KR20210045988A - 미엘로퍼옥시다제(mpo) 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

미엘로퍼옥시다제(mpo) 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상체의 미분화 골수(BM) 세포에서 미엘로퍼옥시다제(MPO) 수준 및/또는 활성을 생체외 및/또는 생체내에서 조절함으로써, 포유동물 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MPO-관련 장애를 치료하기 위한 치료 방법 및 조성물을 더 제공한다.

Description

미엘로퍼옥시다제(MPO) 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물
본 발명은 미엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase: MPO) 발현을 조절하기 위한 방법 및 조성물, 그리고 MPO-관련 병태의 치료에서 이의 용도에 관한 것이다.
현재 개시된 특허 대상과 관련된 배경기술로 간주되는 참고 문헌은 다음과 같다:
[1] Nauseef WM, Borregaard N. Neutrophils at work. Nat Immunol. 2014;15:602-611.
[2] Delgado-Rizo V, Martinez-Guzman MA, Iniguez-Gutierrez L, Garcia-Orozco A, Alvarado-Navarro A, Fafutis-Morris M. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Front Immunol. 2017;8.
[3] Winterbourn CC, Kettle AJ, Hampton MB. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annu Rev Biochem. 2016;85:765-792.
[4] Metzler KD, Goosmann C, Lubojemska A, Zychlinsky A, Papayannopoulos V. Myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 2014;8:883-896.
[5] Strzepaa A, Pritchardc KA, Dittel BM. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cell Immunol. 2017; 317: 1-8.
[6] Khan AA, Alsahli MA, Rahmani AH. Myeloperoxidase as an Active Disease Biomarker: Recent Biochemical and Pathological Perspectives. Med. Sci. 2018 633.
[7] Zenaro E, Pietronigro E, Bianca V Della, et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nat Med. 2015;21(8):880-886.
[8] Azevedo EPC, Guimaraes-Costa AB, Torezani GS, et al. Amyloid fibrils trigger the release of neutrophil extracellular traps (NETs), causing fibril fragmentation by NET-associated elastase. J Biol Chem. 2012;287(44):37206-37218.
[9] Gellhaar S, Sunnemark D, Eriksson H, Olson L, Galter D. Myeloperoxidase-immunoreactive cells are significantly increased in brain areas affected by neurodegeneration in Parkinson's and Alzheimer's disease. Cell Tissue Res. 2017;369(3):445-454.
[10] Naegele M, Tillack K, Reinhardt S, Schippling S, Martin R, Sospedra M. Neutrophils in multiple sclerosis are characterized by a primed phenotype. J Neuroimmunol. 2012;242(1-2):60-71.
[11] Rivers TM. Observations on attempts to produce acute disseminated encephalomyelitis in monkeys. J Exp Med. 1933;58(1):39-53.
[12] Richard JF, Roy M, Audoy-Remus J, Tremblay P, Vallieres L. Crawling phagocytes recruited in the brain vasculature after pertussis toxin exposure through IL6, ICAM1 and ITGαM. Brain Pathol. 2011;21(6):661-671.
[13] Carlson T, Kroenke M, Rao P, Lane TE, Segal B. The Th17-ELR+ CXC chemokine pathway is essential for the development of central nervous system autoimmune disease. J Exp Med. 2008;205(4):811-823.
[14] Wu F, Cao W, Yang Y, Liu A. Extensive infiltration of neutrophils in the acute phase of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Histochem Cell Biol. 2010;133(3):313-322.
[15] Aube B, Levesque SA, Pare A, et al. Neutrophils Mediate Blood-Spinal Cord Barrier Disruption in Demyelinating Neuroinflammatory Diseases. J Immunol. 2014;193(5):2438-2454.
[16] Pun PBL, Lu J, Moochhala S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 2009;43(4):348-364.
[17] Zhang H, Ray A, Miller NM, Hartwig D, Pritchard KA, Dittel BN. Inhibition of myeloperoxidase at the peak of experimental autoimmune encephalomyelitis restores blood-brain barrier integrity and ameliorates disease severity. J Neurochem. 2016;136(4):826-836.
[18] Karin Steinbach, Melanie Piedavent, Simone Bauer, Johannes T. Neumann, and Manuel A. Friese. Neutrophils Amplify Autoimmune Central Nervous System Infiltrates by Maturing Local APCs. J Immunol 2013; 191:4531-4539.
[19] Malle1 E, Furtmuller PG, Sattler W, Obinger C. Myeloperoxidase: a target for new drug development. British Journal of Pharmacology 2007; 152, 838-854.
[20] WO2015148716.
[21] Van Der Veen BS, Myeloperoxidase: molecular mechanisms of action and their relevance to human health and disease. Antioxidants & redox signaling, 2009, 11.11: 2899-2937.
[22] YU, Guoliang; SHIKAN ZHENG, Hao Zhang. Inhibition of myeloperoxidase by N-acetyl lysyltyrosylcysteine amide reduces experimental autoimmune encephalomyelitis-induced injury and promotes oligodendrocyte regeneration and neurogenesis in a murine model of progressive multiple sclerosis. Neuroreport, 2018, 29.3: 208.
본 명세서에서 상기 참고 문헌에 대한 인정은 이들이 현재 개시된 특허대상의 특허 가능성과 어떤 방식으로든 관련이 있다는 의미로 추론되어서는 안된다.
배경기술
호중구는 혈류에 걸쳐있는 식세포 과립 함유 세포이며, 천연의 면역 반응의 중심 매개체로 알려져 있다. 박테리아 감염 또는 조직 손상으로 인한 초기 염증 개시 신호에 따라, 호중구는 혈류에서 내피 세포 장벽을 통해 손상 부위로 이동하여 초기 염증 반응을 매개한다. 이러한 반응은 주로 박테리아 세포 또는 이물질의 식균 작용뿐만 아니라 프로테아제와 활성 산소 종(reactive oxygen species: ROS)을 포함하는 사이토카인 및 과립의 방출에 기인한다[1]. 최근에 확립된 호중구의 특징은 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular trap: NET)을 형성하는 능력이다. NET의 생성(네토시스(NETosis)로 알려짐)은 염색질 탈응축 후 DNA가 세포에서 방출되고, 여러 살균성 단백질과 함께 그물 모양의 트랩을 형성하는 엄격하게 제어되는 메커니즘이다[2].
미엘로퍼옥시다제(MPO)는 여러 골수성 세포에 의해 발현되는 헴-함유 과산화 효소이며, 호중구(5%의 호중구 순중량을 포함함)에서 발현되는 가장 일반적인 단백질이다. MPO는 독성 물질인 차아염소산(HClO) 및 기타 산화성 물질의 형성을 촉매한다[3]. 최근 뮤린 호중구에 대한 MPO 적정은 염색질 탈응축 및 NET 형성을 촉진하는 것으로 나타났다. 더욱이, MPO 결핍이 있는 인간 공여자로부터 유래된 호중구는 NET을 생산할 수 없다는 것이 밝혀졌으며, 이는 MPO가 NET 형성에 필수적임을 나타낸다[4].
MPO는 다수의 병태, 예를 들어 심혈관 질환, 염증성 질환, 신경퇴행성 질환, 신장 질환 및 면역-매개성 질환에서 핵심 요소를 나타내는 것으로 나타났다[5-6]. 문헌[Van Der Been et al.]은 여러 질환, 특히 급성 또는 만성 염증을 특징으로 하는 질환에서 MPO의 영향을 보고하고 있다[21].
보다 구체적으로, 알츠하이머병(AD)과 치매는 기억, 방향, 판단 및 추론과 관련된 전반적인 인지 저하를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질환이며, 노인에서 가장 흔한 형태의 치매이다. 면역 세포는 AD 병인에 관여하는 것으로 오랫동안 알려져 왔으며, 반응성 신경아교세포는 이전에 Alois Alzheimer에 의해 설명되었다. 성상세포와 미세아교세포는 AD의 맥락에서 광범위하게 연구되었으며, 아밀로이드-β 플라크 주변에 군집하는 것으로 알려져 있다. 이러한 세포가 활성화되면, 다양한 전-염증성 매개체를 분비하여 잠재적으로 뉴런 및 주변 혈관 조직에 산화적 손상을 일으키고 만성 염증을 촉진한다. 한때 뇌 생리학 및 병리와 관련성이 덜한 것으로 여겨졌지만, 최근 몇 년 동안 AD에서 말초 면역 세포의 역할에 대한 연구가 증가하고 있다. 이 역할은 AD에 대한 감수성 유전자좌(susceptibility loci)로서 골수성 세포에 의해 발현된 면역-관련 유전자 내의 다중 유전자좌를 확인하는 지난 몇 년 동안 수행된 게놈 전반의 연관 연구에 의해 강력하게 지지되었다. 최근 Zenaro와 동료들은 뇌에 침투된 호중구가 전-염증성 사이토카인 IL-17을 방출하고 NET를 생성함으로써 AD의 두 마우스 모델에서 AD와 유사한 병리를 촉진한다고 보고하였다. 호중구 고갈 또는 CNS로의 호중구 이동의 저해는 인지 및 기억력을 향상시켰을 뿐만 아니라, 신경염증 및 Aβ 부담을 감소시켰다. 마지막으로, 그들은 또한 NET-형성 호중구가 건강한 개체와 달리 AD 환자의 뇌에서 상승한다고 보고하였다[7]. 더욱이, 호중구로부터의 NET 방출은 또한 아밀로이드 원섬유에 의해 촉발되어 신경퇴행성 뇌에서 NET의 형성을 지원하는 것으로 나타났으며[8], MPO 면역-반응성 세포는 신경 퇴행의 특정 영역에서 AD 및 PD 환자의 뇌에서 보고되었다[9]. 또한, 뇌에 침투된 호중구는 전-염증성 사이토카인 IL-17을 방출하고 NET을 생성하는 것과 관련된 AD의 두 마우스 모델에서 AD와 유사한 병리를 촉진하는 것으로 나타났다. 반면에, 항-LY6G 항체를 사용한 호중구 고갈 또는 CNS로의 호중구 이동의 저해는 인지 및 기억력을 향상시켰을 뿐만 아니라 신경염증 및 아밀로이드-β 수준을 감소시켰다. 최근에는, AD 모델 마우스의 뇌에서 피질 모세혈관의 호중구 부착이 강화되어 대뇌 혈류가 감소되는 것으로 보고되었다.
더욱이, 젊은 성인에게 가장 흔한 신경퇴행성 질환인 다발성 경화증(Multiple sclerosis: MS)은 뇌와 척수에 있는 수초의 면역 공격을 특징으로 하는 만성 자가면역 질환으로, 주로 뇌-혈액 장벽(brain-blood barrier: BBB)을 통한 T 세포 침윤에 의해 매개된다. 비-자가면역성 신경퇴행성 질환과 달리 MS의 원인은 선천성 및 후천성 면역 세포를 모두 포함하지만, 호중구-매개성 조직 손상의 관련을 나타내는 몇 가지 증거가 있다. MS 환자로부터 유래된 호중구는 탈과립화 및 NET 형성 증가 및 산화성 버스트(oxidative burst) 증가와 함께 프라이밍된 표현형을 나타낸다[10]. 여러 증거들이 또한 MS의 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE) 마우스 모델에서 호중구의 관련성을 나타낸다[11]. EAE 동안, 호중구는 뇌 혈관계에 동원되고[12], CNS를 침범하며[13], 탈수초화 및 축삭 손상 부위 내에 축적된다[14]. 더욱이, 호중구는 BBB 및 뇌-척수 장벽(brain-spinal cord barrier: BSCB)의 파괴에 연루되며, 항-호중구 항체의 투여는 EAE 발달을 방해하는 것으로 나타났다[15].
호중구에 의한 내피 장벽 파괴는 백혈구가 CNS로 침입하여 EAE/MS 병변을 촉진할 수 있게 한다. 호중구는 임상 증상이 시작되기 직전에 CNS에 축적되며, 병변의 국재화와 관련이 있는 것으로 나타났다[13]. 호중구에 의한 내피 장벽 파괴는 활성 산소 종(ROS)의 방출에 의해 발생하는 것으로 제안되었다[16]. 따라서 EAE 동안 MPO의 저해는 BBB 온전성을 회복하고 질환의 중증도를 개선하는 것으로 나타났다[17]. 그러나, 전임상 단회-투여 항체-매개성 호중구의 고갈은 발병을 지연시켰으며, 지속적인 고갈은 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생을 약화시킨 반면, 수초-특이적 T 세포 반응의 생성은 영향을 받지 않았다. 이 연구에서, 각각의 넉아웃 마우스와 저해제를 사용함으로써 분석된 바와 같이, 미엘로퍼옥시다제 및 호중구 엘라스타제와 같은 호중구-관련 효소는 CNS 염증을 증가시키는데 기여하지 않는 것으로 밝혀졌다[18-19].
이전에 MPO 활성을 저해하기 위해 여러 가지 전략이 사용되었다. 예를 들어, 헴 부위를 변경함으로써 MPO를 저해하기 위해 아자이드, 하이드라자이드 및 하이드록삼산이 사용되었다[7]. 더 나아가, 문헌[Yu et al.]은 EAE 마우스 모드를 사용한 다발성 경화증의 치료를 위한 MPO의 특정 억제제인 N-라이실타이로실시스테인 아마이드(N-acetyl lysyltyrosylcysteine amide: KYC)를 기술하고 있다[22]. WO2015148716은 소분자 약물과 사이토카인/성장인자의 조합을 사용하여 조혈 세포의 생체외 증식을 위한 방법 및 조성물을 개시하고 있다. 여러 유전자, 그 중에서도 MPO가 영향을 받았다[20].
MPO의 헴 활성 부위를 변형시키는 것과 관련하여, 선행 기술 저해제는 MPO의 다른 도메인에 의해 매개되는 원하지 않는 기능을 처리하지 못한다. 더욱이, 이러한 저해제의 사용은 AD와 같은 병리학에서 혈관염을 유발할 수 있는 항-MPO 항체의 형성을 예방할 수 없다. 따라서 MPO-관련 질환을 앓고 있는 대상체에서 MPO 및 이의 다양한 활성을 구체적이고 효과적으로 표적화하기 위한 안전하고 효율적이며 구체적인 방법 및 조성물을 제공할 필요가 있다.
첫 번째 양태에 따르면, 본 개시내용은 포유동물 대상체에서 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 유효량의 다음 중 적어도 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 골수(bone marrow: BM) 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 또는 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물. 대안적으로 또는 추가적으로, 방법은 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단을 대상체에게 투여할 수 있다. (a) 및 (b), 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 조성물 또는 키트의 투여도 또한 본 발명의 방법에 포함된다는 점에 유의하여야 한다.
추가의 양태에 따르면, 본 개시내용은 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 치료된 대상체에게 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. (a) 및 (b), 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 조성물 또는 키트의 투여도 또한 본 발명의 방법에 포함된다.
이의 일부 추가의 양태에서, 본 발명은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 키트를 제공한다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 또는 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
일부 추가의 양태에 따르면, 본 개시내용은 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 또는 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 (들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 하나 이상의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 적어도 하나의 미분화 BM 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 조성물, 키트 및 세포 중 적어도 하나에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 포유동물 대상체에서 MPO-관련 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키기 위한 치료적 방법에 사용하기 위한 본 발명의 조성물, 키트 및 세포 중 적어도 하나를 제공한다.
또 다른 일부 추가의 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 제공한다: (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는데 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) 포유동물 대상체에서 MPO-관련 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한, MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 본 발명은 네토시스 및 관련 병태를 저해하는 방법을 더 제공한다. 본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 다음의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
본 명세서에 개시된 특허 대상을 더 잘 이해하고 실제로 그것이 어떻게 수행될 수 있는지 예를 들기 위해, 실시형태는 이제 첨부된 도면을 참조하여 오직 비제한적인 예에 의해서 기술될 것이다:
도 1: C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 확립.
표시된 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질 35-55(MOG35-55) 및 백일해 독소(pertussis toxin: PT) 농도에서 EAE 질환으로 유도된 C57BL/6 암컷 마우스의 임상 점수. 그룹당 N≥4 마우스.
도 2: 골수(BM) 이식은 방사선 조사된 C57BL/6 마우스에서 치사율을 구제한다.
치사적 방사선(9㏉)을 조사한 후, WT 마우스로부터의 BM 세포, Lin이 풍부한 BM 세포의 이식 또는 식염수 이식을 받은 2개월령 수컷 C57/BL6 마우스의 체중 추적 조사.
도 3A-3F: MPO Tm1/Lus 로부터의 BM을 5xFAD 마우스로 이식.
도 3A: 방사선 조사 및 WT 마우스로부터 유래된 BM의 이식을 받은 2개월령의 비-형질전환 한배새끼의 체중 추적을 보여주는 그래프.
도 3B: 방사선 조사 및 MpoTm1/Lus 마우스로부터 유래된 BM의 이식을 받은 2개월령의 비-형질전환 한배새끼의 체중 추적을 보여주는 그래프.
도 3C: 방사선 조사 및 WT 마우스로부터 유래된 BM의 이식을 받은 2개월령의 5xFAD 형질전환 마우스의 체중 추적을 보여주는 그래프.
도 3D: 방사선 조사 및 MpoTm1/Lus 마우스로부터 유래된 BM의 이식을 받은 2개월령의 5xFAD 형질전환 마우스의 체중 추적을 보여주는 그래프.
도 3E: WT BM-이식된 마우스에서 혈액의 퍼옥시다제 활성 검정.
도 3F: MpoTm1/Lus-BM 이식된 마우스에서 혈액의 퍼옥시다제 활성 검정.
도 4A 내지 도 4C: MPO가 결핍된 골수를 갖는 5XFAD 마우스의 생성.
도 4A: 마우스군의 개략도: 8주령 5XFAD 마우스와 이들의 비-형질전환 한배새끼에 치사적으로 방사선을 조사하고, 두 WT C57BL/6 또는 MPOtm1/lus 마우스로부터 유래된 골수를 이식하였다. 각 군의 마우스 수는 괄호 안에 표시된다.
도 4B: 10개월령 마우스로부터 유래된 골수 세포의 MPO mRNA 발현 분석. 데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정.
도 4C: 실험 설계의 개략적 타임라인.
도 5A 내지 도 5E: MPO 결핍은 5XFAD 마우스에서 불안-관련 행동의 증가를 저해한다.
도 5A: 개방 공간 미로 테스트(open field maze test)를 받은 7개월령 마우스의 모서리에서 보낸 시간을 보여주는 그래프.
도 5B: 개방 공간 미로 테스트를 받은 7개월령 마우스의 중심에서 보낸 시간을 보여주는 그래프.
도 5C: 마우스가 이동한 총 거리를 보여주는 그래프.
도 5D: 고가식 십자미로 테스트(elevated plus maze test)를 받은 마우스의 개방 통로(open arm)에서 보낸 시간을 보여주는 그래프.
도 5E: 고가식 십자미로 테스트를 받은 마우스의 폐쇄된 통로(closed arm)에서 보낸 시간을 보여주는 그래프.
데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정.
도 6A 내지 도 6E: MPO 결핍은 5XFAD 마우스에서 학습 및 기억력 감소를 보호한다.
도 6A: 2회-시험 Y-미로 테스트(two-trial Y-maze test)(단기 공간 기억을 나타냄)를 사용하여 7개월령 마우스의 새로운 통로 탐색 상대 빈도를 보여주는 그래프.
도 6B: 2회-시험 Y-미로 테스트(단기 공간 기억을 나타냄)를 사용하여 7개월령 마우스의 새로운 통로 탐색 상대 시간을 보여주는 그래프.
도 6C: 모리스 물 미로 테스트(Morris water maze test)(공간 학습을 나타냄)에서 8개월령 마우스의 탈출 지연을 보여주는 그래프.
도 6D: 모리스 물 미로 테스트(공간 학습을 나타냄)에서 8개월령 마우스가 여행한 총 거리를 보여주는 그래프.
도 6E: 9개월령 마우스의 공포 조절 테스트(fear conditioning test)에서 동결 행동(freezing behavior)을 보여주는 그래프.
데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정.
도 7A 내지 도 7E: MPO 결핍은 5XFAD 마우스에서 아밀로이드-β 플라크 축적(load)에 영향을 주지 않는다.
도 7A: WT 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI/ThioS로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지. 축적 막대=200㎛.
도 7B: WT 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI/ThioS로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지. 축적 막대=200㎛.
도 7C: MPO-KO 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI/ThioS로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지. 축적 막대=200㎛.
도 7D: MPO-KO 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI/ThioS로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지. 축적 막대=200㎛.
도 7E: ThioS 플라크 밀도의 정량화를 보여주는 그래프. 데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 맨-휘트니 검정.
도 8A 내지 도 8N: 5XFAD MPO KO 마우스에서 낮은 S100β 발현
도 8A: WT 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8B: WT 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8C: MPO-KO 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8D: MPO-KO 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8E: WT 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8F: WT 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8G: MPO-KO 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8H: MPO-KO 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8I: WT 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI/S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8J: WT 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI/S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8K: MPO-KO 골수 세포가 이식된 WT 마우스의 DAPI/S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8L: MPO-KO 골수 세포가 이식된 5XFAD 마우스의 DAPI/S100β로 염색된 해마 슬라이스의 대표 이미지.
도 8M: S100β 평균 강도의 정량화를 보여주는 그래프.
도 8N: 해마 샘플의 S100β mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프. 데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 맨-휘트니 검정.
도 9A 내지 도 9E: 5XFAD MPO KO 마우스에서 낮은 수준의 염증성 마커.
도 9A: 해마 샘플에서 IL1β의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
도 9B: 해마 샘플에서 CXCL10의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
도 9C: 해마 샘플에서 CCL2의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
도 9D: 해마 샘플에서 TNFα의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
도 9E: 해마 샘플에서 VCAM1의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 맨-휘트니 검정.
도 10A 내지 도 10C: 5XFAD MPO KO 마우스에서 낮은 APOE 수준.
도 10A: 항 APOE 항체로 프로브된 해마 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석의 사진.
도 10B: WT-WT 군 평균에 대한 각 샘플의 %로서 나타낸 웨스턴 블롯 분석 데이터를 보여주는 그래프.
도 10C: 해마 샘플에서 APOE의 mRNA 발현 분석을 보여주는 그래프.
데이터는 평균±SEM이다. *P<0.05,　**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 맨-휘트니 검정.
도 11A 내지 도 11N: 플라스미드 클로닝 및 렌티바이러스 제제
도 11A: 24시간 후, 비-형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11B: 24시간 후, 10㎕의 GFP 암호화 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11C: 24시간 후, MPO 유전자에서 gRNA2(서열번호 5)를 표적으로 하는 10㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11D: 24시간 후, MPO 유전자에서 gRNA6(서열번호 6)을 표적으로 하는 10㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11E: 48시간 후, 비-형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11F: 48시간 후, 2㎕의 GFP 암호화 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11G: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA2(서열번호 5)를 표적으로 하는 2㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11H: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA6(서열번호 6)을 표적으로 하는 2㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11I: 48시간 후, 5㎕의 GFP 암호화 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11J: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA2(서열번호 5)를 표적으로 하는 5㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11K: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA6(서열번호 6)을 표적으로 하는 5㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11L: 48시간 후, 10㎕의 GFP 암호화 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11M: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA2(서열번호 5)를 표적으로 하는 10㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 11N: 48시간 후, MPO 유전자에서 gRNA6(서열번호 6)을 표적으로 하는 10㎕의 CRISPR/Ca9 암호화 렌티바이러스 입자로 형질도입된 단리된 Lin- 세포의 FACS 분석.
도 12: MPO 절단의 T7 분석
전장 DNA 및 절단 산물의 T7 분석의 생성물을 보여주는 아가로스 겔의 사진. 겔은 사용된 각각의 crRNA에 대해, 비처리된 세포 및 Cas9와 crRNA:tracrRNA로 편집된 분류 또는 분류되지 않은 세포를 보여준다.
레인 A: H502 유전자좌 주위의 프라이머로 증폭된, 비처리된 293 세포.
레인 B: RNP 항 T173로 처리된 293 세포.
레인 C: RNP 항 D260로 처리된 293 세포.
레인 D: RNP 항 H502로 처리된 293 세포.
레인 E: 형광 표지된 tracrRNA가 풍부한, RNP 항 T173로 처리된 293 세포.
레인 F: 형광 표지된 tracrRNA가 풍부한, RNP 항 D260로 처리된 293 세포.
레인 G: 형광 표지된 tracrRNA가 풍부한, RNP 항 H502로 처리된 293 세포.
레인 H: T7 음성 대조군.
레인 I: T7 양성 대조군.
미엘로퍼옥시다제(MPO)는 감염에 대한 신체 방어 메커니즘에 관여하는 헴-함유 단백질이며, 주로 호중구의 과립에 위치한다. MPO는 다양한 면역-매개성 질환, 신경퇴행성 질환 및 염증성 질환에 관여한다.
MPO RNA는 골수에서만 검출되며, 신체의 다양한 표적 조직에 도달하는 것은 MPO 단백질뿐이다. 골수에서 발생하는 이러한 MPO 유전자의 전사는 골수의 골수성 세포 분화의 근모세포(myoblast) 단계 중 초기에 개시(turned on)되고, 골수 전구체가 분화되도록 유도될 때 중지(turned off)된다.
본 발명자들은 골수의 원시 미성숙 세포에서 MPO의 유전자 발현에 특이적으로 영향을 줌으로써 MPO 발현 및 후속 MPO 활성을 조절하여 결국 조절된 MPO(MPO 발현 및/또는 활성을 제거/저해 또는 대안적으로, 확립/증가시킴)를 갖는 호중구를 생성하는 것이 가능하다고 제안하였다. 따라서 본 발명자들은 미성숙 세포에서 MPO의 특정 골수 제자리(on-site) 유전자 조절을 호중구 및/또는 대식세포 또는 면역계 또는 이의 구성요소와 관련된 기타 세포에서 MPO 발현 및 후속 활성에 영향을 미치는 효과적이고 선택적이며 정확한 방법으로 제안하였다. 흥미롭게도, 일부 병리는 뇌와 같은 신체의 다양한 기관에서 MPO의 축적과 관련되어 있지만, 본 명세서에 기재된 MPO의 조절은 표적 기관(예를 들어, 뇌 또는 이의 임의의 구성요소)이 아닌 미분화 BM, 세포에서 유전자 또는 전사체를 암호화하는 MPO의 유전자 편집에 의해 수행된다. 따라서, BM 세포에서 생체내 또는 생체외 유전자 편집을 통해 호중구 및/또는 대식세포에서의 MPO 단백질 조절의 본 명세서에 기재된 방법은 특정 표적 조직에 제한되지 않는 광범위한 조절 방법을 제공한다. 즉, BM 세포에서 MPO를 특이적으로 조절(예를 들어, 고갈)하여 대상체의 면역계를 조절함으로써, 본 발명은 반드시 면역계에 직접 연결되는 것은 아닌 다른 기관 또는 조직에 영향을 미치는 장애를 치료하는 강력한 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 이러한 방법은 예를 들어, 다양한 이유로 아자이드, 하이드라자이드 및 하이드록삼산과 같은 MPO 단백질 저해제를 사용하는 다른 방법에 비해 유리하다는 것이 추가로 제안된다. 첫째, 공지된 MPO 단백질 저해제를 사용하여 MPO 활성을 실질적으로 조절하려면 MPO를 발현하는 호중구 및/또는 대식세포의 지속적인 형성을 해결하기 위해 지속적인 투여가 필요하다. 둘째, 공지된 MPO 단백질 저해제는 전형적으로 MPO 활성 부위(예를 들어, 헤모글로빈 결합 부위)에 결합하여 단백질 활성, 특히 퍼옥시다제 활성에 영향을 미치도록 설계된다. 따라서 이러한 접근법은 활성 부위에 의해 매개되는 MPO 기능으로 제한된다. 이러한 방식으로, 다른 MPO 활성, 예를 들어 아래에 더 상세히 기재되는 네토시스의 억제 또는 본 발명에 의해 개시된 MPO의 임의의 다른 활성, 특히 MPO 활성 부위에 의해 매개되지 않는 활성의 조절은 다루어지지 않는다. 즉, 결합 부위 이외의 다른 MPO 부위에 의해 매개되는 MPO 활성은 공지된 MPO 저해제를 사용하여 조절될 수 없다. 더욱이, 이러한 저해제의 사용은 AD와 같은 병리에서 맥관염을 유발할 수 있는 항-MPO 항체의 형성을 방지할 수 없다.
따라서, 본 개시내용은 MPO의 발현 및/또는 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 MPO를 조절하기 위한 미분화 BM 세포에서의 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 신규한 개념 및 추가로, 전사 부위, 즉 골수 및 특히 골수의 원시 미성숙 미분화 세포에서 MPO 유전자 발현을 조절하는 화합물의 개발에 기초하고 있다. 따라서, MPO의 수준, 활성 또는 발현을 특이적으로 조절(예를 들어, 제거)함으로써 대상체의 면역계의 표적화된 조절에 의해, 본 발명은 MPO 수준 및/또는 다른 기관 또는 조직(예를 들어, 뇌)에서의 활성에 영향을 미치는 방법, 및 MPO 발현 및/또는 활성(향상, 감소 또는 심지어 정상 수준)과 직접 또는 간접적으로 연관된 장애의 효과적인 치료를 위한 이의 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 생체내에서 치료된 대상체의 면역계를 조작하거나 상기 면역계를 조절된 MPO 발현을 나타내는 세포 (예를 들어, 분화하여 호중구 및/또는 대식세포를 형성할 수 있는 BM 세포)로 대체함으로써, 본 발명은 치료된 대상체의 기관 또는 조직에서 MPO 발현 및/또는 활성에 영향을 미쳐 다른 기관 또는 조직에서 MPO 발현 및/또는 활성과 관련되거나 이에 영향을 받을 수 있는 장애 또는 병태를 치료하기 위한 도구를 제공한다.
본 발명에 의해 입증된 바와 같이, MPO 발현이 조절된 골수 세포는 동종 또는 자가 골수 이식에서 효율적인 플랫폼으로 작용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 개발된 화합물뿐만 아니라 조절된 골수 세포 집단은 MPO 발현 및/또는 활성과 직접 또는 간접적으로 관련된 다양한 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 낮은 MPO 발현 및/또는 활성과 관련된 장애 또는 병태, 높은 MPO 발현 및/또는 활성과 관련된 병태, 또는 심지어 정상 수준의 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타낼 수 있지만 MPO 수준, 발현 또는 활성을 증가시키거나 감소시키는 것에 의해 영향을 받을 수 있는 병태.
따라서, 첫 번째 양태에 따르면, 본 개시내용은 포유동물 대상체에서 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 유효량의 다음 중 적어도 하나를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 골수(BM) 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있고/있거나 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 본 발명은 포유동물에서 미엘로퍼옥시다제(MPO)의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법에서 사용하기 위한, 유효량의 다음 중 적어도 하나를 더 제공한다는 것을 더 이해하여야 한다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있고/있거나 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
본 발명은 MP1의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 방법, 조성물, 세포, 키트 및 시스템을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 미엘로퍼옥시다제(MPO)는 호중구의 아주르친화성(azurophilic) 과립에서 발견되는 매우 독성이 강한 효소이다. MPO는 H2O2를 사용하여 하이포아염소산(HClO) 및 기타 반응성 모이어티를 생성하며, 이는 감염 중에 병원체를 죽인다.
MPO 유전자는 17번 염색체의 긴 암(arm) 세그먼트 q12 내지 q24에 위치하며, 이 유전자의 1차 전사 산물은 11개의 인트론과 12개의 엑손으로 구성된다. MPO mRNA의 대안적 스플라이싱은 3.6kB 및 2.9kB의 두 가지 전사체를 제공한다. 1차 번역 산물은 신호 펩타이드의 절단, N-연결 글리코실화 및 제한된 탈당화를 포함하는 일련의 변형을 겪어 촉매적으로 비활성인 MPO 전구체(아포프로MPO(apoproMPO))를 형성하는 80kDa의 전구체 단백질이다. 다음 단계에서, MPO는 철-헴 분자를 촉매 중심에 혼입함으로써 촉매 활성을 얻는다. 헴은 두 개의 에스터 결합에 의해 공유적으로 부착되며, 헴 함유 효소에 고유한 세 번째 설포늄 결합은 하나의 헴 분자를 효소 포켓으로 고유하게 배향시킨다. 헴 모이어티의 독특한 구성은 MPO에 매우 높은 산화 잠재력을 부여하여, 생리적 pH에서 염소화를 가능하게 한다. 프로MPO(proMPO)의 절단은 헴 모이어티를 통해 공유적으로 부착된 59kDa의 α-서브유닛 및 13.5kDa의 β-서브유닛을 생성한다. 이황화 브리지는 성숙한 150kDa의 MPO에서 두 개의 중쇄-경쇄 프로토머(heavy-light protomer)를 연결한다. MPO 발현 수준은 프로모터 영역의 대립유전자 다형성에 따라 다르다. -463번 위치에서 AG에서 A로의 치환(G-463A)은 MPO 전사를 25배 감소시킨다. 치환은 핵 수용체 결합 부위의 클러스터인 Alu 수용체 반응 요소(Alu receptor response element: AluRRE) 내에서 발생한다. 치환은 향상된 MPO 전사에 필수적인 Sp1 전사 인자의 컨센서스 서열을 변화시킨다. MPO 전사를 감소시키는 AG에서 A로의 치환은 -129번 위치(G-129A)에서도 발견된다. 호중구는 세포 건조 중량의 5%를 차지하는 MPO의 주요 공급원으로, MPO는 호중구에서 가장 풍부한 단백질이다. MPO는 골수에서 호중구 분화 동안 전골수세포에서만 전사된다. MPO 발현은 G-CSF에 의해 유도되며, 이는 전사 인자 C-EBP 및 PU.1을 조절함으로써 다능성 전구세포의 과립구로의 분화를 촉진하고, 이는 과립구-대식세포 전구세포가 호중구 및 대식세포에 투입되도록 지시한다. 호중구 분화는 MPO 전사를 감소시켜 성숙한 세포에서는 검출할 수 없다.
전골수세포에서, MPO는 여러 다른 항균 단백질, 세린 프로테아제 및 라이소솜 가수분해효소와 함께 아주르친화성 과립으로 패키징된다. 아주르친화성 과립에서 단백질의 패키징은 아주르친화성 과립의 불균질한 집단의 비동기식 생성이다. 전골수세포에는 적어도 세 가지 카테고리의 아주르친화성 과립이 있다. 작은 전자 밀도 및 유핵 아주르친화성 과립은 균일한 MPO 분포를 갖는 반면, 대형 구형 과립의 MPO는 과립 테두리에서 검출된다.
또한, MPO는 총 세포 단백질의 1%를 차지하는 전골수성단핵구에 의해 합성되어, 총 세포 단백질의 1%를 차지한다. 순환계로 방출된 단핵구는 MPO 합성을 중지시키고, 이는 대식세포로의 분화 동안 더욱 하향조절된다.
본 개시내용의 맥락에서, "MPO"가 특별히 지시되지 않는 한, "MPO"는 MPO 유전자 및 MPO 단백질 둘 다를 포함한다는 것을 더 이해하여야 한다. 인간 MPO 유전자는 등록 번호: NC_000017.11로 제공되는 서열을 갖는다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 이러한 서열은 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 인간 MPO 단백질은 등록 번호: NP_000241로 표시된다. 추가로 일부 실시형태에서, MPO 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 일부 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은 일부 실시형태에서 서열번호 15로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있는, 등록 번호 NC_000077로 나타내는 마우스 MPO 암호화 서열을 더 제공한다. 일부 추가의 실시형태에서, 마우스 MPO 단백질은 등록 번호: NP_034954로 표시된다. 추가로 일부 실시형태에서, 마우스 MPO 단백질은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체의 미분화 BM 세포에서(생체내 또는 생체외) MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 유전자 편집 시스템의 공급에 의한 MPO 수준 및/또는 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 MPO 수준 및/또는 활성의 조절에 기초한다. 대안적으로, 이러한 조절은 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 갖는 BM 세포를 제공함으로써 수행될 수 있다(특히 동종이계 대상체로부터 수득됨).
본 명세서에서 사용되는 용어 미분화 골수 세포 또는 미성숙 골수 세포는 특정 특성을 갖는 특수화된 세포 유형으로 형질전환할 수 있는 능력을 갖는 골수의 세포를 지칭한다. 골수(BM)는 림프계, 특히 혈액계 세포의 발달에 중요한 역할을 하는 뼈 내부의 빈 공간에서 발견되는 부드러운 해면질의 젤라틴성 조직이다.
일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC)이다. HSC는 BM의 원시 미성숙 미분화 세포로, 이는 자가-재생 및 분화가 가능하다. HSC는 골수 전구 세포와 림프 전구 세포를 통해 혈액 세포의 골수 계통과 림프 계통으로 나뉘어, 각각 순환계에서 발견되는 세 가지 종류의 혈액 세포를 포함한 모든 성숙한 혈액 세포를 생성한다: 백색 혈액 세포(백혈구(leukocyte)), 적색 혈액 세포(적혈구(erythrocyte)) 및 혈소판(혈전구(thrombocyte)). 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 전구 세포이다. 전구 세포는 골수의 주요 기능 성분으로, 혈액으로 성숙될 전구 세포, 및 림프 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 공통 골수성 전구세포(common myeloid progenitor: CMP)이다. 골수성 줄기 세포로도 표시되는 CMP는 HSC 이후 세포 분화의 첫 번째 가지이다. 골수계 및 림프계는 모두 수지상 세포 형성에 관여한다. 골수성 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구 및 혈소판에 대한 거대핵구를 포함한다. 림프구 세포는 T 세포, B 세포 및 (자연 살해 세포)를 포함한다.
HSC 및 전구 세포는 예를 들어, 여러 상이한 세포 표면 마커의 조합을 사용함으로써 유세포 분석의 사용에 의해 확인 또는 단리될 수 있다. 예를 들어, HSC는 성숙한 혈액 세포 마커의 발현이 부족하다. 또한, HSC와 전구 세포 둘 다는 예를 들어, 분화 클러스터(분화 클러스터: CD)로 나타내는 특정 분자에 의해 확인되고 단리될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 명세서에 사용된 분화 클러스터는 세포의 면역-표현형 검사를 위한 표적을 제공하는 세포 표면 분자의 확인 및 조사에 사용되는 명명 프로토콜을 지칭한다. CD 분자는 세포에 중요한 세포 수용체 또는 리간드로 작용한다.
일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 CD34 양성 세포(CD34+)인 것을 특징으로 할 수 있다. 분화 클러스터 34(CD34)는 세포 표면 당단백질로서 조혈 줄기 세포 상에 존재하며, 골수 이식을 위한 조혈 줄기 세포의 선별 및 농축과 연관된다. 또한, CD34는 세포-세포 부착 인자로 기능하며, 조혈 줄기 세포를 골수 세포외 매트릭스에 부착하거나 또는 기질 세포에 직접 부착하는 것을 매개할 수도 있다. 또 다른 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 CD38 양성 세포(CD38+)인 것을 특징으로 할 수 있다. 고리형 ADP 리보스 가수분해효소로도 알려진 분화 클러스터 38(CD38)은 또한 많은 면역 세포의 표면에서 발견되는 당단백질이며, 백혈병의 예후 예측 마커로 사용되었다.
일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 HSC 또는 임의의 전구 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 HSC 및 전구 세포의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포는 HSC 및 CMP의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 여전히 다른 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 호중구로 성숙할 수 있는 CD34+에서 MPO 발현, 수준 및/또는 활성을 조절할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 대식세포로 성숙할 수 있는 CD34+에서 MPO 발현, 수준 및/또는 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 본 발명의 방법 및 조성물은 대식세포 및/또는 호중구의 활성 및 기능의 조절을 제공함을 이해하여야 한다.
본 개시내용에 따르면, 포유동물 대상체는 BM 세포에서 MPO 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 유전자 편집 시스템이 투여될 수 있고, 이에 의해 MPO의 생체내 조절을, 또는 대안적으로 또는 추가적으로 MPO의 변형된 발현 또는 활성을 나타내는 세포와 함께, 제공하여 생체외 조절을 제공한다. 본 발명은 생체내 및 생체외 접근법 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 대상체에서의 MPO 조절을 더 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 이러한 투여는 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성의 조절을 초래한다. 본원에서 사용되는 유전자 편집 화합물은 신체에서 적어도 하나의 유전자를 조절할 수 있는 화합물을 지칭한다. 용어 "조절하는"은 특정 조건하에서 결정된 발현/활성의 대조군 또는 정상 또는 기준선 수준과 비교하여 발현 및/또는 활성의 증가 또는 감소와 같은 신체의 적어도 하나의 유전자의 임의의 변화 또는 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 화합물 또는 시스템, 또는 대안적으로, 대상체에게 투여된 미분화 BM 세포 집단은 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성의 저해 또는 제거를 초래할 수 있다.
일부 대안적 실시형태에서, 유전자 편집 화합물/시스템, 또는 대안적으로, 대상체에게 투여된 미분화 BM 세포 집단은 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 확립, 향상 또는 증가시킬 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 따라서, 대상체의 면역계의 표적화된 조작에 의해, 대상체의 다양한 기관 및 조직에서 MPO의 활성 및/또는 수준 및 발현의 일반적인 조작이 달성된다. 더욱이, 대상체의 면역계의 특이적이며 표적화된 조작에 의해, MPO와 관련된 장애를 치료한다.
더욱 구체적인 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 편집 화합물 또는 시스템은 대상체에서 MPO의 활성 및/또는 발현을 조절하기 위해 투여될 수 있다. 유전자 편집 화합물은 다양한 메커니즘에 의해 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 화합물은 넉다운 세포, 유기체 등을 초래하는 염색체 DNA의 유전적 변형에 의한 MPO 발현 및/또는 활성을 조절한다. 또한, 유전자 편집 화합물/시스템은 일시적(transient)/임시적(temporary) 변형(일시적 넉다운)에 의해 MPO 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 사용되는 유전자 편집 화합물 또는 시스템(뿐만 아니라 이후 본원에 기재된 조성물, 세포, 키트 및 용도에서)은 일부 실시형태에서 자연 발생적 화합물(예컨대, 효소, 짧은 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드), 합성 화합물 또는 인공 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 편집 화합물은 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 활성 유전자 또는 이의 임의의 전사체에 결합할 수 있으며, 예를 들어 전사의 차단 (안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 유전자 결합의 경우), mRNA 전사체의 분해 (예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한), 또는 RNase-H 의존성 안티센스에 의해, 또는 mRNA 번역, 프레-mRNA 스플라이싱 부위, 또는 miRNA를 포함한 다른 기능성 RNA의 성숙에 사용되는 뉴클레아제 절단 부위(예를 들어, 모폴리노 올리고 또는 기타 RNase-H 독립 안티센스 올리고뉴클레오타이드)의 차단을 통해 발현 감소를 유발할 수 있다.
일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 유전자 편집 화합물은 임의의 핵산-변형자 단백질 및 적어도 하나의 표적 인식 요소를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 또 다른 일부 추가 실시형태에서, 본 발명에 적용 가능한 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 핵산-변형자 단백질 및 적어도 하나의 표적 인식 요소를 포함할 수 있다. 이러한 인식 요소는 일부 실시형태에서, 변형 단백질을 표적 유전자, 특히 본 발명에 따른 MPO를 암호화하는 유전자에 특이적으로 표적화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-변형자 단백질은 암호화 또는 비-암호화 핵산 서열을 변형시키는 임의의 단백질 또는 단백질 복합체를 포함할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 상기 변형 단백질에 의해 야기되는 변형은 이러한 변형자의 표적 핵산 서열에 의해 암호화되거나 또는 대안적으로, 제어되는 MPO 단백질 생성물의 발현을 조절할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 적용 가능한 변형자는 이러한 MPO의 안정성 또는 활성을 조절할 수 있다. 이러한 변형은 핵산분해성 절단(예를 들어, 뉴클레아제에 의한), (조절 요소와 같은 코딩 또는 논-코딩 서열의) 메틸화, 탈메틸화, 단백질 발현의 활성화 또는 억제 등을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 핵산 변형자는 뉴클레아제, 메틸 트랜스퍼라제, 데메틸라제, 전사 인자, 전사 억제자, 이들의 임의의 융합 단백질 중 적어도 하나, 및 상기 변형자 중 적어도 하나 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 변형 단백질은 적어도 하나의 뉴클레아제일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레아제"는 일부 실시형태에서 핵산분해 활성을 갖는 활성 뉴클레아제와 관련된다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 일부 실시형태에서, 본원에 사용되는 용어 "뉴클레아제"는 뉴클레아제의 구조적 특징을 갖는 분자를 더 포함하지만, 임의의 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA에 대해 감소되거나, 결함이 있거나, 핵산분해 활성을 나타내지 않음(본 명세서에서 비활성 뉴클레아제로 지칭됨)을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용된 비활성-뉴클레아제는 비활성 뉴클레아제의 임의의 단편, 돌연변이체 또는 융합 단백질을 추가로 포함한다. 보다 구체적으로, 비활성 뉴클레아제와 임의의 다른 단백질, 예를 들어 전사 인자 또는 억제 인자, 메틸 트랜스퍼라제, 데메틸라제의 융합 단백질은 이후에 본 명세서에서 상세히 설명될 것이다.
보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레아제"는 일부 실시형태에서 핵산분해 활성을 나타내는 효소이며, 특히 핵산 단량체(예를 들어, DNA 및/또는 RNA) 사이의 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 있다. 뉴클레아제는 표적 분자에서 단일 및 이중 가닥 절단(break)에 다양하게 영향을 미친다. 활동의 위치에 따라 두 가지 기본 분류가 있다. 엑소뉴클레아제는 말단에서 핵산을 분해한다. 엔도뉴클레아제는 표적 분자의 중간 영역에 작용한다. 이들은 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레아제로 추가로 분류된다. 전자는 DNA에 작용하고, 후자는 RNA에 작용한다. 뉴클레아제는 분자를 절단할 수 있기 전에 핵산과 결합하여 인식의 정도를 제공해야 한다. 뉴클레아제는 포스포다이에스터라제, 리파제 및 포스파타제와 마찬가지로 가수분해효소의 하위그룹인 에스터라제에 속한다. 이 하위그룹은 폴리뉴클레오타이드 사슬의 말단(외부)에서 한 번에 하나씩 뉴클레오타이드를 절단하여 작동하는 효소인 엑소뉴클레아제를 포함한다. 3' 또는 5' 말단에서 포스포다이에스터 결합을 파괴하는 가수분해 반응이 발생한다. 진핵생물과 원핵생물은 mRNA의 정상적인 턴오버에 관여하는 세 가지 유형의 엑소뉴클레아제: 의존성 붕괴 단백질인 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제(Xrn1); 독립 단백질인 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제; 및 폴리(A)-특이적 3' 내지 5' 엑소뉴클레아제를 가지고 있다. 이 패밀리의 구성원은 5'-포스포모노에스터를 생성하는 엑소데옥시리보뉴클레아제, 5'-포스포모노에스터를 생성하는 엑소리보뉴클레아제, 3'-포스포모노에스터를 생성하는 엑소리보뉴클레아제, 및 리보- 또는 데옥시- 둘 다에 활성이 있는 엑소뉴클레아제를 포함한다. 이 패밀리의 구성원은 엑소뉴클레아제, II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII을 포함한다. 위에서 언급한 바와 같이, 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오타이드 사슬 내에서 포스포다이에스터 결합을 절단하는 효소이다. 데옥시리보뉴클라제 I과 같은 일부 엔도뉴클라제는 상대적으로 비특이적으로(서열에 관계없이) DNA를 절단하는 반면, 전형적으로 제한 엔도뉴클레아제 또는 제한 효소라 불리는 많은 것들은 매우 특정한 뉴클레오타이드 서열에서만 절단된다.
일부 실시형태에서, 뉴클레아제는 위에 명시된 바와 같은 핵산분해 활성을 갖는 활성 효소일 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에서, 뉴클레아제는 결함이 있는 효소일 수 있다.
결함이 있는 효소(예를 들어, 결함이 있는 돌연변이체, 변이체 또는 단편)는 활성 뉴클레아제와 비교하여 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 내지 약 100%, 특히 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 65% 내지 약 70%, 약 75% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 약 95% 내지 약 99.9%로 감소된 활성, 보다 구체적으로 약 98% 내지 약 100%의 감소된 활성을 나타내는 효소와 관련될 수 있다.
위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 표적 인식 요소를 더 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "표적 인식 요소"는 핵산-변형자 단백질, 예를 들어 뉴클레아제를 핵산 서열 내의 특정 표적 위치로 지시할 핵산 서열(RNA 또는 DNA)이다. 표적 인식 요소에 의한 표적의 인식은 일부 실시형태에서 염기-쌍 상호작용에 의해 용이해진다. 이들 표적 인식 요소는 가이드된 뉴클레아제의 경우에 특히 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 핵산분해 활성을 나타내는 뉴클레아제의 경우, 뉴클레아제를 특정 부위로 지시하면 핵산 단량체(예를 들어, DNA 및/또는 RNA) 사이의 포스포다이에스터 결합이 절단될 수 있으며, 이는 일부 실시형태에서 이의 특정 절단으로 이어질 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에서, 비활성 뉴클레아제, 특히 이의 융합 단백질이 사용되는 경우, 표적 인식 요소에 의해 이러한 결함이 있는 뉴클레아제를 지시하면 표적 인식 요소에 의해 표적화되는 표적 핵산 서열의 표적화된 조절(예를 들어, 활성화 또는 억제, 메틸화 또는 탈메틸화)을 초래할 수 있다. 표적 인식 요소는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 일부 추가 실시형태에서, 표적 인식 요소는 이후 본 명세서에서 스페이서에 대해 명시된 바와 같은 다수의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 뉴클레아제는 가이드된 뉴클레아제일 수 있다. 또 다른 일부 실시형태에서, 유전자 편집 화합물은 폴리펩타이드, 특히 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-편집 화합물은 적어도 하나의 프로그램 가능한-조작된 뉴클레아제(PEN) 또는 이의 임의의 변이체 또는 단백질을 포함할 수 있다. "분자 DNA 가위"로도 알려진 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로그램 가능한 조작된 뉴클레아제(programmable engineered nucleases: PEN)"는 고도로 표적화된 방식으로 서열을 대체, 제거 또는 변형하는데 사용되는 합성 또는 천연 효소를 지칭한다. PEN은 DNA 서열과 같은 특정 게놈 서열(인식 서열)을 표적으로 하고 절단한다. 적어도 하나의 PEN은 자연 발생적 뉴클레아제로부터 유래되거나 또는 인공 효소일 수 있으며, 모두 이중 가닥 DNA 병변의 DNA 복구에 관여하며 직접적인 게놈 편집을 가능하게 한다. 일부 대안적인 또는 추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 유전자 편집 화합물은 또한 PEN을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자, 또는 적어도 하나의 PEN을 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클, 또는 PEN을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEN은 메가 뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성자-유사 효과기-기반 뉴클레아제(transcription activator-like effector-based nuclease: TALEN), Fok1 뉴클레아제, 또는 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR/Cas) 시스템, 또는 이들의 임의의 융합 단백질 또는 키메라 중 적어도 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEN은 메가 뉴클레아제일 수 있다. 메가 뉴클레아제는 큰 인식 부위(12개 내지 40개의 염기쌍의 이중 가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이며; 이 부위는 일반적으로 주어진 게놈에서 한 번만 발생한다. 메가 뉴클레아제는 특정 자연 발생적 제한 효소이며, 특히 진핵 단세포 유기체의 미토콘드리아 및 엽록체에서 주로 발견되는 귀소(homing) 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEN은 메가TAL일 수 있다. 메가TAL은 LAGLIDADG 패밀리와 같은 귀소 엔도뉴클라제를 TALEN의 모듈형 DNA 결합 도메인과 결합하는 융합 단백질이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 사용되는 뉴클레아제는 가이드된 뉴클레아제일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 적어도 하나의 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)이다. TALEN은 특정 DNA 서열을 절단하도록 조작할 수 있는 제한 효소이다. 이들은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 뉴클레아제의 DNA 절단 도메인에 융합하여 만들어진다. 보다 구체적으로, TALEN은 TAL(전사 활성자-유사) 효과기(TALE) 단백질로부터 얻은 DNA-결합 도메인(각각 약 34개의 아미노산으로 구성된 거의 동일한 반복의 다중)을 FokI 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합함으로써 설계된 인공 엔도뉴클레아제이다. 각 TALE 반복은 반복이 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열을 선형으로 나타내도록 2개의 가변 잔기[반복 가변 이잔기(repeat variable di-residue: RVD)라 불림]가 있는 그것의 상응하는 뉴클레오타이드(nt) 염기를 독립적으로 인식한다.
또 다른 일부 추가의 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 사용되는 가이드된 뉴클레아제는 적어도 하나의 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)일 수 있다. ZFN은 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합하여 생성된 인공 제한 효소이다. 징크 핑거 도메인은 특정의 목적하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있으며, 이는 징크 핑거 뉴클레아제가 복잡한 게놈 내에서 고유한 서열을 표적으로 할 수 있게 한다. 보다 구체적으로, ZFN은 작은 징크 핑거(ZF; 약 30개의 아미노산) DNA-결합/인식 도메인(Cys2His2)을 FokI 제한 효소로부터의 유형 IIS 비특이적 DNA 절단 도메인에 결합함으로써 생성된 인공 엔도뉴클레아제이다. 그러나, FokI 엔도뉴클레아제의 절단 활성은 이량체화를 요구한다. ZF 모듈은 3bp 서열을 인식하므로, 더 긴 DNA 표적 서열을 인식하고 결합하기 위해 각각의 ZFN 단량체에 여러 핑거를 필요로 한다.
또 다른 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 사용되는 가이드된 뉴클레아제는 Fok1 뉴클레아제 또는 이후 본 명세서에서 논의될 이의 임의의 융합 단백질일 수 있다. 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites)에서 자연적으로 발견되는 효소 Fok1(Fok-1)은 N-말단 DNA-결합 도메인과 C-말단의 비-특이적 DNA 절단 도메인으로 구성된 박테리아 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제이다. 본 발명의 일부 실시형태에 따르면, Fok1은 표적 인식 요소에 의해 이의 표적(예를 들어, MPO 유전자에서)으로 지시될 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 이러한 표적 인식 요소는, 일부 실시형태에서, Fok1을 표적 부위로 특이 적으로 지시하는 핵산 서열일 수 있다. 인식 요소는 Fok1에 직접 또는 간접적으로(즉, 링커를 통해) 연결될 수 있다. 따라서, 일단 단백질이 표적 인식 요소를 통해 듀플렉스 DNA에 결합되면, DNA 절단 도메인이 활성화되고, 표적 부위의 가장 가까운 뉴클레오타이드의 제1 가닥의 9개의 뉴클레오타이드 하류 및 제2 가닥의 13개의 뉴클레오타이드 상류가 절단된다. 보다 구체적으로, Fok1이 본 발명의 핵산 변형 단백질로 사용되는 경우, MPO 암호화 서열에 대한 특이적 표적화는 표적 부위에 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 핵산 서열(예를 들어, RNA 또는 DNA)일 수 있는 적어도 하나의 표적 인식 요소를 Fok1에 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해) 결합함으로써 달성될 수 있다. 추가로 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 PEN은 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR/Cas) 시스템일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 MPO 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 PEN으로서 CRISPR 시스템을 사용한다. 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR) 시스템은 게놈 공학을 위해 변형된 박테리아 면역 시스템이다. 일부 특정 실시형태에 따라, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 하나의 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)/CRISPR 연관(cas) 단백질 시스템을 포함할 수 있는 PEN을 사용할 수 있다. 따라서, 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다: (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질, 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및 (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열. 본 발명의 방법은 선택적으로 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클을 사용할 수 있다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템의 두 요소 모두 핵산 서열로서 제공되는 경우, 이들은 2개 이상의 핵산 분자로 개별적으로 또는 대안적으로, 두 서열, 특히 (a) 및 (b) 둘 다를 포함하는 작제물, 벡터 또는 비히클을 포함하는 단일 핵산 분자로 함께 제공될 수 있음에 유의하여야 한다.
위에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 핵산 서열 또는 분자로서 이의 일부 실시형태에서, 유전자-편집 시스템의 요소(예를 들어, gRNA 및/또는 Cas 단백질) 또는 이의 적어도 일부를 제공할 수 있다. 용어 "핵산", "핵산 서열", 또는 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산 분자"는 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, 규칙적 및/또는 불규칙적으로 교차하는 데옥시리보실 모이어티 및 리보실 모이어티(즉, 대체 뉴클레오타이드 단위는 당 모이어티의 2' 위치에 -OH, 다음으로 -H, 다음으로 -OH, 다음으로 -H 등을 가짐)의 폴리뉴클레오타이드 사슬, 및 임의의 위치에서 뉴클레오타이드 단위에 대한 다양한 독립체 또는 모이어티의 부착이 포함되는 이러한 종류의 폴리뉴클레오타이드의 변형을 포함하는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), DNA/RNA 하이브리드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어는 또한 뉴클레오타이드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체로서, 기재되는 실시형태에 적용 가능한 단일 가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 등가물로서 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 핵산의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자(또는 폴리뉴클레오타이드)는 합성적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 핵산 분자를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져있다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 가변 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 1개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 100개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 1,000개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개 또는 10,000개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 10,000개 초과의 뉴클레오타이드, 예를 들어 20,000개, 30,000개, 40,000개, 50,000개, 60,000개, 70,000개, 80,000개, 90,000개 또는 100,000개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
위에 언급한 바와 같이, 핵산 분자는 작제물, 벡터 또는 임의의 다른 비히클 내에 포함된 본 발명에 의해 제공될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 벡터는 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생산할 수 있는 특정 서열의 핵산 분자이다. 벡터는 복제 기점과 같은 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 핵산 발현을 지시하는 프로모터 요소를 포함하여 당업계에 공지된 하나 이상의 선별 가능한 마커 유전자 및 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 핵산을 표적 세포, 특히 BM 세포 내로 전달하는데 유용한 많은 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 미니서클, 파지, 바이러스(아래에 상세히 기재됨)를 본 발명에 적용할 수 있다. 핵산(들)을 포함하는 벡터는 에피솜으로, 예를 들어 플라스미드, 미니서클 DNA, 트랜스포존, 사이토메갈로바이러스, 아데노 바이러스와 같은 바이러스로 유지될 수 있거나, 또는 상동성 재조합 또는 무작위 통합, 예를 들어 렌티바이러스, AAV, MMLV, HIV-1, ALV 등과 같은 레트로바이러스-유래 벡터를 통해 표적 세포 게놈으로 통합될 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 이러한 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 벡터(recombinant adeno associated vector: rAAV), 단일 가닥 AAV(single stranded AAV: ssAAV), 자가-상보적 rAAV(self-complementary rAAV: scAAV), 유인원 공포 바이러스 40(Simian vacuolating virus 40: SV40) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼-의존적 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터 중 어느 하나일 수 있다.
보다 구체적으로, 위에 나타낸 바와 같이, 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터가 본 발명에 적용될 수 있다. 용어 "바이러스 벡터"는 핵산 분자를 숙주로 전달할 수 있는 복제 적격성(replication competent) 또는 복제-결핍성(replication-deficient) 바이러스 입자를 지칭한다.
용어 "바이러스"는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메커니즘이 없는 임의의 절대(obligate) 세포내 기생충을 지칭한다. 바이러스 게놈은 지질막의 단백질 구조가 코팅된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스의 예는 바쿨로비리디아에(baculoviridiae), 파보비리디아에(parvoviridiae), 피코르노비리디아에(picornoviridiae), 헤레페스비리디아에(herepesviridiae), 폭스비리디아에(poxviridiae), 아데노비리디아에(adenoviridiae), 피코트마비리디아에(picotmaviridiae)를 포함한다. 용어 재조합 바이러스는 키메라(또는 심지어 다량체) 바이러스, 즉 하나 이상의 바이러스 서브유형으로부터의 상보적 코딩 서열을 사용하여 구축된 벡터를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 렌티 바이러스 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스의 하위부류인 렌티바이러스에서 유래된다. 일반적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "결함성(defective)"이다. 즉, 생산 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산할 수 없다. 오히려 벡터의 복제에는 패키징 세포주에서 성장이 필요하다. 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 입자를 생성하기 위해, 핵산을 포함하는 레트로바이러스 핵산은 패키징 세포주에 의해바이러스 캡시드로 패키징된다. 서로 다른 패키징 세포주는 캡시드에 통합될 상이한 외피 단백질(동종지향성, 양쪽성 또는 이종성)을 제공하며, 이 외피 단백질은 세포에 대한 바이러스 입자의 특이성을 결정한다(뮤린 및 래트의 경우 동종지향성; 인간, 개 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유류 세포 유형의 경우 양쪽성; 뮤린 세포를 제외한 대부분의 포유류 세포 유형의 경우 이종성). 세포가 패키징된 바이러스 입자에 의해 표적화되는 것을 보장하기 위해 적절한 패키징 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 패키징 세포주에 도입하고 패키징 세포주에 의해 생성된 바이러스 입자를 수집하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
더 나아가 일부 실시형태에서, 본 발명에 적용 가능한 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus: AAV)일 수 있다. 용어 "아데노바이러스"는 용어 "아데노바이러스 벡터"와 동의어이다. AAV는 파라보피리다에 과에 속하는 작은(약 20㎚) 단백질 캡슐을 갖는 단일 가닥 DNA 바이러스이며, 특히 아데노비리디아에 속의 바이러스를 지칭한다. 용어 아데노비리디아에는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린 및 유인원 아데노바이러스 아속을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 마스타데노바이러스 속의 동물 아데노바이러스를 총칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 개별 혈청형뿐만 아니라 A 내지 F 아속을 포함하며, 개별 혈청형 및 A 내지 F 아속은 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11(AdllA 및 Ad IIP), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 91을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
헬퍼바이러스 동시감염(전형적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 감염)이 없는 경우에는 복제할 수 없기 때문에, AAV는 종종 의존바이러스(dependovirus)라 한다. AAV 감염은 경미한 면역 반응만을 생성하고 비병원성으로 간주되며, 이러한 사실은 또한 다른 일반적인 바이러스 벡터 시스템에 비해 재조합 AAV(rAAV)를 사용한 작업에 대한 낮은 생물학적 안전성 수준 요건에 반영된다. 낮은 면역원성과 세포 독성 반응의 부재로 인해, AAV-기반 발현 시스템은 휴지 세포에서 수개월 동안 관심있는 유전자를 발현할 수 있는 가능성을 제공한다.
rAAV 벡터의 생산 시스템은 전형적으로 관심있는 DNA를 함유하는 DNA-기반 벡터로 구성되며, 이는 역 말단 반복이 측면에 있다. 작제물의 크기는 야생형 AAV 게놈의 길이에 상응하는 약 4.7kb 내지 5.0kb로 제한된다. rAAV는 세포주에서 생산된다. 발현 벡터는 바이러스 복제에 중요한 AAV rep 유전자 및 캡시드를 형성하는 단백질을 암호화하는 캡 유전자의 발현을 매개하는 헬퍼 플라스미드로 공동-형질감염된다. 재조합 아데노 관련바이러스 벡터는 분열 및 비-분열 세포를 형질도입할 수 있으며, 다른 rAAV 혈청형은 다양한 세포 유형을 형질도입할 수 있다. 이러한 단일 가닥 DNA 바이러스 벡터는 높은 형질도입 속도를 가지며, 숙주 게놈에서 이중 가닥 DNA 절단을 일으키지 않고 내인성 상동 재조합을 자극하는 독특한 특성을 가지고 있다.
본 발명은 이의 일부 실시형태에서, MPO 유전자의 특정 조절을 위해 CRISPR 시스템을 사용한다. 위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 특히 전달 벡터 또는 비히클에서 핵산 분자로서 제공될 수 있다. 그러나, 사용되는 임의의 유전자 편집 시스템은 또한 단백질 복합체로서, 또는 대안적으로, 본 발명의 경우에 적용 가능한 특정 유전자 편집 시스템과 관련하여 이후에 본 명세서에서 논의될 리보핵단백질 복합체로서 투여될 수 있음이 이해되어야 한다. 위에 나타낸 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 발명에서 적용 가능한 유전자 편집 시스템은 CRISPR-Cas 시스템이다. CRISPR-Cas 시스템은 두 가지 클래스로 나뉜다. 클래스 1 시스템은 외래 핵산을 분해하기 위해 여러 Cas 단백질의 복합체를 사용한다. 클래스 2 시스템은 동일한 목적으로 하나의 큰 Cas 단백질을 사용한다. 보다 구체적으로, 클래스 1은 유형 I, III, IV로 나눌 수 있고, 클래스 2는 유형 II, V, VI로 나눌 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2의 CRISPR-연관 시스템 중 적어도 하나의 구성원일 수 있다. 일부 실시형태에서, cas 단백질은 유형 II, 유형 I, 유형 III, 유형 IV, 유형 V 및 유형 VI 중 어느 하나의 CRISPR-연관 시스템 중 적어도 하나의 구성원일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 스페이서 산재된 직접 반복부(Spacer Interspersed Direct Repeat: SPIDR)로도 알려진 CRISPR 어레이는 일반적으로 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌 패밀리를 구성한다. CRISPR 어레이는 대장균에서 처음 인식된 별개의 클래스의 산재된 짧은 서열 반복부(short sequence repeat: SSR)이다. 이후 몇 년 동안, 마이코박테리움 투버큘로시스(결핵균), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 메타노칼도코커스 야나시(Methanocaldococcus jannaschii), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 및 기타 박테리아 및 고세균에서 유사한 CRISPR 어레이가 발견되었다. 본 발명은 임의의 공지된 CRISPR 시스템, 특히 본 명세서에 개시된 임의의 CRISPR 시스템의 사용을 상정한다는 것을 이해하여야 한다. CRISPR-Cas 시스템은 외래 DNA 또는 RNA를 표적화함으로써 파지 공격 및 원치않는 플라스미드 복제로부터 보호하기 위해 원핵생물에서 진화하였다. CRISPR-Cas 시스템은 반복부 사이에 존재하는 스페이서라고 하는 짧은 상동 DNA 서열을 기반으로 DNA 분자를 표적으로 한다. 이러한 스페이서는 CRISPR-연관(Cas) 단백질을 프로토-스페이서라고 하는 외래 DNA 내의 일치하는(및/또는 상보적인) 서열로 가이드하며, 이는 이후 절단된다. 스페이서는 임의의 DNA 서열, 예를 들어 MPO 유전자 서열을 표적화하도록 합리적으로 설계될 수 있다. 더욱이, 이 인식 요소는 임의의 목적하는 표적을 인식하고 표적화하도록 개별적으로 설계될 수 있다.
일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 뉴클레아제는 CRISPR 클래스 2 시스템일 수 있다. 또 다른 일부 추가의 특정 실시 예에서, 이러한 클래스 2 시스템은 CRISPR 유형 II 시스템일 수 있다.
유형 II CRISPR-Cas 시스템은 'HNH'형 시스템(스트렙토코커스형; 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청형 A 균주 Z2491 또는 CASS4에 대해 Nmeni 하위유형으로도 알려짐)을 포함하며, 여기에서 단일의, 매우 큰 단백질인 Cas9는 유비쿼터스 Cas1 및 Cas2 외에도 crRNA를 생성하고 표적 DNA를 절단하는 데 충분한 것으로 보인다. Cas9는 적어도 두 개의 뉴클레아제 도메인, 즉 아미노 말단 근처에 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 단백질 중간에 HNH(또는 McrA-유사) 뉴클레아제 도메인을 포함하지만, 이들 도메인의 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 그러나, HNH 뉴클레아제 도메인은 제한 효소가 풍부하기 때문에, 표적 절단을 담당하는 엔도뉴클레아제 활성을 가지고 있다.
또한, 유형 II 시스템은 cas9, cas1, cas2, csn2 및 cas4 유전자 중 적어도 하나를 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 이는 임의의 유형 II CRISPR-Cas 시스템, 특히 유형 II-A 또는 B 중 어느 하나가 본 발명에 적용될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 일부 추가의 그리고 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 사용되는 적어도 하나의 cas 유전자는 유형 II CRISPR 시스템(유형 II-A 또는 유형 II-B) 중 적어도 하나의 cas 유전자일 수 있다. 보다 특정한 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 시스템에 의해 사용되는 유형 II CRISPR 시스템 중 적어도 하나의 cas 유전자는 cas9 유전자일 수 있다. 이러한 시스템은 cas1, cas2, csn2 및 cas4 유전자 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의한 Cas 단백질 사용은 Cas9 또는 이의 임의의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체일 수 있다.
Cas9에 의한 이중 가닥 DNA(dsDNA) 절단은 "유형 II CRISPR - Cas" 면역 시스템의 특징이다. CRISPR-연관 단백질 Cas9는 표적 부위(프로토-스페이서)에 상보적인 RNA:DNA를 사용하는 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제이다. Cas9와 표적 서열 사이의 인식 후 이중 가닥 DNA(dsDNA) 절단이 발생하여, 이중 가닥 절단(double strand break: DSB)을 생성한다.
본 명세서에서 사용되는 CRISPR 유형 II 시스템은 "가이드" RNA(gRNA) 및 비-특이적 CRISPR-연관 엔도뉴클레아제(Cas9)의 두 가지 필수 성분의 포함을 필요로 한다. gRNA는 Cas9-결합에 필요한 "스캐폴드" 서열(tracrRNA라고도 함) 및 변형될 게놈 표적을 정의하는 약 20개의 뉴클레오타이드 길이 "스페이서" 또는 "표적화" 서열로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 본 명세서에서 사용되는 가이드 RNA(gRNA)는 내인성 tracrRNA와 표적화 서열(crRNA라고도 함)의 합성적 융합을 지칭하며, Cas9 뉴클레아제에 대한 스캐폴딩/결합 능력 및 표적화 특이성을 모두 제공한다. "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로도 지칭된다.
CRISPR은 원래 다양한 세포 유형 및 유기체에서 표적 유전자를 "넉-아웃"하는 데 사용되었지만, Cas9 효소에 대한 변형은 CRISPR의 적용을 "넉-인" 표적 유전자로 확장하여, 표적 유전자를 선택적으로 활성화 또는 억제하고, DNA의 특정 영역을 정제하고, 심지어 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 DNA를 이미지화한다. 또한, gRNA 생성의 용이성으로 인해 CRISPR은 가장 확장 가능한 게놈 편집 기술 중 하나이며, 최근에는 게놈 전체 스크리닝에 이용되었다. 대부분의 CRISPR 시스템에서, 편집될 게놈 내의 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(프로토스페이서 Adjacent Motif: PAM)의 바로 상류에 존재하여야 한다. 유형 III과 같은 다른 시스템에는 PAM이 없다.
CRISPR 유형 II와 같은 PAM 서열 인식에 기반한 CRISPR 시스템에서, PAM은 표적 결합에 절대적으로 필요하며, 정확한 서열은 Cas9의 종에 따라 다르다(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9의 경우, 5' NGG 3'). 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 핵산 변형 단백질은 Cas9이다. 소정의 실시형태에서, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9가 본 발명의 방법 및 시스템에 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 임의의 공지된 Cas9가 적용될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 개시내용에 유용한 Cas9의 비-제한적 예는 본 명세서에서 SpCas9로도 나타내는 스트렙토코커스 피오게네스(SP), 본 명세서에서 SaCas9로도 나타내는 스트랩토코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus: SA), 본 명세서에서 NmCas9로도 나타내는 나이세리아 메닌지티디스(NM), 본 명세서에서 StCas9로도 나타내는 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus: ST), 본 명세서에서 TdCas9로도 나타내는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola: TD)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cas13, Cas6, Cpf1, CMS1 단백질, 또는 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis) C7, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens) YS-314, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R, 코리네박테리움 크로펜스테티(Corynebacterium kroppenstedtii)(DSM 44385), 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)(ATCC 19977), 노카디아 파시니카(Nocardia farcinica) IFM10152, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) PR4, 로도코커스 요스티(Rhodococcus jostii) RFIA1, 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) B4(uid36573), 악시도더머스 셀룰로이티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11 B, 아트로박터 클로로페놀리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6, 크리벨라 플라비다(Kribbella flavida)(DSM 17836), 서모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata)(DSM43183), 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium) Bd1, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) DJO10A, 슬라키아 헬리오트리니레두센스(Slackia heliotrinireducens)(DSM 20476), 페르세포넬라 마리나(Persephonella marina) EX H 1, 박테로이드 프라길리스(Bacteroides fragilis) NCTC 9434, 카프노사이토파가 오크라세아(Capnocytophaga ochracea)(DSM 7271), 플라보박테리움 사이크로필룸(Flavobacterium psychrophilum) JIP02 86, 아케르만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila)(ATCC BAA 835), 로세이플렉서스 카스텐홀지(Roseiflexus castenholzii)(DSM 13941), 로세이플렉서스 RS1, 시네코시스티스(Synechocystis) PCC6803, 엘루시마이크로비움 미누툼(Elusimicrobium minutum) Pei191, 미배양된 흰개미 그룹 1 박테리움 계통형(uncultured Termite group 1 bacterium phylotype) Rs D17, 파이브로박터 석시노게네스(Fibrobacter succinogenes) S85, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)(ATCC 10987), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) UCC118, 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae)-5-A909, 스트렙토코커스 아갈락티아에 NEM316, 스트렙토코커스 아갈락티아에 2603, 스트렙토코커스 디스갈락티아에 에퀴시밀리스(Streptococcus dysgalactiae equisimilis) GGS 124, 스트렙토코커스 에퀴 주에피데미쿠스(Streptococcus equi zooepidemicus) MGCS10565, 스트렙토코커스 갈롤리티쿠스(Streptococcus gallolyticus) UCN34(uid46061), 스트렙토코커스 고르도니이 칼리스(Streptococcus gordonii Challis) subst CH1, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) NN2025(uid46353), 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 피오게네스 M1 GAS, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS5005, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS2096, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS9429, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS 10270, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS6180, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS315, 스트렙토코커스 피오게네스 SSI-1, 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS10750, 스트렙토코커스 피오게네스 NZ131, 스트렙토코커스 서모필레스(Streptococcus thermophiles) CNRZ1066, 스트렙토코커스 써모필레스 LMD-9, 스트렙토코커스 써모필레스 LMG 18311, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) A3 Loch Maree, 클로스트리디움 보툴리눔 B Eklund 17B, 클로스트리디움 보툴리눔 Ba4 657, 클로스트리디움 보툴리눔 F Langeland, 클로스트리디움 셀룰롤리티쿰(Clostridium cellulolyticum) H10, 피네골디아 마그나(Finegoldia magna)(ATCC 29328), 에우박테리움 렉타레(Eubacterium rectale)(ATCC 33656), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라스마 모비레(Mycoplasma mobile) 163K, 마이코플라스마 페네트란스(Mycoplasma penetrans), 마이코플라스마 시노비아에(Mycoplasma synoviae) 53, 스트렙토바실러스(Streptobacillus), 모닐리포르미스(moniliformis)(DSM 12112), 브라디리조비움(Bradyrhizobium) BTAil, 나이트로박터 함부르겐시스(Nitrobacter hamburgensis) X14, 로돕세우도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) BisB18, 로돕세우도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) BisB5, 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans) DS-1, 다이노로세오박터 시바에.(Dinoroseobacter shibae.) DFL 12, 글루코나세토박터 다이아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) Pal 5 FAPERJ, 글루코나세토박터 다이아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus) Pal 5 JGI, 아조스피릴룸(Azospirillum) B510(uid46085), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum)(ATCC 11170), 다이아포로박터(Diaphorobacter) TPSY(uid29975), 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae) EF01-2, 나이세리아 메닌지티디스 053442, 나이세리아 메닌지티디스 알파14, 나이세리아 메닌지티디스 Z2491, 데설포비브리오 살렉시겐스(Desulfovibrio salexigens) DSM 2638, 캄필로박터 제주니 도일레이(Campylobacter jejuni doylei) 269 97, 캄필로박터 제주니 81116, 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) RM2100, 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 윌리넬라 석시노게네스(Wolinella succinogenes), 톨루모나스 아우엔시스(Tolumonas auensis) DSM 9187, 슈도알테로모나스 아틀란티카(Pseudoalteromonas atlantia) T6c, 쉬와넬라 페알레아나(Shewanella pealeana)(ATCC 700345), 레지오넬라 페뉴모필라 파리스(Legionella pneumophila Paris), 악티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes) 130Z, 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 프란시셀라 툴라렌시스 노비시다(Francisella tularensis novicida) U 112, 프란시셀라 툴라렌시스 홀락티카(Francisella tularensis holarctica), 프란시셀라 툴라렌시스 FSC 198, 프란시셀라 툴라렌시스 툴라렌시스(Francisella tularensis tularensis), 프란시셀라 툴라렌시스 WY96- 3418, 또는 트레포네마 덴티콜라(ATCC 35405)로부터 유래되거나 발현되는 이들의 임의의 변이체일 수 있다.
일부 구체적이고 비-제한적인 실시형태에서, 스트렙토코커스 피오게네스 M1 GAS의 Cas9, 특히 단백질 id: AAK33936.1의 Cas9는 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다. 추가의 특정 실시형태에서, Cas9 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 임의의 유도체, 돌연변이체, 변이체 또는 임의의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일단 발현되면, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 Cas9 단백질 및 gRNA는 gRNA "스캐폴드"(scaffold) 도메인과 Cas9 상의 표면-노출된 양으로 하전된 홈 사이의 상호작용을 통해 리보단백질 복합체를 형성한다. Cas9는 분자를 비활성의 비-DNA 결합 구조에서 활성의 DNA-결합 구조로 변화시키는 gRNA 결합시 구조 변화를 겪는다. 중요하게는, gRNA의 "스페이서" 서열이 표적 DNA와 상호작용할 수 있는 자유를 유지한다. Cas9-gRNA 복합체는 PAM과 함께 임의의 표적 게놈 서열에 결합하지만, gRNA 스페이서가 표적 DNA와 일치하는 정도에 따라 Cas9를 절단할 것인지 또는 대안적으로, 촉매적으로 불활성인 cas9를 포함하는 융합 단백질이 사용되는 경우에 임의의 다른 조작을 수행할 것인지 결정한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 염기 편집 효소는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, CAS9-기반 염기 편집자는 특정 뉴클레오타이드 치환을 촉매하는 효소에 융합된 촉매적으로 불활성인 CAS9를 이용하는 효소, 특히 합성 및 비-자연 발생적 효소이다. 공지된 염기 편집자는 C에서 T로, A에서 G로, T에서 C로, G에서 A로 치환할 수 있다. '염기 편집' 효소는 dsDNA 백본 절단 또는 공여체 주형없이, 하나의 표적 DNA 염기를 프로그램 가능한 방식으로 다른 염기로 직접 비가역적으로 전환할 수 있다. 보다 구체적으로, 이들 키메라 효소(본 명세서에서 융합 단백질이라고도 함)는 CRISPR/Cas9 및 가이드 RNA에 의해 표적화되는 능력을 보유하지만 dsDNA 절단은 유도할 수 없는 사이티딘 데아미나제 효소의 융합을 기반으로 한다. 따라서, 이러한 효소는 사이티딘에서 우리딘으로의 직접 전환을 매개하여 C→T(또는 G→A) 치환에 영향을 준다. 또한, 일단 Cas9-gRNA 복합체가 추정 DNA 표적에 결합하면, gRNA 표적화 서열의 3'말단에서 "시드(seed)" 서열은 표적 DNA를 어닐링하기 시작한다. 시드와 표적 DNA 서열이 일치하면, gRNA는 3'에서 5' 방향으로 표적 DNA에 계속 어닐링한다.
Cas9는 gRNA 스페이서와 표적 서열 간에 충분한 상동성이 존재하는 경우에만 표적을 절단한다. 또한, Cas9 뉴클레아제는 RuvC 및 HNH의 두 가지 기능성 엔도뉴클레아제 도메인을 갖는다. Cas9는 표적 DNA의 반대 가닥을 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인을 위치시키는 표적 결합시 두 번째 구조 변화를 겪는다. Cas9-매개성 DNA 절단의 최종 결과는 PAM 서열의 상류에서 약 3개 내지 4개의 뉴클레오타이드가 발생하는 표적 DNA 내의 이중 가닥 절단(DSB)이다.
그런 다음, 생성된 DSB는 효율적이지만 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단 연결(error-prone Non-Homologous End Joining: NHEJ) 경로와 덜 효율적이지만 정교한 상동성-지정 복구(Homologous Directed Repair: HDR) 경로의 두 가지 일반적인 복구 경로 중 하나에 의해 복구될 수 있다. 게놈 편집을 위한 프로그램 가능한 조작된 뉴클레아제(PEN) 전략은 특정 이중 가닥 DNA 절단(넉인 시스템)에 따른 HDR 메커니즘 또는 NHEJ 메커니즘(넉아웃 시스템)의 세포 활성화에 기반할 수 있다.
일부 특정 실시형태에서, 넉아웃될 표적 유전자, 특히 MPO 유전자는 NHEJ 경로를 통해 복구되어 대부분의 경우 표적 유전자의 기능장애(결실/삽입/넌-센스 돌연변이 등)를 일으킨다. 앞서 논의한 바와 같이, Cas9는 두 개의 뉴클레아제 도메인, RuvC 및 HNH의 조합된 활성을 통해 이중 가닥 절단(DSB)을 생성한다. 엔도뉴클레아제 활성에 중요한 각 뉴클레아제 도메인 내의 정확한 아미노산 잔기는 알려져 있으며(에스, 피오게네스 Cas9에서, HNH의 경우 D10A 및 RuvC의 경우 H840A), 활성 촉매 도메인을 하나만 함유하는 Cas9 효소의 변형된 버전("Cas9 닉카제(Cas9 nickase)"라 함)이 생성되었다. Cas9 닉카제는 여전히 gRNA 특이성을 기반으로 DNA에 결합하지만 닉카제는 DNA 가닥 중 하나만 절단할 수 있어, DSB 대신 "닉" 또는 단일 가닥 절단을 초래한다. DNA 닉은 온전한 상보적 DNA 가닥을 주형으로 사용하여 HDR(상동성 지정 복구)에 의해 빠르게 복구된다. 따라서, 반대 가닥을 표적으로 하는 2개의 닉카제는 표적 DNA 내에서 DSB를 생성하는데 필요하다(종종 "이중 닉" 또는 "이중 닉카제" CRISPR 시스템으로 지칭됨). 이러한 요건은 DSB를 유발하기에 충분히 가까운 거리 내에서 두 개의 표적외(off-target) 닉이 생성될 가능성이 거의 없기 때문에, 표적 특이성을 크게 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 특이성을 증가시키고 표적외 효과를 감소시키기 위한 이중 닉-유도성 DSB를 생성하기 위한 이중 닉카제 접근법을 포함하여 Cas9의 임의의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체의 사용을 더 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법, 세포 및 조성물에서 특이성을 증가시키고 표적외 효과를 감소시키기 위한 이중 닉-유도성 DSB를 생성하기 위한 이중 닉카제 접근법의 사용을 더 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 특이성을 증가시키는 구체적인 예는 표적화 gRNA에 대한 링커 역할을 하는 dCas9에 융합된 Fok1과 같은 뉴클레아제의 사용이다. 보다 구체적으로, 잘 특성화된 이량체화-의존성 FokI 뉴클레아제 도메인은 RNA-가이드된 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9) 단백질에 융합되어 Fok1의 뉴클레아제 활성에 필요한 이량체화로 인해 향상된 특이성을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동일하거나 상이한 표적, 특히 MPO 유전자를 표적으로 할 수 있는 여러 최종 gRNA 산물로 처리될 수 있는 pre-crRNA를 제공하는 옵션을 더 포함한다. 일부 더 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 내에 포함된 crRNA는 표적 게놈 DNA 서열에 상보적인 단일 가닥 리보핵산(ssRNA) 서열일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, MPO 유전자 내의 표적 게놈 DNA 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 바로 상류에 추가로 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 의해 사용되는 gRNA 또는 crRNA는 인간 MPO 유전자의 서열번호 43, 44, 45, 46, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 및 106 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 의해 사용되는 gRNA는 마우스 MPO 유전자의 서열번호 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 중 어느 하나에 의해 표시되는 핵산 서열 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 MPO 단백질, 특히 인간 MPO 유전자 및 단백질에서 다양한 도메인을 암호화하는 MPO 유전자의 다양한 부위에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, MPO 유전자의 특정 부위를 표적화하는 것은 전체 MPO 분자를 넉아웃시키거나 또는 대안적으로, 특히 HDR이 MPO 유전자 내의 특정 잔기 또는 서열의 대체에 사용될 때 이의 기능 및 활성을 조절하는 결과를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 MPO의 활성 부위에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 gRNA는 특히 인간 MPO 단백질, 수준, 발현 및/또는 활성을 조절하도록 지시될 때, MPO의 다른 도메인에 위치한 프로토스페이서를 대상으로 할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 MPO의. 이러한 도메인 또는 서열은 프로토머(protomer) 생합성 및 가공에 필요한 도메인 또는 서열, 인간 MPO 결핍을 모방하는 도메인 또는 특정 잔기, 프로토머 헴 결합에 필요한 도메인 또는 서열 및 적절한 단백질 글리코실화에 필요한 도메인 또는 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 프로토머 생합성 및 가공에 필요한 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 도메인 또는 프로토스페이서에 포함된 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 이러한 서열은 MPO, 특히 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO 아미노산 서열의 120번 내지 190번 잔기 및/또는 320번 내지 380번 잔기 사이에 존재하는 잔기 또는 서열을 포함하는 도메인을 암호화할 수 있다. 따라서 이러한 도메인 내에 포함된 임의의 프로토스페이서 또는 이러한 잔기를 암호화하는 서열을 표적화하는 gRNA는 단백질의 구조 변화 또는 프로토머 생합성 및 가공의 변화를 초래할 수 있다. 추가의, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 인간 MPO 결핍 치환을 모방하는 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 도메인 또는 프로토스페이서에 의해 포함되는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 이러한 프로토스페이서는 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO의 150번 내지 260번 잔기 및/또는 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO의 480번 내지 580번 잔기를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있다. 또 다른 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 프로토머 헴 결합에 필요한 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 도메인 또는 프로토스페이서에 의해 포함되는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 이러한 프로토스페이서는 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO의 250번 내지 270번 잔기 및/또는 390번 내지 510번 잔기를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있다. 또 다른 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA는 적절한 단백질 글리코실화에 필요한 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 도메인 또는 프로토스페이서에 포함된 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 이러한 프로토스페이서는 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO의 300번 내지 360번 잔기를 암호화하는 핵산 서열 내에 위치할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용되는 gRNA 또는 crRNA는 인간 MPO 유전자의 특정 프로토스페이서를 표적으로 한다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 의해 표적화될 수 있는 인간 MPO 유전자 내의 추가적인 표적 부위는 실시예 4에 또한 나타낸 바와 같이, 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO의 잔기 C167, C180, C319, C158, R128, N355, T173, M251, R569, R499, G501, Q257, D260, M409, E408, H261, H502 및 N355를 포함할 수 있다. 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 표적으로서 이들 잔기 각각의 사용을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 표적 인식 요소로 사용되는 crRNA(gRNA)는 인간 MPO 내의 상응하는 표적 프로토스페이서를 표적으로 하는 서열번호 33(본 명세서에서 T173으로 지칭됨), 서열번호 34(본 명세서에서 D260으로 지칭됨), 서열번호 35(본 명세서에서 H502로 지칭됨) 및 서열번호 42(본 명세서에서 C319로 지칭됨) 중 어느 하나에 의해 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 33의 crRNA 서열은 서열 TGCACATCCCGGTGATGGTG(서열번호 43으로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 34의 crRNA 서열은 서열 CAGGGGTGAAGTCGAGGTCG(서열번호 44로도 표시됨)을 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 35의 crRNA 서열은 서열 GGATGAGGGTGTGGCCGTAG(서열번호 45로도 표시됨)을 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 서열번호 42의 crRNA 서열은 서열 GGATGGTGATGTTGCTCCCGGGG(서열번호 46으로도 표시됨)을 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명에 의해 표적 인식 요소로 사용되는 crRNA(gRNA)는 47, 50, 55, 60, 63, 66, 71, 74, 77, 80, 85, 88 및 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 이들 gRNA는 인간 MPO 핵산 서열 내의 프로토스페이서를 표적화한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 이들 프로토스페이서는 각각 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 및 106으로 표시되는 핵산 서열을 포함한다.
일부 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용되는 gRNA 또는 crRNA는 마우스 MPO 유전자에서 특정 프로토스페이서를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 CCCCAACGATCAGCTGACCA(서열번호 5로도 표시됨)를 포함하는 프로토스페이서 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 CAGCGGGGTGTACGGCAGCG(서열번호 6으로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 GCACTCATGTTCATGCAGTG(서열번호 8로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 TGCGATACTTGTCATTCGGT(서열번호 9로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 AGTAAAACAGGAGCTCCGTG(서열번호 10으로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 ACGCTTCCAAGACAATGGCA(서열번호 11로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 ACGCCATCTTCATACTCTGC(서열번호 12로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 ATCAAGCGGAGCCTCCAAAG(서열번호 13으로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 또 다른 일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 서열은 서열 AGAGTACCTGTAACATTGAA(서열번호 14로도 표시됨)를 포함하는 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 마우스 MPO의 위에 정의된 바와 같은 프로토스페이서 서열을 표적으로 하는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 본 발명에 의해 표적 인식 요소로 사용되는 crRNA는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 42뿐만 아니라 서열번호 47, 50, 55, 60, 63, 66, 71, 74, 77, 80, 85, 88 및 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이식유전자(transgene)에 의해 전사된 gRNA는 표적 게놈 DNA, 특히 MPO 유전자 내의 임의의 프로토스페이서에 대해 적어도 부분적으로 상보적일 수 있다. 소정의 실시형태에서, "상보성"은 각각 자물쇠-열쇠 원리(lock-and-key principle)를 따르는 2개의 구조 간의 관계를 지칭한다. 본질적으로, 상보성은 두 DNA 또는 RNA 서열 간에 공유되는 특성이기 때문에 DNA 복제 및 전사의 기본 원리이므로, 이들이 서로 반평행으로 정렬되면 서열의 각 위치에 있는 뉴클레오타이드 염기는 상보적이다(예를 들어, A와 T 또는 U, C 및 G). 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 gRNA 또는 crRNA는 표적 프로토스페이서의 핵산 서열의 적어도 일부를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 특정 실시형태에서 위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 시스템의 gRNA에 의해 표적화된 게놈 DNA 서열은 PAM 서열의 바로 상류에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템은 여러 gRNA, 특히 하나 이상의 gRNA의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개 이상, 특히 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서, gRNA 또는 crRNA 암호화 서열은 MPO 암호화 서열에서 적어도 2개 이상의 상이한 위치를 표적으로 하는 1개 내지 200개 이상의 동일하거나 상이한 gRNA를 암호화할 수 있다. 본 발명의 gRNA를 암호화하는 핵산 서열의 스페이서는 동일하거나 상이한 스페이서일 수 있음을 추가로 이해하여야 한다. 더 많은 실시형태에서, 이들 스페이서는 MPO 유전자 내의 동일하거나 상이한 표적 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 이러한 스페이서는 MPO 유전자 내의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개 이상의 표적 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 이들 표적 서열은 MPO 유전자의 단일 영역 또는 일부 또는 대안적으로, MPO 유전자의 여러 표적 영역 또는 일부, 또는 암호화 서열로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "스페이서"는 특정 서열을 표적화하도록 설계된 비 반복적 또는 반복적 스페이서 서열을 지칭한다. 일부 특정 실시형태에서, 스페이서는 약 15개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 특히 약 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 스페이서는 약 20개 내지 35개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 CRISPR 시스템에 의해 암호화된 가이드 또는 표적화 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 RNA(tracrRNA)를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 특정 CRISPR 시스템에서 가이드 RNA는 CPF1 기반 CRISPR-Cas 시스템 및 CRISPR 유형 I 내지 E와 같은 tracrRNA를 포함하지 않는다는 점에 유의하여야 한다. CRISPR 스페이서에 의해 암호화된 표적화 RNA의 서열은 본 명세서에서 "프로토-스페이서"로도 지칭되는 MPO 유전자 내의 표적 서열을 지시해야 하는(즉, 동일하거나 상보적인 세그먼트를 가짐) 요건 외에는 특별히 제한되지 않는다. 이러한 프로토-스페이서는 본 발명에 의해 제공되는 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템의 gRNA를 암호화하는 핵산 서열 내에 포함된 CRISPR 스페이서에 의해 암호화된 표적화 RNA에 대해 충분한 상보성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 암호화된 gRNA 또는 crRNA는 표적 프로토스페이서의 핵산 서열과 적어도 부분적으로 동일한 서열을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 본 발명의 시스템의 RNA 가이드된 DNA 결합 단백질 뉴클레아제는 새로 확인된 시스템의 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR) 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명은 Cas9, 특히 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 단편, 변이체, 유도체 및 돌연변이체, 또는 이의 임의의 키메라 또는 융합 단백질을 포함하는 Cas9의 임의의 단편, 유도체, 돌연변이체 또는 변이체의 용도를 제공함을 이해하여야 한다. 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트 및 시스템은 이의 일부 실시형태에서 유전자-편집 시스템으로서 Cas 단백질, 특히 Cas9 단백질을 제공할 수 있음을 이해하여야 한다. "아미노산 서열" 또는 "펩타이드 서열"은 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기가 펩타이드 및 단백질의 사슬에 놓이는 순서임에 유의하여야 한다. 서열은 일반적으로 유리 아미노기를 함유하는 N-말단에서 아미드를 함유하는 C- 말단까지 보고된다. 아미노산 서열은 종종 펩타이드, 단백질의 일차 구조를 나타내는 경우 단백질 서열이라고 불리지만, 단백질은 특정 3차원 배열로 접혀지며 전형적으로 인산화, 아세틸화, 글리코실화, 마노실화, 아마이드화, 카복실화, 설피드릴 결합 형성, 절단 등과 같은 번역 후 변형을 겪은 아미노산 서열로서 정의되기 때문에, "아미노산 서열" 또는 "펩타이드 서열" 및 "단백질"이라는 용어는 구별해야 한다. "단편 또는 펩타이드"는 상기 Cas9 단백질의 분획(fraction)을 의미한다. 본 발명의 임의의 아미노산 서열과 같은 분자의 "단편"은 Cas9 단백질의 임의의 아미노산 서브세트를 지칭하는 것을 의미한다. 이것은 또한 이의 "변이체" 또는 "유도체"를 포함할 수 있다. "펩타이드"는 기능적 활성을 갖는 특정 아미노산 서브세트를 의미한다. "기능적"이란 동일한 생물학적 기능, 예를 들어 특정 RNA-가이드된 뉴클레아제 반응을 수행하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 본 발명은 본 발명의 Cas9 단백질의 임의의 변이체 또는 유도체 및 실질적으로 동일하거나 상동체인 임의의 폴리펩타이드를 포함함을 이해하여야 한다. 용어 "유도체"는 본래의 폴리펩타이드의 활성을 변경하지 않는 아미노산 서열(폴리펩타이드)에 대한 임의의 삽입, 결실, 치환 및 변형을 갖는 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 정의하는데 사용된다. 이와 관련하여, 본 발명에 의해 사용되는 Cas9 단백질의 유도체 또는 단편은 Cas9 단백질의 활성을 감소 또는 변경하지 않는, 특히 서열번호 4로 표시되는 Cas9 단백질의 임의의 유도체 또는 단편일 수 있다. 용어 "유도체"는 또한 이의 상동체, 변이체 및 유사체를 지칭한다. 본 발명에 따른 관심있는 단백질과 서열 상동성 또는 동일성을 갖는 단백질 오쏘로그 또는 상동체는 특히 본 발명에 따른 관심있는 단백질, 예를 들어 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 Cas9 단백질의 전체 서열과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 특히 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 또는 그 이상을 공유할 수 있다. 구체적으로, 상동체는 서열번호 4, 특히 서열번호 4로 표시되는 전체 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 특히 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 유도체는 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 본 발명에서 구체적으로 정의된 폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "삽입(들)", "결실(들)" 또는 "치환(들)"은 각각 1개 내지 50개의 아미노산 잔기, 20개 내지 1개의 아미노산 잔기, 특히 1개 내지 10개의 아미노산 잔기의 본 발명에 의해 개시된 폴리펩타이드에 대한 아미노산의 임의의 추가, 결실 또는 대체를 의미한다. 더욱 구체적으로, 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명에 포함되는 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 변형된 펩타이드의 임의의 위치뿐만 아니라 이의 임의의 N' 말단 또는 C' 말단에서 발생할 수 있음에 유의하여야 한다.
아미노산 서열에 관하여, 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 아미노산의 작은 백분율을 변경, 추가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 추가는 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 결과를 유발한다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 그리고 대립유전자에 더해지고 이들을 배제하지 않는다. 예를 들어, 지방족 아미노산(G, A, I, L 또는 V)이 그룹의 다른 구성원으로 치환되는 치환, 또는 라이신의 경우 아르기닌, 아스파르트 산의 경우 글루탐산, 아스파라긴의 경우 글루타민과 같이 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것과 같은 치환이 이루어질 수 있다. 다음의 8개 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 다른 예시적인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M). 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 Cas9 단백질 또는 이의 임의의 유도체, 특히 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 대해 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 보존적 치환을 포함하는 유도체를 포함한다. 보다 구체적으로, 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특성, 즉, 보존적 아미노산 대체를 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과이다. 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성의 "소수성" 아미노산은 발린(V), 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 시스테인(C), 알라닌(A), 타이로신(Y), 히스티딘(H), 트레오닌(T), 세린(S), 프롤린(P), 글리신(G), 아르기닌(R) 및 라이신(K)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; "극성" 아미노산은 아르기닌(R), 라이신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 아스파라긴(N), 글루타민(Q)으로 이루어진 군으로부터 선택되고; "양으로 하전된" 아미노산은 아르기닌(R), 라이신(K) 및 히스티딘(H)으로 이루어진 군으로부터 선택되되, "산성" 아미노산은 아스파르트산(D), 아스파라긴(N), 글루탐산(E) 및 글루타민(Q)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리펩타이드의 변이체, 특히 본 발명에 의해 사용되는 Cas9는 본 발명의 다양한 폴리펩타이드와 같은 관심있는 단백질과 아미노산 수준에서 적어도 80%의 서열 유사성 또는 동일성, 종종 적어도 85%의 서열 유사성 또는 동일성, 90%의 서열 유사성 또는 동일성, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 유사성 또는 동일성을 가질 수 있다. 위에 나타낸 바와 같이, 뉴클레아제, 특히 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 의해 사용되는 Cas9와 같은 가이드된 뉴클레아제는 일부 실시형태에서, MPO의 수준, 발현 및/또는 활성의 추가 조작을 가능하게 하는 본 발명에 의해 개시된 촉매적으로 불활성인 뉴클레아제 또는 이의 임의의 융합 단백질일 수 있다. 이러한 경우, 표적 서열의 표적화된 조작을 위해 이러한 가이드된 뉴클레아제의 표적화 특성만이 사용된다(예를 들어, gRNA를 사용하는 표적 핵산 서열 표적화). 이러한 경우 핵산분해 활성은 바람직하지 않다. 일부 실시형태에서, 핵산분해 활성이 없는 가이드된 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 따라서, 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 시스템에 사용되는 Cas9 효소는 임의의 핵산분해 활성이 없는 cas9, 예를 들어 dCas9와 같은 결함이 있는 효소일 수 있다. dCas9는 핵내 핵산분해 활성이 없는 돌연변이체 Cas9이다. 이러한 돌연변이체에 대한 비-제한적 예는 D10A(10번 위치의 아스파르트산에서 알라닌으로) 및 H840A(840번 위치의 히스티딘에서 알라닌으로) 중 적어도 하나에 점 돌연변이를 운반하는 돌연변이체일 수 있다. 이러한 돌연변이체는 세포에서 매우 특이적인 방식으로 DNA에 다른 단백질 효과기를 동원하기 위한 모듈형 RNA-가이드된 플랫폼으로 사용될 수 있다(문헌[Qi et al., Cell 152: 1173-1183 (2013)]). 억제 및 활성화 효과기 모두 각각 유전자 발현을 억제 또는 대안적으로, 활성화시키기 위해 dCas9에 융합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, dCas9의 융합 단백질 및 활성화 효과기(예를 들어, 탈메틸화를 수행하는 전사 인자 또는 효소) 또는 억제자와 dCas9의 융합은 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템에 의해 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 활성화 또는 억제는 상동 염기쌍만을 기반으로 표적 DNA 서열을 인식하는 sgRNA에 의해 결정될 수 있다. dCas9에 의한 억제는 네이키드 돌연변이 단백질이 표적으로 가이드될 때 달성된다. 이러한 억제는 가이드가 목적하는 유전자, 특히 MPO 유전자의 프로모터 영역에 dCas9를 표적화하고, 가이드 서열이 유전자의 비-주형 가닥에 상보적일 때 더욱 효율적이다. 그러나, 이는 필수적인 것은 아니며, 어떤 경우에는 유전자의 다른 영역으로 가이드하거나 또는 반대 템플릿도 또한 효율적으로 억제할 수 있다.
dCas9에 의한 억제는 dCas9를 공지된 억제자에 융합시킴으로써 향상될 수 있다. 이러한 억제자에 대한 비-제한적 예는 표적의 억제를 향상시키는 크루펠 관련 박스(Kruppel associated box: KRAB) 도메인일 수 있다(문헌[Gilbert et al., Cell 154:442-451(2013)]). 또 다른 일부 실시형태에서, MPO의 발현 및/또는 활성의 향상이 바람직하며, 전사 활성자가 융합될 때 dCas9에 의한 활성화가 달성될 수 있다. 이러한 활성자에 대한 비-제한적 예는 VP16으로도 알려진 단순 헤르페스바이러스 단백질 vmw65일 수 있다(문헌[Gilbert et al., Cell 154:442-451(2013)]). 대안적으로, 활성자 또는 억제자를 동원하여 네이키드 dCas9를 동원하고 결과를 지시하기 위해 가이드 RNA 자체가 조작(dCas9 대신 또는 이에 더하여)될 수 있다(문헌[Zalatan et al., Cell 160: 339-350(2015)]). 예를 들어, 가이드는 특정 RNA-결합 단백질을 동원하는 RNA-도메인을 암호화할 수 있다. 이러한 RNA-결합 단백질은 활성자(예를 들어, VP16) 또는 억제자(예를 들어, Krab)에 융합될 수 있으며, 따라서 억제자 또는 활성자와 함께 dCas9의 전체 동원은 목적하는 결과, 특히 MPO 유전자의 억제 또는 활성화를 초래한다.
유전자 편집 시스템이 MPO의 수준, 발현 및 또는 활성을 조작하기 위해 본 발명에 의해 사용될 때, 이러한 시스템은 이 시스템의 구성 요소를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어 Cas9 및 특정 gRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 작제물로서 전달될 수 있음을 이해하여야 한다. 그러나, 본 발명은 이의 일부 실시형태에서, 기능적 복합체로서 전달되는 정제된 Cas9 및 정제된 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA 리보핵단백질 복합체(Cas9 RNP)를 사용하는 옵션을 더 포함함을 이해하여야 한다. 일부 특정 실시형태에서, 정제된 gRNA는 어닐링된 gRNA 올리고의 PCR 증폭 또는 플라스미드를 함유하는 선형화된 gRNA(예컨대, 애드진(Addgene) 플라스미드 42250)의 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. Cas9(또는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 Cas9의 임의의 변이체)는 박테리아 Cas9 발현 플라스미드를 사용하여 박테리아로부터 정제될 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 표적 세포로의 Cas9 RNP 전달은 지질-매개성 형질감염 또는 전기천공을 통해 일부 특정 및 비-제한적 실시형태에서 수행될 수 있다.
위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법, 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템은 RNA를 절단하는 뉴클레아제의 사용을 더 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용될 수 있는 가이드된 RNA 뉴클레아제는 RNA를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템일 수 있으며, 유리할 수 있다(예를 들어, CRISPR-Cas 유형 II-A 및 새로 확인된 CRISPR-Cas C2c2). 위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템의 사용 또는 대안적으로, 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포가 본 발명의 방법에 의해 사용될 때, 본 명세서에 적용 가능한 미분화 BM 세포 집단은 이러한 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 미분화 BM 세포 집단은 자가 공급원이거나 또는 대안적으로, 동종 또는 심지어 동계(syngeneic)의 공급원일 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 일부 추가의 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 방법은 억제되거나 제거된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계(allogeneic) 대상체의 미분화 BM 세포 집단을 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 MPO의 발현 및/또는 활성을 제거하기 위해 유전적으로 조작된 미분화 BM 세포를 사용할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적합한 세포는 자가 공급원의 세포일 수 있다. 세포 공급원과 관련하여 용어 "자가(autologous)"는 본 발명의 방법에 의해 치료될 동일한 대상체로부터 유래되거나 전달된 세포를 지칭한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적합한 세포는 동종이계 공급원의 세포일 수 있다. 세포 공급원과 관련하여 용어 "동종(allogenic)"은 동일한 종의 본 명세서에서 공여체로 지칭되는 다른 대상체로부터 유래되거나 전달된 세포를 의미한다. 보다 구체적으로, 위에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 MPO 유전자의 변형이 대상체의 세포(자가 공급원의 세포) 또는 대안적으로, 동종이계 공급원의 세포에 대해 생체외에서 수행될 수 있는 옵션을 포함함을 이해하여야 한다. 또 다른 일부 다른 실시형태에서, 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 미분화 BM 세포가 사용될 수 있다. 자가 또는 동종이계(또는 심지어 동계) 공급원의 세포는 그 후 입양 전달에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 정의된 용어 "입양 전달(adoptive transfer)"은 면역계의 구성 요소, 특히 이미 특정 면역 반응을 증가시킬 수 있는 세포의 전달로 구성된 모든 요법에 적용된다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 출원에 적합한 세포는 고정된 HSP일 수 있다. 조혈 줄기 세포(Hematopoietic stem cell: HSC)는 일반적으로 골수에 상주하지만 혈액으로 강제로 유입될 수 있으며, 이 과정은 말초 혈액에서 많은 수의 HSC를 수확하는데 사용되는 골수 동원(bone marrow mobilization)이라 한다. 본 발명에 따라 선택된 하나의 동원제(mobilizing agent)는 과립구 콜로니-자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor: G-CSF)일 수 있다. 생성된 HSC는 동원된 HSC라고도 칭해진다.
골수 주사의 경우, 표적 세포는 HSPC일 수 있고, 전신 주사의 경우, 표적 세포는 동원된 HSPC일 수 있다(환자가 동원 선행 치료를 받는 경우). 골수 주사 및 일부 실시형태에서 유전자 편집 화합물의 전신 주사 둘 모두는 대상체에서 MPO의 생체내 조작에 특히 적합할 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
본 발명은 본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 생체내에서 또는 MPO의 변형된, 또는 특히 감소된 발현, 수준 및/또는 활성을 나타내는 BM 세포를 이식(예를 들어, 입양 전달)함으로써 생체외에서, 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 단순히 변형시킴으로써 대상체, 특히 상기 대상체의 임의의 조직 또는 기관에서 MPO의 수준, 발현 및 활성을 조절, 특히 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 놀랍게도 본 발명에 의해 나타난 바와 같이, 특정 조직, 예를 들어 PD 및 AD의 신경퇴행에 의해 영향을 받는 뇌 영역에서 MPO- 면역반응성 세포의 상당한 증가를 나타낼 수있는 뇌 조직에서 MPO 수준 및/또는 활성의 효과적인 조절은 BM 세포에서 MPO 수준 및/또는 활성을 조절함으로써 달성될 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, MPO의 조절은 BM 세포에서 수행되었으며, 단, 상기 조절은 표적 뇌 조직 또는 이의 임의의 구성 요소, 예를 들어 성상세포, 미세아교세포 및/또는 뉴런에서는 수행되지 않았다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 예를 들어, 위에 기재된 CRISPR/Cas9 시스템인 PEN과 같은 치료된 대상체에서의 BM 세포에서 MPO 발현 및/또는 활성을 생체내에서 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물/시스템을 투여하거나 또는 대안적으로, 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포(생체외 조작 또는 MPO 결핍 동종 대상체로부터 수득함)를 투여함으로써 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 또한 기술된 바와 같이, 조절이라는 용어는 MPO 또는 대조군의 원래의, 조절되지 않은 발현 및/또는 활성, 또는 소정의 조건하에서 결정된 MPO 발현/활성의 정상 또는 기준선 수준과 비교하여 MPO 발현 및/또는 활성의 증가 또는 감소와 같은 임의의 변화 또는 변형을 지칭한다.
따라서, 일부 실시형태에서, MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 것은 상기 대상체에서 MPO의 수준, 발현 및/또는 활성을 저해 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다. MPO의 발현 또는 수준 또는 활성을 "감소" 또는 "저해"하는 것으로 나타낸 일부 실시형태에 따르면, 이러한 감소 또는 저해는 MPO의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성의 약 10% 내지 100%의 감소 또는 저하일 수 있음을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "감소하는" 또는 "저해하는"은 크기, 양, 수 또는 강도가 점차 작아지는 행위에 관련된 것이다. 특히, 예를 들어 건강한 대상체의 세포, 특히 MPO의 정상 수준 및/또는 활성을 나타내는 건강한 대상체의 세포에서, 적합한 대조군과 비교하여 MPO의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 이상의 MPO의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성의 감소, 저하, 제거, 약화 또는 저해.
그러나, MPO의 발현 및 활성을 조절하는 방법, 조성물, 세포, 키트 및 시스템을 제공함으로써, 본 발명은 이의 일부 대안적인 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 상승, 확립 또는 증가시키는 것을 포함할 수 있는 MPO의 발현 및/또는 활성의 조절을 더 포함함을 이해하여야 한다.
MPO의 발현 또는 수준 또는 활성의 "증가" 또는 "향상"을 나타내는 일부 실시형태에 따르면, 이러한 증가 또는 향상은 MPO의 발현 및/또는 안정성의 약 10% 내지 100%의 증가 또는 상승일 수 있음을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "증가", "증대" 및 "향상"은 크기, 양, 수 또는 강도가 점진적으로 커지는 행위와 관련된 것이다. 특히, 적합한 대조군과 비교하여 MPO의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000% 이상의 증가. 증가 또는 상승은 또한 약 2 내지 106배 이상 증가될 수 있음에 유의하여야 한다. 더욱이, MPO의 발현, 수준, 안정성 및/또는 활성의 증가는 상기 MPO의 번역 또는 안정성 및/또는 상기 MPO의 활성일 수 있음이 이해되어야 한다. 위와 관련하여, 제공되는 경우, 예를 들어 10%, 50%, 120%, 500% 등과 같은 퍼센트 값은 각각 0.1, 0.5, 1.2, 5 등과 같은 "배수 변화" 값과 교환할 수 있다. 따라서, 증가라는 용어는 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배 이상의 증가를 지칭한다.
위에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 감소 또는 대안적으로, 향상)하기 위한 방법, 조성물, 세포, 키트 및 시스템을 제공한다. 본 명세서에 사용되는 MPO 발현은 또한 단백질의 안정성을 반영할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 "발현"은 일반적으로 유전자-암호화된 정보, 특히 MPO 유전자가 세포에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 유전자의 "발현"은 특히 폴리뉴클레오타이드로의 전사, 단백질로의 번역, 또는 심지어 단백질의 번역 후 변형을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 단백질 안정성은 단백질의 물리적(열역학적) 안정성 및 화학적 안정성을 지칭하며, 단백질이 본래의 접힌 형태 또는 변성 상태에 있는지 여부를 결정하는 힘의 순(net) 균형과 관련이 있다. 보다 구체적으로, 세포내 MPO와 같은 단백질의 수준은 위에서 논의한 바와 같은 합성 속도뿐만 아니라 분해 속도와 몇 분에서 수 분까지 광범위하게 변하는 세포 내의 단백질의 반감기에 의해 결정된다. 진핵세포에서, 앞서 본 명세서에서 언급된 유비퀴틴-프로테아솜 경로와 리소솜 단백질 분해의 두 가지 주요 경로가 단백질 분해를 매개한다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 MPO의 활성을 조절 (예를 들어, 감소 또는 대안적으로 향상)할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에 사용되는 MPO 활성은 일부에서 MPO에 의해 수행되는 임의의 활성, 예를 들어 각각 반응성 중간체, 예컨대 하이포아염소산(HOCl), 하이포아브롬산(HOBr) 및 하이포시안산(HOSCN), 타이로실 라디칼 및 과산화수소(H2O2)로부터의 반응성 질소 중간체 및 클로라이드 음이온(Cl-) 브로마이드(Br-); 티오사이아네이트(SCN-), 타이로신 및 나이트라이트의 생성을 촉매하는 퍼옥시다제 활성을 지칭할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, MPO 활성은 MPO/HOCl 시스템을 통한 호중구에 의한 박테리아(예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)) 및 진균(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans))의 세포내 살해와 관련이 있을 수 있다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, MPO 활성은 또한 MPO에 의해 적어도 부분적으로 발생하거나 또는 직접 또는 간접적으로 매개되는 임의의 프로세스와 관련이 있을 수 있다. 앞서 본 명세서에 나타난 바와 같이, 이러한 활성은 MPO의 헴 도메인 또는 MPO의 임의의 다른 도메인에 의해 매개될 수 있음을 이해하여야 한다. 이러한 활성의 비-제한적 실시형태는 MPO에 의해 매개되는 네토시스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 호중구 세포외 트랩(NET)은 주로 병원체와 결합하는 호중구의 DNA로 구성된 세포외 섬유의 네트워크이다. NET은 호중구가 숙주 세포에 대한 손상을 최소화하면서 세포외 병원체를 죽일 수 있게 한다.
NET 활성화와 방출 또는 네토시스는 자살 및 필수 네토시스의 두 가지 형태로 올 수 있는 동적 프로세스이다. 전반적으로, 프로세스의 주요 구성 요소 중 많은 부분이 두 유형의 네토시스에 대해 유사하지만, 자극, 타이밍 및 최종 결과 활성화 경로에 주요 차이점이 있다(프로세스는 반응성 산소종(ROS) 중간체를 통한 단백질-아르기닌 데이미나제 4(PAD4)의 NADPH 옥시다제 활성화로 시작됨). PAD4는 호중구에서 히스톤의 시트룰화를 담당하여 염색질의 탈응축을 초래한다. 미엘로퍼옥시다제(MPO) 및 호중구 엘라스타제(NE)와 같은 아주르친화성 과립 단백질은 그 후 핵으로 들어가 응축 과정을 더 진행하여 핵 외피가 파열된다. 비응축된 염색질이 세포질에 들어가고, 여기서 추가적인 과립과 세포질 단백질이 초기 단계 NET에 추가된다. 프로세스의 최종 결과는 활성화된 네토시스 경로에 따라 달라진다. 자살 네토시스는 NET의 방출이 아폽토시스 또는 괴사와는 다른 경로를 통해 호중구의 죽음을 초래하였다는 연구에서 처음 설명되었다. 자살 네토시스에서, 세포내 NET 형성은 원형질막의 파열 후 세포외 공간으로 방출된다. 이러한 네토시스 경로는 톨-유사 수용체(Toll-like Receptor: TLR), Fc 수용체, 및 항체, PMA 등과 같은 다양한 리간드를 갖는 보체 수용체의 활성화를 통해 시작될 수 있다. 이러한 수용체의 활성화시, 하류 신호전달로 인해 소포체로부터 칼슘이 방출된다. 이러한 칼슘의 세포내 유입은 차례로 NADPH 옥시다제를 활성화시켜 위에 기재된 바와 같이 네토시스 경로를 활성화시킨다. 필수 네토시스는 박테리아 지질다당류(LPS), 기타 박테리아 제품, TLR4-활성화된 혈소판, 또는 TLR2 리간드와 함께 보체 단백질에 의해 자극될 수 있다. 필수 네토시스는 핵의 기포형성(blebbing)을 통해 가능하며, DNA가 가득 찬 소포가 세포외로 유출되고 원형질막은 그대로 유지된다. 그것의 빠른 형성과 방출은 호중구의 죽음을 초래하지 않지만, 세포에 DNA가 없기 때문에 DNA가 없는 세포가 살아있는 것으로 간주될 수 있는지에 대한 의문이 제기된다. 호중구는 필수 네토시스 후에도 계속해서 식균 작용을 하고 미생물을 죽일 수 있으며, 이는 호중구의 항균 다양성을 강조한다는 것에 유의하여야 한다. 상술한 바와 같이, MPO 활성은 MPO 촉매 활성("비효소적 효과")과 무관한 메커니즘을 통해 매개될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 용어 MPO 활성은 MAPK 및 NFκB 활성화, ROS 생성, 표면 인테그린 상향조절 및 탈과립화뿐만 아니라 폐에서 염증을 증가시키는 아폽토시스의 감소를 지칭한다. 일부 특정 실시형태에서, 용어 MPO 활성은 인간 호중구의 아폽토시스 억제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 MPO 활성은 MPO가 CD11b/CD18 인테그린에 결합하여 발생하는 프로세스를 포함하고/하거나 이에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 PMN 활성화를 유도하기 위한 다형핵 호중구(PMN) 신호전달 경로의 시뮬레이션을 지칭한다. 일부 다른 실시형태에서, MPO 활성은 호중구에 대한 생존 신호로서 역할을 하여 염증의 연장에 기여하는 MPO의 능력을 지칭한다. 일부 다른 실시형태에서, 용어 MPO 활성은 내피세포 활성화를 지칭한다. 또 다른 일부 실시형태에서, 용어 MPO 활성은 수지상 세포(DC) 기능 및 적응 면역의 억제를 지칭한다. DC는 포유류 면역계의 항원-제시 세포(부속 세포로도 알려짐)이며, 그 기능은 항원 물질을 처리하여 이를 면역계의 T 세포에 대한 세포 표면에 제공하는 것이다. DC는 선천 면역계와 적응 면역계 사이의 메신저 역할을 한다.
일부 실시형태에서, MPO 활성은 FH에 대한 MPO의 결합을 통한 인자 H(FH)의 보체 조절 활성에 대한 효과를 지칭한다. MPO-FH 상호작용은 대안적 보체 경로의 활성화에 기여함으로써 (ANCA)-관련 혈관염(AAV)의 병인에 참여할 수 있다고 제안되었다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 혈관계에서 높은 글루코스-유도성 내피 기능장애의 증폭을 지칭한다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 인간 혈소판에 대한 결합, 액틴 세포골격 재구성의 유도 및 인간 혈소판의 기계적 강성에 영향을 미치는 것을 지칭한다. 이는 차례로 저장소-작동성 Ca2+ 유입(store-operated Ca2+ entry: SOCE) 및 작용제-유도성 인간 혈소판 응집을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 내피 NO 신타제(endothelial NO synthase: eNOS)의 인산화의 감소를 지칭한다. 이는 NO 생성의 감소를 더 유발할 수 있으며, 결과적으로 나이트로실화를 감소시켜 칼파인 활성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 적혈구(RBC) 막에 대한 MPO의 결합을 지칭한다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, MPO 활성은 본 명세서에 앞서 나타낸 바와 같은 지질 과산화 및 일부 실시형태에서, 특히 LDL 과산화를 지칭한다. 일부 실시형태에서, MPO 활성은 지질 카바밀화를 지칭할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, MPO 활성은 글리코칼릭스 결합을 지칭할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 세포, 조성물 및 키트는 위에 명시된 MPO 활성 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 조절, 특히 저해, 저하 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 특히 대상체의 미분화 BM 세포내 MPO 발현 및/또는 활성의 생체내 조작을 일으키는 유전자 편집 도구를 대상체에 적용함으로써, 대상체에서 MPO 발현, 수준 및/또는 활성의 조절, 특히 감소 또는 증가를 제공한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 대상체는 필요한 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포가 투여될 수 있다. 조작은 동종이계 또는 자가 공급원 중 하나인 BM 세포가 본 발명에 의해 제공되는 편집 도구와 접촉될 때 그리고 MPO 발현 및/또는 활성의 조작시 생체외에서 발생할 수 있으며, 세포는 대상체에 도입된다(자가 세포의 경우는 다시 도입됨)는 점에 유의하여야 한다. 치료된 대상체에게 이러한 BM 세포를 도입하면 대상체에서 MPO의 발현 및 활성이 조작된다. 대안적으로, MPO의 조절된(증가 또는 감소) 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 대상체의 BM 세포는 또한 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 대상체에서 MPO의 조작으로 이어지는 대상체에게 도입될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 이러한 조작은 본 명세서에 더 기재된 바와 같이 MPO의 발현 및/또는 활성의 생체내(즉, 포유동물 신체 내) 또는 생체외(즉, 신체로부터 제거된 세포) 조작을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 유전자 편집 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 대상체의 미분화 BM 세포에서 MPO의 생체내 조작을 가능하게 하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다는 점에 유의하여야 하며, 아래에서 더 자세히 설명한다.
일부 다른 실시형태에서, 방법은 생체외 적용을 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 생체외는 본 발명에 의해 제공되는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물 또는 시스템을 대상체로부터 제거, 회수 또는 수득된 BM 세포와 접촉시키는 단계를 지칭한다. 이러한 세포는 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기에 적합한 조건에서 유전자 편집 시스템과 접촉될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉"은 함께 합하거나, 넣거나, 인큐베이션하거나 혼합하는 것을 의미한다. 이와 같이, 예를 들어 서로 접촉하거나 배합함으로써 두 물품을 합하거나 넣을 때, 첫 번째 물품은 두 번째 물품과 접촉된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "접촉"은 본 발명의 유전자 편집 화합물과 세포 사이 또는 생체내에서 수행될 때 조절될 대상체와의 상호작용을 가능하게 하는 모든 측정 또는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 접촉 단계 전 또는 후에, BM 세포는 미분화 세포를 단리하기 위해 선택을 거칠 수 있다. 대상체로부터 제거, 회수 또는 수득된 BM으로부터의 미분화 BM 세포를 단리하는 단계는 선택적 단계라는 점에 유의하여야 한다. 일부 실시형태에서, BM 세포는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물, 특히 본 발명에 의해 개시된 임의의 유전자 편집 화합물 또는 시스템과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, HSC 및/또는 전구 세포를 포함하는 단리된 미분화 BM 세포 집단은 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉될 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에서, BM 세포는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물, 및 HSC 및/또는 전구 세포를 포함하는 미분화 BM 세포 집단과 접촉된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 편집 화합물은 MPO 유전자의 조절을 허용하고 변형된 BM 세포 집단을 생성하기에 충분한 시간 동안 BM 세포 집단, 특히 미분화 BM 세포 집단과 접촉될 수 있다.
따라서, 이의 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 변형된 BM 세포 집단을 제공하되, 일부 실시형태에서 이러한 BM 세포 집단에서 세포의 적어도 일부(예를 들어, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 심지어 100%), 바람직하게는 대부분의 세포는 MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 BM 세포 집단은 미분화 BM 세포, 특히 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 나타내는 HSC 및/또는 전구 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 BM 세포 집단은 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 갖는 HSC를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "변형된 BM 세포" 또는 "변형된 BM 세포 집단"은 MPO 발현 및/또는 활성을 조절하여 생체외에서 변형된 BM 세포를 나타내는데 사용된다.
위에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 특히, 대상체의 미분화 BM 세포에서 MPO를 표적화하여 상기 대상체의 임의의 조직 및 기관에서 MPO 수준의 조작을 유도함으로써 대상체의 면역계를 조작하는 방법을 제공한다. 다음 양태에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 치료적 적용, 특히 MPO-관련 병태를 치료하기 위해 이러한 조절을 더 사용한다. 따라서, 일부 특정 및 비-제한적 실시형태에서, 본 발명은 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내기 위해 대상체의 면역계, 특히 대상체의 BM 세포를 조작함으로써 대상체에서 MPO의 수준, 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다는 것을 이해하여야 한다. 즉, 조작된 면역계 (자가 또는 동종이계 또는 동계 공급원)를 제공하거나 또는 대안적으로, 본 명세서에 제공된 유전자 편집 시스템을 사용하여 대상체의 면역계를 생체내에서 조작함으로써(예를 들어, 대상체에 유전자 편집 시스템의 화합물을 투여), 상기 대상체의 BM 세포 집단이 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내도록 한다. 이와 같이, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 상기 대상체의 임의의 조직 및 기관에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 선구적인 전략을 제공한다. 이 전략은 분명하고 효과적인 치료적 적용을 보여준다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 대상체의 면역계의 이러한 조작은 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내는 BM 세포를 일부 실시형태에서 이식 전에 면역-절제를 겪는 면역계의 조작을 필요로 하는 대상체에게 이식함으로써 달성될 수 있다. MPO의 조절된(예를 들어, 감소 또는 제거된) 수준, 발현 또는 활성을 나타내는 BM 세포를 이식함으로써, 이식된 대상체는 임의의 조직 및 기관에서 조절된 MPO 발현을 나타낼 것이다. 본 발명에 의해 상세히 기재된 바와 같이, 이식된 BM 세포는 동일한 대상체로부터 수득되고 MPO의 수준, 발현 또는 활성을 조절하기 위한 본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 생체외에서 조작된 자가 BM 세포일 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 일부 특정 실시형태에서, 대상체로부터 수득된 BM 세포는 MPO의 수준, 발현 및/또는 활성의 제거 및 저하를 초래할 수 있는 본 발명의 유전자 편집 시스템에 생체외 적용될 수 있다. 대안적으로, (자연적으로 또는 본 발명의 유전자 편집 시스템을 적용함으로써) MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 또는 동계 공급원의 미분화 BM 세포가 사용될 수 있다. 이러한 MPO가 결핍된 자가 또는 동종이계 BM 세포는 대상체에 재도입될 수 있으며, 이는 면역-절제 화합물로 처리될 수 있으므로 이식된 조작된 BM 세포가 대상체의 면역계를 대체한다. 이러한 절차는 대상체의 임의의 기관 또는 조직에서 MPO의 고갈을 초래한다. MPO 고갈 BM 세포는 대상체로부터 또는 대안적으로, 동종 대상체로부터 수득될 수 있음을 이해하여야 한다. 보다 구체적으로, 이러한 자가 또는 동종이계 BM 세포의 대상체로의 이식, 또는 즉 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성(예를 들어, MPO 수준, 발현 및/또는 활성의 제거 또는 저하)을 나타내는 BM 세포를 갖는 대상체의 면역계 세포의 대체는 상기 대상체의 모든 조직 및 기관에서 MPO의 수준, 발현 및 활성의 조절로 이어진다. MPO는 Mpo-/- 마우스의 향상된 T 세포-매개성 피부 지연형 과민증 및 항-유도성 관절염의 두 가지 모델에서 입증된 바와 같이 적응 면역 반응을 억제하는 역할을 한다. 메커니즘적으로, 호중구로부터 방출된 MPO는 감소된 IL-12 생산 및 CD86 발현에 의해 측정된 LPS-유도성 DC 활성화를 저해하여, 결과적으로 T 세포 증식 및 전염증성 사이토카인 생산을 제한한다. 대조적으로, 자가 면역 염증을 유발하는 MPO의 병원성 역할은 저하된 질환 중증도를 나타내는 K/BxN 관절염 및 콜라겐-유도성 관절염(collagen-induced arthritis: CIA) 모델에서 MPO-결핍 마우스를 사용하여 입증되었다. 또한, 다발성 경화증(MS) 및 류마티스성 관절염(RA)을 포함한 많은 염증성 병태 및 자가면역 질환에서 MPO 수준 및 활성의 증가가 관찰되었다. MPO는 죽상 동맥경화증과 같은 만성 혈관 질환과 관련된 혈관계 기능의 조절에 역할을한다. 세포외 매트릭스(extracellular matrix: ECM)에서, MPO는 산화 질소(NO)-스캐빈저로 작용하여 NO를 소비하여 내피 이완을 손상시킨다. 죽상혈관 조직에 존재하는 MPO 및 그 산화성 종은 지질 과산화를 촉진하고, LDL을 고-흡수 죽상 경화성 형태로 전환하고, 아포리포단백질 A-I(apoA-I)를 선택적으로 조절하여 분해에 더 취약한 기능장애 HDL 입자를 생성하고 콜레스테롤 유출을 촉진하는 apoA-I의 능력을 손상시킨다. 더욱이, MPO 및 그 산화 생성물의 상승된 전신 수준은 증가된 심혈관 위험과 관련이 있다. 위에 나타낸 바와 같이, MPO는 다양한 병리학적 병태와 관련이 있으며, MPO 발현을 조절하는 MPO는 그로 인한 장애 또는 병태를 치료 및 예방하기 위한 특정 치료적 도구를 제공한다.
본 발명은 이의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 MPO-관련 병태를 앓고 있는 대상체에서 MPO 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법을 더 포함한다. 방법은 위에 기재된 바와 같다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 또한 MPO 수준 및/또는 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 적어도 하나의 MPO-관련 장애의 치료 및 저해를 위해, 본 발명에 의해 개시된 바와 같이 대상체에서 MPO 수준 및/또는 활성을 조절하는 방법의 용도를 포함한다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 또는 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 본 명세서에 기재된 방법은 (a), (b) 또는 이들의 임의의 조합으로 MPO-관련 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 것을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명의 일부 양태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 제공한다는 것을 이해하여야 한다: (a) 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 또는 이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
본 명세서에 기재된 바와 같이, BM 세포 집단 및 특히, 미분화 BM 세포 집단은 일부 실시형태에서 미분화의 미성숙 BM 세포 집단, 특히 MPO의 발현 및/또는 활성이 조절된 HSC를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포 집단은 MPO 유전자가 조절되도록 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 세포 집단일 수 있다.
미분화 BM 세포 집단은 대상체 비정상적인 MPO 발현 및/또는 활성을 나타내는 대상체, 특히 MPO-관련 병태를 나타내는 대상체에서 BM 세포를 대체하기 위해, 미분화 BM 세포 집단을 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료된 대상체의 BM 세포 집단의 대체는 MPO의 조절된 발현, 수준 및/또는 활성을 나타내는 BM 세포를 갖는 대상체의 세포 집단의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 심지어 100%의 대체를 포함할 수 있음을 이해하여야 한다. 이해되는 바와 같이, 미분화 BM 세포 집단의 투여는 본 명세서의 일부 실시형태에서 골수 이식으로 표시된다.
일부 실시형태에서, BM 세포 집단 및 특히 미분화 BM 세포 집단은 자가 공급원 또는 대안적으로, 동종 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 골수 이식은 자가 골수 이식일 수 있다. 용어 자가 골수 이식은 BM 세포가 대상체로부터 제거, 회수 또는 수득된 후 동일한 대상체에게 이식되는 이식을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락에서, 자가 골수 이식은 일부 실시형태에서 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체로부터 BM 세포를 회수하거나 수득하는 단계; (b) BM 세포를 특히, MPO 발현 및/또는 활성의 조작에 적합한 조건하에서 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) BM 세포를 동일한 대상체에 이식(또는 재-도입)하는 단계. 일부 실시형태에 따르면, 위의 단계 (a) 다음에 HSC 및/또는 전구 세포를 단리할 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에 따르면, 위의 단계 (b) 다음에 HSC 및/또는 전구 세포를 단리할 수 있다. 일부 특정 실시형태에 따르면, 자가 골수 이식은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 대상체로부터 BM 세포를 제거, 회복 또는 수득하는 단계; (b) HSC 및/또는 전구 세포와 같은 BM 세포로부터 미분화 세포를 단리하는 단계; (c) 미분화 세포를 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (d) 미분화 세포를 동일한 대상체에 이식하는 단계. 일부 실시형태에서, 골수 이식은 동종이계 골수 이식일 수 있다. 용어 동종이계 골수 이식은 BM 세포가 대상체(본 명세서에서 공여체로 지칭됨)로부터 제거된 후 다른 대상체(본 명세서에서 수여체로 지칭됨)에 이식되는 이식을 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 동종이계 골수 이식은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 공여체로부터 BM 세포를 제거, 회수 또는 수득하는 단계; (b) 선택적으로, BM 세포를 적어도 하나의 본 발명의 유전자 편집 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) BM 세포를 수여체에게 이식하는 단계. 일부 실시형태에 따르면, 위의 단계 (a) 다음에 HSC 및/또는 전구 세포를 단리할 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에 따르면, 위의 단계 (b) 다음에 HSC 및/또는 전구 세포를 단리할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 동종이계 골수 이식은 다음 단계를 포함할 수 있다: (a) 공여체 대상체로부터 BM 세포를 제거, 회수 또는 수득하는 단계; (b) HSC 및/또는 전구 세포와 같은 BM 세포로부터 미분화 세포를 단리하는 단계; 선택적으로, (c) MPO 조작을 허용하는 적합한 조건하에서 미분화 세포를 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (d) 미분화 세포를 수용체에게 이식하는 단계.
자가 골수 이식과 동종이계 골수 이식은 모두 동일하거나 상이한 대상체에게 이식하는 단계 이전에 BM 세포 또는 미분화 BM 세포를 저장하는 단계를 포함할 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 또 다른 대안적인 단계에서, BM 세포는 이식 전에 더 증식될 수 있다.
일부 실시형태에서, 자가 골수 이식뿐만 아니라 동종이계 골수 이식은 이식된 대상체에서 원래의(조절되지 않은) MPO 발현 및/또는 활성과 비교하여 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 특징으로 할 수 있음에 유의하여야 한다. 즉, 이식된 BM 세포 또는 이식된 미분화 BM 세포는 이식 절차에 의해 대체되는 BM 세포 또는 미분화 BM과 비교하여 상이한 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용에 따른 동종이계 골수 이식은 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 나타내는 공여체로부터 수득된 BM 세포의 이식을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 키트 및 시스템에 의한 동종이계 골수 이식에 사용되는 BM 세포는 BM 세포를 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집제와 접촉시킴으로써 수득된 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 갖는 미분화 BM 세포일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 동종이계 골수 이식 방법은 공여체로부터 BM 세포를 제거, 회수 또는 수득하는 단계, 조절된 BM 세포를 생산하기 위해 세포(선택적으로, 미분화 세포, 특히 HSC 및/또는 전구 세포)를 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, MPO 조절된 BM 세포는 수여체 대상체에 이식될 수 있다. 일부 대안적인 실시형태에서, 동종이계 골수 이식 또는 동종이식을 위한 BM 세포는 비정상적인 MPO의 발현 및/또는 활성(조절된 발현 및/또는 활성)을 나타내는 대상체로부터 수득된 BM 세포 집단일 수 있다. 이러한 BM 세포는 미분화 BM 세포를 단리하기 위해 이식 전에 더 선택될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 동종이계 골수 이식을 위해 본 발명의 방법에 의해 사용되는 골수 세포는 MPO의 억제 또는 제거된 발현 및/또는 활성을 나타내는 대상체로부터 수득된 BM 세포 집단일 수 있다. 이는 이식된 대상체에서 MPO 발현 및/또는 활성의 감소 또는 저해를 초래한다. 일부 대안적인 실시형태에서, 동종이계 골수 이식을 위한 골수 세포는 MPO의 검출 가능하거나 또는 향상된 발현 및/또는 활성을 나타내는 대상체로부터 수득된 BM 세포 집단일 수 있다. 이는 이식된 대상체에서 MPO 발현 및/또는 활성의 증가 또는 상승을 초래할 것이다.
본 발명은 특히 유전적으로 동일하고, 선택적으로 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 허용하도록 조작된 동일한 종의 대상체의 동계 미분화 BM 세포의 사용을 더 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시형태에서, 동종이계 골수 이식을 위한 BM 세포는 비정상적인 MPO의 발현 및/또는 활성(조절된 발현 및/또는 활성)을 나타내는 대상체로부터 수득된 BM 세포 집단(선택적으로, 미분화 BM 세포)이며, 조절된 BM 세포를 생성하기 위해 세포(선택적으로, 미분화 세포: HSC 및/또는 전구 세포)를 적어도 하나의 유전자 편집 화합물과 접촉시킴으로써 더 조절될 수 있다.
이와 관련하여, BM 세포는 수여체와 조직-유형 적합성(tissue-type compatibility)을 나타내야 한다는 점에 유의하여야 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 투여, 특히 BM 세포의 이식 전, 화학 요법 및/또는 방사선 조사 및/또는 항체의 사용 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)-결합 절제 등 또는 이들의 임의의 조합을 수여체 대상체에 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 공여체로부터 BM 세포를 수득하기 위해, 방법은 이후 본 명세서에서 논의되는 바와 같이 세포의 고정화 단계를 더 포함할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, 수득 또는 이식은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 골수 생검 및/또는 골수 흡인에 의해 수행될 수 있다. 골수 흡인은 국소 또는 전신 마취하에 수행될 수 있다. 또한, BM 이식은 주입과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
또한, 골수 주사의 경우, 표적 세포는 HSPC일 수 있고, 전신 주사의 경우 표적 세포는 동원된 HSPC일 수 있다(환자가 고정화의 선행 치료를 받는 경우). 골수 주사뿐만 아니라 전신 주사(예를 들어, 정맥 IV) 모두는 MPO 발현 및/또는 활성을 조작하는 본 발명의 유전자 편집 화합물에 의한 BM 세포의 생체내 조작 및 표적화에 특히 적합할 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 환자는 면역 절제를 포함할 수 있는 선행 치료를 받을 수 있다. 암, 자가 면역 질환 등과 같은 일부 유형의 의학적 병태의 치료는 종종 예를 들어, 골수 세포 이식편의 이식 전에 환자 자신의 면역계를 제거하기 위한 면역절제를 포함한다. 면역 절제는 전신 방사선 또는 고용량 화학 요법, 항체의 사용, 키메라 항원 수용체(CAR)-결합 절제 등, 또는 이들의 임의 조합에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 용어 "면역 절제(immune ablation)" 또는 "면역 절제(immunoablation)"는 의료 목적을 위한 환자의 면역 저항성의 파괴를 지칭한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 환자는 스테로이드를 사용한 선행 치료를 받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 면역 반응을 저해하기 위해 또한 사용될 수 있는 스테로이드 투여일 수 있다. 약리학적(초생리학적) 용량으로, 글루코코르티코이드와 같은 스테로이드는 다양한 알러지, 염증 및 자가 면역 장애를 억제하기 위해 사용된다.
위의 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 의해 사용되는 유전자 편집 화합물은 치료된 대상체의 미분화 BM 세포에서 생체내에서 또는 대안적으로, 자가 또는 동종이계 BM 세포에서 생체외에서 MPO의 발현 및/또는 발현을 조절할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 적어도 하나의 유전자 편집 화합물은 PEN, 상기 PEN을 암호화하는 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 PEN 또는 이러한 PEN을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 PEN은 적어도 하나의 CRISPR/Cas 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 유효량의 (a) 적어도 하나의 Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드; 및 (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클을 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적용 가능한 Cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2의 CRISPR-연관 시스템 중 적어도 하나의 구성원일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 Cas 단백질은 클래스 2의 CRISPR-연관 시스템 유형 II의 구성원일 수 있다. 또 다른 일부 추가 특정 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 또는 이의 임의의 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체일 수 있다. 본 발명의 다른 양태와 관련하여 이전에 본 명세서에 기재된 모든 유전자 편집 시스템이 또한 본 양태에 적용 가능하다는 것을 이해하여야 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 CRISP/Cas 시스템의 요소로서, 적어도 하나의 gRNA 또는 crRNA를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, crRNA은 인간 MPO 유전자의 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46뿐만 아니라 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 및 106 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 적어도 하나의 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 이러한 crRNA는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 42, 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 60, 서열번호 63, 서열번호 66, 서열번호 71, 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 80, 서열번호 85, 서열번호 88 및 서열번호 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 gRNA는 마우스 MPO 유전자를 표적화할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 이러한 gRNA는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 또는 이들의 임의의 단편으로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 마우스 MPO 내의 프로토스페이서를 표적으로 한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 gRNA는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 치료 방법은 MPO-관련 병태를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 특히 적용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 MPO-관련 병태 또는 질환은 MPO의 비정상적, 증가, 결핍 또는 감소된 발현 및/또는 활성과 관련된 병태를 포함한다. 즉, 본 명세서에 기술된 방법은 결핍 또는 감소된 MPO 발현 및/또는 활성과 관련된 병태 또는 대안적으로, 증가된 MPO 발현 및/또는 활성과 관련된 병태를 치료하는데 효과적이다. 이해되는 바와 같이, MPO 및/또는 활성을 설명하는 상대적 용어 "증가된", "결핍된", "저하된" 또는 "감소된"은 소정의 조건하에서 결정된 대조군 또는 정상 또는 기준선 수준에 관한 것이다.
본 명세서에서 병리를 언급할 때 상호교환적으로 사용되는 용어 "연관된", "연결된" 및 "관련된"은 질환, 장애, 병태, 또는 다음 중 적어도 하나가 인과 관계를 공유하고 더 높은 수준에서 공존하는 임의의 병리를 의미하는 것으로 이해된다: 인과 관계를 공유하고, 우연한 빈도보다 더 높은 빈도로 공존하거나, 또는 하나의 질환, 장애 병태 또는 병리가 두 번째 질환, 장애, 병태 또는 병리를 유발하는 경우. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 증가된(상승된) MPO 발현 및/또는 활성과 관련된 MPO-관련 병태에 적용될 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 정상(상승 및 저하되지 않음) 수준의 MPO를 나타낼 수 있는 대상체에 적용될 수 있지만, MPO의 양의 감소는 MPO 수준과 반드시 연관되지 않은 상기 대상체의 임의의 병태 또는 장애에 유익한 효과를 나타낼 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의한 MPO의 조절은 MPO 발현 및/또는 활성의 저해 또는 감소로 이어질 수 있어 MPO의 증가 또는 상승된 발현과 관련된 병태를 완화시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있는 MPO-관련 병태는 면역-관련 장애, 신경퇴행성 장애, 호흡기 장애, 증식성 장애, 혈관 장애 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.
일부 실시형태에서, MPO 관련 병태는 면역-관련 장애일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "면역-관련 장애" 또는 "면역-매개성 장애"는 보다 구체적으로, 면역계의 저해 또는 활성화를 통해 대상체의 면역계와 관련되거나 또는 적응 또는 선천 면역 반응과 같은 대상체에서의 면역 반응의 소정의 성분의 분해를 감소시킴으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있는 임의의 병태를 포함한다. 면역-관련 장애는 감염성 병태(예를 들어, 바이러스 감염), 대사 장애, 자가-면역 장애, 혈관염, 염증 및 증식성 장애, 특히 암을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-관련 질환은 자가면역 질환일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 자가면역 질환을 치료하는데 적용 가능하다. 자가면역 질환은 정상적인 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 병태이다. 자가면역 질환의 예는 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 루푸스(lupus), 제1형 당뇨병, 건선/건선성 관절염, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장 질환 및 혈관염을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 특히 다발성 경화증(MS), 항-호중구 세포질 항체(Anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA)-관련 장애 및 전신 홍반성 루푸스(SLE)와 같은 자가면역 장애에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 MS 및 이와 관련된 임의의 관련 병태 또는 증상의 치료에 적용될 수 있다. 본 명세서에 정의된 용어 "다발성 경화증"(MS)은 수초, 희소돌기아교세포 및 엑손을 파괴하는 중추 신경계의 만성 염증성 신경퇴행성 질환이다. MS는 젊은 성인들 사이에서 가장 흔한 신경 질환으로, 전형적으로 20세 내지 40세 사이에 나타난다. MS의 증상은 한쪽 눈의 시력 상실, 복시와 같은 시각 장애의 출현에서 근육 약화 피로, 통증, 무감각, 뻣뻣함 및 불안정, 협응 상실, 및 떨림, 현기증, 불분명한 언어, 연하 곤란 및 정서적 장애와 같은 기타 증상까지 다양하다. 질환이 진행됨에 따라 환자는 보행 능력을 잃고, 인지 능력 저하, 일상 활동의 자기 관리 능력 상실에 직면할 수 있으며, 심각한 장애를 가지게 되고 의존성이 될 수 있다.
MS 증상은 면역계 요소가 뇌 세포, 특히 신경교세포 및/또는 뉴런을 공격하고 엑손의 보호 수초를 손상시키기 때문에 발생한다. 이러한 공격이 발생하는 영역은 뇌를 통한 메시지의 전달을 방해하는 병변이라 한다. 다발성 경화증은 다음과 같은 질환 진행을 특징으로 하는 4가지 유형으로 분류된다: (1) 재발(증상의 갑작스런 증상 악화(flare-ups)의 공격)에 이어 관해(안정화 및 가능한 회복 기간; 일부 관해에서는 완전한 회복이 있는 반면, 다른 관해에서는 부분적 회복 또는 회복이 없음)를 특징으로 하는 재발-관해 MS(Relapsing-remitting MS: RRMS) 일부 완화는 완전한 회복이 있고, 다른 완화는 부분적이거나 회복이 없음). RRMS의 증상은 경증에서 중증까지 다양할 수 있으며, 재발은 수일 또는 수개월 동안 지속될 수 있다. MS 환자의 80% 초과가 재발-관해 주기로 시작한다; (2) 이차-진행성 MS(Secondary--progressive MS: SPMS)는 재발-관해 MS가 있는 사람에게서 발생한다. SPMS에서, 재발이 발생할 수 있지만, 유의미한 기간 동안 관해(안정화)가 없으며, 장애가 점진적으로 악화된다; (3) 일차-진행성 MS(Primary-progressive MS: PPMS)는 발병으로부터 천천히 그리고 꾸준히 진행되며, MS 사례의 20% 미만을 차지한다. 관해 기간이 없으며, 일반적으로 증상의 강도가 감소하지 않는다; 그리고 (4) 진행성-재발 MS(Progressive-relapsing MS: PRMS). 이러한 유형의 MS에서, 사람들은 관해 기간 동안 꾸준히 악화되는 증상과 발작을 경험한다. 본 발명의 방법은 MS 환자의 임의의 유형, 단계 또는 병태에 적용될 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명의 방법을 사용한 치료는 일부 실시형태에서, 임의의 증상을 완화시키고 공격 사이의 관해 기간을 연장시킬 수 있다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 SLE 및 이와 관련된 임의의 관련 질환 또는 증상의 치료에 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 간단히 루프스로도 알려진 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus: SLE)는 자가면역 질환이다. 증상은 사람마다 다르며 경증에서 중증일 수 있다. 일반적인 증상은 통증 및 부은 관절, 발열, 흉통, 탈모, 구강 궤양, 림프절 부종, 피로감 및 얼굴에서 가장 흔하게 나타나는 붉은 발진을 포함한다. 질환은 갑작스런 증상 악화라고 하는 질환 기간 및 증상이 거의 없는 관해 기간을 특징으로 한다.
SLE의 원인은 명확하지 않지만, 환경 요인과 함께 유전학이 관련되는 것으로 생각된다. 원반모양 홍반성 루프스, 신생아 루푸스 및 아급성 피부 홍반성 루푸스를 포함하는 여러 다른 유형의 홍반성 루푸스가 있다. 본 발명은 이들 유형 각각을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다른 자가면역 장애에 관련될 수 있다. 예를 들어, ANCA-관련 장애의 치료를 위해. 본 명세서에서 사용되는 항-호중구 세포질 항체(anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA)는 주로 MPO 또는 EGPA를 표적으로 하기 때문에 MPO-ANCA로도 알려진 핵주변 항-호중구 세포질 항체(perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody: P-ANCA), 주로 프로테이나제 3(proteinase 3: PR3) 단백질을 표적으로 하기 때문에 주로 GPA와 관련된 PR3-ANCA로도 알려진 세포질성 항-호중구 세포질 항체(Cytoplasmic anti-neutrophil cytoplasmic antibody: c-ANCA) 및 x-ANCA로도 알려진 비정형 ANCA(atypical ANCA: a-ANCA)를 포함하며, 호중구 과립구(가장 일반적인 유형의 백혈구) 및 단핵구의 세포질에 있는 항원에 대해 지시되는 주로 IgG 유형의 자가항체 그룹이다. p-ANCA는 또한 여러 의학적 병태와 관련이 있으며, 상당히 특이하지만 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 대부분의 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis); 국소 괴사성 및 초승달 사구체 신염(focal necrotizing and crescentic glomerulonephritis); 및 류마티스성 관절염에는 민감하지 않다.
더욱이, 이러한 ANCA는 막-결합 PR3/MPO에 결합하여 호중구와 단핵구를 활성화할 뿐만 아니라, 내피와 상호작용하여 부착 인자의 발현을 향상시킨다. 여러 연구에서 혈관염 관해 동안 질환 재발을 예측하는 ANCA 역가를 조사하였으나, ANCA 역가와 AAV의 활성 단계에서의 영구 투석의 요건 간의 연관성은 잘 문서화되지 않았다. 아시아 국가에서는 MPO-ANCA 관련 혈관염이 PR3-ANCA 관련 혈관염보다 더 흔하다. 이들은 다수의 자가면역 질환에서 혈액 검사로 검출되지만, 특히 전신 혈관염, 다발성 혈관염(polyangiitis)을 동반한 육아종증(granulomatosis), 현미경 다발성 혈관염, 원발성 불충분-면역 괴사성 초승달 사구체 신염(primary pauci-immune necrotizing crescentic glomerulonephritis)(신장 제한성 현미경 다발성 혈관염의 일종), 다발성 혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(이전에는 척-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome)으로 알려짐) 및 약물 유도성 혈관염을 포함한 소위 ANCA-관련 혈관염(AAV)과 관련이 있다. PR3 지시된 c-ANCA는 다발성 혈관염을 동반 한 육아종증의 80% 내지 90%, 현미경 다발성 혈관염의 20% 내지 40%, 불충분-면역 초승달 사구체 신염의 20% 내지 40%, 다발성 혈관염을 동반한 호산구성 육아 종증의 35%에 존재한다. c-ANCA(비정형)는 낭포성 섬유증의 80%(표적 항원으로 BPI 포함)에 존재하며, 염증성 장질환, 원발성 경화성 담관염 및 류마티스성 관절염(다중 항원 표적에 대한 항체 포함)에도 존재한다. MPO 특이성이 있는 p-ANCA는 현미경 다발성 혈관염의 50%, 원발성 불충분-면역 괴사성 초승달 사구체 신염의 50%, 다발성 혈관염을 동반한 호산구성 육아종증의 35%에서 발견된다. 다른 항원에 특이성이 있는 p-ANCA는 염증성 장질환, 류마티스성 관절염, 약물-유도성 혈관염, 자가면역 간 질환, 약물 유도성 증후군 및 기생충 감염과 관련이 있다. 비정형 ANCA는 약물-유도성 전신 혈관염, 염증성 장질환 및 류마티스성 관절염과 관련이 있다.
보다 구체적으로, 항호중구 세포질 항항체(Antineutrophil cytoplasmic antoantibody: ANCA)-관련 혈관염(AVV)은 소 혈관의 염증 및 괴사를 특징으로 하는 전신 질환으로, 다발성 기관 손상 및 기능장애를 초래한다. 신장은 가장 빈번하게 영향을 받는 기관로, ANCA-관련 사구체 신염(ANCA-associated glomerulonephritis: AAGN)이라고 하는 불충분-면역 분절 괴사성 초승달 사구체 신염(pauci-immune segmental necrotizing crescentic glomerulonephritis)을 유발한다.
임상 및 실험적 증거는 ANCA가 인간에서 불충분-면역(pauci-immune) 괴사성, 초승달 사구체 신염 (necrotizing, crescentic glomerulonephritis: NCGN) 및 전신성 소 혈관 혈관염을 유발함을 나타낸다.
일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법뿐만 아니라 본 발명에 의해 개시된 조성물, 세포 및 키트는 P-ANCA 관련 장애에 적용될 수 있다.
보다 구체적으로, 항호중구 세포질 항항체의 주요 표적 항원 중 하나는 MPO이다. MPO-ANCA는 단일 에피토프를 표적으로 하는 것이 아니라 주로 중쇄의 카복시 말단에 있는 MPO의 소수의 영역을 표적으로 한다. 따라서, MPO의 발현, 수준 및/또는 활성을 제거함으로써, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 MPO에서 자가항체 표적화된 에피토프의 가변성을 해결한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 ANCA-관련 혈관염인 P-ANCA 관련 장애에 적용될 수 있다. AAV는 임상적 특징에 따라 현미경 다발성 혈관염(MPA), 다발성 혈관염을 동반한 육아종증(GPA), 호산구성 GPA(EGPA) 및 신장-제한 혈관염(RLV)의 네 가지 범주로 분류된다. 기관 침범은 다양한 범주의 AAV에서 많은 변화를 일으키며, 임상 징후는 특이성이 부족하다. 인구 수준에서 불충분-면역 GN의 전염병학과 결과에 대해 알려진 것은 거의 없다. PICG는 급속 진행성 사구체 신염(Rapidly progressive glomerulonephritis: RPGN) 사례의 최대 80%를 차지하며, 미국에서는 연간 백만 명당 7 내지 10건으로 추정된다. 불충분-면역 GN(PICG)은 흑인에 비해 백인에 대한 선호도가 있으며, 남성과 여성이 거의 동일한다.
치료하지 않으면, 불충분-면역 GN-PICG의 1년 사망률은 80%이다. 그러나 공격적인 면역 억제를 사용하면 5년 생존율은 최대 75%이다. 노년, 투석 의존성 및 폐출혈은 모두 생존 가능성을 악화시킨다. 예를 들어, 비가역적 투석-의존성 신부전은 5년 생존율을 35%로 낮춘다. 신장 결과의 관점에서, 환자의 약 25%가 만성 신장 질환의 마지막 단계인 말기 신장 질환(end-stage renal disease: ESRD)이라고도하는 신부전으로 진행된다.
따라서, 일부 실시형태에서, ANCA-관련 또는 연관 장애는 ANCA-관련 혈관염(AAV), ANCA-관련 사구체 신염(AAGN), 초승달 사구체 신염(NCGN) 및 급속 진행성 사구체 신염(RPGN)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 더욱이, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 본 명세서에 개시된 임의의 P-ANCA-관련 장애의 치료를 위한 일부 실시형태에서 적용 가능하다.
일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법은 염증성 장애와 같은 면역-관련 장애를 치료하는데 적용할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 염증성 장애를 치료하는데 적용 가능하다. 용어 "염증성 질환" 또는 "염증-관련 질환"은 적어도 하나의 염증성 매개변수의 감소, 예를 들어 IFN-감마 및 IL-2와 같은 염증성 사이토카인의 유도 및 IL-6 수준의 감소로부터 혜택을 얻을 수 있는 임의의 질환 또는 병리학적 병태를 지칭한다. 병태는 (주로) 염증으로 인해 발생하거나, 또는 염증은 다른 생리학적 원인으로 인한 질환의 증상 중 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 염증성 질환은 죽상 경화증, 류마티스성 관절염(RA) 및 염증성 장질환(IBD) 중 어느 하나일 수 있다. 실시예에 의해 개시된 바와 같이, 본 발명은 MPO-결핍 5XFAD가 MPO-발현 5XFAD 마우스에 비해 우수한 행동 성능을 나타내어 제한된 인지 감소를 반영함을 보여준다. 본 발명은 또한 저하된 수준의 성상세포 활성화, APOE 발현 및 몇몇 전-염증성 사이토카인 수준에 의해 반영된 바와 같이, 이들 마우스의 뇌에서 더 낮은 염증성 반응을 나타낸다.
따라서, 소정의 실시형태에서, 본 발명은 인지 저하의 저해 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 인지 저하를 저해 또는 감소시키기 위한 방법, 조성물, 세포 및 키트를 제공한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 뇌에서의 염증 반응의 저해 또는 감소를 필요로 하는 대상체, 특히 AD를 앓고 있는 대상체의 뇌에서 염증 반응을 저해 또는 감소시키기 위한 방법, 조성물, 세포 및 키트를 제공한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명은 성상세포 활성화 수준의 저해 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서, 성상세포 활성화의 수준을 저해 또는 감소시키기 위한 방법, 조성물, 세포 및 키트를 제공한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 APOE 발현의 저해 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 APOE 발현을 저해 또는 감소시키기 위한 방법, 조성물, 세포 및 키트를 제공한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명은 몇몇 전-염증성 사이토카인의 수준의 저해 또는 감소를 필요로 하는 대상체에서 몇몇 전-염증성 사이토카인의 수준을 저해 또는 감소시키기 위한 방법, 조성물, 세포 및 키트를 제공한다. 이러한 사이토카인은 일부 실시형태에서 IL-1 베타, CXCL10, CCL2 및 TNF 알파 중 적어도 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 대상체는 신경퇴행성 장애를 앓고 있는 대상체일 수 있다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 이러한 신경퇴행성 장애는 AD일 수 있다.
더욱이, 호중구 기능의 중심이며 신경퇴행에서 그 역할이 오랫동안 의심되는 MPO는 AD에서 호중구 손상의 두드러진 매개체로 인정된다. 실제로, 과거에 MPO와 AD의 여러 연관성이 보고되었다. MPO 발현 증가와 관련된 인간 MPO의 프로모터에서 463G/A 유전자좌의 다형성이 후발성 AD의 발생 위험을 높인다는 것이 이전에 밝혀졌다. 또한, MPO와 후발성 AD의 가장 흔한 유전적 위험 요소인 APOE ε4 대립유전자 간의 상호작용이 확인되었다. 그러나, 다음 연구에서 463G/A 다형성과 AD의 연관성에 관한 모순된 결과가 나타났다. Green과 동료들은 AD 환자의 피질에서 MPO 면역 반응과 활성이 상승하고, 산화 생성물의 유병률이 증가했다고 보고하였다. 그러나, 이 연구에서 MPO 발현은 뉴런에 기인하였다. Reynolds와 동료들은 아밀로이드-β 플라크를 둘러싼 CD68 발현 세포에서 MPO 발현을 검출하였으며, 따라서 이는 미세아교세포/대식세포에 기인한다. 최근에는 AD 환자의 뇌에서 아밀로이드-β 플라크와 관련하여 MPO 발현이 보고되었다. 흥미롭게도, 그 뇌에서는 MPO mRNA 발현이 검출되지 않았으며, 이는 관찰된 MPO의 기원이 말초, 골수성이라는 것을 나타낸다. 이러한 관찰은 AD 발병에서 MPO의 관여에 대한 강력한 증거를 제공하지만, 발명자들이 알고 있는 한, 본 발명은 AD의 실험 모델에서 MPO 결핍의 영향을 조사한 최초의 것이다. 본 발명은 CNS-유래 MPO에 영향을 미치지 않으면서 말초 골수성 세포에서 MPO 결핍을 확립하기 위해, 조혈 고갈 및 재증식 방법을 이용하여 주로 호중구로부터 유래된 말초 MPO에 초점을 맞추고 있다. 산화 스트레스와 혈관 손상은 AD 발병에서 주요 이벤트로 간주된다. 이는 잠재적으로 혈액 뇌 장벽 기능장애, 뇌 혈류 감소, 및 CNS 내에서 상당한 산화 및 염증성 손상으로 이어질 수 있다. 신경퇴행에서 호중구 기능에 대한 최근의 결과는 과활성화 및 노화, 피질 모세혈관의 향상된 부착, 뇌 실질의 유출 및 탈과립, 그리고 엄청난 염증성 반응으로 이어지는 NET의 형성을 포함한다. 본 발명에 의해 개시된 데이터는 또한 혈액학적 MPO 결핍이 염증성 반응을 제한한다는 것을 입증한다. 또한, MPO 고갈에 따른 인지 저하에 대한 철저한 보호는 AD 병리학의 상당 부분을 고려하는 호중구로부터 유래된 산화적 손상의 저하를 설명할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 명세서에 개시된 결과는 호중구 고갈 후 AD의 마우스 모델에서 기능적 보호를 나타내는 Zenaro 및 Cruz-Hernandez에 의한 최근 간행물과 일치한다(문헌[Zenaro, E. et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nat. Med. 21, 880-886 (2015), 및 Cruz Hernandez, J. C. et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nat. Neurosci. (2019). doi:10.1038/s41593-018-0329-4]).
MPO 기능은 심혈관 및 신장 질환의 맥락에서 내피 기능장애 및 혈관 손상과 관련이 있다. 활성화된 호중구에 의해 분비된 양으로 하전된 MPO는 음이온성 글리코칼릭스와의 상호작용을 통해 내피 및 내피하 공간을 따라 축적된다. 결합된 MPO로부터 유래된 산화제는 글리코칼릭스 두께 및 내피 손상을 감소시키는 것으로 나타 났지만, MPO는 호중구 동원 및 이동을 촉진하는 것으로 나타났다. 이는 증폭된 MPO 반응 및 호중구의 제자리(in situ) 축적을 초래할 수 있다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 MPO 결핍 5XFAD 마우스의 해마 샘플에서 VCAM1 발현의 감소를 발견하였으며, 이는 내피의 염증 증가를 시사한다. 그러나, MPO의 결핍이 미세혈관 내피에서 호중구의 동원에 미치는 영향과 모세혈관 스톨(capillary stall)과 대뇌 혈류 및 호중구 이동에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았다.
본 발명에 의해 제시된 결과는 호중구-유래 MPO가 5XFAD 마우스에서 AD-유사 발병에 중심적인 역할을 한다는 것을 명확하게 나타낸다. 이러한 결과는 AD의 치료를 위한 새로운 치료 표적으로서 MPO 저해를 제안한다.
따라서, 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, MPO-관련 병태는 신경퇴행성 장애일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 신경퇴행성 장애를 치료하는데 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 신경퇴행성 장애는 염증 및/또는 혈관성 원인(vascular cause)을 더 포함할 수 있다.
신경퇴행은 시냅스 기능장애 및 뉴런의 죽음을 포함하여 뉴런의 구조 또는 기능의 점진적인 손실을 나타내는 포괄적 용어이다. '알츠하이머병' 및 '파킨슨병'을 포함한 많은 신경퇴행성 질환이 신경퇴행 과정과 관련이 있다. 본 명세서에서 또한 적용될 수 있는 신경퇴행의 다른 예는 프리드리히 운동 실조증(Friedreich's ataxia), 루이소체병(Lewy body disease), 척추성 근위축(spinal muscular atrophy), 다발성 경화증, 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 피질기저 변성(corticobasal degeneration), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 유전적 경련성 마비(hereditary spastic paraparesis), 아밀로이드증(amyloidosis), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS) 및 샤르코-마리-투스병(Charcot Marie Tooth)을 포함한다. 정상적인 노화 과정은 진행성 신경퇴행을 포함한다는 점을 간과해서는 안되며, 특히 연령-관련 인지기능 저하(age-related cognitive decline: ACD) 및 경미한 인지 장애(mild cognitive impairment: MCI)도 또한 본 발명에서 적용 가능하다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 키트, 조성물 및 세포는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy: DMD) 또는 이와 관련된 임의의 병태에 적용할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 키트, 조성물 및 세포는 베커 근이영양증에 적용할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 방법, 키트, 본 발명의 방법, 키트, 조성물 및 세포는 결절성 경화증(Tuberous sclerosis complex: TSC)에 적용할 수 있다.
보다 특정한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 장애를 치료하는데 적용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 알츠하이머 병(AD)은 일반적으로 진단 후 3년 내지 9년 이내에 사망에 이르는 기억 및 기타 인지 영역의 저하를 수반하는 장애를 지칭한다. 알츠하이머병의 주요 위험 인자는 나이이다. 이 질환의 발병률은 65세 이후 5년마다 두 배로 증가한다. 질환에 걸린 사람 중 최대 5%는 40세 또는 50세에 나타날 수 있는 조기 발병 AD(젊은 발병(younger-onset)이라고도 함)를 앓고 있다. 알츠하이머병에서 많은 분자적 병변이 발견되었지만, 데이터에서 나타나는 가장 중요한 주제는 노화된 뇌에 미스폴딩된 단백질이 축적되면 산화적 및 염증성 손상을 일으켜 에너지 장애와 시냅스 기능장애를 초래한다는 것이다. 보다 구체적으로, 알츠하이머병 환자의 뇌에서 단리된 구조적으로 손상된 미토콘드리아 내에 Aβ가 축적되는 것으로 나타났다.
알츠하이머병은 주로 시냅스 장애(synaptic failure)의 장애일 수 있다. 해마 시냅스는 경미한 인지 장애(치매 이전에 흔히 나타나는 제한된 인지 부족) 환자에서 감소하기 시작하며, 나머지 시냅스 프로파일은 보상적으로 크기가 증가한다. 경증 알츠하이머병에서, 시냅스전 소포 단백질인 시냅토파이신(synaptophysin)은 약 25% 감소한다. 질환이 진행됨에 따라, 시냅스는 뉴런에 비해 불균형적으로 소실되며, 이러한 소실은 치매와 가장 관련이 있다. 노화 자체는 시냅스 소실을 일으켜 특히 해마의 치아 영역(dentate region)에 영향을 미친다.
알츠하이머병을 시작하고 유발할 수 있는 단일 선형의 알려진 일련의 이벤트나 경로는 없다. AD는 진행성 질환으로, 치매 증상이 수년에 걸쳐 점차 악화된다. 초기 단계에서는 기억 상실이 경미하지만, 후기 AD의 경우 개인은 대화를 계속하고 환경에 반응하는 능력을 상실한다. 알츠하이머병 환자는 증상이 다른 사람에게 눈에 띄게 된 후 평균 8년을 살지만, 생존 기간은 연령 및 기타 건강 상태에 따라 최대 20년까지 가능하다.
AD의 가장 흔한 초기 증상은 AD 변화가 일반적으로 학습과 기억에 영향을 미치는 뇌 부분에서 시작되기 때문에 새로 배운 정보를 기억하는데 어려움이 있다는 것이다. AD가 뇌를 통해 진행됨에 따라 방향 감각 상실, 기분 및 행동 변화; 사건, 시간 및 장소에 대한 혼동 심화; 가족, 친구 및 전문 간병인에 대한 근거없는 의심; 더 심각한 기억 상실 및 행동 변화; 말하기, 삼키기, 걷기의 어려움을 포함하여 점점 더 심각한 증상이 나타난다.
신경소통 장애 및 뇌졸중 국립연구소(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke: NINCDS)와 알츠하이머병 및 관련 장애 협회(Alzheimer's disease and Related Disorders Association: ADRDA, 현재 알츠하이머 협회로 알려짐)는 1984년에 가장 일반적으로 사용된 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 진단 기준을 확립하였으며, 2007년에 광범위하게 업데이트되었다. 이러한 기준은 인지 장애의 존재와 의심되는 치매 증후군이 가능 AD(possible AD) 또는 유력 AD(probable AD)의 임상 진단을 위한 신경 심리학적 검사를 통해 확인될 것을 요구한다. 정확한 진단을 위해서는 뇌 조직의 현미경 검사를 포함한 조직 병리학적 확인이 필요하다. 진단 기준과 최종 조직 병리학적 확인 사이에 좋은 통계학적 신뢰성과 타당성이 나타났다. 기억력, 언어, 지각 능력, 주의력, 구성 능력, 지남력(orientation), 문제 해결 능력, 기능 능력 등 8가지 인지 영역이 AD에서 가장 일반적으로 손상된다. 이러한 범위는 미국 정신과 협회에 의해 발행된 정신 장애 진단 및 통계 매뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-IV-TR)에 열거된 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 기준과 동일하다. 치매 증상의 악화를 일시적으로 늦추는 대증적 치료 외에, AD는 현재의 치료법이 없으며 현재의 치료법으로는 AD의 진행을 막을 수 없다. 본 발명에 의해 제공되는 조성물, 세포, 키트, 용도 및 시스템뿐만 아니라 본 발명의 방법은 본 명세서에 논의된 임의의 MPO- 관련 병태의 AD와 관련된 임의의 단계, 병태 또는 증상에 적용할 수 있음을 이해하여야 한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 AD 환자에서 질환의 임의의 단계, 유형, 증상 또는 정도에 적용할 수 있다는 것을 추가로 이해하여야 한다.
도 5 및 도6에 나타난 바와 같이, MPO-KO BM 세포를 AD 동물(5XFAD)로 입양 전달하면 공간 학습 및 기억력, 연관 학습 및 불안/위험 평가 행동이 명확하게 개선된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 AD 환자에서 공간 학습을 개선하고 향상시키는데 적용할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 AD 환자의 기억력을 개선하고 향상시키는데 적용할 수 있다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 AD 환자에서 연관 학습을 개선하고 향상시키는데 적용할 수 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 AD 환자에서 불안/위험 평가 행동을 개선하고 향상시키는데 적용할 수 있다.
위에 나타낸 바와 같이, AD는 단백질 미스폴딩(예를 들어, Aβ 펩타이드)을 포함하는 병태로 간주된다. 따라서, 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 단백질 미스폴딩과 관련된 임의의 병태, 예를 들어 사이누클레인병증(synucleinopathy) 및 타우병증(tauopathy)에 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, "알파-사이누클레인 병리학적 장애" 또는 "사이누클레인병증(synucleinopathy)"은 뉴런 및 아교세포의 선택적 집단의 세포질에서 알파-사이누클레인 단백질의 원섬유성 응집체를 특징으로 하는 신경퇴행성 장애 그룹을 명명하는데 사용된다. 모노머, 올리고머 중간체 또는 원섬유 형태를 포함하는 알파-사이누클레인 응집체는 파킨슨병(PD)의 발병, 및 다계통 위축증(MSA)과 루이소체 치매(DLB)와 같은 기타 알파-사이누클레인 병증에서 중요한 단계에 관여하는 것으로 생각된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 본 명세서에 개시된 임의의 사이누클레인병증에 적용할 수 있다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 타우 단백질의 축적과 관련된 임의의 병태에 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용되는 "타우 단백질"은 알츠하이머병, 및 타우병증이라 불리는 다른 신경퇴행성 장애에 특징적인 피라미드형 뉴런의 섬유성 봉입체(inclusion)인 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle)를 지칭한다. 그 형성 메커니즘의 해명은 향후 치료의 목표를 제공할 수 있다. 피라미드형 뉴런에서 쌍을 이룬 나선형 필라멘트로서 과인산화된 타우 단백질의 축적은 알츠하이머병의 주요 특징이다. 과인산화 외에, 가교와 같은 타우 단백질의 다른 변형은 불용성 및 단백질 분해에 대한 저항성을 포함하여 쌍을 이룬 나선형 필라멘트의 특징적 특성에 기여할 가능성이 있다. 이러한 신경섬유 덩어리는 과인산화되고 응집된 형태의 미소관-관련 단백질 타우로 구성된다.
실시예 2에 나타난 바와 같이, 미분화 MPO KO BM 세포의 입양 전달은 AD에서 인지 장애의 명확한 저해를 유도하고, 인지 기능 및 연관 학습을 개선시켰다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 인지 저하 또는 장애와 관련된 임의의 병태에 적용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 MCI에 적용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "연령-관련 경미한인지 장애(Age-associated mild cognitive impairment: MCI)"는 인지 변화를 유발하는 병태이다. 주로 기억에 영향을 미치는 MCI는 대상체가 최근 사건, 약속 또는 대화 또는 최근 사건과 관련된 정보를 기억하는데 장애를 경험하는 "건망성 MCI(amnestic MCI)"로 분류될 수 있다. 기억 이외의 사고 능력에 영향을 미치는 MCI는 "비건망성 MCI(nonamnestic MCI)"로 알려져 있다. 비건망성 MCI의 영향을 받을 수 있는 사고 능력은 타당한 결정을 내리고 복잡한 작업을 완료하는데 필요한 시간 또는 단계 순서를 판단하는 능력 또는 시각적 인식을 포함한다.
정상적인 노화는 많은 인지 작업에서 다양한 기억 능력의 감소와 관련이 있고; 이러한 현상은 연령-관련 기억 장애(AMI), 연령-연관 기억 장애(age-associated memory impairment: AAMI) 또는 연령-연관 인지 저하(age-associated cognitive decline: ACD)로 알려져 있다. 사건이나 사실에 대한 새로운 기억과 작업 기억을 암호화하는 능력은 단면적 연구와 종단적 연구 모두에서 감소를 보여준다. 노화가 일화 기억, 의미 기억, 단기 기억 및 프라이밍(priming)에 미치는 영향을 비교한 연구는 일화 기억이 특히 정상적인 노화에서 손상되며; 일부 유형의 단기 기억도 또한 손상된다는 것을 밝혔다. 결함은 최근에 처리된 정보를 새로 고치는 능력에서 보이는 장애와 관련이 있을 수 있다. 일반적으로, 언어 능력, 일부 수치 능력 및 일반 지식과 같은 일부 정신 기능은 연령과 관련된 쇠퇴가 거의 없지만, 다른 정신 기능은 중년 이후 또는 심지어 그 이전에 감소한다. 후자는 기억, 실행 기능, 처리 속도 및 추론의 측면을 포함한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 본 발명은 임의의 인지 저하, 특히 연령, 특히 50세, 55세, 60세, 65세, 70세, 75세, 80세, 85세, 90세, 95세 이상의 연령과 관련된 인지 저하에 대한 치료 방법 및 조성물을 제공한다는 것을 이해하여야 한다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 DLB에 적용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "루이소체 치매(Dementia with Lewy Bodies: DLB)"는 치매의 상대적으로 흔한 원인이며, 치매 사례의 최대 30%를 차지하는 것으로 추정되고, 75세 이상 인구의 최대 5%에 영향을 미친다. 병리학적으로, 이는 뇌에 루이소체를 함유하는 알파 사이누클레인의 존재로 정의되지만, 그 분포는 신피질, 변연계 및 뇌간에 영향을 미친다. 임상적으로, DLB는 눈에 띄는 환각과 망상을 동반하는 진행성 치매 및 서동과 경직을 동반하지만 전형적으로 최소한의 떨림을 동반하는 파킨슨증을 특징으로 한다. 눈에 띄는 인지적 변동은 이러한 상태의 일반적인 특징으로, 혼란, 과도한 졸음 및 몇 시간 내에 거의 정상 상태로 돌아갈 수 있는 일관성 없는 말투가 있다.
일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 PD에 적용할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "파킨슨병(Parkinson's disease: PD)"은 중뇌 도파민 뉴런의 퇴화 및 생존 뉴런에 루이소체를 함유하는 알파-사이누클레인의 축적으로 인한 신경퇴행성 질환이다. PD의 진단은 다른 원인이 없는 상태에서 주요 운동 특징의 존재를 기반으로 한다. 이러한 운동 특징은 서동, 안정시의 환약말이 떨림(resting pill-rolling tremor) 및 전형적으로 무표정증(hypomimia), 발성부전(hypophonia), 소서증(micrographia) 및 자세 불안정(postural instability)과 관련된 경직의 고전적인 삼징후를 포함한다. PD의 비운동적 특징은 진단 이전에도 전구(prodromal) 또는 전운동(premotor) PD를 구성할 수 있다. 이러한 전운동 특징은 후각, 변비, 기분 및 수면 문제를 포함하며, PD의 임상 진단 후 더욱 두드러질 수 있다. 인지 문제와 치매도 또한 PD에서 흔히 발생하며, 진단 후 10년까지 거의 50%에 영향을 미친다. 그러나, 알파-사이누클레인병증이 있는 일부 개인의 경우 심각한 인지 문제가 파킨슨 운동 증상의 발병 이전에 나타나며, 이러한 사례는 루이소체를 사용한 치매 진단으로 임상적으로 분류된다. 임상적으로나 병리적으로 이러한 두 가지 병태 사이에 상당한 정도의 중복이 있지만, 현재 임상적 구분은 운동 증상의 발병과 치매 사이의 시간 간격에 달려 있으며, 루이소체 치매(DLB)와는 달리 PD 진단에는 최소 1년의 간격이 필요하다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 MSA에 적용할 수 있다. "다계통 위축증(Multiple system atrophy: MSA)"은 희소돌기아교세포 내에 섬유질성 알파-사이누클레인을 함유하는 아교세포성 세포질 봉입체의 형태를 취하는 흑질 선조체 및 올리브뇌교소뇌(olivopontocerebellar) 구조의 세포 손실 및 신경아교증(gliosis)을 포함하는 신경 병리이다. 다양한 조합으로 파킨슨증 및 소뇌 기능장애와 함께 자율신경 기능장애를 나타내며, 임상적으로는 주로 소뇌 기능장애가 주된 (MSA-C) 또는 파킨슨증이 주된 (MSA-P)로 분류된다.
더 나아가, 위에 나타낸 바와 같이, 신경퇴행성 장애는 혈관 및 허혈성 병태와 분명히 연관되어 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 임의의 혈관 및/또는 허혈성 병태에 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, 뇌 허혈(또는　대뇌 허혈, 뇌혈관 허혈)은 대사 요구를 충족시키기에 뇌로의 혈류가 충분하지 않은 병태이다. 이는 산소 공급 부족 또는 뇌 저산소증을 유발하여 뇌 조직의 사멸 또는 뇌경색(cerebral infarction)/허혈성 뇌졸중(ischemic　stroke)을 초래한다. 이는 지주막하 출혈 및 뇌내 출혈과 함께 뇌졸중의 하위-유형이다. 허혈은 뇌 신진대사의 변화, 신진대사율의 감소 및 에너지 위기로 이어진다. 허혈에는 두 가지 유형이 있다: 뇌의 특정 영역에 국한된 국소 허혈(focal ischemia); 및 뇌 조직의 넓은 영역을 포함하는 전뇌 허혈(global ischemia). 주요 증상은 시각, 신체 움직임 및 말하기 장애를 포함한다. 뇌 허혈의 원인은 겸상적혈구 빈혈(sickle cell anemia)에서 선천성 심장 결함에 이르기까지 다양하다. 뇌 허혈의 증상은 무의식, 실명, 협응 문제 및 신체 약화를 포함할 수 있다. 뇌 허혈로 인해 발생할 수 있는 다른 영향은 뇌졸중, 심폐 정지 및 돌이킬 수 없는 뇌 손상이다.
허혈성 뇌졸중에서는 뇌의 일부로의 혈액 공급이 감소하여 해당 부위의 뇌 조직 기능이 저하된다. 허혈성 뇌졸중에는 혈전증(thrombosis)(국소적으로 형성되는 혈전에 의한 혈관의 폐색), 색전증(embolism)(신체의 다른 곳에서 발생하는 색전으로 인한 폐색), 전신 저관류(systemic hypoperfusion)(혈액 공급의 일반적인 감소, 예를 들어 쇼크); 및 대뇌 정맥동 혈전증(cerebral venous sinus thrombosis)의 네 가지 주요 원인이 있다.
급성 허혈성 뇌졸중에는 다양한 분류 체계가 있다. 옥스퍼드 공동체 뇌졸중 프로젝트 분류(Oxford Community Stroke Project classification: OCSP, 뱀퍼드(Bamford) 또는 옥스퍼드(Oxford) 분류라고도 함)는 주로 초기 증상에 의존하며; 증상의 정도에 따라 뇌졸중 에피소드는 총 전방 순환 경색(total anterior circulation infarct; TACI), 부분 전방 순환 경색(partial anterior circulation infarct: PACI), 열공 경색(lacunar infarct: LACI) 또는 후방 순환 경색(posterior circulation infarct: POCI)으로 분류된다. 이 네 가지 속성은 뇌졸중의 정도, 뇌졸중이 일어난 뇌의 영역, 기저 원인 및 예후를 예측한다. TOAST(급성 뇌졸중 치료의 Org 10172의 실험)분류는 더 심도있는 연구 결과뿐만 아니라 임상적 증후에도 근거를 두고 있으며; 이 기준에 따라, 뇌졸중은 (1) 대동맥 죽상동맥경화증으로 인한 혈전증 또는 색전증으로 인한 것, (2) 심장에서 발생하는 색전증으로 인한 것, (3) 소 혈관의 완전 폐색으로 인한 것, (4) 다른 확실한 원인으로 인한 것, (5) 불확실한 원인으로 인한 것(두 가지 가능한 원인으로, 확인된 원인이 없거나 또는 연구의 불완전)으로 분류된다.
작은 만성 뇌내 출혈(직경 5㎜ 미만 내지 10㎜)은 대뇌 미세 출혈(cerebral microhemorrhage: CMH; 미세 출혈, 다초점 신호 손실 병변, 점상 출혈로도 기재됨)이라 한다. CMH는 작은 동맥, 세동맥의 파열 및/또는 모세 혈관(인간 CMH에서, 파열된 혈관의 직경은 200㎛ 미만으로 추정되며, 많은 출혈이 세동맥 및 모세혈관 수준에서 발생함)의 파열에 기인한다. CMH는 국소 헤모시데린 침착(focal hemosiderin deposition)에 해당하는 작은 타원형의 하이포인텐스(hypointense) 병변으로 나타나며, 이는 T2*-강조 기울기-회복 에코(T2*-weighted Gradient-Recall Echo: T2*-GRE) MRI 시퀀스를 사용하여 가장 잘 검출될 수 있다.
연령은 CMH의 가장 중요한 독립적인 위험 인자이다. CMH의 유병률은 어린 대상체에서는 낮으며, 나이가 들면서 점차 증가한다. 대부분의 연구는 노인 환자에서 CMH의 유병률이 24% 내지 56%라고 보고하고 있다. 고혈압은 CMH의 또 다른 주요 독립적 위험 인자이다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 알츠하이머병(AD)도 또한 CMH의 중요한 위험 인자를 구성한다. 증식성 당뇨병성 망막증(proliferative diabetic retinopathy)이 있는 제1형 당뇨병 환자에서, CMH의 유병률이 증가한 것으로 보고되었으며, 이는 일반적인 미세혈관병증이 대뇌 및 망막 미세혈관 손상 둘 다에 기여할 수 있음을 시사한다. CMH는 또한 Notch 3 유전자의 돌연변이로 인한 성인형(adult-onset) 유전성 뇌졸중 장애인 피질하 경색과 백질뇌병증을 동반하는 상염색체 우성 뇌동맥병증(cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy: CADASIL)에 걸린 개인의 거의 절반에서 발견된다.
추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 cSVD에 적용할 수 있다. 대뇌 소 혈관 질환(Cerebral small vessel disease: cSVD)은 소동맥, 세동맥, 모세 혈관 및 소정맥을 포함하여 뇌의 소 혈관에 영향을 미치는 다양한 병리학적 과정에 사용되는 용어이다. cSVD는 열공성 뇌경색(lacunar cerebral infarction) 및 심부 또는 피질 출혈에서 중요한 역할을 한다. 인지 기능 저하 및 치매 외에도, 보행 문제가 또한 cSVD와 자주 연관된다. 증상이 있는 뇌졸중의 약 5분의 1은 열공성 뇌졸중 증후군이며, 이는 종종 더 심각한 종류의 뇌졸중, 즉 자발성 실질 뇌출혈(spontaneous parenchymal brain hemorrhage: PBH)이다. 이들은 cSVD와 관련이 있다. 그러나, 산발성 cSVD가 PBH의 주요 원인이지만, 기저 미세혈관 병리의 해부학적 부위(topography)는 각 사례마다 상이하다. cSVD는 두 가지 주요 형태로 분류된다. 첫 번째는 만성 퇴행성 질환인 대뇌 아밀로이드 혈관병증(Cerebral amyloid angiopathy: CAA)을 포함하는 아밀로이드 형태이다. 두 번째 형태는 비-아밀로이드 형태의 cSVD로 특징지어지며, 이는 종종 노령, 고혈압, 당뇨병 및 기타 여러 요인과 같은 일반적인 혈관 위험 인자와 관련이 있다.
콩고친화성 혈관병증(congophilic angiopathy)으로도 알려진 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 중추 신경계의 혈관벽에 아밀로이드 침착이 형성되는 혈관병증의 한 형태이다. 비정상적인 아밀로이드 응집의 존재가 콩고 레드라는 특수 염색을 적용한 후 뇌 조직을 현미경으로 검사함으로써 입증될 수 있기 때문에, 콩고친화성이라는 용어가 사용된다. 아밀로이드 물질은 뇌에서만 발견되며, 다른 형태의 아밀로이드증과는 관련이 없다.
CAA는 cSVD의 흔한 아밀로이드 형태이다. CAA의 발생은 대부분 고령과 관련이 있다. 이는 피질 및 연수막 소동맥의 벽에 β-아밀로이드의 점진적 침착에 의해 유발되며, 이는 혈관 기능장애와 뇌 실질 손상을 유발한다. β- 아밀로이드의 침착은 혈관 폐색 및 파열에 관여하는 것으로 생각된다. CAA 관련 혈관병증은 섬유소성 괴사, 평활근 세포의 손실, 벽 비후, 미세동맥류 형성 및 생성된 생성물의 침착으로 인한 혈관주위 혈액 분해와 같은 특징을 포함한다. 아밀로이드 침착 및 대립유전자 차이의 특정 위치를 기반으로, CAA의 다음의 적어도 두 가지 병리학적 하위유형이 확인되었다: 피질 모세혈관에서의 아밀로이드를 특징으로 하는 CAA 유형-1 및 아밀로이드 침착이 연수막과 피질 동맥으로 제한되지만 모세혈관에는 제한되지 않는 CAA 유형-2. 아밀로이드증을 동반하는 유전성 뇌출혈(네덜란드형)(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis-Dutch type: HCHWA-D) 증상이 있는 환자에서 후두엽의 피질 회백질 감소와 기저 동맥의 플럭스 감소가 관찰되었다. HCHWA-D 환자에서 피질이 얇아지는 현상은 혈관 아밀로이드가 피질 위축의 독립적인 원인임을 나타낸다. CAA-관련 피질 위축은 혈관 기능장애에 의해 촉진되었으며, 심지어 알츠하이머병이 없는 경우에도 관찰되었다. 또한, 아포리포단백질 E(APOE) 유전자 다형성은 CAA의 두 가지 하위유형과 관련이 있다. APOE ε4 대립유전자와 APOE ε2는 각각 유형-1 및 유형-2 질환과 논리적으로 연관되어 있다.
따라서, 본 발명의 방법, 조성물, 시스템, 키트 및 용도는 임의의 허혈성 병태, 특히 본 명세서에 개시된 임의의 병태에 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.
더욱이, 호중구는 병원균을 식균하고 죽이며, 숙주를 감염으로부터 보호하는 염증성 반응을 일으키는 선천성 면역 세포로 오랫동안 알려져 왔다. 호중구 세포외 DNA 트랩(NET)의 형성은 염증과 면역뿐만 아니라 암 생물학 및 혈전증을 포함한 병리학적 병태와 관련 병태(예를 들어, 트루소 증후군(Trousseau syndrome))에서도 호중구의 새로운 역할을 정의하였다. 호중구 염색질의 방출은 종양 성장, 혈관신생, 전이 및 면역 억제를 포함한 종양 발달의 여러 단계에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 위에 나타낸 바와 같이, MPO는 호중구에서 NET 형성에 관여한다. 따라서, MPO 발현, 수준 및/또는 활성을 조절, 특히 저해함으로써, 본 발명은 대상체에서 NET 형성을 조절 및 저해하기 위한 전략을 제공하고, 이에 따라 암 및 관련 장애를 치료하기 위한 접근법을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, MPO의 향상된 발현 또는 활성을 수반할 수 있는 MPO-관련 병태는 증식성 장애일 수 있다. 따라서, 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 증식성 장애를 치료하는데 적용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에 따른 증식성 장애는 암 및/또는 전이와 같은 임의의 관련 병리일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "암", "종양" 및 "악성"은 모두 조직 또는 기관의 과증식과 동등하게 관련된다. 조직이 림프계 또는 면역계의 일부인 경우, 악성 세포는 순환 세포의 비-고형 종양을 포함할 수 있다. 다른 조직 또는 기관의 악성 종양은 고형 종양을 생성할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 비-고형 및 고형 종양의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에서 상정되는 악성 종양은 암종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 골수종 및 육종 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 암종은 형질전환된 상피 세포로 구성된 침습성 악성 종양을 지칭한다. 대안적으로, 이는 조직발생이 알려지지 않은 형질전환된 세포로 구성된 악성 종양을 지칭하지만, 이는 사이토케라틴 또는 세포간 브리지의 생성과 같은 상피 세포와 관련된 특정 분자 또는 조직학적 특징을 가지고 있다.
본 명세서에서 사용되는 흑색종은 흑색 세포의 악성 종양이다. 멜라닌 세포는 피부색을 담당하는 어두운 색소인 멜라닌을 생성하는 세포이다. 이들은 주로 피부에서 발생하지만, 장과 눈을 포함한 신체의 다른 부분에서도 발견된다. 흑색종은 흑색 세포를 포함하는 신체의 임의의 부위에서 발생할 수 있다.
백혈병은 조혈 기관의 진행성 악성 질환을 지칭하며, 일반적으로 혈액 및 골수에서 백혈구 및 그 전구체의 기형적인 증식 및 발달을 특징으로 한다. 백혈병은 일반적으로 (1) 질환의 지속기간 및 특성 - 급성 또는 만성; (2) 관련 세포의 유형; 골수(골수성), 림프(림프성), 또는 단핵구성; 및 (3) 혈액에서 비정상적인 세포 수의 증가 또는 비증가 - 백혈병성 또는 비백혈병성(아백혈병성)에 기초하여 임상적으로 분류된다.
육종은 변형된 결합 조직 세포에서 발생하는 암이다. 이러한 세포는 뼈, 연골 및 지방 조직을 형성하는 배아 중배엽 또는 중간층에서 발생한다. 이것은 상피에서 발생하는 암종과는 대조적이다. 상피는 몸 전체의 구조 표면을 둘러싸고 있으며, 유방암, 결장암 및 췌장암의 기원이다. 본 명세서에 언급된 골수종은 일반적으로 항체의 생산을 담당하는 백혈구의 한 유형인 형질 세포의 암이다. 비정상적인 세포의 집합은 뼈에 축적되어 골 병변을 유발하고, 골수에 축적되어 정상적인 혈액 세포의 생성을 방해한다. 대부분의 골수종 사례는 또한 신장 문제를 일으킬수 있는 비정상적인 항체인 파라단백질의 생성을 특징으로 하며, 면역 결핍으로 이어지는 정상 항체의 생산을 방해한다. 고칼슘혈증(높은 칼슘 수준)이 종종 발생한다. 림프종은 면역계의 림프 세포에 있는 암이다. 전형적으로, 림프종은 림프 세포의 고형 종양으로 존재한다. 이러한 악성 세포는 종종 림프절에서 발생하여 림프절(종양)의 확대로 나타난다. 이는 또한 다른 기관에도 영향을 미칠 수 있으며, 그런 경우에는 림프절외 림프종으로도 칭해진다. 림프종에 대한 비-제한적인 예는 호지킨병, 비호지킨 림프종 및 버킷 림프종을 포함한다.
본 발명에 따라 치료 또는 저해될 수 있는 악성 종양에 대한 추가의 비-제한적 예는 비-고형암, 예를 들어 조혈 악성 종양, 예컨대 모든 유형의 백혈병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia: AML), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS), 비만 세포 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 호 지킨병, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 다발성 골수종을 포함한다. 본 발명에 따라 치료 또는 저해될 수 있는 고형 종양에 대한 비-제한적 예는 입술 및 구강, 인두, 후두, 부비동, 주요 타액선, 갑상선, 식도, 위, 소장, 결장, 결장직장, 항문관, 간, 담낭, 간외 담관, 십이지장 팽대부, 외분비 췌장, 폐, 흉막 중피종, 뼈, 연조직 육종, 피부의 암종 및 악성 흑색종, 유방, 외음부, 질, 자궁경부, 자궁체, 난소, 나팔관, 임신성 영양모세포성 종양, 음경, 전립선, 고환, 신장, 신우, 요관, 방광, 요도, 눈꺼풀의 암종, 결막의 암종, 결막의 악성 흑색종, 포도막의 악성 흑색종, 망막 모세포종, 눈물샘 암종, 안와 육종, 뇌, 척수, 혈관계, 혈관 육종 및 카포시 육종에서의 종양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 유방암이다.
죽상동맥경화증 및 심혈관 질환, 신장 질환, 폐 염증, 류마티스성 관절염, 피부 염증, 신경 질환 및 대사 증후군을 포함하는 다발성 염증성 질환의 발병 기전에서 MPO. 보다 구체적으로, 사구체 및 세뇨관 간질성 질환에서, 다형핵- 및 단핵구-유래 활성 산소 종은 단백질, 지질 및 핵산의 산화적 변형에 기여할 수 있다. 부분적으로, 활성 산소 종에 의해 유발된 과정은 죽상동맥경화증의 발병으로 이어지는 이벤트와 유사하다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 죽상동맥경화증뿐만 아니라 심혈관 질환, 예를 들어 내독소혈증, 심근경색/허혈, 혈관 기능장애 및 심방 세동에 적용할 수 있다.
더욱이, 염화물 이온의 존재하에서 과산화수소로부터 차아염소산/차아염소산염(HOCl/OCl-)을 생성하는 MPO의 능력은 이 효소에 대한 고유하고 결정적인 활성이다. MPO-과산화수소-염화물 시스템은 차례로 신장의 다른 구획에서 세포의 기능장애를 유발할 수 있는 다양한 염소화된 단백질과 지질 부가물을 생성한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 만성 신장 질환, 허혈/재관류 손상, 사구체 신염 및 루푸스 신염을 포함할 수 있는 다양한 신장 질환에 적용할 수 있다.
일부 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법, 조성물, 세포 및 키트는 적어도 하나의 호흡기 병태에 적용할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 호흡기 병태 또는 질환은 호흡기의 일부인 기관 및 조직에 영향을 미치는 병리학적 병태를 포함한다. 이러한 병태는 기관, 기관지, 세기관지, 폐포, 흉막, 흉강 및 호흡 신경과 근육을 포함한 호흡기의 병태를 포함한다. 호흡기 질환은 경증 및 자기-제한적(self-limiting)에서 생명을 위협하는 질환에 이르기까지 다양하며, 만성 및 급성 질환을 포함한다. 만성 호흡기 질환(Chronic respiratory disease: CRD)은 기도 및 기타 폐 구조의 질환이다. 이들은 높은 염증성 세포 동원(호중구) 및/또는 감염의 파괴적 악순환을 특징으로 한다. 호흡기 질환은 관련 기관 또는 조직, 관련 징후 및 증상의 유형과 패턴, 또는 질환의 원인을 포함하여 다양한 방식으로 분류될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 호흡기 질환은 폐동맥 고혈압(Pulmonary arterial hypertension: PAH), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD) 및 만성 육아종성 질환(Chronic Granulomatous Disease: GCD) 중 적어도 하나를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, Klinke(문헌[Klinke et al. (2018) JCI Insight; 3(11): e97530])은 MPO와 손상된 폐 혈관 기능 사이의 메커니즘적 연관성을 보여주었으며, 폐동맥 고혈압이 MPO 저해에 의해 개선될 수 있음을 시사하였다. 특히, 이들은 MPO가 폐동맥 고혈압 환자에서 상승하고 후속 부작용과 관련이 있음을 보여주었다. 또한 이들은 MPO 수준이 높은(583 p㏖/ℓ 초과) 환자는 MPO 수준이 낮은 환자와 비교하여 65주의 중앙값에 걸쳐 감소된 생존율(P=0.023)을 보였음을 관찰하였다. 또한, 결핍성 MPO 마우스(MPO-/-)는 야생형 마우스와 비교하여 저산소 상태에서 우심실 압력이 덜 증가한 것으로 나타났다. MPO-/-마우스에서 Rho-키나제 경로(혈관수축 및 구조적 혈관 재형성에 관여하는 중요한 세포내 신호전달 경로)의 저산소-유도성 활성화가 둔화되었다. 따라서, 이 연구는 MPO, Rho-키나제의 활성화 및 폐 혈관 기능 사이의 긴밀한 메카니즘적 연결을 보여준다. 따라서, 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 PAH를 앓고 있는 대상체에서 MPO 수준을 감소시키기 위해 적용할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 PAH를 앓고 있는 대상체의 치료에 적용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 폐동맥 고혈압(Pulmonary arterial hypertension: PAH)은 폐동맥의 재형성 및 협착을 특징으로 하는 치료법이 없는 진행성 질환으로, 우심실 압력 상승, 심부전 및 사망으로 이어진다. 백혈구-유래 헴-효소인 미엘로퍼옥시다제(MPO)는 혈관벽의 체액성 기능장애의 중심 매개체로 확고하게 확립되어 있기 때문에, PAH의 잠재적 매개체로 등장한다.
더욱이, 미엘로퍼옥시다제는 강력한 항균 및 전죽종형성성(proatherogenic) 특성을 갖는 호중구의 1차 과립에 저장된 강력한 산화제이다. 미엘로퍼옥시다제는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)의 병인과 관련이 있다. 보다 구체적으로, 증가된 혈청 미엘로퍼옥시다제 수준은 COPD 환자의 빠른 폐 기능 저하 및 불량한 심혈관 결과와 관련이 있으며, 이는 COPD 진행의 병인에서 미엘로퍼옥시다제의 새로운 역할을 지지한다.
또한, 미엘로퍼옥시다제는 호중구 과립의 주요 과산화 효소이며, 낭포성 섬유증에서 염증성 폐 손상에 기여한다. 유리 미엘로퍼옥시다제는 낭포성 섬유증 폐액에 존재하며, 차아염소산을 생성한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 낭포 성 섬유증, COPD, 패혈증-유도성 손상, 인플루엔자바이러스-유도성 손상, 석면-유도성 손상 및 급성 폐 염증을 포함하는 다양한 폐 염증 병태에 적용할 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 다른 염증성 질환은 류마티스성 관절염 및 피부 염증을 포함한다. MPO의 발현, 수준 및 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에 MPO의 발현, 수준 및 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 제공함에 있어서, 본 발명은 MPO의 저하 또는 감소된 발현 및/또는 활성과 관련된 장애, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 다른 인자와 연관되지만 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 개선되거나 영향을 받을 수 있는 장애 또는 병태를 치료하는 제공을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 병태 또는 장애는 MPO와 간접적으로 연관된 것으로 본 명세서에서 언급될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 MPO 수준을 조절하고 상승시킴으로써, 본 명세서는 예를 들어, ROS-결핍 및/또는 MPO-결핍과 관련된 병태를 치료하는 방법을 더 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적용할 수 있 MPO-관련 병태는 저하되거나 결핍된 ROS 수준과 관련될 수 있다. 다른 인자, 예를 들어 ROS와 관련된 장애에 대한 비-제한적인 예는 활성 산소 종(ROS)-생성 식세포 NADPH 산화효소 NOX2의 유전적 결핍으로 정의되는 만성 육아종성 질환(GCD) 일 수 있다. 이러한 경우, MPO의 수준을 높이면 ROS가 상승하여 ROS-관련 장애를 치료하는 도구를 제공할 수 있다.
따라서, 일부 특정 실시형태에서, 본 발명은 ROS 장애와 관련될 수 있는 만성 육아종성 질환(CGD)에 더 적용할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 MPO 결핍-관련 병태 또는 MPO 고갈에 의해 직접 또는 간접적으로 발생하는 임의의 병태를 치료하는데 적용할 수 있다.
본 발명은 대상체의 미분화 BM 세포에서 MPO 수준을 제거 또는 감소시킴으로써 MPO와 관련된 장애, 예를 들어 AD, MS, P-ANCA-관련 장애 및 PAH, 또는 본 발명에 의해 개시된 임의의 장애를 치료하기 위한 치료적 방법을 제공한다는 것을 이해하여야 한다. 위에 개시된 바와 같이, 본 발명은 특히 대상체의 미분화 BM 세포에서 MPO를 표적화하여 상기 대상체의 임의의 조직 및 기관에서 MPO 수준의 조작을 유도함으로써 대상체의 면역계를 조작하는 치료적 방법, 조성물, 키트 및 세포를 제공한다. 이러한 양태에 의해 입증된 바와 같이, 이러한 조절은 치료적 적용, 특히 AD, MS, P-ANCA-관련 장애 및 PAH와 같은 MPO-관련 병태를 치료하기 위해 본 발명에 의해 효과적으로 사용된다. 따라서, 일부 특정 및 비-제한적 실시형태에서, 본 발명은 대상체의 면역계, 특히 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내도록 대상체의 BM 세포를 조작함으로써 MPO-관련 병태, 예를 들어 AD, MS, P-ANCA-관련 장애 및 PAH를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다는 것을 이해하여야 한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 조작된 면역계(자가 또는 동종이계 또는 동계 공급원 중 하나)의 제공에 기초한다. 대안적으로, 대상체의 면역계는 상기 대상체의 BM 세포 집단이 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내도록 본 명세서에 제공된 유전자 편집 시스템을 사용하여(예를 들어, 유전자 편집 시스템의 화합물을 대상체에게 투여함) 생체내에서 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료적 방법, 키트 및 조성물은 이러한 병리학적 병태를 치료하기 위한 효과적인 치료적 전략을 제공한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 이러한 치료적 전략은 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 나타내는 BM 세포를 일부 실시형태에서 이식 전에 면역-절제를 받은 MPO-관련 병태, 예를 들어 MS 또는 AD를 앓고 있는 대상체에 이식함으로써 영향을 받을 수 있다. MPO의 조절된 (예를 들어, 저하 또는 제거된) 수준, 발현 또는 활성을 나타내는 BM 세포를 이식함으로써, 이식된 대상체는 임의의 조직 및 기관에서 조절된 MPO 발현을 나타낸다. 본 발명에 의해 상세히 설명된 바와 같이, 이식된 BM 세포는 동일한 대상체로부터 수득되고, MPO의 수준, 발현 또는 활성을 조작하기 위해 본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 생체외에서 조작된 자가 BM 세포일 수 있음을 이해하여야 한다. 예를 들어, 일부 특정 실시형태에서, 대상체로부터 수득된 BM 세포는 생체외에서 본 발명의 유전자 편집 시스템에 적용될 수 있다. 이는 MPO 수준, 발현 및/또는 활성의 제거 및 감소를 초래할 수 있다. 대안적으로, MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성을 (자연적으로 또는 본 발명의 유전자 편집 시스템을 적용함으로써) 나타내는 동종이계 또는 동계 공급원의 미분화 BM 세포가 사용될 수 있다. MPO가 결핍된 이러한 자가 또는 동종이계 BM 세포는 대상체에 재-도입될 수 있으며, 대상체는 일부 실시형태에서 면역-절제 화합물로 치료되고, 이에 따라 이러한 이식된 조작된 BM 세포가 적어도 부분적으로 대상체의 면역계를 대체할 수 있다. 이러한 절차는 대상체의 임의의 기관 또는 조직에서 MPO의 고갈을 초래한다. 위에 나타낸 바와 같이, MPO가 고갈된 BM 세포는 대상체로부터 또는 대안적으로, 동종 또는 동계 대상체로부터 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 자가 또는 동종이계 BM 세포를 대상체에 이식하는 것 또는 즉, 대상체의 면역계 세포를 MPO의 조절된 수준, 발현 및/또는 활성(예를 들어, 제거 또는 저하된 MPO 수준, 발현 및/또는 활성)을 나타내는 BM 세포로 대체하는 것은 상기 대상체의 모든 조직 및 기관에서 MPO의 수준, 발현 및 활성을 조절하여 임의의 MPO-관련 장애 또는 병태, 특히 AD, MS, P-ANCA-관련 장애 및 PAH, 또는 본 발명에 의해 개시된 임의의 장애 또는 병태의 치료를 위한 새롭고 창의적인 접근법을 제공한다.
위에 언급된 바와 같이, 본 발명은 상기 명시된 바와 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 치료량의 본 발명의 조성물, 특히 위에 논의된 CRISPR 시스템, 또는 질환과 관련된 원치않는 증상을 개선하고, 질환이 발생하기 전에 이러한 증상의 발현을 예방하고, 질환의 진행을 늦추고, 증상의 악화를 늦추고, 관해 기간의 시작을 향상시키고, 질환의 진행성 만성 단계에서 발생하는 돌이킬 수 없는 손상을 늦추고, 상기 진행 단계의 개시를 지연시키고, 질환의 중증도를 감소시키거나 질환을 치료하고, 생존률을 개선하거나 보다 빠르게 회복시키고, 또는 질환이 발생하는 것을 예방하거나 상기 중 둘 이상의 조합에 효과적인 MPO의 조절된 발현을 나타내는 BM 세포를 투여하는 것을 지칭한다. 치료는 면역-관련, 자가 면역, 신경퇴행성, 호흡기, 염증성 또는 증식성 병태가 초기에 발생할 때 수행될 수 있거나, 또는 위에 열거된 치료 효과를 달성하기 위해 예를 들어, 1일 1회 이상, 1일 내지 7일마다, 7일 내지 15일마다, 15일 내지 30일마다, 1개월 내지 2개월마다, 2개월 내지 6개월마다 또는 그 이상 투여함으로써 연속 투여될 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 심지어 질환의 임의의 증상이 나타나기 전에, 대상체에서의 MPO의 발현 및/또는 활성에 기초하여, MPO 관련 장애를 예방하기 위한 예방적 도구를 더 제공한다. 용어 "예방"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 예방하고자 하는 생물학적 또는 의학적 이벤트의 발생 위험, 특히 면역-관련, 자가 면역, 신경퇴행성, 염증성 또는 증식성 병태와 관련된 장애의 발생 또는 재발의 예방 또는 감소를 지칭하며, 용어 "예방적 유효량"은 투여되는 활성 성분의 양이 이러한 목표를 달성할 것임을 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 예방, 즉, 본 명세서에서 논의된 임의의 면역-관련, 자가 면역, 신경퇴행성, 염증성 또는 증식성 장애와 관련된 병태의 예방에 특히 효과적이다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 치료되거나 조성물이 투여된 대상체는 과거에 이미 질환을 경험한 대상체에게서 재발할 가능성이 적은 상기 신경퇴행성, 혈관 및/또는 염증성 질환과 관련된 증상을 경험할 가능성이 적다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "개선"은 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 의해 야기된 증상의 감소 및 대상체 병태의 개선에 관한 것이되, 상기 개선은 본 명세서에 기재된 면역 관련, 자가면역, 신경퇴행성, 염증성 또는 증식성 장애와 관련된 병리적 과정의 저해, 그 심각성(magnitude)의 현저한 감소, 또는 병든 대상체의 생리학적 상태의 개선의 형태로 나타날 수 있다.
용어 "저해하다" 및 이 용어의 모든 변형은 병리학적 증상의 진행 및 악화 또는 병리학적 과정 진행의 제한 또는 금지를 포함하는 것으로 의도되며, 상기 병리학적 과정 증상 또는 과정은 관련된다.
용어 "제거하다"는 선택적으로 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 따라 병리학적 증상 및 아마도 병리학적 병인의 실질적인 근절 또는 제거와 관련된다.
용어 "지연" 또는 "발병을 지연하는" 및 이들의 모든 변형은 면역-관련, 자가 면역, 신경퇴행성, 염증성 또는 증식성 장애와 관련된 장애의 진행 및/또는 악화를 늦추고, 이들의 증상이 본 발명에 따른 치료가 없을 때보다 늦게 나타나도록 진행, 추가로 악화 또는 발생을 늦추는 것을 포함하도록 의도된다.
위에서 언급된 바와 같이, 치료 또는 예방은 질환 발병의 예방 또는 연기, 증상의 발병의 예방 또는 연기 및/또는 발생할 또는 발생할 것으로 예상되는 이러한 증상의 중증도의 감소를 포함한다. 이는 기존 증상의 개선, 추가적인 증상의 예방 및 증상의 근본적인 대사적 원인의 개선 또는 예방을 더 포함한다. 본 명세서에 언급된 용어 "저해", "절제(moderation)", "감소" 또는 "약화"는 과정, 특히 면역-관련, 자가면역, 신경퇴행성, 염증성 또는 증식성 장애 중 임의의 과정 중 어느 하나를 약 1% 내지 99.9%, 특히, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85% 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 약 95% 내지 99%, 또는 약 99% 내지 99.9%, 100% 이상 지체(retardation), 제지(restraining) 또는 감소시키는 것과 관련이 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 본 발명을 필요로 하는 대상체 또는 환자의 치료에 관한 것이다. "환자"또는 "필요로 하는 대상체"는 위에 언급된 병태에 의해 영향을 받을 수 있고, 본 명세서에 기재된 예방 및 예방적 조성물 및 방법이 바람직한 임의의 유기체를 의미한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물(들), 키트(들) 및 방법(들)은 포유 동물의 병리학적 병태를 예방하기 위한 것이다. "포유동물 대상체"는 인간, 개와 고양이 대상체, 소, 유인원, 말 및 뮤린 대상체 및 설치류와 같은 가축 및 비가축 포유동물을 포함하는 제안된 요법이 바람직한 임의의 포유동물을 의미한다. 특히 비인간 대상체의 경우, 본 발명의 방법은 주사, 음용수, 사료, 분무, 경구 세척을 통한 투여를 사용하여 이를 필요로 하는 대상체의 소화관으로 직접 투여할 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
임의의 전신 또는 국소 투여 모드가 본 발명에 적용될 수 있음을 이해하여야 한다. MPO를 표적으로 하는 본 발명의 CRISPR 시스템 또는 이의 임의의 조성물 또는 본 발명의 BM 세포 집단 또는 이의 임의의 조성물의 투여 경로는 직접 BM 주사 또는 이식, 뇌내, 심실내, 뇌실내, 척수강내, 흉골내, 척추내 및/또는 두개내 또는 척추내 바늘 및/또는 펌프 장치가 있거나 없는 카테터를 통한 전달에 의한 척추-주위 투여 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서 임의의 추가의 투여 모드, 예를 들어 복강내(IP), 정맥내(IV) 및 피내, 피하, 비강, 폐, 경구 및 근육내 투여를 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.
추가 양태에서, 본 발명은 유전자 편집 화합물, 특히 본 발명에 의해 제공되는 적어도 MPO 표적화 CRISPR 시스템을 유리 형태로 포함하며, 치료할 대상체에게 직접 투여되는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 BM 세포 집단 및 특히 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 모두 갖는 HSC와 같은 조절된 MPO 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: (a) 본 발명의 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는/이에 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 본 발명의 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체(들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있음에 유의하여야 한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 다른 양태에 따라 위의 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 적어도 하나의 유전자 편집 화합물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 PEN 또는 상기 PEN을 암호화하는 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 적어도 하나의 PEN을 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클, 또는 이러한 PEN을 암호화하는 임의의 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 CRISPR/cas 시스템을 포함하는 적어도 하나의 PEN일 수 있는 유전자 편집 화합물을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물 내에 포함된 CRISPR/cas 시스템은 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질, 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및 (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열. 본 발명의 조성물은 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클을 포함할 수 있음을 이해하여야 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2의 CRISPR-연관 시스템 중 적어도 하나의 구성원일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 포함된 Cas 단백질은 클래스 1 및 클래스 2의 CRISPR 연관 시스템 중 적어도 하나, 특히 유형 II, 유형 I, 유형 III, 유형 IV, 유형 V 및 유형 VI 중 어느 하나의 구성원일 수 있다. 보다 구체적인 실시형태에서, 이러한 cas 단백질은 클래스 2의 CRISPR-연관 시스템 유형 II의 구성원일 수 있다. 또한, 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 Cas 단백질로서, Cas9 또는 임의의 단편, 이의 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템을 포함할 수 있다. 이 시스템은 일부 실시형태에서 2개의 요소, 적어도 하나의 gRNA 및 적어도 하나의 Cas9 또는 이의 임의의 돌연변이체, 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 두 요소 모두 gRNA 및 폴리펩타이드(cas9)로서 또는 이러한 요소를 암호화하는 핵산 서열로서 제공될 수 있음을 이해하여야 한다. 일부 실시형태에서, gRNA를 암호화하는 핵산 서열은 단독으로 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 또한 포함하는 핵산 분자, 특히 단일 핵산 분자 또는 벡터로 제공될 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체(들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 gRNA 또는 crRNA는 인간 MPO 유전자의 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46뿐만 아니라 서열번호 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 및 106으로 표시되는 핵산 서열 또는 이들의 임의의 단편을 포함하는 프로토스페이서를 표적화할 수 있다. 또 다른 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 유용한 crRNA(gRNA)는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 42, 47뿐만 아니라 서열번호 50, 55, 60, 63, 66, 71, 74, 77, 80, 85, 88 및 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 일부 추가의 실시형태에서, 마우스 MPO 유전자에서 프로토스페이서를 표적으로 하는 gRNA가 사용되었으며, 이러한 gRNA는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14 중 어느 하나로 표시된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 위에 언급된 바와 같이, 일부 대안적인 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 BM 세포 집단, 특히 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 위에 논의된 유전자 편집 화합물과 세포 집단 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 키트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체(들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들) 중 적어도 하나를 더 포함한다.
위의 본 명세서에 기재된 바와 같이, 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단은 단리된 HSC 및/또는 전구 세포를 포함할 수 있다. 추가로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 미분화 BM 세포는 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포 집단은 자가 공급원 또는 동종 공급원 중 하나일 수 있음을 이해하여야 한다. 동계 공급원의 세포의 사용도 또한 본 발명에 포함된다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 조성물 내에 포함되는 미분화 BM 세포 집단은 MPO의 저해 또는 제거된 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 대상체의 BM 세포 집단일 수 있다. 본 발명의 임의의 다른 양태와 관련하여 이전에 본 명세서에 개시된 임의의 세포는 또한 본 양태와 관련하여 적용 가능하다는 것을 이해하여야 한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 포유동물 대상체에서 MPO 관련 병태 또는 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위해 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 면역-관련 장애, 신경퇴행성 장애, 증식성 장애, 호흡기 장애, 혈관 장애 또는 임의의 이들의 조합 중 적어도 하나일 수 있는 MPO-관련 병태를 치료하는데 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 이러한 면역-관련 장애는 자가면역 장애 및 염증성 장애 중 적어도 하나일 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명은 MS, ANCA-관련 병태, 특히 AAV, AAGN, NCGN 및 RPGN 및 SLE 중 어느 하나와 같은 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 추가의 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 신경퇴행성 장애, 일부 특정 실시형태에서 AD 또는 PD와 같은 신경퇴행성 장애에 적용할 수 있다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 증식성 장애, 특히 암을 치료하는데 적용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 염증성 질환, 특히 죽상동맥경화증, RA 및 IBD 중 어느 하나의 치료를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 또 다른 일부 실시형태에서, 본 발명은 호흡기 질환의 치료, 특히 PAH의 치료를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 MPO의 발현 및/또는 활성의 증가를 유도하는 약제학적 조성물의 제공을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, 본 명세서에서 앞서 구체적으로 논의된 바와 같은 H2O2 수준의 상승을 포함하는 MPO-결핍과 관련된 장애를 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 더 제공한다. 본 발명의 다른 양태 또는 이와 관련된 임의의 단계, 증상과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 임의의 장애 또는 병태는 또한 이러한 양태, 특히 본 발명의 조성물과 관련하여 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여 전에 약제학적으로 허용 가능한 담체에 혼합될 수 있다. 치료적 제형은 임의의 종래의 투여 제형으로 투여될 수 있다. 제형은 전형적으로 다른 성분과 상용성이면서 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 하나 이상의 약제학적 및 생리학적으로 허용 가능한 담체와 함께 위에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 활성 성분을 포함한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 주사에 적합할 수 있다. 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사능(syringability)이 나타나는 정도로 유동성이어야 한다. 마이셀 제형, 리포솜 및 나노 입자, 예를 들어 금 나노 입자를 사용하는 나노 스케일 약물 전달 시스템은 합리적인 약물 전달을 위한 새로운 기술이며, 이는 개선된 약동학적 특성, 약물의 제어되고 지속적인 방출, 그리고 더 중요하게는 낮은 전신 독성을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 나노 입자 기반 전달은 본 발명의 CRISPR 시스템의 전달을 위해 사용될 수 있다. 특히 바람직한 해결책은 캡슐화된 화합물의 외부 촉발 방출을 허용한다. 마이셀, 리포솜 또는 고분자 전해질 다층 캡슐과 같은 약물 전달 비히클이 나노 입자(NP) 액추에이터를 포함하면 외부 제어 방출이 달성될 수 있다. 보다 구체적으로, 제어 약물 전달 시스템(drug delivery system: DDS)은 전통적인 약물 형태와 비교하여 몇 가지 장점이 있다.
따라서, 본 발명은 약물 전달 시스템에서 담체로서 마이셀 제형, 리포솜, 중합체, 덴드리머, 금속, 특히 금, 실리콘 또는 탄소 재료, 중합체 나노 입자 및 자성 나노 입자를 포함하는 다양한 나노구조의 사용을 더 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 용어 "나노구조" 또는 "나노입자"는 직경이 약 100㎚보다 작은 임의의 미세한 입자를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 다른 실시형태에서, 담체는 조직화된 지질의 집합체이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 완충제, 이의 삼투압을 조절하는 작용제, 및 선택적으로 당업계에 공지된 것과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제 등을 포함한다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료적 조성물에서 이들의 사용이 상정된다. 약제학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 매질 또는 작용제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료적 조성물에서 이들의 사용이 상정된다. 경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 현탁액, 또는 물 또는 비-수성 매질 중 용액, 캡슐, 사쉐 또는 정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 특히 생체내 적용이 개시될 때(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템 또는 이를 암호화하는 임의의 핵산 서열의 투여), 다양한 투여 모드를 적용할 수 있으며, 따라서 본 발명의 조성물은 본 발명에 의해 개시된 임의의 투여 모드, 특히 복강내(IP), 정맥내(IV), 비경구 및 피내, 피하, 국소, 비강, 폐, 경구, 골수내, 근육내, 설하, 협측, 직장, 질 투여에 적합화될 수 있다. 또 다른 일부 추가 실시형태에서, 특히 호흡기 질환에 대해, 폐 투여가 바람직한 투여 모드로 간주된다. 호흡기 질환의 치료와 관련하여 용어 "투여"는 경구 흡입, 예컨대 액체 분무기, 에어로졸-기반 정량 흡입기(metered dose inhaler: MDI) 또는 건조 분말 분산 장치에 의한 또는 복강내 주사에 의한 폐 전달이 바람직하다. 대안적으로, 투여는 설하, 협측, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 골수내 또는 경피 중 어느 하나일 수 있다.
추가로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 제공한다: (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하도록 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단. 일부 실시형태에서, 미분화 BM 세포 집단은 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단이다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 CRISPR/cas 시스템을 포함하는 적어도 하나의 PEN이며, 상기 CRISPR/cas 시스템은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질, 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및 (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열; 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
이의 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO 관련 병태 또는 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연하기 위한 조성물의 제조에서, 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 치료적 유효량의 적어도 하나의 유전자 편집 화합물의 용도를 제공한다.
이의 또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO 관련 병태 또는 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연하기 위한 조성물의 제조에서, 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 치료적 유효량의 미분화 BM 세포 집단의 용도를 제공한다.
또 다른 추가 양태에서, 본 발명은 (a) 치료 키트를 필요로 하는 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및 (b) 조절된 MPO의 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단 중 적어도 하나를 포함하는 치료 키트를 제공한다.
추가로, 일부 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 적어도 하나의 미분화 BM 세포에 관한 것이다.
일부 특정 실시형태에서, 세포는 MPO-관련 병태를 앓고 있는 대상체일 수 있다. 일부 추가의 대안적인 장애에서, 세포는 동종이계 또는 동계 대상체일 수 있다. 본 발명에 의해 개시된 임의의 세포 및 임의의 유전자 편집 화합물은 또한 이러한 양태에 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.
또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 임의의 세포를 제공한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 임의의 세포를 제공한다.
본 발명에 의해 개시된 임의의 MPO-장애는 본 양태에서도 적용할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 임의의 양태와 관련하여 본 발명에 의해 개시된 모든 세포, 유전자-편집 시스템은 또한 본 발명에 의해 개시된 임의의 다른 양태에도 적용할 수 있음을 이해하여야 한다.
위에 나타낸 바와 같이, MPO는 네토시스에 관여하므로, MPO의 수준, 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 본 발명은 네토시스를 조절하기 위한 접근법을 더 제공한다. 따라서, 또 다른 일부 양태에서, 본 발명은 특히 대상체에서 네토시스를 조절하는 방법을 제공한다. 또한, MPO 발현 및/또는 활성을 저해하는 방법을 제공함으로써, 본 발명은 일부 실시형태에서 특히, MPO 발현 및/또는 활성의 저해가 필요한 대상체에서 네토시스를 저해, 제거 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 더 제공한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 임의의 네토시스 관련 장애 및 병태를 치료 및 예방하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다는 것을 이해하여야 한다. 자극시, 호중구는 NADPH 산화효소를 빠르게 활성화하여 과산화수소(H2O2)로 변하는 반응성이 높은 분자인 수퍼옥사이드를 생성한다. H2O2는 MPO에 의해 소비되어 하이포아염소산(HOCl) 및 기타 산화제를 생성한다. MPO가 완전히 결핍된 공여체에서 볼 수 있듯이, MPO는 NET 형성에도 필요하지만 그 역할은 불분명하다. ROS는 세포독성이지만, 특정 아미노산 잔기의 산화를 통해 단백질 기능을 조절하는 중요한 신호전달 매개체이기도 하다. 그러나 ROS는 반응성이 매우 높고 수명이 짧은 분자이기 때문에, 특정 세포 반응을 어떻게 생성할 수 있는지 불분명하다. 특히, NET 형성 중에, ROS가 과립에서 핵으로 NE의 선택적 전좌를 조절하는지 여부와 그 방법은 알려지지 않다. 또한, NET 형성 중에 핵이 탈응축되기 시작함에 따라 호중구 화학 주성이 알려지지 않은 메커니즘을 통해 저지된다. 따라서, 이의 또 다른 양태에서, 본 발명은 호중구 세포의 특성 및 기능을 조절하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 정수 값 및 적용 가능한 경우, 연속 범위를 구성하는 정수가 아닌 값 또한 포함하는 편차 범위에 대해 언급된 값보다 최대 1%, 보다 구체적으로 5%, 보다 구체적으로 10%, 보다 구체적으로 15% 벗어난, 그리고 일부 경우에는 최대 20% 더 높거나 낮을 수 있는 값을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 ±10%를 지칭한다.
용어 "포함하다(comprise)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 이들의 활용어는 "포함하지만 이들로 제한되지 않음"을 의미한다. 이들 용어는 "로 구성되는(consisting of)" 및 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"을 포함한다. 문구 "본질적으로 구성되는"은 조성물 또는 방법이 추가적인 성분 및/또는 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있다는 것을 의미한다(그러나 오직 추가적인 성분 및/또는 단계가 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특징을 실질적으로 변경하지 않는 경우). 본 명세서 및 다음의 실시예 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지는 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용되는 단수는 반대로 명확히 표시되지 않는다면, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확히 기술하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의하여야 한다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용되는 문구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소들, 즉, 일부 경우에서는 결합하여 존재하며 다른 경우에서는 분리하여 존재하는 요소들 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 열거된 여러 요소는 동일한 방식, 즉, 이렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 이들 요소들에 관련되는지 또는 관련되지 않는지에 관계없이, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 실시형태에서, A만(선택적으로 B 이외의 요소를 포함함)을 지칭할 수 있고; 다른 실시형태에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소를 포함함)을 지칭할 수 있고; 또 다른 실시형태에서, A 및 B 둘 다(선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용되는 바와 같이, "또는"은 위에 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 리스트에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적, 즉, 요소들 중 적어도 하나를 포함하지만 다수의 요소들 또는 이들의 리스트 중 하나 이상, 그리고 선택적으로 추가적인 열거되지 않은 항목들을 포함하는 것으로 해석될 것이다. "중 단지 하나" 또는 "중 정확하게 하나", 또는 청구항에서 사용될 때 "로 구성되는"과 같이 반대로 명확하게 표시된 용어만이 다수의 요소들 또는 이들의 리스트 중 정확하게 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "중 하나", "중 하나만" 또는 "중 정확하게 하나"와 같은 배타적 용어가 선행될 때 배타적 대안(즉, "하나 또는 둘 다가 아닌")을 나타내는 것으로 해석되어야 하며, 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 구성되는"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서에서 그리고 청구항에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소들의 리스트와 관련하여 문구 "적어도 하나"는 요소들의 리스트에서 요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 반드시 요소들의 리스트 내에 구체적으로 열거된 모든 각각의 요소 중 적어도 하나를 포함하는 것은 아니며 요소들의 리스트에서 요소들의 임의의 조합들을 제외하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 구체적으로 확인된 이들 요소들에 관련되는지 또는 관련되지 않는지에 관계없이, 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소들의 리스트 내에서 구체적으로 확인된 요소들이 아닌 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비-제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동일하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동일하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시형태에서, 선택적으로 하나 이상의 A를 포함하고 B는 존재하지 않음(그리고 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 다른 실시형태에서, 적어도 하나, 선택적으로 하나 이상의 B를 포함하고 A는 존재하지 않음(그리고 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의, 선택적으로 하나 이상의 A를 포함하고, 그리고 적어도 하나의, 선택적으로 하나 이상의 B를 포함함 (그리고 임의로 다른 요소들을 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 인용된 순서로 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
위의 본 명세서에 묘사되고 아래의 청구범위 부문에 청구되는 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태는 다음 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
개시되고 기재된 바와 같이, 이러한 방법 단계 및 조성물은 다소 다를 수 있기 때문에, 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 실시예, 방법 단계 및 조성물에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 균등물에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
다음의 실시예는 본 발명의 양태를 수행하는데 본 발명자들에 의해 사용된 대표적인 기법이다. 이러한 기법은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 실시형태의 예시이지만, 당업자는 본 개시내용에 비추어볼 때 본 발명의 정신 및 의도된 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
시약
MOG35-55(블라바트닉 센터(Blavatnik center), 텔 아비브 유니버시티)
IFA(시그마(Sigma))
결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(MTB, H37Ra, 디프코(Difco))
백일해 독소(PT, 시그마)
케타민(브레머(Bremer)).
자일라진(피브로(Phibro)).
소듐 아자이드(시그마, 미국).
에반스 블루 염료(시그마).
리포펙타민 2000(인비트로젠(Invitrogen))
제한 효소
BsmBI(NEB).
T4 DNA 리가제(NEB)
플라스미드
pL-CRISPR.EFS.GFP(애드진(Addgene), 카탈로그 번호 # 57818).
키트
자성 세포 단리 키트(밀텐이 바이오테크(Miltenyi Biotech)).
DNeasy(퀴아젠(Qiagen)).
ViraPower 프로모터가 없는 렌티바이러스 게이트웨이 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재).
렌티-X p24 신속 역가 키트(클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재).
항체
마우스 항 미엘로퍼옥시다제(압캠(abcam)); 토끼 항 호중구 엘라스타제(압캠); 토끼 항 Iba1(압캠); 래트 항 GFAP(인비트로젠); 래트 항 CD3(알앤디 시스템즈(R&D Systems)); 마우스 항 TAU(압캠); 마우스 항 아밀로이드 베타(코반스(Covance)); 마우스 항 희소돌기아교세포(머크(Merck)).
세포
컴피턴트 대장균 세포(JM109, 프로메가(Promega)), 293T 세포(ATCC, CRL-3216™).
배지 및 보충물
Stemspam SFEM 배지(스템 셀 테크놀로지스(Stem cell technologies)), TPO, SCF(페프로테크(Peprotech)).
동물
C57BL/6(아를란(Arlan));
MpoTm1/Lus(4265, 잭슨 랩스(Jackson labs)), 이 돌연변이체 마우스는 미엘로퍼옥시다제 결핍으로 인해 손상된 살균 활성을 나타낸다. 고지혈증 조건하에서, 돌연변이체 마우스는 대조군 마우스보다 더 큰 죽상경화성 병변이 발생한다. 이 마우스는 병원체에 대한 전신 염증 방어를 연구하는데 유용하다.
5xFAD 마우스(34840, 잭슨 랩스).
실험적 절차
동물의 주거
C57BL/6, MpoTm1/Lus 및 5xFAD 마우스를 빛이 제어된 환경(12시간의 명/암 주기)에 두고, 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 개별 환기 케이지(individually ventilated cage: IVC)를 제공하였다. 모든 동물 연구는 텔 아비브 대학의 동물 관리, 사용 및 검토 위원회의 승인을 받았다(부록 B - 승인 번호 01-17-069 및 01-18-010).
마우스 방사선 조사 및 세포 이식
수여체 마우스에 감마 조사원(Biobeam GM)으로부터 9㏉(3㏉/분)의 전신 치사 방사선 조사를 하였다. 방사선 조사 24시간 후, 2×106의 새로 단리된 골수 세포 또는 5000개의 렌티바이러스가 형질도입된 HSC를 27 게이지 바늘을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 수여체 마우스에 정맥 주사하였다. 마우스를 모니터링하고, 다음 8주 동안 격일로 체중을 측정하였다.
혈액 샘플 MPO 분석
MPO 넉다운의 검증을 위해, 이식 8주 후 안면 정맥에서 200㎕의 혈액을 채취하였다. ADVIA2120i(지멘스(Siemens)) 혈액학 시스템을 사용하여 혈액 샘플을 퍼옥시다제 활성에 대해 분석하였다.
골수 단리 및 HSC 농축
C57BL/6(아를란) 또는 MpoTm1/Lus(잭슨 랩스) 공여체 마우스를 희생시키고, 27-게이지 바늘을 사용하여 대퇴골, 경골 및 상완골 뼈에서 골수를 채취하였다. 적혈구를 용해하고, 세포를 즉시 이식하거나 자성 세포 단리 키트(밀텐이 바이오테크)를 사용하여 계대-세포를 농축하였다. 세포를 50 ng/㎖의 TPO와 100 ng/㎖의 SCF(페프로테크)가 보충된 Stemspam SFEM 배지(스템 셀 테크놀로지스)에서 배양하였다.
EAE 모델 유도
14 내지 16 주령의 C57BL/6 마우스를 4 ㎎/㎖의 결핵균(MTB, H37Ra, 디프코)이 보충된 IFA(시그마)에 유화된 300㎍의 MOG35-55(서열번호 7로 표시되는 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK, 블라바트닉 센터, 텔 아비브 유니버시티)로 세 군데의 주사 부위에 피하로 면역화하였다. 면역화 후 제0일 및 제2일에, 200㎕의 인산염 완충 식염수(PBS) 중 300ng의 백일해 독소(PT, 시그마)를 복강내로 투여하였다. 질환의 중증도를 매일 모니터링하고, 다음 척도에 따라 EAE 임상 질환 점수를 매겼다: 0, 마비 없음; 0.5, 꼬리 긴장성의 부분적 손실; 1, 꼬리 긴장성의 완전한 상실; 2, 뒷다리 쇠약 및 부분 뒷다리 마비; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 뒷다리 마비 및 앞다리 쇠약 또는 부분 앞다리 마비; 5, 빈사(moribund) 상태; 6, 죽음.
행동 검사
행동 검사는 생후 7개월부터 시행하였다. 시험 시작 2주 전에 마우스를 역광 환경에 적응시켰다. 각 시험 전에 마우스를 시험 습관화의 시작 30분 전에 행동 시험실로 옮겼다. 시험 순서는 4가지 처리와 유전자형에서 균형을 이루었다. 시험 사이에 Virusolve+로 미로를 세척하였다. 개방 공간, 고가식 십자미로, Y 미로 및 모리스 물 미로 테스트를 자동화된 추적 시스템(Ethovision, 놀더스(Noldus))에 의해 기록, 관찰 및 분석하였다.
위험 평가/불안-관련 행동을 평가하기 위해 개방 공간을 수행하였다. 테스트는 흰색의 방풍 빈 경기장(50×50×40㎝)에서 수행하였다. 마우스를 경기장 중앙에 놓고 15분 동안 탐색할 수 있게 하였다. 총 이동 거리와 미로의 중심과 미로의 모서리에서 보낸 시간을 측정하였다.
위험 평가/불안-관련 행동을 평가하기 위해 고가식 십자미로를 수행하였다. 테스트는 4개의 십자 모양의 흰색 방풍 통로(35×5㎝)로 구성되고, 바닥에서 40㎝를 들어 올린 장치에서 수행하였다. 서로 마주보고 있는 두 개의 통로는 15㎝의 벽으로 둘러싸여 있고, 두 개의 다른 통로는 개방되어 있었다. 마우스를 폐쇄된 통로를 향한 미로의 중앙에 놓고 7분 동안 기록하였다. 미로의 개방 또는 폐쇄된 통로에서 보낸 시간을 측정하였다. 개방된 통로에서 떨어진 마우스는 분석에서 제외하였다.
Y-미로: 공간 기억을 평가하기 위해 2회-시험 Y- 미로를 수행하였다. 테스트는 통로 길이 38㎝, 너비 5㎝, 높이 15㎝의 흰색 방풍 Y 형 기구에서 수행하였다. 테스트는 샘플 시험과 테스트 시험으로 구성하였다. 샘플 시험에서는 벽을 향한 미로의 한쪽 통로 끝에 마우스를 놓고 미로의 한쪽 통로를 막고 5분 동안 미로의 두 통로를 탐색할 수 있게 하였다. 샘플 시험 후 5분의 시험간 간격을 두었다. 테스트 시험에서 마우스는 모든 통로를 열고 5분 더 미로로 돌아갔다. 새로운 통로 진입(새로운 통로 진입/총 통로 진입의 수) 및 새로운 통로 탐색 시간(새로운 시간 탐색 시간/총 통로 탐색 시간)을 테스트 시험의 첫 1분 동안 측정하였다.
공간 학습을 평가하기 위해 모리스 물 미로를 수행하였다. 테스트는 탈지유로 불투명하게 만든 물로 채워진 수영장(직경 150㎝, 깊이 30㎝)에서 수행하였다. 수영장 벽에는 검은색 직사각형, 삼각형 및 원형 큐를 배치하였다. 수온은 27±1℃였다. 투명한 플랫폼(12㎝×12㎝)을 수영장의 한 사분면 중앙, 수면 아래 약 2㎝에 배치하였다. 각 마우스에 대해 플랫폼을 포함하지 않는 3개 사분면의 다른 사분면에서 매일 시작하여 연속 5일 동안 하루에 4번의 시도를 수행하였다. 각 시험에서 마우스를 물에 넣고, 60초 동안 숨겨진 플랫폼을 찾을 수 있게 하였다. 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면, 플랫폼으로 안내하여 10초 동안 머물 수 있게 하였다. 60초 이내에 숨겨진 플랫폼을 찾기 위한 대기 시간과 총 거리를 각 마우스에 대해 기록하였다. 플랫폼을 찾지 못한 마우스는 60초 내에 플랫폼에 도달한 것으로 점수를 매겼다.
연상 기억을 평가하기 위해 공포 조절 테스트를 수행하였다. 테스트는 공포 조절 챔버(유고 바실(Ugo Basile), 17×17×25㎝)에서 수행하였다. 제1일에, 마우스를 습관화를 위해 5분 동안 챔버에 두었다. 제2일에, 마우스를 3.5분 동안 다시 챔버에 두었다. 2분 후 마우스에 1분 간격으로 두 번의 발 충격(0.8mA, 2초)을 주었다. 제3일에, 마우스를 3분 동안 챔버에 두었다. 동결 행동(호흡을 제외한 모든 움직임의 부재)에 의해 공포 조절을 평가하였다.
조직학
마우스에 케타민/자일라진(각각 100 ㎎/㎏ 및 10 ㎎/㎏)의 혼합물을 복강내로 주사하였다. 그런 다음, 전기 펌프를 사용하여, 마우스의 심장 내로 PBS에 이어 얼음 냉각된 4% PBS 중 파라폼알데하이드(PFA)로 관류하였다. 뇌를 제거하고, 24시간 동안 4℃에서 4% PFA에 고정한 후, 30% 수크로스에 냉동보존하였다. 그 후, 뇌를 면역조직화학 처리할 때까지 4℃에서 0.02% 소듐 아자이드(시그마, USA)가 포함된 PBS에 보관하였다. 수크로스 처리된 뇌를 건조시킨 다음, 액체 질소 중 2-메틸뷰탄에 급속 냉동시켰다. 뇌를 크라이오스탯을 사용하여 절단(10㎛)하고, 분석을 위해 슬라이드 위에 바로 고정시켰다. 10% 정상 염소 혈청, 1% 소 혈청 알부민 및 0.5% 트라이톤-100이 보충된 PBS로 1시간 동안 절편을 차단하고 투과화시키고, 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션한 다음 2차 항체와 함께 1시간 인큐베이션하였다.
면역염색
뇌를 액체 질소로 냉각된 2-메틸뷰탄에 급속 냉동시키고, 절단하기 전에 OCT에 포매시켰다. 냉동 슬라이딩 마이크로톰(레이카(Leica) CM1850)을 사용하여 관상 절편(Coronal section)(10㎛)으로 절단하고, 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
S100β 면역염색을 위해, 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고, 1% 소 혈청 알부민, 5% 염소 혈청(바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries), 이스라엘) 및 0.05% 트라이톤-X(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))이 보총된 PBS로 1시간 동안 차단하고 투과화시키고, S100β 항체(1:500, ab66028, 압캠)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.　슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 2차 염소 항 마우스 항체(1/700, 알렉사-플루오르(Alexa-Flour))와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA를 DAPI(1:1000, 시그마-알드리치)로 염색하였다. 티오플라빈 S(ThioS) 염색을 위해, 슬라이드를 50% 에탄올 중 0.01% ThioS 용액과 함께 8분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 슬라이스를 80% 에탄올로 10초 동안 2회 간단히 인큐베이션하고, 재증류수(double distilled water: DDW)로 2회 세척하였다.
공초점 이미징
공초점 현미경 LSM710(칼 자이스 마이크로 이미징(Carl Zeiss Micro Imaging))을 사용하여 형광 이미지를 얻었다. 10× 및 20× 대물 렌즈를 사용하여 공초점 이미지를 캡처하였다((NA=0.3, 각각 0.8, 플랜-아포크로맷(Plan-Apochromat)). EGFP 및 CY3에 대해 각각 Ar 488㎚ 및 543㎚ 레이저 라인에서 발생하는 형광 방출을 제조업체에서 제공한 필터 세트를 사용하여 검출하였다. DAPI 검출을 위해, 720㎚ 파장에서 모드락(mode-locked) Ti:사파이어, 펨토초 펄스, 다광자 레이저(Chameleon Ultra II, 코히런트 인코포레이션(Coherent, Inc.))를 사용하였다. 자이스 ZEN 2011 소프트웨어(칼 자이스 인코포레이션(Carl Zeiss, Inc.))를 사용하여 이미지를 생성하였다. 모든 이미지를 TIF로 받고, ImageJ를 사용하여 대비 및 밝기를 최적화시켰다. S100β 평균 강도 평균 강도 및 ThioS 플라크 밀도를 ImageJ를 사용하여 분석하였다.
RNA 및 단백질 분석을 위한 조직 수집
RNA 및 단백질 분석을 위해, 마우스를 케타민/자일라진으로 마취시키고, 즉시 PBS로 관류시켰다. 뇌를 제거하고, 해마를 해부하여 왼쪽 및 오른쪽 반구로 나누어 액체 질소에 급속 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 골수 RNA 분석을 위해, 대퇴골을 채취하고, 27G 바늘로 플러싱하여 골수를 PBS에 추출하였다. 골수 세포를 Tri-시약(시그마)에 동결시키고, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
단백질 추출 및 웨스턴 블롯
해마를 해동하고, 프로테아제 저해제(로슈(Roche))가 보충된 용해 완충액(200mM HEPES, 5mM　EDTA, 1% Nonidet P-40, 0.5%　소듐 데옥시콜레이트, 1mM Na2VO4, 150mM NaCl 및 50mM NaF)으로 균질화시켰다. 세포를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 2분 동안 14,000　Хg에서 원심분리하여 단백질을 제거하였다. Pierce™ BCA 단백질 검정 키트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 각 샘플로부터의 25㎍의 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하였다. 나이트로셀룰로스 전달 막을 0.1% Tween 20과 5% 소 혈청 알부민을 포함한 PBS로 1시간 동안 차단하고, 염소 항 APOE 항체(1:10,000, 케미콘(Chemicon))로 4℃에서 밤새, 염소 항 ACTIN 항체(1:5000, MAB1501, 밀리포어(Milipore))로 실온에서 1시간 프로빙하고, 이어서 염소 항 마우스 2차 항체(1:5,000, 리코르(Licor))와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 오디세이 시스템(리코르)과 이미지 스튜디오 라이트(Image Studio Lite) 5.2 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도의 시각화 및 분석을 수행하였다. 각 샘플에 대해, APOE 결과를 ACTIN으로 정규화하였다.
RNA 추출 및 실시간 PCR
RNeasy 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 해마의 RNA를 추출하였다. 골수 샘플로부터 RNA를 이전에 설명한 바와 같이 추출하고, RNeasy 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 제거하였다. verso cDNA 합성 키트(써모-사이언티픽)를 사용하여 RNA를 상보적 DNA(cDNA)로 역전사하였다. 사이버-그린 마스터 믹스(써모-사이언티픽) 및 맞춤 설계된 프라이머를 사용하여 스텝-원 실시간 PCR 시스템에서 반-정량적 PCR을 수행하였다. 역치 주기값을 3중으로 결정하고, 액틴과 비교하여 평균으로 나타내었다. 2-△△CT 방법을 사용하여 배수 변화를 계산하였다.
프라이머 세트 리스트(전부 마우스 유전자용)
APOE 정방향, 5'-GAGCTGATCTGTCACCTCCG-3' (서열번호 17) 및 역방향 5'-GACTTGTTTCGGAAGGAGC-3' (서열번호 18); CCL2 정방향, 5'-GGGATCATCTTGCTGGTGAA-3' (서열번호 19) 및 역방향 5'-AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3' (서열번호 20); CXCL10 정방향, 5'-AACTGCATCCATATCGATGAC-3' (서열번호 21) 및 역방향 5'-GTGGCAATGATCTCAACAC-3' (서열번호 22); IL1β 정방향, 5'-GGAGAACCAAGCAACGACAAAATA-3' (서열번호 23) 및 역방향 5'-TGGGGAACTCTGCAGACTCAAAC-3' (서열번호 24); MPO 정방향, 5'- TGGTGGCCTGCAGAGTATGA-3' (서열번호 25) 및 역방향 5'- GTTGAGGCCAGTGAAGAAGG-3' (서열번호 26); S100β 정방향, 5'-TTGCCCTCATTGATGTCTTCCA-3' (서열번호 27) 및 역방향 5'-TCTGCCTTGATTCTTACAGGTGAC-3' (서열번호 28); TNFα 정방향, 5'-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3' (서열번호 29) 및 역방향 5'-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3' (서열번호 30); VCAM1 정방향, 5'-GGAGCCTGTCAGTTTTGAGAATG-3' (서열번호 31) 및 역방향 5'-TTGGGGAAAGAGTAGATGTCCAC-3' (서열번호 32).
통계적 분석
모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. GraphPad Prism 7을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 행동 데이터와 골수 MPO mRNA 수준은 독립 표본 스튜던트 t-검정(unpaired student's t-test)을 사용하여 분석하였다. 기타 mRNA 분석, 블로 팅 정량화, S100β 강도 정량화 및 ThioS 플라크 밀도는 맨-휘트니 비모수 테스트(Mann-Whitney nonparametric test)를 사용하여 분석하였다. 모든 테스트의 경우, 통계적 유의성 역치는 p<0.05로 설정하였다.
BBB 투과성 검정
식염수(4 ㎖/kg 체중) 중 2% 에반스 블루 염료의 용액을 마우스에 복강내로 주사하였다. 주사 1시간 후, 마우스를 PBS로 관류하고, 뇌와 척수를 채취하여 균질화하였다. 균질액으로부터의 상청액을 610에서 흡광도를 측정하였으며, 에반스 블루 침투를 나타내었다.
MPO CRISPR/Cas9 플라스미드 클로닝
Azimuth 2.033 툴을 사용하여, 서열번호 5로 표시되는 마우스 MPO 표적화 가이드 RNA(gRNA) gRNA-3(CCCCAACGATCAGCTGACCA) 및 서열번호 6으로 표시되는 gRNA-4(CAGCGGGGTGTACGGCAGCG), 서열번호 8로 표시되는 gRNA2(GCACTCATGTTCATGCAGTG) 및 서열번호 9로 표시되는 gRNA6(TGCGATACTTGTCATTCGGT)을 설계하였다. pL-CRISPR.EFS.GFP 플라스미드(벤자민 에버트로부터 받음, 애드진 플라스미드 # 57818)를 BsmBI(NEB)로 절단하고, gRNA 서열을 T4 DNA 리가제(NEB)를 사용하여 결찰하였다. 결찰된 플라스미드를 컴피턴트 대장균 세포 (JM109, 프로메가)로 형질전환시키고, 암피실린을 사용하여 선별하고, 삽입체 결찰(insert ligation)을 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 검증하였다. 293T 세포로의 형질감염에 이어 DNA 추출(DNeasy, 퀴아젠) 및 생어 시퀀싱에 의해 MPO 표적화를 평가하였다.
레트로바이러스 입자 생산
결찰된 플라스미드를 ViraPower 프로모터가 없는 렌티바이러스 게이트웨이 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 사용하여 클로닝하였다. 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여, 293 T 생산 세포주에 패키징 플라스미드(9㎍): pLP1, pLP2, 및 pLP/VSVG와 함께 플라스미드(3㎍)를 공동 형질감염시켰다. 렌티-X p24 신속 역가 키트 및 제조업체의 권장 절차(클론테크, 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하여 렌티바이러스 역가를 결정하였다.
단리된 HSC의 렌티바이러스 형질도입
단리 24시간 후, 4 ㎍/㎖ 폴리브렌 및 1 ㎍/㎖ 라파마이신의 존재하에 MPO CRISPR/Cas9 렌티바이러스를 HSC에 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 치사 방사선 조사된 마우스에 즉시 이식하거나 또는 CRISPR/Cas9 활성 분석을 위해 생체외에서 성장시켰다. GFP 발현은 배양 1일 후에 분명해졌다.
실시예 1
다발성 경화증의 EAE 모델에서 MPO 표적화
EAE 또는 실험적 알러지성 뇌척수염은 다발성 경화증(MS) 및 급성 파종 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis: ADEM)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인간 CNS 탈수초성 질환의 동물 모델로 널리 인정되고 있는 중추 신경계(CNS)의 유도된 염증성 탈수초성 질환이다. EAE는 마우스, 래트, 기니피그, 토끼 및 영장류를 포함한 여러 종에서 유발될 수 있다. 질환 유도는 일반적으로 동물을 다양한 항원에 노출시킴으로써 이루어진다. 가장 일반적으로 사용되는 항원은 척수 균질물(spinal cord homogenate: SCH), 정제된 마이엘린, 마이엘린 염기성 단백질 (myelin basic protein: MBP)과 같은 마이엘린 단백질, 마이엘린 단백지질 단백질 (Myelin proteolipid protein: PLP, 또는 리포필린(lipophilin)), 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein: MOG) 또는 이러한 단백질의 펩타이드이며, 모두 면역학 및 병리학에 관한 다른 질환 특성을 가진 별개의 모델을 생성한다.
사용된 항원과 동물의 유전적 구성에 따라 설치류는 단발성(monophasic bout) EAE, 재발-관해 형태 또는 만성 EAE를 나타낼 수 있다. 전형적인 감수성 설치류는 면역화 후 약 2주 후에 임상 증상이 처음 나타나고, 재발-관해 질환의 증상이 나타날 것이다. 마이엘린-희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드(MOG)로 질환이 유발된 C57BL/6 암컷 마우스를 사용하여 다발성 경화증의 모델링을 수행하였다. 이 모델은 질환의 진행성(만성이라고도 함) 형태를 나타낸다. MPO 발현 및/또는 활성을 조절, 특히 감소 또는 저해하는 본 발명의 조성물 및 키트의 치료 효과를 결정하기 위해, 질환의 중증도 및 재발의 발병을 모니터링하는데 실험 절차에 표시된 점수 지수를 사용하였다.
EAE 모델의 확립
MS의 EAE 모델은 백일해 독소(PT)로 2회의 면역화와 함께 MOG35-55 펩타이드를 함유하는 보조제로 성체 암컷 마우스를 면역화하여 유도하였다. EAE 모델을 확립하는 데 필요한 이러한 물질의 최소량을 결정하기 위해, C57BL/6 암컷 마우스를 200㎍의 MOG35-55 및 200ng의 PT, 200㎍의 MOG35-55 및 300ng의 PT 또는 300㎍의 MOG35-55 및 300ng의 PT로 면역화하였다. 처음 두 용량 간에 마우스 임상 점수에 차이가 나타나지 않았지만, 더 높은 용량의 300㎍의 MOG35-55 및 300ng PT는 모든 면역화된 마우스에서 심각한 질환을 유발하였다(도 1). 이러한 결과는 이 용량이 EAE 질환을 향상시키는데 가장 적합하다는 것을 나타낸다.
BM 이식은 방사선 조사된 C57BL/6 마우스에서 치사율을 구제한다
방사선 조사선량 치사율(irradiation dose lethality)과 BM 세포 이식의 조혈 재구성 능력을 결정하기 위해, 7 마리의 8주령 수컷 C57BL/6 마우스에 방사선을 조사(9㏉)하고, 그 중 5 마리는 꼬리 정맥을 통해 새로 단리된 100만개의 BM을 이식하였다. 예상대로, 모든 마우스는 48시간 후 체중이 4% 내지 10% 감소하였다(도 2). 이식한 모든 마우스는 급격한 회복을 보였고 2주 만에 초기 체중으로 돌아왔지만, 이식하지 않은 마우스는 13일 내지 15일 후에 악화되어 죽었다. 이러한 결과는 사용된 9㏉ 선량이 치명적임을 나타낸다. 더욱이, BM 세포를 이식한 5 마리의 마우스 모두 14일 후에 회복할 수 있었으며, 이는 실제로 이식시 완전한 조혈 재구성이 확립되었음을 나타낸다.
CRISPR-Cas9 매개성 KO 실험에 대해 보다 균질한 세포 집단을 확립하기 위해, BM 세포를 조혈 전구세포에 대해 더 농축하였다. 이는 자성 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 성숙 조혈 세포(즉, Lin- 세포)의 마커를 발현하지 않는 세포에 대해 BM을 농축함으로써 수행하였다. 이러한 세포가 조혈 재구성 잠재력을 보유하고 있음을 확인하기 위해, 이 세포를 치사 방사선 조사된 C57BL/6 마우스에 이식하였다. BM 이식된 마우스와 유사하게, 이들 마우스도 또한 48시간 후에 급격한 체중 감소를 보인 후 회복 및 생존을 나타내었다(도 2). 이러한 결과는 Lin 조혈 전구세포가 조혈 재구성 잠재력을 보유하며, CRISPR-Cas9 KO 실험에 적합하다는 것을 의미한다.
EAE 마우스에 MPO Tm1/Lus 로부터의 BM의 이식
MS의 EAE 마우스 모델에서 골수성-MPO 결핍의 효과를 평가하기 위해, 28 마리의 암컷 C57BL/6 마우스를 위에 기재한 바와 같이 치사 방사선 조사하고, MPO를 정상적으로 발현하는 WT C57BL/6 마우스 또는 MPO 넉-아웃 MpoTm1/Lus 마우스로부터 유래된 BM 세포(200㎕ 중 1×106)를 방사선 조사된 EAE 마우스에 이식하였다. 표 1은 이 실험에 사용된 실험군을 요약한다.
Figure pct00001
EAE 질환 과정에 대한 MPO 결핍의 영향을 실험 절차에 기재한 바와 같이 질환 임상 점수를 측정하여 평가하였다. 모든 실험군의 마우스는 또한 뉴런 손실, 시냅스 손실 및 미세아교세포종과 같은 EAE-관련 양태뿐만 아니라 BBB 투과성, CNS로의 백혈구 침윤, 미세아교세포증 및 네토시스 비율을 검사하는 사후 분석에 의해 평가하였다.
실시예 2
알츠하이머병(AD)의 FAD 모델에서 MPO의 표적화
5xFAD 마우스에 Mpo Tm1/Lus 로부터의 BM의 이식 - 퍼옥시다제 활성의 검사
AD의 5xFAD 마우스 모델에서 골수성-MPO 결핍의 효과를 평가하기 위해, 70 마리의 수컷 5xFAD 및 이들의 비-형질전환 한배새끼에 치사 방사선을 조사하고, MPO를 정상적으로 발현하는 WT C57BL/6 마우스 또는 MPO 넉-아웃(KO) MpoTm1/Lus 마우스로부터 유래된 BM 세포(200㎕ 중 1×106)를 방사선 조사된 AD 마우스에 이식하였다. 실험군은 표 2에 요약되어 있다. 이식 4주 후, 마우스의 84%가 생존하였고 초기 체중으로 돌아갔다(도 3A 내지 도 3D). 이식 8주 후, WT 또는 MPO KO BM 세포 이식을 받은 마우스의 혈액 샘플에서 퍼옥시다제 활성을 측정하였다. 실제로, MPO KO 마우스에서 수득된 BM 세포를 이식한 마우스의 혈액 샘플은 퍼옥시다제 활성을 더 적게 나타내어(도 3E 내지 도 3F), 이 마우스에서 MPO KO 세포의 MPO KO 조혈 재구성을 확인하였다.
Figure pct00002
5xFAD 마우스에 Mpo Tm1/Lus 로부터의 BM의 이식 - MPO-mRNA 수준의 검사
혈액 MPO가 결핍된 성체 5XFAD 마우스 및 이들의 비-형질전환 한배새끼를 생성하였다. 2개월령 마우스를 골수절제 방사선에 노출시켜 조혈 절제한 다음, MPO-KO 또는 WT C57BL/6 마우스로부터 유래된 골수(BM) 세포로 골수 증식시켰다. 이로 인해 4개의 실험군이 생성되었다: (1) WT BM을 갖는 WT(WT-WT), (2) MPO-KO BM을 갖는 WT(WT-MPO KO), (3) WT BM을 갖는 5XFAD 마우스(5XAD-WT) 및 (4) MPO-KO BM을 갖는 5XAD(5XFAD-MPO KO)(도 4A). MPO-KO BM을 주사한 마우스에서 MPO의 감소를 확인하기 위해, MPO-mRNA 발현 분석을 수행하였다. 이식된 마우스에서 조혈 집단의 효율적인 교환을 보이는 대조군의 높은 수준과 비교하여, 거의 검출이 불가능한 MPO-mRNA 수준이 WT-MPO KO 및 5XFAD-MPO KO 마우스로부터 유래된 BM에서 발견되었다(도 4B).
MPO 결핍은 5XFAD 마우스의 인지 장애를 저해한다
5XFAD 마우스의 인지 장애에 대한 MPO KO의 효과를 조사하였다. 이를 위해 이식된 마우스에 생후 7개월부터 일련의 행동 검사를 실시하였다(도 4C). 개방 공간 테스트에서, 5XFAD 마우스는 주변이 아닌 미로의 중심에서 더 많은 시간을 보냄으로써 손상된 위험 평가가 반영되는 것으로 알려져 있다. 실제로, 5XFAD-WT 마우스는 WT-WT 마우스에 비해 미로의 모서리에서 훨씬 적은 시간을 보냈고, 미로의 중심에서 더 많은 시간을 보냈다. 대조적으로, 5XFAD-MPO KO 마우스는 5XFAD-WT 마우스에 비해 미로의 중심에서 훨씬 더 적은 시간을 보냈으며, 대조군 WT 마우스 그룹과 유사한 행동을 나타내었다(도 5A 내지 도 5B). 특히, 총 이동 거리에서 4개의 실험군간에 차이가 측정되지 않았으며, 이는 유사한 운동 능력을 나타낸다(도 5C).
고가식 십자미로에서, WT 마우스는 미로의 폐쇄된 통로에서 더 많은 시간을 보내는 경향이 있는 반면, 5XFAD 마우스는 개방되고 노출된 통로로 향하는 경향을 보여 손상된 위험/불안-관련 평가를 반영한다. 이 실험에서, 5XFAD-WT 및 5XFAD-MPO KO 마우스는 교란된 위험 평가 행동을 반영하여 개방된 통로에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈다. 그러나, 5XFAD-MPO KO 마우스는 5XFAD-WT 마우스에 비해 미로의 개방된 통로에서 훨씬 더 적은 시간을 소비하였다(도 5D 내지 도 5E). 종합하면, 이러한 결과는 MPO KO가 5XFAD 마우스에서 위험 평가/불안-관련 행동을 감소시킴을 나타낸다.
다음으로, MPO 결핍이 5XFAD 마우스에서 보이는 인지 저하를 저해하는지 여부를 테스트하였다. Y-미로 테스트에서, 5XFAD-WT 마우스는 WT-WT와 비교하여 새로운 통로에 대한 탐사 시간이 단축되고 진입은 더 적음을 보여준 반면, 5XFAD-MPO KO 마우스는 5XFAD WT와 비교하여 미로의 새로운 통로에 대한 진입이 약 50% 더 많음을 보여주었다(도 6A). 5XFAD-WT와 5XFAD-MPO KO 마우스 간에 탐사 시간의 유의한 차이는 측정되지 않았다(도 6B). 그런 다음, 모리스 물 미로에서 이 마우스의 공간 학습 능력을 조사하였다. 시험 5일 동안, 5XFAD-WT 마우스는 손상된 공간 학습을 반영하여 시험 제3일부터 플랫폼을 찾기 위해 훨씬 더 긴 대기 시간을 보였다(도 6C). 그러나, 5XFAD-MPO KO 마우스는 5XFAD-WT 마우스와 비교하여 제5일에 플랫폼을 찾는 지연 시간이 현저히 적어 훨씬 더 나은 학습 능력을 보여주었다(도 6C). WT 마우스의 학습 향상은 마우스가 이동한 총 거리에도 반영될 수 있다. 초기에는 이 마우스가 후기보다 더 먼 거리를 여행했기 때문이다. 5XFAD-WT 마우스는 시험 내내 비교적 일정한 이동 거리를 보였지만, 5XFAD-MPO KO 마우스는 WT 그룹과 유사하게 테스트가 진행됨에 따라 더 짧은 이동 거리를 나타내었다(도 6D). 마지막으로, 두려움 조절 테스트를 사용하여 연관 학습을 평가하였다. 이 테스트에서, 혐오 발 충격(aversive foot shock)을 가하는 조건형성 후 다음날 동결 행동을 측정하였다. WT-WT 및 WT-MPO KO 마우스는 약 40%의 적절한 연관성 기억 재통합을 반영하는 동결 행동을 보였지만, 5XFAD-WT 마우스는 동결 행동이 현저히 감소하였다. 특히, MPO가 결핍된 마우스가 5XFAD 마우스에서보다 2.45배 더 높은 동결 행동을 보인다(도 6E). 따라서, 5가지 행동 테스트에서 혈액 MPO 결핍이 AD의 5XFAD 모델에서 인지 기능 손상을 저해한다는 것이 입증되었다.
MPO KO 마우스 그룹은 유사한 아밀로이드-β 플라크 축적을 나타낸다
행동 검사 후, 마우스를 희생시키고, 뇌 절편에서 ThioS 염색을 수행하여 MPO KO가 플라크 밀도에 미치는 영향을 결정하였다. WT 마우스 그룹은 검출 가능한 ThioS 염색을 보여주지 않았지만, 5XFAD-WT 및 5XFAD-MPO KO 마우스 그룹은 모두 비슷한 수준의 아밀로이드-β 플라크를 보였으며, 이는 MPO KO가 5XFAD 마우스의 뇌에서 아밀로이드-β의 생성 및 축적에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다(도 7A 내지 도 7E).
5XFAD-MPO KO 마우스는 저하된 염증을 보인다
MPO 결핍이 뇌 염증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 해마 절편을 S100β에 대한 항체로 염색하였다. 이 단백질은 활성화된 성상세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있으며, AD의 이영양성 신경돌기 형성과 관련이 있다. 예상대로, 5XFAD-WT 마우스는 WT-WT 마우스와 비교하여 해마에서 상당히 높은 S100β 발현을 나타내었다(도 8A 내지 도 8M). 그러나, 5XFAD-MPO KO 마우스는 5XFAD-WT 마우스와 비슷한 낮은 S100β 수준을 나타내어 이들 마우스에서 더 제한된 염증성 반응을 나타내었다. 해마 mRNA 샘플의 실시간 PCR (RT-PCR) 분석은 또한 WT-WT 마우스와 비교하였을 때 5XFAD-WT 마우스에서 S100β 발현에서 현저한 상향조절을 보였으며, 이는 MPO 결핍 5XFAD 마우스에서 제한된 발현 패턴을 반영하였다(도 8N).
MPO 결핍이 염증에 미치는 영향을 추가로 조사하기 위해 RT-PCR을 사용하여 여러 인지된 염증성 마커의 해마 mRNA 발현을 분석하였다. MPO가 결핍된 5XFAD 마우스는 전-염증성 매개체 IL1β 및 CXCL10의 발현 수준이 현저하게 감소하였고(도 9A 내지 도9B), CCL2 및 TNFα 발현은 어느 정도 저하되었다(도 9C 내지 도9D). 흥미롭게도, 5XFAD-WT 마우스에서 향상된 VCAM1 수준은 5XFAD-MPO KO 마우스에서 감소하였다(도 9E). VCAM1과 내피 손상의 알려진 연관성을 감안할 때, 이러한 결과는 5XFAD 마우스의 내피 온전성에 대한 MPO KO의 유익한 효과를 시사할 수 있다.
MPO 결핍은 5XFAD 마우스에서 APOE 발현을 감소시킨다
APOE 유전자형의 ε4 대립유전자는 산발성 후기-발병 AD의 가장 큰 유전적 위험 인자로 간주된다. AD에서 APOE의 정확한 역할은 여전히 논쟁 중이지만, APOE는 분명히 AD 진행에서 중심적인 역할을 하며, 아밀로이드 대사, 응집 및 타우 병리를 포함하여 AD와 관련된 많은 병리학적 과정과 관련이 있다. 흥미롭게도, APOE 발현은 5XFAD 마우스의 뇌에서 실질적으로 증가하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 해마 단백질 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 WT-WT 마우스와 비교할 때 5XFAD-WT 마우스의 뇌에서 APOE 수준은 현저하게 증가한 반면, APOE 수준은 5XFAD-MPO KO 마우스에서 현저하게 낮았다(도 10A, 도 10B). 이러한 결과는 RNA 수준에서 추가로 검증되었으며(도 10C), MPO 결핍이 CNS 내에서 APOE 상승을 방지하였음을 나타낸다.
실시예 3
단리된 HSC에서 CRISPR/Cas9 기법을 사용한 MPO 넉-아웃
CRISPR/Cas9-기반 유전자 변경은 유전자 기반 치료를 위한 효율적인 플랫폼으로 간주된다. 표적 세포의 단리 및 생체외 배양은 조혈 계통 관련 질환에 대한 이러한 접근법의 활용을 용이하게 한다. 따라서 본 발명자들은 단리 HSC에서 렌티바이러스 매개성 MPO 넉아웃을 위해 이 플랫폼을 사용하였다. 이를 위해, 골수 세포를 자성-기반 세포 분류를 사용하여 HSC에 대해 단리하고 농축하였다. 이러한 세포를 MPO를 표적화하는 Cas9 단백질, GFP 및 가이드 RNAs(gRNAs)을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 배양 24시간 후, GFP 양성 세포를 FACS 분류하고, 치사 방사선 조사된 모델 동물에 주사하였다. MPO를 표적으로 하는 렌티바이러스 벡터의 생성을 위해, 다양한 gRNA 프라이머를 설계하고 pL-CRISPR.EFS.GFP 플라스미드에 클로닝하였다. 적절한 결찰은 생어 시퀀싱을 사용하여 검증하였다. 다음으로, 이러한 플라스미드를 Virapower 렌티바이러스 패키징 키트(인비트로젠)를 사용하여 레트로바이러스 입자를 생성하는데 사용하였다. 적절한 렌티바이러스 어셈블리 및 조혈 줄기 세포(HSC)로의 통합을 상승하는 농도(200,00개의 세포당 0.5㎕, 2㎕ 및 10㎕)의 단리된 HSC를 형질도입하여 평가하였다. 대조군으로 렌티바이러스를 발현하는 GFP를 사용하였다. 형질도입 24시간 및 48시간 후 GFP 분석으로 HSC가 실제로 형질도입되었음을 확인하였고(도 11), 각각 배양 24시간 및 48시간 후 조사된 최고 농도에서 33% 및 45%의 GFP+ 세포를 나타내었다. 이러한 결과는 단리된 HSC가 방사선 조사된 마우스로의 이식을 위해 24시간 후에 형질도입되고 FACS 선별될 수 있음을 나타낸다.
GFP 양성 세포를 FACS 분류하고, 치사 방사선 조사된 모델 동물에 주사하였다.
렌티바이러스-형질도입된 HSC를 이용한 후속 동물 실험을 EAE 모델 및 5xFAD 모델 둘 다에서 수행하였다. gRNA를 발현하지 않는 렌티바이러스 벡터를 이 실험의 대조군으로 사용하였다. 이 실험의 그룹은 표 3(EAE 실험용) 및 표 4(5xFAD 실험용)에 기재하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 4
인간 세포(HEK293)에서 CRISPR/Cas9 기법을 이용한 MPO 넉-아웃
인간 HEK293 세포를 Cas9 단백질, 형광 표지된 tracrRNA 및 각각의 인간 MPO 암호화 서열(서열번호 33 내지 35 및 서열번호 42)을 표적으로 하는 하기 crRNA 서열 및 상응하는 프로토스페이서(각각 서열번호 43 내지 46)을 포함하는 리보핵단백질(RNP) 복합체로 형질감염시켰다; (PAM은 굵게 표시함):
T173: TGCACATCCCGGTGATGGTG(서열번호 33으로 표시됨);
D260: CAGGGGTGAAGTCGAGGTCG(서열번호 34로 표시됨);
H502: GGATGAGGGTGTGGCCGTAG(서열번호 35로 표시됨); 및
C319: GGATGGTGATGTTGCTCCCG(서열번호 42로 표시됨).
T173: TGCACATCCCGGTGATGGTGCGG(서열번호 43으로 표시됨);
D260: CAGGGGTGAAGTCGAGGTCGTGG(서열번호 44로 표시됨);
H502: GGATGAGGGTGTGGCCGTAGCGG(서열번호 45로 표시됨); 및
C319: GGATGGTGATGTTGCTCCCGGGG(서열번호 46으로 표시됨).
하기 실시예 5에 의해 나타낸 바와 같이, 이들 특정 표적은 또한 MPO 유전자의 넉아웃을 위한 표적에 추가하여, 또한 단백질의 구조 변화 또는 프로토머 생합성 및 가공의 변화를 형성하는 아미노산 치환(C319A), 인간 MPO 결핍 치환을 모방하는 치환(T173C), 프로모터 헴 결합 D260A 및 H502A를 방해하는 아미노산 치환을 유도하는 HDR 표적으로서 사용될 수 있다. 제조업체의 프로토콜(인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 인코포레이션(Integrated DNA Technologies, Inc.), 미국 소재)에 따라 Alt-R 시스템을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염 72시간 후, DNA 추출을 위해 세포를 수확하거나 tracrRNA로 표지된 세포의 농축을 위해 FACS 분류하고, 72시간 동안 더 배양한 다음, DNA 추출을 위해 수확하였다. DNA 샘플을 제조사의 프로토콜(인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 인코포레이션, 미국 소재)에 따라 T7 엔도뉴클라제 I(T7EI) 불일치 검출 검정을 사용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 편집된 세포 집단에서 주어진 가이드 RNA 표적 부위에서 CRISPR-Cas9 시약의 유전자 편집 효율을 평가하기 위해 T7EI 검정을 사용하였다.
T7EI 검정을 위해 하기 프라이머를 사용하였다:
1. T173 gRNA의 경우:
Fw 프라이머(약 182bps 하류): T173_T7_Fw: TCTTCCTCCAGGGAGTCTCA(서열번호 36으로 표시됨).
Rv 프라이머(약 673bps 하류): T173_T7_Rv: GCAGGAAGGAGACAGGTCAT(서열번호 37로 표시됨).
앰플리콘 크기: 915
2. D260 gRNA의 경우:
Fw 프라이머(약 621bps 하류): D260_T7_Fw: TCTTCCTCCAGGGAGTCTCA(서열번호 36으로 표시됨).
Rv 프라이머(약 234bps 하류): D260_T7_Rv: GCAGGAAGGAGACAGGTCAT(서열번호 37로 표시됨).
앰플리콘 크기: 915
3. C319 gRNA의 경우:
Fw 프라이머(약 263bps 하류): C319_T7_Fw: CCAGGTTCCCAGTTCAGTGT(서열번호 38로 표시됨).
Rv 프라이머(약 558bps 하류): C319_T7_Rv: CCACAGCGTTCTCTGTCCTT(서열번호 39로 표시됨).
앰플리콘 크기: 881
4. H502 gRNA의 경우:
Fw 프라이머(약 297bps 하류): H502_T7_Fw: ATGCCTCTCAGTGCCACTCT(서열번호 40으로 표시됨).
Rv 프라이머(약 566bps 하류): H502_T7_Rv: AGCCAGGTCAGGGGAAGTAT(서열번호 41로 표시됨).
앰플리콘 크기: 923.
도 12에 나타낸 바와 같이, MPO의 절단이 인간세포, 특히 H502(27.3%) 및 T173 (19.8%) crRNA로 형질감염된 분류된 세포에서 나타난 바와 같이 관찰되었다. 이러한 결과는 인간 세포에서 MPO의 특이적이고 효과적인 표적화의 가능성을 분명히 보여준다.
실시예 5
인간 MPO 기능 및 수준을 조작하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 사용
본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 인간 세포에서 MPO의 성공적인 넉아웃에 의해 고무된 본 발명자들은 다음으로 MPO 생합성 및 기능의 변화를 유도하는 인간 MPO의 특정 아미노산 잔기를 치환하기 위한 도구로서 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하였다. 특정 표적 아미노산 잔기는 다음 그룹으로 세분된다.
1. 단백질의 구조 변화 또는 프로토머 생합성 및 가공의 변화를 형성하는 아미노산 치환 - C167A, C180A, C319A, C158A, R128A, N355A.
2. 인간 MPO 결핍 치환을 모방하는 아미노산 치환 - T173C, M251T, R569W, R499C, G501S.
3. 프로토머 헴 결합을 방해하는 아미노산 치환 - Q257A, D260A, M409A, E408A, H261A, H502A.
4. 적절한 단백질 글리코실화를 방해하는 아미노산 치환 - N355A.
본 명세서에 명시된 표적 잔기는 서열번호 2로 표시되는 인간 MPO 아미노산 서열에 관한 것이다.
시스테인167
시스테인167은 C180과 이황화 브리지를 형성하는 MPO의 경쇄에 있는 보존적 아미노산이다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 치환하면, 이황화 브리지의 형성을 방지한다.
시스테인에서 알라닌으로의 치환 C167A(TGC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시스테인167의 코돈 서열 내 Cas9-매개성 이중 가닥 절단(DSB)은 하기 gRNA 서열을 사용하여 수행하였다.
C167A-1: GGACGTGGGGGTGACTT^GCC(서열번호 47로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GGACGTGGGGGTGACTT^GCCCGG(서열번호 94로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: CAGGACGTGGGGGTGACTTGC 167CCGGAGCAGGACAAA(서열번호 48로 표시됨).
절단 후: CAGGACGTGGGGGTGACTT^GC 167CCGGAGCAGGACAAA(서열번호 48로 표시됨).
(PAM 서열에는 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고 데옥시뉴클레오타이드(ssODN)는 HDR의 주형으로 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
C167A에 대한 주형 ssODN 올리고는 다음을 포함한다:
GTTGTCCAAGTCAAGCGGCTGCGCCTACCAGGACGTGGGGGTGACTGCC 167C CTG AGCAGGACAAATACCGCACCATCACCGGGATGTGCAACAACAGGTGCGGC(서열번호 49로 표시됨).
시스테인180
시스테인 180은 C167과 이황화 브리지를 형성하는 MPO의 경쇄에 있는 보존적 아미노산이다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 치환하면, 이황화 브리지의 형성을 방지한다.
시스테인에서 알라닌으로의 치환 C180A(TGC에서 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 시스테인180의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
C180A-1: TCACCGGGATGTGCAAC^AAC(서열번호 50으로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열 TCACCGGGATGTGCAAC^AACAGG(서열번호 95로 표시됨)를 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: ACCATCACCGGGATGTGC 180AACAACAGGTGCGGCTGGCTG(서열번호 51로 표시됨).
절단 후: ACCATCACCGGGATGTGC 180AAC^AACAGGTGCGGCTGGCTG(서열번호 51로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다.
상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
C180A에 대한 주형 ssODN 올리고:
CTTGCCCGGAGCAGGACAAATACCGCACCATCACCGGGATGGCC 180AACAAC AGC TGCGGCTGGCTGGGGGTGGCTGCAGGAACCGGGCTCAGAGAGGCGTCCCG(서열번호 52로 표시됨).
타이로신173
타이로신 173의 코돈에서 미스센스 돌연변이로 인해 시스테인으로 대체되는 것은 이전에 MPO 결핍을 초래하여 비정상적인 단백질 가공을 유발하여 분해를 일으키는 것으로 보고되었다.
따라서, 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 타이로신에서 시스테인으로의 치환 Y173C(TAC를 TGT/TGC로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 타이로신173의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
Y173C -1: TGCACATCCCGGTGATG^GTG(서열번호 33으로 표시됨), 핵산 서열: TGCACATCCCGGTGATG^GTGCGG(서열번호 43으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: TGCCCGGAGCAGGACAAATA C 173 CG CACCATCACCGGG(서열번호 53으로 표시됨).
절단 후: TGCCCGGAGCAGGACAAATA C 173 CG CAC^CATCACCGGG(서열번호 53으로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
Y173C에 대한 주형 ssODN 올리고:
GGCTGCGCCTACCAGGACGTGGGGGTGACTTGCCCGGAGCAGGACAAATG T 173 CG CACCATCACCGGGATGTGCAACAACAGGTGCGGCTGGCTGGGGGTGGCTG(서열번호 54로 표시됨).
글루타민 257
글루타민 257은 헴 공동(heme cavity)과 수소 결합을 형성하고, 할로겐화물 결합에 관여하는 것으로 보고되었다. 이 아미노산을 중성 아미노산으로 대체하면 카보닐 잔기가 물 분자와 상호작용하고 수소 결합이 형성되는 것을 방지한다.
글루타민에서 알라닌으로의 치환 Q257A(CAG를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 글루타민 257의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다.
Q257A -1: CATGCAATGGGGCCAGC^TGT(서열번호 55로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열 CATGCAATGGGGCCAGC^TGTTGG(서열번호 96으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: CATGTTCATGCAATGGGGCCAG 257CTGT TGG ACCACGA(서열번호 56으로 표시됨).
절단 후: CATGTTCATGCAATGGGGCCAG 257C^TGT TGG ACCACGA(서열번호 56으로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
Q257A에 대한 주형 ssODN 올리고:
GACTCCGGACCAGGAGCGCTCACTCATGTTCATGCAATGGGGCGCG 257CTGT TTG ACCACGACCTCGACTTCACCCCTGAGCCGGCCGCCCGGGCCTCCTTCGTC(서열번호 57로 표시됨).
아스파테이트260
아스파테이트 260은 아마도 헴 그룹에 대한 MPO 경쇄의 유일한 공유 결합인 헴의 피롤기와 에스터 결합을 형성한다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 대체하면 이러한 단백질-헴 상호작용을 방지한다.
아스파테이트를 알라닌으로의 치환 D260A(GAC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 아스파테이트260의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 실시예 4에 개시된 바와 같이 수행하였다:
D260A -1: CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCG(서열번호 34로 표시됨), 이는 핵산 서열 CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGG(서열번호 44로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 함.
절단 전: GCAATGGGGCCAGCTGTTGGA C 260 CA CGACCTCGACTTCACCCCT(서열번호 58로 표시됨).
절단 후: GCAATGGGGCCAGCTGTTGGA C 260 CA CGA^CCTCGACTTCACCCCT(서열번호 58로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
Q260A에 대한 주형 ssODN 올리고:
CCGGACCAGGAGCGCTCACTCATGTTCATGCAATGGGGCCAGCTGTTGGC A 260 CA CGACCTCGACTTCACCCCTGAGCCGGCCGCCCGGGCCTCCTTCGTCACTG(서열번호 59로 표시됨).
메티오닌409
메티오닌 409는 아마도 헴 그룹에 대한 MPO 경쇄의 유일한 공유 결합인 헴의 피롤기와 에스터 결합을 형성한다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 대체하면 이러한 단백질-헴 상호작용을 방지한다.
메티오닌에서 알라닌으로의 치환 M409A(ATG를 GCC/GCA/GCT/GCG)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 메티오닌 409의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
M409A -1: GGTGAGCTCGGGCATCT^CAC(서열번호 60으로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GGTGAGCTCGGGCATCT^CACTGG(서열번호 97로 표시됨)를 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: AGGGGACACCCGTT CCA GTGAGATG 409CCCGAGCTCACCTCCA(서열번호 61로 표시됨).
절단 후: AGGGGACACCCGTTCCAGTG^AGATG 409CCCGAGCTCACCTCCA(서열번호 61로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
M409A에 대한 주형 ssODN 올리고:
GAGGCCTTAAGAATGACAGTGGCTTTTGCCTCCCCAAGGGGACACCCGTT ACA GTGAGGCG 409CCCGAGCTCACCTCCATGCACACCCTCTTACTTCGGGAGCAC(서열번호 62로 표시됨).
글루타메이트408
글루타메이트 408은 헴의 피롤기와 에스터 결합을 형성한다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 대체하면 이러한 단백질-헴 상호작용을 방지한다.
글루타메이트에서 알라닌으로의 치환 e408a(GAG를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 글루타메이트 408의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
E408A -1: GGTGAGCTCGGGCATCT^CAC(서열번호 63으로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GGTGAGCTCGGGCATCT^CACTGG(서열번호98로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: AGGGGACACCCGTT CCA GTGAG 408ATGCCCGAGCTCACCTCCA(서열번호 64로 표시됨).
절단 후: AGGGGACACCCGTT CCA GTG^AG 408ATGCCCGAGCTCACCTCCA(서열번호 64로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
E408A에 대한 주형 ssODN 올리고:
GAGGCCTTAAGAATGACAGTGGCTTTTGCCTCCCCAAGGGGACACCCGTT ACA GTGCG 408ATGCCCGAGCTCACCTCCATGCACACCCTCTTACTTCGGGAGCAC(서열번호 65로 표시됨).
히스티딘261
히스티딘 261은 헴 철을 조정하는 원위 리간드이다. 이 아미노산 잔기를 중성 아미노산으로 대체하면 이러한 단백질-헴 상호작용을 방지한다.
히스티딘에서 알라닌으로의 치환 H261A(CAC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 히스티딘 261의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
H261A -1: CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCG(서열번호 66으로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGG CAGGGGTGAAGTCGAGG^TCGTGG(서열번호 99로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: GCAGCGCAGCAGGGA CCA C 261GACCTCCCAGGTGAGGGGCT(서열번호 67로 표시됨).
절단 후: GCAGCGCAGCAGGGA CCA C 261GA^CCTCCCAGGTGAGGGGCT(서열번호 67로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
H261A에 대한 주형 ssODN 올리고:
ATGAGGATTGGGCTGGACCTGCCTGCTCTGAACATGCAGCGCAGCAGGGA C GCC 261GACCTCCCAGGTGAGGGGCTGCAGGAGTCTCCCCTGATGCTCACCTCCCC(서열번호 68로 표시됨).
시스테인 319
시스테인 319는 MPO 동종이량체를 포함하는 두 프로토머 사이에 유일한 이황화 브리지를 형성한다. 시스테인 319의 알라닌으로의 치환 돌연변이는 MPO 생합성을 방해하고 이의 퍼옥시다제 활성을 감소시킨다.
시스테인에서 알라닌으로의 치환 C319A(TGC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 시스테인 319의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 실시예 4에 나타낸 바와 같이 수행하였다:
C319A -1: GGATGGTGATGTTGCTC^CCG(서열번호 42로 표시됨), 이는 핵산 서열 GGATGGTGATGTTGCTC^CCGGGG(서열번호 46으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 함.
절단 전: CCTGGCCCAGATCTCATTGC 319 CC CGGATCATCTGCGACAA(서열번호 69로 표시됨).
절단 후: CCTGGCCCAGATCTCATTGC 319 CC CGG^ATCATCTGCGACAA(서열번호 69로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
C319A에 대한 주형 ssODN 올리고:
GGGTGTGTTCAGCATGCAGCAGCGACAGGCCCTGGCCCAGATCTCATGCC 319 AC CGGATCATCTGCGACAACACAGGCATCACCACCGTGTCTAAGAACAACAT(서열번호 70으로 표시됨).
메티오닌 251
메티오닌 251의 코딩 영역에서 미스센스 돌연변이로 인해 트레오닌으로의 치환이 유전된 MPO 결핍을 유발한다. 시험관내 데이터는 M251T 치환이 MPO 가공에 영향을 미치며 퍼옥시다제 활성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
메티오닌에서 트레오닌으로의 치환 M251A(ATG를 ACC/ACA/ACT/ACG로 변경)은 하기 gRNA 서열을 사용하여 메티오닌 251의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 수행하였다:
M251A -1: GCTCACTCATGTTCATG^CAA(서열번호 71로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GCTCACTCATGTTCATG^CAATGG(서열번호 100으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: GAGCGCTCACTCATG 251TTCATGCAA TGG GGCCAGCTGTTG(서열번호 72로 표시됨).
절단 후: GAGCGCTCACTCATG 251TTCATG^CAA TGG GGCCAGCTGTTG(서열번호 72로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
M251A에 대한 주형 ssODN 올리고:
CCACTGATCAGCTGACTCCGGACCAGGAGCGCTCACTCACG 251TTCATGCAA TGT GGCCAGCTGTTGGACCACGACCTCGACTTCACCCCTGAGCCGGCCGCCCG(서열번호 73으로 표시됨).
아르기닌 569
아르기닌 569의 코딩 영역에서 미스센스 돌연변이로 인해 트립토판으로의 치환이 유전된 MPO 결핍을 유발한다. 시험관내 데이터는 R569W 치환이 MPO 가공에 영향을 미치며 헴의 혼입을 방지하고 퍼옥시다제 활성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
아르기닌에서 트립토판으로의 치환 R569W(CGG를 TGG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 아르기닌 569의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 수행하였다:
R569W -1: AATTGCAGTGGATGAGA^TCCGGG(서열번호 74로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: AATTGCAGTGGATGAGA^TCCGGG(서열번호 101로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: GCAGTGGATGAGATCC GG 569 G AGCGATTGTTTGAGCAGG(서열번호 75로 표시됨).
절단 후: GCAGTGGATGAGA^TCC GG 569 G AGCGATTGTTTGAGCAGG(서열번호 75로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
R569W에 대한 주형 ssODN 올리고:
CACCCCTGCCAAGCTGAATCGTCAGAACCAAATTGCAGTGGATGAGATCT GA 569 G AGCGATTGTTTGAGCAGGTCATGAGGATTGGGCTGGACCTGCCTGCTCTG(서열번호 76으로 표시됨).
아르기닌499
499번 위치에서 아르기닌의 시스테인으로의 유전된 치환 돌연변이는 MPO 결핍을 초래한다. 아르기닌 499는 중요한 히스티딘 502의 안정화에 중요한 것으로 나타났다.
아르기닌에서 시스테인으로의 치환 R499C(CGC를 TGT/TGC로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 아르기닌 499의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 수행하였다:
R499C-1: TTCACCAATGCCTTCCG^CTA(서열번호 77로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: TTCACCAATGCCTTCCG^CTACGG(서열번호 102로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: ACCAATGCCTTCCGC 499TA CGG CCACACCCTCATC(서열번호 78로 표시됨).
절단 후: ACCAATGCCTTCCG^C 499TA CGG CCACACCCTCATC(서열번호 78로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
R499C에 대한 주형 ssODN 올리고:
GACTCAGTGGACCCACGCATCGCCAACGTCTTCACCAATGCCTTCTGC 499TA CCG CCACACCCTCATCCAACCCTTCATGTTCCGCCTGGACAATCGGTACCAGC(서열번호 79로 표시됨).
글리신 501
501번 위치에서 글리신의 세린으로의 유전된 치환 돌연변이는 MPO 결핍을 초래한다. 글리신 501은 중요한 히스티딘 502의 안정화에 중요한 것으로 나타났다.
글리신에서 세린으로의 치환 G501S(GC를 AGT/AGC로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 글리신 501의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
G501S-1: TTCACCAATGCCTTCCG^CTA(서열번호 80으로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: TTCACCAATGCCTTCCG^CTACGG(서열번호 103으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: ACCAATGCCTTCCGCTA CGG C 501CACACCCTCATC(서열번호 81로 표시됨).
절단 후: ACCAATGCCTTCCG^CTA CGG C 501CACACCCTCATC(서열번호 81로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
G501S에 대한 주형 ssODN 올리고:
GACTCAGTGGACCCACGCATCGCCAACGTCTTCACCAATGCCTTCCGCTA CAG C 501CACACCCTCATCCAACCCTTCATGTTCCGCCTGGACAATCGGTACCAGCC(서열번호 82로 표시됨).
히스티딘 502
히스티딘 502는 헴 철을 조정하는 근위 리간드이다. 히스티딘 502는 MPO 헴 결합에 중요하다.
히스티딘에서 알라닌으로의 치환 H502A(CAC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 히스티딘 502의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 실시예 4에 의해 나타낸 바와 같이 수행하였다:
H502A-1: GGATGAGGGTGTGGCCG^TAG(서열번호 35로 표시됨), 이는 핵산 서열 GGATGAGGGTGTGGCCG^TAGCGG(서열번호45로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 함.
절단 전: ACCAATGCCTT CCG CTACGGCCAC 502ACCCTCATCCA(서열번호 83으로 표시됨).
절단 후: ACCAATGCCTT CCG CTA^CGGCCAC 502ACCCTCATCCA(서열번호 83으로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
H502A에 대한 주형 ssODN 올리고:
TACAATGACTCAGTGGACCCACGCATCGCCAACGTCTTCACCAATGCCTT ACG CTACGGCGCC 502ACCCTCATCCAACCCTTCATGTTCCGCCTGGACAATCGGT(서열번호 84로 표시됨).
시스테인 158
시스테인 158은 프로-펩타이드에서 시스테인 319와 이황화 브리지를 형성하며, 그 돌연변이는 MPO 가공 및 방출을 방해한다.
시스테인에서 알라닌으로의 치환 C158A(TGC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 시스테인 158의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB에 의해 수행하였다:
C158A-1: GTCAAGCGGCTGCGCCT^ACC(서열번호 85로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GTCAAGCGGCTGCGCCT^ACCAGG(서열번호 104로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: GTCCAAGTCAAGCGGCTGC 158GCCTACC AGG ACGTGGGG(서열번호 86으로 표시됨).
절단 후: GTCCAAGTCAAGCGGCTGC 158GCCT^ACC AGG ACGTGGGG(서열번호 86으로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
C158A에 대한 주형 ssODN 올리고:
GACGCCCGCCCAGCTGAATGTGTTGTCCAAGTCAAGCGGCGCC 158GCCTACC ATG ACGTGGGGGTGACTTGCCCGGAGCAGGACAAATACCGCACCATCACCGGG(서열번호 87로 표시됨).
아스파라긴 355
아스파라긴 355는 글리코실화되는 것으로 알려진 6개의 아스파라긴 잔기 중 하나이다. 아스파라긴 355의 탈글리코실화는 MPO 효소 활성을 낮추는 것으로 나타났다.
아스파라긴에서 알라닌으로의 치환 N355A(AAC를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 아스파라긴 355의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 수행하였다:
N355A-1: GCTGGTTGGACATGTTG^CGC(서열번호 88로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: GCTGGTTGGACATGTTG^CGCAGG(서열번호 105로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: CCCTGGCCAGGAA CCT GCGCAAC 355 ATGTCCAACCAGCTG(서열번호 89로 표시됨).
절단 후: CCCTGGCCAGGAA CCT GCG^CAAC 355 ATGTCCAACCAGCTG(서열번호 89로 표시됨).
(PAM 서열은 밑줄이 그어져 있고, ^는 절단 부위를 나타내며, 굵은 글씨는 치환된 코돈을 표시함).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
N355A에 대한 주형 ssODN 올리고:
TTCGTGGACGCCAGCATGGTGTACGGCAGCGAGGAGCCCCTGGCCAGGAA TCT GCGCGCC 355 ATGTCCAACCAGCTGGGGCTGCTGGCCGTCAACCAGCGCTTCC(서열번호 90으로 표시됨).
아르기닌 128
서브틸리신-유사 프로펩타이드 컨버타제에 의한 MPO 프로펩타이드 절단은 MPO 생합성에 필요하다. 아르기닌 128은 서브틸리신-유사 프로펩타이드 컨버타제-인식 부위의 일부이며, 다른 아미노산으로의 치환은 프로펩타이드 절단을 방지하여야 한다.
아르기닌에서 알라닌으로의 치환 R128A(AGG를 GCC/GCA/GCT/GCG로 변경)는 하기 gRNA 서열을 사용하여 아르기닌 128의 코돈 서열 내의 Cas9-매개성 DSB를 사용하여 수행하였다:
R128A-1: TGGCTCTAGACCTGCTG^GAGAGG(서열번호 91로 표시됨). 이 gRNA는 핵산 서열: TGGCTCTAGACCTGCTG^GAGAGG(서열번호 106으로 표시됨)을 포함하는 프로토스페이서를 표적으로 한다.
절단 전: TAGACCTGCTGGAG AGG 128AAGCTGCGGTCCCTG(서열번호 92로 표시됨).
절단 후: TAGACCTGCTG^GAG AGG 128AAGCTGCGGTCCCTG(서열번호 92로 표시됨).
(치환될 PAM 서열 및 코딩 서열은 밑줄이 그어져 있으며, ^는 절단 부위를 나타냄).
단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)를 HDR에 대한 주형으로서 사용하였다. ssODN은 새로운 코돈 서열 옆에 있는 두 개의 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 대칭이며, PAM의 각 측면으로부터 50개의 염기를 갖는다.
또한, CRISPR 재절단을 방지하기 위해 PAM 차단 돌연변이를 PAM 서열에 도입하였다.
R128A에 대한 주형 ssODN 올리고:
CGGCGGTGAGGGCCGCTGACTACCTGCACGTGGCTCTAGACCTGCTGGAG GCG 128AAGCTGCGGTCCCTGTGGCGAAGGCCATTCAATGTCACTGATGTGCTGAC(서열번호 93으로 표시됨).
실시예 6
CRISPR-매개 유전자 편집과 조합된 조혈 줄기 세포 이식(HSCT): 임상 연구
환자의 적격성 평가
환자를 연령, 질환 상태, 임상 평가 및 Karnofsky 성능 점수와 같은 기능 평가를 기반으로 HSCT에 대한 신체 적격성에 대해 평가하였다. 또한, 환자에 대해 MPO-표적화 gRNA 서열에 대한 유전적 순응도를 검증하기 위해, MPO 유전자좌에서 시퀀싱하였다.
CD34+ 동원 및 성분채집기에 의한 수집
HSPC는 장골 능선 골수 흡인물로부터 추출하거나 또는 화학 요법과 과립구-콜로니 자극 인자(granulocyte-colony stimulating factor: G-CSF)를 결합한 말초 동원 양생법을 사용하여 동원할 수 있으며, CD34+ 세포를 성분채집기에 의해 적혈구와 백혈구에서 수집 및 단리하고 주입 백에 보관하였다. 수집된 세포의 킬로그램당 2×106개의 중요한 세포를 백업으로 20% DMSO로 냉동 보존하였다.
CD34+ 유전자 편집 및 형질전환된 세포의 농축
사이토카인으로 사전 자극된 농축된 CD34+ 세포를 적절한 crRNA 및 형광 표지된 tracrRNA와 복합체화된 CRISPR-Cas9 리보핵단백질을 사용한 전기 천공과 같은 MPO 유전자를 표적으로 하는 유전자 편집 벡터로 처리하였다. RNP 복합체와 함께 인큐베이션한 후, CD34+ 세포를 tracrRNA-유래 또는 벡터-유래 형광 또는 다른 적용 가능한 선택 방법에 의해 농축하였다.
편집된 CD34+ 세포의 품질 테스트
박테리아 또는 곰팡이 오염, 내독소 및 마이코플라스마를 확인하고, 세포 생존력을 평가하기 위해 MPO-편집된 CD34+를 검사하였다. CD34+ 세포 내 HSPC 기관 재증식 능력은 유세포 분석에 의해 평가될 수 있다.
유전자 편집된 세포 증식
MPO-편집된 CD34+ 세포를 사이토카인, 금속 킬레이터 또는 소분자와 같은 화합물을 사용하여 생체외에서 증식시켰으며, 이는 이식을 위해 중요한 세포 수에 도달하거나 생착 속도를 개선하기 위해 바람직할 수 있다.
컨디셔닝 양생법
유전자-편집된 HSPC를 주입하기 전에, 환자에게 골수 세포를 억제하고 공여체 줄기 세포의 거부를 방지하기 위해 전신 방사선 조사 유무에 관계없이 화학요법 및 ATG(항-흉선세포 글로불린)를 포함하는 컨디셔닝 양생법을 수행하였다. 이 절차는 골수 파괴 또는 비-골수 양생법 요법을 포함할 수 있다. 자가 줄기 세포 이식의 경우, G-CSF에 의한 CD34+ 세포의 동원 및 CD34+ 세포의 성분채집 후, 전신 방사선 조사 유무에 관계없이 사이톡산(Cytoxan)과 ATG에 의한 컨디셔닝을 수행할 것이다.
세포 투여
HSPC 평가 및 컨디셔닝 양생법에 따라, 환자에게 정맥내로 킬로그램당 적어도 2×106개의 세포 용량을 투여하였다.
이식 후 치료 및 모니터링
이식편대숙주병(graft-versus-host disease: GVHD)의 예방을 위해 사이클로스포린 또는 타크롤리무스와 같은 약물을 사용하는 이식 후 면역억제요법을 제공하였다. 심각한 감염을 예방하기 위해 예방 약물을 투여하였다. 환자를 집중적인 간호로 모니터링하고, HSCT 또는 감염, GVHD 등과 같은 면역억제의 가능한 합병증 및 치료의 잠재적인 부작용에 대해 치료하였다. 조혈 회복 및 생착 속도를 평가하고, 성장 인자를 사용하여 가속화하였다.
실시예 7
폐동맥 고혈압(PAH)의 치료에서 MPO 넉-아웃
추가적인 MPO-관련 병태에 대한 잠재적 요법으로서 제안된 MPO KO 미분화 골수 세포의 적용 가능성을 평가하기 위해, 다음으로 래트에서 PAH와 같은 혈관 장애에 대한 MPO KO의 효과를 조사하였다. 특히, 래트의 Sugen5416/저산소-유도성(SuHx-유도성) 폐동맥 고혈압 모델을 사용하였다. SuHx는 소 폐동맥(small pulmonary artery: PA)에서 혈관 근육화의 현저한 증가, 우심실 수축기 압력(right ventricular systolic pressure: RVSP) 및 우심실 비대(Right ventricular hypertrophy: RVH)의 증가를 야기한다.
보다 구체적으로, SuHx 래트를 골수 절제 방사선 조사에 노출시켜 조혈 절제한 다음, MPO-KO 또는 WT 래트로부터 유래된 골수(BM) 세포로 재증식시켰다. 그 결과 4개의 그룹이 생성되었다: (1) WT BM(WT-WT)를 갖는 WT, (2) MPO-KO BM을 갖는 WT(WT-MPO KO), (3) WT BM을 갖는 SuHx 래트(SuHx-WT) 및 (4) MPO-KO BM을 갖는 SuHx 래트(SuHx -MPO KO). 병행 실험에서, MPO-KO BM의 효과를 본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 조작된 미분화 MPO-KO BM 세포를 사용하여 이 래트 PHA 모델에서 평가하였다.
미분화 MPO-KO BM 세포가 PHA에 미치는 영향을 평가하기 위해, 위에 명시된 4개의 실험군에서 다형핵 호중구(PMN)의 활성화 및 탈과립을 결정하였다. 또한, 폐동맥압(PA 압력)과 RVSP를 결정하고, 폐 조직 내 염증-관련 유전자의 mRNA도 또한 모든 실험군의 래트의 폐 균질물에서 정량화하였다.
폐 혈관 구조에 대한 혈관 수축 효과에 대한 MPO KO의 효과를 또한 각 실험군에서 얻은 분리된 폐동맥(PA) 세그먼트를 프로스타글란딘 F2α(PGF2α)에 노출시켜 테스트하였다. PAH에서 MPO-의존적 혈관 수축의 역할은 우심실 압력-체적 루프에서 효과적인 동맥 탄성(Ea)을 평가함으로써 더 조사하였다. 유효 Ea는 확립된 심실 후부하(afterload) 매개변수를 나타내므로, 혈관 저항성 및 순응도를 반영한다.
4개의 실험군 모두에서 폐동맥의 증가된 혈관 근육화의 존재를 비교하기 위해 면역 조직 화학적 연구를 수행하였다.
실시예 8
초승달 사구체 신염(CGN)의 치료에서 MPO 넉-아웃
추가적인 MPO-관련 병태에 대한 잠재적 요법으로서 제안된 MPO KO 미분화 골수 세포의 적용 가능성을 평가하기 위해, 다음으로 래트에서 MPO KO의 효과를 신장 기능의 급격한 상실을 의미하는 증후군인 초승달 사구체 신염(CGN)에 대해 조사하였다. 특히, 인간 MPO-ANCA로 사전 면역화되고 이후에 리소솜 추출물과 H2O2로 관류되는 래트는 GCN가 발생하는 것으로 알려져 있다. 인간 MPO-ANCA로 사전 면역화하면 IgG 및 C3 침착이 발생하고, IgG 면역 침착의 양에 비례하는 조직학적 사구체 손상이 관찰될 수 있다.
보다 구체적으로, 사전 면역화된 래트를 골수 절제 방사선 조사에 노출시켜 조혈 절제를 한 다음 MPO-KO 또는 WT 래트로부터 유래된 골수(BM) 세포로 재증식시켰다. 그 결과 4개의 실험군이 생성되었다: (1) WT BM(WT-WT)를 갖는 WT, (2) MPO-KO BM을 갖는 WT(WT-MPO KO), (3) WT BM으로 사전 면역화된 래트(Preimm-WT) 및 (4) MPO-KO BM으로 사전 면역화된 래트(Preimm-MPO KO). 병행 실험에서, MPO-KO BM의 효과를 본 발명의 유전자 편집 시스템을 사용하여 조작된 미분화 MPO-KO BM 세포를 사용하여 이 래트 CGN 모델에서 평가하였다.
CGN에 대한 미분화 MPO-KO BM 세포의 효과를 평가하기 위해, 위에 명시된 4개의 실험군에서 래트의 신장을 절제하고, IgG와 C3 침착 및 조직학적 사구체 손상을 검사하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Lempo Therapeutics Ltd <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING MYELOPEROXIDASE (MPO) EXPRESSION <130> WO2020/008466 <140> PCT/IL2019/050745 <141> 2019-07-04 <150> IL260445 <151> 2018-07-05 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11080 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Accession Number: NC_000017.11>NC_000017.11:c58280935-58269856 Homo sapiens chromosome 17, GRCh38.p12 Primary Assembly <400> 1 gacaatatca ggtgagctgt ggaggtgggg tccttggaag ctggatgaca gcagctggca 60 aggggataag agagcagtga gcccctccct caaggaggtc tggctttatc catagacagg 120 gccctctgag gtggggctga ggtacaaagg gggattgagc agcccaggag aagagagatg 180 ggggttccct tcttctcttc tctcagatgc atggtggact taggaccttg ctgggctggg 240 ggtctcactg cagagatgaa gctgcttctg gccctagcag ggctcctggc cattctggcc 300 acgccccagc cctctgaagg tgctgctcca ggtaacagtt cccaaggtgg gagaagatgg 360 tgtgttgggg tggttgtgtt ccagagaccc cttttctcag agcaggcctt cctagctctg 420 gggcctgata gggggttggg gcccattcct gactttgtga 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agttcagtgt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C319 T7 Rv primer <400> 39 ccacagcgtt ctctgtcctt 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H502 T7 Fw primer <400> 40 atgcctctca gtgccactct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H502 T7 Rv primer <400> 41 agccaggtca ggggaagtat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C319 gRNA <400> 42 ggatggtgat gttgctcccg 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T173 protospacer <400> 43 tgcacatccc ggtgatggtg cgg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D260 protospacer <400> 44 caggggtgaa gtcgaggtcg tgg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H502 protospacer <400> 45 ggatgagggt gtggccgtag cgg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C319 protospacer <400> 46 ggatggtgat gttgctcccg ggg 23 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C167A-1 gRNA <400> 47 ggacgtgggg gtgacttgcc 20 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C167A Before and after cut <400> 48 caggacgtgg gggtgacttg cccggagcag gacaaa 36 <210> 49 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template ssODN oligo for C167A <400> 49 gttgtccaag tcaagcggct gcgcctacca ggacgtgggg gtgactgccc ctgagcagga 60 caaataccgc accatcaccg ggatgtgcaa caacaggtgc ggc 103 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C180A-1 gRNA <400> 50 tcaccgggat gtgcaacaac 20 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C180A-1 Before and after cut <400> 51 accatcaccg ggatgtgcaa caacaggtgc ggctggctg 39 <210> 52 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template ssODN oligo for C180A <400> 52 cttgcccgga gcaggacaaa taccgcacca tcaccgggat ggccaacaac agctgcggct 60 ggctgggggt ggctgcagga accgggctca gagaggcgtc ccg 103 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y173C -1 Before and after cut <400> 53 tgcccggagc aggacaaata ccgcaccatc accggg 36 <210> 54 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template ssODN oligo for Y173C <400> 54 ggctgcgcct accaggacgt gggggtgact tgcccggagc aggacaaatg tcgcaccatc 60 accgggatgt gcaacaacag gtgcggctgg ctgggggtgg ctg 103 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA Q257A-1 <400> 55 catgcaatgg ggccagctgt 20 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q257A -1 Before and after cut <400> 56 catgttcatg caatggggcc agctgttgga ccacga 36 <210> 57 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for Q257A <400> 57 gactccggac caggagcgct cactcatgtt catgcaatgg ggcgcgctgt ttgaccacga 60 cctcgacttc acccctgagc cggccgcccg ggcctccttc gtc 103 <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D260A-1 Before and after cut <400> 58 gcaatggggc cagctgttgg accacgacct cgacttcacc cct 43 <210> 59 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for D260A <400> 59 ccggaccagg agcgctcact catgttcatg caatggggcc agctgttggc acacgacctc 60 gacttcaccc ctgagccggc cgcccgggcc tccttcgtca ctg 103 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA M409A -1 <400> 60 ggtgagctcg ggcatctcac 20 <210> 61 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M409A -1 Before and after cut <400> 61 aggggacacc cgttccagtg agatgcccga gctcacctcc a 41 <210> 62 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for M409A <400> 62 gaggccttaa gaatgacagt ggcttttgcc tccccaaggg gacacccgtt acagtgaggc 60 gcccgagctc acctccatgc acaccctctt acttcgggag cac 103 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA E408A -1 <400> 63 ggtgagctcg ggcatctcac 20 <210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E408A -1 Before and after cut <400> 64 aggggacacc cgttccagtg agatgcccga gctcacctcc a 41 <210> 65 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for E408A <400> 65 gaggccttaa gaatgacagt ggcttttgcc tccccaaggg gacacccgtt acagtgcgat 60 gcccgagctc acctccatgc acaccctctt acttcgggag cac 103 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA H261A -1 <400> 66 caggggtgaa gtcgaggtcg 20 <210> 67 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H261A -1 Before and after cut <400> 67 gcagcgcagc agggaccacg acctcccagg tgaggggct 39 <210> 68 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for H261A <400> 68 atgaggattg ggctggacct gcctgctctg aacatgcagc gcagcaggga cgccgacctc 60 ccaggtgagg ggctgcagga gtctcccctg atgctcacct cccc 104 <210> 69 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C319A -1 Before and after cut <400> 69 cctggcccag atctcattgc cccggatcat ctgcgacaa 39 <210> 70 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for C319A <400> 70 gggtgtgttc agcatgcagc agcgacaggc cctggcccag atctcatgcc accggatcat 60 ctgcgacaac acaggcatca ccaccgtgtc taagaacaac at 102 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA M251A -1 <400> 71 gctcactcat gttcatgcaa 20 <210> 72 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M251A Before and after cut <400> 72 gagcgctcac tcatgttcat gcaatggggc cagctgttg 39 <210> 73 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for M251A <400> 73 ccactgatca gctgactccg gaccaggagc gctcactcac gttcatgcaa tgtggccagc 60 tgttggacca cgacctcgac ttcacccctg agccggccgc ccg 103 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA R569W -1 <400> 74 aattgcagtg gatgagatcc 20 <210> 75 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R569W -1 Before and after cut <400> 75 gcagtggatg agatccggga gcgattgttt gagcagg 37 <210> 76 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for R569W <400> 76 cacccctgcc aagctgaatc gtcagaacca aattgcagtg gatgagatct gagagcgatt 60 gtttgagcag gtcatgagga ttgggctgga cctgcctgct ctg 103 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA R499C-1 <400> 77 ttcaccaatg ccttccgcta 20 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R499C-1 Before and after cut <400> 78 accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atc 33 <210> 79 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for R499C <400> 79 gactcagtgg acccacgcat cgccaacgtc ttcaccaatg ccttctgcta ccgccacacc 60 ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctggac aatcggtacc agc 103 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA G501S-1 <400> 80 ttcaccaatg ccttccgcta 20 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G501S-1 Before and after cut <400> 81 accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atc 33 <210> 82 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for G501S <400> 82 gactcagtgg acccacgcat cgccaacgtc ttcaccaatg ccttccgcta cagccacacc 60 ctcatccaac ccttcatgtt ccgcctggac aatcggtacc agcc 104 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H502A-1 Before and after cut <400> 83 accaatgcct tccgctacgg ccacaccctc atcca 35 <210> 84 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for H502A <400> 84 tacaatgact cagtggaccc acgcatcgcc aacgtcttca ccaatgcctt acgctacggc 60 gccaccctca tccaaccctt catgttccgc ctggacaatc ggt 103 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA C158A-1 <400> 85 gtcaagcggc tgcgcctacc 20 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C158A-1 Before and after cut <400> 86 gtccaagtca agcggctgcg cctaccagga cgtgggg 37 <210> 87 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for C158A <400> 87 gacgcccgcc cagctgaatg tgttgtccaa gtcaagcggc gccgcctacc atgacgtggg 60 ggtgacttgc ccggagcagg acaaataccg caccatcacc ggg 103 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA N355A-1 <400> 88 gctggttgga catgttgcgc 20 <210> 89 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N355A-1 Before and after cut <400> 89 ccctggccag gaacctgcgc aacatgtcca accagctg 38 <210> 90 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for N355A <400> 90 ttcgtggacg ccagcatggt gtacggcagc gaggagcccc tggccaggaa tctgcgcgcc 60 atgtccaacc agctggggct gctggccgtc aaccagcgct tcc 103 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA R128A-1 <400> 91 tggctctaga cctgctggag 20 <210> 92 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R128A-1Before and after cut <400> 92 tagacctgct ggagaggaag ctgcggtccc tg 32 <210> 93 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template ssODN oligo for R128A <400> 93 cggcggtgag ggccgctgac tacctgcacg tggctctaga cctgctggag gcgaagctgc 60 ggtccctgtg gcgaaggcca ttcaatgtca ctgatgtgct gac 103 <210> 94 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C167A-1 protospacer <400> 94 ggacgtgggg gtgacttgcc cgg 23 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C180A-1 protospacer <400> 95 tcaccgggat gtgcaacaac agg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Q257A -1 protospacer <400> 96 catgcaatgg ggccagctgt tgg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M409A -1 protospacer <400> 97 ggtgagctcg ggcatctcac tgg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E408A -1 protospacer <400> 98 ggtgagctcg ggcatctcac tgg 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H261A -1 protospacer <400> 99 caggggtgaa gtcgaggtcg tgg 23 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M251A -1 protospacer <400> 100 gctcactcat gttcatgcaa tgg 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R569W -1 protospacer <400> 101 aattgcagtg gatgagatcc ggg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R499C-1 protospacer <400> 102 ttcaccaatg ccttccgcta cgg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G501S-1 protospacer <400> 103 ttcaccaatg ccttccgcta cgg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C158A-1 protospacer <400> 104 gtcaagcggc tgcgcctacc agg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 355A-1 protospacer <400> 105 gctggttgga catgttgcgc agg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R128A-1 protospacer <400> 106 tggctctaga cctgctggag agg 23

Claims (45)

  1. 포유동물 대상체에서 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase: MPO)의 발현 및/또는 활성을 조절하는 방법으로서,
    유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 골수(BM) 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및
    (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포는 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC) 또는 전구 세포인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 프로그램 가능한 조작된 뉴클레아제(programmable engineered nuclease: PEN), 상기 PEN을 암호화하는 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자, 상기 적어도 하나의 PEN 또는 상기 PEN을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEN은 적어도 하나의 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat: CRISPR)/CRISPR 연관(cas) 단백질 시스템을 포함하고, 상기 방법은 유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및
    (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열; 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 서열번호 42, 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 60, 서열번호 63, 서열번호 66, 서열번호 71, 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 80, 서열번호 85, 서열번호 88 및 서열번호 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 자가 또는 동종 공급원의 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 MPO의 저해 또는 제거된 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 대상체의 BM 세포 집단인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하는 것은 상기 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 저해 또는 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법으로서,
    치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및
    (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 자가 또는 동종 공급원의 것인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 MPO의 저해 또는 제거된 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 대상체의 BM 세포 집단인, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 PEN, 상기 PEN을 암호화하는 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자, 상기 적어도 하나의 PEN 또는 상기 PEN을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 PEN은 적어도 하나의 CRISPR/Cas 시스템을 포함하며, 상기 방법은 유효량의 다음 중 하나를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 적어도 하나의 Cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리펩타이드; 및
    (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열;
    또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
  16. 제10항 내지 제15항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 42, 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 60, 서열번호 63, 서열번호 66, 서열번호 71, 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 80, 서열번호 85, 서열번호 88 및 서열번호 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MPO-관련 병태는 신경퇴행성 장애, 면역-관련 장애, 호흡기 장애, 증식성 장애, 혈관 장애 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 중 어느 하나인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 면역-관련 장애는 자가면역 장애 및 염증성 장애 중 적어도 하나인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 자가면역 장애는 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS), 항-호중구 세포질 항체(Anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA)-관련 장애, 및 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus: SLE) 중 어느 하나인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 염증성 질환은 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis: RA) 중 어느 하나인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 호흡기 장애는 폐동백 고혈압(Pulmonary arterial hypertension: PAH)인, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 증식성 장애는 암인, 방법.
  24. 약제학적 조성물로서, 치료적 유효량의
    (a) 약제학적 조성물을 필요로 하는 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및
    (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단
    중 적어도 하나를 포함하되; 상기 조성물은 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체(들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들) 중 적어도 하나를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 CRISPR/cas 시스템을 포함하는 적어도 하나의 PEN을 포함하며, 상기 CRISPR/cas 시스템은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 약제학적 조성물:
    (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및
    (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열; 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 서열번호 42, 서열번호 47, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 60, 서열번호 63, 서열번호 66, 서열번호 71, 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 80, 서열번호 85, 서열번호 88 및 서열번호 91 중 어느 하나로 표시되는 핵산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단인, 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 자가 또는 동종 공급원의 것인, 약제학적 조성물.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 MPO의 저해 또는 제거된 발현 및/또는 활성을 나타내는 동종이계 대상체의 BM 세포 집단인, 약제학적 조성물.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체에서 MPO 관련 병태 또는 질환의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연하기 위한 방법에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 MPO-관련 병태는 신경퇴행성 장애, 면역-관련 장애, 호흡기 장애 증식성 장애, 혈관 장애 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인, 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 AD 및 PD 중 어느 하나인, 약제학적 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 면역-관련 장애는 자가면역 장애 및 염증성 장애 중 적어도 하나인, 약제학적 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 자가면역 장애는 MS, ANCA-관련 장애 및 SLE 중 어느 하나인, 약제학적 조성물.
  35. 제31항에 있어서, 상기 호흡기 장애는 PAH인, 약제학적 조성물.
  36. 제31항에 있어서, 상기 증식성 장애는 암인, 약제학적 조성물.
  37. 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 적어도 하나의 미분화 BM 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포는 MPO-관련 병태를 앓고 있는 대상체로부터의 것인, 세포.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 포유동물 대상체에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 방법에 사용하기 위한, 세포.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한, 세포.
  41. 포유동물 대상체에서 MPO-관련 병태의 발병을 치료, 예방, 개선, 저해 또는 지연시키는 방법에 사용하기 위한, 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나:
    (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및
    (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
  42. 제41항에 있어서, 상기 미분화 BM 세포 집단은 상기 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 적어도 하나의 유전자 편집 화합물로 형질도입 또는 형질감염된 BM 세포 집단인, 치료적 유효량의 (a)의 적어도 하나의 유전자 편집 화합물 및 (b)의 미분화 BM 세포 집단 중 적어도 하나.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 CRISPR/cas 시스템을 포함하는 적어도 하나의 PEN이며, 상기 CRISPR/cas 시스템은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 치료적 유효량의 (a)의 적어도 하나의 유전자 편집 화합물 및 (b)의 미분화 BM 세포 집단 중 적어도 하나:
    (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및
    (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열; 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
  44. 포유동물 대상체에서 네토시스(NETosi) 및 관련 병태를 저해하는 방법으로서, 치료적 유효량의 다음 중 적어도 하나를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 대상체의 적어도 하나의 미분화 BM 세포에서 MPO의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위해 적합화된 적어도 하나의 유전자 편집 화합물; 및
    (b) MPO의 조절된 발현 및/또는 활성을 나타내는 미분화 BM 세포 집단.
  45. 제44항에 있어서, 상기 유전자 편집 화합물은 적어도 하나의 CRISPR/cas 시스템을 포함하는 적어도 하나의 PEN이며, 상기 CRISPR/cas 시스템은 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 방법:
    (a) 적어도 하나의 CRISPR/cas 단백질 또는 상기 Cas 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 분자; 및
    (b) MPO 유전자 내의 프로토스페이서를 표적으로 하는 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열 또는 상기 gRNA를 암호화하는 임의의 핵산 서열; 또는 (a) 및 (b) 중 적어도 하나를 포함하는 임의의 키트, 조성물 또는 비히클.
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