JP2024037914A - アルファ-シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
アルファ-シヌクレインを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】SNCAタンパク質発現減少にいたる、細胞におけるSNCA mRNA(例えば、イントロンエクソン接合部)を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】AtTcctttacaccACAC(配列番号4)の連続的ヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなる又はこれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)であって、ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAであり、小文字はDNAである、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。SNCAタンパク質発現減少は、ある医学的障害、例えば、神経学障害の処置に有益である。【選択図】なし
Description
本出願において電子的に提供した配列表の引用
本出願において電子的に提供した配列表(名称:3338_107PC01_SequenceListing_ST25.txt、サイズ:10,458バイト;および作成日:2019年1月10日)の内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本出願において電子的に提供した配列表(名称:3338_107PC01_SequenceListing_ST25.txt、サイズ:10,458バイト;および作成日:2019年1月10日)の内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は、アルファ-シヌクレイン(SNCA)タンパク質発現減少にいたる、細胞におけるアルファ-シヌクレイン(SNCA)転写物のイントロン1とエクソン2の接合部を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物(ASO)に関する。SNCAタンパク質発現減少は、多系統萎縮症、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)およびレビー小体型認知症などの一定範囲の医学的障害に有益であり得る。
本発明は、アルファ-シヌクレイン(SNCA)タンパク質発現減少にいたる、細胞におけるアルファ-シヌクレイン(SNCA)転写物のイントロン1とエクソン2の接合部を標的とするアンチセンスオリゴマー化合物(ASO)に関する。SNCAタンパク質発現減少は、多系統萎縮症、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)およびレビー小体型認知症などの一定範囲の医学的障害に有益であり得る。
発明の背景
シヌクレインタンパク質ファミリーのメンバーであるアルファ-シヌクレイン(SNCA)は、主に神経組織内で発現される小可溶性タンパク質である。Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)参照。多くの細胞型で発現されるが、神経細胞のシナプス前終末内に優勢に局在化する。厳密な機能はまだ完全には解明されていないが、SNCAは、シナプス伝達の制御に重要な役割を有することが示唆されている。例えば、SNCAは、SNARE複合体形成における分子シャペロンとして機能し、これは神経細胞のシナプス小胞とシナプス前膜のドッキングに介在する。SNCAは微小管関連タンパク質タウなどの他のタンパク質とも相互作用でき、これは、微小管安定化を助け、小胞輸送を制御する。
シヌクレインタンパク質ファミリーのメンバーであるアルファ-シヌクレイン(SNCA)は、主に神経組織内で発現される小可溶性タンパク質である。Marques O et al., Cell Death Dis. 19: e350 (2012)参照。多くの細胞型で発現されるが、神経細胞のシナプス前終末内に優勢に局在化する。厳密な機能はまだ完全には解明されていないが、SNCAは、シナプス伝達の制御に重要な役割を有することが示唆されている。例えば、SNCAは、SNARE複合体形成における分子シャペロンとして機能し、これは神経細胞のシナプス小胞とシナプス前膜のドッキングに介在する。SNCAは微小管関連タンパク質タウなどの他のタンパク質とも相互作用でき、これは、微小管安定化を助け、小胞輸送を制御する。
シナプス伝達制御におけるSNCAの役割のため、SNCA発現および/または機能の改変は重要な生物学的過程を妨害し得る。このような妨害は、脳内のSNCAタンパク質凝集体の異常蓄積により特徴づけられる神経変性疾患である、α-シヌクレイン病に寄与すると考えられている。従って、誤って折り畳まれた、凝集し、かつリン酸化したSNCAタンパク質の不溶性封入体は、パーキンソン病(PD)、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症(DLB)および多系統萎縮症(MSA)などの疾患の病理学的特徴である。Galvin JE et al., Archives of Neurology 58: 186-190 (2001); and Valera E et al., J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352 (Oct. 2016)参照。
パーキンソン病などのα-シヌクレイン病は、特に高齢者で非常に多くみられる進行性神経変性脳障害である。Recchia A et al., FASEB J. 18: 617-26 (2004)参照。世界中で約700万~1000万人がこのような障害をもって生活し、米国単独で毎年約60,000の新規症例があると推定される。一個人に対する医療費は年間$2,500を優に超え、治療的手術は患者あたり最大$100,000の費用となり得る。それ故に、より強固かつ費用効率のよい処置選択肢の必要性が大きい。
発明の概要
本発明は、AtTcctttacaccACAC(配列番号4)の連続的ヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に関し、ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAであり、小文字はDNAである。他の実施態様において、ASOは、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。
本発明は、AtTcctttacaccACAC(配列番号4)の連続的ヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)に関し、ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAであり、小文字はDNAである。他の実施態様において、ASOは、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む。ある実施態様において、ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある実施態様において、ASOは、OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMCを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるものであり、ここで、OxyA、OxyTおよびOxyMCはそれぞれアデニンベータD-オキシ-LNA、チミンベータD-オキシ-LNAおよびメチルシトシンベータD-オキシ-LNAであり、DNAt、DNAcおよびDNAaはそれぞれチミンDNA、シトシンDNAおよびアデニンDNAである。ある実施態様において、本発明のASOは、C171H214N56O90P16S16の分子式および図1Bに示す構造を有し、ここで、M+はカウンターイオンである。ある実施態様において、カウンターイオンは、H+、Na+、NH4
+およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、カウンターイオンはNa+である。
本発明はまたここに開示するASOを含むコンジュゲートであって、ここで、ASOは少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合しているものを提供する。ある実施態様において、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの何れかの組み合わせを含む。
またここに提供されるのは、ここに開示するASOまたはコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。ある実施態様において、組成物は、さらに治療剤を含む。ある実施態様において、治療剤はアルファ-シヌクレインアンタゴニストである。ある実施態様において、アルファ-シヌクレインアンタゴニストは抗アルファ-シヌクレイン抗体またはそのフラグメントである。
本発明は、さらに、ここに開示するASO、コンジュゲートまたは組成物を含むキットを提供する。また提供されるのは、本発明のASO、コンジュゲートまたは組成物を含む診断キットである。
本発明はまた細胞におけるSNCAタンパク質発現を阻止または減少する方法に関し、方法はここに開示するASO、コンジュゲートまたは組成物をSNCAタンパク質発現細胞に投与することを含み、ここで、細胞のSNCAタンパク質発現が投与後阻止または減少される。ある実施態様において、ASOは、投与後細胞のSNCA mRNA発現を阻止または減少する。ある実施態様において、SNCA mRNAの発現は、投与後、ASOに曝されていない細胞と比較して少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または約100%減少される。他の実施態様において、ASOは、投与後、ASOに曝されていない細胞と比較して、細胞のSNCAタンパク質少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%減少させる。ある実施態様において、細胞は神経細胞である。
ここに提供されるのは、有効量の本発明のASO、コンジュゲートまたは組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病を処置する方法である。ある実施態様において、シヌクレイン病は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される。
またここに提供されるのは、医薬の製造のための本発明のASO、コンジュゲートまたは組成物の使用である。本発明はまた処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置用医薬の製造のための、ASO、コンジュゲートまたは組成物の使用を提供する。ある実施態様において、本発明のASO、コンジュゲートまたは組成物は、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置に使用するためである。他の実施態様において、本発明のASO、コンジュゲートまたは組成物は治療に使用するためである。
ある実施態様において、対象はヒトである。ある実施態様において、ASO、コンジュゲートまたは組成物は、経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与される。
本発明の詳細な記載
I. 定義
物の単数表現はその物の1またはそれ以上をいうことは注意すべきである;例えば「ヌクレオチド配列」は1以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、「1以上」および「少なくとも1」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。
I. 定義
物の単数表現はその物の1またはそれ以上をいうことは注意すべきである;例えば「ヌクレオチド配列」は1以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。すなわち、単数表現、「1以上」および「少なくとも1」は、ここでは相互交換可能に使用され得る。
さらに、「および/または」は、ここで使用されるとき、他方を伴うまたは伴わない、2つの特定の性質または要素の各々と解釈すべきである。故に、ここで「Aおよび/またはB」などの表現で使用する用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)および「B」(単独)を含むことを意図する。同様に、「A、Bおよび/またはC」などの言い回しで使用する用語「および/または」は、次の態様を包含することが意図される:A、BおよびC;A、BまたはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);およびC(単独)。
ある態様が用語「含む」を使用して記載されているとき、用語「からなる」および/または「から本質的になる」で記載される類似する態様も提供されると理解される。
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本発明に使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞および記号は、国際単位系(SI)により認められた形態で示す。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。特に断らない限り、ヌクレオチド配列は、左から右に5'から3'配向で記載する。アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。ここに提供する表題は、本明細書を全体として参酌して得られる本発明の種々の態様を限定するものではない。従って、直ぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参酌してより完全に定義される。
用語「約」は、ここでは、おおよそ、大まかに、近辺またはその辺りを意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用されるとき、その範囲が示す数値の上および下に境界を広げるように修飾される。一般に、用語「約」は、数値を、記載した値の例えば、10パーセント上または下の(高いまたは低い)偏差まで、上および下に修飾し得る。例えば、「ASOは、ASO投与後、細胞のSNCAタンパク質を少なくとも約60%減少させる」なる記載があるならば、SNCAレベルは50%~70%の範囲で減少されることが含意される。
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」(ASO)は、ヌクレオチド間結合により互いに共有結合された、天然に存在するヌクレオシドまたはその修飾形態などのヌクレオシドのオリゴマーまたはポリマーをいう。本発明に有用なASOは、少なくとも1つの天然に存在しないヌクレオシドを含む。ASOは、ASOが標的核酸配列とハイブリダイズするように、標的核酸と相補性である。ここで使用する用語「アンチセンスASO」、「ASO」および「オリゴマー」は、用語「ASO」と相互交換可能である。
用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することが意図される。ある実施態様において、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、インビボまたはインビトロの標的配列、例えば、pre-mRNA、mRNAまたはDNAをいう。本用語が標的配列の核酸またはヌクレオチドをいうとき、該核酸またはヌクレオチドは細胞に天然に存在する配列であり得る。他の実施態様において、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本発明のASOの配列をいう。本用語がASOの配列をいうとき、該核酸またはヌクレオチドは天然に存在しない、すなわち、化学合成された、酵素的に産生された、組み換えにより産生されたまたはこれらの何れかの組み合わせであり得る。ある実施態様において、ASOの核酸またはヌクレオチドは合成または組み換えにより産生され、天然に存在する配列またはそのフラグメントではない。他の実施態様において、ASOの核酸またはヌクレオチドは、本来天然に存在しない少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含むため、天然に存在しない。用語「核酸」または「ヌクレオシド」は、ポリヌクレオチドに存在する単一核酸セグメント、例えば、DNA、RNAまたはそのアナログをいう。「核酸」または「ヌクレオシド」は天然に存在する核酸または天然に存在しない核酸を含む。ある実施態様において、用語「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列をいうとき、言及されるのは、A、T、G、CまたはUおよびそれらのアナログなどの塩基配列であることは認識される。
ここで使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基などの共有結合基(結合基)を含むグリコシドをいい、DNAまたはRNAなどの天然に存在するヌクレオチドおよび修飾糖および/または塩基を含む天然に存在しないヌクレオチドの両者を包含する。ここで、単一ヌクレオチド(単位)はモノマーまたは核酸単位とも称され得る。
ここで使用する用語「ヌクレオシド」は、ASOのヌクレオシド間をヌクレオチド間結合により共有結合され得る、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいう。バイオテクノロジー分野において、用語「ヌクレオシド」はしばしば核酸モノマーまたは単位をいうために使用される。ASOに関連して、用語「ヌクレオシド」は、糖主鎖およびヌクレオチド間結合の存在が含意される、シトシン(DNAおよびRNA)、グアニン(DNAおよびRNA)、アデニン(DNAおよびRNA)、チミン(DNA)およびウラシル(RNA)を含む、塩基単独、すなわち、核酸塩基配列をいい得る。同様に、特にヌクレオチド間結合基の1以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は「ヌクレオシド」といい得る。例えば用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質が特定されていても、使用できる。
当業者には認識されるとおり、オリゴヌクレオチドの5'末端ヌクレオチドは、5'末端基を含み得るが、5'ヌクレオチド間結合基を含まない。
用語「下流」は、ヌクレオチド配列についていうとき、核酸またはヌクレオチド配列が対照ヌクレオチド配列の3'に位置することを意味する。ある実施態様において、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
特に断らない限り、ここに提供する配列は、5'末端(左)から3'末端(右)に記載される
用語「上流」は、対照ヌクレオチド配列の5'に位置するヌクレオチド配列をいう。
ここで使用する用語「転写物」は、DNAの転写により合成され、処理後メッセンジャーRNA(mRNA)になる一次転写物すなわち、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)および処理されたmRNAそれ自体をいうことができる。用語「転写物」は、「pre-mRNA」および「mRNA」と相互交換可能に使用され得る。DNA鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNAおよびその他などの成熟、機能的形態に変換されるようにいくつかの方法で修飾される。故に、用語「転写物」は、エキソン、イントロン、5' UTRおよび3' UTRを含み得る。
ここで使用する用語「発現」は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、RNAまたはポリペプチドを産生する過程をいう。ポリヌクレオチドのメッセンジャーRNA(mRNA)への転写およびmRNAのポリペプチドへの翻訳を含むが、これらに限定されない。発現は「遺伝子産物」を産生する。ここで使用する遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生された核酸、例えば、メッセンジャーRNAまたは転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。ここに記載する遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングされた核酸または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの結合またはタンパク質分解的開裂されたポリペプチドをさらに含む。
SNCAポリペプチドの「天然に存在するバリアント」なる用語は、規定分類群、例えば、マウス、サルおよびヒトなどの哺乳動物に天然に存在するSNCAポリペプチド配列またはSNCA核酸配列(例えば、転写物)のバリアントをいう。一般に、SNCAポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」をいうとき、本用語はまた染色体転座または複製により染色体位置17q21におよびそれ由来のmRNAなどのRNAに見られる、SNCAコードゲノムDNAのあらゆるアレルバリアントも包含し得る。「天然に存在するバリアント」は、SNCA mRNAの選択的スプライシングに由来するバリアントも含み得る。特定のポリペプチド配列をいうとき、例えば、本用語はまた天然に存在するタンパク質も包含し、それは、従って、例えば、シグナルペプチド開裂、タンパク質分解的開裂、グリコシル化などにより共翻訳または翻訳後修飾により処理され得る。
ここで使用する用語「相補物」は、対照配列と相補的である配列を示す。相補性は、互いに逆平行で整列されたとき、鏡を見るのにおよび物の逆側を見るのによく似て、配列の各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるように、2つのDNAまたはRNA配列間で共有される性質であるDNA複製および転写の塩基原則であることは周知である。それ故に、例えば、5'「ATGC」3'配列の相補物は、3'「TACG」5'または5'「GCAT」3'として記載し得る。ここで使用する用語「逆相補物」、「逆相補的」および「逆相補性」は、ここでは用語「相補物」、「相補的」および「相補性」と相互交換可能に使用する。それ故に、配列5' attcctttacaccacac 3'(配列番号4)は、5' gtgtggtgtaaaggaat 3'と相補的であり得る。
ここで使用する配列番号(すなわち、配列番号4)への言及は特定の核酸塩基配列を含むが、デザインまたは完全化学構造の何れかを含まない。本明細書で特定のASO番号(すなわち、ASO-005459)に言及するとき、対象は配列、特定のASO設計および化学構造を含む。
「有効性」は、通常、特に断らない限り、μM、nMまたはpMのIC50またはEC50値として表される。有効性はパーセント阻害の観点でも表し得る。IC50は治療分子の中央阻害濃度である。EC50は、媒体または対照(例えば、食塩水)に対する治療分子の中央有効濃度である。機能的アッセイにおいて、IC50は、生物学的応答、例えば、mRNA転写またはタンパク質発現を、該治療分子により達成される生物学的応答の50%減ずる治療分子の濃度である。機能的アッセイにおいて、EC50は、生物学的応答、例えば、mRNA転写またはタンパク質発現の50%を生じる治療分子の濃度である。IC50またはEC50は、当分野で知られる何れかの手段により計算され得る。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、それに対する診断、予後診断または治療が望まれるあらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどを含むヒト、家庭用動物、農業用動物、競技用動物および動物園の動物を含む。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性を有効とし、該組成物が投与される対象に許容されない毒性であるさらなる成分を含まないような形態の調製物をいう。このような組成物は無菌であり得る。
ここに開示するASOの「有効量」は、具体的に述べる目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記載する目的に関連して、経験的におよび日常的方法で決定され得る。
「処置」または「処置する」または「処置するためまたは「軽減する」または「軽減するため」などの用語は、(1)診断された病的状態または障害を治癒、減速または症状軽減するおよび/または進行停止させる治療手段および(2)標的病的状態または障害の発症を阻止および/または遅延させる予防的または防止的手段の両者をいう。それ故に、処置を含むものは、既に障害を有するもの;障害を有する素因があるもの;および障害を阻止すべきものを含む。ある実施態様において、対象は、患者が、疾患または障害と関連する症状の、例えば、完全な部分的なまたは一過性の軽減または消失を示すならば、ここに提供される方法により、本明細書の他の箇所に記載される疾患または状態が十分に「処置される」。
II. ASO-005459
本発明のASO(すなわち、ASO-005459)は17ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み、これは、SNCA転写物の領域(すなわち、イントロン1とエクソン2の間の接合部)の相補物、すなわち、配列番号1のヌクレオチド7,604~7,620に対応する。本発明のASOは、LDLDDDDDDDDDDLLLL(すなわち、AtTcctttacaccACAC)のASO設計で配列番号4に示すヌクレオチド配列(すなわち、attcctttacaccacac)を有し、ここで、Lはロックド核酸ヌクレオシド(すなわち、LNA、例えば、ベータ-D-オキシ-LNA)を示し、Dはデオキシリボ核酸(DNA)を示す。従って、ASO-005459の5'末端から1番目、3番目および14~17番目のヌクレオチドはベータ-D-オキシ-LNAであり、他のヌクレオチドの各々はDNAである。ここに開示するASOはまた次の化学構造も有する:OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC(ここで、「s」はホスホロチオエート結合を示す)。ASO-005459の構造式は図1Bに示し、ここで、M+は薬学的に許容されるカウンターイオンである。ここで使用する用語「薬学的に許容されるカウンターイオン」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではなく、それにより、薬学的に許容される塩形態の産生を可能とする、電気的中性の維持のためのイオン種を伴うイオンをいう。従って、ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはH+、Na+、K+、NH4 +、Li+または1+の荷電を有する任意の他のカチオンであり得る。ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはH+、Na+、NH4 +およびこれらの組み合わせである。
本発明のASO(すなわち、ASO-005459)は17ヌクレオチド長の連続的ヌクレオチド配列を含み、これは、SNCA転写物の領域(すなわち、イントロン1とエクソン2の間の接合部)の相補物、すなわち、配列番号1のヌクレオチド7,604~7,620に対応する。本発明のASOは、LDLDDDDDDDDDDLLLL(すなわち、AtTcctttacaccACAC)のASO設計で配列番号4に示すヌクレオチド配列(すなわち、attcctttacaccacac)を有し、ここで、Lはロックド核酸ヌクレオシド(すなわち、LNA、例えば、ベータ-D-オキシ-LNA)を示し、Dはデオキシリボ核酸(DNA)を示す。従って、ASO-005459の5'末端から1番目、3番目および14~17番目のヌクレオチドはベータ-D-オキシ-LNAであり、他のヌクレオチドの各々はDNAである。ここに開示するASOはまた次の化学構造も有する:OxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMC(ここで、「s」はホスホロチオエート結合を示す)。ASO-005459の構造式は図1Bに示し、ここで、M+は薬学的に許容されるカウンターイオンである。ここで使用する用語「薬学的に許容されるカウンターイオン」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではなく、それにより、薬学的に許容される塩形態の産生を可能とする、電気的中性の維持のためのイオン種を伴うイオンをいう。従って、ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはH+、Na+、K+、NH4 +、Li+または1+の荷電を有する任意の他のカチオンであり得る。ある実施態様において、薬学的に許容されるカウンターイオンはH+、Na+、NH4 +およびこれらの組み合わせである。
ここで使用する用語「薬学的に許容される塩」は、ASO-005459がその塩の形成により修飾(例えば、ここに開示するカチオンの付加)されている、ASO-005459の誘導体をいう。このような塩は、望ましくない毒物学的効果を付与することなく、ASOの所望の生物学的活性を保持する。本発明のASOは任意の塩形態であり得る。ある実施態様において、本発明のASOはナトリウム塩の形態である。他の実施態様において、ASOはカリウム塩の形態である。
ASO-005459はSNCA mRNAのイントロン1/エクソン2接合部に結合し、SNCA mRNAの翻訳を阻止し得る。ある実施態様において、糖修飾のため、本発明のASOは、対照(例えば、このような糖修飾がないASO)と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも100%増強された標的RNA配列への結合親和性を有する。
ここに記載するASOのモノマーは、結合基を介して一緒に結合される。好適には、各モノマーは結合基により3'隣接モノマーに結合される。
本発明の状況で、ASOの末端の5'モノマーは、5'末端基を含んでも含まなくてもよいが、5'結合基を含まないことは当業者には理解される。
用語「結合基」および「ヌクレオチド間結合」は、2つのヌクレオチドを一緒に共有結合できる基を意味することを意図する。例は、ホスフェート基およびホスホロチオエート基を含む。
ヌクレオチド間結合の例はホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせを含む。引用により全体として本明細書に包含させるWO2007/031091も参照。
本発明のASOのある態様において、ヌクレオチドはホスホロチオエート基の手段により互いに結合させる。
ホスホジエステル結合、例えば1個または2個の結合の、そうではないホスホロチオエートASOへの、特にヌクレオチド間または隣への挿入は、ASOのバイオアベイラビリティおよび/または生体内分布を修飾できることが認識されている - 引用により本明細書に包含させるWO2008/113832参照。
上記の実施態様などの、適切であり、具体的に示されていないある実施態様において、全ての残りの結合基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートまたはそれらの混合物である。
ある実施態様において、ヌクレオチド間結合基全てホスホロチオエートである。
「LNAヌクレオシド」は、該ヌクレオシドのリボース糖環のC2'およびC4'に架橋結合を含む2'修飾ヌクレオシドであり(「2'-4'架橋」とも称する)、これはリボース環の配座を制限またはロックする。これらヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも呼ばれる。リボースの配座のロッキングは、LNAが相補的RNAまたはDNA分子についてオリゴヌクレオチドに導入されたとき、ハイブリダイゼーションの親和性増強(二本鎖安定化)に関連する。オリゴヌクレオチド/相補物二本鎖の融点の測定により日常的に決定され得る。
非限定的、例示的LNAヌクレオシドはWO99/014226、WO00/66604、WO98/039352、WO2004/046160、WO00/047599、WO2007/134181、WO2010/077578、WO2010/036698、WO2007/090071、WO2009/006478、WO2011/156202、WO2008/154401、WO2009/067647、WO2008/150729、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, and Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238およびWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に開示される。
特定の実施態様において、本発明において有用なLNAはベータ-D-オキシ-LNAである。
II.A. コンジュゲート
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分に共有結合したASO-005459をいう。
ここで使用する用語コンジュゲートは、非ヌクレオチド部分に共有結合したASO-005459をいう。
ASO-005459の1以上の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、活性、細胞分布、細胞取り込みまたはASO安定性に影響することにより、ASOの薬理学を改善し得る。ある実施態様において、コンジュゲート部分は、ASOの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および/または細胞取り込み改善により、ASOの薬物動態性質を修飾または増強する。特にコンジュゲートは、ASOを特定の臓器、組織または細胞型に標的化させ、それにより、その臓器、組織または細胞型でのASOの有効性を増強させ得る。同時に、コンジュゲートは、ASOの非標的細胞型、組織または臓器での活性、例えば、オフターゲット活性または非標的細胞型、組織または臓器での活性の減少に作用し得る。WO93/07883およびWO2013/033230は適当なコンジュゲート部分を提供する。さらに適当なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)に結合できるものである。特に三価N-アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ASGPrへの結合に適する、例えばWO2014/076196、WO2014/207232およびWO2014/179620参照。
ASOコンジュゲートおよびおよびその合成は、Manoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 and Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的レビューにも報告されている。
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬物物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば、細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えば、カプシド)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
II.B. 活性化ASO
ここで使用する用語「活性化ASO」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ASOの1以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にする少なくとも1つの官能化部分に共有結合(すなわち、官能化)されている本発明のASOをいう。一般に、官能化部分は、ASOを、例えば、アデニン塩基の3'-ヒドロキシル基または環外NH2基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を結合できる末端基を介してASOに共有結合できる化学基を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、NH2基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のような任意の適当な保護基で保護される。
ここで使用する用語「活性化ASO」は、ここに記載するコンジュゲートを形成するように、ASOの1以上のコンジュゲート部分、すなわち、それ自体核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にする少なくとも1つの官能化部分に共有結合(すなわち、官能化)されている本発明のASOをいう。一般に、官能化部分は、ASOを、例えば、アデニン塩基の3'-ヒドロキシル基または環外NH2基、親水性であり得るスペーサーおよびコンジュゲート部分(例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を結合できる末端基を介してASOに共有結合できる化学基を含む。ある実施態様において、この末端基は保護されていない、例えば、NH2基である。他の実施態様において、末端基は、例えば、"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のような任意の適当な保護基で保護される。
ある実施態様において、ASO-005459は、ASOの5'末端のコンジュゲート部分への共有結合を可能とするため、5'末端で官能化される。他の実施態様において、本発明のASOは3'末端で官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のASOは主鎖に沿ってまたはヘテロ環式塩基部分を官能化され得る。さらに他の実施態様において、本発明のASOは、5'末端、3'末端、主鎖および塩基から独立して選択される1超える位置で官能化され得る。
ある実施態様において、本開示の活性化ASOは、官能化部分に共有結合した1以上のモノマーの合成中に取り込まれることにより合成される。他の実施態様において、本開示の活性化ASOは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、ASOは合成完了後官能化される。
III. 医薬組成物および投与経路
ASO-005459は医薬製剤および組成物で使用され得る。好適には、このような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。
ASO-005459は医薬製剤および組成物で使用され得る。好適には、このような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。
ASO-005459は、処置患者に重篤な副作用を引き起こすことなく、患者に治療有効量を送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤などのような単位製剤に包含され得る。しかしながら、ある形態の治療においては、重篤な副作用は、治療処置の前向きな結果を確実にするという場合には許容され得る。
製剤された薬物は薬学的に許容される結合剤およびアジュバントを含み得る。カプセル、錠剤または丸剤は、例えば、次の化合物を含み得る:結合剤として微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン;賦形剤としてデンプンまたはラクトース;滑沢剤としてステアレート;種々の甘味または風味剤。カプセル剤について、投与量単位は脂肪油などの液体担体を含み得る。同様に、糖コーティングまたは腸溶性コーティングも投与量単位の一部であり得る。オリゴヌクレオチド製剤はまたミセルエマルジョンを形成する活性医薬成分と脂質のエマルジョンでもあり得る。
本発明の医薬組成物は、局所または全身処置いずれが望まれるかおよび処置する領域により、多くの方法で投与され得る。投与は、(a)経口、(b)例えば、ネブライザーを含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送法による、肺、気管内、鼻腔内;(c)上皮、経皮、眼および膣および直腸送達を含む粘膜への局所;または(d)静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴;または頭蓋内、例えば、髄腔内、脳室内または心室内投与を含む非経腸であり得る。ある実施態様において、ASO-005459は、IV、IP、経口、局所的でまたはボーラス注射として投与されまたは標的臓器に直接投与される。ある実施態様において、ASO-005459は髄腔内または脳室内にボーラス注射として投与される。
局所投与用医薬組成物および製剤は経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、スプレー剤、坐薬剤、液剤および散剤を含み得る。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるか望ましいことがある。局所製剤の例は、ASO-005459が脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものを含む。経口投与用組成物および製剤は、散剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水または非水性媒体の懸濁液剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤を含むが、これらに限定されない。非経腸、髄腔内、脳室内または心室内投与用組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤および、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体または添加物などであるが、これらに限定されない他の適当な添加物も含み得る、無菌水溶液を含み得る。
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない多様な成分から製造され得る。薬物の標的組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子およびマイクロスフェアを含むが、これらに限定されない担体介在送達により増強され得る(Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27)。
本発明の医薬製剤は、簡便には単位投与量形態で提示され得て、製薬業界で周知の慣用の技術により製造され得る。このような技術は、活性成分と医薬担体または添加物を結合させる工程を含む。一般に、製剤は均一にかつ緊密に活性成分と液体担体または微粉砕固体担体または両者を混合し、次いで、必要であれば、製品を成形することにより製造される。
非経腸、皮下、皮内または局所投与のために、製剤は無菌希釈剤、緩衝液、張性制御剤および抗細菌剤を含み得る。活性ASOは、制御された放出特性を備えたインプラントまたはマイクロカプセルを含む、崩壊または体からの即時の排泄から保護する担体を用いて製造され得る。静脈内投与のために、担体は生理学的食塩水またはリン酸緩衝化食塩水であり得る。2007年3月22日公開の国際公開WO2007/031091(A2)は適当な薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントをさらに提供する - これは引用により本明細書に包含させる。
IV. 診断
本開示は、さらに、SNCA関連疾患、例えば、シヌクレイン病の診断に有用な診断方法を提供する。シヌクレイン病の非限定的例は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。
本開示は、さらに、SNCA関連疾患、例えば、シヌクレイン病の診断に有用な診断方法を提供する。シヌクレイン病の非限定的例は、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。
ASO-005459を、個体からの組織または体液のSNCA転写物発現測定に使用し、正常組織または体液の標準SNCA転写物発現レベルと測定発現レベルを比較でき、ここで、標準と比較した発現レベル増加は、ASO-005459で処置可能な障害の指標である。
ASO-005459を使用して、当業者に知られる何れかの方法を使用して、生物学的サンプルのSNCA転写物レベルをアッセイし得る。(Touboul et. al., Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56; Verjout et. al., Mutat. Res. (2000) 640: 127-38); Stowe et. al., J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91)。
「生物学的サンプル」は、個体、細胞株、組織培養またはSNCA転写物を発現する可能性のある他の細胞源から得たあらゆる生物学的サンプルを意図する。哺乳動物から組織および体液を得る方法は、当分野で周知である。
V. ASOを含むキット
本開示は、さらに、ここに記載するASO-005459を含み、ここに記載する方法の実施に使用できる、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、1以上の容器に少なくともASO-005459を含む。ある実施態様において、キットは、全て対照物、アッセイ実施の指示および結果の解析および提示に必要な何れかの必要なソフトウエアを含む、検出アッセイに必要なおよび/または実施に十分な全ての要素を含む。当業者は、ASO-005459が当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込み得ることを認識する。
本開示は、さらに、ここに記載するASO-005459を含み、ここに記載する方法の実施に使用できる、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、1以上の容器に少なくともASO-005459を含む。ある実施態様において、キットは、全て対照物、アッセイ実施の指示および結果の解析および提示に必要な何れかの必要なソフトウエアを含む、検出アッセイに必要なおよび/または実施に十分な全ての要素を含む。当業者は、ASO-005459が当分野で周知の確立されたキット形式の一つに容易に取り込み得ることを認識する。
VI. 使用方法
ASO-005459は治療および予防に利用され得る。SNCAは、シナプス伝達制御に役割を有すると考えられる場所であるシナプス前末端で、神経細胞に優勢に発現される140アミノ酸タンパク質である。天然に折り畳まれていないモノマーおよび安定なα-ヘリックスの四量体の両者で天然に存在することが推定されており、幾つかの翻訳後修飾を受けていることが示されている。広く研究されている修飾の一つは、SNCAのアミノ酸セリン129(S129)のリン酸化である。通常、SNCAはS129で小さいパーセンテージでしか構成的にリン酸化(pS129)されないが、病的細胞内封入で見られる大多数がpS129 SNCAである。これら病的封入体は、誤って折り畳まれたSNCAタンパク質の凝集された、不溶性蓄積物からなり、集合的にシヌクレイン病(またはα-シヌクレイン病)として知られる神経変性疾患群の特徴である。
ASO-005459は治療および予防に利用され得る。SNCAは、シナプス伝達制御に役割を有すると考えられる場所であるシナプス前末端で、神経細胞に優勢に発現される140アミノ酸タンパク質である。天然に折り畳まれていないモノマーおよび安定なα-ヘリックスの四量体の両者で天然に存在することが推定されており、幾つかの翻訳後修飾を受けていることが示されている。広く研究されている修飾の一つは、SNCAのアミノ酸セリン129(S129)のリン酸化である。通常、SNCAはS129で小さいパーセンテージでしか構成的にリン酸化(pS129)されないが、病的細胞内封入で見られる大多数がpS129 SNCAである。これら病的封入体は、誤って折り畳まれたSNCAタンパク質の凝集された、不溶性蓄積物からなり、集合的にシヌクレイン病(またはα-シヌクレイン病)として知られる神経変性疾患群の特徴である。
シヌクレイン病で、SNCAは神経細胞にレビー小体として知られる病的凝集体を形成し、これは、パーキンソン病(PD)、パーキンソン病認知症(PDD)およびレビー小体型認知症(DLB)両者の特徴である。ASO-005459は、それ故に、SNCA病的凝集体の数を減らすまたはSNCA病的凝集体の形成を阻止することができる。さらに、グリア細胞質内封入体(GCI)と称される異常SNCA富病巣がオリゴデンドロサイトに見られ、多系統萎縮症(MSA)として知られる、急速に進行する、致死的シヌクレイン病の特徴を表す。ある実施態様において、ASO-005459はGCI数を減らすまたはGCI形成を阻止するオリゴデンドロサイトでの検出不可能なまたは低レベルのSNCA mRNA発現の報告は、SNCAのある病的形態が、高度に発現される神経細胞から、オリゴデンドロサイトに伝播されることを示唆する。ある実施態様において、ASO-005459は、SNCA、例えば、病的形態のSNCAの神経細胞からの伝播を減少または阻止する。
ASO-005459を使用して、細胞および実験動物での、例えば、SNCAタンパク質の合成を特異的に阻害(一般にmRNAの分解または阻害、それによるタンパク質形成阻止による)についての研究ができ、それにより、標的の機能的分析またはその治療介入の標的としての有用性の評価が促進される。さらに提供されるのは、インビトロまたはインビボで、細胞または組織と、有効量の本開示のASO-005459、コンジュゲートまたは組成物を接触させることを含む、細胞または組織におけるSNCA mRNAおよび/またはSNCAタンパク質の発現を下方制御する方法である。
治療として、SNCA転写物および/またはSNCAタンパク質発現調節により処置され得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、ここに開示によりASO-005459の投与により処置するさらに提供されるのは、治療的または予防有効量の本発明のASO-005459または組成物を投与することによる、SNCA転写物および/またはSNCAタンパク質の発現と関連する疾患または状態を有することが疑われるまたはその素因のある動物を処置するなどの哺乳動物を処置する方法である。本発明によるASO、コンジュゲートまたは医薬組成物は、一般に有効量で投与される。ある実施態様において、本発明のASOまたはコンジュゲートは治療に使用される。
本発明は、さらに、パーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患などの、ここに記載する疾患の1以上の処置に使用するための、ASO-005459を提供する。
本発明は、さらに、有効量のASO、コンジュゲートまたはその医薬組成物をそれを必要とする動物(例えば処置が必要な患者)に投与することを含む、α-シヌクレイン病を処置する方法を提供する。
ある実施態様において、疾患、障害または状態は、SNCA遺伝子転写物および/またはSNCAタンパク質の過発現と関連する。
本発明はまた細胞または組織におけるSNCA遺伝子転写物および/またはSNCAタンパク質の発現を阻害(例えば、減少)する方法も提供し、方法は、インビトロまたはインビボで、細胞または組織とここに開示の有効量のASO、そのコンジュゲートまたは医薬組成物を接触させて、SNCA遺伝子転写物の発現の低下に影響を与え、それによりSNCAタンパク質を減少させることを含む。
ある実施態様において、ASO-005459を、脳の1以上の区画、例えば、海馬、脳幹、線条体または何れかのこれらの組み合わせにおけるSNCA mRNAの発現の減少に使用する。他の実施態様において、ASO-005459は、3日目、5日目、7日目、10日目、14日目、15日目、20日目、21日目または25日目に、媒体(無ASO)の投与または暴露後のSNCA mRNA発現と比較して、例えば、脳幹および/または線条体におけるSNCA mRNAの発現を70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満または5%未満に減少させる。ある実施態様において、SNCA mRNAの発現は、28日目、30日目、32日目、35日目、40日目、42日目、45日目、49日目、50日目、56日目、60日目、63日目、70日目または75日目まで、媒体(無ASO)の投与または暴露後のSNCA mRNA発現と比較して、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下または5%以下に維持される。
他の実施態様において、ASO-005459は、髄質、尾状核被殻、橋、小脳、腰部脊髄、前頭前皮質および/または何れかのこれらの組み合わせのSNCA mRNAおよび/またはSNCAタンパク質発現を減少させる。
本発明はまた、医薬の製造のための、記載する本発明のASO-005459またはコンジュゲートも提供する。本発明はまた、ここに記載する障害の処置に使用するためのまたはここに記載する障害の処置の方法のための、ASO-005459またはそのコンジュゲートを含む組成物も提供する。本発明はまた治療に使用するためのASO-005459またはコンジュゲートを提供する。本発明は、さらに、シヌクレイン病の処置に使用するための、ASO-005459またはコンジュゲートを提供する。
本発明は、さらに、細胞におけるSNCAタンパク質の阻害を及ぼすように、細胞に本発明のASO-005459またはコンジュゲートを投与することを含む、SNCA発現細胞におけるSNCAタンパク質を阻害する方法を提供する。
本発明は、本発明によるASO-005459またはコンジュゲートを投与することを含む、処置を必要とする対象における神経過興奮を減少、軽減、予防または処置する方法を含む。
本発明はまた、処置を必要とする患者に、ここに記載する本発明のASO-005459またはコンジュゲートおよび/または本発明の医薬組成物を投与することを含む、ここに記載する障害を処置する方法も提供する。
本発明のASO-005459および他の組成物を、SNCAタンパク質の過発現または変異バージョンの発現と関連する状態の処理に使用し得る。
本発明は、α-シヌクレイン病の処置などのための医薬として使用するための、本発明のASO-005459またはコンジュゲートも提供する。ある実施態様において、α-シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される疾患である。
本発明は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、ASO-005459の使用をさらに提供する。ある実施態様において、ASO-005459またはそのコンジュゲートを、α-シヌクレイン病、発作性疾患またはこれらの組み合わせの処置用医薬の製造に使用する。
一般的に述べて、本発明の一態様は、哺乳動物に治療有効量のここに記載するASOを投与することを含む、SNCAの異常レベルと関連する状態(すなわち、α-シヌクレイン病)を有するかまたは疑われる哺乳動物を処置する方法に関する。
ここで述べる疾患または障害は、ある実施態様において、SNCA遺伝子またはタンパク質産物がSNCAタンパク質と関連するまたは相互作用する遺伝子の変異と関連し得る。それ故に、ある実施態様において、標的mRNAは、SNCA配列の変異形態である。
本発明の興味深い態様は、ここに記載する疾患、障害または状態の処置用医薬の製造における、ここに定義するASO-005459またはここに定義するコンジュゲートの使用に関する。
本発明の方法は、異常レベルのSNCAタンパク質が原因の疾患の処置または予防に用いられ得る。ある実施態様において、異常レベルのSNCAタンパク質が原因の疾患はα-シヌクレイン病である。ある実施態様において、α-シヌクレイン病はパーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含む。
換言すると、ある実施態様において、本発明は、さらに、本発明のASO-005459またはコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、異常レベルのSNCAタンパク質を処置する方法に関する。
本発明は、医薬として使用するためのここに定義するASO-005459、組成物またはコンジュゲートにも関する。
本発明は、異常レベルのSNCAタンパク質またはSNCAタンパク質の変異体形態(例えば、ここに記載する疾患の一つと関連するもののようなアレルバリアント)の発現の処置用医薬の製造のための、ここに定義する化合物、組成物またはコンジュゲートの使用にさらに関する。
処置を必要とする患者は、該疾患または障害を有するか有する可能性が高い患者である。
本発明の実施には、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えDNAおよび免疫学の慣用の技術が用いられる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)参照。
上に引用する全ての参考文献ならびに本明細書に引用する全ての引用文献は、引用によりその全体として本明細書に包含させる。
次の実施例は、説明のために提供し、限定のためではない。
実施例1:ASO-005459の構築
ここに記載するASO(すなわち、ASO-005459)を、SNCA pre-mRNAのイントロン1とエクソン2の間の接合部(すなわち、配列番号1のヌクレオチド7,604~7,620)を標的とするよう設計した。ASO-005459をギャップマー(例えば、交互ギャップマー)として設計し、5'末端および3'末端にロックド核酸 - LNA(大文字)、ベータ-デオキシLNAをおよびホスホロチオエート主鎖を含む。しかし、主鎖は他のタイプの主鎖でよい(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの組み合わせ)。
ここに記載するASO(すなわち、ASO-005459)を、SNCA pre-mRNAのイントロン1とエクソン2の間の接合部(すなわち、配列番号1のヌクレオチド7,604~7,620)を標的とするよう設計した。ASO-005459をギャップマー(例えば、交互ギャップマー)として設計し、5'末端および3'末端にロックド核酸 - LNA(大文字)、ベータ-デオキシLNAをおよびホスホロチオエート主鎖を含む。しかし、主鎖は他のタイプの主鎖でよい(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの組み合わせ)。
本発明のASOを、当分野で周知の方法を使用して合成した。このようなASOの製造法の例は、Barciszewski et al., Chapter 10 - " Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)に記載され、その内容全体を引用により明示的に本明細書に包含させる。
実施例2. 初代神経細胞におけるSNCAタンパク質の減少を測定する高含量アッセイ
ASO-005459を、初代マウス神経細胞のSNCAタンパク質発現を減少させるその能力について試験した。初代神経細胞培養を、A53T変異を有するヒトSNCA遺伝子全体をマウスSNCAノックアウトバックグラウンドで担持するPAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-(「PAC-A53T」)マウスの前脳から確立した。Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)参照。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。初代神経細胞を、製造業者のプロトコールに従うパパイン消化により産生した(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。単離神経細胞を洗浄し、B27(Gibco)、1.25μM Glutamax(Gibco)、100単位/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アムホテリシンB添加神経基底培地(NBM、Invitrogen)に再懸濁した。
ASO-005459を、初代マウス神経細胞のSNCAタンパク質発現を減少させるその能力について試験した。初代神経細胞培養を、A53T変異を有するヒトSNCA遺伝子全体をマウスSNCAノックアウトバックグラウンドで担持するPAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-(「PAC-A53T」)マウスの前脳から確立した。Kuo Y et al., Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)参照。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。初代神経細胞を、製造業者のプロトコールに従うパパイン消化により産生した(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。単離神経細胞を洗浄し、B27(Gibco)、1.25μM Glutamax(Gibco)、100単位/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび25μg/ml アムホテリシンB添加神経基底培地(NBM、Invitrogen)に再懸濁した。
細胞を、多ウェルポリD-リシン被覆プレートに5,400細胞/cm2で播種した(例えば384ウェルプレートで25μl NBM中6,000細胞/ウェル)。ASOを水で希釈し、細胞にDIV01(すなわち、播種1日後)に加えた。ASOを培地中最終濃度の2倍で添加し、次いで、細胞に手動で送達した。あるいは、ASO水溶液をLabcyte ECHOアコースティックディスペンサーを使用して分配した。ECHO分配のために、250nlのASO水溶液を培地中の細胞に加え、続いて新鮮NBMの等体積アリコートを加えた。一次スクリーニングのため、ASOを5μM、3.3μM、1μM、200nMまたは40nMの最終濃度で加えた。有効性決定のために、ASOの8~10点滴定を0.75mM現役から調製し、次いで2.7~4000nMまたは4.5~10,000nM範囲の最終濃度で培養細胞に送達した。ASO-000010(TCTgtcttggctTTG、配列番号5)およびASO-000838(AGAaataagtggtAGT、配列番号6)(5μM)を、それぞれチューブリンおよびSNCAの参照対照阻害剤としてプレートに包含させた。細胞をASOと14日間インキュベートし、mRNAの定常状態減少を達成した。
14日間インキュベーション後、細胞を、ウェル中4%ホルムアルデヒド(J.T. Baker)および4%スクロース(Sigma)の最終濃度に固定剤を加えることにより固定した。細胞を15分間固定し、固定剤をウェルから吸引した。次いで、細胞を、0.3%Triton-X 100および3%ウシ血清アルブミン(BSA)または3%正常ヤギ血清含有リン酸緩衝化食塩水(PBS)溶液で20分間透過性処理した。その後、透過処理緩衝液をウェルから吸引し、細胞をPBSで1回洗浄した。次いで、一次抗体を0.1%Triton X-100および3%BSA含有PBSで希釈した。1:1000のウサギ抗SNCA(Abcam)および1:500のニワトリ抗チューブリン(Abcam)の希釈を使用した。細胞を、一次抗体と2時間~一夜インキュベートした。インキュベーション後、一次抗体染色溶液を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄した。3%BSAと共に0.1%Triton X-100を含むPBS中の1:500希釈のヤギ-抗ニワトリAlexa 567抗体、ヤギ抗ウサギ-Alexa 488抗体およびHoechst(10μg/ml)を含む二次染色溶液をウェルに加え、プレートを1時間インキュベートした。その後、二次染色溶液をウェルから吸引し、細胞をPBSで3回洗浄した。細胞洗浄後、60μlのPBSを各ウェルに加えた。次いで、プレートをPBSユニットイメージングまで保存した。
造影のために、プレートを核(Hoechst染色、チャネル1)、チューブリン伸長(Alexa 567、チャネル2)およびSNCA(Alexa 488、チャネル3)を定量するためのSpot Detector bio-application(Cellomics)を使用するThermo-Fisher(Cellomics)CX5イメージャー上で走査した。対象カウント(核)をモニターしたが、データベースに公開しなかった。チューブリンにより被覆された総面積を特性SpotTotalAreaCh2として定量し、SNCAの染色の総強度をSpotTotalIntenCh3として定量した。チューブリン測定は毒性のモニターのために含めた。SNCAタンパク質減少を決定するために、SNCA強度対チューブリン染色面積比を計算し、結果を、合計として媒体処理ウェルおよびチューブリンまたはSNCAそれぞれの最大阻害ウェルとしてASO-000010またはASO-000838ウェルを使用して%阻害中央として正規化した。
実施例3:ヒト神経細胞でmRNA減少を測定するためのQUANTIGENE(登録商標)分析(96ウェルアッセイ)
ASO-005459がヒトSNCA mRNAを減少させる能力および/または可能性のあるヒトオフターゲットmRNA種を、インビトロでQUANTIGENE(登録商標)分析により測定した。ヒト神経細胞(Cellular Dynamics Inc., "iNeurons")を、製造業者の明細にしたがい解凍し、播種し、培養した。これらのiNeuronsはCellular Dynamic所有の分化および精製プロトコールを使用して多能性幹(iPS)細胞から誘導したヒト神経細胞の高度に純粋な集団である。
ASO-005459がヒトSNCA mRNAを減少させる能力および/または可能性のあるヒトオフターゲットmRNA種を、インビトロでQUANTIGENE(登録商標)分析により測定した。ヒト神経細胞(Cellular Dynamics Inc., "iNeurons")を、製造業者の明細にしたがい解凍し、播種し、培養した。これらのiNeuronsはCellular Dynamic所有の分化および精製プロトコールを使用して多能性幹(iPS)細胞から誘導したヒト神経細胞の高度に純粋な集団である。
溶解:細胞を、ウェルあたり50,000~100,000細胞(試験するオフターゲットの発現による)でポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆96ウェルプレートに播種し、B27、glutamaxおよびペニシリン-ストレプトマイシン添加神経基底培地に維持した。ASOを水で希釈し、DIV01(すなわち、播種1日後)に細胞に加えた。一点測定のために、0.5μMの最終ASO濃度を一般に使用した。IC50決定のために、神経細胞を5μMの最高濃度で1:4の7点濃度応答希釈で処理し、IC50を規定した。次いで、細胞を37℃および5%CO2で6日間インキュベートして、mRNAの定常状態減少を達成した
インキュベーション後、培地を除去し、細胞をDPBSで1回洗浄し、次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーRNA測定を、特別に設計されたRNA捕捉プローブセットを利用する分岐DNA-シグナル増幅法を使用してRNAを定量するQUANTIGENE(登録商標)2.0 Reagent System(AFFYMETRIX(登録商標))を使用して実施した。作業細胞溶解緩衝溶液を、50μl プロテイナーゼKを5mlの予め温めた(37℃)混合物に添加し、dH2Oで1:4最終希釈に希釈することにより製造した。作業溶解緩衝液プレートに加え(試験するオフターゲットの発現により、100~150μl/ウェル)、10回摩砕し、密封し、30分間、55℃でインキュベートした。溶解後、ウェルをさらに10回摩砕し、プレートを-80℃で保存するか直ぐにアッセイした。
アッセイ:使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、SNCA、PROS1またはチューブリン)によって、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積80μl/ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された96ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))の指示に従い、無ヌクレアーゼ水(12.1μl)、溶解混合物(6.6μl)、遮断剤(1μl)および特定2.0プローブセット(0.3μl)(ヒトSNCA catalogue #SA-50528、ヒトPROS1 catalogue #SA-10542またはヒトベータ3チューブリンcatalogue #SA-15628)を合わせることにより産生した。次に、20μl 作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで80μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために80μl溶解混合物)に加えた。プレートを240gで20秒間遠心分離し、次いで16~20時間、55℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的RNA捕捉)。
標的RNAのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で3回(300μl/ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を加え、55℃で1時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、3回吸引した。次いで、2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を加え、1時間、55℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を加え、1時間、50℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び240gで20秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(100μl/ウェル)をプレートに加えた。プレートを5分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーでルミノメーターモードで15分以内に造影した。
データ決定:目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナルを各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングチューブリンRNAのバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、対照処理サンプルライセートに対して計算した。ASOで処理した細胞のQUANTIGENE(登録商標)アッセイの結果を、例えば、図3に示す。
実施例4:Ramos細胞におけるmRNA減少を測定するためのQUANTIGENE(登録商標)分析(96ウェルアッセイ)
ヒトオフターゲットIKZF3(IKAROSファミリー亜鉛フィンガー3)mRNA減少の可能性を測定するために、Ramos細胞(ヒトリンパ球性細胞株)を使用した。Ramos細胞はSNCAを発現しないため、Ramos細胞で発現されるRB1(RB転写コリプレッサー1)を、ASO介在ノックダウンIKZF3 mRNA発現評価のための陽性対照として使用した。ヒトRB1 mRNA発現への結合およびノックダウンのために2つのASOを合成した。ベータ-2ミクログロブリン(β2M)をハウスキーピング遺伝子対照として使用した。Ramos細胞を、FBS、グルタミンおよびPen/Strep添加RPMI培地の懸濁液で増殖させた。
ヒトオフターゲットIKZF3(IKAROSファミリー亜鉛フィンガー3)mRNA減少の可能性を測定するために、Ramos細胞(ヒトリンパ球性細胞株)を使用した。Ramos細胞はSNCAを発現しないため、Ramos細胞で発現されるRB1(RB転写コリプレッサー1)を、ASO介在ノックダウンIKZF3 mRNA発現評価のための陽性対照として使用した。ヒトRB1 mRNA発現への結合およびノックダウンのために2つのASOを合成した。ベータ-2ミクログロブリン(β2M)をハウスキーピング遺伝子対照として使用した。Ramos細胞を、FBS、グルタミンおよびPen/Strep添加RPMI培地の懸濁液で増殖させた。
溶解:細胞を、ウェル当たり20,000細胞でポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆96ウェルプレートに播種し、B27、glutamaxおよびペニシリン-ストレプトマイシン含有神経基底培地に維持した。ASOを水で希釈し、播種1日後(DIV01)、1μMの最終濃度で細胞に加えた。ASO処理後、細胞を37℃で4日間インキュベートして、mRNAの定常状態減少を達成した。インキュベーション後、培地を除去し、細胞を次のとおり溶解した。ライセートメッセンジャーRNA測定を、特別に設計されたRNA捕捉プローブセットを利用する分岐DNA-シグナル増幅法を使用してRNAを定量するQUANTIGENE(登録商標)2.0 Reagent System(AFFYMETRIX(登録商標))を使用して実施した。溶解混合物(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))を37℃で30分間インキュベーターで予め温めた。懸濁液に細胞を溶解するために、100μlの3X溶解緩衝液(10μl/ml プロテイナーゼK含有)を、200μlの懸濁液中の細胞に加えた。次いで、細胞を10回摩砕して溶解させ、プレートを密封し、30分間、55℃でインキュベートした。その後、ライセートを-80℃で保存するか直ぐにアッセイした。
アッセイ:使用する特定の捕捉プローブ(すなわち、IKZF3、RB1およびβ2M)により、ライセートを溶解混合物で希釈した(または希釈しなかった)。次いで、ライセートを、総体積80μl/ウェルで捕捉プレート(捕捉プローブで被覆された96ウェルポリスチレンプレート)に加えた。作業プローブセット試薬を、製造業者(QUANTIGENE(登録商標)2.0 AFFYMETRIX(登録商標))の指示に従い、無ヌクレアーゼ水12.1μl、溶解混合物6.6μl、遮断剤1μl、特定2.0プローブセット0.3μl(ヒトIKZF3 catalogue #SA-17027、ヒトRB1 catalogue #SA-10550またはヒトベータ-2ミクログロブリンcatalogue #SA-10012)を合わせることにより産生した。次いで20μl 作業プローブセット試薬を、捕捉プレートで80μlライセート希釈物(またはバックグラウンドサンプルのために80μl溶解混合物)に加えた。次いでプレートを16~20時間、55℃でインキュベートしてハイブリダイズさせた(標的RNA捕捉)。標的RNAのシグナル増幅および検出を、プレートを緩衝液で3回(300μl/ウェル)洗浄し、あらゆる非結合物質を除去することにより開始した。次に、2.0 Pre-Amplifierハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を加え、55℃で1時間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄緩衝液を加え、3回吸引した。2.0 Amplifierハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を記載のとおり加え、1時間、55℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。次に2.0 Label Probeハイブリダイゼーション試薬(100μl/ウェル)を加え、1時間、50℃でインキュベートし、上記のとおり洗浄工程を繰り返した。プレートを再び240gで20秒間遠心分離して、何らかの過剰の洗浄緩衝液を除去し、次いで、2.0 Substrate(100μl/ウェル)をプレートに加えた。プレートを5分間、室温でインキュベートし、次いで、プレートをPerkinElmer Envisionマルチラベルリーダーでルミノメーターモードで15分以内に造影した。
データ決定:目的の遺伝子について、平均アッセイバックグラウンドシグナル(すなわち、無ライセート、1X溶解緩衝液のみ)を各技術的反復の平均シグナルから減じた。次いで、目的の遺伝子のバックグラウンド減算、平均シグナルを、ハウスキーピングmRNA(Ramos細胞ではベータ-2-ミクログロブリンであった)のバックグラウンド減算、平均シグナルに対して正規化した。処理サンプルのパーセント阻害を、未処理サンプルライセートの平均に対して計算した。ASO-005459で処理した細胞のQUANTIGENE(登録商標)アッセイの結果を、表4に示す。
実施例5:SK-N-BE(2)細胞でのSNCA mRNAの減少を測定するためのqPCRアッセイ
SNCAを標的とするASO-005459を、ATCCから得たヒトSK-N-BE(2)神経芽腫細胞(CRL-2271)におけるSNCA mRNA発現を減少させる能力について試験した。
SNCAを標的とするASO-005459を、ATCCから得たヒトSK-N-BE(2)神経芽腫細胞(CRL-2271)におけるSNCA mRNA発現を減少させる能力について試験した。
SK-N-BE(2)細胞を、細胞培養培地(10%ウシ胎児血清[Sigma, cat.no F7524]、1×GlutamaxTM[Sigma, cat.no 3050-038]、1×MEM非必須アミノ酸溶液[Sigma, cat.no M7145]および0.025mg/ml ゲンタマイシン[Sigma, cat.no G1397]添加MEM[Sigma, cat.no M2279])で増殖させた。細胞を、5日毎にリン酸緩衝化食塩水(PBS)[Sigma cat.no 14190-094]で洗浄し、続いて0.25%トリプシン-EDTA溶液(Sigma、T3924)を加え、37℃で2~3分間インキュベートし、摩砕してトリプシン処理し、その後細胞播種した。細胞を、最大15継代培養に維持した。
実験での使用のため、12,500細胞/ウェルを100μL増殖培地中96ウェルプレート(Nunc cat.no 167008)に播種した。オリゴヌクレオチドを750μM原液から調製した。PBSに溶解したASOを、細胞を最終濃度25μMの一点試験のために播種した約24時間後に加えた。細胞を、培地を一切交換することなく、4日間インキュベートした。有効性決定のために、8濃度のASOを16~50,000nMの最終濃度範囲で調整した。ASO-004316(CcAAAtcttataataACtAC、配列番号7)およびASO-002816(TTCctttacaccACAC、配列番号8)を対照として含めた。
インキュベーション後、細胞を培地を除去し、続いて125μL PURELINK(登録商標)Pro 96溶解緩衝液(Invitrogen 12173.001A)および125μL 70%エタノールを加えることにより回収した。RNAを製造業者の指示に従い精製し、50μL水の最終体積で溶出し、10~20ng/μlのRNA濃度を得た。RNAを、一工程qPCR反応前に水で10倍希釈した。一工程qPCR反応のために、qPCR-mix(QauntaBioのqScript TMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX(登録商標)Low ROX, cat.no 95134-500)を2つのTaqmanプローブと10:1:1比(qPCR mix:プローブ1:プローブ2)で混合し、マスターミックスを作製した。TaqmanプローブはLifeTechnologiesから得た:SNCA:Hs01103383_m1;PROS1:Hs00165590_m1:TBP:4325803;GAPDH4325792。次いで、マスターミックス(6μL)およびRNA(4μL、1~2ng/μL)をqPCRプレート(MICROAMP(登録商標)光学384ウェル、4309849)で混合した。密封後、プレートを1000gで1分間、RTのクイックスピンに付し、ViiaTM 7システム(Applied Biosystems, Thermo)に移し、次のPCR条件を使用した:50℃で15分;95℃で3分;40サイクルの95℃で5秒、続いて1.6℃/秒での温度低下、続いて60℃で45秒。データをQuantStudioTM Real_time PCR Softwareで分析した。
実施例6:ヒトSNCA mRNA減少に対するASO-005459のインビトロ分析
マウス神経細胞におけるASO-005459の有効性
実施例2に記載する方法を使用して、SNCA mRNA減少の下流結果としてSNCAタンパク質発現を減少させる能力について、ASO-005459を試験した。簡潔には、PAC-A53Tマウス由来初代神経細胞をASO-005459または対照ASOで14日間処理した。細胞を固定し、SNCAタンパク質およびチューブリンタンパク質レベルを高含量イメージングで測定した。チューブリンレベルを毒性モニターおよびSNCAタンパク質減少を正規化のために測定した。
マウス神経細胞におけるASO-005459の有効性
実施例2に記載する方法を使用して、SNCA mRNA減少の下流結果としてSNCAタンパク質発現を減少させる能力について、ASO-005459を試験した。簡潔には、PAC-A53Tマウス由来初代神経細胞をASO-005459または対照ASOで14日間処理した。細胞を固定し、SNCAタンパク質およびチューブリンタンパク質レベルを高含量イメージングで測定した。チューブリンレベルを毒性モニターおよびSNCAタンパク質減少を正規化のために測定した。
下表1に示すとおり、細胞と4nMのASO-005459のインキュベーションは、SNCAタンパク質発現を21%減少させた。40nMおよび5μMのASO-005459で、SNCAタンパク質発現はそれぞれ84%および86%減少した。対照的に、ASO-005459はチューブリンタンパク質発現レベルへの効果が最小限であるか全くなかった。
SD=標準偏差
N=試験数
SD=標準偏差
N=試験数
有効性をさらに評価するため、A53T-PAC神経細胞を実施例2Aに記載のとおりASO-005459の10点滴定で処理し、SNCAおよびチューブリンタンパク質に対する効果のIC50を決定した。図2Aおよび2Bおよび表2(下記)に示すとおり、α-Syn/チューブリン比の濃度依存性減少が観察され、平均IC50は7.4nMであった。この観察は、表1(上記)の一点活性データと一致した。さらに、ASO-005459のTubレベルに対する効果は無視できるであった。まとめて、これらの結果はASO-005459が全体的細胞生存能への効果は最小で、SNCAタンパク質レベルを強力に減少させることを示す。
SD=標準偏差
N=試験数
SD=標準偏差
N=試験数
SK-N-BE(2)細胞におけるASO-005459の効果
実施例5に記載の方法を使用して、ASO-005459を、4日間処理後のSK-N-BE(2)におけるSNCA mRNAを減少する能力について、試験した
実施例5に記載の方法を使用して、ASO-005459を、4日間処理後のSK-N-BE(2)におけるSNCA mRNAを減少する能力について、試験した
細胞と25μM ASO-005459のインキュベーションは、SK-N-BE(2)細胞でSNCA mRNAを92%減少させた。
ヒト神経細胞におけるASO-005459の有効性
SNCAに対するASO-005459有効性を、実施例3に記載のとおり、一次ヒト神経細胞を使用して確認した。簡潔には、ヒト神経細胞を、誘導多能性幹(iPS)細胞から導いた。細胞を6日間ASO-005459または対照ASOで処理し、次いで、mRNAレベルをQUANTIGENE(登録商標)アッセイで測定した。ヒト神経細胞がASO-005459のオフターゲットの可能性があるPROS1も発現するため、PROS1 mRNAレベルも、オフターゲット遺伝子に対するASO-005459の効果を評価するために測定した。さらに、チューブリン(TUBB)mRNAを毒性モニターのために測定した。
SNCAに対するASO-005459有効性を、実施例3に記載のとおり、一次ヒト神経細胞を使用して確認した。簡潔には、ヒト神経細胞を、誘導多能性幹(iPS)細胞から導いた。細胞を6日間ASO-005459または対照ASOで処理し、次いで、mRNAレベルをQUANTIGENE(登録商標)アッセイで測定した。ヒト神経細胞がASO-005459のオフターゲットの可能性があるPROS1も発現するため、PROS1 mRNAレベルも、オフターゲット遺伝子に対するASO-005459の効果を評価するために測定した。さらに、チューブリン(TUBB)mRNAを毒性モニターのために測定した。
図3および表3(下記)に示すとおり、ASO-005459は、ヒト神経細胞で発現されるSNCAの濃度依存性減少を誘発し、平均IC50は100nMであった。このIC50は、PAC-A53T神経細胞におけるSNCAタンパク質減少のIC50(表2、上記)より約13倍弱かった。この有効性シフトの理由は明らかではないが、ASO取り込み、代謝またはSNCノックダウンの反応速度論の差異による可能性がある。ASO-005459はヒト神経細胞でPROS1 mRNAの濃度依存性減少も示したが、IC50はSNCAに対するIC50より30~50倍弱かった。これらの結果は、ヒト神経細胞におけるSNCAに対するASO-005459活性を確認し、ASO-005459がPROS1と比較してSNCAに30~50倍選択的であることを示す。
バッチ=使用したASO-005459の特定のロット番号
バッチ=使用したASO-005459の特定のロット番号
Ramos細胞におけるASO-005459の有効性
IKZF3はASO-005459について別の潜在的オフターゲットであるが、PROS1と異なり、ヒト神経細胞で発現されない。その代わり、IKZF3はヒトリンパ球性細胞株であるRamos細胞で強く発現される。Ramos細胞を1μM ASO-005459で処理し、IKZF3 mRNA発現に対する効果を測定した。毒性モニターのために、ベータ-2ミクログロブリンmRNAも測定した。Ramos細胞がSNCAを発現しないため、別の遺伝子、RB1(RB転写コリプレッサー1)をASO介在ノックダウンの陽性対照として使用した。ASO-006754(GGTgaggtttggtaGA、配列番号9)およびASO-006755(GGTgaggtttggtagaAG、配列番号10)はRB1を標的とし、本試験に含めた。表4(下記)に示すとおり、1μM濃度で、ASO-005459はIKZF3 mRNA発現に影響を与えず、ASO-005459のSNCAへの特異性が示された。ASO-005459はまたRB1およびβ2M mRNA発現にも影響を与えず、ASO-005459はRamos細胞に毒性でないことが示される。対照的に、ASO-006754およびASO-006755(対照ASO)は、RB1レベルをそれぞれ87%および83%減少させ、Ramos細胞におけるASO活性を確認した。
バッチ=使用したASOの特定のロット番号
IKZF3はASO-005459について別の潜在的オフターゲットであるが、PROS1と異なり、ヒト神経細胞で発現されない。その代わり、IKZF3はヒトリンパ球性細胞株であるRamos細胞で強く発現される。Ramos細胞を1μM ASO-005459で処理し、IKZF3 mRNA発現に対する効果を測定した。毒性モニターのために、ベータ-2ミクログロブリンmRNAも測定した。Ramos細胞がSNCAを発現しないため、別の遺伝子、RB1(RB転写コリプレッサー1)をASO介在ノックダウンの陽性対照として使用した。ASO-006754(GGTgaggtttggtaGA、配列番号9)およびASO-006755(GGTgaggtttggtagaAG、配列番号10)はRB1を標的とし、本試験に含めた。表4(下記)に示すとおり、1μM濃度で、ASO-005459はIKZF3 mRNA発現に影響を与えず、ASO-005459のSNCAへの特異性が示された。ASO-005459はまたRB1およびβ2M mRNA発現にも影響を与えず、ASO-005459はRamos細胞に毒性でないことが示される。対照的に、ASO-006754およびASO-006755(対照ASO)は、RB1レベルをそれぞれ87%および83%減少させ、Ramos細胞におけるASO活性を確認した。
バッチ=使用したASOの特定のロット番号
まとめて、ここに示す結果はASO-005459がSNCA mRNA減少に協力且つ高度に選択的であり、これはその後SNCAタンパク質レベルの減少に介在することを示す。結果はまたASO-005459がマウスおよびヒト神経細胞両者で十分に忍容性であることを示す。これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのASO-005459の開発継続を支持する。
実施例7:インビボ忍容性およびインビボSNCA mRNA減少
本発明のASOのインビボ忍容性を試験して、種々の動物モデル(すなわち、マウスおよびカニクイザル)に注射したとき、どのようにASOが許容されたかを確認した。
本発明のASOのインビボ忍容性を試験して、種々の動物モデル(すなわち、マウスおよびカニクイザル)に注射したとき、どのようにASOが許容されたかを確認した。
マウス
対象A53T変異を有するヒトSNCA遺伝子全体をマウスSNCAノックアウトバックグラウンドで担持する雄および雌(2~3か月齢)PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-(「PAC-A53T」)マウスを、急性、長期およびPK/PDインビボ効果試験に使用した。一部例では、野生型(WT)C57B/6マウスを使用して、長期(すなわち、4週間)健康評価をした。マウスを、4匹または5匹のグループで、温度制御飼育室で、餌および水は自由に摂取させて飼育した。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。
対象A53T変異を有するヒトSNCA遺伝子全体をマウスSNCAノックアウトバックグラウンドで担持する雄および雌(2~3か月齢)PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-(「PAC-A53T」)マウスを、急性、長期およびPK/PDインビボ効果試験に使用した。一部例では、野生型(WT)C57B/6マウスを使用して、長期(すなわち、4週間)健康評価をした。マウスを、4匹または5匹のグループで、温度制御飼育室で、餌および水は自由に摂取させて飼育した。マウスが関与する全ての方法は、Bristol-Myers Squibb Animal Care and Use Committee(ACUC)により承認されたAnimal Test Methods(ATM)に従い実施した。
ASO投与溶液調製:0.2μm Whatmanフィルターおよび無ヌクレアーゼ遠心管を装着した無菌食塩水(1mL)シリンジを使用して、投与溶液を調製した。記載する量の水または食塩水をASO粉末に加え、ボルテックス処理(約1分間)して、ASO粉末を溶解させた。次いで、溶液を10分間静置し、再び約1分間ボルテックス処理した。チューブを短く遠心して全ての液体をチューブの底に戻し、次いで、溶液を0.2μm 無菌フィルターをとおして、第二の無RNaseチューブに入れた。一次原液の少量をNanodropを使用する濃度分析のために1mg/mlに希釈した。分析サンプルを、手で倒置させながら3回ボルテックス処理して、徹底的に混合した。次いで、サンプルのUV吸光度を、Nanodropで260nmで2回測定した(サンプルを入れる前に台を3回濯ぎ、拭いた)。試験サンプルは、分析が完了したら廃棄した。サンプルは、UV吸光度がサンプルの90~110%であるならば、投与の準備ができたとみなした。UV吸光度がサンプルの110%を超えているならば、二次希釈を調製した;吸光度が<90%であるならば、高い初期濃度で、上記と同様の工程に従い調製した。サンプルを使用するまで4℃で保存した。
フリーハンド脳室内(ICV)注射:HaleyおよびMcCormickの方法に従い、ICV注射を27または30ゲージ針を備えたハミルトンマイクロシリンジを使用して実施した。針は、その脳内への浸透を制限するために、先端から2.5~3mmにポリエチレンガードを備えた。マウスをイソフルラン麻酔(1~4%)を使用して麻酔した。十分に麻酔されたら、一方の手の親指と人差し指で、首背部のたるんだ皮膚の部位でマウスを持った。次いで、優しく、しかし確かに圧をかけながら、動物の頭部を堅い平らな表面に押し付けて固定した。27 2/1g針を備えた10μL ハミルトンシリンジを使用して投与を行った。次いで針先端を頭皮および頭蓋骨をとおして前項の約1mm側面および1mm後端に挿入した(すなわち、中線の右、眼線から測定して約3mm後ろ)。針が設置できたら、ASOを食塩水媒体中5μlの体積で与え、約30秒間かけて注入した。針を、出す前5~10秒間その場に置いた。マウスを飼育ケージに戻し、約2~4分間回復させた。マウスを薬物および/または投与の有害行動変化について、投与直後30分間連続して観察した。この間、離れて3回を超えて痙攣したマウスは全て直ぐに屠殺し、20の自動スコアを付した。薬物忍容性を投与後1時間±15分間採点した。非忍容性を投与された動物(忍容性スコア>4)は、1時間評価後直ぐに屠殺した。
ASO忍容性評価:ASO投与動物を、投与直後評価し、あらゆる有害作用について2時間モニターした。急性忍容性(AT)試験について、マウスを投与時およびテイクダウン時、すなわちASO注射3日後に再び評価した。長期健康評価について、マウスを、実験完了まで毎週秤量し、あらゆる健康および行動問題についてモニターした。最初の体重から15%を超えて体重が減少したまたは忍容性問題を示したマウスを試験から除き、屠殺した。健康および忍容性評価を、次のチャートに従い実施した。
a 正常を「0」と採点する。動物を、投与後連続した時点で、個々に採点する。観察は、1時間±15分、次いで24時間±2時間、その後7日目(適切であれば)に採点する。痙攣は、前の観察ウインドで生じても1時間時点としてカウントする。総忍容性スコアを、個々のカテゴリースコアの合計に基づき計算し、可能な最高スコアは20である。
a 正常を「0」と採点する。動物を、投与後連続した時点で、個々に採点する。観察は、1時間±15分、次いで24時間±2時間、その後7日目(適切であれば)に採点する。痙攣は、前の観察ウインドで生じても1時間時点としてカウントする。総忍容性スコアを、個々のカテゴリースコアの合計に基づき計算し、可能な最高スコアは20である。
組織回収:最終行動および健康評価後、マウスを断頭台で断頭し、脳を直ぐに摘出した。各脳を2つの半球に分け、a)海馬を3日急性忍容性試験におけるmRNA測定のために切断した;b)半球の一方からの海馬、脳幹および線条体をmRNA測定のために切断し、同時に他方の半球の同じ領域を用量応答時間経過PK/PD試験におけるタンパク質/PK測定のために切断した。
試験のいくつかで、血液および脳脊髄液(CSF)も、PK(血液)およびPK/タンパク質(CSF)測定のために採取した。血液およびCSFを採取するために、マウスをイソフルラン(4%)で麻酔した。血液を23G針を使用する心臓穿刺により採取した。採ったら、血液を2ml BD Microtainer(K2EDTA BD #365974)チューブに移し、処理するまで氷上に置いた。血液を処理するために、チューブを4500×gで10分間、4℃で遠心分離した。次いで、血漿を取り、0.5mlエッペンドルフチューブに入れ、使用するまで-80℃で保存した。CSFを採取するために、胸腔を開けて心臓を露出させ、できるだけ多くの血液を、CSFの汚染を避けるために吸引した。CSFサンプルをマイクロピペットを使用して大槽から採取し、lo-bindタンパク質エッペンドルフチューブに入れた。次いで、チューブを4500×gで15分間、4℃で遠心分離した。CSFを注意深く清潔なlo-bind 0.5mlエッペンドルフチューブに入れ、さらに使用するまで-80℃で保存した。
カニクイザルデータ
対象:試験開始時3.5~10.0kgの雄カニクイザルを使用した。それぞれL3またはL4椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(CSF)カテーテルをインプラントした。ポリレタンカテーテルの遠位先端はほぼL1椎骨まで髄腔内空間内を伸びた。近位末端を動物の背下部に位置する皮下アクセスポートに接続した。動物を試験開始前少なくとも2週間治癒させた。実験動物ケアは、Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory AnimalsおよびGuide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011)(National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health)に従った。プロトコールはBristol-Myers Squibb CompanyのWallingford Animal Care and Use Committeeに承認された。
対象:試験開始時3.5~10.0kgの雄カニクイザルを使用した。それぞれL3またはL4椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(CSF)カテーテルをインプラントした。ポリレタンカテーテルの遠位先端はほぼL1椎骨まで髄腔内空間内を伸びた。近位末端を動物の背下部に位置する皮下アクセスポートに接続した。動物を試験開始前少なくとも2週間治癒させた。実験動物ケアは、Public Health Service Policy on the Humane Care and Use of Laboratory AnimalsおよびGuide for the Care and use of Laboratory Animals NRC (2011)(National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health)に従った。プロトコールはBristol-Myers Squibb CompanyのWallingford Animal Care and Use Committeeに承認された。
CSFおよび血液サンプリング:CSFポートを、無菌法を使用して皮下でアクセスし、CSFを霊長類拘束椅子に正立で座っている起きた動物からサンプリングした。約0.1mlのCSFをカテーテルのデッドスペースおよびポートを浄化するために採取開始時に廃棄した。CSFを、最大0.5ml CSF/サンプルで自然流下により集めた。CSFを2,000gで4℃で10分間遠心分離した。上清をドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで-90℃に維持した。
血液を利用可能な静脈、一般に伏在静脈からサンプリングした。血液サンプルを問題の特定の測定により、多数の方法で調製した。血漿について、血液をEDTA処理チューブに集めた。血清について、血液を血清セパレーターチューブに集め、少なくとも30分間凝血させ、その後遠心分離した。凝固および凝固因子測定のため、血液をクエン酸処理チューブに集め、RNA分析のため、血液をRNAlater含有チューブに集めた。処理後、サンプルをドライアイスまたは液体窒素で凍結させ、分析するまで凍結させたままにした。
髄腔内投与:動物を、覚醒時、市販の拘束椅子を改変して使用して投与できるように訓練し、動物を伏臥位に維持した。SNCA標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を食塩水に溶解し、濾過滅菌し、0.33ml/分で1.0ml体積で投与し、続いて0.5ml 無菌水をフラッシュした。総注入時間は4.5分であった。動物は注入後30分間、伏臥位に維持した。
剖検:カニクイザルに、適切な体積の市販屠殺溶液を、ケタミンおよび/またはイソフルランで麻酔しながら投与した。剖検組織をその直後に得て、脳を切開のために湿った氷に載せた。目的領域を4~6mmスライスを使用して、ASI Cyno Brain Matrixならびにフリーハンド技術を使用して切断した。サンプルを、RNAlater(登録商標)に生のまま入れるかまたは後の分析のためドライアイスで凍結させた。CNS組織をカニクイザルから迅速に切断し、いずれの軸も4mmを超えない長さの切片を集め、5mLのRNAlaterに入れた。サンプルを4℃で一夜保存し、次いで分析するまで保存するため-20℃に移した。
分析した脳領域は、髄質、橋、中脳、小脳、尾状核被殻(左右)、海馬(左右)、前頭前皮質(左右)、側頭皮質(左右)、頭頂皮質(左右)、後頭皮質(左右)および皮質下白質を含んだ。さらに、脊髄を頸部、胸部および腰部領域からサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓および心臓からも採取した。数例で、三叉神経核、脛骨神経および大動脈のサンプルを集め、これら領域でのオフターゲット薬理学を試験した。
マウスまたはサル組織、血漿およびCSFにおけるASO濃度のELISA定量:
組織を1:1比の血漿および水で均質化した。血漿(血漿およびCSF用)および血漿:水(組織サンプル用)で5000~4.9nMの2倍連続希釈により標準曲線を作成し、次いで5×SSCT(750mM NaClおよび75mM クエン酸ナトリウム、pH7.0、0.05%(v/v) Tween-20含有)単独および35nM捕捉および35nM検出試薬含有5×SSCTでさらに計5000倍まで希釈して、1~1000pMの標準範囲を得た。使用した希釈計数は予測されるサンプル濃度範囲により変わる。捕捉プローブはAAAGGAAと3'ビオチン(Exiqon)および検出プローブは5' DigN-イソプロピル18リンカー--GTGTGGT(Exiqon)であった。
組織を1:1比の血漿および水で均質化した。血漿(血漿およびCSF用)および血漿:水(組織サンプル用)で5000~4.9nMの2倍連続希釈により標準曲線を作成し、次いで5×SSCT(750mM NaClおよび75mM クエン酸ナトリウム、pH7.0、0.05%(v/v) Tween-20含有)単独および35nM捕捉および35nM検出試薬含有5×SSCTでさらに計5000倍まで希釈して、1~1000pMの標準範囲を得た。使用した希釈計数は予測されるサンプル濃度範囲により変わる。捕捉プローブはAAAGGAAと3'ビオチン(Exiqon)および検出プローブは5' DigN-イソプロピル18リンカー--GTGTGGT(Exiqon)であった。
実験サンプルおよび標準を、1:1比でClarity溶解緩衝液(Phenomenex, cat#AL0-8579)に加え、その後捕捉および検出緩衝液で希釈し、次いでELISAプレートに移した。CSFサンプルを血漿(2倍)で希釈し、その後溶解緩衝液を加えた。ストレプトアビジン被覆プレート(Thermo 15119)を5×SSCT緩衝液で3回洗浄した。100μlサンプルを加え、60分間、室温でインキュベートした。0.05%Tween-20含有PBSで1:4000希釈した検出プローブ、100μl抗Dig-AP Fabフラグメント(Roche Applied Science, Cat. No. 11 093 274 910)を加え、60分間、室温でインキュベートした。プレートを2×SSCT緩衝液で洗浄後、100μl Tropix CDP-star Sapphire II基質(Applied Biosystems)を30分間、室温で加えた。ASO濃度を発光により測定した(Enspire-PerkinElmer)。
アルファ-シヌクレインタンパク質測定:
脳組織サンプルを、ベッドホモジナイザーQiagen Tissuelyser IIを25サイクル/秒で、5mmステンレス鋼ベッドで計2分使用して、RIPA緩衝液(50mM Tris HCl、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)中、10ml/g組織で均質化した。均質化サンプルを、氷上で30分間インキュベートした。各サンプルの50μLアリコートをPK分析用に残した。残ったサンプルを20,800gで60分間、4℃で遠心分離した。上清を保持し、分析に使用した。総タンパク質をPierce BCAタンパク質アッセイキット(23227)を使用して測定した。
脳組織サンプルを、ベッドホモジナイザーQiagen Tissuelyser IIを25サイクル/秒で、5mmステンレス鋼ベッドで計2分使用して、RIPA緩衝液(50mM Tris HCl、150mM NaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム)中、10ml/g組織で均質化した。均質化サンプルを、氷上で30分間インキュベートした。各サンプルの50μLアリコートをPK分析用に残した。残ったサンプルを20,800gで60分間、4℃で遠心分離した。上清を保持し、分析に使用した。総タンパク質をPierce BCAタンパク質アッセイキット(23227)を使用して測定した。
脳組織抽出物:SNCAタンパク質を、MJFR1+4B12 ELISAを使用して測定した。簡潔には、ELISAプレート(Costar)を100μlの抗SNCA抗体MJFR1(Abcam)で、BupH炭酸-炭酸水素緩衝液、pH9.4(Thermo Scientific)に希釈した0.1μg/ml濃度で、一夜(O/N)、4℃で被覆した。翌日、プレートをDulbecco's PBS (Life Technologies)で4回洗浄し、PBS中3%BSA(ウシ血清アルブミン、無プロテアーゼ、Fraction V, Roche Diagnostic)で2~3時間、室温(RT)または一夜、4℃で遮断した。標準および脳サンプル両者をRocheプロテアーゼ阻害剤(Roche 11836145001、1ペレット/25ml)およびホスファターゼ阻害剤2&3(Sigma、1:100)含有1%BSA/0.05%Tween/PBSで希釈した。SNCA野生型(rPeptide)を標準として使用した。サンプルをデュプリケート(50μl/ウェル)で載せ、O/Nで4℃でインキュベートした。プレートをRTに平衡化した後、50μlの検出抗体4B12(Biolegend)(1%BSA/0.1%Tween/DPBSで1:4000希釈)を各ウェルに加え、サンプルとRTで約2時間共インキュベートした。検出抗体は、アルカリホスファターゼ(Novus BiologicalsからのAPキット)とプレコンジュゲートさせた。次いでプレートを0.05%Tween/PBSで4回洗浄し、100μlのアルカリホスファターゼ基質(Tropix CDP Star Ready-to-Use with Sapphire II, T-2214, Life Technologies)で30分間展開した。発光カウントをPerkin Elmer EnVision(2102 Multilabel Reader)で測定した。プレートを、アッセイ中一定に振盪させた(Titer plate shaker, speed 3)。データを、GraphPad Prismで分析した。脳組織の総タンパク質を、製造業者の指示に従い、Micro protein assay kit(Thermofisher #23235)を使用して測定した。
脳脊髄液(CSF):SNCAタンパク質を、製造業者の指示に従いU-PLEX Human SNCA Kit(cat# K151WKK-2, Meso Scale Discovery)で測定した。CSFサンプルを10倍希釈した。Abcam mouse Hemoglobin ELISA kit(ab157715)を使用して、CSFサンプルでヘモグロビンを測定した。CSFサンプルをヘモグロビン測定のため40倍希釈した。
qRT-PCRによるmRNA測定
脳領域を回収し、RNA-later、RNA安定化溶液を予め充填したRNA-later Tissue Protect tubes(Qiagen cat#76514)に入れた。RNA-later溶液中の組織は、4℃で1か月または-20℃もしくは-80℃で無期限に保存できた。
脳領域を回収し、RNA-later、RNA安定化溶液を予め充填したRNA-later Tissue Protect tubes(Qiagen cat#76514)に入れた。RNA-later溶液中の組織は、4℃で1か月または-20℃もしくは-80℃で無期限に保存できた。
RNA単離:RNeasy Plus Mini Kit:マウス海馬および皮質からのRNAをRNeasy Plus Mini Kit(Qiagen cat#74134)を使用して単離した。組織サンプルを10μl/mlの2-メルカプトエタノールおよび0.5%Reagent Dx含有600μLまたは1200μL RLT Plus緩衝液体積で均質化した。600μL溶解緩衝液を組織サンプルが<20mgであるならば使用し、1200μl溶解緩衝液を組織サンプル>20mgで使用した。各均質化で、組織サンプルを600μL RLT Plus緩衝液(と10μl/mlの2-メルカプトエタノールおよび0.5%Reagent Dx)および5mmステンレス鋼ビーズ(Qiagen cat#69989)を含む2.0mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移した。サンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。サンプルを2.0分間、20Hzで処理し、サンプルを180°回転させ、さらに2.0分間、20Hzで処理した。次いでサンプルを2.0分間、30Hzで処理し、サンプルを180°回転させ、さらに2.0分間、30Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび/または高頻度均質化を使用した。次いで600μLの組織ライセートを2.0mL回収チューブのgDNA Eliminator spinカラムに移し、30秒間、10,000gで遠心分離した。全遠心分離工程をRTで実施した。フロースルーを集め、等体積の70%エタノールを加え、混合した。600μLを2.0mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに集め、サンプルを15秒間、10,000gで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った600μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。カラムを700μLの洗浄緩衝液RW1で洗浄し、15秒間、10,000gで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムをキットプロトコールに記載のとおり、4体積のエタノールを含む500μLの緩衝液RPEで2回洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために15秒間、10,000gで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために2.0分間、10,000gで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために1.0分間、10,000gで1回遠心分離した。次いで、カラムを新しい1.5mL回収チューブに移し、30μLの無RNase水を膜中心に直接加えた。膜を10分間、RTでインキュベートした。次いで、カラムを1.0分間、10,000gで遠心分離して、RNAを溶出した。RNA含有溶出液を回収し、RNA濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するUV吸光度により決定されるまで氷上に置いた。RNAサンプルを-80℃で保存した。
RNA単離:RNEASY(登録商標)Plus Universal Mini Kit:全ての他のカニクイザル、マウスおよびラット組織サンプルからのRNAを、RNEASY(登録商標)Plus Universal Mini Kit(Qiagen cat#73404)を使用して単離した。均質化のために、50μg以下の組織サンプルを、900μL QIAZOL(登録商標)溶解試薬および5mmステンレス鋼ビーズ(Qiagen cat#69989)を含む2.0mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブ(Eppendorf cat#022600044)に移したサンプルを、Qiagen's TissueLyser II装置を使用して均質化した。を2.0分間、20Hzで処理し、サンプルを180°回転させ、さらに2.0分間、20Hzで処理した。次いでサンプルを2.0分間、30Hzで処理し、サンプルを180°回転させ、さらに2.0分間、30Hzで処理した。処理が完全でないならば、長いおよび/または高頻度均質化を使用した。均質化組織ライセートを新しい2.0mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに入れ、RTで5.0分間静置した。100μLのgDNA Eliminator溶液を各チューブに加え、チューブを30秒間激しく撹拌した。180μLのクロロホルム(Sigma cat#496189)を各チューブに加え、チューブを30秒間激しく撹拌した。チューブをRTで3分間静置した。チューブを12,000gで15分間、4℃で遠心分離した。遠心分離後、上部水相を新しい2.0mL丸底Eppendorf Safe-Lockチューブに約500μL加えた。等体積の70%エタノーを加え、混合した。以降の全遠心分離工程をRTで実施した。500μLを2.0mL回収チューブに入れたRNeasy spinカラムに移し、サンプルを15秒間、10,000gで遠心分離した。フロースルーを廃棄し、残った500μLサンプルをスピンカラムに加えた。スピンカラムを遠心分離し、フロースルーを廃棄し、カラムを2体積のエタノールを含む700μLの洗浄緩衝液RWTで洗浄した。カラムを15秒間、10,000gで遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いでカラムを、キットプロトコールに記載のとおり、4体積のエタノールを含む500μLの緩衝液RPEで洗浄した。カラムをまず初回洗浄のために15秒間、10,000gで遠心分離し、次いで二回目洗浄のために2.0分間、10,000gで遠視分離し、カラムを膜乾燥のために1.0分間、10,000gで1回遠心分離した。次いで、カラムを新しい1.5mL回収チューブに移し、30μLの無RNase水を膜中心に直接加えた。膜を10分間、RTでインキュベートした。カラムを1.0分間、10,000gで遠心分離して、RNAを溶出した。RNA含有溶出液を回収し、RNA濃度が、NanoDrop分光光度計(Thermo)を使用するUV吸光度により決定されるまで氷上に置いた。RNAサンプルを-80℃で保存した。
逆転写によるcDNA合成:300ngのRNAを、PCR-96-AB-Cマイクロプレート(Axygen cat#321-65-051)中、無ヌクレアーゼ水(Invitrogen cat#10977-015)を使用して10.8μLの最終体積に希釈した。6.0μLを、次の物を含む反応混合物1の各ウェルに加えた:2.0μLの50μMランダムデカマー(Ambion cat#AM5722G)および4.0μLの1×dNTPミックス(Invitrogen cat#10297-018)。プレートを光学シーリングテープ(Applied Biosystems cat# 4360954)で密閉し、1.0分間、1,000×gでRTで遠心分離した。次に、プレートを、96ウェルThermal Cycler GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)を使用して、3.0分間、70℃に加熱した。次いで、プレートを氷で完全に冷やした。次に、3.25μLの反応混合物2(2μLの10×標準緩衝液、1.0μLのMMLV-RT 200U/μL 逆転写酵素酵素(Ambion cat#2044)および0.25μLのRNase阻害剤40U/μL(Ambion cat#AM2682)含有)を各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、1.0分間、1,000×gでRTで遠心分離した。96ウェルThermal Cyclerを使用して、プレートを95℃で10分間の後42℃で60分間加熱した。次いで、プレートを氷で冷却した。cDNAプレートを、PCR分析の準備ができるまで-20℃に保存した。
SNCAおよびGAPDH mRNA発現増幅および定量のためのqPCR:cDNAを、PCR-96-AB-Cマイクロプレートで無ヌクレアーゼ水で5倍希釈した。10μLの2×Taqman Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems cat#4369016)、1.0μLの20×Taqmanプライマー-プローブセット(Applied Biosystems)および5.0μLの無ヌクレアーゼ水からなる16μLのMaster Mix溶液を、384ウェル光学PCRプレート(Applied Biosystems cat#4483315)の各ウェルに加えた。4.0μLの希釈cDNAを384ウェル光学PCRプレートの各ウェルに加えた。プレートを光学シーリングテープで密閉し、1.0分間、1,000×gでRTで遠心分離した。PCRを、次のパラメーターを標準モードで使用するApplied Biosystems 700 HT Fast Real-Time PCRシステムで実施した:50℃で2.0分間、95℃で10分間、続いて40サイクルの95℃で15秒間および60℃で1.0分間。
qRT-PCRプライマー-プローブセット:Applied Biosystems(Thermo Fisher)のプライマー-プローブセットは次のものを含んだ:
1) ヒトアルファシヌクレイン(cat#Hs01103383_m1)FAM標識
2) ヒトPROS1(cat#HS00165590_m1)FAM標識
3) カニクイザルアルファシヌクレイン(cat#Mf02793033_m1)FAM標識
4) カニクイザルGAPDH(cat#Mf04392546_g1)FAM標識
5) カニクイザルGAPDH(cat#Mf04392546_g1)VIC標識プライマー限定
6) ラットアルファシヌクレイン(cat#Rn01425141_m1)FAM標識
7) ラットGAPDH(cat#Rn01775763-g1)FAM標識
8) ラットGAPDH(cat#4352338E)VIC標識プライマー限定
9) マウスGAPDH(cat#Mm99999915-g1)FAM標識
10) マウスGAPDH(cat#4352339E)VIC標識プライマー限定。
1) ヒトアルファシヌクレイン(cat#Hs01103383_m1)FAM標識
2) ヒトPROS1(cat#HS00165590_m1)FAM標識
3) カニクイザルアルファシヌクレイン(cat#Mf02793033_m1)FAM標識
4) カニクイザルGAPDH(cat#Mf04392546_g1)FAM標識
5) カニクイザルGAPDH(cat#Mf04392546_g1)VIC標識プライマー限定
6) ラットアルファシヌクレイン(cat#Rn01425141_m1)FAM標識
7) ラットGAPDH(cat#Rn01775763-g1)FAM標識
8) ラットGAPDH(cat#4352338E)VIC標識プライマー限定
9) マウスGAPDH(cat#Mm99999915-g1)FAM標識
10) マウスGAPDH(cat#4352339E)VIC標識プライマー限定。
実施例8:マウスにおけるASO-005459のインビボ活性および忍容性分析
ASO-005459は、ヒトSNCA特異的LNA修飾ASOである。インビトロ結果(上記)は、ASO-005459が初代神経細胞のSNCA mRNA減少に強力かつおよび選択的であることを示す。インビトロ結果は、ASO-005459が良好な忍容性であることも示唆する。
ASO-005459は、ヒトSNCA特異的LNA修飾ASOである。インビトロ結果(上記)は、ASO-005459が初代神経細胞のSNCA mRNA減少に強力かつおよび選択的であることを示す。インビトロ結果は、ASO-005459が良好な忍容性であることも示唆する。
A53T-PACマウス
これらの結果がインビボでも当てはまるかを評価するために、100μgのASO-005459をA53T-PACマウスにICV注射で投与し、忍容性および海馬におけるSNCA mRNAノックダウン(KD)両者を、実施例4(上記)のとおり注射3日後に評価した。
これらの結果がインビボでも当てはまるかを評価するために、100μgのASO-005459をA53T-PACマウスにICV注射で投与し、忍容性および海馬におけるSNCA mRNAノックダウン(KD)両者を、実施例4(上記)のとおり注射3日後に評価した。
表6および7(下記)に示すとおり、ASO-005459は忍容性が良好であり、全体的平均忍容性スコア1であった。さらに、ASO-005459は、投与3日後、海馬のSNCA mRNAレベルを>90%に有意に低下させた(図4)。
インビボでの活性評価のために、A53T-PACマウスに、ASO-005459を3.13μg、12.5μg、25μgまたは50μg濃度でICV注射で投与した。忍容性を、投与後7日目および14日目の体重測定により評価した。SNCA mRNA発現を、投与14日後評価し、そのとき動物を屠殺し、組織を採取した。SNCA mRNAノックダウンを海馬、脳幹および線条体の3脳領域で測定した。脳幹および線条体は、MSAおよびPD患者脳で最も影響を受けている領域の二つである。別の試験で、C57BL/6マウスに、100μgのASO-005459を投与し、忍容性を投与後7日目、14日目、21日目および28日目の体重測定により評価した。100μg ASO-005459を、ICVで野生型(WT)C57BL/6マウスに投与し、体重および行動を4週間にわたりモニターした。ASO-005459がマウスSNCAを標的としないため、SNCA mRNA発現減少は、これら動物で測定しなかった。
図5Aおよび5Bに示すとおり、ASO-005459(全濃度)処置マウス(A53T-PACマウスおよびC57BL/6マウス両者)および対照媒体処置マウスで、体重に有意差はなかった。動物(C57BL/6)は実験の経過中、何ら異常行動は示さなかった。表8参照(下記)。このような結果は、ASO-005459が良好な忍容性であることを示した。また、ASO-005459処置マウスで、試験した全3脳領域でSNCA mRNA発現の有意かつ依存性依存的減少があった。図6A~6C参照。海馬で、SNCA mRNA発現は、3.13μg、12.5μg、25μgおよび50μg ASO-005459でそれぞれ53%、73%、80%および96%減少した。類似の用量依存的ノックダウンが脳幹でも観察された。線条体で、SNCA mRNAノックダウンは、他の領域と比較して、より可変性であり、あまり強くなかった(図6A~6C):それぞれ75%および46%ノックダウンが50μgおよび25μgのASO-005459で観察された。しかしながら、12.5μgおよび3.13μgのASO-005459で、SNCA mRNA発現の有意な減少はなかった。線条体での低活性について可能性のある説明は、SNCA mRNAノックダウンのASOレベルまたは反応速度論の差異であろう。
ASO-005459レベルを、A53T-PACマウスの全3つの脳領域で測定した。図7および表9(下記)に示すとおり、脳暴露はほぼ用量比例的であり、線条体を含む全3領域で類似した。種々の脳領域のASO-005459暴露-応答相関を図8A~8Dに示す。類似の暴露-応答相関が海馬および脳幹で観察され、それぞれ推定IC50は179および206nMであった。比較として、線条体の暴露応答は比較的急であり、その領域でのSNCA mRNA減少の遅い反応速度論を示唆する。図8C参照。
より広範な用量-応答/時間経過曲線を提供するために、ASO-005459を、再びICVフリーハンド注射によりA53T-PACマウスに脳室に直接投与した(0μg、12.5μg、25μgまたは50μg)。動物を投与24時間、3日、4週、8週、12週、16週および20週後に屠殺し、脳幹および線条体のSNCA mRNA発現を評価した。
図9Aおよび9Bに示すとおり(および上記データに一致して)、A53T-PACマウスへのASO-005459は、脳幹および線条体両者でSNCA mRNA発現レベルの有意な減少(対媒体対照)をもたらした。減少は時間および用量両者に依存的であるように見え、ピーク減少(約90%)が脳幹で50μg ASO-005459で投与約4週間後に観察された(図9A)。線条体で、ピーク減少(約55%)は、50μg ASO-005459で投与約3日後に観察された(図9B)。SNCA mRNA発現レベルは、媒体対照と比較して投与4週間でも有意に低いままであり(図10Aおよび10B)、ベースライン対照に投与約16週間後までに戻った(図9Aおよび9B)。
図11Aおよび11Bに示すとおり、動物へのASO-005459投与も、脳幹および線条体脳組織両者でSNCAタンパク質レベルの時間および用量依存的減少をもたらした。ピーク減少(約75%)は、脳幹で50μg用量で投与8週間後得られた(図11A)。線条体脳組織について、ピーク減少(約75%)は、同様に50μg用量であるが、投与4週間後得られた(図11B)。個々のマウスの投与8週間後の発現レベルを図12A(脳幹)および12B(線条体)に示す。SNCAタンパク質レベルは投与約12週間後に線条体でほぼベースラインに戻ったが、脳幹で、発現レベルは投与16週間後でさえ、有意に減少していた(約25%)。
実施例9:カニクイザルのSNCA標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)のインビボ活性および忍容性の分析
ASO活性および忍容性をインビボでさらに評価するため、髄腔内ポートのあるカニクイザルモデル(カニクイザルIT)を開発した。このモデルは、SNCAのASO-005459介在ノックダウンならびに潜在的1塩基対ミスマッチオフターゲットPROS1およびIKZF3のノックダウンの評価を可能とする。SNCA、PROS1およびIKZF3のASO-005459標的部位は、ヒトとカニクイザルで完全に保存される。
ASO活性および忍容性をインビボでさらに評価するため、髄腔内ポートのあるカニクイザルモデル(カニクイザルIT)を開発した。このモデルは、SNCAのASO-005459介在ノックダウンならびに潜在的1塩基対ミスマッチオフターゲットPROS1およびIKZF3のノックダウンの評価を可能とする。SNCA、PROS1およびIKZF3のASO-005459標的部位は、ヒトとカニクイザルで完全に保存される。
実施例6に上記のとおり、各動物にL3またはL4椎骨に入る髄腔内脳脊髄液(CSF)カテーテルをインプラントした。ASO-005459を食塩水に溶解し、動物(8mg/動物)に投与し、ITポートを使用して4.5分間にわたり注入した(2動物/投与群)。次いで、動物を投与24時間および3日後に屠殺し、その時組織をASO暴露および活性の分析のために採取した。分析した脳領域は髄質(Med)、橋(V-橋)、中脳(V-MB)、小脳(CBL)、尾状核被殻(左右)(CauP)、海馬(左右)(Hip)、前頭前皮質(左右)(FrC)、側頭皮質(左右)(TeC)、頭頂皮質(左右)(PaC)、後頭皮質(左右)(Occ)および皮質下白質(WM)を含んだ。さらに、脊髄を頸部(CSC)、胸部(TSC)および腰部(LSC)領域でサンプリングした。サンプルを肝臓、腎臓、心臓、三叉神経核、脛骨神経および大動脈からも採取し、これらの領域でのオフターゲット薬理作用を試験した。
マウスで見られたのと同様、ASO-005459はカニクイザルで有害作用は観察されず、良好な忍容性であった(データは示していない)。そして下表10に示すとおり、ASO-005459投与は、カニクイザル脳の種々の領域でSNCA mRNAの強固なノックダウンを示した。
上記SNCA mRNA減少をさらに特徴づけるため、カニクイザルにASO-005459(計8mg/動物)を投与し、投与24時間、3日、2週、4週、8週、13週または20週後に屠殺して、種々の組織のSNCA mRNA発現レベルを評価した。図13Aに示すとおり、投与後2週間~13週間でピーク減少が観察された。髄質、小脳、橋、尾状核被殻、前頭前皮質および腰部脊髄でそれぞれ70%、65%、75%、35%、94%および99%のピーク減少が観察された。SNCA mRNA発現レベルのこの現象はまたSNCAタンパク質発現レベルの時間依存的減少とも相関する(図13B)。
次に、カニクイザルでの発現レベル減少が用量にも依存するかを評価するため、動物に2mg、4mgまたは8mgのASO-005459を投与し、次いで、投与2週間後屠殺した。図14Aおよび14Bに示すとおり、SNCA mRNAおよびSNCAタンパク質発現レベル両者の減少は用量依存的でもあり、8mgのASO-005459で最大減少が観察された。
ここに提供する結果は、ASO-005459がSNCA mRNA減少に強力かつ選択的であり、ASO-005459が神経細胞およびインビボ前臨床種で忍容性が良好であることを示す。さらに、A53T-PAC神経細胞からの結果は、mRNAのASO-005459介在減少が、インビトロおよびインビボでSNCAタンパク質レベル減少をもたらすことを示す。さらに、A53T-PACマウスおよびカニクイザルでの結果は、ASO-005459が、忍容性が良好な用量で脳でSNCA mRNAおよびSNCAタンパク質を減少させることを示す。まとめると、これらの治験は、シヌクレイン病処置のための疾患修飾治療としてのASO-005459の開発継続を支持する。
このPCT出願は2018年1月12日出願の、米国仮出願62/616,937に基づく優先権を主張し、それは引用により本明細書に全体として包含させる。
Claims (27)
- AtTcctttacaccACAC(配列番号4)の連続的ヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)であって、ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAであり、小文字はDNAである、ASO。
- ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド間結合を含む、請求項1に記載のASO。
- ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項2に記載のASO。
- 連続的ヌクレオチド配列がOxyAs DNAts OxyTs DNAcs DNAcs DNAts DNAts DNAts DNAas DNAcs DNAas DNAcs DNAcs OxyAs OxyMCs OxyAs OxyMCであり、ここで、OxyA、OxyTおよびOxyMCがそれぞれアデニンベータD-オキシ-LNA、チミンベータD-オキシ-LNAおよびメチルシトシンベータD-オキシ-LNAであり、DNAt、DNAcおよびDNAaがそれぞれチミンDNA、シトシンDNAおよびアデニンDNAであり、sが2ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合である、請求項1に記載のASO。
- C171H214N56O90P16S16の分子式および図1Bに示す構造を含み、ここで、M+がカウンターイオンである、請求項1~4の何れかに記載のASO。
- カウンターイオンがH+、Na+、NH4 +およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項5に記載のASO。
- カウンターイオンがNa+である、請求項6に記載のASO。
- 請求項1~7の何れかに記載のASOを含むコンジュゲートであって、ここで、ASOは少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、コンジュゲート。
- 非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたは任意のこれらの組み合わせを含む、請求項8に記載のコンジュゲート。
- 請求項1~7の何れかに記載のASOまたは請求項8または9に記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- さらに治療剤を含む、請求項10に記載の組成物。
- 治療剤がアルファ-シヌクレインアンタゴニストである、請求項11に記載の組成物。
- 請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物および使用指示を含む、キット。
- 請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物および使用指示を含む、診断キット。
- 細胞におけるSNCAタンパク質発現を阻止または減少する方法であって、請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物をSNCAタンパク質発現細胞に投与することを含み、ここで、細胞のSNCAタンパク質発現が該投与後阻止または減少される、方法。
- ASOが投与後細胞のSNCA mRNA発現を阻止または減少する、請求項15に記載の方法。
- SNCA mRNAの発現が、投与後、ASOに曝されていない細胞と比較して少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または約100%減少される、請求項15または16に記載の方法。
- ASOが、投与後、ASOに曝されていない細胞と比較して、細胞のSNCAタンパク質少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%または少なくとも約90%減少させる、請求項15~17の何れかに記載の方法。
- 細胞が神経細胞である、請求項15~18の何れかに記載の方法。
- 対象に有効量の請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病を処置する方法。
- 医薬の製造のための、請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物の使用。
- 処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の処置用医薬の製造のための、請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物の使用。
- 治療に使用するための、請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物。
- 処置を必要とする対象におけるシヌクレイン病の治療に使用するための、請求項1~7の何れかに記載のASO、請求項8または9に記載のコンジュゲートまたは請求項10~12の何れかに記載の組成物。
- シヌクレイン病がパーキンソン病、パーキンソン病認知症(PDD)、多系統萎縮症、レビー小体型認知症および任意のこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項20に記載の方法、請求項21または22に記載の使用または請求項23または24に記載の使用のためのASO。
- 対象がヒトである、請求項20または25の何れかに記載の方法、請求項21、22および25の何れかに記載の使用または請求項23~25の何れかに記載の使用のためのASO。
- ASO、コンジュゲートまたは組成物が、経口、非経腸、髄腔内、脳室内、肺、局所的または心室内投与される、請求項20、25および26の何れかに記載の方法、請求項21、22、25および26の何れかに記載の使用または請求項23~26の何れかに記載の使用のためのASO。
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