CN112584845A - 用于调节髓过氧化物酶(mpo)表达的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过离体和/或体内调节哺乳动物受试者的未分化骨髓(BM)细胞中的MPO水平和/或活性来调节所述受试者中髓过氧化物酶(MPO)的表达和/或活性的方法。本发明还提供了用于治疗MPO相关病症的治疗方法和组合物。

Description

用于调节髓过氧化物酶(MPO)表达的方法和组合物
技术领域
本发明涉及用于调节髓过氧化物酶(MPO)表达的方法和组合物，以及它们治疗MPO相关疾患的用途。
背景技术
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在本文中对以上参考文献的认可不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与当前公开的主题的可专利性相关。
背景技术
嗜中性白细胞是跨越血流的吞噬性含颗粒细胞，并且被称为先天性免疫应答的主要介体。在产生由细菌性感染或组织损害所致的早期炎症性起始信号后，嗜中性白细胞从血流，穿过内皮细胞屏障，并且朝向损害部位进行迁移，并且介导早期炎症性应答。这个应答主要归因于对细菌细胞或外来物质的吞噬以及细胞因子和含有蛋白水解酶和反应性氧类(ROS)的颗粒的释放[1]。嗜中性白细胞的一种更新近确定的特征是它们能够形成嗜中性白细胞细胞外诱捕网(NET)。NET的产生(被称为NETosis)是一种受到严格控制的机制，通过所述机制，在染色质解凝之后，DNA从细胞释放，连同多种杀细菌蛋白质一起形成网样陷阱[2]。
髓过氧化物酶(MPO)是一种由若干髓系细胞表达的含血红素过氧化物酶，并且是由嗜中性白细胞表达的最常见蛋白质(占嗜中性白细胞净重的5％)。MPO催化形成毒性物质次氯酸(HClO)以及其他氧化性物质[3]。新近地，显示对鼠嗜中性白细胞进行MPO滴定会促进染色质解凝和NET形成。此外，显示源于患有MPO缺乏症的人供者的嗜中性白细胞不能产生NET，从而指示MPO为NET形成所必需[4]。
MPO被显示代表许多疾患中的关键因素，所述疾患例如是心血管疾病、炎症性疾病、神经变性疾病、肾病和免疫介导的疾病[5-6]。Van Der Been等人报道MPO牵涉于若干疾病中，尤其是以急性或慢性炎症为特征的那些疾病[21]。
更具体来说，阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease，AD)和痴呆是特征在于涉及记忆、定向、判断和推理的整体认知减退的进行性神经变性疾病，并且是年长者中最常见的痴呆形式。长期以来已知晓免疫细胞涉及于AD发病机理中，并且Alois Alzheimer先前描述了反应性神经胶质细胞。星形细胞和小神经胶质细胞在AD的情形下被广泛研究，并且已知所述细胞在淀粉样蛋白-β(amyloid-β)斑块周围簇集。当这些细胞变得活化时，它们分泌多种促炎性介体，从而潜在导致对神经元和周围血管组织的氧化性损害，并且促进慢性炎症。尽管曾经被视为与脑生理机能和病变具有较小相关性，但近年来，外周免疫细胞在AD中的作用已正受到日益增长的探究。这个作用由在过去数年中进行的全基因组关联研究强烈支持，所述研究将由髓系细胞表达的免疫相关基因内的多个基因座鉴定为AD易感基因座。新近地，Zenaro和同事报道穿透脑的嗜中性白细胞通过释放促炎性细胞因子IL-17以及通过产生NET来促进AD的两个小鼠模型中的AD样病变。嗜中性白细胞消减或抑制嗜中性白细胞向CNS中迁移导致认知和记忆改善，以及神经炎症减轻和Aβ负担降低。最后，它们还报道与健康个体相对比，在AD患者的脑中，形成NET的嗜中性白细胞升高[7]。此外，还显示NET从嗜中性白细胞的释放由淀粉样原纤维触发，从而支持在神经变性脑中形成NET[8]，并且报道了MPO免疫反应性细胞处于AD和PD患者的脑中特定神经变性区域中[9]。此外，显示穿透脑的嗜中性白细胞促进AD的两个小鼠模型中的AD样病变，此与释放促炎性细胞因子IL-17以及产生NET相关。在另一方面，使用抗LY6G抗体进行嗜中性白细胞消减或抑制嗜中性白细胞向CNS中迁移导致认知和记忆改善，以及神经炎症减轻和淀粉样蛋白-β水平降低。更新近地，报道了在AD模型小鼠的脑中，皮质毛细血管中嗜中性白细胞粘附增强，从而导致脑血流量降低。
此外，多发性硬化症(MS)，作为年轻成人的最常见神经变性疾病，是一种慢性自体免疫疾病，特征在于对脑和脊髓中髓鞘的免疫攻击，主要由T细胞穿过脑-血屏障(BBB)进行浸润所介导。尽管不同于非自体免疫神经变性疾病，MS的病因包括先天性免疫细胞与获得性免疫细胞两者，但若干证据指示涉及嗜中性白细胞介导的组织损害。源于MS患者的嗜中性白细胞展现致敏表型，以及增加的脱粒和NET形成和增强的氧化爆发[10]。多个证据还指示嗜中性白细胞涉及于MS的实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中[11]。在EAE期间，嗜中性白细胞被募集至脑血管结构[12]，侵袭CNS[13]，并且在脱髓鞘和轴突损害的区域内积累[14]。此外，嗜中性白细胞牵涉于对BBB和脑-脊髓屏障(BSCB)的破坏中，并且显示施用抗嗜中性白细胞抗体会阻碍EAE进展[15]。
由嗜中性白细胞达成的内皮屏障破坏可允许白细胞侵扰至CNS中，并且促进EAE/MS病变。嗜中性白细胞被显示在临床症状发作之前不久在CNS中积累，并且与病变定位相关联[13]。由嗜中性白细胞达成的内皮屏障破坏被表明通过反应性氧类(ROS)的释放而发生[16]。因此，显示在EAE期间抑制MPO会恢复BBB完整性，并且改善疾病严重性[17]。然而，临床前单次剂量抗体介导的嗜中性白细胞消减延迟了实验性自体免疫脑脊髓炎的发作，并且连续消减减弱了实验性自体免疫脑脊髓炎的进展，而髓磷脂特异性T细胞应答的产生仍然不受影响。在这个研究中，还发现嗜中性白细胞相关酶诸如髓过氧化物酶和嗜中性白细胞弹性蛋白酶在发动CNS炎症方面不起作用，如通过使用相应剔除小鼠和抑制剂所分析[18-19]。
若干策略先前用于抑制MPO活性。举例来说，叠氮化物、酰肼和异羟肟酸用于通过修饰血红素位点来抑制MPO[7]。此外，Yu等人描述在使用EAE小鼠模式的情况下，用于治疗多发性硬化症的特异性MPO抑制剂N-乙酰基赖氨酰基酪氨酰基半胱氨酸酰胺(KYC)[22]。WO2015148716公开用于使用小分子药物和细胞因子/生长因子的组合来离体扩增造血细胞的方法和组合物。多个基因受到影响，在它们之中包括MPO[20]。
因为旨在修饰MPO的血红素活性位点，所以先前技术抑制剂未能解决由MPO的其他结构域介导的非所需功能。此外，使用这类抑制剂不能防止形成可导致诸如AD的病变中的血管炎的抗MPO抗体。因此，有需要提供用以特异性地和有效地靶向罹患MPO相关疾患的受试者中的MPO及其各种活性的安全、高效和特异性的方法和组合物。
发明内容
根据第一方面，本公开提供了调节哺乳动物受试者中髓过氧化物酶(MPO)的表达和/或活性的方法。更具体来说，本发明方法可包括向受试者施用有效量的以下中的至少一者的步骤：(a)至少一种能够或适合于调节受试者的至少一种未分化骨髓(BM)细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物。或者或另外，方法可向受试者施用(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。应注意本发明方法还涵盖施用(a)和(b)或包含(a)和(b)中的至少一者的任何组合物或药盒。
根据其他方面，本公开提供了用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法。本发明方法可包括向所治疗受试者施用治疗有效量的以下中的至少一者的步骤：(a)至少一种能够调节受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。本发明方法还涵盖施用(a)和(b)或包含(a)和(b)中的至少一者的任何组合物或药盒。
在本发明的一些其他方面，本发明提供了包括以下中的至少一者的药盒：(a)至少一种能够或适合于调节受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
根据一些其他方面，本公开提供了一种包含治疗有效量的以下中的至少一者的药物组合物：(a)至少一种能够或适合于调节受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。组合物可任选地还包含药学上可接受的一种或多种载体、一种或多种稀释剂和/或一种或多种赋形剂中的至少一者。
本发明的其他方面涉及至少一种未分化BM细胞，所述细胞用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染。
本发明的其他方面涉及供在用于调节MPO的表达和/或活性的方法中使用的本发明的组合物、药盒和细胞中的至少一者。本发明的其他方面提供了供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的治疗方法中使用的本发明的组合物、药盒和细胞中的至少一者。
在某一其他方面，本发明提供了供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用的治疗有效量的以下中的至少一者：(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。本发明还提供了用于抑制NETosis和相关疾患的方法。借助于以下描述，本发明的这些和其他方面将变得显而易知。
附图说明
为更好地了解本文公开的主题以及例示它可如何在实践中加以执行，现将通过仅仅是列举非限制性实例的方式，参考随附图式来描述实施方案，在附图中：
图1：在C57BL/6小鼠中建立实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)模型
在所指示髓磷脂寡树突细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)和百日咳毒素(PT)浓度下诱发达成EAE疾病的C57BL/6雌性小鼠的临床评分。N≥4只小鼠/组。
图2：骨髓(BM)移植挽救对经照射C57BL/6小鼠的致死性
对经受致死性辐射(9Gy)，继之以来自WT小鼠的BM细胞、Lin-经富集BM细胞的移植或盐水移植的2月龄雄性C57/BL6小鼠的重量追踪。
图3A至图3F：来自MPOTm1/Lus的BM移植至5xFAD小鼠中
图3A：显示对经受照射以及源于WT小鼠的BM的移植的2月龄非转基因同窝仔畜的重量追踪的图。
图3B：显示对经受照射以及源于MpoTm1/Lus小鼠的BM的移植的2月龄非转基因同窝仔畜的重量追踪的图。
图3C：显示对经受照射以及源于WT小鼠的BM的移植的2月龄5xFAD转基因小鼠的重量追踪的图。
图3D：显示对经受照射以及源于MpoTm1/Lus小鼠的BM的移植的2月龄5xFAD转基因小鼠的重量追踪的图。
图3E：经WT BM移植小鼠中血液过氧化物酶活性测定。
图3F：经MpoTm1/Lus-BM移植小鼠中血液过氧化物酶活性测定
图4A至图4C：具有MPO缺陷性骨髓的5XFAD小鼠的产生图4A：小鼠群组的图示：以致死方式照射8周龄5XFAD小鼠和它们的非转基因同窝仔畜，并且用源于WT C57BL/6或MPOtm1 /lus小鼠的骨髓移植。每个组中小鼠的数目在括号中指示。
图4B：对源于10月龄小鼠的骨髓细胞的MPO mRNA表达分析。数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾t检验。
图4C：实验设计的示意性时间线。
图5A至图5E：MPO缺乏抑制5XFAD小鼠的焦虑相关行为的增加
图5A：显示经受旷场迷宫测试的七月龄小鼠在角落花费的时间的图。
图5B：显示经受旷场迷宫测试的七月龄小鼠在中心花费的时间的图。
图5C：显示由小鼠行进的总距离的图。
图5D：显示经受高架十字迷宫测试的小鼠在敞开臂中花费的时间的图。
图5E：显示经受高架十字迷宫测试的小鼠在闭合臂中花费的时间的图。
数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾t检验。
图6A至图6E：MPO缺乏针对5XFAD小鼠的学习和记忆减退进行保护
图6A：显示使用双试验Y型迷宫测试(指示短期空间记忆)，7月龄小鼠的新异臂探索相对频率的图。
图6B：显示使用双试验Y型迷宫测试(指示短期空间记忆)，7月龄小鼠的新异臂探索相对时间的图。
图6C：显示8月龄小鼠在莫里斯水迷宫(Morris water maze)测试(指示空间学习)中的逃避潜伏期的图。
图6D：显示8月龄小鼠在莫里斯水迷宫测试(指示空间学习)中的总行走距离的图。
图6E：显示9月龄小鼠在恐惧条件化测试中的僵直行为的图。
数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾t检验。
图7A至图7E：MPO缺乏不影响5XFAD小鼠中的淀粉样蛋白-β斑块负荷
图7A：用WT骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI/ThioS染色的海马薄片的代表性图像。比例尺＝200μm。
图7B：用WT骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI/ThioS染色的海马薄片的代表性图像。比例尺＝200μm。
图7C：用MPO-KO骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI/ThioS染色的海马薄片的代表性图像。比例尺＝200μm。
图7D：用MPO-KO骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI/ThioS染色的海马薄片的代表性图像。比例尺＝200μm。
图7E：显示对ThioS斑块密度的定量的图。数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。
图8A至图8N：5XFAD MPO KO小鼠中的低S100β表达
图8A：用WT骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI染色的海马薄片的代表性图像。
图8B：用WT骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI染色的海马薄片的代表性图像。
图8C：用MPO-KO骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI染色的海马薄片的代表性图像。
图8D：用MPO-KO骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI染色的海马薄片的代表性图像。
图8E：用WT骨髓细胞移植的WT小鼠的用S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8F：用WT骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8G：用MPO-KO骨髓细胞移植的WT小鼠的用S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8H：用MPO-KO骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8I：用WT骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI/S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8J：用WT骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI/S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8K：用MPO-KO骨髓细胞移植的WT小鼠的用DAPI/S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8L：用MPO-KO骨髓细胞移植的5XFAD小鼠的用DAPI/S100β染色的海马薄片的代表性图像。
图8M：显示对S100β平均强度的定量的图。
图8N：显示对海马样品的S100βmRNA表达分析的图。数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾曼-惠特尼检验。
图9A至图9E：5XFAD MPO KO小鼠中低水平的炎症性标志物
图9A：显示对海马样品中IL1β的mRNA表达分析的图。
图9B：显示对海马样品中CXCL10的mRNA表达分析的图。
图9C：显示对海马样品中CCL2的mRNA表达分析的图。
图9D：显示对海马样品中TNFα的mRNA表达分析的图。
图9E：显示对海马样品中VCAM1的mRNA表达分析的图。
数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾曼-惠特尼检验。
图10A至图10C：5XFAD MPO KO小鼠中的低APOE水平
图10A：对用抗APOE抗体探测的海马细胞溶解产物的western印迹分析的图片。
图10B：显示表示为每个样品相对于WT-WT组平均值的％的western印迹分析数据的图。
图10C：显示对海马样品中APOE的mRNA表达分析的图。
数据是平均值±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。双尾曼-惠特尼检验。
图11A至图11N：质粒克隆和慢病毒制备
图11A：在24小时之后对非转导经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11B：在24小时之后对用10μL GFP编码粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11C：在24小时之后对用10μL靶向MPO基因中gRNA2(SEQ ID NO:5)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11D：在24小时之后对用10μL靶向MPO基因中gRNA6(SEQ ID NO:6)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11E：在48小时之后对非转导经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11F：在48小时之后对用2μl GFP编码粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11G：在48小时之后对用2μl靶向MPO基因中gRNA2(SEQ ID NO:5)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11H：在48小时之后对用2μl靶向MPO基因中gRNA6(SEQ ID NO:6)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11I：在48小时之后对用5μl GFP编码粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11J：在48小时之后对用5μl靶向MPO基因中gRNA2(SEQ ID NO:5)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11K：在48小时之后对用5μl靶向MPO基因中gRNA6(SEQ ID NO:6)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11L：在48小时之后对用10μl GFP编码粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11M：在48小时之后对用10μl靶向MPO基因中gRNA2(SEQ ID NO:5)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图11N：在48小时之后对用10μl靶向MPO基因中gRNA6(SEQ ID NO:6)的CRISPR/Ca9编码慢病毒粒子转导的经分离Lin-细胞的FACS分析。
图12：T7 MPO裂解分析
显示T7全长DNA分析产物和裂解产物的琼脂糖凝胶的图片。胶凝显示未处理细胞以及关于所用crRNA中的每一者的经分选的或未分选的用Cas9和crRNA:tracrRNA编辑的细胞。
泳道A：未处理293细胞，用围绕H502基因座的引物扩增。
泳道B：用抗T173 RNP处理的293细胞。
泳道C：用抗D260 RNP处理的293细胞。
泳道D：用抗H502 RNP处理的293细胞。
泳道E：用抗T173 RNP处理，关于经荧光标记的tracrRNA加以富集的293细胞。
泳道F：用抗D260 RNP处理，关于经荧光标记的tracrRNA加以富集的293细胞。
泳道G：用抗H502 RNP处理，关于经荧光标记的tracrRNA加以富集的293细胞。
泳道H：T7阴性对照。
泳道I：T7阳性对照。
具体实施方式
髓过氧化物酶(MPO)是一种涉及于针对感染的身体防御机制中的含血红素蛋白质，并且主要位于嗜中性白细胞的颗粒中。MPO涉及于多种免疫介导的疾病、神经变性疾病和炎症性疾病中。
MPO RNA仅在骨髓处被检测到，并且仅有MPO蛋白到达身体中的各种靶标组织。发生在骨髓中的这个MPO基因转录在骨髓髓系细胞分化的肌母细胞阶段期间的早期被开启，并且在髓系前体被诱导以进行分化时被关闭。
本发明者提出通过特异性影响骨髓的原始不成熟细胞中MPO的基因表达，有可能调节MPO表达和后续MPO活性，从而最终产生具有经调节MPO(消除/抑制，或替代地，建立/增加MPO表达和/或活性)的嗜中性白细胞。因此，本发明者提出对不成熟细胞中MPO的特异性骨髓就地基因调节作为一种用于影响嗜中性白细胞和/或巨噬细胞或与免疫系统或其组分相关的任何其他细胞中的MPO表达和后续活性的有效、选择性和准确方法。引起关注的是，尽管一些病变与MPO在身体中的各种器官诸如脑中的积累相关，但如本文所述的对MPO的调节通过对未分化BM细胞中MPO编码基因或转录物的基因编辑而非在靶标器官(例如脑或其任何组分)中来进行。因此，本文所述的通过在BM细胞中进行体内或离体基因编辑来在嗜中性白细胞和/或巨噬细胞中达成MPO蛋白调节的方法提供了不限于特定靶标组织的广泛调节方法。换句话说，通过特异性调节(例如消减)BM细胞中的MPO，由此调节受试者的免疫系统，本发明提供了用于治疗影响未必直接与免疫系统关联的其他器官或组织的病症的强力方法。
还表明本文所述的这类方法由于各种原因而优于例如使用MPO蛋白抑制剂诸如叠氮化物、酰肼和异羟肟酸的其他方法。首先，使用已知MPO蛋白抑制剂实质性调节MPO活性需要恒定施用以解决表达MPO的嗜中性白细胞和/或巨噬细胞的持续形成。其次，已知MPO蛋白抑制剂通常被设计来结合MPO活性位点(例如血红蛋白结合位点)，由此影响蛋白质活性，具体来说是过氧化物酶活性。因此，这个方法限于由它的活性位点介导的MPO功能。以这个方式，未解决对其他MPO活性的调节，例如对如在以下进一步详述的NETosis，或由本发明公开的任何其他MPO活性具体来说是不由MPO活性位点介导的活性的抑制。换句话说，由除结合位点以外的其他MPO位点介导的MPO活性不能使用已知MPO抑制剂来调节。此外，使用这类抑制剂不能防止形成可导致诸如AD的病变中的血管炎的抗MPO抗体。
因此，本公开基于调节未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性以调节有需要的受试者中的MPO的新颖构思，并且此外，基于对调节在转录部位即骨髓处，并且具体来说是在骨髓的原始不成熟未分化细胞中进行的MPO基因表达的化合物的开发。因此，通过特异性调节(例如消除)MPO的水平、活性或表达来靶向调节受试者的免疫系统，本发明提供了影响其他器官或组织(例如脑)中的MPO水平和/或活性的方法，及其用于有效治疗直接或间接与MPO表达和/或活性(增强、降低或甚至在正常水平下)相关的病症的用途。更具体来说，通过在体内操控所治疗受试者的免疫系统或用展现经调节MPO表达的细胞(例如可分化以形成嗜中性白细胞和/或巨噬细胞的BM细胞)替换所述免疫系统，本发明提供了用于影响所治疗受试者的其他器官和组织中的MPO表达和/或活性，由此治疗可为相关的或受不同器官或组织中的MPO表达和/或活性影响的病症或疾患的工具。
如由本发明所证明，具有经调节MPO表达的骨髓细胞可在同种异体或自体骨髓移植中充当高效平台。
此外，本文开发的化合物以及经调节骨髓细胞群体可用于治疗多种直接或间接与MPO表达和/或活性相关的疾患。举例来说，与低MPO表达和/或活性相关的病症或疾患，与高MPO表达和/或活性相关的疾患，或甚至可展现MPO的正常水平、表达和/或活性，但可通过升高或通过降低MPO水平、表达或活性而受影响的疾患。
因此，根据第一方面，本公开提供了一种调节哺乳动物受试者中髓过氧化物酶(MPO)的表达和/或活性的方法。更具体来说，本发明方法可包括向受试者施用有效量的以下中的至少一者的步骤：(a)至少一种能够并且/或者适合于调节受试者的至少一种未分化骨髓(BM)细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。还应了解本发明还提供了供在调节哺乳动物受试者中髓过氧化物酶(MPO)的表达和/或活性的方法中使用的有效量的以下中的至少一者：(a)至少一种能够并且/或者适合于调节受试者的至少一种未分化骨髓(BM)细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
本发明提供了用于调节MP1的表达和/或活性的方法、组合物、细胞、药盒和系统。如本文所用的髓过氧化物酶(MPO)是见于嗜中性白细胞的嗜天青颗粒中的最具毒性的酶。MPO利用H2O2来产生在感染期间杀灭病原体的次氯酸(HClO)和其他反应性部分。
MPO基因位于染色体17的长臂区段q12–24上，并且这个基因的初级转录产物由11个内含子和12个外显子组成。MPO mRNA的选择性剪接产生3.6和2.9kB的两种转录物。初级翻译产物是80kDa前体蛋白质，所述前体蛋白质经受一系列修饰，包括信号肽裂解、N连接的糖基化和有限去糖基化，以形成催化非活性MPO前体(脱辅基原MPO(apoproMPO))。在下一步骤中，MPO通过铁-血红素分子并入至催化中心中来获得催化活性。血红素通过两个酯键以及为含血红素酶所特有的第三锍键联来共价连接，所述锍键联独特地使一个血红素分子定向至酶口袋中。血红素部分的独特构型赋予MPO极高的氧化潜力，从而使得能够在生理pH下进行氯化。原MPO的裂解产生通过血红素部分来共价连接的59kDaα亚单位和13.5kDaβ亚单位。二硫桥使成熟150kDa MPO中的两个重-轻原聚体接合。MPO表达水平取决于启动子区域中的等位基因多态性。在位置463处的G至A取代(G-463A)导致MPO转录降低至1/25。所述取代发生在是一簇核受体结合位点的Alu受体应答元件(AluRRE)内。所述取代改变了为达成增强的MPO转录所必需的Sp1转录因子的共有序列。导致MPO转录降低的G至A取代还见于位置129处(G-129A)。嗜中性白细胞是MPO的主要来源，其中它占细胞干重的5％，从而使得MPO成为嗜中性白细胞中的最丰富蛋白质。MPO仅在骨髓中在嗜中性白细胞分化期间在前髓细胞中转录。MPO表达由通过调控转录因子C-EBP和PU.1来促进多潜能祖细胞分化成粒细胞的G-CSF诱导，所述转录因子驱动粒细胞-巨噬细胞祖细胞定型成嗜中性白细胞和巨噬细胞。嗜中性白细胞分化导致在成熟细胞中不可检测的降低的MPO转录。
在前髓细胞中，MPO连同若干其他抗微生物蛋白质、丝氨酸蛋白酶和溶酶体水解酶一起被包装至嗜天青颗粒中。蛋白质包装在嗜天青颗粒中是异步的，从而产生异质性嗜天青颗粒群体。在前髓细胞中，存在至少三个种类的嗜天青颗粒。小型电子致密和有核嗜天青颗粒具有均一MPO分布，而大型球形颗粒中的MPO在颗粒边缘处被检测到。
此外，MPO由前骨髓单核细胞合成，其中它占总细胞蛋白质的1％。单核细胞释放至循环中会关闭MPO合成，所述合成在它们分化成巨噬细胞期间被进一步下调。
还应了解，在本公开的情形下，除非明确指示，否则“MPO”涵盖MPO基因与MPO蛋白两者。人MPO基因具有如由登录号：NC_000017.11提供的序列。在某一其他具体实施方案中，这种序列可包含如由SEQ ID NO:1表示的核酸序列。在一些其他实施方案中，人MPO蛋白由登录号：NP_000241表示。此外，在一些实施方案中，MPO蛋白可包含如由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。此外，在某一其他具体实施方案中，本发明还提供了如由登录号NC_000077表示的小鼠MPO编码序列，在一些实施方案中，所述编码序列可包含如由SEQ ID NO:15表示的核酸序列。在一些其他实施方案中，小鼠MPO蛋白由登录号：NP_034954表示。此外，在一些实施方案中，小鼠MPO蛋白可包含如由SEQ ID NO:16表示的氨基酸序列。
本发明方法基于通过提供(在体内或离体)调节受试者的未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑系统来调节有需要的受试者中的MPO水平和/或活性。或者，这种调节可通过提供具有经调节MPO表达和/或活性的BM细胞(特别是从同种异体受试者获得)来进行。
如本文所用，术语未分化骨髓细胞或不成熟骨髓细胞是指骨髓中具有转化成具有特定特征的专门化细胞类型的能力的细胞。骨髓(BM)是一种见于骨的内部中的中空间隙中的柔软海绵状胶性组织，其在淋巴系统中，并且特别是在血液系统的细胞的发育中产生重要作用。
在一些实施方案中，未分化BM细胞可为造血干细胞(HSC)。HSC是BM中能够自我更新和分化的原始不成熟未分化细胞。HSC分别通过髓系祖细胞和淋巴系祖细胞分裂成血细胞的骨髓谱系和淋巴谱系以产生所有成熟血细胞，包括见于循环中的三个类别的血细胞：白血细胞(白细胞)、红血细胞(红细胞)和血小板(凝血细胞)。在一些实施方案中，未分化BM细胞是祖细胞。祖细胞是骨髓的主要功能性组分，并且包括注定会成熟成为血细胞和淋巴系细胞的祖细胞。在一些实施方案中，未分化BM细胞是共同髓系祖细胞(CMP)。也表示为髓系干细胞的CMP是在HSC之后的第一细胞分化分支。骨髓谱系与淋巴谱系两者均涉及于树突细胞形成中。髓系细胞包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和巨核细胞直至血小板。淋巴系细胞包括T细胞、B细胞和(天然杀伤细胞)。
HSC和祖细胞可例如通过使用流式细胞计量术，通过利用若干不同细胞表面标志物的组合来鉴定或分离。举例来说，HSC缺乏成熟血细胞标志物的表达。此外，HSC与祖细胞两者均可例如根据表示为分化簇(CD)的特定分子来鉴定和分离。
更具体来说，如本文所用的分化簇是指用于鉴定和探究为对细胞进行免疫分型提供靶标的细胞表面分子的命名方案。CD分子充当对细胞重要的细胞受体或配体。
在一些实施方案中，未分化BM细胞的特征可在于是CD34阳性细胞(CD34+)。分化簇34(CD34)是一种作为细胞表面糖蛋白存在于造血干细胞上的跨膜磷酸糖蛋白，并且与对用于骨髓移植的造血干细胞的选择和富集相关联。此外，CD34充当细胞-细胞粘附因子，并且还可介导造血干细胞附着于骨髓细胞外基质或直接附着于基质细胞。在一些其他实施方案中，未分化BM细胞的特征可在于是CD38阳性细胞(CD38+)。分化簇38(CD38)，也被称为环状ADP核糖水解酶，是一种见于许多免疫细胞的表面上的糖蛋白，并且已被用作白血病中的预后标志物。
在一些实施方案中，未分化BM细胞可为HSC或任何祖细胞。在一些实施方案中，未分化BM细胞可包含HSC和祖细胞的任何组合。在一些实施方案中，未分化BM细胞可包含HSC和CMP的任何组合。此外，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可调节可成熟成为嗜中性粒细胞的CD34+中的MPO表达、水平和/或活性。在一些其他实施方案中，本发明的方法和组合物可调节可成熟成为巨噬细胞的CD34+中的MPO表达、水平和/或活性。因此，应了解，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物提供对巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的活性和功能的调节。
根据本公开，哺乳动物受试者可被施用以能够调节BM细胞中的MPO表达和/或活性，由此提供对MPO的体内调节的基因编辑系统，或替代地，或另外，可被施用以显示MPO的经改变表达或活性，由此提供离体调节的细胞。应注意本发明还涵盖在受试者中进行的可包括体内和离体方法以及它们的任何组合的MPO调节。这种施用导致对受试者中MPO的表达和/或活性的调节。如本文所用的基因编辑化合物是指能够调节身体中的至少单一基因的化合物。术语“调节”涵盖相对于在某种条件下测定的对照或正常或基线表达/活性水平，身体中的至少一种基因的任何变化或改变，诸如表达和/或活性增加或降低。在一些实施方案中，向受试者施用的基因编辑化合物或系统，或替代地，未分化BM细胞群体，可导致受试者中MPO的表达和/或活性的抑制或消除。
应注意，在一些替代性实施方案中，向受试者施用的基因编辑化合物/系统，或替代地，未分化BM细胞群体，可导致受试者中MPO的表达和/或活性的建立、增强或增加。因此，通过靶向操控受试者的免疫系统，实现对受试者的各种器官和组织中MPO的活性和/或水平和表达的一般性操控。此外，通过特异性和靶向操控受试者的免疫系统，与MPO-相关的病症得以治疗。
在更具体实施方案中，可施用至少一种基因编辑化合物或系统以调节受试者中MPO的活性和/或表达。基因编辑化合物可通过各种机理来调节MPO的表达和/或活性。举例来说，基因编辑化合物通过对染色体DNA进行会产生敲低细胞、生物体等的遗传修饰来调节MPO表达和/或活性。此外，基因编辑化合物/系统可通过短暂/暂时修饰(短暂敲低)来调节MPO表达和/或活性。
在一些实施方案中，由本发明方法(以及在下文中所述的组合物、细胞、药盒和用途中)使用的基因编辑化合物或系统可为天然存在的化合物(诸如酶、短DNA或RNA寡核苷酸)、合成化合物或人工化合物。在一些实施方案中，至少一种基因编辑化合物可为寡核苷酸。这种寡核苷酸可结合活性基因或其任何转录物，并且通过例如阻断转录(在由反义寡核苷酸达成的基因结合的情况下)，降解mRNA转录物(例如用小干扰RNA(siRNA))或RNA酶-H依赖性反义物)，或通过阻断mRNA翻译、前mRNA剪接位点、或用于包括miRNA的其他功能性RNA的成熟的核酸酶裂解位点(例如用吗啉代寡聚物或其他RNA酶-H非依赖性反义寡核苷酸)来导致表达降低。
在一些其他实施方案中，本发明的基因编辑化合物可包含任何核酸修饰蛋白和至少一种靶标识别元件。更具体来说，在一些其他实施方案中，可适用于本发明中的基因编辑系统可包含至少一种核酸修饰蛋白和至少一种靶标识别元件。在一些实施方案中，这种识别元件可包含使修饰蛋白特异性靶向靶标基因的核酸序列，所述靶标基因具体来说是编码本发明的MPO的基因。在一些实施方案中，核酸修饰蛋白可包括修饰编码或非编码核酸序列的任何蛋白质或蛋白质复合物。在一些其他实施方案中，由所述修饰蛋白导致的修饰可调节由这种修饰剂的靶标核酸序列编码，或替代地，由所述靶标核酸序列控制的MPO蛋白产物的表达。或者，可适用于本发明中的修饰剂可调节这种MPO的稳定性或活性。这种修饰包括溶核酸裂解(例如用核酸酶)、甲基化、脱甲基化(对编码或非编码序列，诸如控制元件进行)、蛋白质表达的活化或阻遏等。因此，在一些实施方案中，核酸修饰剂可为以下中的至少一者：核酸酶、甲基转移酶、脱甲基酶、转录因子、转录阻遏物、它们的任何融合蛋白、和包含所述修饰剂中的至少一者的任何复合物、以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，本发明的修饰蛋白可为至少一种核酸酶。应了解如本文所用的术语“核酸酶”在一些实施方案中涉及具有溶核酸活性的活性核酸酶。然而，应了解，在一些实施方案中，如本文所用的术语“核酸酶”还涵盖具有核酸酶的结构特征，但显示对任何核酸分子具体来说是DNA或RNA具有降低、缺陷性或无溶核酸活性的分子(在本文中被称为非活性核酸酶)。如本文所用的非活性核酸酶还涵盖非活性核酸酶的任何片段、突变体或融合蛋白。更具体来说，非活性核酸酶与任何其他蛋白质例如转录因子或阻遏物、甲基转移酶、脱甲基酶的融合蛋白，如将在下文中加以阐述。
更具体来说，如本文所用，术语“核酸酶”是在一些实施方案中显示具体来说能够裂解核酸(例如DNA和/或RNA)的单体之间的磷酸二酯键的溶核酸活性的酶。核酸酶以各种方式在它们的靶标分子中实现单链和双链断裂。基于活性的位置，存在两种初级分类。核酸外切酶从末端消化核酸。核酸内切酶作用于处于靶标分子的中间的区域。它们被进一步再分类为脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。前者作用于DNA，后者作用于RNA。核酸酶在它可裂解分子之前必须与核酸缔合，从而提供一定识别度。正如磷酸二酯酶、脂酶和磷酸酶一样，核酸酶属于作为水解酶的子组的酯酶。这个子组包括核酸外切酶，所述核酸外切酶是通过从多核苷酸链的末端(外)一次一个裂解核苷酸来起作用的酶。发生在3'或5'末端使磷酸二酯键断裂的水解反应。真核生物和原核生物具有涉及于mRNA的正常转换中的三种类型的核酸外切酶：5'至3'核酸外切酶(Xrn1)，其是依赖性脱帽蛋白；3'至5'核酸外切酶，即非依赖性蛋白；和多腺苷酸特异性3'至5'核酸外切酶。这个家族的成员包括产生5'-磷酸单酯的脱氧核糖核酸外切酶、产生5'-磷酸单酯的核糖核酸外切酶、产生3'-磷酸单酯的核糖核酸外切酶以及对核糖核酸或脱氧核糖核酸具有活性的核酸外切酶。这个家族的成员包括核酸外切酶II、III、IV、V、VI、VII和VIII。如上所指示，核酸内切酶是裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。一些核酸内切酶诸如脱氧核糖核酸酶I相对非特异性地切割DNA(不考虑序列)，而通常称为限制核酸内切酶或限制酶的许多核酸内切酶仅在极具特异性的核苷酸序列处进行裂解。
在某一实施方案中，核酸酶可为具有如上指定的溶核酸活性的活性酶。在一些替代性实施方案中，核酸酶可为缺陷性酶。
缺陷性酶(例如缺陷性突变体、变体或片段)可涉及相较于活性核酸酶，显示活性降低约1％、2％、3％、4％、5％至约100％，特别是约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、约95％至约99.9％，更特别是活性降低约98％至约100％的酶。
如上所指示，本发明的基因编辑系统还包含至少一种靶标识别元件。如本文所用，“靶标识别元件”是将把核酸修饰蛋白例如核酸酶引导至核酸序列内的特定靶标位置的核酸序列(RNA或DNA)。在一些实施方案中，由靶标识别元件对靶标的识别通过碱基配对相互作用来促进。在经引导核酸酶的情况下，这些靶标识别元件是特别相关的。在一些实施方案中，对于显示溶核酸活性的核酸酶，将核酸酶引导至特定位点可导致裂解核酸(例如DNA和/或RNA)的单体之间的磷酸二酯键，在一些实施方案中，此可导致对所述核酸的特异性破坏。在一些替代性实施方案中，当使用非活性核酸酶，并且特别是其融合蛋白时，通过靶标识别元件来引导这种缺陷性核酸酶可导致对由所述靶标识别元件靶向的靶标核酸序列的靶向调节(例如活化或阻遏、甲基化或脱甲基化)。应注意靶标识别元件可包含约10个核苷酸至70个核苷酸或更多。在一些其他实施方案中，靶标识别元件可包含许多核苷酸，如在下文中对于间隔体所指定。在某些实施方案中，由本发明方法使用的核酸酶可为经引导核酸酶。在一些其他实施方案中，基因编辑化合物可包含多肽，具体来说是酶。在一些实施方案中，基因编辑化合物可包含至少一种可编程经工程改造核酸酶(PEN)或其任何变体或蛋白质。如本文所用的术语“可编程经工程改造核酸酶(PEN)”，也被称为“分子DNA剪刀”，是指用于以高度靶向方式替换、消除或修饰序列的合成或天然酶。PEN靶向并且切割特定基因组序列(识别序列)，诸如DNA序列。至少一种PEN可源于天然存在的核酸酶或可为人工酶，所述核酸酶或人工酶全都涉及于双链DNA损伤的DNA修复中，并且使得能够进行直接基因组编辑。在一些替代性或额外实施方案中，本公开的基因编辑化合物还涵盖包含至少一个编码PEN的核酸序列的任何核酸分子，或包含至少一种PEN、或编码PEN的任何核酸序列的任何药盒、组合物或运载体。在一些实施方案中，至少一种PEN可为以下中的至少一者：兆碱基大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应物基核酸酶(TALEN)、Fok1核酸酶、或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统、或它们的任何融合蛋白或嵌合体。
在一些实施方案中，至少一种PEN可为兆碱基大范围核酸酶。兆碱基大范围核酸酶是特征在于具有大型识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)的脱氧核糖核酸内切酶；以致这个位点通常在任何给定基因组中仅出现一次。兆碱基大范围核酸酶是特异性的天然存在的限制酶，并且尤其包括LAGLIDADG家族的归巢核酸内切酶，主要见于真核单细胞生物体的线粒体和叶绿体中。在一些实施方案中，至少一种PEN可为megaTAL。MegaTAL是将归巢核酸内切酶诸如LAGLIDADG家族与TALEN的模块化DNA结合结构域组合的融合蛋白。
在一些实施方案中，由本发明的方法和组合物使用的核酸酶可为经引导核酸酶。在一些具体实施方案中，核酸酶是至少一种转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)。TALEN是可被工程改造来切割DNA的特定序列的限制酶。它们通过使TAL效应物DNA结合结构域融合于核酸酶的DNA裂解结构域来制备。更具体来说，TALEN是通过以下方式来设计的人工核酸内切酶：使从TAL(转录活化子样)效应物(TALE)蛋白获得的DNA结合结构域(多个几乎相同的重复序列，每个重复序列包含约34个氨基酸)融合于FokI核酸内切酶的裂解结构域。每个TALE重复序列独立地以两个可变残基[被称为重复可变二残基(RVD)]识别它的相应核苷酸(nt)碱基，以致重复序列线性地代表结合位点的核苷酸序列。
在一些其他替代性实施方案中，由本发明的方法和组合物使用的经引导核酸酶可为至少一种锌指核酸酶(ZFN)。ZFN是通过使锌指DNA结合结构域融合于DNA裂解结构域来产生的人工限制酶。锌指结构域可被工程改造来靶向特定所需DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。更具体来说，ZFN是已通过将小型锌指(ZF；约30个氨基酸)DNA结合/识别结构域(Cys2His2)与来自FokI限制酶的IIS型非特异性DNA裂解结构域组合来产生的人工核酸内切酶。然而，FokI核酸内切酶的裂解活性需要二聚化。因为ZF模块识别3bp序列，所以要求每个ZFN单体中有多指用于识别和结合较长DNA靶标序列。
在一些其他实施方案中，由本发明的方法和组合物使用的经引导核酸酶可为Fok1核酸酶或其任何融合蛋白，如将在下文中加以讨论。酶Fok1(Fok-1)，天然地见于海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)中，是一种由N末端DNA结合结构域和在C末端的非特异性DNA裂解结构域组成的细菌性IIS型限制核酸内切酶。根据本发明的一些实施方案，Fok1可通过靶标识别元件来引导至它的靶标(例如在MPO基因处)。在一些实施方案中，如上文讨论的这种靶标识别元件可为将Fok1特异性引导至靶标位点的核酸序列。识别元件可直接或间接(即通过接头)连接于Fok1。因此，一旦蛋白质通过靶标识别元件来结合于双链体DNA，DNA裂解结构域即被活化，并且裂解在靶标位点的最近核苷酸的下游的第一链9个核苷酸以及在上游的第二链13个核苷酸。更具体来说，在Fok1用作本发明的核酸修饰蛋白的情况下，特异性靶向MPO编码序列可通过使可为至少一种核酸序列(例如RNA或DNA)的至少一种特异性杂交于靶标位点的靶标识别元件直接或间接(例如通过接头)结合于Fok1来实现。此外，在一些实施方案中，至少一种PEN可为成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)系统。在一些实施方案中，本文所述的方法使用CRISPR系统作为用于调节MPO表达和/或活性的PEN。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统是一种已被改进用于基因组工程改造的细菌性免疫系统。
根据一些具体实施方案，本文所述的方法可使用可包含至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(cas)蛋白系统的PEN。因此，在更具体实施方案中，本发明方法可包括向所述受试者施用有效量的以下中的至少一者的步骤：(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的引导RNA(gRNA)的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列。本发明方法可任选地使用包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
应注意当本发明的CRISPR/Cas系统的两种元件以核酸序列形式提供时，它们可单独提供在两个或更多个核酸分子中，或替代地，一起提供在包含两种序列的单一核酸分子特别是包含(a)与(b)两者的构建体、载体或任何运载体中。
如上所指示，在本发明的一些实施方案中，本发明可以核酸序列或分子形式提供基因编辑系统的元件(例如gRNA和/或Cas蛋白)或至少其部分。术语“核酸”、“核酸序列”或“多核苷酸”和“核酸分子”是指核苷酸聚合物，并且包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、包括具有规律以及/或者不规律交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分的多核苷酸链的DNA/RNA杂合物(即其中交替核苷酸单元在糖部分的2'位置处具有–OH，接着–H，接着–OH，接着–H等)、以及这些种类的多核苷酸的修饰形式，其中包括各种实体或部分在任何位置处连接于核苷酸单元。所述术语还应理解为包括作为等同物的由核苷酸类似物制得的RNA或DNA类似物，以及如可适用于所描述的实施方案的单链(诸如有义或反义)和双链多核苷酸。核酸的制备在本领域中是熟知的。应注意本发明的核酸分子(或多核苷酸)可以合成方式或通过重组DNA技术来产生。用于产生核酸分子的方法在本领域中是熟知的。本发明的核酸分子可具有可变核苷酸长度。举例来说，在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含1-100个核苷酸，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的核酸分子包含100-1,000个核苷酸，例如约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的核酸分子包含1,000-10,000个核苷酸，例如约1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000个核苷酸。在其他实施方案中，本发明的核酸分子包含大于10,000个核苷酸，例如20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个核苷酸。
如上所指示，核酸分子可包含在构建体、载体或任何其他运载体内由本发明提供。如本文所用的载体是具有特定序列的核酸分子，其可被引入至宿主细胞中，由此产生经转化宿主细胞。载体可包括容许它在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可包括一种或多种可选择标记基因以及本领域中已知的其他遗传元件，包括引导核酸表达的启动子元件。可用于将核酸转移至靶标细胞特别是BM细胞中的许多载体例如质粒、粘粒、小环、噬菌体、病毒(如下所详述)可适用于本发明中。包含一种或多种核酸的载体可以游离体形式维持，例如作为质粒、小环DNA、转座子、病毒诸如巨细胞病毒、腺病毒，或它们可通过同源性重组或随机整合来整合至靶标细胞基因组中，例如逆转录病毒源性载体诸如慢病毒、AAV、MMLV、HIV-1、ALV等。更具体来说，在一些实施方案中，载体可为病毒载体。在一些特定实施方案中，这种病毒载体可为以下中的任一者：重组腺相关载体(rAAV)、单链AAV(ssAAV)、自身互补性rAAV(scAAV)、猿猴空泡病毒40(SV40)载体、腺病毒载体、辅助病毒依赖性腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
更具体来说，如上所指示，在一些实施方案中，病毒载体可适用于本发明中。术语“病毒载体”是指能够将核酸分子转移至宿主中的有复制能力的或复制缺陷性病毒粒子。
术语“病毒”是指不具有蛋白质合成或能量产生机构的任何专性细胞内寄生物。病毒基因组可为被脂质膜的包被蛋白质结构所包围的RNA或DNA。可用于实施本发明的病毒的实例包括杆状病毒科、细小病毒科、微小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、腺病毒科、微小核糖核酸病毒科。术语重组病毒包括嵌合(或甚至多聚)病毒，即使用来自超过一种病毒亚型的互补性编码序列构建的载体。
在一些具体实施方案中，慢病毒载体可用于本发明中。慢病毒载体源于作为逆转录病毒的子类的慢病毒。通常使用的逆转录病毒载体是“缺陷性的”，即不能产生为增殖性感染所需的病毒蛋白质。更确切来说，载体的复制需要在包装细胞系中生长。为产生包含本发明的核酸序列的病毒粒子，包含核酸的逆转录病毒核酸通过包装细胞系来包装至病毒衣壳中。不同包装细胞系提供不同包膜蛋白(亲嗜性、双嗜性或异嗜性)以并入至衣壳中，这个包膜蛋白决定病毒粒子对细胞的特异性(亲嗜性用于鼠和大鼠；双嗜性用于大多数哺乳动物细胞类型，包括人、狗和小鼠；并且异嗜性用于除鼠细胞之外的大多数哺乳动物细胞类型)。适当包装细胞系可用于确保细胞由包装的病毒粒子靶向。将包含本发明的核酸序列的逆转录病毒载体引入至包装细胞系中以及收集通过包装系来产生的病毒粒子的方法在本领域中是熟知的。
此外，在一些实施方案中，可适用于本发明中的病毒载体可为腺相关病毒(AAV)。术语“腺病毒”与术语“腺病毒载体”同义。AAV是具有小型(约20nm)蛋白质包壳的单链DNA病毒，属于细小病毒科，并且特指腺病毒科属的病毒。术语腺病毒科总体指代哺乳动物腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人、牛、羊、马、犬、猪、鼠和猿猴腺病毒亚属。具体地说，人腺病毒包括A-F亚属以及它们的单种血清型，单种血清型和A-F亚属包括但不限于人腺病毒类型1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(AdllA和Ad IIP)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91。
由于AAV不能在不存在辅助病毒共感染(通常是腺病毒或疱疹病毒感染)下复制，所以它经常被称为依赖性病毒。AAV感染仅产生轻度免疫应答，并且被视为是非致病性的，所述事实还反映在相较于其他普及的病毒载体系统，对于以重组AAV(rAAV)进行的操作，生物安全性水平要求降低。由于它的低免疫原性以及不存在细胞毒性应答，所以基于AAV的表达系统提供持续数月在休眠细胞中表达目标基因的可能性。
rAAV载体的产生系统通常由含有目标DNA的基于DNA的载体组成，所述目标DNA由反向末端重复序列侧接。构建体大小限于约4.7-5.0kb，此对应于野生型AAV基因组的长度。rAAV在细胞系中产生。表达载体与介导对于病毒复制重要的AAV rep基因和编码形成衣壳的蛋白质的cap基因的表达的辅助质粒共转染。重组腺相关病毒载体可转导分裂细胞和非分裂细胞，并且不同rAAV血清型可转导不同细胞类型。这些单链DNA病毒载体具有高转导率，并且具有在不导致宿主基因组中的双链DNA断裂的情况下刺激内源性同源性重组的独特性质。
在本发明的一些实施方案中，本发明利用CRISPR系统来特异性调节MPO基因。如上所指示，本发明的基因编辑系统可以核酸分子形式，特别是于递送载体或运载体中提供。然而，应了解任何所用基因编辑系统都还可以蛋白质复合物形式，或替代地，以如将在下文中与可适用于本发明情况下的特定基因编辑系统关联加以讨论的核糖核蛋白复合物形式施用。
如上所指示，在一些实施方案中，可适用于本发明中的基因编辑系统是CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统分成两个类别。1类系统使用多种Cas蛋白的复合物来降解外来核酸。2类系统使用单一大型Cas蛋白来达成相同目的。更具体来说，1类可分成I、III和IV型，并且2类可分成II、V和VI型。
因此，在一些实施方案中，Cas蛋白可为1类和2类CRISPR相关系统中的至少一者的成员。在一些实施方案中，cas蛋白可为II型、I型、III型、IV型、V型和VI型中的任一者的CRISPR相关系统中的至少一者的成员。如本文所用，CRISPR阵列，也被称为SPIDR(间隔体穿插的同向重复序列)，构成了通常为特定细菌物种所特有的DNA基因座家族。CRISPR阵列是最初在大肠杆菌(E.coli)中确认的一类独特散在短序列重复(SSR)。在随后数年中，类似CRISPR阵列在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、詹氏甲烷暖球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)以及其他细菌和古细菌中被发现。应了解本发明涵盖对任何已知CRISPR系统，特别是本文公开的任何CRISPR系统的使用。CRISPR-Cas系统已在原核生物中进化以通过靶向外来DNA或RNA来针对噬菌体攻击和非所需质粒复制进行保护。CRISPR-Cas系统基于存在于重复序列之间的称为间隔体的短同源性DNA序列来靶向DNA分子。这些间隔体将CRISPR相关(Cas)蛋白引导至外来DNA内的称为原间隔体的匹配(以及/或者互补性)序列，所述序列随后被裂解。间隔体可被合理设计来靶向任何DNA序列，例如MPO基因序列。此外，这个识别元件可被单独设计以识别和靶向任何所需靶标。
在某一具体实施方案中，本发明的系统的经RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶可为2类CRISPR系统。在一些其他特定实施方案中，这种2类系统可为II型CRISPR系统。
II型CRISPR–Cas系统包括‘HNH’型系统(链球菌样；也被称为就脑膜炎奈瑟氏菌血清群A菌株Z2491(Neisseria meningitidis serogroup A str.Z2491)来说的Nmeni亚型，或CASS4)，其中除遍在性Cas1和Cas2之外，作为单一极大蛋白质的Cas9也似乎足以产生crRNA以及裂解靶标DNA。Cas9含有至少两个核酸酶结构域，即在氨基末端附近的RuvC样核酸酶结构域和在蛋白质的中间的HNH(或McrA样)核酸酶结构域，但这些结构域的功能仍有待阐明。然而，因为HNH核酸酶结构域在限制酶中是丰富的，并且具有核酸内切酶活性，所以所述结构域负责靶标裂解。
此外，应注意II型系统包含cas9、cas1、cas2 csn2和cas4基因中的至少一者。应了解任何II型CRISPR-Cas系统都可适用于本发明中，特别是II-A型或II-B型中的任一者。因此，在一些其他和替代性实施方案中，用于本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统中的至少一种cas基因可为II型CRISPR系统(II-A型或II-B型)的至少一种cas基因。在更特定实施方案中，由本发明的方法和系统使用的II型CRISPR系统的至少一种cas基因可为cas9基因。应了解这种系统可还包含cas1、cas2、csn2和cas4基因中的至少一者。因此，在一些具体实施方案中，由本发明方法使用的Cas蛋白可为Cas9或其任何片段、突变体、变体或衍生物。
由Cas9达成的双链DNA(dsDNA)裂解是“II型CRISPR-Cas”免疫系统的标志。CRISPR相关蛋白Cas9是一种经RNA引导的DNA核酸内切酶，其使用与靶标位点(原间隔体)的RNA:DNA互补性。在Cas9与靶标序列之间的识别之后，发生双链DNA(dsDNA)裂解，从而产生双链断裂(DSB)。
如本文所用的II型CRISPR系统需要包括两种必需组分：“引导”RNA(gRNA)和非特异性CRISPR相关核酸内切酶(Cas9)。gRNA是由为Cas9结合所必需的“骨架”序列(也名为tracrRNA)和限定待修饰的基因组靶标的约20个核苷酸长度的“间隔体”或“靶向”序列组成的短合成RNA。如本文所用的引导RNA(gRNA)是指内源性tracrRNA与靶向序列(也名为crRNA)的合成融合物，从而提供骨架化/Cas9核酸酶结合能力与靶向特异性两者。也被称为“单链引导RNA”或“sgRNA”。
CRISPR最初用于“剔除”各种细胞类型和生物体中的靶标基因，但对Cas9酶的修饰已使CRISPR的应用延伸至“敲入”靶标基因，选择性活化或阻遏靶标基因，纯化DNA的特定区域，并且甚至使用荧光显微术使活细胞中的DNA成像。此外，容易产生gRNA使得CRISPR成为最可缩放的基因组编辑技术中的一者，并且新近已被用于全基因组筛选。在大多数CRISPR系统的情况下，基因组内的待编辑靶标序列应紧靠在原间隔体邻近基序(PAM)的上游存在。在其他系统诸如III型的情况下，不存在PAM。
在基于PAM序列识别的CRISPR系统如II型CRISPR的情况下，PAM就靶标结合来说是绝对必要的，并且确切序列取决于Cas9的种类(对于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9来说是5′NGG 3′)。在一些实施方案中，用于本发明方法中的核酸修饰蛋白是Cas9。在某些实施方案中，来自化脓性链球菌的Cas9可用于本发明的方法和系统中。然而，应了解任何已知Cas9都可为可适用的。可用于本公开中的Cas9的非限制性实例包括但不限于化脓性链球菌(SP)，在本文中也指示为SpCas9；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，在本文中也指示为SaCas9；脑膜炎奈瑟氏菌(NM)，在本文中也指示为NmCas9；嗜热链球菌(ST)，在本文中也指示为StCas9；以及齿垢密螺旋体(Treponema denticola，TD)，在本文中也指示为TdCas9。此外，在本公开的一些实施方案中，核酸内切酶可为Cas9、Cas13、Cas6、Cpf1、CMS1蛋白、或它们的源于以下或从以下表达的任何变体：海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)C7、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、高效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)YS-314、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，ATCC13032)、谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)、谷氨酸棒杆菌R、克罗彭施泰特棒杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii，DSM 44385)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus，ATCC 19977)、鼻疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)IFM10152、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)PR4、约氏红球菌(Rhodococcus jostii)RFIA1、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)B4(uid36573)、解纤维素热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)11B、氯酚节杆菌(Arthrobacter chlorophenolicus)A6、苍黄色克里布所菌(Kribbellaflavida，DSM 17836)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata，DSM43183)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)Bd1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)DJO10A、还原天芥茉碱斯奈克氏菌(Slackia heliotrinireducens，DSM 20476)、海珀尔女神菌(Persephonella marina)EX H 1、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC 9434、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea，DSM 7271)、嗜冷黄杆菌(Flavobacteriumpsychrophilum)JIP02 86、嗜粘蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila，ATCC BAA835)、卡氏玫瑰弯菌(Roseiflexus castenholzii，DSM 13941)、玫瑰弯菌RS1、集胞藻(Synechocystis)PCC6803、小迷踪菌(Elusimicrobium minutum)Pei191、未培养白蚁群组1细菌种系型Rs D17、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)S85、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，ATCC 10987)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG、唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)UCC118、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)-5-A909、无乳链球菌NEM316、无乳链球菌2603、似马停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiaeequisimilis)GGS 124、兽瘟马链球菌(Streptococcus equi zooepidemicus)MGCS10565、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)UCN34(uid46061)、查利斯格氏链球菌CH1亚株(Streptococcus gordonii Challis subst CH1)、变异链球菌(Streptococcusmutans)NN2025(uid46353)、变异链球菌、化脓性链球菌M1 GAS、化脓性链球菌MGAS5005、化脓性链球菌MGAS2096、化脓性链球菌MGAS9429、化脓性链球菌MGAS 10270、化脓性链球菌MGAS6180、化脓性链球菌MGAS315、化脓性链球菌SSI-1、化脓性链球菌MGAS10750、化脓性链球菌NZ131、嗜热链球菌CNRZ1066、嗜热链球菌LMD-9、嗜热链球菌LMG 18311、肉毒梭菌A3马里湖株(Clostridium botulinum A3 Loch Maree)、肉毒梭菌B埃克隆17B株(Clostridiumbotulinum B Eklund 17B)、肉毒梭菌Ba4 657(Clostridium botulinum Ba4 657)、肉毒梭菌F朗厄兰株(Clostridium botulinum F Langeland)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)H10、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna，ATCC 29328)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale，ATCC 33656)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、运动支原体(Mycoplasma mobile)163K、穿通支原体(Mycoplasma penetrans)、滑液支原体(Mycoplasma synoviae)53、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis，DSM 12112)、Bradyrhizobium BTAil、汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)X14、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB18、沼泽红假单胞菌BisB5、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)DS-1、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae.)DFL 12、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)Pal5FAPERJ、重氮营养葡糖酸醋杆菌Pal 5JGI、固氮螺菌(Azospirillum)B510(uid46085)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum，ATCC 11170)、代尔夫特菌(Diaphorobacter)TPSY(uid29975)、蚯蚓蚯蚓肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)EF01-2、脑膜炎奈瑟氏菌053442、脑膜炎奈瑟氏菌α14、脑膜炎奈瑟氏菌Z2491、需盐脱硫弧菌(Desulfovibriosalexigens)DSM 2638、德莱空肠弯曲杆菌269 97(Campylobacter jejuni doylei 26997)、空肠弯曲杆菌81116、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)RM2100、肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、奥湖甲苯单胞菌(Tolumonas auensis)DSM 9187、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)T6c、乌贼希瓦氏菌(Shewanella pealeana，ATCC 700345)、巴黎嗜肺军团菌(Legionella pneumophila Paris)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)130Z、多杀性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、新凶手土拉热弗朗西斯氏菌U 112(Francisella tularensis novicida U 112)、全北美区土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis holarctica)、土拉热弗朗西斯氏菌FSC 198、土拉热土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis tularensis)、土拉热弗朗西斯氏菌WY96-3418或齿垢密螺旋体(ATCC 35405)。
在一些具体和非限制性实施方案中，化脓性链球菌M1 GAS的Cas9，特别是蛋白质标识符：AAK33936.1的Cas9，可适用于本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统中。在一些实施方案中，Cas9蛋白可由如由SEQ ID NO:3表示的核酸序列编码。在其他具体实施方案中，Cas9蛋白可包含如由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列或其任何衍生物、突变体、变体或任何融合蛋白。一旦表达，由本发明的方法和组合物提供的Cas9蛋白和gRNA即通过gRNA“骨架”结构域与Cas9上的表面暴露的带正电荷沟槽之间的相互作用来形成核糖蛋白复合物。在gRNA结合后，Cas9经受使分子从非活性非DNA结合构象转变成活性DNA结合构象的构象变化。重要的是，gRNA的“间隔体”序列保持自由地与靶标DNA相互作用。Cas9-gRNA复合物结合具有PAM的任何靶标基因组序列，但gRNA间隔体与靶标DNA匹配的程度决定Cas9是否将进行切割，或替代地，在使用包含催化非活性cas9的融合蛋白的情况下进行任何其他操控。在一些其他具体实施方案中，碱基编辑酶可由本发明的组合物和方法使用。更具体来说，基于CAS9的碱基编辑物是利用融合于对特定核苷酸取代进行催化的酶的催化非活性CAS9的酶，具体来说是合成和非天然存在的酶。已知的碱基编辑物能够达成C至T、A至G、T至C、以及G至A取代。‘碱基编辑’酶使得能够在不需要dsDNA骨架裂解或供体模板的情况下，以可编程方式使一种靶标DNA碱基直接不可逆转变成另一碱基。更具体地说，这些嵌合酶(在本文中也称为融合蛋白)基于CRISPR/Cas9和胞苷脱氨酶的融合，所述融合保留了由引导RNA所靶向的能力，然而，不能诱导dsDNA断裂。因此，这些酶介导胞苷直接转变成尿苷，由此实现C→T(或G→A)取代。此外，一旦Cas9-gRNA复合物结合推定DNA靶标，在gRNA靶向序列的3′末端的“种子”序列开始与靶标DNA退火。如果种子和靶标DNA序列匹配，那么gRNA以3′至5′方向继续与靶标DNA退火。
如果在gRNA间隔体与靶标序列之间存在足够同源性，那么Cas9将仅裂解靶标。此外，Cas9核酸酶具有两个功能性核酸内切酶结构域：RuvC和HNH。在靶标结合后，Cas9经受使核酸酶结构域定位以裂解靶标DNA的相对链的第二构象变化。Cas9介导的DNA裂解的最终结果是在靶标DNA内产生双链断裂(DSB)，所述双链断裂发生在PAM序列的上游约3至4个核苷酸处。
所得DSB可接着通过两种一般性修复路径中的一者来修复，即高效但易出错的非同源性末端接合(NHEJ)路径和效率较低但高保真的同源性引导的修复(HDR)路径。用于基因组编辑的可编程经工程改造核酸酶(PEN)策略可基于在特定双链DNA裂解之后HDR机制的细胞活化(敲入系统)，或基于NHEJ机制(剔除系统)。
在一些具体实施方案中，待剔除的所靶向基因，特别是MPO基因，通过NHEJ路径来修复，从而在大多数情况下导致靶标基因的功能异常(缺失/插入/无义突变等)。如先前所讨论，Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH的组合活性来产生双链断裂(DSB)。每个核酸酶结构域内对于核酸内切酶活性至关重要的确切氨基酸残基是已知的(在化脓性链球菌Cas9中，对于HNH是D10A，并且对于RuvC是H840A)，并且已产生Cas9酶的仅含有一个活性催化结构域的经修饰形式(称为“Cas9切口酶”)。Cas9切口酶仍然基于gRNA特异性来结合DNA，但切口酶仅能够切割一个DNA链，从而产生“切口”或单链断裂，而非DSB。使用完整互补性DNA链作为模板，DNA切口通过HDR(同源性引导的修复)而得以快速修复。因此，在靶标DNA内产生DSB需要靶向相对链的两个切口酶(经常被称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。这个要求显著增加了靶标特异性，因为不可能的是两个脱靶切口将在足够接近的距离内产生以导致DSB。因此，应了解，本发明还涵盖对Cas9的任何突变体、变体或衍生物的使用，包括用于增加特异性以及降低脱靶效应的用以产生双切口诱导的DSB的双切口酶方法。因此，应了解，本发明还涵盖在本发明的方法、细胞和组合物中使用用于增加特异性以及降低脱靶效应的用以产生双切口诱导的DSB的双切口酶方法。增加特异性的具体实例是使用融合于充当与靶向gRNA的接头的dCas9的核酸酶诸如Fok1。更具体来说，使充分表征的二聚化依赖性FokI核酸酶结构域融合于经RNA引导的催化非活性Cas9(dCas9)蛋白，由此由于Fok1的核酸酶活性需要二聚化而提供增强的特异性。在另一实施方案中，本发明还涵盖提供可被加工成若干最终gRNA产物的前crRNA的选项，所述产物可靶向相同或不同靶标，特别是MPO基因。在一些更具体实施方案中，包含在本发明的gRNA内的crRNA可为互补于靶标基因组DNA序列的单链核糖核酸(ssRNA)序列。在一些具体实施方案中，MPO基因内的靶标基因组DNA序列可位于紧靠在原间隔体邻近基序(PAM)序列的上游以及更远处。
在一些实施方案中，由本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统使用的gRNA或crRNA可靶向人MPO基因的包含如由SEQ ID NO.43、44、45、46、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105和106中的任一者表示的核酸序列或其任何片段的原间隔体。在一些其他实施方案中，由本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统使用的gRNA可靶向小鼠MPO基因的包含如由SEQ ID NO.5、6、8、9、10、11、12、13、14中的任一者表示的核酸序列或其任何片段的原间隔体。此外，在一些实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向包含对应于MPO基因中编码MPO蛋白中的各种结构域的各种位点的核酸序列的原间隔体，所述MPO基因和MPO蛋白特别是人MPO基因和蛋白。
在一些特定实施方案中，靶向MPO基因中的特定位点可导致剔除整个MPO分子，或替代地，调节它的功能和活性，特别是当HDR用于替换MPO基因内的特定残基或序列时。在一些实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向包含对应于MPO的活性位点的核酸序列的原间隔体。在更具体实施方案中，本发明的gRNA，特别是在旨在调节人MPO蛋白水平、表达和/或活性时，可靶向位于MPO的不同结构域处的原间隔体。在一些具体实施方案中，人MPO包含如由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列。这类结构域或序列可包括为原聚体生物合成和加工所需的结构域或序列、模拟人MPO缺乏症的结构域或特定残基、为原聚体血红素结合所需的结构域或序列、以及为适当蛋白质糖基化所需的结构域或序列。在更具体实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向由结构域涵盖的原间隔体，或包含编码为原聚体生物合成和加工所需的残基的核酸序列的原间隔体。这类序列可编码包括处在具体来说具有如由SEQ ID NO.2表示的人MPO氨基酸序列的MPO的残基120至190或/和残基320-380之间的残基或序列的结构域。因此，靶向包含在编码这类残基的这种结构域或序列内的任何原间隔体的gRNA可导致蛋白质的构象变化，或原聚体生物合成和加工的变化。此外，在一些实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向由结构域涵盖的原间隔体，或包含编码模拟人MPO缺乏症取代的残基的核酸序列的原间隔体。这种原间隔体可位于编码如由SEQ ID NO.2表示的人MPO的残基150至260，和/或如由SEQ ID NO.2表示的人MPO的残基480至580的核酸序列内。在一些其他实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向由结构域涵盖的原间隔体，或包含编码为原聚体血红素结合所需的残基的核酸序列的原间隔体。在一些具体实施方案中，这类原间隔体可位于编码如由SEQ ID NO.2表示的人MPO的残基250至270和/或残基390至510的核酸序列内。在一些其他实施方案中，由本发明方法使用的gRNA可靶向由结构域涵盖的原间隔体，或包含编码为适当蛋白质糖基化所需的残基的核酸序列的原间隔体。这种原间隔体可位于编码如由SEQ ID NO.2表示的人MPO的残基300至360的核酸序列内。在一些具体实施方案中，由本发明使用的gRNA或crRNA靶向人MPO基因中的特定原间隔体。人MPO基因内可通过本发明的方法、组合物和药盒来靶向的额外靶标位点可包括如由SEQ ID NO.2表示的人MPO的残基C167、C180、C319、C158、R128、N355、T173、M251、R569、R499、G501、Q257、D260、M409、E408、H261、H502和N355，如还由实施例4所指示。应注意本发明涵盖使用这些残基中的每一者作为如本文讨论的靶标。在一些其他具体实施方案中，由本发明用作靶标识别元件的crRNA(gRNA)可包含靶向人MPO内的相应靶标原间隔体的如由SEQ ID NO.33(在本文中被称为T173)、SEQ ID NO:34(在本文中被称为D260)、SEQ ID NO.35(在本文中被称为H502)和SEQ ID NO.42(在本文中被称为C319)中的任一者表示的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的SEQ ID NO.33的crRNA序列可靶向包含序列TGCACATCCCGGTGATGGTG(也由SEQ ID NO.43表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的SEQ ID NO.34的crRNA序列可靶向包含序列CAGGGGTGAAGTCGAGGTCG(也由SEQ ID NO.44表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的SEQ ID NO.35的crRNA序列可靶向包含序列GGATGAGGGTGTGGCCGTAG(也由SEQ ID NO.45表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的SEQ ID NO.42的crRNA序列可靶向包含序列GGATGGTGATGTTGCTCCCGGGG(也由SEQ ID NO.46表示)的序列。在一些其他实施方案中，由本发明用作靶标识别元件的crRNA(gRNA)可包含如由47、50、55、60、63、66、71、74、77、80、85、88和91中的任一者表示的核酸序列。在一些其他实施方案中，这些gRNA靶向人MPO核酸序列内的原间隔体。在更具体实施方案中，这些原间隔体包含如分别由SEQ IDNO.94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105和106表示的核酸序列。
在一些其他具体实施方案中，由本发明使用的gRNA或crRNA靶向小鼠MPO基因中的特定原间隔体。在一些实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列CCCCAACGATCAGCTGACCA(也由SEQ ID NO.5表示)的原间隔体序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列CAGCGGGGTGTACGGCAGCG(也由SEQ ID NO.6表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列GCACTCATGTTCATGCAGTG(也由SEQ ID NO.8表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列TGCGATACTTGTCATTCGGT(也由SEQ ID NO.9表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列AGTAAAACAGGAGCTCCGTG(也由SEQ ID NO.10表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列ACGCTTCCAAGACAATGGCA(也由SEQ IDNO.11表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列ACGCCATCTTCATACTCTGC(也由SEQ ID NO.12表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列ATCAAGCGGAGCCTCCAAAG(也由SEQ ID NO.13表示)的序列。在一些其他实施方案中，本发明的gRNA序列可靶向包含序列AGAGTACCTGTAACATTGAA(也由SEQID NO.14表示)的序列。在一些实施方案中，gRNA包含靶向小鼠MPO的如上定义的原间隔体序列的如由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14中的任一者表示的核酸序列。在一些其他实施方案中，由本发明用作靶标识别元件的crRNA可包含如由SEQ ID NO.33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.42以及SEQ ID NO.47、50、55、60、63、66、71、74、77、80、85、88和91中的任一者表示的核酸序列。
如本文所指示，通过本发明的转基因来转录的gRNA可至少部分地互补于靶标基因组DNA，具体来说是MPO基因内的任何原间隔体。在某些实施方案中，“互补性”是指各自遵循锁和钥匙原理的两个结构之间的关系。在自然界中，互补性是DNA复制和转录的基本原理，因为它是在两个DNA或RNA序列之间共有的性质，以致当它们反向平行彼此对准时，在序列中每个位置处的核苷酸碱基将是互补的(例如A和T或U，C和G)。在一些其他实施方案中，由本发明方法使用的gRNA或crRNA可包含含有靶标原间隔体的核酸序列的至少一部分的核酸序列。
如上所指示，在一些特定实施方案中，由本发明的系统的gRNA靶向的基因组DNA序列可位于紧靠在PAM序列的上游。
根据一些实施方案，本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统可涵盖对若干gRNA，具体来说是超过一个gRNA的使用。因此，在一些实施方案中，编码本发明的gRNA的多核苷酸可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个，特别是110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个或更多个间隔体。也就是说，在一些实施方案中，gRNA或crRNA编码序列可编码1至200个或更多个靶向MPO编码序列上至少两个或更多个不同位置的相同或不同gRNA。还应了解，编码本发明的gRNA的核酸序列的间隔体可为相同或不同间隔体。在另外实施方案中，这些间隔体可靶向MPO基因内的相同或不同靶标原间隔体。在一些其他实施方案中，这种间隔体可靶向MPO基因内至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个靶标原间隔体。这些靶标序列可源于MPO基因的单一区域或部分，或替代地，源于MPO基因或编码序列的若干靶标区域或部分。
如本文所用，术语“间隔体”是指被设计来靶向特定序列的非重复或重复间隔体序列。在一些具体实施方案中，间隔体可包含约15个至约50个之间的核苷酸，具体来说是约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个核苷酸。更具体来说，间隔体可包含约20个-35个之间的核苷酸。
通常，由本发明的CRISPR系统编码的引导或靶向RNA可包含CRISPR RNA(crRNA)和反式活化性RNA(tracrRNA)。然而，应注意，在一些特定CRISPR系统中，引导RNA不包括tracrRNA，诸如基于CPF1的CRISPR-Cas系统和I-E型CRISPR。由CRISPR间隔体编码的靶向RNA的序列不受特定限制，除了要求它针对MPO基因内的在本文中也称为“原间隔体”的靶标序列之外(即具有与所述靶标序列相同或互补的区段)。这类原间隔体包含与由CRISPR间隔体编码的靶向RNA具有足够互补性的核酸序列，所述间隔体包含在编码由本发明提供的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统的gRNA的核酸序列内。因此，在一些实施方案中，所编码gRNA或crRNA包含至少部分地与靶标原间隔体的核酸序列相同的序列。在某一其他实施方案中，本发明的系统的经RNA引导的DNA结合蛋白核酸酶可为新近鉴定的系统的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)中的任一者。应了解本发明提供了对Cas9，特别是包含如由SEQID NO.4表示的氨基酸序列或其任何片段、变体、衍生物和突变体的Cas9，或其任何嵌合体或融合蛋白，的任何片段、衍生物、突变体或变体的使用。应了解，在本发明的一些实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞、药盒和系统可提供Cas蛋白特别是Cas9蛋白作为基因编辑系统。应注意“氨基酸序列”或“肽序列”是由肽键连接的氨基酸残基处于肽和蛋白质中的链中所处的顺序。序列通常从含有游离氨基的N末端至含有酰胺的C末端加以报道。如果氨基酸序列代表蛋白质的一级结构，那么它经常被称为肽、蛋白质序列，然而，必须在术语“氨基酸序列”或“肽序列”和“蛋白质”之间进行辨别，因为蛋白质定义为折叠成特定三维构型，并且通常已经受翻译后修饰的氨基酸序列，所述翻译后修饰诸如是磷酸化、乙酰化、糖基化、甘露糖基化、酰胺化、羧化、氢硫基键形成、裂解等。就“片段或肽”来说，其意指所述Cas9蛋白的一部分。分子的“片段”，诸如本发明的任何氨基酸序列，意指Cas9蛋白的任何氨基酸子组。这还可包括其“变体”或“衍生物”。“肽”意指具有功能活性的特定氨基酸子组。就“功能性”来说，其意指具有相同生物功能，例如具有进行特定经RNA引导的核酸酶反应的能力。
应了解本发明涵盖本发明的Cas9蛋白的任何变体或衍生物以及大致上相同或同源的任何多肽。术语“衍生物”用于定义具有对氨基酸序列(多肽)进行的不改变原始多肽的活性的任何插入、缺失、取代和修饰的氨基酸序列(多肽)。就此而论，由本发明使用的Cas9蛋白的衍生物或片段可为特别是如由SEQ ID NO.4表示的Cas9蛋白的不降低或改变Cas9蛋白的活性的任何衍生物或片段。就术语“衍生物”来说，它还被称为其同源物、变体和类似物。蛋白质直系同源物或同源物与本发明的目标蛋白质具有序列同源性或同一性，特别是可共有至少50％，至少60％，并且特别是65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更高，特别是相较于本发明的目标蛋白质的整个序列，所述目标蛋白质例如是包含如由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列的Cas9蛋白。具体来说，同源物包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO.4特别是如由SEQ ID NO.4表示的整个序列至少50％，至少60％，并且特别是65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，衍生物是指由于氨基酸残基的插入、缺失或取代而与本发明中明确定义的多肽不同的多肽。应了解，就如本文所用的术语“一个或多个插入”、“一个或多个缺失”或“一个或多个取代”来说，其分别意指对由本发明公开的多肽进行的氨基酸残基的任何添加、缺失或替换，所述氨基酸残基是1个至50个之间的氨基酸残基、20个至1个之间的氨基酸残基，并且特别是1个至10个之间的氨基酸残基。更具体地说，一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸中的任一者达成。应注意由本发明涵盖的一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可发生在经修饰肽的任何位置中，以及在其N'或C'末端中的任一者中。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、添加或缺失所编码序列中单一氨基酸或小百分比的氨基酸的单个取代、缺失或添加是“经保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸被化学类似氨基酸取代。提供在功能上类似的氨基酸的保守性取代表在本领域中是熟知的。这类经保守修饰变体外加于并且不排除本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因。举例来说，可进行其中脂族氨基酸(G、A、I、L或V)被群组的另一成员取代的取代，或诸如一个极性残基被取代成另一极性残基，诸如精氨酸被取代成赖氨酸、谷氨酸被取代成天冬氨酸、或谷氨酰胺被取代成天冬酰胺的取代。以下八组中的每一者含有彼此是保守性取代的其他示例性氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。因此，在一些实施方案中，本发明涵盖Cas9蛋白或其任何衍生物，特别是包含对如由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列进行的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守性取代的衍生物。更具体来说，氨基酸“取代”是用具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸替换一个氨基酸，即保守性氨基酸替换的结果。氨基酸取代可基于所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的类似性进行。举例来说，非极性“疏水性”氨基酸选自由以下组成的组：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)；“极性”氨基酸选自由以下组成的组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；“带正电荷”氨基酸选自由以下组成的组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)，并且其中“酸性”氨基酸选自由以下组成的组：天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)。
本发明的多肽，特别是由本发明使用的Cas9，的变体可与目标蛋白质诸如本发明的各种多肽在氨基酸水平上具有至少80％序列类似性或同一性，经常是至少85％序列类似性或同一性，90％序列类似性或同一性，或至少95％、96％、97％、98％或99％序列类似性或同一性。如上所指示，在一些实施方案中，由本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统使用的核酸酶，并且特别是经引导核酸酶诸如Cas9，可为可使得能够对MPO的水平、表达和/或活性进行其他操控的如由本发明公开的催化非活性核酸酶或其任何融合蛋白。在这类情况下，仅使用这些经引导核酸酶的靶向性质(例如使用gRNA靶向靶标核酸序列)来靶向操控靶标序列。在这类情况下，溶核酸活性是非所需的。在一些实施方案中，可使用不具有溶核酸活性的经引导核酸酶。因此，在一些特定实施方案中，用于本发明的系统的Cas9酶可为缺乏任何溶核酸活性的cas9，例如缺陷性酶诸如dCas9。dCas9是一种缺乏内切核苷酸活性的突变Cas9。这种突变体的一非限制性实例可为携带是D10A(在位置10中天冬氨酸变为丙氨酸)和H840A(在位置840中，组氨酸变为丙氨酸)中的至少一者的点突变的突变体。这种突变体可作为模块化经RNA引导的平台用于在细胞中以高度特异性方式将不同蛋白质效应物募集至DNA(Qi等人,Cell 152:1173-1183(2013))。阻遏性效应物与活化性效应物两者均可融合于dCas9以分别阻遏，或替代地，活化基因表达。因此，在一些实施方案中，dCas9和活化性效应物(例如转录因子或进行脱甲基化的酶)的融合蛋白或dCas9与阻遏物的融合物可由本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统使用。更具体来说，活化或阻遏可由仅基于同源性碱基配对来识别靶标DNA序列的sgRNA决定。当裸露突变蛋白质被引导至靶标时，实现通过dCas9达成的阻遏。当引导物使dCas9靶向所需基因具体来说是MPO基因的启动子区域时，并且当引导序列与基因的非模板链互补时，这个阻遏作用是更高效的。然而，这不是必需的，并且在一些情况下，引导至基因中不同区域或相对模板也可进行高效阻遏。
通过使dCas9融合于已知阻遏物，可增强通过dCas9达成的阻遏。这种阻遏物的一非限制性实例可为克吕佩尔相关框(Krüppel associated box，KRAB)结构域，其使对靶标的阻遏增强(Gilbert等人,Cell 154:442-451(2013))。在一些替代性实施方案中，当需要增强MPO的表达和/或活性时，通过dCas9达成的活化可在转录活化子与它融合时实现。这种活化子的一非限制性实例可为单纯疱疹病毒蛋白vmw65，也被称为VP16(Gilbert等人,Cell154:442-451(2013))。或者，引导RNA自身可被工程改造(替代或外加于dCas9)来募集活化子或阻遏物，因此，募集裸露dCas9，并且决定结果(Zalatan等人,Cell 160:339-350(2015))。举例来说，引导物可编码募集特定RNA结合蛋白的RNA结构域。这个RNA结合蛋白可融合于活化子(例如VP16)或阻遏物(例如Krab)，因此，对dCas9以及阻遏物或活化子的整个募集会产生所需结果，具体来说是阻遏或活化MPO基因。
应了解，当基因编辑系统由本发明用于操控MPO的水平、表达和/或活性时，这种系统可以编码这个系统的组分的核酸序列形式递送，所述核酸序列例如是包含编码Cas9和特定gRNA的核酸序列的构建体。然而，应了解，在本发明的一些实施方案中，本发明还涵盖使用包含以功能性复合物形式递送的纯化Cas9和纯化gRNA的Cas9/gRNA核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)的选项。在一些特定实施方案中，纯化gRNA可通过PCR扩增退火gRNA寡聚物，或在体外转录线性化的含gRNA质粒(诸如Addgene质粒42250)来产生。Cas9(或如本文讨论的任何Cas9变体)可通过使用细菌Cas9表达质粒来从细菌纯化。在一些其他实施方案中，在一些具体和非限制性实施方案中，Cas9 RNP向靶标细胞中的递送可通过脂质介导的转染或电穿孔来进行。
如上所指示，本发明的方法、组合物、细胞、药盒、用途和系统可还涵盖对切割RNA的核酸酶的使用。因此，在一些实施方案中，可由本发明使用的经引导RNA核酸酶可为靶向RNA的CRISPR-Cas系统，并且可为有利的(例如II-A型CRISPR-Cas和新近鉴定的CRISPR-CasC2c2)。如上所指示，本发明方法可涉及对本文所述的基因编辑系统的使用，或替代地，对显示MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞的使用。因此，在一些实施方案中，当本发明方法使用细胞时，可适用于本文中的未分化BM细胞群体可为用至少一种能够调节这些细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。应注意，在一些实施方案中，这种未分化BM细胞群体可属于自体来源，或替代地，属于同种异体来源或甚至同种同基因来源。在一些其他替代性实施方案中，本发明方法可使用同种异体受试者的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的未分化BM细胞群体。在一些实施方案中，本发明方法可使用被遗传操控以消除MPO的表达和/或活性的未分化BM细胞。
因此，在一些实施方案中，适于本发明方法的细胞可为自体来源的细胞。术语“自体”在涉及细胞来源时是指细胞从待通过本发明方法来治疗的同一受试者获得或转移。在一些其他实施方案中，适于本发明方法的细胞可为同种异体来源的细胞。术语“同种异体”在涉及细胞来源时是指细胞从同一物种的在本文中被称为供者的不同受试者获得或转移。
更具体来说，如上所指示，应了解，本发明方法还涵盖对MPO基因的修饰可以离体方式对受试者的细胞(自体来源的细胞)，或替代地，对同种异体来源的细胞进行的选项。在一些其他替代性实施方案中，可使用显示MPO的经调节表达和/或活性的同种异体未分化BM细胞。自体或同种异体(或甚至同种同基因)来源的细胞可接着通过继承性转移来向受试者施用。如本文定义的术语“继承性转移”适用于由转移免疫系统的组分，特别是已能够发动特异性免疫应答的细胞组成的所有疗法。此外，在一些实施方案中，在本申请中是适合的细胞可为经动员HSP。造血干细胞(HSC)通常驻留在骨髓中，但可被迫使进入血液中，所述过程被称为用于在外周血液中收集大量HSC的骨髓动员。本发明的一种所选动员剂可为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。所得HSC还被称为经动员HSC。
在骨髓注射的情况下，靶标细胞可为HSPC，并且在全身性注射的情况下，靶标细胞可为经动员HSPC(其中患者经受先前动员处理)。应注意，基因编辑化合物的骨髓注射与在一些实施方案中的全身性注射两者均可特别适于体内操控受试者中的MPO。
本发明提供了用于仅仅通过以下方式来调节，并且特别是降低受试者中，具体来说是所述受试者的任何组织或器官中MPO的水平、表达和活性的方法和组合物：使用本发明的基因编辑系统在体内，或通过移植(例如继承性转移)显示MPO的经改变，或特别是降低的表达、水平和/或活性的BM细胞以离体方式改变未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性。因此，如由本发明惊人地显示，对特定组织例如可在PD和AD的情况下显示在受神经变性影响的脑区域中MPO免疫反应性细胞显著增加的脑组织中MPO水平和/或活性的有效调节可通过调节BM细胞中的MPO水平和/或活性来实现。更具体来说，在一些实施方案中，已进行BM细胞中MPO的调节，前提是所述调节尚未在靶标脑组织或其任何组分例如星形细胞、小神经胶质细胞和/或神经元中进行。如本文所述，本发明方法包括通过以下方式来调节MPO的表达和/或活性：施用至少一种能够在体内调节所治疗受试者中BM细胞中的MPO表达和/或活性的基因编辑化合物/系统，例如是以上所述的CRISPR/Cas9系统的PEN，或替代地，施用显示MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞(离体操控或从MPO缺陷性同种异体受试者获得。如还在本文中所述，术语调节是指相对于在某种条件下测定的原始非经调节MPO表达和/或活性，或对照或正常或基线MPO表达/活性水平，MPO表达和/或活性的任何变化或改变，诸如增加或降低。
因此，在一些实施方案中，调节MPO的表达和/或活性可包括抑制或消除所述受试者中MPO的水平、表达和/或活性。根据一些实施方案，其中指示“降低”或“抑制”MPO的表达或水平或活性，其意指这种降低或抑制可为MPO的表达、水平、稳定性和/或活性降低或减小在约10％至100％之间。如本文所用的术语“降低”或“抑制”涉及在尺寸、数量、数目或强度方面渐进地变得更小的行为。具体地说，相较于适合对照，例如相较于在健康受试者的细胞，具体来说是健康受试者的显示MPO的正常水平和/或活性的细胞中，MPO的表达、水平、稳定性和/或活性有至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％或更大的MPO表达、水平、稳定性和/或活性降低、减小、消除、减弱或抑制。
然而，应了解，通过提供调节MPO的表达和活性的方法、组合物、细胞、药盒和系统，在本发明的一些替代性实施方案中，本发明还涵盖对MPO的表达和/或活性的可包括升高、建立或增加有需要的受试者中MPO的表达和/或活性的调节。
根据一些实施方案，其中指示“增加”或“增强”MPO的表达或水平或活性，其意指这种增加或增强可为MPO的表达和/或稳定性增加或升高在约10％至100％之间。如本文所用的术语“增加”、“加强”和“增强”涉及在尺寸、数量、数目或强度方面渐进地变得更大的行为。具体地说，相较于适合对照，MPO的表达、水平、稳定性和/或活性增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％或更多。还应注意增加或升高还可为增加至约2至106倍或更大。此外，应了解MPO的表达、水平、稳定性和/或活性的增加可在所述MPO的翻译或稳定性，和/或所述MPO的活性方面。关于以上，应了解，当提供时，百分比值诸如像10％、50％、120％、500％等可分别与“倍数变化”值即0.1、0.5、1.2、5等互换。因此，术语增加是指增加至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或更大。
如上所指示，本发明提供了用于调节(例如降低，或替代地，增强)MPO的表达和/或活性的方法、组合物、细胞、药盒和系统。如本文所用的MPO表达还可反映蛋白质的稳定性。更具体来说，如本文所用的“表达”通常是指基因编码信息具体来说是MPO基因转变成在细胞中存在并且起作用的结构所采用的过程。因此，根据本发明，基因的“表达”具体来说可指转录成多核苷酸，翻译成蛋白质，或甚至是对蛋白质进行翻译后修饰。如本文所用的蛋白质稳定性是指蛋白质的物理(热力学)稳定性和化学稳定性，并且涉及决定蛋白质将呈它的天然折叠构象还是变性状态的力的净平衡。更具体来说，细胞内蛋白质诸如MPO的水平不仅由如上讨论的合成速率，而且还由降解速率和细胞内蛋白质的半衰期决定，所述半衰期广泛变化，从数分钟至数天。在真核细胞中，两种主要路径介导蛋白质降解，即上文提及的泛素-蛋白酶体路径以及溶酶体蛋白水解。
在一些其他实施方案中，本发明方法可调节(例如降低，或替代地，增强)MPO的活性。更具体来说，在一些情况下，如本文所用的MPO活性可指由MPO执行的任何活性，例如分别从过氧化氢(H2O2)和氯阴离子(Cl-)溴离子(Br-)；硫氰酸根(SCN-)、酪氨酸和亚硝酸盐催化产生反应性中间体诸如次氯酸(HOCl)、次溴酸(HOBr)和次硫氰酸(HOSCN)、酪氨酰基以及反应性氮中间体的过氧化物酶活性。在一些其他实施方案中，MPO活性可与由嗜中性白细胞通过MPO/HOCl系统来对细菌(例如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))和真菌(例如白色念珠菌(Candida albicans))的细胞内杀灭相关联。
在一些其他实施方案中，MPO活性还可涉及至少部分地由MPO直接或间接引起或介导的任何过程。如上文所指示，应了解这类活性可由MPO的血红素结构域或由MPO的任何其他结构域介导。这种活性的非限制性实施方案涉及由MPO介导的NETosis。更具体来说，嗜中性白细胞细胞外诱捕网(NET)是主要由来自嗜中性白细胞的DNA组成，结合病原体的细胞外纤维的网状结构。NET允许嗜中性白细胞杀灭细胞外病原体，同时使对宿主细胞的损害最小。
NET活化和释放，或NETosis，是一种可以两种形式即自杀性NETosis和活体性NETosis发生的动态过程。总之，对于两种类型的NETosis，过程的许多关键组分是类似的，然而，在刺激、时机和最终结果方面存在关键差异。活化路径-过程以通过反应性氧类(ROS)中间物，NADPH氧化酶对蛋白质-精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)进行活化开始。PAD4负责嗜中性白细胞中组蛋白的瓜氨酸化，从而导致染色质的解凝。嗜天青颗粒蛋白质诸如髓过氧化物酶(MPO)和嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)接着进入核中，并且促进解凝过程，从而导致核被膜的破裂。未凝聚的染色质进入细胞质中，在细胞质中，额外颗粒和细胞质蛋白被添加至早期NET中。过程的最终结果于是取决于哪个NETosis路径被活化。自杀性NETosis最初在指示NET的释放通过不同于凋亡或坏死的路径来导致嗜中性白细胞死亡的研究中加以描述。在自杀性NETosis中，细胞内NET形成继之以质膜的破裂，从而将它释放至细胞外间隙中。这个NETosis路径可通过以各种配体诸如抗体、PMA等使Toll样受体(TLR)、Fc受体和补体受体活化来引发。在这些受体的活化后，下游信号传导导致从内质网释放钙。这个细胞内钙流入转而使NADPH氧化酶活化，从而导致如上所述的NETosis路径的活化。活体性NETosis可由细菌脂多糖(LPS)、其他细菌产物、TLR4活化的血小板、或与TLR2配体合作的补体蛋白质刺激。活体性NETosis通过核的起泡，从而产生胞外分泌的经DNA填充囊泡而成为可能，并且保持质膜完整。它的快速形成和释放不导致嗜中性白细胞死亡，然而，细胞无DNA，从而提出了关于无DNA的细胞是否可被视为活着的问题。已指示在活体性NETosis之后，嗜中性白细胞可继续进行吞噬和杀灭微生物，从而突出了嗜中性白细胞的抗微生物多用性。如上所详述，MPO活性可通过不依赖于MPO催化活性的机制(“非酶作用”)来介导。在一些其他实施方案中，术语MPO活性是指以下中的至少一者：MAPK和NFκB活化、ROS产生、表面整合素(integrin)上调和脱粒、以及降低凋亡，从而导致肺中炎症增强。在一些具体实施方案中，术语MPO活性是指抑制人嗜中性白细胞的凋亡。在一些实施方案中，术语MPO活性涵盖/涉及由MPO与CD11b/CD18整合素的结合所致的过程。在一些实施方案中，MPO活性是指刺激多形核嗜中性白细胞(PMN)信号传导路径以诱导PMN活化。在一些其他实施方案中，MPO活性是指MPO能够作为嗜中性白细胞的存活信号起作用，并且由此促进炎症的延长。在一些其他实施方案中，术语MPO活性是指内皮细胞活化。在一些其他实施方案中，术语MPO活性是指抑制树突细胞(DC)功能和适应性免疫性。DC是哺乳动物免疫系统的抗原递呈细胞(也被称为辅助细胞)，它们的功能在于加工抗原物质，并且将它在细胞表面上对免疫系统的T细胞递呈。DC充当先天性免疫系统与适应性免疫系统之间的信使。
在一些实施方案中，MPO活性是指通过MPO与因子H(FH)的结合来对FH的补体调控活性的作用。据表明MPO-FH相互作用可通过促进替代性补体路径的活化来参与(ANCA)相关血管炎(AAV)的发病机理。在一些实施方案中，MPO活性是指增强血管结构中高葡萄糖诱导的内皮功能异常。在一些实施方案中，MPO活性是指与人血小板的结合，诱导肌动蛋白细胞骨架重新组织，以及影响人血小板的机械刚度。这转而可导致增强钙库操纵性Ca2+内流(SOCE)和激动剂诱导的人血小板聚集。在一些实施方案中，MPO活性是指降低内皮NO合成酶(eNOS)的磷酸化。这可进一步导致降低NO产生，此从而通过降低钙蛋白酶的亚硝基化来增加它的活性。在一些实施方案中，MPO活性是指MPO与红血细胞(RBC)膜的结合。
在一些其他实施方案中，MPO活性是指如上文指示的脂质过氧化，并且在一些实施方案中，特指LDL过氧化。在一些实施方案中，MPO活性可指脂质氨甲酰化。在一些其他实施方案中，MPO活性可指糖萼结合。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法、细胞、组合物和药盒可调节，特别是抑制、减小或降低以上指定的MPO活性中的至少一者，或它们的任何组合。通过对受试者应用特异性地导致对所述受试者的未分化BM细胞内的MPO表达和/或活性的体内操控的基因编辑工具，本发明方法提供了对所述受试者中的MPO表达、水平和/或活性的调节，具体来说是降低或增加。或者，或另外，受试者可被施用以显示MPO的所需经调节表达和/或活性的未分化BM细胞。应注意操控可以离体方式发生，此时使同种异体或自体来源的BM细胞与由本发明提供的编辑工具接触，并且在操控MPO表达和/或活性后，将细胞引入(在自体细胞的情况下是再引入)至受试者中。将这类BM细胞引入至所治疗受试者导致对受试者中MPO的表达和活性的操控。或者，可将同种异体受试者的显示MPO的经调节(增加的或降低的)表达和/或活性的BM细胞引入至受试者，从而导致对受试者中MPO的操控，如还通过实施例所说明。因此，在一些实施方案中，这种操控涵盖对MPO的表达和/或活性的体内(即在哺乳动物身体内)或离体(即在从身体移除的细胞中)操控，如本文进一步所述。
在一些实施方案中，方法可包括向有需要的受试者施用至少一种基因编辑化合物，由此使得能够在体内操控所述受试者的未分化BM细胞中的MPO。应注意这类施用方法在本领域中是已知的，并且在以下进一步详述。
在一些其他实施方案中，方法包括离体应用。在本公开的情形下，离体是指使由本发明提供的至少一种基因编辑化合物或系统与从受试者移除、回收或获得的BM细胞接触的步骤。可使这些细胞与基因编辑系统在适于调节细胞中MPO的表达和/或活性的条件下接触。如本文所用的术语“接触”意指集合、放置、孵育或混合在一起。因此，第一物品与第二物品在以下情况下时是接触的：将这两个物品例如通过使它们彼此触碰或将它们组合来集合或放置在一起。在本发明的情形下，术语“接触”包括允许本发明的基因编辑化合物与细胞，或当在体内进行时，与待调节的受试者之间的相互作用的所有措施或步骤。在一些实施方案中，在接触步骤之前或之后，BM细胞可经受选择以分离未分化细胞。应注意从自受试者移除、回收或获得的BM分离未分化BM细胞的步骤是任选的步骤。在一些实施方案中，可使BM细胞与至少一种基因编辑化合物，特别是由本发明公开的任何基因编辑化合物或系统接触。在一些实施方案中，可使包含HSC和/或祖细胞的经分离未分化BM细胞群体与至少一种基因编辑化合物接触。在一些替代性实施方案中，使BM细胞与至少一种基因编辑化合物接触，并且分离包含HSC和/或祖细胞的未分化BM细胞群体。
在一些实施方案中，可使至少一种基因编辑化合物与BM细胞群体特别是未分化BM细胞群体接触，持续一段足以容许对MPO基因的调节并且产生经修饰BM细胞群体的时间。
因此，根据本公开的一些方面，本公开提供了一种经修饰BM细胞群体，其中在一些实施方案中，在这种BM细胞群体中，至少一部分细胞(例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％、60％、70％、80％、90％或更多、或甚至100％)，并且优选地，大多数细胞，展现MPO的经调节表达和/或活性。在一些实施方案中，经修饰BM细胞群体可包含显示经调节MPO表达和/或活性的未分化BM细胞，特别是HSC和/或祖细胞。在一些实施方案中，经修饰BM细胞群体可包含具有经调节MPO表达和/或活性的HSC。在本发明中，术语“经修饰BM细胞”或“经修饰BM细胞群体”用于表示通过调节MPO表达和/或活性来离体修饰的BM细胞。
如上所指示，本发明提供了一种用于操控受试者的免疫系统的方法，具体来说，通过靶向受试者的未分化BM细胞中的MPO，由此导致对所述受试者的任何组织和器官中的MPO水平的操控。如在下一方面所说明，本发明还使用这种调节来达成治疗性应用，特别是用于治疗MPO相关疾患。因此，应了解，在一些具体和非限制性实施方案中，本发明提供了用于通过操控受试者的免疫系统，具体来说是所述受试者的BM细胞以显示MPO的经调节水平、表达和/或活性来调节所述受试者中MPO的水平、表达和/或活性的方法、组合物和药盒。换句话说，通过提供经操控免疫系统(属于自体或同种异体或同种同基因来源)，或替代地，通过使用本文提供的基因编辑系统(例如将基因编辑系统的化合物施用至受试者)来体内操控受试者的免疫系统，以致所述受试者的BM细胞群体展现MPO的经调节水平、表达和/或活性。因此，本发明的方法、药盒和组合物提供了一种用于调节所述受试者的任何组织和器官中MPO的表达和/或活性的开创性策略。这个策略显示明确有效治疗性应用。在一些其他具体实施方案中，对受试者的免疫系统的这种操控可通过将显示MPO的经调节水平、表达和/或活性的BM细胞移植至有需要的受试者来实现，在一些实施方案中，所述受试者在移植之前经受免疫净化。通过移植显示MPO的经调节(例如降低的或消除的)水平、表达或活性的BM细胞，经移植受试者将展现任何组织和器官中MPO的经调节表达。应了解，如由本发明所详细解释，所移植BM细胞可为从同一受试者获得，并且使用本发明的基因编辑系统离体操控以调节MPO的水平、表达或活性的自体BM细胞。举例来说，在一些具体实施方案中，从受试者获得的BM细胞可离体经受本发明的可导致MPO水平、表达和/或活性的消除和降低的基因编辑系统。或者，可使用同种异体或同种同基因来源的显示(天然地，或由于应用本发明的基因编辑系统)MPO的经调节水平、表达和/或活性的未分化BM细胞。这类MPO缺陷性自体或同种异体BM细胞可被再引入至可用免疫净化化合物处理的受试者，并且由此，这些所移植经操控BM细胞替换受试者的免疫系统。这个程序导致受试者的任何器官或组织中MPO的消减。应了解MPO经消减BM细胞可从受试者，或替代地，从同种异体受试者获得。更具体来说，将这些自体或同种异体BM细胞移植至受试者，或换句话说，用显示MPO的经调节水平、表达和/或活性(例如消除的或降低的MPO水平、表达和/或活性)的BM细胞替换受试者的免疫系统细胞，导致对所述受试者的每个组织和器官中MPO的水平、表达、活性的调节。MPO在抑制适应性免疫应答方面起作用，如由Mpo-/-小鼠中增强的T细胞介导的皮肤延迟型过敏和抗原诱发的关节炎这两个模型所证明。从机理上说，从嗜中性白细胞释放的MPO抑制LPS诱导的DC活化，如由降低的IL-12产生和CD86表达所度量，从而限制T细胞增殖和促炎性细胞因子产生。相比之下，通过使用MPO缺陷性小鼠，在K/BxN关节炎和胶原诱发的关节炎(CIA)模型中展现疾病严重性减轻来证明了MPO在驱动自体免疫炎症方面的病原性作用。此外，已观察到在包括多发性硬化症(MS)和类风湿性关节炎(RA)的许多炎症性疾患和自体免疫疾病中，MPO水平和活性增加。MPO在调节与慢性血管疾病诸如动脉粥样硬化相关的血管结构功能方面起作用。在细胞外基质(ECM)中，MPO充当消耗NO，导致内皮松弛受损的一氧化氮(NO)清除剂。存在于动脉粥样硬化性组织中的MPO和它的氧化性物质促进脂质过氧化、LDL转变成高度摄取致动脉粥样化形式；选择性调节载脂蛋白A-I(apoA-I)，从而产生更易经受降解的功能异常HDL粒子；并且损害apoA-I促进胆固醇流出的能力。此外，MPO和它的氧化产物的全身性水平升高与心血管风险增加相关联。如上所指示，MPO已牵涉于多种病理性状况中，因此，调节MPO表达提供了一种用于治疗和预防由其引起的病症或疾患的特定治疗工具。
在本发明的一些实施方案中，本发明还涵盖用于调节罹患至少一种MPO相关疾患的受试者中的MPO表达和/或活性的方法。方法如上文所述。在一些其他实施方案中，本发明还涵盖如由本发明公开的特异性调节受试者中MPO水平和/或活性的方法用于治疗和抑制有需要的受试者中至少一种MPO相关病症的用途。
因此，在另一方面，本发明提供了一种用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法。更具体来说，在一些实施方案中，本发明方法可包括向所述受试者施用治疗有效量的以下中的至少一者的步骤：(a)至少一种能够或适合于调节受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。应了解本文所述的方法涵盖用(a)、(b)或它们的任何组合治疗罹患MPO相关疾患的受试者。此外，应了解，在本发明的一些方面，本发明提供了供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用的治疗有效量的以下中的至少一者：(a)至少一种能够或适合于调节受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
如本文所述，在一些实施方案中，BM细胞群体，并且特别是未分化BM细胞群体，可指其中MPO的表达和/或活性被调节的未分化不成熟BM细胞特别是HSC的群体。在一些实施方案中，未分化BM细胞群体可为用至少一种能够调节细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的细胞群体，以致MPO基因已被调节。
可向有需要的受试者施用未分化BM细胞群体以替换具有异常MPO表达和/或活性的受试者特别是显示MPO相关疾患的受试者中的BM细胞。应了解，在一些实施方案中，替换所治疗受试者的BM细胞群体可涉及用显示MPO的经调节表达、水平和/或活性的BM细胞替换受试者的细胞群体的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或甚至100％。如所了解，在本文中，在一些实施方案中，施用未分化BM细胞群体表示为骨髓移植。
在一些实施方案中，BM细胞群体，并且特别是未分化BM细胞群体，可从自体来源，或替代地，从同种异体来源获得。在一些实施方案中，骨髓移植可为自体骨髓移植。术语自体骨髓移植是指其中从受试者移除、回收或获得BM细胞，并且此后移植至那个同一受试者中的移植。在本公开的情形下，在一些实施方案中，自体骨髓移植可包括以下步骤：(a)从受试者回收或获得BM细胞；(b)使所述BM细胞与至少一种基因编辑化合物具体来说在适于操控MPO表达和/或活性的条件下接触；以及(c)将所述BM细胞移植(或再引入)至所述同一受试者中。根据一些实施方案，以上步骤(a)可继之以分离HSC和/或祖细胞。根据一些替代性实施方案，以上步骤(b)可继之以分离HSC和/或祖细胞。根据一些具体实施方案，自体骨髓移植可包括以下步骤：(a)从受试者移除、回收或获得BM细胞；(b)从所述BM细胞分离未分化细胞，诸如HSC和/或祖细胞；(c)使所述未分化细胞与至少一种基因编辑化合物接触；以及(d)将所述未分化细胞移植至所述同一受试者中。在一些实施方案中，骨髓移植可为同种异体骨髓移植。术语同种异体骨髓移植是指其中从受试者(在本文中被称为供者)移除BM细胞，并且此后移植至不同受试者(在本文中被称为接受者)中的移植。
在本公开的情形下，同种异体骨髓移植可包括以下步骤：(a)从供者移除、回收或获得BM细胞；(b)任选地，使所述BM细胞与本发明的至少一种基因编辑化合物接触；以及(c)将所述BM细胞移植至接受者中。根据一些实施方案，以上步骤(a)可继之以分离HSC和/或祖细胞。根据一些替代性实施方案，以上步骤(b)可继之以分离HSC和/或祖细胞。根据一些实施方案，同种异体骨髓移植可包括以下步骤：(a)从供给受试者移除、回收或获得BM细胞；(b)从所述BM细胞分离未分化细胞，诸如HSC和/或祖细胞；任选地，(c)使所述未分化细胞与至少一种基因编辑化合物在允许MPO操控的适合条件下接触；以及(d)将所述未分化细胞移植至接受者中。
应注意自体骨髓移植与同种异体骨髓移植两者均可包括在向同一或不同受试者中进行的移植步骤之前，储存BM细胞或未分化BM细胞的步骤。在另一替代性步骤中，在移植之前，可进一步扩增BM细胞。
应注意，在一些实施方案中，自体骨髓移植物以及同种异体骨髓移植物的特征可在于相较于经移植受试者中的原始(未调节)MPO表达和/或活性，MPO表达和/或活性被调节。换句话说，所移植BM细胞或所移植未分化BM细胞的特征在于相较于待通过移植过程来替换的BM细胞或未分化BM，具有不同的经调节MPO表达和/或活性。
本公开的同种异体骨髓移植涵盖移植从供者获得，显示经调节MPO表达和/或活性的BM细胞。在一些实施方案中，由本发明的方法、组合物、药盒和系统用于同种异体骨髓移植的BM细胞可为具有经调节MPO表达和/或活性的未分化BM细胞，其通过使BM细胞与至少一种适合于调节细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑剂接触来获得。因此，在一些实施方案中，同种异体骨髓移植的方法可包括从供者移除、回收或获得BM细胞，使所述细胞(任选是未分化细胞，特别是HSC和/或祖细胞)与至少一种基因编辑化合物接触以产生经调节BM细胞。根据一些实施方案，可将MPO经调节BM细胞移植至接受受试者中。在一些替代性实施方案中，用于同种异体骨髓移植的BM细胞或同种异体移植物可为从受试者获得的展现MPO的异常表达和/或活性(经调节表达和/或活性)的BM细胞群体。在移植之前，可进一步选择这些BM细胞，以分离未分化BM细胞。在一些具体实施方案中，由本发明方法用于同种异体骨髓移植的骨髓细胞可为从受试者获得的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的BM细胞群体。这将导致经移植受试者中的MPO表达和/或活性的降低或抑制。在一些替代性实施方案中，用于同种异体骨髓移植的骨髓细胞可为从受试者获得的展现MPO的可检测或增强表达和/或活性的BM细胞群体。这将导致经移植受试者中的MPO表达和/或活性的增加或升高。
应了解本发明还涵盖对具体来说同一物种的在遗传上相同的受试者的同种同基因未分化BM细胞的使用，所述细胞任选地被操控以允许达成MPO的经调节表达和/或活性。
在一些实施方案中，用于同种异体骨髓移植的BM细胞是从受试者获得的展现MPO的异常表达和/或活性(经调节表达和/或活性)的BM细胞群体(任选是未分化BM细胞)，并且可进一步通过使细胞(任选是未分化细胞：HSC和/或祖细胞)与至少一种基因编辑化合物接触来调节以产生经调节BM细胞。
就此而论，应注意BM细胞必须显示与接受者的组织类型相容性。在一些实施方案中，本文所述的方法可还包括在BM细胞的施用具体来说是移植之前，对接受受试者应用化学疗法和/或照射，并且/或者使用抗体和/或嵌合抗原受体(CAR)结合净化等，或它们的任何组合。在一些其他实施方案中，对于从供者获得BM细胞，方法可还涉及如下文讨论的对细胞进行动员的步骤。
在本公开的情形下，获得或移植可通过本领域中的任何已知方法来进行，例如通过骨髓活检和/或骨髓抽吸。骨髓抽吸可在局部或全身麻醉下进行。此外，BM移植可通过本领域中的任何已知方法诸如输注来进行。
此外，在骨髓注射的情况下，靶标细胞可为HSPC，并且在全身性注射的情况下，靶标细胞可为经动员HSPC(其中患者经受先前动员处理)。应注意骨髓注射以及全身性注射(例如静脉内IV)两者均可特别适于通过本发明的操控MPO表达和/或活性的遗传编辑化合物来体内操控和靶向BM细胞。
在一些其他实施方案中，通过本发明方法来治疗的患者可经受可涉及免疫净化的先前处理。对一些类型的医学状况诸如癌症、自体免疫疾病等的治疗经常涉及免疫净化以例如在移植骨髓细胞移植物之前移除患者的自身免疫系统。免疫净化可通过全身辐射，或通过高剂量化学疗法，使用抗体，嵌合抗原受体(CAR)结合净化等，或它们的任何组合来实现。因此，术语“免疫净化(immune ablation/immunoablation)”是指出于医学目的破坏患者免疫抗性。此外，在一些实施方案中，通过本发明方法来治疗的患者可经受用类固醇进行的先前处理。在一些实施方案中，这种处理可为类固醇施用，还可用于抑制免疫应答。在药理学(超生理)剂量的情况下，类固醇诸如糖皮质素用于抑制各种过敏性、炎症性和自体免疫病症。
如上文所述，由本发明的方法、组合物和药盒使用的基因编辑化合物可在体内调节所治疗受试者的未分化BM细胞中，或替代地，离体调节自体或同种异体BM细胞中MPO的表达和/或表达。根据本发明的方法，至少一种基因编辑化合物可包括以下中的至少一者：PEN，包含编码所述PEN的序列的任何核酸分子，或包含至少一种PEN、或编码这种PEN的核酸序列的任何药盒、组合物或运载体。
根据一些实施方案，至少一种PEN可包含至少一种CRISPR/Cas系统。根据这类实施方案，本发明方法可包括向所述受试者施用有效量的：(a)至少一种包含至少一种Cas蛋白的多肽，或编码所述Cas蛋白的任何核酸序列；和(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列的步骤。本发明方法可使用包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
如本文所述，在一些实施方案中，可适用于本发明方法的Cas蛋白可为1类和2类CRISPR相关系统中的至少一者的成员。在一些具体实施方案中，可由本发明方法使用的Cas蛋白可为2类II型CRISPR相关系统的成员。在一些其他具体实施方案中，Cas蛋白可为Cas9或其任何片段、突变体、变体或衍生物。应了解在上文中与本发明的其他方面关联所述的所有基因编辑系统都还可适用于当前方面。
在一些实施方案中，本发明方法可提供至少一种gRNA或crRNA作为CRISP/Cas系统的元件。根据一些实施方案，crRNA可靶向人MPO基因的至少一个包含如由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46以及SEQ ID NO.94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105和106中的任一者表示的核酸序列或其任何片段的原间隔体。这种crRNA包含如由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:88和SEQID NO:91中的任一者表示的核酸序列。在一些其他具体实施方案中，由本发明方法提供的gRNA可靶向小鼠MPO基因。在一些具体实施方案中，这类gRNA靶向小鼠MPO内包含如由SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14表示的核酸序列或其任何片段的原间隔体。在一些其他具体实施方案中，由本发明方法提供的gRNA可包含如由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14表示的核酸序列。
由本发明提供的治疗方法可特别适用于治疗罹患MPO相关疾患的受试者。如本文所用，术语MPO相关疾患或疾病包括与MPO的异常、增加的、缺陷性或降低的表达和/或活性相关的疾患。换句话说，本文所述的方法有效治疗与缺陷性或降低的MPO表达和/或活性相关的疾患，或替代地，与增加的MPO表达和/或活性相关的疾患。如所了解，描述MPO表达和/或活性的相关术语“增加”、“缺陷性”、“减小”或“降低”是相对于在某种条件下测定的对照或正常或基线表达/活性水平来说的。
应了解，可互换使用的术语“相关”、“关联”和“有关”在涉及本文病变时，意指具有以下情况中的至少一者的疾病、病症、疾患或任何病变：共有因果性，在高于巧合频率下共同存在，或其中至少一种疾病、病症、疾患或病变导致第二疾病、病症、疾患或病变。在一些具体实施方案中，本发明方法可适用于与增加的(升高的)MPO表达和/或活性相关的MPO相关疾患。然而，应了解，在一些实施方案中，本发明方法可适用于以下受试者：所述受试者可展现MPO的正常(不升高，并且不降低)水平，然而，MPO的数量降低可展现对所述受试者的未必与MPO水平相关的任何疾患或病症的有益作用。因此，在一些实施方案中，通过本发明方法来调节MPO可导致抑制或降低MPO表达和/或活性，由此减轻与MPO的增加的或升高的表达相关的疾患。在一些实施方案中，可通过本发明方法来治疗的MPO相关疾患可为以下中的至少一者：免疫相关病症、神经变性病症、呼吸病症、增生性病症、血管病症或它们的任何组合。
在一些实施方案中，MPO相关疾患可为免疫相关病症。如本文所用的“免疫相关病症”或“免疫介导的病症”涵盖与受试者的免疫系统相关，更具体来说通过对免疫系统的抑制或活化所致；或可通过降低受试者中免疫应答诸如适应性或先天性免疫应答的某一组分的降解来治疗、预防或改善的任何疾患。免疫相关病症可包括感染性疾患(例如病毒性感染)、代谢病症、自体免疫病症、血管炎、炎症和增生性病症，特别是癌症。在一些实施方案中，免疫相关病症可为自体免疫疾病。根据一些实施方案，本发明方法可适用于治疗自体免疫病症。自体免疫疾病是由对正常身体部分的异常免疫应答引起的疾患。自体免疫病症的实例包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(狼疮)、1型糖尿病、牛皮癣/牛皮癣性关节炎、包括克罗恩氏病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎的炎症性肠病、以及血管炎。
在一些具体实施方案中，本发明方法可特别适用于自体免疫病症，诸如多发性硬化症(MS)、抗嗜中性白细胞细胞质抗体(ANCA)相关病症和全身性红斑狼疮(SLE)。
在一些实施方案中，本发明方法可适用于治疗MS以及与其相关的任何相关疾患或症状。如本文定义的术语“多发性硬化症”(MS)是中枢神经系统的一种破坏髓磷脂、寡树突细胞和轴突的慢性炎症性神经变性疾病。MS是年轻成人中最常见的神经疾病，通常在20与40岁之间出现。MS的症状呈多样化，从出现视觉障碍诸如单眼视力丧失、复视，至肌肉衰弱疲劳、疼痛、麻木、僵硬和不稳、协调丧失、以及其他症状，诸如震颤、眩晕、言语不清、吞咽困难和情绪障碍。随着疾病进展，患者可丧失他们的步行能力，可遭遇认知减退，丧失对日常活动的自我管理，并且可变得严重失能和依赖。
MS症状因为免疫系统要素攻击脑细胞特别是神经胶质和/或神经元，并且损害轴突的保护性髓鞘而显现。这些攻击发生的区域被称为破坏通过脑进行的信息传输的病灶。多发性硬化症分类成通过疾病进展来表征的四种类型：(1)复发-缓解性MS(RRMS)，其特征在于复发(症状发作)，继之以缓解(稳定化以及可能恢复的时期；尽管在一些缓解中存在完全恢复，但在其他缓解中存在部分或不存在恢复)。RRMS的症状可从轻度至重度进行变化，并且复发可持续数天或数月。大于80％的患有MS的人员以复发-缓解循环开始；(2)在患有复发-缓解性MS的人员中显现的继发性进行性MS(SPMS)。在SPMS的情况下，可发生复发，但不存在持续有意义时期的缓解(稳定化)，并且失能以进行性方式恶化；(3)原发性进行性MS(PPMS)，其从它的发作开始缓慢地以及稳定地进展，并且占MS病例的小于20％。不存在缓解时期，并且症状通常在强度方面不降低；以及(4)进行性复发性MS(PRMS)。在这个类型的MS的情况下，人员经受稳定恶化症状与在缓解时期期间的发作两者。应了解本发明方法可适用于MS患者的任何类型、阶段或状况。在一些实施方案中，使用本发明方法进行的治疗可导致任何症状的减轻，并且/或者导致延长发作之间的缓解时期。
在一些其他实施方案中，本发明方法可适用于治疗SLE以及与其相关的任何相关疾患或症状。更具体来说，全身性红斑狼疮(SLE)，也简称为狼疮，是一种自体免疫疾病。症状在人员之间变化，并且可为轻度至重度的。常见症状包括关节疼痛和肿胀、发热、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、感觉疲劳、以及最通常在面部上的红疹。疾病通过称为发作的疾病时期和存在少许症状所处的缓解时期来表征。
SLE的原因是不明确的，然而，被认为涉及遗传以及环境因素。存在许多其他类型的红斑狼疮，包括盘状红斑狼疮、新生儿狼疮和亚急性皮肤性红斑狼疮。应了解本发明涵盖这些类型中的每一者。
此外，在一些实施方案中，对于其他自体免疫病症，本发明方法可为相关的。举例来说，对于ANCA相关病症的治疗。如本文所用的抗嗜中性白细胞细胞质抗体(ANCA)包括主要靶向MPO或EGPA，因此也被称为MPO-ANCA的核周抗嗜中性白细胞细胞质抗体(P-ANCA)；主要靶向蛋白酶3(PR3)蛋白，因此也被称为主要与GPA相关的PR3-ANCA的细胞质抗嗜中性白细胞细胞质抗体(c-ANCA)；以及非典型ANCA(a-ANCA)，也被称为x-ANCA，并且是一组自体抗体，主要属于IgG型，针对嗜中性白细胞粒细胞(最常见的白血细胞类型)和单核细胞的细胞质中的抗原。p-ANCA还与若干医学状况相关联，对于溃疡性结肠炎来说，它是十分特异性的，但不灵敏；大多数原发性硬化性胆管炎；局灶性坏死性和新月体性肾小球性肾炎；以及类风湿性关节炎。
此外，这些ANCA不仅通过结合膜结合型PR3/MPO来使嗜中性白细胞和单核细胞活化，而且与内皮相互作用以增强粘附因子的表达。尽管若干研究已探究在血管炎缓解期间ANCA滴度用于预测疾病复发，但在AAV的活动性时期中ANCA滴度与要求永久透析之间的关联尚未有文件充分记载。在亚洲国家，MPO-ANCA相关血管炎比PR3-ANCA相关血管炎更常见。它们作为血液测试结果在许多自体免疫病症中被检测到，但特别与全身性血管炎，即所谓ANCA相关血管炎(AAV)，包括肉芽肿病伴多血管炎、显微性多血管炎、原发性寡免疫坏死性新月体性肾小球性肾炎(一种类型的肾局限性显微性多血管炎)、嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴多血管炎(先前被称为车格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome))和药物诱发的血管炎相关联。针对PR3的c-ANCA存在于80-90％的肉芽肿病伴多血管炎、20-40％的显微性多血管炎、20-40％的寡免疫新月体性肾小球性肾炎和35％的嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴多血管炎中。c-ANCA(非典型)存在于80％的囊性纤维化(以BPI作为靶标抗原)中，并且还存在于炎症性肠病、原发性硬化性胆管炎和类风湿性关节炎(具有针对多种抗原性靶标的抗体)中。具有MPO特异性的p-ANCA见于50％的显微性多血管炎、50％的原发性寡免疫坏死性新月体性肾小球性肾炎和35％的嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴多血管炎中。对其他抗原具有特异性的p-ANCA与炎症性肠病、类风湿性关节炎、药物诱发的血管炎、自体免疫肝病、药物诱发的综合征和寄生生物感染相关联。非典型ANCA与药物诱发的全身性血管炎、炎症性肠病和类风湿性关节炎相关联。
更具体来说，抗嗜中性白细胞细胞质自体抗体(ANCA)相关血管炎(AVV)是一种特征在于小血管炎症和坏死，从而导致多器官损害和功能异常的全身性疾病。肾是最经常受影响的器官，从而导致寡免疫节段性坏死性新月体性肾小球性肾炎，其被称为ANCA相关肾小球性肾炎(AAGN)。
临床和实验证据指示ANCA导致人中的寡免疫坏死性新月体性肾小球性肾炎(NCGN)和全身性小血管血管炎。
在一些具体实施方案中，本发明的方法以及由本发明公开的组合物、细胞和药盒可适用于P-ANCA相关病症。
更具体来说，抗嗜中性白细胞细胞质自体抗体的一种主要靶标抗原是MPO。MPO-ANCA不靶向单一表位，而是MPO的少数区域，主要在重链的羧基末端中。因此，通过消除MPO的表达、水平和/或活性，本发明的方法、组合物、细胞和药盒解决了MPO中自体抗体靶向表位的可变性。
在一些实施方案中，本发明方法可适用于是Anca相关血管炎的P-ANCA相关病症。视临床特征而定，AAV被分类成四个种类：显微性多血管炎(MPA)、肉芽肿病伴多血管炎(GPA)、嗜酸性粒细胞性GPA(EGPA)和肾局限性血管炎(RLV)。在各个种类的AAV中，器官受累产生许多改变，并且临床表现缺乏特异性。
在群体水平上，关于寡免疫GN的流行病学和结果所知甚少。PICG占快速进行性肾小球性肾炎(RPGN)病例的多达80％，所述PICG在美国的发病率据估计是每年每百万人中7–10例。相较于黑人，寡免疫GN(PICG)好发于白人，在男性和女性中具有大致相等表现。
在不治疗的情况下，寡免疫GN-PICG具有80％的1年死亡率。然而，采用积极免疫抑制，5年存活率达到75％。年龄较大、透析依赖和肺出血全都使存活机会恶化。举例来说，不可逆的透析依赖性肾衰竭使5年存活率降低至35％。从肾结果角度来看，约25％的患者进展至肾衰竭，也被称为末期肾病(ESRD)，其是慢性肾病的最后阶段。
因此，在一些实施方案中，ANCA有关或相关病症包括但不限于ANCA相关血管炎(AAV)、ANCA相关肾小球性肾炎(AAGN)、新月体性肾小球性肾炎(NCGN)和快速进行性肾小球性肾炎(RPGN)。此外，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于治疗本文公开的任何P-ANCA相关病症。
在一些其他实施方案中，本发明方法可适用于治疗免疫相关病症诸如炎症性病症。根据一些实施方案，本发明方法可适用于治疗炎症性病症。术语“炎症性疾病”或“炎症相关疾患”是指可受益于至少一种炎症性参数的降低的任何疾病或病理状况，例如对炎症性细胞因子诸如IFN-γ和IL-2的诱导以及IL-6水平的降低。状况可(主要)由炎症引起，或炎症可为由另一生理原因引起的疾病的一种表现形式。在一些实施方案中，可适用于本发明方法的炎症性疾病可为动脉粥样硬化、类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)中的任一者。如由实施例所公开，本发明显示相较于MPO表达性5XFAD小鼠，MPO缺陷性5XFAD展现优越行为表现，由此反映认知减退受到限制。本发明还显示在这些小鼠的脑中，炎症性应答较低，如由降低的星形细胞活化水平、APOE表达水平、以及若干促炎性细胞因子水平所反映。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于抑制或降低有需要的受试者的认知减退的方法、组合物、细胞和药盒。在一些其他实施方案中，本发明提供了用于抑制或降低有需要的受试者特别是罹患AD的受试者的脑中的炎症性应答的方法、组合物、细胞和药盒。此外，在一些实施方案中，本发明提供了用于抑制或降低有需要的受试者中星形细胞活化的水平的方法、组合物、细胞和药盒。在一些其他实施方案中，本发明提供了用于抑制或降低有需要的受试者中的APOE表达的方法、组合物、细胞和药盒。此外，在一些实施方案中，本发明提供了用于抑制或降低有需要的受试者中若干促炎性细胞因子的水平的方法、组合物、细胞和药盒。在一些实施方案中，这类细胞因子可为IL-1β、CXCL10、CCL2和TNFα中的至少一者。在一些实施方案中，这种受试者可为罹患神经变性病症的受试者。在一些其他具体实施方案中，这种神经变性病症可为AD。
此外，对于嗜中性白细胞功能重要，并且长期被怀疑它在神经变性中起作用，MPO充当AD中嗜中性白细胞损害的主要介体。实际上，在过去已报道MPO与AD的若干关联。先前显示人MPO的启动子中463G/A基因座中与增加的MPO表达相关联的多态性使显现晚期发作AD的风险升高。此外，鉴定了MPO与作为晚期发作AD的最常见遗传风险因素的APOEε4等位基因之间的相互作用。然而，关于463G/A多态性与AD的关联，之后研究展现了相抵触的研究结果。Green和同事已报道在AD患者的皮质中，MPO免疫反应性和活性升高，以及它的氧化产物的普遍性增加。然而，在那个研究中，MPO表达归因于神经元。Reynolds和同事检测到在淀粉样蛋白-β斑块周围的CD68表达性细胞中的MPO表达，因此，将这归因于小神经胶质细胞/巨噬细胞。更新近地，报道了MPO表达与AD患者的脑中的淀粉样蛋白-β斑块相关联。引起关注的是，在那些脑中未检测到MPO mRNA表达，从而指示观察到的MPO的来源具有外周骨髓性质。尽管这些观察结果提供了MPO涉及于AD发病机理中的强力证据，但据本发明者所知，本发明最先考查MPO缺乏在AD的实验模型中的影响。通过利用造血消减和再增殖方法来建立外周髓系细胞中MPO缺乏，而不影响CNS源性MPO，本发明集中于主要源于嗜中性白细胞的外周MPO。氧化应激和血管损害被视为AD的发病机理中的关键事件。这些事件可潜在导致血脑屏障功能异常、脑血流量降低、以及CNS内的实质性氧化性和炎症性损害。嗜中性白细胞功能在神经变性中的新近牵连包括过度活化和衰老、在皮质毛细血管中的粘附增强、在脑实质中的外渗和脱粒、以及形成NET，从而导致深度炎症性应答。由本发明公开的数据还证明血液MPO缺乏限制了炎症性应答。此外，在MPO消减之后，针对认知减退的深度保护可说明源于嗜中性白细胞的氧化性损害降低，所述氧化性损害被视为AD中病理的实质性部分。在这个情形下，本文公开的结果与Zenaro等人以及Cruz-Hernandez等人的展现在嗜中性白细胞消减之后在AD的小鼠模型中的功能性保护的新近出版物一致(Zenaro,E.等人Neutrophilspromote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1integrin.Nat.Med.21,880–886(2015)，以及Cruz Hernández,J.C.等人Neutrophiladhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memoryfunction in Alzheimer’s disease mouse models.Nat.Neurosci.(2019).doi:10.1038/s41593-018-0329-4)。
MPO功能已牵涉于在心血管和肾疾病的情形下的内皮功能异常和血管损害中。由活化的嗜中性白细胞分泌的带正电荷MPO通过它与阴离子糖萼的相互作用来沿内皮和内皮下间隙积累。尽管显示由结合的MPO获得的氧化剂会降低糖萼厚度和对内皮的损害，但还显示MPO会促进嗜中性白细胞募集和迁移。这可导致MPO应答放大，以及嗜中性白细胞原位积累。引起关注的是，本发明者发现MPO缺陷性5XFAD小鼠的海马样品中VCAM1表达降低，从而表明内皮中炎症增加。然而，MPO缺乏对微血管内皮中嗜中性白细胞募集的影响以及它对毛细血管阻塞和脑血流量以及嗜中性白细胞迁移的影响还有待于确定。
由本发明呈现的结果明确指示在5XFAD小鼠中，嗜中性白细胞源性MPO在AD样发病机理中起主要作用。这些结果提出了MPO抑制作为用于治疗AD的新型治疗靶标。
因此，在一些其他实施方案中，MPO相关疾患可为神经变性病症。在一些具体实施方案中，本发明方法可适用于治疗神经变性病症。在一些实施方案中，神经变性病症可还涉及炎症性和/或血管性原因。
神经变性是关于包括神经元的突触功能异常和死亡的进行性神经元结构或功能丧失的综合术语。包括阿尔茨海默氏病和帕金森氏病(Parkinson’s)的许多神经变性疾病与神经变性过程相关联。也可适用于本文中的其他神经变性实例可包括弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、路易体(Lewy body)疾病、脊髓性肌肉萎缩、多发性硬化症、额颞叶性痴呆、皮质基底变性、进行性核上麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性下肢轻瘫、淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和恰克马利杜斯病(Charcot Marie Tooth)。不应忽视包括进行性神经变性特别是年龄相关的认知减退(ACD)和轻度认知损害(MCI)的正常老化过程也可适用于本发明中。在一些其他实施方案中，本发明的方法、药盒、组合物和细胞可适用于杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)或与其相关的任何疾患。在一些其他实施方案中，本发明的方法、药盒、组合物和细胞可适用于贝克尔肌营养不良(Beckermuscular dystrophy)。在一些其他实施方案中，本发明的方法、药盒、组合物和细胞可适用于结节性硬化复合征(TSC)。
在更具体实施方案中，本发明方法可适用于治疗神经变性病症诸如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
如本文所用的阿尔茨海默氏病(AD)是指涉及记忆以及其他认知范畴的恶化，一般导致在诊断之后3至9年内死亡的病症。阿尔茨海默氏病的主要风险因素是年龄。在65岁之后，疾病的发病率每5年倍增。多达5％的患病人员患有可在40或50岁时出现的早期发作AD(也被称为年轻发作)。许多分子病变已在阿尔茨海默氏病中检测到，但从数据显露出来的首要主题是错误折叠蛋白质在老化脑中的积累导致氧化性和炎症性损害，此转而导致能量衰竭和突触功能异常。更具体来说，已显示Aβ在从患有阿尔茨海默氏病的患者的脑分离的结构受损线粒体中积累。
阿尔茨海默氏病可主要是突触衰竭病症。在患有轻度认知损害(经常在痴呆之前的有限认知缺陷)的患者中，海马突触开始减退，在所述患者中，剩余突触概况显示在尺寸方面的代偿性增加。在轻度阿尔茨海默氏病中，突触前囊泡蛋白突触素(synaptophysin)有约25％的降低。在进展性疾病的情况下，相对于神经元，突触不相称地丧失，并且这个丧失与痴呆最为相关。老化自身会导致突触丧失，其特别影响海马的齿状区域。
不存在可引发和驱动阿尔茨海默氏病的单一线性已知事件或路径链条。AD是一种进行性疾病，其中痴呆症状历经许多年逐渐恶化。在它的早期中，记忆丧失是轻度的，但在晚期AD的情况下，个体丧失继续对话以及对他们的环境起响应的能力。患有AD者在他们的症状变得可为别人所觉察之后存活平均八年，但视年龄和其他健康状况而定，存活期可多达20年。
AD的最常见早期症状是难以记住新获悉的信息，因为AD变化通常在脑的影响学习和记忆的部分中开始。随着AD在脑的各处进展，它导致日益严重的症状，包括定向障碍、情绪和行为变化；关于事件、时间和地点的混乱加深；无根据地怀疑亲属、朋友和专业护理者；更严重的记忆丧失和行为变化；以及言语、吞咽和行走困难。
国立神经和交际病症以及中风研究所(NINCDS)以及阿尔茨海默氏病和相关病症联合会(ADRDA，现被称为阿尔茨海默氏病联合会)在1984年建立了最通常使用的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默氏病诊断准则，在2007年进行了广泛更新。这些准则要求通过用于临床诊断可能或也许的AD的神经心理学测试来确认存在认知损害和怀疑的痴呆综合征。包括对脑组织的显微检查的组织病理学确认为确定性诊断所需。已显示诊断准则与确定性组织病理学确认之间的良好统计可靠性和有效性。在AD中，八个认知范畴最通常受损：记忆、语言、感知技能、注意力、建构能力、定向、解决问题和功能性能力。这些范畴对应于如由美国精神病学联合会(American Psychiatric Association)出版的心理障碍的诊断和统计手册(DSM-IV-TR)中所列的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默氏病准则。除用以暂时减缓痴呆症状的恶化的对症治疗之外，AD不具有当前治愈方法，并且当前治疗不能停止AD进展。应了解本发明方法以及由本发明提供的组合物、细胞、药盒、用途和系统可适用于本文讨论的任何MPO相关疾患的与AD相关的任何阶段、状况或症状。还应了解在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于AD患者中疾病的任何阶段、类型、症状或程度。
如由图5和图6所示，将MPO-KO BM细胞继承性转移至AD动物(5XFAD)明确改善了空间学习和记忆、联想学习和焦虑/风险评估行为。因此，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于改善和增强AD患者的空间学习。在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于改善和增强AD患者的记忆。此外，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于改善和增强AD患者的联想学习。在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于改善和增强AD患者的焦虑/风险评估行为。
如上所指示，AD被视为一种涉及蛋白质错误折叠(例如Aβ肽)的疾患。因此，在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于与蛋白质错误折叠相关的任何疾患，例如突触核蛋白病变和τ蛋白病变。更具体来说，“α-突触核蛋白病理学病症”或“突触核蛋白病变”用于命名特征在于在选择的神经元和神经胶质群体的细胞质中具有α-突触核蛋白的原纤维聚集物的一组神经变性病症。包含单体、寡聚中间体、或原纤维形式的α-突触核蛋白聚集物被认为涉及于帕金森氏病(PD)的发病机理中的关键步骤中，以及其他α-突触核蛋白病变诸如多系统萎缩(MSA)和路易体痴呆(DLB)中。因此，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于本文公开的任何突触核蛋白病变。此外，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于与τ蛋白的积累相关的任何疾患。更具体来说，如本文所用的“τ蛋白”是指神经原纤维缠结，其是锥体神经元中的丝状包涵体，为阿尔茨海默氏病以及被称为τ蛋白病变的其他神经变性病症所特有。对它们的形成的机制的阐明可为未来疗法提供靶标。过度磷酸化τ蛋白以成对螺旋丝形式在锥体神经元中积累是阿尔茨海默病的主要标志。除过度磷酸化之外，τ蛋白的其他修饰诸如交联也可能促成成对螺旋丝的典型特征，包括它们的不溶性和对蛋白水解降解的抗性。这些神经原纤维缠结由过度磷酸化和聚集形式的微管相关蛋白τ组成。
如实施例2中所示，继承性转移未分化MPO KO BM细胞导致了明确抑制AD中的认知损害，并且改善了认知功能和联想学习。因此，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于与认知减退或损害相关的任何疾患。在一些实施方案中，本发明可适用于MCI。如本文所用的“年龄相关的轻度认知损害(MCI)”是一种导致认知变化的疾患。主要影响记忆的MCI可分类为“遗忘性MCI”，其中受试者在对与新近事件、约定或对话或新近事件相关的信息进行记忆方面经受损害。影响除记忆以外的思维技能的MCI称为“非遗忘性MCI”。可受非遗忘性MCI影响的思维技能包括做出合理决定，判断为完成复杂任务所需的步骤的时间或顺序，或视觉感知的能力。
正常老化与许多认知任务中各种记忆能力的减退相关；所述现象称为年龄有关的记忆损害(AMI)、年龄相关的记忆损害(AAMI)或年龄相关的认知减退(ACD)。在横向研究与纵向研究两者中，编码新的事件或事实记忆以及工作记忆的能力均显示减退。将老化对情景记忆、语义记忆、短期记忆和促发的影响进行比较的研究揭示了在正常老化中，情景记忆尤其受损；一些类型的短期记忆也受损。缺陷可与在刷新新近处理的信息的能力方面所见的损害相关。通常，在一些心理功能诸如言语能力、一些数字能力和一般知识方面存在少许年龄相关的减退，但其他心理能力从中年起或甚至更早发生减退。后者包括记忆、执行功能、处理速度和推理方面。因此，应了解，在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗任何认知减退特别是与年龄相关的认知减退的方法和组合物，所述年龄特别是50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁以及更大岁数的年龄。
在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于DLB。如本文所用的“路易体痴呆(DLB)”是痴呆的一种相对常见原因，据估计占痴呆病例的多达30％，并且影响多达5％的超过75岁者。在病理学上，它通过在脑中存在含有α突触核蛋白的路易体来定义，但它们的分布影响新皮质、边缘系统和脑干。在临床上，DLB的特征在于是一种进行性痴呆，具有显著幻视和妄想、以及具有运动徐缓和僵硬但通常最小程度的震颤的帕金森氏症。显著认知波动是这个疾患的常见特征，其中混乱、过度嗜睡和语无伦次的发作可在数小时内恢复至接近正常状态。
在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于PD。如本文所用的“帕金森氏病(PD)”是一种由中脑多巴胺神经元的变性以及含有α-突触核蛋白的路易体在存活神经元中的积累所致的神经变性疾病。对PD的诊断基于在不存在其他病因状况下存在主要运动特征。这些运动特征包括经典三联症，即运动徐缓、静息滚丸样震颤和僵硬，通常伴有表情缺乏、发音过弱、写字过小和姿势不稳。PD的非运动特征可甚至在它的诊断之前，从而构成前驱或运动前期PD。这些运动前期特征包括嗅觉、便秘、情绪和睡眠问题，并且在PD的临床诊断之后，它们可变得更加显著。认知问题和痴呆也通常在PD中显现，截至从诊断开始的10年，影响几乎50％。然而，在一些患有α-突触核蛋白病变的个体中，显著认知问题在帕金森氏病运动症状的发作之前，并且这些病例在临床上以诊断为路易体痴呆分类。在临床上以及在病理学上，在这两种疾患之间均明确存在重大程度的重叠，但目前，临床区别建立在运动症状发作与痴呆之间的时间间隔上，其中与路易体痴呆(DLB)相对比，对PD的诊断需要最少一年间隔。此外，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于MSA。“多系统萎缩(MSA)”是一种包括黑质纹状体和橄榄体脑桥小脑结构中的细胞丧失和神经胶质增生的神经病变，采用在寡树突细胞内的含有原纤维α-突触核蛋白的神经胶质细胞质包涵体形式。它呈现以呈不同组合形式的自主神经功能异常以及帕金森氏症和小脑功能异常，并且在临床上按照它的表现分类为以小脑症状为主(MSA-C)或以帕金森氏病为主(MSA-P)。
此外，如上所指示，神经变性病症与血管和缺血性疾患明确相关。因此，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于任何血管和/或缺血性疾患。更具体来说，脑缺血(brain ischemia)(或脑缺血(cerebral ischemia)、脑血管缺血)是一种其中朝向脑的血流量不足以满足代谢需求的疾患。这导致供氧不良或脑缺氧，因此导致脑组织死亡或脑梗塞/缺血性中风。它是中风的一种亚型，连同蛛网膜下出血和脑内出血一起。缺血导致脑代谢改变、代谢速率降低和能量危机。存在两种类型的缺血：限于脑的特定区域的局灶性缺血；以及涵盖脑组织的广泛区域的全脑缺血。
主要症状涉及视力、躯体运动和言语的损害。脑缺血的原因从镰状细胞贫血至先天性心脏缺陷进行变化。脑缺血的症状可包括无意识、失明、协调问题以及身体衰弱。可由脑缺血所致的其他影响是中风、心脏呼吸骤停和不可逆脑损害。
在缺血性中风中，朝向脑的部分的供血降低，从而导致那个区域中脑组织的功能异常。对于缺血性中风，存在四种主要原因，即血栓形成(血管由局部形成的血液凝块阻塞)、栓塞(归因于来自身体中其他地方的栓塞物的阻塞)、全身性灌注不足(全身性供血降低，例如在休克的情况下)；以及脑静脉窦血栓形成。
对于急性缺血性中风，存在各种分类系统。牛津社区中风项目分类(OxfordCommunity Stroke Project classification，OCSP，也被称为班福德(Bamford)或牛津分类)主要依赖于初始症状；基于症状的程度，中风发作被分类为完全前循环梗塞(TACI)、部分前循环梗塞(PACI)、腔隙性梗塞(LACI)或后循环梗塞(POCI)。这四个病种预示中风的程度、脑的受影响区域、潜伏原因和预后。TOAST(急性中风治疗Org 10172试验)分类基于临床症状以及其他探究的结果；在此基础上，中风被分类为归因于(1)由于大动脉的动脉粥样硬化的血栓形成或栓塞，(2)起源于心脏的栓塞，(3)小血管的完全堵塞，(4)其他所确定原因，(5)未确定原因(两种可能原因、未鉴定出原因、或探究不完全)。
小量慢性脑内出血(直径<5至10mm)被称为脑微出血(CMH；也描述为微量出血、多灶性信号缺失病变、点状出血)。CMH归因于小动脉、微动脉和/或毛细血管的破裂(在人CMH中，破裂血管的直径据估计小于200μm，其中许多出血在微动脉和毛细血管水平上发生)。CMH表现为对应于局灶性血铁黄素沉积的小型卵形低强度病变，其可使用T2*加权梯度回波(T2*-GRE)MRI序列加以最佳检测。
对于CMH，年龄是最显著的独立风险因素。在较年轻的受试者中，CMH的患病率较低，并且随年龄渐进增加。大多数研究报道在年长患者中，CMH的患病率是24％至56％。高血压是CMH的另一主要独立风险因素。脑淀粉样血管病变和阿尔茨海默氏病(AD)也构成CMH的重要风险因素。在患有增生性糖尿病性视网膜病变的1型糖尿病患者中，报道了CMH的患病率增加，从而表明全身性微血管病变可促成脑微血管损伤与视网膜微血管损伤两者。CMH还见于接近半数的受伴有皮质下梗塞和脑白质病变的脑常染色体显性动脉病变(CADASIL)影响的个体中，所述CADASIL是一种由Notch 3基因的突变引起的成人发作型遗传性中风病症。
此外，在一些实施方案中，本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于cSVD。脑小血管疾病(cSVD)是用于影响脑的小血管的不同病理性过程的术语，所述小血管包括小动脉、微动脉、毛细血管和小静脉。cSVD在腔隙性脑梗塞以及深出血或皮质出血中具有关键作用。除认知减退和痴呆之外，步态问题也经常与cSVD相关联。约五分之一的有症状中风是腔隙性中风综合征，其经常是更严重种类的中风，即自发性实质性脑出血(PBH)。这些与cSVD相关联。然而，尽管散发性cSVD是PBH的主要原因，但潜伏微血管病变的地形图在每种情况下是不同的。cSVD被分类成两种主要形式。第一是淀粉样形式，其包括作为慢性退变性疾病的脑淀粉样血管病变(CAA)。第二形式被表征为非淀粉样形式的cSVD，其经常与常见血管风险因素诸如年龄较大、高血压、糖尿病和许多其他因素相关。
脑淀粉样血管病变(CAA)，也被称为嗜刚果红血管病变，是一种其中淀粉样沉积物在中枢神经系统的血管的壁中形成的血管病变形式。因为淀粉样蛋白的异常聚集的存在可通过在施加称为刚果红(Congo red)的特殊染色剂之后对脑组织进行显微检查来显示，所以使用术语嗜刚果红。淀粉样物质仅见于脑中，因此，疾病不与其他形式的淀粉样变性相关。
CAA是cSVD的常见淀粉样形式。CAA的发病率主要与高龄相关。它由β-淀粉样蛋白在皮质和柔脑膜小动脉的壁中的进行性沉积引起，所述沉积导致血管功能异常和脑实质损伤。β-淀粉样蛋白的沉积被认为涉及于血管阻塞和破裂中。CAA相关血管病变包括诸如纤维素样坏死、平滑肌细胞丧失、壁增厚、微动脉瘤形成、以及血管周围血液分解伴有所得产物沉积的特征。基于淀粉样蛋白沉积的特定位置和等位基因差异，已鉴定CAA的至少两种病理学亚型：特征在于淀粉样蛋白在皮质毛细血管中的1型CAA，以及其中淀粉样沉积物限于柔脑膜和皮质动脉而非毛细血管的2型CAA。注意到在有症状的荷兰型遗传性脑出血伴淀粉样变性(HCHWA-D)患者中，枕叶中皮质灰质降低以及基底动脉中流量降低。在患有HCHWA-D的患者中出现皮质变薄指示血管淀粉样蛋白是皮质萎缩的独立促进因素。CAA相关皮质萎缩由血管功能异常促进，并且甚至在不存在阿尔茨海默氏病下被观察到。此外，载脂蛋白E(APOE)基因多态性与CAA的两种亚型相关联。APOEε4等位基因和APOEε2分别与1型疾病和2型疾病合理地相关联。
因此，应了解本发明的方法、组合物、系统、药盒和用途可适用于任何缺血性疾患，特别是本文公开的任何疾患。
此外，嗜中性白细胞长久以来已被称为吞噬和杀灭病原体，并且发动炎症性应答，从而保护宿主免遭感染的先天性免疫细胞。嗜中性白细胞细胞外DNA诱捕网(NET)的形成已确定了嗜中性白细胞在炎症和免疫性中，而且还在包括癌症生物学和血栓形成的病理性状况以及相关疾患(例如特鲁索综合征(Trousseau syndrome))中的新作用。已显示嗜中性白细胞的染色质的释放影响肿瘤发展的不同步骤，包括肿瘤生长、血管生成、转移和免疫抑制。如上所指示，MPO涉及于嗜中性白细胞中的NET形成中。因此，通过调节，并且特别是抑制MPO表达、水平和/或活性，本发明提供了一种用于调节和抑制受试者中的NET形成的策略，并且由此提供了一种用于治疗癌症和相关病症的方法。因此，在一些实施方案中，可涉及MPO的增强的表达或活性的MPO相关疾患可为增生性病症。因此，在一些具体实施方案中，本发明方法可适用于治疗增生性病症。根据本发明的一些实施方案的增生性病症可为癌症和/或任何相关病变诸如转移。如本文所用，“癌症”、“肿瘤”和“恶性肿瘤”全都同等地涉及组织或器官的增生。如果组织是淋巴或免疫系统的一部分，那么恶性细胞可包括循环细胞的非实体肿瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可产生实体肿瘤。一般来说，本发明的方法和组合物可用于治疗非实体和实体肿瘤。如本发明中涵盖的恶性肿瘤可为癌瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤中的任一者。
如本文所用的癌瘤是指由转化上皮细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。或者，它是指由组织发生未知，但具有与上皮细胞相关的特定分子或组织学特征的转化细胞组成的恶性肿瘤，所述特征诸如是产生细胞角蛋白或细胞间桥。
如本文所用的黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。黑素细胞是产生决定着皮肤颜色的深色色素黑色素的细胞。它们主要存在于皮肤中，但也见于身体的其他部分，包括肠和眼中。黑素瘤可发生在身体的含有黑素细胞的任何部分中。
白血病是指形成血液的器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中白细胞和它们的前体的增殖和发育不正常。白血病通常在临床上基于以下加以分类：(1)疾病的持续时间和特性-急性或慢性；(2)涉及的细胞的类型-髓系(髓源性)、淋巴系(淋巴源性)或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞的数目增加或不增加-白血病性或非白血性(亚白血病性)。
肉瘤是由转化结缔组织细胞引起的癌症。这些细胞来源于形成骨、软骨和脂肪组织的胚胎中胚层或中间层。这不同于起源于上皮的癌瘤。上皮被覆于全身各种结构的表面，并且是乳腺、结肠和胰腺中癌症的来源。如本文提及的骨髓瘤是浆细胞的癌症，所述浆细胞是一种类型的白血细胞，通常负责产生抗体。大量异常细胞积累在它们在其中导致骨病变的骨中，以及它们在其中干扰正常血细胞的产生的骨髓中。骨髓瘤的大多数病例的特征还在于产生副蛋白，即可导致肾问题，并且干扰正常抗体的产生，从而导致免疫缺陷的异常抗体。经常遭遇高钙血症(高钙水平)。淋巴瘤是免疫系统的淋巴细胞的癌症。通常，淋巴瘤呈现为淋巴系细胞的实体肿瘤。这些恶性细胞经常起源于淋巴结，呈现为结节肿大(肿瘤)。它还可影响其他器官，在所述情况下，它被称为结外淋巴瘤。淋巴瘤的非限制性实例包括霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤。
可根据本发明加以治疗或抑制的恶性肿瘤的其他非限制性实例包括非实体癌症，例如造血性恶性肿瘤诸如所有类型的白血病，例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓源性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓源性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、肥大细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤。可根据本发明加以治疗或抑制的实体肿瘤的非限制性实例包括在以下中的肿瘤：唇和口腔、咽、喉、鼻旁窦、大唾液腺、甲状腺、食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、肛管、肝、胆囊、肝外胆管、法特壶腹(ampulla of Vater)、外分泌胰腺、肺、胸膜间皮瘤、骨、软组织肉瘤、皮肤癌和恶性黑素瘤、乳腺、外阴、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管、妊娠性滋养母细胞肿瘤、阴茎、前列腺、睾丸、肾、肾盂、输尿管、膀胱、尿道、眼睑癌、结膜癌、结膜恶性黑素瘤、葡萄膜恶性黑素瘤、视网膜母细胞瘤、泪腺癌、眼眶肉瘤、脑、脊髓、血管系统、血管肉瘤和卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)。在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤是乳腺癌。
MPO涉及于多种炎症性疾病的发病机理中，包括动脉粥样硬化和心血管疾病、肾病、肺炎症、类风湿性关节炎、皮肤炎症、神经元疾病和代谢综合征。更具体来说，在肾小球和肾小管间质性疾病中，多形核白细胞和单核细胞源性反应性氧类可促进对蛋白质、脂质和核酸的氧化性修饰。部分地，由反应性氧类鼓动的过程与导致显现动脉粥样硬化的事件并行。因此，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可适用于动脉粥样硬化以及心血管疾病，例如内毒素血症、心肌梗塞/缺血、血管机能异常和心房纤颤。
此外，MPO在氯离子存在下从过氧化氢产生次氯酸/次氯酸根(HOCl/OCl-)的能力是这个酶的独特和起决定性作用的活性。MPO-过氧化氢-氯离子系统产生多种氯化蛋白质和脂质加合物，所述加合物转而可导致肾的不同区室中细胞的功能异常。因此，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可适用于可包括慢性肾病、缺血/再灌注损伤、肾小球性肾炎和狼疮肾炎的多种肾病。
在一些其他实施方案中，本发明的方法、组合物、细胞和药盒可适用于至少一种呼吸疾患。如本文所用的呼吸疾患或疾病涵盖影响是呼吸道的一部分的器官和组织的病理性状况。这些疾患包括呼吸道的疾患，所述呼吸道包括气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜、胸膜腔以及呼吸神经和肌肉。呼吸疾病在从轻度和自限性疾病至危急生命的疾病的范围内，并且包括慢性和急性疾患。慢性呼吸疾病(CRD)是气道以及肺的其他结构的疾病。它们的特征在于高度炎症性细胞募集(嗜中性白细胞)和/或破坏性感染循环。呼吸疾病可以许多不同方式分类，包括根据涉及的器官或组织，根据相关征象和症状的类型和样式，或根据疾病的原因。
在一些实施方案中，由本发明涵盖的呼吸疾患包括但不限于肺动脉高血压(PAH)、慢性阻塞性肺病(COPD)和慢性肉芽肿性疾病(GCD)中的至少一者。更具体来说，Klinke等人(Klinke等人(2018)JCI Insight；3(11):e97530)显示MPO与肺血管功能受损之间的机理性关联，并且提出肺动脉高血压可通过MPO抑制来改善。具体来说，他们显示在患有肺动脉高血压的患者中，MPO升高，并且这与后续不利结果相关联。此外，他们观察到相较于具有低MPO水平的患者，历经65周中值时间，具有高MPO水平(>583pmol/L)的患者显示降低的存活期(P＝0.023)。此外，相较于野生型小鼠，缺陷性MPO小鼠(MPO-/-)显示在缺氧后右心室压增加程度较小。在MPO-/-小鼠中，缺氧诱导的对Rho激酶路径-涉及于血管收缩和结构性血管重塑中的关键亚细胞信号传导路径-的活化被减弱。因此，这个研究证明MPO、Rho激酶活化和不利肺血管功能之间的紧密机理性关联。因此，根据一些实施方案，本发明方法可适用于降低罹患PAH的受试者中的MPO水平。在一些其他实施方案中，本发明方法可适用于治疗罹患PAH的受试者。
如本文所用的肺动脉高血压(PAH)是一种无治愈方法的进行性疾病，特征在于肺动脉的重塑和狭窄，此导致右心室压升高、心脏衰竭和死亡。白细胞源性血红素-酶髓过氧化物酶(MPO)作为PAH的潜在介体出现，因为它被坚定地确定为血管壁的体液功能异常的主要介体。
此外，髓过氧化物酶是一种储存在嗜中性白细胞的初级颗粒中，具有强力抗细菌和促动脉粥样化性质的强力氧化剂。髓过氧化物酶已牵涉于慢性阻塞性肺病(COPD)的发病机理中。更具体来说，增加的血清髓过氧化物酶水平与COPD患者中的快速肺功能减退和不良心血管结果相关联，此支持髓过氧化物酶在COPD进展的发病机理中的新出现作用。
此外，髓过氧化物酶是嗜中性白细胞颗粒中的主要过氧化物酶，并且在囊性纤维化中牵涉于促进炎症性肺损害中。游离髓过氧化物酶存在于囊性纤维化肺液中，并且产生次氯酸。因此，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可适用于多种肺炎症性疾患，包括囊性纤维化、COPD、败血症诱发的损伤、流感病毒诱发的损伤、石棉诱发的损伤和急性肺炎症。
可适用于本发明中的其他炎症性疾病包括类风湿性关节炎和皮肤炎症。在提供用于调节有需要的受试者中MPO的表达、水平和活性的方法和组合物方面，本发明还涵盖提供治疗与MPO的减小的或降低的表达和/或活性相关的病症，或替代地或另外，与其他因素相关，但可通过调节MPO的表达和/或活性来改善或影响的病症或疾患。在一些实施方案中，这类疾患或病症可在本文中被称为与MPO间接相关。通过使用本发明方法来调节和升高MPO水平，本说明书还提供了用于治疗例如与ROS缺乏和/或MPO缺乏相关的疾患的方法。因此，在一些实施方案中，可适用于本发明方法的MPO相关疾患可与降低的或缺陷性ROS水平相关。与其他因素例如ROS相关的病症的一非限制性实例可为慢性肉芽肿性疾病(GCD)，其被定义为产生反应性氧类(ROS)的吞噬细胞NADPH氧化酶NOX2的遗传缺陷。在这种情况下，增强MPO的水平可导致ROS升高，由此提供一种用于治疗ROS相关病症的工具。
因此，在一些具体实施方案中，本发明可还适用于可与ROS病症相关的慢性肉芽肿性疾病(CGD)。根据一些实施方案，本发明方法可适用于治疗MPO缺乏相关疾患或直接或间接由MPO消减引起的任何疾患。
应了解本发明提供了用于通过消除或降低受试者的未分化BM细胞中的MPO水平来治疗与MPO相关的病症例如AD、MS、P-ANCA相关病症和PAH，或由本发明公开的任何病症的治疗方法。如上所公开，本发明提供了操控受试者的免疫系统的治疗方法、组合物、药盒和细胞，具体来说，通过靶向受试者的未分化BM细胞中的MPO，由此导致对所述受试者的任何组织和器官中的MPO水平的操控。如由这个方面所说明，这种调节由本发明有效地用于治疗性应用，特别是用于治疗MPO相关疾患，诸如AD、MS、P-ANCA相关病症和PAH。因此，应了解，在一些具体和非限制性实施方案中，本发明提供了用于通过操控受试者的免疫系统，具体来说是所述受试者的BM细胞以显示MPO的经调节水平、表达和/或活性来治疗罹患MPO相关疾患例如AD、MS、P-ANCA相关病症和PAH的受试者的方法、组合物和药盒。更具体来说，本发明的治疗方法基于提供经操控免疫系统(自体来源或同种异体或同种同基因来源中的任一者)。或者，可使用本文提供的基因编辑系统在体内操控受试者的免疫系统(例如将基因编辑系统的化合物施用至受试者)，以致所述受试者的BM细胞群体展现MPO的经调节水平、表达和/或活性。因此，本发明的治疗方法、药盒和组合物提供了用于治疗这类病理性状况的有效治疗策略。在一些其他具体实施方案中，这种治疗策略可通过将显示MPO的经调节水平、表达和/或活性的BM细胞移植至罹患MPO相关疾患例如MS或AD的受试者来实现，在一些实施方案中，所述受试者在移植之前经受免疫净化。通过移植显示MPO的经调节(例如降低的或消除的)水平、表达或活性的BM细胞，经移植受试者展现任何组织和器官中MPO的经调节表达。应了解，如由本发明所详细解释，所移植BM细胞可为从同一受试者获得，并且使用本发明的基因编辑系统离体操控以调节MPO的水平、表达或活性的自体BM细胞。举例来说，在一些具体实施方案中，从受试者获得的BM细胞可离体经受本发明的基因编辑系统。这可导致MPO水平、表达和/或活性的消除和降低。或者，可使用同种异体或同种同基因来源的显示(天然地，或由于应用本发明的基因编辑系统)MPO的经调节水平、表达和/或活性的未分化BM细胞。这类MPO缺陷性自体或同种异体BM细胞可被再引入至可在一些实施方案中用免疫净化化合物处理的受试者，并且由此，这些所移植经操控BM细胞至少部分地替换受试者的免疫系统。这个程序导致受试者的任何器官或组织中MPO的消减。如上所指示，MPO经消减BM细胞可从受试者，或替代地，从同种异体或同种同基因受试者获得。更具体来说，将这些自体或同种异体BM细胞移植至受试者，或换句话说，用显示MPO的经调节水平、表达和/或活性(例如消除的或降低的MPO水平、表达和/或活性)的BM细胞替换受试者的免疫系统细胞，导致对所述受试者的每个组织和器官中MPO的水平、表达、活性的调节，由此提供一种用于治疗任何MPO相关病症或疾患特别是AD、MS、P-ANCA相关病症和PAH，或由本发明公开的任何病症或疾患的新型和发明性方法。
如上所指示，本发明提供了用于治疗如上指定的病症的方法。如本文所用的术语“治疗”是指施用有效改善与疾病相关的非所需症状的治疗量的本发明组合物，特别是以上讨论的CRISPR系统或显示MPO的经调节表达的BM细胞，以在这类症状出现之前预防它们的显现，减缓所述疾病的进展，减缓症状的恶化，增强缓解时期的发生，减缓在疾病的进行性慢性阶段中引起的不可逆损害，延迟所述进行性阶段的发生，减轻严重性或治愈所述疾病，提高存活率或更快速恢复，或预防所述疾病发生，或以上两者或更多者的组合。治疗可在免疫相关、自体免疫、神经变性、呼吸、炎症性或增生性疾患初始显现时进行，或可为连续施用，例如每天超过一次，每1天至7天，每7天至15天，每15天至30天，每个月至两个月，每两个月至6个月，或甚至更长时间进行施用，以实现以上所列的治疗作用。
如上所指示，本发明还提供了一种甚至在疾病的任何症状的出现之前用于预防受试者的基于MPO的表达和/或活性的MPO相关病症的防治性工具。术语“防治”是指预防或降低组织、系统、动物或人类中由研究者、兽医、医师或其他临床医师设法阻止的生物或医学事件的发生，特别是与免疫相关、自体免疫、神经变性、炎症性或增生性疾患相关的病症的发生或复发的风险，并且术语“防治有效量”意指所施用活性成分的将实现这个目标的那个量。因此，在特定实施方案中，本发明方法在防治即预防与本文讨论的任何免疫相关、自体免疫、神经变性、炎症性或增生性病症相关的疾患方面是特别有效的。因此，通过本发明方法来治疗或施用以组合物的受试者经受与所述神经变性、血管和/或炎症性病症相关的症状的可能性较小，所述症状也较不可能再发生在已在过去经受它们的受试者中。
如本文提及的术语“改善”涉及通过本发明的组合物和方法来致使症状减轻以及受试者的状况改善，其中所述改善可以抑制与本文所述的免疫相关、自体免疫、神经变性、炎症性或增生性病症相关的病理性过程，显著降低它们的等级，或改善患病受试者生理状态的形式表现。
术语“抑制”以及这个术语的所有变化形式意图涵盖限制或阻止病理性症状的进展和恶化或病理性过程进展，所述病理性过程症状或过程是相关的。
术语“消除”涉及对病理性症状以及可能病理性病因的实质性根除或移除，任选地，根据本文所述的本发明方法来达成。
术语“延迟”或“延迟发作”以及它们的所有变化形式意图涵盖减缓与免疫相关、自体免疫、神经变性、炎症性或增生性病症和它们的症状相关的病症的进展和/或恶化，减缓它们的进展、进一步恶化或发展，以便相比于在不存在本发明的治疗下，更迟出现。
如上所指示，治疗或预防包括预防或延缓疾病的显现，预防或延缓症状的显现，并且/或者减轻将会显现或预期会显现的这类症状的严重性。这些还包括改善现有症状，预防额外症状，以及改善或预防症状的潜伏代谢原因。应了解如本文提及的术语“抑制”、“缓和”、“降低”或“减弱”涉及将某一过程，特别是任何免疫相关、自体免疫、神经变性、炎症性或增生性病症阻止、遏制或降低以下的中的任一者：约1％至99.9％，特别是约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％、或约99％至99.9％、100％或更多。
本发明涉及对有需要的受试者或患者的治疗。就“患者”或“有需要的受试者”来说，其意指可受以上提及的疾患影响，并且需要本文所述的预防性和防治性组合物和方法的任何生物体。更具体来说，本发明的一种或多种组合物、一种或多种药盒和一种或多种方法意图用于预防哺乳动物的病理性状况。就“哺乳动物受试者”来说，其意指需要提出的疗法的任何哺乳动物，包括人、家养和非家养哺乳动物，诸如犬和猫受试者、牛、猿猴、马和鼠受试者和啮齿动物。应注意，特别是在非人受试者的情况下，本发明方法可使用通过以下方式达成的施用来进行：注射、饮用水、饲料、喷雾、经口灌洗以及直接向有需要的受试者的消化道中施用。
应了解任何全身性或局部施用模式都可适用于本发明中。本发明的MPO靶向CRISPR系统或其任何组合物、或本发明的BM细胞群体或其任何组合物的施用途径包括但不限于直接BM注射或移植，通过在有或无泵装置下借助于颅内或脊柱内针和/或导管进行的递送来达成的脑内、脑室内、侧脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱周施用途径。应了解，在一些实施方案中，任何其他施用模式都可为可适用的，例如腹膜内(IP)、静脉内(IV)和真皮内、皮下、经鼻、经肺、口服和肌肉内施用。
在另一方面，本发明涉及包含呈游离形式，并且直接向待治疗的受试者施用的基因编辑化合物特别是至少是由本发明提供的MPO靶向CRISPR系统的药物组合物。或者，在一些其他实施方案中，本发明提供了包含BM细胞群体，并且特别是显示经调节MPO表达和/或活性的未分化BM细胞，诸如HSC的药物组合物，所述细胞全都具有MPO的经调节表达和/或活性。因此，在一些实施方案中，本发明的药物组合物可包含治疗有效量的以下中的至少一者：(a)至少一种能够/适合于调节有需要的受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。应注意本发明组合物可任选地还包含药学上可接受的一种或多种载体、一种或多种稀释剂和/或一种或多种赋形剂中的至少一者。
在一些实施方案中，药物组合物可包含治疗有效量的根据本发明的其他方面的至少一种如上文所述的基因编辑化合物。更具体来说，在一些实施方案中，至少一种基因编辑化合物是至少一种PEN或包含编码所述PEN的序列的任何核酸分子，或包含至少一种PEN、或编码这种PEN的任何核酸分子的任何药盒、组合物或运载体。在一些实施方案中，本发明组合物可包含可为至少一种包含至少一种CRISPR/cas系统的PEN的基因编辑化合物。在更具体实施方案中，包含在本发明的组合物内的CRISPR/cas系统可包含以下中的至少一者：(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列。应了解本发明的组合物可包括包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
在一些实施方案中，本发明的组合物的cas蛋白可为1类和2类CRISPR相关系统中的至少一者的成员。在一些具体实施方案中，包含在本发明的组合物内的Cas蛋白可为1类和2类，具体来说是II型、I型、III型、IV型、V型和VI型中的任一者的CRISPR相关系统中的至少一者的成员。在更具体实施方案中，这种cas蛋白可为2类II型CRISPR相关系统的成员。此外，在一些实施方案中，本发明的药物组合物可包含Cas9或其任何片段、突变体、变体或衍生物作为Cas蛋白。
因此，在一些实施方案中，本发明的组合物可包含CRISPR/Cas基因编辑系统。在一些实施方案中，这个系统可包含两种元件，即至少一种gRNA和至少一种Cas9或其任何突变体、片段或变体。应了解两种元件可以gRNA和多肽(cas9)形式，或以编码这些元件的核酸序列形式提供。在一些实施方案中，编码gRNA的核酸序列可单独提供，或提供在还包含编码Cas9多肽的核酸序列的核酸分子中，特别是在单一核酸分子或载体中。在一些其他实施方案中，本发明的组合物可任选地还包含药学上可接受的一种或多种载体、一种或多种稀释剂和/或一种或多种赋形剂中的至少一者。在一些其他实施方案中，本发明的组合物可包含至少一种靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA。更具体来说，在一些实施方案中，本发明的gRNA或crRNA可靶向人MPO基因的包含如由SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46以及SEQ ID NO.94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105和106表示的核酸序列或其任何片段的原间隔体。在一些特定实施方案中，可用于本发明组合物中的crRNA(gRNAs)可包含如由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、47以及SEQ ID NOS.50、55、60、63、66、71、74、77、80、85、88和91中的任一者表示的核酸序列。在一些其他实施方案中，使用靶向小鼠MPO基因中的原间隔体的gRNA，这类gRNA可包含如由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中的任一者表示的核酸序列。如上所指示，在一些替代性实施方案中，本发明的药物组合物可包含治疗有效量的展现MPO的经调节表达和/或活性的BM细胞群体，特别是未分化BM细胞群体。本发明的组合物可包括药盒，所述药盒包括细胞群体或其与以上讨论的基因编辑化合物的任何组合。在一些实施方案中，药物组合物可任选地还包含药学上可接受的一种或多种载体、一种或多种稀释剂和/或一种或多种赋形剂中的至少一者。
如上文所述，显示MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体可包含经分离HSC和/或祖细胞。此外，在一些实施方案中，本发明组合物的未分化BM细胞可为用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。应了解，在一些实施方案中，未分化BM细胞群体可属于自体来源或属于同种异体来源。本发明还涵盖对同种同基因来源的细胞的使用。
在一些其他实施方案中，包含在本发明的组合物内的未分化BM细胞群体可为同种异体受试者的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的BM细胞群体。应了解在上文中与本发明的任何其他方面关联加以公开的任何细胞都还可适用于与当前方面关联。
在某些实施方案中，本发明的组合物可适用于在如本文所述的用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或疾病或延迟所述疾患或疾病的发作的方法中使用。更具体来说，在一些实施方案中，本发明的组合物可适用于治疗可为免疫相关病症、神经变性病症、增生性病症、呼吸病症、血管病症或它们的任何组合中的至少一者的MPO相关疾患。在一些其他具体实施方案中，这种免疫相关病症可为自体免疫病症和炎症性病症中的至少一者。根据特定实施方案，本发明提供了用于治疗自体免疫病症，诸如MS；ANCA相关疾患，特别是AAV、AAGN、NCGN和RPGN；以及SLE中的任一者的组合物。在一些其他具体实施方案中，本发明的组合物可适用于神经变性病症，在一些具体实施方案中，诸如AD或PD的神经变性病症。在一些其他实施方案中，本发明的药物组合物可适用于治疗增生性病症，特别是癌症。本发明的其他实施方案提供了本发明的药物组合物用于治疗炎症性疾病特别是动脉粥样硬化、RA和IBD中的任一者的用途。在一些其他实施方案中，本发明提供了本发明的药物组合物用于治疗呼吸疾病特别是用于治疗PAH的用途。在一些替代性实施方案中，本发明涵盖对导致MPO的表达和/或活性的增加的药物组合物的提供。在一些实施方案中，本发明还提供了用于治疗具体地如上文讨论的与MPO缺乏相关，涉及例如H2O2水平升高的病症的组合物。应了解由本发明与本发明的其他方面关联加以公开的任何病症或疾患或与其相关的任何阶段、症状都还可适用于与这个方面，具体来说是本发明的组合物关联。
本发明的药物组合物可在施用之前掺混于药学上可接受的载体中。治疗性制剂可以任何常规剂量制剂施用。制剂通常包含至少一种如上定义的活性成分以及一种或多种从可与其他成分相容，并且不对患者有害的意义上说的药学上和生理上可接受的载体。在一些具体实施方案中，本发明的药物组合物可适于注射。适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且就存在容易可注射性而言必须是流体。使用胶束制剂、脂质体和纳米粒子例如金纳米粒子的纳米级药物递送系统是用于合理药物递送的新兴技术，所述递送提供改进的药物代谢动力学性质、受控制和持续的药物释放，并且更重要的是，较低的全身性毒性。因此，在一些实施方案中，基于纳米粒子的递送可用于递送本发明的CRISPR系统。特别需要的溶液允许在外部触发囊封化合物的释放。如果药物递送载体诸如胶束、脂质体或聚电解质多层囊体并有纳米粒子(NP)致动器，那么可实现外部控制释放。更具体来说，相较于传统形式的药物，受控药物递送系统(DDS)具有若干优势。
因此，应了解本发明还涵盖使用各种纳米结构作为药物递送系统中的载体，所述纳米结构包括胶束制剂、脂质体、聚合物、树状体、金属特别是金、硅或碳材料、聚合纳米粒子和磁性纳米粒子。术语“纳米结构”或“纳米粒子”在本文中用于表示直径小于约100nm的任何微观粒子。在一些其他实施方案中，载体是脂质的组织化集合。本发明的药物组合物通常包含缓冲剂，即调整所述药物组合物的容积摩尔渗透浓度的剂，以及任选的一种或多种如本领域中已知的药学上可接受的载体、赋形剂和/或添加剂。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂等。关于药物活性物质使用这类介质和剂在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或剂与活性成分不相容，否则预期它用于治疗性组合物中。用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、于水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、小袋剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可为合乎需要的。
在一些其他实施方案中，特别是在公开体内应用时(例如施用CRISPR/Cas系统或编码所述系统的任何核酸序列)，多种施用模式可为可适用的，因此，本发明的组合物可适合于由本发明公开的任何施用模式，特别是腹膜内(IP)、静脉内(IV)、胃肠外、以及真皮内、皮下、经表面、经鼻、经肺、口服、髓内、肌肉内、舌下、经颊、经直肠、经阴道施用。在一些其他实施方案中，特别是对于呼吸病症，经肺施用被视为一种优选施用模式。术语“施用”在涉及治疗呼吸病症时优选是通过经口吸入或通过腹膜内注射进行的经肺递送，所述经口吸入诸如通过使用液体雾化器、基于气雾剂的定量吸入器(MDI)或干燥粉末分散装置来进行。或者，施用可为舌下、经颊、胃肠外、静脉内、肌肉内、皮下、髓内或经皮施用中的任一者。
此外，在另一方面，本发明提供了供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用的治疗有效量的以下中的至少一者：(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。在一些实施方案中，未分化BM细胞群体是用至少一种能够调节细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。
在一些其他实施方案中，基因编辑化合物是至少一种包含至少一种CRISPR/cas系统的PEN，所述CRISPR/cas系统包含以下中的至少一者：(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
在本发明的某一其他方面，本发明提供了治疗有效量的至少一种基因编辑化合物制备用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或疾病或延迟所述疾患或疾病的发作的组合物的用途，所述基因编辑化合物能够调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性。
在本发明的某一其他方面，本发明提供了治疗有效量的展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体制备用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或疾病或延迟所述疾患或疾病的发作的组合物的用途。
在另一方面，本发明提供了一种治疗药盒，所述治疗药盒包括：以下中的至少一者：(a)至少一种能够调节有需要的受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
此外，在一些其他方面，本发明涉及至少一种用至少一种能够调节细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的未分化BM细胞。
在一些具体实施方案中，细胞可属于罹患MPO相关疾患的受试者。在某一其他替代性病症中，细胞可属于同种异体或同种同基因受试者。应了解由本发明公开的任何细胞和任何基因编辑化合物都还可适用于这个方面。
在一些其他实施方案中，本发明提供了供在用于调节哺乳动物受试者中MPO的表达和/或活性的方法中使用的本文公开的任何细胞。在一些其他实施方案中，本发明提供了供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用的本文公开的任何细胞。
应了解由本发明公开的任何MPO病症都还可适用于当前方面。此外，应了解由本发明与本发明的任何方面关联加以公开的所有细胞、基因编辑系统都还可适用于由本发明公开的任何其他方面。
如上所指示，MPO涉及于NETosis中，因此，通过调节MPO的水平、表达和/或功能，本发明还提供了一种用于调节NETosis的方法。因此，在一些其他方面，本发明提供了用于调节特别是受试者中的NETosis的方法。此外，通过提供用于抑制MPO表达和/或活性的方法，在本发明的一些实施方案中，本发明还提供了用于抑制、消除或降低特别是有需要的受试者中的NETosis的方法和组合物。在一些其他实施方案中，应了解本发明提供了用于治疗和预防受试者的任何NETosis相关病症和疾患的方法和组合物。在刺激后，嗜中性白细胞快速活化NADPH氧化酶以产生超氧化物，即会歧化成过氧化氢(H2O2)的高度反应性分子。H2O2由MPO消耗以产生次氯酸(HOCl)和其他氧化剂。MPO还为NET形成所需，如完全缺乏MPO的供者中所示，但它的作用仍不明确。尽管ROS具有细胞毒性，但它们还是通过氧化特定氨基酸残基来调控蛋白质功能的重要信号传导介体。然而，因为ROS是高度反应性的短命分子，所以不明确它们如何能够产生特定细胞应答。具体地说，在NET形成期间，不知ROS是否以及如何调控NE从颗粒选择性易位至核。此外，随着核在NET形成期间开始解凝，嗜中性白细胞趋化性通过未知机制而受到遏止。因此，在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于调节嗜中性白细胞的性质和功能的方法。
如本文所用的术语“约”指示数值可偏离高于或低于提及的数值多达1％，更特别是5％，更特别是10％，更特别是15％，并且在一些情况下多达20％，偏差范围包括整数值，并且如果可适用，也包括非整数值，构成连续范围。在一些实施方案中，术语“约”是指±10％。
术语“包含”“包括”、“具有”以及它们的同根变形词意指“包括但不限于”。这个术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。短语“基本上由……组成”意指组合物或方法可包括额外成分和/或步骤和/或部位，但仅当所述额外成分和/或步骤不实质上改变所要求保护的组合物或方法的基本和新型特征时。在整篇本说明书以及随后实施例和权利要求中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和变化形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应被理解为暗示包括一个陈述的整数或步骤或一组陈述的整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或任何其他组整数或步骤。
除非明确相反指示，否则如本文在说明书中以及在权利要求中所用的不定冠词“一个(种)(a/an)”应被理解为意指“至少一个(种)”。必须注意，除非内容另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”包括复数个(种)指示物。
如本文在说明书中以及在权利要求中所用的短语“和/或”应被理解为意指这样联合的要素中的“任一者或两者”，即要素在一些情况下结合存在，而在其他情况下分离存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同方式加以解释，即这样联合的要素中的“一者或多者”。除通过“和/或”条项来明确标识的要素以外的其他要素可任选地存在，无论与明确标识的那些要素相关还是无关。因此，作为一非限制性实例，提及在与开端措辞诸如“包含”联合使用时的“A和/或B”在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B以外的要素)；在另一实施方案中，仅指B(任选地包括除A以外的要素)；在另一实施方案中，指A与B两者(任选地包括其他要素)；等。
如本文在说明书中以及在权利要求中所用，“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同含义。举例来说，当分隔清单中的条目时，“或”或“和/或”应解释为是包括性的，即包括许多要素或一列要素中的至少一者，但还包括超过一者，以及任选的额外未列条目。只有明确相反指示的术语，诸如“……中的仅一者”或“……中的恰好一者”，或当在权利要求中使用时的“由……组成”，将指包括许多要素或一列要素中的恰好一个要素。一般来说，当前置有排他性术语诸如“任一”、“中的一者”、“中的仅一者”或“……中的恰好一者”时，如本文所用的术语“或”只应解释为指示排他性替代方案(即“一者或另一者而非两者”)。“基本上由……组成”在用于权利要求中时将具有它的如在专利法领域中所用的普通含义。
如本文在说明书中以及在权利要求中所用，关于一列一个或多个要素的短语“至少一个(种)”应被理解为意指至少一个(种)选自这列要素中的任何一者或多者的要素，但未必包括至少一个(种)在这列要素内明确列出的各个和每个要素，并且不排除这列要素中的要素的任何组合。这个定义还允许除在短语“至少一个(种)”所涉及的一列要素内明确标识的要素以外的要素可任选地存在，无论与明确标识的那些要素相关还是无关。因此，作为一非限制性实例，“至少一个(种)A和B”(或同等地，“至少一个(种)A或B”，或同等地，“至少一个(种)A和/或B”)在一个实施方案中可指至少一个(种)，任选地包括超过一个(种)A，B不存在(并且任选地包括除B以外的要素)；在另一实施方案中，指至少一个(种)，任选地包括超过一个(种)B，A不存在(并且任选地包括除A以外的要素)；在另一实施方案中，指至少一个(种)，任选地包括超过一个(种)A，以及至少一个(种)，任选地包括超过一个(种)B(并且任选地包括其他要素)；等。
还应了解，除非明确相反指示，否则在本文所要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序未必限于叙述方法的步骤或动作所采用的顺序。
如上文叙述以及如以下权利要求章节中要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验性支持。
尽管加以公开和描述，但应了解本发明不限于本文公开的特定实例、方法步骤和组合物，因此，方法步骤和组合物可在某种程度上变化。还应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的而使用，并且不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅由随附权利要求及其等同物限制。
以下实施例代表由本发明者在实施本发明的方面时所采用的技术。应了解尽管这些技术示例了对于实施本发明来说是优选的实施方案，但本领域技术人员鉴于本公开将认识到可在不脱离本发明的精神和预定范围的情况下进行众多修改。
实施例
试剂
MOG35–55(特拉维夫大学布拉瓦尼克中心(Blavatnik center,Tel AvivUniversity))
IFA(Sigma)
结核分枝杆菌(MTB，H37Ra，Difco)
百日咳毒素(PT，Sigma)
氯胺酮(Bremer)。
甲苯噻嗪(Phibro)。
叠氮化钠(Sigma,USA)。
伊文思蓝染料(sigma)。
转脂胺2000(Invitrogen)
限制酶
BsmBI(NEB)。
T4 DNA连接酶(NEB)
质粒
pL-CRISPR.EFS.GFP(Addgene，目录号57818)。
试剂盒
磁性细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)。
DNeasy(Qiagen)。
ViraPower无启动子慢病毒Gateway试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。
Lenti-X p24快速滴定试剂盒(Clontech,Mountain View,CA,USA)。
抗体
小鼠抗髓过氧化物酶抗体(abcam)；兔抗嗜中性白细胞弹性蛋白酶抗体(abcam)；兔抗Iba1抗体(abcam)；大鼠抗GFAP抗体(Invitrogen)；大鼠抗CD3抗体(R&D Systems)；小鼠抗τ蛋白抗体(abcam)；小鼠抗淀粉样蛋白β抗体(Covance)；小鼠抗寡树突细胞抗体(Merck)。
细胞
感受态大肠杆菌细胞(JM109，Promega)、293T细胞(ATCC，CRL-3216TM)。
培养基和补充剂
Stemspam SFEM培养基(Stem cell technologies)、TPO、SCF(Peprotech)。
动物
C57BL/6(Arlan)；
MpoTm1/Lus(4265，Jackson labs)，这些突变小鼠由于髓过氧化物酶缺乏而显示杀真菌活性受损。在高脂血症性状况下，突变小鼠相比于对照小鼠显现更大动脉粥样硬化性病变。这些小鼠可用于研究针对病原体的全身性炎症性防御。
5xFAD小鼠(34840，Jackson labs)。
实验程序
动物舍饲
将C57BL/6、MpoTm1/Lus和5xFAD小鼠放置在光受控环境(12小时光照/黑暗循环)中，并且在单独通风的笼(IVC)中舍饲，自由获取食物和水。所有动物研究都由特拉维夫大学的动物护理、使用和评审委员会批准(附录B–核准编号01-17-069和01-18-010)。
小鼠照射和细胞移植
对接受小鼠给与来自γ辐照源(Biobeam GM)的9Gy(3Gy/分钟)全身致死性照射。在照射之后24小时，使用27规格针，通过尾部静脉来将2x106个新鲜分离的骨髓细胞或5000个经慢病毒转导HSC静脉内注射至接受小鼠中。对小鼠进行监测，并且每隔一天进行称重，持续之后8周。
血液样品MPO分析
对于MPO敲低的验证，在移植之后8周从面静脉获取200μl血液。使用ADVIA2120i(Siemens)血液学系统分析血液样品的过氧化物酶活性。
骨髓分离和HSC富集
将C57BL/6(Arlan)或MpoTm1/Lus(Jackson labs)供给小鼠处死，并且使用27规格针从股骨、胫骨和肱骨收集骨髓。使红细胞溶解，并且立刻移植细胞，或使用磁性细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)使细胞经受富集以获得谱系细胞。在补充以50ng/ml TPO和100ng/ml SCF(Peprotech)的Stemspam SFEM培养基(Stem cell technologies)中培养细胞。
EAE模型诱导
用在补充以4mg/ml结核分枝杆菌(MTB，H37Ra，Difco)的IFA(Sigma)中乳化的300μg MOG35–55(如由SEQ ID NO:7表示的MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，特拉维夫大学布拉瓦尼克中心)在三个注射部位处对14-16周龄C57BL/6小鼠进行皮下免疫。在免疫后第0和2天，腹膜内施用处于200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的300ng百日咳毒素(PT，Sigma)。每日监测疾病严重性，并且根据以下量表对EAE临床疾病评分：0，无麻痹；0.5，部分丧失尾部紧张性；1，完全丧失尾部紧张性；2，后肢无力以及部分后肢麻痹；3，完全后肢麻痹；4，后肢麻痹以及前肢无力或部分前肢麻痹，5，濒死状态；6，死亡。
行为检查
从七月龄开始实施行为检查。在开始检查之前两周，使小鼠适应于逆转的光照环境。在每次试验之前，在开始试验习惯形成(habituation)之前30分钟，将小鼠转移至行为测试室中。在四种处理和基因型之间，试验的顺序是均衡的。在试验之间用Virusolve+清洁迷宫。通过自动化跟踪系统(Ethovision，Noldus)来记录、监测和分析旷场、高架十字迷宫、Y型迷宫和莫里斯水迷宫测试。
进行旷场测试以评估风险评估/焦虑相关行为。测试在白色有机玻璃空场地(50x50x40cm)中进行。小鼠被放置在场地的中心，并且可对场地探究15分钟。测量行进的总距离以及在迷宫的中心和迷宫的角落花费的时间。
进行高架十字迷宫测试以评估风险评估/焦虑相关行为。测试在由四个十字形白色有机玻璃臂(35x5cm)组成，并且从地面提升40cm的设备中进行。彼此面对的两个臂由15cm高的墙壁包围，而另外两个臂是敞开的。将小鼠面对闭合臂放置在迷宫的中心，并且持续7分钟对小鼠进行记录。测量在迷宫的敞开或闭合臂中花费的时间。从分析排除从敞开臂掉落的小鼠。
Y型迷宫：进行双试验Y型迷宫测试以评估空间记忆。测试在具有38cm的臂长、5cm的臂宽和15cm的臂高的白色有机玻璃Y形设备中进行。测试由样例试验和测试试验组成。在样例试验中，将小鼠面向墙壁放置在迷宫的一个臂的末端，同时，迷宫的一个臂被封阻，并且小鼠可对迷宫的两个臂探究5分钟。样例试验继之以5分钟试验间间隔。在测试试验中，使小鼠返回至迷宫中，所有臂都打开，再持续5分钟。持续测试试验的第一分钟测量新异臂进入(新异臂进入次数/总体臂进入次数)和新异臂探索时间(新异臂探索时间/总体臂探索时间)。
进行莫里斯水迷宫测试以评估空间学习。测试在填充有用脱脂奶使得不透明的水的池(150cm直径，30cm深)中进行。将黑色矩形、三角形和圆形线索放置在池壁上。水温是27±1℃。将透明平台(12cm x 12cm)放置在池的一个象限的中心，在水面以下约2cm。每只小鼠连续5天每天进行四次试验，每天从不含有平台的三个象限中的不同象限开始。在每次试验中，将小鼠放置至水中，并且允许其有60秒来发现隐藏平台。如果小鼠未能在60秒内发现平台，那么将它引导至平台，并且允许它在那里停留10秒。记录每只小鼠用以在60秒内发现隐藏平台的潜伏期以及总行走距离。未能发现平台的小鼠被评分为在60秒内到达平台。
进行恐惧条件化测试以评估联想记忆。测试在恐惧条件化腔室(Ugo Basile，17x17x 25cm)中进行。在第1天，将小鼠放置在腔室中，持续5分钟以进行习惯形成。在第2天，将小鼠再次放置在腔室中，持续3.5分钟。在2分钟之后，小鼠接受间隔一分钟的两次足部电击(0.8mA，2s)。在第3天，将小鼠放置在腔室中，持续3分钟。通过对僵直行为-除呼吸之外不存在所有动作-评分来评估恐惧条件化。
组织学
用氯胺酮/甲苯噻嗪(分别是100和10mg/kg)的混合物对小鼠进行腹膜内注射。接着，使用电动泵，依次用PBS和冰冷的含4％多聚甲醛(PFA)的PBS对小鼠进行心内灌注。将脑移除，并且在4℃下在4％PFA中后固定24小时，接着在30％蔗糖中低温保存。随后，将脑于具有0.02％叠氮化钠(Sigma,USA)的PBS中在4℃下储存直至免疫组织化学处理。使经蔗糖处理的脑干燥，接着于2-甲基丁烷中在液氮中快速冷冻。使用低温恒温器将脑切片(10μm)，并且直接封固至载片上以进行分析。将薄片用补充以10％正常山羊血清、1％牛血清白蛋白和0.5％曲通-100(Triton–100)的PBS封闭和-可渗透化处理1小时，并且与初级抗体一起孵育过夜，随后与二级抗体一起孵育1小时。
免疫染色
将脑于在液氮中冷却的2-甲基丁烷中快速冷冻，并且在切割之前包埋在OCT中。使用冷冻滑动切片机(Leica CM1850)切割冠状缝切面(10μm)，并且在–20℃下储存直至使用。对于S100β免疫染色，将载片用PBS洗涤两次，用含1％牛血清白蛋白、5％山羊血清(Biological Industries,Israel)和0.05％曲通-X(Sigma-Aldrich)的PBS封闭和可渗透化处理一小时，并且与S100β抗体(1:500，ab66028，Abcam)一起在4℃中孵育过夜。将载片用PBS洗涤3次，并且与二级山羊抗小鼠抗体(1/700，Alexa-Flour)一起在室温下孵育1小时。将DNA用DAPI(1:1000，Sigma-Aldrich)染色。对于硫代黄素S(ThioS)染色，使载片与0.01％ThioS 50％乙醇溶液一起孵育8分钟。接着使薄片与80％乙醇一起短暂孵育两次，每次十秒，并且用双蒸水(DDW)洗涤两次。
共焦成像
使用共焦显微镜LSM710(Carl Zeiss Micro Imaging)获得荧光图像。使用10×和20×物镜(NA分别＝0.3、0.8,平场复消色差透镜)捕捉共焦图像。使用由制造商提供的滤波器组检测由分别针对EGFP和CY3的Ar 488和543nm激光线所致的荧光发射。对于DAPI检测，我们在720nm的波长下使用我们的锁模Ti:蓝宝石飞秒脉冲多光子激光器(ChameleonUltra II，Coherent,Inc.)。使用Zeiss ZEN 2011软件(Carl Zeiss,Inc.)产生图像。所有图像都以TIF输出，并且使用ImageJ来优化它们的对比度和亮度。使用ImageJ分析S100β平均强度和ThioS斑块密度。
用于RNA和蛋白质分析的组织收集
对于RNA和蛋白质分析，用氯胺酮/甲苯噻嗪使小鼠麻醉，并且立刻用PBS灌注。将脑移除，并且解剖海马，分成左侧和右侧半球，在液氮中快速冷冻，并且在–80℃下储存直至使用。对于骨髓RNA分析，收集股骨，并且通过用27G针冲洗来将骨髓提取至PBS中。将骨髓细胞于Tri试剂(Sigma)中冷冻，并且在–80℃下储存直至使用。
蛋白质提取和Western印迹
使海马解冻，并且于补充以蛋白酶抑制剂(Roche)的溶解缓冲液(200mM HEPES、5mM EDTA、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、1mM Na2VO4、150mM NaCl和50mM NaF)中均质化。在4℃下将细胞孵育一小时。通过在4℃下在14,000×g下离心20分钟来使蛋白质澄清。利用PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific)来定量蛋白质浓度。来自每个样品的25μg蛋白质在SDS-PAGE中加以分辨。将硝化纤维素经转移膜用含5％牛血清白蛋白的0.1％吐温20PBS封闭一小时，并且用山羊抗APOE抗体(1:10,000，Chemicon)在4℃中探测过夜，并且用山羊抗肌动蛋白抗体(1:5000，MAB1501，Milipore)在室温下探测一小时，随后与山羊抗小鼠二级抗体(1:5,000，Licor)一起在室温下孵育一小时。使用Odyssey系统(Licor)和Image Studio Lite 5.2软件进行条带强度的显影和分析。对于每个样品，将APOE结果以肌动蛋白作归一化。
RNA提取和实时PCR
使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)提取海马RNA。来自骨髓样品的RNA如先前所述加以提取，并且使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)加以净化。使用verso cDNA合成试剂盒(Thermo-Scientific)使RNA逆转录成互补性DNA(cDNA)。使用Syber-Green主混合物(Thermo-Scientific)和定制设计引物，在Step-One实时PCR系统上进行半定量PCR。一式三份测定阈值循环值，并且呈现为相较于肌动蛋白的平均值。使用2-ΔΔCT方法计算倍数变化。
引物组清单(全都针对小鼠基因)
APOE正向5′-GAGCTGATCTGTCACCTCCG-3′(SEQ ID NO:17)和反向5′-GACTTGTTTCGGAAGGAGC-3′(SEQ ID NO:18)；CCL2正向5′-GGGATCATCTTGCTGGTGAA-3′(SEQID NO:19)和反向5′-AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3′(SEQ ID NO:20)；CXCL10正向5′-AACTGCATCCATATCGATGAC-3′(SEQ ID NO:21)和反向5′-GTGGCAATGATCTCAACAC-3′(SEQ IDNO:22)；IL1β正向5′-GGAGAACCAAGCAACGACAAAATA-3′(SEQ ID NO:23)和反向5′-TGGGGAACTCTGCAGACTCAAAC-3′(SEQ ID NO:24)；MPO正向5′-TGGTGGCCTGCAGAGTATGA-3′(SEQ ID NO:25)和反向5′-GTTGAGGCCAGTGAAGAAGG-3′(SEQ ID NO:26)；S100β正向5′-TTGCCCTCATTGATGTCTTCCA-3′(SEQ ID NO:27)和反向5′-TCTGCCTTGATTCTTACAGGTGAC-3′(SEQ ID NO:28)；TNFα正向5′-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′(SEQ ID NO:29)和反向5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3′(SEQ ID NO:30)；VCAM1正向5′-GGAGCCTGTCAGTTTTGAGAATG-3′(SEQ ID NO:31)和反向5′-TTGGGGAAAGAGTAGATGTCCAC-3′(SEQ ID NO:32)。
统计分析
所有数据都表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism 7进行统计分析。使用未配对史都登氏t检验(unpaired student’s t-test)分析行为数据以及骨髓MPO mRNA水平。其他mRNA分析、印迹定量、S100β强度定量和ThioS斑块密度使用曼-惠特尼非参数检验来分析。对于所有测试，将统计显著性阈值设置成p<0.05。
BBB可渗透性测定
将2％伊文思蓝染料盐水溶液(4ml/kg体重)腹膜内注射至小鼠中。在注射之后一小时，用PBS灌注小鼠，并且获取脑和脊髓并加以均质化。在610下测量来自匀浆的上清液的吸光度，从而指示伊文思蓝穿透。
MPO CRISPR/Cas9质粒克隆
使用Azimuth 2.033工具设计小鼠MPO靶向引导RNA(gRNA)，即如由SEQ ID NO:5表示的gRNA-3(CCCCAACGATCAGCTGACCA)和如由SEQ ID NO:6表示的gRNA-4(CAGCGGGGTGTACGGCAGCG)，以及如由SEQ ID NO:8表示的gRNA2(GCACTCATGTTCATGCAGTG)和如由SEQ ID NO:9表示的gRNA 6(TGCGATACTTGTCATTCGGT)。用BsmBI(NEB)消化pL-CRISPR.EFS.GFP质粒(由Benjamin Ebert赠与，addgene质粒编号57818)，并且使用T4 DNA连接酶(NEB)连接gRNA序列。将经连接质粒转化至感受态大肠杆菌细胞(JM109，Promega)中，使用氨苄青霉素选择，并且通过桑格尔(Sanger)测序来验证插入物连接。MPO靶向通过转染至293T细胞中，继之以DNA提取(DNeasy，Qiagen)和桑格尔测序来评估。
慢病毒粒子产生
使用ViraPower无启动子慢病毒Gateway试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)克隆经连接质粒。使用转脂胺2000(Invitrogen)，将质粒(3μg)与包装质粒(9μg)：pLP1、pLP2和pLP/VSVG一起共转染至293T生产细胞系中。使用Lenti-X p24快速滴定试剂盒和制造商的推荐程序(Clontech,Mountain View,CA,USA)测定慢病毒滴度。
经分离HSC的慢病毒转导
在分离之后24小时，在4μg/ml聚凝胺和1μg/ml雷帕霉素存在下用MPO CRISPR/Cas9慢病毒转导HSC。经转导细胞被立刻移植至以致死方式照射的小鼠中，或离体生长以进行CRISPR/Cas9活性分析。在培养1天之后，GFP表达是明显的。
实施例1
在多发性硬化症的EAE模型中靶向MPO
EAE，或实验性过敏性脑脊髓炎，是中枢神经系统(CNS)的诱发性炎症性脱髓鞘疾病，其作为包括但不限于多发性硬化症(MS)和急性播散性脑脊髓炎(ADEM)的人CNS脱髓鞘性疾病的动物模型被广泛接受。EAE可在包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔和灵长类动物的许多物种中加以诱发。疾病诱发通常通过使动物暴露于各种抗原来进行。最通常使用的抗原是脊髓匀浆(SCH)、纯化髓磷脂、髓磷脂蛋白诸如髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂蛋白脂质蛋白(PLP或亲脂素)和髓磷脂寡树突细胞糖蛋白(MOG)、或这些蛋白质的肽，全都会导致具有关于免疫学与病理学两者的不同疾病特征的独特模型。
视所用抗原和动物的遗传组成而定，啮齿动物可显示EAE的单相发作、复发-缓解形式、或慢性EAE。典型易感啮齿动物将在免疫之后约两周首现临床症状，并且将呈现复发-缓解性疾病的症状。可使用C57BL/6雌性小鼠进行对多发性硬化症的建模，其中用髓磷脂-寡树突细胞糖蛋白肽(MOG)诱发疾病。这个模型代表疾病的进行性(也被称为慢性)形式。实验程序中指示的评分指数用于监测疾病的严重性和复发的发生以确定调节，并且具体来说是降低或抑制MPO表达和/或活性的本发明的组合物和药盒的治疗作用。
EAE模型的建立
通过用含有MOG35-55肽的佐剂使成年雌性小鼠免疫以及用百日咳毒素(PT)进行2次免疫来诱发MS的EAE模型。为确定这些物质的为建立EAE模型所需的最小量，用200μgMOG35-55和200ng PT、200μg MOG35-55和300ng PT、或300μg MOG35-55和300ng PT使C57BL/6雌性小鼠免疫。尽管在前两种剂量之间在小鼠临床评分方面未显示差异，但300μgMOG35-55和300ng PT的较高剂量在所有经免疫小鼠中都激起严重疾病(图1)。这个结果指示这个剂量最适合于增强EAE疾病。
BM移植挽救对经照射C57BL/6小鼠的致死性
为确定照射剂量致死性和BM细胞移植的造血重构能力，对七只8周龄雄性C57BL/6小鼠进行照射(9Gy)，并且将它们中的五只通过尾部静脉来用一百万个新鲜分离的BM移植。如所预期，在48小时之后，所有小鼠都在重量方面显示4-10％下降(图2)。尽管所有经移植小鼠都显示急剧恢复，并且在2周内返回至它们的初始重量，但非经移植小鼠恶化，并且在13-15天之后死亡。这些结果指示所用9Gy剂量是致死性的。此外，用BM细胞移植的所有5只小鼠都能够在14天之后恢复，从而指示在移植后确实建立了完全造血重构。
为建立更加同质的细胞群体用于CRISPR-Cas9介导的KO实验，进一步富集BM细胞以获得造血祖细胞。这通过使用磁激活的细胞分选(MACS)富集BM中不表达成熟造血细胞的标志物的细胞(即Lin-细胞)来进行。为验证这些细胞保留造血重构潜能，也将这些细胞移植至以致死方式照射的C57BL/6小鼠中。与经BM移植小鼠类似，在48小时之后，这些小鼠也显示在重量方面急剧下降，继之以恢复和存活(图2)。这个结果暗示Lin-造血祖细胞保留它们的造血重构潜能，并且适用于CRISPR-Cas9 KO实验。
将来自MPOTm1/Lus的BM移植至EAE小鼠中
为评估髓系MPO缺乏在MS的EAE小鼠模型中的影响，如上所述以致死方式照射二十八只雌性C57BL/6小鼠，并且将源于正常表达MPO的WT C57BL/6小鼠或MPO剔除MpoTm1/Lus小鼠的BM细胞(1x106，于200μl中)移植至经照射EAE小鼠中。表1概述用于这个实验中的实验组。
表1：MpoTm1/Lus源性骨髓细胞EAE实验的分组
品系 小鼠的数目 照射 所移植细胞来源 EAE诱发
A C57BL/6 14 V C57BL/6 V
B C57BL/6 14 V Mpo<sup>Tm1/Lus</sup> V
C C57BL/6 14 X 不移植 V
D Mpo<sup>Tm1/Lus</sup> 4 X 不移植 V
通过如实验程序中所述测量疾病临床评分来评估MPO缺乏对EAE疾病过程的影响。所有实验组的小鼠都还通过死后分析来评估，所述分析考查EAE相关方面诸如神经元丧失、突触丧失和小胶质细胞增生，以及BBB可渗透性、白细胞向CNS中的浸润、小胶质细胞增生和NETosis率。
实施例2
在阿尔茨海默病(AD)的FAD模型中靶向MPO
将来自MpoTm1/Lus的BM移植至5xFAD小鼠中-考查过氧化物酶活性
为评估髓系MPO缺乏在AD的5xFAD小鼠模型中的影响，以致死方式照射70只雄性5xFAD，以及它们的非转基因同窝仔畜，并且将源于正常表达MPO的WT C57BL/6小鼠或MPO剔除(KO)MpoTm1/Lus小鼠的所移植BM细胞(1x106，于200μl中)移植至经照射AD小鼠中。实验组概述于表2中。在移植之后四周，84％的小鼠存活，并且返回至它们的初始重量(图3A至图3D)。在移植之后八周，测量来自经受WT或MPO KO BM细胞移植的小鼠的血液样品中的过氧化物酶活性。实际上，来自经受从MPO KO小鼠获得的BM细胞的移植的小鼠的血液样品显示较小过氧化物酶活性(图3E至图3F)，从而确认MPO KO细胞在这些小鼠中的MPO KO造血重构。
表2：MpoTm1/Lus源性骨髓细胞5xFAD实验的分组
Figure BDA0002944385390000491
Figure BDA0002944385390000501
将来自MpoTm1/Lus的BM移植至5xFAD小鼠中-考查MPO-mRNA水平
产生了成年5XFAD小鼠以及它们的非转基因同窝仔畜中的血液MPO缺乏。通过暴露于清髓性照射，使两月龄小鼠经受造血净化，继之以用源于MPO-KO或WT C57BL/6小鼠的骨髓(BM)细胞再增殖。这产生四个实验组；(1)WT具有WT BM(WT-WT)，(2)WT具有MPO-KO BM(WT-MPO KO)，(3)5XFAD小鼠具有WT BM(5XAD-WT)以及(4)5XAD具有MPO-KO BM(5XFAD-MPOKO)(图4A)。为确认用MPO-KO BM注射的小鼠中的MPO降低，进行MPO-mRNA表达分析。相较于对照中的高水平，在源于WT-MPO KO和5XFAD-MPO KO小鼠的BM中，MPO-mRNA水平几乎不可检测，从而指示经移植小鼠中造血群体的高效更换(图4B)。
MPO缺乏抑制5XFAD小鼠中的认知损害
考查了MPO KO对5XFAD小鼠中的认知损害的影响。为了这个目的，从7月龄开始，使经移植小鼠经受一系列行为检查(图4C)。在旷场测试中，已知的是5XFAD小鼠会显示风险评估受损，由在迷宫的中心而非周边花费更多时间所反映。实际上，相较于WT-WT小鼠，5XFAD-WT小鼠花费显著更少时间在迷宫的角落，并且更多时间在迷宫的中心。相比之下，相较于5XFAD-WT小鼠，5XFAD-MPO KO小鼠在迷宫的中心花费显著更少时间，并且展现与对照WT小鼠组类似的行为(图5A至图5B)。值得注意的是，在四个实验组之间在总行进距离方面未测得差异，从而指示运动能力类似(图5C)。
在高架十字迷宫中，WT小鼠倾向于在迷宫的闭合臂中花费更多时间，而5XFAD小鼠显示倾向于敞开暴露臂，从而反映受损的风险/焦虑相关评估。在这个实验中，5XFAD-WT小鼠与5XFAD-MPO KO小鼠两者均在敞开臂中花费显著更多时间，从而反映扰乱的风险评估行为。然而，相较于5XFAD-WT小鼠，5XFAD-MPO KO小鼠在迷宫的敞开臂中花费显著更少时间(图5D至图5E)。总之，这些结果指示MPO KO减轻了5XFAD小鼠的风险评估/焦虑相关行为。
接着，测试了MPO缺乏是否将抑制在5XFAD小鼠中观察到的认知减退。在Y型迷宫测试中，相较于WT-WT，5XFAD-WT小鼠显示降低的探索时间和更少进入新异臂中，而相较于5XFAD WT，5XFAD-MPO KO小鼠显示进入迷宫的新异臂中多约50％(图6A)。在5XFAD-WT小鼠与5XFAD-MPO KO小鼠之间未测得在探索时间方面的显著差异(图6B)。接着在莫里斯水迷宫中考查这些小鼠的空间学习能力。在试验的五天期间，从试验的第3天开始，5XFAD-WT小鼠显示用以发现平台的潜伏期显著较长，从而反映受损的空间学习(图6C)。然而，相较于5XFAD-WT小鼠，5XFAD-MPO KO小鼠显示显著更好的学习能力，由在第5天时用以发现平台的潜伏期显著更短所证明(图6C)。WT小鼠的学习改进还可反映在由小鼠行进的总距离方面，因为相比于在后期时，这些小鼠在前期时行进更长距离。尽管5XFAD-WT小鼠在整个试验中展现相对一致的行进距离，但随着测试进展，5XFAD-MPO KO小鼠显示更短行进距离，这类似于WT组(图6D)。最后，通过使用恐惧条件化测试来评估联想学习。在这个测试中，在用厌恶性足部电击进行条件化之后一天测量僵直行为。尽管WT-WT和WT-MPO KO小鼠显示约40％僵直行为，从而反映适当联想记忆再巩固，但5XFAD-WT小鼠显示显著更少的僵直行为。值得注意的是，在5XFAD小鼠的情况下，MPO缺陷性小鼠显示的僵直行为是2.45倍高的(图6E)。因此，在五种不同行为测试中证明了血液MPO缺乏抑制了AD的5XFAD模型中的认知功能损害。
MPO KO小鼠组显示类似淀粉样蛋白-β斑块负荷
在行为检查之后，将小鼠处死，并且对脑切片进行ThioS染色以确定MPO KO对斑块密度的影响。尽管WT小鼠组显示无可检测ThioS染色，但5XFAD-WT小鼠组与5XFAD-MPO KO小鼠组两者均显示类似高水平的淀粉样蛋白-β斑块，从而指示MPO KO对淀粉样蛋白-β在5XFAD小鼠的脑中的产生和积累不具有影响(图7A至图7E)。
5XFAD-MPO KO小鼠显示减轻的炎症
为评估MPO缺乏对脑炎症的影响，将海马切片用针对S100β的抗体染色。已知这个蛋白质在活化的星形细胞中过度表达，并且已牵涉于AD中的营养不良神经突形成中。如所预期，当相较于WT-WT小鼠时，5XFAD-WT小鼠在它们的海马中展现显著较高的S100β表达(图8A至图8M)。然而，5XFAD-MPO KO小鼠展现与5XFAD-WT小鼠类似的较低S100β水平，从而指示在这些小鼠中，炎症性应答受到更大限制。对海马mRNA样品的实时PCR(RT-PCR)分析也显示当相较于WT-WT小鼠时，5XFAD-WT小鼠中的S100β表达显著上调，由MPO缺陷性5XFAD小鼠中的受限制表达样式所反映(图8N)。
为进一步考查MPO缺乏对炎症的影响，使用RT-PCR来分析若干认定炎症性标志物的海马mRNA表达。MPO缺陷性5XFAD小鼠显示促炎性介体IL1β和CXCL10的表达水平显著减弱(图9A至图9B)，并且CCL2和TNFα表达在一定程度上降低(图9C至图9D)。引起关注的是，在5XFAD-WT小鼠中增强的VCAM1水平在5XFAD-MPO KO小鼠中减弱(图9E)。鉴于VCAM1与内皮损害的已知关联，这个结果可表明MPO KO对5XFAD小鼠中内皮完整性的有益作用。
MPO缺乏降低5XFAD小鼠中的APOE表达。
APOE基因型的ε4等位基因被视为散发性晚期发作型AD的最大遗传风险因素。尽管APOE在AD中的确切作用仍有争论，但APOE明确地在AD进展中起主要作用，并且已与和AD相关的许多病理性过程相关联，所述病理性过程包括淀粉样蛋白代谢和聚集以及τ蛋白病变。引起关注的是，发现APOE表达在5XFAD小鼠的脑中大幅增加。实际上，对海马蛋白质溶解产物的western印迹分析显示当相较于WT-WT小鼠时，在5XFAD-WT的脑中，APOE水平显著增加，而在5XFAD-MPO KO小鼠中，APOE水平是显著较低的(图10A、图10B)。这个结果关于RNA水平得到进一步验证(图10C)，从而指示MPO缺乏阻止了CNS内的APOE升高。
实施例3
使用CRISPR/Cas9技术在经分离HSC中进行MPO剔除
基于CRISPR/Cas9的基因改变被视为一种用于基于基因的疗法的高效平台。分离和离体培养靶标细胞有助于将这个方法用于造血谱系相关疾病。因此，本发明者利用这个平台在经分离HSC中进行慢病毒介导的MPO剔除。出于这个目的，分离骨髓细胞，并且使用基于磁性的细胞分选加以富集以获得HSC。将这些细胞用表达Cas9蛋白、GFP和靶向MPO的引导RNA(gRNA)的慢病毒载体转导。在培养24小时之后，FACS分选GFP阳性细胞，并且注射至以致死方式照射的模型动物中。对于产生靶向MPO的慢病毒载体，设计各种gRNA引物，并且克隆至pL-CRISPR.EFS.GFP质粒中。使用桑格尔测序验证适当连接。接着，这些质粒用于使用Virapower慢病毒包装试剂盒(Invitrogen)来产生慢病毒粒子。适当慢病毒组装和向造血干细胞(HSC)中的整合通过在升高浓度(0.5、2和10μl/200,00个细胞)下转导经分离HSC来评估。作为对照，使用GFP表达性慢病毒。在转导之后24和48小时的GFP分析确认HSC确实经转导(图11)，在培养24和48小时之后分别展现在最高考查浓度下33％和45％GFP+细胞。这些结果指示经分离HSC可被转导，并且在24小时之后加以FACS选择以移植至经照射小鼠中。
FACS分选GFP阳性细胞，并且注射至以致死方式照射的模型动物中。
用经慢病毒转导HSC进行的后续动物实验在EAE模型与5xFAD模型两者的情况下进行。不表达gRNA的慢病毒载体用作这些实验的对照。这些实验的分组描述于表3(关于EAE实验)和表4(关于5xFAD实验)中。
表3：经慢病毒转导HSC EAE实验的分组
品系 照射 所移植细胞来源 EAE诱发
A C57BL/6 V MPO-KO转导HSC V
B C57BL/6 V 无gRNA转导HSC V
C C57BL/6 V MPO-KO转导HSC X
D C57BL/6 V 无gRNA转导HSC X
E Mpo<sup>Tm1/Lus</sup> X 不移植 V
F Mpo<sup>Tm1/Lus</sup> X 不移植 X
表4：经慢病毒转导HSC 5XFAD实验的分组
品系 照射 所移植细胞来源
A 5xFAD V MPO-KO转导HSC
B 5xFAD V 无gRNA转导HSC
C 同窝仔畜 V MPO-KO转导HSC
D 同窝仔畜 V 无gRNA转导HSC
E 5xFAD X 不移植
F 同窝仔畜 X 不移植
实施例4
使用CRISPR/Cas9技术在人细胞(HEK293)中进行MPO剔除
用核糖核蛋白(RNP)复合物转染人HEK293细胞，所述复合物含有Cas9蛋白、经荧光标记的tracrRNA以及以下crRNA序列中的每一者，所述crRNA序列靶向人MPO编码序列(SEQID NO.33-35和42)和相应原间隔体(分别是SEQ ID No.43-46)；(PAM以粗体呈现)：
T173：TGCACATCCCGGTGATGGTG，如由SEQ ID NO:33所表示；
D260：CAGGGGTGAAGTCGAGGTCG，如由SEQ ID NO:34所表示；
H502：GGATGAGGGTGTGGCCGTAG，如由SEQ ID NO:35所表示；以及
C319：GGATGGTGATGTTGCTCCCG，如由SEQ ID NO:42所表示。
T173：
Figure BDA0002944385390000521
如由SEQ ID NO:43所表示；
D260：
Figure BDA0002944385390000522
如由SEQ ID NO:44所表示；
H502：
Figure BDA0002944385390000523
如由SEQ ID NO:45所表示；以及
C319：
Figure BDA0002944385390000524
如由SEQ ID NO:46所表示。
如由以下实施例5所指示，除用于剔除MPO基因的靶标之外，这些特定靶标也可用作导致形成蛋白质中的构象变化或原聚体生物合成和加工中的变化的氨基酸取代(C319A)、模拟人MPO缺乏症取代的取代(T173C)、干扰原聚体血红素结合的氨基酸取代D260A和H502A的HDR靶标。根据制造商方案(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)，使用Alt-R系统进行转染。在转染之后72小时，收集细胞以进行DNA提取，或加以FACS分选以富集用tracrRNA标记的细胞，再培养72小时，接着收集以进行DNA提取。根据制造商方案(Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)，使用T7核酸内切酶I(T7EI)错配检测测定分析DNA样品。更具体来说，T7EI测定用于评估在经编辑细胞的群体中CRISPR-Cas9试剂在给定引导RNA靶标位点处的基因编辑效率。
以下引物用于T7EI测定：
1.针对T173 gRNA：
正向引物(下游约182bp)：T173_T7_Fw：TCTTCCTCCAGGGAGTCTCA，如由SEQ ID NO:36所表示。
反向引物(下游约673bp)：T173_T7_Rv：GCAGGAAGGAGACAGGTCAT，如由SEQ ID NO:37所表示。
扩增子大小：915
2.针对D260 gRNA：
正向引物(下游约621bp)：D260_T7_Fw：TCTTCCTCCAGGGAGTCTCA，如由SEQ ID NO:36所表示。
反向引物(下游约234bp)：D260_T7_Rv：GCAGGAAGGAGACAGGTCAT，如由SEQ ID NO:37所表示。
扩增子大小：915
3.针对C319 gRNA：
正向引物(下游约263bp)：C319_T7_Fw：CCAGGTTCCCAGTTCAGTGT，如由SEQ ID NO:38所表示。
反向引物(下游约558bp)：C319_T7_Rv：CCACAGCGTTCTCTGTCCTT，如由SEQ ID NO:39所表示。
扩增子大小：881
4.针对H502 gRNA：
正向引物(下游约297bp)：H502_T7_Fw：ATGCCTCTCAGTGCCACTCT，如由SEQ ID NO:40所表示。
反向引物(下游约566bp)：H502_T7_Rv：AGCCAGGTCAGGGGAAGTAT，如由SEQ ID NO:41所表示。
扩增子大小：923。
如图12中所示，观察到人细胞中的MPO裂解，特别是如在经分选的用H502(27.3％)和T173(19.8％)crRNA转染的细胞的情况下所示。这些结果明确证明了特异性和有效靶向人细胞中的MPO的可行性。
实施例5
使用CRISPR/Cas9系统来操控人MPO功能和水平
受到使用本发明的基因编辑系统成功剔除人细胞中的MPO的鼓舞，本发明者接着使用CRISPR/Cas9系统作为取代人MPO中引发MPO生物合成和功能的变化的特定氨基酸残基的工具。特定靶标氨基酸残基被再分成以下群组：
1.形成蛋白质中的构象变化或原聚体生物合成和加工中的变化的氨基酸取代-C167A、C180A、C319A、C158A、R128A、N355A。
2.模拟人MPO缺乏症取代的氨基酸取代-T173C、M251T、R569W、R499C、G501S。
3.干扰原聚体血红素结合的氨基酸取代-Q257A、D260A、M409A、E408A、H261A、H502A。
4.干扰适当蛋白质糖基化的氨基酸取代–N355A。
本文指定的靶标残基与如由SEQ ID NO.2表示的人MPO氨基酸序列相关。
半胱氨酸167
半胱氨酸167是MPO的轻链中与C180形成二硫桥的保守性氨基酸。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止二硫桥的形成。
如本文所述进行半胱氨酸至丙氨酸取代C167A(将TGC变为GCC/GCA/GCT/GCG)。
使用以下gRNA序列进行半胱氨酸167的密码子序列内的Cas9介导双链断裂(DSB)：
C167A-1：GGACGTGGGGGTGACTT^GCC，如由SEQ ID NO.47所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GGACGTGGGGGTGACTT^GCCCGG，如由SEQ ID NO.94所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000545
如由SEQ IDNO.48所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000546
如由SEQ IDNO.48所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成C167A的模板ssODN寡聚物包含：
Figure BDA0002944385390000541
Figure BDA0002944385390000542
如由SEQ IDNO.49所表示。
半胱氨酸180
半胱氨酸180是MPO的轻链中与C167形成二硫桥的保守性氨基酸。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止二硫桥的形成。
通过使用以下gRNA序列在半胱氨酸180的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行半胱氨酸至丙氨酸取代C180A(将TGC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
C180A-1：TCACCGGGATGTGCAAC^AAC，如由SEQ ID NO.50所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：TCACCGGGATGTGCAAC^AACAGG，如由SEQ ID NO.95所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000543
如由SEQID NO.51所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000547
如由SEQID NO.51所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成C180A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000548
Figure BDA0002944385390000549
如由SEQ IDNO.52所表示。
酪氨酸173
先前报道酪氨酸173的密码子中导致替换成半胱氨酸的错义突变会导致MPO缺乏症，从而引起异常蛋白质加工，因而导致它的降解。
因此，如由实施例4所示，通过使用以下gRNA序列在酪氨酸173的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行酪氨酸至半胱氨酸取代Y173C(将TAC变为TGT/TGC)：
Y173C-1：TGCACATCCCGGTGATG^GTG，如由SEQ ID NO.33所表示，靶向包含以下核酸序列的原间隔体：TGCACATCCCGGTGATG^GTGCGG，如由SEQ ID NO.43所表示。
在切割之前：
Figure BDA00029443853900005410
如由SEQ IDNO.53所表示。
在切割之后：
Figure BDA00029443853900005411
如由SEQ IDNO.53所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成Y173C的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000551
Figure BDA0002944385390000552
如由SEQ IDNO.54所表示。
谷氨酰胺257
谷氨酰胺257与血红素空腔形成氢键，并且据报道涉及于卤离子结合中。用中性氨基酸取代这个氨基酸会阻止它的羰基残基与水分子的相互作用以及氢键的形成。
通过使用以下gRNA序列在谷氨酰胺257的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行谷氨酰胺至丙氨酸取代Q257A(将CAG变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
Q257A-1：CATGCAATGGGGCCAGC^TGT，如由SEQ ID NO.55所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：CATGCAATGGGGCCAGC^TGTTGG，如由SEQ ID NO.96所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000553
如由SEQ IDNO.56所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000554
如由SEQ IDNO.56所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成Q257A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000555
Figure BDA0002944385390000556
如由SEQ ID NO.57所表示。
天冬氨酸260
天冬氨酸260与血红素的吡咯基团形成酯键，据推测是MPO轻链与血红素基团的仅有的共价键。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止这个蛋白质-血红素相互作用。
使用以下gRNA序列，使用在天冬氨酸260的密码子序列内的Cas9介导DSB，如由实施例4所公开来进行天冬氨酸至丙氨酸取代D260A(将GAC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
D260A-1：CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCG，如由SEQ ID NO.34所表示，其靶向包含以下核酸序列的原间隔体：CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGG，如由SEQ ID NO.44所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000557
如由SEQ ID NO.58所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000558
如由SEQ ID NO.58所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成Q260A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000559
Figure BDA00029443853900005510
如由SEQID NO.59所表示。
甲硫氨酸409
甲硫氨酸409与血红素的吡咯基团形成酯键，据推测是MPO轻链与血红素基团的仅有的共价键。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止这个蛋白质-血红素相互作用。
通过使用以下gRNA序列在甲硫氨酸409的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行甲硫氨酸至丙氨酸取代M409A(将ATG变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
M409A-1：GGTGAGCTCGGGCATCT^CAC，如由SEQ ID NO.60所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GGTGAGCTCGGGCATCT^CACTGG，如由SEQ ID NO.97所表示。在切割之前：
Figure BDA0002944385390000561
如由SEQ ID NO.61所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000562
如由SEQ ID NO.61所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成M409A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000563
Figure BDA0002944385390000564
如由SEQ IDNO.62所表示。
谷氨酸408
谷氨酸408与血红素的吡咯基团形成酯键。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止这个蛋白质-血红素相互作用。
通过使用以下gRNA序列在谷氨酸408的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行谷氨酸至丙氨酸取代e408a(将GAG变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
E408A-1：GGTGAGCTCGGGCATCT^CAC，如由SEQ ID NO.63所表示。
这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GGTGAGCTCGGGCATCT^CACTGG，如由SEQ ID NO.98所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000565
如由SEQ ID NO.64所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000566
如由SEQ ID NO.64所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成E408A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000567
Figure BDA0002944385390000568
如由SEQ ID NO.65所表示。
组氨酸261
组氨酸261是与血红素铁配位的远端配体。用中性氨基酸取代这个氨基酸残基会阻止这个蛋白质-血红素相互作用。
通过使用以下gRNA序列在组氨酸261的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行组氨酸至丙氨酸取代H261A(将CAC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
H261A-1：CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCG，如由SEQ ID NO.66所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGGCAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGG，如由SEQ ID NO.99所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000571
如由SEQID NO.67所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000572
如由SEQID NO.67所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成H261A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000573
Figure BDA0002944385390000574
如由SEQ IDNO.68所表示。
半胱氨酸319
半胱氨酸319形成构成MPO同二聚体的两个原聚体之间的仅有的二硫桥。半胱氨酸319至丙氨酸的取代突变会干扰MPO生物合成，并且减弱它的过氧化物酶活性。
使用以下gRNA序列，使用在半胱氨酸319的密码子序列内的Cas9介导DSB，如由实施例4所示来进行半胱氨酸至丙氨酸取代C319A(将TGC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
C319A-1：GGATGGTGATGTTGCTC^CCG，如由SEQ ID NO.42所表示，其靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GGATGGTGATGTTGCTC^CCGGGG，如由SEQ ID NO.46所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000575
如由SEQID NO.69所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000576
如由SEQID NO.69所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成C319A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000577
Figure BDA0002944385390000578
如由SEQ ID NO.70所表示。
甲硫氨酸251
甲硫氨酸251的编码区中导致取代成苏氨酸的错义突变会导致遗传性MPO缺乏症。体外数据表明M251T取代会影响MPO加工，并且降低过氧化物酶活性。
使用以下gRNA序列，使用在甲硫氨酸251的密码子序列内的Cas9介导DSB进行甲硫氨酸至苏氨酸取代M251A(将ATG变为ACC/ACA/ACT/ACG)：
M251A-1：GCTCACTCATGTTCATG^CAA，如由SEQ ID NO.71所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GCTCACTCATGTTCATG^CAATGG，如由SEQ ID NO.100所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000579
如由SEQID NO.72所表示。
在切割之后：
Figure BDA00029443853900005710
如由SEQID NO.72所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成M251A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000581
Figure BDA0002944385390000582
如由SEQ ID NO.73所表示。
精氨酸569
精氨酸569的编码区中导致取代成色氨酸的错义突变会导致遗传性MPO缺乏症。体外数据表明R569W取代会影响MPO加工，阻止血红素并入，并且减弱过氧化物酶活性。
使用以下gRNA序列，使用在精氨酸569的密码子序列内的Cas9介导DSB进行精氨酸至色氨酸取代R569W(将CGG变为TGG)：
R569W-1：AATTGCAGTGGATGAGA^TCCGGG，如由SEQ ID NO.74所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：AATTGCAGTGGATGAGA^TCCGGG，如由SEQ ID NO.101所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000583
如由SEQ IDNO.75所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000584
如由SEQID NO.75所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成R569W的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000585
Figure BDA0002944385390000586
如由SEQ ID NO.76所表示。
精氨酸499
在位置499中精氨酸至半胱氨酸的遗传性取代突变会导致MPO缺乏症。显示精氨酸499对于关键组氨酸502的稳定化是重要的。
使用以下gRNA序列，使用在精氨酸499的密码子序列内的Cas9介导DSB进行精氨酸至半胱氨酸取代R499C(将CGC变为TGT/TGC)：
R499C-1：TTCACCAATGCCTTCCG^CTA，如由SEQ ID NO.77所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：TTCACCAATGCCTTCCG^CTACGG，如由SEQ ID NO.102所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000587
如由SEQ ID NO.78所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000588
如由SEQ IDNO.78所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成R499C的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000589
Figure BDA00029443853900005810
如由SEQ ID NO.79所表示。
甘氨酸501
在位置501中甘氨酸至丝氨酸的遗传性取代突变会导致MPO缺乏症。显示甘氨酸501对于关键组氨酸502的稳定化是重要的。
通过使用以下gRNA序列在甘氨酸501的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行甘氨酸至丝氨酸取代G501S(将GGC变为AGT/AGC)：
G501S-1：TTCACCAATGCCTTCCG^CTA，如由SEQ ID NO.80所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：TTCACCAATGCCTTCCG^CTACGG，如由SEQ ID NO.103所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000591
如由SEQ ID NO.81所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000592
如由SEQ IDNO.81所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成G501S的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000593
Figure BDA0002944385390000594
如由SEQ ID NO.82所表示。
组氨酸502
组氨酸502是与血红素铁配位的近端配体。组氨酸502对于MPO血红素结合至关重要。
使用以下gRNA序列，使用在组氨酸502的密码子序列内的Cas9介导DSB，如由实施例4所示来进行组氨酸至丙氨酸取代H502A(将CAC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
H502A-1：GGATGAGGGTGTGGCCG^TAG，如由SEQ ID NO.35所表示，其靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GGATGAGGGTGTGGCCG^TAGCGG，如由SEQ ID NO.45所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000595
如由SEQ IDNO.83所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000596
如由SEQ IDNO.83所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成H502A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000597
Figure BDA0002944385390000598
如由SEQ ID NO.84所表示。
半胱氨酸158
在原肽中，半胱氨酸158与半胱氨酸319形成二硫桥，并且它的突变会扰乱MPO加工和释放。
通过使用以下gRNA序列在半胱氨酸158的密码子序列内达成Cas9介导的DSB来进行半胱氨酸至丙氨酸取代C158A(将TGC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
C158A-1：GTCAAGCGGCTGCGCCT^ACC，如由SEQ ID NO.85所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GTCAAGCGGCTGCGCCT^ACCAGG，如由SEQ ID NO.104所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000599
如由SEQ IDNO.86所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000601
如由SEQID NO.86所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成C158A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000602
Figure BDA0002944385390000603
如由SEQ IDNO.87所表示。
天冬酰胺355
天冬酰胺355是已知被糖基化的六个天冬酰胺残基中的一者。显示使天冬酰胺355去糖基化会降低MPO酶活性。
使用以下gRNA序列，使用在天冬酰胺355的密码子序列内的Cas9介导DSB进行天冬酰胺至丙氨酸取代N355A(将AAC变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
N355A-1：GCTGGTTGGACATGTTG^CGC，如由SEQ ID NO.88所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：GCTGGTTGGACATGTTG^CGCAGG，如由SEQ ID NO.105所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000604
如由SEQID NO.89所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000605
如由SEQID NO.89所表示。
(PAM序列加下划线，^标记切割位点，粗体字母标记被取代的密码子)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成N355A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000606
Figure BDA0002944385390000607
如由SEQ IDNO.90所表示。
精氨酸128
由枯草杆菌蛋白酶样原肽转化酶达成的MPO原肽裂解为MPO生物合成所必需。精氨酸128是枯草杆菌蛋白酶样原肽转化酶识别位点的一部分，并且用不同氨基酸对它进行取代应会阻止原肽裂解。
使用以下gRNA序列，使用在精氨酸128的密码子序列内的Cas9介导DSB进行精氨酸至丙氨酸取代R128A(将AGG变为GCC/GCA/GCT/GCG)：
R128A-1：TGGCTCTAGACCTGCTG^GAGAGG，如由SEQ ID NO.91所表示。这个gRNA靶向包含以下核酸序列的原间隔体：TGGCTCTAGACCTGCTG^GAGAGG，如由SEQ ID NO.106所表示。
在切割之前：
Figure BDA0002944385390000608
如由SEQ ID NO.92所表示。
在切割之后：
Figure BDA0002944385390000609
如由SEQ ID NO.92所表示。
(PAM序列和待取代的编码序列加下划线，^标记切割位点)。
单链寡脱氧核苷酸(ssODN)用作HDR的模板。ssODN含有两个侧接于新密码子序列的同源臂。同源臂是对称的，在PAM的每一侧具有50个碱基。
另外，将PAM阻断突变引入至PAM序列，以防止CRISPR再切割。
用于达成R128A的模板ssODN寡聚物：
Figure BDA0002944385390000611
Figure BDA0002944385390000612
如由SEQ ID NO.93所表示。
实施例6
与CRISPR介导的基因编辑组合的造血干细胞移植(HSCT)：临床研究
患者的合格性的评估
基于年龄、疾病状态、临床评估和功能性评估诸如卡诺夫斯库(Karnofsky)表现评分来评估患者进行HSCT的身体合格性。还对患者在MPO基因座处测序以验证他们对靶向MPO的gRNA序列的遗传顺应性。
CD34+动员以及通过单独采集进行的收集
HSPC可由髂嵴骨髓抽吸来提取，或使用将化学疗法与粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)组合的外周动员方案加以动员，通过单独采集来从红血细胞和白血细胞收集和分离CD34+细胞，并且储存在输注袋中。每千克收集细胞2×106临界数目的细胞与20％DMSO一起低温保存作为备用物。
CD34+基因编辑和经转染细胞的富集
用靶向MPO基因的基因编辑载体处理用细胞因子预刺激的经富集CD34+细胞，诸如用与适当crRNA和经荧光标记的tracrRNA复合的CRISPR-Cas9核糖核蛋白进行电穿孔。在与RNP复合物一起孵育之后，关于tracrRNA源性或载体源性荧光或通过其他可适用选择方法来富集CD34+细胞。
经编辑CD34+细胞的品质测试
检查MPO经编辑CD34+以探明细菌或真菌污染、内毒素和支原体，以及评估细胞活力。CD34+细胞内的HSPC长期再增殖能力可通过流式细胞计量术来评估。
基因经编辑细胞扩增
使用诸如细胞因子的化合物离体扩增MPO经编辑CD34+细胞，金属螯合剂或小分子可为达到用于移植或对于提高移入率是优选的临界细胞数目所必需。
调理方案
在输注基因经编辑HSPC之前，患者经受包括化学疗法和ATG(抗胸腺细胞球蛋白)，伴有或不伴有全身照射的调理方案，以抑制骨髓细胞，并且防止对供者干细胞的排斥。这个程序可涉及清髓性或非清髓性方案。在自体干细胞移植的情况下，在通过G-CSF动员CD34+细胞以及单独采集CD34+细胞之后，将进行通过癌得星(Cytoxan)和ATG，伴有或不伴有全身照射来进行的调理。
细胞施用
在HSPC评估和调理方案之后，用至少2×106个细胞/千克的剂量对患者进行静脉内施用。
移植后治疗和监测
给与使用药物诸如环孢灵(cyclosporine)或他克莫司(tacrolimus)进行的植入后免疫抑制方案以预防移植物抗宿主疾病(GVHD)。给与防治性药物治疗以预防严重感染。以加强护理对患者进行监测，并且治疗HSCT或免疫抑制的可能并发症诸如感染、GVHD等，以及治疗的潜在副作用。评估造血恢复和移入率，并且使用生长因子加以促进。
实施例7
在治疗肺动脉高血压(PAH)的情况下的MPO剔除
为评估提出的MPO KO未分化骨髓细胞作为对额外MPO相关疾患的潜在疗法的适用性，接着考查MPO KO对大鼠中的血管病症诸如PAH的影响。具体来说，采用了大鼠中Sugen5416/缺氧诱发的(SuHx诱发的)肺高血压的模型。SuHx导致小肺动脉(PA)中血管肌化显著增加、右心室收缩压(RVSP)增加和右心室肥大(RVH)。
更具体来说，通过暴露于清髓性照射，使SuHx大鼠经受造血净化，继之以用源于MPO-KO或WT大鼠的骨髓(BM)细胞再增殖。这产生四个实验组：(1)WT具有WT BM(WT-WT)，(2)WT具有MPO-KO BM(WT-MPO KO)，(3)SuHx大鼠具有WT BM(SuHx-WT)以及(4)SuHx大鼠具有MPO-KO BM(SuHx-MPO KO)。在平行实验中，使用利用本发明的基因编辑系统加以操控的未分化MPO-KO BM细胞评估MPO-KO BM在这个大鼠PHA模型中的影响。
为评估未分化MPO-KO BM细胞对PHA的影响，测定以上指定的四个实验组中多形核嗜中性白细胞(PMN)的活化和脱粒。此外，测定肺动脉压(PA压)和RVSP，并且还在来自所有实验组的大鼠的肺匀浆中定量了肺组织中炎症相关基因的mRNA。
还通过使从每个实验组获得的经分离肺动脉(PA)区段暴露于前列腺素F2α(PGF2α)来测试MPO KO对于对肺血管结构的血管收缩作用的影响。通过根据右心室压力-容积环评估有效动脉弹性(Ea)来进一步考查PAH中MPO依赖性血管收缩的作用。有效Ea代表心室后负荷的确定参数，由此反映血管阻力和顺应性。
进行免疫组织化学研究以比较所有四个实验组中肺微动脉的血管肌化增加的存在。
实施例8
在治疗新月体性肾小球性肾炎(CGN)的情况下的MPO剔除
为评估提出的MPO KO未分化骨髓细胞作为对额外MPO相关疾患的潜在疗法的适用性，接着考查MPO KO对大鼠模型中的作为一种以肾功能急剧丧失为标志的综合征的新月体性肾小球性肾炎(CGN)的影响。具体来说，已知用人MPO-ANCA预先免疫，随后用溶酶体提取物和H2O2灌注的大鼠会显现CGN。用人MPO-ANCA进行的预先免疫会导致IgG和C3沉积，并且可观察到与IgG免疫沉积物的量成比例的组织学肾小球损伤。
更具体来说，通过暴露于清髓性照射，使预先免疫的大鼠经受造血净化，继之以用源于MPO-KO或WT大鼠的骨髓(BM)细胞再增殖。这产生四个实验组：(1)WT具有WT BM(WT-WT)，(2)WT具有MPO-KO BM(WT-MPO KO)，(3)预先免疫的大鼠具有WT BM(Preimm-WT)以及(4)预先免疫的大鼠具有MPO-KO BM(Preimm-MPO KO)。在平行实验中，使用利用本发明的基因编辑系统加以操控的未分化MPO-KO BM细胞评估MPO-KO BM在这个大鼠CGN模型中的影响。
为评估未分化MPO-KO BM细胞对CGN的影响，将大鼠的肾切除，并且考查以上指定的四个实验组中IgG和C3沉积以及组织学肾小球损伤。
序列表
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<400> 1
gacaatatca ggtgagctgt ggaggtgggg tccttggaag ctggatgaca gcagctggca 60
aggggataag agagcagtga gcccctccct caaggaggtc tggctttatc catagacagg 120
gccctctgag gtggggctga ggtacaaagg gggattgagc agcccaggag aagagagatg 180
ggggttccct tcttctcttc tctcagatgc atggtggact taggaccttg ctgggctggg 240
ggtctcactg cagagatgaa gctgcttctg gccctagcag ggctcctggc cattctggcc 300
acgccccagc cctctgaagg tgctgctcca ggtaacagtt cccaaggtgg gagaagatgg 360
tgtgttgggg tggttgtgtt ccagagaccc cttttctcag agcaggcctt cctagctctg 420
gggcctgata gggggttggg gcccattcct gactttgtga tccctgctct gggcagctgt 480
cctgggggag gtggacacct cgttggtgct gagctccatg gaggaggcca agcagctggt 540
ggacaaggcc tacaaggagc ggcgggaaag gtggggcacg aggcactgcc cagctctggg 600
caaggatgtc ccaggccttt cagagaagca gcaggcagca gggagcttga aggtgggaga 660
gggggactat ggggacccat gtggactccc tttctgtctg tctgtccctg tgtttctgga 720
tgggagaaca gcttaaaagc catccttccc aaagccttgc ctctgtctgg acacccaggt 780
ccatatcctt tttataaaag gaagccttcc tcccacccgt gggcctgcct gcatggtcct 840
gcatgtctgc ccctgggctg gggctctgct gggtgggtct gtatcccttc tctggccctc 900
actcctcctt tctccaagca gcatcaagca gcggcttcgc agcggctcag ccagccccat 960
ggaactccta tcctacttca agcagccggt ggcagccacc aggacggcgg tgagggccgc 1020
tgactacctg cacgtggctc tagacctgct ggagaggaag ctgcggtccc tgtggcgaag 1080
gccattcaat gtcactggta ctgttgccca tcacacccca ggtccctgct ccactagtga 1140
ctcctcctag ggaccccagc cgtctctcag tgatcccctc aacttcttcc tccagggagt 1200
ctcaggagtc tccagggctc ctcagcctca ggttgcctgg gataggaagt gaggcggctc 1260
agctccccca ttgttctttc ccccggcaga tgtgctgacg cccgcccagc tgaatgtgtt 1320
gtccaagtca agcggctgcg cctaccagga cgtgggggtg acttgcccgg agcaggacaa 1380
ataccgcacc atcaccggga tgtgcaacaa caggtgcggc tggctggggg tggctgcagg 1440
aaccgggctc agagaggcgt cccggacgcc acaagcctcc cggtgtcagc gccctgtcct 1500
cccctgcaga cgcagcccca cgctgggggc ctccaaccgt gcctttgtgc gctggctgcc 1560
ggcggagtat gaggacggct tctctcttcc ctacggctgg acgcccgggg tcaagcgcaa 1620
cggcttcccg gtggctctgg tgagcgccgg cgggcagagg gggcgaggcc cggccacgcg 1680
gtgcgcggac ccaggcgcca gctgatctcc gtgtcccgca ggctcgcgcg gtctccaacg 1740
agatcgtgcg cttccccact gatcagctga ctccggacca ggagcgctca ctcatgttca 1800
tgcaatgggg ccagctgttg gaccacgacc tcgacttcac ccctgagccg gccgcccggg 1860
cctccttcgt cactggcgtc aactgcgaga ccagctgcgt tcagcagccg ccctgcttcc 1920
cgctcaaggt ggccctgctt cccgcccact gcctgggttg ggagagggga gattgtttct 1980
ggaaggggcc atctcccttc tgtgcccagg tttcctttcc cagacgctga ggaaggctgg 2040
ccctgcctcc cttgtgtcca cagcactggc tgctcagcta tgacctgtct ccttcctgcg 2100
cctgggctca gccagctggc agccagggcc gtccatttgc tcactgcctc tggcaggcca 2160
agggagagag ggttgttcct ccttggctga caggagtcct gttggtggaa tcactggctc 2220
tttgttaggt tgggagaggg ttctgggagg agaccttctc agtgcccccc aagcctccat 2280
gctcagtcct gtttccgccc cactgagagg gcagccccaa cccccatcac acagaaagag 2340
agagcctggg ggtctggtgg gtgccgtggg acagggctgg gagtgggcag ggtggtcgag 2400
gcactgctga gtagggaagg aggaggagag aaaggagaga gcgcctgaga gagggagaga 2460
cagacaggag aatgtcaggg ccagagggag agcaggcaca gcagagagaa ggggagagag 2520
acgggcgacg ctttagtgag gagggatccg aggcctggcg gtgcccagac ccaggggttg 2580
cccaggttcc cagttcagtg ttctgctcat taaccctgca cctcagaggc tgttgctgat 2640
ggcgccctag gcagcgatcc ctttcgggcc tccggaggcc tctctgcagg ttgagggtac 2700
cagaggtcct gagggcaggg ggagatccag ttctgcctgg gcaccttcct tgccctcggt 2760
gagccagtct agcctctctc tgtgcctcag atcccgccca atgacccccg catcaagaac 2820
caagccgact gcatcccgtt cttccgctcc tgcccggctt gccccgggag caacatcacc 2880
atccgcaacc agatcaacgc gctcacttcc ttcgtggacg ccagcatggt gtacggcagc 2940
gaggagcccc tggccaggaa cctgcgcaac atgtccaacc agctggggct gctggccgtc 3000
aaccagcgct tccaagacaa cggccgggcc ctgctgccct ttgacaacct gcacgatgac 3060
ccctgtctcc tcaccaaccg ctcagcgcgc atcccctgct tcctggcagg tcagctttgg 3120
ggtggggacc agaggtggca taggagatgt tccctgttgg agccacagtg agtctgtttg 3180
tgagcagctt gtgggtttgt acttagagag actgtcctca ccagccatta ctatcaactt 3240
catgatatta atccagttgc cttggtaaca agtcagatgg agccagaaaa gcagaaaagc 3300
aaacaacctc tccaacccta agatggagac ccaggcatgg ctgaggagcc tctgtccatc 3360
agtccattgc tttctctgtc ccttttttcc cttctggact ctggaagaca agagagtcaa 3420
atccctcagg ggcagggaac taaaggacag agaacgctgt ggtgccctca ccctctagag 3480
cgacactatc caatgtggta gccactagct gcatgtggct attttaattt tagttatttt 3540
aaattaaata aacccagttt ctcagcggtg ctaaccacat ttcaaatgct caattgcctt 3600
acagtctagt ggctccccct attgggtggc acagatgtaa aatattttca tcatctcgga 3660
aggttgagtt ggaccacact gctccaaaat atcccctcct gcgcatctta attacccata 3720
ataagagatg atgggatttt aaatgtaaac aattggcagt tttggagaca caattggggc 3780
agtgatggca gccatgacca gacattttcc agtgtttttt ttttttctaa gacggaatct 3840
cactctgtca cccaggcttg agtacagtgg cacagtctcg gctcactgca acctctgcca 3900
actgggttta agtgattctt ctgcctcagc ctcctgagta gctgggacta caggcgcctg 3960
ccaccacact tggctaattt tttgtatttt tagtagagat ggtgttttac catgttggcc 4020
aggctggtct caaactcctg acctcatgat ctgcccacct taacctccca aagtgctggg 4080
attacaggtg tgagccaccg cacgcagcca ttttccagtg tttttaaatg taaacccaat 4140
agtggacctc aggccctttc ctctggcctc cctctgcctc ctcctgatgg ttcctgctgg 4200
tctctccctg gctgggaccc tgggaggagg atccaggtcg gactttctgc aagagatgcc 4260
cgacctcttc tgggctagtt aggcaagggc agccctcctt agccagactc agctgcccac 4320
agcctggctt tgatgagccc catgtcccaa gcctgggtca ttatgacctc tagctgttca 4380
tggatggaga tgctgctctc agagaatttc ctttccacca gcttctagag ctggcaagga 4440
ctgaccctag tgtcctgacc ctagccctct ggcccctgca gagaagggtt ctgggaggac 4500
taggggaacc aggggggatc tgcttagttt tcttgaacag tctcaggtgt ggactccaca 4560
tatctcatgt cctagccctc tcccctgggg caggctgcac cattggcatg tagtaaaggg 4620
cagggctgac aactctgttc aaatggtagt ggctttctgg agtcctgtgt tgagaaggat 4680
tctgaggttg catccaattt tagcaggaaa gagtgctgtg atcgttagct gcatcagaca 4740
tgggcatgga tgtaggctgt gccaacacgc atgcttcttc ccagacactc cttggaatca 4800
agagaatcaa tgaaccaagc agtgttcata agtctcatac tttgtaccag gcactctgtt 4860
aagccccatg tatccatatg tgtgctagga gggagggtaa aatataaaaa ggcacaagcc 4920
ttggtcctgt gctcaaggag ctcccagttt caggtacagg aaagtggcat gtcatgtgtt 4980
ggaagtgata cctattgaat gagcatcccc aaccagcagc ggccctgagc tgaggcagaa 5040
gctatcattg tggactgggg catcagggaa ggcctcctag aggagtgtaa attggggata 5100
gtttgaaaag atggatgggg aggaggggtg agtaggaggc atttcaggcc ttggctgggg 5160
agggggtttc agtggagcaa atcttttctg ggatggaggc cttaagaatg acagtggctt 5220
ttgcctcccc aaggggacac ccgttccagt gagatgcccg agctcacctc catgcacacc 5280
ctcttacttc gggagcacaa ccggctggcc acagagctca agagcctgaa ccctaggtgg 5340
gatggggaga ggctctacca ggaagcccgg aagatcgtgg gggccatggt ccaggtaggc 5400
cgtcttgaac accgggcaca cgggatccag atgtgtccct gcaacatcct agctgtgtga 5460
ccttgggcaa gttcctaacg ctcctgagcc ttgccttctt catccatgag gctgtaagga 5520
ttataataca tatatgaaaa cacctttcag atagtaagtg cttgacaaag cctccttccc 5580
ttccctctcc ttcttcgcag gtttgctccc tgcagtcttc tttcctgtgg gtctgttatt 5640
ggtgttggga gggttgaatg tttggtttag cgcccaagta gctgttcagt aaattcttct 5700
tccctccatc tcactgtcac tcttagctcc tttacccact cacctcttct ttttaaaatt 5760
aaaaaaatta tagggctggg cgcggtggct catgcctgta atcccagcac tttgggaggc 5820
ggaggcgggt ggatcacgag gtcaggagat caagaccatg ctggctaaca cggtgaaacc 5880
ccatctctac taaaaataca aaaattagcc gggcgtggtg gcgggcacct gtagtcccag 5940
ctacttggga ggctgaggca ggagaatggc gtgaacctgg gaggcagagc ttgcagtgag 6000
ctgagatggc gctgctgcac tccagcctgg gtgacagagc gagactccat ctcaaaataa 6060
ataaataaat aaaataaaat ttaaaaatta ttattattat tttattttta ttttttgata 6120
cagggtctta ccctgttgcc caggctggag tgcagtggtg cgatcttggc tcactgcaac 6180
ctccaccttt caggctcaag ccattctccc atctcagcct tctgagtagc tgggatttca 6240
agcacgggcc accacgcccg gctaattttt gtattttttg tagagacggg gtttcgccac 6300
gttacccagt gtggtctcaa actcctgggc tcaagtaatc cgccctcctc gacctcccaa 6360
atccctggga ttacaggcac gagtcactgt gttcagccca ctcacctctt ctttttggct 6420
ctgtcataat ccacccaatg tccttagcct catttacccc tggggcaatg ttcctggttc 6480
tgtctctcaa catctggtgc ttcattgccc ccaccctctc cctcagaggc agaggcagac 6540
atacacacac tcacacacac acacacacac acacacacac acacacactc ctagattctg 6600
gaggagagag ttttcggtgc taagggtgag tttttgattt gcactaagaa ctcaagtgaa 6660
attcatttac actccaaaat aacttctaga ctctagaatg tagagtgaga ctattccatg 6720
tcttcacttt tcacagggaa aatcatgcca gaatggccct tcgttccttc ctgcctccct 6780
gctttccaca aacctaaact gagccttact gtgggcaggc acttggtggg cactgtgaag 6840
aatttcaaca acttcaattt cccttgctct caaggacttt ataagatagt tgcagaaatg 6900
agacattaat aacttgagga caaggaagtt atcacaatga ctaaaaaagt gatttgctat 6960
ttagtcctct aaggcagagg gcaatataat tatccttaat gtacatttga ggaactcagg 7020
ctcagagagg ttaataattg gtccaaggtc acccagccag caagcagtag aactctattt 7080
atgcctctca gtgccactct gttaggccca ggtccggtat tgtgggaggc tattccctga 7140
ccatagaggg atggaagggg tccccgaagc caagagcagg cagagactct ggccctcctg 7200
tgctgccagg cggcatttgc tgtggaggag tgggtggaga ggccattcca aatgacttgt 7260
ctttagatca tcacttaccg ggactacctg cccctggtgc tggggccaac ggccatgagg 7320
aagtacctgc ccacgtaccg ttcctacaat gactcagtgg acccacgcat cgccaacgtc 7380
ttcaccaatg ccttccgcta cggccacacc ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctggac 7440
aatcggtacc agcccatgga acccaacccc cgtgtccccc tcagcagggt cttttttgcc 7500
tcctggaggg tcgtgctgga aggtaagcag gacctaggcc aggagcgagt gggctgacag 7560
ctaaaggtgg ggtagggatc accttggctc tagggagcta gggtggggag cagtctgctt 7620
tcctcccatc ttggagatct ggtctgactc tctagcctca gttcctctga ctctgcttcc 7680
atatctgata ataaacagtg gggtggggat ggccctcaga gggaactggc tacttcctat 7740
gtgttgtggc tcgctgtgac ccaggaagcc agggcctggg agcatcccaa tcttgcaagt 7800
ctgaatggca taatctcctg agacctatat gtccctgggg tcatgtagtg accggtgagg 7860
acctgctcac tggggccacc accttggcac caggcactgc ttgtgcccag ccctcttctc 7920
gaatcctcct gaccctacct ggacttgtcc ctgactccaa tctgagctct gatactgagc 7980
cagatacttc ccctgacctg gctcctctgg tccccaggtg gcattgaccc catcctccgg 8040
ggcctcatgg ccacccctgc caagctgaat cgtcagaacc aaattgcagt ggatgagatc 8100
cgggagcgat tgtttgagca ggtcatgagg attgggctgg acctgcctgc tctgaacatg 8160
cagcgcagca gggaccacgg cctcccaggt gaggggctgc aggagtctcc cctgatgctc 8220
acctcccctg agctgcctcc taggtagccc atcacccccc ttcccactct agggtccctg 8280
ccctctccaa agcatattag aggcactttg ctctcaggaa gtagcctgag gccaggcccc 8340
tgccttttcc cggacccacc tgataaattt ccagctcctc tcaacctcct ttgcatgctg 8400
taattctcat attaggggca tcgtcatcat aatgataacc cacagtctga aaatctgtct 8460
ctgtcatcat tccattttgc ttcattgtac gttaactctg ggggaagaga ttattattgc 8520
cttcatttta ctgatgagga aactgaggct tgatgagatt cagaacctgg ccaggttctc 8580
tagccaagtc agtggcaaag ctgaaatttg aagccagatt agcctaacct caaagcctgt 8640
gcctatgtta tggggtagcc catgtggctg aggcttctag acacatttca cctctcatgg 8700
gtcagagaca gacacatcgg gctgctctgg agggggacaa ggagatgtcc ctattcttgg 8760
acccagcagg aactgtggca gtttagggtt tgccttatgg taggagggca agagaaagac 8820
agagagggtc ccagagaggc ccagttgtgc cccttggtct aagccaaagg tacagggttc 8880
cttgaggtga ggtccttccc tccctctatg accttggttg tgttgggaag gtgggttttc 8940
tgggctgctg gcgatatgtg aatcttccct gctgtctcca gtgacctccc caccttgaag 9000
cagagagacc tgcccatagc cacctgtccc ctcccccatg caggatacaa tgcctggagg 9060
cgcttctgtg ggctcccgca gcctgaaact gtgggccagc tgggcacggt gctgaggaac 9120
ctgaaattgg cgaggaaact gatggagcag tatggcacgc ccaacaacat cgacatctgg 9180
atgggcggcg tgtccgagcc tctgaagcgc aaaggccgcg tgggcccact cctcgcctgc 9240
atcatcggta cccagttcag gaagctccgg gatggtgatc ggtgaggagg ggcaggcgtc 9300
gtgggccgct gggtggctgt gggcccatcc ttgactctct tggagcccaa atttcctcct 9360
gtcagttgaa ggactggagg gagtcagtaa ttttccagtg tgttccagga atcctccaga 9420
tgccctggag tgcccctaat gtgccctgaa cctgttgggg gtgcagcaag gaaagacctg 9480
gacccctggt tgtaaagggt ggaagataga aaagtgccac ccttagctac ttcttcccat 9540
gggtttcact gtgccaccat gtgggtgtca gtcaccagtg ggcagtcccc tcccagcttt 9600
cccacagctc cccttagtgt catttcctcg tggtcctgat gtcttcatgt ctagttcttg 9660
cttagcctgt actgcacctt tgggaaaatt agaaaaaggt gcccctctct gggtgggcga 9720
attataaacc acccccaaga ttctcttcca ctcctgtgga tgcagctcct ggccagggca 9780
cagggcttca ggagtgtgtg tgggcccggg tccccctcca gcatggtgcc ctggaggccg 9840
ccgggctagg ggtaagggaa aggccactgg gcagctgtgc tttactctgc acgatgagtg 9900
gagcatcact tgtgtgaaag cccctgggct gcccaagggc ctggggccct cctgtgcttc 9960
caggtggcat ttgttgtggc tttgttatat cctgggagca gcacaagccc atcgatgccc 10020
tgccagccca gaatatcctt gggcacagtg tccatgggtg ttccccatgc aggttttggt 10080
gggagaacga gggtgtgttc agcatgcagc agcgacaggc cctggcccag atctcattgc 10140
cccggatcat ctgcgacaac acaggcatca ccaccgtgtc taagaacaac atcttcatgt 10200
ccaactcata tccccgggac tttgtcaact gcagtacact tcctgcattg aacctggctt 10260
cctggaggga agcctcctag aggccaggta agggggtgca gcagtgaggg gtatatctgg 10320
gctggccagt tggaaccacg gagatctcct tgccctagat gagcccagcc ctgttctggg 10380
tgcagctgag aaaatgagtg actagacgtt catttgtgtg ctcatgtatg tgcgaagtat 10440
ataaattggc ttttcatgcg tgtgtgttgt ctgaacatgg ggagtgtttc atgggttatg 10500
tgtatgtgcc atttatgtga gtgtgtgttt gtgctgatga gaatactgag tatgtggaag 10560
gcagcagagc ggactggtga ggagcacagc tcaggaacta gactgcctgg gttccaatcc 10620
tggctctgtg gcttgctagc tatgtgacct tgagcaaatt accctcctta aacaagagtt 10680
ttcttccttg taaattacat ctgtcatggt ttcttggagg gcccacttgt atcctctggt 10740
tcttcattta ttgagcacct actacatgca aggcactgta ctaggcgtga gaagcatata 10800
gaggcaagaa agagatacca agatgccatc tgtgtcctgg ttagcagagc tggaccagtg 10860
gtgccttgga gggataagcc agctgcagct gggctgtgtg gttgacttat gggcccagcc 10920
agccaggctc aggccatggc tccccttttt cttcctcacc ctgatttctt gcttattcac 10980
tgaagttctc ctgaagagga actgggcctg ttgccctttc tgtaccattt atttgctccc 11040
aatgtttatg ataataaagg caccgctgat ggggacctcc 11080
<210> 2
<211> 745
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MPO蛋白登录号：NP_000241
<400> 2
Met Gly Val Pro Phe Phe Ser Ser Leu Arg Cys Met Val Asp Leu Gly
1 5 10 15
Pro Cys Trp Ala Gly Gly Leu Thr Ala Glu Met Lys Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile Leu Ala Thr Pro Gln Pro Ser Glu Gly
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Val Leu Gly Glu Val Asp Thr Ser Leu Val Leu Ser
50 55 60
Ser Met Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp Lys Ala Tyr Lys Glu Arg
65 70 75 80
Arg Glu Ser Ile Lys Gln Arg Leu Arg Ser Gly Ser Ala Ser Pro Met
85 90 95
Glu Leu Leu Ser Tyr Phe Lys Gln Pro Val Ala Ala Thr Arg Thr Ala
100 105 110
Val Arg Ala Ala Asp Tyr Leu His Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu Arg
115 120 125
Lys Leu Arg Ser Leu Trp Arg Arg Pro Phe Asn Val Thr Asp Val Leu
130 135 140
Thr Pro Ala Gln Leu Asn Val Leu Ser Lys Ser Ser Gly Cys Ala Tyr
145 150 155 160
Gln Asp Val Gly Val Thr Cys Pro Glu Gln Asp Lys Tyr Arg Thr Ile
165 170 175
Thr Gly Met Cys Asn Asn Arg Arg Ser Pro Thr Leu Gly Ala Ser Asn
180 185 190
Arg Ala Phe Val Arg Trp Leu Pro Ala Glu Tyr Glu Asp Gly Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Tyr Gly Trp Thr Pro Gly Val Lys Arg Asn Gly Phe Pro Val
210 215 220
Ala Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Glu Ile Val Arg Phe Pro Thr Asp
225 230 235 240
Gln Leu Thr Pro Asp Gln Glu Arg Ser Leu Met Phe Met Gln Trp Gly
245 250 255
Gln Leu Leu Asp His Asp Leu Asp Phe Thr Pro Glu Pro Ala Ala Arg
260 265 270
Ala Ser Phe Val Thr Gly Val Asn Cys Glu Thr Ser Cys Val Gln Gln
275 280 285
Pro Pro Cys Phe Pro Leu Lys Ile Pro Pro Asn Asp Pro Arg Ile Lys
290 295 300
Asn Gln Ala Asp Cys Ile Pro Phe Phe Arg Ser Cys Pro Ala Cys Pro
305 310 315 320
Gly Ser Asn Ile Thr Ile Arg Asn Gln Ile Asn Ala Leu Thr Ser Phe
325 330 335
Val Asp Ala Ser Met Val Tyr Gly Ser Glu Glu Pro Leu Ala Arg Asn
340 345 350
Leu Arg Asn Met Ser Asn Gln Leu Gly Leu Leu Ala Val Asn Gln Arg
355 360 365
Phe Gln Asp Asn Gly Arg Ala Leu Leu Pro Phe Asp Asn Leu His Asp
370 375 380
Asp Pro Cys Leu Leu Thr Asn Arg Ser Ala Arg Ile Pro Cys Phe Leu
385 390 395 400
Ala Gly Asp Thr Arg Ser Ser Glu Met Pro Glu Leu Thr Ser Met His
405 410 415
Thr Leu Leu Leu Arg Glu His Asn Arg Leu Ala Thr Glu Leu Lys Ser
420 425 430
Leu Asn Pro Arg Trp Asp Gly Glu Arg Leu Tyr Gln Glu Ala Arg Lys
435 440 445
Ile Val Gly Ala Met Val Gln Ile Ile Thr Tyr Arg Asp Tyr Leu Pro
450 455 460
Leu Val Leu Gly Pro Thr Ala Met Arg Lys Tyr Leu Pro Thr Tyr Arg
465 470 475 480
Ser Tyr Asn Asp Ser Val Asp Pro Arg Ile Ala Asn Val Phe Thr Asn
485 490 495
Ala Phe Arg Tyr Gly His Thr Leu Ile Gln Pro Phe Met Phe Arg Leu
500 505 510
Asp Asn Arg Tyr Gln Pro Met Glu Pro Asn Pro Arg Val Pro Leu Ser
515 520 525
Arg Val Phe Phe Ala Ser Trp Arg Val Val Leu Glu Gly Gly Ile Asp
530 535 540
Pro Ile Leu Arg Gly Leu Met Ala Thr Pro Ala Lys Leu Asn Arg Gln
545 550 555 560
Asn Gln Ile Ala Val Asp Glu Ile Arg Glu Arg Leu Phe Glu Gln Val
565 570 575
Met Arg Ile Gly Leu Asp Leu Pro Ala Leu Asn Met Gln Arg Ser Arg
580 585 590
Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn Ala Trp Arg Arg Phe Cys Gly Leu
595 600 605
Pro Gln Pro Glu Thr Val Gly Gln Leu Gly Thr Val Leu Arg Asn Leu
610 615 620
Lys Leu Ala Arg Lys Leu Met Glu Gln Tyr Gly Thr Pro Asn Asn Ile
625 630 635 640
Asp Ile Trp Met Gly Gly Val Ser Glu Pro Leu Lys Arg Lys Gly Arg
645 650 655
Val Gly Pro Leu Leu Ala Cys Ile Ile Gly Thr Gln Phe Arg Lys Leu
660 665 670
Arg Asp Gly Asp Arg Phe Trp Trp Glu Asn Glu Gly Val Phe Ser Met
675 680 685
Gln Gln Arg Gln Ala Leu Ala Gln Ile Ser Leu Pro Arg Ile Ile Cys
690 695 700
Asp Asn Thr Gly Ile Thr Thr Val Ser Lys Asn Asn Ile Phe Met Ser
705 710 715 720
Asn Ser Tyr Pro Arg Asp Phe Val Asn Cys Ser Thr Leu Pro Ala Leu
725 730 735
Asn Leu Ala Ser Trp Arg Glu Ala Ser
740 745
<210> 3
<211> 4104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 来自Addgene质粒pL.CRISPR.EFS.GFP的Cas9 Cdna Cas9 DNA序列
<400> 3
gccgacaaga agtacagcat cggcctggac atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120
cacagcatca agaagaacct gatcggagcc ctgctgttcg acagcggcga aacagccgag 180
gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240
tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300
ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360
aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420
aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480
atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540
gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600
atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660
cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggcaac 720
ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780
gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840
cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900
ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960
atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020
cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080
ggctacattg acggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140
gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200
aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260
gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320
gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380
agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440
gtggtggaca agggcgcttc cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500
aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560
tataacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620
agcggcgagc agaaaaaggc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680
gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740
tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800
atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860
ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920
cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980
aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040
gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100
agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160
cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220
gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280
atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340
atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400
gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460
gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggaccat 2520
atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct gaccagaagc 2580
gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640
aactactggc ggcagctgct gaacgccaag ctgattaccc agagaaagtt cgacaatctg 2700
accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760
ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820
actaagtacg acgagaatga caagctgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880
aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000
taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060
atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120
aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180
cctctgatcg agacaaacgg cgaaaccggg gagatcgtgt gggataaggg ccgggatttt 3240
gccaccgtgc ggaaagtgct gagcatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300
cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga taagctgatc 3360
gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420
tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480
aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540
tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600
tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660
cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720
cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780
cagcacaagc actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840
atcctggccg acgctaatct ggacaaagtg ctgtccgcct acaacaagca ccgggataag 3900
cccatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960
cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020
gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080
gacctgtctc agctgggagg cgac 4104
<210> 4
<211> 1368
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cas9蛋白
<400> 4
Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA-3
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA-4
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cagcggggtg tacggcagcg 20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> MOG35-55
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Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu
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Tyr Arg Asn Gly Lys
20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA-2
<400> 8
gcactcatgt tcatgcagtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 6
<400> 9
tgcgatactt gtcattcggt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 1
<400> 10
agtaaaacag gagctccgtg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 5
<400> 11
acgcttccaa gacaatggca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 7
<400> 12
acgccatctt catactctgc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 8
<400> 13
atcaagcgga gcctccaaag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠gRNA 9
<400> 14
agagtacctg taacattgaa 20
<210> 15
<211> 10629
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> misc_feature
<223> MPO染色体11，GRCm38.p4 C57BL/6J DNA序列登录号：NC_000077
<400> 15
ataacttctc agctttagct ccctgaattt tggttctttc aaaggatttg ggacactcag 60
tttaaccaac actttgaggg gctggttgtt tgtgctctcc gggagaagct ctgatccatt 120
cctttgtcca cccctccttc ttcatagacc cctttctgtg cacccctaac cccagtgggg 180
gaggagagtc tagtcttggg ataggtccat ctctttttag gtcagcccgc ccccagcttt 240
tacaccccag gcataaaaac ccgttgtcag tgagaggagt tgacagtgtc aggtaagtgg 300
tgaagttgag ctcttgggga ctggggacta tagctggagg gggtcttggg ttgtacacct 360
cttcatagac caggcccact agggtagggc tgtgtataaa ggggagagga gggggcttgg 420
gaggaggaga attgtaaaac ctctcttttt tcaaaagctc tggatacttc ctgagctgag 480
gtttttgttt tttgtcttgt tttgttttgt tttgttttgt tttgttttgt tttgttttgt 540
tttgttttgt ttttttaaag gtttatttat ttattatatg taagtacact gcagctgtcc 600
ttagatactc cagaagagag catcagattt tgttacggat ggttgtgagc caccatgtgg 660
ttgctgggat ttgaactcgg gacctttgga agagcagtcg gcgctcttaa ccactgagca 720
atctccccag cccccttgtt ttttgtcttg cagagatgaa gctactcttg gccttggcag 780
gcctcctggc ccctctggcc atgcttcaga cctccaatgg tgccacccca ggtgatagtg 840
ccaaaaggag ggtggactaa gggattgggg gtagggggtg gggattctca gcccagcatc 900
tccccttccc ctggataggc ttcctttgct ttggggcctg atgtagggct ttggggccag 960
ccctgacctt atgatttatg ctctgggcag ctctcctggg ggaagtggag aattcagttg 1020
tgctgagctg tatggaagag gccaagcagc tagtggacag agcctacaag gagcggagag 1080
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tctgtctgga catccaggtc catgtccttt tgacaaaaga aatgcactgc tcctccgtgg 1320
ttctctccag agttctttct gcctgctcac cgcaggctgg cctttgctga gtgtctctat 1380
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gccagcccca cggagctcct gttttacttc aagcagccgg tggcgggcac cagaacagct 1500
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ttatgtgcag gacctaggca tccaatgact cctgttgttg ctgcaggctc gccaggtctc 2460
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tcttcttcat actcccaatg tacaggcact ggcctgttct cactctctct cccctatggg 3000
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agtgtggaga aaaagaaagg cagagattaa ggagataaag ggccaggggt ctgacagggc 3240
cagggtgaca gaacagagag gaaaaggcag acacaggcaa gaagaggatt aagaggcata 3300
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tgaattcttt gtcaccctta aacctcagtc tctttgctga ctgagcccca gtatttctat 3420
gaaaccttga gagcttccct gcagctcgag ggggccagag ttctcttctg cagggtgtaa 3480
gttacaaatg cccgctctcc cgacccacaa aagccagcct agcttctctc tgtgctgtag 3540
atcccaccca atgaccctcg aatcaagaac caaaaggact gcatcccctt cttccgctcc 3600
tgcccggcat gcaccaggaa caacatcacc attcgcaacc agatcaacgc gctcacttcc 3660
ttcgtggacg ccagcggggt gtacggcagc gaggaccccc tagccagaaa gctgcgcaac 3720
ctcaccaacc agctggggct gctggctatc aatacacgct tccaagacaa tggcagggcc 3780
ctgatgccct ttgacagcct gcacgatgac ccctgcctcc tcaccaaccg ctccgcccgc 3840
attccttgtt ttctggcagg tcagcccggg gactgaacta gagtggcata gagctgtttc 3900
cagcttgtga gaacacagcc tgtatgtgag caacatgcgg gcttgtgata agagatgctg 3960
gtctcaacaa cttattagtc tagttgcctt ggtaacgagt tggatggaga cagaaaggaa 4020
aataacagca aaaatcaaac cacataagca tacaaaaaaa aaatcctcca tccatcaact 4080
gaagatggag tcacagggct gctaaggacc ctctattatt gatccagctt tctctgtctt 4140
ctccctcctg tggactgtgg aaaaagagag agccaagtct atgtccacaa gggacagaga 4200
actaaaagtg acagagagga atatggcatc ctcacctttt agaaccatcc tgtccaatct 4260
ggagctagta gccacatgtg gttatttcaa tttaaattct ttgtagcagg gagtactggc 4320
tcacaccttt aatcccagtc tttgggaggt agaggcatga ggctcttagt gagaattcaa 4380
ggccagcctg gtctacagag tgagttctag gacagccagg gctatagagt gatagtgaga 4440
ccctgtcttg aaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga 4500
agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaaa acaaccaata 4560
aatacataaa taattttaaa ttaaattaaa agtttctgca gtaactgcat tttaagggct 4620
cagtagtcca tgggtgaaga agtggttgtt ttcttcacct cagaaaattc tagtagattg 4680
tgtcacagaa tatcactccg tgagcttttt ggtttcttag aaagacagaa ggtgggattt 4740
caaaaggaga gatgtttggc agtttgggga taggattggg gcaggggttg tggtcacacc 4800
cagaaattga tgcctctccc tcacacctct ctgtgatttt agactgggtt atagctagcc 4860
ttcgcaggtc tggtacttgc tttgaagccc aggctagctt caaacattcc tcaatcttcc 4920
tatcttagcc tgtcaagtgt tgggtggctc acatgtacca tcaagcccac acacagcggg 4980
aggtctcttc ttgcacctcc cttcccttct aggggtccag ttggtctctc ctgggtcccc 5040
tggcagggca gccaaggtca atgcaagggt gtgtctccta agggagggcc tgctctcttc 5100
tggactggtc atgacctctg gttactcatg gggtggaaaa gctactctca ggaatatgtt 5160
ttcctctcag aattttcttt ctaagttggc aagggctgag cccagtcagt gtcttgcagc 5220
aaaggccctg gcccccacct tctggccttc cctgttgaag gtttatggag cactagagga 5280
atcggggact tcattttctt gaatagtctt aggtatggat gtacacattc cgtgccctct 5340
tcccaccatg acaggatgta cagtggctta tagtgagagt gataatgaca actgtcttca 5400
aatagtagag ggtttggggt cctgttttga gaaggcttct gaggttgatc caatttgagc 5460
agaaaacatg catattactt tttggcttgt gccaatgagt acttgctctt gggagtgttc 5520
atgtattgtg gagtgtgtgt gtatgtgtgt gtagtatgta tgtatgtatg tatgcatgca 5580
tgcatataag tatgtgtagt atgtgtgtgt aatatgtctg tatgtctgtg tagtgtgtat 5640
gcatatgtat atatgtgtgt atgtatagta tgtgtatgta gtatgtgtat atgttattat 5700
gagtgtgtat agtatgtatg tgtatagtgt atgtgcatgc atatataatg tatatgtatg 5760
tgtgcatatg tgtgtagtat gtgtacatgt gtgtgtgtag taaatggcaa aatacagaaa 5820
gacacagggc ttggccttgt gcctaaggat cttgtgccta aggtctgctc caggcaggtg 5880
acaagtcaaa tgtaatggct attgggtaag gctgcaggga gtaccacagt gttcctgagc 5940
tcttatgcca gcctgtggct cacacttgaa tctggtgtgt gggagtaggt ggaaaacagg 6000
cacgtgaggg ccactgaagc tctttgctgg tcaggagatg atggagacca taaaggtgac 6060
aaaggctttg cttccctcag gggacatgcg ctccagcgag atgccggagc tcacctccat 6120
gcacaccctc tttgttcgag agcataaccg gctggccaca cagctcaagc gcctgaatcc 6180
tcgatggaat ggggagaagc tctaccagga ggcccggaag attgtagggg ccatggtcca 6240
ggtaggctgt gtcctaacac atcttggcca tgtgttcttg ggcagttttt ttttttaaat 6300
ctctcctgaa cactggcttt tttttatcca taaaaggctc aaaggagcga aatgaaaatg 6360
cccctcagac atgagatgct tggcgagtgc acttcccttc ctcctgtctc cccggccctc 6420
ttccttcctg agggcctgag gagttgagag ggtcttaagc agaagcacca gagtcaccgc 6480
tggctctttt acccgctgtc atcatcttga gcattccccc acccccaccc ccacccccac 6540
cccacccctg ccacccgggg cagggctcct ccatctggtt tttgatgttt tcatgacccc 6600
taatttccca agaatgtaaa cattcgtgca tatcacacac acacacacac acaacacaca 6660
cacacacaca cacacacaca tacacacact ccctagactt tagggagggg gtgtggttag 6720
tgctgagcat ggggttttga ttgacaggca cacccacaag agggattcac tttggtctca 6780
gaggcaattc tagccttagg tccagagtga cactgtctca cagcctttgg gggacatcgc 6840
actggagcag acctctgcca tctctctgtc tataaacctg tactgagccc tactgtgtgc 6900
tagtctattg ctggacactg tgaataatct cagtaatttc aacttccctg ggtctcaagg 6960
ggaaatggga ccactaatac cttaaagaca cgggggatat tacaatgact aaaaagacat 7020
tttgtttaat cctgagagag agggagagag aattattcct tgtttacatt tgtggttcag 7080
agagtttaat aaatgacctg aggtgagttc tatttatgtc cttctgttaa aatctaagac 7140
ctaagactat gggagactga tcctagccag gtaggggcaa ttcccccaag ctggagacca 7200
cagggaggaa caaatagaca tctaacacaa agtgactttg ttttagatca tcacataccg 7260
ggactacctg cccttggtgt tggggccagc agccatgaag aagtacctac cccagtaccg 7320
atcttacaac gactcagtag accctcgaat cgccaatgtc ttcaccaacg ctttccgtta 7380
tggccacacc ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctgaac aatcagtacc ggcccacagg 7440
gcccaacccc cgagtcccac tcagcaaggt cttttttgcc agctggagag tcgtgttgga 7500
aggtgaatgg aacctaagaa aagccagcag ctaatgatgg gatggtggct gcagagacct 7560
aggctaggga gaggtctttt ttcatcttgg ggaacccagt cttgctttcc actttcattg 7620
acttagaagg ctagcgcatc ccaaccttgt gaaccctccc ccaaccctcc aagtgttgca 7680
agagcttata gcttctctct gacccctacg attccacttg gaccagccct gactccactg 7740
tgtgctctca tagtaagaga accaaccttt cctttcactc tggtctcttg tcctcaggtg 7800
gcattgaccc catcctccga ggcctcatgg ccactccagc caaactgaat cgccagaatc 7860
aaattgtggt ggatgagatc cgggagcgac tatttgagca agtcatgagg ataggactgg 7920
atttgcctgc tcttaacatg cagcgcagcc gggatcacgg cctcccaggt gagaggccag 7980
ccacagcccc atcccacctc ccaggcagct ccccttcttg ctcaggggtc ctttccagtt 8040
ttatggatgc acctgaggca aggcgctgcc ttttccagcc cctggtggcc taagttcggc 8100
ctctcttggc ttcttcacaa gctggacttt tgcaacccgc gtagcagctg aacatcatcc 8160
cacgatctgg aagtctgcct ccatcgttag cacgttctga ctcattcatg aactcgcggg 8220
tgggagagta ccactgtcat ttttactgac gaggaaacta gggcttagag cagttcagag 8280
tctggctcgg tgtggttgcc acgtcagtga gagacgtgga ggttggacct aaggggatca 8340
gcggaaccca aaagccccgt gcctgtgttg tggagtagca caagtggcca cgcctctggg 8400
aaacgttttc attctctgag tcagagaaag atacattagg ctgctgctct aagggacaat 8460
gtgctgtttc cgtgcttgag tctggcggga tttgtggtaa tacagggctg gccagggtag 8520
gagagagtga ggaaaagagt gagaggtctg gaggagccca gctgcctact ttggcctgag 8580
ccaatcattt agggatccat tctacttacg gtcttgtgta ctgagatggg cttttgaaca 8640
tctgtgtatt ctttcctgcc cttcccagta ctcctagccg gcaggagagg ggtccattta 8700
cagctacctg ttctctggcc caacgcagga tacaatgcct ggagacgctt ttgtgggctt 8760
ccacagccca gcacagtggg tgagctcggc acggtgctga agaacctgga gttggcacgg 8820
aagctgatgg cacaatatgg cacgcccaac aacattgaca tctggatggg cggtgtgtcc 8880
gagcccctgg agcccaatgg ccgtgtaggc cagctccttg cctgcctcat tggcactcag 8940
tttaggaagc tacgtgatgg tgatcggtaa ggaagctgtg ggaaagcagg gtgccacaac 9000
tgtgaggccg ggagggggcg catgcgcacc gcagcagtca ggcggcgctt agagaacaac 9060
ttatctgtga gttggttcca tcatgtctgg tctagggatg gtagtcaagt tctcagcctt 9120
ggtggtacgt gcctttgccc actgaaccat cttgctggtc ccaaaaatgc cactcttaat 9180
aggttctctg ggtttctcag tgctactgtg gaggcgtcag ttaccatgga aaagtgccaa 9240
aagtctcccg ctgacccctt ttcatgtcat ttcatcacga tcttggaatc tccgtgtcta 9300
gttcttatct agcttgcatt acacctttgg caatatcgta aaaaggtgtc ccagtcaaga 9360
agagaacatc acaaatgcca cccaggcttt cttttacccc gtgggagcgt gcatcagact 9420
gggacccaag cagctgtgct tctgtcttct gggctgagtg ggcactgccc acgacctgag 9480
ctctcctgtg ctgtagataa gaatattctg aagccccctc acactcaggg gacgtctcaa 9540
gccaggggat gtcctgggta gcctcactcg ggacatcctc agacataatg tccacgatgc 9600
tccctcccat gcaggttttg gtgggagaac ccaggcgtgt tcagtaaaca gcagagacag 9660
gccttggcca gcatctcctt gccccgtatc atctgtgaca acactggcat caccaccgtg 9720
tcgaagaaca acatcttcat gtccaacaca tacccccgag actttgtcag ctgtaacacc 9780
cttcctaaac tgaacctgac ttcctggaag gagacctaga ggttgggtaa gggcttggca 9840
cactgaaggg tatacctggt tggctagtgg gaatcacaga gaactctctt ccctgggtga 9900
atccatcttt gtggatattg tgggtgacag tggggggtgg ggggaaatga ctggacattc 9960
acttgtgagt gcacaagtat atttgcatat acacttgtgc acatctatat atatgcaaca 10020
tacataaact agtatttcat gtgtgtctgg tctgtgagca tgggcaatgt ttgatgtgcc 10080
ttgtgtgcct gccaatcaca tgagtctggg ctcactgctt acgacaatat taggaacgtg 10140
gggacagtga gcagacagcc cgagttcaag tcatcaccct gtagcacagt actgtgtgtg 10200
actttggcca aattactcta aggataaatt ctcttcctta taaatgaaat cagccacggc 10260
ttgttagagg gcctattgcc tcctccaact ctccactcat ggagcagctc ccatgtgcta 10320
ggcactgtgc tagccatggg aagcagaaac aataaagatg aataccaaag atgaatgcca 10380
aatcctcgat caccttctgg ttggcagaaa caaggtggtg gcctccggag gagaggatgc 10440
agctagcagc tgggctgtgt ggttgtgata cagttctggg ccagctctgc ttaactggct 10500
atttctcctt ttcccttact ctcttctctt gctattcaca ggagtctgcc gggagaagga 10560
cggaggccat tggccttcct gtgctatttg tacctgaggt tcacactaat aaaacatggt 10620
ggatgggga 10629
<210> 16
<211> 718
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MPO蛋白序列登录号：NP_034954
<400> 16
Met Lys Leu Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Ala Pro Leu Ala Met
1 5 10 15
Leu Gln Thr Ser Asn Gly Ala Thr Pro Ala Leu Leu Gly Glu Val Glu
20 25 30
Asn Ser Val Val Leu Ser Cys Met Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp
35 40 45
Arg Ala Tyr Lys Glu Arg Arg Glu Ser Ile Lys Arg Ser Leu Gln Ser
50 55 60
Gly Ser Ala Ser Pro Thr Glu Leu Leu Phe Tyr Phe Lys Gln Pro Val
65 70 75 80
Ala Gly Thr Arg Thr Ala Val Arg Ala Ala Asp Tyr Leu His Val Ala
85 90 95
Leu Asp Leu Leu Lys Arg Lys Leu Gln Pro Leu Trp Pro Arg Pro Phe
100 105 110
Asn Val Thr Asp Val Leu Thr Pro Ala Gln Leu Asn Leu Leu Ser Val
115 120 125
Ser Ser Gly Cys Ala Tyr Gln Asp Val Arg Val Thr Cys Pro Pro Asn
130 135 140
Asp Lys Tyr Arg Thr Ile Thr Gly His Cys Asn Asn Arg Arg Ser Pro
145 150 155 160
Thr Leu Gly Ala Ser Asn Arg Ala Phe Val Arg Trp Leu Pro Ala Glu
165 170 175
Tyr Glu Asp Gly Val Ser Met Pro Phe Gly Trp Thr Pro Gly Val Asn
180 185 190
Arg Asn Gly Phe Lys Val Pro Leu Ala Arg Gln Val Ser Asn Ala Ile
195 200 205
Val Arg Phe Pro Asn Asp Gln Leu Thr Lys Asp Gln Glu Arg Ala Leu
210 215 220
Met Phe Met Gln Trp Gly Gln Phe Leu Asp His Asp Ile Thr Leu Thr
225 230 235 240
Pro Glu Pro Ala Thr Arg Phe Ser Phe Phe Thr Gly Leu Asn Cys Glu
245 250 255
Thr Ser Cys Leu Gln Gln Pro Pro Cys Phe Pro Leu Lys Ile Pro Pro
260 265 270
Asn Asp Pro Arg Ile Lys Asn Gln Lys Asp Cys Ile Pro Phe Phe Arg
275 280 285
Ser Cys Pro Ala Cys Thr Arg Asn Asn Ile Thr Ile Arg Asn Gln Ile
290 295 300
Asn Ala Leu Thr Ser Phe Val Asp Ala Ser Gly Val Tyr Gly Ser Glu
305 310 315 320
Asp Pro Leu Ala Arg Lys Leu Arg Asn Leu Thr Asn Gln Leu Gly Leu
325 330 335
Leu Ala Ile Asn Thr Arg Phe Gln Asp Asn Gly Arg Ala Leu Met Pro
340 345 350
Phe Asp Ser Leu His Asp Asp Pro Cys Leu Leu Thr Asn Arg Ser Ala
355 360 365
Arg Ile Pro Cys Phe Leu Ala Gly Asp Met Arg Ser Ser Glu Met Pro
370 375 380
Glu Leu Thr Ser Met His Thr Leu Phe Val Arg Glu His Asn Arg Leu
385 390 395 400
Ala Thr Gln Leu Lys Arg Leu Asn Pro Arg Trp Asn Gly Glu Lys Leu
405 410 415
Tyr Gln Glu Ala Arg Lys Ile Val Gly Ala Met Val Gln Ile Ile Thr
420 425 430
Tyr Arg Asp Tyr Leu Pro Leu Val Leu Gly Pro Ala Ala Met Lys Lys
435 440 445
Tyr Leu Pro Gln Tyr Arg Ser Tyr Asn Asp Ser Val Asp Pro Arg Ile
450 455 460
Ala Asn Val Phe Thr Asn Ala Phe Arg Tyr Gly His Thr Leu Ile Gln
465 470 475 480
Pro Phe Met Phe Arg Leu Asn Asn Gln Tyr Arg Pro Thr Gly Pro Asn
485 490 495
Pro Arg Val Pro Leu Ser Lys Val Phe Phe Ala Ser Trp Arg Val Val
500 505 510
Leu Glu Gly Gly Ile Asp Pro Ile Leu Arg Gly Leu Met Ala Thr Pro
515 520 525
Ala Lys Leu Asn Arg Gln Asn Gln Ile Val Val Asp Glu Ile Arg Glu
530 535 540
Arg Leu Phe Glu Gln Val Met Arg Ile Gly Leu Asp Leu Pro Ala Leu
545 550 555 560
Asn Met Gln Arg Ser Arg Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn Ala Trp
565 570 575
Arg Arg Phe Cys Gly Leu Pro Gln Pro Ser Thr Val Gly Glu Leu Gly
580 585 590
Thr Val Leu Lys Asn Leu Glu Leu Ala Arg Lys Leu Met Ala Gln Tyr
595 600 605
Gly Thr Pro Asn Asn Ile Asp Ile Trp Met Gly Gly Val Ser Glu Pro
610 615 620
Leu Glu Pro Asn Gly Arg Val Gly Gln Leu Leu Ala Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Thr Gln Phe Arg Lys Leu Arg Asp Gly Asp Arg Phe Trp Trp Glu Asn
645 650 655
Pro Gly Val Phe Ser Lys Gln Gln Arg Gln Ala Leu Ala Ser Ile Ser
660 665 670
Leu Pro Arg Ile Ile Cys Asp Asn Thr Gly Ile Thr Thr Val Ser Lys
675 680 685
Asn Asn Ile Phe Met Ser Asn Thr Tyr Pro Arg Asp Phe Val Ser Cys
690 695 700
Asn Thr Leu Pro Lys Leu Asn Leu Thr Ser Trp Lys Glu Thr
705 710 715
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> APOE正向引物
<400> 17
gagctgatct gtcacctccg 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> APOE反向引物
<400> 18
gacttgtttc ggaaggagc 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CCL2正向
<400> 19
gggatcatct tgctggtgaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CCL2反向
<400> 20
aggtccctgt catgcttctg 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CXCL10正向
<400> 21
aactgcatcc atatcgatga c 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CXCL10反向
<400> 22
gtggcaatga tctcaacac 19
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL1β正向
<400> 23
ggagaaccaa gcaacgacaa aata 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL1β反向
<400> 24
tggggaactc tgcagactca aac 23
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MPO正向
<400> 25
tggtggcctg cagagtatga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MPO反向
<400> 26
gttgaggcca gtgaagaagg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S100β正向
<400> 27
ttgccctcat tgatgtcttc ca 22
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> S100β反向
<400> 28
tctgccttga ttcttacagg tgac 24
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFα正向
<400> 29
agggtctggg ccatagaact 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFα反向
<400> 30
ccaccacgct cttctgtcta c 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VCAM1正向
<400> 31
ggagcctgtc agttttgaga atg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VCAM1反向
<400> 32
ttggggaaag agtagatgtc cac 23
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T173
<400> 33
tgcacatccc ggtgatggtg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> D260
<400> 34
caggggtgaa gtcgaggtcg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H502
<400> 35
ggatgagggt gtggccgtag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T173 T7正向引物
<400> 36
tcttcctcca gggagtctca 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T173 T7反向引物
<400> 37
gcaggaagga gacaggtcat 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C319 T7正向引物
<400> 38
ccaggttccc agttcagtgt 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C319 T7反向引物
<400> 39
ccacagcgtt ctctgtcctt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H502 T7正向引物
<400> 40
atgcctctca gtgccactct 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H502 T7反向引物
<400> 41
agccaggtca ggggaagtat 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C319 gRNA
<400> 42
ggatggtgat gttgctcccg 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T173原间隔体
<400> 43
tgcacatccc ggtgatggtg cgg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> D260原间隔体
<400> 44
caggggtgaa gtcgaggtcg tgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H502原间隔体
<400> 45
ggatgagggt gtggccgtag cgg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C319原间隔体
<400> 46
ggatggtgat gttgctcccg ggg 23
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C167A-1 gRNA
<400> 47
ggacgtgggg gtgacttgcc 20
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C167A，在切割之前和之后
<400> 48
caggacgtgg gggtgacttg cccggagcag gacaaa 36
<210> 49
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成C167A的模板ssODN寡聚物
<400> 49
gttgtccaag tcaagcggct gcgcctacca ggacgtgggg gtgactgccc ctgagcagga 60
caaataccgc accatcaccg ggatgtgcaa caacaggtgc ggc 103
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C180A-1 gRNA
<400> 50
tcaccgggat gtgcaacaac 20
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C180A-1，在切割之前和之后
<400> 51
accatcaccg ggatgtgcaa caacaggtgc ggctggctg 39
<210> 52
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成C180A的模板ssODN寡聚物
<400> 52
cttgcccgga gcaggacaaa taccgcacca tcaccgggat ggccaacaac agctgcggct 60
ggctgggggt ggctgcagga accgggctca gagaggcgtc ccg 103
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Y173C-1，在切割之前和之后
<400> 53
tgcccggagc aggacaaata ccgcaccatc accggg 36
<210> 54
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成Y173C的模板ssODN寡聚物
<400> 54
ggctgcgcct accaggacgt gggggtgact tgcccggagc aggacaaatg tcgcaccatc 60
accgggatgt gcaacaacag gtgcggctgg ctgggggtgg ctg 103
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA Q257A-1
<400> 55
catgcaatgg ggccagctgt 20
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Q257A-1，在切割之前和之后
<400> 56
catgttcatg caatggggcc agctgttgga ccacga 36
<210> 57
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成Q257A的模板ssODN寡聚物
<400> 57
gactccggac caggagcgct cactcatgtt catgcaatgg ggcgcgctgt ttgaccacga 60
cctcgacttc acccctgagc cggccgcccg ggcctccttc gtc 103
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> D260A-1，在切割之前和之后
<400> 58
gcaatggggc cagctgttgg accacgacct cgacttcacc cct 43
<210> 59
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成D260A的模板ssODN寡聚物
<400> 59
ccggaccagg agcgctcact catgttcatg caatggggcc agctgttggc acacgacctc 60
gacttcaccc ctgagccggc cgcccgggcc tccttcgtca ctg 103
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA M409A-1
<400> 60
ggtgagctcg ggcatctcac 20
<210> 61
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M409A-1，在切割之前和之后
<400> 61
aggggacacc cgttccagtg agatgcccga gctcacctcc a 41
<210> 62
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成M409A的模板ssODN寡聚物
<400> 62
gaggccttaa gaatgacagt ggcttttgcc tccccaaggg gacacccgtt acagtgaggc 60
gcccgagctc acctccatgc acaccctctt acttcgggag cac 103
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA E408A-1
<400> 63
ggtgagctcg ggcatctcac 20
<210> 64
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E408A-1，在切割之前和之后
<400> 64
aggggacacc cgttccagtg agatgcccga gctcacctcc a 41
<210> 65
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成E408A的模板ssODN寡聚物
<400> 65
gaggccttaa gaatgacagt ggcttttgcc tccccaaggg gacacccgtt acagtgcgat 60
gcccgagctc acctccatgc acaccctctt acttcgggag cac 103
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA H261A-1
<400> 66
caggggtgaa gtcgaggtcg 20
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H261A-1，在切割之前和之后
<400> 67
gcagcgcagc agggaccacg acctcccagg tgaggggct 39
<210> 68
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成H261A的模板ssODN寡聚物
<400> 68
atgaggattg ggctggacct gcctgctctg aacatgcagc gcagcaggga cgccgacctc 60
ccaggtgagg ggctgcagga gtctcccctg atgctcacct cccc 104
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C319A-1，在切割之前和之后
<400> 69
cctggcccag atctcattgc cccggatcat ctgcgacaa 39
<210> 70
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成C319A的模板ssODN寡聚物
<400> 70
gggtgtgttc agcatgcagc agcgacaggc cctggcccag atctcatgcc accggatcat 60
ctgcgacaac acaggcatca ccaccgtgtc taagaacaac at 102
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA M251A-1
<400> 71
gctcactcat gttcatgcaa 20
<210> 72
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M251A，在切割之前和之后
<400> 72
gagcgctcac tcatgttcat gcaatggggc cagctgttg 39
<210> 73
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成M251A的模板ssODN寡聚物
<400> 73
ccactgatca gctgactccg gaccaggagc gctcactcac gttcatgcaa tgtggccagc 60
tgttggacca cgacctcgac ttcacccctg agccggccgc ccg 103
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA R569W-1
<400> 74
aattgcagtg gatgagatcc 20
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R569W-1，在切割之前和之后
<400> 75
gcagtggatg agatccggga gcgattgttt gagcagg 37
<210> 76
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成R569W的模板ssODN寡聚物
<400> 76
cacccctgcc aagctgaatc gtcagaacca aattgcagtg gatgagatct gagagcgatt 60
gtttgagcag gtcatgagga ttgggctgga cctgcctgct ctg 103
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA R499C-1
<400> 77
ttcaccaatg ccttccgcta 20
<210> 78
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R499C-1，在切割之前和之后
<400> 78
accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atc 33
<210> 79
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成R499C的模板ssODN寡聚物
<400> 79
gactcagtgg acccacgcat cgccaacgtc ttcaccaatg ccttctgcta ccgccacacc 60
ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctggac aatcggtacc agc 103
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA G501S-1
<400> 80
ttcaccaatg ccttccgcta 20
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G501S-1，在切割之前和之后
<400> 81
accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atc 33
<210> 82
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成G501S的模板ssODN寡聚物
<400> 82
gactcagtgg acccacgcat cgccaacgtc ttcaccaatg ccttccgcta cagccacacc 60
ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctggac aatcggtacc agcc 104
<210> 83
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H502A-1，在切割之前和之后
<400> 83
accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atcca 35
<210> 84
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成H502A的模板ssODN寡聚物
<400> 84
tacaatgact cagtggaccc acgcatcgcc aacgtcttca ccaatgcctt acgctacggc 60
gccaccctca tccaaccctt catgttccgc ctggacaatc ggt 103
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA C158A-1
<400> 85
gtcaagcggc tgcgcctacc 20
<210> 86
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C158A-1，在切割之前和之后
<400> 86
gtccaagtca agcggctgcg cctaccagga cgtgggg 37
<210> 87
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成C158A的模板ssODN寡聚物
<400> 87
gacgcccgcc cagctgaatg tgttgtccaa gtcaagcggc gccgcctacc atgacgtggg 60
ggtgacttgc ccggagcagg acaaataccg caccatcacc ggg 103
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA N355A-1
<400> 88
gctggttgga catgttgcgc 20
<210> 89
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> N355A-1，在切割之前和之后
<400> 89
ccctggccag gaacctgcgc aacatgtcca accagctg 38
<210> 90
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成N355A的模板ssODN寡聚物
<400> 90
ttcgtggacg ccagcatggt gtacggcagc gaggagcccc tggccaggaa tctgcgcgcc 60
atgtccaacc agctggggct gctggccgtc aaccagcgct tcc 103
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA R128A-1
<400> 91
tggctctaga cctgctggag 20
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R128A-1，在切割之前和之后
<400> 92
tagacctgct ggagaggaag ctgcggtccc tg 32
<210> 93
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于达成R128A的模板ssODN寡聚物
<400> 93
cggcggtgag ggccgctgac tacctgcacg tggctctaga cctgctggag gcgaagctgc 60
ggtccctgtg gcgaaggcca ttcaatgtca ctgatgtgct gac 103
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C167A-1原间隔体
<400> 94
ggacgtgggg gtgacttgcc cgg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C180A-1原间隔体
<400> 95
tcaccgggat gtgcaacaac agg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Q257A-1原间隔体
<400> 96
catgcaatgg ggccagctgt tgg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M409A-1原间隔体
<400> 97
ggtgagctcg ggcatctcac tgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E408A-1原间隔体
<400> 98
ggtgagctcg ggcatctcac tgg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H261A-1原间隔体
<400> 99
caggggtgaa gtcgaggtcg tgg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M251A-1原间隔体
<400> 100
gctcactcat gttcatgcaa tgg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R569W-1原间隔体
<400> 101
aattgcagtg gatgagatcc ggg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R499C-1原间隔体
<400> 102
ttcaccaatg ccttccgcta cgg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G501S-1原间隔体
<400> 103
ttcaccaatg ccttccgcta cgg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C158A-1原间隔体
<400> 104
gtcaagcggc tgcgcctacc agg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 355A-1原间隔体
<400> 105
gctggttgga catgttgcgc agg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R128A-1原间隔体
<400> 106
tggctctaga cctgctggag agg 23

Claims (45)

1.一种调节哺乳动物受试者中髓过氧化物酶(MPO)的表达和/或活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下中的至少一者的步骤：
(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化骨髓(BM)细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和
(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述未分化BM细胞是造血干细胞(HSC)或祖细胞。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因编辑化合物包括以下中的至少一者：至少一种可编程经工程改造核酸酶(PEN)，包含编码所述PEN的序列的任何核酸分子，或包含所述至少一种PEN、或编码所述PEN的所述核酸分子的任何药盒、组合物或运载体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述PEN包含至少一种成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(cas)蛋白系统，并且其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下中的至少一者的步骤：
(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和
(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的引导RNA(gRNA)的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含如由以下中的任一者表示的核酸序列：SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:88和SEQ IDNO:91。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体是用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体属于自体来源或属于同种异体来源。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体是同种异体受试者的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的BM细胞群体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中调节MPO的表达和/或活性包括抑制或消除所述受试者中MPO的表达和/或活性。
10.一种用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的以下中的至少一者的步骤：
(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和
(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体是用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。
12.根据权利要求10和11中任一项所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体属于自体来源或属于同种异体来源。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述未分化BM细胞群体是同种异体受试者的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的BM细胞群体。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述基因编辑化合物包括以下中的至少一者：至少一种PEN，包含编码所述PEN的序列的任何核酸分子，或包含所述至少一种PEN、或编码所述PEN的任何核酸序列的任何药盒、组合物或运载体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种PEN包含至少一种CRISPR/Cas系统，并且其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的：
(a)至少一种包含至少一种Cas蛋白的多肽，或编码所述Cas蛋白的任何核酸序列；和
(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；
或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体的步骤。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含如由以下中的任一者表示的核酸序列：SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:88和SEQID NO:91。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的方法，其中所述MPO相关疾患是神经变性病症、免疫相关病症、呼吸病症、增生性病症、血管病症或它们的任何组合中的至少一者。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述神经变性病症是阿尔茨海默氏病(AD)和帕金森氏病(PD)中的任一者。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫相关病症是自体免疫病症和炎症性病症中的至少一者。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述自体免疫病症是多发性硬化症(MS)、抗嗜中性白细胞细胞质抗体(ANCA)相关病症和全身性红斑狼疮(SLE)中的任一者。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述炎症性疾病是动脉粥样硬化和类风湿性关节炎(RA)中的任一者。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述呼吸病症是肺动脉高血压(PAH)。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述增生性病症是癌症。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的以下中的至少一者：
(a)至少一种适合于调节有需要的受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和
(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体；所述组合物任选地还包含药学上可接受的一种或多种载体、一种或多种稀释剂和/或一种或多种赋形剂中的至少一者。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述基因编辑化合物是至少一种包含至少一种CRISPR/cas系统的PEN，所述CRISPR/cas系统包含以下中的至少一者：
(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和
(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的药物组合物，其中所述gRNA包含如由以下中的任一者表示的核酸序列：SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35SEQ ID NO:42、SEQID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:91。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的药物组合物，其中所述未分化BM细胞群体是用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述未分化BM细胞群体属于自体来源或属于同种异体来源。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的药物组合物，其中所述未分化BM细胞群体是同种异体受试者的展现MPO的受抑制或经消除表达和/或活性的BM细胞群体。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或疾病或延迟所述疾患或疾病的发作的方法中使用。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述MPO相关疾患是神经变性病症、免疫相关病症、呼吸病症、增生性病症、血管病症或它们的任何组合中的至少一者。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述神经变性病症是AD和PD中的任一者。
33.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述免疫相关病症是自体免疫病症和炎症性病症中的至少一者。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述自体免疫病症是MS、ANCA相关病症和SLE中的任一者。
35.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述呼吸病症是PAH。
36.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述增生性病症是癌症。
37.至少一种未分化BM细胞，所述细胞用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述细胞属于罹患MPO相关疾患的受试者。
39.根据权利要求37至38中任一项所述的细胞，所述细胞供在用于调节哺乳动物受试者中MPO的表达和/或活性的方法中使用。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的细胞，所述细胞供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用。
41.供在用于治疗、预防、改善、抑制哺乳动物受试者中MPO相关疾患或延迟所述疾患的发作的方法中使用的治疗有效量的以下中的至少一者：
(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和
(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
42.根据权利要求41使用的治疗有效量的(a)的至少一种基因编辑化合物和(b)的未分化BM细胞群体中的至少一者，其中所述未分化BM细胞群体是用至少一种能够调节所述细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物转导或转染的BM细胞群体。
43.根据权利要求41至42中任一项使用的治疗有效量的(a)的至少一种基因编辑化合物和(b)的未分化BM细胞群体中的至少一者，其中所述基因编辑化合物是至少一种包含至少一种CRISPR/cas系统的PEN，所述CRISPR/cas系统包含以下中的至少一者：
(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和
(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
44.一种用于抑制哺乳动物受试者中NETosis和相关疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的以下中的至少一者的步骤：
(a)至少一种适合于调节所述受试者的至少一种未分化BM细胞中MPO的表达和/或活性的基因编辑化合物；和
(b)展现MPO的经调节表达和/或活性的未分化BM细胞群体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述基因编辑化合物是至少一种包含至少一种CRISPR/cas系统的PEN，所述CRISPR/cas系统包含以下中的至少一者：
(a)至少一种CRISPR/cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的任何核酸分子；和
(b)至少一种包含至少一个靶向MPO基因内的原间隔体的gRNA的核酸序列，或编码所述gRNA的任何核酸序列；或包含(a)和(b)中的至少一者的任何药盒、组合物或运载体。
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