CN112638405A - 用于治疗神经退行性疾病的对rip激酶的抑制 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含RIPK2抑制剂的组合物和使用RIPK2抑制剂治疗或预防神经退行性疾病或障碍的方法。本文还提供了筛选或鉴定用于治疗或预防神经退行性疾病或障碍的治疗剂的方法。

Description

用于治疗神经退行性疾病的对RIP激酶的抑制
关于联邦赞助的研究和开发的声明
美国政府在本发明中具有援助许可，并且在有限的情况下有权要求专利拥有者按照美国国立卫生研究院授予的R01NS107404的条款，以合理的条款对他人进行许可。
在本发明开发过程中进行的部分工作利用了美国政府的资金。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明的实施方案涉及受体相互作用蛋白(RIP)激酶，用于预防和治疗神经退行性疾病。
背景技术
神经系统分成两部分：包括脑和脊髓的中枢神经系统(CNS)，以及包括脑和脊髓外部的神经和神经节的周围神经系统。尽管周围神经系统能够修复和再生，但CNS无法自我修复和再生。
神经变性是指神经元的功能或结构的逐渐丧失。神经退行性疾病，诸如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)、痴呆和亨廷顿病，是神经退行性过程的结果，并影响全世界数百万人，所述神经退行性疾病。这些年龄相关的对CNS的损害会导致神经元结构和功能的逐步恶化、轴突丧失、中断的神经元连接，并最终导致永久性失明、瘫痪以及认知、运动和感觉功能的其他丧失。治疗方法在目前是非常有限的。
发明概述
在各种实施方案中，本发明至少部分是基于对中枢神经系统具有神经保护和疾病改变作用的RIPK2抑制剂的开发和使用。
本发明的实施方案特别涉及通过抑制RIP激酶2(RIPK2)和任选其他RIP激酶来预防和治疗神经退行性疾病或障碍的组合物。本发明的实施方案还涉及治疗神经退行性疾病或障碍的方法，包括将至少一种RIPK2抑制剂给药于受试者。
在某些实施方案中，本发明提供了预防或治疗神经退行性疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将治疗有效量的至少一种RIPK2抑制剂或包含至少一种RIPK2抑制剂的药物组合物给药于需要的受试者。
在某些实施方案中，至少一种RIPK2抑制剂抑制RIPK2的活性和/或表达。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂的选择性优于其他RIP激酶，如RIPK1和/或RIPK3，例如，具有约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或更高的选择性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂基本上没有针对其他RIP激酶的活性。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂也可以是双重或多重RIP激酶抑制剂，或泛(pan)-RIP激酶抑制剂。
在一些实施方案中，本发明公开内容至少部分是基于用于阻断或逆转小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成的组合物和方法的鉴定，以阻止一连串神经炎症和神经毒性途径的触发，小胶质细胞和反应性星形胶质细胞是神经退行性疾病进展中涉及的关键细胞。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了借助靶向脑中超表达且磷酸化的RIPK2，通过阻断神经胶质过多症(小胶质细胞和/或星形胶质细胞的激活)以及从激活的小胶质细胞和/或反应性星形胶质细胞释放毒性分子，来保护神经细胞的方法。
各种RIPK2抑制剂适用于本文的组合物和方法。在某些实施方案中，RIPK2抑制剂可以包括小分子、siRNA、shRNA、微RNA、抗体、适体、DNA酶、酶、基因编辑系统、激素、无机化合物、寡核苷酸、有机化合物、多核苷酸、肽、核糖酶(ribozyme)或合成的化合物。
在某些实施方案中，RIPK2抑制剂是多核苷酸分子。根据某些实施方案，多核苷酸分子是能够与编码或控制RIPK2表达的核酸杂交的核酸序列或分子。在本发明的情况中合适的示例性核酸序列包括，但不限于，RNA抑制(RNAi)分子、反义分子和核糖酶。每种可能性表示本发明的单独的实施方案。如本文使用的，术语RNAi描述能够通过结合靶基因转录物中的互补位点来引起翻译抑制或转录物降解从而调控靶基因表达的短RNA序列。
在一些实施方案中，与合适的对照相比，RIPK2基因表达下调至少25％，至少50％，至少70％，至少80％，或至少90％。在特定的其他实施方案中，部分下调是优选的。如本文详述的，用于表达抑制(下调或沉默)寡核苷酸的实例是反义分子、RNA干扰分子(RNAi)和酶性核酸(enzymatic nucleic acid)分子。
在某些实施方案中，RIPK2抑制剂是能够抑制RIPK2蛋白活性的小分子。根据本发明的教导可以使用已知具有这样活性的任何小分子。根据更多典型的实施方案，可以将小分子配制在药物组合物中。根据某些实施方案，小分子能够通过血脑屏障(BBB)，或将其配制成穿过BBB。存在几种通过BBB递送化合物的方式，如例如在美国专利号No.8,629,114、8,497,246和7,981,864中公开的。例如，RIPK2抑制剂化合物可以与BBB转移化合物融合或缀合，如本领域中所述的。
在某些实施方案中，RIPK2抑制剂选择性地抑制以下活性中的一种或多种：NF-κB的NOD1依赖性激活、NF-κB的NOD2依赖性激活、淀粉样蛋白-β聚集物诱导的小胶质细胞激活、α-突触核蛋白聚集物诱发的小胶质细胞激活和/或A1星形胶质细胞形成。
在某些实施方案中，通过抑制RIPK2活性，与合适的对照相比，将受试者中的TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、C1q和/或激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞的水平降低、维持或恢复至正常水平。
在某些实施方案中，通过抑制RIPK2活性，与合适的对照相比，将受试者中的脑蛋白如α-突触核蛋白(路易体)、淀粉样斑块和/或tau的异常沉积水平降低、维持或恢复至正常水平。
在某些实施方案中，通过抑制RIPK2活性，与合适的对照相比，治疗减轻了或恢复了受试者的运动障碍、改善了记忆功能和/或延长了寿命。
在某些实施方案中，本文所述的方法进一步包括将有效量的至少一种其他治疗活性化合物给药于受试者，例如，其他抗帕金森病或抗阿尔茨海默氏病的药剂。在一些实施方案中，其他治疗活性化合物也可以是其他RIP激酶(诸如RIPK1、RIPK3、RIPK4或RIPK5)的抑制剂。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂也可以是给药于受试者用于各种疾病或障碍的唯一活性化合物。
在各种实施方案中，将RIPK2抑制剂和/或其他治疗活性化合物通过静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼内、肌内、颊、直肠、阴道、眶内、脑内、皮内、颅内、脊髓内、脑室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、经粘膜、经皮、吸入或其任意组合来给药。在某些实施方案中，将RIPK2抑制剂通过口服或胃肠外给药。
各种神经退行性疾病或障碍适于通过本文的方法来治疗。在某些实施方案中，神经退行性疾病或障碍可以包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)、帕金森病、多发性硬化、糖尿病性神经病、聚谷氨酰胺(多Q)病、卒中、法尔病、门可氏病、威尔逊氏病、脑缺血、朊粒病、痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性轻瘫、脊髓小脑萎缩、脑损伤或脊髓损伤。
在某些实施方案中，本发明公开内容还提供了鉴定用于神经退行性疾病或障碍的治疗剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将表达RIPK2的细胞或组织接触候选治疗剂；测定RIPK2活性或表达；和测量与对照相比的RIPK2表达或活性的抑制。在一些实施方案中，所述方法包括在候选治疗剂的存在下，将CNS驻留固有免疫细胞(例如，小胶质细胞和/或星形胶质细胞)与诱导免疫细胞的激活(例如，异常聚集的蛋白)的试剂接触；测量候选治疗剂存在下的CNS驻留固有免疫细胞的激活；和鉴定与对照相比抑制CNS驻留固有免疫细胞激活的治疗剂。在一些实施方案中，候选治疗剂是RIPK2抑制剂。
在某些实施方案中，本发明公开内容提供了包含治疗有效量的一种或多种如本文所述的RIPK2抑制剂的药物组合物。
在其他实施方案中，本发明公开内容提供了用于治疗神经退行性疾病或障碍的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物包含至少一种RIPK2抑制剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括至少一种其他的治疗活性化合物(例如，如本文所述的)。
下文描述其他方面。
附图/图简述
本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。在需要并且支付必要的费用时将由专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A-1H呈现与人PD死后组织中的RIPK2表达相关的图和图片。图1A呈现显示了PD死后组织中的小胶质细胞激活的图片。图1B呈现显示了PD死后组织中的p-RIPK2激活的图。将p-RIPK2阳性信号定量并表示为图1B中的条形图。图1C显示了具有抗-p-RIPK2(绿色)和小胶质细胞标志物抗-cd-11b(红色)的代表性共聚焦图像。图1D呈现了显示了人死后组织的SNpc区中的Nod2和Ripk2的mRNA表达水平的条形图。图1E显示了通过western印迹评估的人死后的SNpc中的NOD2、p-RIPK2和RIPK2表达水平。将NOD2表达水平定量并表示为图1F中的条形图。将p-RIPK2和RIPK2表达水平定量并表示为图1G中的条形图。图1H呈现显示了邻近连接试验结果的图片，其显示了人PD死后组织的SNpc中的NOD2和α-突触核蛋白聚集物之间的相互作用。
图2呈现显示了用α-突触核蛋白PFF激活3小时的小鼠原代小胶质细胞的RIPK2、NOD1和NOD2表达的条形图。通过实时PCR测量了RIPK2、NOD1和NOD2的基因表达。
图3A-3C是显示使用实时RT-PCR测量的PFF诱导的小胶质细胞中的A1反应性星形胶质细胞诱导因子(如C1q、TNFα和IL-1α)的mRNA水平的条形图。图3D显示了接受从PFF诱导的WT、NOD2-/-和RIPK2-/-原代培养的小胶质细胞纯化的小胶质细胞条件培养基(MCM)处理后24小时的原代培养的星形胶质细胞中测量的PAN-反应性、A1-特异性和A2-特异性转录物的水平。图3E和3F是显示了接受MCM激活的星形胶质细胞条件培养基(ACM)处理的原代培养的小鼠皮质神经元的细胞毒性的条形图，使用AlamarBlue和LDH试验测量。值是三个独立实验的平均数±S.E.M.(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图4A和4B呈现了显微照片和条形图，其显示了α-突触核蛋白PFF处理12hr后来自野生型(WT)、NOD2敲除(NOD2-/-)和RIPK2敲除(RIPK2-/-)小鼠的原代培养的小胶质细胞的形态相关(n＝3，每组)。图4C、4D和4E呈现显示了使用实时RT-PCR测量的IL-1β、iNOS和趋化因子Cxc11的mRNA表达的条形图。图4F显示了迁移试验的示意图。将原代培养的小胶质细胞在培养皿的上室和底部铺板。图4G呈现显示了12小时α-突触核蛋白PFF处理后的结果的图像，室底侧的迁移细胞被Iba-1抗体染色。图4H呈现了条形图，其显示了通过Iba-1阳性PFF诱发的迁移的小胶质细胞相对于PBS对照的数量之间的比例计算的迁移指数(n＝3，每组)。值是三个独立实验的平均数±S.E.M.(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图5A-5C呈现了条形图，其显示了使用实时RT-PCR测量的PFF诱导的小胶质细胞中的A1反应性星形胶质细胞诱导因子(如C1q、TNFα和IL-1α)的mRNA水平。图5D显示了使用RIPK2抑制剂吉非替尼和GSK583的，接受从PFF诱导的原代小胶质细胞纯化的α-突触核蛋白PFF激活的小胶质细胞条件培养基(MCM)处理后24小时的原代培养的星形胶质细胞中测量的PAN-反应性、A1-特异性和A2-特异性转录物的水平。图5E和5F呈现了条形图，其显示了使用AlamarBlue和LDH试验测量的MCM激活的ACM处理的原代培养的小鼠皮质神经元的细胞毒性。值是三个独立实验的平均数±S.E.M.(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图6A和6B呈现了图片和条形图，其显示了注射PFF的野生型(WT)、NOD2敲除(NOD2-/-)和RIPK2敲除(RIPK2-/-)小鼠的腹侧中脑组织，用pS129-α-突触核蛋白或抗-Iba-1抗体染色并定量。
图7A-7C呈现了条形图，其显示了通过免疫淘选法使用从WT、RIPK2敲除和NOD2敲除小鼠纯化的小胶质细胞测量的A1反应性星形胶质细胞诱导因子(如C1q、TNFα和IL-1α)的mRNA水平。通过实时RT-PCR测量了mRNA水平并表示为条形图。图7D显示了通过免疫淘选法在从腹侧中脑区纯化的星形胶质细胞中测量的PAN-反应性、A1-特异性和A2-特异性转录物的mRNA水平。图7E显示了腹侧中脑中的Iba-1、GFAP和β-肌动蛋白的代表性免疫印迹。图7F和7G呈现了条形图，其显示了归一化至β-肌动蛋白的Iba-1、GFAP蛋白水平的定量。误差条表示平均数±S.E.M.，每组n＝4只小鼠。将One-way ANOVA用于统计学分析，接着使用post-hoc Bonferroni检验，用于多组比较。*P<0.05，***P<0.001vs.PBS立体定向注射载体的小鼠或α突出核蛋白PFF立体定向注射载体的小鼠。n.s.：不显著。
图8A显示了针对TH免疫反应性染色的纹状体切片的代表性显微照片。纹状体中TH纤维密度的高倍视野(下图)。比例尺分别代表100μm(上图)和50μm(下图)。图8B呈现了条形图，其显示了通过使用Image J软件对纹状体中的多巴胺能纤维密度进行定量。图8C显示了来自接受纹状体内注射PBS和α-突触核蛋白PFF的小鼠中的含有TH阳性神经元的冠状中脑切片的代表性显微照片，使用立体定位仪。比例尺代表500μm。图8D显示了腹侧中脑中TH、DAT和β-肌动蛋白的代表性免疫印迹。图8E呈现显示了TH的立体计数的条形图，并且图8E呈现显示了SNpc区中Nissl-阳性神经元的条形图。在SNpc区中进行了无偏态的立体计数。误差条表示平均值±S.E.M，每组n＝5只小鼠。图8G和8H呈现了条形图，其显示了标准化至β-肌动蛋白的TH和DAT蛋白水平的定量。误差条表示平均数±S.E.M.，每组n＝4只小鼠。PBS或α-syn PFF立体定向纹状体内注射后六个月，进行了行为测试。小鼠标杆(图8I)和握力(图8J)测试的结果。误差条表示平均数±S.E.M.(n＝12-16)。将One-way ANOVA用于统计学分析，接着使用post-hoc Bonferroni检验，用于多组比较。**P<0.01，***P<0.001vs.PBS立体定向注射载体的小鼠或α突触核蛋白PFF立体定向注射载体的小鼠。爬下标杆的最大时间限制为60秒。
图9A和9B显示了使用RIPK2抑制剂吉非替尼的注射PFF的动物的腹侧中脑组织的图像，用pS129-α-突触核蛋白或抗Iba-1抗体染色并定量。
图10A显示了用抗p-RIPK2抗体通过免疫组织化学评估AD死后的人海马区中的p-RIPK2表达(箭头表示p-RIPK2阳性信号)。图10B呈现了条形图，其显示了通过ImageJ测量的海马CA1区中的p-RIPK2信号的密度(n＝3，每组)。
图11显示了代表性的western印迹，显示了Aβ-激活的BV-2小胶质细胞中的p-RIPK2表达和NOD2的结合。
图12A显示了行为实验程序。给小鼠注射AβO1-42(总共5μmol，双侧i.c.v.)，然后进行莫里斯水迷宫测试(MWMT)。图12B和12C呈现了条形图，其分别显示了莫里斯水迷宫测试中的逃避潜伏时间和探索试验阶段的数据。图12D和12E呈现了条形图，其分别显示了MWMT探索试验阶段中的总移动距离和游泳速度的数据。探索实验阶段进行了60sec。图12F显示了在探索实验第5天MWMT中每个组的小鼠的代表性游泳路径。然后每天对小鼠进行两次试验，连续四天，试验间隔为15min，并记录逃避潜伏期。针对每个试验阶段和每只小鼠，对该参数取平均值。误差条表示平均数±S.E.M.。通过one-way ANOVA，接着使用用于多组比较的post-hoc Bonferroni检验分析所有行为测试。每组n＝9-13。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001vs.PBS立体定向注射载体的小鼠或AβO1-42立体定向i.c.v.注射载体的小鼠。n.s.：不显著。
发明详述
定义
本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的并不是旨在限制本发明。
如本文所使用的，单数形式“一(a)”，“一个(an)”和“该(the)”意在也包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就详述和/或权利要求中使用术语“包括(including)”，“包括(includes)”，“具有(having)”，“具有(has)”，“有(with)”或其变体的程度而言，这些术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式是包含式的。
术语“约”或“大约”意思是对于特定值，在可接受的误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于如何测量或测定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准偏差之内。可替换地，“大约”可以表示给定值或范围的高达20％，高达10％，高达5％或高达1％的范围。可替换地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示数值的5倍内的数量级内，也可以是数值的2倍内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应认为术语“约”表示该特定值在可接受的误差范围内。
如本文使用的，短语化合物的“给药”、“给药”化合物或其其他变体表示将化合物或化合物的前药提供给需要治疗的受试者。
“反义寡核苷酸”或“反义化合物”表示结合另一个RNA或DNA(靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一个RNA靶标并且改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可以上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义旨在包括从治疗、诊断或其他观点看有用的任何外来RNA或DNA分子。这样的分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶RNA、短发夹RNA(shRNA)、治疗性编辑RNA以及激动和拮抗RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部向导序列(EGS)寡核苷酸、替代剪接子、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡聚化合物。因此，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能来引起功能和/或活性的调节时，则反义化合物是“特异性地可杂交的”，并且存在足够程度的互补性，以在其中期望特异性结合的条件下，即，在体内试验或治疗性处理的情况中，在生理条件下，以及就体外试验而言在其中进行试验的条件下，避免反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。
共同给药的活性剂可以同时或按序给药于个体。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”，“包含(comprise)”或“包含(comprised)”及其变体，涉及到项目、组合物、装置、方法、过程、系统等的定义或描述的元素，是包含性的或开放式的，允许使用其他元素，由此表示所定义或描述的项目、组合物、设备、方法、过程、系统等包括那些指定的元素-或在合适的情况下包括其等同物-并且其他元素也可以包括在内并且仍落入所限定的项目、组合物、设备、方法、过程，系统等的范围/定义内。
术语“对照”是指适于与测试样品中的表达产物进行比较的任何参考标准。在一些实施方案中，对照包括获得“对照样品”，从中检测表达产物水平并将其与测试样品的表达产物水平进行比较。这样的对照样品可以包括任何合适的样品，包括但不限于来自具有已知结局的患有特定神经退行性疾病或障碍的对照患者的样品(可以是储存的样品或之前的样品测量)；从受试者诸如正常患者或患有特定神经退行性疾病或障碍的患者分离的正常组织或细胞，从受试者诸如正常受试者或患有特定神经退行性疾病或障碍的患者分离的培养的原代细胞/组织，获自患有特定神经退行性疾病或障碍的患者的相同器官或身体位置的邻近正常细胞/组织，从正常受试者分离的组织或细胞样品，或从保管处获得的原代细胞/组织。在其他实施方案中，对照可以包括来自任何合适来源的参考标准表达产物水平，包括但不限于管家基因、来自正常组织的表达产物水平范围(或其他之前分析的对照样品)、之前测定的来自一组患者的测试样品内的表达产物水平范围，或具有特定结局(例如，存活一年、两年、三年、四年等)的一组患者或正接受特定治疗(例如，针对患有特定神经退行性疾病或障碍的患者的标准护理治疗)的一组患者。本领域技术人员将理解这样的对照样品和参考标准表达产物水平可以组合使用作为本发明方法中的对照。在一些实施方案中，对照可以包括正常细胞/组织样品。在其他实施方案中，对照可以包括针对一组患者的表达水平，诸如患有特定神经退行性疾病或障碍的一组患者，诸如接受特定疗法的患有特定神经退行性疾病或障碍的一组患者，或针对相对于另一种结局具有一种结局的一组患者。在前一种情况中，可以将每位患者的特定表达产物水平，例如，RIPK2表达，可以指定为百分数位的表达水平，或表示为比参考标准表达水平的平均数或均值更高或更低。在其他实施方案中，对照可以包括正常细胞或来自用RIP激酶的抑制剂治疗的患者的细胞等。在其他实施方案中，对照可以还可以包括测量的值，例如，与相同群体中的管家基因的表达水平相比的群体中的RIP激酶基因的平均表达水平。这样的群体可以包括正常受试者、患有特定神经退行性疾病或障碍的未经历任何治疗(即，未治疗(treatment
Figure BDA0002956762510000121
))的患者，或患有特定神经退行性疾病或障碍的正接受标准护理治疗的患者。在其他实施方案中，对照包括表达产物水平的比例转化，包括但不限于测定测试样品中的两个基因的表达产物水平的比例并将其与参考标准中的相同的两个基因的任何合适的比例进行比较；测定测试样品中的两个或更多个基因的表达产物水平并测定任何合适的对照中的表达产物水平的差异；以及测定测试样品中的两个或更多个基因的表达产物水平，将其表达归一化至测试样品中的管家基因的表达，并与任何合适的对照进行比较。在一些实施方案中，对照包括对照样品，其是与测试样品相同的世系和/或类型。在其他实施方案中，对照可以包括一组患者样品内的或基于一组患者样品的归组为百分位数的表达产物，如患有特定神经退行性疾病或障碍的所有患者。在一些实施方案中，建立对照表达产物水平，其中将相对于例如特定百分位数更高或更低的表达产物水平用作预测结局的基础。在其他实施方案中，使用来自具有已知结局的患有特定神经退行性疾病或障碍的对照患者的表达产物水平建立了对照表达产物水平，并且将来自测试样品的表达产物水平与作为用于预测结局的基础的对照表达产物水平进行比较。如通过以下数据所显示的，本发明的方法不限于在比较测试样品与对照的表达产物水平中使用特定的分割点。
如本文使用的，“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”是在受试者中产生至少一种所期望的治疗作用的组合物(例如，治疗组合物或药剂)量，所述作用如预防或治疗靶病症或有益地减轻与病症相关的症状。
“哺乳动物”涵盖通常在医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和非人，如家养动物)。实例包括猫、犬、马、牛和人。
在本发明的内容中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物(mimetics)的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸”还包括天然和/或修饰的单体或连接的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯等。寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的常规模式(如Watson-Crick型碱基配对、Hoogsteen型或反向Hoogsteen型碱基配对等)特异性结合靶多核苷酸。
“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且描述包括其中事件或情况发生的情形和其中事件或情况未发生的情形。
如本说明书和所附权利要求中使用的，术语“或”通常以包括“和/或”的含义来使用，除非文中明确表示是其他含义。
术语“患者”、“受试者”和“个体”可以互换使用并且是指人或非人哺乳动物。这些术语包括哺乳动物，如人、灵长类、牲畜(例如牛、猪)、伴侣动物(例如犬科动物、猫科动物)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。
如本文使用的，术语“shRNA”是指具有茎-环结构的RNA物质，包括互补序列的第一和第二区，所述区的互补程度和方向足以使得在所述区之间发生碱基配对，所述第一和第二区通过环区连接，所述环由环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成。shRNA可以是Dicer酶的底物，并且Dicer切割的产物可以参与RNAi。shRNA可以源自编码shRNA的内源基因的转录，或可以源自引入载体(例如，质粒载体或病毒载体)上的细胞或生物体中的外源基因的转录。编码shRNA的外源基因可以使用本领域已知的其他方法(例如，脂转染、核转染等)另外引入细胞或生物体中。
“治疗性”的处理是施用于表现出病理征象的受试者的处理，出于削弱或消除那些征象的目的。
如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指消除、减轻或改善疾病或病症和/或与其相关的症状，例如减少患者经历疾病或病症的症状的频率。尽管没有排除，但治疗疾病或病症并不需要完全消除与其相关的疾病、病症或症状。如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等可以包括“预防性治疗”，其是指在没有但有重新产生疾病或病症或疾病或病症复发风险的或易于重新产生疾病或病症或疾病或病症复发的受试者中，降低重新产生疾病或病症或先前得到控制的疾病或病症的复发的可能性。术语“治疗(treat)”及同义词考虑到将治疗有效量的本文所述的化合物(例如本文所述的RIPK2抑制剂)给药于需要这种治疗的受试者。
术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibit)”或“抑制剂(inhibitor)”是指化合物降低、减缓、停止或防止特定生物过程的活性(例如，RIPK2相对于载体对照的活性)的能力。
如本文中使用的，短语“治疗有效量”是指足以或有效预防或治疗(延迟或防止发作，防止进展，抑制、降低或逆转)疾病或病症的含量，包括减轻这样的疾病的症状。
本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于适用于本文公开的组合物和方法的任何物种的同源物。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。将理解公开了来自特定物种的基因或基因产物时，本公开内容仅意图是示例性的，并且不应解释为限制性的，除非其出现的内容中明确指出。因此，例如，对于本文公开的基因或基因产物，其在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列的，是旨在包括来自其他动物的同源和/或直系同源基因和基因产物，所述其他动物包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。在一些实施方案中，基因、核酸序列、氨基酸序列、肽、多肽和蛋白质是人类的。
RIPK2
小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的驻留巨噬细胞。响应全身性炎症或神经变性，小胶质细胞变成激活状态，通常称为M1样促炎状态，并且小胶质细胞的慢性激活可能潜在地引起神经毒性并促进神经退行性疾病进展。小胶质细胞的激活导致静息星形胶质细胞转化为各种神经退行性疾病中的反应性(A1)星形胶质细胞，所述神经退行性疾病包括帕金森病(PD)和阿尔茨海默氏病(AD)(Liddelow,S.A.等，Nature541，481-487，doi:10.1038/nature21029(2017))。α-突触核蛋白和淀粉样蛋白-β的异常错误折叠和聚集分别在PD和AD的神经元中引起毒性作用。因此，可以抑制M1样小胶质细胞和反应性星形胶质细胞形成的药剂的开发可以作为针对包括PD和AD的神经退行性疾病的通用神经保护药物来开发。
本发明的实施方案部分是基于以下发现：α-突触核蛋白和淀粉样蛋白-β聚集物通过分泌神经毒性细胞因子(包括TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q和IL-6)诱导小胶质细胞激活并促进A1星形胶质细胞形成。因此，这样从激活的小胶质细胞或反应性星形胶质细胞释放的炎性介质引起神经元损伤并有助于神经退行性疾病的进展。因此，可以将激活的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞描述为神经退行性疾病中的主要上游活性物质。小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成的抑制是防止、停止和/或逆转神经变性过程的逻辑策略。然而，特异性地靶向小胶质细胞激活的翻译方法的缺乏阻碍了这种策略。
本文的实施方案描述了独特的策略来靶向和阻断小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成以及炎性和神经毒性分子从激活的驻留固有免疫细胞的释放；因此防止、停止和/或改善神经退行性疾病的进展。在一些实施方案中，这样的方法也可以是选择性的，例如，基本上不抑制CNS中的其他细胞(如神经元)的正常功能，从而引起细胞毒性。
如本文详述的，进行了RNA测序分析，并且发现了α-突触核蛋白和淀粉样蛋白-β聚集物激活的小胶质细胞显著地诱导了RIPK2(受体相互作用丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶2)(人体中由RIPK2基因编码的酶(Silke J等，Nat Immunol.16(7):689-97(2015))和NOD1(含核苷酸结合寡聚结构域蛋白1)以及NOD2。令人惊讶地，发现了小胶质细胞中RIPK2和NOD2的耗竭显著遏制了小胶质细胞激活和神经毒性细胞因子的释放：因此抑制A1星形胶质细胞形成并保护神经元。
重要地是，发现了与正常受试者的相比，PD和AD患者的人死后脑组织中的NOD2、RIPK2和磷酸化RIPK2(p-RIPK2)水平显著增加。此外，提高的p-RIPK2信号在PD和AD患者的脑组织中与小胶质细胞高度共同定位，如通过免疫组织化学明显可见的。这表明了RIPK2激活在包括PD和AD的神经退行性疾病的发病机理中起着重要作用并且可能是临床上相关的治疗靶。
此外，通过立体定位注射α-突触核蛋白预制纤维(α-突触核蛋白PFF)诱发NOD2和RIPK2敲除(KO)小鼠发生PD时，与α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠相比，NOD2和RIPK2 KO小鼠证明了明显改善的LB/LN样病理、小鼠脑中的多巴胺能变性和运动功能障碍，以及减少的小胶质细胞激活和A1星形胶质细胞形成和受保护的神经元。
相似地，与正常的淀粉样蛋白β诱发AD的小鼠相比，通过脑室内注射淀粉样蛋白β聚集物诱发AD的NOD2和RIPK2 KO小鼠显示了明显改善的记忆功能和改善的认知缺陷。
此外，发现了各种口服活性的、基于小分子的RIPK2抑制剂抑制RIPK2活性(1)抑制α-突触核蛋白PFF诱导的或淀粉样蛋白β聚集物诱导的小胶质细胞激活，(2)阻断反应性星形胶质细胞形成，和(3)最终保护神经元。在本文所述的发明之前，还不清楚RIPK2的作用和RIPK2抑制剂在小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成中的作用。
最后，证实了在α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠中口服给药吉非替尼(一种已知的RIPK2抑制剂)明显拯救了小鼠中α-突触核蛋白PPF诱发的病理，同时在体内抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活。总之，这些发明清楚地提供了RIPK2是包括PD和AD在内的神经退行性疾病的可行治疗靶的证据。
因此，在某些实施方案中，通过靶向RIPK2和NOD2抑制小胶质细胞激活和/或反应性星形胶质细胞形成的物质作为用于PD和AD的改善疾病的疗法具有深远的治疗潜力。
受体相互作用蛋白(RIP)激酶
受体相互作用蛋白(RIP)激酶是一组苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，其具有相对保守的激酶结构域，但具有独特的非激酶区域。在人类中，已知五种不同的RIP激酶形式，称为RIP1、RIP2、RIP3、RIP4和RIP5。在不同的RIP家族成员中发现了许多不同的结构域结构，如死亡结构域和caspase激活和募集结构域(CARD)，并且这些结构域被认为是确定每种RIP激酶特定功能的关键特征。众所周知，RIP激酶参与不同的生物过程，包括固有免疫中的那些，但其下游底物在很大程度上是未知的。最近的证据已经表明了程序性坏死(necroptosis,一种程序化形式的坏死)的信号传导途径取决于响应死亡受体诱导的RIP1和RIP3的激活。caspase对RIP的直接切割防止了坏死性细胞死亡，并且与凋亡性细胞死亡有关。最近显示了RIP1和RIP3除了在程序性坏死中的作用外，还通过激活树突细胞中的NLRP3炎症小体来促进炎症(Kang,T.B.等，Immunity；38:27-40；2013)。
受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(登录号NP_003812；NCBI/蛋白质登录号NP_003812.1；基因登录号NM_003821)转导胞内肽聚糖传感器NOD1和NOD2下游的信号传导，以促进产生性炎症反应。然而，过量的NOD2信号传导已与许多疾病相关，包括炎性肠病(IBD)、结节病和炎性关节炎。
含核苷酸结合寡聚结构域的蛋白NOD1和NOD2是胞质的Nod样受体(NLR)家族蛋白，其在固有免疫系统中起作用以检测病原菌(Philpott等，Nat.Rev.Immunol.,14(2014)，pp.9-23，2014)。NOD1在与含有二氨基庚二酸(DAP)的细菌肽聚糖片段结合后被激活，而NOD2则识别胞壁酰二肽(MDP)成分(Chamaillard等，Nat.Immunol.,4(2003)，pp.702-707；Girardin等，Science,300(2003)，pp.1584-1587；Girardin等，J.Biol.Chem.,278(2003),pp.8869-8872；Inohara等，J.Biol.Chem.,278(2003)，pp.5509-5512)。NOD激活通过受体相互作用蛋白激酶2(RIPK2，也称为RIP2或RICK)诱导促炎性信号传导，该蛋白在NOD依赖性的激活而非Toll样受体应答中起着强制性和特异性的作用(Park等，J.Immunol.,178(2007),pp.2380-2386)。
通过RIPK2的信号传导依赖于具有双重Ser/Thr和Tyr激酶活性的N-末端激酶结构域(Dorsch等，Cell.Signal.，18(2006)，pp.2223-2229；Tigno-Aranjuez等，Genes Dev.，24(2010)，pp.2666-2677)，以及介导CARD-CARD结构域与激活的NOD装配的C-末端caspase激活和募集结构域(CARD)(Inohara等，J.Biol.Chem.，274(1999)，pp.14560-14567；Ogura等，J.Biol.Chem.，276(2001)，pp.4812-4818)。一旦啮合，RIPK2通过自磷酸化被激活(Dorsch等，2006)并进一步被XIAP(X-连锁的凋亡抑制剂)和其他E3连接酶靶向，用于非降解性多聚泛素化(Bertrand等，PLoS One，6(2011)，p.e22356；Damgaard等，Mol.Cell，46(2012)，pp.746-758；Tao等，Curr.Biol.，19(2009)，pp.1255-1263；Tigno-Aranjuez等，Mol.Cell.Biol.，33(2013)，pp.146-158；Yang等，J.Biol.Chem.,282(2007)，pp.36223-36229；Yang等，Nat.Immunol.，14(2013)，pp.927-936)。泛素缀合的蛋白随后激活TAK1和IKK激酶，导致丝裂原激活的蛋白激酶和核因子κB(NF-κB)信号传导通路的上调(Kim等，J.Biol.Chem.,283(2008)，pp.137-144；Park等，J.Immunol.，178(2007)，pp.2380-2386)。此外，RIPK2通过NOD和自噬因子ATG16L1之间的信号传导诱导抗菌自噬响应(Cooney等，Nat.Med.，16(2010)，pp.90-97；Homer等，J.Biol.Chem.，287(2012)，pp.25565-25576)。
RIPK2抑制剂
RIPK2活性的抑制通常由以下的至少一种或多种来介导：降低、抑制或防止RIPK2的表达，中和RIPK2的功能以及诱导RIPK2降解。根据某些实施方案，通过减少、抑制或防止RIPK2的表达来介导抑制RIPK2活性。抑制RIPK2活性可通过与RIPK2蛋白、基因或mRNA相互作用来直接介导，或通过与RIP介导的活性或表达有关的蛋白、基因或mRNA相互作用而间接介导。
不同类别的RIPK2抑制剂适用于本文的组合物和方法，包括但不限于小分子、抗体、核酸分子(DNA、RNA，如shRNA、siRNA，反义分子等)等，其可以抑制RIPK2或涉及RIPK2的生物途径中的分子的表达、加工、翻译后修饰或活性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可抑制(例如，特异性地抑制)RIPK2的表达、加工、翻译后修饰或活性。在其他实施方案中，RIPK2抑制剂可抑制(例如特异性地抑制)未剪接的RIPK2基因的表达、加工、翻译后修饰或活性。
在一些实施方案中，本发明的RIPK2抑制剂可以是例如作用来特异性地或直接地抑制例如RIPK2或涉及RIPK2的生物途径中的分子的表达、加工、翻译后修饰或活性的胞内结合分子。如本文使用的，术语“胞内结合分子”旨在包括通过结合蛋白质或编码蛋白质的核酸(例如，mRNA分子)而在细胞内起作用以抑制蛋白质的加工表达或活性的分子。下文进一步详细描述的胞内结合分子的实例包括抑制RIPK2或涉及RIPK2的生物途径中的分子的相互作用的反义核酸、胞内抗体、肽化合物以及特异性地或直接抑制RIPK2活性或涉及RIPK2的生物途径中的分子活性的化学试剂。
在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以是酶性核酸。给定基因的表达可以通过酶性核酸来抑制。如本文使用的，“酶性核酸”是指包含底物结合区的核酸，所述底物结合区具有与基因的连续核酸序列的互补性，并且其能够特异性地切割该基因。酶性核酸底物结合区可以是例如与基因中的连续核酸序列50-100％互补，75-100％互补，90-100％互补，或95-100％互补。酶性核酸还可以包含碱基、糖和/或磷酸基团的修饰。用于本发明中的示例性酶性核酸是核糖酶(ribozyme)。术语酶性核酸可以例如与核糖酶、催化性RNA、酶RNA、催化性DNA、适酶或适体结合核酶、催化性寡核苷酸、核酶(nucleozyme)、DNA酶和RNA酶互换使用。
小分子：在某些实施方案中，RIPK2抑制剂可以包括一种或多种抑制(例如，选择性地抑制)RIPK2的小分子。合适的小分子RIPK2抑制剂包括本领域已知那些中的任何一种。例如，在某些实施方案中，小分子可以是吉非替尼(IRESSATM，AstraZeneca)、SB203580(Gretchen M.Argast等，Mol.Cell.Biochem.Vol.268，129-140(2005))、OD36、OD38(J.T.Tigno-Aranjuez等，J.Biol Chem.Vol.289No.43,29651-29664(2014))、普纳替尼(ponatinib)、索拉非尼(sorafenib)，雷戈非尼(regorafenib)或GSK583(Pamela A Haile等，J.Med.Chem.Vol 59 N.10，4867-4880(2016)，及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂具有与体外RIPK2激酶试验中针对吉非替尼观察到的IC50值相似(5倍内)或更优的IC50值。
非限制性有用的小分子RIPK2抑制剂还包括以下美国或PCT申请公开中所述那些中的任何一种：US20160024114A1；WO2011106168A1；US2013/0251702A1；US20180118733A1；WO2016042087A1；WO2018052773A1；WO2018052772A1；WO2011112588A2；WO2011120025A1；WO2011120026A1；WO2011123609A1；WO2011140442A1；WO2012021580A1；WO2012122011A2；WO2013025958A1；WO2014043437A1；WO2014043446A1；WO2014128622A1；WO2016172134A2；WO2017046036A1；WO2017182418A1；WO2012003544A1；将其每篇内容全部按引用并入本文中。
非限制性合适的小分子RIPK2抑制剂还可以包括以下所描述那些中的任何一种：Cruz J.V.等，“Identification of Novel protein kinase receptor type 2inhibitors using pharmacophore and structure-based virtual screening,”Molecules 23，453，第1-25页(2018)；Sala M.等，“Identification andcharacterization of novel receptor-interacting serine/threonine-proteinkinase 2inhibitors using structural similarity analysis,The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,365:354-367(2018)；He X等，“Identification of potent and selective RIPK2 inhibitors for the treatment ofinflammatory diseases,”ACS Med Chem Lett 8:1048–1053(2017)；将每篇内容全部按引用并入本文中。
在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是CSLP分子或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002956762510000221
其中：
X是甲基或NH2，
R1是氢、F或甲氧基，
R2是氢、羟基或甲氧基，并且
R3是-NHSO2(n-丙基)。作为RIPK2抑制剂的CSLP分子的实例已有描述，参见，例如，Hrdinka M.等，The EMBO Journal，e99372，第1-16页(2018)，将其内容全部按引用并入本文中。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是CSLP分子或其药学上可接受的盐，其中X是NH2、R1是甲氧基、R2是甲氧基和R3是-NHSO2(n-丙基)。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是CSLP分子或其药学上可接受的盐，其中X是NH2、R1是F、R2是甲氧基和R3是-NHSO2(n-丙基)。
在本文所述的任一个实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是吉非替尼、索拉非尼、雷戈非尼、普纳替尼、SB203580、OD36(6-氯-10,11,14,17-四氢-13H-1,16-亚乙烯基-4,8-次甲基-1H-吡唑并[3,4-g][1,14,4,6]二噁二氮杂环十六烷)、OD38([4,5,8,9-四氢-7H-2,17-亚乙烯基-10,14-次甲基-1H-咪唑并[1,5-g][1,4,6,7,12,14]氧杂五氮杂环十六烷])、WEHI-435(N-(2-(4-氨基-3(p-甲苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲丙基)异烟酰胺)或GSK583(6-(叔-丁基磺酰基)-N-(5-氟-1H-吲唑-3-基)喹啉-4-胺)或其药学上可接受的盐。在一些特定的实施方案中，RIPK抑制剂可以是吉非替尼或GSK583或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，小分子RIPK2抑制剂可以抑制RIP激酶涉及的一种或多种途径。例如，RIPK2激酶是NOD2激活必不可少的，包括下游NF-κB、MAPK和自噬途径的启动(J.T.Tigno-Aranjuez等，J.Biol Chem.Vol.289No.43，29651-29664(2014)；Kobayashi K.等，Nature 416,194-199(2002)；Park J.H.等，J.Immunol.178，2380-2386(2007)；HomerC.R.等，J.Biol.Chem.287，25565-25576 18-20(2012))。有用的小分子RIPK2抑制剂可以通过一种或多种试验来鉴定，如以下举例说明的。
反义寡核苷酸：在一些实施方案中，RIPK2抑制剂是与编码RIPK2或涉及RIP激酶的途径中的分子(例如，RIPK2与其相互作用的分子)的基因或与这样的基因的一部分互补的反义核酸分子，或编码反义核酸分子的重组表达载体。RIPK2反义的一些实例描述于美国专利No.6,426,221中，将其内容全部按引用并入本文中。反义核酸下调细胞中的特定蛋白质的表达的用途是本领域公知的(参见，例如，Weintraub,H.等，1986.Reviews--Trends inGenetics,Vol.1(1)；Askari,F.K.等，1996.N.Eng.Med.334,316-318；Bennett,M.R.等，1995.Circulation 92,1981-1993；Mercola,D.等，1995.Cancer Gene Mer.2,47-59；Rossi,J.J.,1995.Br.Med.Bull.51,217-225；Wagner.R.W.,1994.Nature 372,333-335)。反义核酸分子包括与另一个核酸分子的编码链(mRNA序列)互补的核苷酸序列并且因此能够与另一个核酸分子的编码链氢键结合。与mRNA的序列互补的反义序列可以与mRNA的编码区中发现的序列、mRNA的5’或3’非翻译区或桥接编码区和非翻译区的区域(例如，在5’非翻译区和编码区的连接处)互补。此外，反义核酸可以在序列中与编码mRNA的基因的调控区(例如，转录启动序列或调控元件)互补。在一个实施方案中，将反义寡核苷酸设计成与先于或横跨mRNA的编码链上的或3’未翻译区中的启动密码子的区域互补。鉴于已知的RIP激酶基因的编码链的核苷酸序列并且因此已知的RIP激酶mRNA的序列，可以根据Watson和Crick碱基配对的规则设计本发明的反义核酸。例如，反义寡核苷酸可以与RIP激酶的翻译起始位点周围的区域互补，反义寡核苷酸可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长。本发明的反义核酸可以使用本领域已知的程序，使用化学合成和酶连接反应来构建。为了抑制在细胞中的表达，可以使用一个或多个反义寡核苷酸。
可替换地，可以使用表达载体在生物学上产生反义核酸，在所述表达载体中已经以反义方向(即，从插入的核酸转录的核酸对于目标靶核酸将是反义方向的)亚克隆了全部或部分cDNA。反义表达载体可以是例如重组质粒、噬菌体或减毒病毒的形式。可以使用标准转染技术将反义表达载体引入细胞中。
通常将本发明的反义核酸分子给予受试者或在原位产生，使得它们与编码蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，由此抑制蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。给予本发明的反义核酸分子的途径的实例包括在组织部分直接注射。或者，可以将反义核酸分子进行修饰以靶向选定的细胞，并随后全身性地给药。例如，对于全身性给药，可以将反义分子进行修饰，使其特异性地结合选定的细胞表面上表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸分子连接肽或抗体，所述肽或抗体结合细胞表面受体或抗原。还可以使用本文所述的载体将反义核酸分子递送至细胞。
再在其他实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特定的双链杂合体，其中与通常的β-单元相反，链彼此平行(Gautier,C.等，1987.Nucleic Acids.Res.15，6625-6641)。反义核酸分子还可以包括2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue,H.等，1987.Nucleic Acids Res.15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue,H.等，1987.FEBS Lett.215，327-330)。
再在其他实施方案中，本发明的反义核酸分子是核糖酶。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够切割具有互补区的单链核酸，如mRNA。因此，核糖酶(例如，锤头状核糖酶(描述于Haselhoff,J.等，1988.Nature 334,585-591))可以用于催化性地切割mRNA转录物，以由此抑制翻译mRNA。或者，可以通过靶向与基因的调控区(例如，RIP激酶启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列来形成防止基因在靶细胞中转录的三重螺旋结构，从而抑制基因表达。通常参见，Helene,C.,1991.Anticancer Drug Des.6(6),569-84；Helene,C.等，1992.Ann.N.Y.Acad.Sci.660,27-36；和Maher,L.J.,1992.Bioassays 14(12),807-15。
在其他实施方案中，促进RNAi的化合物可以用于抑制任何一种或多种RIP激酶或涉及RIP激酶的生物途径中的分子的表达。如本文使用的，术语“RNA干扰”或“RNAi”，通常是指序列特异性或选择性过程，通过其靶分子(例如，靶基因、蛋白质或RNA)被下调。在特定的实施方案中，“RNA干扰”或“RNAi”过程的特征在于RNA分子(例如，细胞内的RNA分子)的降解，所述降解由RNA剂引发。降解通过酶、RNA诱导的沉默复合物(RISC)来催化。RNAi在细胞中天然发生，以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA裂解的片段进行，其将降解机制导向其他相似的RNA序列。或者，RNAi可以由人为启动，例如以沉默靶基因的表达。RNA干扰(RNAi是转录后的靶向基因沉默技术，其使用双链RNA(dsRNA)来降解含有与dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp,P.A.等，2000.Science 287，5462:2431-3；Zamore,P.D.等，2000.Cell 101,25-33.Tuschl,T.等，1999.Genes Dev.13,3191-3197；Cottrell T.R.等，2003.Trends Microbiol.11，37-43；Bushman F.,2003.Mol.Therapy 7,9-10；McManus M.T.等，2002.Nat Rev Genet 3，737-47)。内源性核糖核酸酶将较长的dsRNA切割成较短的，例如21-23个核苷酸长的RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时，就会发生此过程。如本文使用的，术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本领域中也称为“短干扰RNA”)是指约10-50个核苷酸长(术语“核苷酸”包括核苷酸类似物)的RNA剂，如双链剂，例如，约15-25个核苷酸长，或约17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长，所述链任选具有包括例如1、2或3个悬垂核苷酸(或核苷酸类似物)的悬垂端，其能够指引或介导RNA干扰。天然产生的siRNA通过细胞的RNAi机制(例如，Dicer或其同系物)从较长的dsRNA分子(例如，>25个核苷酸类似物)产生。较小的RNA区段随后介导靶mRNA的降解。用于RNAi合成的试剂盒是可商购获得的，例如，来自New England Biolabsor Ambion。在一些实施方案中，以上针对用于反义RNA中描述的一种或多种化学物质可以用于介导RNAi的分子中。
或者，促进RNAi的化合物可以在细胞(例如，受试者中的细胞)中表达，以抑制RIP激酶或涉及RIP激酶的生物途径中的分子的表达。与siRNA相反，shRNA模拟微RNA(miRNA)的天然过程并且在基因沉默途径的顶部进入。出于这个原因，认为shRNA借由通过整个天然基因沉默途径饲喂来更有效地介导基因沉默。shRNA分子的必需元件包括第一部分和第二部分，其具有足够的互补性以退火或杂交来形成双链或双链茎部分。这两个部分不必完全或完美互补。第一和第二“茎”部分通过具有序列的部分来连接，所述序列具有不足的序列互补性，不与shRNA的其他部分退火或杂交。将这后一部分称为shRNA分子中的“环”部分。加工shRNA分子以产生siRNA。shRNA还可以包括一个或多个凸出部分，即在茎的部分中形成小的核苷酸“环”的额外核苷酸，例如一个，两个或三个核苷酸环。茎部分可以具有相同的长度，或者一部分可以包括例如1-5个核苷酸的悬垂。在某些实施方案中，本发明的shRNA包括上文描述的所需siRNA分子的序列。在这样的实施方案中，shRNA前体在双链体茎中包括期望在体内产生的siRNA的21-23个左右的核苷酸序列。
体内有效递送至细胞需要特异性靶向以及对胞外环境特别是血清蛋白的实质性保护。实现特异性靶向的一种方法是将靶向部分与iRNA试剂缀合。靶向部分有助于将iRNA试剂靶向所需的靶位点。靶向部分可以改善递送的一种方式是通过受体介导的内吞活性。这种摄取机制涉及通过膜结构的内陷或通过递送系统与细胞膜的融合，将与膜受体结合的iRNA剂移动到被膜包围的区域内部。该过程通过在特异性配体与受体结合后激活细胞表面或膜受体来启动。许多受体介导的内吞系统是已知的并已经进行了研究，包括识别糖类(如半乳糖、甘露糖、6-磷酸甘露糖)、肽和蛋白质(如转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF))的那些。去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)是高容量受体，其在肝细胞上高度丰富。ASGP-R对N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的亲和力比D-Gal高50倍。先前的工作表明，实现nM亲和力需要多重价，而糖之间的间隔也很重要。
对D-甘露糖具有高亲和力的甘露糖受体代表了另一种重要的基于碳水化合物的配体-受体对。甘露糖受体在特定细胞类型(如巨噬细胞和可能的树突细胞)上高度表达。甘露糖缀合物以及甘露糖基化的药物载体已成功用于将药物分子靶向那些细胞。例如，参见Biessen等(1996)J.Biol.Chem.271,28024-28030；Kinzel等(2003)J.Peptide Sci.9,375-385；Barratt等(1986)Biochim.Biophys.Acta 862,153-64；Diebold等(2002)Somat.CellMol.Genetics 27，65-74。
与高亲水性分子(如核酸)连接时，亲脂性部分，如胆固醇或脂肪酸，可以显著增强血浆蛋白结合并因此显著提高循环半衰期。另外，已表明结合某些血浆蛋白(如脂蛋白)增加了特定组织对表达相应脂蛋白受体(例如，LDL-受体HDL-受体或清道夫受体SR-B1)的摄取。例如参见Bijsterbosch,M.K.,Rump,E.T.等(2000)Nucleic Acids Res.28,2717-25；Wolfrum,C.,Shi,S.等(2007)25，1149-57。亲脂性缀合物也可以与靶向配体结合使用，以改善靶向递送方法的胞内运输。
PULMOZYMETM以液态蛋白质制剂形式提供，准备用于喷雾器系统。除雾化器系统外，药物和其他药物的肺部给药可以通过提供可吸入溶液或干粉制剂来实现，所述溶液配制成通过称为计量吸入器的适当的基于液体的吸入器进行吸入，所述干粉制剂通过称为干粉吸入器(DPI)的适当的吸入器进行吸入。
胞内抗体：可用于抑制RIP激酶或涉及RIP激酶的生物途径中的分子的表达和/或活性的另一种类型的抑制性化合物是对所述蛋白质具有特异性的胞内抗体。胞内抗体抑制细胞中的蛋白质功能的用途是本领域已知的(参见，例如，Carlson,J.R.,1988.Mol.Cell.Biol.8,2638-2646；Biocca,S.等，1990.EMBO.J.9,101-108；Werge,T.M.等，1990.FEBS Letters 274,193-198；Carlson,J.R.,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7427-7428；Marasco,W.A.等，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7889-7893；Biocca,S.等，1994.BioTechnology 12,396-399；Chen,S.Y.等，1994.Human Gene Therapy 5,595-601；Duan,L.等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,5075-5079；Chen,S.Y.等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,5932-5936；Beerli,R.R.等，1994.J.Biol.Chem.269,23931-23936；Beerli,R.R.等，1994.Biochem.Biophys.Res.Commun.204，666-672；Mhashilkar,A.M.等，1995.EMBO J.14，1542-1551；Richardson,J.H.等，1995.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,3137-3141；Marasco等的PCT公开号No.WO 94/02610；和Duan等的PCT公开号No.WO 95/03832)。
为了使用胞内抗体来抑制蛋白质活性，制备了重组表达载体，其编码抗体链，所述抗体链的形式使得将载体引入细胞中时，抗体链在细胞的胞内区隔中作为功能性抗体来表达。根据本发明的方法，为了抑制RIP激酶活性，在细胞核内表达特异性地结合蛋白质的胞内抗体。可以通过从抗体轻链和重链基因除去编码N-末端疏水性前导序列的那些核苷酸序列并添加编码轻链和轻链基因的N-或C-末端的核定位信号的核苷酸序列来实现胞内抗体的核表达(参见，例如，Biocca.S.等，1990.EMBO J.9，101-108；Mhashilkar,A.M.等，1995.EMBO.J.14，1542-1551)。可以用于胞内抗体链的核靶向的核定位信号是SV40大T抗原的核定位信号(参见，Biocca.S.等，1990.EMBO J.9，101-108；Mhashilkar,A.M.等，1995.EMBO.J.14，1542-1551)。
基因编辑剂：在某些实施方案中，抑制剂是基因编辑剂。基因编辑剂可以灭活或除去整个基因或其部分，以抑制或防止转录和翻译。可以使用任何合适的核酸酶系统，包括，例如，Argonaute内切核酸酶家族、成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其他内切核酸酶或外切核酸酶或其组合。参见，Schiffer，2012，J.Virol.88(17):8920-8936，全部按引用并入本文中。
在某些实施方案中，基因编辑剂是成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的内切核酸酶/Cas(CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。可以修饰CRISPR/Cas样蛋白以增加核酸结合亲和力和/或特异性、改变酶促活性，和/或改变蛋白质的另一性质。例如，可以修饰、缺失或灭活CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即，DNase、RNase)结构域。或者，可以将CRISPR/Cas样蛋白截短以去除对该蛋白质的功能不是必需的结构域。CRISPR/Cas样蛋白也可以被截短或修饰以优化该蛋白质效应域的活性。通常，CRISPR/Cas蛋白包括至少一个RNA识别和/或RNA结合结构域。RNA识别和/或RNA结合结构域与向导RNA相互作用。CRISPR/Cas蛋白还可以包括核酸酶结构域(即，DNase、RNase结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、RNA酶结构域、蛋白质-蛋白质相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。
在实施方案中，CRISP/Cas系统可以是I型、II型或III型系统。合适的CRISP/Cas蛋白的非限制性实例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。
在一些实施方案中，RNA向导的核酸内切酶衍生自II型CRISPR/Cas系统。在其他实施方案中，RNA指导的核酸内切酶衍生自Cas9蛋白。
在某些实施方案中，所述系统是Argonaute核酸酶系统。Argonaute是使用5’磷酸化短单链核酸作为向导来切割靶标的核酸内切酶家族(Swarts,D.C.等，The evolutionaryjourney of Argonaute proteins.Nat.Struct.Mol.Biol.21，743-753(2014))。与Cas9相似，Argonautes在基因表达遏制和防御外来核酸中具有关键作用(Swarts,D.C.等，Nat.Struct.Mol.Biol.21，743-753(2014)；Makarova,K.S.,等，Biol.Direct 4，29(2009)；Molloy,S.Nat.Rev.Microbiol.11，743(2013)；Vogel,J.Science 344，972-973(2014)；Swarts,D.C.等，ature 507，258-261(2014)；Olovnikov,I.等，Mol.Cell 51，594-605(2013))。然而，Argonautes在许多方面不同于Cas9(Swarts,D.C.等，Nat.Struct.Mol.Biol.21，743-753(2014))。Cas9仅存在于原核生物中，而Argonautes在进化过程中得到保存，并且几乎存在于所有生物体中；尽管大多数Argonautes与单链(ss)RNA结合并在RNA沉默中发挥重要作用，但某些Argonautes结合ssDNA并切割靶DNA(Swarts,D.C.等，Nature 507，258-261(2014)；Swarts,D.C.等，Nucleic Acids Res.43，5120-5129)。向导RNA必须具有3'RNA-RNA杂交结构才能正确地与Cas9结合，而Argonaute结合则不需要向导的特定共有二级结构；尽管Cas9只能切割PAM上游的靶标，但Argonaute所需的靶标上没有特定序列。一旦Argonaute和向导结合后，它们会相互影响彼此的理化特性，并作为整体工作，具有核酸结合蛋白更典型的动力学特性(Salomon,W.E.等，Cell 162，84-95(2015))。
Argonaute蛋白通常具有～100kDa的分子量并且特征在于Piwi-Argonaute-Zwille(PAZ)结构域和PIWI结构域。对古细菌和细菌Argonaute蛋白的晶体学研究表明了PAZ结构域(其也是Dicer酶常见的)形成了特异性的结合袋，用于与其结合的小RNA3'突出端(Jinek和Doudna，(2009)Nature 457,405-412)。PIWI结构域的结构类似于细菌RNA酶H的结构，其已显示出可切割RNA-DNA杂合体的RNA链(Jinek和Doudna，(2009)Nature 457,405-412)。最近，发现了miRNA效应复合物的催化活性，也称为Slicer活性，存在于Argonaute蛋白本身中。
由AGO1、AGO2、AGO3和AGO4组成的人Ago亚家族的成员被普遍表达并与miRNA和siRNA相关。Ago蛋白在整个物种中都是保守的，并且许多生物体表达多个家族成员，范围从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pomb)中的一个，果蝇(Drosophila)中的五个，人类中的八个，拟南芥(Arabidopsis)中的十个到秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的二十七个(Tolia和Joshua-Tor，(2007)Nat.Chem.Biol.3,36-43)。Argonaute蛋白也存在于一些出芽酵母的物种中，包括酿酒酵母(Saccharomyces castellii)。发现酿酒酵母表达由不同于动物、植物和其他真菌中发现的经典Dicer蛋白的Dicer蛋白产生的siRNA(Drinnenberg等，(2009)Science 326,544-550)。
结构研究已经扩展到仅与向导链或向导DNA链和靶RNA双链体复合的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute。该分析表明了复合物的结构分为两叶。一个叶含有通过接头区L1连接N-末端结构域的PAZ结构域。第二个叶由中间(MID)结构域(位于PAZ和PIWI结构域之间)和PIWI结构域组成。与Argonaute结合的小RNA的5'磷酸位于MID结构域的特异性结合袋中(Jinek和Doudna(2009)Nature 457,405-412)。Argonaute蛋白与向导DNA或RNA分子之间的接触主要是通过与小RNA或DNA的糖-磷酸骨架相互作用来实现的；因此，RNA或DNA向导链的碱基对于与互补靶RNA的碱基配对是游离的。该结构表明靶mRNA碱基与向导DNA链配对，但不接触蛋白质(Wang等(2008a)，Nature 456,921-926；Wang,Y.等(2009)Nat.Struct.Mol.Biol.16,1259-1266；Wang等(2008b)Nature 456,209-213)。
Argonaute核酸内切酶的有用特征，例如，用于基因组编辑的格氏嗜盐碱菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)包括以下的：(i)NgAgo对向导-靶错配的耐受性低；(ii)5'磷酸化短ssDNA在哺乳动物细胞中很少见，这使细胞寡核苷酸误导NgAgo的可能性降至最低；和(iii)NgAgo遵循“忠实于一个向导”的规则，即只有在NgAgo蛋白处于表达过程时才能加载向导，并且一旦加载，NgAgo便无法在37℃下与其他游离ssDNA交换其gDNA。
因此，在某些实施方案中，Argonaute核酸内切酶包括与单链RNA(ssRNA)或单链DNA(ssDNA)结合的那些。在某些实施方案中，Argonaute衍生自格氏嗜盐碱菌。在其他实施方案中，格氏嗜盐碱菌Argonaute(NgAgo)是野生型NgAgo、修饰的NgAgo或野生型或修饰的NgAgo的片段。可以修饰NgAgo以增加核酸结合亲和力和/或特异性，改变酶活性，和/或改变蛋白质的另一种性质。例如，可以修饰、删除或灭活NgAgo的核酸酶(例如DNase)结构域。
可用于特异性地抑制RIP激酶或涉及RIP激酶的生物学途径中的分子的活性的其他抑制剂是直接抑制例如RIP激酶2的表达、加工、翻译后修饰和/或活性的化合物。可以使用如详细描述的选择此类化合物的筛选试验以及使用其他本领域公认的技术来鉴定此类化合物。
在示例性实施方案中，根据标准药物方案配制一种或多种上述抑制性化合物以产生用于治疗用途的药物组合物。将本发明的药物组合物配制成与其预期的给药途径相适。
筛选试验
在某些方面中，本发明特征在于鉴定可用于抑制RIP激酶的化合物的方法。在某些实施方案中，所述抑制剂是RIPK2的抑制剂。筛选试验的实例包括但不限于基因表达试验、转录试验、激酶试验、免疫试验等。
用于筛选为RIP激酶抑制剂的小分子可以从市售的文库中获得，例如
Figure BDA0002956762510000331
(Oncodesign)。化合物文库的筛选可以使用体外放射激酶试验来进行，利用在细胞(如昆虫细胞)中表达的重组纯化的RIPK2作为激酶，而RBER-CHKtide作为底物。每50μl反应使用约50ng重组RIPK2和2μg重组RBER-CHKtide底物对3×10-6m至9×10-11m范围内的各种抑制剂浓度进行测试。然后在细胞试验中测试显示出体外IC50值<100nm的化合物，其中RIPK2活性(酪氨酸自磷酸化)是通过NOD2与RIPK2的共表达诱导的，并且激酶活性的抑制是通过RIPK2抑制剂处理后酪氨酸自身磷酸化的丧失来评估的。将在细胞试验中以较低(例如约250nm)剂量维持RIPK2酪氨酸磷酸化抑制的化合物随后用于进一步的体外和体内测定。可以在使用已知底物进行体外激酶测定之前，通过将重组激酶与各种剂量的抑制剂预孵育来测试激酶特异性。30min后，停止反应并测量磷酸盐的掺入。
因此，在示例性的方面中，本发明的特征在于鉴定在抑制RIP激酶的磷酸化活性中有用的化合物的方法。这可以包括RIP激酶的转录、翻译、基因表达、活性等的抑制。在示例性方面中，所述方法包括：提供包括纯化的重组RIP激酶和底物的指示剂组合物；将指示剂组合物接触测试化合物文库的每个成员；以及从测试化合物文库中选择提高激酶活性的目标化合物。
在其他实施方案中，筛选试验测量抑制剂对以下的作用：(1)NF-κB的NOD1和NOD2依赖性激活，其在炎症中起着关键作用，(2)淀粉样蛋白-β和α突触核蛋白聚集物诱导的小胶质细胞激活和A1星形胶质细胞形成的阻断和(3)神经元的维持。
如本文使用的，术语“测试化合物”是指之前未被鉴定为或被认为是测试的活性的调节剂的化合物。术语“测试化合物的文库”是指包括多种测试化合物的组。如本文使用的，术语“指示剂组合物”是指包括目标蛋白(例如，RIPK2或涉及RIPK2生物途径中的分子，例如，NOD1、NOD2)的组合物，例如，天然表达所述蛋白质的细胞、已经通过将一个或多个编码所述蛋白质的表达载体引入细胞中以工程化表达所述蛋白质的细胞，或含有蛋白质的无细胞组合物(例如，纯化的天然产生的蛋白质或重组工程化的蛋白质)。术语“细胞”包括原核和真核细胞。在一些实施方案中，本发明的细胞是细菌细胞。在其他实施方案中，本发明的细胞是真菌细胞，如酵母细胞。在其他实施方案中，本发明的细胞是脊椎动物细胞，例如，鸟类或哺乳动物细胞。在其他实施方案中，本发明的细胞是鼠或人细胞。如本文使用的，术语“工程化的”(如在工程化的细胞中)是指其中已经引入了例如，编码RIP激酶的核酸分子(例如，剪接和/或未剪接形式的)的细胞。
在一些实施方案中，本发明还提供了一种鉴定用于神经退行性疾病或障碍(例如，与中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域中的上调的NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2相关的那些)的治疗剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将CNS驻留固有免疫细胞在候选治疗剂的存在下接触诱导免疫细胞激活的试剂(例如，异常聚集的蛋白质)；测量在候选治疗剂存在下的CNS驻留固有免疫细胞的激活；和鉴定与对照相比抑制CNS驻留固有免疫细胞激活的治疗剂。在一些实施方案中，候选治疗剂是RIPK2抑制剂，例如，通过本文的筛选试验鉴定的。在一些实施方案中，将CNS驻留固有免疫细胞与治疗剂接触诱导NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2的上调。在一些实施方案中，CNS驻留固有免疫细胞是小胶质细胞和/或星形胶质细胞。在一些实施方案中，诱导CNS驻留固有免疫细胞激活的试剂是异常聚集的蛋白质，如α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。在一些实施方案中，测量包括测量NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2的表达水平。在一些实施方案中，测量包括测量因子iNOS、Cxc11和/或IL-1β的表达水平。在一些实施方案中，测量包括测量CNS免疫细胞的趋化性。在任一个这样的实施方案中，所述方法包括鉴定抑制RIPK2活性和/或表达的治疗剂，例如，选择性地抑制RIPK2活性和/或表达而优于其他RIP激酶；抑制NF-κB的NOD2依赖性激活；和/或抑制淀粉样蛋白-β聚集物诱发的小胶质细胞激活、α-突触核蛋白聚集物诱发的小胶质细胞激活和/或A1星形胶质细胞形成。在任一个这样的实施方案中，神经退行性疾病或失调可以是阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)、帕金森病、糖尿病性神经病、聚谷氨酰胺(多Q)病、卒中、法尔病、多发性硬化、门可氏病、威尔逊氏病、脑缺血、朊粒病、痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性轻瘫、脊髓小脑萎缩、脑损伤和/或脊髓损伤。在一些特定实施方案中，神经退行性疾病或障碍是阿尔茨海默氏病或帕金森病。在一些实施方案中，本发明还涉及用本文任一种筛选方法鉴定的治疗剂。
药物组合物
其他方面提供了包含作为活性剂的RIPK2抑制剂和药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。本文所述的任一种RIPK2抑制剂都是合适的。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂是药物组合物中唯一的活性成分。在一些实施方案中，RIPK2和一种或多种其他活性成分(例如，本文所述的)可以包括在药物组合物中。
RIPK2抑制剂可以根据给药途径来配制。在某些实施方案中，通过包括以下的给药途径来给药RIPK2抑制剂：静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼内、肌内、颊、直肠、阴道、眶内、脑内、皮内、颅内、脊髓内、脑室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、经粘膜、经皮、吸入或其任意组合。
在某些实施方案中，RIPK2抑制剂口服或胃肠外给药。
在本发明的某些实施方案中，以允许全身性摄取的剂型给药RIPK2抑制剂治疗剂，使得治疗剂可以穿过血脑屏障，以对神经元细胞发挥作用。例如，所用的适于胃肠外/注射的治疗剂的药物制剂通常包括无菌水溶液(其中是水溶性的)，或用于临时制备无菌注射液或分散液的分散体和无菌粉末。在所有情况中，所述形式必须是无菌的并且必须是至易于注射程度的流体。它必须在生产和储存条件下是稳定的，并且必须加以防腐，以防止微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，其合适的混合物，或植物油。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、山梨酸等。在许多情况下，包括等渗剂是合理的，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。
通过将治疗剂以所需量并按照需要与上述各种其他成分掺入合适的溶剂中来制备无菌注射液，接着过滤或终末灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和所需的来自上述那些的其他成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上来自其之前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。根据本发明的药物组合物通常是适用于注射或输注的液体制剂。例如，盐水溶液以及含水右旋糖和甘油溶液可以用作液体载体，特别是用于注射液。
用于静脉内给药的溶液或悬浮液通常包括载体，如生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)、乙醇或多元醇。在所有情况中，组合物必须是无菌的和易于注射的流体。通常可以使用卵磷脂或表面活性剂获得适当的流动性。该组合物在制造和储存条件下也必须是稳定的。可以使用抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物。在许多情况下，组合物中可以包括等渗剂(糖)、多元醇(甘露醇和山梨糖醇)或氯化钠。组合物的延长吸收可以通过添加延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。必要时，组合物还可包含局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，将成分分别或以单位剂型混合在一起提供，例如，作为指示活性剂量的密封容器中(如安瓿或小药囊)的干燥冻干粉或无水浓缩物。当组合物通过输注给药时，可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射给药时，可以提供安瓿瓶的注射用无菌水或盐水，以便可以在施用之前将成分混合。
口服组合物包括惰性稀释剂或可食用载体。所述组合物可以包封在明胶中或压制成片剂。为了口服给药，可以将活性剂与赋形剂结合并置于片剂、锭剂或胶囊中。药学上相容的粘合剂或辅助材料可包含在组合物中。片剂、锭剂和胶囊可任选包含粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；或甜味剂或调味剂。
组合物还可以通过经粘膜或经皮途径来给药。经粘膜给药可以通过使用锭剂、鼻喷雾、吸入器或栓剂来实现。经皮给药也可以通过使用本领域已知的含有组合物的膏剂、油膏、凝胶或霜剂来完成。对于经粘膜或经皮给药，使用适于待穿透的屏障的渗透剂。组合物可以配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体，如甘油三酯。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括至少一种以下成分：无菌稀释剂，如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；张力剂，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH。这样的制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
在某些实施方案中，使用载体制备多肽活性剂，以保护多肽对抗从身体的快速消除。常常使用生物可降解聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸)。用于制备这样的制剂的方法是本领域技术人员已知的。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。脂质体可以根据本领域已知的确定方法来制备(例如，美国专利号No.4,522,811)。
可以在考虑需要治疗的受试者的各种状况下确定本发明方法中的RIPK2抑制剂的给药剂量，所述状况例如，症状的严重性，受试者的一般健康状况，受试者的年龄、体重、性别，膳食，给药的时间和频率，联合使用的药物，对治疗的响应性和治疗顺从性。
治疗方法
在各种实施方案中，本发明还提供了预防或治疗神经退行性疾病或障碍(如帕金森病或阿尔茨海默氏病)的方法，所述方法包括将治疗有效量的受体相互作用蛋白(RIP)激酶2(RIPK2)抑制剂或包含RIPK2抑制剂的药物组合物给药于需要的受试者(例如，人)。可以使用本文所述的任一种RIPK2抑制剂和包含RIPK2抑制剂的药物组合物。例如，有用的RIPK2抑制剂包括可以抑制RIPK2活性和/或其表达的那些。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以是优于其他RIP激酶(如RIPK1和/或RIPK3)的选择性抑制剂，例如，具有约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或更高的选择性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂基本上没有对抗其他RIP激酶的活性。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是双重或多重RIP激酶抑制剂，或泛-RIP激酶抑制剂。
在一些实施方案中，神经退行性疾病或障碍与中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域中的上调的NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2有关。与CNS中上调的NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2相关的各种疾病或障碍可以用本文的方法治疗。非限制性实例包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)、帕金森病、糖尿病性神经病、聚谷氨酰胺(多Q)病、卒中、法尔病、门可氏病、威尔逊氏病、脑缺血、朊粒病、痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性轻瘫、脊髓小脑萎缩、脑损伤或脊髓损伤。
在一些实施方案中，神经退行性疾病或障碍与CNS驻留固有免疫细胞的激活相关。在一些实施方案中，神经退行性疾病或障碍与CNS驻留固有免疫细胞的激活相关，例如，由一种或多种异常蛋白质介导的，如异常聚集的蛋白质。在一些实施方案中，CNS驻留固有免疫细胞是小胶质细胞和/或星形胶质细胞。在一些实施方案中，异常蛋白质包括α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。在一些实施方案中，神经退行性疾病或障碍是帕金森病或阿尔茨海默氏病。在这样的实施方案中，RIPK2抑制剂通常以有效抑制CNS驻留固有免疫细胞激活的量来给药。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以以有效降低从一种或多种激活的驻留固有免疫细胞分泌的一种或多种诱导神经炎症和神经元损伤的炎性或神经毒性介质(TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q和/或IL-6)的量来给药。
某些特定的实施方案涉及治疗或预防帕金森病的方法，包括将治疗有效量的RIPK2抑制剂或包含RIPK2抑制剂的药物组合物给药于需要的受试者(例如，人)。可以使用本文所述的任一种RIPK2抑制剂和包含RIPK2抑制剂的药物组合物。例如，有用的RIPK2抑制剂包括可以抑制RIPK2活性和/或其表达的那些。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以是优于其他RIP激酶(如RIPK1和/或RIPK3)的选择性抑制剂，例如，具有约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或更高的选择性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂基本上没有对抗其他RIP激酶的活性。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是双重或多重RIP激酶抑制剂，或泛-RIP激酶抑制剂。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂是如本文所述的小分子RIPK2抑制剂。
某些实施方案还涉及治疗或预防阿尔茨海默氏病的方法，包括将治疗有效量的RIPK2抑制剂或包含RIPK2抑制剂的药物组合物给药于需要的受试者(例如，人)。可以使用本文所述的任一种RIPK2抑制剂和包含RIPK2抑制剂的药物组合物。例如，有用的RIPK2抑制剂包括可以抑制RIPK2活性和/或其表达的那些。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以是优于其他RIP激酶(如RIPK1和/或RIPK3)的选择性抑制剂，例如，具有约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或更高的选择性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂基本上没有对抗其他RIP激酶的活性。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是双重或多重RIP激酶抑制剂，或泛-RIP激酶抑制剂。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂是如本文所述的小分子RIPK2抑制剂。
在一些实施方案中，本发明还提供了保护受试者的神经元细胞的方法，包括将有效量的RIPK2抑制剂或包含RIPK2抑制剂的药物组合物给药于受试者。在一些实施方案中，所述方法保护神经元细胞免受由胶质增生(小胶质细胞和/或星形胶质细胞的激活)引起的神经炎症和/或毒性，例如由异常蛋白质诸如α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau介导的。在一些实施方案中，受试者患有一种或多种神经退行性疾病或障碍(如，本文所述那些中的任一种)，例如，帕金森病或阿尔茨海默氏病。可以使用本文所述的任一种RIPK2抑制剂和包含RIPK2抑制剂的药物组合物。例如，有用的RIPK2抑制剂包括可以抑制RIPK2活性和/或其表达的那些。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以是优于其他RIP激酶(如RIPK1和/或RIPK3)的选择性抑制剂，例如，具有约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍或更高的选择性。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂基本上没有对抗其他RIP激酶的活性。然而，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂还可以是双重或多重RIP激酶抑制剂，或泛-RIP激酶抑制剂。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂是如本文所述的小分子RIPK2抑制剂。
在本文所述的任一种方法中，RIPK2抑制剂可以配制成用于给药和/或通过计划的给药途径给药于受试者(例如，人)。例如，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以通过静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼内、肌内、颊、直肠、阴道、眶内、脑内、皮内、颅内、脊髓内、脑室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、经粘膜、经皮和/或通过吸入来给药。在一些特定实施方案中，RIPK2抑制剂可以通过口服来给药。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以通过胃肠外给药来给药(例如，注射，如静脉内注射)。通常，以有效抑制一种或多种活性的量来给药RIPK2抑制剂，所述活性选自NFκB的NOD1依赖性激活、NF-κB的NOD2依赖性激活、小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成。
在某些实施方案中，本文所述的RIPK2抑制剂(例如，小分子抑制剂)可以结合至少一种其他治疗活性剂来给药。两种或更多种药剂可以共同给药、共同配制、分开给药或按序给药。例如，在一些实施方案中，所述方法用于治疗帕金森病，并且RIPK2抑制剂可以结合左旋多巴(levodopa)、卡波多巴(carbodopa)或其组合，普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)、司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)、恩他卡朋(entacapone)、托卡朋(tolcapone)、苄托品(benztropine)、苯海索(trihexyphenidyl)或金刚烷胺，或其药学上可接受的盐联合给药。在一些实施方案中，所述方法用于治疗阿尔茨海默氏病，并且RIPK2抑制剂可以结合多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)、美金刚(memantine)、利凡斯的明(rivastigmine)、抗Aβ(淀粉样蛋白β)治疗剂(包括aducanumab、克雷内治单抗(crenezumab)、索拉珠单抗(solanezumab)和gantenerumab)、BACE1的小分子抑制剂(包括verubecestat、AZD3293(LY3314814)、elenbecestat(E2609)、LY2886721、PF-05297909、JNJ-54861911、TAK-070、VTP-37948、HPP854、CTS-21166)或抗tau治疗剂，如LMTM(无色-亚甲蓝-双(氢甲磺酸盐))或其药学上可接受的盐联合给药。
在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以联合其他RIP激酶(如RIPK1、RIPK3、RIPK4和/或RIPK5)的抑制剂来给药。例如，在一些实施方案中，RIPK2抑制剂可以联合RIPK1抑制剂来给药。合适的RIPK1抑制剂包括本领域已知的那些，例如，美国专利No.9,896,458和WO2017/096301中描述的那些，将其内容全部按引用并入本文中。
某些实施方案包括抑制CNS驻留固有免疫细胞激活的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将免疫细胞接触有效量的RIPK2抑制剂(例如，本文所述的)。在一些实施方案中，所述方法抑制由异常蛋白质介导的CNS驻留固有免疫细胞的激活，所述异常蛋白质如异常聚集的蛋白质，例如，α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。在一些实施方案中，所述接触可以在体内。在一些实施方案中，需要时，可以通过各种成像方法测量CNS驻留固有免疫细胞的体内激活或其抑制。例如，Dipont A.C.等描述了用于检测神经退行性疾病中激活的小胶质细胞的转运蛋白18kDa(TSPO)正电子发射断层扫描(PET)成像方法。Intl.J.Mol.Sci.,18(4):785(2017)。例如，在一些实施方案中，接触发生在患有一种或多种神经退行性疾病(例如，本文所述那些中的任何一种，如帕金森病或阿尔茨海默氏病)的受试者的CNS中。在一些实施方案中，接触可以在体外。在一些实施方案中，接触还可以是离体的。在一些实施方案中，RIPK2抑制剂的量与对照(例如，用安慰剂而没用RIPK2抑制剂处理/接触的基本上相同的细胞)相比能够有效降低由CNS驻留固有免疫细胞分泌的一种或多种炎症或神经毒性介质。例如，在一些实施方案中，与对照相比，接触RIPK2抑制剂可有效降低TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6或其组合的水平。
试剂盒
在某些实施方案中，用于治疗神经退行性疾病或其障碍的试剂盒包括至少一种RIPK2抑制剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括标签，所述标签带有用于治疗或给药方法的说明。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括至少一种其他的治疗活性化合物(例如，如本文所述的)。
试剂盒中可以包括两种或多种RIPK2抑制剂，其可以包括小分子、siRNA、shRNA、微RNA、抗体、适体、酶、基因编辑系统、激素、无机化合物、寡核苷酸、有机化合物、多核苷酸、肽或合成的化合物。
实施例
实施例1：人PD死后组织的SNpc中的p-RIPK2升高。
研究理由和目标：这个研究的目的在于研究PD患者的死后人脑组织中磷酸化RIPK2(p-RIPK2)、RIPK2和NOD2的表达并且研究如果NOD2(模式识别受体)可以是针对PD中的小胶质细胞中的α-突触核蛋白聚集物的受体。来自神经学上未损伤的正常受试者(n＝4)的和来自PD受试者(n＝7)的人死后组织样品(黑质，SN)获自约翰·霍普金斯大学病理学系神经病理分部。通过病理学和临床标准证实了PD的诊断。通过免疫染色、PLA、实时PCR和Western印迹分析监测来自PD患者和对照的人死后黑质(SN)脑组织中的p-RIPK2、RIPK2和NOD2水平。
方法
用于PD死后脑的免疫组织化学(IHC)：从约翰·霍普金斯大学病理学系神经病理分部获得福尔马林固定的石蜡包埋的人死后SN组织的10μm厚度的载玻片。将组织切片脱蜡并复水，然后用基于柠檬酸盐的抗原解掩溶液(Vector Laboratories)进行热诱导的表位恢复。然后，将切片用兔多克隆p-RIPK2或Iba-1抗体染色。所有切片均用H&E染色。
原位邻近连接试验。按照制造商的说明，将组织切片用于原位邻近连接试验(Sigma)。简而言之，将切片用提供的封闭缓冲液封闭，并与一抗在4℃下孵育12小时。然后加入与Minus或Plus探针缀合的二抗，并在37℃下孵育1小时。孵育后，将连接混合物添加到每个盖玻片中，并在37℃下孵育30分钟。然后通过加入含有扩增聚合酶的反应溶液来放大信号。苏木精计数器染色后安装盖玻片。
实时RT-PCR(qPCR)：使用
Figure BDA0002956762510000441
Plus Micro Kit(Qiagen)从人SN死后组织和小鼠腹侧中脑组织中分离总RNA。然后用
Figure BDA0002956762510000442
IV第一链合成系统(Invitrogen)合成第一链cDNA。通过ViiATM7实时PCR系统使用SYBR Green试剂进行实时PCR。使用2-ΔΔCT方法(Livak和Schmittgen,Methods 25:402-8，(2001))来计算所述值。将所有ΔCT值归一化至GAPDH。
Western印迹分析：如先前所描述(Ko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107：16691-6(2010))，将人SN的死后组织在含有150mM NaCl，5mM EDTA，10mM Tris-HCl pH 7.4，Nonidet P-40、10mM Na-β-甘油磷酸酯，完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)以及磷酸酶抑制剂混合物I和II(Sigma-Aldrich)的组织裂解缓冲液中匀浆。然后将裂解物用于在2XLaemmli缓冲液(Bio-Rad)中稀释。用8-16％梯度的SDS-PAGE凝胶分离20μg蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜上。在RT下，将硝酸纤维素膜用在含Tris缓冲盐水的0.1％Tween-20中用5％脱脂奶粉封闭1小时。随后将膜与如下一抗孵育：抗NOD2、抗RIPK2和抗pRIPK2抗体在4℃下过夜。洗涤三次后，将膜与HRP缀合的兔或小鼠二抗(GE Healthcare)在RT下孵育1小时。信号用于通过化学发光试剂(Thermo Scientific)的可视化。随后用HRP缀合的β-肌动蛋白抗体(Sigma)再次探测膜。
结果：我们的数据表明在PD患者样品的SN(图1B)中，p-RIPK2免疫反应性显著增加，具有稳健的小胶质细胞激活和路易体(LB)病理(图1A)，并且在PD患者样品的SN中，如通过免疫组织化学评估的，p-RIPK2信号主要与cd-11b阳性小胶质细胞共同定位(图1C)。在PD患者样品的SN中，如通过qPCR分析评估的，NOD2和RIPK2 mRNA水平显著提高(图1D)。此外，PD患者样品的SN中，如通过Western印迹分析评估的，NOD2、RIPK2和p-RIPK2蛋白水平显著提高(图1E-G)。综合起来，这些数据表明了RIPK2的激活部位主要是PD脑中的小胶质细胞，并且过度的RIPK2激活在PD的发病机理中起着关键作用。
为了确定NOD2(模式识别受体)是否可以成为PD小胶质细胞中α-突触核蛋白聚集物的受体，我们进行了原位Duolink邻近连接试验(PLA)，这是能够检测单个蛋白质事件的有力技术，所述事件如蛋白质-蛋白质在体外和体内的相互作用。我们观察到在α-突触核蛋白聚集物和NOD2的特异性抗体的存在下。在PD死后的SN中的大量强阳性信号(图1H)，表明小胶质细胞中α-突触核蛋白聚集物与NOD2之间的相互作用(图1H)。这个数据表明了α-突触核蛋白是NOD2受体的配体。
表1.NOD2和RIPK2的mRNA水平(相对倍数)(关联图1D)。所述值是平均数±S.E.M.，n＝5。(*P<0.05，***P<0.001)。
Mrna 对照 PD
NOD2 1±0.12 2.90±0.83*
RIPK2 1±0.11 3.98±0.49***
表2.NOD2的相对蛋白质水平(关联图1F)。所述值是平均数±S.E.M.，n＝4(对照)，n＝7(PD)。(*P<0.05)。
蛋白质 对照 PD
NOD2 1.00±0.16 1.63±0.15*
表3.p-RIPK2和RIPK2的相对蛋白质水平(关联图1G)。所述值是平均数±S.E.M.，n＝4(对照)，n＝7(PD)。(**P<0.01，***P<0.001)。
蛋白质 对照 PD
NOD2 1.00±0.16 1.63±0.15*
实施例2：α-突触核蛋白PFF激活的小胶质细胞在体外诱导RIPK2、NOD1和NOD2。
研究理由和目标：这个研究的目的在于通过qPCR分析来研究α-突触核蛋白是否在原代小胶质细胞中诱导RIPK2、NOD1和NOD2的mRNA表达。
方法
比较qPCR：按照公司提供的说明，使用RNA分离试剂盒(Qiagen，CA)提取培养细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Biotek，Winooski，VT)通过分光光度法测量了RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY)，将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master混合物(Life Technologies)和ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品进行一式两份或一式三份的比较qPCR。将靶向的基因的表达水平归一化至β-肌动蛋白的表达，并基于比较循环阈值Ct法(2-ΔΔCt)来计算。
结果：我们使用接受无内毒素的α-突触核蛋白PFF处理的原代小胶质细胞从RNAseq分析获得了总共>600个的差异表达的基因。其中，NOD2和RIPK2排在前列。我们证实了RIPK2和NOD2的mRNA水平在α-突触核蛋白PFF激活的小胶质细胞中显著提高，因此可以是用于脑中与激活的小胶质细胞相关的神经退行性障碍的治疗靶标。
表4.正常(PBS)和α-突触核蛋白PFF激活的小鼠原代小胶质细胞中的RIPK2、NOD1和NOD2的mRNA水平(相对倍数)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(**P<0.01，***P<0.001)。
Mrna PBS α-突触核蛋白PFF
RIPK2 1±0.14 38.75±2.81***
NOD1 1±0.16 2.56±0.27**
NOD2 1±0.13 19.33±1.82***
实施例3.NOD2或RIPK2的耗竭遏制了α-突触核蛋白PFF诱导的小胶质细胞激活和A1反应性星形胶质细胞。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)通过用α-突触核蛋白PFF激活的原代小胶质细胞评估在细胞因子产生(如TNFα、IL-1α和补体C1q(A1星形胶质细胞诱导剂))方面NOD2或RIPK2的耗竭效应，2)研究在由激活的小胶质细胞诱导的神经毒性和反应性A1星形胶质细胞分化方面NOD2或RIPK2的耗竭效应，和3)研究在反应性A1星形胶质细胞诱导的神经元毒性方面NOD2或RIPK2的耗竭效应。为此，采用了qPCR和神经元毒性试验。
方法
α-突触核蛋白纯化和α-突触核蛋白PFF制备：按照先前所述的，用IPTG-无关性诱导型pRK172载体系统(Nat.Protoc.9:2135-46(2014))纯化了重组小鼠α-突触核蛋白。通过ToxinEraser内毒素去除试剂盒(Genscript，NJ，USA)耗竭了内毒素。在PBS中制备了α-突触核蛋白PFF(5mg ml-1)，同时用磁搅拌器搅拌(1,000rpm，37℃)。在α-突触核蛋白孵育一周后，将聚集物用PBS稀释至0.1mg ml-1并以10％振幅超声波处理30s(0.5s脉冲开/关)(Branson Digital sonifier，Danbury，CT，USA)。使用原子力显微镜和透射电子显微镜对α-突触核蛋白PFF进行了验证，并使用免疫染色证实了诱导磷酸-丝氨酸129α-突触核蛋白(p-α-synSer129)的能力。将α突触核蛋白PFF储存在-80℃直至使用。
原代神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞培养，以及α-突触核蛋白PFF处理：NOD2或RIPK2敲除小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)。从胚胎的第15.5天幼崽开始制备原代皮层神经元，并在包覆了聚-L-赖氨酸的组织培养板上的补充有B-27、0.5mM L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)的Neurobasal培养基(Gibco)中培养。每3-4天更换培养基来维持神经元。如先前所述(PMID：26157004)的进行了原代小胶质细胞和星形胶质细胞培养。在出生后第1天(P1)从小鼠的幼崽获得了全脑。除去脑膜后，在补充有10％热灭活的FBS，50U ml-1青霉素，50μg ml-1链霉素，2mM L-谷氨酰胺，100μM非必需氨基酸和2mM-丙酮酸钠的DMEM/F12(Gibco)(DMEM/F12完全培养基)中将脑洗涤三次。将脑转移至0.25％胰蛋白酶-EDTA中，接着温和搅动10min。使用DMEM/F12完全培养基来停止胰酶消化。将脑在这个培养基中再次洗涤三次。通过研磨获得了单细胞悬液。通过将单细胞悬液通过100-μm尼龙网来除去细胞碎片和聚集物。将由此获得的最终单细胞悬液在T75培养瓶中培养13天，在第6天更换完全培养基。使用EasySep小鼠CD11b阳性选择试剂盒(StemCell)将混合的胶质细胞群分成富含星形胶质细胞的部分和富含小胶质细胞的部分。将磁分离的含有小胶质细胞的部分和流出的含有星形胶质细胞的部分分开培养。
用α-突触核蛋白PFF(终浓度1μg/mL)处理从野生型(WT)、NOD2敲除(KO)、RIPK2 KO小鼠制备的小胶质细胞30min，接着进行qPCR试验。
收集来自接受α-突触核蛋白PFF处理的原代野生型小胶质细胞(WT PFFs-MCM)、NOD2敲除小胶质细胞(NOD2-/-PFF-MCM)或RIPK2敲除小胶质细胞(RIPK2-/-PFFs-MCM)的条件培养基并施加于原代星形胶质细胞24h。用完全的、Mini、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)收集通过以下的来自激活的星形胶质细胞的条件培养基：1)WT PFFs-MCM，我们将其定义为α-syn PFF-ACM，2)NOD2-/-PFFs-MCM，我们将其定义为NOD2-/-PFFs-ACM，3)RIPK2-/-PFFs-MCM，我们将其定义为RIPK2-/-PFF-ACM，并用Amicon Ultra-15离心过滤单元(10kDa截留)(Millipore)浓缩，直至浓缩50×。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoScientific)确定了总蛋白浓度，并且将15或50μg ml-1的总蛋白加入小鼠原代神经元中，用于神经元细胞死亡试验。
比较qPCR：按照公司提供的说明，使用RNA分离试剂盒(Qiagen，CA)提取培养细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Biotek，Winooski，VT)通过分光光度法测量了RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY)，将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master混合物(Life Technologies)和ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品进行一式两份或一式三份的比较qPCR。将靶向的基因的表达水平归一化至β-肌动蛋白的表达，并基于比较循环阈值Ct法(2-ΔΔCt)来计算。
通过LDH和Alamar蓝试验的细胞活力：用PFF-ACM或NOD2-/-PFF-ACM或RIPK2-/-PFF-ACM处理原代培养的皮层神经元24hr。通过两种方法测定了细胞活力：AlamaBlue(Invitrogen)和LDH试验(Sigma)。根据制造商的实验方案，通过AlamarBlue试验评估了细胞死亡。遵循制造商的说明，使用LDH试验试剂盒通过分光光度法测量了培养基中的LDH活性，这表示了相对细胞活力和膜完整性。对于每个条件，测定了一式三份的孔。
结果：我们的数据表明了α-突触核蛋白PFF可以诱导小胶质细胞中的TNFα、IL-1α和C1q，称为反应性A1星形胶质细胞诱导剂(图3A、3B和3C)，并转化A1星形胶质细胞(图3D)。重要地，小胶质细胞中的NOD2或RIPK2的耗竭遏制了A1星形胶质细胞诱导剂从小胶质细胞(图3A、3B和3C)的释放和随后的A1星形胶质细胞转化(图3D)。α-突触核蛋白PFF诱导的A1星形胶质细胞条件培养基(PFF-ACM)对原代皮层神经元是有毒的，而NOD2-/-PFF-ACM或RIPK2-/-PFF-ACM毒性显著更低(图3E和3F)。这个结果清楚地表明了RIPK2和/或NOD2活性的抑制阻断了小胶质细胞的激活和神经毒性A1星形胶质细胞形成的形成；由此保护了神经元。
表5.C1q的mRNA水平(相对倍数)(关联图3A)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(***P<0.001)。
Mrna 对照 PFFs
WT 1±0.02 2.91±0.55***
NOD2<sup>-/-</sup> 1±0.03 1.10±0.02<sup>NS</sup>
RIPK2<sup>-/</sup>- 1±0.01 1.37±0.10<sup>NS</sup>
表6.TNFα的mRNA水平(相对倍数)(关联图3B)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(***P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000501
Figure BDA0002956762510000511
表7.IL-1α的mRNA水平(相对倍数)(关联图3C)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(***P<0.001)。
Mrna 对照 PFFs
WT 1±0.13 1831.49±137.34***
NOD2<sup>-/</sup>- 1±0.18 1097.87±25.48***
RIPK2<sup>-/</sup>- 1±0.15 473.40±20.25***
表8.荧光强度(对照的％；关联图3E)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(**P<0.01，***P<0.001)。
强度 PBS对照 PFFs
WT 100.00±1.16 43.33±1.45***
NOD2<sup>-/-</sup> 97.67±0.88 89.04±3.61<sup>NS</sup>
RIPK2<sup>-/-</sup> 98.67±1.45 85.67±1.48**
表9.LDH释放(阳性对照的％；关联图3F)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(*P<0.05，***P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000512
Figure BDA0002956762510000521
实施例4.NOD2或RIPK2的耗竭遏制α-突触核蛋白PFF诱导的小胶质细胞形态变化和迁移。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)评估在α-突触核蛋白PFF诱导的形态变化和迁移方面NOD2或RIPK2的耗竭效应。为此，使用了形态学试验、qPCR和迁移试验。
方法
形态学试验：将原代培养的小胶质细胞接种到聚D-赖氨酸包覆的12孔-平板上。12小时的α-突触核蛋白PFF处理后，对小胶质细胞的形态变化的阿米巴形式进行计数。细胞用DAPI复染。
比较定量实时PCR(qPCR)：按照公司提供的说明，使用RNA分离试剂盒(Qiagen，CA)提取培养细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Biotek，Winooski，VT)通过分光光度法测量了RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY)，将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master混合物(Life Technologies)和ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品进行一式两份或一式三份的比较qPCR。将靶向的基因的表达水平归一化至β-肌动蛋白的表达，并根据比较循环阈值Ct法(2-ΔΔCt)来计算。
迁移试验：对于体外细胞迁移测定，将原代培养的小胶质细胞接种到培养皿的聚D-赖氨酸包覆的12孔聚碳酸酯细胞培养插入物和底部上。在培养皿中进行12小时的α-synPFF处理后，用Iba-1抗体对插入物底侧上的迁移小胶质细胞进行染色。然后通过Iba-1阳性迁移的小胶质细胞数目相对于PBS对照之间的比率计算迁移指数。
结果：我们的数据表明了α-突触核蛋白明显诱导了小胶质细胞形态变化。小胶质细胞中NOD2或RIPK2的缺失遏制了小胶质细胞的阿米巴形式(图4A和4B)。在NOD2-/-或RIPK2-/-小胶质细胞中，PFF诱导的促炎基因，诸如IL-1α和iNOS的mRNA表达剧烈减少(图4C和4D)。在NOD2-/-和RIPK2-/-小胶质细胞中的迁移能力和趋化因子Cxcl1表达也降低了(图4E、4F、4G和4H)。
表10.形态变化的小胶质细胞(变化的小胶质细胞的数量；关联图4B)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(*P<0.05，***P<0.001)。
变化的细胞# PBS对照 PFFs
WT 1.00±0.13 18.97±3.82**
NOD2<sup>-/-</sup> 0.93±0.15 3.14±0.97*
RIPK2<sup>-/</sup>- 0.97±0.11 6.52±1.71*
表11.IL-1α的mRNA水平(相对倍数)(关联图4C)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(**P<0.01，***P<0.001)。
阳性对照的％ PBS对照 PFFs
WT 1.00±0.14 1750.70±62.83***
NOD2<sup>-/-</sup> 1.00±0.16 527.69±81.76***
RIPK2<sup>-/-</sup> 1.00±0.32 267.74±10.08**
表12.iNOS的mRNA水平(相对倍数)(关联图4D)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(**P<0.01，***P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000531
Figure BDA0002956762510000541
表13.Cxcl1的mRNA水平(相对倍数)(关联图4E)。所述值是平均数±SEM，n＝3(*P<0.05，**P<0.01)。
阳性对照的％ PBS对照 PFFs
WT 1.00±0.18 170.03±22.86**
NOD2<sup>-/-</sup> 1.00±0.09 3.55±0.77*
RIPK2<sup>-/</sup>- 1.00±0.08 4.58±0.74*
表14.小胶质细胞的迁移指数(关联图4C)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(*P<0.05，**P<0.01)。
迁移指数 PBS对照 PFFs
WT 1.00±0.11 11.04±1.72***
NOD2<sup>-/-</sup> 0.97±0.14 3.41±0.59<sup>NS</sup>
RIPK2<sup>-/-</sup> 0.98±0.16 3.97±0.22*
实施例5：RIPK2的抑制剂在体外遏制了α-突触核蛋白PFF诱导的小胶质细胞激活和A1反应性星形胶质细胞。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)通过用α-突触核蛋白PFF激活的原代小胶质细胞评估RIPK2抑制剂对细胞因子产生(如TNFα、IL-1α和补体C1q(反应性星形胶质细胞诱导剂))的作用，2)研究RIPK2抑制剂对由激活的小胶质细胞诱导的A1神经毒性星形胶质细胞的形成的作用，和3)研究RIPK2抑制剂对反应性A1星形胶质细胞诱导的神经元毒性的作用。为此，使用了qPCR和神经元毒性试验。
方法
α-突触核蛋白纯化和α-突触核蛋白PFF制备：按照先前所描述的，用IPTG-无关性诱导型pRK172载体系统(Nat.Protoc.9:2135-46(2014))，纯化了重组小鼠α-突触核蛋白。通过ToxinEraser内毒素去除试剂盒(Genscript，NJ，USA)耗竭了内毒素。在PBS中制备了α-突触核蛋白PFF(5mg ml-1)，同时用磁搅拌器搅拌(1,000rpm，37℃)。在α-突触核蛋白孵育一周后，将聚集物用PBS稀释至0.1mg ml-1并以10％振幅超声波处理30s(0.5s脉冲开/关)(Branson Digital sonifier，Danbury，CT，USA)。使用原子力显微镜和透射电子显微镜对α-突触核蛋白PFF进行了验证，并使用免疫染色证实了诱导磷酸-丝氨酸129α-突触核蛋白(p-α-synSer129)的能力。将α突触核蛋白PFF储存在-80℃直至使用。
原代神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞培养，以及α-突触核蛋白PFF处理：NOD2或RIPK2敲除小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME，USA)。从胚胎的第15.5天幼崽开始制备原代皮层神经元，并在包覆了聚-L-赖氨酸的组织培养平板上的补充有B-27、0.5mM L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)的Neurobasal培养基(Gibco)中培养。每3-4天更换培养基来维持神经元。如先前所述(PMID：26157004)的进行了原代小胶质细胞和星形胶质细胞培养。在出生后第1天(P1)从小鼠的幼崽获得了全脑。除去脑膜后，在补充有10％热灭活的FBS，50U ml-1青霉素，50μg ml-1链霉素，2mM L-谷氨酰胺，100μM非必需氨基酸和2mM-丙酮酸钠的DMEM/F12(Gibco)(DMEM/F12完全培养基)中将脑洗涤三次。将脑转移至0.25％胰蛋白酶-EDTA中，接着温和搅动10min。使用DMEM/F12完全培养基来停止胰酶消化。将脑在这个培养基中再次洗涤三次。通过研磨获得了单细胞悬液。通过将单细胞悬液通过100-μm尼龙网来除去细胞碎片和聚集物。将由此获得的最终单细胞悬液在T75烧瓶中培养13天，在第6天更换完全培养基。使用EasySep小鼠CD11b阳性选择试剂盒(StemCell)将混合的胶质细胞群分成富含星形胶质细胞的部分和富含小胶质细胞的部分。将磁分离的含有小胶质细胞的部分和流出的含有星形胶质细胞的部分分开培养。
将吉非替尼或GSK583(10μM)加入从WT、NOD2 KO或RIPK2 KO制得的小胶质细胞中30min，并将α-突触核蛋白PFF(终浓度1μg/mL)再孵育4h，接着进行qPCR。
从接受α-突触核蛋白PFF处理的原代野生型小胶质细胞(PFF-MCM)、吉非替尼处理的小胶质细胞(PFF-吉非替尼-MCM)或GSK583处理的小胶质细胞(PFF-GSK583-MCM)收集条件培养基并施加于原代星形胶质细胞24h。收集通过以下激活的来自激活的星形胶质细胞的条件培养基：1)PFF-MCM，我们将其定义为PFF-ACM，2)PFF-吉非替尼-MCM，我们将其定义为PFF吉非替尼-ACM，3)PFF-GSK583-MCM，我们将其定义为PFF-GSK583-ACM，加完全的、Mini、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，并用Amicon Ultra-15离心过滤单元(10kDa截留)(Millipore)浓缩，直至浓缩50×。使用Pierce BCA蛋白试验试剂盒(ThermoScientific)测定了总蛋白浓度，并且将15或50μg ml-1的总蛋白加入小鼠原代神经元中，用于神经元细胞死亡试验。
比较qPCR：按照公司提供的说明，使用RNA分离试剂盒(Qiagen，CA)提取培养细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Biotek，Winooski，VT)通过分光光度法测量了RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY)，将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master混合物(Life Technologies)和ViiA7实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品进行一式两份或一式三份的比较qPCR。将靶向的基因的表达水平均一化至β-肌动蛋白的表达，并根据比较循环阈值Ct法(2-ΔΔCt)来计算。
通过LDH和Alamar蓝试验的细胞活力：用PFF-ACM、PFF-吉非替尼-MCM或PFF-GSK583-ACM处理原代培养的皮层神经元24hr。通过两种方法测定了细胞活力：AlamaBlue(Invitrogen)和LDH试验(Sigma)。根据制造商的实验方案，通过AlamarBlue试验评估了细胞死亡。按照制造商的说明，使用LDH试验试剂盒通过分光光度法测量了培养基中的LDH活性，这表示相对细胞活力和膜完整性。对于每个条件，测定了一式三份的孔。
结果：我们的数据表明了α-突触核蛋白PFF诱导小胶质细胞(图5A、5B和5C)中的TNFα、IL-1α和C1q，并转化反应性、神经毒性A1星形胶质细胞(图5D)。小胶质细胞中RIPK2抑制剂(如吉非替尼或GSK583)遏制了A1星形胶质细胞诱导剂从小胶质细胞(图5A、5B和5C)的释放和随后的A1星形胶质细胞转化(图5D)。α-突触核蛋白PFF诱导的A1星形胶质细胞条件培养基(PFF-ACM)对原代皮层神经元是有毒的，而吉非替尼或GSK583的处理显著防止了主要由神经毒性星形胶质细胞诱导的神经元细胞死亡(图5E和5F)。
表15.C1q的mRNA水平(相对倍数)(关联图5A)。所述值是平均数±SEM.，n＝3。(***P<0.001)。
mRNA 对照 PFFs
WT 1±0.02 2.91±0.55***
NOD2<sup>-/</sup>- 1±0.03 1.58±0.29***
RIPK2<sup>-/-</sup> 1±0.02 1.44±0.11***
表16.TNFα的mRNA水平(相对倍数)(关联图5B)。所述值是平均数±SEM.，n＝3。(***P<0.001)。
mRNA 对照 PFFs
WT 1±0.21 483.69±23.85***
NOD2<sup>-/</sup>- 1±0.14 366.45±6.70***
RIPK2<sup>-/</sup>- 1±0.19 340.23±16.65***
表17.IL-1α的mRNA水平(相对倍数)(关联图5C)。所述值是平均数±SEM.，n＝3。(***P<0.001)。
mRNA 对照 PFFs
WT 1±0.13 1831.49±137.34***
NOD2<sup>-/</sup>- 1±0.12 504.48±14.87***
RIPK2<sup>-/</sup>- 1±0.31 452.113±14.334***
表18.荧光强度(对照的％，关联图5E)。所述值是平均数±SEM.，n＝3。(***P<0.001)。
强度 PBS对照 PFFs
WT 100.00±1.16 43.33±1.45***
NOD2<sup>-/-</sup> 95.67±1.20 83.67±6.57<sup>NS</sup>
RIPK2<sup>-/-</sup> 94.33±1.67 83.33±4.63<sup>NS</sup>
表19.LDH释放(阳性对照的％，关联图5F)。所述值是平均数±SEM，n＝3。(***P<0.001)。
阳性对照的％ PBS对照 PFFs
WT 12.31±0.88 63.33±3.18***
NOD2<sup>-/-</sup> 11.38±1.45 19.07±3.01<sup>NS</sup>
RIPK2<sup>-/-</sup> 12.32±3.48 29.33±7.22<sup>NS</sup>
实施例6：在α-突触核蛋白PFF诱发的PD动物模型中，NOD2或RIPK2的耗竭显著改善了路易体(LB)病理并遏制了小胶质细胞激活。
研究理由和目标：这个研究的目的在于在α-突触核蛋白PFF模型PD中研究NOD2或RIPK2耗竭的抗PD功效，以验证NOD2或RIPK2是否可以是用于PD的可行治疗靶标。
方法
用于立体定位α-突触核蛋白PFF注射的小鼠株系：NOD2或RIPK2敲除小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。所有的饲养、繁殖和程序均按照NIH实验动物的护理和使用指南(NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals)进行，并获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的批准。
α-突触核蛋白纯化和α-突触核蛋白PFF制备：按照先前所述的，用IPTG-无关性诱导型pRK172载体系统，纯化了重组小鼠α-突触核蛋白。通过ToxinEraser内毒素去除试剂盒(Genscript，NJ，USA)耗竭了内毒素。在PBS中制备了α-突触核蛋白PFF(5mg ml-1)，同时用磁搅拌器搅拌(1,000rpm，37℃)。在α-突触核蛋白孵育一周后，将聚集物用PBS稀释至0.1mgml-1并以10％振幅超声波处理30s(0.5s脉冲开/关)(Branson Digital sonifier，Danbury，CT，USA)。使用原子力显微镜和透射电子显微镜对α-突触核蛋白PFF进行了验证，并使用免疫染色证实了诱导磷酸-丝氨酸129α-突触核蛋白(p-α-synSer129)的能力。将α突触核蛋白PFF储存在-80℃直至使用。
立体定位α-突触核蛋白PFF注射和免疫组织化学(IHC)：为了α-突触核蛋白PFF的立体定位注射，将3个月大的NOD2 KO或RIPK2 KO雄性和雌性用赛拉嗪(xylazene)和氯胺酮麻醉。将注射套管(26.5规格)立体定向地单侧施用到右半球的纹状体(STR)(中外侧，距前囟2.0mm；前后位，0.2mm；背腹，2.6mm)。以每分钟0.2μL的速率输注2μLα-突触核蛋白PFF(在PBS中为2.5μg/mL)或相同体积的PBS。最终剂量后，将注射套管在STR中再保持5分钟，以完全吸收α-突触核蛋白PFF或PBS，然后从小鼠脑中缓慢取出。通过缝合闭合头部皮肤，并在手术后监测伤口的愈合和恢复。为了进行IHC分析，在纹状体α-突触核蛋白PFF注射后3个月，对动物用冰冷的PBS接着用4％的多聚甲醛进行灌注并进行心内固定。取出脑并进行免疫组织化学处理。单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射后3个月进行了pS129-α-突触核蛋白或Iba-1的IHC。
结果：通过IHC评估，NOD2或RIPK2的耗竭显著改善了路易体(LB)病理(图7A)，并遏制了α突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠模型的腹侧中脑中的小胶质细胞激活(图7B)。这些结果清楚地表明，抑制NOD2和/或RIPK2活性可能是PD的可行治疗靶标。
表20.SN中的p-αSyn和小胶质细胞密度的阳性信号(关联图6A)。所述值是平均数±SEM，n＝5。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
WT+PFFs RIPK2<sup>-/-</sup>+PFFs NOD2<sup>-/-</sup>+PFFs
p-αSyn<sup>+</sup>信号# 32.67±13.58 13.67±4.163** 7.67±2.08***
小胶质细胞的# 1138.72±91.48 683.24±71.52* 561.82±52.73**
实施例7：NOD2或RIPK2的耗竭显著遏制了PD小鼠中的小胶质细胞激活和反应性星形胶质细胞形成。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)在α-突触核蛋白PFF诱导的PD小鼠模型中评估在细胞因子产生(如TNFα、IL-1α和补体C1q(A1诱导剂))方面NOD2或RIPK2的耗竭效应，2)研究在α-突触核蛋白PFF诱导的PD小鼠模型中在A1神经毒性星形胶质细胞分化方面NOD2或RIPK2的耗竭效应，和3)研究在α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠模型中在神经元毒性方面NOD2或RIPK2的耗竭效应。为此，使用了qPCR和Western印迹分析。
方法
组织裂解物制备：通过在RIPA缓冲液[50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，1％Nonidet P-40，1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，磷酸酶抑制剂混合物II和III(Sigma-Aldrich)以及完全蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)]中将组织匀浆来制备总裂解物。匀浆后，将样品在4℃下旋转30min以进行完全裂解，将匀浆液在22,000×g离心20min，并收集上清液。使用BCA试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)和BSA标品对蛋白质水平进行定量，并通过免疫印迹进行分析。
比较定量实时PCR(qPCR)：按照公司提供的说明，使用RNA分离试剂盒(Qiagen，CA)提取用或未用α-突触核蛋白PFF注射的WT、NOD2 KO或RIPK2 KO小鼠的腹侧中脑分离的小胶质细胞或星形胶质细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Biotek，Winooski，VT)通过分光光度法测量了RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY)，将1-2μg的总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master混合物(Life Technologies)和ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)对每个样品进行一式两份或一式三份的比较qPCR。将靶向的基因的表达水平均一化至β-肌动蛋白的表达，并根据比较循环阈值Ct法(2-ΔΔCt)来计算。
免疫印迹分析：在8-16％和4-20％梯度SDS-PAGE凝胶上进行电泳，以分解从小鼠脑组织获得的10-20μg蛋白质。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜用封闭溶液(含5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水)封闭1hr，并在4℃下与抗Iba-1(Abcam)和抗GFAP(EMD Millipore)抗体孵育过夜，然后用HRP缀合的兔的小鼠二抗(1:50,000，GEHealthcare，Pittsburgh，PA，USA)在RT下孵育1hr。通过增强的化学发光(ThermoScientific，IL，USA)使条带可视化。最后，将膜剥离后，用HRP缀合的β-肌动蛋白抗体(1:40,000，Sigma-Aldrich)重新探测。
结果：与体外原代小胶质细胞的结果一致，纹状体内注射α-突触核蛋白PFF在腹侧中脑的小胶质细胞中诱导称为反应性A1星形胶质细胞诱导剂的TNFα、IL-1α和补体C1q的mRNA表达。NOD2或RIPK2的耗竭显著阻断了这种诱导(图7A，7B和7C)。还通过qPCR在从腹侧中脑分离的原代星形胶质细胞中评估了一般的星形胶质细胞反应性、A1-和A2-特异性mRNA水平。纹状体内注射α-突触核蛋白PFF主要诱导A1特异性转录物，并且这可以通过NOD2或RIPK2的耗竭来防止(图7D)。纹状体内注射α-突触核蛋白PFF诱导Iba-1(激活的小胶质细胞标记物)和GFAP(激活的星形胶质细胞标记物)，在腹侧中脑中表达，这被NOD2或RIPK2的耗竭所阻断(图7E，7F和7G)，如通过Western印迹分析评估的。这些结果表明抑制NOD2和/或RIPK2抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，从而保护脑中的神经元。
表21.IL-1α的mRNA水平(相对倍数)(关联图7A)。所述值是平均数±SEM，n＝4。
Figure BDA0002956762510000621
Figure BDA0002956762510000631
表22.TNFα的mRNA水平(相对倍数)(关联图7B)。所述值是平均数±SEM，n＝4。
mRNA 对照 PFFs
WT 1.00±0.21 12.48±1.36
NOD2<sup>-/</sup>- 0.89±0.16 3.69±1.48
RIPK2<sup>-/-</sup> 1.03±0.17 4.92±1.31
表23.C1q的mRNA水平(相对倍数)(关联图7C)。所述值是平均数±SEM，n＝4。
mRNA 对照 PFFs
WT 1.00±0.14 3.25±0.41
NOD2<sup>-/-</sup> 0.96±0.15 1.34±0.23
RIPK2<sup>-/-</sup> 1.05±0.12 1.52±0.21
表24.腹侧中脑中的蛋白质表达。n＝4。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000632
Figure BDA0002956762510000641
实施例8：NOD2或RIPK2的耗竭拯救了α-突触核蛋白PFF诱导的体内多巴胺能神经变性和多巴胺能末端损失。
研究理由和目标：这个研究的目的在于研究NOD2或RIPK2耗竭在α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠模型中的抗PD功效。为此，将α-突触核蛋白PFF注射至NOD2 KO或RIPK2 KO小鼠的纹状体中。α-syn PFF注射后6个月时，将动物用于各种神经病理学和神经行为评估。
方法
用于立体定位α-突触核蛋白PFF注射的小鼠株系：NOD2 KO或RIPK2 KO小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。所有的饲养、繁殖和程序均按照NIH实验动物的护理和使用指南(NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals)进行，并获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的批准。
α-突触核蛋白纯化和PFF制备：按照先前所述的，用IPTG-无关性诱导型pRK172载体系统，纯化了重组小鼠α-突触核蛋白。通过ToxinEraser内毒素去除试剂盒(Genscript，NJ，USA)耗竭了内毒素。在PBS中制备了α-突触核蛋白PFF(5mg ml-1)，同时用磁搅拌器搅拌(1,000rpm，37℃)。在α-突触核蛋白孵育一周后，将聚集物用PBS稀释至0.1mg ml-1并以10％振幅超声波处理30s(0.5s脉冲开/关)(Branson Digital sonifier，Danbury，CT，USA)。使用原子力显微镜和透射电子显微镜对α-突触核蛋白PFF进行了验证，并使用免疫染色证实了诱导磷酸-丝氨酸129α-突触核蛋白(p-α-synSer129)的能力。将α突触核蛋白PFF储存在-80℃直至使用。
立体定位α-突触核蛋白PFF注射：为了α-突触核蛋白PFF的立体定位注射，将3个月大的NOD2或RIPK2 KO雄性和雌性小鼠用赛拉嗪和氯胺酮麻醉。将注射导管(26.5规格)立体定向地单侧施用到右半球的纹状体(STR)(中外侧，距前囟2.0mm；前后位，0.2mm；背腹，2.6mm)。以每分钟0.2μL的速率输注2μLα-突触核蛋白PFF(在PBS中为2.5μg/mL)或相同体积的PBS。最终剂量后，将注射套管在STR中再保持5min，以完全吸收α-突触核蛋白PFF或PBS，然后从小鼠脑中缓慢取出。通过缝合闭合头部皮肤，并在手术后监测伤口的愈合和恢复。为了立体学分析，在纹状体α-突触核蛋白PFF注射后6个月，对动物先用冰冷的PBS接着用4％的多聚甲醛进行灌注和心内固定。取出脑并加工用于免疫组织化学或免疫荧光。单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射后6个月进行了行为测试。
酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学和定量分析：用冰冷的PBS灌注小鼠，然后用4％多聚甲醛/PBS(pH 7.4)固定。收集脑并在4％多聚甲醛中固定后过夜，然后在30％蔗糖/PBS(pH 7.4)溶液中孵育。将脑冷冻在OCT缓冲液中，并用切片机切下30μm连续冠状切片。用4％山羊或马血清/PBS加0.2％Triton X-100封闭自由漂浮的30μm切片，并用抗TH抗体(NovusBiologicals，Littleton，CO，USA)孵育，然后用生物素缀合的抗兔抗体(Vectastain EliteABC Kit，Vector laboratories，Burlingame，CA，USA)孵育。使用SigmaFast DAB过氧化物酶底物(Sigma-Aldrich)显影后，将切片用Nissl(0.09％硫醚)复染。对来自SNc区的TH阳性和Nissl阳性DA神经元通过光学分级器进行计数，这是通过使用计算机辅助图像分析系统来进行细胞计数的无偏方法，该系统由配有计算机控制的机械化平台(Ludl Electronics)的Axiophot显微显微镜(Carl Zeiss Vision)、Hitachi HV C20相机和StereoInvestigator软件(MicroBright-Field)组成。使用ImageJ软件(NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)通过光密度(OD)测量分析纹状体中的纤维密度。
免疫印迹分析：使用Diax 900匀浆机(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，在裂解缓冲液[(10mM Tris-HCL，pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5％Nonidet P-40，10mM Na-β-甘油磷酸，磷酸盐抑制剂混合物I和II(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)以及完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)]中将小鼠脑组织匀浆并制备。匀浆后，将样品在4℃下旋转30min以进行完全裂解，将匀浆液在15,000rpm下离心20min，并收集上清液。使用BCA试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)和BSA标品对蛋白质水平进行定量，并通过免疫印迹进行分析。在8-16％和4-20％梯度SDS-PAGE凝胶上进行电泳，以分解从小鼠脑组织获得的10-20μg蛋白质。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜用封闭溶液(含5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水)封闭1小时，并在4℃下与抗TH(1:2000，Novus Biologicals，Littleton，CO，USA)、抗DAT孵育过夜，接着用HRP缀合的兔的小鼠二抗(1:50,000，GEHealthcare)和HRP缀合的小鼠的驴二抗(1:10000，GE Healthcare)在RT下孵育1hr。通过增强的化学发光(Thermo Scientific)使条带可视化。最后，将膜剥离后，用HRP缀合的β-肌动蛋白抗体(1:50,000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)重新探测。
爬杆测试：使小鼠在行为程序室适应30min。标杆由直径为9毫米的75厘米金属棒制成。将小鼠面对头朝上方向放在标杆顶部(距标杆顶部7.5cm)。记录到达标杆基部所需的总时间。在实际测试之前，连续两天对小鼠进行训练。每个训练阶段由三个测试试验组成。在测试当天，在三个阶段中对小鼠进行评估，并记录总时间。停止测试和记录的最大截止时间为60秒。记录转身朝下、爬下和总时间(以sec计)的结果。
握力测试：使用Bioseb握力测试仪(BIO-GS3，Bioseb，FL USA)进行神经肌肉力量测试。小鼠的表现评估三次。为了评估握力，允许小鼠的前肢或前肢和后肢同时抓住金属网格。小鼠释放对网格的抓握力时，轻轻拉动尾巴，并通过力传感器记录最大保持力。通过数字记录峰值保持强度，并以克为单位显示力。握力强度以克(g)单位计分。
结果：通过NOD2或RIPK2的耗竭拯救了α-突触核蛋白PFF诱发的纹状体酪氨酸羟化酶免疫反应性的降低(图8A和8B)。Western印迹分析表明α-突触核蛋白PFF介导的酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白(DAT)免疫反应性的降低通过腹侧中脑中NOD2或RIPK2的耗竭得以恢复(图8D)。α-突触核蛋白PFF注射诱导SNpc中酪氨酸羟化酶-和NissI-阳性神经元的大量损失，这可以通过NOD2或RIPK2耗竭来防止(图8C，8E和8F)。NOD2或RIPK2的耗竭还显著减少了α-突触核蛋白PFF注射引起的行为缺陷，如通过抓握强度(图8G)和标杆测试(图8H)所测量的。这些结果清楚地表明了体内NOD2和/或RIPK2活性的抑制保护了神经元并改善了PD。
表25.TH阳性纤维的光学密度、多巴胺能神经元的数量、蛋白质表达和行为缺陷(关联图8B、8E、8F、8G、8H、8I和8J)。n＝5。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000671
Figure BDA0002956762510000672
Figure BDA0002956762510000681
Figure BDA0002956762510000682
Figure BDA0002956762510000683
实施例9：α-突触核蛋白PFF诱发的PD动物模型中口服给药的RIPK2抑制剂改善了LB病理并遏制了小胶质细胞激活。
研究理由和目标：这个研究的目的在于研究吉非替尼(RIPK2抑制剂)在α-突触核蛋白PFF模型PD中的抗PD功效。为此，将α-突触核蛋白PFF注射到NOD2 KO或RIPK2 KO的纹状体中。1个月的纹状体α-突触核蛋白PFF注射5个月后，用吉非替尼(Gef)(30mg/kg，每天一次)口服治疗α-突触核蛋白PFF诱发的PD小鼠，并对组织进行分析。
方法
用于立体定位α-突触核蛋白PFF注射的小鼠株系：NOD2或RIPK2 KO小鼠获自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。所有的饲养、繁殖和程序均按照NIH实验动物的护理和使用指南(NIH Guide for the Care and Use of Experimental Animals)进行，并获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的批准。
α-突触核蛋白纯化和PFF制备：按照先前所述的，用IPTG-无关性诱导型pRK172载体系统，纯化了重组小鼠α-突触核蛋白。通过ToxinEraser内毒素去除试剂盒(Genscript，NJ，USA)耗竭了内毒素。在PBS中制备了α-突触核蛋白PFF(5mg ml-1)，同时用磁搅拌器搅拌(1,000rpm，37℃)。在α-突触核蛋白孵育一周后，将聚集物用PBS稀释至0.1mg ml-1并以10％振幅超声波处理30s(0.5s脉冲开/关)(Branson Digital sonifier，Danbury，CT，USA)。使用原子力显微镜和透射电子显微镜对α-突触核蛋白PFF进行了验证，并使用免疫染色证实了诱导磷酸-丝氨酸129α-突触核蛋白(p-α-synSer129)的能力。将α突触核蛋白PFF储存在-80℃直至使用。
立体定位α-突触核蛋白PFF注射和免疫组织化学(IHC)：为了α-突触核蛋白PFF的立体定位注射，将3个月大的NOD2 KO或RIPK2 KO雄性和雌性用赛拉嗪和氯胺酮麻醉。将注射套管(26.5规格)立体定向地单侧施用到右半球的纹状体(STR)(中外侧，距前囟2.0mm；前后位，0.2mm；背腹，2.6mm)。以每分钟0.2μL的速率输注2μLα-突触核蛋白PFF(在PBS中为2.5μg/mL)或相同体积的PBS。最终剂量后，将注射套管在STR中再保持5min，以完全吸收α-突触核蛋白PFF或PBS，然后从小鼠脑中缓慢取出。通过缝合闭合头部皮肤，并在手术后监测伤口的愈合和恢复。为了进行IHC分析，在纹状体α-突触核蛋白PFF注射后3个月，对动物先用冰冷的PBS接着用4％的多聚甲醛进行灌注并心内固定。取出脑并进行免疫组织化学处理。单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射后3个月进行了pS129-α-突触核蛋白免疫反应性的IHC。在单侧纹状体α-突触核蛋白PFF注射一个月后完成了吉非替尼的治疗，每天一次。
结果：吉非替尼治疗显著改善了LB病理(图9A)，如通过降低的pS129-α-突触核蛋白免疫反应性证实的，并通过IHC评估，通过与未治疗的PD小鼠比较，遏制了腹侧中脑中的小胶质细胞激活(图9B)。这些结果证明了RIPK2抑制剂是用于与小胶质细胞激活相关的神经退行性障碍(如PD)的潜在药物。
表26.SN中的p-αSyn和小胶质细胞的阳性信号(涉及图9A)。所述值是平均数±SEM，n＝5。(*P<0.05)。
Veh+PFFs 吉非替尼+PFFs
p-αSyn阳性信号的# 32.14±1.93 16.49±2.01*
小胶质细胞的# 1138.72±91.48 409.15±94.27*
实施例10：人AD死后组织的海马中的p-RIPK2升高。
研究理由和目标：这个研究的目的在于研究AD患者的死后人脑组织中的磷酸化RIPK2(p-RIPK2)的表达。为了研究这，使用了IHC。
方法
用于AD死后脑的IHC：从约翰霍普金斯大学病理学院神经病理学系获得福尔马林固定的石蜡包埋的人死后海马组织的10μm厚度的载玻片(对照组和AD分别为n＝3)。将组织切片去石蜡并复水，然后用基于柠檬酸盐的抗原解掩溶液(Vector Laboratories)进行热诱导的表位恢复。然后，将切片用兔多克隆pRIPK2抗体染色。所有切片均用苏木精染色。
结果：我们的数据表明p-RIPK2免疫反应性在AD患者样品的海马中显著提高，如通过IHC评估的(图10A、B)，表明了过量的RIPK2激活在AD的发病机理中起着关键作用。这些结果表明了靶向RIPK2和/或p-RIPK2活性可以是用于包括AD的神经退行性障碍的可行治疗靶标。
表27.AD死后的海马中的p-RIPK2的强度(关联图10A)。所述值是平均数±SEM，n＝9。(***P<0.001)。
相对强度 对照 AD
p-RIPK2 1.00±0.08 5.76±0.46***
实施例11：淀粉样蛋白-β(Aβ或Abeta)聚集物激活的小胶质细胞诱导了mRNARIPK2和炎性细胞因子。
研究理由和目标：这个研究的目的在于证实由Abeta聚集物激活的小胶质细胞诱导mRNA RIP2K连同炎性细胞因子。
方法
按照先前所述的(PMID：27834631)，产生了合成的Abeta1-42寡聚物。将羟基氟异丙醇(HFIP)处理的合成Abeta1-42肽(rPeptide，Bogart，GA，USA)溶解在二甲亚砜(DMSO)中，并进一步在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释以获得250μM储液。将储液在4℃孵育至少24小时，并在–80℃储存直至使用。使用前，将溶液在12,000g下离心10分钟，并将上清液用作寡聚Aβ。
在DMEM培养基中培养BV-2小胶质细胞。用2.5μM Abeta处理6孔平板中的106个BV-2小胶质细胞4hr。按照制造商的说明，用RNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)提取培养细胞的总RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo science)通过分光光度法测量RNA浓度。随后，使用高容量cDNA逆转录系统(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)将2μg总RNA逆转录为cDNA。使用快速SYBR Green Master Mix(Life Technologies)和steponeplus实时pcr系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)进行比较qPCR。将靶基因的表达水平归一化至GAPDH的表达，并根据比较循环阈值Ct方法-ΔΔ(2)Ct计算。(n＝3)
结果：为了确定RIPK2在小胶质细胞中的潜在作用机理，评估了RIPK2在BV-2小胶质细胞中的表达。Aβ寡聚物(AβO)激活BV-2小胶质细胞时，RIPK2的mRNA表达显著增加。在小胶质细胞中，AβO使RIPK2 mRNA表达增加近10倍。除了RIPK2的表达，还测量了多种炎症介质。AβO增加了M1小胶质细胞的典型标志物，包括TNF-α，IL-1β和IL-6在内的细胞因子亚群的水平。
表28.Abeta-激活的小胶质细胞诱导了RIPK2和炎性细胞因子。
mRNA PBS AβO
RIPK2 1 9.5±2.6
TNFα 1 19.6±6.2
IL-1α 1 41.48±16.8
IL-6 1 22.6±7.3
实施例12：淀粉样蛋白-β(Aβ)聚集物激活的小胶质细胞诱导RIPK2的磷酸化
研究理由和目标：这个的目的在于证实由Abeta聚集物激活的小胶质细胞诱导磷酸化RIPK2(p-RIPK2)和NOD2。
方法
用5μM Aβ处理6孔平板中的2×106BV-2小胶质细胞15、60、120、240或360min。随后，将细胞裂解物用RIPA缓冲液裂解30min，所述缓冲液含有完全的、Mini、无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)，与抗RIPK2抗体一起孵育过夜，然后与蛋白A/G一起孵育3小时，并使用抗-磷酸-特异性RIP2K或NOD抗体，用Western印迹分析。
结果：如图11中看到的，p-RIPK2从Aβ处理后的15min开始出现，并在60min达到峰值。与RIPK2磷酸化一致，用AβO处理小胶质细胞时，NOD2的结合随磷酸化增加。这个结果表明NOD2结合RIPK2的链反应，接着是磷酸化，用于AD中小胶质细胞中的AβO诱导的激活。
实施例13：NOD2或RIPK2的耗竭遏制了AβO诱导的小胶质细胞激活。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)在AβO激活的小胶质细胞中评估在细胞因子产生(如TNFα和IL-6(A1诱导剂))方面NOD2或RIPK2的耗竭效应。为了研究这，使用了qPCR。
方法
在这个研究中，从Jackson实验室评估了野生型(WT)、NOD2敲除(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J，NOD2-/-)和RIPK2敲除(B6.129S1-Nod2tm1Flv/J，RIPK2-/-)小鼠。对于原代小胶质细胞培养物，在出生后第2天(P2)从小鼠的幼崽获得了全脑。除去脑膜后，将脑在补充有10％热灭活的FBS，50U ml-1青霉素，50μg ml-1链霉素的DMEM(Cellgro)中洗涤。将脑转移至0.25％胰蛋白酶-EDTA中，并孵育10min。使用DMEM完全培养基来中和胰蛋白酶。通过吸移获得了单细胞悬液。通过将单细胞悬液通过70-μm尼龙网来除去细胞碎片和聚集物。将由此获得的最终单细胞悬液在T175培养瓶中培养2周，在第7天更换完全培养基。使用EasySep小鼠CD11b阳性选择试剂盒(StemCell)将混合的胶质细胞群分成富含星形胶质细胞的部分和富含小胶质细胞的部分。磁分离的小胶质细胞部分是培养物。用5μM AβO将来自野生型(WT)、NOD2敲除(NOD2-/-)和RIPK2敲除(RIPK2-/-)的原代培养小胶质细胞激活4小时。通过实时RT-PCR测量了TNFα和IL-6的基因表达。所述值是四个独立实验的平均数±SD。
结果：为了验证AD中NOD2-RIP2K途径的靶信号传导，先用AβO激活原代小胶质细胞，然后进行实时PCR，评估TNFα和IL-6。Aβ42寡聚物(AβO)激活的小胶质细胞上调了WT同窝仔的小胶质细胞中TNFα和IL-6的mRNA水平。NOD2或RIPK2的耗竭显著降低了AβO激活的原代小胶质细胞中促炎细胞因子的水平。这个结果表明了NOD2-RIPK2信号传导的抑制关闭了促炎性物质的释放，并且毒性介质诱导了AβO诱导的毒性。
表29.WT、RIP2或NOD2敲除小鼠的正常(PBS)和Aβ激活的小鼠原代小胶质细胞中的TNF-a和IL-6的mRNA水平(相对倍数)。所述值是平均数±SD，n＝2-4。(*P<0.05vs.PBS)
Figure BDA0002956762510000741
Figure BDA0002956762510000751
实施例14：RIPK2的抑制剂遏制了AβO-诱导的小胶质细胞激活。
研究理由和目标：这个研究的目的在于1)评估RIPK2抑制剂对Aβ聚集物激活的原代小胶质细胞的细胞因子产生(如TNFα，IL-6和补体C1q(反应性A1星形胶质细胞诱导剂))的作用。为此，使用了qPCR试验。
方法
为了检查RIPK2抑制的作用，用DMSO、GSK583(1μM，Medchemexpress)、OD361(1μM，Calbiochem)或索拉非尼(1μM)将6孔平板中的106个BV-2小胶质细胞预孵育1小时。为了mRNA分析，将5μM AβO再处理4小时。
结果：为了证实RIPK2抑制在由异常聚集的蛋白质(例如，AβO)激活的BV-2小胶质细胞中的抗炎功效，使用实时PCR评估了TNFα、IL-6和Clq。Aβ42寡聚物(AβO)激活的小胶质细胞上调了Clq、IL-6和TNF-α的mRNA水平。重要地，小胶质细胞用RIPK2抑制剂，GSK583(1μM)、OD36(1μM)或索拉非尼(1μM)预处理接着用AβO(5μM)时，阻断了小胶质细胞激活并显著减少了多种炎症介质的释放，包括Clq、IL-6和TNFα。与ELISA中的研究结果一致，如表30中概括的，RIPK2抑制剂处理的AβO激活的小胶质细胞显著降低了促炎标志物的表达。这个结果表明，RIPK2抑制剂对RIPK2活性的抑制阻断了包括PD和AD的神经退行性障碍中可以诱导A1反应性星形胶质细胞形成和神经元损伤的小胶质细胞激活。
表30.Aβ激活的小胶质细胞中的RIPK2抑制剂的作用。通过实时PCR分析了BV-2小胶质细胞中的C1q、IL-6和TNF-α的mRNA水平。±SD，每组n＝2-4。(对照vs，**P<0.01，***P<0.001，Aβvs，##P<0.01，###P<0.001)。
Figure BDA0002956762510000761
实施例15：5x-FAD AD转基因小鼠的脑中的RIPK2升高。
研究理由和目标：这个研究的目的在于证实转基因AD小鼠模型中升高的RIPK2，如PD小鼠模型中所示的。
方法
动物：从杰克逊实验室获得5X FAD(Tg6799，B6SJL-Tg(APPSwFlLon，PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax)小鼠。这些被广泛使用的小鼠含有五个突变，过表达具有瑞典人(K670N，M671L)、佛罗里达(I716V)和伦敦(V717I)家族AD突变连同带有两个FAD突变M146L和L286V的人PS1的突变人APP(695)。5XFAD小鼠概括了AD淀粉样蛋白病理学的主要特征，并被称为神经内Abeta-42诱导的神经变性和淀粉样蛋白斑形成的有用模型。Aβ沉积是进行性的，并且最早在三四个月大时就出现在细胞内，而六个月时就会在额叶皮层中出现胞外沉积，并且到十二个月时会更加广泛。在这个研究中，使用了6个月大的雄性5XFAD AD小鼠。
RIP-激酶的表达：从6个月大的野生型或5XFAD小鼠的海马分离从RNA，并且使用实时PCR评估了包括RIPK1、RIPK2、RIPK3和NOD2的不同基因表达。将mRNA的水平归一化至管家基因18S rRNA。用Wester印迹评估七个月大的野生型(WT)或5XFAD小鼠的皮层区的RIP激酶的蛋白质表达水平。
结果：将5XFAD小鼠中的RIPK1、RIPK2、RIPK3和NOD2的mRNA表达与WT同窝小鼠的比较。与WT同窝小鼠相比，5XFAD中的RIPK1和RIPK2显著提高，表明了RIP激酶是包括AD和PD的神经退行性疾病的可行治疗靶。为了评估RIPK蛋白表达的变化，分析了七个月大的5XFAD的皮层区。与RIPK1或RIPK2相比，5XFAD中的RIPK2的蛋白质表达显著提高。
实施例16：NOD2或RIPK2的耗竭拯救了AβO-诱发的AD小鼠中的认知障碍。
研究理由和目标：这个研究的目的在于研究AβO诱发的AD小鼠模型中NOD2或RIPK2耗竭的抗AD功效。为此，将AβO注入对照、NOD2 KO或RIPK2 KO小鼠的纹状体中。将AβO注射后2周时的动物用于各种神经行为评估。
方法
Abeta1-42寡聚物的制备：按照之前所述的产生了合成的Abeta1-42寡聚物(AbetaO1-42)。将羟基氟异丙醇(HFIP)处理的合成Abeta1-42肽(rPeptide，Bogart，GA，USA)溶解在二甲亚砜(DMSO)中，并进一步在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释以获得250μM储液。将储液在4℃孵育至少24小时，并在–80℃储存直至使用。使用前，将溶液在12,000g下离心10分钟，并将上清液用作寡聚Aβ。
立体定向的AbetaO1-42 i.c.v.注射：为了AbetaO1-42的立体定向注射，用赛拉嗪和氯胺酮将3个月大的NOD2或RIPK2 KO雄性和雌性小鼠麻醉。将注射套管(26.5规格)立体定向地施用到脑室内(i.c.v.)空间中，距前囱后坐标为0.2mm，侧坐标为1.0mm，腹侧距颅骨表面2.5mm(Paxinos and Franklin，The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates，第2版，Academic Press,San Diego(2001))。以每分钟0.2μL的速率输注5μL AbetaO1-42(0.5μmol)或相同体积的PBS。最终剂量后，将注射套管在i.c.v.中再保持5分钟，以完全吸收AbetaO1-42或PBS，然后从小鼠脑中缓慢取出。通过缝合闭合头部皮肤，并在手术后监测伤口的愈合和恢复。在两侧i.c.v.AbetaO1-42注射(总5μmol)之后七天进行了行为测试。
莫里斯水迷宫测试(MWMT)：按照之前的报道中所述的进行了MWMT(Vorhees和Williams，Nat.Protoc.1：848-58(2006))。MWM是一个白色的圆形池(直径150厘米，且高50厘米)，表面上有四个不同的内部提示。圆形池充满水和无毒的水溶性白色染料(20±1℃)，并且将平台浸入水面以下1cm，使得水位是不可见的。池被分成相等面积的四个象限。黑色平台(直径9厘米，且高15厘米)位于水池四个象限之一的中心。从开始位置到平台，每只游泳小鼠的位置都通过视频跟踪系统(ANY-maze，Stoelting Co.，Wood Dale，IL，USA)进行了数字化处理。实验前一天是在没有平台的情况下游泳训练60秒。然后每天对小鼠进行两次试验阶段，连续四天，试验间隔为15min，并记录逃避潜伏期。对于每个试验阶段和每只小鼠，均对这个参数取平均值。一旦小鼠位于平台上，就可以在其上停留10sec。如果小鼠在60sec内无法到达平台上，则将其放在平台上10sec，然后由实验者放回其笼中。在第6天，探索试验涉及将平台从池中移出，并且允许小鼠的截留时间为60sec。
结果：在注射AβO1-42或PBS后7天，我们通过莫里斯水迷宫任务评估了空间学习和记忆能力。在暴露于莫里斯水迷宫的第一天，在注射AβO1-42或PBS的野生型、RIPK2-/-或NOD2-/-小鼠之间在寻找平台时没有差异(图12B)。在暴露于莫里斯水迷宫的第3天和第4天，与PBS处理的野生型小鼠相比，注射AβO1-42的野生型小鼠表现出明显增加的逃避潜伏时间(图12B)。相反，注射AβO1-42的RIPK2-/-和NOD2-/-小鼠的逃避潜伏时间与PBS野生型小鼠相当。在试验的最后一天(第5天)后，与注射AβO1-42的野生型小鼠相比，在除去平台后，注射AβO1-42的RIPK2-/-和NOD2-/-小鼠表现出显著增加的游泳时间和目标象限中的路径，与注射PBS的野生型小鼠相似(图12C和12F)。在所有实验组之间游泳速度和行进的总距离没有显示出显著差异(图12D和12E)。这些结果清楚地表明了在AD模型中抑制RIPK2和/或NOD2活性改善了记忆功能并拯救了认知障碍。
上面已经借助说明特定功能及其关系的实现的功能构件块描述了本发明。为了描述的方便，在本文中已经任意定义了这些功能构件块的边界。只要适当执行特定功能及其关系，就可以定义其他边界。
关于被描述为属的本发明的方面，所有个体物种被单独地视为本发明的独立方面。如果本发明的各方面被描述为“包括”一个特征，则还考虑了“由所述特征构成”或“基本上由所述特征构成”的实施方案。
前面对特定实施例的描述将如此充分地揭示了本发明的一般性质，以至于在不脱离本发明的一般概念的情况下，其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识容易地修改和/或适于这样的特定实施方案的各种应用，而无需进行过度的实验。因此，基于本文提出的教导和指导，这样的适应和修改意图在所公开的实施方案的等同形式的含义和范围内。应当理解，本文中的措词或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞将由技术人员根据教导和指导来解释。
本发明的广度和范围不应由任何上述示例性实施方案限制，而应仅根据以下权利要求及其等同体来限定。
在此描述的所有各个方面、实施方案和选择可以以任何和所有变化来组合。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请按引用并入本文中，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出按引用并入的相同程度。如果这个文件中的某个术语的任何含义或定义与按引用并入的文献中的同一术语的任何含义或定义冲突，则以本文件中指定给该术语的含义或定义为准。

Claims (39)

1.一种预防或治疗神经退行性疾病或障碍的方法，包括：将治疗有效量的受体相互作用蛋白(RIP)激酶2(RIPK2)抑制剂给药于需要的受试者，其中神经退行性疾病或障碍与中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域中上调的NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2有关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中RIPK2抑制剂抑制RIPK2活性和/或表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中RIPK2抑制剂是选择性优于RIP激酶1和/或RIP激酶3的。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中以有效抑制一种或多种选自以下活性的量来给药RIPK2抑制剂：NFκB的NOD1依赖性激活、NF-κB的NOD2依赖性激活、小胶质细胞激活和/或反应性星形胶质细胞形成。
5.一种用于治疗与由异常聚集的蛋白质激活中枢神经系统(CNS)驻留固有免疫细胞有关的神经退行性疾病或障碍的方法，所述方法包括将有效量的受体相互作用蛋白(RIP)激酶2(RIPK2)抑制剂给药于需要的受试者。
6.根据权利要求5所述的方法，其中以有效抑制由异常聚集的蛋白质激活CNS驻留固有免疫细胞的量来给药RIPK2抑制剂。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中RIPK2抑制剂的给药降低了从诱导神经炎症和神经元损伤的激活的固有免疫细胞分泌的一种或多种炎性或神经毒性介质的水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其中一种或多种炎性或神经毒性介质是TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6，和/或其组合。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中驻留固有免疫细胞是小胶质细胞和/或星形胶质细胞。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其中异常聚集的蛋白质是α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。
11.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其中神经退行性疾病或障碍是帕金森病或阿尔茨海默病。
12.一种抑制由异常聚集的蛋白质激活中枢神经系统(CNS)驻留固有免疫细胞的方法，所述方法包括将CNS驻留固有免疫细胞接触有效量的受体相互作用蛋白(RIP)激酶2(RIPK2)抑制剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中CNS驻留固有免疫细胞是小胶质细胞和/或星形胶质细胞。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中异常聚集的蛋白质是α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。
15.根据权利要求12-14任一项所述的方法，其中接触是在体外、在体内或离体。
16.根据权利要求12-15任一项所述的方法，其中与对照相比RIPK2抑制剂的量有效降低了由CNS驻留固有免疫细胞分泌的一种或多种炎性或神经毒性介质的水平，其中一种或多种炎性或神经毒性介质是TNFα、IL-1α、IL-1β、C1q、IL-6，和/或其组合。
17.一种治疗需要的受试者的帕金森病的方法，所述方法包括将治疗有效量的RIPK2抑制剂给药于受试者。
18.根据权利要求17所述的方法，其中通过口服或胃肠外将RIPK2抑制剂给药于受试者。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中RIPK2抑制剂是选择性优于RIP激酶1和/或RIP激酶3的。
20.一种治疗需要的受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括将治疗有效量的RIPK2抑制剂给药于受试者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过口服或胃肠外将RIPK2抑制剂给药于受试者。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中RIPK2抑制剂是选择性优于RIP激酶1和/或RIP激酶3的。
23.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中RIPK2抑制剂是吉非替尼、索拉非尼、雷戈非尼、普纳替尼、SB203580、OD36(6-氯-10,11,14,17-四氢-13H-1,16-亚乙烯基-4,8-次甲基-1H-吡唑并[3,4-g][1,14,4,6]二噁二氮杂环十六烷)、OD38([4,5,8,9-四氢-7H-2,17-亚乙烯基-10,14-次甲基-1H-咪唑并[1,5-g][1,4,6,7,12,14]氧杂五氮杂环十六烷])、WEHI-435(N-(2-(4-氨基-3(p-甲苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-2-甲丙基)异烟酰胺)或GSK583(6-(叔-丁基磺酰基)-N-(5-氟-1H-吲唑-3-基)喹啉-4-胺)或其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求1-22任一项所述的方法，其中RIPK2抑制剂是吉非替尼、GSK583，或其药学上可接受的盐。
25.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将有效量的至少一种其他治疗活性化合物给药于受试者。
26.根据权利要求1所述的方法，其中神经退行性疾病或障碍包括：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)、帕金森病、糖尿病性神经病、聚谷氨酰胺(多Q)病、卒中、法尔病、门可氏病、威尔逊氏病、脑缺血、朊粒病、痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性轻瘫、脊髓小脑萎缩、脑损伤或脊髓损伤。
27.根据权利要求1-26任一项所述的方法，其中RIPK2抑制剂通过静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼内、肌内、颊、直肠、阴道、眶内、脑内、皮内、颅内、脊髓内、脑室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、经粘膜、经皮和/或通过吸入来给药。
28.根据权利要求27所述的方法，其中RIPK2抑制剂通过口服或胃肠外来给药。
29.一种鉴定用于神经退行性疾病或障碍的治疗剂的方法，包括：
(a)在候选治疗剂的存在下，将CNS驻留固有免疫细胞接触异常聚集的蛋白质；
(b)在候选治疗剂的存在下，测量CNS驻留固有免疫细胞的激活；和
(c)鉴定与对照相比抑制CNS驻留固有免疫细胞激活的治疗剂，其中候选治疗剂是RIPK2抑制剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中CNS驻留固有免疫细胞是小胶质细胞和/或星形胶质细胞。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中异常聚集的蛋白质是α-突触核蛋白、淀粉样蛋白-β和/或tau。
32.根据权利要求29-31任一项所述的方法，其中测量包括测量NOD2、磷酸化RIPK2和/或RIPK2的表达水平。
33.根据权利要求29-32任一项所述的方法，其中测量包括测量因子C1q、TNFα和/或IL-1α的表达水平。
34.根据权利要求29-33任一项所述的方法，其中测量包括测量因子iNOS、Cxc11和/或IL-1β的表达水平；和/或测量CNS驻留固有免疫细胞的趋化性。
35.根据权利要求29-34任一项所述的方法，其中治疗剂优于RIPK1和/或RIPK3地选择性地抑制RIPK2。
36.根据权利要求29-35任一项所述的方法，其中治疗剂抑制NF-κB的NOD依赖性激活。
37.根据权利要求29-36任一项所述的方法，其中治疗剂抑制淀粉样蛋白-β聚集物诱导的小胶质细胞激活、α-突触核蛋白聚集物诱导的小胶质细胞激活和/或A1星形胶质细胞形成。
38.根据权利要求29-37任一项所述的方法，其中神经退行性疾病或障碍是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症(ALS/Lou Gehrig's病)、帕金森病、多发性硬化、糖尿病性神经病、聚谷氨酰胺(多Q)病、卒中、法尔病、门可氏病、威尔逊氏病、脑缺血、朊粒病、痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、遗传性痉挛性轻瘫、脊髓小脑萎缩、脑损伤或脊髓损伤。
39.根据权利要求29-37任一项所述的方法，其中神经退行性疾病或障碍是阿尔茨海默病或帕金森病。
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