F1A-996은 조금 덜 우수한 성능을 보였다. 농축 비율은 고려되어야 하는 마지막 조건이었고, F1A-935, F1A-946, 및 F1A-769는 적절한 성능을 보였다. 후보물질 F1A-582는 비록 다른 기준하에서는 우수한 성능을 보이지는 않았지만, 가장 큰 농축 비율을 보였기 때문에 포함시켰다. 남은 후보물질은 상기 4개와 비교하였을 때 우수한 성능을 보이지는 않았지만, 허용되는 특징들을 보였다.
추가의 표적 펜시클로버를 통해 7개의 강력한 후보물질 (서열 번호: 94-100) (각각 F1P로 지칭 (도 18))이 생성되었다. 상기와 같이, 본 목적은 데옥시구아노신에 결합하는 것으로 공지된 RNA에 기초하여, 10 라운드 이후 아시클로버(acyclovir) (아시클로버(acyclovir))에의 결합에 대하여 농축된 라이브러리로부터 분기되는 압타머를 라이브러리로부터 확인하고자 하는 것이었다. 강력한 후보물질은 교차 반응성을 최소화시키기 위해 아시클로버 및 카운터-표적 집단, 둘 모두에 최소로 존재하여야 했다. 후보물질 F1P-923은 제1 기준을 충족시켰고, 후보물질 F1P-710은 제2 기준을 충족시켰고, 후보물질 F1P-584는 어느 정도까지는 상기 두 기준 모두를 충족시켰다. 후보물질 F1P-584 또한 음성 조건에 비하여 펜시클로버에 대해 중간 정도의 호의성을 보였을 뿐만 아니라, 아시클로버에 대한 이전 세대의 반응성 대비 중간 정도의 농축을 나타내었다. 남은 후보물질은 아시클로버에 비하여 펜시클로버에 대해 최소의 호의성, 또는 카운터-표적에 비하여 펜시클로버에 대해 최소의 호의성을 보였다 (각각 F1P-837 및 F1P-932; F1P-991 및 F1P-718). 이들 4개의 후보물질은 음성 조건에 비하여 펜시클로버에 대해 약간의 호의성을 보였고, 비록 상기 기준은 후보물질이 그의 유사체에 비하여 펜시클로버에 대해 선택성을 보이지 않는다면 유의적이지는 않지만, 위 양성의 기회를 최소화시킨다. 농축 비율은 고려되어야 하는 마지막 조건이었고, F1P-923, F1P-932, 및 F1P-584는 적절한 성능을 보였다.
선별된 압타머에 대한 정성적 PAGE 사정을 수행하였다. 개별적으로 합성되고, 전사된 압타머에 대해 생리적 Mg++ (0.5 mM)하에 산화그래핀 (GrO) 상에서 선별을 수행하고, 아시클로버 (+) 또는 카운터-표적 (x) 이용하여 용리시켰다. 각 샘플에 대해 특이적으로 용리된 압타머 분획에 대해 분석을 위해 PAGE를 수행하였다.
100 pmole의 각 압타머 후보물질 (1 래인당 1회 시험마다)을1X 변형된 선별 완충제 (50 mM HEPES, 100 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, pH 7.3) 중에 재현탁시키고, (90℃에서 5 min 동안, 이어서, 4℃에서 5 min 동안) 재폴딩시킨 후, 이어서, 37℃에서 30분 동안 (각각) 200 pmole의 풀링된 카운터-표적 또는 표적과 함께 인큐베이션시켰다. 최종 라이브러리 농도는 0.5 μM이었고, 표적/카운터-표적 농도는 1 μM이었다 (인큐베이션 부피는 200 ㎕이었다).
표적/카운터-표적 인큐베이션 후, 250 ㎍의 GrO (옹스토론 매테리얼즈: 미국 오하이오주 데이턴)를 첨가하여 비결합 후보물질을 흡착시켰다 (37℃에서 10분 인큐베이션).
샘플을 7,000 x g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 횟수하고, 40 mM EDTA와 함께 2X 포름아미드를 사용하여 변성시키고, 8 M 우레아를 이용하여 10% 변성 PAGE (공급업체: 아메리칸 바이오아날리티컬(American Bioanalytical); 카탈로그 번호 AB13021-01000. AB13022-01000) 상에서 전개시켰다. 전개용 완충제는 1X TBE였다 (공급업체: 암레스코(Amresco)/VWR; 카탈로그 번호 0658-20L, DI 수를 사용하여 희석된 것). DNA 래더는 20/100 DNA 래더 (IDT)였다. 겔을 겔 스타(Gel Star) (론자, 50535)로 염색하고, 청색광 투과조명기 상에서 영상화하였다.
후보물질 F1A-769, F1A-795, F1A-946, 및 F1A-996은 본 정성적 PAGE 사정에서 선택적 양성 반응을 보이는 것으로 나타났다 (아시클로버 표적의 경우, 압타머는 Gro로부터 잘 용리되었고, 카운터-표적의 경우, 비교적 더 낮은 수준으로 또는 최소로 용리되었다).
결론
12회 라운드의 반복된 스크리닝 및 동시 사정 이후에 아시클로버에 대한 강력한 후보물질이 확인되었고; 2회 라운드의 스크리닝 및 동시 사정 이후에 펜시클로버에 대한 적절한 후보물질이 확인되었다.
실시예 2: 조건부 scFv의 단리
잠재적 스플라이스 부위 취약부를 제거하고, 중복 올리고 합성법에 의해 종양 항원 특이적 scFv를 합성하고, 아시클로버 반응성 요소 및 영장류 CD3ζ 프로모터를 함유하는 CAR 셔틀 구축물로 클로닝한다. 초기 프로토타입으로서, CD8-알파 신호 펩티드, 스토크, 및 막횡단 도메인을 포함하는 EPCAM 또는 ERBB2scFv의 항-ECD를 사용한다. 미국 특허 번호 8,709,755 및 PCT 공개 번호 WO/2016/033331A1에 기술된 방법을 사용하여 또는 허용 및 비허용 조건하에서 인간 파지 라이브러리로부터의 직접적인 선별에 의해 고형 종양 미세환경 제한 CAR 생성물을 생성한다. 간략하면, 비오티닐화된 인간 IgG에 결합된 스트렙트아비딘 자기 비드 (써모피셔(ThermoFisher: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 이용하여 제거한 후, 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs: 미국 뉴욕주 셜리)로부터의 인간 VH x VL 라이브러리를 하기 종양 허용 조건하에서 패닝한다: 100 ㎍/ml 히알루로난, 100 kDa 분획 (라이프코어 바이오메디컬(Lifecore Biomedical: 미국 미네소타주 채스카)), 20 mg/ml 재조합 HSA (사이젠(Cyagen: 미국 캘리포니아주 산타 클라라)), 25 mM 중탄산나트륨 완충제 중 200 ng/ml 재조합 인간 VEGF제, 2 μM 아데노신, 10 mM 락트산 나트륨 pH 6.7. 37℃에서 허용 조건하에서 접합된 비드의 EPCAM 및 ERBB2의 비오티닐화된 표적 수용체 ECD에의 결합을 수행한 후, 허용 조건하에서 연속 세척한다. 생리적 조건 (1 ㎍/ml 히알루로난, 20 mg/ml HSA, 25 mM 비카보네이트, 1 mM 락트산 나트륨 pH 7.2)을 이용하여 파지를 방출시킨 후, 산성 용리를 이용하여 견고한 변이체를 용리시키고, 1 M 트리스로 신속히 중화시킨다. 파지를 확장시키고, 긴 리드 서열분석 (팩바이오(PacBio: 미국 캘리포니아주 멘로 파크))을 사용하여 VH x VL 쇄의 심층 서열 분석을 위해 게놈 DNA를 나눈다. 농축을 위해 패닝을 반복할 수 있다. 표적에 대한 농축에 비하여 파지 배양 프로세스 동안 리드의 차별적 증폭을 보이는 VH x VL 서열은 추가 분석을 위해 배제시킨다. 생리적 조건과 비교하여 종양 선택적 환경에서의 CAR 매개 종양 항원 발현 표적 세포 사멸을 시험하기 위해, CAR 구축물 발현 시스템으로의 클로닝, 렌티바이러스의 생성, 및 T 세포로의 형질도입에 의해 추가로 특징규명하기 위하여 종양 허용 조건하에서는 농축되지만, 생리적 조건하에서 방출되는, 표적에 대하여 선택적으로 결합하는 파지를 선택한다.
실시예 3: 미세환경 제한 scFv를 사용한 MRB -CAR의 생성
출원 WO/2016/033331A1에 기술된 바와 같이, 종양 미세환경에 대하여 선택성이 낮은 VH 및 VL 서열을 진화시킴으로써 제조된 미세환경 제한 ASTR을 수득하였다. 미세환경 제한 단일 쇄 항체의 중쇄 및 경쇄를 다른 CAR 도메인과 함께 렌티바이러스 발현 벡터 내로 도입시켜 MRB-CAR을 생성함으로써, 정상 조직과 비교하여 종양 환경의 감소된 pH하에서 증가된 활성을 보이는, 두 종양 항원, Axl 또는 Ror2 중 어느 하나에의 결합을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) (상기 미세환경 제한 생물학적 제제는 본원에서 종종 (MRB-CAR)로 지칭된다)를 제조하였다. 상기 CAR은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단으로 모듈의 다양한 조합을 포함하였고, 이는 CD8 신호 펩티드 (P1) (서열 번호: 74); 미세환경 제한 항-Ror2 및 항-Axl VH 및 VL 조합; CD8 (서열 번호: 75) 또는 CD28 (서열 번호: 76)로부터의 스토크 및 막횡단 도메인 (P5); CD 137 (서열 번호: 1) 또는 ICΔ로부터의 공동자극성 도메인 (서열 번호: 3) (P6); CD3Z로부터의 활성화 도메인 (서열 번호: 13) (P7); 2A-1 리보솜 스킵 서열 (서열 번호: 77) (P8); 및 예시적인 eTAG (서열 번호: 78) (P9)를 포함한다.
전체 T 세포를, 후보물질 CAR을 발현하는 재조합 렌티바이러스 입자로 형질도입시키고, FACS를 사용하여 eTag를 발현하는 세포의 비율(%)을 측정함으로써 형질감염된 세포의 비율(%)을 측정하였다. 전체 T 세포는, 후보물질 CAR을 코딩하는 재조합 렌티바이러스 입자로 성공적으로 형질도입되었고, pH 7.4 대비 pH 6.7에서 상기 형질도입된 T 세포 검정법에서 조건부 활성을 나타내었다.
Axl 또는 Ror2 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포에 대한 후보물질 CAR의 세포독성 활성을 pH 7.4 (생리적 pH) 또는 pH 6.7 (pH 대용물 종양 검정 조건)에서 분석하였다. 다수의 후보물질 CAR은 표적 세포를 용해시키는 데 있어서 pH 7.4보다 pH 6.7에서 더욱 효과적이었다.
실시예 4. 리간드- 유도가능한 리보스위치의 구축
데옥시구아노신 리보스위치 압타머 및 구아닌 리보스위치 압타머 (문헌 [Pikovskaya, 2014]; [Kim, 2007]) 또는 다른 퓨린 리보스위치 압타머를 올리고뉴클레오티드와 같이 합성한다. 한 예에서, 메조플라스마 플로럼으로부터의 데옥시구아노신 IA 리보스위치 (도 6에서 굵은 밑줄체로 표시; 도 7)를 아시클로버 반응성 리보스위치를 생성하기 위한 진화를 위해 선택한다. 또 다른 예에서, 바실러스 섭틸리스로부터의 구아닌 xpt 리보스위치 (도 10에서 굵은 밑줄체로 표시; 도 11)를 아시클로버 반응성 리보스위치를 생성하기 위한 진화를 위해 선택한다. 각각의 상기 두 예에서, P2, P3, J1-2, 및 J2-3 세그먼트 중 표적화된 서열 위치에 대안적 뉴클레오티드를 포함하는 무작위 RNA 라이브러리를 생성한다 (도 7 및 11). 각 세그먼트는 각각의 표적화된 서열 위치에서 3개의 대안적 핵산을 허용하거나, 또는 대안적으로, 도 8a-8b 및 9 (M. 플로럼 IA) 및 도 12a-12b 및 13 (B. 섭틸리스 xpt)에 명시된 바와 같이, 포화 돌연변이유발을 위해 각각의 표적화된 서열 위치에서 +1 부위에 4개의 뉴클레오티드로 이루어진 염기 결실 및 삽입을 허용한다. 프라이머 연장 및 반응물을 제조 후, RNA 전사를 수행한다. 생성된 RNA 라이브러리를 구아닌, 구아노신, 및 데옥시구아노신의 존재하에 산화그래핀 상에서 음성 선별을 수행한 후, 아시클로버 또는 펜시클로버를 이용하여 양성 선별을 수행한다. 음성 및 양성 선별 프로세스 동안, 인간 세포 생리적 마그네슘 수준 (0.5 mM 내지 1.2 mM)을 사용하여 온도는 37℃로 유지시킨다. 적어도 8회에 걸친 연속 라운드의 선별 동안, 회수된 압타머를 역전사시키고, PCR 증폭 후, 전사시킨 후, 후속하여 스크리닝시킨다. 평행 접근법에서, 압타머를 40℃에서 추가의 음성 스크린을 이용하여 스크리닝한다. 생성된 양성 풀을 넥스트겐(NextGen) 서열분석 및 분석에 의해 조사한다. 개별 압타머를 합성하고, 인간 세포 생리적 마그네슘 수준하에 35-40℃에서 등온 적정 열량 측정법에 의해 친화도에 대하여 조사한다. 양성 아시클로버 및 펜시클로버 특이적 압타머에 대하여 선별한 후, 압타머를 해머헤드 및 피스톨 리보자임인 리보자임과 통합시킨다. 양성 아시클로버 선택적 압타머를 피스톨 리보자임과 조합하여 아시클로버 조절 리보자임을 확인한다 (문헌 [Harris KA RNA. 2015 Nov;21(11):1852-8. doi: 10.1261/rna]). 아시클로버의 존재 및 펜시클로버의 부재하에서 변이체에 대해 PAGE 정제에 기반한 겔 이동을 수행한다. 추가로, 아시클로구아노신 선택적 리보스위치는 루프 중, CAR/IL-7 구축물 상류의 스플라이스 억셉터에 대하여 3' 방향으로 바로 옆에 배치된다. 아시클로버의 부재하에서, 스플라이스 부위 위치는 리보스위치 복합체에서 결합되지만, 아시클로버의 존재하에서는, 접근가능하게 되고, 이로써, 기능성 CAR 전사체가 생성된다.
실시예 5. 생체내 증식 도메인의 구축
T 세포 림프아구성 백혈병으로부터의 구성적으로 활성을 띠는 IL7 수용체 (IL7R) 막횡단 돌연변이체 시리즈 (243 InsPPCL (서열 번호: 82); 246 InsKCH (서열 번호: 101); 241 InsFSCGP (서열 번호: 102); 244 InsCHL (서열 번호: 103); 및 244 InsPPVCSVT (서열 번호: 104); 이들 모두 문헌 [Shochat et al., 2011, J. Exp. Med. Vol. 208 No. 5 901-908]로부터의 것)를 중복 올리고 뉴클레오티드 합성법 (DNA2.0, 미국 캘리포니아주 뉴어크)에 의해 합성한다. 합성된, 구성적으로 활성을 띠는 IL7R 막횡단 돌연변이체를, CD8A 스토크 (서열 번호: 79) 및 리더 펩티드 (서열 번호: 74)를 포함하는 항-CD19 CD3ζ 발현 카세트가 그 뒤로 이어지는 2A 리보솜 스킵 서열 바로 뒤의 구성적으로 발현하는 렌티바이러스 벡터 골격 내로 삽입한다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여, HEK293 패키징 세포를 IL7R 막횡단 돌연변이체 렌티바이러스 벡터 및 렌티바이러스 패키징 구축물로 형질감염시키고, 성장시키고, 바이러스 상청액을 수거한다. CD3/CD28 자극받은 T 세포를 바이러스 상청액으로 형질도입시키고, IL2 결핍 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM(CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM), 또는 X-비보 15 배지 중에서 4주 동안 성장시키고, 동일 기증자로부터의 냉동된 PBMC를 매주 보충해 주었다. IL7R 변이체를 발현하는 생성된 확장된 형질도입된 T 세포를 FACS 분류에 의해 클로닝하고, RT-PCR 생성물을 서열분석하여 IL7R 구축물의 서열을 확인한다. 조건부로 활성을 띠는 CAR을 생성하기 위한 추가 진화를 위해 243 InsPPCL 변이체 (PPCL) (서열 번호: 82)를 선별한다.
실시예 6. CAR-T 활성화 및 증식을 위한 보조 성분의 스크리닝.
CD3-프로모터 구동 CAR 카세트의 역 가당 상에 합성 인트론 내로 도입시키기 위해 단백질 코딩 도메인 시리즈 (ABCG1, SOCS1, SMAD2, TGFBR2, cCBL, 및 PD1) 및 miRNA 서열을 구축한다. CD3-프로모터 구동 CAR 카세트 및 단백질 코딩 도메인 또는 miRNA 서열을 함유하는 각 구축물은 심층 서열부넉을 위해 고유의 바코드를 포함하고, 이를 깁슨(Gibson) 어셈블리를 사용하여 어셈블리시킨 후, E. 콜라이(E. coli)에서 형질전환시키고, 라이브러리를 확장시킨다. 바이러스 스톡을 제조하고, 이를 사용하여 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM, 또는 IL2 무함유 X-비보 15 배지 중에서 CD3/CD28 자극받은 T 세포를 형질도입시키고, 증폭을 위해 DNA를 연속 샘플링하고, 코드 확인을 위해 심층 서열분석을 수행하면서, 4주 동안 배양물 중에서 성장시킨다. 또한, 라이브러리에 대해 PACBio 전장 서열분석을 수행함으로써 라이브러리 다양성을 측정하고, 바코드 성분을 해독한다. miRNA 서열 및 단백질 코딩 도메인을 CAR CD3ζ 도메인의 시너지적 활성화에 대하여 시험한다.
실시예 7. 선택적 T 세포 통합 및 PBMC로부터의 발현을 위한 표적 휴지기 T 세포로의 시스템의 형질도입
일시적 형질감염에 의한 고역가 렌티바이러스 벡터 제조가 가능하기는 하지만, 상기 방법은 복제 능력이 있는 레트로바이러스 (RCR)를 생성할 위험을 수반하고, 임상 적용을 위한 규모 조정이 불가능하다. 본원에서, 유도가능한 프로모터 및 그의 조절인자를 코딩하는 다중 구축물을 HEK293 현탁액 적합화된 세포 (HEK293S) 내로 동시에 도입함으로써 바이러스 성분, CAR 유전자, 및 그의 조절 성분을 안정적으로 제조함으로써 안정적인 레트로바이러스 패키징 세포주가 생성된다. 2개의 상이한 유도가능한 시스템을 사용하여 유전자의 발현을 일시적으로 제어할 수 있다. 한 시스템은 두 전사 인자의 라파마이신- 또는 라팔로그-유도 이량체화에 기초한다. 한 전사 인자는 ZFHD1 DNA 결합 도메인에 융합된 FKPB 단백질의 3개 카피로 구성되고, 나머지 다른 한 전사 인자는 p65 활성화 도메인에 융합된 FRB 단백질로 구성된다. 라파마이신 또는 라팔로그는 전사 인자를 이량체화하여 ZFHD1/p65 AD를 형성하고, 12xZFHD1 결합 부위에서 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다.
HEK293S 게놈 내로의 통합을 위해 측면에 트랜스포존 서열을 가지는, 도 3a-3e에 제시된 바와 같은 벡터 시리즈가 생성된다. 일단 세포의 게놈 내로 통합되고 나면, 이들 서열은 조절 성분으로서, 및 본원에서 랜딩 패드로 지칭되는, Cre 및/또는 flp 리콤비나제를 사용하는 후속 통합을 위한 lox 및/또는 FRT 부위로서 작용한다. 초기의 5개의 구축물은 퓨로마이신 내성, GFP, RFP, 및 N 말단 PLss (소 프로락틴 신호 펩티드)를 통해 세포 막으로 표적화되고, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) C 말단 막횡단 부착 도메인을 통해 세포 막에 부착된 세포외 MYC 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 초기의 5개의 구축물은 또한 구성적 최소 CMV 및 최소 IL-2 프로모터, 라파마이신-조절 ZFHD1 기반 프로모터, 테트라사이클린 반응성 요소 (TRE) 프로모터, 또는 양방향 TRE (BiTRE) 프로모터를 포함할 수 있다. 도 3a의 구축물은 구성적으로 발현되는, NFκB p65 활성인자 도메인 (p65 AD)에 융합된 FRB 도메인, 및 3개의 FKBP 반복부에 융합된 ZFHD1 DNA 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 도 3a의 구축물은 또한 라파마이신 유도가능한 ZFHD1/p65 AD 프로모터하에 HIV1 REV 및 HSV VP65 도메인 SrcFlagVpx도 포함한다. 도 3b의 구축물은 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에 rtTA 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 한다. 도 3c 의 구축물은 loxP 부위 측면에 위치하는 퓨로마이신 내성 유전자 및 lox2272 부위 측면에 위치하는 세포외 MYC 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 상기 두 선별가능한 마커 모두 FRT 부위 측면에 위치하는 BiTRE 프로모터의 제어하에 있다. 도 3d의 구축물은 TRE 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 측면에 위치하는 GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 도 3d의 구축물은 또한 TRE 프로모터와 GFP의 5' loxP 부위 사이에 단일 FRT 부위를 포함한다. 도 3e의 구축물은 ZFHD1/p65 AD 프로모터의 제어하에 있는 loxP 부위 측면에 위치하는 폴리뉴클레오티드 RFP를 포함한다. 도 3e의 구축물은 또한 ZFHD1/p65 AD프로모터와 RFP의 5' loxP 부위 사이에 단일 FRT 부위를 포함한다. 도 3c-3e의 구축물은 패키징 세포주의 게놈 내로 삽입시키기 위한 다른 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 랜딩 패드로서의 기능을 한다. 삽입되는 폴리뉴클레오티드 서열은 lox 부위 측면에 위치할 수 있고, Cre 리콤비나제 및 loxP 부위를 사용하여 게놈 내로 삽입될 수 있다. 이를 통해 퓨로마이신 내성, 세포외 MYC 태그, GFP, 및 RFP를 코딩하는 게놈 영역을 삽입되고, 동시에 제거된다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 FRT 부위 측면에 위치할 수 있고, flp 리콤비나제 및 FRT 부위를 사용하여 게놈 내로 삽입된 후, 이어서, 퓨로마이신 내성, 세포외 MYC 태그, GFP, 및 RFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 Cre 리콤비나제 사용으로 제거될 수 있다.
게놈 내로 통합된 랜딩 패드를 포함하는 패키징 세포주를 생성하기 위해 HEK293S 세포를, 2:1 또는 3:1 PEI 대 DNA (w/w)의 비로 PEI의 존재하에서 피기백 트랜스포사제를 발현시키기 위해 위해 같은 몰 농도의 5개의 플라스미드 (도 3a-3e) + 5 ㎍의 시험관내 전사된 피기백 트랜스포사제 mRNA 또는 5 ㎍의 프로모터를 포함하는 플라스미드 또는 양이온 펩티드 혼합물을 사용하여 2-5 ㎍의 피기백 트랜스포사제 단백질로 공동 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 2-5일 동안 100 nm 라파마이신 및 1 ug/mL 독시사이클린의 존재하에서 퓨로마이신을 이용하여 선별한 후, 형광 활성화 세포 분류에 의해 GFP 및 RFP를 발현하는 세포를 수집한다. 분류된 세포를 퓨로마이신, 라파마이신, 및 독시사이클린의 부재하에서 5일 동안 성장시키고, GFP 및 RFP를 발현하는 세포를 제거하고, 또한 myc 양성 세포도 myc 비드를 이용하여 제거한다. 이어서, 음성적으로 분류된 세포로부터의 개별 클론을 라파마이신 및 독시사이클린에 의한 GFP 및 RFP의 유도에 대하여 스크리닝하고, 단일 세포를 클로닝한다. 클론으로부터의 DNA을 수거하고, 통합 분석을 위해 서열분석한다. 라파마이신 및 독시사이클린의 부재하에서는 제한된 배경 발현을 보이지만, 라파마이신 및 독시사이클린의 존재하에서 GFP 및 RFP의 강력한 유도가능한 발현에 대해 양성을 띠는 클론을 확장시키고, 저장한다.
이어서, 게놈 내로 통합된 도 3a-3e로부터의 구축물을 포함하는 HEK293S 세포를, CD14 GPI 앵커 부착 부위, CD28을 CD16B GPI 앵커 부착 부위와 결합시킬 수 있는 CD80 세포외 도메인 (ECD), 및 HEK293S 게놈 내로의 통합을 위한 폴리뉴클레오티드 영역 측면에 위치하는 트랜스포존 서열과 함께 분해-가속 인자 (DAF)에 융합된 IL-7과 함께 항-CD3 (클론 UCHT1) scFvFc DAF 신호 서열/항-CD3 scFvFc (UCHT1)/CD14 GPI 앵커 부착 부위 (서열 번호: 252), DAF 신호 서열/CD28에 결합할 수 있는 CD80 세포외 도메인/CD16B GPI 앵커 부착 부위 (서열 번호: 253), DAF 신호 서열/IL-7/DAF (서열 번호: 107) 및 HEK293S 게놈 내로의 통합을 위한 폴리뉴클레오티드 영역 측면에 위치하는 트랜스포존 서열을 코딩하는 트리시스트로닉 폴리뉴클레오티드를 함유하는 구축물로 형질감염시킨다 (도 4a). 형질감염 후, 세포를 라파마이신 및 독시사이클린의 부재하에서 2일 동안 확장시키고, 콜로니를 구성적으로 선별한다. 이어서, 양성 콜로니를, Cre 리콤비나제를 발현하는 구축물로 형질감염시켜 남은 게놈 DNA, 및 RFP 코딩 영역을 제거한다. BiTRE 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 한 방향으로 gag 및 pol 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역 및 다른 방향으로 홍역 바이러스 F 및 H 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 함유하는 또 다른 구축물 (도 4b)을 동시에 형질감염시킨다. Cre 리콤비나제는 구축물을 게놈 내로 통합시켜 도 4b에 제시된 바와 같은 통합된 서열을 생성한다. 생성된 콜로니를 독시사이클린 및 라파마이신의 존재하에서 단백질 발현에 대해 평가하고, 게놈 통합에 대하여 심층 서열분석에 의해 분석한다. 남은 TRE 반응성 GFP 부위는 렌티바이러스 게놈 삽입을 위해 유지된다.
실시예 8. 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 패키징 생성
실시예 7에서 생성된 레트로바이러스 패키징 안정적인 세포주를, Flp 리콤비나제 발현을 위한 구축물 (도 4c), 및 HEK293S 세포에서는 활성을 띠지 않는 CD3Z 프로모터의 제어하에서 CAR 및 림프구 증식성 요소 IL7Rα-insPPCL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 구축물 (여기서, CAR 및 IL7Rα-insPPCL은 T2A 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 이격되어 있고, IL7Rα-insPPCL은 아시클로버 리보스위치 제어식 리보자임을 가진다)로 형질감염시킨다. CAR 함유 구축물은 cPPT/CTS 및 RRE 서열, 및 HIV-1 프사이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 게놈 내로 통합되는 CAR 함유 구축물 상의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 FRT 부위 측면에 위치한다. CAR 함유 구축물이 성공적으로 통합되면, GFP가 구성적으로 발현되고, 그 결과, GFP는 Cre 리콤비나제를 발현하는 구축물에 의한 일시적 형질감염에 의해 제거된다. HEK293S 세포주를 무혈청 배지 중에서 성장시킨다. 교반식 탱크 반응장치에서 최고 세포 밀도까지 성장시킨 후, 세포를 70% 최고 세포 밀도로 희석하고, 2일 동안 100 nM 라파마이신으로 처리하여 조기 유전자 REV, Vpx, 및 CD3 scFv CD16B GPI, CD28 scFv CD16B GPI, 및 IL-7 SD GPI DAF의 발현을 유도한 후, 배지 중 1 ug/mL 독시사이클린을 첨가하여 구조 요소, 예컨대, Gag Pol, MV(Ed)-FΔ30, MV(Ed)-HΔ18, 및 치료적 표적을 포함하는 렌티바이러스 게놈의 발현을 유도한다. 패키징 서열의 qPCR 및 p24 ELISA에 의해 바이러스 제조 수준을 조사한다. 세포의 심층 여과에 의해 바이러스 수거하고, 농축/TFF 카트리지를 사용하여 투석여과한 후, 바이알 용기에 넣기 위해 급속 냉동시킨다.
실시예 9. 말초 혈액 단핵구 세포 ( PBMC ) 단리, 형질도입, 및 확장.
하기 실시예는 생체내 확장 이전에 PBMC의 생체외 프로세싱을 위해 폐쇄형 시스템을 사용하는 것을 예시한다. 한 예로서, 항응고제로서 산 시트레이트 덱스트로스 용액 (ACD)을 사용하여 30 내지 200 ml의 인간 혈액을 대상체로부터 채혈하여 혈액 수집 백 내로 넣는다. 대안적으로, 혈액을 채혈하여 진공 채혈관, 시린지 또는 등가물 내로 넣고, 빈 혈액 수집 또는 IV 백으로 옮겨 놓는다. 전혈을 세팍스 2 세포 프로세싱 시스템 (바이오세이프) 상에서 니트 셀(Neat Cell) 키트 (카탈로그 번호 CS-900.2, 옴니아메드(Omniamed))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 프로세싱한다. 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 배양 백 내로, 또는 대안적으로, 시린지 내로 수집한다. 세포를 계수하여 생존가능한 세포의 개수를 측정하기 위해 무균 방식으로 분취량을 취한다. PBMC를 최대 200 ml의 최종 부피 중 10-300 IU/ml IL-2 (카탈로그 번호 202-IL-010, R&D 시스템즈(R&D Systems))와 함께 X-비보 15 (카탈로그 번호 08-879H, 론자) 또는 CTS 옵트마이저 셀 익스펜션 SFM (카탈로그 번호 A1048501, 써모 피셔 사이언티픽) 배지 중 0.1 - 1.0 x 106개의 생존가능 세포/ml인 최종 농도로 G-렉스100MCS 가스 투과 세포 배양 시스템 장치 (윌슨 울프(Wilson Wolf))로 옮겨 놓았다. IL-2 이외에도, CTS 이뮨 셀 SR(CTS Immune Cell SR) (카탈로그 번호 A2596101, 써모 피셔 사이언티픽)을 배지에 첨가할 수 있다. 폐쇄형 G-렉스 가스 투과 세포 배양 시스템 장치를 제소사의 설명서에 따라 레트로넥틴(Retronectin) (카탈로그 번호 CH-296, 다카라(Takara)), 또는 유사한 피브로넥틴 유래 등가물로 미리 코팅시킬 수 있다.
말초 혈액으로부터 단리된 PBMC를 PALL PBMC 필터 상에 로딩하고, 필터를 통해 10 ml의 AIM V (써모 피셔 사이언티픽), 또는 X-비보 15 배지로 1회 세척한 후, 이어서, 37℃에서 5 ml/hr로 (실시예 8에서 제조된 것과 같은) 10-60 ml의 렌티바이러스 스톡을 관류시킨다. 이어서, PBMC를 AIM V, CTS 옵트마이저 T 셀 익스펜션 SFM, 또는 재조합 인간 DNase (풀모자임(Pulmozyme), 제넨테크(Genentech))를 함유하는 X-비보 15 배지로 다시 세척한 후, DNase 무함유 락테이티드 링거스(Lactated Ringers) (카탈로그 번호 L7500, 브라운(Braun))로 세척한다. 이어서, PBMC를 필터를 통해 시린지 내로 역으로 관류시킨다. 이어서, 세포 (세포의 표적 수준은 5 x 105 내지 1 x 106개의 세포/kg이다)를 정맥내 주입을 통해 대상체 내로 재주입시킨다.
레트로바이러스 게놈 내에 함유된 리보스위치에 의존하여, 대상체는 각각의 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스 프로드럭 (아시클로버, 발라시클로버, 펜시클로버, 또는 팜시클로버)을 제공받는다. 대상체는 임의의 치료학상 유효 용량으로, 예컨대, 500 mg의 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 경구적으로 1일 3회에 걸쳐 제공될 수 있다. 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 이용한 처리는 바람직하게는 재주입 이전에, 예컨대, 2시간 전에 시작되고, 이는 또한 재주입 시점에, 또는 재주입 후 몇시간이 경과한 시점에 시작될 수 있다. 처리는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 30, 60, 90, 120일, 또는 5, 6, 9, 12, 24, 36, 또는 48개월 이상 동안 계속 진행될 수 있다. 처리는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭을 1일 1, 2, 3, 또는 4회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 재주입 및 처리 시작 후, 재주입 후 2, 5, 7, 11, 13, 18, 28, 및 56일째에 바이러스 게놈의 양을 정량화하는 qPCR을 사용하여 혈액 계수를 감염된 세포의 개수를 측정한다. 발열 또는 시토카인 방출 증후군을 보이는 대상체에서는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 용량 또는 빈도를 감소시키거나, 또는 중단할 수 있다. 감염된 T 세포가 18일째까지 10,000-100,000배 증폭되지 못했다면, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 용량 또는 빈도를 증가시킬 수 있다. 대상체의 임상 반응은 FDG PET 영상화 및 연속 CT 스캔을 통해 측정될 수 있다. 장기간의 관해 이후에, 또는 전체 말초 T 세포 계수의 30% 초과로 과도한 T 세포 증식이 일어난 경우에는 뉴클레오시드 유사체 항바이러스성 약물 또는 프로드럭의 경구적 투약은 감소되거나, 또는 중단될 수 있다.
실시예 10. 혈관 또는 조직 pH를 상승시키기 위한 치료적 개입.
항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에의 결합을 감소시키기 위해, NaHCO3을 IV 볼루스로서, 또는 IV 주입에 의해 투여한다. 표준 투여량은 초기 용량으로서 체중 1 kg당 1 mg이고, 이후 매 10분마다 0.5 mg/kg이다. 50 ml의 NaHCO3 볼루스가 혈청 pH를 pH 단위로 대략 0.1씩 상승시킬 것이다. pH가 7.0이면, pH를 7.40으로 보정하기 위해 4개의 50 mEq HCO3 앰플이 요구된다.
실시예 11. PBMC에서의 IL-7 수용체 림프구 증식성/생존 요소의 활성 시험
IL-7Rα 변이체를 T 세포의 항원-비의존적 생존을 매개할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험하기 위해, 항응고제로서 산 시트레이트 덱스트로스 (ACD)를 사용하여 30 ml의 인간 혈액을 채혈하여 진공 채혈관 내로 넣었다. 제조사의 설명서에 따라 피콜-파크(Ficoll-Pacque)™ (제너럴 일렉트릭(General Electric))를 이용하여 밀도 구배 원심분리를 사용함으로써 전혈을 프로세싱하여 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 수득하였다. 분취량의 PBMC를 무균 방식으로 X-비보(X-Vivo)™ 15 배지 (론자)와 함께 1 mL의 최종 부피 중 50만 개의 생존가능 세포/mL인 최종 농도로 12 웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮겨 놓았다. 일부 샘플에서는 재조합 인간 인터류킨-2 (IL-2) (노보프로테인(Novoprotein)) 또한 100 IU/ml인 농도로 첨가하였다. 바이러스 형질도입을 위해 PBMC를 활성화시키기 위해, 활성화 항-CD3 Ab (OKT3, 노보프로테인)를 50 ng/ml 농도로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 원하는 시험 구축물 (도 19a)을 함유하는 렌티바이러스 입자 제제를 감염 다중도 (MOI) = 5로 개별 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 12 웰 플레이트의 각 웰의 내용물을 수집하고, 원심분리하여 펠릿을 수득하였다. 샘플을 D-PBS + 2% 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 1회 세척하고, X-비보15™ 배지 중에 재현탁시키고, G-렉스® 6-웰 가스 투과 세포 배양 장치 (윌슨 울프)의 웰로 옮겨 놓았다. 추가의 X-비보™ 15 배지를 첨가하여 각 웰의 최종 부피가 30 ml가 되도록 만들었다. 각 구축물에 대한 대응 대조군 샘플을 G-렉스® 6-웰 가스 투과 세포 배양 장치 (윌슨 울프)의 웰로 옮겨 놓았고, 일부 대조군 샘플의 경우, 100 IU/ml IL-2와 함께, 추가의 배지를 첨가하여 각 웰의 최종 부피가 30 ml가 되도록 만들었다. G-렉스® 장치를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 표준 습윤화된 조직 배양 인큐베이터에서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 배양하는 동안 매 2-3일마다 IL-2를 함유하는 대조군 샘플에 신선한 IL-2를 첨가하였다. IL-2를 함유하지 않는, 대응 시험 샘플은 보충하지 않았다. 7일째 확장 동안 세포 개수 및 생존능을 추적하기 위해 (카운테스(Countess), 써모 피셔) 샘플을 제거하였다.
도 19a는 시험된 IL7Rα 구축물의 개략도를 제공하는 것이다. 상기 구축물을 재조합 렌티바이러스 게놈 내로 삽입하였다. 재조합 레트로바이러스를 사용하여 PBMC를 형질도입시켰다. 도 19a는 신호 서열 (SS), 세포외 도메인 (ECD), 막횡단 (TM), 및 세포내 도메인 (ICD)으로 구성된 야생형 IL7Rα (서열 번호: 229)의 개략도를 보여주는 것이다. "1"은 피브로넥틴 타입 III 도메인의 부위를 표시하는 것이고; "2"는 WSXWS 모티프의 부위를 표시하는 것이고; "3"은 박스 1 부위를 표시하는 것이고, "4"는 단백질 키나제 C (PKC) 인산화 부위 표시하는 것이고, "5"는 박스 2 부위를 표시하는 것이다.
변이체 "A"는 그의 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩티드, GSG 링커, 및 P2A 리보솜 스킵 서열과 함께 한 전사체 상에서 발현되는, 243번 위치에 InsPPCL을 포함하되 (문헌 [Shochat et al. 2011, J. Exp . Med . Vol. 208 No. 5 901-908]), S185C 돌연변이는 포함하지 않는 IL-7Rα이다. 변이체 "B"는 신호 서열과 세포외 도메인 사이의 Myc Tag 뿐만 아니라, 그의 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩티드, GSG 링커, 및 P2A 리보솜 스킵 서열과 함께 포함하는 IL-7Rα InsPPCL이다. 변이체 "C"는 변이체 "B"와 유사하되, 단, 예외적으로, 그의 세포내 도메인은 292번 위치에서 말단절단되어 있는 것이다. 변이체 "D"는 변이체 "A"와 유사하되, 단, 예외적으로, 그의 세포내 도메인은 292번 위치에서 말단절단되어 있는 것이다. 변이체 "E"는 그의 N 말단에서 말단절단된 IL-7Rα InsPPCL 변이체이며, 이로써, 신호 서열 및 세포외 도메인 (잔기 1-228) 대부분은 존재하지 않고; 변이체 "E"는 또한 아미노 말단으로부터 순서대로 N 말단에 융합된 GFP 폴리펩티드, GSG 링커, P2A 리보솜 스킵 서열, 및 eTag를 가진다. 아미노산 잔기의 넘버링은 IL7Rα (NCBI GI 번호 002176.2)에 기초한다. 각 변이체를 함유하는 T 세포를 IL-2의 존재 또는 부재하에서 트리판 블루 배제를 사용하여 생존능에 대해 시험하였다.
도 19b에 제시된 바와 같이, PBMC는 시험관내에서 생존을 위해 IL-2를 필요로 한다. 도 19b에 도시된 바와 같이, 형질감염되지 않은 PBMC는 IL-2의 존재하에서 생존율이 약 80%였고, IL-2의 부재하에서는 생존율이 0%였다. 전장 버전의 IL-7Rα InsPPCL (도 19a에서 IL-7Rα 변이체 A 및 B)을 가지는 PBMC는 L-2의 부재하에서는 생존율이 20%를 초과하였고, 이는 구성적으로 활성을 띠는 IL-7Rα InsPPCL 수용체의 발현은 상기 세포에서 생존 활성을 가진다는 것을 시사한다. 추가로, 세포내 도메인 (ICD)이 말단절단된 IL-7Rα InsPPCL 변이체 (도 19a에서 IL-7Rα 변이체 C 및 D)를 발현하는 T 세포는 야생형 IL-7 수용체와 비교하였을 때, 증가된 생존율을 보였다. 마지막으로, 도 19b에 제시된 바와 같은 N 말단 IL-7 수용체 돌연변이체 (도 19a에서 IL-7Rα 변이체 E)는 상기 세포에서 생존 활성을 가졌다. 따라서, 본 실시예는 IL-7 수용체가 PBMC에서 발현되었을 때, 생존 활성을 가진다는 것을 예시한다.
실시예 12. 새로 단리된 비자극인간 T 세포의 MeVpp에 의한 형질도입율
293T 세포 (렌티-X(Lenti-X) 293T, 클론테크)를 렌티바이러스 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킴으로써 렌티바이러스를 제조하였다. 프리스타일(Freestyle) 293 발현 배지 (써모피셔 사이언티픽) 중에서 연속 성장시켜 세포를 현탁 배양에 적응시켰다. 현탁액 중 세포를 125 mL 에를렌마이어 플라스크 중에 1 Х 106개의 세포/mL (30mL)로 시딩하고, 약산 중에 용해된 PEI (폴리사이언시스(Polysciences))를 사용하여 즉시 형질감염시켰다.
30 mL 세포에 대하여 1.5 ml Optimem 배지 중에 플라스미드 DNA를 희석시켰다. VSV-G 슈도-입자의 경우, 총 DNA (1 ㎍/mL의 배양 부피)는 하기 몰비로 이루어진 4개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드, 1x Rev 함유 플라스미드, 1x VSVg 함유 플라스미드, 및 1x Gagpol 함유 플라스미드. MV(Ed)-FΔ30/HΔ18 슈도-입자의 경우, 총 DNA (1 ㎍/mL의 배양 부피)는 하기 몰비로 이루어진 5개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드, 1x Rev 함유 플라스미드, (2/3, 3분의 2) x MV(Ed)-FΔ30 함유 플라스미드, (1/3, 3분의 1) x MV(Ed)-HΔ18 함유 플라스미드, 및 1x Gagpol 함유 플라스미드. MV(Ed)-FΔ30/HΔ24 슈도-입자의 경우, 총 DNA (1 ㎍/mL의 배양 부피)는 하기 몰비로 이루어진 5개의 플라스미드의 혼합물이었다: 2x 게놈 플라스미드, 1x Rev 함유 플라스미드, (2/3, 3분의 2) x MV(Ed)-FΔ30 함유 플라스미드, (1/3, 3분의 1)x MV(Ed)-HΔ24 함유 플라스미드, 및 1x Gagpol 함유 플라스미드. 별개로, PEI를 1.5 ml Optimem 중에 2 ㎍/mL (배양물 부피, DNA 대비 비율 2:1) 로 희석시켰다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 두 용액을 함께 충분하게 혼합시키고, 실온에서 20분 초과의 시간 동안 인큐베이션시켰다. 최종 부피 (3 ml)를 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 120 rpm으로 회전시키면서, 및 5-8% CO2하에 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
48시간 후, 1,000 g로 10분 동안 원심분리하여 상청액을 수거하였다. 상청액을 새 튜브로 경사분리하고, PEG 용액 (PEG-IT, 시스템 바이오사이언시스(시스템 Biosciences)) 중 상청액 부피의 ¼을 첨가하였다. 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 1,500 g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 렌티바이러스 슈도타입을 침전시켰다. 상청액을 제거하고, 바이러스를 1:100 부피의 PBS 중에 재현탁시켰다. 형질도입 후 48시간째에, 연속 희석 및 CD46 및 SLAM, 둘 모두를 발현하는 라지(Raji) 세포 상에서의 GFP 발현에 의해 바이러스를 유세포 분석법에 의해 역가를 측정하였다.
먼저, 샌디에고 혈액 은행(San Diego Blood Bank: 미국 캘리포니아주)에 의해 수집되고, 배포된 혈액의 새 연만으로부터 농축된 말초 혈액 T 세포를 단리시켰다. 간략하면, 제조사의 설명서에 따라 피콜-플라크 플러스(Ficoll-Paque PLUS)® (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)) 상에서 PBMC의 SepMate™ (스템셀(Stemcell)™) 기반 구배 밀도 분리를 수행하였다. 이어서, 본래 그대로의 T 세포 다이나비즈(Dyna비드)® 키트 (인비트로겐) 및 제조사의 설명서를 사용하여, 본래 그대로의 T 세포를 음성 선별에 의해 새로 단리된 전체 PBMC로부터 추가로 농축시켰다. 단리 후, 2.6E5의 농축된 및 새로 단리된 및 비자극 말초 혈액 T 림프구를 상이한 벡터를 이용하여 다양한 감염 다중도로 이중으로 형질도입시켰다. 96 웰 플레이트 포맷에서 최종 100 uL RPMI-2%HIFCS 중 37℃에서 14h 동안 형질도입을 수행하였다. 14h 동안의 벡터와의 인큐베이션 후, 세포를 PBS-2%HIFCS로 3회에 걸쳐 세척하고, 마지막으로, 3일째까지 RPMI-10%HIFCS 중 37℃에서 0.5E6/mL의 세포 밀도로 인큐베이션시켰다.
VSV-Gpp 또는 MeVpp로 형질도입시킨 후 3일째, 1E5 세포를 수집하고, CD3+ 세포 집단에서 GFP 발현에 대해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 도 20은 음성적으로 선별된 및 비자극 T 세포에 대한 MOI 대비 형질도입율의 플롯을 보여주는 것이다. 기호는 명료성 향상을 위해 엇갈리게 배열되어 있다. 비자극 T 세포는 MOI = 1인 VSV-Gpp (~0-5%)와 비교하면, MV(Ed)-FΔ30/ MV(Ed)-HΔ18 슈도-입자 (~70-80%)를 사용하였을 때, 더욱 효율적으로 형질도입되었다. 비자극 T 세포는 또한 MOI = 6인 VSV-Gpp (~5-10%)와 비교하면, MV(Ed)-FΔ30/ MV(Ed)-HΔ24 슈도타입화 입자를 사용하였을 때, MOI = 5 (~70-80%)로 더욱 효율적으로 형질도입되었다. 새로 단리된 비자극인간 T 세포의 슈도타입화된 렌티벡터에 의한 형질도입율은 슈도타입화를 위해 VSV-G가 사용되었을 때보다 말단절단된 MeV-외피 폴리펩티드가 사용되었을 때에 훨씬 더 높다.
실시예 13. EF - 1알파 프로모터 인트론 내로 삽입된 miRNA의 기능 입증
각각 miR-155 프레임워크를 함유하는 4개의 g블록(gBlock)® 유전자 단편을 디자인하였다. 각 g블록®에 대하여, CD3제타 mRNA 전사체를 표적화하는 고유 miRNA를 사용하여 miR-155 표적 서열을 대체시켰다. 각 g블록®은 4개의 g블록스® 모두를 단일 쇄로서 EF-1알파 프로모터 인트론으로 어셈블리시키는 것을 촉진시키도록 디자인된 40 bp 오버랩 서열을 함유하였다. 시판용 깁슨® 어셈블리 울트라(Gibson® assembly ultra) 키트 (NE빌더(NEBuilder), 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.(New England Biolabs, Inc.))를 사용하여 g블록스®를 어셈블리시켰다.
EF-1알파 프로모터 및 인트론 A (서열 번호: 255)는 렌티바이러스 벡터 골격에 함유되어 있는 GFP 및 eTag의 발현을 구동시키는, 트랜스진 발현 카세트의 일부분이었다 (GFP, 및 세툭시맙에 의해 인식되는 예시적인 eTag를 포함하는 렌티바이러스 벡터 골격은 본원에서 F02로서 지칭된다). 서열 번호: 255 중의 각 g블록® 및 그의 각 성분들의 뉴클레오티드 위치는 하기 표 3에 제시되어 있다. EF-1알파 프로모터의 철저한 서열분석에 의해 4개의 miRNA의 렌티바이러스 벡터 골격으로의 적절한 어셈블리를 확인하였다.
Figure 112018099692761-pct00019
Figure 112018099692761-pct00020
4개의 플라스미드를 현탁 HEK293 세포 내로 일시적으로 공동 형질감염시켜 CD3제타에 대한 4개의 miRNA를 함유하는 렌티바이러스를 제조하였다: CD3제타 mRNA 전사체를 표적화하는 4개의 miRNA를 함유하는 플라스미드, VSV-G를 함유하는 플라스미드, REV를 함유하는 플라스미드, 및 GAG-POL을 함유하는 플라스미드. 바이러스 상청액을 48시간 후 수거하고, 24시간 동안 PEG 침전시켰다. 상청액을 원심분리하고, 펠릿화된 바이러스를 IL-2 무함유 완전 PBMC 성장 배지 중에 재현탁시켰다. 주르카트 세포의 48시간 형질도입에 의해 바이러스 역가를 산출하였다.
형질도입을 위해, 0일째 PBMC를 해동시키고, 100 U/mL의 hrIL-2와 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 1일째, PBMC를 CD3/CD28 접합된 비드를 통해 활성화시켰다. 2일째, 활성화된 PBMC를, miRNA를 함유하는 렌티바이러스로 MOI = 10으로 형질도입시켰다. 매 2일마다 신선한 hrIL-2를 첨가하면서 11일째까지 세포를 확장시켰다. 7, 9, 및 11일째, FACS 분석을 위해 100만 개의 세포를 수거하였다.
CD3 엡실론 표면 발현을 위해 PE 접합된 OKT-3 항체 (바이오레전드(Biolegend))를 사용하여 세포를 염색시켰다. GFP 양성 집단 (형질도입된 세포)에서의 PE의 평균 형광 강도 (MF)에 의해 발현 수준을 측정하였다. 야생형 (F02) 바이러스와 CD3z miRNA를 함유하는 F02 바이러스 사이의 형질도입된 세포의 발현 수준을 비교하였다. 도 21은 EF-1알파 프로모터 인트론 중에 있는 CD3제타를 표적화하는 miRNA가 CD3 복합체의 발현을 넉다운시킬 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다.
본 개시내용의 실시양태, 예, 및 실험은 본 개시내용의 범주를 제한하거나 또는 하기 실험이 모든 실험 또는 오직 수행된 실험뿐이라는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치 (예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 약간의 실험상의 오차 및 편차를 감안하여야 한다. 기술된 바와 같은 방법은 실험이 예시하고자 하는 기본적 측면은 변화시키지 않으면서 변형될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
당업자는 본 개시내용의 범주 및 정신 내에서 다수의 변형 및 다른 실시양태를 고안해 낼 수 있다. 실제로, 당업자는 본 개시내용의 기본적 측면은 변화시키지 않으면서 기술된 물질, 방법, 도면, 실험, 예 및 실시양태를 변형시킬 수 있다. 개시된 실시양태 중 임의의 것은 임의의 다른 개시된 실시양태와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 경우에서, 일부 개념은 구체적인 실시양태를 참조로 하여 기술되었다. 그러나, 당업계의 숙련가는 하기의 특허청구범위에 기술된 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변경될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 명세서 및 도면은 제한적 의미보다는 예시적인 것으로 간주되어야 하고, 상기와 같은 변형은 모두 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> F1 ONCOLOGY, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TRANSDUCING LYMPHOCYTES AND REGULATED EXPANSION THEREOF <130> IPA180951-US <140> PCT/US2017/023112 <141> 2017-03-19 <150> 62/390,093 <151> 2016-03-19 <150> 62/360,041 <151> 2016-07-08 <150> 62/467,039 <151> 2017-03-03 <160> 255 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 2 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 3 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala 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Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr 35 40 45 Gly Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly 50 55 60 Ser Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile 65 70 75 80 Val Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu 85 90 95 Ala Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val 100 105 110 Arg Ser <210> 8 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr 1 5 10 15 Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro 20 25 30 Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro 35 40 45 Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys 50 55 60 His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala 65 70 75 80 Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg 85 90 95 Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met 100 105 110 Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu 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Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 100 105 110 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 115 120 125 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 130 135 140 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 145 150 155 160 Pro Pro Arg <210> 12 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 100 105 110 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 115 120 125 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 130 135 140 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 145 150 155 160 Leu Pro Pro Arg <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 1 5 10 15 Val Leu Asp Lys Arg 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 1 5 10 15 Ser Glu Ile Gly Met Lys 20 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 1 5 10 15 Ala Leu His Met Gln 20 <210> 17 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110 Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170 <210> 18 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Thr Ala Asp Thr Gln 85 90 95 Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln 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Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro 145 150 155 160 Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys 165 170 175 Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys 180 185 190 Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Gly Leu Asn Gln Arg 20 <210> 22 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys 20 25 30 Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95 Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 100 105 110 Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val 115 120 125 Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly 165 170 175 Asn Gln Leu Arg Arg Asn 180 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser 1 5 10 15 His Leu Gln Gly Asn 20 <210> 24 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala 20 25 30 Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu 35 40 45 Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val 50 55 60 Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe 65 70 75 80 Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln 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synthetic Dox-rapamycin inducible GAG POL ENV <400> 84 gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60 acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120 ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180 gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240 ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300 tttctagggt taagacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca 360 atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 420 gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 480 atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gaagttccta tactttctag agaataggaa 540 cttcggaata ggaacttcgg atgcaatttc ctcattttat taggaaagga cagtgggagt 600 ggcaccttcc agggtcaagg aaggcacggg ggaggggcaa acaacagatg gctggcaact 660 agaaggcaca gcgttagtga tacttgtggg ccagggcatt agccacacca gccaccactt 720 tctgataggc agcctgcact ggtggggtga attccgcgga agcttgtgta attgttaatt 780 tctctgtccc actccatcca ggtcgtgtga 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uggagacuau 60 aagu 64 <210> 238 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Deoxyguanosine riboswitch aptamer mutations <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> n at positions 10-13 can be A, C, G, or T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(29) <223> n at positions 27-29 can be A, C, G, or T <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n at positions 31-32 can be A, C, G, or T <220> <221> misc_feature <222> (33)..(40) <223> n at positions 33-40 can be A, C, G, T, or no nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(46) <223> n at positions 44-46 can be A, C, G, or T <220> <221> misc_feature <222> (57)..(59) <223> n at positions 57-59 can be A, C, G, or T <400> 238 acuuauacan nnnagcauaa ugggcunnng nnnnnnnnnn gccnnnaaac cuauuunnng 60 acuauaagu 69 <210> 239 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Oligo library for screen <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n at positions 19-21 can be A, C, G, or T <220> <221> 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RNA <400> 248 gggcggcacu uauacagggu agcauaaugg gcuacugacg ccuucaaacc uauuuggaga 60 cuauaagugu cgcgcggggc ggcacuuaua caggguagca uaaugggcua cugacgccuu 120 caaaccuauu uggagacuau aagugucgcg cg 152 <210> 249 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Oligo 1 Synthesized template <400> 249 cgcgcgacac ttatagtctc caaataggtt tgaaggcgtc agtagcccat tatgctaccc 60 tgtataagtg ccgccc 76 <210> 250 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Oligo 2 Transcribed RNA <400> 250 gggcggcacu uauacagggu agcauaaugg gcuacugacc ccgccuucaa accuauuugg 60 agacuauaag ugucgcgcg 79 <210> 251 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic Oligo 2 Synthesized template <400> 251 cgcgcgacac ttatagtctc caaataggtt tgaaggcggg gtcagtagcc cattatgcta 60 ccctgtataa gtgccgccc 79 <210> 252 <211> 560 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DAFss-aCD3scFv(UCHT1)IgG1 Fc-CD14GPI <400> 252 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 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Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp 245 250 255 Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 260 265 270 Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 275 280 285 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 290 295 300 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 305 310 315 320 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 325 330 335 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 340 345 350 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 355 360 365 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 370 375 380 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 385 390 395 400 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 405 410 415 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 420 425 430 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 435 440 445 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 450 455 460 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 465 470 475 480 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 485 490 495 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp 500 505 510 Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr Ala Leu Pro His Glu Gly Ser 515 520 525 Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val 530 535 540 Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala 545 550 555 560 <210> 253 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DAFss-CD80ECD-CD16GPI <400> 253 Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly 1 5 10 15 Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Val Ile 20 25 30 His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His 35 40 45 Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys 50 55 60 Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser 85 90 95 Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys 100 105 110 Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala 115 120 125 Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser 130 135 140 Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu 165 170 175 Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu 180 185 190 Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His 195 200 205 Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr 210 215 220 Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Val Ser 225 230 235 240 Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu 245 250 255 Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val 260 265 270 Lys Thr Asn Ile 275 <210> 254 <211> 533 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DAFss-IL7-DAF <400> 254 Met Ala Thr Thr Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Gly Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys 20 25 30 Leu Pro Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 35 40 45 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 50 55 60 Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His 65 70 75 80 Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg 85 90 95 Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 100 105 110 His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr 115 120 125 Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro 130 135 140 Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu 145 150 155 160 Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys 165 170 175 Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Cys Gly Leu Pro Pro 180 185 190 Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro 195 200 205 Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile 210 215 220 Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser 225 230 235 240 Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu 245 250 255 Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro 260 265 270 Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu 275 280 285 Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser 290 295 300 Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu 305 310 315 320 Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala 325 330 335 Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr 340 345 350 Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro 355 360 365 Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp 370 375 380 Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser 385 390 395 400 Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser 405 410 415 Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro 420 425 430 Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val 435 440 445 Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr 450 455 460 Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr 465 470 475 480 Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr 485 490 495 Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser 500 505 510 Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr 515 520 525 Met Gly Leu Leu Thr 530 <210> 255 <211> 1823 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic EF-1a promoter with miRs <400> 255 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccact gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgacatgg tacagttcaa tggtggtttt 1020 ggccactgac tgaccaccat tgctgtacca tgtcaggaca caaggcctgt tactagcact 1080 cacatggaac aaatggccca cattggtgcc ggatgaagct cttatgttgc acggtcatct 1140 ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgtcag tctgttcatc ttctggcgtt ttggccactg 1200 actgacgcca gaaggaacag actgacagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 1260 acaaatggcc gttgccggag tcttggcagc gagagatcac tatcaactaa ctggaggctt 1320 gctgaaggct gtatgctgaa gcgtgaagtg aatcaacggg ttttggccac tgactgaccc 1380 gttgatactt cacgcttcag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg 1440 ccgtgttaat tgtccatgta gcgaggcatc cttatggcgt ggctggaggc ttgctgaagg 1500 ctgtatgctg gcagtatcct agtacattga cgttttggcc actgactgac gtcaatgtta 1560 ggatactgcc aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggccgctttt 1620 ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg 1680 agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg 1740 ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt 1800 ttcttccatt tcaggtgtcg tga 1823

Claims (282)

  1. 하기를 포함하는, 복제 불능 재조합 레트로바이러스:
    A. 하나 이상의 바이러스 외피 폴리펩티드;
    B. T 세포에서 활성인 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서 하나 이상의 전사 단위가 다음을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드:
    i. 림프구 증식성 요소(lymphoproliferative element)를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드로서, 림프구 증식성 요소가 Jak 경로를 활성화할 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 사이토카인 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편이 T 세포의 증식 및/또는 생존을 촉진하며, 사이토카인 수용체 폴리펩티드가 구성적으로 활성인 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 폴리펩티드; 및
    ii. 항원-특이적 표적화 영역, 막횡단 도메인, 및 세포내 활성화 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 제2 조작된 신호전달 폴리펩티드; 및
    C. 그의 표면 상에 있는 활성화 요소로서, 막 부착 서열에 융합되고, 휴지기 T 세포의 표면에서 CD3에 결합하고 휴지기 T 세포를 활성화시킬 수 있는 항체이고, 재조합 레트로바이러스에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되지 않는, 활성화 요소.
  2. 제1항에 있어서, 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드가 재조합 레트로바이러스의 게놈 내에서 바이러스 LTR, 또는 이의 활성 단편에 대해 역 배향으로 인코딩되는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 프로모터의 적어도 하나가 복제 불능 재조합 레트로바이러스를 생산하는데 사용되는 패키징 세포주에서는 활성을 띠지 않는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 프로모터의 적어도 하나가 EF1a 프로모터, MSCV 프로모터, 또는 CD3z 프로모터인 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인트론을 더 포함하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 인트론이 shRNA 또는 하나 이상의 miRNAs를 인코딩하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  7. 제5항에 있어서, 인트론이 EF1a 인트론인 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 전사 단위의 제1 전사 단위가 인트론을 더 포함하고, 여기서 하나 이상의 프로모터 중 적어도 하나, 인트론, 및 제1 전사 단위의 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 재조합 레트로바이러스의 게놈 내에서 바이러스 LTR, 또는 이의 활성 단편에 대해 역 배향으로 존재하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  9. 제1항에 있어서, Jak 경로를 활성화할 수 있는 신호전달 도메인이 Stat3 경로, Stat4 경로, 또는 Stat5 경로를 활성화시키는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
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  13. 제1항에 있어서, 구성적으로 활성인 사이토카인 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편이 243번 위치에 아미노산 PPCL의 삽입을 갖는 서열번호: 229의 아미노산 229 내지 292를 포함하는 돌연변이된 IL-7 수용체의 기능적 단편인 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 림프구 증식성 요소가 인식 도메인과의 융합이고, 여기서 인식 도메인이 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 구성원의 세포외 도메인 또는 이의 에피토프를 인식하는 항체에 의해 인식되는 폴리펩티드를 포함하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  15. 제1항에 있어서, 림프구 증식성 요소의 발현이 생체 내 제어 요소에 의해 조절되는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  16. 제1항에 있어서, 활성화 요소가 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  17. 제16항에 있어서, CD3에 결합할 수 있는 항체가 이종성 GPI 앵커 부착 서열(heterologous GPI anchor attachment sequence)에 융합되고 CD28에 결합할 수 있는 막-결합 폴리펩티드가 이종성 GPI 앵커 부착 서열에 융합되는 CD28에 결합할 수 있는 폴리펩티드이고, 재조합 레트로바이러스가 상기 재조합 레트로바이러스의 표면에 막-결합된 사이토카인을 추가로 포함하고, 상기 막-결합된 사이토카인이 IL-7 및 DAF의 융합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 융합 폴리펩티드가 서열번호: 107의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
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  19. 제1항에 있어서, 항-CD3 항체가 GPI-고정된(anchored) 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  20. 제1항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 외피 폴리펩티드 중 하나가 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV-G) 외피 단백질, 고양이 내인성 바이러스(RD114) 외피 단백질, 홍역 바이러스(Measles Virus) F 폴리펩티드, 또는 홍역 바이러스 H 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
  21. 제1항에 있어서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스가 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스인 것인, 복제 불능 재조합 레트로바이러스.
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  23. T 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, T 세포를 생체 외에서 제1항에 따른 복제 불능 재조합 레트로바이러스와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 것을 포함하고, 상기 접촉이 T 세포에 대한 복제 불능 재조합 레트로바이러스의 융합을 촉진하여 유전적으로 변형된 T 세포를 생산하는 것인, 방법.
  24. T 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, T 세포를 생체 외에서 복제 불능 재조합 레트로바이러스와 접촉시켜 형질도입 반응 혼합물을 형성하는 것을 포함하고,
    여기서 복제 불능 재조합 레트로바이러스가:
    a) 하나 이상의 바이러스 외피 폴리펩티드;
    b) CD3에 결합할 수 있는 막-결합 항체; 및
    c) T 세포에서 활성인 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 전사 단위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 하나 이상의 전사 단위가 림프구 증식성 요소를 포함하는 제1 조작된 신호전달 폴리펩티드를 인코딩하고, 림프구 증식성 요소가 Jak 경로를 활성화할 수 있는 신호전달 도메인을 포함하는 사이토카인 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 사이토카인 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편이 T 세포의 증식 및/또는 생존을 촉진하며, 사이토카인 수용체 폴리펩티드가 구성적으로 활성인 돌연변이된 IL-7 수용체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 접촉이 T 세포가 형질도입 반응 혼합물로부터 세척되기 전에 15분과 14시간 사이 동안 일어나고,
    상기 접촉이 T 세포에 대한 복제 불능 재조합 레트로바이러스의 융합을 촉진하여 유전적으로 변형된 T 세포를 생산하는 것인, 방법.
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