CN105709224A - 用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物 - Google Patents
用于治疗与herv-w包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新颖的化合物和组合物，用于预防和/或治疗一种新发现的损害机制，该机制在与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中阻碍成熟神经系统(NS)的内源髓磷脂修复能力。
Description
本申请是申请日为2013年10月1日、申请号为201380051713.4、发明名称为“用于治疗与HERV-W包膜蛋白表达相关的疾病中的髓鞘再生阻断的化合物”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新颖的化合物和组合物，用于预防和/或治疗一种新发现的损害机制，该机制在与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型表达相关的疾病中阻碍成熟神经系统(NS)的内源性髓磷脂修复能力。
该新颖的治疗方法将抑制Env对于少突胶质前体细胞(OPCs)的上游致病效果与抑制Env对于OPCs分化的致病性的最下游效应因子(NO自由基)结合起来，目前表明这些下游效应因子能够阻碍HERV-W相关疾病中的髓鞘再生，影响神经系统。
本发明涉及治疗组合物，其包含(i)至少一种抗-HERV-WEnv配体和/或(ii)至少一种一氧化氮自由基(NO)抑制药物，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
当组合配体和NO抑制药物二者时，所述组合物靶向上游诱导物Env，以及在该新阐明的过程中导致NS病变中的髓鞘再生阻断的下游NO效应物。
此外，两种类型化合物的协同作用(分别靶向Env和NO)增强了治疗具有非髓鞘再生病变的患者的快速性和效力，所述患者中的非髓鞘再生病变由HERV-W的活化(特别在与作为病毒粒子从MS细胞中分离1而来的MSRV亚型相关时)和由神经系统中其Env蛋白的表达诱导。
发明内容
根据第一方面，本发明涉及一种抗-HERV-WEnv配体，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
在本发明中，术语“分化阻断”、“髓鞘再生阻断”或“髓鞘再生阻碍”用于概括新发现的现象，如实施例1所描述，该现象包括：(i)由HERV-W包膜蛋白(特别是来自MSRV亚型)诱导的少突胶质前体细胞(OPCs)分化被抑制，(ii)由此导致OPCs产生的NO和(iii)由此导致OPCs产生髓磷脂被抑制，如在实施例1中所述。
与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病被定义为影响神经系统的HERV-W相关疾病，且更特别地，但以非限定方式被定义为以下疾病：多发性硬化(MS)，更特别地为复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP2)、诸如精神分裂症或双相情感障碍6的精神病，在上述疾病中也有髓磷脂损伤的描述3-5。
一般来说，多发性硬化(MS)病变归因于免疫介导的少突胶质细胞减少和髓鞘损失，伴有轴突损害。由来自神经系统(NS)炎性病变相关内源逆转录病毒HERV-W家族的多发性硬化相关逆转录病毒(MSRV)包膜蛋白(Env)介导的对于免疫细胞的作用已被描述7。然而，MSRV-Env对于神经胶质细胞的直接致病性(涉及由少突胶质前体细胞(OPC)进行的MS斑块髓鞘再生的阻断)先前未知且尚未见报道。
根据本发明的一方面，抑制Env对于少突胶质前体细胞(OPCs)的上游致病效果是通过使用一种抗-HERV-WEnv配体实现。本发明的抗-HERV-WEnv配体通过其结合Env蛋白的能力来定义。
配体的术语“结合”或“绑定”表示与目标抗原(比如ENV，包含其含有表位的片段)的短暂相互作用或结合。
根据本发明，HERV-WENV表示由HERV-W家族的任意成员env基因编码的蛋白质，包括由来自MS的逆转录病毒颗粒RNA中鉴定的序列所定义的MSRV亚组14，23。
本发明的配体也可以被定义为包含在重组的scFV蛋白、Fab片段、抗体中，所述抗体可以是多克隆、单克隆、寡克隆、嵌合、基因工程或人源或人抗体。在本发明的具体方面，所述包含配体的抗体是人源或人IgG，且更具体地为IgG1或IgG4。
更具体地，本发明的配体包含至少一个和更优选地每一个具有氨基酸序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的互补决定区(CDRs)。
上述配体包含至少一个和更优选地每一个由SEQIDNo.25、SEQIDNo.26、SEQIDNo.27、SEQIDNo.28、SEQIDNo.29和SEQIDNo.30编码的互补决定区(CDRs)。
如上文所述，髓鞘再生阻断也导致OPCs产生NO。然后，根据进一步的方面，本发明也涉及一种一氧化氮自由基抑制药物，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
与HERV-WENV表达相关的疾病为如上文所定义的那些。
在本发明一个更具体的方面，一氧化氮游离自由基(NO)抑制药物、一氧化氮自由基抑制药物或NO抑制药物是能够抑制NO分子(也称为NO自由基)的生物学作用的任意药物。NO抑制药物选自Ng-硝基-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)、S-甲基-异硫脲(SMT)、富马酸或二甲基富马酸(DMF)。
在另一方面，本发明涉及一种医药组合物，其将至少一种如上文所定义的抗-MSRV/HERV-WEnv配体和至少一种如上文所定义的一氧化氮自由基抑制药物组合起来。所述组合物用作预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。所述疾病为上文所定义那些。
包含如上文所定义的抗-HERV-WEnv配体；和如上文所定义的一氧化氮自由基抑制药物的医药品被看作同时、分开或随着时间推移散开施用的组合品，用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
根据下文描述的在Env诱导的实验性变应性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型上获得的结果，与单独使用此种治疗剂中的任一种相比，抗-MSRV/HERV-WEnv配体和此种NO抑制分子中的至少一种的组合显示协同作用。即使单独提供，一氧化氮自由基抑制药物或所述抗-MSRV/HERV-WEnv配体，显示出恢复已知与EAE中髓磷脂病变相关的临床缺陷8的治疗效果。尽管如此，(i)一氧化氮自由基抑制药物或所述抗-MSRV/HERV-WEnv配体和(ii)至少一种一氧化氮自由基抑制药物和至少一种抗-MSRV/HERV-WEnv配体的组合之间的比较证明在治疗过程中使用该组合具有很大优势。
因此，不出现炎症浸润和/或具有炎症活性的病变(比如MS的无活性斑块)不排除在受影响的患者中治疗由Env诱导的髓鞘再生阻断。这与患有进行性MS(原发或继发进展形式)的患者特别相关，已知这类患者具有大量没有炎症活性的病变。在大多数脑和脊髓病变中，这样的病变不再显示钆增强的磁共振成像信号。
本发明还涉及一种用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍的方法，其包含向人类施用至少一种抗-MSRV/HERV-WEnv配体。
在一个具体的方面，所述方法进一步包含施用至少一种一氧化氮自由基抑制药物。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍的方法，其包含向人类施用至少一种一氧化氮自由基抑制药物。
附图说明
图1：检测MS组织中Env蛋白和TLR4受体的表达。(A，B)抗-Env免疫组化分析显示，Env蛋白(箭头)在NAWM中与慢性活性病变相邻(B)但不存在于健康大脑白质中(A)。(C)在慢性活性病灶边缘，Olig2-阳性OPCs与Env-阳性小神经胶质细胞极其接近。(D-D″′)具有PDGFRα-阳性OPCs的健康脑组织对照，其特征在于共表达TLR4(箭头)。(E-E″′)NAWM中的OPCs与一个MS患者中表达TLR4和PDGFRα二者的活性病变相邻(箭头)。比例尺：50μm。
图2：OPC分化过程中TLR4表达的调节。(A)RT-PCR定量分析表明，培养基中大鼠自发OPC分化期间，TLR4表达在九天期间呈现进展性下调。GAPDH表达作为参照基因。所示数据为来自3个独立实验的平均值+/-标准差。t-检验(***P＜0.001)。(B，B′)抗-TLR4免疫染色说明，通过小发夹RNA(shRNA)介导的TLR4沉默，转染的OPCs不再表达TLR4(箭头)，从而保证了抗体的特异性。在转染后三天固定所示的OPCs，并通过表达eGFP标记已转染的细胞。注意邻近的未转染细胞是TLR4阳性的。(C-D′)代表培养基中自发分化三天后半乳糖脑苷脂(GalC)/TLR4双阳性OPCs(C，C′)和六天后髓磷脂碱蛋白(MBP)/TLR4双阳性OPCs(D，D′)的实例。(D)中的箭头尖指向分化程度较高的OPCs，其特征仅在于TLR4表达水平降低，从而反映了(A)所示的基因表达数据。箭头指示表达显著的未成熟细胞。
图3：重组Env对于培养的大鼠OPCs的促炎症作用。与各自的缓冲液对照或与生长于pV14ctrl转染的U343胶质母细胞瘤细胞存在下的OPCs(E-E′)相比，(A，B，C)通过溶液中的重组Env(A，溶解的Env)、表面结合的重组Env(B；固化Env)和在pV14Env转染的U343胶质母细胞瘤细胞(D-D′)中表达的膜结合Env(C)刺激OPCs，均在刺激后八小时强烈诱导iNOS表达。根据LAL检测的测定，在重组Env制备物中内毒素的水平＜5EU/mL。(D-E′)pV14Env和pV14ctrl转染的U343细胞的抗-Env免疫染色显示了Env的表面表达。(F-G′)根据O4免疫染色的评估，经表面结合的重组Env刺激，培养的少突胶质细胞的形态保持不变，所示为一天后(F，F′)以及五天后(G，G′)。(H)为了测定NO分解产物亚硝酸盐，对细胞培养物上清进行间接光谱分析的结果表明，用溶解的Env刺激24h的OPC样品中剂量依赖的NO水平显著增加。(I-K)经表面结合的重组Env刺激，诸如TNFα、IL-1β和IL-6的促炎症细胞因子发生上调。GAPDH作为参照基因。所示数据为平均值+/-标准差，并分别代表了6(A)、8(B)、3(C)、3(H)和8个(I-K)独立实验中的1个。t-检验(***P＜0.001)。比例尺：50μm。
图4：比较未成熟(一日龄＝OPC)和成熟(7日龄；“成熟OPCs”或少突胶质细胞＝OL；)大鼠OPCs对于HERV-W的敏感性。用100ng/ml的溶解重组Env刺激两种细胞类型。经Env刺激，尽管OLs中iNOS和细胞因子的上调水平比缓冲液对照中明显，但不如OPCs中显著。GAPDH表达作为参照基因。所示数据为平均值+/-标准差且来自3个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.005)。
图5：人OPCs的Env依赖反应。(A)与缓冲液处理的细胞相比，用表面结合(固化)和溶解的(溶解的)重组Env刺激人培养OPCs在刺激24h后强烈诱导iNOS表达。GAPDH表达作为参照基因。所示数据为平均值+/-标准差且来自3个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001)。(B，B′)GalC阳性的人培养OPCs免疫荧光染色显示了TLR4的强烈信号(显示培养三天后)。比例尺：50μm。
图6：Env通路中和实验。(A)与天然重组Env相比，加热失活的重组Env在OPC刺激8h后导致iNOS基因诱导的终止。天然Env和变性Env(加热Env)两种制备物均以1000ng/ml的浓度使用。(B，C)分别经IRAK1/4和TRIF的药理学抑制后，OPCs中iNOS表达减少。用3200nMIRAK1/4抑制剂I或50μMTRIF抑制肽进行2h预孵育步骤后，接着用表面结合(固化)重组Env刺激OPCs8h，并接着将其裂解。(D)在抗体介导的Env受体TLR4被阻断后，OPCs中iNOS表达减少。用15μg/ml浓度的抗TLR4抗体在37℃进行2h预孵育步骤后，接着用固化rENv刺激OPCs8h，并接着将其裂解。GAPDH表达作为参照基因。所示数据为平均值+/-标准差且来自3个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001；**P＜0.01)。(E)用表面结合(固化)重组Env刺激OPCs8h后，NFκB的细胞核定位增多。所示数据为平均值+/-标准差且来自3个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001)。(F-G′)代表缓冲液(对照)和Env刺激的OPCs中NFκB免疫染色。比例尺：50μm。
图7：生成3-硝基酪氨酸(3-NT)阳性OPCs。(A)免疫荧光染色显示，与缓冲液处理的细胞相比，Env刺激(表面结合重组Env)24h后，表达NO依赖的硝化应激标记物3-NT的OPCs显著更多。极强的NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)用作阳性对照。然而，在Env刺激之前用iNOS抑制分子L-NAME以100μM浓度在37℃孵育OPCs30分钟时，3-NT阳性降低到对照水平。失活的对映异构体D-NAME不能消除Env依赖的3-NT诱导。所示数据为平均值+/-标准差且来自3个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001)。(B-F′)代表对照细胞(B，B′)，Env刺激的OPCs(C，C′)，用L-NAME(D，D′)、D-NAME(E，E’)预孵育的OPCs和暴露于SNAP的OPCs(F，F′)的抗-3-NT免疫染色。比例尺：50μm。(G-G″′)MS患者NAWM组织切片的免疫组化荧光染色说明常驻型OPCs(以其表达前体标记物PDGFRα为标记，箭头)对于3-NT的阳性反应显示其能发生硝化应激。
图8：Env依赖的OPC分化抑制。(A，B)免疫荧光分析证明，与对照细胞相比，用表面结合的重组Env刺激一天和三天后，表达早期髓磷脂标记物CNPase以及晚期髓磷脂标记物MBPas的OPCs的数量显著减少。所示数据为平均值+/-标准差且来自4个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001)。(C-C″′)和(D-D″′)显示的结果代表对照和Env刺激的OPCs的抗-CNPase和抗-MBP免疫染色。(E)抗-MBP免疫染色显示，用100μML-NAME组合表面结合重组Env孵育OPCs三天消除了Env介导的OPC分化阻碍。使用D-NAME不能恢复髓磷脂的表达。所示数据为平均值+/-标准差且来自4个独立实验中的一个代表性实验。t-检验(***P＜0.001；n.s.不显著)。(F-H′)代表分别用单独的Env、Env和L-NAME组合和Env和D-NAME组合刺激的OPCs的MBP免疫染色。比例尺：50μm。
图9：在用MSRV-Env预包被的labteks中刺激24和72小时后OPC成熟标记物的表达。与其稀释缓冲液(缓冲液)相比，包被的MSRV-Env(+Env-T)在刺激24小时后诱导CNPase阳性OPC的减少百分比(A)，以及在刺激72小时后MBP阳性OPC的减少百分比(B)。所呈现数据为经重复验证的一个实验的平均值±SEM(每组410至563计数细胞；*ρ＜0,05t-检验(A)和每组364至491计数细胞；*ρ＜0,001Mann-Whitney秩和检验(B))。
图10：由MSRV-Env和GNbAC1刺激24小时后CNPase在人OPC中的表达。(A)包被的MSRV-Env在刺激24小时后诱导CNPase阳性OPC的减少百分比。在两种被检测的GNbAC1处理方案(GNbAC1-A或GNbAC1-B)中，50nM或200nM的GNbAC1完全抑制了MSRV-Env的作用。所呈现数据为2至8个独立实验的平均值±SEM(每组705至3878计数细胞)。(B)在两种被检测的GNbAC1处理方案(GNbAC1-A或GNbAC1-B)中，GNbAC1(50nM或200nM)单独包被或与BSA(1μg/ml)一起包被对CNPase阳性OPC的百分比均不产生影响。所呈现数据为经重复验证的一个实验的平均值±SEM(每组399至512计数细胞；ρ＞0,05；单因素方差分析)。
图11：由加入培养基中的MSRV-Env和GNbAC1刺激24小时后CNPase在人OPC培养物中的表达。处理24小时后，溶解在细胞培养基中的MSRV-Env(3nM)显著减少CNPase表达。GNbAC1(200nM)完全抑制该作用，然而其单独并不显示任何作用。所呈现数据为2至4个独立实验的平均值±SEM(每组927至1913计数细胞)；*ρ＜0,001对缓冲液；单因素方差分析接着FishcherLSDpost-hoc分析)。
图12：由MSRV-Env和GNbAC1刺激72小时后MBP在人OPC培养物中的表达。(A)包被的MSRV-Env(Env-T)在刺激72小时后诱导MBP阳性OPC的百分比减少。在两种被检测的GNbAC1处理方案(GNbAC1-A或GNbAC1-B)中，GNbAC1在50nM时部分抑制MSRV-Env的作用，且在200nM时完全抑制。(B)在处理72小时后，加入细胞培养基中的MSRV-Env(3nM)显著减少MBP表达。GNbAC1(200nM)完全抑制该作用(B)。
所呈现数据为以下实验的平均值±SEM：(A)2至8个独立实验(每组924至4156计数细胞)*ρ＜0,05；**ρ＜0,001对缓冲液；Ψρ＜0,001对Env-T；单因素方差分析接着FisherLSDpost-hoc分析，和(B)2至4个独立实验(每组1013至1834计数细胞；*ρ＜0.001对缓冲液；Ψρ＜0.001对Env-T；单因素方差分析接着FisherLSDpost-hoc分析)。
图13：由包被的MSRV-Env和GNbAC1刺激24和72小时后OPC成熟标记物的表达。包被的MSRV-Env诱导(A)刺激24小时后CNPase阳性人OPC的百分比减少，以及(B)刺激72小时后MBP阳性人OPC的百分比减少。(A)在两种被检测的GNbAC1处理方案(GNbAC1-A或GNbAC1-B)中，GNbAC1(200nM)完全抑制MSRV-Env的作用。所呈现数据为6个独立实验(每组2805至3039计数细胞；*ρ＜0,05对缓冲液；Ψρ＜0,05对MSRV-Env；等级Kruskal-Wallis方差分析-1接着StudentNewmanKeulspost-hoc分析和(B)5至6个独立实验(每组1671至2066计数细胞；*ρ＜0,05对缓冲液；Ψρ＜0,05对MSRV-Env；等级Kruskal-Wallis方差分析-1接着Dunnpost-hoc分析)。
图14：GNbAC1完全逆转的由MSRV-Env诱导的人OPC成熟的抑制作用.包被的MSRV-Env(Env)诱导(A)刺激24小时后CNPase阳性人OPC的百分比减少，以及(B)刺激72小时后MBP阳性人OPC的百分比减少。在两种被检测的GNbAC1处理方案(+GNbAC1A或+GNbAC1B)中，GNbAC1(200nM)完全抑制MSRV-Env的作用。结果表示为CNPase(A)或MBP(B)阳性细胞的百分比，且呈现了8-14个独立实验的平均值±SEM(每组3600至6800计数细胞(A)和每组2700至5800计数细胞(B))。*ρ＜0.05对对照；Ψρ＜0.05对MSRV-Env；等级Kruskal-Wallis方法分析-1接着Dunnpost-hoc分析)。
图15：GNbAC1完全逆转的由MSRV-Env诱导的人OPC成熟的抑制作用(标准化数据).接种OPCs之前将MSRV-Env包被在腔室培养玻片上。GNbAC1(200nM)在包被前与MSRV-Env混合(GNbAC1-A)或在已经包被了MSRV-Env的培养腔室上孵育(GNbAC1-B)。数据定量为(A)CNPase或(B)MBP阳性细胞的百分比，且表示为相对于对照条件(MSRV-Env缓冲液)改变的百分比。结果呈现了8至14个独立实验的平均值±SEM(每组3600至6800个细胞计数(A)和每组2700至5800计数细胞(B))。*ρ＜0.05对对照；Ψρ＜0.05对MSRV-Env；等级Kruskal-Wallis方差分析-1接着Dunnpost-hoc分析)。
图16：A、B、C和F组EAE临床评分动力学(A-未处理EAE阳性对照，B-用200μgGNbAc1处理的EAE，C-用L-NAME处理的EAE，F-用200μgGNbAc1+L-NAME处理的EAE)
图17：A、B、D和G组EAE临床评分动力学(A-未处理EAE阳性对照，B-用200μgGNbAc1处理的EAE，D-用SMT处理的EAE，G-用200μgGNbAc1+SMT处理的EAE)
图18：A、B、E和H组EAE临床评分动力学(A-未处理EAE阳性对照，B-用200μgGNbAc1处理的EAE，E-用DMF处理的EAE，H-用200μgGNbAc1+DMF处理的EAE)
图19：疲劳转棒仪上23rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B组，“注射1次”和“注射2次”Env；B：A、B、C和F组；
C：A、B、D和G组；D：A、B、E和H组。
图20：疲劳转棒仪上26rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B组，“注射1次”和“注射2次”Env；B：A、B、C和F组；
C：A、B、D和G组；D：A、B、E和H组。
图21：疲劳转棒仪上29rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B组，“注射1次”和“注射2次”Env；B：A、B、C和F组；
C：A、B、D和G组；D：A、B、E和H组。
图22：A、B、C和D组EAE临床评分动力学(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，C-用200μgGNbAc处理的EAE，D-用500μgGNbAc处理的EAE)
图23：A、B、E和F组EAE临床评分动力学(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，D-用SMT处理的EAE，G-用200μgGNbAc+SMT处理的EAE)
图24：A、B、G和H组EAE临床评分动力学(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，E-用DMF处理的EAE，H-用200μgGNbAc1+DMF处理的EAE)
图25：研究期间体重增加的动力学(与第一次注射免疫原前一天相比的相对体重增加)：A、B、C和D组(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，C-用200μgGNbAc处理的EAE，D-用500μgGNbAc处理的EAE)
图26：研究期间体重增加的动力学(与第一次注射免疫原前一天相比的相对体重增加)：A、B、E和F组(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，D-用SMT处理的EAE，G-用200μgGNbAc+SMT处理的EAE)
图27：研究期间体重增加的动力学(与第一次注射免疫原前一天相比的相对体重增加)：A、B、G和H组(A-模拟EAE阴性对照，B-未处理的EAE阳性对照，E-用DMF处理的EAE，H-用200μgGNbAc1+DMF处理的EAE)
图28：疲劳转棒仪上16rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B、C和D组；B：A、B、E和F组；C：A、B、G和H组。
图29：疲劳转棒仪上26rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B、C和D组；B：A、B、E和F组；C：A、B、G和H组。
图30：疲劳转棒仪上29rpm时的时间动力学
X轴：测量值的天数，依据实验方案。
Y轴：相对于第7天，疲劳转棒仪上增加或减少的时间。
A：A、B、C和D组；B：A、B、E和F组；C：A、B、G和H组。
图31：所有组在研究期间的EAE临床评分动力学(A-模拟EAE阴性对照，B-同型抗体模拟处理的EAE阳性对照，C-用500μgGNbAc处理的EAE，D-用富马酸钠处理的EAE和E-用500μgGNbAc+富马酸钠处理的EAE)
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下列实施例是说明本发明，而非意图限制本发明。
实施例1：由HERV-W家族包膜蛋白诱导的髓鞘再生阻断在神经系统脱髓鞘病变中(抑制了少突胶质前体细胞分化。
1.1材料和方法
1.1.1少突胶质前体细胞细胞培养
按照先前的描述纯化大鼠少突胶质前体细胞(OPCs)22。OPCs要么培养在增殖培养基(添加有10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子和10ng/ml重组人血小板源生长因子-AA的Sato培养基；R&DSystems，威斯巴登-诺顿施塔特，德国)中，然而其分化由添加有0.5％胎牛血清的Sato培养基引发。人胚胎少突胶质前体细胞(hOPC)和各培养基购自3HBiomedical，乌普萨拉，瑞典。重组Env由PX-Therapeutics(Grenoble，法国)依据GeNeuro(日内瓦，瑞士)的QC说明书生产和纯化，GeNeuro提供了蛋白批次。通过鲎变形细胞溶解物(LAL)检测测量内毒素水平＜5EU/mL。使用三种不同的方法进行Env刺激，分别使用i)在分化培养基中稀释为10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml的重组全长Env蛋白；ii)以17.53ng/em2的表面浓度包被在细胞培养皿上的重组Env蛋白，和iii)通过将OPCs接种在过表达Env的经转染U343胶质母细胞瘤细胞上。对照刺激实验使用重组Env的缓冲液制备物(20mM组氨酸，5％(W/V)蔗糖，0.01％(W/V)聚山梨醇酯20，pH6.0)以相同的稀释度进行。使用比色一氧化氮分析试剂盒(Merck-Millipore/Calbiochem，达姆施塔特，德国)实施OPC上清液中NO浓度的测定，并且使用Anthos平板读数器2001(Anthoslabtec仪器，Salzburg，澳大利亚)检测540nm的吸光度。使用抗O4抗体(Merck-Millipore/Calbiochem，达姆施塔特，德国)进行OPC形态学评估，考虑细胞直径和分支程度。根据制造商的方案，IRAK-1/4抑制剂I(1-(2-(4-吗啉基)乙基)-2-(3-硝基苯甲酰氨基)苯并咪唑，N-(2-吗啉基乙基)-2-(3-硝基苯甲酰氨基)-苯并-咪唑；SigmaAldrich，汉堡，德国)实验在2400nM的浓度实施，TRIF抑制肽(Invivogen，圣地亚哥，USA)实验在50μM浓度实施。通过将重组Env暴露在123℃的温度下1h进行Env失活。TLR4抗体的受体阻断实验在15μg/ml抗体浓度下实施。L-NAME/D-NAME阻断实验各自在100μM的浓度下实施；S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺(SNAP)以100μg/ml的浓度使用。
1.1.2少突胶质细胞前体和U343胶质母细胞瘤细胞转染
OPCs在增殖培养基中生长24h，并且使用NanoJuice试剂(Merck-Millipore，达姆施塔特，德国)进行转染，在HuSH29pGFP-V-RS载体(OriGene，洛克维尔，马里兰，USA)基础上引入shRNA，编码TLR4抑制载体，用于证明抗-TLR4抗体特异性。对于膜结合Env在U343胶质母细胞瘤细胞中的表达，将用于呈现经转染细胞的柠檬色表达载体9与Env过表达(含有HERV-WMSRV-型env基因编码序列(-GenBankAF331500.1-，由Geneuro，SA，瑞士提供)nt1至nt1629的pV14载体)以1∶5的比例组合。相应的空载体用作对照。使用脂质体(LifeTechnologies，达姆施塔特，德国)完成U343胶质母细胞瘤细胞的转染。
1.1.3多发性硬化组织染色
对于Olig2/Env双染色，切割甲醛固定石蜡包埋的人MS组织，并将5μm的切片在二甲苯中脱蜡然后通过梯度酒精至蒸馏水进行再水合。通过将玻片孵育在甲醇溶解的0.3％双氧水中而遏止内源过氧化物酶活性。然后用蒸馏水清洗玻片，并将其转移至10mMTris，1mMEDTA(pH9)溶液中，以实现热诱导的抗原补偿。然后，将玻片冷却至室温，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗，并在4℃与抗-Olig2(1∶300；Merck-Millipore)和抗-Env抗体3B2H4(1∶500，GeNeuro，日内瓦，瑞士)孵育过夜。随后，将切片与Alexa488标记的驴-抗-兔(1∶400；LifeTechnologies/分子探针，达姆施塔特，德国)孵育，以检测Olig2和Alexa555标记的山羊-抗-小鼠，呈现Env。对于TLR4/PGRFRα双染色，切割快速冷冻的组织，并将5μm的切片在4℃与抗-TLR4(1∶100；Merck-Millipore)和抗-PDGFRα抗体(1∶50，eBiosciences，圣地亚哥，加利福尼亚，USA)孵育过夜。TLR4用Alexa488标记的羊-抗-小鼠(1∶400；LifeTechnologies/分子探针，达姆施塔特)检测，且PGRFRα分别用生物素标记的兔-抗-大鼠(1∶500；VectorLaboratories，伯灵格姆，加利福尼亚，USA)和Alexa647标记的亲和素(1∶400；LifeTechnologies/分子探针)检测。对于细胞核染色，将切片与Hoechst染液(1∶100；Sigma-Aldrich，汉堡，德国)孵育1分钟，并用Vectashield(VectorLaboratories)覆盖。使用莱卡TCSSP2AOBS激光扫描共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems，海德堡，德国)进行显微分析。
1.1.4培养细胞染色
如先前描述对多聚甲醛固定的培养细胞进行染色22。一级抗体如下稀释：抗-TLR4抗体(1/1000；Merck-Millipore，达姆施塔特，德国)，抗-Env抗体3B2H4(1/500；GeNeuro，日内瓦，瑞士)；抗-2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶(CNPase)抗体(1/1000；Covance，普林斯顿，新泽西，USA)，单克隆抗髓磷脂碱性蛋白(MBP；1/1000；Covance，普林斯顿，新泽西，USA)，抗髓磷脂碱性蛋白多克隆抗体(1∶1000；Millipore，Schwalbach，德国)，抗-半乳糖脑苷脂(GalC)抗体、抗-O4抗体(都是1/1000；Merck-Millipore，达姆施塔特，德国)；抗-3-NT抗体(1/1000；Abcam，坎布里奇，麻萨诸塞，USA)，和抗-NFκB抗体(1/1000；Abcam，坎布里奇，麻萨诸塞，USA)。AlexaFluor488-和AlexaFluor594共轭的抗体(都是1∶500)用于呈现信号。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色(DAPI；Roche，巴塞尔，瑞士)。
1.1.5RNA制备，cDNA合成和定量反转录聚合酶链式反应
使用RNeasy实验流程(Qiagen，Hilden，德国)进行培养细胞RNA纯化。使用高容量cDNA反转录试剂盒(LifeTechnologies/AppliedBiosystems)将分离的RNA反转录。使用PowerSybrGreenuniversalmastermix(LifeTechnologies/AppliedBiosystems)在7900HT序列检测系统(LifeTechnologies/AppliedBiosystems)上进行基因表达水平的定量检测。使用PrimerExpress2.0软件(LifeTechnologies/AppliedBiosystems)确定引物序列，并通过产生特定扩增子对其进行检验：
TLR4_fwd：CTGGGTTTCTGCTGTGGACA(SEQIDNo.7)
TLR4_rev：AGGTTAGAAGCCTCGTGCTCC(SEQIDNo.8)
riNOS_fwd：CTCAGCACAGAGGGCTCAAAG(SEQIDNo.9)
riNOS_rev：TGCACCCAAACACCAAGGT(SEQIDNo.10)
huiNOS_fwd：TGAGGAGCAGGTCGAGGACT(SEQIDNo.11)
huiNOS_rev：TGATAGCGCTTCTGGCTCTTG(SEQIDNo.12)
huGAPDH_fwd：TGGACCTGACCTGCCGTCTA(SEQIDNo.13)
huGAPDH_rev：AGGAGTGGGTGTCGCTGTTG(SEQIDNo.14)
TNFα_fwd：AGCCCTGGTATGAGCCCATGTA(SEQIDNo.15)
TNFα_rev：CCGGACTCCGTGATGTCTAAG(SEQIDNo.16)
IL1β_fwd：GAAACAGCAATGGTCGGGAC(SEQIDNo.17)
IL1β_rev：AAGACACGGGTTCCATGGTG(SEQIDNo.18)
IL6_fwd：GTTGTGCAATGGCAATTCTGA(SEQIDNo.19)
IL6_rev：TCTGACAGTGCATCATCGCTG(SEQIDNo.20)
GAPDH_fwd：GAACGGGAAGCTCACTGGC(SEQIDNo.21)
GAPDH_rev：GCATGTCAGATCCACAACGG(SEQIDNo.22)
ODC_fwd：GGTTCCAGAGGCCAAACATC(SEQIDNo.23)
ODC_rev：GTTGCCACATTGACCGTGAC(SEQIDNo.24)
GAPDH和ODC用作参照基因，并且依据ΔΔCt方法(LifeTechnologies/AppliedBiosystems)确定基因相对表达水平。每一个样品分四份测量；所示数据为平均值±标准差，并且使用t-检验来检测统计学显著性。
1.2结果
1.2.1定位Env蛋白靠近慢性活性MS病变并与常驻型OPCs相邻
我们使用免疫组学分析研究了Env蛋白质在人脑组织样品中的定位。这揭示了大量的Env蛋白存在于靠近慢性活性MS病变的NAWM中(CAL，图1B)以及在邻近Olig2-阳性OPCs的CALs边缘(图1C)。距病变较远的NAWM中不显示可识别的Env免疫反应性(图1A)。为了进一步证明Env蛋白对于常驻型OPCs以及由此对相关髓磷脂修复的潜在影响，我们进一步检测了TLR4和血小板源生长因子受体α(PDGFRα)双阳性的OPCs。在健康脑髓(图D-D″′)和在MS病人的NAWM(图E-E″′)中我们都能检测到它们。这清楚地证明，MS脑中，在表达HERV-WEnv的细胞或在相应的分泌蛋白附近可以检测到TLR4阳性OPCs，其如所描述的那样10使得它们成为该TLR4致病性激动剂的易感目标。尽管如此，这构成了一个出乎意料的发现，并且开启了仍未发现的应用前景，原因在于先前并不知道TLR4能在这样的条件下在OPCs中表达，而且更重要的原因在于，如进一步阐明，故此不能预见诸如MSRV-Env的HERV-W包膜蛋白能够在该分化的精确步骤与OPCs直接作用并最终对它们的髓鞘形成潜力造成深刻影响。
1.2.2由培养的大鼠和人OPCs表达TLR4
先前的研究主要已经证明对于单核细胞和树枝状细胞的TLR4依赖性促炎症作用10。抗-TLR4免疫标记实验确认了该受体在大鼠和人少突胶质前体细胞二者表面的表达(图2C、2C′和5B)。而且大鼠OPCs中特异shRNA介导的TLR4敲除证实了先前免疫标记实验的特异性(图2B、2B′)。为了评价从幼期到成熟OPCs中TLR4受体表达的动力学，我们在培养分化三天和六天后使用抗-半乳糖脑苷脂(GalC)抗体以及抗-髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗体(较成熟OPCs的标记物)进行共染色(图2C-D′)。令人感兴趣的是，发现TLR4受体基因的表达在细胞分化过程中随着时间下调(图2A)，然而，与较幼期的细胞相比，形态学成熟的大鼠OPCs中特异TLR4蛋白检测仅在最后的时间点产生微弱的信号(图2D)。
1.2.3用Env刺激OPCs诱导促炎症细胞因子和诱导型NO合酶的表达
与对照(缓冲液或空载体处理)条件相比，用溶解于培养基中的重组Env蛋白(溶解Env，100ng/ml，图3A)刺激大鼠OPCs引起诱导型一氧化氮合酶(iNOS)转录剧烈增加，以及引起诸如TNFα、IL-1β和IL-6的促炎症细胞因子的诱导(图2I-K)，所述重组Env蛋白包被于细胞培养皿上(固化Env；图3B)或在经转染的U343胶质母细胞瘤细胞表面过表达(pV14Env，图3C-E′)。反过来，iNOS表达增强引起其硝化应激诱导产物一氧化氮(NO)在细胞上清液中Env浓度依赖性增加(图3H)。令人感兴趣的是，如在暴露于Env一天和五天之后进行的少突胶质细胞O4染色实验所示，大鼠OPC形态在Env刺激过程中保持不变(图3F-G′)。还发现人GalC阳性OPCs也表达TLR4(图5B、B′)，而且用重组Env刺激(在溶液中以及包被在培养皿表面两者)同样诱导iNOS转录(图5A)。而且，我们观察到，Env刺激并未影响OPC的存活(如由TUNEL和细胞总数定量所揭示，数据未呈现)，也未诱导衰老OPC表现型(通过β-半乳糖染色来检测，数据未呈现)。如由iNOS、TNFα、IL-1b和IL-6转录水平所测定，Env对于大鼠成熟OPCs(matOPCs；在分化培养基中培养六天)的刺激与对于未成熟OPCs的作用相比，引起实质上较弱的促炎症反应(图4)。这一观察结果符合成熟OPCs中TLR4表达水平低的发现(图2)，而且表明未成熟细胞对于Env和TLR4表达水平具有类似的较高的敏感度。
1.2.4.Env通过TLR4介导其作用并且促炎症反应涉及IRAK-1/4，TRIF和NFκB
为了证明Env对于TLR4的特异性和更清楚地呈现下游信号通路，我们实施了大量的对照实验(图6)。与对照相比，在刺激OPC之前将重组Env加热失活极其显著地降低了iNOS诱导(图6A)。通过抗体介导的TLR4阻断实验观察到iNOS转录同样显著地减少，从而确认了Env对于该受体的特异性和其与所观察到的下游促炎症作用的关联(图6D)。为了更清楚地呈现Env活化TLR4情况下的细胞内通路，我们检测了TLR4活化后的两个已知下游通路的作用：涉及IRAK-1/4(白介素-1受体相关激酶1/4)的MyD88依赖通路和涉及TRIF(β干扰素TIR结构域衔接蛋白)的MyD88依赖通路。在Env存在时施用IRAK-1/4抑制剂I或TRIF抑制肽导致iNOS表达水平显著降低(图6B、C)，证明Env介导的TLR4活化导致MyD88依赖以及MyD88非依赖信号转导通路二者的激活。两个通路能够汇合于NFκB(核因子活化B细胞κ轻链增强子)细胞核转运。我们使用抗-NFκB抗体确认了Env刺激导致具有细胞核定位NFκB的OPCs急剧增加(图E-G′)，这对于所观察到的促炎症细胞因子转录上调现象提供了一种解释。
1.2.5Env介导硝化应激标记物硝基酪氨酸的诱导
Env刺激后显著增加的NO(参见图3H)是一种活性氮(RNS)。NO能与大量细胞内分子，包括蛋白质、核酸和脂质反应，导致形成3-硝基酪氨酸残基(3-NT)。我们发现，与缓冲液对照相比，将大鼠OPCs暴露于重组Env蛋白导致3-NT阳性细胞急剧增加(图7B，B′和C，C′)，表明NO介导硝化应激的诱导。然后，用iNOS抑制分子L-NAME(L-Ng-硝基精氨酸甲酯)预孵育的情况下，发现NO产量显著减少(数据未呈现)，3-NT阳性OPCs的形成也如此(图7D-D′)。当把失活的对映异构体D-NAME用作阴性对照时，Env介导的3-NT形成未受到影响(图7E-E’)。另一方面，施用极强的NO供体SNAP(S-亚硝基-N-乙酰青霉胺)用作阳性对照且导致几乎所有OPCs都硝基酪氨酸化(图7F-F′)。更重要的是，在MS患者脑髓的NAWM中也能检测到通过其表达前体标记物PDGFRα而呈现的3-硝基酪氨酸阳性OPCs(图7G-G″′)，表明该应激机制在MS中具有病理学关联。
1.2.6Env影响OPCs髓磷脂表达
紧接着这些观察，我们检测了Env蛋白能否影响髓磷脂修复活性所必需的少突胶质细胞分化过程。为了这一目的，分别评价了Env刺激的大鼠OPCs中髓磷脂蛋白CNPase(2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶)在Env刺激后三天和MBP(髓磷脂碱性蛋白)在刺激后六天的表达。结果表明Env急剧减少CNPase和MBP阳性细胞的数目(图8A-D″′)，与此相反，前体标记物O4的表达未改变(图3F-G′)。这证明，Env蛋白的存在极大地阻碍了细胞分化反应。然而，在Env刺激的同时加入L-NAME而不是D-NAME能够恢复MBP的表达(图8E-H′)，从而证明3-NT形成与OPC分化能力的降低之间通过硝化应激而建立直接联系。
1.3结果分析
诸如MS的神经炎症脱髓鞘疾病中NS髓鞘再生无效被认为主要是由于常驻型OPCs合理分化和使得脱髓鞘的神经元髓鞘再生的能力降低所导致的11-13，但是造成这一髓鞘再生阻断的主要和上游致病分子尚不清楚。先前的研究已经表明HERV-W的包膜蛋白Env(也称为“多发性硬化相关逆转录因子”(MSRV))在从相应的逆转录病毒颗粒中获得时14即对先天免疫系统显现促炎症作用，激活了单核细胞，单核细胞又反过来产生主要的促炎症细胞因子10。然而，到目前为止尚未发现，而且也不能预见，Env和OPC分化能力的降低之间存在直接联系。本文中我们证明在MS影响的NS组织中能够检测到该Env蛋白，而且此Env能够通过先前未知的、在某分化步骤中存在于OPCs上的Env受体TLR4干预OPC分化。该不利的效果是通过iNOS造成的。该应激反应导致硝基酪氨酸形成并且直接影响髓磷脂蛋白的表达。令人感兴趣的是，Env刺激不影响OPC细胞存活率，而且细胞形态保持不变，表明Env介导的信号不靶向细胞骨架成分。需要注意且证明本出乎意料的发现具有新颖性的是，之前的研究已声称在人脑少突胶质细胞上不存在TLR415。然而，与本领域中该前述认识形成对照的是，我们能够清楚地证明TLR4不仅在原代培养OPCs中表达(大鼠和人来源两者)，而且还在MS组织中的PDGFRα阳性常驻型人OPCs中表达。这样的差异可能源于Lehnhardt和其同事使用了较一般的标记物O4来检测少突胶质细胞而我们改为使用新近承认的前体标记物PDGFRα这一事实。尽管如此，我们故此首次证明了TLR4在OPCs中的这一独特表达模式，此时业内还无法相信存在该模式。此外，我们观察到在OPC成熟期间TLR4急剧下调，表明受体表达和由此引起的对于Env的敏感性都局限于未成熟细胞。尽管如此，该发现具有病理学关联，因为它表明这些细胞能够与MS病变中表达和释放的Env蛋白直接作用。根据这些发现，我们的结论是，MSRV/HERV-WEnv蛋白不仅是MS的免疫病理学组分，而且还能够对内源髓磷脂修复活性呈现显著的消极影响。因此，结论在于，在许多MS患者疾病过程中观察到的修复能力减弱现象是由于激活了MSRV/HERV-W成分2。需要注意，先前的一项研究描述了由染色体7上一个具有稳定插入片段的缺陷性拷贝(由于在gag和pol基因之间不具有编码序列而不能产生RT-活性或颗粒)编码的HERV-WEnv蛋白的实验效果16。该Env蛋白能够由这唯一的HERV-W7q元件编码基因(env，或ERVW-E1位点)表达，在其表面结构域的C末端部分具有四个氨基酸缺失，明显导致独特的细胞通路，而且已知具有体内表达，蛋白水平局限于胎盘17、18。该蛋白实际上是“驯化”HERV蛋白17的一个实例，目前对合胞体滋养层组织形成具有生理作用并因此命名为“合胞素”19。在HERV-W亚型(例如MSRV-Env或合胞素)之间，HERV-WEnv中相应的融合基因结构域以及TLR4结合结构域能够基本保守。他们作为活性结构域构象暴露的表面或细胞外蛋白的有效性是被高度调控的，而且合胞素的生理作用仍然深埋在合胞体滋养层中并限于存在在胎盘中。因此，相关的致病原似乎是非生理激活的特征，例如，通过人中的某环境传染因素20、21，或者是体内或体外实验性转基因条件。有报道称在患有多发性硬化(MS)的个体NS星形胶质细胞中发现了合胞素，但是其他报道中使用抗体检测到HERV-WMSRV-Env亚型而非合胞素22。尽管如此，能通过转基因技术在小鼠星形胶质细胞中表达合胞素序列，导致释放对于少突胶质细胞损害的细胞因子16，但是发现转基因小鼠无法存活(C.Power与H.Perron的私人交流，神经病毒学专题研讨会，圣地亚哥，2007)。然而，在Antony和其同事发现在这样的转基因小鼠脑髓中，结肠腺瘤性息肉病基因(APC)阳性髓鞘形成少突胶质细胞易受到合胞素介导的细胞毒性影响的情况下，我们能够证明只有未成熟的OPCs显著地易受Env介导的促炎症信号影响，此时成熟细胞不受影响。因此，该研究的结果目前看起来像是由于与其在脑细胞中转基因硬性表达胎盘蛋白这一条件相关的人为实验条件造成的。与从人为实验条件中推出的这些结果不同，我们目前已经揭示了一种处理成熟神经系统(NS)的内源修复能力的损害机制，而不是如上述的MS病理，其突出特征在于伴随轴突损害的免疫介导的少突胶质细胞减少和髓鞘损失。实际上，目前已深刻证明了与NS炎性病变相关的、Env-介导的对于免疫细胞的作用7、10、23-25，但是先前的研究并未证明HERV-WEnv对于神经胶质细胞具有涉及MS斑块OPCs磷脂再生阻断的这样的直接致病力。本发明的结果关联了MS脑免疫组化结果，显示活性MS斑块或活性较差的病变边缘有大量Env蛋白表达，目前支持其在MS病变中已知的OPC髓鞘再生缺陷方面具有作用。
实施例2：使用抗-Env特异抗体有效治疗由HERV-W家族包膜蛋白诱导的髓鞘再生阻断
来自HERV-W家族的包膜蛋白(Env，尤其来自多发性硬化相关逆转录病毒亚型，MSRV-Env)是非髓鞘形成OPC分化为产生髓鞘的成熟少突胶质细胞这一能力的潜在抑制剂，该分化步骤似乎是髓鞘再生过程的关键步骤。我们研究了MSRV-Env蛋白对于少突胶质细胞分化的两个不同标记物的表达的影响：
-CNPase(2′，3′-环核苷酸-3′-磷酸二酯酶)代表了总髓磷脂蛋白的4％，并且存在于轴突的非致密少突胶质细胞被鞘的细胞质中。CNPase是由发育中的少突胶质细胞合成的髓磷脂特异性蛋白中最早发现的。
-MBP(髓磷脂碱性蛋白)构成髓磷脂蛋白的30％，并且在中枢和周围神经系统髓磷脂致密化中起到主要作用。在体内和体外，它都紧随着CNPase出现，而且是成熟少突胶质细胞的特异性标记物。本研究的目的是确定诸如GNbAC1这一重组人源抗-EnvIgG4单克隆抗体这样的特异性抗-Env抗体能否阻断MSRV-Env介导的对于OPC成熟的抑制。实际上，GNbAC1的这样的作用能指示抗体具有“抗髓鞘再生阻断细胞”的特性。为了检测这一假设，在存在和不存在GNbAC1的情况下，通过将重组蛋白包被在培养物表面或者通过将蛋白质加入培养基中而用MSRV-Env孵育人OPC原代培养物。分别在刺激后一天或三天通过免疫细胞化学分析评估CNPase(作为早期成熟标记物)和MBP(作为晚期成熟标记物)的表达。
在本实施例中，MSRV-Env指代全长重组MSRV-Env蛋白，其包含HERV-W包膜蛋白的细胞内、跨膜和细胞外结构域。
呈现于此处的结果表明人OPC在其细胞质膜上特异地表达TLR4，而且也证明MSRV-Env重组蛋白特异地和显著地减少CNPase和MBP阳性细胞的数目。这些观察结果与实施例1中对于人和大鼠OPC获得的结果是一致的。此外，我们的实验首次显示，MSRV-Env诱导的人OPC成熟的抑制(阻断)能够由GNbAC1处理完全逆转，说明其新颖和之前无法预期的治疗特性。这因而对于进展形式的多发性硬化的治疗提供了额外的指示。
2.1材料和方法
2.1.1材料
用于人OPC原代培养的材料
用于评价人OPC中成熟标记物表达的材料
用于由MSRV-Env、GNbAC1和MSRV-Env缓冲液刺激OPC的材料
2.1.2实验方案
用MSRV-Env、MSRV-Env缓冲液和GNbAC1孵育人OPC
由PX′Therapeutics生产和纯化重组全长MSRV-Env(548aa；61,44KDa)(批次110719-1)。初始浓度为0.6mg/ml(9,76μM)。MSRV-Env缓冲液(20mMTrizma-HCI，pH7.5，150mMNaCl，1.5％SDS，10mMDTT)由PX′Therapeutics提供。该溶液用作阴性对照。GNbAC1(批次T96/bAC1/B1；GMP生产)由PolymunScientific，维也纳，奥地利生产和纯化。初始浓度为10mg/ml(68,03μM)。
通过在接种细胞之前将溶液包被于细胞培养皿表面或者通过在接种细胞之前将其加入细胞培养基中，用不同的处理刺激人OPC。在任何情况下，将labtek8孔腔室玻片(Nunc)预先用聚合-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich)在37℃包被过夜。
Labtek8孔腔室玻片的包被
在无菌层流罩(FischerBioblock，法国)中将不同处理溶液稀释于PBS，并且将Labtek8孔腔室玻片(Nunc；每孔250μ)如下包被：
-MSRV-Env(1μg/ml)在37℃包被2小时
-MSRV-Env缓冲液(与MSRV-Env相同的稀释度)在37℃包被2小时
-MSRV-Env+GNbAC1A1：MSRV-Env(1μg/ml)和GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)的混合物在37℃包被2小时
-MSRV-Env+GNbAC1A2：MSRV-Env(1μg/ml)和GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)的混合物在37℃包被2小时
-MSRV-Env+GNbAC1B1：MSRV-Env(1μg/ml)在37℃包被2小时，用PBS清洗，并紧接着用GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)在37℃包被1小时
-MSRV-Env+GNbAC1B2：MSRV-Env(1μg/ml)在37℃包被2小时，用PBS清洗，并紧接着用GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)在37℃包被1小时
-单独的GNbAC1A1：GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)在37℃包被2小时
-单独的GNbAC1A2：GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)在37℃包被2小时
-单独的GNbAC1B1：PBS在37℃下2小时，然后用GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)在37℃包被1小时
-单独的GNbAC1B2：PBS在37℃下2小时，然后用GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)在37℃包被1小时
-BSA(1μg/ml)在37℃包被2小时
-BSA+GNbAC1A1：BSA(1μg/ml)和GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)的混合物在37℃包被2小时
-BSA+GNbAC1A2：BSA(1μg/ml)和GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)的混合物在37℃包被2小时
-BSA+GNbAC1B1：BSA(1μg/ml)在37℃包被2小时，用PBS清洗，并紧接着用GNbAC1(7.35μg/ml＝50nM)在37℃包被1小时
-BSA+GNbAC1B2：BSA(1μg/ml)在37℃包被2小时，用PBS清洗，并紧接着用GNbAC1(29.4μg/ml＝200nM)在37℃包被1小时
人少突胶质前体细胞培养
从人脑组织中分离的OPC购自ScienCellResearchLaboratories(通过3HBiomedical，瑞典)。每个小瓶在1ml中含有＞1×106个细胞。根据制造商(Sciencell)的建议，通过向OPC完全培养基(OPCM)中添加OPC生长溶液(OPCGS)和青霉素/链霉素(P/S)而重建OPCM。
将含有人OPC的小瓶放置于37℃的水浴中并用搅拌器缓慢搅动，直至内容物完全融化。用1ml的Gilson吸液管缓慢地重悬所述细胞。然后，将其稀释于完全OPCM，并且接种到8孔labtek培养皿中(7000细胞/cm2＝10000细胞每孔)，所述8孔labtek培养皿先前用多聚-L-赖氨酸(0.01％，Sigma)和用(或不用)如上描述(参见3.2.1.1)的处理在无菌层流罩(FischerBioblock，法国)中包被。所述培养物在37℃；5％CO2下孵育直至进行接下来的免疫细胞化学实验。次日更换生长培养基，以除去处理了72小时的培养基中残留的DMSO和未贴壁的细胞。
在培养基中用MSRV-Env孵育
在8孔labtek培养皿中对人OPC进行3小时的预培养(参见3.2.1.2)之后，将所述细胞在8孔labteks(250μl/孔)中在37℃培育24小时或72小时，同时加入下述溶液：
-MSRV-Env缓冲液，用作阴性对照加入完全细胞培养基中
-MSRV-Env以3nM(0,184μg/ml)加入完全细胞培养基中
-MSRV-Env(3nM)+GNbAC1(200nM；29,4μg/ml)混合物加入完全细胞培养基中
-GNbAC1(200nM)单独加入完全细胞培养基中
OPC体外表达TLR4和髓鞘形成标记物
孵育24或72小时后，除去细胞培养基并且将由如上所描述的处理刺激的人OPC细胞(参见3.2.1)在多聚甲醛溶液(PBS溶解的4％PFA，每腔室250μl)中于室温固定1小时。然后，在PBS(每腔室3×250μl)中清洗他们三次，并且通过与PBS溶解且含有0,1％TritonX100的10％肽牛血清(FBS)溶液(每腔室250μl)在37℃孵育1小时而使得非特异性结合位点饱和。在TLR4染色的情况下，细胞仅与PBS溶解的10％FBS孵育(每腔室250μl)。饱和后，将OPC培养物与第一抗体溶液在4℃孵育过夜，所述抗体溶液如下稀释于PBS溶解的10％FBS溶液(每腔室200μl)中：
-1/1000的鼠抗-TLR4抗体(培养24和72小时之后)
-1/200的鼠抗-CNPase抗体(刺激24小时之后)
-1/100的鼠抗-MBP抗体(刺激72小时之后)
在PBS(每腔室3×250μl)中清洗细胞三次，并且与如下的第二抗体溶液在37℃孵育1小时(每腔室250μl)
-1/200的共轭FITC山羊抗-鼠抗体
室温下在PBS(每腔室3×300μl)中清洗三次之后，将塑料腔室与玻片分开。然后将玻片用含有DAPI的封片剂(Vectashield)封片。使用Axioscope显微镜(蔡司)通过荧光显微技术呈现染色情况。
数据分析
MSRV-Env-T刺激(或对照)24小时后，每个腔室随机选择10个视野计数CNPase免疫反应性细胞。CNPase阳性细胞的百分比如下计算：
MSRV-Env-T刺激(或对照)72小时后，每个腔室随机选择10个视野计数MBP免疫反应性细胞。MBP阳性细胞的百分比如下计算：
呈现的数据为CNPase或MBP阳性细胞百分比的平均值±SEM。图表使用Windows系统下5.00版GraphPad软件(圣地亚哥，加利福尼亚，USA)绘制。使用SigmaStat(芝加哥，IL，USA)进行无参数统计学检验。
以下的结果是在三个独立的系列实验中获得的，每一个实验使用一小瓶新的冷冻商购OPC：OPCICC01、OPCICC02和OPCICC03。
2.2结果
2.2.1人OPC体外表达TLR4受体
通过免疫荧光显微技术评估TLR4的表达。进行饱和步骤时不使用任何去污剂使得仅检测细胞表面的TLR4。该实验确认了MSRV-Env的目标受体在原代培养24和72小时后存在于人OPC细胞表面(未显示)。
2.2.2人OPC体外表达CNPase和MBP
使用亮视野显微术呈现人OPC体外形态。OPC呈现一个细胞主体和通常两部分细胞延伸。通过免疫荧光显微术确认CNPase和MBP分别在培养24小时和72小时之后的表达(未呈现)。
2.2.3存在或不存在GNbAC1的情况下MSRV-Env对于人OPC分化的影响
包被的MSRV-Env对于原代培养人OPC成熟标记物表达的影响(OPCICC01)
该第一系列实验(OPCICC01)的目的是建立人OPC原代培养条件，以及用MSRV-Env预包被labteks腔室玻片的条件和CNPase和MBP免疫染色实验方案。
在接种人OPC之前，用1μg/mlMSRV-Env包被labtek培养皿。作为阴性对照(缓冲液)，仅用MSRV-Env缓冲液在相同条件下孵育培养皿。
CNPase阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的85±4％显著地减低至在由MSRV-Env预包被的labteks中刺激24小时的人OPC中的69±6％(*ρ＜0,05；t-检验)(图9A)。
培养72小时之后，MBP阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的74±7％显著地减低至由MSRV-Env(+Env-T)预包被的labteks中的25±3％(*ρ＜0,001Mann-Whitney秩和检验)(图9B)。这些结果表明，MSRV-Env在体外抑制人OPC向髓鞘形成细胞成熟。
GNbAC1对于由MSRV-Env诱导的OPC成熟抑制作用的影响(OPCICC02)
第二系列实验(OPCICC02)的目的是确认MSRV-Env对于人OPC分化的影响，并且确定将蛋白质直接加入细胞培养基的情况下，MSRV-Env能否抑制人OPC分化。而且，我们也测试了GNbAC1是否能够在该模型中抑制MSRV-Env的作用。
对于在预包被MSRV-Env的labteks中刺激人OPC的情况，采用两种不同的实验方案评估GNbAC1处理。首先，在接种OPC之前用MSRV-Env(1μg/mL)和GNbAC1(50nM或200nM)的混合物预孵育labteks培养玻片(条件GNbAC1-A)。第二个实验方案由接种OPC之前顺序进行的MSRV-Env(1μg/mL)包被然后GNbAC1(50nM或200nM)包被组成(条件GNbAC1-B)。
MSRV-Env和GNbAC1对于人OPC中CNPase表达的影响
刺激24小时之后，在由1μg/mlMSRV-Env预包被的labteks中观察到CNPase阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的75±2％显著地减低至55±2％(*ρ＜0,001对缓冲液；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)。而且在由1μg/mlBSA预包被的labteks中进行刺激对于CNPase表达没有影响(71±2％)，这表明，使用MSRV-Env时观察到的影响是特异的，因为这样的影响在使用对照蛋白质时无法呈现(图10A)。
由MSRV-Env预包被的labteks中CNPase阳性细胞的减少被GNbAC1显著地抑制(图10A)。在50nM和200nM，以及在两个所检测的处理方案中能够观察到GNbAC1的这一作用：(i)条件GNbAC1-A，50nM(69±4％)，200nM(80±2％)；(ii)条件GNbAC1-B，50nM(96±3％)和200nM(76±4％)(Ψρ＜0,001，单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)。而且，GNbAC1的作用似乎是浓度依赖的(图10A)。
额外的对照实验表明，与对照条件(缓冲液)相比，在单独用GNbAC1(50nM或200nM)或者用GNbAC1(50nM或200nM)+BSA(1μg/ml)的混合物预包被的labteks中刺激人OPC24小时对于CNPase的表达不产生影响(ρ＞0,05；单因素方差分析)(图10B)。这些观察结果是由如先前所描述的两个GNbAC1处理方案获得的(GNbAC1-A，50nM；GNbAC1-A，200nM和GNbAC1-B，50nM)。
本实验也证明了，即便溶液中低浓度的MSRV-Env也能在24小时后诱导CNPase阳性细胞百分比显著减少，从对照条件下(缓冲液)的78±2％至MSRV-Env组中的57±2％(*ρ＜0,001对缓冲液；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)(图11)。而且，MSRV-Env诱导的CNPase表达的降低被GNbAC1(200nM)处理完全抵销(76±2％；Ψρ＜0,001对Env-T；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)。令人感兴趣的是，需要注意，与对照条件(缓冲液)相比，单独的200nMGNbAC1(74±2％)对CNPase表达不产生影响(图11).
MSRV-Env和GNbAC1对于人OPC中MBP表达的影响
刺激72小时之后，在由1μg/mlMSRV-Env预包被的labteks中观察到MBP阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的76±2％显著地减低至57±1％(**ρ＜0,001对缓冲液；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)(图12A)。在该实验中，由BSA(1μg/ml)预包被的labteks中的OPC培养物显示其MBP阳性细胞百分比与对照(缓冲液)稍有不同(69±2％)。然而，BSA的效果也明显不同于MSRV-Env的效果(ρ＜0,001对Env-T；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)，而且，由于在其他实验中或使用CNPase的相同系列实验中未观察到该现象，因而表明其是独立且不具有影响性的作用。
由MSRV-Env预包被的labteks中MBP阳性细胞的减少被GNbAC1显著地抑制(图12A)。在50nM时观察到GNbAC1具有部分效果，而在200nM，以及在所检测的两个处理方案中达到了完全的抑制：(i)GNbAC1-A，50nM(69±2％)和200nM(73±2％)；和(ii)GNbAC1-B，50nM(68±2％)和200nM(74±2％)(Ψρ＜0,001对Env-T，单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)。而且，GNbAC1的作用似乎是浓度依赖的(图12A)。
本实验也证明，MBP阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的76±2％显著地减低至由加入培养基中(3nM)的MSRV-Env刺激72小时的细胞中的55±2％(*ρ＜0,001对缓冲液；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)(图12B)。而且，MSRV-Env诱导的MBP表达的减少被GNbAC1处理(GNbAC1200nM)完全抑制(76±2％；Ψρ＜0,001对Env-T；单因素方差分析然后FisherLSDpost-hoc分析)(图12B).
确认GNbAC1对于由MSRV-Env诱导的OPC细胞分化抑制作用的影响(OPCICC03)
尽管如上所描述的结果来自获得的大量数据，该第三系列实验(OPCICC03)的目的是在彻底独立的实验系列中完全重复GNbAC1的效果。
MSRV-Env和GNbAC1对于人OPC中CNPase和MBP表达的影响
刺激24小时之后，在由MSRV-Env(1μg/ml)预包被的labteks中观察到CNPase阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的90±1％显著地减低至71±1％(*ρ＜0,05；等级Kruskal-Wallis方差分析-1然后StudentNewmanKwulspost-hoc分析)(图13A)。如先前所描述，在两个所检测的GNbAC1处理方案中，由MSRV-Env诱导的CNPase表达抑制被GNbAC1彻底逆转(GNbAC1-A，90±2％，GNbAC1-B，91±4％)(Ψρ＜0,05对Env-T，等级Kruskal-Wallis方差分析-1然后Dunnpost-hoc分析)(图13A)。
刺激72小时之后，在由MSRV-Env(1μg/ml)预包被72小时的labteks中观察到MBP阳性细胞的百分比从对照条件下(缓冲液)的78±2％显著地减低至55±3％(*ρ＜0,05对于缓冲液；等级Kruskal-Wallis方差分析-1然后Dunnpost-hoc分析)(图13B)。如先前所描述，在两个所检测的GNbAC1处理方案中，由MSRV-Env诱导的MBP表达抑制被GNbAC1(200nM)彻底逆转(GNbAC1-A；80±2％，GNbAC1-B；75±2％)(Ψρ＜0,05对Env-T，等级Kruskal-Wallis方差分析-1然后Dunnpost-hoc分析)(图13B)。
合并OPCICC02和OPCICC03实验的数据
在同一分析中将自如上所示的两组不同系列实验(OPCICC02和OPCICC03)所获得的结果合并。因此，图14的标绘数据表示了针对CNPase(图14A)和MBP(图14B)的8至14个独立实验。该分析表明，MSRV-Env和GNbAC1对于人OPC分化的影响是高度可重复和一致的。
为了标准化表达数据，对照条件(缓冲液)被用作参照并被看作100％。总的来说，这些结果表明，在本系列实验中使用的MSRV-Env浓度抑制24％数量的CNPase阳性细胞(对照；100±1％；ENV：76±1％)和27％数量的MBP阳性细胞(对照；100±2％；ENV：73±2％)。GNbAC1(200nM)完全逆转MSRV-Env对于CNPase表达的作用(GNbAC1-A；102±1％；GNbAC1-B；101±1％)(图15A)，还有对于MBP表达的作用(GNbAC1-A；101±2％；GNbAC1-B；97±2％)(图15B)。
2.3结果分析
因此，本实施例的数据表明，MSRV-Env强烈且高度可重复地诱导少突胶质细胞成熟过程的两个不同特异标记物表达减少。因此MSRV-Env抑制了人少突胶质前体细胞向髓鞘形成细胞分化。而且，我们在此清楚地证明GNbAC1完全逆转MSRV-Env的这一损害影响，并恢复该模型中CNPase和MBP的正常水平。这些结果表明，GNbAC1能够治疗HERV-W/MSRV-Env诱导的OPC分化阻断。因此，这些结果有力支持GNbAC1用于治疗HERV-W包膜蛋白诱导的脱髓鞘病变的新颖特性。鉴于如实施例1所示的持久性Env-阳性细胞和分泌物，这尤其可以施用于进展形式的多发性硬化，对于该多发性硬化，髓鞘再生是关键步骤但不发生自MS病变周围的OPC。
实施例3：在由髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和MSRV/HERV-W包膜蛋白(Env)诱导的实验性变应性脑脊髓炎(EAE)鼠科模型中研究GNbAC1抗体、L-NAME、SMT、DMF或富马酸钠的治疗效果
3.A比较单个分子(单剂治疗)和抗-Env抗体与小分子的结合(组合治疗)，所述小分子抑制Env在OPC阻断中诱导的效应物
3.A.1.材料
C57BL/6小鼠来自CharlesRiver
MOG35-55EspiKem，Srl(多肽公司)；编号：SC1272。
GNbAC1；批次T950111-8(抗MSRV/HERV-W人源lgG4抗体，包括如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示互补决定区(CDRs)中的每一个。
L-NAME(NG-硝基-L-精氨酸甲基酯)Sigma；编号：N5751-5G批次BCBF4375V
SMT(S)甲基异硫脲半硫酸盐(Sigma)；编号：M84445-100G批次STBC1003V
二甲基富马酸酯(DMF)Sigma；编号：242926-100G批次2507VBCBH
甲基纤维素MCSigma；编号64605-100G批次BCBD9989V
IFA(Sigma)Sigma编号：F5506-10ML批次：061M8728
PTX(百日咳毒素；Calbiochem)；编号：516561批次D00128881
PBS(磷酸盐缓冲溶液；Lonza)；编号516561；批次；D00128881
Env(P′XTherapeutics)；生产批次的纯化蛋白经验证不含内毒素(LDL检测＜5UI/ml)并且具有生物学活性(Geneuro内部QC检测)。
疲劳转棒仪(LE8200；Bioseb法国)
3.A.2.方法
无病原体的雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自CharlesRiver实验室并在免疫前饲养于动物平台一周。免疫前一天，所有的小鼠均称重，并随后在疲劳转棒测试中进行评估。疲劳转棒仪：
训练期：免疫之前9和8天。用小鼠饲养笼将它们从储藏间转移到实验室。使小鼠在15分钟内适应实验室。在训练期间，将每只小鼠放在恒定转速(4rpm)的疲劳转棒仪上，如果一只小鼠跌落，她会回到疲劳转棒仪上，当小鼠舒服地待在疲劳转棒仪上时，小鼠在120秒内跑动。将所有小鼠放回笼子，转速增加到13rpm并将小鼠再次放到疲劳转棒仪上120秒。将所有小鼠放回笼子，转速增加到19rpm并将小鼠再次放到疲劳转棒仪上120秒。在检测期间保持温度和光密度实验室环境的稳定。
检测期：
每次免疫之前1天，用小鼠饲养笼将它们从储藏间转移到实验室。使小鼠在15分钟内适应实验室。然后让小鼠在10个逐渐增加的转速水平接受两种测验，转速范围从7到40rpm。记录个体在从疲劳转棒仪上跌落(每一个转速水平采用两种检测)之前所延迟的时间直至60秒。因此，确定了每一个动物在疲劳转棒仪系统上的训练和表现。
疲劳转棒检测结果表达为，在本条件下(16至29rpm)在神经运动损伤可识别范围内针对每一测试日期和每一个测试转速，每一组个体平均评分的动力学，显示SEM条。
针对每一测试日期和每一个转速值对每一个小鼠个体计算与第一天测试日期相同转速(D-7，在相关组中开始诱导疾病之前)相比在疲劳转棒仪上相对增加或减少的时间(跌落前)。该值计算为“在X天在疲劳转棒仪上的时间”-“7天时相同的小鼠在相同转速下的时间”。附图说明了不同的组针对代表性的可区分转速值在整个研究期间的动力学，所述代表性的可区分转速值经验证可以在我们的条件下将生病的动物与健康动物区别开(比如，过高或过低的转速值要么使得健康动物很快跌落，要么使得生病的动物能够维持缓慢的运动)。
在每一个动物已能够自我控制的情况下，初始体重和行为数据作为计算每一组的平均值和标准差之前的参照。根据每一系列实验之前提供的相应信息，将不同组的动物均一地关在每一个笼子里。
临床评估
根据以下标准，每星期5天对动物进行称重和临床评分：0＝无症状；1＝尾瘫痪或后肢反射亢进或单侧后肢无力；2＝双侧后肢或前肢无力；3＝加上一侧麻痹或严重缺陷；4＝完全后肢或前肢瘫痪；5＝加上对侧肢体的部分瘫痪或主要缺陷；6＝濒死的或死的。这些编自标准准则，目的在于使用本模型更快地反映脑和颈髓病变的诱导。
在所有实验过程中，在星期一、星期三和星期五对小鼠称重，每周3次。
对于实施例3.A的系列实验，分组定义如下：
所有6小鼠组在0天进行第一次颈部皮下注射，然后在第7天和第14天进行脊侧注射，使用200μgMOG/小鼠+60gMSRV-Env+IFA。
A组为MSRV-Env诱导EAE阳性对照组，未进行任何处理。
对于G至H组，从免疫后12天已开始单独用GNbAc、L-NAME、SMT和DMF或与GNbAc1一起以如下所示的计量治疗，此时已经开始观察到EAE临床症状的进展情况。GNbAc1人源抗体施用一次，而L-Name或SMT每4天施用直至第29天本研究结束。对于用作接受DMF治疗的E和H组，我们之前已经确定了每只小鼠每天消耗水体积量，而且已经确定(在我们的实验条件下)，每只小鼠每天消耗大约3.5ml饮用水。因此，在该测量结果基础上，每天向3.5ml饮用水中每只小鼠添加1mgDMF+0.08％甲基纤维素的剂量。
在每一种免疫原注射后的同一天，对所有组的每只动物注射350ng百日咳毒素(PTX)(腹腔注射)，并且如通常在EAE实验方案中所作的那样在2天后重复注射一次，以有助于淋巴细胞迁移通过血-脑屏障。
实施例3.A实验组总揽
3.A.3结果：
临床观察：
如上所描述定期评估临床症状评分和体重。研究期间EAE评分动力学呈现于图16、17和18中。
所有小鼠中均可记录到诸如反射亢进，尾瘫痪，后肢、前肢无力和部分瘫痪的EAE临床评分的规律、持续的演变，直至A组(EAE阳性对照)实验结束和在其他组中直至12天，其他组在12天时单独用GNbAc1人源抗体(B组)或抗自由基(C、D、E组)或同时用GNbAc1和抗自由基(F、G、H组)治疗。
治疗后观察：在用GNbAc1仅治疗1次的B组中，临床症状在达到29天时稍微减弱。在仅用L-NAME、SMT治疗的组中，可以观察到无规律的恢复，但EAE进展减少。需要提出的是，16+天时SMT的注射被打断。
对于用GNbAc1和L-NAME、SMT和DMT分别同时治疗的F、G和H组而言，恢复更加显著，而且G和H组尤其显著。这结果表明，协同作用显著地加快并增加了EAE症状的恢复。还值得提出的是，使用这些物质治疗并未在任何组小鼠中导致异常(包括分开检测的对照小鼠)。
根据图16、17和18所呈现的结果，我们可总结如下：
-未治疗动物(A组)呈现最高临床评分(最坏的疾病演变)。用GNbAc1单独治疗的动物(B组)在注射后得到改善(从12天开始)。
-用L-Name或SMT单独治疗的动物比B组具有较低的恢复评分和动力学。
-用DMF治疗的E组和用GNbAc1抗体(200μg单独剂量)与L-NAME组合治疗的F组在研究结束时具有相同的恢复。
-用GNbAc1抗体与SMT组合治疗的G组和用GNbAc1抗体与DMF组合治疗的H组在研究结束时具有显著更好的恢复，而且比所有的其他组更早呈现临床改善动力学。这表明，组合GNbAc1和SMT或GNbAc1和DMF的协同益处可导致治疗效果的显著改善。
疲劳转棒测试
需要首先明确的是，图19中标记为“1inj”和“2inj”的组对应于用Env蛋白和MOG抗原仅注射一次(1)或两次(2)的对照动物，与其他所有组中为了诱导临床上明显的EAE而要求用Env蛋白和MOG抗原注射三次形成对比。它们代表暴露于低于致病阈值的Env并且未诱导临床疾病的对照小鼠。它们确认了，为了诱导所有进行不同治疗的检测动物发展成急性和严重EAE症候及演变，必须进行这种三次注射的模式。因此，在发展型和进行性疾病条件下，被治疗的动物中观察到的治疗作用是相对于治疗效果而言的。
根据图19中呈现的23rpm时疲劳转棒评分结果，我们可以看出：
-23rmp时的体力已经达到足以揭示动物中主要感官和运动机能失调的阈值：未治疗的A组具有最差的结果和动力学，其中注射仅一次或两次(“1inj或2inj”)的动物具有显著较轻微的症状和明显更好的演变。未治疗的B组中的恶化和进展性临床缺陷确认了疾病和相应的NS病变被3次Env注射完全激活。因此，进行不同治疗的所有其他组由Env诱导发生了类似的潜在疾病。
——经单独注射200μgGNbAC1进行治疗后，具有EAE的B组在本实验期间结束时恢复到与低剂量暴露于Env而未诱导疾病的对照小鼠类似的评分。
——在这些条件下，最值得注意的效果呈现于用GNbAC1抗体结合SMT所治疗的G组，其似乎具有突出的恢复动力学曲线，在本研究结束时获得所有组中最好的评分。这表明，组合GNbAC1和SMT的协同益处可导致显著改善的治疗效果。
——仅用SMT治疗的D组也具有改善的动力学和结果(研究期间的最后时间点)，尽管其程度不大。
根据图20中呈现的26rpm时疲劳转棒评分结果，我们可以看出：
-26rmp时的体力确认了，这些条件超过了本实验中为了揭示动物主要感官和运动机能失调而要求的阈值：未治疗的A组具有最差的结果和动力学，其中注射仅一次或两次(“1inj或2inj”)的动物具有显著较轻微的症状和明显更好的演变(在研究期间结束时“1inj”组具有非常好的评分)。
——经单独注射200μgGNbAC1进行治疗后，具有EAE的B组在本实验期间结束时恢复到与D、G、C、E和H组以及与“2inj”对照类似的评分
——在这些条件下，最值得注意的效果呈现于用GNbAC1抗体结合L-NAME所治疗的F组，其似乎具有良好的恢复动力学曲线，在本研究结束时获得所有组中最好的评分。仅用L-NAME治疗的C组也具有改善的动力学和结果，尽管其程度不大。这表明，组合GNbAc1和L-NAME的协同益处可导致显著改善的治疗效果。
根据图21中呈现的29rpm时疲劳转棒评分结果，我们可以看出：
-29rmp时的体力也确认了，这些条件超过了为揭示动物主要感官和运动机能失调而要求的阈值：未治疗的A组具有最差的结果和动力学，其中注射仅一次或两次(“1inj或2inj”)的动物在研究结束时具有显著较轻微的症状和更好的发展，具有类似的良好评分。
——经单独注射200μgGNbAC1进行治疗后，具有EAE的B组在本实验期间结束时恢复到与低剂量暴露于Env而未诱导疾病的对照小鼠类似的评分。
——在这些条件下，最值得注意的效果呈现于用GNbAC1抗体结合L-NAME所治疗的F组，其也似乎具有良好的恢复动力学曲线，结果获得所有组中最好的评分(研究结束时)。仅用L-NAME治疗的C组也具有改善的动力学和结果，尽管其程度不大。
——另一个一般情况下值得注意的结果在于，仅由GNbAc1治疗的B组小鼠具有规律性改善，与未治疗的动物(A组)相比，B组小鼠在所有条件下(16至29rpm检测)总是呈现非常稳定和/或改善的评分。
虽然如此，GNbAc1与L-NAME或SMT的组合极大地强调了所揭示的这一明显效果。与DMF的组合也能起到改善作用，但具有较慢的动力学。然而，这并不排除优化剂量和较长治疗期导致的较好改善。
因此，在所有检测的条件下(包括临床评分)，SMT、L-NAME或DMF与GNbAc1的组合相对于单独使用任何治疗分子对于临床和功能的恢复具有更显著的优势。单独使用所述小分子似乎具有较低且特别短暂的效果，而GNbAc1具有持续较长时间的效果，与这些小分子药物相比在研究结束时能够提供最好的恢复，因而呈现持久效果。
使用组合可以显著改善最终的恢复动力学和幅度，目前已在体内呈现使用本发明治疗剂组合获得协同和标的功能恢复效果的优势。这证明了在人类疾病中指示更早和更潜在的临床效果的指标。
3.B.比较抗-Env抗体的两种剂量作为单剂治疗单独提供或与抗-NO药物组合提供的治疗效果
3.B.1材料和方法
除非特别指出，所以的材料和方法如实施例3A所描述。
实验组
实施例3B实验组总揽
所有小鼠在第0天进行三次颈部皮下注射，在第7天和第14天进行脊侧注射。此处，A组的小鼠仅注射200μgMOG/小鼠和IFA，不注射Env，从而在本系列实验中构成不具有EAE的阴性对照组(对照-)。B组代表本系列实验中具有未治疗EAE的阳性对照组(对照+)。其他组注射200μgMOG/小鼠+MSRV-ENV(60μg)+IFA，治疗方式如上文所总结的内容所示。在免疫后12天在对应的组中起始治疗。
C、E、G组在J12接受200μgGnbAc1；D、F、H组在J12接受500μgGnbAc1；B组仅接受GnbAc1缓冲溶液。
E和F组在J12、J14、J19、J21、J26和J28每周两次接受SMT腹腔内注射(200mg/小鼠)
对于接受DMF的G和H组，我们之前已经确定了每只小鼠每天消耗水体积量，而且已经确定(在我们的实验条件下)，每只小鼠每天消耗大约3.5ml饮用水。因此，在该测量结果基础上，每天向3.5ml饮用水中每只小鼠添加2mgDMF+0.08％甲基纤维素的剂量。
对于每一个疲劳转棒检测转速，当具有Env诱导EAE的未治疗小鼠(B组，代表具有未治疗EAE的阳性对照)的对应曲线与模拟对照(A组，用不含Env蛋白的IFA稀释MOG免疫)相比显示显著缺陷时，结果是有效的。任何时候，只要这样的标准不能达到，那么就认为结果是“不具有说明性的”，因为基于来自“阳性对阴性EAE”组的这样一个显著分歧的曲线，故此相应的技术和实验条件也不能通过质量控制。
20天之后，用生理盐水溶解的20μgMSRV-Env进行静脉注射(I.V.)，从而由MSRV-Env蛋白在所有小鼠中造成系统性急性免疫反应，此时对于EAE小鼠的大多数治疗都取得了显著的临床改善(类似缓解)。这只在第21天对B、D、F和H组的小鼠实施，或者在第22天对A、C、E和G组的小鼠实施。实施的目的是为了研究不同组对于急性Env抗原血症的反应，以及评估各种治疗方案预防效果的最终差异。
3.B.2结果：
临床观察
如上文所描述定期评估临床症状评分和体重。研究期间EAE临床评分动力学呈现于图22、23和24中。呈现于图25、26和27中的体重曲线表示与第一次注射免疫原之前一天相比体重的相对增加。
疲劳转棒测试
疲劳转棒测试的结果以不同转速(16；26；29rpm)呈现于图28、29和30中。
本系列实验解决中等(200μg)相对高(500μg)浓度治疗性GNbAC1抗体作为单剂治疗的影响，并且在与SMT和DMF组合时进行类似比较。
整个研究期间临床得分曲线的全面比较已经证明是有效的，因为(i)未治疗的Env诱导EAE(B组)具有最恶化的演变，而且(ii)不具有EAE的模拟免疫对照(A组)在第20天静脉注射(I.V.)Env之前这期间不具有可检测的临床症状。
直至第20天时的该静脉注射，所有治疗组与未治疗的Env诱导EAE具有显著和清晰的不同。第20天时，在研究期间具有不同疾病动力学的治疗组具有类似的评分，平均组低于0.5，表明所有治疗组处在缓解期。这确认了所有抗体施用剂量以及所有检测的与DMF或SMT的组合的效果。此后，在第20天静脉(iv)注射Env蛋白引起的免疫反应模拟Env表达高峰及其在血液中的释放，在自然发生的疾病启动新的严重复发阶段预期如此。如图22、23和24所示，不同产品和剂量的治疗潜力之间显示显著差别：
1)GNbAC1在500μg剂量时(D组)非常有效地赋予抵抗该Env抗原血症高峰的抵抗性，但是在200μg剂量时(C组)显示暂时的临床损伤。
2)在与SMT组合的情况下，两种GNbAC1剂量(E和F组)并未显示显著的临床评分的变化。因此，与单独用抗体在该较低剂量进行治疗的小鼠(C组)相比，SMT增加该用最低剂量GNbAC1(200μg)治疗的小鼠抵抗静脉注射MSRV-Env免疫反应的抵抗力。
3)在同时用较高的GNbAC1剂量(H组)治疗时，用DMF治疗的小鼠对该抗原血症高峰显示临床抵抗性，但是在较低剂量时(G组)不能预防临床损伤。DMF因而不能增加该用最低剂量GNbAC1(200μg)治疗的小鼠抵抗静脉注射MSRV-Env免疫反应的抵抗力。与单独用GNbAC1在相同剂量治疗的小鼠(D组)相比，用DMF和较高GNbAC1剂量(500μg，在H组)治疗的小鼠具有类似抵抗力。
4)曲线指示了所有组在研究期间增加的体重，其令人惊讶地显示用500μgGNbAC1治疗的D组具有最好的端点。
5)200μgGNbAC1(C组)或仅组合较高剂量GNbAC1的DMF(H组)产生与模拟对照相等的端点。
这表明了临床评分动力学显示超出了各种治疗的相对效果：
-单独的较高剂量(500μg)GNbAC1抗体显示最好的临床效率。如体重增加动力学所示，它对于动物的全面健康也具有积极效果。
-在与较低剂量(200μg)GNbAC1组合时，SMT显示能显著增加治疗效果，对最终的MSRV-Env静脉注射免疫反应具有完全的抵抗性。
这表明，GNbAC1显示最具潜力的治疗作用，因为其在较高剂量(500μg)时提供了最好的结果，但是，在其较低剂量(200μg)时，通过与SMT组合能够有力增强其效力，SMT能有效防止研究结束时由静脉注射造成的Env抗原血症高峰带来的临床恶化。
而且，这些结果也表明，较高剂量的GNbAC1，单独或与目前剂量的DMF组合使用，能够显著增加综合健康治疗效果(根据体重增加曲线)。
尽管如此，SMT或DMF与较高剂量的GNbAC1的最终协同效果即便存在也不能看出，因为在EAE小鼠目前的疾病诱导和活性条件下，单独的抗体已经提供了最大的治疗效果。
并列地，疲劳转棒分析客观上确认了，在所有相关的转速下(图28A、29A和30A)，较高剂量的GNbAC1(500μg/小鼠)对于改善经治疗Env诱导EAE小鼠的神经缺陷显然是最有效的产品(单独提供)。
当疲劳转棒测试显示用较低剂量GNbAC1与SMT组合治疗的动物中神经系统改善，在26和29rpm具有明显的神经运动(图29B和30B)时，其也确认了SMT与GNbAC1的协同效果。在16rpm(图28B)，较低的转速在研究期间似乎不能提供足以证明该临床益处的可辨别的潜力。
最后，疲劳转棒的结果显示了，在两个GNbAC1剂量下，DMF治疗的Env介导EAE小鼠具有改善，但该结果只在29rpm显得更加清楚(图30C)。
因此，如果将该客观且自动化的测试结果考虑进来评价动物神经系统的表现，如目前的实施例3B所示，单剂治疗基础上提供GNbAC1能够清楚地呈现稳妥的治疗。与抗-NO分子的协同效果，如低剂量GNbAC1与SMT中所见的那样，也能清楚地证明和指示潜在的疗效。这必然存在于各种GNbAC1剂量，但是在已经具有500μgGNbAC1的最佳效果的目前的实验条件中无法看到。
3.C.单独的抗-Env抗体或富马酸钠(单剂治疗)与抗-Env抗体和富马酸钠(组合治疗)之间的比较
3.C.1材料和方法
材料
实验组
3.C.2结果：
临麻观察：
如上文所描述定期评估临床症状评分和体重。研究期间EAE评分动力学呈现于图31中。
A组代表阴性对照，用IFA、不含有Env蛋白的MOG和溶于其稀释缓冲液中的抗体的安慰剂注射，A组在研究期间从未显示明显的临床症状。
在第12天用GNbAc1人源抗体(C组)或富马酸钠治疗的组中，EAE临床评分的演变可以记录直到第12天，富马酸钠是DMF-相关抗一氧化氮自由基(抗-NO)，其在D组中单独使用，或在E组中与GNbAc1同时使用。
令人感兴趣的是，此处仅接受了高剂量GNbAc1抗体的组(C和E)在研究结束时显示其临床评分曲线显著恢复和端点显著改善。与用无效的同型对照抗体治疗的B组相比，仅用富马酸钠治疗的D组并不显示任何显著的临床改善(曲线上重叠的误差条)。所有小鼠中均记录了规律且持久的EAE临床评分演变，直至用对Env蛋白不具有特异性的同型对照抗体治疗的B组(Env诱导EAE)实验结束。这表明，用GNbAc1时观察到的治疗效果是该特定抗体所特有的，而且其与注射任何同型人源抗体(比如，不能靶向同样的表位)无关。
因此，该最后的实施例表明：
-尽管注射了所有其他成分以达到模拟Env诱导的EAE(IFA和MOG)以及模拟抗体注射(抗体稀释剂)的要求，不注射Env蛋白的对照A组的行为表现与健康对照相似，不产生临床症状；普通饮用水隐含模拟了投送水溶解富马酸钠。
-用无关的同型对照抗体治疗的动物(B组)呈现了最高的临床评分(最差的疾病演变)。Env蛋白存在下的该模拟同型抗体注射因而形成具有典型EAE演变的阳性EAE对照。
-仅用富马酸钠治疗的D组在研究结束时呈现不好的结果，与用无效抗体对照治疗的B组类似。
-在本研究结束时，高剂量GNbAC1单独使用或与富马酸钠组合治疗的C和E组具有相同并且显著优良的恢复。临床的改善从治疗开始后的第15天出现。
此处，由于富马酸钠单独不具有效果，而且由于C和E组的曲线动力学似乎是相同的，因而在富马酸钠显示无效的情况下，在这两个组中观察到的治疗效果一定是彻底的而且仅由GNbAC1导致。
3.D分析实施例3的全部结果
综上所述，用诸如GNbAC1的抗-Env特异性抗体和诸如DMF、SMT或L-Name的抗一氧化氮自由基(抗-NO)化合物治疗，无论单独或组合，均是有优势的，因为在体外和体内能够治疗和预防由HERV-W包膜蛋白，特别MSRV-Env，诱导的髓鞘再生潜在活性的阻断。
高剂量GNbAC1(500μg/小鼠，大约20-25g)在本实施例中单独提供用作单剂治疗时，与低剂量(200μg)相比也显示特有的效果。
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Claims (21)
1.一种抗-HERV-WEnv配体，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
2.根据权利要求1所述的抗-HERV-WEnv配体，其用于预防和/或治疗多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
3.根据权利要求1或2所述的抗-HERV-WEnv配体，其为scFV、Fab片段或抗体，更特别为嵌合、基因工程或人源抗体，而且甚至更特别地为IgG，诸如IgG1或IgG4。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的抗-HERV-WEnv配体，其特征在于其包含至少一个且更优选地包含每一个如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的互补决定区(CDRs)。
5.一种一氧化氮自由基抑制药物，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
6.根据权利要求5所述的一氧化氮自由基抑制药物，其用于预防和/或治疗多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
7.根据权利要求5或6所述的一氧化氮自由基抑制药物，其选自Ng-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、S-甲基-异硫脲(SMT)、富马酸或二甲基富马酸酯(DMF)。
8.一种医药组合物，其包含至少一种根据权利要求1至4中任一权利要求所述的抗-MSRV/HERV-WEnv配体和至少一种根据权利要求5至7中任一权利要求所述的一氧化氮自由基抑制药物。
9.根据权利要求8所述的医药组合物，其用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
10.根据权利要求9所述的医药组合物，其用于预防和/或治疗多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
11.一种用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍的方法，其包含向人类施用至少一种抗-HERV-WEnv配体。
12.根据权利要求11所述的方法，其用于预防和/或治疗多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述抗-HERV-WEnv配体为scFV、Fab片段或抗体，更特别为嵌合、基因工程或人源抗体，而且甚至更特别地为IgG，诸如IgG1或IgG4。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗-HERV-WEnv配体包含每一个如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的互补决定区(CDRs)。
15.根据权利要求11至14中任一权利要求所述的方法，其进一步包含施用至少一种一氧化氮自由基抑制药物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一氧化氮自由基抑制药物选自Ng-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、S-甲基-异硫脲(SMT)、富马酸或二甲基富马酸酯(DMF)。
17.一种用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍的方法，其包含向人类施用至少一种一氧化氮自由基抑制药物。
18.根据权利要求17所述的方法，其用于预防和/或治疗多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述一氧化氮自由基抑制药物选自Ng-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、S-甲基-异硫脲(SMT)、富马酸或二甲基富马酸酯(DMF)。
20.一种医药品，其包含：
-至少一种如权利要求1至4中任一权利要求所定义的抗-HERV-W
Env配体；和
-至少一种如权利要求5、6或7所定义的一氧化氮自由基抑制药物；
作为可同时、分开或随着时间推移散开施用的组合品，用于预防和/或治疗与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的疾病中的髓鞘再生阻碍。
21.根据权利要求20所述的医药品，其用于治疗和/或预防多发性硬化(MS)中的髓鞘再生阻碍，更特别用于复发减缓型多发性硬化(RRMS)、诸如继发进行性多发性硬化(SPMS)或原发进行性多发性硬化(PPMS)的进行性多发性硬化、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、诸如精神分裂症或双相情感障碍的精神病，以及与HERV-W包膜蛋白(ENV)，特别其MSRV亚型，表达相关的其他脱髓鞘疾病。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1221399 Country of ref document: HK |
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| GR01 | Patent grant | ||
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