CN114938632A - Mog用于引发胶质母细胞瘤治疗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种治疗胶质母细胞瘤受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括向受试者施用分子回路，所述分子回路包括结合触发型转录开关(BTTS)，所述结合触发型转录开关在与MOG结合时诱导对由GBM表达的一种或多种抗原具有特异性的一种或多种编码治疗剂。还提供了含有编码这些回路的全部或部分的序列的核酸，以及含有这些核酸的细胞、表达盒和载体。还提供了用于实施所述方法的试剂盒。

Description

MOG用于引发胶质母细胞瘤治疗的用途
交叉引用
本申请要求2020年2月24日提交的美国临时申请序列号62/980,882的权益，并且是2019年11月7日提交的国际专利申请序列号PCT/US2019/060357的部分继续申请，所有这些申请通过引用并入本文。
关于联合赞助研究的声明
本发明是在政府支持下在美国卫生研究院授予的授权号R01 CA196277、P50GM081879和R35 NS105068下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
背景技术
尽管嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经对血液恶性肿瘤患者表现出显著的治疗应答和益处(June和Sadelain，2018年6月)，但开发用于实体癌的有效CAR T疗法仍然是一个挑战，很大程度上是由于难以鉴定最佳靶表面抗原。精确的肿瘤识别受到这样的问题的限制，即非常少的抗原是真正的肿瘤特异性的，并且与正常组织的潜在的在靶但脱肿瘤的交叉反应可能导致危及生命或致命的毒性(Watanabe等人，2018)。例如，对ERBB2具有特异性的CAR T细胞诱导急性肺毒性，从而导致死亡，可能是由于识别在肺上皮上以低水平表达的ERBB2所致(Morgan等人，2010)。还已观察到经工程改造以识别实体瘤抗原的若干其它T细胞的毒性交叉反应(Johnson等人，2009；Morgan等人，2013；Parkhurst等人，2011)。第二个阻碍的问题是，即使在肿瘤特异性抗原的情况下，这些靶标通常在肿瘤细胞中异质性地表达，并且选择性地靶向它们可能允许肿瘤逃逸(通过选择抗原阴性肿瘤细胞)。因此，通常需要克服特异性和异质性的双重挑战的新的肿瘤识别策略，以创建更大的治疗窗口。
这种双重挑战的具体实例在胶质母细胞瘤(GBM)中发现。一部分GBM患者具有表达表皮生长因子受体的缺失变体III(EGFRvIII，高度肿瘤特异性表面新抗原)的肿瘤(Heimberger等人，2005；Moscatello等人，1995；Thorne等人，2016；Wikstrand等人，1997)。在先前的研究中，我们发现EGFRvIII阳性GBM可以被α-EGFRvIII CAR T细胞有效靶向(Johnson等人，2015；Ohno等人，2013)，没有肿瘤外毒性(O’Rourke等人，2017)。然而，尽管EGFRvIII阳性GBM细胞减少，但肿瘤复发，最可能是由于EGFRvIII阴性细胞的存活和再生，因为EGFRvIII是异质性表达的(O’Rourke等人，2017)。虽然存在备选的神经胶质瘤相关表面抗原(包括EphA2和IL13Rα2)作为GBM中潜在的CAR靶标，但这些抗原也在其它正常非脑组织中以可检测水平表达。因此，靶向它们可能导致肿瘤外毒性。
本公开解决了这个问题。
发明内容
提供了治疗胶质母细胞瘤(包括例如EGFRvIII阴性胶质母细胞瘤)的受试者的方法。本公开的方法涉及向受试者施用分子回路，所述分子回路包括特异性结合触发型转录开关(BTTS)，当与细胞表面上的MOG结合时，所述转录开关诱导对GBM表达的一种或多种抗原具有特异性的一种或多种编码治疗剂。还提供了含有编码这类回路的全部或部分的序列的核酸，以及含有这类核酸的细胞、表达盒和载体。还提供了用于实施所述方法的试剂盒。
附图说明
图1A-1D描绘了具有或不具有可扩散组分，以及使用EGFRvIII(-)GBM细胞上表达的引发性抗原和靶向性抗原进行抗原识别和治疗靶向的引发/杀伤回路的实例。
图2A-2B展示了在如本文所述的synNotch→CAR T细胞GBM回路中，选择性地在靶向的GBM细胞存在下，激活靶向各种抗原的synNotch受体。
图3A-3D展示了使用如本文所述的synNotch→CAR T回路在存在靶向的GBM细胞时的选择性synNotch激活和细胞杀伤。
图4描绘了含有IF/THEN回路的细胞，所述IF/THEN回路在相关结合触发型转录开关、抗原特异性治疗剂或两者处具有和不具有OR门控功能。
图5显示了组合抗原“引发-与-杀伤”回路的设计，以克服抗原异质性和肿瘤外毒性的双重挑战。
(a)标准CAR T细胞在异质肿瘤中的限制。鉴定用于胶质母细胞瘤的理想CAR抗原的主要挑战之一是使CAR T细胞靶向高度特异性且均质性表达的抗原。如果CAR T细胞针对肿瘤特异性抗原(例如EGFRvIII)，但抗原的表达是异质性的(不是在所有肿瘤细胞中)，则非抗原表达性的肿瘤细胞可逃逸治疗。另一方面，如果CAR T细胞针对在肿瘤中均质性表达但具有不完全特异性(也在一些正常细胞中表达)的肿瘤抗原，这将导致在靶、肿瘤外毒性。异质性和特异性的双重挑战固有地限制了CAR T细胞的治疗窗口。
(b)T细胞回路可以被设计为组合两种不完全但互补的抗原(一种特异性抗原和一种均质性抗原)的识别。我们的方法是使用序贯的引发-与-杀伤机制工程化改造T细胞：T细胞首先由抗原A(高度特异性抗原或组织特异性抗原)引发，以便诱导靶向抗原B的CAR的表达，其是均质的但不是必需绝对肿瘤特异性的。通过在较少约束的杀伤机制上应用特异性预过滤器，这些组合抗原识别回路可以使工程化T细胞能够克服肿瘤抗原异质性，同时还消除在靶、肿瘤外毒性。
图6显示具有α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR引发-与-杀伤回路的CD8+T细胞可在体外有效杀伤具有异质性EGFRvIII表达的U87 GBM群体。
(a)原代人CD8+T细胞用α-EGFRvIII synNotch受体和控制α-EphA2/IL13α2 4-1BBζCAR表达的相应响应元件工程化(“EphA2/IL13突变蛋白CAR”，图11a)。IL13突变蛋白是优先结合IL13Rα2的IL13的突变体形式(E13K，K105R)(Krebs等人，2014)。原代T细胞必须首先通过其synNotch受体识别EGFRvIII以引发CAR表达。引发-与-杀伤CAR T细胞应当在暴露于EGFRvIII阳性细胞时仅激活以杀伤EphA2+或IL13Rα2+靶细胞。
(b)我们使用工程化的U87 GBM细胞系模拟GBM中观察到的异质性。U87细胞天然表达两种靶抗原EphA2和IL13Rα2，但不表达EGFRvIII(U87-EGFRvIII-阴性细胞，这里也称为“靶”细胞)。我们工程化的U87细胞也表达EGFRvIII引发性抗原(U87-EGFRvIII-阳性细胞，这里也称为“引发”细胞)。我们可以通过以不同比例混合这些U87细胞来系统地产生不同水平的异质性。用不同的荧光蛋白标记肿瘤细胞，以允许追踪每种单独细胞类型的细胞存活。
(c)“引发-与-杀伤”T细胞回路能够克服肿瘤异质性。引发-与-杀伤回路利用synNotch受体来识别引发性抗原(金色)，其进而诱导识别不同杀伤抗原(蓝色)的CAR的表达。我们假设肿瘤中T细胞的局部引发可以允许杀伤缺乏引发性抗原(蓝色)的相邻肿瘤细胞。因此，特异性但异质性表达的抗原可用作良好的引发性抗原，而均质性但不绝对肿瘤特异性的抗原可用作良好的杀伤抗原。在该模型中，只要引发性抗原不被表达，表达杀伤抗原的其他正常组织将被赦免。
(d)杀伤不同的异质性肿瘤细胞比的延时分析。将具有α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR的原代CD8+人T细胞与指定的U87细胞混合物以5:1的E:T比率培养，并使用IncuCyte系统成像3天。EGFRvIII阳性引发细胞以黄色着色，而EGFRvIII阴性靶细胞以蓝色着色(T细胞未标记)。虚线示出了仅作为参考的100％靶细胞的生长。来自这些实验的数据(通过荧光测量的细胞存活率)在下面的时间过程图中被定量分析(n＝3，误差棒是SEM)。
(e)使用原代CD8+引发-与-杀伤CAR T细胞的细胞毒性测定。将图6a中描述的原代CD8+引发-与-杀伤CAR T细胞与图6b中描述的U87细胞共培养。示出了前向和侧向散射流式细胞术图(在72小时时间点)。活U87细胞落在红色门控内。当在群体内发现引发细胞时，引发-与-杀伤CAR T细胞仅杀伤U87群体，显示为U87门控中细胞的减少(代表三个实验)。作为引发/靶细胞比的函数，定量引发-与-杀伤CAR T细胞(n＝3，误差棒是SEM)。
图7显示具有α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2引发-与-杀伤回路的T细胞介导对在脑中异质性地表达EGFRvIII的U87 GBM的有效且局部的抗肿瘤应答。
(a)将U87 GBM异种移植物原位植入免疫缺陷型NCG小鼠的脑中。肿瘤含有以下三种引发/靶细胞比之一：i)100％U87(EGFRvIII阴性)靶肿瘤细胞，ii)50％/50％U87-EGFRvIII阳性(引发)和EGFRvIII阴性(靶)肿瘤细胞，和iii)100％U87-EGFRvIII阳性(引发)细胞。将肿瘤细胞工程化以表达萤光素酶以允许追踪肿瘤大小。在肿瘤植入后六天，将小鼠静脉内输注各3百万个CD4+和CD8+T细胞。T细胞表达：i)无构建体(未经转导的对照)或ii)α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR回路。
(b)通过纵向生物发光成像测定肿瘤尺寸。每个动物的各个迹线用细线示出，而平均值用粗线示出。用未经转导的T细胞进行阴性对照处理以黑色显示，用粉红色显示引发-与-杀伤CAR T细胞处理。引发-与-杀伤CAR T细胞对缺乏EGFRvIII引发的肿瘤没有影响(左图，n＝5)，但在减小肿瘤尺寸方面显示出显著改善(＊＊＊＊p<0.0001，t检验)。
(c)同时用两种肿瘤植入NCG小鼠：i)在脑中，以1:1比率包含EGFRvIII阳性U87和EGFRvIII阴性U87细胞的异质性肿瘤，ii)在侧腹中，皮下EGFRvIII阴性U87肿瘤细胞。因此，两种肿瘤都表达杀伤抗原(EphA2和IL13Rα2)，但EGFRvIII引发性抗原的表达不同。将小鼠用静脉内输注未转导的细胞(n＝6)或引发-与-杀伤CAR T细胞(n＝6)处理一次(肿瘤植入后6天)。
(d)通过萤光素酶发光测量肿瘤尺寸。引发-与-杀伤CAR T细胞以粉红色显示，而未经转导的对照T细胞以灰色显示。在用引发-与-杀伤CAR T细胞处理的小鼠中观察到对脑肿瘤大小的显著抑制(＊＊＊＊p<0.00001；t检验)，而侧腹肿瘤以与用未经转导的T细胞处理的小鼠相同的速率生长。
(e)用引发-与-杀伤CAR T细胞处理具有异质性U87(EGFRv III阳性和EGFRvIII阴性的1:1混合物)肿瘤细胞的小鼠的随时间的生物发光成像。每列表示一只小鼠；每行表示成像的时间点。
(f)在引发-与-杀伤CAR T细胞输注后两天使荷瘤小鼠安乐死。对从颅内异质性肿瘤、脾和对照侧腹肿瘤分离的T细胞进行流式细胞术。已被EGFRvIII抗原引发的工程化T细胞是GFP阳性的(CAR与GFP融合)。仅在脑异种移植物中观察到T细胞(CD3+)中GFP表达的上调，而在从侧腹肿瘤和脾分离的T细胞中未观察到。
图8显示具有α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR引发-与-杀伤回路的T细胞在小鼠中持久清除患者来源的GBM6异种移植肿瘤，尽管EGFRvIII表达为异质性。
(a)患者来源的异种移植物GBM6细胞中EGFRvIII的内源性表达是异质性的。
(b)将GBM6患者来源的异种移植细胞原位植入免疫缺陷型NCG小鼠的脑中。将肿瘤细胞工程化以表达mCherry和萤光素酶以允许追踪肿瘤大小。GBM6细胞上的EGFRvIII表达是异质性的。在肿瘤植入后十天，将小鼠静脉内输注各3百万个CD4+和CD8+T细胞。T细胞表达：i)无构建体(未经转导的对照)(n＝5)，ii)α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13α2CAR回路(n＝7)，或iii)组成型表达的α-EGFRvIII CAR(n＝6)。
(c)随时间推移的肿瘤大小(顶部行)和存活(底部行)。通过纵向生物发光成像测定肿瘤尺寸。每个动物的各个迹线用细线示出，而平均值用粗线示出。使用未转导的T细胞的阴性对照处理以黑色显示，引发-与-杀伤CAR回路处理以粉红色显示，并且常规的α-EGFRvIII CAR处理(仅为了清楚起见取平均)以紫色虚线显示。用常规α-EGFRvIII CAR T细胞处理导致早期肿瘤消退，随后在所有小鼠中复发(n＝6)，在第117天时2只小鼠肿瘤诱导死亡。相反，用引发-与-杀伤CAR T细胞处理的所有小鼠显示完全清除肿瘤(p<0.0001t检验，未转导相对于引发-与-杀伤CAR T细胞)。除了由于不相关的感染而被安乐死的两只小鼠之外，这些小鼠存活超过125天。该实验的独立重复在图13e中示出。
(d)用引发-与-杀伤CAR T细胞和常规α-EGFRvIII CAR T细胞处理的携带GBM6的小鼠的纵向生物发光成像。每列表示一只小鼠；每行表示成像的时间点。
(e)GBM6异种移植物的代表性荧光显微术显示肿瘤接种(mCherry肿瘤)后10天EGFRvIII(红色)的异质性表达。
(f)荧光显微术显示了在系统性施用synNotch-CAR T细胞后，移植的GBM6异种移植物的清除(缺少mCherry肿瘤细胞)。保留引发-与-杀伤CAR T细胞(用CD45染色，呈红色)于脑实质和脑膜中。
(g)常规α-EGFRvIII CAR T细胞处理的异种移植物的肿瘤复发(mCherry阳性肿瘤细胞)和EGFRvIII表达损失(红色)的代表性图像。
(h)引发-与-杀伤CAR T细胞处理的GBM6异种移植物的代表性共聚焦荧光显微术显示在肿瘤床(黄色)中引发的GFP+T细胞(与红色的hCD45染色剂共定位，由白色箭头指示)。引发-与-杀伤CAR T细胞在引发时表达GFP。右图。脾脏中的引发-与-杀伤CAR T细胞(红色)不表达GFP。
图9显示局部脑特异性引发-与-杀伤CAR T细胞介导有效的抗GBM应答。
(a)原代人CD8+T细胞用抗脑抗原synNotch受体和控制α-EphA2/IL13α2 4-1BBζCAR表达的相应响应元件工程化(“EphA2/IL13突变蛋白CAR”，图11a)。原代T细胞必须首先通过其synNotch受体识别脑抗原以引发CAR表达。引发-与-杀伤回路应当仅在暴露于脑时仅激活以杀伤EphA2+或IL13Rα2+靶细胞。
(b)盒须图，示出了CDH10和MOG在GTExv7中的组织样品子集上的组织特异性表达。所示的单位是从GTEx入口v7取得的对数缩放的标准化RNAseq计数(每百万的转录本)。
(c)将原代CD8+α-CDH10或α-MOG synNotch→GFP PGK BFP T细胞与亲本K562或经转导以表达小鼠CDH10或MOG或人CDH10或MOG的K562共培养。通过诱导GFP报告蛋白测量48小时暴露后的T细胞引发。FACS直方图显示仅在存在小鼠CDH10+或MOG+或人CDH10+或MOG+K562而不是K562亲本细胞的情况下诱导GFP报告蛋白(代表3个实验)。
(d)将GBM6患者来源的异种移植细胞原位植入免疫缺陷型NCG小鼠的脑中。将肿瘤细胞工程化以表达mCherry和萤光素酶以允许追踪肿瘤大小。在肿瘤植入后十天，将小鼠静脉内输注各3百万个CD4+和CD8+T细胞。T细胞表达：i)无构建体(未经转导的对照)，ii)α-MOG synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR回路(n＝6)，或iii)α-CDH10 synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR回路(n＝7)。
(e)随时间推移的肿瘤大小(顶部行)和存活(底部行)。通过纵向生物发光成像测定肿瘤尺寸。用未经转导T细胞的阴性对照处理以灰色显示，引发-与-杀伤CAR回路处理以粉红色显示。与未经转导的处理组相比，用α-MOG引发-与-杀伤CAR T细胞处理的小鼠(6只小鼠中的4只)显示出强的抗肿瘤应答(p<0.001，通过t检验伴有对多个比较的Holm-Sidak校准)并存活60天(p＝0.05，对数秩(Mantel-Cox)检验)。
(f)随时间推移的肿瘤大小(顶部行)和存活(底部行)。通过纵向生物发光成像测定肿瘤尺寸。使用未经转导的T细胞的阴性对照处理以灰色显示，引发-与-杀伤CAR回路处理以紫色显示。与未经转导的处理组相比，用α-CDH10引物和杀伤CAR T细胞治疗的小鼠(7只小鼠中的5只)显示持续的抗肿瘤应答(p<0.001，通过t检验伴有对多个比较的Holm-Sidak校准)(p<0.0001，对数秩(Mantel-Cox)检验)。
(g)将GBM6PDX肿瘤细胞植入NCG小鼠的脑和侧腹。两处肿瘤都表达杀伤抗原(EphA2和IL13Rα2)，然而引发性抗原MOG/CDH10的表达限于脑。将小鼠用静脉内输注未转导的(n＝5)或α-MOG引发-与-杀伤CAR T细胞(n＝6)或(iii)α-CDH10引发-与-杀伤CAR T细胞(n＝5)处理一次(肿瘤植入后10天)。
(h)通过萤光素酶发光测量肿瘤尺寸。α-MOG引发-与-杀伤CAR T细胞以粉红色显示，α-CDH10引发-与-杀伤CAR T细胞以紫色显示，而未经转导的对照T细胞以灰色显示。在用引发-与-杀伤CAR T细胞处理的小鼠中观察到对脑肿瘤大小的显著抑制(＊＊＊＊p<0.0001；t检验)，而侧腹肿瘤以与用未经转导的T细胞处理的小鼠相同的速率生长。
图10显示多抗原T细胞回路可用于灵活地塑造肿瘤识别。
(a)和(b).部署在此的引发-与-杀伤回路代表3个输入的AND-OR门控：当T细胞遇到引发性抗原EGFRvIII(a)或MOG(b)和任一杀伤抗原(EphA2或IL13Rα2)时，将诱导杀伤活性。
(c).假设引发-与-杀伤回路允许以围绕引发细胞(这里是EGFRvIII阳性细胞)的“杀伤半径”杀伤靶细胞。一旦T细胞离开肿瘤并且不再接受连续的引发信号，则CAR表达在几个小时的过程中衰减，从而防止在其它组织中持续的杀伤应答(Roybal等人，2016a；Roybal等人，2016b)。
(d).引发-与-杀伤CAR回路如外科般切割抗原空间以优化捕获所有肿瘤细胞，同时避免交叉反应性。这里抗原空间以3维表示，其中3个轴表示EGFRvIII或MOG作为引发性抗原，EphA2和IL13Rα2作为杀伤抗原。引发-与-杀伤CAR回路选择位于阴影粉红色体积内的肿瘤：工程化T细胞必须遇到在脑肿瘤环境中表达的EGFRvIII或MOG，以及在GBM细胞上的EphA2或IL13Rα2表达。
图11显示α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞针对U87 GBM的设计和测试。
(a)α-EphA2/IL13α2 CAR、α-EphA2 CAR和α-IL13Rα2 CAR的域架构。IL13突变蛋白是优先结合IL13Rα2的IL13的突变体形式(E13K，K105R)(Krebs等人，2014)。
(b)比较新的α-EphA2/IL13α2 CAR相对于表达α-EphA2 CAR或α-IL13Rα2 CAR的T细胞对U87野生型细胞(EphA2+IL13Rα2+)的杀伤。在测量总荧光(活细胞)随时间的IncuCyte杀伤测定中使用荧光标记的U87细胞测量杀伤(n＝3，误差棒是SEM)。在时间点24、48和72小时时，串联CAR比任一单个靶CAR更快速且有效地杀伤(p≤.0164；Tukey’s多次比较检验)。
(c)α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR有效杀伤U87细胞的50/50％EGFRvIII阳性/EGFRvIII阴性共培养物。α-EphA2/IL13α2 CAR与具有诱导α-EphA2 CAR的类似回路的T细胞在48小时后一样有效地杀伤(n＝3，误差棒是SEM，p＝不显著；t检验)。
(d)将图7a中描述的原代CD8+synNotch CAR T细胞与图7b中描述的U87细胞共培养。通过追踪与GFP报告蛋白融合的α-EphA2/IL13α2 CAR的诱导来测量在24小时和48小时暴露后的T细胞引发。FACS直方图显示在不存在引发细胞的情况下没有诱导，并且低至10％引发细胞(EGFRvIII阳性)时的显著诱导(代表至少3个独立实验)。
(e)比较与α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR共培养的U87-EGFRvIII阴性50％群体和U87-EGFRvIII阴性90％群体在48小时暴露后的相对细胞存活。在测量总荧光(活细胞)随时间的IncuCyte测定中使用荧光标记的U87细胞测量存活(n＝3，误差棒是SEM)。与U87-EGFRvIII阴性50％群体相比，U87-EGFRvIII阴性90％群体具有更高的相对细胞存活(p＝.0149；t检验)。
(f)显示α-EGFRvIII synNotch Gal4VP64受体和调节α-EphA2/IL13α2 4-1BBζCARGFP pGK BFP的相应响应元件在原代CD4+和CD8+T细胞中表达的代表性等高线图。通过存在于synNotch受体上的myc标签对synNotch受体阳性的T细胞染色，并基于BFP表达选择响应元件。将红色框象限中的T细胞分选用于体外和体内实验。
图12显示肿瘤细胞接种后第6天，50/50％EGFRvIII阳性/EGFRvIII阴性U87异种移植物的代表性免疫荧光图像。U87-EGFRvIII阳性和U87-EGFRvIII阴性细胞分别用GFP和mCherry标记，并且细胞核用DRAQ7染色。比例尺100um。参见细胞系生成的方法。
图13显示了针对GBM6测试α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞的结果。
(a)使用具有回路的原代CD8+α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞以1:1ET比率与GBM6细胞共培养进行杀伤测定。量化72小时内的相对细胞存活率，并显示synNotch CAR T细胞克服GBM6细胞群的细胞毒性能力(n＝3，误差棒是SEM)。
(b)原代CD8+α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞与或不与GBM6细胞以1:1ET比率共培养。通过追踪与GFP报告蛋白融合的α-EphA2/IL13Rα2 CAR的诱导来测量48小时暴露后的T细胞引发。FACS直方图显示在不存在GBM6细胞的情况下没有诱导，并且在有GBM6细胞情况下的显著诱导(代表至少3个独立实验)。
(c)对GBM6细胞分选不同水平的EGFRvIII表达，并在分选后通过流式细胞术进行评估。灰色表示未染色的对照。
(d)使用原代CD8+α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞、α-EGFRvIII CAR T细胞或α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞在EGFRvIII无表达、高表达或未分选表达的情况下共培养进行杀伤测定。定量72小时内的相对细胞存活，并显示α-EGFRvIIIsynNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞和α-EGFRvIII CAR T细胞不能杀伤不表达任何EGFRvIII抗原的GBM6细胞群(n＝3，误差棒是SEM)。
(e)图8c中所示的小鼠实验的独立重复(具有不同T细胞回路的GBM6PDX肿瘤处理)。
图14示出了针对GBM6测试α-CDH10 synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR和α-MOGsynNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞的结果。
(a)原代CD8+α-CDH10 synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞与U87细胞和表达或不表达小鼠CDH10的K562共培养。定量72小时内的相对细胞存活，并且仅在引发细胞表达小鼠CDH10时才显示α-CDH10 synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞杀伤U87细胞的细胞毒性能力(n＝3，误差棒为SD)。细胞群体比：1:1:1，每种10K细胞。
(b)原代CD8+α-MOG synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR T细胞与GBM6细胞和表达或不表达小鼠MOG的L929细胞共培养。量化72小时内的相对细胞存活，并且仅在引发细胞表达小鼠MOG时显示α-MOG synNotch→α-EphA2/IL13α2 CAR T细胞杀伤GBM6细胞的细胞毒性能力(n＝3，误差棒为SD)。细胞群体比：1:1:1，每种10K细胞。
(c)代表性荧光显微术图像揭示了在系统性施用α-MOG synNotch-CAR T细胞后移植的GBM6异种移植物(缺乏mCherry肿瘤细胞)的清除。在脑膜中保留引发-与-杀伤CAR T细胞(针对CD45染色)。
定义
如本文中所使用，术语“异质性”当用于提及癌症时通常是指显示某一水平的癌症内或肿瘤内异质性(例如，在分子、细胞、组织或器官水平)的癌症。异质性癌症由至少两种不同的细胞类型组成，其中不同的细胞类型可以以各种方式定义。例如，不同的细胞类型可以在基因组上不同(例如，通过在一种细胞类型中存在突变而在另一种细胞类型中不存在突变)、在转录上不同(例如，通过在一种细胞类型中表达而未在另一种细胞类型中表达的基因、通过与另一种细胞类型相比在一种细胞类型中基因的表达增强或降低等)、或蛋白组学上不同(例如，通过在一种细胞类型中表达未在另一种细胞类型中表达的蛋白质，通过在一种细胞类型中与另一种细胞类型相比蛋白质的增强或降低的表达等)。在一些情况下，可以基于癌症中存在的两种或更多种表型不同细胞的存在来鉴定癌症异质性，包括例如其中通过临床测试(例如组织学、免疫组织化学、原位杂交、细胞计量术、转录组学、突变分析、全基因组测序、蛋白质组学等)鉴定此类表型不同的细胞。
因此，如本文所定义的异质性癌症通常将包括至少一种癌细胞类型和至少一种其他细胞类型，其中所述一种其他细胞类型可以是第二癌细胞类型或非癌细胞类型。例如，异质性癌症可以包括第一癌细胞类型和第二癌细胞类型。或者，异质性癌症可以包括癌细胞类型和非癌细胞类型。尽管异质性癌症将包括至少两种不同的细胞类型，但是这类癌症不限于此，并且可以包括例如多于两种不同的细胞类型、三种或更多种不同的细胞类型、四种或更多种不同的细胞类型、五种或更多种不同的细胞类型等，其中至少一种细胞类型是癌性的，并且另外的细胞类型可以各自是癌性的或非癌性的。
如上所概况的，癌症的异质性可以通过癌症细胞的不同亚群的不同基因或蛋白质表达来定义。例如，在一些情况下，细胞的第一亚群可以表达来自未被细胞的第二亚群表达的第一基因的第一基因产物，其中这种第二细胞群可以表达或可以不表达来自限定该第二群的第二基因的第二基因产物。换句话说，在一些情况下，异质性癌症内的细胞亚群可以各自由一种或多种表达基因产物的存在或不存在(或相对水平)来定义，其中用于定义细胞类型的有用的表达基因产物可以包括但不限于生物标志物、抗原、野生型蛋白、突变蛋白、野生型转录本、突变转录本等。
在一些情况下，癌症异质性可以包括或排除受试者水平的异质性，即患者内异质性。如本文所用，术语“患者内异质性”通常是指在单个受试者中存在的多个癌症(例如多个肿瘤)之间观察到的异质性。例如，原发性肿瘤和受试者的转移可以是异质性的，例如，差异表达特定基因产物，例如生物标志物、抗原或突变蛋白。通过各种机制，包括但不限于突变、克隆扩增、转移、选择及其组合，受试者中可能出现多种异质性癌症。例如，由原发性肿瘤的转移引起的两种不同的患者内异质性癌症相对于它们所在的组织可能是异质性的。或者，源自同一原发性肿瘤的两种不同的患者内异质性癌症可能由于突变和克隆扩增而产生，其中一种癌症是另一种的亚克隆。可以产生不同的患者内异质性癌症的各种其他机制是可能的，并且落入本文使用的该术语的范围内。
在如本文使用的一些情况下，癌症异质性可以排除群体水平的异质性，即患者间异质性。如本文所用，术语“患者间异质性”通常是指在存在于不同受试者或患者的两个癌症或两个肿瘤之间观察到的差异。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等是指获得期望的药理学和/或生理效果和/或与治疗相关的应答。该效果可以在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的，和/或可以在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不利影响方面是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物特别是人类中疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退。
“治疗有效量”或“有效量”是指药剂(包括生物制剂，例如细胞)的量或两种药剂的组合量，当将其施用给哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时，足以实现对疾病的这类治疗。“治疗有效量”将根据药剂、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。
本文可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠类(例如，大鼠、小鼠)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马类、牛类、绵羊、猪类、山羊)、兔类动物等。在一些情况下，个体是人。在一些情况下，个体是非人灵长类动物。在一些情况下，个体是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。在一些情况下，个体是兔类动物，例如兔子。
本文所用的术语“难治性”是指不应答治疗的疾病或病况。关于癌症，如本文所用的“难治性癌症”是指不应答治疗的癌症。难治性癌症可在治疗开始时为抗性的或其可在治疗期间变成抗性的。难治性癌症也可称为抗性癌症。
如本文所用，术语“组织学”和“组织学的”通常是指对从多细胞生物体(包括但不限于植物和动物)获得的细胞解剖结构和/或细胞形态的显微术分析。
如本文所用，术语“细胞学”和“细胞学的”通常是指组织学的亚类，其包括对单个细胞、解离细胞、松散细胞、细胞簇等的显微术分析。细胞学样品的细胞可以是一种或多种体液中的细胞或从一种或多种体液获得的细胞或从已经解离成液体细胞样品的组织获得的细胞。
本文可互换使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指能够触发或抑制免疫细胞的激活的人工多模块分子，其通常但不排他地包含细胞外结构域(例如，配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。术语CAR不特别限于CAR分子，还包括CAR变体。CAR变体包括分裂的CAR，其中CAR的细胞外部分(例如，配体结合部分)和细胞内部分(例如，细胞内信号传导部分)存在于两个分开的分子上。CAR变体还包括ON开关CAR，其是条件可激活的CAR，例如包括分裂式CAR，其中分裂式CAR的两个部分的条件异二聚合是药理学受控的(例如，如PCT公开号WO2014/127261A1和美国专利申请号2015/0368342A1中描述的，其公开内容通过引用整体并入本文)。CAR变体还包括双特异性CAR，其包括能扩大或抑制一级CAR活性的二级CAR结合结构域。CAR变体还包括抑制性嵌合抗原受体(iCAR)，其可例如用作双特异性CAR系统的组分，其中二级CAR结合结构域的结合导致抑制一级CAR的活化。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)描述于例如PCT申请号US2014/016527；Fedorov等人Sci Transl Med(2013)；5(215)：215ra172；Glienke等人Front Pharmacol(2015)6：21；Kakarla&Gottchalk 52 Cancer J(2014)20(2)：151-5；Riddell等人Cancer J(2014)20(2)：141-4；Pegram等人Cancer J(2014)20(2)：127-33；Cheadle等人Immunol Rev(2014)257(1)：91-106；Barrett等人Annu Rev Med(2014)65：333-47；Sadelain等人CancerDiscov(2013)3(4)：388-98；Cartellieri等人，J Biomed Biotechnolo(2010)956304中；它们的公开内容通过引用并入本文中。有用的CAR还包括由慢病毒负载的CTL019(Tisagenlecleucel-T)CAR-T细胞表达的抗CD19—4-1BB—CD3ζCAR，其由Novartis(Basel，Switzerland)商业化。
术语“T细胞受体”和“TCR”可互换使用，并且通常是指在T细胞或T淋巴细胞的表面上发现的分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。TCR复合物是二硫化物连接的膜锚定异二聚蛋白，其通常由表达为与CD3链分子的复合物的一部分的高度可变的alpha(α)和beta(β)链组成。许多天然TCR以异二聚体αβ或γδ形式存在。异二聚体αβ形式的完全内源TCR复合物包括八个链，即α链(本文称为TCRα或TCRalpha)、β链(本文称为TCRβ或TCR beta)、δ链、γ链、两个ε链和两个ζ链。在一些情况下，TCR通常仅指TCRα和TCRβ链，然而由于组装的TCR复合物可与内源性δ、γ、ε和/或ζ链缔合，本领域普通技术人员将容易理解提及存在于细胞膜中的TCR可包括提及完全或部分组装的TCR复合物(在适当时)。
已经开发了重组或工程化的个别TCR链和TCR复合物。在治疗背景中提及使用TCR可以指个别的重组TCR链。因此，工程化TCR可包括个别修饰的TCRα或修饰的TCRβ链以及单链TCR，所述单链TCR包括通过连接多肽连接到单个多肽中的修饰和/或未修饰的TCRα和TCRβ链。
如本文所用，“嵌合双特异性结合成员”意指对两个不同结合配偶体(例如，两个不同抗原)具有双重特异性的嵌合多肽。嵌合双特异性结合成员的非限制性示例包括双特异性抗体、双特异性缀合单克隆抗体(mab)2、双特异性抗体片段(例如，F(ab)2)、双特异性scFv、双特异性双抗体、单链双特异性双抗体等)、双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性缀合的单域抗体、其micabody和突变体等。嵌合双特异性结合成员的非限制性实例还包括以下中所述的那些嵌合双特异性试剂：Kontermann.MAbs.(2012)4(2):182–197；Stamova等人Antibodies 2012,1(2),172-198；Farhadfar等人Leuk Res.(2016)49:13-21；Benjamin等人Ther Adv Hematol.(2016)7(3):142-56；Kiefer等人Immunol Rev.(2016)270(1):178-92；Fan等人J Hematol Oncol.(2015)8:130；May等人Am J Health Syst Pharm.(2016)73(1):e6-e13；其公开内容通过引用整体并入本文。
“生物样品”涵盖从个体或个体群体获得的多种样品类型，并且可以以各种方式使用，包括例如细胞或生物分子的分离、诊断测定等。该定义涵盖血液和生物来源的其他液体样品、固体组织样品(诸如活检标本)或组织培养物或从其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在其获得之后以任何方式被操纵的样品，例如通过混合或汇集单个样品、用试剂处理、溶解或富集某些组分，例如细胞、多核苷酸、多肽等。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。术语“生物样品”包括尿、唾液、脑脊液、间质液、眼液、滑液、血液级分如血浆和血清等。术语“生物样本”还包括固体组织样品、组织培养样品(例如，活检样品)和细胞样品。因此，生物样品可以是细胞样品或无细胞样品。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白、保留与抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、纳米抗体、单域抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，和残余的“Fc”片段，一种反映容易结晶能力的名称。肽处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原组合位点且仍能够交联抗原。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方式中，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun于The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)。
如本文所用，术语“纳米抗体”(Nb)是指来源自天然存在的重链抗体的最小抗原结合片段或单可变域(VHH)，并且是本领域技术人员已知的。它们来源自可见于骆驼科的仅重链抗体(Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363:446；Desmyter等人(2015)Curr.Opin.Struct.Biol.32:1)。在“骆驼科”家族中，发现缺乏轻链多肽的免疫球蛋白。“骆驼科”包括旧世界骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelus dromedarius))和新世界骆驼(例如Llama paccos、Llama glama、Llama guanicoe和Llama vicugna)。单域重链抗体在本文中称为纳米抗体或VHH抗体。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种试剂的可逆结合的平衡常数，并且表示为解离常数(Kd)。亲和力可比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力大至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更多。抗体与靶蛋白的亲和力可为例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)、或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更高。如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种试剂的复合物对稀释后解离的抵抗性。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中关于抗体和/或抗原结合片段时可互换使用。
术语“结合”是指两个分子之间的直接缔合，例如由于共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用。非特异性结合将指具有小于约10-7M的亲和力的结合，例如具有10-6M、10-5M、10-4M等的亲和力的结合。
结合对的一个或多个“正交(orthogonal)”或“正交化”成员从其原始或野生型形式修饰，使得正交对特异性地彼此结合，但不特异性地或实质性结合该对的未修饰或野生型组分。任何结合配偶体/特异性结合对可以是正交的，包括但不限于例如本文所述的那些结合配偶体/特异性结合对。
本文中可互换使用的术语“结构域”和“基序”是指具有一个或多个特定功能的结构化结构域以及多肽的非结构化区段，所述非结构化区段虽然非结构化但保留一个或多个特定功能。例如，结构化结构域可以包括但不限于折叠多肽中的连续或不连续的多个氨基酸或其部分，其包含有助于多肽的特定功能的三维结构。在其它情况下，结构域可包括多肽的非结构化区段，其包含多个的两个或更多个氨基酸或其部分，该非结构化区段维持展开或无序的多肽的特定功能。也包含在该定义内的是可以是无序的或非结构化的但在与靶标或结合配偶体缔合时变得结构化或有序的结构域。固有非结构化结构域和固有非结构化蛋白质的结构域的非限制性示例描述于例如Dyson&Wright.Nature Reviews MolecularCell Biology 6:197-208。
如本文所用，术语“合成”、“嵌合”和“工程化”通常是指人工衍生的非天然存在的多肽或编码多肽的核酸。合成多肽和/或核酸可以从包括例如单氨基酸、单核苷酸等的基础亚单位从头组装，或者可以衍生自预先存在的多肽或多核苷酸，无论是天然或人工衍生的，例如通过重组方法。嵌合和工程化的多肽或编码多肽的核酸通常通过将两种或更多种不同的多肽或编码多肽的核酸或多肽结构域或编码多肽结构域的核酸组合、连接或融合来构建。嵌合和工程化多肽或编码多肽的核酸包括其中连接的两个或更多个多肽或核酸“部分”来源自不同蛋白质(或编码不同蛋白质的核酸)，以及其中连接的部分包括相同蛋白质(或编码蛋白质的核酸)的不同区域但这些部分以不天然存在的方式连接。
如本文所用，术语“重组”描述核酸分子，例如基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，其由于其来源或操纵而不与天然与其缔合的多核苷酸序列的全部或部分缔合。关于蛋白质或多肽使用的术语重组意指由重组多核苷酸表达产生的多肽。关于宿主细胞或病毒使用的术语重组是指重组多核苷酸已被引入其中的宿主细胞或病毒。重组在本文中还用于指关于材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)，所述材料已通过引入异源材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)而被修饰。
术语“可操作地连接”是指并置，其中所述部件处于允许它们以其意图方式起作用的关系。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。可操作地连接的核酸序列可以但不一定是相邻的。例如，在一些情况下，可操作地连接到启动子的编码序列可以与启动子相邻。在一些情况下，可操作地连接到启动子的编码序列可以由一个或多个间隔序列(包括编码序列和非编码序列)分开。此外，在一些情况下，多于两个序列可以可操作地连接，包括但不限于例如两个或更多个编码序列可操作地连接到单个启动子。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸，化学或生化修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合物，具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基；带免疫学标签的蛋白等。
“载体”或“表达载体”是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，另一个DNA片段(即“插入物”)可以与其附接以便在细胞中复制附接的片段。
如本文所用，术语“异源”是指分别未见于天然(例如，天然存在的)核酸或蛋白质中的核苷酸或多肽序列。异源核酸或多肽可来源于与其中存在或表达该核酸或多肽的生物体或细胞不同的物种。因此，异源核酸或多肽与其所在的细胞或生物体相比通常具有不同的进化起源。
如本文所用，术语“结合触发型转录开关”或“BTTS”是指能够将细胞外部的特异性结合事件(例如，BTTS的细胞外结构域的结合)转导为细胞核内重组启动子的激活的任何多肽。许多BTTS通过释放激活启动子的转录因子来工作。在这些实施方案中，BTTS由一种或多种多肽组成，所述多肽在与抗原结合时经历蛋白水解切割以释放激活重组启动子的基因表达调节剂。例如，BTTS可包含(i)包含抗原特异性抗体的抗原结合区的细胞外结构域；(ii)包含一个或多个蛋白水解切割位点的蛋白水解可切割序列；和(iii)细胞内结构域，其中抗原结合区与抗原的结合诱导一个或多个蛋白水解切割位点处的序列的切割，从而释放细胞内结构域，并且其中细胞内结构域激活表达盒的转录。BTTS可以基于例如synNotch、A2、MESA或力受体。
在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一)以及该陈述范围中的任何其他陈述或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受制于所述范围中的任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个/种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一个/种细胞”的提述包括多个/种这样的细胞，并且对“该细胞”的提述包括对一个或多个细胞及本领域技术人员已知的其等同物的提述，等等。还应注意，权利要求可以被撰写为排除任何可选要素。因此，该陈述旨在用作结合权利要求要素的叙述使用诸如“单独”、“仅”等这样的排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
应当理解，为了清楚起见在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合被本发明具体地包含在内，并且在本文中的公开就好像每一个组合被单独地和明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也被本发明具体地包含在内，并且在本文中的公开就好像每一个这样的子组合在本文中被单独地和明确地公开一样。
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发明详述
如上所概述，本公开提供了一种治疗包括EGFRvIII阴性胶质母细胞瘤在内的胶质母细胞瘤受试者的方法。本公开的方法涉及向受试者施用分子回路，所述分子回路由MOG引发以诱导对由胶质母细胞瘤表达的一种或多种抗原具有特异性的一种或多种编码的治疗剂。该回路可以以编码分子回路的细胞、将编码回路的核酸递送到受试者细胞的载体等的形式施用。因此，还提供了含有编码这种回路的所有或部分的序列的核酸，以及含有这种核酸的细胞、表达盒和载体。还提供了用于实施所述方法的试剂盒。
主题回路整合MOG(其在本文中可称为“引发性抗原”)在脑中的表达和在GBM细胞上表达的至少第二抗原，以产生关于GBM细胞的所需结果。MOG在髓鞘中表达，并且预期在大多数脑细胞(包括GBM细胞)中表达。如本文所讨论的，许多GBM肿瘤是异质性的，因此GBM的单个细胞可以表达或可以不表达MOG。因此，在一些情况下，MOG和第二抗原可都在GBM细胞上表达。在其他情况下，MOG和第二抗原可以在肿瘤中或肿瘤上的不同细胞上表达。MOG的脑/CNS特异性表达用于限制治疗性蛋白质对脑的表达，并允许疗法整合可能在不同细胞上(即，反式)的标志物。例如，主题回路可以整合MOG抗原在位于或接近EGFRvIII阴性(“EGFRvIII(-)”)多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞的细胞上的表达和至少第二抗原在EGFRvIII(-)GBM的第二细胞上的表达，以产生对于第二细胞的所需结果。整合由异质细胞群的不同细胞表达的两种抗原以产生期望的靶向事件在本文中可称为“反式靶向”。
在一些具体实施方案中，所采用的回路可以整合称为“引发细胞”的脑中第一细胞(例如，其可以是或可以不是EGFRvIII(-)GBM细胞)的MOG表达，和称为“靶向细胞”的第二细胞(例如，GBM的附近细胞(例如，EGFRvIII(-)GBM)表达第二抗原(例如，“靶向性抗原”或“靶向抗原”或“杀伤抗原”)，以反式靶向第二细胞类型。用这种回路修饰的治疗细胞通过在第一细胞上存在引发性抗原来引发，然后靶向到靶向的细胞。
为了比较，在这种背景下顺式靶向是指整合两种抗原以靶向同时表达引发性抗原和靶向性抗原的单个细胞，以相对于该单个细胞产生期望的结果。因此，在顺式靶向中，靶向的细胞表达引发性抗原和靶向性抗原两者，使得两种抗原相对于细胞顺式表达。在反式靶向中，靶向细胞仅表达靶向性抗原而不表达引发性抗原，使得两种抗原相对于两种细胞反式表达。因此，反式靶向可用于靶向不表达引发性抗原的细胞。在一些情况下，本公开的回路可以采用反式和顺式靶向两者，即，顺式靶向和反式靶向可以组合在单个回路中。在一些情况下，本公开的回路可以仅采用反式靶向，并且可以例如排除顺式靶向。
本公开的回路通常将采用至少一个结合触发型转录开关(BTTS)，如下面更详细描述的。可以修饰治疗细胞以表达响应于引发性抗原的BTTS。BTTS可以在细胞的质膜中表达。BTTS与引发性抗原的结合可诱导蛋白质在BTTS表达细胞中的表达。被诱导的蛋白质可以是异源的抗原特异性蛋白质例如第二BTTS，或异源的抗原特异性治疗剂，如下面更详细描述的。在顺式靶向的背景下，BTTS与GBM引发细胞(例如，EGFRvIII(-)GBM引发细胞)上表达的引发性抗原的结合诱导抗原特异性蛋白的表达，所述抗原特异性蛋白对也由GBM引发细胞(例如，EGFRvIII(-)GBM引发细胞)表达的靶向性抗原具有特异性(即，GBM细胞既是引发细胞又是靶向细胞)。在反式靶向的背景下，BTTS与在脑细胞(其本身可以是或可以不是癌性GBM引发细胞)上表达的引发性抗原的结合诱导抗原特异性蛋白的表达，所述抗原特异性蛋白对在GBM细胞(例如，EGFRvIII(-)GBM细胞)上表达的靶向性抗原具有特异性。在一些情况下，GBM细胞不表达MOG。
以这种方式，反式靶向允许仅在存在引发细胞的情况下通过抗原特异性蛋白(例如抗原特异性治疗剂)靶向细胞。相应地，反式靶向允许在异质细胞群(诸如异质性癌症)中用抗原特异性蛋白(诸如抗原特异性治疗剂)靶向细胞，其中靶向细胞不表达引发性抗原，即，为引发性抗原(-)细胞。因此，此类靶向的引发性抗原(-)GBM细胞(例如，引发性抗原(-)/EGFRvIII(-)GBM细胞)可在空间上与引发性抗原阳性(“引发性抗原(+)”)GBM细胞(例如，引发性抗原(+)/EGFRvIII(-)GBM细胞)关联，即，与不表达引发性抗原的细胞相关联。
虽然本主题方法可在本文中关于EGFRvIII(-)GBM细胞(即，EGFRvIII(-)GBM引发细胞和EGFRvIII(-)GBM靶向细胞)进行描述，但在一些情况下，所述回路可用于在受试者中的GBM细胞的反式靶向的方法中，所述GBM细胞是EGFRvIII(+)细胞和/或存在于EGFRvIII阳性(“EGFRvIII(+)”)GBM中的细胞。在这种情况下，使用的引发性抗原通常不是EGFRvIII(即，引发性抗原可以是非EGFRvIII引发性抗原)。因此，本公开包括治疗受试者的方法，如下面更详细描述的，对于GBM(可以是EGFRvIII(+)或EGFRvIII(-))，其包括向受试者施用用以下遗传修饰的免疫细胞：(a)编码结合除EGFRvIII之外的引发性抗原(即，MOG)的结合触发型转录开关(BTTS)的核酸序列；(b)编码结合由GBM表达的杀伤抗原的抗原特异性治疗剂的核酸序列；(c)可操作地连接到(b)的调节序列，其响应BTTS；其中BTTS与引发性抗原的结合激活抗原特异性治疗剂的表达，所述抗原特异性治疗剂结合杀伤抗原，从而诱导对表达杀伤抗原的GBM细胞的杀伤。
方法
如上所概述的，本公开的一些实施方案提供了在异质性EGFRvIII(-)GBM中靶向引发性抗原(-)细胞的方法，包括其中这样的细胞以反式靶向。此类方法可包括向有需要的受试者施用编码响应MOG抗原的BTTS的回路，所述回路诱导抗原特异性治疗剂的表达，其中所述抗原特异性治疗剂可响应除引发性抗原之外的一种或多种抗原。当在治疗性免疫细胞上表达时，此类回路可激活免疫细胞以介导对EGFR(-)GBM肿瘤中的引发性抗原(-)/EGFRvIII(-)GBM细胞的靶向性杀伤，所述GBM肿瘤中至少一些细胞异质性地表达引发性抗原。
在许多实施方案中，GBM将位于患者的脑中。然而，在一些情况下，GBM可能已经转移到患者体内的其他组织。在任一种情况下，肿瘤应该是可治疗的，因为许多GBM异质性地表达MOG。
治疗方法
如上所概述，本公开的方法可用于治疗GBM受试者，例如EGFRvIII(-)GBM。此类治疗可包括获得关于对于MOG可能是异质性阳性的GMB肿瘤的至少一种EGFRvIII(-)GBM细胞类型(或其子群体)的期望效果。如本文所用，术语“异质性阳性”通常是指含有至少一些表达引发性抗原(即，MOG)的细胞和至少一些不表达引发性抗原的细胞的GBM肿瘤。在一些情况下，此类肿瘤可包括不表达引发性抗原的细胞亚群，其源自表达引发性抗原的亲本群。在一些情况下，肿瘤的亚群可以开始从不表达引发性抗原的亲本群体中新表达引发性抗原。在一些情况下，GBM细胞的抗原表达可在肿瘤进展过程中改变或发展。
在一些情况下，治疗可包括获得关于异质性EGFRvIII(-)GBM的一种细胞类型或多于一种细胞类型(或细胞亚群)的期望效果，包括异质性EGFRvIII(-)GBM的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种等细胞类型或细胞亚群。如下面更详细描述的，治疗的期望效果将变化。例如，对于一种或多种靶向细胞类型，期望的效果将变化，并且可以包括但不限于例如杀伤一种或多种靶向细胞类型、减少一种或多种靶向细胞类型的增殖等。
主题方法可包括将含有编码用于反式靶向异质性EGFRvIII(-)GBM的细胞的回路的核酸序列的细胞引入有此需要的受试者中。引入的细胞可以是免疫细胞，包括例如髓细胞或淋巴细胞。
在一些情况下，本发明的方法可包括使细胞与编码回路的一种或多种核酸接触，其中这种接触足以将所述核酸引入细胞中。将核酸引入细胞中的任何方便的方法可用于本文，包括但不限于病毒转染、电穿孔、脂转染、轰击、化学转化、使用可转导载体(例如，可转导载体蛋白)等。可以将核酸引入体外或离体维持或培养的细胞中。核酸也可例如通过使用一种或多种载体(例如，病毒载体)体内引入活受试者的细胞中，所述载体将核酸递送到细胞中而无需在受试者外部分离、培养或维持细胞。
引入的核酸可维持在细胞内或瞬时存在。因此，在一些情况下，引入的核酸可以保持在细胞内，例如整合到基因组中。任何方便的核酸整合方法均可用于主题方法，包括但不限于例如基于病毒的整合、基于转座子的整合、基于同源重组的整合等。在一些情况下，引入的核酸可以瞬时存在，例如在细胞内的染色体外存在。瞬时存在的核酸可持续存在，例如作为任何方便的瞬时转染载体的一部分。
可以以如下方式引入编码回路的引入核酸，该方式使得可操作地连接于调节序列(例如启动子)，所述调节序列驱动回路的一种或多种组分表达。此类调节序列的来源可变化，并且可包括例如其中调节序列与核酸一起引入，例如作为表达构建体的一部分，或者其中调节序列在引入核酸之前存在于细胞中或在核酸之后引入。如本文更详细描述的，有用的调节序列可包括例如内源启动子和异源启动子。例如，在一些情况下，可引入作为含有可操作地连接至核酸序列的异源启动子的表达构建体的一部分的核酸。在一些情况下，核酸可以作为表达构建体的一部分引入，所述表达构建体含有核酸引入其中的细胞内源性的启动子的拷贝。在一些情况下，可以在没有调节序列的情况下引入核酸，并且在整合到细胞的基因组中时，核酸可以可操作地连接到细胞中已经存在的内源调节序列。取决于所利用的确认和/或调节序列，来自核酸的回路的每个组分的表达可被配置为组成型、诱导型、组织特异性、细胞类型特异性等，包括其组合。
递送回路编码组分的任何方便方法可用于主题方法中。在一些情况下，可以通过向受试者施用表达回路的细胞来递送主题回路。在一些情况下，可以通过向受试者施用包含编码回路的一个或多个核苷酸序列的核酸来递送主题回路。向受试者施用编码回路的核酸可以包括向受试者施用含有核酸的细胞，其中该核酸可能表达了或可能尚未表达。在一些情况下，向受试者施用编码回路的核酸可包括向受试者施用被设计成将核酸递送至细胞的载体。
因此，在主题治疗方法中，编码回路或其组分的核酸可以在体外、离体或体内施用。在一些情况下，可以从受试者收集细胞并用核酸转染，并且可以向受试者施用转染的细胞，进行或不进行进一步操纵，包括但不限于例如体外扩增。在一些情况下，核酸(例如，具有或不具有递送载体)可以直接施用给受试者。
主题回路的引发细胞和靶向细胞通常至少在引发性抗原和靶向性抗原的表达方面不同。在一些情况下，引发细胞和靶向细胞可以在至少一种表面表达的表位(例如，表面表达的蛋白质，在MHC的背景下呈递的抗原等)的表达方面不同，包括例如其中表面表达的表位是除引发性抗原和/或靶向性抗原之外的分子。在一些情况下，两种不同的靶细胞可在至少一种表面表达的表位(例如，表面表达的蛋白质，在MHC的背景下呈递的抗原等)的表达方面不同。
EGFRvIII(-)GBM的两种细胞或两种细胞类型之间的差异表达将变化。例如，在一些情况下，细胞表达的一种表面表位未被另一种细胞表达。在一些情况下，细胞表达的一种表面表位比另一细胞表达的表面表位更高。在细胞的表面表位表达水平不同(例如与存在/不存在相比)的情况下，水平的差异可以变化，但是通常将实质性不同，例如，足够不同以允许相对于另一种细胞而实际靶向一种细胞。细胞之间的表达差异的范围可以从小于一个数量级的表达到十个数量级的表达或更高，包括但不限于例如1个数量级、2个数量级、3个数量级、4个数量级、5个数量级、6个数量级、7个数量级、8个数量级、9个数量级、10个数量级等。在一些情况下，特定表位的表达水平不同的两种细胞类型可以分别被称为表位的“高”和“低”，其中可以使用相关技术人员已知的常规方法区分高与低表达。
在一些情况下，特定表位的存在或不存在将由用于检测表位的方法的检测限来限定，包括例如，当这种检测限可以或可以不基于适当的参考标准或阳性或阴性对照的情况。例如，在表位的存在低于检测限的情况下，细胞可以被称为对于表位是“阴性的”。相应地，在表位的存在低于参考标准物或适当对照中检测到的水平的情况下，可以说细胞对于表位是阴性的。当表位的存在高于检测限时，细胞可以被称为对于表位是“阳性的”。相应地，在表位的存在高于参考标准物或适当对照中检测到的水平的情况下，细胞可以被称为对于表位是阳性的。
如上文所概述，异质性GBM中的引发细胞和靶向细胞通常将足够接近以允许通过引发的免疫细胞识别表达靶向性抗原但不表达引发性抗原的靶向细胞。足以用于靶向细胞的反式靶向的引发细胞和靶向细胞之间的相对接近度将变化，并且如本文所述，可以根据如何设计主题回路而如期望地进行修改(例如，通过使用或多或少稳定的抗原特异性治疗剂，通过使用可扩散有效载荷等)。在一些情况下，引发细胞和靶向细胞可以是相邻的。在一些情况下，引发细胞和靶向细胞可以是非相邻的。因此，在本文中表示为引发细胞和靶向细胞之间的距离的接近度可以在约1细胞直径至100细胞直径或更大的范围内，包括但不限于例如1至100细胞直径、2至100细胞直径、5至100细胞直径、10至100细胞直径、1至50细胞直径、2至50细胞直径、5至50细胞直径、10至50细胞直径、1至25细胞直径、2至25细胞直径、5至25细胞直径、10至25细胞直径等。
使用本文所述方法治疗的EGFRvIII(-)GBM肿瘤的异质性将变化。例如，在一些情况下，异质性EGFRvIII(-)GBM中的异质性程度将变化。例如，关于存在于异质性GBM中的每种个别细胞类型，主题细胞类型(例如，引发细胞、第一靶向细胞类型、第二靶向细胞类型或另一种细胞类型)将代表EGFRvIII(-)GBM的细胞的小于100％，包括但不限于例如异质性EGFRvIII(-)GBM的细胞的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
在一些情况下，异质性EGFRvIII(-)GBM的75％或更少的细胞表达相关引发性抗原，包括但不限于例如70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、或20％或更少。在一些情况下，本公开的方法可用于治疗受试者中的异质性EGFRvIII(-)GBM，其中表达相关引发性抗原的EGFRvIII(-)GBM的细胞的百分比在1％或大于1％至99％或小于99％的范围内，包括但不限于例如1％至99％、5％至90％、10％至85％、20％至80％、25％至75％等。
在一些情况下，本文公开的方法的靶向细胞(例如，肿瘤的靶向性抗原阳性、EGFR(-)细胞)可以代表小于50％的异质性癌症或异质性肿瘤的细胞，包括但不限于例如小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的异质性癌症或异质性肿瘤的细胞。
在一些情况下，存在于异质性EGFR(-)GBM中的特定细胞类型(例如，引发细胞类型、靶向细胞类型或另一细胞类型)可以是异质性癌症的大多数细胞类型，包括例如其中特定细胞类型占异质性GBM的细胞的50％或更多，包括例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多。在一些情况下，本文公开的方法的引发细胞可代表50％或更多的异质性GBM的细胞，包括但不限于例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多的异质性GBM细胞。在一些情况下，本文公开的方法的表达靶向性抗原的EGFRvIII(-)靶向细胞可代表50％或更多的异质GBM细胞，包括但不限于例如60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多的异质GBM细胞。
本公开的方法可用于靶向和治疗多种GBM肿瘤，包括例如原发性GBM、继发性GBM肿瘤、再生长GBM肿瘤、复发性GBM肿瘤、难治性GBM肿瘤等。例如，在一些情况下，本公开的方法可用作受试者中鉴定的原发性GBM的初始治疗，包括其中原代GBM被鉴定为EGFRvIII(-)的情况。在一些情况下，本公开的方法可用作非初步(例如，二次或以后)治疗，例如，在具有对至少一种先前治疗难治性的GBM的受试者中，在具有在至少一种先前治疗之后再生长的GBM的受试者中，在具有对至少一种先前治疗的混合应答(例如，受试者中的至少一个肿瘤中有阳性应答和受试者中的至少第二肿瘤中的阴性或中性应答，包括例如对多种GBM的治疗的混合应答)的受试者中等。
在一些情况下，本公开的方法可用于靶向、治疗或清除受试者在先前GBM治疗之后剩余的最小残余疾病(MRD)。EGFRvIII(-)GBM MRD的靶向、治疗和/或清除可以使用本发明方法来进行，无论MRD是否被确定或已被确定为对先前的治疗难治性的。在一些情况下，本公开的方法可以用于在确定MRD对先前治疗或除了采用本文所述回路的那些之外的一个或多个可用治疗选项难治性之后，靶向、治疗和/或清除MRD的受试者。
在一些情况下，本发明的方法可以预防性地用于监视。例如，当有此需要的受试者不具有可检测的疾病但存在发展GBM或复发性GBM的风险时，可以向该受试者施用涉及本文所述的一个或多个回路的治疗。在一些情况下，当受试者处于发展原发性GBM的特别高的风险时，可以采用预防性方法，该原发性GBM被预测为异质性GBM并且可以例如被预测为EGFRvIII(-)。在一些情况下，当受试者先前已经治疗GBM并且处于复发风险时，可以采用预防性方法。基本上，引发性抗原和靶向性抗原的任何组合可用于预防性治疗，包括本文所述的那些。
在一些情况下，本文所述的方法可用于预防性监视受试者的表达GBM肿瘤中通常存在的一个或多个突变的GBM细胞，所述突变包括在复发性和/或难治性GBM中发现的突变或在原代GBM中发生的突变。在原代、复发性和/或难治性GBM(及其亚型)中发现的突变包括但不限于例如IDH1突变、TP53突变、ALK突变、RRM1突变、TUBB3突变、ATRX突变、BRAF突变、PTEN突变、PDGFRA突变、PTPN11突变和SMARCA4突变。在一些情况下，方法可采用对一种或多种杀伤抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂，其中一种或多种杀伤抗原包括一种或多种通常突变的蛋白质，包括表面表达的蛋白质。
在一些情况下，本公开的方法可用于治疗不一定存在异质性GBM(包括原发性和非原发性GBM)但是处于发展这种异质性GBM的增加的风险的受试者。例如，具有明显均质性EGFRvIII(-)GBM的受试者可以用回路治疗以预防性地监视受试者中表达在GBM中发生的一个或多个突变(其中在一些情况下，此类突变可以排除导致EGFRvIII变体产生的突变)的GBM细胞。
在一些情况下，本文所述的治疗方法可在先前已经历一种或多种常规治疗的受试者中进行。例如，在肿瘤学的情况下，本文所述的方法在一些情况下可以在常规癌症治疗之后进行，所述常规癌症治疗包括但不限于例如常规化疗、常规放射治疗、常规免疫疗法、手术等。在一些情况下，当受试者尚未对常规治疗作出应答或对常规治疗难治性时，可以使用本文所述的方法。
关于作为整体的GBM，所述治疗的期望效果可导致GBM中的细胞数量的减少、GBM肿瘤的大小的减小、GBM的总体增殖的减少、GBM肿瘤的总体生长速率的降低等。例如，在一些情况下，有效治疗是这样的治疗：当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，与不存在治疗时的癌细胞数量和/或肿瘤质量相比，将个体中癌细胞的数量和/或个体中肿瘤质量减少至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％或超过75％。癌细胞的数量或肿瘤块大小的减少可以相对于作为整体的异质性肿瘤或相对于GBM的靶向细胞来定义。
在一些实施方案中，有效治疗是当单独(例如，以单一疗法)或与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，以组合疗法)以一个或多个剂量施用时，与不存在治疗时的肿瘤生长速率、GBM细胞数量或肿瘤质量相比，有效地将肿瘤生长速率、GBM细胞数量和肿瘤质量中的一种或多种降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的治疗。肿瘤生长速率、GBM细胞数量或肿瘤质量的降低可相对于作为整体的异质性肿瘤或相对于GBM的靶向细胞来定义。
在一些情况下，治疗可涉及激活含有编码如本文所述的回路的核酸序列的免疫细胞。因此，本公开相应地呈现了激活免疫细胞的方法，例如其中免疫细胞表达如本文所述的引发/靶向回路，并且与表达引发性抗原的EGFRvIII(-)GBM的第一细胞和表达靶向性抗原的GBM的第二细胞接触。
作为本文所述方法的结果，免疫细胞激活可以以多种方式测量，包括但不限于例如测量免疫细胞激活的一种或多种标记物的表达水平。免疫细胞激活的有用标志物包括但不限于例如CD25、CD38、CD40L(CD154)、CD69、CD71、CD95、HLA-DR、CD137等。例如，在一些情况下，在抗原与免疫细胞受体结合时，免疫细胞可以被激活并且可以以升高的水平(例如，高于未与抗原结合的相应细胞的水平)表达免疫细胞激活标志物(例如，CD69)。与未活化对照相比，本公开的活化免疫细胞的升高表达水平将变化并且可包括增加的标记物表达，例如1倍或更大的增加，包括但不限于例如1倍增加、2倍增加、3倍增加、4倍增加等。
在一些情况下，例如经修饰以编码本公开的回路的免疫细胞在与靶向性抗原结合时可具有增加的细胞毒性活性，与未活化的对照细胞相比。在一些情况下，编码受试者回路的激活的免疫细胞与未激活的对照细胞相比可显示10％或更高的对抗原表达靶细胞的细胞杀伤。在一些情况下，与适当的对照相比，活化的免疫细胞的细胞杀伤升高的水平将变化并且可以在10％或更大的范围内，包括但不限于例如20％或更大、30％或更大、40％或更大、50％或更大、60％或更大、70％或更大、80％或更大、90％或更大等。
在一些情况下，治疗可涉及通过含有编码如本文所述的回路的核酸序列的免疫细胞调控(包括诱导)细胞因子的表达和/或分泌。细胞因子(其表达/分泌可以被调控)的非限制性实例包括但不限于，例如白细胞介素和相关细胞因子(例如，IL-1样、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-6样、IL-6、IL-11、G-CSF、IL-12、LIF、OSM、IL-10样、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17等)，干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)，TNF家族(例如，CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE等)，TGF-β家族(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等)，等等。
在一些情况下，通过本公开的回路激活免疫细胞可以诱导细胞因子表达和/或分泌相对于其中回路不存在或以其他方式无活性的可比细胞的细胞因子表达和/或分泌的增加。增加量可以变化并且可以在10％或更大的范围内增加，包括但不限于例如10％或更大、25％或更大、50％或更大、75％或更大、100％或更大、150％或更大、200％或更大、250％或更大、300％或更大、350％或更大、400％或更大等。
常规治疗和组合疗法
如将容易理解的，本文所述的治疗方法在一些情况下可与一种或多种常规治疗组合。例如，在GBM的肿瘤学的情况下，本文所述的方法在一些情况下可与常规GBM疗法组合，所述常规GBM疗法包括但不限于例如常规化疗、常规放射疗法、常规免疫疗法、手术等。同样如上所述，在一些情况下，本文所述的治疗方法可以在常规疗法之后使用，例如治疗对常规疗法难治性的异质性EGFRvIII(-)GBM，治疗在常规疗法之后复发的异质性EGFRvIII(-)GBM，在常规疗法之后治疗受试者的MRD等。
在一些情况下，本文所述的方法可在常规疗法之前或之后使用。例如，本文描述的方法可以用作辅助疗法，例如，在受试者已经从常规疗法改善之后，或者可以在受试者未对常规疗法作出应答时使用。在一些情况下，本文所述的方法可以在另外的疗法之前使用，例如，以使受试者准备好另外的疗法，例如如本文所述的常规疗法。
标准GBM疗法包括手术(例如，手术去除癌组织)、放射疗法、化疗治疗、抗体治疗、生物应答调节剂治疗以及前述的某些组合。
放射疗法包括但不限于从外部施加的源(诸如射束)或通过植入小放射源递送的x射线或伽马射线。
适用于GBM治疗或在GBM治疗的研究中使用的抗体包括但不限于裸抗体，例如曲妥珠单抗(Herceptin)、贝伐单抗(AvastinTM)、西妥昔单抗(ErbituxTM)、帕尼单抗(VectibixTM)、伊普利单抗(YervoyTM)、利妥昔单抗(RituxanTM)、阿仑单抗(LemtradaTM)、欧氏单抗(Oregovomab)(OvaRexTM)、兰姆珠单抗(Lambrolizumab)(pembrolizumab，MK-3475，KeytrudaTM)、雷尼单抗(ranibizumab)(LucentisTM)等，以及缀合抗体，例如上面列出的缀合抗体等。
常规的癌症疗法还包括用于癌症的靶向疗法，包括但不限于例如靶向VEGF配体的贝伐单抗(Avastin)(被批准用于胶质母细胞瘤)等。
适合与本公开的方法结合使用的生物应答调节剂包括但不限于：(1)酪氨酸激酶(RTK)活性的抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性的抑制剂；(3)肿瘤相关抗原拮抗剂，例如特异性结合肿瘤抗原的抗体；(4)凋亡受体激动剂；(5)白介素-2；(6)干扰素-α；(7)干扰素-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成抑制剂；和(10)肿瘤坏死因子的拮抗剂。
化学治疗剂是非肽类(即，非蛋白质类)化合物，其减少癌细胞的增殖并且包括细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
作用于减少细胞增殖的药剂在本领域中是已知的并且被广泛使用。这样的药剂包括烷化剂，例如氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯和三嗪，包括但不限于甲氯雷胺、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-sarcolysin)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲菌素、氯佐辛、尿嘧啶氮芥、氮芥(chlormethine)、异磷酰胺、苯丁酸氮芥、吡泊罗曼(pipobroman)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物药剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FudR)、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二脱氮叶酸(PDDF，CB3717)、5，8-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)、亚叶酸、磷酸氟达拉滨、戊他汀和吉西他滨。
合适的天然产品及其衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于Ara-C、紫杉醇
Figure BDA0003734102090000331
多西他赛
Figure BDA0003734102090000332
脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、咪唑硫嘌呤；布喹那(brequinar)；生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等；鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环霉素、盐酸柔红霉素(道诺霉素、红比霉素、cerubidine)、伊达比星、多柔比星、表柔比星和吗啉代衍生物等；苯肟酮(phenoxizone)双环肽，例如放线菌素；碱性糖肽，例如博来霉素；蒽醌糖苷，例如普卡霉素(光神霉素)；蒽二酮，例如米托蒽醌；氮丙啶吡咯并吲哚二酮(azirinopyrrolo indoledione)，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢霉素、FK-506(他克莫司，普乐可复(prograf))、雷帕霉素等；等等。
其它抗增殖细胞毒性剂是诺维本(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛沙芬(droloxafine)。
也适合使用具有抗增殖活性的微管效应剂，包括但不限于别秋水仙碱(NSC406042)、Halichondrin B(NSC 609395)、秋水仙碱(NSC757)、秋水仙碱衍生物(例如NSC33410)、dolstatin 10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根佐素(NSC 332598)、紫杉醇
Figure BDA0003734102090000341
衍生物、多西他赛
Figure BDA0003734102090000342
硫代秋水仙碱(NSC361792)、三苯甲基cysterin、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、天然和合成埃博霉素，包括但不限于，埃博霉素A、埃博霉素B、discodermolide；依拉莫司汀、诺科达唑等。
适合使用的激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)包括但不限于，肾上腺皮质类固醇，例如强的松、地塞米松等；雌激素和孕激素，例如羟基孕酮己酸酯、羟基孕酮乙酸酯、乙酸甲地孕酮、雌二醇、克罗米酚、他莫昔芬等；以及肾上腺皮质抑制剂，例如氨基苯乙哌啶酮(aminoglutethimide)；17α-乙炔基雌二醇；二乙基己烯雌酚、睾酮、氟羟甲睾酮、丙酸屈他雄酮(dromostanolone)、睾酮内酯、甲基泼尼松龙、甲基-睾酮、泼尼松龙、氟羟泼尼松龙、三对甲氧苯氯乙烯、羟基孕酮、氨基苯乙哌啶酮、依拉莫司汀、乙酸甲氧基孕酮、亮丙瑞林、氟他米(Drogenil)、托瑞米芬(Fareston)和Zoladex。雌激素刺激增殖和分化，因此与雌激素受体结合的化合物用于阻断该活性。皮质类固醇可抑制T细胞增殖。
其它化疗剂包括金属络合物，例如顺铂(顺-DDP)、卡铂等；脲，例如羟基脲；和肼，例如N-甲基肼；表鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；亚叶酸；替加氟等。其它感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如麦考酚酸、沙利度胺、脱氧精胍菌素、氮杂孢菌素(azasporine)、来氟米特、咪唑立宾(mizoribine)、azaspirane(SKF 105685)；
Figure BDA0003734102090000351
(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)等。
“紫杉烷类”包括紫杉醇，以及任何活性紫杉烷衍生物或前药。“紫杉醇”(其在本文中应当理解为包括类似物、制剂和衍生物，如例如多西他赛、TAXOLTM、TAXOUTERETM(多西他赛的制剂)、紫杉醇的10-脱乙酰类似物和紫杉醇的3'N-脱苯甲酰基-3'N-t-丁氧基羰基类似物)可以利用本领域技术人员已知的技术容易地制备(也参见WO94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO94/07876、WO93/23555、WO93/10076；美国专利号5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和EP 590,267)，或者从各种商业来源获得，包括例如Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO(来自短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的T7402；或来自云南红豆杉(Taxus yannanensis)的T-1912)。
紫杉醇应理解为不仅指紫杉醇的常见化学上可用的形式，而且指类似物和衍生物(例如，TaxotereTM多西他赛，如上所述)和紫杉醇缀合物(例如，紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
术语“紫杉烷”还包括多种已知的衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请WO99/18113中所述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO99/14209中所述的哌嗪和其它衍生物；WO99/09021、WO98/22451和美国专利号5,869,680中所述的紫杉烷衍生物；WO98/28288中所述的6-硫代衍生物；美国专利号5,821,263中所述的亚磺酰胺衍生物；和美国专利号5,415,869中所述的紫杉醇衍生物。它还包括紫杉醇的前药，包括但不限于WO98/58927；WO98/13059；和美国专利号5,824,701中所述的那些。
在一些情况下，治疗受试者的癌症的方法可以进一步包括施用增强治疗活性的药剂。增强治疗活性的此类药剂将广泛变化，并且可包括但不限于例如抑制抑制剂分子的药剂。可以被靶向的合适的抑制性分子包括但不限于例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。
对抑制性分子的抑制可通过任何方便的方法实现，包括但不限于例如施用抑制性分子的直接抑制剂(例如，结合抑制性分子的抗体、抑制性分子的小分子拮抗剂等)，施用抑制抑制性分子表达的药剂(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如靶向编码抑制性分子的核酸的siRNA或shRNA)，抑制性信号传导的间接抑制剂等。在一些情况下，可以施用的药剂可以是结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，药剂可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(ipilimumab，也称为MDX-010和MDX-101，并以Yervoy(Bristol-Myers Squibb)销售)、曲美木单抗(Tremelimumab，Pfizer，以前称为ticilimumab，CP-675,206))、TIM3、LAG3等。
在一些情况下，本公开的方法可以在没有任何另外的常规疗法的情况下使用，包括例如本文所述的方法是用于治疗受试者的唯一方法。例如，在肿瘤学的情况下，本文所述的方法在一些情况下可以是用于治疗受试者的GBM(包括例如原发性GBM、复发性GBM等)的唯一方法。
确定何时指示组合疗法(例如涉及施用改善本文所述疗法的一种或多种副作用的一种或多种药剂或涉及施用增强本文所述疗法的一种或多种药剂)以及施用此类组合疗法的细节在相关医学从业人员的技能范围内。在一些情况下，组合疗法的剂量方案和治疗时间表可以通过临床试验来确定。
测试
如上所概述的，在一些情况下，本公开的方法可以包括测试，其中这种测试可以包括但不限于例如受试者的测试、从受试者获得的生物样品的测试等。在一些情况下，本公开的方法可以包括测试和/或评估受试者中的异质性GBM。在一些情况下，本公开的方法可包括测试和/或评估受试者中的异质性EGFRvIII(-)GBM。在一些情况下，可以采用测试来确定或鉴定受试者是否具有异质性GBM或在已知具有GBM(例如，EGFRvIII(-)GBM)的受试者中的GBM是否是异质性GBM。
在一些情况下，可以测试或评估受试者的GBM以确定、检测或鉴定GBM是否表达一种或多种特定抗原，包括但不限于例如EGFRvIII抗原、引发性抗原(即，单独的MOG或与例如白介素-13受体亚基α-2(IL13RA2)、白介素-13受体亚基α-1(IL13RA1)、神经连接蛋白、轴突蛋白-1-β(NRXN1)、受体型酪氨酸-蛋白质磷酸酶ζ(PTPRZ1)、神经元细胞粘附分子(NRCAM)、钙粘蛋白-10(CDH10)和原钙粘蛋白γ-C5(PCDHGC5)、CD70抗原(CD70)、硫酸软骨素蛋白聚糖5(CSPG5)、短蛋白聚糖核心蛋白(BCAN)、代谢型谷氨酸受体3(GRM3)、蛋白碎片同源物1(CRB1)、神经调节蛋白(GAP43)、钠/钾-转运ATP酶亚基β-2(ATP1B2)、受体型酪氨酸-蛋白质磷酸酶ζ-干细胞生长因子受体融合物(PTPRZ1-MET)等组合)，和/或靶向性抗原(包括但不限于例如Ephrin A型受体2(EphA2)、Ephrin A型受体3(EphA3)、白介素-13受体(IL13R)(例如IL13RA1或IL13RA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)、其组合等等)。在一些情况下，是否采用本公开的方法和/或在主题回路中采用的引发性抗原和靶向性抗原的特定组合可基于对受试者测试在受试者的GBM细胞中的特定抗原表达来确定。
适合于测试的受试者将包括先前已经或尚未针对GBM治疗的受试者，包括异质性GBM和/或EGFRvIII(-)GBM。例如，在一些情况下，受试者可能最近已经诊断为GBM，并且可以在对诊断的GBM的任何治疗之前测试受试者，例如以评估EGFRvIII、一种或多种引发性抗原和/或一种或多种靶向性抗原的存在。在一些情况下，受试者可能先前已经针对GBM进行了治疗，并且可在治疗诊断的GBM之后测试受试者，例如以评估EGFRvIII、一种或多种引发性抗原和/或一种或多种靶向性抗原的存在，包括例如其中受试者的GBM对先前疗法具有应答性或难治性的情况。在一些情况下，受试者可能正在接受GBM的治疗，并且可在治疗诊断的GBM期间测试受试者，例如以评估EGFRvIII、一种或多种引发性抗原和/或一种或多种靶向性抗原的存在，包括例如其中受试者的GBM对正在进行的治疗具有应答性或难治性，或者其中受试者的应答仍然未知的情况。
受试者的测试可包括测定从受试者获得的生物样品。可用的生物样品可包括但不限于例如活检(例如，GBM肿瘤活检等)、血液样品等。收集生物样品的任何方便的方法可用于本文所述的方法，包括但不限于例如针穿活检、立体定向活检、开放活检等。
在脑肿瘤针穿活检中，可以进行小切口，并且可以在颅骨中钻出被称为钻孔的小孔。狭窄的中空针可以穿过孔插入，并且肿瘤组织可以从针的芯取出。在脑肿瘤的立体定向活检中(又名“闭合”活检)，可以采用与针对针穿活检所描述的相同的一般程序；然而，可以采用有助于肿瘤的定位和诊断的计算机辅助引导系统。使用来自CT或MRI扫描的信息的计算机可以提供关于肿瘤位置及其相对于脑中其他结构的位置的精确信息。可以将立体定向引导设备移动到钻孔中以移取肿瘤的样品。在脑肿瘤的开放活检中，在暴露肿瘤的操作期间采集组织样品。无论用于收集的活检方法如何，样品之后都可以发送以供例如病理学家研究和审查。
测定生物样品的任何方便的方法可用于本文所述的方法，包括但不限于例如血液化学测试、癌症基因突变测试、全血量计数(CBC)、细胞遗传学分析、免疫表型分析、肿瘤标志物测试、组织学、细胞学(包括例如流式细胞术，包括FACS)、免疫组织化学、基因表达分析、蛋白质组学、原位杂交等。例如，在一些情况下，可以对从受试者获得的活检样品进行免疫组织化学和/或原位杂交，例如以检测一种或多种抗原的表达。在一些情况下，可以对来自受试者的血液样品执行细胞学，例如以检测循环肿瘤细胞(CTC)。
在一些情况下，生物样品中的抗原检测可包括抗原转录物的分子检测。可以采用任何方便的转录物检测方法，包括但不限于基于PCR的测定。抗原转录物检测可用于本文所述方法的各种实施方案中，包括但不限于例如其中所述方法包括确定来自受试者样品的一个或多个细胞是否表达EGFRvIII、EGFR或表达EGFRvIII和EGFR两者和/或进行其表达水平的定量。
在一些情况下，可采用免疫组织化学方法(包括例如其比色或免疫荧光测定)来评估EGFRvIII、EGFR或EGFRvIII和EGFR两者的存在或不存在和/或定量其表达水平。用于检测和/或定量EGFRvIII、EGFR或EGFRvIII和EGFR两者的基本上任何方便和适当的方法可用于本文所述的方法中，例如，采用针对EGFRvIII的特异性结合成员、针对EGFR的特异性结合成员或针对两者的特异性结合成员的方法。在一些情况下，用于本发明方法的特异性结合EGFRvIII或EGFR的特异性结合成员可特异性结合分别由本文提供或描述的主题蛋白的人氨基酸序列表示的EGFRvIII或EGFR。
抗原
在一些情况下，如上所述，本发明方法中使用的抗原包括引发性抗原(即MOG)和一种或多种靶向性抗原等。在用于靶向杀死靶细胞的情况下，受试者靶向性抗原在本文中可称为“杀伤性抗原(killing antigen)”。在适当的情况下，这些术语可以互换使用但不必一定要互换使用。
如本文关于癌症异质性所述，抗原的相对存在和/或表达抗原的细胞的相对存在将有变化。通常，小于100％的用所述方法治疗的异质性癌症细胞将表达引发性抗原，包括但不限于，例如其中小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％的异质性癌症细胞表达引发性抗原。
本发明的试剂和方法使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)作为引发性抗原。MOG(另外称为BTN6、BTNL11、MOGIG2或NRCLP7)是被认为在中枢神经系统(CNS)中的神经髓鞘形成中重要的糖蛋白。在人类中，该蛋白质由MOG基因编码(Pham-Dinh等人，Genomics.199529:345–52；Pham-Dinh等人，Immunogenetics 1995 42:386–91；和Roth等人，Genomics1995 28:241–50)，其存在于6号染色体p21.3-p22上(Pham-Dinh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1993 90:7990–4)。MOG是在少突胶质细胞表面和髓鞘最外表面上表达的跨膜蛋白。据信它是为髓鞘提供结构完整性所必需的“粘附分子”，并且已知在少突胶质细胞上后期发展。MOG的几个序列存放在NCBI的Genbank数据库中，包括登录号NP_001008229。
在某些情况下，可采用两种或更多种引发性抗原的组合，包括但不限于，例如其中这样的组合包括但不限于一种或多种上述合适的引发性抗原的实例。在一些情况下，此类组合可用于如本文中所描述的OR门控中。在某些情况下，可采用双头BTTS，包括但不限于，例如，其中双头BTTS结合两种引发性抗原，包括但不限于上述合适的引发性抗原的实例中的两种。
在一些情况下，异质性GBM的所有细胞可表达所采用的杀伤性抗原。可以认为这样的异质性GBM对于杀伤性抗原的表达是同质性的。在一些情况下，异质性GBM对于引发性抗原表达可以是异质性的，但对于杀伤性抗原表达可以是同质性的。因此，在某些实施方案中，异质性GBM的某些细胞可以表达引发性抗原和杀伤性抗原两者。在此类情况下，可采用本公开的方法，其中异质性GBM仍包括表达杀伤性抗原但不表达引发性抗原的细胞。
在一些情况下，异质性GBM对于引发性抗原表达和靶向性/杀伤性抗原表达可以是异质性的，包括其中由小于100％的异质性GBM的细胞表达靶向性/杀伤性抗原。在一些情况下，靶向性/杀伤性抗原可在异质性GBM的大多数细胞中但少于100％的细胞中表达，包括但不限于，例如其中多于95％、多于90％、多于85％、多于80％、多于75％、多于70％、多于65％、多于60％、多于55％或多于50％的异质性GBM的细胞。
在一些情况下，可以使用靶向不同靶向性/杀伤性抗原的多种抗原特异性治疗剂。在一些情况下，可以使用靶向多种不同靶向性/杀伤性抗原的抗原特异性治疗剂。在一些情况下，在靶向性/杀伤性抗原表达是异质性的情况下，可以靶向多种靶向性/杀伤性抗原，包括例如其中一种或多种主题靶向性/杀伤性抗原由GBM的大多数细胞表达的情况，其中一种或多种主题靶向性/杀伤性抗原由GBM的少数细胞表达的情况等。在一些情况下，两种或更多种不同靶向性/杀伤性抗原的靶向导致所采用的抗原组合靶向100％或接近100％(例如，99％或更大、98％或更大、95％或更大、90％或更大等)的GBM的细胞。
在一些情况下，靶向性/杀伤性抗原可由受试者中的非GBM细胞表达。换言之，在一些情况下，具有靶向性/杀伤性抗原的异质性或均质性表达的EGFRvIII(-)GBM的受试者还可在除GBM之外的细胞中(例如远离GBM的细胞)表达靶向性/杀伤性抗原。在一些情况下，这样的细胞可以被称为旁观者细胞。在一些情况下，通过使用本文所述的回路，在除GBM之外的部位处或在GBM的相对邻近之外的旁观者细胞可能不会实质上或过度地受本文所述的方法中采用的免疫细胞影响。
可用作靶向性抗原的有用抗原包括但不限于：例如肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A型受体3(EphA3)、白介素13受体(IL13R)(例如IL13RA1或IL13RA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)等。在一些情况下，使用的引发性抗原可用作靶向性抗原。例如，在一些情况下，引发性抗原可以用作引发性抗原和杀伤性抗原两者，包括但不限于例如在AND-OR门控中，其中引发性抗原作用为引发性抗原以诱导一种或多种对引发性抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂(作为第一靶向性/杀伤性抗原和第二靶向性/杀伤性抗原)的表达。在这种情况下，第二靶向性/杀伤性抗原可以选自(但不必一定选自)EphA2、EphA3、IL13R(例如，IL13RA1或IL13RA2)、EGFR和ERBB2。
在一些情况下，本文所述的方法可采用特异性结合IL13R(包括IL13RA1和/或IL13RA2，包括例如人IL13RA1亚型1、人IL13RA1亚型2、人IL13RA2或其任何组合)的抗原特异性治疗剂。上文提供了IL13RA1和IL13RA2及其同种型的代表性人氨基酸序列。靶向性抗原的实例描述于2019年10月8日提交的PCT/US2019/053151中，该申请以引用方式并入本文。
抗原特异性治疗剂
如上所述，在本发明的方法中，响应于引发性抗原的BTTS可诱导响应于一种或多种靶向性抗原的抗原特异性治疗剂的表达。可用的抗原特异性治疗剂将变化，并且可包括表面表达的和分泌的抗原特异性治疗剂。例如，在一些情况下，在本公开的方法中使用的抗原特异性治疗剂可以响应于BTTS的激活而在免疫细胞(即，经基因修饰以编码如本文所述的引发/靶向回路的免疫细胞)的表面上表达。在一些情况下，本公开的方法中使用的抗原特异性治疗剂可以响应于BTTS的激活而从免疫细胞(即，经基因修饰以编码如本文所述的引发/靶向回路的免疫细胞)分泌。
通常，除非另有说明，否则本文所述回路的抗原特异性治疗剂将不会在没有诱导其表达的BTTS的激活的情况下表达。此外，除非另有说明，否则本文所述回路的抗原特异性治疗剂在不存在其结合的抗原的情况下，即在不结合抗原特异性治疗剂特异性针对的抗原的情况下，将不具有活性。其相应抗原的结合，或者在多特异性或双特异性药剂的情况下，其相应的多种抗原的结合，导致抗原特异性治疗剂的激活。当由免疫细胞表达或以其他方式与免疫细胞接合并与一种或多种抗原结合时，抗原特异性治疗剂可活化免疫细胞。活化的免疫细胞可介导关于受试者的异质性GBM的一种或多种有益效果，包括本文所述的那些，例如但不限于癌细胞杀伤、细胞因子释放等。
关于本文所述的抗原特异性结合结构域，术语“抗原”在广义上用于指抗原特异性治疗剂结合的基本上任何特异性结合配偶体。因此，任何方便的特异性结合对，即特异性结合成员和特异性结合配偶体对，可用于本发明方法的抗原特异性治疗剂，包括但不限于例如抗原-抗体对、配体受体对、支架蛋白对等。在一些情况下，特异性结合成员可以是抗体，并且其结合配偶体可以是抗体特异性结合的抗原。在一些情况下，特异性结合成员可以是受体，并且其结合配偶体可以是受体特异性结合的配体。在一些情况下，特异性结合成员可以是配体，并且其结合配偶体可以是配体特异性结合的受体。
在一些情况下，有用的配体-受体特异性结合对可以包括其中特异性结合成员是相对于野生型配体具有至少一个突变的配体的突变蛋白，包括但不限于例如一个或多个突变、两个或更多个突变、三个或更多个突变、四个或更多个突变、五个或更多个突变等。在一些情况下，有用的突变蛋白将与相关野生型氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，包括但不限于例如与相关野生型氨基酸序列的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％等的序列同一性。在一些情况下，与受体和野生型配体之间的亲和力相比，本发明多肽中采用的突变蛋白可对受体具有更高的亲和力。
可用于本公开的方法中的抗原特异性治疗剂将变化，并且可包括但不限于例如嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合双特异性结合成员等。
可用的CAR基本上包括可用于治疗癌症的任何CAR，包括针对一种或多种靶向性抗原的单链和多链CAR。本发明方法中使用的CAR通常至少包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。所采用的CAR可以进一步包括一个或多个共刺激结构域。
可采用的CAR的非限制性实例包括用于商业化CAR T细胞(CART)疗法的那些，其针对一种或多种适当的靶向性抗原或已被修饰以针对一种或多种适当的靶向性抗原。例如，在一些情况下，可采用靶向一种或多种靶向性抗原的一种或多种CAR，所述靶向性抗原包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如，IL13RA1或IL13RA2)、EGFR和ERBB2。
可以被修饰以针对一种或多种适当的靶向性抗原的有用的CAR包括但不限于针对CD19和BCMA的那些CAR，包括例如由慢病毒负载的CTL019(Tisagenlecleucel-T)CAR-T细胞表达的抗CD19-4-1BB-CD3ζCAR，也称为由Novartis(Basel，Switzerland)商业化的Kymriah(TM)(tisagenleucel)和由慢病毒负载的CAR-T细胞(称为“bb2121”，由bluebird bio,Inc.(Cambridge,MA)和Celgene Corporation(Summit,NJ)商业化)表达的抗BCMA-4-1BB-CD3ζCAR。
有用的CAR，例如可以被修饰以针对适当的靶向性抗原的CAR，或其有用的结构域，例如可以用在针对适当的靶向性抗原的CAR中，在一些情况下可以包括美国专利号9,914,909；9,821,012；9,815,901；9,777,061；9,662,405；9,657,105；9,629,877；9,624,276；9,598,489；9,587,020；9,574,014；9,573,988；9,499,629；9,446,105；9,394,368；9,328,156；9,233,125；9,175,308和8,822,647中描述的那些；它们的公开内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，可用的CAR可包括或不包括异二聚体(也称为可二聚的或可转换的)CAR和/或包括或不包括其一个或多个结构域。在一些情况下，可用的异二聚体CAR和/或其可用结构域可包括描述于美国专利号9,587,020和9,821,012以及美国公开号US20170081411A1、US20160311901A1、US20160311907A1、US20150266973A1和PCT公开号WO2014127261A1、WO2015142661A1、WO2015090229A1和WO2015017214A1中的那些；它们的公开内容通过引用整体并入本文。
如上文所总结的，在一些情况下，CAR的抗原结合结构域(例如但不限于上述任何一个文献中所述的那些)可以用针对不同抗原(例如但不限于本文所述的一种或多种抗原)的替代或另外抗原结合结构域取代或修改，以用于本文所述的方法。在这种情况下，抗原-结构域取代的CAR的细胞内部分(即，细胞内信号传导结构域或一个或多个共刺激结构域)可以或可以不被修饰。
在一些情况下，有用的CAR和/或其有用的结构域包括在一个或多个临床试验中已经或目前正在研究的那些，包括但不限于针对以下抗原的CAR(列出了示例性的相应临床试验编号，有关的更多信息可以通过访问www.clinicaltrials.gov检索)：AFP，例如在NCT03349255中；BCMA，例如在NCT03288493中；CD10，例如在NCT03291444中；CD117，例如在NCT03291444中；CD123，例如在NCT03114670中；CD133，例如在NCT02541370中；CD138，例如在NCT01886976中；CD171，例如在NCT02311621中；CD19，例如在NCT02813252中；CD20，例如在NCT03277729中；CD22，例如在NCT03244306中；CD30，例如在NCT02917083中；CD33，例如在NCT03126864中；CD34，例如在NCT03291444中；CD38，例如在NCT03291444中；CD5，例如在NCT03081910中；CD56，例如在NCT03291444中；CD7，例如在NCT02742727中；CD70，例如在NCT02830724中；CD80，例如在NCT03356808中；CD86，例如在NCT03356808中；CEA，例如在NCT02850536中；CLD18，例如在NCT03159819中；CLL-1，例如在NCT03312205中；cMet，例如在NCT01837602中；EGFR，例如在NCT03182816中；EGFRvIII，例如在NCT02664363中；EpCAM，例如在NCT03013712中；EphA2，例如在NCT02575261中；GD-2，例如在NCT01822652中；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，例如在NCT02905188中；GPC3，例如在NCT02723942中；HER-2，例如在NCT02547961中；kappa免疫球蛋白，例如在NCT00881920中；LeY，例如在NCT02958384中；LMP1，例如在NCT02980315中；间皮蛋白，例如在NCT02930993中；MG7，例如在NCT02862704中；MUC1，例如在NCT02587689中；NKG2D-配体，例如在NCT02203825中；PD-L1，例如在NCT03330834中；PSCA，例如在NCT02744287中；PSMA，例如在NCT03356795中；ROR1，例如在NCT02706392中；ROR1R，例如在NCT02194374中；TACI，例如在NCT03287804中；和VEGFR2，例如在NCT01218867。
可用的TCR基本上包括可用于治疗癌症的任何TCR，包括针对靶向性抗原的单链和多链TCR。本发明方法中使用的TCR通常至少包括抗原结合结构域和修饰或未修饰的TCR链或其部分，包括但不限于例如修饰或未修饰的α链、修饰或未修饰的β链等。采用的TCR可以进一步包括一个或多个共刺激结构域。在一些情况下，本文采用的TCR将包括α链和β链，并且当由主要组织相容性复合物呈递时识别抗原。
基本上任何TCR可使用本公开的方法由BTTS诱导，所述TCR包括例如对多种表位中的任一种具有特异性的TCR，所述表位包括例如在癌细胞表面上表达的表位、癌细胞表面上的肽-MHC复合物等。在一些情况下，TCR是工程化改造的TCR。
用于本文所述方法中的工程化改造的TCR(包括具有免疫细胞活化功能并且可被修饰以包括对合适靶向性抗原具有特异性的抗原结合结构域的那些)的非限制性示例包括：例如抗原特异性TCR、单克隆TCR(MTCR)、单链MTCR、高亲和性CDR2突变体TCR、CD1结合MTCR、高亲和性NY-ESO TCR、VYG HLA-A24端粒酶TCR，包括例如记载在以下文献中的那些：PCT公开号WO2003/020763、WO2004/033685、WO2004/044004、WO2005/114215、WO2006/000830、WO2008/038002、WO2008/039818、WO2004/074322、WO2005/113595、WO2006/125962；Strommes等人，Immunol Rev.2014；257(1):145-64；Schmitt等人，Blood.2013；122(3):348-56；Chapuls等人，Sci Transl Med.2013；5(174):174ra27；Thaxton等人，Hum VaccinImmunother.2014；10(11):3313-21(PMID:25483644)；Gschweng等人，Immunol Rev.2014；257(1):237-49(PMID:24329801)；Hinrichs等人，Immunol Rev.2014；257(1):56-71(PMID:24329789)；Zoete等人，Front Immunol.2013；4:268(PMID:24062738)；Marr等人，Clin ExpImmunol.2012；167(2):216-25(PMID:22235997)；Zhang等人，Adv Drug Deliv Rev.2012；64(8):756-62(PMID:22178904)；Chhabra等人，Scientific World Journal.2011；11:121-9(PMID:21218269)；Boulter等人，Clin Exp Immunol.2005；142(3):454-60(PMID:16297157)；Sami等人，Protein Eng Des Sel.2007；20(8):397-403；Boulter等人，ProteinEng.2003；16(9):707-11；Ashfield等人，IDrugs.2006；9(8):554-9；Li等人，NatBiotechnol.2005；23(3):349-54；Dunn等人，Protein Sci.2006；15(4):710-21；Liddy等人，Mol Biotechnol.2010；45(2)；Liddy等人，Nat Med.2012；18(6):980-7；Oates,等人，Oncoimmunology.2013；2(2):e22891；McCormack,等人，Cancer ImmunolImmunother.2013Apr；62(4):773-85；Bossi等人，Cancer Immunol Immunother.2014；63(5):437-48以及Oates,等人，Mol Immunol.2015Oct；67(2Pt A):67-74；它们的公开内容通过引用整体并入本文。
可用的TCR包括对其相应抗原具有野生型亲和力的TCR以及对其相应抗原具有增强的亲和力的TCR。对其相应抗原具有增强亲和力的TCR可称为“亲和力增强”或“增强亲和力”TCR。TCR的亲和力可通过任何方便的方式增强，包括但不限于结合位点工程化(即合理设计)、筛选(例如TCR展示)等。亲和力增强的TCR和产生增强的亲和力TCR的方法的非限制性实例包括但不限于例如PCT公开号20150118208、2013256159、20160083449；20140349855、20100113300、20140371085、20060127377、20080292549、20160280756、20140065111、20130058908、20110038842、20110014169、2003276403等中所述的那些；它们的公开内容通过引用整体并入本文。可以响应于本公开的BTTS的细胞内结构域的释放而表达的经修饰以针对适当靶向性抗原的进一步工程化改造的TCR包括例如PCT申请号US2017/048040中描述的那些；其公开内容通过引用整体并入本文。
在一些情况下，可被修饰以针对适当靶向性抗原的可用TCR还可以包括美国专利号9,889,161、9,889,160、9,868,765、9,862,755、9,717,758、9,676,867、9,409,969、9,115,372、8,951,510、8,906,383、8,889,141、8,722,048、8,697,854、8,603,810、8,383,401、8,361,794、8,283,446、8,143,376、8,003,770、7,998,926、7,666,604、7,456,263、7,446,191、7,446,179、7,329,731、7,265,209和6,770,749中所描述的那些，这些公开内容通过引用整体并入本文。
如上所述，在一些情况下，TCR的抗原结合结构域(例如但不限于上文所述或所引用的那些)可用针对不同抗原(例如但不限于本文所述的一种或多种抗原)的替代或另外抗原结合结构域取代或修改，以用于本文所述的方法。在这种情况下，抗原-结构域-取代的TCR的其它部分(即，跨膜结构域、任何细胞内信号传导结构域等)可以或可以不被修饰。
如上所述，在一些情况下，有用的抗原特异性治疗剂可包括在由激活的BTTS诱导时从生产细胞表达和分泌的那些，包括例如其中分泌细胞是免疫细胞的情况。例如，在结合由免疫细胞表达的BTTS时，BTTS可诱导特异于靶向性抗原的编码的抗原特异性治疗剂的表达和分泌。分泌的抗原特异性治疗剂可以反式靶向表达靶抗原的癌细胞，从而介导靶细胞的杀伤。如本文所述，在一些情况下，与编码非分泌的(例如，膜表达的)抗原特异性治疗剂的类似回路相比，分泌的抗原特异性治疗剂可增加受试者回路的靶向区或杀伤区。
可用的分泌型抗原特异性治疗剂将变化，并且在一些情况下可包括但不限于例如嵌合双特异性结合成员。在一些情况下，有用的嵌合双特异性结合成员可包括靶向在免疫细胞表面上表达的蛋白质的那些成员，所述蛋白质包括但不限于例如T细胞受体(TCR)的组分，例如一种或多种T细胞共受体。与TCR组分结合的嵌合双特异性结合成员在本文中可称为TCR靶向双特异性结合剂。可用于本发明方法的嵌合双特异性结合成员通常对靶向性抗原具有特异性，并且在一些情况下，可以对靶向性抗原和在免疫细胞表面上表达的蛋白质(例如，TCR的组分，例如CD3共受体)具有特异性。
有用的嵌合双特异性结合成员的非限制性实例包括结合肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A型受体3(EphA3)、白介素13受体(IL13R)(例如，IL13RA1或IL13RA2)、表皮生长因子受体(EGFR)或erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)的那些。可用的嵌合双特异性结合成员的非限制性实例还包括已被修饰以结合EphA2、EphA3、IL13R(例如，IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2的那些。
在一些情况下，有用的嵌合双特异性结合成员可包括双特异性T细胞衔接子(BiTE)。BiTE通常通过将结合免疫细胞抗原的特异性结合成员(例如scFv)与结合癌症抗原(例如肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原等)的特异性结合成员(例如scFv)融合来制备。例如，示例性BiTE包括经由短肽接头(例如，五氨基酸接头，例如GGGGS)融合的抗-CD3 scFv和抗肿瘤相关抗原(例如，EpCAM、CD19等)scFv。
在一些情况下，适用于本文所述方法的BiTE可包括例如已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-CD3×抗-CD19 BiTE(例如博纳吐单抗(Blinatumomab))、已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-EpCAM×抗-CD3 BiTE(例如MT110)，已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-CEA×抗-CD3 BiTE(例如MT111/MEDI-565)、已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-CD33×抗-CD3 BiTE、已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-HER2 BiTE、抗-EGFR BiTE、已经修饰以结合合适的靶向性抗原(包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR或ERBB2)的抗-IgE BiTE等。
如上文所总结的，在一些情况下，嵌合双特异性结合成员的抗原结合结构域，例如但不限于上面描述或引用的那些，可以用针对不同抗原(例如但不限于本文所述的一种或多种抗原)的替代或另外的抗原结合结构域取代或修改，以用于本文所述的方法。在这种情况下，抗原-结构域-取代的嵌合双特异性结合成员的其它部分(即，接头结构域、任何免疫细胞靶向结构域等)可以或可以不被修饰。
在一些情况下，在本文所述的方法中通过BTTS与其相应的引发性抗原结合而诱导的有效载荷可包括分泌型生物正交衔接子分子。在一些情况下，这种生物正交衔接子分子可以被配置为靶向和结合靶向性抗原，并且还结合由免疫细胞表达的异源多肽或被由免疫细胞表达的异源多肽结合。
例如，在一些情况下，本文描述的方法中采用的主题回路可以在免疫细胞内编码：响应于引发性抗原的BTTS；对靶向性抗原具有特异性的生物正交衔接子分子；以及结合生物正交衔接子分子的治疗剂或其部分。在这种回路中，在BTTS与引发性抗原结合时诱导生物正交衔接子分子的表达和分泌。然后，在(1)表达靶向性抗原的癌细胞和(2)结合生物正交衔接子分子的治疗剂的存在下，治疗剂结合生物正交衔接子分子，然后生物正交衔接子分子结合靶向性抗原，从而激活治疗剂。然后，激活的治疗剂可以介导针对表达靶向性抗原的癌细胞的治疗效果(例如，细胞毒性效果)，包括其中靶向性抗原相对于引发性抗原以反式表达的情况。如本文所述，在一些情况下，与编码非分泌的(例如，膜表达的)抗原特异性治疗剂的类似回路相比，分泌的生物正交衔接子分子可以增加受试者回路的靶向区或杀伤区。
生物正交衔接子分子可用于本文所述方法内的各种情形中。例如，在一些情况下，可以采用生物正交衔接子分子，其包括抗原特异性治疗剂的可扩散抗原结合部分，例如CAR的可扩散抗原结合部分、TCR的可扩散性原结合部分等。在一些情况下，抗原特异性治疗剂的这种可扩散抗原结合部分可称为“可扩散头部”，包括例如“可扩散CAR头部”、“可扩散TCR头部”等。在一些情况下，可扩散抗原结合部分可以对EphA2、EphA3、IL13R(例如，IL13RA1或IL13RA2)、EGFR和/或ERBB2中的一个或多个具有特异性。
在一些情况下，治疗剂可以直接结合到生物正交衔接子分子。直接结合治疗剂与生物正交衔接子分子的策略可以变化。例如，在一些情况下，治疗剂可以包括结合结构域(例如，诸如正交抗体或其片段)，其结合共价连接到生物正交衔接子的结合部分(例如，抗体可以被引导到的正交表位)。作为非限制性实例，治疗剂可以包括针对非天然存在的表位的结合结构域(例如抗荧光素抗体或其片段)，并且生物正交衔接子分子可以包括与其共价连接的表位，例如荧光素。在一些情况下，生物正交衔接子分子与治疗剂相互作用的构型可以与前述相反，包括例如其中治疗剂包括共价连接的表位并且生物正交衔接子分子包括针对表位的结合结构域。有用的表位将变化并且可以包括但不限于例如基于小分子的表位、基于肽的表位(例如，肽新表位)、基于寡核苷酸的表位等。表位结合结构域将相应地变化，并且可以包括但不限于例如小分子结合结构域、肽结合结构域、寡核苷酸结合结构域等。
有用的生物正交衔接子分子和与其结合的结构域的非限制性实例包括但不限于例如在可转换CAR(sCAR)T细胞中使用的肽新表位和与其结合的抗体结合结构域，包括但不限于例如Rodgers等人，Proc Natl Acad Sci USA.(2016)113(4):E459-68和Cao等人,Angew Chem Int Ed Engl.2016Jun 20；55(26):7520-4以及PCT公开号WO2016168773中所述的那些；它们的公开内容全文以引用方式并入本文。
在一些情况下，治疗剂可以间接结合到生物正交衔接子分子，包括例如其中结合由可扩散二聚剂介导的情况。合适的二聚剂和与其结合的二聚结构域的非限制性实例包括蛋白质二聚剂。
蛋白质二聚化因子通常包括例如在二聚剂的存在下或当暴露于二聚剂时二聚化的多肽对。蛋白质二聚化因子的二聚化多肽对可以同二聚化或异二聚化(即，二聚化多肽对可以包括形成同二聚体的两种相同多肽或形成异二聚体的两种不同多肽)。非限制性的蛋白二聚化因子对(在括号中为相关二聚剂)包括但不限于，例如，FK506结合蛋白(FKBP)和FKBP(雷帕霉素)；FKBP和钙依赖磷酸酶催化亚基A(CnA)(雷帕霉素)；FKBP和亲环蛋白(雷帕霉素)；FKBP和FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRB)(雷帕霉素)；促旋酶B(GyrB)和GyrB(香豆霉素)；二氢叶酸还原酶(DHFR)和DHFR(甲氨蝶呤)；DmrB和DmrB(AP20187)；PYL和ABI(脱落酸)；Cry2和CIB1(蓝光)；GAI和GID1(赤霉素)等。在美国专利申请公开号US2015-0368342A1中提供了这样的蛋白质二聚化因子的进一步描述，包括氨基酸序列；该美国专利申请公开号US2015-0368342A1的公开内容通过引用整体并入本文。
可用的蛋白质二聚化因子还包括在二聚剂存在下二聚化的那些核激素受体衍生的蛋白质二聚化因子，其记载于PCT公开号WO2017/120546和美国专利申请公开号US2017/0306303A1中；它们的公开内容通过引用整体并入本文，等等。这样的核激素受体衍生的二聚化因子通常包括：二聚对的第一成员，其为核激素受体的共调节剂；二聚对的第二成员，其包含核激素受体的LBD。
在所述回路中采用生物正交衔接子分子的情况下，结合生物正交衔接子分子以介导靶向性抗原识别的治疗剂的表达可以或可以不由回路控制。换言之，治疗剂的表达可以或可以不与回路的BTTS的激活(例如，BTTS与引发性抗原或另一抗原的结合)相关联。在一些情况下，回路可以被配置为使得BTTS与其抗原的结合诱导结合生物正交衔接子分子的治疗剂的表达。在一些情况下，诱导治疗剂表达的BTTS与诱导生物正交衔接子分子表达的BTTS相同。在一些情况下，治疗剂由与诱导生物正交衔接子分子表达的BTTS不同(即，分开)的BTTS诱导。
在一些情况下，结合生物正交衔接子分子的治疗剂的表达可以不由BTTS诱导。例如，在一些情况下，这种治疗剂不是由BTTS诱导，而是在单独的调节元件或序列的控制下表达，包括但不限于例如其中治疗剂的表达是组成型、诱导型、条件性、组织特异性、细胞类型特异性的等。在一些情况下，例如，通过引入的免疫细胞对治疗剂的独立表达(例如，组成型表达、诱导型表达等)允许可扩散生物正交衔接子分子介导远离引发部位的免疫细胞中治疗剂的激活。
在一些情况下，由治疗剂结合的生物正交衔接子分子的表达可以不由BTTS诱导，包括其中相应的治疗剂由BTTS诱导的情况。例如，在一些情况下，这种生物正交衔接子分子不是由BTTS诱导，而是在分开的调控元件或序列的控制下表达，包括但不限于例如其中生物正交衔接子分子的表达是组成型、诱导型、条件性、组织特异性、细胞类型特异性的等。在一些情况下，可以外部提供生物正交衔接子分子。
在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有细胞外结构域，所述细胞外结构域包括结合特异性结合对的第二成员的特异性结合对的第一成员，其中细胞外结构域不包括第二特异性结合对的任何另外的第一或第二成员。例如，在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有细胞外结构域，所述细胞外结构域包括结合抗原的第一抗原结合结构域，其中细胞外结构域不包括任何另外的抗原结合结构域并且不结合任何其它抗原。在一些情况下，本发明的抗原特异性治疗剂可仅包括单个细胞外结构域。因此，所采用的抗原特异性治疗剂可对单一抗原具有特异性且仅对单一抗原具有特异性。此类抗原特异性治疗剂可称为“针对单一抗原的抗原特异性治疗剂”。
在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有包括两个或更多个特异性结合对的第一或第二成员的细胞外结构域。例如，在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有细胞外结构域，其包括不同的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，使得细胞外结构域对两种不同抗原具有特异性。在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有两个或更多个细胞外结构域，其各自包括两个不同特异性结合对的第一成员或第二成员。例如，在一些情况下，抗原特异性治疗剂可具有包括第一抗原结合结构域的第一细胞外结构域和包括第二抗原结合结构域的第二细胞外结构域，其中这两个不同抗原结合结构域各自对不同抗原具有特异性。因此，抗原特异性治疗剂可对两种不同抗原具有特异性。
对两种或更多种不同抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂(含有两个细胞外结构域或对两种不同抗原具有特异性的一个细胞外结构域)可被配置成使得任一抗原与抗原特异性治疗剂的结合足以激活抗原特异性治疗剂。能够由两种或更多种抗原中的任一者激活的这样的抗原特异性治疗剂可在所描述回路中用作含有OR功能性的逻辑门控的组分。在一些情况下，对两种不同抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂可被称为“双头抗原特异性治疗剂”。对多种抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂将不限于仅两种抗原，并且可以例如对多于两种抗原具有特异性和/或被多于两种抗原激活，所述多于两种抗原包括例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种抗原等。
例如，对两种或更多种不同抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂可结合EphA2或EphA3、EphA2或IL13RA1、EphA2或IL13RA2、EphA2或EGFR、EphA2或ERBB2、EphA3或IL13RA1、EphA3或IL13RA2、EphA3或EGFR、EphA3或ERBB2、IL13RA1或IL13RA2、IL13RA1或EGFR、IL13RA1或ERBB2、IL13RA2或EGFR、IL13RA2或ERBB2、或EGFR或ERBB2，和/或被它们激活。
对两种或更多种不同抗原具有特异性的抗原特异性治疗剂的实例是串联CAR(也称为“tanCAR”或“tanCAR”)。“串联CAR”是包括两个或更多个不相同的抗原识别结构域的双特异性CAR。串联CAR的非限制性实例包括记载在以下中的那些：美国专利号9,447,194、10,155,038、10,189,903和10,239,948，美国专利申请公开号20130280220和PCT申请公开号WO/2013/123061；它们的公开内容全文以引用方式并入本文。串联CAR可被配置成结合多种不同的抗原，包括但不限于例如本文所述的两种或更多种抗原和/或记载在以下中的两种或更多种抗原：美国专利号9,447,194、10,155,038、10,189,903和10,239,948，美国专利申请公开号20130280220和PCT申请公开号WO/2013/123061。
结合触发型转录开关(BTTS)
本公开的方法包括使用采用BTTS的回路来诱导编码的抗原特异性治疗剂的表达。如本文所用，“结合触发型转录开关”或BTTS通常是指合成的模块化多肽或具有细胞外结构域的相互作用多肽的系统，所述系统包括特异性结合对的第一成员、结合转导物和细胞内结构域。当特异性结合对的第二成员与BTTS结合时，结合信号被转导到细胞内结构域，使得细胞内结构域被激活并在细胞内执行其在没有结合信号的情况下不执行的一些功能。例如，在PCT公开号WO 2016/138034以及美国专利号9,670,281和9,834,608中描述了结合触发型转录开关，它们的公开内容通过引用整体并入本文。在任何实施方案中，BTTS可以是一种或多种多肽(例如，单一多肽或其复合物)，其在结合MOG时经历蛋白水解切割以释放激活调节序列的基因表达调节子。例如，在一些实施方案中，BTTS可以包含：(i)包含MOG特异性抗体的抗原结合区的细胞外结构域；(ii)包含一个或多个蛋白水解切割位点的蛋白水解可切割序列；和(iii)细胞内结构域，其中抗原结合区与胶质母细胞瘤上的MOG的结合诱导一个或多个蛋白水解切割位点处的序列的切割，从而释放细胞内结构域，并且其中细胞内结构域通过(c)的调节序列诱导(b)的抗原特异性治疗剂的表达。
细胞外结构域的特异性结合成员通常决定BTTS的特异性。在一些情况下，BTTS可以根据基于其特异性结合成员确定的特异性来提及。例如，具有结合配偶体“X”的特异性结合成员可称为X-BTTS或抗-X BTTS。
任何方便的特异性结合对，即特异性结合成员和特异性结合配偶体对，可用于本发明方法的BTTS，包括但不限于例如抗原-抗体对、配体受体对、骨架蛋白对等。在一些情况下，特异性结合成员可以是抗体，并且其结合配偶体可以是抗体特异性结合的抗原。在一些情况下，特异性结合成员可以是受体，并且其结合配偶体可以是受体特异性结合的配体。在一些情况下，特异性结合成员可以是骨架蛋白，并且其结合配偶体可以是骨架蛋白特异性结合的蛋白。有用的特异性结合对包括对引发性抗原和/或一种或多种靶向性/杀伤性抗原特异性的那些，包括本文所述的那些。
在一些情况下，特异性结合成员是抗体。抗体可以是任何基于结合抗原的抗体的多肽，其中多种是本领域已知的。在一些情况下，特异性结合成员是或包括单克隆抗体、单链Fv(scFv)、Fab等。其他基于抗体的识别结构域(cAb VHH(骆驼抗体可变结构域)和人源化版本、IgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)和人源化版本、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域)适用。在一些情况下，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域如单链TCR(scTv，含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适用。
当BTTS的特异性结合成员是基于抗体的结合成员时，BTTS可以在存在针对基于抗体的结合成员的结合配偶体的情况下被激活，所述结合配偶体包括例如由基于抗体的结合成员特异性结合的抗原。在一些情况下，如相关领域中通常所做的，基于抗体的结合成员可以基于由基于抗体的结合成员结合的抗原来定义，包括例如其中基于抗体的结合成员被描述为“抗”抗原抗体，例如抗引发性抗原抗体(例如，抗IL13RA2抗体、抗IL13RA1抗体、抗神经连接蛋白抗体、抗NRXN1抗体、抗PTPRZ1抗体、抗NRCAM抗体、抗CDH10抗体、抗PCDHGC5抗体、抗CD70抗体、抗CSPG5抗体、抗BCAN抗体、抗GRM3抗体、抗CRB1抗体、抗GAP43抗体、抗ATP1B2抗体、抗PTPRZ1-MET融合抗体等)。因此，适于包含在本发明方法的BTTS或抗原特异性治疗剂中的基于抗体的结合成员可具有多种抗原结合特异性。
在所描述的方法中采用的BTTS的组分以及开关的组分相对于彼此的排列将根据许多因素而变化，包括但不限于例如期望的结合触发、细胞内结构域的活性、BTTS的整体功能、包含BTTS的分子回路的更广泛的布置等。第一结合成员可包括但不限于例如结合本文所述抗原的那些药剂。细胞内结构域可包括但不限于例如在调控序列下激活或抑制转录(例如以诱导或抑制特定回路的下游组分的表达)的那些细胞内结构域。
BTTS的结合转导物也将根据结合信号的期望转导方法而变化。通常，结合转导物可以包括将细胞外信号转导为细胞内信号传导的那些多肽和/或多肽的结构域，例如由各种信号转导途径的受体执行。结合信号的转导可以通过各种机制实现，包括但不限于例如结合诱导的蛋白水解裂解、结合诱导的磷酸化、结合诱导的构象变化等。在一些情况下，结合转导物可包含配体诱导的蛋白水解切割位点，使得在结合时，结合信号通过BTTS的切割而被转导，例如以释放细胞内结构域。例如，在一些情况下，BTTS可包括Notch衍生的可切割结合转导物，例如本文所述的嵌合notch受体多肽。
在其他情况下，结合信号可以在没有诱导蛋白水解切割的情况下被转导。信号转导途径的任一种或多种信号转导组分可用于BTTS中，无论信号传播是否需要蛋白水解切割。例如，在一些情况下，基于磷酸化的结合转导物，包括但不限于例如Jak-Stat途径的一个或多个信号转导组分，可用于非蛋白水解BTTS。
为简单起见，BTTS，包括但不限于嵌合notch受体多肽，主要描述为单个多肽链。然而，包括嵌合notch受体多肽的BTTS可在两个或更多个单独的多肽链上分开或分离，其中连接两个或更多个多肽链以形成功能性BTTS(例如嵌合notch受体多肽)可为组成型或有条件控制的。例如，分裂式BTTS的两个部分的组成型连接可以通过在分裂式多肽的第一和第二部分之间插入组成型异二聚结构域来实现，使得在异二聚时，分裂式部分在功能上连接。
可用在所述方法中的可用BTTS包括但不限于模块化细胞外传感器架构(MESA)多肽。MESA多肽包含：a)配体结合结构域；b)跨膜结构域；c)蛋白酶切割位点；和d)功能结构域。功能性结构域可以是转录调节子(例如，转录激活子、转录阻遏子)。在一些情况下，MESA受体包含两个多肽链。在一些情况下，MESA受体包含单个多肽链。MESA多肽的非限制性实例描述于例如美国专利公开号2014/0234851中；其公开内容通过引用整体并入本文中。
可用在所述方法中的可用BTTS包括但不限于在TANGO测定中采用的多肽。所述TANGO测定采用作为异二聚体的TANGO多肽，其中第一多肽包含烟草蚀刻病毒(Tev)蛋白酶，并且第二多肽包含融合至转录因子的Tev蛋白水解切割位点(PCS)。当两种多肽彼此接近时，该接近由天然蛋白质-蛋白质相互作用介导，Tev切割PCS以释放转录因子。TANGO多肽的非限制性实例描述于例如Barnea等人(Proc Natl Acad Sci USA.2008Jan.8；105(1):64-9))中；其公开内容通过引用整体并入本文。
可用在所述方法中的有用的BTTS包括但不限于基于von Willebrand因子(vWF)切割结构域的BTTS，例如但不限于包含未修饰或修饰的vWF A2结构域的那些。基于主题vWF切割结构域的BTTS通常包括：包含结合对的第一成员的细胞外结构域；包含蛋白水解切割位点的von Willebrand因子(vWF)切割结构域；可切割的跨膜结构域和细胞内结构域。vWF切割结构域和基于vWF切割结构域的BTTS的非限制性实例描述于Langridge&Struhl(Cell(2017)171(6)：1383-1396)中；其公开内容通过引用整体并入本文。
可用在所述方法中的可用BTTS包括但不限于嵌合Notch受体多肽，诸如但不限于例如synNotch多肽，其非限制性示例记载在PCT公开号WO2016/138034、美国专利号9,670,281、美国专利号9,834,608、Roybal等人，Cell(2016)167(2):419-432、Roybal等人，Cell(2016)164(4):770-9和Morsut等人，Cell(2016)164(4):780-91中；它们的公开内容通过引用整体并入本文。
SynNoch多肽通常是蛋白水解可切割的嵌合多肽，其通常包括：a)包含特异性结合成员的细胞外结构域；b)包含一个或多个蛋白水解切割位点的蛋白水解可切割的Notch受体多肽；和c)细胞内结构域。特异性结合成员通过其结合配偶体的结合通常诱导synNotch在一个或多个蛋白水解切割位点处的切割，从而释放细胞内结构域。在一些情况下，本发明的方法可包括其中细胞内结构域的释放触发(即，诱导)所编码的有效载荷的产生，有效载荷的编码核酸序列包含在细胞内。根据具体情况，所产生的有效载荷随后通常在细胞表面上表达或分泌。SynNotch多肽通常包括至少一个与Notch受体多肽异源的序列(即，不来源于Notch受体)，包括例如其中细胞外结构域是异源的，其中细胞内结构域是异源的，其中细胞外结构域和细胞内结构域都是与Notch受体异源的，等等。
有用的SynNotch BTTS将在所采用的结构域和这样的结构域的架构中变化。synNotch多肽通常包括Notch受体多肽，其包括一个或多个配体诱导的蛋白水解切割位点。Notch受体多肽的长度将变化，并且长度范围可为约50个氨基酸或更小到约1000个氨基酸或更多。
在一些情况下，synNotch多肽中存在的Notch受体多肽的长度为50个氨基酸(aa)至1000aa，例如50aa至75aa、75aa至100aa、100aa至150aa、150aa至200aa、200aa至250aa、250aa至300aa、300aa至350aa、350aa至400aa、400aa至450aa、450aa至500aa、550aa至550aa、550aa至600aa、600aa至650aa、650aa至700aa、700aa至750aa、750aa至800aa、800aa至850aa、850aa至900aa、900aa至950aa、或950aa至1000aa。在一些情况下，synNotch多肽中存在的Notch受体多肽的长度为300aa至400aa、300aa至350aa、300aa至325aa、350aa至400aa、750aa至850aa、50aa至75aa。在一些情况下，Notch受体多肽的长度为310aa至320aa，例如310aa、311aa、312aa、313aa、314aa、315aa、316aa、317aa、318aa、319aa或320aa。在一些情况下，Notch受体多肽的长度为315aa。在一些情况下，Notch受体多肽的长度为360aa至370aa，例如360aa、361aa、362aa、363aa、364aa、365aa、366aa、367aa、368aa、369aa或370aa。在一些情况下，Notch受体多肽的长度为367aa。
在一些情况下，Notch受体多肽包含与Notch受体的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Notch受体多肽的Notch调控区是哺乳动物Notch调控区，包括但不限于例如小鼠Notch(例如小鼠Notch1、小鼠Notch2、小鼠Notch3或小鼠Notch4)调控区、大鼠Notch调控区(例如大鼠Notch1、大鼠Notch2或大鼠Notch3)、人Notch调控区(例如人Notch1、人Notch2、人Notch3或人Notch4)等或源自哺乳动物Notch调控区并且与哺乳动物Notch受体氨基酸序列的哺乳动物Notch调控区的氨基酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的Notch调控区。
所述Notch调控区可以包括或不包括各种组分(例如，结构域、切割位点等)。其中适当时可全部或部分存在或不存在的Notch调控区的此类组分的实例包括例如一个或多个EGF样重复结构域、一个或多个Lin12/Notch重复结构域、一个或多个异二聚结构域(例如HD-N或HD-C)、跨膜结构域、一个或多个蛋白水解切割位点(例如呋喃样蛋白酶位点(例如S1位点)、ADAM家族蛋白酶位点(例如S2位点)和/或γ-分泌酶蛋白酶位点(例如S3位点)等。Notch受体多肽在一些情况下可排除一个或多个Notch细胞外结构域的全部或一部分，包括例如Notch配体结合结构域，诸如δ结合结构域。在一些情况下，Notch受体多肽可包括一个或多个Notch细胞外结构域的一个或多个非功能形式，包括例如Notch-配体结合结构域，诸如δ结合结构域。在一些情况下，Notch受体多肽可排除一个或多个Notch细胞内结构域的全部或一部分，包括例如Notch Rbp相关分子结构域(即，RAM结构域)、Notch Ankyrin重复结构域、Notch反式激活结构域、Notch PEST结构域等。在一些情况下，Notch受体多肽可包括一个或多个Notch细胞内结构域的一个或多个非功能性形式，包括例如非功能性Notch Rbp相关分子结构域(即，RAM结构域)、非功能性Notch锚定蛋白重复结构域、非功能性Notch反式激活结构域、非功能性Notch PEST结构域等。
特定synNotch BTTS、其结构域和合适的结构域排列的非限制性示例描述在PCT公开号WO2016/138034、WO2017/193059、WO2018/039247和美国专利号9,670,281和9,834,608中；其公开内容通过引用整体并入本文。
有用的BTTS结构域，例如细胞外结构域、结合转导物结构域(binding-transducerdomain)、细胞内结构域等，可以直接连接，即没有居间的氨基酸残基，或者可以包括连接两个结构域的肽接头。肽接头可以是合成的或天然来源的，包括例如天然存在的多肽的片段。
肽接头的长度可以在约3个氨基酸(aa)或更小到约200aa或更大的范围变化，包括但不限于例如3aa到10aa、5aa到15aa、10aa到25aa、25aa到50aa、50aa到75aa、75aa到100aa、100aa到125aa、125aa到150aa、150aa到175aa或175aa到200aa。肽接头可以具有3aa至30aa的长度，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。肽接头可具有5aa至50aa的长度，例如，5aa至40aa、5aa至35aa、5aa至30aa、5aa至25aa、5aa至20aa、5aa至15aa或5aa至10aa。
在一些情况下，BTTS可以具有细胞外结构域，其包括结合特异性结合对的第二成员的特异性结合对的第一成员，其中细胞外结构域不包括第二特异性结合对的任何另外的第一或第二成员。例如，在一些情况下，BTTS可具有包括结合抗原的第一抗原结合结构域的细胞外结构域，其中细胞外结构域不包括任何另外的抗原结合结构域并且不结合任何其它抗原。在一些情况下，所述BTTS可以仅包括单个细胞外结构域。因此，所采用的BTTS可以对单一抗原具有特异性并且仅对单一抗原具有特异性。这样，BTTS可以被称为“单抗原BTTS”。在一些情况下，可以使用“双抗原BTTS”。
在一些情况下，BTTS可以具有包括两个或更多个特异性结合对的第一或第二成员的细胞外结构域。例如，在一些情况下，BTTS可具有细胞外结构域，其包括不同的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，使得细胞外结构域对两种不同抗原具有特异性。在一些情况下，BTTS可以具有两个或更多个细胞外结构域，每个细胞外结构域包括两个不同特异性结合对的第一成员或第二成员。例如，在一些情况下，BTTS可具有包括第一抗原结合结构域的第一细胞外结构域和包括第二抗原结合结构域的第二细胞外结构域，其中两个不同抗原结合结构域各自对不同抗原具有特异性。这样，BTTS可以对两种不同的抗原具有特异性。
包含两个细胞外结构域或对两种不同抗原具有特异性的一个细胞外结构域的BTTS(对两种或更多种不同抗原具有特异性)可被配置为使得任一抗原与BTTS的结合足以触发BTTS的激活，例如BTTS的切割结构域的蛋白水解切割，例如释放BTTS的细胞内结构域。能够由两种或更多种抗原中的任何一种触发的这种BTTS可以在所描述的回路中用作包含OR功能的逻辑门控的组分。在一些情况下，对两种不同抗原具有特异性的BTTS可以被称为“双头BTTS”或串联BTTS(或tanBTTS)。例如，在一些情况下，被配置为结合两种或更多种不同抗原的synNotch BTTS可以被称为串联SynNotch或tanSynNotch。对多种抗原具有特异性的BTTS将不限于仅两种抗原，并且可以例如对多于两种抗原具有特异性和/或由多于两种抗原触发，包括例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种抗原等。
制备方法
本公开还包括制备本文所述方法中采用的核酸、回路和细胞的方法。在制备本发明的核酸和回路及其组分时，可采用任何方便的核酸操作、修饰和扩增方法(例如，统称为“克隆”)。在制备含有编码所述回路的核酸的细胞中，可以使用方便的转染、转导、培养方法等。
编码本公开的回路的全部或部分组分的核苷酸序列可以存在于表达载体和/或克隆载体中。在主题回路或其组分在两个或更多个单独的多肽之间分裂的情况下，编码两个或更多个多肽的核苷酸序列可以克隆在相同或单独的载体中。表达载体可以包括可选择标记、复制起点以及提供载体的复制和/或维持的其他特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。
大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的；许多可商购用于产生主题重组构建体。作为示例提供以下载体。细菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene、La Jolla、Calif.、USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(Pharmacia)。
表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。可以存在可在表达宿主中操作的可选择标记。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于牛痘病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549，1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等人,PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人.,Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人.,Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava，WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822 3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,PNAS(1993)90:10613 10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人，PNAS 94：10319 23，1997；Takahashi等人，J Virol 73：7812 7816，1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维斯肉瘤病毒、禽类白细胞瘤病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。
如上所述，在一些实施方案中，包含编码本公开的回路或其组分的核苷酸序列的核酸在一些实施方案中将是DNA或RNA，例如体外合成的DNA、重组DNA、体外合成的RNA、重组RNA等。体外合成DNA/RNA的方法是本领域已知的；可以使用任何已知的方法来合成包含所需序列的DNA/RNA。将DNA/RNA引入宿主细胞的方法是本领域已知的。将DNA/RNA引入宿主细胞可以在体外或离体或体内进行。例如，可以用包含编码本公开的全部或部分回路的核苷酸序列的DNA/RNA来体外或离体转导、转染或电穿孔宿主细胞(例如，NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞等)。
本公开的方法还可包括培养经基因修饰以编码本公开的回路的细胞，包括但不限于例如在施用之前培养细胞、在体外或离体培养细胞(例如，存在或不存在一种或多种抗原)等。可以采用任何方便的细胞培养方法，而这样的方法将基于各种因素而变化，所述因素包括但不限于例如被培养的细胞的类型、细胞的预期用途(例如，细胞是否被培养用于研究或治疗目的)等。在一些情况下，本公开的方法还可包括细胞培养的常见过程，包括但不限于例如接种细胞培养物、饲养细胞培养物、传代细胞培养物、分开细胞培养物、分析细胞培养物、用药物处理细胞培养物、收获细胞培养物等。
在一些情况下，本公开的方法还可包括接收和/或收集在所述方法中使用的细胞。在一些情况下，从受试者收集细胞。从受试者收集细胞可包括从受试者获得组织样品并从组织样品中富集、分离和/或繁殖细胞。细胞的分离和/或富集可以使用任何方便的方法进行，包括例如通过培养(例如，粘附培养、悬浮培养等)分离/富集)、细胞分选(例如，FACS、微流体等)等。可以从任何方便的细胞组织样品收集细胞，包括但不限于例如血液(包括例如外周血、脐带血等)、骨髓、活检、皮肤样本、面颊拭子等。在一些情况下，从包括例如血库、组织库等的来源接收细胞。所接收的细胞可能先前已被分离或可作为组织样品的一部分被接收，因此分离/富集可在接收细胞之后和使用之前进行。在某些情况下，所接收的细胞可以是非原代细胞，包括例如培养细胞系的细胞。本文进一步详述了用于本文所述方法的合适细胞。
核酸
如上所述，本公开提供了编码用于治疗受试者的异质性EGFRvIII(-)GBM的回路及其组分的核酸。所述核酸可包括例如编码对引发性抗原(即MOG)具有特异性的BTTS的序列和编码靶向性抗原特异性治疗剂(包括例如对EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR和/或ERBB2中的一种或多种具有特异性的靶向性抗原特异性治疗剂)的序列。
此类核酸可被配置成使得编码靶向性抗原特异性治疗剂的序列可操作地连接至对BTTS的激活作出响应的调控序列。提供了基本上编码采用反式靶向的任何回路的核酸，其利用识别在第一EGFRvIII(-)GBM细胞上表达的引发性抗原以靶向表达靶向性抗原的第二EGFRvIII(-)GBM细胞，包括但不限于本文具体描述的那些回路。所包含的是编码所述回路的分离的核酸以及含有此类核酸的各种构型，诸如载体，例如表达盒、重组表达载体、病毒载体等。
本公开的重组表达载体包括包含一种或多种所述核酸的那些。在一些实施方案中，包含编码本发明回路的所有或部分组分的核苷酸序列的核酸将为DNA，例如，包括重组表达载体。包含编码本公开的回路的所有或部分组分的核苷酸序列的核酸在一些实施方案中将是RNA，例如体外合成的RNA。
如上所述，在一些情况下，所述回路可以利用编码核酸(例如，编码BTTS或抗原特异性治疗剂的核酸)，其可操作地连接到调节序列，例如转录控制元件(例如，启动子；增强子等)。在一些情况下，转录控制元件是可诱导的。在一些情况下，转录控制元件是组成型的。在一些情况下，启动子在真核细胞中起作用。在一些情况下，启动子是细胞类型特异性启动子。在一些情况下，启动子是组织特异性启动子。
取决于所利用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等，可用于表达载体中(参见例如Bitter等人(1987)Methods in Enzymology，153:516-544)。
启动子可以是组成型活性启动子(即，组成性地处于活性/“ON”状态的启动子)，它可以是诱导型启动子(即，其状态(活性/“ON”或非活性/“OFF”)由外部刺激(例如，特定温度、化合物或蛋白质的存在)控制的启动子)，它可以是空间受限的启动子(即转录控制元件、增强子等)(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)，并且其可以是时间限制性的启动子(即，启动子在胚胎发育的特定阶段期间或在生物过程的特定阶段期间(例如小鼠的毛囊周期)处于“ON”状态或“OFF”状态)。
合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP和trc。对于在真核细胞中的表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；巨细胞病毒立即早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期SV40启动子；逆转录病毒的长末端重复中存在的启动子；小鼠金属硫蛋白-I启动子；和各种领域已知的组织特异性启动子。
在一些情况下，本文所述核酸的转录控制元件可以包括顺式作用调节序列。任何合适的顺式作用调节序列可用于本文所述的核酸。例如，在一些情况下，顺式作用调节序列可以是或包括上游激活序列或上游活化序列(UAS)。在一些情况下，本文所述核酸的UAS可以是Gal4应答性UAS。
合适的可逆启动子，包括可逆诱导型启动子是本领域已知的。此类可逆启动子可以分离并衍生自许多生物体，例如真核生物和原核生物。修饰衍生自第一生物体的可逆启动子以用于第二生物体(例如第一原核生物和第二原核生物、第一原核生物和第二原核生物等)是本领域公知的。此类可逆启动子和基于此类可逆启动子但还包含额外对照蛋白的系统包括(但不限于)醇调控的启动子(例如醇脱氢酶I(alcA)基因启动子)、响应醇反式激活蛋白(AlcR)的启动子等)，四环素调控的启动子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等的启动子体系)、类固醇调控的启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌激素受体启动子系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮激素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调控的启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、病理相关的调控的启动子(例如水杨酸调控的启动子、乙烯调控的启动子、苯并噻二唑调控的启动子等)、温度调控的启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆热激启动子等)、光调控的启动子、合成诱导型启动子等。
适用的诱导型启动子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调控和物理调控的启动子，诸如醇调控的启动子、四环素调控的启动子(例如，脱水四环素(aTc)响应性启动子和其他四环素响应性启动子系统，其包括四环素阻抑蛋白(tetR)、四环素操纵子序列(tetO)和四环素反式激活融合蛋白(tTA))、类固醇调控的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子，以及来自类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调控的启动子(例如，衍生自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合并隔绝金属离子的蛋白)基因的启动子)、病理调控的启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(BTH)诱导)、温度/热诱导型启动子(例如，热激启动子)和光调控的启动子(例如，来自植物细胞的光响应性启动子)。
在一些情况下，启动子是免疫细胞启动子，例如CD8细胞特异性启动子、CD4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子或NK特异性启动子。例如，可以使用CD4基因启动子；参见例如Salmon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7739；和Marodon等人(2003)Blood 101:3416。作为另一个实例，可以使用CD8基因启动子。NK细胞特异性表达可以通过使用Ncr1(p46)启动子来实现；参见例如Eckelhart等人(2011)Blood 117:1565。
在一些情况下，本公开的核酸的免疫细胞特异性启动子可以是下述中的启动子：B29基因启动子、CD14基因启动子、CD43基因启动子、CD45基因启动子、CD68基因启动子、IFN-β基因启动子、WASP基因启动子、T细胞受体β链基因启动子、V9γ(TRGV9)基因启动子、V2δ(TRDV2)基因启动子等。
在一些情况下，包含编码本公开的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组表达载体或包含在重组表达载体中。在一些实施方案中，重组表达载体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒(AAV)构建体、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组逆转录病毒构建体等。在一些情况下，包含编码本公开的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组慢病毒载体。在一些情况下，包含编码本公开的回路或其一种或多种组分的核苷酸序列的核酸是重组AAV载体。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549，1994；Borras等人，Gene Ther 6:515 524，1999；Li和Davidson，PNAS 92:7700 7704，1995；Sakamoto等人，Hum Gene Ther 5:1088，1097，1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO95/00655)；腺相关病毒(参见例如Ali等人，HumGene Ther 9:81 86，1998，Flannery等人，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人，InvestOpthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人，Gene Ther 4:683 690,1997,Rolling等人，Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人，Hum Mol Genet 5:591 594,1996；Srivastava，WO 93/09239,Samulski等人，J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人，PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人，J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒、哈维斯肉瘤病毒、禽类白细胞瘤病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)；等等。在一些情况下，载体是慢病毒载体。同样合适的是转座子介导的载体，例如piggyback载体和睡美人(sleeping beauty)载体。
在一些情况下，本公开的核酸可具有编码两种或更多种多肽的单个序列，其中通过在单独编码区之间存在促进单独多肽的单独表达的序列元件而使得两种或更多种多肽的表达成为可能。这样的序列元件在本文中可称为双顺反子促进序列，其中双顺反子促进序列在两个编码区之间的存在使得来自存在于单个核酸序列中的每个编码区的分离的多肽的表达成为可能。在一些情况下，核酸可包含编码存在于单个核酸中的两个多肽的两个编码区，在编码区之间具有双顺反子促进序列。可以采用用于从单个核酸序列分开表达多个单独多肽的任何合适的方法，并且类似地，可以采用双顺反子表达的任何合适的方法。
在一些情况下，双顺反子促进序列可允许从单个核酸序列表达由可切割连接多肽临时连接的两个多肽。在此类情况下，双顺反子促进序列可以包括一个或多个编码的肽切割位点。合适的肽切割位点包括自切割肽的那些以及由单独的酶切割的那些。在一些情况下，双顺反子促进序列的肽切割位点可以包括呋喃酮切割位点(即，双顺反子促进序列可以编码呋喃酮切割位点)。
在一些情况下，双顺反子促进序列可以编码自切割肽序列。有用的自切割肽序列包括但不限于例如肽2A序列，包括但不限于例如T2A序列。
在一些情况下，双顺反子促进序列可以包括一个或多个间隔子编码序列。间隔子编码序列通常编码氨基酸间隔子，在一些情况下也称为肽标签。有用的间隔子编码序列包括但不限于例如V5肽编码序列，包括编码V5肽标签的那些序列。
来自单个核酸序列的多个编码序列的多顺反子或双顺反子表达可以利用但不限于采用弗林蛋白酶(furin)切割、T2A和V5肽标签序列的那些方法。例如，在一些情况下，可以采用基于内部核糖体进入位点(IRES)的系统。可采用任何合适的双顺反子表达方法，包括但不限于例如Yang等人(2008)Gene Therapy 15(21):1411-1423；Martin等人(2006)BMCBiotechnology.6:4中所述的那些，其公开内容通过引用整体并入本文。
细胞
如上所述，本公开还提供了免疫细胞。本公开的免疫细胞包括含有一种或多种所述核酸、表达载体等(编码所述回路)的免疫细胞。本公开内容的免疫细胞包括哺乳动物免疫细胞，其包括例如经基因修饰以产生本公开内容的回路的组分或如上所述的核酸已另外引入至其的那些。在一些情况下，所述免疫细胞已经用一种或多种核酸和/或表达载体转导以表达本公开的回路的一种或多种组分。
合适的哺乳动物免疫细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在一些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞、免疫细胞祖细胞或免疫干细胞。例如，细胞是从个体获得的淋巴样细胞，例如淋巴细胞或其祖细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的细胞毒性细胞或其祖细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的干细胞或祖细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白细胞(leukocyte)。“免疫细胞”包括例如淋巴细胞，即淋巴细胞(T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞)和骨髓衍生的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、T调控细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。“B细胞”包括B细胞谱系的成熟和不成熟细胞，包括例如表达CD19的细胞，如Pre B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞和浆母细胞。免疫细胞还包括B细胞祖细胞如Pro B细胞和B细胞谱系衍生物如浆细胞。
编码本公开的回路的免疫细胞可以通过任何方便的方法产生。编码所述回路的一种或多种组分的核酸可以稳定或瞬时引入所述免疫细胞，包括所述核酸仅暂时存在、保持在染色体外或整合到宿主基因组中。所述核酸的引入和/或所述免疫细胞的基因修饰可以在体内、体外或离体进行。
在一些情况下，引入所述核酸和/或基因修饰离体进行。例如，从个体获得T淋巴细胞、干细胞或NK细胞；并且从个体获得的细胞被修饰以表达本公开的回路的组分。经修饰的细胞因此可以被重定向到一种或多种选择的抗原，如存在于引入的回路组分上的一种或多种抗原结合结构域所定义的。在一些情况下，经修饰细胞经离体调节。在其他情况下，将细胞引入个体(例如，从其获得细胞的个体)和/或已经存在于个体中；并且例如通过在体内向个体施用核酸或载体来调节细胞。
回路
如上所述，本公开还提供了由核酸序列编码的回路，在一些情况下也称为分子回路。在一些情况下，这样的回路可以存在和/或配置在表达载体和/或表达盒中。在一些情况下，本发明回路的主题核酸可包含在载体内，包括例如病毒载体和非病毒载体中。在一些情况下，此类回路可存在于细胞诸如免疫细胞中，或者可通过各种方式引入细胞中，包括例如通过使用病毒载体引入。在一些情况下，可以对细胞进行基因修饰以编码主题回路，其中这种修饰可以根据需要是有效地永久的(例如，整合的)或瞬时的。
本公开的回路的编码组分通常至少包括至少一种编码的BTTS和至少一种编码抗的原特异性治疗剂。本公开的回路整合多个输入，其中这样的输入包括抗原，诸如一种或多种引发性抗原(即，单独的MOG或与例如IL13RA2、IL13RA1、神经连接蛋白、NRXN1、PTPRZ1、NRCAM、CDH10、PCDHGC5、CD70、CSPG5、BCAN、GRM3、CRB1、GAP43、ATP1B2、PTPRZ1-MET和/或其组合的组合)、一种或多种靶向性抗原(例如，EphA2、EphA3、IL13R(例如，IL13RA1或IL13RA2)、EGFR、ERBB2和/或其组合)等。本公开的回路的组分的表达可以取决于回路的另一组分的状态(即，有活性/无活性状态)。例如，抗原特异性治疗剂的表达可取决于BTTS的激活，其中BTTS通过结合BTTS特异性抗原而被激活。在一些实例中，回路的一个组分对另一个组分的依赖性可以由调控序列来介导。例如，编码回路的第二组分的序列可以可操作地链接到响应于回路的第一组分的激活的调控序列，从而将第二组分的表达与第一组分的激活连锁。
在一些实施方案中，回路可包含至少两个BTTS(例如，两个、三个或四个BTTS)和抗原特异性治疗剂，其中BTTS可串联连接(其中一个BTTS激活另一个BTTS)，其中BTTS中的一个结合MOG并且其他BTTS中的至少一个结合另一种抗原，例如另一种癌症或组织特异性抗原。使用多于一种BTTS可以使治疗更特异并且具有更少的副作用。
在本公开的回路中使用BTTS促进表达和/或活性与分子结合事件的连锁。在PCT公开号WO2016/138034、美国专利申请公开号US2016-0264665A1和授权的美国专利号9,670,281和9,834,608中已经描述了涉及结合触发型转录开关的系统及其组分；其公开内容通过引用整体并入本文。
本公开的回路可以以各种方式配置。在一些情况下，两个或更多个多肽或单一多肽的结构域的独立活性和/或诱导表达可产生逻辑门控回路。这样的逻辑门控回路可以包括但不限于例如“AND门控”、“OR门控”、“NOT门控”及其组合，包括例如高阶门控，包括例如高阶AND门控、高阶OR门控、高阶NOT门控、高阶组合门控(即，使用AND、OR和/或NOT门控的一些组合的门控)。在一些情况下，有用的回路还可以包括IF/THEN门控。
“AND”门控包括需要两个或更多个输入来传播信号的情况。例如，在一些情况下，AND门控允许通过第一多肽或第一多肽结构域的第一输入和取决于第一输入的输出的第二输入进行信号传导。在“AND”门控中，需要两个输入(例如，两个抗原)来通过回路进行信号传导。
“OR”门控包括两个或更多个输入中的任一个可以允许信号的传播的情况。例如，在一些情况下，OR门控允许通过结合两种不同抗原中的任一种来进行信号传导。在OR门控中，任何一个输入(例如，两个抗原中的任一者)可诱发回路的信号传导输出。在一个实施方案中，可以通过使用两个单独的分子或构建体来实现OR门控。在另一个实施方案中，OR门控可以通过使用识别两种抗原的单个构建体实现，包括例如BTTS或抗原特异性治疗剂(例如，CAR或TCR)，其具有两个不同的抗原结合结构域，每个抗原结合结构域结合不同的抗原，并且每个结合事件可以独立地传播信号(例如，诱导回路的下游组分的表达，激活免疫细胞等)。
“NOT”门控包括输入能够防止信号传播的情况。例如，在一些情况下，NOT门控抑制通过本公开的回路的信号传导。在一个实施方案中，NOT门控可以防止回路的组分的表达，或者回路的特定组分(例如，CAR或TCR)的激活。
“IF/THEN”门控包括其中门控的输出取决于第一输入。例如，在一些实例中，如果(IF)第一输入存在，则(THEN)信号传导可以通过第二输入进行，并且其中第一输入不存在，则信号传导可不进行。包括IF/THEN门控的回路的非限制性示例是具有至少两个受体的回路，其中第一受体响应于输入而诱导第二受体的表达，第二受体响应于第二输入而具有一些输出。因此，如果(IF)存在第一受体的第一输入，则(THEN)表达第二受体，并且信号传导可以经由第二输入通过第二受体进行以产生输出。IF/THEN门控可以或可以不包括OR组分(例如，具有OR功能的受体)。
图4中描绘了IF/THEN门控的非限制性示例，包括具有OR功能的示例。图4的第一(顶部)细胞中描绘的回路包括对抗原“A”应答的BTTS和结合抗原“C”的抗原特异性治疗剂。注意，尽管抗原特异性治疗剂被描绘为CAR，但是本公开不限于此，并且其他抗原特异性治疗剂可以容易地被取代。在第一(顶部)回路中，如果(IF)存在抗原A，则(THEN)基于抗原C的存在诱导细胞杀伤。
在各种实施方案中，可以采用OR功能，包括其中主题回路的一个或多个组分包括OR功能。如图4中所示的第二、第三和第四细胞中所示，OR功能可以由BTTS、抗原特异性治疗剂或两者提供，所述BTTS、抗原特异性治疗剂或两者对两种或更多种抗原具有特异性并且由两种或更多种抗原触发或激活。
例如，在图4所示的第二(从顶部)细胞中，使用包括响应抗原“A”的BTTS和与抗原“C”或抗原“D”结合并被其激活的抗原特异性治疗剂的回路。在这样的回路中，如果(IF)存在抗原A，则(THEN)基于抗原C或(OR)抗原D的存在而诱导细胞杀伤。注意，还可以诱导杀伤表达抗原C和抗原D的细胞，以及杀伤仅表达抗原C或仅表达抗原D的细胞。
在图4中所示的第三(从顶部)细胞中，采用包括响应抗原“A”或抗原“B”的BTTS和结合到抗原“C”并由抗原“C”激活的抗原特异性治疗剂的回路。在这样的回路中，如果(IF)存在抗原A或抗原B，则(THEN)基于抗原C的存在诱导细胞杀伤。注意，编码主题回路的免疫细胞可以被引发以杀伤仅表达抗原A、仅表达抗原B或表达抗原A和B两者的细胞。
在图4所示的第四(底部)细胞中，使用包括响应抗原“A”或抗原“B”的BTTS和与抗原“C”或抗原“D”结合并被其激活的抗原特异性治疗剂的回路。在这样的回路中，如果(IF)存在抗原A或(OR)抗原B，则(THEN)基于抗原C或抗原D的存在而诱导细胞杀伤。注意，编码主题回路的免疫细胞可以被引发以杀死仅表达抗原A、仅表达抗原B或表达抗原A和B两者的细胞。还应注意，还可以诱导杀伤表达抗原C和抗原D的细胞，以及杀伤仅表达抗原C或仅表达抗原D的细胞。
在一些情况下，OR功能的使用可以具有某些优点。例如，具有OR门控功能的上述回路(即，图4中的第二、第三和第四细胞)及其变体提供了对异质性癌症逃逸的抗性和改善的功效，因为在不受理论束缚的情况下，癌症(或肿瘤)逃逸将需要包含或进化/产生不表达两种引发性和/或杀伤性抗原中的任一种的细胞。
在一些情况下，存在于BTTS或抗原特异性治疗剂上的多个抗原结合结构域可以为本文所述的分子回路提供OR门控能力。例如，在一些情况下，具有两个不同抗原结合结构域的BTTS可响应于第一抗原(例如，第一引发性抗原)或(OR)第二抗原(例如，第二引发性抗原)。在一些情况下，具有两个不同的抗原结合结构域的抗原特异性治疗剂(例如，CAR、TCR等)可响应于第一抗原(例如，第一靶向性抗原)或(OR)第二抗原(例如，第二靶向性抗原)。
在一些例子中，这些OR门控可与其它门控(包含AND门控)组合。例如，编码具有两个不同抗原结合结构域的OR门控抗原特异性治疗剂的核酸可以可操作地连接至响应BTTS的启动子，BTTS响应引发性抗原。因此，在结合引发性抗原时，BTTS驱动响应于两种不同抗原的抗原特异性治疗剂的表达，产生AND-OR门控。
在一些情况下，OR门控可用于本公开的回路中以产生用于两种或更多种靶向性抗原(或两种或更多种杀伤性抗原)的OR门控。例如，在一些情况下，回路可以被配置成使得用回路基因修饰的细胞包含编码抗原特异性治疗剂的核酸序列，所述抗原特异性治疗剂结合到由靶向癌细胞表达(或由两种不同的靶向癌细胞表达)的第一靶向性/杀伤性抗原或第二靶向性/杀伤性抗原，从而产生通过第一靶向性/杀伤性抗原或第二靶向性/杀伤性抗原激活(例如，激活用于细胞杀伤)的细胞。在一些情况下，本公开的回路可以包括编码第一抗原特异性治疗剂和第二抗原特异性治疗剂的核酸序列，其各自结合不同的靶向性/杀伤性抗原。这种双抗原特异性治疗剂OR门控中有用的抗原包括但不限于例如EphA2、EphA3、IL13R(例如IL13RA1或IL13RA2)、EGFR和ERBB2。
在一些情况下，OR门控可用于允许同时以反式和顺式靶向细胞。例如，在一些情况下，OR门控所导向的第二杀伤性抗原可以由引发细胞表达。在一些情况下，用于靶向的OR门控可用于靶向在EGFRvIII(-)GBM的细胞内不相互排斥的两种抗原(即，GBM细胞具有重叠但不完全同时的两种抗原表达)。例如，在一些情况下，OR门控所靶向的第二杀伤性抗原可由也表达第一杀伤性抗原的GBM细胞亚群表达。然而，癌症可进一步包括表达第二杀伤性抗原但不表达第一杀伤性抗原的细胞亚群。在一些情况下，OR门控中使用的第一和第二杀伤性抗原在异质性癌症的细胞中将不具有重叠表达。因此，在一些情况下，第二杀伤性抗原可由除引发细胞之外的异质性EGFRvIII(-)GBM的细胞和/或表达第一杀伤性抗原的GBM细胞表达。
试剂盒
本公开提供了用于实施如本文所述的方法和/或构建一个或多个回路、其组分、编码回路或其组分的核酸等的试剂盒。在一些情况下，所述试剂盒包含载体，例如表达载体或递送载体，其包含编码本公开的回路的核苷酸序列或其一个或多个部分。递送载体可以提供在递送装置中，或者可以单独提供，例如包括递送载体的试剂盒并且递送装置作为试剂盒的单独组分。
在一些情况下，所述试剂盒包含细胞，例如宿主细胞或宿主细胞系，其用包含编码本公开的回路或其一部分的核苷酸序列的核酸进行基因修饰或将进行基因修饰。在一些情况下，所述试剂盒包含细胞，例如宿主细胞，其用包含编码本公开的回路的核苷酸序列的重组表达载体进行基因修饰或将进行基因修饰。试剂盒组分可以在同一容器中，或在单独的容器中。
任何上述试剂盒还可包括一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可选自：稀释缓冲液；重构溶液；洗涤缓冲液；对照试剂；对照表达载体；编码阴性对照的核酸(例如，缺少一种或多种关键元件的回路)；编码阳性对照多肽的核酸等。
除了上述组分之外，主题试剂盒还可包括使用试剂盒的组分实施主题方法的说明书。用于实施主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可印刷在基底上，例如纸或塑料等。因此，说明书可作为包装插入物存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在其他实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但是提供了用于例如经由互联网从远程源获得说明书的方式。该实施方案的示例是包括可以查看说明书和/或可以从其下载说明书的网址的试剂盒。与说明书一样，用于获得说明书的该装置被记录在合适的基底上。
实施方案
在上文或下文描述的任何实施方案中，可以使用替代的引发性抗原钙粘蛋白10(CDH10)、短蛋白聚糖核心蛋白(BCAN)或硫酸软骨素蛋白聚糖5(CSPG5)代替MOG。
实施方案1.治疗胶质母细胞瘤的系统，所述系统包含：(a)编码结合触发型转录开关(BTTS)的核酸序列，所述结合触发型转录开关结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、钙粘蛋白10(CDH10)、短蛋白聚糖核心蛋白(BCAN)或硫酸软骨素蛋白聚糖5(CSPG5)；(b)编码抗原特异性治疗剂的核酸序列，所述抗原特异性治疗剂结合由胶质母细胞瘤表达的杀伤性抗原；和(c)可操作地连接到(b)的调节序列，所述调节序列响应于所述结合触发型转录开关；其中所述结合触发型转录开关与MOG、CDH10、BCAN或SCPG5的结合激活结合所述杀伤性抗原的抗原特异性治疗剂的表达。
实施方案2.实施方案1所述的系统，其中所述BTTS是一种或多种多肽，所述多肽在结合MOG、CDH10、BCAN或SCPG5后经历蛋白水解切割以释放激活(c)的调节序列的基因表达调节剂。
实施方案3.实施方案1-2中任一项所述的系统，其中所述BTTS包含：(i)包含MOG、CDH10、BCAN或SCPG5特异性抗体的抗原结合区的细胞外结构域；(ii)包含一个或多个蛋白水解切割位点的蛋白水解可切割序列；和(iii)细胞内结构域，其中所述抗原结合区与MOG、CDH10、BCAN或SCPG5的结合诱导所述一个或多个蛋白水解切割位点处的序列切割，从而释放所述细胞内结构域，并且其中所述细胞内结构域通过(c)的调节序列诱导(b)的抗原特异性治疗剂的表达。
实施方案4.实施方案1-3中任一项所述的系统，其中所述杀伤性抗原选自由以下组成的组：肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A型受体3(EphA3)、白介素-13受体亚基α-1(IL13RA1)、白介素-13受体亚基α-2(IL13RA2)、表皮生长因子受体(EGFR)和erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2或Her2)。
实施方案5.实施方案1-4中任一项所述的系统，其中(b)的抗原特异性治疗剂是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，或具有类似的靶向性免疫细胞杀伤功能的不同分子系统。
实施方案6.实施方案1-5中任一项所述的系统，其中所述BTTS结合MOG、CDH10、BCAN或SCPG5和一种或多种其它细胞表面抗原，所述其它细胞表面抗原增加所述抗原特异性治疗剂表达的特异性或广度。
实施方案7.实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性治疗剂结合由胶质母细胞瘤表达的两种不同杀伤性抗原。
实施方案8.实施方案7所述的方法，其中所述抗原特异性治疗剂结合EphA2和IL13Rα2.9。
实施方案9.根据前述实施方案任一项所述的方法，其中所述BTTS为synNotch受体、A2力传感器、模块化外细胞传感器架构(MESA)受体或TANGO受体。
实施方案10.包含实施方案1-9中任一项所述的系统的细胞，其中所述细胞表达所述结合触发型转录开关。
实施方案11.实施方案10所述的细胞，其中所述细胞作为免疫细胞。
实施方案12.实施方案10-11中任一项所述的细胞，其中所述抗原特异性治疗剂在表达时是在细胞表面上表达。
实施方案13.实施方案10-12中任一项所述的细胞，其中所述细胞是髓样细胞。
实施方案14.实施方案10-13中任一项所述的细胞，其中所述细胞是淋巴样细胞。
实施方案15.实施方案14所述的细胞，其中所述淋巴样细胞选自由以下组成的组：T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞。
实施方案16.实施方案10-15中任一项所述的细胞，其中所述抗原特异性治疗剂在表达时是由细胞分泌。
实施方案17.治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用实施方案10-16中任一项所述的免疫细胞：其中所述结合触发型转录开关与MOG、CDH10、BCAN或SCPG5的结合激活所述抗原特异性治疗剂的表达，所述抗原特异性治疗剂结合所述杀伤性抗原并诱导表达所述杀伤性抗原的胶质母细胞瘤细胞的杀伤。
实施方案18.实施方案15所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤是EGFRvIII阴性胶质母细胞瘤。
实施方案19.任何先前的实施方案，其中所述结合触发型转录开关(BTTS)结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
实施方案20.任何先前的实施方案，其中结合触发型转录开关(BTTS)与钙粘蛋白10(CDH10)结合。
实施方案21.任何先前的实施方案，其中所述结合触发型转录开关(BTTS)结合至品种核心蛋白(BCAN)。
实施方案22.任何前述实施方案，其中所述结合触发型转录开关(BTTS)结合硫酸软骨素蛋白聚糖5(CSPG5)。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为的本发明的范围，也不旨在表示下文的实验是全部或仅进行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等等。
实施例1：使用引发/杀伤回路治疗EGFRvIII(-)胶质母细胞瘤
表皮生长因子受体(EGFR)基因的扩增是与胶质母细胞瘤(GBM)相关的最常见的遗传改变，其导致跨膜酪氨酸激酶受体EGFR的过表达。显示扩增的EGFR的GBM通常过度表达受体变体III(EGFRvIII)。然而，某些形式的GBM不显示EGFRvIII表达。尽管缺乏EGFRvIII表达，但在细胞水平，EGFRvIII(-)GBM肿瘤通常是异质性的。
在GBM中可能潜在地被靶向的已知单一抗原无一在所有GBM肿瘤细胞中绝对特异性且均质性地存在。此外，在GBM中可能潜在地被靶向的许多抗原也在其它正常组织中表达。因此，即使组合EGFRvIII(-)GBM中两种或更多种独立被靶向的抗原，仍然不会预期完全有效(即，不是GBM的所有细胞都将被靶向)或预期产生毒性交叉反应性(即，非癌旁观者细胞/组织也将被靶向)。
在该实施例中，开发了使用EGFRvIII(-)肿瘤中两种或更多种抗原的靶向特异性的新方法。该方法采用GBM表达的引发性抗原来引发基于第二抗原(或多种抗原的组合)靶向和杀伤肿瘤细胞的第二分子的表达。即使第二抗原不是完全肿瘤特异性的，该方法也是有效的。不受理论束缚，本质上，这种方法利用两种或更多种不完全抗原来开发组合T细胞，其显示出高选择性并且对抗原表达异质性不敏感。
设计了这样的回路，其中基于引发性抗原引发治疗细胞，诱导杀伤剂(例如CAR、BiTE等人)的表达，所述杀伤剂然后基于均质性抗原进行杀伤(参见图1A)。换言之，在该实施例中，基于癌症特异性但异质性的抗原对回路进行引发，然后通过靶向均质性表达的抗原激活回路以在引发性抗原细胞周围的“杀伤区”中进行杀伤(参见图1B)。杀伤区大小可基于多种因素调节，例如但不限于杀伤性受体(例如CAR)稳定性或使用细胞外扩散剂作为杀伤性有效载荷(例如双特异性衔接子)(参见图1C和1D)。
如图1A-1D所示，治疗细胞(例如，用如图1A所示的回路工程化改造的细胞)的引发在治疗细胞周围产生杀伤区，使得即使当这种肿瘤细胞不表达引发性抗原时，也靶向表达杀伤性抗原的肿瘤细胞。在图1B中示意性地示出了这种情况的一个实例，其示出了由异质性表达引发性抗原的肿瘤引发的治疗细胞，显示为T细胞。引发的治疗细胞靶向并杀伤其附近的肿瘤细胞，包括表达杀伤性抗原但不表达引发性抗原的那些肿瘤细胞。以这种方式，肿瘤附近的细胞引发治疗细胞以在引发的细胞周围产生杀伤区，导致所有肿瘤细胞的有效清除。
杀伤区的大小可以根据需要加宽或调整，例如，通过使用可扩散的有效载荷、所采用的治疗剂的稳定性(例如，CAR稳定性)。例如，图1C描绘了包括synNotch结合触发型转录开关的回路，该转录开关被配置为结合诱导可扩散CAR头部表达的引发性抗原(圆圈)。可扩散CAR头部对杀伤性抗原(三角形)具有特异性，并且被CAR的一部分结合，在图1C中称为“分裂式CAR”，其包括在抗原结合时T细胞活化所需的细胞内信号传导组分。因此，通过扩散远离引发的细胞，可扩散CAR头部用于调节更远的T细胞中的抗原识别和靶细胞杀伤，所述更远的T细胞表达分裂式CAR但不一定表达可扩散CAR头部。
如图1D的左图所示，通过使用包括驱动传统CAR(即，具有抗原识别结构域和细胞内信号传导组分的单个连续链)表达的synNotch的回路，表达杀伤性抗原的非引发癌细胞的杀伤半径保持相对较短。相比之下，如图1D的右图中所描绘，通过使用包括可扩散正交双特异性衔接子(例如可扩散CAR头部)的回路，加宽了表达杀伤性抗原的非引发癌细胞的杀伤半径。因此，可以根据需要控制期望的杀伤半径。在一些情况下，例如，可能需要短杀伤半径，其中杀伤性抗原在非癌组织(即，旁观者组织)中表达。在其它情况下，可能需要宽杀伤半径，其中例如相对较少的表达引发性抗原的细胞扩散地存在于受试者的整个癌区域中。
实施例2：测试用于胶质母细胞瘤的SynNotch受体抗原靶标
在该实施例中，在用于靶向GBM的T细胞中测试采用靶向各种靶抗原的synNotch受体的回路。具体地，将人原代CD8+T细胞用针对胶质母细胞瘤的synNotch受体抗原靶标库(即EGFRvIII、NRCAM、EphA2、EphA3、IL13Ra2、Her2、EGFR和PTRZ1)和控制报告蛋白(eGFP)表达的相应应答元件来工程化改造。这些CD8+synNotch AND-门控T细胞被配置成首先通过synNotch受体感测相应的表面GBM抗原，然后如果检测到相应的表面GBM抗原，则表达eGFP报告蛋白。原代CD8+synNoch AND-门控T细胞单独培养(“仅T细胞”)或与GBM细胞共培养(“T细胞+GBM6”)。所用的GMB细胞是GBM6细胞，一种人患者来源的异种移植物(PDX)成体胶质母细胞瘤细胞系。图2A提供了报告蛋白(eGFP)表达水平的直方图，显示了针对各种抗原的synNotch受体活化。
图2B提供与图2A相关的量化。具体地，定量CD8+synNotch AND-门控原代T细胞活化减去GFP表达的基础渗漏，GFP表达独立于synNotch受体与其靶抗原的结合。这些数据显示了用特定GBM6细胞系测试的构建体的各种激活水平，证明了可以靶向各种抗原，例如，取决于所需的激活灵敏度水平和/或靶细胞群体中特定抗原的存在和/或水平。
进一步评估了采用IL13Ra2和EphA2抗原靶向的回路。具体地，用抗-IL13Ra2synNotch受体或抗-EphA2 synNotch受体与控制抗-IL13Ra2/EphA2—4-1BBz CAR GFP受体表达的相应应答元件工程化改造人原代CD8+T细胞。这些CD8+synNotch AND-门控细胞首先分别经由synNotch受体感测表面EphA2或IL13Ra2，然后细胞表达抗-IL13Ra2/EphA2 CAR并被引发用于响应于CAR抗原结合而激活。图3A提供了CD8+synNotch AND-门控原代T细胞与原代GBM细胞系(SF11411)24小时共培养之后的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)流式细胞图。靶标SF11411在圆形门中指示。如与未经转导的对照相比，IL13Ra2 synNotch和EphA2synNotch图中SF11411门中的细胞减少所示，靶向任一抗原的synNotch AND-门控T细胞导致被靶向的SF11411 GBM细胞的杀伤。
在存在(“T细胞+SF11411”)和不存在(“仅T细胞”)靶SF11411 GBM细胞的情况下，评估CAR的表达(通过GFP报告蛋白测量)。图3B提供了在这些情况下a-IL13Ra2/EphA2 CARGFP受体表达水平的直方图，表明与单独培养工程化T细胞时相比，当工程化T细胞与SF11411共培养时，CAR被表达和/或表达增加。
图3C提供了与图3A相关的量化，具体示出了由IL13Ra2 synNotch和EphA2synNotch回路诱导的重复CD8+synNotch AND-门控原代T细胞的细胞毒性的定量。图3D提供了与图3B相关的量化，特别显示了CD8+synNoch AND-门控原代T细胞活化的定量减去GFP表达的基础渗漏，GFP表达独立于synNoch受体与其靶抗原的结合。如在数据中可见，在GBM靶细胞(SF11411)的存在下诱导编码的CAR的表达。
总的来说，这些数据表明，在靶GBM细胞存在下，可以在受试者回路中使用各种抗原来驱动抗原特异性治疗剂(例如CAR)的表达。此外，由于不存在诱导治疗剂表达的抗原，靶治疗剂在不存在靶GBM细胞的情况下基本上不表达。相应地，这些数据证明了本文所述回路对GBM细胞的靶向性和有效杀伤。
实施例3：多抗原CAR T细胞精确且持久地治疗异质性胶质母细胞瘤
以下实施例显示多抗原CAR T细胞可以精确且持久地治疗异质性胶质母细胞瘤。因为缺乏肿瘤特异性且均质性表达的抗原，用嵌合抗原受体T细胞治疗实体癌具有挑战性。在胶质母细胞瘤中，表皮生长因子受体变体III新抗原是肿瘤特异性的但异质性地表达，这允许肿瘤逃逸。相反，更均质性表达的胶质母细胞瘤抗原由于在其它正常器官中表达而不理想，产生潜在的交叉反应性毒性。这里表明，多抗原识别回路具有克服这些孪生挑战的灵活性和精度。使用synNotch受体作为特异性预过滤器(识别新抗原或组织特异性抗原)，可以将CAR T细胞的细胞毒性活性限制在局部部位，使得能够通过不是绝对肿瘤特异性的抗原进行受控杀伤。通过整合多个不完全但互补的抗原，可以改善针对胶质母细胞瘤的T细胞的特异性和持久性，并提供适用于其他实体瘤的通用识别策略。
该方法涉及“引发-与-杀伤”双重抗原识别T细胞回路：识别肿瘤特异性但异质性的抗原(EGFRvIII)或脑特异性抗原(例如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG))的引发性抗原的synNoch受体用于局部诱导识别肿瘤相关抗原(例如杀伤性抗原：EphA2或IL13Rα2)的CAR的表达，所述肿瘤相关抗原在整个肿瘤中相对均匀但不一定限于肿瘤。带有这些类型的回路的T细胞可以被引发性抗原局部活化以介导针对表达杀伤性抗原的邻近细胞的特异性细胞毒性。这种细胞毒性被认为在引发细胞周围的局部“爆炸半径(blast radius)”中操作，从而避免在表达杀伤性抗原但缺乏引发性抗原的远端正常组织中的无差别杀伤。这种类型的回路在空间上整合了跨多个相邻细胞的两个不完全但互补的抗原靶标的识别。引发性抗原提供特异性，而杀伤性抗原确保治疗攻击的同质性。
已经表明，表达这种类型的引发-与-杀伤回路的T细胞在治疗小鼠中的异质性GBMPDX肿瘤方面显示出显著改善的有效性和持久性，同时显示出与仅表达杀伤性抗原的组织没有交叉反应性。这种类型的T细胞回路可以整合跨肿瘤中的多个相邻细胞的信息，并且提供强大的工具以克服识别和消除实体瘤的基本挑战。利用这些回路，可以组合单独不完全的抗原以产生更精确和有效识别的多抗原肿瘤特征。该工作清楚地证明了基于细胞的治疗如何在治疗平台之间是独特的，因为它们可以被编程以基于细微差别的多参数特征来识别和治疗疾病。
实施例3结果
维持高特异性但可以克服抗原异质性的双抗原引发-与-杀伤回路的设计
常规的单抗原靶向的CAR T细胞允许不表达靶抗原的肿瘤细胞逃逸，并且因此在某些情况下可能对具有异质性表达的抗原无效(图5a)。双抗原引物发-和-杀伤CAR T细胞回路(Morsut等人，2016；Roybal等人，2016b)能够克服肿瘤抗原的异质性表达(图5b)。这些回路使用组成性表达的synNotch受体来识别肿瘤特异性抗原A(称为引发性抗原)。抗原A的识别导致synNotch受体的激活和随后的蛋白水解切割，释放细胞内转录活化结构域，其可以驱动识别抗原B(称为杀伤性抗原)的CAR的表达。利用这种类型的回路，T细胞不表达针对杀伤性抗原的CAR，除非首先由synNotch受体激活引发。
该回路的一个灵活特征是引发性抗原与杀伤性抗原的选择。理想地，引发性抗原应该是高度肿瘤特异性的，但原则上不需要由肿瘤同质性表达。相反，杀伤性抗原将不需要是绝对肿瘤特异性的(因为引发性抗原将提供特异性)，而是应在整个肿瘤细胞中同质性表达。因此，利用这种类型的回路，T细胞可以被高度特异性但异质性的抗原局部引发，然后被活化以在引发信号周围的局部半径内介导表达杀伤性抗原的肿瘤细胞的杀伤。简而言之，具有不同缺点的两个不完全抗原可以通过这种双抗原回路以互补的方式被组合识别。以下描述了设计这种回路的两种方式——一种由肿瘤特异性新抗原引发，另一种由组织特异性抗原引发(图5b)。
识别异质性GBM的回路设计：通过EGFRvIII引发并通过EphA2或IL13Rα2杀伤
如图6a中所示的T单元回路被设计成识别和杀伤EGFRvIII-阳性GBM。GBM特异性的新抗原EGFRvIII作为引发性抗原被靶向。尽管潜在的交叉反应性不是问题，但EGFRvIII新表位在GBM中异质性表达(肿瘤中10-95％的细胞表达EGFRvIII；O’Rourke等人，2017)。在最近的评估靶向EGFRvIII的CAR T细胞的临床试验中，尽管EGFRvIII阳性GBM细胞减少，但肿瘤复发，最可能是由于EGFRvIII阴性细胞的存活和再生长(O’Rourke等人，2017)。总之，从特异性的角度来看，EGFRvIII是优异的靶标，但其在整个肿瘤中的异质性表达使其作为杀伤性抗原是不理想的。
为了杀伤靶标，我们关注肝配蛋白A型受体2(EphA2)和IL13受体α2(IL13Rα2)。两种抗原均由绝大多数GBM细胞表达且不存在于正常大脑中，但也在一些非肿瘤组织中以低水平表达(即，这些是GBM相关抗原而不是GBM特异性抗原)(Bielamowicz等人，2018；Hegde等人，2013b；Wykosky等人，2005)。缺乏完全的肿瘤特异性使得这些GBM相关抗原对于常规单靶标CAR T细胞疗法方法而言不理想。然而，如果肿瘤选择性由引发性抗原提供，则这些可以用作有效的杀伤性抗原。
因此，我们改造的引发-与-杀伤回路利用synNotch受体识别EGFRvIII，这然后诱导识别EphA2或IL13Rα2的CAR的表达(α-EGFRvIII synNotchα-EphA2/IL13α2 CAR)。使用串联CAR(关于回路设计的细节参见图11)，其中含有EphA2单链抗体的细胞外区域融合到IL13突变蛋白(IL13配体的变体针对IL13α2的亲和力高于针对IL13Rα1的亲和力)(Kahlon等人，2004)。据推理，靶向多种杀伤性抗原(EphA2 OR IL13Rα2)而不是单一抗原将通过杀伤性抗原的丧失进一步降低肿瘤逃逸的风险。
对于靶细胞，使用U87 GBM肿瘤细胞系，其对于EphA2和IL13Rα2都是阳性的，但对于EGFRvIII是阴性的(Chow等人，2013；Krenciute等人，2016)。我们通过用EGFRvIII稳定转染来构建U87细胞系的EGFRvIII阳性版本(U87-EGFRvIII)(Johnson等人，2015；Ohno等人，2013)。U87-EGFRvIII-阳性和U87-EGFRvIII-阴性细胞可以不同比例混合，以概括在GBM患者(10-100％引发细胞)中观察到的不同水平的异质性(图6b)。用α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR回路工程化改造的原代人CD8+T细胞进行体外细胞毒性测定。在该模型中，T细胞由肿瘤中的EGFRvIII阳性细胞引发，诱导它们表达可杀伤邻近肿瘤细胞的CAR，包括缺乏EGFRvIII表达的那些肿瘤细胞(图6c)。
发现用α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR引发-与-杀伤回路工程化改造的CD8+T细胞可在体外根除异质性U87 GBM细胞群体，甚至使用低至10％的EGFRvIII阳性引发细胞(图6d，e)。相反，在没有引发细胞的情况下没有观察到杀伤。在这些测定中，在72小时内跟踪CAR表达的诱导和两种不同肿瘤细胞群体(EGFRvIII-阳性和EGFRvIII-阴性)的杀伤动力学(关于CAR诱导参见图11d)。在低至10％引发细胞的情况下观察到有效清除(p＝.0149；t检验)，但与50％引发细胞相比，杀伤稍慢(图2d)。总之，这些体外杀伤研究表明，引发-与-杀伤回路代表了一种有前途的策略，其可以显著减少由于异质性导致的肿瘤逃逸的机会。
具有α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR回路的T细胞有效抑制脑中异质性EGFRvIII-阳性GBM肿瘤的生长，而不影响缺乏引发性抗原的共移植侧腹肿瘤
基于这些体外数据，在GBM异种移植小鼠模型中评估这些引发-与-杀伤CAR T细胞的抗肿瘤活性。首先，为了系统地探索不同程度的EGFRvIII异质性，将U87-EGFRvIII-阴性细胞与U87-EGFRvIII-阳性细胞以不同的比例(0:100；50:50；和100:0)混合，并将混合的群体注射到免疫缺陷性NCG小鼠的脑中(图7a)。用野生型EGFR转染U87-EGFRvIII-阴性细胞以产生EGFRvIII-阴性伴侣细胞系，其以与EGFRvIII-阳性细胞相同的速率生长(参见图12)(Bonavia等人，2012)。通过组织学检查确认EGFRvIII-阴性与EGFRvIII-阳性细胞的混合比在第6天在体内得以保持(图12)。然后将带有这些肿瘤的小鼠用人原代T细胞治疗，所述细胞未被转导(阴性对照)或用引发-与-杀伤回路转导。发现引发-与-杀伤CAR T细胞或对照T细胞都没有显示出0％EGFRvIII-阳性肿瘤的任何清除，但是引发-与-杀伤CAR T细胞显示出50％和100％EGFRvIII-阳性肿瘤的同等有效的肿瘤清除(对照没有显示出清除)(图7b)。因此，在这种情况下，引发-与-杀伤CAR T细胞可以识别并有效地克服具有异质性EGFRvIII表达的肿瘤。
为了评估引发-与-杀伤CAR T细胞的功能是否局限于GBM部位(从而避免与表达杀伤性抗原的其他远端正常组织的交叉反应性)，重要的可能是确定GBM肿瘤部位内已被EGFRvIII引发的T细胞是否能够全身介导任何抗-EphA2或IL13Rα2活性。为此，作为特异性对照，用接种有两种肿瘤的小鼠进行平行实验：脑中的50％EGFRvIII-阳性U87肿瘤和侧腹中的U87-EGFRvIII-阴性肿瘤(图7c)。这里，侧腹肿瘤表示表达杀伤性抗原但不表达引发性抗原的潜在交叉反应性正常组织。
在肿瘤接种后第6天，小鼠接受静脉内(i.v.)施用引发-与-杀伤CAR T细胞或对照未经转导的T细胞(n＝6只/组)。用对照T细胞治疗的所有小鼠在两个部位均显示肿瘤生长，并且迅速达到安乐死终点，中值生存期为25.5天。相反，与对照小鼠相比，用引发-与-杀伤CAR T细胞治疗的小鼠证实了对颅内肿瘤生长的显著抑制(p<0.001；t检验)。然而，重要的是，与对照组(p＝0.4；t检验，图3d和e)相比，用引发-和-杀伤CAR T细胞治疗的小鼠未显示出侧腹肿瘤的统计学显著抑制。在非引发侧腹肿瘤中选择性缺乏杀伤表明，引发-与-杀伤CAR T细胞的细胞毒性活性在空间上局限于表达引发性抗原和杀伤性抗原二者的颅内肿瘤。
引发-与-杀伤CAR T细胞显示CAR的局部诱导表达
为了进一步证实α-EphA2/IL13Rα2 CAR的EGFRvIII诱导的表达限于颅内GBM肿瘤(EGFRvIII-阳性)，工程化改造CAR-GFP构建体，使得T细胞在引发synNotch受体时表达GFP。从双肿瘤小鼠(带有EGFRvIII-阳性颅内肿瘤和EGFRvIII-阴性侧腹肿瘤)中，我们在静脉内(i.v.)施用引发-与-杀伤CAR T细胞后2天从颅内和侧腹肿瘤以及脾中分离出人T细胞。从颅内肿瘤回收的T细胞表达GFP，但从脾或侧腹肿瘤回收的T细胞不表达(图7f)。这些发现表明杀伤CAR的表达局限于引发性抗原周围的局部环境。这些数据支持基于synNotch引发系统的CAR T治疗的开发，作为缓解与具有不完全特异性的肿瘤相关抗原的靶向相关的系统性靶向、脱瘤毒性的安全策略。
引发-与-杀伤CAR T细胞导致异质性表达EGFRvIII的GBM6 PDX肿瘤的完全缓解
评价引发-与-杀伤CAR T细胞在表现出天然存在的EGFRvIII表达异质性的肿瘤模型中的功效(图8a)。GBM6患者来源的异种移植(PDX)肿瘤被鉴定为显示固有EGFRvIII异质性(图8a)的模型，并且最重要的是，显示通过EGFRvIII单抗原CAR逃避治疗的高度可再现能力。当在颅内植入时，GBM6肿瘤在40天内迅速生长并杀死小鼠(图8c)。当用EGFRvIII CAR治疗小鼠时，肿瘤显著收缩，但缓慢且稳定地复发，具有高再现性(图8c，紫色虚线，和图13e)。这些复发性肿瘤显示EGFRvIII表达的丧失(图8g)。进一步的体外研究表明，GBM6培养物在群体内具有EGFRvIII抗原水平不可检测的单个细胞，并且这些细胞对常规EGFRvIII CAR T细胞的杀伤具有抗性(图13c，d)。总之，GBM6模拟了在EGFRvIII CAR临床试验中观察到的基于异质性的逃逸，因此代表了一种理想的模型，在该模型中评估可以克服这些问题的替代T细胞回路。
用α-EGFRvIII synNotch→α-EphA2/IL13Rα2 CAR回路工程化改造的CD8+T细胞可以在体外根除异质性GBM6群体(图13a)。当在脑中携带GBM6肿瘤的NCG小鼠接受静脉内(i.v.)输注对照、未转导的T细胞时，所有小鼠(n＝5)在肿瘤后接种第42天因肿瘤进展死亡(图8b和c)。在初始消退后，用α-EGFRvIII CAR T细胞治疗一致地(n＝6)导致EGFRvIII-阴性肿瘤复发(6只小鼠中有3只到第125天因肿瘤进展死亡)，表明GBM6模型的临床相关性(图8c和g)(O’Rourke等人，2017)。此外，我们在复发的肿瘤中没有检测到静脉内输注的EGFRvIII CAR T细胞，表明缺乏T细胞持久性(图8g)。显著相反，用引发-与-杀伤CAR T细胞治疗的所有小鼠(n＝6)显示GBM6肿瘤的长期完全消毒(图8b，c)。这种更持久和完全的肿瘤清除是高度可再现的(图13e)。尸检后免疫荧光分析显示不存在肿瘤细胞，但在脑实质和脑膜中存在CAR T细胞(图8f)。为了可视化脑局限性引发和CAR表达的诱导，使用EphA2/Il13Rα2 CAR-GFP融合构建体。值得注意的是，在T细胞输注后6天，我们在肿瘤床中检测到GFP阳性引发-与-杀伤CAR T细胞(也针对人CD45染色)，但在脾脏中没有检测到(图8h)。
总之，就其诱导持久和更完全的异质性GBM6模型的消退的能力而言，引发-与-杀伤CAR T细胞优于常规α-EGFRvIII CAR T细胞。因此，这些引发-与-杀伤CAR T细胞既可维持EGFRvIII-引导的肿瘤特异性(如前部分所示)，又可克服EGFRvIII异质性(如此处所示)。
使用脑特异性抗原的引发-与-杀伤GBM回路
这些结果清楚地表明，可以通过在所有肿瘤细胞上不均匀表达的抗原来有效地引发“引发-与-杀伤”CAR T细胞。此外，已经证明，引发-和-杀伤CAR T细胞可以实现一个细胞的反式引发/杀伤-去引发(trans-priming/killing–priming off)，诱导对不同但相邻的细胞的杀伤。因此，假设还可以设计通过识别仅在非恶性细胞上表达的组织特异性抗原来局部引发的T细胞(图9a)。例如，在GBM的情况下，可以设计通过识别脑特异性抗原来引发的T细胞回路，然后基于GBM抗原EphA2和IL-13Rα2引起局部杀伤。抗脑synNotch→EphA2/IL-13Rα2 CAR引发-与-杀伤CAR T细胞将由此提供用于治疗EGFRvIII-阴性GBM患者的潜在方案。
在生物信息学上鉴定了两种脑局限性表面蛋白：钙粘蛋白10(CDH10)——一种脑特异性钙粘蛋白，和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)——神经元髓鞘上的一种表面蛋白(其也是参与多发性硬化的自身抗原)。这些抗原的预测组织表达示于图9b。鉴定结合这些抗原的抗体，并使用这些抗体来构建同源synNotch受体。筛选这些synNotch受体中的几种以鉴定可由表达CDH10或MOG的小鼠同种型的细胞激活的形式(图9c)，因此这些受体可用于介导内源性小鼠脑组织的引发。然后构建其中脑特异性synNotch受体诱导EphA2/IL-13Rα2串联CAR表达的回路(图9d)。发现用α-CDH10或α-MOG synNotch→α-EphA2/IL-13Rα2 CAR回路工程化改造的CD8+T细胞仅可在体外存在反式引发细胞(MOG+或CDH10+细胞)的情况下根除U87 GBM细胞群体或GBM6细胞群体(图14a，b)。
为了测试这些脑抗原引发的回路的体内功效，将GBM6 PDX肿瘤植入NCG小鼠的脑中并用T细胞治疗它们，所述T细胞可基于MOG或CDH10的识别而引发。在这两种情况下，用引发-与-杀伤回路T细胞治疗的大多数小鼠显示出有效的GBM6肿瘤清除(图9e，f)。这些观察结果表明，通过识别小鼠脑中的组织特异性抗原，确实可以有效地引发脑引发-与-杀伤T细胞，从而局部诱导杀伤CAR受体的表达。与用对照T细胞治疗的小鼠相比，用任一回路治疗的小鼠显示出显著改善的生存期(图9e，f)。
为了评价MOG-引发的或CDH10-引发的CAR T细胞的作用是否限于脑中的肿瘤，通过同时将GBM6肿瘤植入脑和侧腹并静脉内输注脑引发-与-杀伤CAR T细胞来重复这些实验(图9g)。与最后的实验一致，MOG-引发的和CDH10-引发的CAR T细胞都显示出有效的抗脑肿瘤反应(图9h)。在侧腹，与对照未转导的T细胞相比，MOG-引发-与-杀伤CAR T细胞对肿瘤生长没有显示出影响，表明MOG-引发-与-杀伤CAR T细胞以脑特异性方式起作用。另一方面，CDH10-引发的CAR T细胞显示出侧腹肿瘤尺寸的显著减小，表明抗-CDH10 scFV可能与存在于脑外部的其他抗原上的表位交叉反应，或者CDH10表达可能不充分局限在脑中，如表明非CNS器官中CDH10 mRNA表达的RNA-seq数据所提示的(图9b)。
总的来说，这些数据表明了引发-与-杀伤CAR T细胞的多功能性，包括来自正常组织特异性抗原的整合引发。
实施例3方法
SynNotch受体和响应元件构建体设计
通过将EGFRvIII 139scFv(Johnson等人，2015)、MOG M26 scFv(von Büdingen等人，2002)和CDH10(来自Sidhu实验室的馈赠)融合到小鼠Notch1(NM_008714)最小调节区(Ile1427至Arg1752)和Gal4 DBD VP64来构建SynNotch受体。所有synNoch受体含有用于膜靶向的n-末端CD8a信号肽和用于容易用a-myc A647(细胞信号传导#2233)或a-flag A647(RND系统#IC8529R)测定表面表达的myc-标签或flag-标签；参见Morsut等人(Morsut等人，2016，关于受体synNoch受体肽序列)。对于所有初级T细胞实验，将受体克隆到含有PGK或SFFV启动子的修饰的pHR’SIN:CSW载体中。还对pHR’SIN:CSW载体进行修饰以制备响应元件质粒。将Gal4 DNA结合结构域靶序列的五个拷贝克隆到最小CMV启动子。在响应元件质粒中还包括PGK启动子，其组成性地驱动mCherry或BFP表达以容易地鉴定转导的T细胞。通过将EphA2 scFv(Goldgur等人，2014)、IL13突变蛋白[E13K，K105R](Krebs等人，2014)或IL13突变蛋白[E13K，K105R]-G4Sx4-EphA2 scFv(Goldgur等人，2014)融合到人CD8α链的铰链区和人4-1BB的跨膜和细胞质区以及CD3z信号传导胞内域来构建诱导型CAR。经由多克隆位点3′的BamHI位点将诱导型CAR构建体克隆至Gal4响应元件。对于一些可诱导的CAR载体，CAR用GFP/BFP在c-末端标记或包含myc/flag标签以验证表面表达。通过融合克隆(Clontech#ST0345)克隆所有构建体。
原代人T细胞分离和培养
在通过阴性选择(STEMCELL Technologies#15062和#15063)分离后，从匿名供体血液中分离原代CD4+和CD8+T细胞。血液是从太平洋血液中心(Blood Centers of thePacific)获得的，由大学机构审查委员会(the University Institutional ReviewBoard)批准的。将T细胞冷冻保存在含有20％人AB血清(Valley Biomedical，#HP1022)和10％DMSO的RPMI-1640(UCSF细胞培养中心)中。解冻后，将T细胞在由X-VIVO 15(Lonza#04-418Q)、5％人AB血清和10mM中和的N-乙酰基L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich#A9165)组成的人T细胞培养基中培养，所述培养基补充有30单位/mL IL-2(NCI BRB PreclinicalRepository)，用于除了IncuCyte实验之外的所有实验。在含有5％人AB血清(ValleyBiomedical，#HP1022)、补充有30单位/mLIL-2(NCI BRB Preclinical Repository)的RPMI-1640(UCSF细胞培养中心)中培养IncuCyte实验。
人T细胞的慢病毒转导
通过下述产生泛热带VSV-G假型慢病毒：使用Fugene HD(Promega#E2312)，用pHR’SIN:CSW转基因表达载体和病毒包装质粒pCMVdR8.91和pMD2转染LentiX 293T细胞(Clontech#11131D)。原代T细胞在同一天解冻，并且在培养24小时后，用人T-激活剂CD3/CD28 Dynabead(Life Technologies#11131D)以1:3细胞:珠粒比率刺激原代T细胞。在48小时时，收集病毒上清液，并在一些测定中使用Lenti-X浓缩器(Clonetech#631231)浓缩。将原代T细胞暴露于病毒24小时。在T细胞刺激后第4天，除去Dynabead，并扩增T细胞直至第9天，此时将它们静置并可用于测定。用Beckton Dickinson(BD)FAC ARIA融合物对T细胞进行分选以用于测定。在分选期间将表现出基础CAR表达的AND-门控T细胞门控出来。
癌细胞系
所使用的癌细胞系是K562髓性白血病细胞(ATCC#CCL-243)、L929小鼠成纤维细胞(ATCC#CCL-1)、U87 MG GBM细胞(ATCC#HTB-14)和GBM6 PDX细胞(由Ludwig研究所和UCSD的Dr.Frank Furnari馈赠)。U87-EGFRvIII-阴性萤光素酶(Ohno等人，2013)和U87 MG进行慢转导以在脾病灶形成病毒(SFFV)启动子的控制下分别稳定地表达GFP或mCherry。在转导后72小时，基于GFP表达，在Aria Fusion细胞分选仪(BD Biosciences)上将细胞分选为100％GFP或mCherry阳性并随后扩增。分选所有细胞系以表达转基因。使用逆转录病毒构建体(Matthew Meyerson馈赠；Addgene质粒#11011)用非突变的EGFR稳定地转导U87-萤光素酶和U87-萤光素酶-mCherry细胞，以产生以与EGFRvIII-阳性U87细胞系类似的速率生长的EGFRvIII-阴性细胞系。野生型EGFR的过表达与具有EGFR扩增的人GBM相关(Bonavia等人，2012)。将两个GBM6经慢病毒转导以稳定地表达mCherry和萤火虫萤光素酶二者。将这些细胞在含有EGF(20μg/mL)、FGF(20μg/mL)和肝素(5μg/mL)的补充剂的DMEM F12培养基中培养。K562经慢病毒转导以稳定表达表面CDH10(CDH10细胞外膜融合至PDGF跨膜结构域)。对K562和L929进行慢病毒转导以稳定地表达全长MOG。
SynNotchT细胞的体外刺激
对于与U87共培养的所有体外synNotch T细胞刺激，将1×104个U87在平底96孔组织培养板中培养过夜。次日早上，将1×104-5×104个T细胞加入平底96孔组织培养板，并在24-96小时分析共培养物的靶肿瘤细胞的活化和特异性裂解。对于与GBM6和T细胞共培养的所有体外synNotch T细胞刺激，将1×104个GBM6在平底96孔组织培养板中培养过夜。次日早上，将1×104个T细胞加入平底96孔组织培养板中，并在24-96小时分析共培养物的靶肿瘤细胞的活化和特异性裂解。对于与三种不同细胞群体共培养的所有体外synNotch T细胞刺激，靶细胞(GBM6)以1×104个细胞培养，引发细胞(K562或L929)在平底96孔组织培养板中以1×104个细胞培养过夜。次日早上，将1×104个T细胞加入平底96孔组织培养板中，并在24-96小时分析共培养物的靶肿瘤细胞的活化和特异性裂解。使用BD LSR II或Attune NxT流式细胞仪进行所有流式细胞术，并在FlowJo软件(TreeStar)中进行分析。
SynNotch AND-门控T细胞的细胞细胞毒性的评估
如上所述，用表达指定抗原的靶细胞刺激CD8+synNotch AND-门控T细胞24-96小时。通过比较培养物中存活的靶细胞与用未经转导的T细胞对照治疗相比的分数来确定靶癌细胞的特异性裂解水平。通过将靶细胞移出通常由靶细胞占据的侧向散射和前向散射区来监测细胞死亡。备选地，使用IncuCyte Zoom系统(Essen Bioscience)分析细胞活力。将肿瘤细胞以每孔1.0×104个细胞的密度一式三份地接种到96孔板中过夜。第二天将T细胞以每孔200μl的终体积添加到每个孔中。如上所述共培养靶细胞和T细胞。每15分钟每孔拍摄2个视场。使用IncuCyte Zoom软件(Esenn BioScience)计算平均荧光强度(MFI)以确定靶细胞存活。数据总结为平均值±SEM。
统计学分析和曲线拟合
统计学显著性通过特定检验来确定，并且表示为平均值±标准误差平均值(SEM)或平均值±标准偏差(SD)，如附图中图例所示。Kaplan-Meier估计量用于生成生存曲线，并且使用Log-Rank检验评估生存分布的差异。所有p值在附图或其图例中提供。所有统计学分析使用Prism软件版本7.0(GraphPad)进行。
小鼠模型
所有小鼠实验均按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。对于具有U87的原位异质模型，将1.5×104个U87-luc-mCherry和1.5×104个U87-luc-EGFRvIII-阴性GFP细胞的混合物颅内植入6至8周龄雌性NCG小鼠(Charles River)，每组6-10只小鼠。对于均质U87-luc-GFP-EGFRvIII-阳性模型，将3x104个细胞注射到NCG小鼠的脑中。对于具有GBM6的原位异质模型，将1.0×105个GBM6-luc-mcherry细胞颅内植入6至8周龄雌性NCG小鼠，每组6-10只小鼠。进行用于肿瘤细胞接种的立体定向手术，其中注射部位的坐标在前囟右侧2mm和前侧1mm并进入脑中3mm。在手术前和手术后3天，用镇痛剂治疗小鼠并按照IACUC监测不良症状。在皮下模型中，在第0天，向NCG小鼠皮下注射在100μl HBSS中的1.0×106个U87-Luc-mcherry+或1.2×105个GBM6-luc-mcherry细胞。根据制造商的指导(GoldBio)，通过腹膜内D-荧光素注射后Xenogen IVIS谱上的发光来评价肿瘤进展。在治疗之前，将小鼠随机化，使得对照组和治疗组中的初始肿瘤负荷相等。用在100μl PBS中的6.0×106个工程化改造的或匹配数目的未经转导的T细胞通过尾静脉静脉内治疗小鼠。随着时间的推移评估生存期，直到达到预定的IACUC批准的终点(隆起，神经损伤，例如兜圈、共济失调、瘫痪、跛行、偏头、平衡问题、癫痫发作)(每组n＝6至10只小鼠)。
免疫荧光
小鼠在用冷PBS经心脏灌注之前被安乐死。然后取出脑并在4％PFA-PBS中固定过夜，然后转移到30％蔗糖中并使其沉降(1-2d)。随后，将脑包埋在O.C.T.Compound(Tissue-Tek；4583；Sakura Finetek)中。然后在冷冻切片机上切割连续的10-μm冠状切片并保存在-20 0C。随后将切片解冻并在4 0C染色过夜。所用的一抗是：CD45(D9M8I)
Figure BDA0003734102090000911
兔mAb(CellSignaling Technologies,1:100)，抗–EGFRvIII,克隆DH8.3(Millipore Sigma,1:100)，人EphA2 Alexa Fluor 700-缀合的抗体(R&D Systems,1:100)，和抗-IL13受体α2抗体(Abcam,1:100)。在4 0C下使用在驴中产生并与AlexFluor 647缀合的二抗两小时以检测初级标记。用核染料DRAQ7(Abcam)或DAPI5(Thermofisher)染色切片。使用具有TisseFAXS扫描软件(TisseeGnostics)的Zeiss Axio Imager2显微镜(×20倍放大率)或具有Zeiss Zen成像软件的Zeiss LSM780显微镜(×20倍放大率)获取图像。在成像期内，曝光时间和阈值在样品之间保持一致。
STAR方法
Figure BDA0003734102090000921
Figure BDA0003734102090000931
Figure BDA0003734102090000941
Figure BDA0003734102090000951
这里已经表明，在GBM的情况下，可以使用整合多种抗原的识别的更复杂的T细胞识别回路来克服这些问题(图10)。为了证明这一点，构建了一系列引发-与-杀伤回路。将GBM特异性但异质表达的新抗原EGFRvIII作为引发性抗原靶向(图10a)，然后将我们的策略扩展到靶向脑中的非肿瘤细胞上表达的脑特异性抗原(图10b)。
在本文所述的回路中，synNotch受体诱导靶向两种GBM相关抗原EphA2和IL13Rα2的串联CAR的基因表达。作为常规治疗靶，这两种抗原可能是不完全的，因为它们在一些其他正常的非脑组织中表达。然而，在这些引发-与-杀伤回路中，因为同源CAR的表达仅在表达EGFRvIII或MOG的细胞附近被诱导，所以该交叉反应性被减轻。引发-与-杀伤回路组合这些不完全的抗原，并以优化它们各自如何有助于整体识别的方式整合它们。由于EGFRvIII和MOG分别在GBM肿瘤或脑中是非常特异性的，因此它们代表优异的引发性抗原。EphA2和IL13Rα2的特异性较低，但因为它们更均质地表达，所以在整个肿瘤中，靶向这些抗原将可能增强杀伤更广泛的GBM细胞群体。因此，只要它们的杀伤由局部引发信号控制，这些抗原就变得更适合作为杀伤性抗原靶标。此外，即使这些杀伤性抗原单独不是完全均质性的，在杀伤中使用串联CAR也提供肿瘤清除的更高可能性(串联CAR作用为OR门控)(Hegde等人，2016)。因此，这些回路可以整合来自三种抗原的信号，即使这些抗原存在于肿瘤内的不同细胞上，从而诱导高度局部化但足够宽泛以有效的杀伤反应。假设回路基本上在引发细胞周围产生杀伤的“爆炸半径”(图10c)。其他最近的研究还研究了如何利用EGFRvIII识别来局部增强其他不完全特异性的治疗反应，例如分泌EGFR双特异性结合物(Choi，2019)。
体内数据证明EGFRvIII或MOG诱导的α-EphA2/IL-13Rα2 CAR表达及其细胞毒性活性局限于表达引发性抗原和杀伤性抗原的颅内肿瘤，从而不影响在远端部位表达杀伤性抗原的组织。在先前的体内小鼠研究(Roybal等人，2016a)中，发现表达类似的引发-与-杀伤回路的T细胞能够显示对植入的均质性表达引发与杀伤回路(即“AND-门控”)的肿瘤细胞的高度选择性杀伤，但未显示对对侧植入仅表的达杀伤性抗原的肿瘤细胞的任何杀伤。在对侧对照肿瘤中没有发生杀伤的事实表明，在一个器官中引发T细胞不会产生然后可以在体内的长距离处进行杀上的引发的T细胞(一旦除去引发刺激，CAR表达在数小时内衰减，排除持续免疫应答的安排；Roybal 2016)。这些观察与当前模型一致，其中synNotch介导的T细胞引发可以诱导靶细胞的短程杀伤，而不是长程杀伤。
关于EGFRvIII作为引发性抗原，约20％的GBM患者对于EGFRvIII是阳性的(Heimberger等人，2005；Moscatello等人，1995；Thorne等人，2016；Wikstrand等人，1997)。此外，患者可以在10-95％之间显示EGFRvIII表达的异质性，参见O’Rourke(O’Rourke等人，2017)。仍然不清楚在体内需要多少百分比的EGFRvIII-阳性细胞来实现足够的引发以消除肿瘤，因为诱导的杀伤还导致非引发和引发肿瘤细胞两者的并行减少；即，在一些情况下可能太快地消除引发细胞。然而，基于我们使用GBM6模型得到的数据(图8)，EGFRvIII引发策略似乎是有希望的，因为所有小鼠都显示出长期肿瘤清除。这与其它类似治疗相比是有利的(Johnson等人，2015)。引发信号的消除较少受到脑抗原引发回路(例如针对MOG的脑抗原引发回路)的关注，因为引发-与-杀伤CAR T细胞不会杀伤表达MOG的正常脑细胞，因为正常脑细胞缺乏所需的杀伤性抗原(EphA2或IL-13Rα2)。
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虽然已经参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等同物。另外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质组合物、方法、一个或多个方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。

Claims (18)

1.一种治疗胶质母细胞瘤的系统，所述系统包含：
(a)编码结合触发型转录开关(BTTS)的核酸序列，所述结合触发型转录开关结合髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；
(b)编码抗原特异性治疗剂的核酸序列，所述抗原特异性治疗剂结合由胶质母细胞瘤表达的杀伤性抗原；和
(c)可操作地连接到(b)的调节序列，所述调节序列响应于所述结合触发型转录开关；
其中所述结合触发型转录开关与MOG的结合激活结合所述杀伤性抗原的抗原特异性治疗剂的表达。
2.权利要求1所述的系统，其中所述BTTS是一种或多种多肽，所述多肽在与MOG结合后经历蛋白水解切割以释放激活(c)的调节序列的基因表达调节剂。
3.权利要求1-2中任一项所述的系统，其中所述BTTS包含:
(i)包含MOG特异性抗体的抗原结合区的细胞外结构域；
(ii)包含一个或多个蛋白水解切割位点的蛋白水解可切割序列；和
(iii)细胞内结构域，
其中所述抗原结合区与MOG的结合诱导所述一个或多个蛋白水解切割位点处的序列切割，从而释放所述细胞内结构域，并且其中所述细胞内结构域通过(c)的调节序列诱导(b)的抗原特异性治疗剂的表达。
4.权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述杀伤性抗原选自由以下组成的组：肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A型受体3(EphA3)、白介素-13受体亚基α-1(IL13RA1)、白介素-13受体亚基α-2(IL13RA2)、表皮生长因子受体(EGFR)和erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2或Her2)。
5.权利要求1-4中任一项所述的系统，其中(b)的抗原特异性治疗剂是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，或具有类似靶向性免疫细胞杀伤功能的不同分子系统。
6.权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述BTTS结合MOG和一种或多种其它细胞表面抗原，所述其它细胞表面抗原增加所述抗原特异性治疗剂表达的特异性或广度。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性治疗剂结合由胶质母细胞瘤表达的两种不同杀伤性抗原。
8.权利要求7所述的方法，其中所述抗原特异性治疗剂结合EphA2和IL13Rα2.9。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述BTTS是synNotch受体、A2力传感器、模块化细胞外传感器架构(MESA)受体或TANGO受体。
10.包含权利要求1-9中任一项所述的系统的细胞，其中所述细胞表达所述结合触发型转录开关。
11.权利要求10所述的细胞，其中所述细胞作为免疫细胞。
12.权利要求10-11中任一项所述的细胞，其中所述抗原特异性治疗剂在表达时是在细胞表面上表达。
13.权利要求10-12中任一项所述的细胞，其中所述细胞为髓样细胞。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的细胞，其中所述细胞为淋巴样细胞。
15.权利要求14所述的细胞，其中所述淋巴样细胞选自由以下组成的组：T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀伤细胞。
16.权利要求10-15中任一项所述的细胞，其中所述抗原特异性治疗剂在表达时是由细胞分泌。
17.一种治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括：
向受试者施用权利要求10-16中任一项所述的免疫细胞：
其中所述结合触发型转录开关与MOG的结合激活所述抗原特异性治疗剂的表达，所述抗原特异性治疗剂结合所述杀伤性抗原并诱导对表达所述杀伤性抗原的胶质母细胞瘤细胞的杀伤。
18.权利要求15所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤是EGFRvIII阴性胶质母细胞瘤。
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