CN107709560A - 治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本说明书通常教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法。

Description

治疗方法
提交数据
本申请与2015年4月15日提交的标题为"A method of treatment”的澳大利亚临时专利申请第2015901338号相关并要求其优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景
领域
本说明书通常教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法。
相关技术描述
在本说明书中被作者提及的出版物的书目细节在说明书的最后按字母顺序收集。
在本说明书中对任何现有技术的提及并非并且不应该被视为确认或以任何形式暗示将该现有技术形成任何国家中的公知常识的一部分。
哺乳动物中性发育的主要事件为由双潜能(bipotential)和未分化的性腺到睾丸或卵巢的性腺性别发育。被称为性别决定的这个过程是由SRY基因(Y染色体性别决定区域)触发的。SRY为性别决定的证据最初来自将包含小鼠SRY基因的14.6kb基因组DNA序列显微注射到染色体雌性胚胎中。所得到的转基因小鼠表型发育为雄性(Koopman等(1991)Nature351(6322):117-21)。SRY属于Sox(SRY-盒)家族，其成员的特征在于共同的HMG(高速泳动族蛋白(high mobility group))DNA结合基序(Laudet等(1993)Nucleic Acids Res,21(10)2493-501；Wegner(1999)Nucleic Acids Res,27(6):1409-20)。Sox基因已经在宽范围的发育过程中有所记载，所述宽范围的发育过程包括神经发生(Sox2、Sox3和Sox10)[Hargrave等(1997)Dev Dyn,210(2):79-86；Rex等(1997)Mech Dev,66(1-2):39-53；Uwanogho等(1995)Mech Dev,49(1-2):23-36]和性别决定(Sox9)。另外，突变分析已经表明了Sox基因在发育期间影响细胞命运决定的作用(Pevny和Lovell-Badge(1997)Curr OpinGenet Dev,7(3):338-44)。认为，SRY编码一个204个氨基酸的蛋白，通过其HMG盒结合并急剧弯曲DNA以调节雄性特异性基因表达(Ferrari等(1992)Embo J,11(12):4497-506；Harley等(1992)Science,255(5043):453-6；King和Weiss(1993)Proc Natl Acad SciUSA,90(24):11990-4；Nasrin等(1991)Nature,354(6351):317-20)。在胚胎天数E10.5和E12.5之间，SRY在发育中的生殖器隆起中的短时间期间的瞬时表达是触发由双潜能性腺发育为睾丸的原因(Koopman等(1990)Nature,348(6300):450-2)。在小鼠胎儿性腺中的这种严格控制的表达窗口之后，SRY在成年睾丸中被重新表达。
黑质(SN)为位于中脑中的核心，其在控制随意运动(voluntary movement)中发挥关键作用。SN在细胞结构上(cytoarchitecturally)分为三个不同的部分：SN致密部(SNc)、SN网状部、和SN侧部(Olanow和Tatton(1999)Annu Rev Neurosci,22:123-44)。SNc，一种富含多巴胺能神经元的区域，与神经系统紊乱帕金森氏病相关，因为在帕金森氏病患者中，SNc的多巴胺能神经元优先退化(Castillo等(1998)Mol Cell Neurosci,11(1-2):36-46)。帕金森氏病为由SNc多巴胺能细胞死亡引起的神经退行性紊乱，且其特征在于强直(rigidity)、静止性震颤(rest tremor)、姿势不稳定和运动迟缓。SNc的多巴胺能神经元经由黑质纹状体投射至背外侧纹状体调节运动功能(motor function)。转录因子诸如β-连环蛋白、Nurr1和Pitx3控制多巴胺表型(Maxwell等(2005)Dev Biol,282(2):467-79；Malbon(2004)Front Biosci,9:1048-58)。
已经描述了SNc及其纹状体投射的功能中的许多性别差异(Saunders-Pullman(2003)Endocrine,21(1):81-7)。这些差异的临床意义在帕金森氏病的发病和进展中是明显的。雄性比雌性更易患帕金森氏病。
神经退行性疾病为人口老龄化的重要问题。管理罹患此类紊乱的人类受试者的社会和医学费用对世界各地的经济造成了巨大的压力。迫切需要新的改善神经退行性紊乱的破坏性影响的治疗方案。已经证明，SNc中的SRY下调使雄性大鼠中的运动功能受损(Dewing等(2006)Current Biology16(4):415-420)。这导致了促进SRY水平升高的策略。根据本发明，提出了，事实上需要该方法的相反方面。
概述
核苷酸和氨基酸序列由序列标识符号(SEQ ID NO)提及。SEQ ID NO数字上相应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等。序列标识符的概要提供于表1中。在权利要求之后提供了序列表。
遍及整个主题说明书中使用的序列标识符的概要提供于表1中。
本说明书教导了，脑区域的分子特征及其相关行为的性别差异受独立于性腺激素的遗传因素的影响。本文提出了，SRY，关键的雄性特异性基因，在雄性多巴胺神经元中表达，其中SRY调节多巴胺合成和运动功能。某些神经系统紊乱通过产生多巴胺的细胞的损失而发展或以其他方式加剧。本文设想了一种通过特异性下调雄性受试者中的多巴胺能神经细胞中SRY的表达或活性或功能来改善雄性偏倚的神经系统紊乱的症状或减轻这些紊乱的严重程度的方法。本文提出了，在创伤、损伤、疾病或暴露于毒素或毒物之后，SRY水平至少在多巴胺能神经细胞中最初被升高，并且这导致产生多巴胺的细胞的损失。因此，本文提出雄性偏倚的神经系统紊乱通过选择性下调功能或活性SRY蛋白的水平或下调神经细胞诸如多巴胺能神经元中编码SRY的基因的表达来治疗。充当SRY或SRY基因表达的拮抗剂的剂在雄性受试者诸如人类男性受试者中是神经保护性的。
本文预期的雄性偏倚的神经系统紊乱包括但不限于帕金森氏病、孤独症、癫痫、注意缺陷多动紊乱(ADHD)、包括精神分裂症的精神病、药物成瘾和疼痛。此外，与雄性中产生多巴胺的细胞的损失相关的任何紊乱被本发明涵盖。
本文提供了一种通过下调雄性受试者中神经细胞诸如多巴胺能神经元中的SRY的表达或活性单独地或与另外的治疗或行为改变(behavioral modification)一起治疗雄性偏倚的神经系统紊乱的医学方案。本文还教导了药物组合物、药物和治疗试剂盒。
本说明书教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码Y染色体性别决定区域(SRY)的基因的表达或抑制SRY功能的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善神经系统紊乱的症状、阻止神经系统紊乱的症状的发展或最小化神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至所述雄性。
本文还教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的治疗方案，所述方案包括：
(i)基于行为、遗传倾向性(genetic predisposition)、症状或年龄或向毒素或毒物的暴露来鉴定和选择所述雄性受试者；
(ii)将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码Y染色体性别决定区域(SRY)的基因的表达或抑制SRY功能的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善所述神经系统紊乱的症状、阻止所述神经系统紊乱的症状的发展或最小化所述神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至所述雄性；
(iii)监测所述雄性受试者的症状和行为；
(iv)根据需要提供另外的剂(further agent)或其他药物或行为改变以维持所述雄性受试者的健康。
本文提供了拮抗SRY活性或功能或SRY基因表达的剂在制备治疗或改善雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的症状的药物中的用途。用于人类使用的反义寡核苷酸的实例包括SEQ ID NO:897至899以及SEQ ID NO:888(ASO-A)、890(ASO-B)、894(ASO-D)和896(ASO-E)。
遍及整个主题说明书中使用的缩写的列表提供于表2中。
表1
序列标识符的概要
序列ID NO: 说明
1至886 用于下调人类SrYR基因的潜在/靶位点
887 靶位点A(人类)
888 ASO-A(人类)
889 靶位点B(人类)
890 ASO-B(人类)
891 靶位点C(人类)
892 ASO-C(人类)
893 靶位点D(人类)
894 ASO-D(人类)
895 靶位点E(人类)
896 ASO-E(人类)
897 反义治疗ODN+1至+21(人类)
898 反义治疗ODN+5至+27(人类)
899 反义治疗ODN-10至+10(人类)
900 有义对照ODN+1至+21(人类)
901 有义对照ODN+5至+27(人类)
902 有义对照ODN-10至+10(人类)
903 编码人类SRY的cDNA的核苷酸序列：NM 003140.2
904 反义ODN 1(大鼠)
905 反义ODN 2(大鼠)
906 反义ODN 3(大鼠)
907 对照(有义)ODN 1(大鼠)
908 对照(有义)ODN 2(大鼠)
909 对照(有义)ODN 3(大鼠)
910 编码大鼠SRY的cDNA
911 大鼠SRY的氨基酸序列
表2
缩写
附图简述
图1至D为显示SRY控制雄性大鼠中的运动功能和黑质纹状体多巴胺水平的图形表示A)重复的黑质SRY反义或有义ODN注射(2μg/每天持续10天)对雄性或雌性大鼠中的运动功能的影响。B)通过肢体使用不对称(上图)和旋转(下图)测试评价雄性(左图)或雌性(右图)大鼠中的运动功能。在最后一次行为测试之后，将脑处理用于C)黑质SRY、Sox-6、Sox-3、TH、DDC、MAO-A、和D2R mRNA或D)纹状体DA和DOPAC测量(n≥10/组；*P<0.05，与有义处理组相比；#P<0.05，与第0天相比)。
图2A和B为显示在6-OHDA注射之前，重复的SRY反义处理减弱雄性大鼠中的6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质DA细胞损失的图形和照片表示。重复黑质SRY反义或有义ODN处理(2μg/每天，10天)对雄性大鼠中6-OHDA诱导的运动缺陷和多巴胺细胞损失的影响。A)运动功能通过肢体使用不对称(左图)和苯丙胺诱导旋转(右图)测试进行评价B)在运动行为测试结束时，将脑进行处理，并确定黑质多巴胺细胞计数(n＝20/组；*P<0.05**P<0.01，与有义处理组相比；#P<0.05，与第0天相比；^P<0.05，与第10天相比)。
图3A和3B为显示在6-OHDA注射之后，重复的SRY反义处理减弱雄性大鼠中6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质DA细胞损失的图形和照片表示。重复的黑质SRY反义或有义ODN处理(2μg/每天，10天)对雄性大鼠中6-OHDA诱导的运动缺陷和多巴胺细胞损失的影响。A)运动功能通过肢体使用不对称(左图)和苯丙胺诱导的旋转(右图)测试进行评价B)在运动行为测试结束时，将脑进行处理，并确定黑质多巴胺细胞计数(n＝10/组；*P<0.05**P<0.01，与有义处理组相比；#P<0.05，与第0天相比；^P<0.05，与第10天相比)。
图4A和4B为显示在鱼藤酮注射之前，重复的SRY反义处理减弱雄性大鼠中的鱼藤酮诱导的运动缺陷和黑质DA细胞损失的图形和照片表示。重复的黑质SRY反义或有义ODN处理(2μg/每天，10天)对雄性大鼠中的鱼藤酮诱导的运动缺陷和多巴胺细胞损失的影响。A)运动功能通过肢体使用不对称(左图)和苯丙胺诱导的旋转(右图)测试进行评价B)在运动行为测试结束时，将脑进行处理，并确定黑质多巴胺细胞计数(n＝10/组；*P<0.05**P<0.01，与有义处理组相比；#P<0.05，与第0天相比；^P<0.05，与第10天相比)。
图5A和5B为显示在6-OHDA注射之前，重复的SRY反义处理不影响雌性大鼠中6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质DA细胞损失的图形和照片表示。重复的黑质SRY反义或有义ODN处理(2μg/每天，10天)对雌性大鼠中6-OHDA诱导的运动缺陷和多巴胺细胞损失的影响。A)运动功能通过肢体使用不对称(左图)和苯丙胺诱导的旋转(右图)测试进行评价B)在运动行为测试结束时，将脑进行处理，并确定黑质多巴胺细胞计数(n＝10/组；^P<0.05，与第10天相比)。
详细说明
遍及整个本说明书，除非上下文另有要求，词“包含(comprise)”或变形诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，将被理解为隐含包括陈述的要素或整数或方法步骤，或者要素或整数或方法步骤的组，但不排除任何要素或整数或方法步骤，或者要素或整数或方法步骤的组。
除非上下文另有清楚地规定，如本说明书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数方面。因此，例如，提及"一(a)神经元"包括单个神经元以及两个或更多个神经元；提及"一(an)剂"包括单个剂以及两个或更多个剂；提及“该(the)公开内容”包括被该公开内容教导的单个和多个方面等等。本文教导和实现的方面由术语“发明”涵盖。所有此类方面都在所要求保护的发明的宽度范围内实现。
本发明涉及一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统状况的方法。该方法部分地基于以下的确定：在起因于损害、损伤、毒性、疾病或感染的神经系统环境之后，雄性产生多巴胺的神经细胞中的Y染色体性别决定区域(SRY)基因表达引起升高的多巴胺合成。虽然这最初可能是保护性的，但其最终导致产生多巴胺的细胞的选择性损失。因此，下调SRY的水平或其功能的能力或下调编码SRY的基因的表达为神经保护性的。特别地，多巴胺能神经元为用于下调SRY功能、活性或基因表达的靶。
因此，本文提供了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码Y染色体性别决定区域(SRY)的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善神经系统紊乱的症状、阻止神经系统紊乱的症状的发展或最小化神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至雄性受试者。
提及“产生多巴胺的神经细胞”包括产生多巴胺的神经元，其也称为多巴胺能神经元。多巴胺能神经元通常位于脑的黑质致密部(SNc)。尽管如此，对于多种神经系统紊乱，靶向脑的其他区域，诸如黑质(SN)网状部和SN侧部可以是必要的，并且所有此类区域均被本发明涵盖。本文提出了，SRY功能、活性或水平的下调降低或抑制产生多巴胺的细胞的渐进性损失。提及降低产生多巴胺的细胞损失包括，将正常脑中的产生多巴胺的细胞百分比作为100％，被治疗的雄性受试者维持从至少约40％至100％产生多巴胺的细胞，或在其间的百分比，诸如50％、60％、70％、80％或90％。“正常脑”包括来自无症状受试者的脑。
本文提出，神经系统紊乱为雄性偏倚状况，并且包括与产生多巴胺的细胞损失相关的紊乱。此类紊乱包括帕金森氏病(PD)、孤独症、癫痫、注意缺陷多动紊乱(ADHD)、精神病、药物成瘾和疼痛。提及“精神病”包括精神分裂症。与多巴胺水平变化或任何类型的多巴胺功能异常或失调相关的任何紊乱被本发明涵盖，包括表现出导致潜在的反社会或自我伤害行动的奖赏特征的行为紊乱。
在一个实施方案中，神经系统紊乱为帕金森氏病。
因此，本文教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的帕金森氏病的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善帕金森氏病的症状、阻止帕金森氏病的症状的发展或最小化帕金森氏病的症状的进一步进展的量施用至雄性受试者。
在另一个实施方案中，神经系统紊乱为ADHD。
因此，本说明书为一种用于治疗或预防雄性受试者中的ADHD的方法的指导，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善ADHD的症状、阻止ADHD的症状的发展或最小化ADHD的症状的进一步进展的量施用至雄性受试者。
又在另一个实施方案中，神经系统紊乱为孤独症。
本文提供了一种用于治疗或预防雄性受试者中的孤独症的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善孤独症的症状、阻止孤独症的症状的发展或最小化孤独症的症状的进一步进展的量施用至雄性受试者。
仍又在另一个实施方案中，神经系统紊乱为癫痫。
因此，本文教导了一种用于治疗或预防雄性受试者中的癫痫的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善癫痫的症状、阻止癫痫的症状的发展或最小化癫痫的症状的进一步进展的量施用至雄性受试者。
提及“产生多巴胺的神经细胞”包括多巴胺能神经元。
本文设想了一种剂，其：
(i)下调编码SRY的基因的表达；
(ii)抑制或降低SRY的功能；
(iii)抑制或降低SRY的活性；和/或
(iv)抑制或降低与SRY相关的信号传导途径中的成分的功能或水平。
该剂事实上为SRY功能、活性或基因表达的拮抗剂。该剂可以被称为拮抗剂、药物(medicament)、药品(pharmaceutical)、活性以及其他术语。该剂涵盖核酸、基于核酸的构建体(包括硫代磷酸化核酸和CRISPR/Cas核酸)、蛋白和小化学分子。
编码SRY的基因的“下调”表达意指阻止或降低基因的转录或翻译。在一个实施方案中，SRY mRNA由反义或有义寡核苷酸靶向。可以靶向mRNA或DNA序列的任何部分。SRY基因上的DNA靶位点的实例包括SEQ ID NO:903或其mRNA等同物或调节区域诸如启动子区或聚腺苷酸化信号上的任何靶位点。实例包括包含选自SEQ ID NO:1至886的DNA序列或mRNA等同物。特定实例包括靶位点SEQ ID NO:887、889、891、893和895(例如分别为反义分子SEQID NO:888、890、892、894和896)和反义分子SEQ ID NO:897、898和899。本说明书设想了包含从约6个至约1,000个核苷酸的任何核酸分子，其能够与SRY mRNA转录物在低严格条件或中等严格条件或高严格条件下杂交，并阻止SRY mRNA转录物的翻译或至少降低翻译量从而降低活性SRY水平。也可以靶向基因的非编码5'和3'末端处的靶位点。实例包括从10个核苷酸长度至100个核苷酸长度。在一个实施方案中，ODN包含20个核苷酸。
本文提及低严格包括和涵盖从至少约0v/v至至少约15％v/v甲酰胺和从至少约1M至至少约2M盐用于杂交，以及至少约1M至至少约2M盐用于洗涤条件。通常，低严格为在从约25℃-30℃至约42℃。温度可以被改变，并且较高的温度用于替代甲酰胺和/或给出可选的严格条件。当必要时可以应用可选的严格条件，诸如中度严格或者高度严格，所述中度严格包括和涵盖从至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和从至少约0.5M至至少约0.9M盐用于杂交，以及至少约0.5M至至少约0.9M盐用于洗涤条件，所述高度严格包括和涵盖从至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和从至少约0.01M至至少约0.15M盐用于杂交，以及至少约0.01M至至少约0.15M盐用于洗涤条件。通常，洗涤进行Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty,J.Mol.Biol.5:109,1962)。然而，错配碱基对数目每增加1％，双链体DNA的Tm减少1℃(Bonner和Laskey(1974)Eur.J.Biochem.46:83)。甲酰胺在这些杂交条件下为任选的。因此，特别优选的严格水平定义如下：低严格为在25℃-42℃的6×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS；中度严格为在范围为20℃至65℃内的温度的2×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS；高严格为在至少65℃的温度的0.1×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS。
术语“寡核苷酸”包括寡脱氧核苷酸(ODN)或寡核糖核苷酸(ORN)，其可以是对编码序列反义的或对其有义的。该术语通常指多个连接的核苷单元。
此类寡核苷酸可以从现有核酸来源(包括基因组或cDNA或mRNA)获得，或者通过合成方法产生。在示例性实施方案中，与野生型寡核苷酸相比，每一个核苷单元可以包括多种化学修饰和取代，包括但不限于修饰的核苷碱基和/或修饰的糖单元。化学修饰的实例为本领域技术人员已知的并描述于，例如，以下中：Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90:543；Hunziker.等(1995)Mod.Syn.Methods 7:331-417；和Crooke等(1996)Ann.Rev.Pharm.Tox.36:107-129。核苷残基可以通过许多已知的核苷间键中的任何一个彼此偶联。此类核苷间键包括，但不限于，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、氨基逐乙酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷基(borano)、硫醚、桥接的氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)、桥接的亚甲基膦酸酯、桥接的硫代磷酸酯和砜核苷间键。术语“寡核苷酸”还涵盖具有一个或更多个立体特异性核苷间键(例如硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯键)的多核苷。如本文使用的，术语“寡核苷酸”包括具有任何此类核苷间键的多核苷，无论该键是否包含磷酸基团。在一个实施方案中，这些核苷间键可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键或其组合。
核苷可以是2'-取代的。术语“2'-取代的”通常包括其中在戊糖部分2’位置的羟基基团被取代以产生2'-取代的或2'-O-取代的核苷的核苷。在一个实施方案中，此类取代为用包含1-6个饱和的或不饱和的碳原子的低级烃基基团、用卤素原子或用具有6-10个碳原子的芳基基团，其中此类烃基或芳基基团可以是未被取代的或可以是被取代的，例如但不限于被卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基基团取代。2'-O-取代的核苷的实例包括，但不限于，2'-氨基、2'-氟、2'-烯丙基、2'-O-烷基和2'-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷、2'-O-甲基核糖核苷或2'-O-甲基阿拉伯糖苷和2'-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2'-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。
术语“约”通常意指，精确数目并不是关键的。因此，根据本发明的该方面的寡核苷酸中从约6个至约1,000个核苷残基的数目不一定是关键的，并且具有更少或更多个核苷残基或从一个至几个较少或另外的核苷残基的寡核苷酸被预期为以上描述的实施方案的每一个的等同物。靶向SRY mRNA转录物的非编码5'和3'末端或该基因中的相应部分的寡核苷酸也被本文预期。
术语“反义寡核苷酸”通常指与所选择的核酸序列(诸如由SRY基因转录的mRNA)互补的DNA或RNA或其组合的链。在一个实施方案中，靶核酸为SRY mRNA转录物。当被引入到神经细胞时，反义寡核苷酸可以结合与其互补的SRY RNA并引起与其互补的SRY RNA的翻译的降低。如果结合发生，该核酸复合物可被内源酶降解。反义寡核苷酸包括，但不限于，传统的反义寡核苷酸，但还包括短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(mRNA)、单链RNA、发夹RNA和核酶，以及任何这些的脱氧核糖核苷酸等同物。
有用的寡核苷酸包括成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)DNA。这些为DNA基因座，其包含散布有间隔区DNA的核苷酸序列的短重复。CRISPR与Cas基因联合用于通过在编码、非编码和调控区域中插入、缺失或取代靶核苷酸序列进行基因编辑。例如，CRISPR可以使用指导RNA将Cas9内切核酸酶递送到细胞中(Wang等(2013)Cell 153(4):910-918)。
因此，本文提供了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法，所述方法包括将进入脑并且破坏SRY基因藉以降低所述SRY基因在多巴胺能神经细胞中表达功能蛋白的能力的CRISPR/Cas剂施用至所述雄性受试者。CRISPR/Cas剂的量有效改善神经系统疾病的症状或阻止神经系统疾病的症状发展或最小化神经系统疾病的症状的进一步进展。
包含核酸分子的表达载体可以编码SRY的有义或反义寡核苷酸或蛋白拮抗剂。这些可以存在于用于引入到脑中的靶神经细胞使用的病毒或类病毒颗粒中。核酸被可操作地连接至基因表达所需的调控元件。因此，将DNA或RNA分子掺入到递送病毒或其他媒介物导致当病毒将表达载体引入至神经细胞时编码寡核苷酸或蛋白的DNA或RNA的表达。
因此，包含被可操作地连接至调控元件的编码寡核苷酸或蛋白的核苷酸序列的核酸分子可以经由病毒载体或剂被引入到靶多巴胺能神经细胞中。可选地，可以整合到染色体中的线性DNA或RNA可以被引入到靶细胞中。当将DNA或RNA引入到细胞中时，可以添加促进DNA或RNA整合到染色体或转录组中的试剂。
表达载体的必要元件包括编码SRY的寡核苷酸或蛋白拮抗剂的核苷酸序列和在靶神经细胞中表达该序列所必要的调控元件。调控元件被可操作地连接至编码寡核苷酸或蛋白拮抗剂的核苷酸序列以使得能够在靶神经细胞内表达。核苷酸序列可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其杂合体或RNA分子，诸如mRNA。
基因表达所必要的调控元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。这些元件在多巴胺能神经元中为可操作的是必要的。此外，必要的是这些元件被可操作地连接至编码寡核苷酸或蛋白拮抗剂的核苷酸序列，使得核苷酸序列可以在神经细胞中表达，并因此可以产生寡核苷酸或蛋白拮抗剂。提及神经细胞包括多巴胺能神经元。
本文设想的其他剂包括小化学分子、被修饰为跨越血脑屏障或直接引入到脑并进入神经元的抗体、小肽、环己烯衍生物、脂质衍生物和用于转运这些剂的媒介物诸如脂质体，和遗传修饰的感染靶细胞并促进递送和表达或产生剂诸如寡核苷酸的病毒剂。
术语“小分子”通常指具有生物学活性的小有机化合物。小分子可以天然地存在或者可以合成地产生。小分子可以包括下调SRY的表达、功能或活性的化合物。它们可以跨越过血脑屏障被直接引入至脑。
通常，剂与生理学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起递送。因此，本文设想了包含该剂和生理学或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制剂、药物、治疗剂和药物组合物。
术语“生理学上可接受的”通常指不干扰剂的有效性且与生物学体系诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的材料。通常，生物体为哺乳动物诸如人类。
术语“药学上可接受的”通常指适用于在人类和动物中使用而没有不适当毒性的组分。
术语“载体”通常涵盖用于在药物制剂中使用的任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、油、脂质、包含脂质的囊泡、微球体、脂质体包封或本领域熟知的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于用于特定应用的施用途径。包含这些材料的药学上可接受的制剂的制备描述于以下中：例如，Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro,编著,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990。
术语“有效量”、“药学上有效量”或“治疗有效量”通常指足以实现所期望的生物学效应的量，所述所期望的生物学效应诸如有益结果，包括降低产生多巴胺的细胞的损失，降低SRY功能、活性或基因表达或者改善或减轻神经退行性疾病的影响。因此，“有效量”或“足够量”或“药学上有效量”或“治疗有效量”将取决于其被施用的情形。在施用降低SRY基因表达或SRY蛋白功能或活性的组合物的情形中，是足以达到预期的改善神经退行性疾病症状的量。因此，施用的剂的量有效抑制或降低SRY的功能或水平或活性。通常，该量有效减轻神经系统紊乱的症状或潜在原因。因此，在一个实施方案中，该量有效降低产生多巴胺的细胞的损失并且至少维持运动功能。
该剂可以以任何方式施用，使其能够通过任何机制到达其在脑中的靶。虽然本文设想了颅内施用和逆行转运，该剂可以可选地需要以能够渗透血脑屏障的形式施用。因此，本发明延伸至基于纳米生物技术的递送方法诸如被动扩散，使用脂质或脂溶性物质，使用载体蛋白的活性转运，和受体介导的转运诸如在腰椎穿刺之后经由脑脊液与特定受体连接的剂。用于神经移植的教导包括立体定位手术，其中剂的制剂被植入到脑中或通过显微外科手术移植到脑中。已经描述了用于引入剂的技术(Lindvall等(1987)Ann.Neurol.22:457468；Madrazo等(1987)New Engl.J.Med.316:831 834；Dewing等(2006)同上)。其他机制包括插入引导套管(guide cannula)以注射核酸。这包括脑引导套管，诸如来自BASi(WestLafayette,Indiana,USA)的MBR型脑引导套管。
本文提供了一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的治疗方案，所述方案包括：
(i)基于行为、遗传倾向性(genetic predisposition)、症状或年龄或向毒素或毒物的暴露来鉴定和选择所述雄性受试者；
(ii)将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善所述神经系统紊乱的症状、阻止所述神经系统紊乱的症状的发展或最小化所述神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至所述雄性受试者；
(iii)监测所述雄性受试者的症状和行为；
(iv)根据需要提供另外的剂或其他药物或行为改变以维持所述雄性受试者的健康。
产生多巴胺的神经细胞包括多巴胺能神经元。
本文还提供了拮抗SRY活性或功能或SRY基因表达的剂在制备治疗或改善雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的症状的药物中的用途。
雄性受试者通常为需要治疗或处于需要治疗的风险的人类男性，然而，也可以治疗非人类哺乳动物。这通常用于测试目的。“处于风险”的受试者的实例为暴露于毒素或毒物诸如环境毒物的人员或诸如经由遗传手段遗传上易患该状况的人员。因此，治疗包括在发展之前潜在地预防症状。
在一个实施方案中，在开始治疗后，将需要在受试者的生命中继续治疗。治疗仅部分地有效并且导致症状减缓是可能的。尽管如此，治疗将比不治疗更长时间地延长生命质量。
该剂可以单独地或与其他药物组合给予，以帮助患者缓解症状的严重程度或改善症状。
行为改变诸如按摩、锻炼和心理治疗以及其他药物诸如镇静剂、抗癫痫药物或甲基菲啶(methylphidale)或其衍生物(例如Retalin)也可以与SRY拮抗剂同时或依次或独立地施用。深部脑刺激(DBS)也可以与SRY拮抗剂一起采用。DBS包括植入脑起搏器，其经由植入的电极向脑的选择部分发射电脉冲(Kringlebach等(2007)Nature ReviewsNeuroscience 8:623-635)。
因此，本文还设想了组合治疗，所述组合治疗包括第一治疗方案和一种或更多种其他药物和/或行为改变，所述第一治疗方案包括施用SRY拮抗剂。
因此，提供了一种治疗试剂盒，所述治疗试剂盒包含隔室，其中至少一个隔室包含SRY拮抗剂，并且至少一个其他隔室包含可用于治疗神经系统状况的另一种药物。试剂盒可以递送多次剂量持续从2天至21天诸如持续7天的过程。试剂盒还可以包含单独的SRY拮抗剂，还被设计为分配多次剂量持续从2天至21天。可选地，包装中提供有以可以维持数月的丸剂形式的SRY拮抗剂。治疗试剂盒还可以包括诸如用于深部脑刺激的医学装置或允许递送剂的用于脑的套管。
给药将取决于人员、紊乱、症状的严重程度等。因此，可以需要每日单次剂量至每日多次剂量，通常持续雄性受试者的生命。
实施例
本文公开的方面通过以下非限制性实施例被进一步描述。
材料和方法
使用重量在280g和350g之间的成年Long-Evans雄性和雌性大鼠。将动物圈养于12小时明：暗周期室中，并随意获得食物和水。
实验设计
研究1.降低的黑质SRY水平对正常大鼠中的运动和黑质纹状体功能的影响。
对经由重复SRY反义寡核苷酸(ODN)注射降低的黑质SRY水平对运动功能的影响进行评价。将SRY反义或有义ODN每天注射到雄性或雌性大鼠中的右侧SNc(2μg)中持续10天。在ODN处理之前(第0天)和在ODN处理结束时(第10天)，通过肢体使用不对称和旋转测试评价运动功能。在最后的行为测试之后，将脑进行处理用于测量纹状体DA/DOPAC和黑质mRNA表达。
研究2.毒素诱导的损伤对雄性大鼠中的黑质SRY表达的影响。
黑质纹状体多巴胺系统的部分损伤通过将6-OHDA或鱼藤酮注射到右侧SNc中来实现。在手术麻醉之后，将大鼠置于立体定位框架中。将不同量的6-OHDA(15μg/μl或30μg/μl)、鱼藤酮(30μg/μl)或媒介物(在盐水中的0.1w/v抗坏血酸或1％w/v DMSO)注射到右侧SNc(前囱后部5.3mm，前囱侧部3mm，且硬脑膜表面腹侧6.0mm)。在术前运动功能评价之后，在处理后的第2天、第7天、第14天或第28天评价雄性大鼠中的运动功能。在6-OHDA处理后的不同时间点时的运动行为研究结束时，将大鼠杀死，并且对脑进行处理以用于测量黑质SRY和酪氨酸羟化酶(TH)mRNA水平。
研究3.降低的黑质SRY水平对正常大鼠中的毒素诱导的运动缺陷和多巴胺细胞损失的影响。
在用单次剂量6-OHDA(30μg/μl)或鱼藤酮(30μg/μl)注射到右侧SNc的雄性或雌性大鼠中评价重复黑质SRY反义或有义ODN注射(2μg/每天，持续10天)对运动功能的影响。通过肢体使用不对称和苯丙胺诱导的旋转测试评价雄性或雌性大鼠中的运动功能。在最后的行为测试之后，将脑进行处理用于测量黑质mRNA、黑质TH和纹状体DAT免疫组织化学。大鼠ODN示于表3中。
手术和药物注射
在大鼠SNc中立体定位植入套管
在手术麻醉之后，将大鼠固定于立体定位框架中。将针对右侧SNc的单侧引导套管(22GA)植入在距离前囱的后部5.3mm、侧部2mm和硬脑膜表面腹侧6.0mm处。将引导套管用不锈钢螺钉和牙科粘固粉(dental cement)固定至颅骨。将突出于开口以外<0.5mm的仿制套管(Dummy cannulae)置于引导套管中。
将SRY反义寡核苷酸长期注射到大鼠SNc中
用于输注的反义为以相等比例添加的不同ODN(表3)的混合物(cocktail)。第一和第二ODN，21-mer和23-mer硫代磷酸酯封端寡核苷酸被设计为相应于大鼠SRY mRNA(GenBank登录号AF274872[SEQ ID NO:910和911])。也相应于大鼠SRY mRNA序列的20-mer第三ODN不是硫代磷酸酯封端的。有义三联体混合物ODN相应于三种反义ODN的互补序列。将ODN经HPLC纯化(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并溶解于人工脑脊液(aCSF)媒介物(在dH2O中的0.1M NaCl、4mM KCl、1mM CaCl2、870mM NaH2PO4、和430mM MgSO4)至终浓度为2μg/μL。通过22号不锈钢注射套管进行输注，将该注射套管插入并延伸到在留置引导套管顶端下方的0.5mm处，并以柔性管道附接到安装在机动Harvard微型泵(Harvard Apparatus,UK)上的100μL Hamilton注射器上。以0.5μL/分钟的速率进行输注，随后进行2分钟的平衡时间段，在此期间将针保持在适当的位置。将所有大鼠每天用反义或有义ODN单侧注射(在1μL aCSF中的2μg)持续连续10天。
表3
SRY反义和有义寡脱氧核苷酸的碱基序列和位置
1加斜体的碱基为硫代磷酸酯化的
将多巴胺毒素急性注射入到大鼠SNc中
通过急性注射多巴胺毒素6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-OHDA,Sigma-Aldrich,USA)或鱼藤酮(Sigma-Aldrich,USA)制备右侧SNC的单侧损伤。简言之，将在1.5μL 0.1％w/v抗坏血酸盐水溶液中的6-OHDA(20μg)或在1.5μL 1％w/v DMSO/盐水溶液中的鱼藤酮(20μg)输注到有意识动物的SNc中。为了避免降解，对于每一个实验制备新鲜的6-OHDA，将其保持在冰上并避免光照。通过22号不锈钢注射套管进行输注，将该注射套管插入并延伸到在留置引导套管顶端下方的0.5mm处，并以柔性管道附接到安装在机动Harvard微型泵(HarvardApparatus,UK)上的100μL Hamilton注射器上。以0.5μL/分钟的速率进行输注，随后进行2分钟的平衡时间段，在此期间将针保持在适当的位置。
运动行为测试
使用肢体使用不对称测试、旋转试验和苯丙胺诱导的旋转试验评价大鼠的运动功能。
肢体使用不对称测试
肢体使用不对称测试评价大鼠中垂直探查期间的自发性前肢使用，其中运动受损通过药物注射部位对侧的肢体使用的降低来指示。将大鼠轻轻地放入到圆筒中，并且将垂直探查期间的前肢接触录像记录，直至达到总计30次触碰。将数据表示为左(受损)前爪接触的百分比；其中对称爪使用(左侧≈右侧)是未受损肢体使用的量度。
旋转
旋转测试通过评价啮齿动物在旋转平台上保持平衡的能力来评价啮齿动物的平衡和运动协调。在行为测试那天之前训练大鼠持续2天。
苯丙胺诱导的旋转测试
苯丙胺诱导的旋转测试提供了已经接受单侧6-OHDA注射的动物中多巴胺细胞死亡的行为估计(Lee等(2008)Brain 131:1574-1587)。简言之，通过将大鼠置于圆形笼中来测量旋转行为，在圆形笼中将大鼠束缚于自动化的回圈测试仪(rotometer)系统并注射苯丙胺(2mg/kg，腹膜内)。以10分钟的间隔测量总旋转数目，持续90分钟。将数据表示为每分钟的净旋转，其中朝向损伤侧的旋转被给予正值。
大鼠SNc和纹状体的分离
在行为研究结束时，将大鼠脑进行心脏内(intracardially)灌注并处理用于免疫组织化学或新鲜分离并处理用于蛋白印迹或qRT-PCR。根据需要，将脑在-20℃使用恒冷切片机(Leica)切片。分别以16μm和10μm收集纹状体和SNc的连续冠状切片。将切片解冻封固到多聚(l-赖氨酸)涂覆的载玻片上，干燥并储存在-80℃。在每一个系列之间收集200μm厚片(slab)以便分离组织用于RNA和蛋白加工。
脑在恒冷切片机上进行调整，直至背腹轴和内外侧(medial-lateral)轴上均匀。将Paxinos大鼠脑图谱(atlas)用于基于常见标志(landmarks)诸如脑室和神经纤维束来确定SNc的位置。在观察到SNc后，收集了6个连续的冠状切片，随后从200μm厚片上分离出SNc，以分离组织用于RNA加工。通过对于对照左侧SNc和6-OHDA处理的右侧SNc收集2×1mm直径的样品来获得SNc分离。
免疫组织化学和立体学
TH免疫组织化学如下进行：通过将20μm厚的SNc切片在绵羊抗-TH第一抗体(Pelfreeze，1:2000，在4℃过夜)、随后是生物素化的第二抗体(山羊，抗绵羊IgG，1:1000，Vector Labs,USA)中孵育，并与钴和镍强化的二氨基联苯胺(DAB,Sigma-Aldrich)反应。DAB免疫染色的切片用中性红复染。DAT免疫组织化学如下进行：通过将16μm厚的纹状体切片在大鼠抗-DAT第一抗体(Chemicon，1:2000，在4℃78小时)、随后是生物素化的第二抗体(兔，抗大鼠IgG，1:500，Vector Labs)中孵育，并与DAB反应。DAB-免疫染色的切片使用配备有Olympus cellSens图像分析软件的Olympus显微镜通过明视野显微术进行分析。在覆盖整个SNc或纹状体的规则间隔的切片上，立体定量TH-免疫反应性和中性红阳性细胞体或DAT-免疫反应性末梢。进行用于估计TH-免疫反应性神经元数目和纹状体DAT-免疫反应性轴突膨体(axonal varicosities)数目的分馏器(fractionator)设计。
大鼠黑质mRNA的测量
由于RNA的初始低产率，在整个提取过程中采取努力来确保无RNA酶和DNA酶的环境，最小化潜在的RNA降解。为了确保无RNA酶环境，在用0.1％w/v SDS，随后用0.1％w/vDEPC处理的水处理的通风橱中进行提取。移液管和均质设备均用0.1％w/v DEPC处理的水，随后用0.1％w/v SDS，并且再次用0.1％w/v DEPC处理的水彻底洗涤。将研杵在每一次使用之后进行洗涤，并用镊子操纵。仅使用检定无RNA酶和DNA酶的尖端(tips)。最后，将所有溶液的新鲜等分试样用于每一个批次的RNA提取。使用TRIzol(注册商标)试剂(LifeTechnologies)的制造商说明中概述的条件从组织样品中分离总RNA。简言之，根据部分2.3.6，将从黑质分离的组织在室温在800μl TRIzol(注册商标)试剂中均质化5分钟。将均质化的样品留在室温孵育3分钟以确保核蛋白复合物的完全解离。然后通过添加200μl氯仿，剧烈振荡15秒，并在4℃以12,000rpm离心15分钟将样品进行相分离。注意不要扰乱下部的DNA和有机相，将顶层RNA水相(总体积的～60％)转移至新的管中。然后添加10μg体积的无RNA糖原作为载体分子以增加RNA产率，随后添加400μl异丙醇。然后将样品在4℃以13,000rpm离心10分钟。将所得沉淀物用75％v/v乙醇-0.1％w/v DEPC处理水洗涤一次，然后在4℃以7,500rpm离心10分钟。将沉淀物留下短暂地干燥，然后重新溶解于20μl 0.1％w/vDEPC处理水中。在0.75％w/v琼脂糖凝胶上检查RNA质量，并在260nm处以Nanodrop分光光度法(ThermoScientific)分析用于质量和数量评价。
为了将mRNA转化为cDNA，将适当量(50ng、100ng或200ng)分离的总RNA根据制造商规格，使用在5X第一链缓冲液中的修饰酶Superscript III(Invitrogen)进行逆转录。2μlOligo d(T)15引物(Roche)用于在每一个RT-PCR反应中逆转录mRNA转录物。mRNA水平的实时定量根据制造商的说明，使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)来进行。标准曲线通过扩增来自感兴趣的基因的DNA(连续稀释)来产生。标准曲线用作建立从样品扩增的mRNA的量的参考。将对于每一个样品获得的值对管家基因GAPDH、Tbp-1和HRPT1的扩增水平标准化。mRNA水平的实时定量根据制造商的说明，使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)来进行。使用来自M17细胞的cDNA作为模板，将每一个感兴趣的基因进行PCR扩增，凝胶纯化并连续稀释以产生一组标准品(standards)。标准曲线通过扩增来自感兴趣的基因的DNA(连续稀释)来产生。标准曲线用作建立从样品扩增的mRNA的量的参考。将对于每一个样品获得的值对管家基因GAPDH的扩增水平标准化。
SRY、TH、GADD45γ和GAPDH引物用于确定响应于6-OHDA处理的基因转录水平。每个样品总体积22μl PCR混合物如下制备：将4ul cDNA和0.2μl Taq聚合酶添加至包含以下的混合物：10x Taq缓冲液MgCl2(2mM)、正向引物(5μM)、反向引物(5μM)、无RNA酶的水、dNTP2.5mM。
统计分析
将所有值表示为平均值±S.E.M。将所有数据使用Graphpad Prism 5内的工具进行分析。处理组跨测试的天数的运动功能以天作为重复测量因素通过双因素方差分析(ANOVA)进行分析。组织学或生物化学测定中各组之间的显著差异通过进行单向重复测量ANOVA来确定。在适当的情况下，Bonferroni的事后检验将用于估计总体显著性。对于所有统计检验，5％的概率水平(p<0.05)被认为是显著的。
实施例1
SRY控制雄性大鼠中的运动功能和黑质纹状体多巴胺水平
将针对黑质SRY基因的重复反义寡核苷酸(ODN)处理与有义ODN阴性对照提供至雄性和雌性大鼠。运动功能通过肢体使用不对称和旋转测试进行评价。然后将脑处理用于黑质SRY、Sox-6、Sox-3、酪氨酸羟化酶(TH)、DOPA脱羧酶(DDC)、单胺氧化酶-A(MAO-A)mRNA表达以及纹状体多巴胺(DA)和二羟基苯乙酸(DOPAC)测量。结果示于图1中。反义处理引起雄性大鼠中的运动功能的显著降低。
实施例2
在6-OHDA注射之前SRY反义处理的作用
将SRY反义ODN与阴性有义ODN对照重复给予雄性大鼠。在6-OHDA注射之前，重复SRY反义处理减弱雄性大鼠中的6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质纹状体退化。结果示于图2中。药物6-OHDA诱导帕金森病样症状。证明了，当在6-OHDA之前给予时，SRY反义处理降低这些症状的发展。存活的神经元从25％增加至50％。
实施例3
在6-OHDA注射之后SRY反义处理的作用
重复实施例2，不同之处在于在6-OHDA处理之后施用反义ODN。获得类似的结果。在6-OHDA注射之后，重复SRY反义处理减弱雄性大鼠中的6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质纹状体退化。结果示于图3中。
实施例4
在鱼藤酮注射之前SRY反义处理的作用
使用鱼藤酮代替6-OHDA重复实施例2。鱼藤酮为引起帕金森病样症状的另一种毒素。在鱼藤酮注射之前，重复SRY反义处理减弱雄性大鼠中的鱼藤酮诱导的运动缺陷和黑质纹状体退化。结果示于图4中。
实施例5
SRY反义处理对雌性大鼠的作用
测试了SRY反义ODN在雌性大鼠中的作用。在6-OHDA注射之前，重复SRY反义处理不影响雌性大鼠中的6-OHDA诱导的运动缺陷和黑质DA细胞损失。结果示于图5中。不存在实质性改进，证明该治疗针对雄性偏倚的紊乱。
实施例6
治疗方案
提出了一种治疗方案，所述治疗方案用于被诊断为患有或具有与雄性偏倚的神经系统紊乱相关的症状的雄性受试者。提出了施用下调编码SRY的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂，所述剂包括靶向并下调SRY mRNA的表达的反义寡核苷酸。提出了在健康的脑中，SRY控制多巴胺产生和运动功能。在损害的脑中，SRY上调为有害的。随着渐进性产生多巴胺的细胞的损失，SRY神经元被选择性地损失。施用SRY-选择性抑制剂持续所需的时长，以最小化患者健康的渐进性降低。对于人类使用，表4中的寡核苷酸代表一组可能的寡核苷酸。与人类SRY mRNA结合的包含20mer Gapmer的另一组寡核苷酸提供于表5中。该构型为10个核苷酸，侧翼为10个2'-甲氧基乙基-核糖核苷酸，具有硫代磷酸化的碱基。
表4
人类SRY反义和有义寡脱氧核苷酸的碱基序列和位置
1加下划线的碱基为硫代磷酸化的
表5
结合人类SRY mRNA的20mer Gapmer反义寡核苷酸(ASO)
本领域技术人员将理解，本文描述的公开内容除了具体描述的那些以外还易于变化和修改。应当理解，本公开内容设想了所有此类变化和修改。本公开内容还提供了在本说明书中单独或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物以及任何两个或更多个所述步骤或特征或组合物或化合物的任何一个和所有组合。
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Claims (36)

1.一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法，所述方法包括将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码Y染色体性别决定区域(SRY)的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善所述神经系统紊乱的症状、阻止所述神经系统紊乱的症状的发展或最小化所述神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至所述雄性受试者。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述产生多巴胺的神经细胞为多巴胺能神经元。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述多巴胺能神经元位于所述脑的黑质致密部(SNc)。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述SRY基因的表达的下调或所述SRY蛋白的功能或活性的下调降低或抑制产生多巴胺的细胞的渐进性损失。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述神经系统紊乱与产生多巴胺的细胞的损失相关。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述神经系统紊乱选自包括以下的列表：帕金森氏病、孤独症、癫痫、注意缺陷多动紊乱(ADHD)、精神病、药物成瘾和疼痛。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述精神病为精神分裂症。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述剂为遗传分子、小化学分子、肽或包含所述遗传分子、所述小化学分子、所述肽的媒介物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述遗传分子为靶向编码SRY或其调控区域的mRNA或DNA、藉以降低或抑制翻译为活性蛋白或表达为可翻译的mRNA的寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述寡核苷酸选自包括以下的列表：短单链或双链RNA或DNA、iRNA、siRNA、发夹RNA或者DNA构建体。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO:88、890、892、894、896、897、898和899。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述剂为CRISPR/Cas剂。
13.如权利要求10或11或12所述的方法，其中所述寡核苷酸由表达载体产生。
14.如权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述媒介物为病毒。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述剂被直接施用至所述脑。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者为人类男性。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述剂与深部脑刺激结合施用。
18.一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的治疗方案，所述方案包括：
(i)基于行为、遗传倾向性、症状或年龄或向毒素或毒物的暴露来鉴定和选择所述雄性受试者；
(ii)将进入脑并且在产生多巴胺的神经细胞中抑制编码Y染色体性别决定区域(SRY)的基因的表达或抑制SRY功能或活性的剂或携带所述剂的媒介物以有效改善所述神经系统紊乱的症状、阻止所述神经系统紊乱的症状的发展或最小化所述神经系统紊乱的症状的进一步进展的量施用至所述雄性受试者；
(iii)监测所述雄性受试者的症状和行为；
(iv)根据需要提供另外的剂或其他药物或行为改变以维持所述雄性受试者的健康。
19.如权利要求18所述的治疗方案，其中所述产生多巴胺的神经细胞为多巴胺神经元。
20.如权利要求18所述的治疗方案，其中所述多巴胺神经元位于所述脑的黑质致密部(SNc)。
21.如权利要求20所述的治疗方案，其中所述SRY基因的表达的下调或所述SRY蛋白的功能或活性的下调降低或抑制产生多巴胺的细胞的渐进性损失。
22.如权利要求21所述的治疗方案，其中所述神经系统紊乱与产生多巴胺的细胞的损失相关。
23.如权利要求18至22中任一项所述的治疗方案，其中所述神经系统紊乱选自包括以下的列表：帕金森氏病、孤独症、癫痫、注意缺陷多动紊乱(ADHD)、精神病、药物成瘾和疼痛。
24.如权利要求23所述的治疗方案，其中所述精神病为精神分裂症。
25.如权利要求18至24中任一项所述的治疗方案，其中所述剂为遗传分子、小化学分子、肽或包含所述遗传分子、所述小化学分子、所述肽的媒介物。
26.如权利要求25所述的治疗方案，其中所述遗传分子为靶向编码SRY的mRNA或DNA、藉以降低或抑制翻译为活性蛋白或表达为可翻译的mRNA的寡核苷酸。
27.如权利要求26所述的治疗方案，其中所述寡核苷酸选自包括以下的列表：短单链或双链RNA或DNA、iRNA、siRNA、发夹RNA或者DNA构建体。
28.如权利要求26或权利要求27所述的治疗方案，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO:888、890、892、894、896、897、898和899。
29.如权利要求25所述的治疗方案，其中所述剂为CRISPR/Cas剂。
30.如权利要求27或28或29所述的治疗方案，其中所述寡核苷酸由表达载体产生。
31.如权利要求25至30中任一项所述的治疗方案，其中所述媒介物为病毒。
32.如权利要求18至31中任一项所述的治疗方案，其中所述剂被直接施用至所述脑。
33.如权利要求18所述的治疗方案，其中所述受试者为人类男性。
34.如权利要求33所述的治疗方案，其中所述剂与深部脑刺激结合给予。
35.拮抗SRY活性或功能或SRY基因表达的剂在制备治疗或改善雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的症状的药物中的用途。
36.一种用于治疗或预防雄性受试者中的雄性偏倚的神经系统紊乱的方法，所述方法包括将进入脑并且在多巴胺能神经细胞中破坏SRY基因藉以降低所述SRY基因表达功能蛋白的能力的CRISPR/Cas剂施用至所述雄性受试者。
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