CN117813378A - 用于通过免疫细胞展示进行体内蛋白酶谱分析的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
极大关注的是开发用于鉴定蛋白水解底物的策略。合成肽文库是最广泛用于筛选基于底物的活性的技术之一，然而，这种技术受到文库大小的限制，并且是耗时的。若干种组合的基于文库的展示技术，如噬菌体展示、细菌展示和酵母展示，可以通过对特异性底物进行较高通量测序和富集经多轮选择来鉴定出更好的蛋白酶活性底物。尽管这些谱分析技术提供了对蛋白酶切割型底物的更大覆盖，但此类细胞不太能够进入难以递送的位点、存在免疫原性问题，并且尚未应用于在体内区分中靶活性与脱靶活性。本文中公开了用于筛选蛋白酶底物的体外和体内方法。
Description
关于联邦资助研究的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号CA237210和HD091793在政府支持下进行的。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术
蛋白水解平衡的调节异常通常与疾病相关，并且可以指示包含癌症、自身免疫性疾病、炎症和其它疾病在内的疾病进展。蛋白水解是一种不可逆的调节机制，并且已知选择性地切割特异性底物。这些肽底物的鉴定已成为推动用于早期疾病检测的生物标志物的开发和用于更安全的癌症疗法的新药物设计的有力工具。例如，许多蛋白酶参与细胞死亡和组织重塑上游的过程，所述细胞死亡和组织重塑最终导致疾病负担，这从而产生了用于通过利用如PET探针等细胞毒性蛋白酶颗粒酶B(GzmB)和尿液生物标志物来进行早期癌症检测的基于活性的策略。另外，癌症治疗的不期望的中靶/脱肿瘤毒性与大多数临床应答有关。这种毒性激发了几种被设计为前药、前体、掩蔽细胞因子和T细胞双特异性的癌症疗法，所述前药、前体、掩蔽细胞因子和T细胞双特异性在非靶标器官中被屏蔽，并且可在存在肿瘤相关蛋白酶的情况下激活。鉴于蛋白酶活性用于诊断性和治疗性应用的用途，需要通过开发用于筛选和鉴定在实际病理部位中被蛋白酶选择性地切割的底物的策略来解决以上提到的前述问题。
发明内容
本公开涉及经工程化的蛋白酶激活型受体以及其制造方法和用途。
一方面，本文中公开了经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。在其它实施例中，所述经工程化的受体包括嵌合抗原受体(CAR)或合成Notch(synNotch)受体。
此外，公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为细胞外表面受体。在一些实施例中，所述抗原结合受体为抗人表皮生长因子2(αHER2)单链可变片段(scFv)受体或抗表皮生长因子受体(αEGFR)scFv受体。在其它实施例中，所述抗原结合受体为CAR，所述CAR包含但不限于靶向CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD22、CD33、CD38、NCAM1、CD5、CD70、MET、Muc1、L1CAM、CD44 SLAMF7、EPHA2、GPC3、间皮素或PDCD1、抗前列腺特异性抗原(PSA)受体、抗前列腺干细胞抗原(PSCA)受体或抗可变重链重结构域(αVHH)的CAR。
在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个氨基酸。在一个实例中，在一些方面中，所述掩蔽肽包括SEQ ID NO:1-4。在另一个实例中，所述掩蔽肽包括HER2肽。
本文中还公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施例中，所述连接肽包括蛋白酶切割型肽。在其它实施例中，所述蛋白酶切割型肽包括SEQ ID NO:5-7。
在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中信号转导复合物包括CD8α信号传导肽、细胞外Notch核和膜旁Notch核。在一些实施例中，所述CD8α信号传导肽包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。在其它实施例中，所述细胞外Notch核包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。在一些实施例中，其中所述膜旁Notch核包括SEQ ID NO:12。
本文中还公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜结构域为跨膜Notch核。在一些实施例中，所述跨膜Notch包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞内转录因子激活报告基因。在一些实施例中，所述转录因子包括Gal4-VP64转录因子。在一些实施例中，所述报告基因包括荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、海葵(Discosoma striata)(DsRed)、mCherry、mOrange、tdTomato、mStrawberry、mPlum、光激活型GFP(PA-GFP)、Venus、Kaede、单体kusabira orange(mKO)、Dronpa、增强型CFP(ECFP)、Emerald、用于能量转移的青色荧光蛋白(CyPet)、超级CFP(SCFP)、Cerulean、光切换型CFP(PS-CFP2)、光激活型RFP1(PA-RFP1)、光激活型mCherry(PA-mCherry)、单体蓝绿色荧光蛋白(mTFP1)、Eos荧光蛋白(EosFP)、Dendra、TagBFP、TagRFP、增强型YFP(EYFP)、Topaz、Citrine、用于能量转移的黄色荧光蛋白(YPet)、超级YFP(SYFP)、增强型GFP(EGFP)、Superfolder GFP、T-Sapphire、Fucci、mKO2、mOrange2、mApple、Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV-TK)和/或碘化钠同向转运体(NIS)。
本文中公开了免疫细胞，其包括前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体。在一些实施例中，所述免疫细胞为T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括蛋白酶底物文库。在一些实施例中，所述文库包括随机3个、4个、5个或6个氨基酸肽。
本文中还公开了一种筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体外方法，所述方法包括：a.将表达靶抗原的癌样品与以下一起培养：i)免疫细胞，所述免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子；其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、蛋白酶底物、抗原结合受体和信号转导复合物；以及ii)蛋白酶；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与所述癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；以及b.检测报告基因的表达。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过测序鉴定所述蛋白酶底物的序列。在其它实施例中，所述方法进一步包括连续进行所述筛选2次、3次、4次或5次，并且每个后续次仅使用来自前一轮次的序列的前10％。
在一些方面中，本文中公开了一种根据前述方面中任一项所述的筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体外方法，其中所述蛋白酶底物文库中的任一者包括3个、4个、5个或6个随机氨基酸接头。
本文中公开了一种监测受试者中的癌症(例如实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤)的方法，所述方法包括施用经工程化的细胞，所述经工程化的细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子。在一些方面中，本文中公开了一种根据前述方面中任一项所述的监测癌症的方法，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。在一些方面中，蛋白酶切割所述连接肽，以允许所述经工程化的细胞与癌细胞之间发生相互作用。在一些实施例中，所述相互作用涉及将所述经工程化的细胞的所述抗原结合受体与所述癌细胞的表面抗原结合。在其它实施例中，所述相互作用激活所述细胞内转录因子和报告基因的表达。在一些方面中，所述经工程化的细胞为经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞)。
本文中还公开了本文中公开了筛选蛋白酶底物以监测癌症(例如，实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤)中的失调的蛋白酶的体内方法，所述方法包括步骤：a)获得包括蛋白酶激活型受体(CAR或synNotch受体)的经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞)，所述经工程化的免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库和抗原结合受体；b)将所述经工程化的免疫细胞转移到表达靶抗原的携带肿瘤的小鼠体内；其中肿瘤微环境是蛋白酶富集的；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；其中所述靶标的结合进一步使肿瘤组织解离；以及c)检测所述报告基因的表达。本文公开了筛选蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体内方法，所述方法包括步骤：a)获得包括蛋白酶激活型受体(CAR或synNotch受体)的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库和抗原结合受体；b)将所述经工程化的免疫细胞转移到表达靶抗原的携带肿瘤的小鼠体内；其中肿瘤微环境是蛋白酶富集的；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；其中所述靶标的结合进一步使肿瘤组织解离；以及c)检测所述报告基因的表达。在一些方面中，所述方法可以包括通过测序(包含但不限于下一代测序(NGS))鉴定蛋白酶的序列。
在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的筛选蛋白酶底物以监测失调的蛋白酶的体内方法，所述方法进一步包括对报告基因的表达进行性分选。
本文中还公开了根据前述方面中任一项所述的筛选蛋白酶底物以监测失调的蛋白酶的体内方法，所述方法进一步包括检测表达报告基因的细胞并且通过阴性选择对所述细胞进行分选。
本公开的另外的方面和优点将部分地在随后的具体实施方式和任何权利要求中进行阐述，并且将部分地衍生自具体实施方式，或可以通过本公开的各个方面的实践了解到。下面描述的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应理解，前述一般描述和以下具体实施方式两者仅是示例性和解释性的并且并不限制本公开。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图展示了本公开的某些实例，并且与描述一起用于解释本公开的原理，但不限于本公开的原理。贯穿附图，类似附图标记指代相同元件。
图1示出了用于开发用于体外和体内鉴定肽底物的T细胞展示平台的整体研究。经工程化的T细胞展示呈现了数百万个经基因编码的底物序列文库。这些T细胞展示在体内贩运到疾病部位。经工程化的T细胞表达掩蔽肽，以阻断抗原结合位点，这些接头然后被反应性T细胞和肿瘤蛋白酶切割。抗原结合然后使得能够选择蛋白酶激活的T细胞，并且随后通过NGS和数据分析回收蛋白酶底物，以确定获胜序列。
图2示出了用于研究经过掩蔽的synNotch T细胞展示的整体方法。
图3A示出了蛋白酶致动的T细胞构建体和设计的经工程化的蛋白酶激活型T细胞展示(3A)示意图。掩蔽肽阻断抗原结合位点，并且被特定蛋白酶切割以暴露抗原结合，并且然后激活synNotch报告基因。图3B示出了流动染色，其示出了用Thrb切割型接头编码的蛋白酶致动的T细胞在与Thrb或Thrb抑制剂(比伐卢定(bivalirudin))一起在37℃下温育30分钟或不温育的情况下的HER2抗原结合(使用HER2-生物素+链霉亲和素-APC)。图3C示出了直方图，其示出了与MDA-MB-468表达HER2的细胞共温育的蛋白酶致动的T细胞在与Thrb或比伐卢定一起在37℃下温育24小时或不温育的情况下的BFP表达。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正(Tukey post-test and correction)，描绘了平均值±SEM，n＝3个生物独立孔)。
图4A和4B示出了热图，其总结了对定义底物的蛋白酶切割。(4A)合成肽荧光产生探针(温育30分钟)和(4B)蛋白酶致动的T细胞(与蛋白酶和MDA-MB-468HER2+一起温育24小时)的蛋白酶感测活性的比较。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±SD，n＝3个生物独立孔)。
图5示出了T细胞展示文库、筛选以及NGS和分析的示意图。
图6A和6B示出了T细胞文库的3聚体接头的传代(6A)。对3聚体接头的文库进行基因编码以产生文库大小为8,000个氨基酸序列的蛋白酶激活型αEGFR CAR T细胞展示的示意表示。通过NGS研究了所产生的文库，其显示出文库大小为3,943个氨基酸序列。(6B)通过T细胞展示对Thrb蛋白酶的多轮筛选。条形图，其显示了每轮筛选中报告基因激活的细胞的百分比。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±SD，n＝3)。
图7A示出了Thrb底物的体外筛选(7A)。蛋白酶激活型αEGFR CART基因编码含有针对Thrb筛选的3聚体随机接头的蛋白酶切割型接头的文库的示意图。通过NGS鉴定了经激活的细胞的蛋白酶底物序列。图7B示出了筛选中发现的唯一序列的读段计数频率。图7C示出了序列一致性的肽测序的传代(Thrb处理的经分选的细胞)的比对。图7D示出了在荧光产生测定中验证了来自筛选的唯一序列(Δ频率>0；LVSPRSG(SEQ ID NO:20)和Δ频率<0；LVSFPSG(SEQ ID NO:21)、LVQNLSG(SEQ ID NO:22)的切割活性。
图8示出了T细胞展示文库、分离、分选以及NGS和分析的示意图。
图9A-9D示出了建立的表达人HER2抗原的鼠E0771乳腺癌细胞。图9A示出了不同HER2表达水平的HER2代抗原表达型E0771乳腺癌细胞的示意图。直方图示出了用αHER2-FITC染色得到的每种经分选的克隆的HER2抗原的不同表达水平。图9B示出了基于靶抗原密度的不同synNotch报告基因激活水平。BFP报告基因在24小时温育后在αHER2 synNotch与E0771癌细胞上的HER2抗原结合时的表达水平。数据表示为平均值±S.D(n＝3)。图9C示出了人HER2表达型E0711在B6相对于B6-Tg(WapHER2)小鼠中的肿瘤生长生长曲线。图9D为肿瘤接种21天后，从携带E0771-HER2的小鼠中分离的人HER2抗原表达型肿瘤细胞相对于从B6-Tg(WapHER2)小鼠中分离的人HER2抗原表达型肿瘤细胞的流式图。
图10A-10C示出了体内对经过掩蔽的synNotch T细胞展示的激活。将一千万个4聚体接头的αHER2掩蔽的synNotch基因编码的文库静脉内注射到携带MDA-MB-468HER+的小鼠和健康NSG小鼠体内。(10A)接头被肿瘤蛋白酶切割，并且抗原结合然后使得能够激活BFP报告基因。过继性T细胞转移后24小时BFP+细胞在肿瘤和其它器官中的百分比的(10B)代表性流式图和(10C)条形图。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±SD，n＝3)
图11A-11C示出了-基于对synNotch报告基因进行光学成像以检测蛋白酶活性的荧光素酶。图11A示出了Gal4响应元件共表达GFP和荧光素酶构建体的示意图示。图11B示出了发光图像，并且(11C)条形图示出了蛋白水解时的synNotch激活和下游高荧光素酶表达。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±SD，n＝3个生物独立孔)。
图12A和12B示出了使用荧光素酶报告基因在体内对synNotch激活的检测。将具有荧光素酶报告基因的经工程化的T细胞转移到肿瘤的两个部位中，其中一个群组接受αHer2synNotch细胞，并且另一个群组接受具有GSGGSG接头的αHer2掩蔽的synNotch细胞。图12A示出了过继性细胞转移的荧光素酶表达动力学。图12B示出了转移24小时后小鼠的代表性荧光素酶图像和条形图。(*P<0.05，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±D，n＝3)。
图13A-13E示出了经工程化的蛋白酶激活型CAR T细胞展示(13A)。经过掩蔽的CART细胞展示设计的示意图。掩蔽肽阻断抗原结合位点，并且被特定蛋白酶切割以暴露抗原结合。关于m.CAR细胞在与Thrb或Thrb抑制剂(比伐卢定)一起在37℃下温育30分钟或不温育的情况下的EGFR抗原结合的(13B)流式染色和(13C)条形图。关于与MDA-MB-231表达EGFR的细胞共温育的m.CAR细胞在与Thrb或比伐卢定一起在37℃下温育24小时或不温育的情况下的CD69表达的(13D)流式图和(13E)条形图。(****P<0.0001，单向ANOVA以及图基后检验和校正，描绘了平均值±SEM，n＝3个生物独立孔)。
具体实施方式
提供本公开的以下描述以作为本公开在其最好的、当前已知的实施例中的促成教导。为此，相关领域的技术人员将认识到并理解可以对本文中描述的本发明的各个实施例进行许多改变，同时仍然获得本公开的有益结果。还将显而易见的是，本公开的一些期望益处可以通过选择本公开的一些特征而不利用其它特征来获得。因此，本领域的技术人员将认识到对本公开的许多修改和改编是可能的，并且在某些情况下甚至可以是期望的并且是本公开的一部分。因此，提供以下描述作为对本公开的原理的说明而不是对其的限制。
术语
在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，这些术语应当被定义为具有以下含义：
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。因此，例如，除非上下文另有明确说明，否则对“金属”的提及包含具有两种或更多种此类“金属”的实例。
在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实例包含从所述一个特定值和/或到所述另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，应理解，所述特定值形成另一个实施例。应进一步理解，所述范围中的每个范围的端点在相对于另一个端点以及独立于另一个端点两个方面都是显著的。还应理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中还被公开为除了所述特定值本身之外，还包含“约”所述值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，如本领域的技术人员适当理解的，当公开的值“小于或等于”所述值时，还公开了“大于或等于所述值”以及所述值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，以多种不同的格式提供数据，并且此数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15以及在10和15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
在本说明书和随后的权利要求中，将参考许多术语，这些术语应当被定义为具有以下含义：
“任选的”或“任选地”意味着，随后描述的事件或情形可能会或可能不会发生，并且所述描述包含所述事件或情形发生的情况及所述事件或情形未发生的情况。
“增加”可以指导致更大量的症状、疾病、组合物、病状或活性的任何变化。增加可以是病状、症状、活性、组合物以统计显著量的任何个别、中值或平均增加。因此，增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％增加，只要增加是统计上显著的即可。
“减少”可以指导致更小量的症状、疾病、组合物、病状或活性的任何变化。当利用物质的基因产物的遗传输出相对于不利用所述物质的基因产物的输出较低时，所述物质还应被理解为减少基因的遗传输出。还例如，减少可以是使得症状比先前观察到的更少的病症症状的变化。减少可以是病状、症状、活性、组合物以统计学显著量的任何个别、中值或平均减少。因此，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少，只要该减少在统计上是显著的。
“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”和“抑制(inhibition)”意指活性、应答、病状、疾病或其它生物参数的减少。这可以包含但不限于活性、应答、病状或疾病的完全消融。这也可以包含，例如，与天然或对照水平相比，活性、应答、病状或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，所述减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何量的减少。
“减少(reduce)”或所述词语的其它形式，如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”意指减少事件或特性(例如，肿瘤生长)。应当理解，这通常与某个标准或预期值有关，换言之其是相对的，但并不总是需要引用标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”意指相对于标准或对照减少肿瘤生长的速率。
“预防(prevent)”或所述词语的其它形式如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”意指阻止特定事件或特性，稳定或延迟特定事件或特性的发展或进展，或使特定事件或特性发生的机会最小化。预防不需要与对照进行比较，因为其通常比例如减少更绝对。如本文所使用的，某物可以减少但不能预防，但减少的某物也可以预防。同样，某物可以预防但不能减少，但预防的某物也可以减少。应当理解，除非另外明确指出，否则在使用减少或预防的情况下，还明确公开了其它词语的使用。
术语“受试者”是指作为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以为脊椎动物，例如哺乳动物。一方面，受试者可以为人、非人灵长类动物、牛、马、猪、犬或猫。受试者还可以为豚鼠、大鼠、仓鼠、兔、小鼠或鼹鼠。因此，受试者可以为人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医生，例如医师的治疗下的受试者。
“组合物”是指具有有益生物作用的任何药剂。有益生物作用包含：治疗作用，例如，治疗病症或其它不期望的生理病状；和预防作用，例如，预防病症或其它不期望的生理病状。所述术语还涵盖本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的药理学上活性的衍生物，包含但不限于载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前体药剂(proagent)、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时，或者当具体鉴定特定组合物时，应当理解，所述术语包含组合物本身以及药学上可接受的药理学上活性的载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
“转录因子”是指通过与特异性DNA序列结合来控制遗传信息从DNA转录到信使RNA的速率的序列特异性DNA结合蛋白。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框能够在转录和转译后对特定多肽或蛋白质进行编码。本文所述的任何多核苷酸序列都可以用于鉴定其所缔合的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域的技术人员已知的，其中一些方法在本文进行了描述。
“包括”旨在意指组合物、方法等包含所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应当意指包含所叙述的要素，但排除对组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载剂，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由…组成”应意指排除多于痕量要素的其它成分和用于施用本公开中提供和/或要求保护的组合物的大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本公开的范围内。
“对照”为在实验中用于比较目的的替代受试者或样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。
“治疗剂”是指具有有益生物作用的任何组合物。有益生物作用包含：治疗作用，例如，治疗病症或其它不期望的生理病状；和预防作用，例如，预防病症或其它不期望的生理病状。所述术语还涵盖本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的药理学上活性的衍生物，包含但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当具体鉴定特定药剂时，应当理解，所述术语包含药剂本身以及药学上可接受的药理学上活性的盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
术语“检测(detect)”或“检测(detecting)”是指出于感知物理现象的目的而释放的输出信号。环境中的事件或变化被感测到，并且信号输出以光的形式释放。
术语“癌症”用于描述任何赘生性疾病，并且不限于上皮赘生物(表面和腺癌；如鳞状癌或腺瘤)。其在此用于描述实体瘤和血液恶性肿瘤两者，包含上皮(表面和腺)癌、软组织和骨肉瘤、血管瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包含子代。还应理解，由于有意或无意突变，所有子代可能在DNA内容方面不完全相同。包含了具有如进行筛选的与经原始转化的细胞中的功能或生物活性相同的功能或生物活性的变体子代。本公开中使用的“宿主细胞”通常为原核宿主和真核宿主。
“T细胞”是指作为免疫系统中最重要的白细胞之一的淋巴细胞类型。T细胞可以通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其它淋巴细胞区分开。T细胞的免疫介导的细胞死亡功能由两种亚型执行：CD8+“杀伤”T细胞和CD4+“辅助”T细胞。
“生物传感器”或“传感器”是指可以检测分析物或靶分子的细胞、蛋白质、核酸或生物模拟聚合物。这些传感器适用于体外和体内应用。这些传感器还通过半渗透性屏障或聚合物基质封装或限制，以将感测细胞或大分子物理地或化学地限制到支架或膜上。
如本文所用，“多肽”或“肽”是指氨基酸的聚合物，并且不暗示氨基酸的聚合物的特定长度。因此，例如，术语肽、寡肽、蛋白质、抗体和酶包含在多肽的定义内。此术语还包含具有表达后修饰，如糖基化(例如，添加糖)、乙酰化、磷酸化等的多肽。
“氨基酸”在本文中用于指代具有以下通式的化合物：NH2-CRH COOH，其中R，基侧链，为H或有机基团。其中R是有机的，R可以变化，并且是极性的或非极性的(即，疏水性的)。贯穿本申请使用以下缩写：A＝Ala＝丙氨酸，T＝Thr＝苏氨酸，V＝Val＝缬氨酸，C＝Cys＝半胱氨酸，L＝Leu＝亮氨酸，Y＝Tyr＝酪氨酸，I＝Ile＝异亮氨酸，N＝Asn＝天冬氨酸，P＝Pro＝脯氨酸，Q＝Gln＝谷氨酰胺，F＝Phe＝苯丙氨酸，D＝Asp＝天冬氨酸，W＝Trp＝色氨酸，E＝Glu＝谷氨酸，M＝Met＝甲硫氨酸，K＝Lys＝赖氨酸，G＝Gly＝甘氨酸，R＝Arg＝精氨酸，S＝Ser＝丝氨酸，H＝His＝组氨酸。除非另有指示，否则本文中所用的术语“氨基酸”还包含仍然保留通式的氨基酸衍生物。
术语“相互作用”是指两个或更多个物体在有或没有物理接触的情况下对彼此产生影响时发生的动作。就生物相互作用而言，细胞、蛋白质和其它大分子可以对彼此具有所述影响以影响影响生物功能，如细胞/肿瘤生长、细胞死亡和细胞信号传导通路。
术语“筛选”是指特别用于药物发现的方法，在所述方法中数据处理/控制软件、液体搬运装置和敏感检测器可以允许快速进行化学、遗传或药理学测试。此过程允许快速地识别活性化合物、抗体或调节特定生物分子通路的基因。这些过程的结果提供了药物设计的起点。
如本文所用，“模拟表位”是指模仿表位的结构或另一种蛋白质上的所靶向的结合位点的大分子，通常为肽。模拟表位分析通常用于绘制表位，鉴定药物靶标和/或揭示蛋白质相互作用网络。
如本文所用，“表达”是指来自基因的信息用于使得能够产生肽/蛋白质最终产物的功能性基因产物的合成，并且最终影响表型作为最终效果的过程。
“蛋白水解”是指蛋白质或多肽分解成更小的多肽或氨基酸。此过程在未催化的情况下可能非常缓慢，需要数百年。蛋白水解通常为由被称为蛋白酶的细胞酶执行的催化过程。这还涵盖术语“切割(cleave)”、“切割(cleavage)”和“切割型”，这些都是指肽键或氨基酸之间的键的断裂。
贯穿本申请，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现状。对于参考文献中含有的在参考文献所依赖的句子中讨论的材料，所公开的参考文献也单独且具体地通过引用并入本文。
组合物
本文中公开了用于制备所公开的组合物的组分以及在本文公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些材料和其它材料，并且应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能未明确公开这些化合物的每个不同个体以及共同组合和排列的特定提及，但各自在本文中特别考虑且描述。例如，如果公开和讨论了特定蛋白酶传感器或经工程化的T细胞，并且讨论了可能对包含蛋白酶传感器或经工程化的T细胞的许多分子进行的许多修饰，则除非具体地相反地指明，否则具体设想了蛋白酶传感器或经工程化的T细胞的每个和每一个组合和排列以及可能的修饰。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开了组合分子A-D的实例，则即使未单独叙述每种组合，也单独地且共同地设想了每种组合，这意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被视为是公开的。同样，还公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，子组A-E、B-F和C-E将被视为是公开的。此概念适用于本申请的所有方面，包含但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多种额外步骤，则应理解，可以利用所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行这些额外步骤中的每个额外步骤。
应理解，本文中公开的组合物具有某些功能。本文中公开了执行所公开功能的某些结构要求，并且应理解，存在可以执行与所公开的结构相关的相同功能的各种结构，并且这些结构将最终实现相同的结果。
除非另有明确说明，否则不旨在将本文中所阐述的任何方法解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求实际上不叙述其步骤所遵循的顺序或者在权利要求书或说明书中没有另外具体地说明步骤被限制为特定顺序的情况下，绝不旨在任何方面推断顺序。这适用于任何可能的用于解释的非表达基础，包含：相对于步骤安排或操作流程的逻辑问题；由语法组织或标点符号得出的简单含义；以及说明书中所描述的实施例的数量或类型。
用于开发早期疾病检测的生物标志物和药物设计的策略正在努力生产更安全的癌症疗法。例如，鉴定蛋白酶的肽底物提供了用于在早期阶段检测癌症进展的有力工具。蛋白水解或蛋白质的降解为由存在于所有细胞类型中的切割特异性肽底物的蛋白酶进行的不可逆机制。在疾病中，这些机制是失调的，从而导致蛋白质的异常和/过度降解。此外，蛋白水解机制的失调可能上调细胞死亡和组织重塑通路，这进一步促进癌症进展。目前的癌症治疗在肿瘤中引起中靶/脱肿瘤毒性，这促成前药、前体、掩蔽细胞因子和T细胞双特异性的发展，所述前药、前体、掩蔽细胞因子和T细胞双特异性在存在肿瘤非特异性蛋白酶下激活之后在靶向肿瘤部位时屏蔽非靶标器官。总的来说，这些努力说明需要开发用于筛选和鉴定要用于靶向和防止肿瘤部位处的蛋白酶失调的肿瘤特异性蛋白酶底物。
因此，一方面，本文中公开了一种经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子。本文中还公开了所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。
在一些实施例中，所述抗原结合受体为细胞外表面受体。在一些实施例中，所述抗原结合受体为抗人表皮生长因子受体2(αHER2)scFv受体或抗表皮生长因子受体(αEGFR)scFv受体。在其它实施例中，经工程化的受体包括嵌合抗原受体(CAR)或合成Notch(synNotch)受体。在其它实施例中，所述CAR包含但不限于包含但不限于靶向CD19、B细胞成熟抗原(BCMA)、CD22、CD33、CD38、NCAM1、CD5、CD70、MET、Muc1、L1CAM、CD44 SLAMF7、EGFR、EPHA2、GPC3、HER2、间皮素或PDCD1的CAR。在一些实施例中，所述经工程化的受体包括抗前列腺特异性抗原(PSA)受体、抗前列腺干细胞抗原(PSCA)受体或抗可变重链重结构域(αVHH)。
所述细胞外传感器为外部细胞膜蛋白，其包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。所述掩蔽肽或模拟表位为以限制或防止底物与细胞膜或另一种蛋白质的特定结合位点结合的方式设计的合成肽。所述掩蔽肽可以与结合位点结合并阻断结合位点，以防止所述底物与其靶标之间发生相互作用。掩蔽肽的一个实例为具有SEQ ID NO:1-3的人表皮生长因子受体(HER2)掩蔽肽。在一些实施例中，掩蔽肽为9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个氨基酸长。一个或多个掩蔽肽的序列的实例提供于表1中。在一些实施例中，掩蔽肽包括SEQ ID NO:1-4中的任一项的氨基酸序列或由其组成。
表1：掩蔽肽/模拟表位序列
| 说明 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 10聚体HER2肽模拟表位 | QMWAPQWGPD | 1 |
| 10聚体HER2肽模拟表位 | KLYWADGEFT | 2 |
| 12聚体HER2肽模拟表位 | LLGPYELWELSH | 3 |
| 21聚体EGFR经过掩蔽的肽模拟表位 | QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY | 4 |
连接肽为包括侧接有甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGS)间隔肽的蛋白酶切割型肽的肽。在一些实施例中，蛋白酶切割型肽包括颗粒酶B(GzmB)、凝血酶(Thrb)或基质金属蛋白酶9(MMP9)的蛋白酶底物的氨基酸序列。在一些实施例中，蛋白酶切割型肽包括如表2中所示的氨基酸序列SEQ ID NO:5-7。在其它实施例中，连接肽包括3氨基酸(3聚体)、4氨基酸(4聚体)、5氨基酸(5聚体)或6氨基酸(6聚体)蛋白酶切割型肽，其中3聚体、4聚体、5聚体或6聚体的每个残基可以包括20个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，使用含有NNK简并密码子的合成DNA以创建连接肽的文库。合成DNA的一实例为CTTGTANNKNNKNNKGTGGGG(SEQ ID NO:23)，其中N＝腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝胸腺嘧啶或鸟嘌呤。在其它实施例中，GGS间隔肽可以重复1次、2次、3次、4次或5次。在一些实施例中，间隔肽为GGSGGSGGS(SEQ IDNO:17)或GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:18)与作为阴性对照的GSGGSG间隔肽(SEQ ID NO:15)。连接肽的一个实例为GGS-XXXXX-GGS(SEQ ID NO:37)。在一些实施例中，X＝20个氨基酸中的任一个。在一些实施例中，连接肽的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在其它实施例中，凝血酶(Thrb)为已产生候选底物肽序列，以使用具有SEQ ID NO:19的通用肽序列创建Thrb特异性接头肽的靶蛋白酶。在一些实施例中，候选Thrb底物肽序列示出于表3中。
表2：蛋白酶切割型肽序列
| 说明 | 序列 | SEQ ID NO: |
| GzmB蛋白酶切割型接头 | IEFDSG | 5 |
| Thrb蛋白酶切割型接头 | LVPRGSG | 6 |
| MMP9蛋白酶切割型接头 | PLGLAG | 7 |
表3：凝血酶(Thrb)底物肽序列
| 说明 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 通用Thrb底物肽 | LVXXXSG | 19 |
| Thrb底物肽(候选物1) | LVSPRSG | 20 |
| Thrb底物肽(候选物2) | LVSFPSG | 21 |
| Thrb底物肽(候选物3) | LVQNLSG | 22 |
| Thrb底物肽(候选物4) | LVPRGSG | 6 |
信号转导复合物包含嵌入在细胞膜中或与细胞膜缔合的多种蛋白质，所述细胞膜将发生在细胞之外的蛋白酶切割活性中继到细胞内隔室。在一些实施例中，信号转导复合物包括具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的CD8α信号传导肽。在一些实施例中，信号转导复合物还包括Notch核，所述Notch核进一步包括细胞外结构域ILDYSFTGGAGRDIPPPQIEEACELPECQVDAGNKVCNLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCTQSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQLTEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCAEHVPERLAAGTLVLVVLLPPDQLRNNSFHFLRELSHVLHTNVVFKRDAQGQQMIFPYYGHEEELRKHPIKRSTVGWATSSLLPGTSGGRQRRELDPMDIRGSIVYLEIDNRQCVQSSSQCFQSATDVAAFLGALASLGSLNIPYKIEAVKSEPVEPPLPSQ(SEQ ID NO:10)或CPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLSVGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTEECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPSPGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGE(SEQ ID NO:11)、具有SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的跨膜结构域以及具有SEQ ID NO:12的膜旁结构域。信号转导复合物的组分的肽序列示出在表4中。信号转导复合物通过细胞内转录因子结合。在连接肽的蛋白水解切割时，转录因子行进到细胞核以激活报告基因。在一些实施例中，转录因子为Gal4-VP64。在其它实施例中，转录因子为tetR-VP64(tTA)。在一些实施例中，报告基因为蓝色荧光蛋白(BFP)。在一些实施例中，报告基因为荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、海葵(DsRed)、mCherry、mOrange、tdTomato、mStrawberry、mPlum、光激活型GFP(PA-GFP)、Venus、Kaede、单体kusabira orange(mKO)、Dronpa、增强型CFP(ECFP)、Emerald、用于能量转移的青色荧光蛋白(CyPet)、超级CFP(SCFP)、Cerulean、光切换型CFP(PS-CFP2)、光激活型RFP1(PA-RFP1)、光激活型mCherry(PA-mCherry)、单体蓝绿色荧光蛋白(mTFP1)、Eos荧光蛋白(EosFP)、Dendra、TagBFP、TagRFP、增强型YFP(EYFP)、Topaz、Citrine、用于能量转移的黄色荧光蛋白(YPet)、超级YFP(SYFP)、增强型GFP(EGFP)、Superfolder GFP、T-Sapphire、Fucci、mKO2、mOrange2、mApple、Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV-TK)或碘化钠同向转运体(NIS)。
表4：信号转导复合物肽序列
| 说明 | 序列 | SEQ ID NO: |
| CD8α信号传导肽(小鼠) | MASPLTRFLSLNLLLLGESIILGSGEA | 8 |
| CD8α信号传导肽(人) | MALPVTALLLPLALLLHAARP | 9 |
| 膜旁Notch核结构域 | RKRRR | 12 |
| 跨膜Notch核结构域(小鼠) | LMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS | 13 |
| 跨膜Notch核结构域(人) | LPLLVAGAVLLLVILVLGVMVA | 14 |
另一方面，本文中公开了一种免疫细胞，其包括以上公开的经工程化的蛋白酶激活型受体。在一些实施例中，所述免疫细胞为T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。在其它实施例中，所述免疫细胞包括蛋白酶底物文库。在其它实施例中，所述文库包括随机3聚体、4聚体、5聚体或6聚体氨基酸肽，其中3聚体、4聚体、5聚体或6聚体的每个残基可以包括20种氨基酸中的任一种。
治疗方法
所公开的蛋白酶激活型受体和包括所述蛋白酶激活型受体的免疫细胞(即，重组T细胞受体(TCR)T细胞、CAR T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞和/或NK T细胞)可以用于治疗蛋白酶活性不受控制的任何疾病，包含但不限于癌症。所公开的组合物可以用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下：肉瘤、母细胞瘤、如B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤等淋巴瘤；蕈样真菌病；霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)；髓系白血病(包含但不限于急性髓系白血病(AML)和/或慢性髓系白血病(CML))；膀胱癌；脑癌；神经系统癌症；头颈癌(head andneck cancer)；头颈鳞状细胞癌；肾癌；肺癌，如小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)；神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；皮肤癌；肝癌；黑色素瘤；口腔、咽喉、喉部和肺部的鳞状细胞癌；宫颈癌(cervicalcancer)；宫颈癌(cervical carcinoma)；乳腺癌，包含但不限于三阴性乳腺癌；泌尿生殖器癌；肺部癌症；食管癌；头颈癌(head and neck carcinoma)；大肠癌；造血系统癌症；睾丸癌；以及结肠癌和直肠癌。
因此，本文中公开了鉴定、监测和/或筛选受试者的癌症和/或转移(例如，实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤)的方法，所述方法包括筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶，所述方法包括：a.将表达靶抗原的癌样品与以下一起培养：i)免疫细胞，所述免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子；其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、蛋白酶底物、抗原结合受体和信号转导复合物；以及ii)蛋白酶；其中作为特异性靶标或蛋白酶的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与所述癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；以及b.检测报告基因的表达。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过测序鉴定所述蛋白酶底物的序列。在一些实施例中，所述方法进一步包括进行所述筛选至少两次、三次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次，包含但不限于2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次或25次，并且每个后续时间仅使用相对于来自前一轮次的序列的前10％。在其它实施例中，先前公开的蛋白酶底物中的任一种包括3种、4种、5种或6种氨基酸接头肽。
应当理解并且本文中设想了对蛋白酶底物进行的筛选还可以在体内发生。因此，本文中还公开了本文中公开的筛选蛋白酶底物以监测失调的蛋白酶为筛选蛋白酶底物以监测癌症(例如，实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤)中的失调的蛋白酶的体内方法，所述方法包括步骤：a)获得包括蛋白酶激活型受体(CAR或synNotch受体)的经工程化的免疫细胞(例如，经工程化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞)，所述经工程化的免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库和抗原结合受体；b)将所述经工程化的免疫细胞转移到表达靶抗原的携带肿瘤的小鼠体内；其中肿瘤微环境是蛋白酶富集的；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；其中所述靶标的结合进一步使肿瘤组织解离；以及c)检测所述报告基因的表达。本文公开了筛选蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体内方法，所述方法包括步骤：a)获得包括蛋白酶激活型受体(CAR或synNotch受体)的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库和抗原结合受体；b)将所述经工程化的免疫细胞转移到表达靶抗原的携带肿瘤的小鼠体内；其中肿瘤微环境是蛋白酶富集的；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；其中所述靶标的结合进一步使肿瘤组织解离；以及c)检测所述报告基因的表达。在一些方面中，所述方法可以包括通过测序(包含但不限于下一代测序(NGS))鉴定蛋白酶的序列。
报告基因的表达允许可以通过本领域已知的任何方法进行对筛选蛋白酶底物以监测失调的蛋白酶的检测。一方面，所述方法可以包括针对报告基因的表达进行分选。
此外，本文中公开了鉴定、监测和/或筛选受试者的癌症和/或转移(例如，实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤)的方法，所述方法包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子。在一些实施例中，所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。在一些实施例中，蛋白酶切割连接肽以允许经工程化的细胞与癌细胞之间发生相互作用。在一些实施例中，所述相互作用涉及将所述经工程化的细胞的所述抗原结合受体与所述癌细胞的表面抗原结合。在一些实施例中，所述相互作用激活细胞内转录因子和报告基因的表达，所述报告基因包含但不限于蓝色荧光蛋白(BFP)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、海葵(DsRed)、mCherry、mOrange、tdTomato、mStrawberry、mPlum、光激活型GFP(PA-GFP)、Venus、Kaede、单体kusabira orange(mKO)、Dronpa、增强型CFP(ECFP)、Emerald、用于能量转移的青色荧光蛋白(CyPet)、超级CFP(SCFP)、Cerulean、光切换型CFP(PS-CFP2)、光激活型RFP1(PA-RFP1)、光激活型mCherry(PA-mCherry)、单体蓝绿色荧光蛋白(mTFP1)、Eos荧光蛋白(EosFP)、Dendra、TagBFP、TagRFP、增强型YFP(EYFP)、Topaz、Citrine、用于能量转移的黄色荧光蛋白(YPet)、超级YFP(SYFP)、增强型GFP(EGFP)、Superfolder GFP、T-Sapphire、Fucci、mKO2、mOrange2、mApple、Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV-TK)和/或碘化钠同向转运体(NIS)。在一些实施例中，所述经工程化的细胞为经工程化的免疫细胞。在一些实施例中，癌症为实体瘤，包含但不限于上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤。
实例
为了进一步说明本公开的原理，提出以下实例，以便向本领域的普通技术人员提供完整公开和对如何制备和评估本文中所要求保护的组合物、制品和方法的描述。其旨在为本发明的纯粹实例，并且不旨在限制发明人认为其公开的范围。已努力确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，然而，应考虑一些误差和偏差。除非另外指明，否则温度为℃或在环境温度下，并且压力处于或接近大气压。存在许多变化和可以用于优化产品质量和性能的工艺条件的组合。将仅需要合理且常规的实验以优化此类工艺条件。
实例1：通过免疫细胞展示进行的体内蛋白酶谱分析
蛋白酶致动的synNotch。SynNotch受体是用于对程序化多细胞形态学、局部化肿瘤控制、多抗原肿瘤识别和肿瘤抗原密度鉴别的细胞电路系统进行工程化的有力工具。这些是展现经过掩蔽的synNotch T细胞以在生物环境中通过蛋白酶活性来控制synNotch激活以检测癌症的首次研究。
作为蛋白酶传感器的T细胞展示平台。在此，使用了广泛的专业知识以设计基于活性的纳米传感器以检测和监测疾病，以及对T细胞进行工程化以远程控制抗肿瘤活性。本实例通过利用经工程化的T细胞作为展示平台以筛选蛋白酶活性来整合这两个领域。这些T细胞展示可以对含有数百万个肽的文库进行基因编码并且还高效地将文库递送到疾病部位。
在实际体内生物环境中的筛选。尽管先前的筛选方法具有其优点，但没有一种方法在实际体内疾病条件下鉴定出蛋白酶活性底物。由于大量蛋白酶的共存以及其在许多生物通路中的不同作用，难以在复杂细胞组分池中鉴定出特异性切割产物。条件性或瞬时蛋白酶-底物相互作用还可能导致底物的假阴性发现。(例如，存在非特异性血清蛋白酶和内源性蛋白酶抑制剂)。在此，T细胞展示平台被工程化为浸润到疾病部位，并且可以在自体转移后在没有免疫原性的情况下进行中靶/脱靶选择。
实例2：方法
本文中的结果是严谨的，因为其实现了统计差异。适当的对照组被包含在内以用于比较，通过几个指标对其进行了验证，并且进行了再现。在皮下肿瘤模型中进行了筛选实验(图10)。另外，在缺乏完整免疫系统的NSG小鼠体内进行了体内T细胞展示的初步生物分布。因此，本实例通过将肿瘤接种到小鼠乳腺脂肪垫中来使用同种和异种移植原位乳腺肿瘤模型，这允许在相关环境中评估肿瘤发展，并且模拟人类的疾病过程。
研究的严谨性和作为生物学变量的性别。严谨的实验设计通过以下得以实现：对T细胞展示文库(通过NGS)和肽底物(通过荧光产生探针和荧光素酶报告基因)进行验证；使用多个复制品和小鼠模型；在复杂度增加的研究中测试这种方法；样品和动物组大小的广泛经历；统计分析；多级控制；以及在合适的情况下本质上配对的实验设计。由于乳腺癌在女性中比在男性中更常见，在女性中为在男性中的100倍，因此对这些研究使用雌性小鼠。考虑并论证了其它因素，如动物的年龄、品系和其它潜在条件的选择以及生物学变量，以确保实验严谨性。
实例3：原代T细胞中的经过掩蔽的合成Notch受体
经基因编码的展示平台，包含噬菌体展示、细菌展示和酵母展示，由于缺乏进入疾病部位的途径、免疫原性担忧以及体内未区分的中靶活性与脱靶活性而对于体内蛋白酶活性筛选的用途有限。为了克服这些限制，开发了蛋白酶致动的T细胞作为T细胞传感器以检测蛋白水解活性。经工程化的T细胞由synNotch受体组成，所述synNotch受体的结合和激活被掩蔽肽模拟表位阻断，所述掩蔽肽模拟表位通过蛋白酶切割型基序连接。研究了不同长度的肽侧接接头，以为蛋白酶感测T细胞展示平台产生高信噪比(图2)。小鼠和人源性synNotch两者分别作为同种和异种移植小鼠模型中的蛋白酶活性筛选的基准。
用于感测Thrb蛋白酶的蛋白酶致动的T细胞。用synNotch受体工程化的T细胞具有强大且高度受控的自定义行为。因此，可以利用synNotch应答程序作为蛋白酶传感器，以允许创建T细胞展示平台，以选择特异性蛋白酶底物。设计了抗人表皮生长因子受体2(αHER2)掩蔽的synNotch，其包含阻断抗原结合位点的肽(源自曲妥珠单抗(trastuzumab)的αHER2scFv，克隆4D5-7)、蛋白酶敏感性接头、Notch的核心调节区和细胞质正交转录因子(TF)、控制BFP的表达的Gal4 VP64、荧光报告基因(图3a)。衍生自不同细菌肽展示文库的掩蔽肽模拟表位LLGPYELWELSH(SEQ ID NO:3)被设计成特异性识别并阻断曲妥珠单抗的结合。为了研究经过掩蔽的synNotch设计，选择LVPRGSG(SEQ ID NO:6)肽序列作为用于与肽模拟表位连接并阻断synNotch激活的凝血酶(Thrb)切割型接头。掩蔽肽能够有效地阻断αHER2掩蔽的synNotch的抗原识别能力，然而，αHER2 scFv受体与HER2抗原的结合在很大程度上通过Thrb切割型接头的切割得到恢复，并且仍通过添加Thrb抑制剂比伐卢定(图3b)被阻断。考虑到掩蔽肽减弱了αHER2 scFv与HER2抗原的抗原结合，掩蔽肽还阻止在不存在Thrb的情况下synNotch报告基因对共培养的表达HER2抗原的MDA-MB-468乳腺癌细胞系的激活，并且随后在通过Thrb进行蛋白水解并且通过HER2+细胞进行结合刺激时展示出高BFP荧光表达(图3c)。
蛋白酶切割型荧光产生探针与经过掩蔽的synNotch的相当的蛋白酶感测活性。然后用经鉴定的底物评估经过掩蔽的synNotch，以确保每种底物都被特异性选择的蛋白酶切割。这些经过掩蔽的细胞用于感测分别在免疫应答、癌症和血栓形成中具有致病作用的蛋白酶GzmB、基质金属肽酶9(MMP9)和Thrb。这些蛋白酶彼此正交。另外，富含GS的接头(GSGGSG(SEQ ID NO:15))被设计为阴性对照。在GzmB(IEFDSG(SEQ ID NO.5))、MMP9(PLGLAG(SEQ ID NO.7))和Thrb(LVPRGSG(SEQ ID NO.6))的蛋白酶切割型接头的正交序列的情况下，仅对应蛋白酶显示出特异性切割(图4a)。经过掩蔽的synNotch设计提供了与合成肽荧光产生探针相当的报告基因激活(图4b)，所述合成肽荧光产生探针通常用于体外蛋白酶底物筛选。综上所示，这些数据显示出经过掩蔽的synNotch在蛋白酶激活的环境中被选择性地激活，并且被用作用于蛋白酶底物选择的T细胞展示平台。
用于增加蛋白酶的可及性的接头长度研究。任何筛选策略成功的关键因素是降低噪声并保留信号。为了促进高效抗原筛选，研究了额外的侧翼接头序列，以提供另外的柔性和稳定性。研究了在靶序列之间并入不同长度的间隔子的影响以增加蛋白酶的可及性。这些包含不同的重复GGS长度(GGS,GGSGGSGGS(SEQ ID NO:17)、GGSGGSGGSGGSGGS(SEQ IDNO:18))。为了对蛋白酶活性进行定量，将经过掩蔽的synNotch克隆成具有这些不同GGS间隔子长度并且转导到T细胞。通过用不同浓度的蛋白酶和温育时间来对这些经过掩蔽的synNotch细胞进行处理来确定其催化效率。最后，使用在循环血液中以高水平存在的蛋白酶(例如，凝血酶、纤溶酶、C1s)来比较脱靶切割，以对潜在背景活性进行定量。
HER2肽模拟表位掩蔽αHER2 scFv的阻断效率。已通过噬菌体展示鉴定出几种HER-2模拟表位(表5)。Riemer等人使用受限的10聚体随机肽噬菌体展示文库以鉴定曲妥珠单抗的肽模拟表位。Jiang等人鉴定出另一种在HER-2/曲妥珠单抗界面处与位于HER-2的环1与2之间的表位匹配的模拟表位。用如表5所示的这3种不同的HER2模拟表位通过非切割型富含GS的接头将经过掩蔽的synNotch克隆到慢病毒载体中以递送到人T细胞，并且对其阻断αHER2 scFv与HER2抗原结合的阻断能力进行了测试。构建了不具有掩蔽肽和接头序列的常规未掩蔽的抗原受体作为对照。为了评估不同肽模拟表位-αHER2 scFv对其靶抗原的结合能力的降低，用蛋白质L或重组HER2-Fc融合蛋白对αHER2掩蔽的synNotch T细胞进行染色。还获得了对不同αHER2 scFv结合亲和力的阻断效率(4D5-3、4D5-5、4D5-7和4D5-8 scFv，其顺序为结合亲和力增加)。最后，用在循环血液中以高水平存在的常见蛋白酶(例如，凝血酶、纤溶酶、C1s)来评估这些肽模拟表位的稳定性，并且通过对B6小鼠进行皮下免疫来检查这些肽模拟表位的免疫原性。
表5：HER2肽模拟表位列表
| 模拟表位序列 | 长度 |
| QMWAPQWGPD(SEQ ID NO:1) | 10聚体 |
| KLYWADGEFT(SEQ ID NO:2) | 10聚体 |
| LLGPYELWELSH(SEQ ID NO:3) | 12聚体 |
小鼠notch信号传导组分相对于人notch信号传导组分。为了在同种和异种移植小鼠模型中利用蛋白酶活性筛选，针对小鼠和人源性notch开发了经过掩蔽的synNotch。最初的synNotch受体存在影响其进一步推进到临床转化的已知的局限性。这些问题包含使用可能引发免疫排斥的物种不匹配组成部分。在此，基于鼠Notch1和人Notch3开发了经过掩蔽的synNotch。构建了针对HER2的经过掩蔽的synNotch，所述经过掩蔽的synNotch含有掩蔽肽模拟表位、蛋白酶切割型接头(用于文库筛选)、小鼠或人Notch核和Gal4-VP64 TF(表6)，从而将其与控制BFP报告基因的同源Gal4 DNA应答元件组合。对这些经过掩蔽的synNotch在与重组蛋白酶和HER2阳性乳腺癌细胞系共培养中进行的蛋白酶依赖性T细胞激活进行了测试。靶抗原细胞的数量和蛋白酶的浓度是不同的。另外，HER2阴性癌细胞被用作阴性对照，以证明配体依赖性信号传导。
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实例4：用于蛋白酶底物的体外选择的T细胞展示
合成肽文库是最广泛用于筛选基于底物的活性的技术之一，然而，这种技术基本上受到文库大小的限制，所述大小不可以超过104个不同氨基酸序列。因此，超过三个氨基酸的肽的随机底物文库是不完整的。合成了更大的文库大小(至多数百万个氨基酸序列多样性)，并且研究文库大小用在乳腺癌中表达的肿瘤相关蛋白酶在体外对T细胞展示的蛋白酶底物进行筛选(图5)。构建了经过掩蔽的synNotch，所述经过掩蔽的synNotch对蛋白酶切割型接头文库进行基因编码。然后，针对来自乳腺癌细胞的选定肿瘤相关蛋白酶和条件培养基对蛋白酶底物进行筛选。然后通过荧光产生测定从切割活性方面对序列进行研究。
用于针对Thrb蛋白酶的体外筛选的T细胞展示文库。为了证明经过掩蔽的T细胞展示用于在体外筛选蛋白酶底物的能力，抗表皮生长因子受体(αEGFR)掩蔽的CAR Jurkat细胞被构建为具有经过掩蔽的肽模拟表位(QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY)(SEQ ID NO:4)，所述经过掩蔽的肽模拟表位对3聚体接头文库(LVXXXSG(SEQ ID NO:19)；X任意20个氨基酸)进行基因编码，以产生8,000个氨基酸序列的预期文库大小(图6a)。将此文库克隆到慢病毒载体中。将慢病毒以有利于每个细胞一个插入事件的MOI滴定并转导到T细胞中，以在每个T细胞展示上表达单个肽底物表达。在克隆和转导期间保持密码子文库大小的至少10倍表示，以保持文库多样性。通过NGS对其质量和多样性进行研究。从所产生的文库中鉴定出相似的共有序列基序，并且将其与具有3,943个氨基酸多样性序列的理论基序进行比较(图6a)。将T细胞展示文库与抗原表达型靶细胞、内源性地表达EGFR的MDA-MB-231和Thrb蛋白酶共温育。在通过Thrb进行蛋白水解和随后与靶抗原细胞结合时观察到报告基因激活的显著增加(图6b)。对经激活的报告细胞进行的筛选和分选的多次迭代循环表明大型文库中的特异性底物的增加。每轮阳性选择后，观察到报告基因激活的细胞显著增加，这显示出Thrb特异性肽底物的富集。
通过蛋白酶激活的T细胞展示进行的体外筛选可以选择具有高特异性的候选Thrb底物。然后针对Thrb对图6中产生的文库进行筛选，并且将所述文库与抗原表达型靶细胞共温育。对于所述轮次的筛选中，对报告基因激活的细胞进行分选，以及通过NGS鉴定的蛋白酶底物序列(图7a)。通过比较经处理和未经处理的Thrb蛋白酶条件的读段计数频率，通过Δ频率分析和评估筛选中发现的所有唯一序列的读段计数频率。(图7b)。通过位置特异性评分矩阵(PSSM)方法鉴定出共有序列基序，所述共有序列基序显示出与凝血酶(XPR|SX；MEROPS数据库)的共有底物的一致性(图7c)。选择Δ频率序列(LVSPRSG(SEQ ID NO:20))的靠前的正数和靠前的负Δ频率序列(LVSFPSG(SEQ ID NO:21)和LVQNLSG(SEQ ID NO:22))，以通过荧光产生测定研究切割活性(图7d)。这些底物序列利用每个在末端处含有淬灭剂荧光团对(例如，5-FAM/Dabcyl)的肽合成，并且然后与Thrb一起温育。靠前的命中序列(LVSPRSG)(SEQ ID NO:20))显示出的切割活性比原始Thrb切割型序列设计(LVPRGSG(SEQID NO:23))的切割活性更高。
肽文库编码的经过掩蔽的synNotch T细胞展示。使用含有编码每个X位残基处的所有20个氨基酸的NNK简并密码子(其中N＝A/G/C/T并且K＝T/G)的合成DNA，利用具有包含3聚体、4聚体、5聚体和6聚体的不同文库大小的蛋白酶敏感性接头的随机化文库构建T细胞展示(表8)。合成简并寡核苷酸文库，并且将其与含有经过掩蔽的synNotch的慢病毒转移质粒的基因位点直接连接。将质粒连接产物转化到细菌中，然后进行扩增，并且用于产生慢病毒。将慢病毒以有利于每个细胞一个插入事件的MOI滴定并转导到原代人T细胞中，以在每个T细胞展示上产生单个底物表达。提取T细胞展示文库的gDNA，并且通过NGS(因美纳MiSeq(Ilumina MiSeq)上的2x 150bp配对端读段)研究文库的质量和多样性。使用以R编写的内部信息学流水线进行序列过滤和肽分析。应用了一些高质量过滤器：i)去除所有具有终止密码子的序列；ii)仅保留为帧内的序列；iii)bowtie 2对准映射质量应大于10。每个位置处和整个4个氨基酸窗口中的密码子频率应是统一的，并且与预期的输入合成DNA相匹配。通过将已知底物与文库以不同比率(范围为1:10至1:100,000)混合并且通过NGS对已知序列的富集进行定量来确定每个文库的检测限。
体外筛选具有肿瘤相关重组蛋白酶的蛋白酶底物。通过在HER2抗原涂覆的孔中温育来针对肿瘤相关重组蛋白酶对上面建立的文库进行筛选。靶蛋白酶包含与肿瘤微环境分泌相对应的蛋白酶。这包含由大多数癌细胞分泌并激活成纤维细胞的MMP家族的成员(MMP2、MMP8、MMP9和MMP10)和成纤维细胞激活蛋白(FAP)，以及在蛋白酶激活时触发细胞死亡通路的胱天蛋白酶的关键成员(CASP3、CASP7、CASP8、CASP9)。还使用在循环血液中以高水平存在的蛋白酶(例如，凝血酶、纤溶酶、C1s)来筛选阴性选择，以对潜在背景活性进行定量。改变蛋白酶浓度以研究报告基因激活水平，以进行活性筛选。使用蛋白酶抑制剂以展示蛋白酶依赖性报告基因激活，所述蛋白酶抑制剂包含N-乙基马来酰亚胺(胱天蛋白酶抑制剂)、二氯异香豆素(FAP抑制剂)和乙二胺四乙酸(MMP抑制剂)。基于BFP表达对经激活的T细胞展示进行的筛选和分选的多次迭代循环表明，三轮选择中的每一轮的富集都增加。将经分选的细胞进行培养，并且收集并制备经分选的文库细胞的至少10倍表示作为每次筛选的输入样品。提取经分选的细胞的gDNA，以通过NGS鉴定蛋白酶底物序列。采用位置特异性评分矩阵(PSSM)方法以鉴定蛋白酶的共有序列基序。基于PSSM衍生自哪里以对每个选定序列内的精确切割位点进行高置信度预测，通过多个序列比对产生了共有切割基序。将所获得的序列与先前发布的底物序列或MEROPS数据库中报告的序列进行比较。
用肿瘤分泌的蛋白酶体外筛选蛋白酶底物。针对来自与HER2表达型MDA-MB-468和E0771乳腺癌细胞的共培养的肿瘤分泌的蛋白酶对以上建立的文库进行筛选。将T细胞文库以不同的效应:靶标比率，包含1:1、1:5、1:10和1:20比率，以及不同的共温育时间，包含24小时、48小时和72小时，进行温育。为了测试蛋白酶感测特异性，使用了可商购获得的蛋白酶抑制剂混合物，包含丝氨酸蛋白酶(二氯异香豆素)、金属蛋白酶(二氯异香豆素)、胱氨酸蛋白酶(N-乙基马来酰亚胺)和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(胃抑素(pepstatin))。基于BFP表达对经激活的报告细胞进行分选，并且提取经分选的细胞的gDNA以通过NGS鉴定蛋白酶底物序列。还采用位置特异性评分矩阵(PSSM)方法以鉴定蛋白酶的共有序列基序。从筛选中提名靠前的底物清单。这些底物序列利用每个在末端处含有淬灭剂荧光团对(例如，5-FAM/Dabcyl)的肽合成。这些底物通过使用癌细胞培养上清液和荧光分析对催化切割效率(kcat/KM)进行定量来评估。底物的特异性通过评估蛋白酶之中的交叉切割-和血清蛋白酶(例如，补体和凝血蛋白酶)进行的脱靶切割确定。在蛋白酶之间使用单向ANOVA检验比较一式三份样品的平均荧光信号(p<0.05)。
实例5：用于小鼠乳腺癌模型中的蛋白酶底物发现的T细胞展示
由于肿瘤中包含癌细胞蛋白酶和基质细胞蛋白酶在内的大量蛋白酶的共存以及其在许多生物通路中的不同作用，难以在复杂细胞组分池中鉴定出特异性切割产物。本实例的目的是在体内小鼠模型中通过T细胞展示技术筛选蛋白酶底物，以确定所述蛋白酶底物是否可以区分中靶蛋白酶活性与脱靶蛋白酶活性，从而获得具有高选择性和特异性的更好的底物(图8)。
建立的表达人HER2抗原的鼠E0771乳腺癌细胞。为了开发临床前小鼠模型，将C57BL/6-Tg(WapHER2)转基因小鼠用作表达人HER2的同种E0771肿瘤的宿主和鼠T细胞的接受者。首先，将慢病毒编码的人HER2抗原转导到E0771乳腺癌细胞中。然后将经转导的细胞在96孔板上使用FACS Aria Fusion分选成单细胞，并且培养2-3周。通过Quantum SimplyCellularTM微珠试剂盒(图9a)针对每个克隆中细胞表面抗原分子在抗体结合能力方面的不同HER2表达水平进行了定量，并且所述表达水平被分为低、中、高表达水平。为了评估在E0771细胞上表达的Her2抗原是否结合并激活αHER2synNotch，将癌细胞与synNotch一起共培养，并且测量BFP报告基因表达。BFP表达随着E0771上的HER2表达密度的增加而增加(图9b)。然后，通过将HER2表达型小鼠E0771细胞(高表达水平)移植到C57BL/6-Tg(WapHER2)转基因小鼠体内证明了肿瘤生长动力学。由于在此转基因小鼠中对人HER2相关抗原的耐受性，肿瘤生长并表达抗原(图9c和9d)。
通过潜在阳性和阴性筛选进行的体内经过掩蔽的synNotch报告基因激活。为了证明T细胞展示在区分中靶蛋白酶活性与脱靶蛋白酶活性方面的能力，将1000万个αHer2掩蔽的synNotch T细胞文库(4聚体接头)静脉内注射到健康小鼠和携带MDA-MB-468HER2+肿瘤(皮下异种移植)的NSG小鼠体内。过继性转移24小时后，从肿瘤和其它器官，包含血液、脾、肝、肺中分离出T细胞，以分析增加的BFP表达水平。当T细胞展示出浸润到肿瘤中时，肽接头被肿瘤相关蛋白酶切割，从而导致synNotch激活和下游BFP表达的诱导(图10a)。相比于健康小鼠和携带肿瘤的小鼠的其它器官中的BFP+T展示细胞，肿瘤中存在的BFP+T展示细胞的百分比显著更高(图10b和10c)。这些数据显示，经过掩蔽的synNotch T细胞展示在蛋白酶激活的肿瘤中选择性地进行激活，并且能够用于在体内区分中靶活性与脱靶活性。
用于在体内检测synNotch激活的荧光素酶报告基因。用synNotch受体工程化的T细胞具有强大且高度受控的自定义行为。为了研究对小鼠模型中的蛋白酶活性进行体内成像的可行性，首先克隆了Gal4转录应答元件，以共表达非稳定的桡足动物GFP和萤火虫(Fluc)荧光素酶(图11a)。然后，将此报告基因与αHER2掩蔽的synNotch受体基因共转导到原代人T细胞中。将具有荧光素酶报告基因的经过掩蔽的synNotch与HER2+乳腺癌细胞系MDA-MB-468一起在有或没有经处理的蛋白酶的情况下共培养24小时。在向培养基中添加荧光素后，通过IVIS光谱CT系统测量synNotch激活时荧光素酶表达的水平。与BFP报告基因相似，具有LVPRGSG(SEQ ID NO:23)接头的经过掩蔽的synNotch诱导的synNotch激活和下游高荧光素酶发光表达与在通过Thrb进行蛋白水解和通过MDA-MB-468HER2+细胞进行刺激时未掩蔽的synNotch中的synNotch激活和下游高荧光素酶发光表达相同(图11b和c)。然后，利用荧光素酶报告基因以检测体内synNotch激活。向具有双侧侧腹肿瘤的NSG小鼠接种MDA-MB-468HER2+肿瘤。将其中荧光素酶报告基因进入到两个肿瘤部位中的经工程化的T细胞瘤内转移，其中一个群组接受αHER2 synNotch(未掩蔽的)细胞，并且另一个群组接受具有GSGGSG(SEQ ID NO:15)接头(阴性对照)的αHER2掩蔽的synNotch细胞，以分别对经激活的和未经激活的T细胞展示进行建模。在过继性转移后24小时，荧光在接受αHER2 synNotch的肿瘤中比同一动物中接受具有GSGGSG接头的αHER2掩蔽的synNotch细胞的肿瘤中明显增加(图12)。
小鼠的人乳腺癌异种移植物中的蛋白酶底物活性的体内筛选。利用上面的T细胞展示文库对HER2表达型MDA-MB-468肿瘤中的蛋白酶底物进行筛选。首先，通过将一百万个MDA-MB-468细胞接种在乳腺脂肪垫中来表征T细胞展示的肿瘤生长动力学和生物分布。肿瘤达到约100mm3后，将T细胞展示编码的文库静脉内注射(萤火虫荧光素酶报告基因)(1000万个、2000万个和5000万个细胞)到携带肿瘤的小鼠和作为对照的原初小鼠的体内。T细胞转移24小时、48小时和72小时后，通过借助于IVIS光谱CT系统获取的发光图像来跟踪迁移，并且然后从肿瘤、肺、脾、肝中采集T细胞并收集血液以分析每个器官中的细胞数量。T细胞注射剂量选自提供肿瘤中积累的最大T细胞的最小剂量。另外，所选择的时间点提供了肿瘤中的最大报告基因+T细胞数量。肿瘤中的经工程化的T细胞的数量对于决定肽文库和所注射的T细胞数量来说是重要的。使肿瘤迁移的T细胞的数量应为肽底物文库大小的至少2-5倍，以保持筛选的多样性。为了进行筛选，将T细胞展示文库注射到健康小鼠和携带肿瘤的小鼠体内。所选时间点后，对具有BFP报告基因表达的蛋白酶激活的肿瘤浸润T细胞进行分选(碧迪FacsAria II(BD FacsAria II))。从经分选的细胞中提取gDNA，并且将引物设计成与病毒转基因上的侧接文库基因位点的区粘接，并且将其直接与含有群体特异性索引序列的因美纳衔接的引物尾部连接。测序在因美纳MiSeq平台上进行((2x 150bp配对端读段)。对于每个数据集，在肿瘤中而非在健康器官中鉴定出并存在蛋白酶底物的频率排序顺序的列表。然后，采用位置特异性评分矩阵方法以鉴定蛋白酶底物特征的共有序列基序。
对C57BL/6-Tg(WapHER2)转基因小鼠体内的小鼠乳腺癌中的蛋白酶底物特征的体内筛选。由于NSG小鼠缺乏完整的免疫系统，因此在作为表达HER2的同种E0771肿瘤的宿主和鼠T细胞的接受者的C57BL/6-Tg(WapHER2)转基因小鼠中对此技术进行了进一步评估。此转基因小鼠系展示出对HER2抗原的耐受性，所述耐受性是建立表达HER2的鼠乳腺癌模型所必需的。使这些小鼠作为半合子在内部交配，并且还与B6小鼠交配以建立B6-HER2半合子。针对如以上的蛋白酶底物对鼠经过掩蔽的synNotch T细胞展示进行筛选。对经激活的T细胞进行分选，并且提取gDNA，并且然后通过NGS回收命中序列。
与乳腺癌相关的底物特征。基于以上蛋白酶底物的列表，将经基因编码的命中底物集克隆到具有如所建立的萤火虫荧光素酶报告基因的经过掩蔽的synNotch细胞中。将这些经过掩蔽的synNotch T细胞集静脉内注射到携带肿瘤的小鼠体内(每种底物编码的T细胞的单独群组中)，并且通过IVIS光谱CT监测整个小鼠体内的荧光素酶信号。在选定时间点(以上确定的)时，采集肿瘤和其它器官，包含肺、肝、脾、肾、淋巴结，并且测量荧光素酶信号。使用曼-惠特尼检验(Mann Whitney Test)在各组之间比较生物复制品的中值荧光素酶信号(p<0.05)，以确定蛋白酶底物特征集。
最后，应当理解，虽然本公开已就其某些说明性和具体方面进行了详细提供，但不应将其视为限于此，因为在不偏离所附权利要求书中定义的本公开的广泛精神和范围的情况下可以进行许多修改。
Claims (54)
1.一种经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。
2.根据权利要求1所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为细胞外表面受体。
3.根据权利要求1或2所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述经工程化的受体包括合成Notch(synNotch)受体或嵌合抗原受体(CAR)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为包括SEQ ID NO:27的抗人表皮生长因子受体2(αHER2)scFv受体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为抗表皮生长因子受体(αEGFR)scFv受体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9-21个氨基酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9个氨基酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为10个氨基酸。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为11个氨基酸。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为12个氨基酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括SEQ ID NO:1-4。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括αHER2肽或αEGFR肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为5-40个氨基酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为6个氨基酸。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为7个氨基酸。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为8个氨基酸。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为9个氨基酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽包括蛋白酶切割型肽。
19.根据权利要求18所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述蛋白酶切割型肽包括SEQ ID NO:5-7。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述信号转导复合物包括CD8α信号传导肽、细胞外Notch核和膜旁Notch核。
21.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述CD8α信号传导肽包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
22.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞外Notch核包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
23.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述膜旁Notch核包括SEQ ID NO:12。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜结构域为跨膜Notch核。
25.根据权利要求24所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜Notch核包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞内转录因子激活报告基因。
27.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述转录因子包括Gal4-VP64转录因子，所述Gal4-VP64转录因子包括SEQ ID NO:28。
28.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述报告基因包括CD69、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、海葵(Discosoma striata)(DsRed)、mCherry、mOrange、tdTomato、mStrawberry、mPlum、光激活型GFP(PA-GFP)、Venus、Kaede、单体kusabira orange(mKO)、Dronpa、增强型CFP(ECFP)、Emerald、用于能量转移的青色荧光蛋白(CyPet)、超级CFP(SCFP)、Cerulean、光切换型CFP(PS-CFP2)、光激活型RFP1(PA-RFP1)、光激活型mCherry(PA-mCherry)、单体蓝绿色荧光蛋白(mTFP1)、Eos荧光蛋白(EosFP)、Dendra、TagBFP、TagRFP、增强型YFP(EYFP)、Topaz、Citrine、用于能量转移的黄色荧光蛋白(YPet)、超级YFP(SYFP)、增强型GFP(EGFP)、Superfolder GFP、T-Sapphire、Fucci、mKO2、mOrange2、mApple、Sirius、Azurite、EBFP、EBFP2、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和/或碘化钠同向转运体(NIS)。
29.一种免疫细胞，其包括根据权利要求1至28中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体。
30.根据权利要求29所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
31.根据权利要求30所述的免疫细胞，其进一步包括位于连接肽结构域中的蛋白酶切割型底物文库。
32.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述文库包括随机3个、4个、5个或6个氨基酸肽。
33.一种筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症的失调的蛋白酶的体外方法，所述方法包括
a.将表达靶抗原的癌样品与以下一起培养：i)免疫细胞，所述免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库、抗原结合受体和信号转导复合物；以及ii)蛋白酶；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与所述癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；以及
b.检测报告基因的表达。
34.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括通过测序鉴定所述蛋白酶底物的序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述测序是下一代测序(NGS)。
36.根据权利要求33所述的方法，其进一步包括连续进行所述筛选至少2-5次，并且每个后续次仅使用来自前一轮次的序列的前10％。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶底物中的任一种包括位于接头肽中的随机3个氨基酸。
38.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶底物中的任一种包括位于所述接头肽中的随机4个氨基酸。
39.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶底物中的任一种包括位于所述接头肽中的随机5个氨基酸。
40.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶底物中的任一种包括位于所述接头肽中的随机6个氨基酸。
41.一种监测受试者的癌症的方法，所述方法包括施用经工程化的细胞，所述经工程化的细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中蛋白酶切割所述连接肽以允许所述经工程化的细胞与癌细胞之间发生相互作用。
44.根据权利要求41至43所述的方法，其中所述相互作用涉及将所述经工程化的细胞的所述抗原结合受体与所述癌细胞的表面抗原结合。
45.根据权利要求41至44所述的方法，其中所述相互作用激活所述细胞内转录因子和报告基因的表达。
46.根据权利要求41至45所述的方法，其中所述经工程化的细胞为经工程化的免疫细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述经工程化的免疫细胞为经工程化的T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
48.根据权利要求33至47所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述实体瘤为上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、母细胞瘤或黑色素瘤。
50.一种筛选蛋白酶底物以监测癌症的失调的蛋白酶的体内方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得包括蛋白酶激活型受体(CAR或synNotch受体)的经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中
所述细胞外传感器包括掩蔽肽、蛋白酶底物文库和抗原结合受体；
b.将所述经工程化的免疫细胞转移到表达靶抗原的携带肿瘤的小鼠体内；其中
肿瘤微环境是蛋白酶富集的；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；其中所述靶标的结合进一步使肿瘤组织解离；以及
c.检测所述报告基因的表达。
51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括对所述报告基因的表达进行分选。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其进一步包括检测血液或健康组织中表达所述报告基因的细胞并对所述细胞进行分选以进行阴性选择。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其进一步包括通过测序鉴定所述蛋白酶的序列。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述测序是下一代测序(NGS)。
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