TW202020151A - 用於調制 Tau 表現之寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本發明關於能夠調制標靶細胞中 Tau 的表現之反義寡核苷酸。該等寡核苷酸係與 MAPT mRNA 雜交。本發明進一步關於該寡核苷酸之共軛體及用於治療 Tau 異常沉積病變 (Tauopathy)、阿茲海默症 (AD)、額顳葉失智症 (FTD)、FTDP-17、進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、慢性創傷性腦病變 (CTE)、皮質基底核退化症 (corticobasal ganglionic degeneration) (CBD)、癲癇、卓飛症候群(Dravet syndrome)、抑鬱、癲癇發作(seizure disorder) 及運動障礙 (movement disorder) 之醫藥組成物及方法。

Description

用於調制　Tau　表現之寡核苷酸

本發明關於與微管相連蛋白 Tau (MAPT ) 轉錄本互補而導致 Tau 的表現減少之寡核苷酸 (寡聚物)。MAPT 轉錄本及/或 Tau 蛋白表現的減少係有益於一系列醫學病症，諸如 Tau 異常沉積病變 (Tauopathy)、阿茲海默症 (Alzheimzer's disease)、額顳葉失智症 (fronto-temporal dementia) (FTD)、FTDP-17、進行性上眼神經核麻痺 (progressive supranuclear palsy) (PSP)、慢性創傷性腦病變 (chronic traumatic encephalopathy) (CTE)、皮質基底核退化症 (corticobasal ganglionic degeneration) (CBD)、癲癇 (epilepsy)、卓飛症候群 (Dravet syndrome)、抑鬱 (depression)、癲癇發作(seizure disorder) 及運動障礙 (movement disorder)。

Tau 是一種微管相連蛋白 (MAP)，其與微管蛋白交互作用且參與微管組裝和安定化。微管是細胞細胞骨架的關鍵結構組分，並參與各種細胞過程，包括有絲分裂、胞質分裂、和囊泡運輸。Tau 蛋白存在於多種細胞和組織類型中，但在神經元中特別豐富，其在調控軸突運輸和功能中扮演關鍵角色。

Tau 表現量及/或功能的改變導致各種神經退化性失調的病理生理學。例如，錯誤折疊和過度磷酸化的 Tau 聚集體係經發現於與阿茲海默症 (AD) 相關和有關的 Tau 異常沉積病變 (諸如進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、皮質基底核退化症 (CBD)、慢性創傷性腦病變 (CTE)、額顳葉失智症 (FTD) 及 FTD 伴隨與染色體 17 相關之帕金森症 (FTDP-17)、匹克症 (PiD)、嗜銀顆粒病 (AGD)、纏結為主的老年失智症 (TPSD)、與原發性年齡相關的Tau異常沉積病變 (PART)、唐氏症及關島 lytico-bodig 病) 的神經纖維包涵物中。病理性 Tau 的上調與嬰兒型 Tau 異常沉積病變相關，包括半邊巨腦症 (HME)、結節性硬化症 (tuberous sclerosis complex)；局灶性皮質發育不良第 2b 型；及神經節性神經膠質瘤。此外，異常的 Tau 表現及/或功能亦可能與其他疾病相關，諸如 Hallervorden-Spatz 二氏症候群，也稱為腦鐵沉積性第 1 型的神經退化 (NBIA1)、神經節細胞瘤、及亞急性硬化性泛腦炎。Tau 亦可在癲癇發作 (seizure disorder) (例如癲癇)、網路功能障礙 (例如抑鬱)、及運動障礙 (movement disorder) (例如帕金森病) 扮演角色。

反義分子以及 siRNA 分子具有可藉由靶向 MAPT 前 mRNA 或 mRNA 轉錄本而降低 Tau 蛋白水平已說明於例如參見 De Vos 等人 2013 Journal of Neuroscience Vol 33 pp 12887、WO2013/148260、WO2014/153236、WO2015/010135、WO2016/126995、WO2016/151523、WO2017/09679 及 WO2018/064593。可誘導 MAPT 轉錄本的剪接調制之反義寡核苷酸亦已說明於 Sud 等人 2014 Mol Ther Nucl Acid 3 e180 及 WO2016/019063。

諸如 AD 的 Tau 相關失調是年長者失智的最常見原因，且非常需要用於治療 AD 和相關神經退化性疾病 (包括 Tau 異常沉積病變、癲癇發作、和運動障礙) 的強效且有效之劑。 [發明目的]

本發明提供在活體內及活體外皆可減少 Tau 的反義寡核苷酸。本發明提出位於人MAPT 前-mRNA 的內含子 1 或 2 中的MAPT 前-mRNA 中的三個特異性標靶區域，其可藉由反義寡核苷酸來靶定以產生有效的 Tau 抑制。具體而言，就減少 Tau 而言，靶定SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12111、39562 至 39593 及/或 72837 至 72940 係有利的。本發明亦提供有效的反義寡核苷酸序列及能夠減少 Tau 之化合物、以及它們在治療疾病或失調 (諸如神經退化性疾病，包括 Tau 異常沉積病變、阿茲海默症、FTDP-17、癲癇發作及運動障礙) 中的用途。

本發明關於靶定 Tau 編碼核酸之寡核苷酸，其能夠調制 Tau 的表現，以及使用該寡核苷酸以治療或預防與 Tau 運作相關的疾病。

因此，在第一態樣中，本發明提供長度 10 至 30 個核苷酸的寡核苷酸，其包含長度至少 10 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列具有與SEQ ID NO：3、4 及 5 所代表之 MAPT 的特定區域至少 90% 互補性。

該寡核苷酸可係反義寡核苷酸，較佳的是具有缺口體 (gapmer) 設計。較佳的是，該寡核苷酸能夠藉由標靶核酸裂解來抑制 Tau 的表現。該裂解較佳的是經由核酸酶召募而達成。

在又一態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含本發明之寡核苷酸以及醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。

在又一態樣中，本發明提供之方法，係用於藉由投予有效量的本發明之寡核苷酸或組成物，而調制表現 Tau 的標靶細胞中之 Tau 表現之體內或體外方法。

在一進一步態樣中，本發明提供用於治療或預防與 Tau 體內活性有關之疾病、失調或功能障礙之方法，該方法包含對已罹患或易於罹患該疾病、失調或功能障礙之個體投予治療或預防上有效量的本發明之寡核苷酸。

在一進一步態樣中，本發明之寡核苷酸或組成物係用於治療或預防阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、額顳葉失智症 (FTD) 或 FTDP-17。

[定義] 寡核苷酸

本文所用的「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連結核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中製作，先經固相化學合成後再加以純化和分離。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連結核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2' 糖修飾核苷。 反義寡核苷酸

本文所用「反義寡核苷酸」一詞的定義是能夠藉由與標靶核酸雜交而調制標靶基因之表現的寡核苷酸，其所雜交的對象具體而言是標靶核酸上的連續序列。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應知，只要跨寡核苷酸全長的序列內或序列間自補程度低於 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙鏈體結構 (同一寡核苷酸的兩個分子之間的雙鏈體)。

有利的是，本發明之單股反義寡核苷酸不含有 RNA 核苷，因為這將會降低核酸酶抗性。

有利的是，本發明之反義寡核苷酸含有一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如 2' 糖修飾核苷。此外，有利的是，所述未經修飾的核苷是 DNA 核苷。 連續核苷酸序列

「連續核苷酸序列」一詞意指寡核苷酸的與標靶核酸或標靶序列互補的區域。在本文中，此詞可與「連續核鹼基序列」一詞和「寡核苷酸模體序列」一詞交替使用。在某些實施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸構成所述連續核苷酸序列。在某些實施例中，所述寡核苷酸包含連續核苷酸序列，例如 F-G-F' 缺口體區域，且可隨選包含其他核苷酸，例如可用於將官能基團附加至所述連續核苷酸序列的核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與標靶核酸互補或不互補。應理解的是，該寡核苷酸的連續核苷酸序列不能比寡核苷酸本身長，並且該寡核苷酸不能短於連續核苷酸序列。 核苷酸

核苷酸是寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中包括自然產生及非自然產生核苷酸。在本質上，例如 DNA 及 RNA 核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根 (核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。 修飾核苷

本文中所用的「修飾核苷」或「核苷修飾」一詞意指藉由導入糖部分或 (核) 鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA 或 RNA 核苷進行修飾的核苷。於一較佳實施例中，所述修飾核苷包含修飾糖部分。修飾核苷一詞在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA 或 RNA 糖部分的核苷稱為 DNA 或 RNA 核苷。在 DNA 或 RNA 核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克 (Watson Crick) 鹼基配對，則大體上仍稱為 DNA 或 RNA。 修飾核苷間鍵聯

「修飾核苷間鍵聯」一詞，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯 (PO) 鍵聯以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵聯。因此本發明之寡核苷酸可包含修飾核苷間鍵聯。在某些實施例中，所述修飾核苷間鍵聯可使寡核苷酸的核酸酶抗性相較於磷酸二酯鍵聯增加。就自然產生寡核苷酸而言，核苷間鍵聯包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵的磷酸根。經修飾之核苷間鍵聯特別可用於穩定寡核苷酸以供體內使用，且可用以防止本發明之寡核苷酸中 DNA 或 RNA 核苷的區域發生核酸酶裂解的情形，例如在缺口體寡核苷酸的缺口區域 G 內，以及在經修飾之核苷的區域中，例如區域 F 及 F'。

在一實施例中，該寡核苷酸包含從天然磷酸二酯所修飾的一個或多個核苷間鍵聯，例如一個或多個經修飾之核苷間鍵聯，其例如對核酸酶攻擊更具抗性。核酸酶抗性可藉由將該寡核苷酸培育在血清中或藉由使用核酸酶抗性檢定 (例如蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD)) 而判定，兩者均係本技術領域中已知者。能夠增強寡核苷酸的核酸酶抗性之核苷間鍵聯被稱為核酸酶抗性核苷間鍵聯。在一些實施例中，該寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的該等核苷間鍵聯係經修飾，該寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少 60%、例如至少 70%、例如至少 75%、例如至少 80%，或例如至少 90% 的該等核苷間鍵聯係經修飾。在某些實施例中，修飾範圍包括所述寡核苷酸的全部所述核苷間鍵聯或其連續核苷酸序列。應知在某些實施例中，將本發明之寡核苷酸連結至例如共軛體等非核苷酸功能基團的核苷可為磷酸二酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列的全部所述核苷間鍵聯皆為抗核酸酶核苷間鍵聯。

經修飾之核苷間鍵聯可選自包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯 (diphosphorothioate) 及硼烷磷酸酯 (boranophosphate) 之群組。在一些實施例中，該等經修飾之核苷間鍵聯與本發明之寡核苷酸的核糖核酸酶 H 召募相容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。

在一些實施例中，該核苷間鍵聯包含硫 (S)，例如硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

有利的是在本發明之寡核苷酸中使用硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

硫代磷酸酯核苷間鍵聯由於具有核酸酶抗性、優良藥物動力學且易於製造，因此特別適用。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少 60%，例如至少 70%，例如至少 75%，例如至少 80% 或例如至少 90% 的所述核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯。

在一些實施例中，除了二硫代磷酸酯鍵聯 (phosphorothioate linkage) 外，本發明之寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯及至少一個磷酸二酯鍵聯，諸如 2、3 或 4 個磷酸二酯鍵聯。在缺口體寡核苷酸中，磷酸二酯鍵聯 (當存在時) 係適當地不位於缺口區域 G 中的連續 DNA 核苷之間。

在一些實施例中，該寡核苷酸包含一個或多個中性核苷間鍵聯，特別是選自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、醯胺-3、甲縮醛或硫代甲縮醛的核苷間鍵聯。

進一步的核苷間鍵聯係揭示於 WO2009/124238 中 (以引用方式併入本文中)。在一實施例中，該核苷間鍵聯係選自揭示於 WO2007/031091 中之連接子 (以引用方式併入本文中)。特別是，該核苷間鍵聯可係選自 -O-P(O)₂ -O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)₂ -O-、-S-P(O)₂ -O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)₂ -O-、-O-P(O)₂ -S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)₂ -S-、-O-PO(R^H )-O-、O-PO(OCH₃ )-O-、-O-PO(NR^H )-O-、-O-PO(OCH₂ CH₂ S-R)-O-、-O-PO(BH₃ )-O-、-O-PO(NHR^H )-O-、-O-P(O)₂ -NRH-、-NR^H -P(O)₂ -O-、-NR^H -CO-O-、-NR^H -CO-NR^H -，及/或該核苷間連接子可係選自由下列所組成之群組：-O-CO-O-、-O-CO-NR^H -、-NR^H -CO-CH₂ -、-O-CH₂ -CO-NR^H -、-O-CH₂ -CH₂ -NR^H -、-CO-NR^H -CH₂ -、-CH₂ -NR^H CO-、-O-CH₂ -CH₂ -S-、-S-CH₂ -CH₂ -O-、-S-CH₂ -CH₂ -S-、-CH₂ -SO₂ -CH₂ -、-CH₂ -CO-NR^H -、-O-CH₂ -CH₂ -NR^H -CO -、-CH₂ -NCH₃ -O-CH₂ -，其中 R^H 係選自氫及 C1 -4-烷基。

核酸酶抗性鍵聯，諸如硫代磷酸酯鍵聯，特別可用於當與標靶核酸形成雙鏈體時能夠召募核酸酶的寡核苷酸區域，諸如缺口體的區域 G。然而，硫代磷酸酯鍵聯亦可用於非核酸酶召募區域及/或親和力增強區域，諸如缺口體之區域 F 和 F'。在一些實施例中，缺口體寡核苷酸可包含一個或多個磷酸二酯鍵聯於區域 F 或 F' 中、或區域 F 及 F' 兩者，其中區域 G 中的所有核苷間鍵聯可係硫代磷酸酯。

有利的是，所述寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯，或所述寡核苷酸的所有所述核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。 核鹼基

核鹼基一詞包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤 (例如腺嘌呤及鳥嘌呤) 和嘧啶 (例如脲嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，核鹼基一詞亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、脲嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變體。此類變體例如是 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 中所描述的變體。

在某些實施例中，該核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為經修飾之嘌呤或嘧啶而修飾，諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、2'硫胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。

所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可隨選包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自 A、T、G、C 及 5-甲基胞嘧啶。隨選的是，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 缺口體。 修飾寡核苷酸

修飾寡核苷酸一詞描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵聯的寡核苷酸。有些文獻中使用「嵌合寡核苷酸」一詞來描述具有修飾核苷的寡核苷酸。 互補性

「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對能力。瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對是鳥嘌呤 (G) - 胞嘧啶 (C) 及腺嘌呤 (A) - 胸腺嘧啶 (T)/脲嘧啶 (U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如 5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此互補性一詞包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對 (見例如 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。

本文所用的「% 互補」一詞係指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如標靶序列或序列模體) 互補的核苷酸所佔的比例 (百分比)，所述核酸分子橫跨所述連續核苷酸序列。互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補 (形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對) 的對齊核鹼基 (當對齊於標靶序列 5'-3' 及寡核苷酸序列 3'-5') 的數目，將該數字除以所述寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。應知在判定互補性時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5'-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。

「完全互補」一詞意指具有 100% 互補性。

下列是與標靶核酸完全互補的寡核苷酸實例。

下列是與標靶核酸 (SEQ ID NO：4) 完全互補的寡核苷酸 (SEQ ID NO：49) 實例。 5' gaaggttgaaatgagaattgatttgagttaaa 3' (SEQ ID NO：4) 3'                   actcttaactaaactcaatt   5' (SEQ ID NO：49) 相同度

本文所用的「相同度」一詞意指核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列中與參考序列 (例如序列模體) 完全相同的核苷酸所佔的比例 (百分比)，所述核酸分子橫跨所述連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列 (在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5'-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。 雜交

本文所用的「雜交」是指兩股核酸 (例如一股寡核苷酸及一股標靶核酸) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙鏈體。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (T_m ) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與標靶核酸形成雙鏈體時的溫度。在生理條件下，T_m 並非確實與親和力成比例 (Mergny 與 Lacroix, 2003 年，Oligonucleotides 13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (K_d ) 之間具有 ΔG°=-RTln(K_d ) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間反應的非常低的 ΔG° 體現所述寡核苷酸與標靶核酸之間的強勢雜交。ΔG° 是與含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 的反應關聯的能量。寡核苷酸與標靶核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的 ΔG° 小於零。ΔG° 可經由實驗來測量，例如，利用如 Hansen 等人 1965 年在 Chem. Comm. 36–38 及 Holdgate 等人 2005 年在 Drug Discov Today 中所描述的等溫滴定微量熱法 (ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在 Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460–1465 中所描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人於 1995 年在 Biochemistry 34:11211–11216 中及 McTigue 等人於 2004 年在 Biochemistry 43:5388–5405 中所描述的適當取得的熱動力學參數。為了能夠經由雜交調制本發明之寡核苷酸的預期核酸標靶，將長度為 10-30 個核苷酸的寡核苷酸以低於 -10 千卡的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在某些實施例中，所述寡核苷酸以 -10 至 -60 千卡，例如 -12 至 -40 千卡，例如自 -15 至 -30 千卡或 -16 至 -27 千卡，例如 -18 至 -25 千卡的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸。 標靶核酸

依據本發明，標靶核酸是編碼哺乳動物 Tau 的核酸且可為例如基因、RNA、mRNA 及前 mRNA、成熟 mRNA 或 cDNA 序列。因此，該標靶可因此稱為 Tau 標靶核酸或 MAPT 標靶核酸，這些用語可互換使用。本發明之寡核苷酸可例如靶定哺乳動物 MAPT 的外顯子區域，或可例如靶定 MAPT 前 mRNA 中的內含子區域 (見表 1)。 表 1. 人類 MAPT 外顯子與內含子

適合的是，該標靶核酸編碼 Tau 蛋白質，特別是哺乳動物 Tau，例如人類 Tau (見例如表 2 及表 3)，其提供用於人類及猴子 Tau 的前 mRNA 序列)。

在某些實施例中，該標靶核酸係選自由SEQ ID NO：1 及 2 所組成之群組或其自然產生變體 (例如編碼哺乳動物 Tau 蛋白質的序列)。若在研究或診斷中使用本發明之寡核苷酸，則該標靶核酸可係 cDNA 或源自 DNA 或 RNA 的合成核酸。

針對體內或體外應用方面，本發明之寡核苷酸係通常能夠在表現 MAPT 標靶核酸的細胞中抑制 Tau 蛋白質表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基的連續序列在整個寡核苷酸長度上測量的結果通常是與 MAPT 標靶核酸為互補，隨選的是有一個或兩個錯配的例外，且隨選的是不包含能將寡核苷酸連結至諸如共軛體等隨選官能基團或其他非互補末端核苷酸 (例如區域 D'或 D'') 的基於核苷酸之連接子區域。在某些實施例中，所述標靶核酸可為 RNA 或 DNA，例如信使 RNA，例如成熟 mRNA 或前 mRNA。

在某些實施例中，該標靶核酸是編碼哺乳動物 Tau 蛋白質的 RNA 或 DNA，諸如人類 Tau，例如人類 MAPT 前-mRNA 序列，諸如SEQ ID NO：1 所揭示者。表 2 及表 3 中提供有關例示標靶核酸的進一步資訊。

表 2.Tau 跨物種基因組及組裝資訊。

Fwd = 正向股。基因組座標提供前 mRNA 序列 (基因組序列)。NCBI 參考提供 mRNA 序列 (cDNA 序列)。 *美國國家生物技術資訊中心參考序列資料庫是全面的整合性非冗餘且註解完善的參考序列組，包括基因組、轉錄及蛋白質。其網址為 www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。 表 3.Tau/ MAPT 跨物種序列詳情。

標靶序列

本文所用的「標靶序列」一詞意指出現在標靶核酸中的核苷酸的一個序列，其包含與本發明之寡核苷酸為互補的核鹼基序列。在某些實施例中，所述標靶序列包含標靶核酸上的一個區域，所述區域的核鹼基序列與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列為互補。所述標靶核酸的此一區域也可互換地稱為標靶核苷酸序列、標靶序列或標靶區域。在某些實施例中，所述標靶序列比單一寡核苷酸的互補序列更長，且可能例如代表所述標靶核酸的較容易受本發明之數種寡核苷酸所標定的區域。

在一些實施例中，標靶序列係選自表 4 中任何區域的序列 (R_1 至 R_2254)。特別地，標靶序列可係選自由 R_223、R_738 或 R_1298 組成的區域組內的區域之一。

表 4.SEQ ID NO：1 上可使用本發明之寡核苷酸而靶定之區域 (reg.)

在一些實施例中，該標靶序列係選自人類 MAPT mRNA 內含子、諸如 Tau 人類 mRNA 內含子 1 或 2 的序列 (見上表 1)。

本發明之寡核苷酸包含與所述標靶核酸互補或雜交的連續核苷酸序列，例如本文所述的標靶序列。

與所述寡核苷酸互補或雜交的所述標靶序列通常包含具有至少 10 個核苷酸的連續核鹼基序列。該連續核苷酸序列係介於 10 至 100 個核苷酸，例如 12 至 60 個、例如 13 至 50 個、例如 14 至 30 個、例如 15 至 25 個、例如 16 至 20 個連續核苷酸。

在本發明之一個實施例中，該標靶序列係SEQ ID NO：3，其對應區域 A。在某些實施例中，該標靶序列係選自SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12111，諸如SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12079、位置 12085 至 12111 或位置 12060 至 12078。

在本發明之另一實施例中，該標靶序列係SEQ ID NO：4，其對應區域 B。在某些實施例中，該標靶序列係選自SEQ ID NO：1 的位置 39562 至 39593，諸如SEQ ID NO：1 的位置 39573 至 39592。

在本發明之另一實施例中，該標靶序列係SEQ ID NO：5，其對應區域 C。在某些實施例中，該標靶序列係選自SEQ ID NO：1 的位置 72837 至 72940，諸如SEQ ID NO：1 的位置 72861 至 72891 或SEQ ID NO：1 的位置 72862 至 72890。 標靶細胞

本文所用的「標靶細胞」一詞是指正在表現標靶核酸的細胞。在某些實施例中，所述標靶細胞可以是活體內或活體外的。在某些實施例中，所述標靶細胞是哺乳動物細胞，例如囓齒動物細胞，例如小鼠細胞或大鼠細胞，或靈長類動物細胞，例如猴子細胞或人類細胞。

在較佳實施例中，該標靶細胞表現 Tau mRNA，例如 Tau 前 mRNA 或 Tau 成熟 mRNA。Tau mRNA 的多 A 尾在反義寡核苷酸靶定上通常予以忽略。 自然產生變體

用語「自然產生變體 (naturally occurring variant)」係指與該標靶核酸源自相同基因座但可有差異的 MAPT 基因或轉錄本的變體，所述差異可例如是出於基因碼簡併造成多重密碼子編碼同一個胺基酸，或因前 mRNA 的選擇性剪接，或多態性的存在，諸如單核苷酸多態性 (SNP) 及等位基因變體。在與所述寡核苷酸有充分互補序列的條件下，本發明之寡核苷酸可因此標定標靶核酸及其自然產生變體。

在一些實施例中，所述自然產生變體與哺乳動物 MAPT 標靶核酸具有至少 95%、諸如至少 98% 或至少 99% 的同源性，諸如選自由SEQ ID NO：1 及 2 所組成之群組的標靶核酸。在某些實施例中，所述自然產生變體與SEQ ID NO：1 的人類 MAPT 標靶核酸具有至少 99% 的同源性。 表現的調制

如本文中所使用的用語「表現的調制 (modulation of expression)」是一個總體用語，用以描述與投予寡核苷酸前的 Tau 量相較之下，所述寡核苷酸改變 Tau 量的能力。或者，表現的調制可參照對照組實驗進行判定。如普遍所知，對照組是以鹽水組成物處置的個體或標靶細胞，或是以非標定寡核苷酸 (仿製品) 處置的個體或標靶細胞。

有一類型的調制是寡核苷酸抑制、調降、減少、減制、去除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止 Tau 表現的能力，例如藉由降解 mRNA 或阻斷轉錄。另一類型的調制是寡核苷酸的恢復、增加或增強 Tau 表現的能力，例如，藉由修復剪接位點或防止剪接或去除或阻斷抑制機制諸如微小 RNA 壓抑。 高親和力修飾核苷

高親和力修飾核苷是一種修飾核苷，當併入所述寡核苷酸中時，可提升所述寡核苷酸對其互補標靶的親和力，例如以融化溫度 (T^m ) 所測定者。本發明之高親和力修飾核苷較佳的是造成每一修飾核苷的融化溫度增加 +0.5 至 +12℃，更佳的是 +1.5 至 +10℃，最佳的是 +3 至 +8℃。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力修飾核苷，包括例如許多 2' 取代核苷以及鎖核酸 (LNA) (見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。 糖修飾

本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。

目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。

這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋的雙環 (LNA)，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO2011/017521) 或三環核酸 (WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。

糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2'-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2'、3'、4' 或 5'位置導入。 2' 糖修飾核苷

2' 糖修飾核苷是在 2' 位置 (2' 取代核苷) 具有非 H 或 –OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2' 碳與第二碳之間形成架橋的 2' 連結雙自由基的核苷，例如 LNA (2' – 4' 雙自由基架橋) 核苷。

更確切地，2' 糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多 2' 取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2' 修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2' 取代修飾核苷的實例包括 2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA 及 2'-F-ANA 核苷。更多實例請參看例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 以及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2' 取代修飾核苷的圖解。

在本發明中，2' 取代糖修飾核苷並不包括 2' 橋接核苷，如 LNA。 鎖核酸核苷 (LNA 核苷)

「LNA 核苷」是一種 2'-糖修飾之核苷，其包含連結所述核苷的核糖環之 C2' 與 C4' 的雙自由基 (此雙自由基亦稱為「2' - 4' 橋 (2'- 4' bridge)」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙鏈體穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙鏈體的融化溫度，可對此進行常規的判定。

非限制性地，例示 LNA 核苷已於 WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita 等人，Bioorganic & Med.Chem.Lett.12, 73-76,      Seth 等人 J. Org. Chem.2010, Vol 75(5) pp. 1569-81, Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238 以及 Wan 與 Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667 中揭露。

2'-4' 橋包含 2 至 4 個橋接原子，特別是式 -X-Y-，其中 X 係  氧、硫、-CR^a R^b -、-C(R^a )=C(R^b )‑、-C(=CR^a R^b )-、-C(R^a )=N‑、-Si(R^a )₂ -、-SO₂ -、-NR^a -；-O-NR^a -、-NR^a -O-、-C(=J)-、Se、-O-NR^a -、-NR^a -CR^a R^b -、-N(R^a )-O- 或 -O-CR^a R^b -； Y 係  氧、硫、-(CR^a R^b )_n -、-CR^a R^b -O-CR^a R^b -、-C(R^a )=C(R^b )‑、-C(R^a )=N‑、-Si(R^a )₂ -、-SO₂ -、-NR^a -、-C(=J)-、Se、-O-NR^a -、-NR^a -CR^a R^b -、-N(R^a )-O- 或 -O-CR^a R^b -； 惟 -X-Y- 不為 -O-O-、Si(R^a )₂ -Si(R^a )₂ -、-SO₂ -SO₂ -、-C(R^a )=C(R^b )-C(R^a )=C(R^b )、-C(R^a )=N-C(R^a )=N-、-C(R^a )=N-C(R^a )=C(R^b )、-C(R^a )=C(R^b )-C(R^a )=N- 或 -Se-Se-； J 係   氧、硫、=CH₂ 或 =N(R^a )； R^a 及 R^b 係獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫代羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、脲基、烷醯基氧基 (alkanoyloxy)、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基氫硫基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、 -OC(=X^a )R^c 、-OC(=X^a )NR^c R^d 及 -NR^e C(=X^a )NR^c R^d ； 或兩個成對 R^a 及 R^b 一起形成隨選之經取代之亞甲基； 或兩個成對 R^a 及 R^b 與彼等接附之碳原子一起形成環烷基或鹵環烷基，僅與一個碳原子鹵環烷基 (-X-Y- 之僅一個碳原子)； 其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基和經取代之亞甲基係經 1 至 3 個取代基所取代之烷基、烯基、炔基和亞甲基，所述取代基獨立地選自鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基和雜芳基； X^a 係 氧、硫或 -NR^c ； R^c 、R^d 及 R^e 係獨立地選自氫及烷基；及 n 係   1、2 或 3。

在本發明之另一具體實施例中，X 係氧、硫、-NR^a -、-CR^a R^b - 或 -C(=CR^a R^b )-，特別是氧、硫、-NH-、-CH₂ - 或 -C(=CH₂ )-，更特別是氧。

在本發明之另一具體實施例中，Y 係 -CR^a R^b -、-CR^a R^b -CR^a R^b - 或 -CR^a R^b- CR^a R^b- CR^a R^b -、特定言之-CH₂ -CHCH₃ -、-CHCH₃ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ - 或 -CH₂ -CH₂ -CH₂ -。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-(CR^a R^b )_n -、-S-CR^a R^b -、-N(R^a )CR^a R^b -、-CR^a R^b -CR^a R^b -、-O-CR^a R^b -O-CR^a R^b -、-CR^a R^b -O-CR^a R^b -、-C(=CR^a R^b )-CR^a R^b -、-N(R^a )CR^a R^b -、-O-N(R^a )-CR^a R^b - 或 -N(R^a )-O-CR^a R^b -。

在本發明之一具體實施例中，R^a 及 R^b 係獨立地選自由氫、鹵素、羥基、烷基、及烷氧基烷基、特別是氫、鹵素、烷基、及烷氧基烷基所組成之群組。

在本發明之另一實施例中，R^a 及 R^b 係獨立地選自由氫、氟基、羥基、甲基及 -CH₂ -O-CH₃ 、特別是氫、氟基、甲基及 -CH₂ -O-CH₃ 所組成之群組。

有利的是，-X-Y- 之 R^a 及 R^b 中之一者係如上所定義，並且其他者均同時係氫。

在本發明之另一具體實施例中，R^a 係氫或烷基、特別是氫或甲基。

在本發明之另一具體實施例中，R^b 係氫或烷基，特別是氫或甲基。

在本發明之一具體實施例中，R^a 及 R^b 中之一者或二者係氫。

在本發明之一具體實施例中，R^a 及 R^b 中僅一者係氫。

在本發明之一具體實施例中，R^a 及 R^b 中一者係甲基，且另一者係氫。

在本發明之一具體實施例中，R^a 及 R^b 兩者均同時係甲基。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH₂ -、-S-CH₂ -、-S-CH(CH₃ )-、-NH-CH₂ -、-O-CH₂ CH₂ -、-O-CH(CH₂ -O-CH₃ )-、-O-CH(CH₂ CH₃ )-、-O-CH(CH₃ )-、-O-CH_2- O-CH₂ -、-O-CH₂ -O-CH₂ -、-CH₂ -O-CH₂ -、-C(=CH₂ )CH₂ -、-C(=CH₂ )CH(CH₃ )-、-N(OCH₃ )CH₂ - 或 -N(CH₃ )CH₂ -；

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CR^a R^b -，其中 R^a 及 R^b 係獨立地選自由氫、烷基及烷氧基烷基、特別是氫、甲基及 -CH₂ -O-CH₃ 所組成之群組。

在一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH₂ - 或 -O-CH(CH₃ )-，特定言之-O-CH₂ -。

2'-4' 橋可位於核糖環平面下方 (β-D-構型)，或位於環平面上方 (α-L-構型)，如式 (A) 和式 (B) 分別所繪示。

根據本發明之 LNA 核苷特定言之係式 (A) 或 (B) 者

其中 W 係 氧、硫、-N(R^a )- 或 -CR^a R^b -特別是氧； B 係  核鹼基或經修飾之核鹼基； Z 係  核苷間鍵聯至相鄰核苷或 5'-端基團； Z* 係     核苷間鍵聯至相鄰核苷或 3'-端基團； R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 係獨立地選自氫、鹵素、烷基、鹵烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烷氧基烷基、疊氮基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基及芳基；及 X、Y、R^a 及 R^b 係如上所定義。

在一具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^a 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在另一具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^b 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在一進一步具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^a 及 R^b 中之一者或二者係氫。在一具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^a 及 R^b 中僅一者係氫。在一具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^a 及 R^b 中一者係甲基，且另一者係氫。在一具體實施例中，在 -X-Y- 之定義中，R^a 及 R^b 兩者均同時係甲基。

在一進一步具體實施例中，在 X 之定義中，R^a 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在另一具體實施例中，在 X 之定義中，R^b 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在一具體實施例中，在 X 之定義中，R^a 及 R^b 中之一者或二者係氫。在一具體實施例中，在 X 之定義中，R^a 及 R^b 中僅一者係氫。在一具體實施例中，在 X 之定義中，R^a 及 R^b 中一者係甲基，且另一者係氫。在一具體實施例中，在 X 之定義中，R^a 及 R^b 兩者均同時係甲基。

在一進一步具體實施例中，在 Y 之定義中，R^a 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在另一具體實施例中，在 Y 之定義中，R^b 係氫或烷基，特別是氫或甲基。在一具體實施例中，在 Y 之定義中，R^a 及 R^b 中之一者或二者係氫。在一具體實施例中，在 Y 之定義中，R^a 及 R^b 中僅一者係氫。在一具體實施例中，在 Y 之定義中，R^a 及 R^b 中一者係甲基，且另一者係氫。在一具體實施例中，在 Y 之定義中，R^a 及 R^b 兩者均同時係甲基。

在本發明之一具體實施例中，R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 係獨立地選自氫和烷基，特別是氫和甲基。

在本發明之另一具體實施例中，R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 同時均係氫。

在本發明之另一具體實施例中，R¹ 、R² 、R³ 同時均係氫，R⁵ 及 R^5* 中之一者係氫，且另一者係如上定義，特定言之係烷基，更特定言之係甲基。

在本發明之一具體實施例中，R⁵ 及 R^5* 係獨立地選自氫、鹵素、烷基、烷氧基烷基及疊氮基，特別是選自氫、氟、甲基、甲氧基乙基及疊氮基。在本發明之特別有利之實施例中，R⁵ 及 R^5* 中之一者係氫，且另一者係烷基，特別是甲基、鹵素，特別是氟、烷氧基烷基，特別是甲氧基乙基、或疊氮基；或者 R⁵ 及 R^5* 兩者同時係氫或鹵素，特別是兩者同時係氫或氟。在此等特定實施例中，W 可有利地係氧，且 -X-Y- 有利地係 -O-CH₂ -。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH₂ -，W 係氧及 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 LNA 核苷係揭示於 WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352 和 WO 2004/046160，彼等在此均以引用方式併入，且包括本技術領域中通常已知的β-D-氧基 LNA 及 α-L-氧基 LNA 核苷。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -S-CH₂ -，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等硫代 LNA 核苷係揭示於 WO 99/014226 及 WO 2004/046160，彼等已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -NH-CH₂ -，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等胺基 LNA 核苷係揭示於 WO 99/014226 及 WO 2004/046160，彼等已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH₂ CH₂ - 或 -OCH₂ CH₂ CH₂ -，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 LNA 核苷係揭示於 WO 00/047599 和 Morita 等人，Bioorganic & Med.Chem.Lett.12，73-76，彼等已以引用方式併入本文中，且包括本技術領域中通常已知之如 2'-O-4'C-伸乙基橋接核酸 (2'-O-4'C-ethylene bridged nucleic acid) (ENA)。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH₂ -，W 係氧，R¹ 、R² 、R³ 同時均係氫，R⁵ 及 R^5* 中之一者係氫，且另一者不是氫，諸如烷基，例如甲基。此等經 5' 取代之LAN核苷係揭示於 WO 2007/134181，其已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CR^a R^b -，其中 R^a 及 R^b 中之一者或兩者不是氫，特定言之為烷基，諸如甲基，W 是氧，R¹ 、R² 、R³ 同時均係氫，R⁵ 及 R^5* 中之一者係氫，且另一者不是氫，特定言之為烷基，例如甲基。此等雙修飾之 LNA 核苷揭示於 WO 2010/077578，其已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CHR^a -，W 係氧，且R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 6' 取代之 LNA 核苷揭示於 WO 2010/036698 及 WO 2007/090071，彼等兩者均已以引用方式併入本文中。在此等 6'-取代之 LNA 核苷中，R^a 特定言之為C₁ -C₆ 烷基，諸如甲基。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係-O-CH(CH₂ -O-CH₃ )- (「2' O-methoxyethyl bicyclic nucleic acid」，Seth等人 ，J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81)。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH(CH₂ CH₃ )- (「2' O-ethyl bicyclic nucleic acid」，Seth等人 ，J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81)。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH(CH₂ -O-CH₃ )-，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 LNA 核苷在本技術領域中也稱為環狀 MOE (cMOE) 並且揭示於 WO 2007/090071。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH(CH₃ )-。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH_2- O-CH₂ - (同上之 Seth等人 ，J. Org.Chem 2010)。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CH(CH₃ )-，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 6'-甲基 LNA 核苷在本技術領域中也稱為 cET 核苷，並且可係 (S)-cET 或 (R)-cET 非鏡像異構物，如 WO 2007/090071 (β-D) 及 WO 2010/036698 (α-L)中所揭示，彼等兩者均已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CR^a R^b -，其中 R^a 及 R^b 均不係氫，W 係氧，且R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。在一具體實施例中，R^a 及 R^b 兩者均係烷基，特別是兩者同時係甲基。此等經 6'-二-取代之 LNA 核苷係揭示於 WO 2009/006478，其已以引用方式併入本文中。

在本發明之另一具體實施例中，-X-Y- 係 -S-CHR^a -，W 係氧，且R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。此等 6'-取代之硫代 LNA 核苷係揭示於 WO 2011/156202，其已以引用方式併入本文中。在此 6'-取代之硫代 LNA 之一具體實施例中，R^a 係烷基，特別是甲基。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -C(=CH₂ )C(R^a R^b )-、-C(=CHF)C(R^a R^b )- 或 -C(=CF₂ )C(R^a R^b )-，W 係氧且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 同時均係氫。R^a 及 R^b 有利的係獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別是氫、甲基、氟基及甲氧基甲基。R^a 及 R^b 特別同時係氫或甲基，或 R^a 及 R^b 中之一者係氫，且另一者係甲基。此等乙烯基碳 LNA 核苷 (vinyl carbo LNA nucleoside) 係揭示於 WO 2008/154401 及 WO 2009/067647，彼等兩者均已以引用方式併入本文中。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -N(OR^a )-CH₂ -，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。在一具體實施例中，R^a 係烷基，諸如甲基。此等 LNA 核苷也稱為 N 取代之 LNA，且揭示於 WO 2008/150729，其已以引用方式併入本文中。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-N(R^a )-、-N(R^a )-O-、-NR^a -CR^a R^b -CR^a R^b - 或 -NR^a -CR^a R^b -，W 係氧，且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 同時均係氫。R^a 及 R^b 有利的係獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別是氫、甲基、氟基及甲氧基甲基。在一具體實施例中，R^a 係烷基，諸如甲基，R^b 係氫或甲基，特別是氫。(同上之 Seth等人 ，J. OrgChem 2010)。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-N(CH₃ )- (同上之 Seth 等人，J. Org.Chem 2010)。

在本發明之一具體實施例中，R⁵ 及 R^5* 兩者均同時係氫。在本發明之另一具體實施例中，R⁵ 及 R^5* 中之一者係氫，且另一者係烷基，諸如甲基。在此等實施例中，R¹ 、R² 及 R³ 特定言之係氫且 -X-Y- 特定言之係 -O-CH₂ - 或 -O-CHC(R^a )₃ -，諸如 -O-CH(CH₃ )-。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -CR^a R^b -O-CR^a R^b -，諸如 -CH₂ -O-CH₂ -，W 係氧且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。在此等具體實施例中，R^a 可係烷基，諸如甲基，R^b 係氫或甲基，特定言之係氫。此等 LNA 核苷也稱為構形上限制之核苷酸 (conformationally restricted nucleotide) (CRN)，且係揭示於 WO 2013/036868，其已以引用方式併入本文中。

在本發明之一具體實施例中，-X-Y- 係 -O-CR^a R^b -O-CR^a R^b -，諸如 -O-CH₂ -O-CH₂ -，W 係氧且 R¹ 、R² 、R³ 、R⁵ 及 R^5* 均同時係氫。R^a 及 R^b 有利的係獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別是氫、甲基、氟基及甲氧基甲基。在此具體實施例中，R^a 特定言之係烷基，諸如甲基，R^b 係氫或甲基，特定言之係氫。此等 LNA 核苷也稱為 COC 核苷酸，且係揭示於 Mitsuoka 等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238，其已以引用方式併入本文中。

除非另有說明，否則將理解的是 LNA 核苷可係 β-D 或 α-L 立體異構體。

本發明之 LNA 核苷的具體實例係呈現於方案 1 (其中 B 係如上所定義)。

特別的 LNA 核苷為 β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基 LNA，諸如 (S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET) 及 ENA。

如果本發明之起始原料或化合物之一者含有一個或多個在一個或多個反應步驟的反應條件下不穩定或具有反應性的官能基，則適當的保護基 (如 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York 之「Protective Groups in Organic Chemistry」中所述) 可在應用本技術領域中所熟知方法之關鍵步驟之前引入。可使用文獻中描述的標準方法在合成的後期除去此等保護基。保護基的實例係三級丁氧基羰基 (Boc)、9-茀基甲基胺甲酸酯 (Fmoc)、2-三甲基甲矽基乙基胺甲酸酯 (Teoc)、芐氧羰基 (carbobenzyloxy) (Cbz) 及對甲氧基芐氧基羰基 (Moz)。

本文所述的化合物可包含數個非對稱中心，且其形式可為純對映體、對映體的混合物例如外消旋物、非鏡像異構體的混合物、非鏡像異構外消旋物或非鏡像異構外消旋物的混合物。

「非對稱碳原子」一詞意指具有四個不同取代基的碳原子。依據 Cahn-Ingold-Prelog 序列法則，非對稱碳原子可為「R」或「S」組態。 化學基團定義

在本說明書中，用語「烷基」、單獨或組合下，表示具有 1 至 8 個碳原子的直鏈或支鏈烷基，特別是具有 1 至 6 個碳原子的直鏈或支鏈烷基、且更特別是具有 1 至 4 個碳原子的直鏈或支鏈烷基。直鏈及支鏈 C₁ -C₈ 烷基的實例是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、三級丁基、異構戊基、異構己基、異構庚基和異構辛基，特別是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的具體實例是甲基、乙基和丙基。

用語「環烷基」、單獨或組合下，表示具有 3 至 8 個碳原子的、特別是具有 3 至 6 個碳原子的環烷基環。環烷基的實例是環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基和環辛基，更具體地是環丙基和環丁基。「環烷基」的具體實例是環丙基。

用語「烷氧基」、單獨或組合下，表示式烷基-O- 的基團，其中用語「烷基」具有先前給出的含義，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、二級丁氧基和三級丁氧基。特別的「烷氧基」是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是「烷氧基烷氧基」的特定實例。

用語「氧基」、單獨或組合下，表示 -O- 基團。

用語「烯基」、單獨或組合下，表示包含烯鍵和達至 8 個、較佳的是達至 6 個、特佳的是達至 4 個碳原子的直鏈或支鏈烴殘基。烯基的實例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和異丁烯基。

用語「炔基」、單獨或組合下，表示包含參鍵和達至 8 個、較佳的是達至 6 個、特佳的是達至 4 個碳原子的直鏈或支鏈烴殘基。

用語「鹵素」或「鹵基」、單獨或組合下，表示氟、氯、溴或碘，且特別是氟、氯或溴，更特別是氟。用語「鹵基」與另一基團組合，表示用至少一個鹵素取代該基團，特別是經一個至五個鹵素取代，特別是一個至四個鹵素，即一個、兩個、三個或四個鹵素。

用語「鹵烷基」、單獨或組合下，表示經至少一個鹵素取代的烷基，特別是經一個至五個鹵素取代，特別是一個至三個鹵素。鹵烷基的實例包括單氟-、二氟- 或三氟-甲基、-乙基或 -丙基，例如 3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。氟甲基、二氟甲基和三氟甲基係特定之「鹵烷基」。

用語「鹵環烷基」、單獨或組合下，表示經至少一個鹵素取代的如上定義之環烷基，特別是經一個至五個鹵素取代，特別是一個至三個鹵素。「鹵環烷基」的具體實例是鹵環丙基，特別是氟環丙基、二氟環丙基和三氟環丙基。

用語「羥基 (hydroxyl 及 hydroxy)」、單獨或組合下，表示 -OH 基團。

用語「硫代羥基或巰基 (thiohydroxyl 及 thiohydroxy)」、單獨或組合下，表示 -SH 基團。

用語「羰基」、單獨或組合下，表示 -C(O)- 基團。

用語「羧基 (carboxy 或 carboxyl)」、單獨或組合下，表示 -COOH 基團。

用語「胺基」、單獨或組合下，表示一級胺基 (-NH₂ )、二級胺基 (-NH-)、或三級胺基 (-N-)。

用語「烷基胺基」、單獨或組合下，表示經如上定義的一個或兩個烷基取代的如上定義的胺基。

用語「磺醯基」、單獨或組合下，表示 -SO₂ 基團。

用語「亞磺醯基」、單獨或組合下，表示 -SO- 基團。

用語「硫基 (sulfanyl)」、單獨或組合下，表示 -S- 基團。

用語「氰基」、單獨或組合下，表示 -CN- 基團。

用語「疊氮基」、單獨或組合下，表示 -N₃ 基團。

用語「硝基」、單獨或組合下，表示 NO₂ 基團。

用語「甲醯基」、單獨或組合下，表示 -C(O)H 基團。

用語「胺甲醯基」、單獨或組合下，表示 -C(O)NH₂ 基團。

用語「脲基」、單獨或組合下，表示 -NH-C(O)-NH₂ 基團。

用語「芳基」、單獨或組合下，表示包含 6 至 10 個碳環原子的單價芳族碳環單環或雙環系統，任選地經 1 至 3 個獨立地選自鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲醯基的取代基取代。芳基的實例包括苯基和萘基，特別是苯基。

用語「雜芳基」、單獨或組合下，表示具有 5 至 12 個環原子的單價芳族雜環單環或雙環系統，包含 1、2、3 或 4 個選自 N、O 和 S 的雜原子，其餘環原子是碳，任選地經 1 至 3 個獨立地選自鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲醯基的取代基取代。雜芳基的實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嗒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮呯基、二氮呯基、異噁唑基、苯並呋喃基、異噻唑基、苯並噻吩基、吲哚基、異吲哚基、異苯並呋喃基、苯並咪唑基、苯並噁唑基、苯並異噁唑基、苯並噻唑基、苯並異噻唑基、苯並噁二唑基、苯並噻二唑基、苯並三唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、咔唑基或吖啶基。

用語「雜環基」、單獨或組合下，表示 4 至 12 個、特定言之4 至 9 個環原子的單價飽和或部分不飽和的單環或雙環環系，其包含 1 個、2 個、3 個或 4 個選自 N、O 和 S 的雜原子，其餘環原子是碳，任選地經 1 個至 3 個獨立地選自鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基和甲醯基的取代基取代。單環飽和雜環基的實例是四氫氮唉基、吡咯啶基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡唑啶基、咪唑啶基、噁唑啶基、異噁唑啶基、四氫噻唑基、哌啶基、四氫哌喃基、四氫噻喃基、哌嗪基、嗎福林基、硫代嗎福林基、1,1-二側氧基-硫代嗎福林-4-基、氮雜環庚烷基、二氮雜環庚烷基、升哌嗪基、或氧雜氮雜環庚烷基。雙環飽和雜環烷基的實例是 8-氮-雙環[3.2.1]辛基、

啶基，8-氧-3-氮-雙環[3.2.1]辛基、9-氮-雙環[3.3.1]壬基、3-氧-9-氮-雙環[3.3.1]壬基、或 3-硫-9-氮-雙環[3.3.1]壬基。部分不飽和雜環烷基的實例是二氫呋喃基、咪唑啉基、二氫噁唑基、四氫吡啶基或二氫哌喃基。 醫藥上可接受之鹽

「醫藥上可接受之鹽」一詞意指保有生物效應及自由鹼或自由酸特性，且並非在生物上或在其他方面有不利之處的鹽。鹽 (類) 係以與無機酸形成，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，特別是鹽酸，和有機酸，諸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯半胱胺酸。此外，這些鹽可從加入無機鹼或有機鹼至游離酸來製備。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於一級胺、二級胺、和三級胺的鹽，經取代之胺，包括天然存在的經取代之胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多胺樹脂。式 (I) 化合物也可以兩性離子的形式存在。特佳的式 (I) 化合物的醫藥上可接受之鹽是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的鹽。 保護基

「保護基」一詞在單獨或結合使用時，代表一個能夠選擇性鎖住多功能化合物中的反應位置，而使化學反應可選擇性地在另一個未受保護的反應位置進行的基團。保護基可以去除。例示保護基為胺基保護基、羧基保護基或羥基保護基。 核酸酶中介降解

核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙鏈體時，居中影響所述序列的降解。

在某些實施例中，所述寡核苷酸可經由所述標靶核酸的核酸酶中介降解而發揮作用，在其中，本發明之寡核苷酸能夠召募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳的是核糖核酸酶 (RNase)，例如核糖核酸酶 H。在經由核酸酶中介機轉而運作的寡核苷酸設計實例中，所述寡核苷酸通常包含一個長度為至少 5 或 6 個連續 DNA 核苷的區域，且在所述區域的一側或兩側上側接有親和力提升型核苷，例如缺口體、頭聚物及尾聚物。 核糖核酸酶 H 活性與招募

反義寡核苷酸的核糖核酸酶 H 活性是指當其與互補 RNA 分子在雙鏈體中時，招募核糖核酸酶 H 的能力。WO01/23613 提供判定核糖核酸酶 H 活性的體外方法，可用於判定召募核糖核酸酶 H 的能力。以具有與受測修飾寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中的全部單體之間僅包含具有硫代磷酸酯鍵聯的 DNA 單體的寡核苷酸為基準，使用 WO01/23613 (經參照併入於此) 提供的實例 91 至實例 95 所描述的方法，以皮莫耳/公升/分鐘 (pmol/l/min) 為單位判定初始速率，如果一寡核苷酸與互補標靶核酸序列反應的初始速率為上述基準初始速率的至少 5%，例如至少 10% 或超過 20%，則通常認為所述寡核苷酸能夠召募核糖核酸酶 H。在判定核糖核酸酶 H 活性時可使用瑞士琉森 Lubio Science GmbH 的重組型人類核糖核酸酶 H1。 缺口體

本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可為一缺口體，亦稱為缺口體寡核苷酸或缺口體設計。反義缺口體常用於透過核糖核酸酶 H 中介降解來抑制標靶核酸。一個缺口體寡核苷酸包含至少三個有區別的結構區域，也就是一個 5'-側翼、一個缺口和一個 3'-側翼，F-G-F' 為 ‘5 -＞ 3' 方向。所述「缺口」區域 (G) 包含一段讓寡核苷酸能夠召募核糖核酸酶 H 的連續 DNA 核苷酸。所述缺口區域側接包含一個或多個糖修飾核苷的 5' 側翼區域 (F)，有利的是高親和力糖修飾核苷，且側接包含一個或多個糖修飾核苷的 3' 側翼區域 (F')，有利的是高親和力糖修飾核苷。區域 F 及 F' 中的一個或多個糖修飾核苷可提升寡核苷酸對於標靶核酸的親和力 (亦即其為親和力提升型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域 F 及 F' 中的一個或多個糖修飾核苷是 2' 糖修飾核苷，例如高親和力 2' 糖修飾，例如獨立選自 LNA 及 2'-MOE。

在缺口體設計中，缺口區域的 5' 及 3' 多數核苷為 DNA 核苷，且位置分別鄰近 5' (F) 或 3' (F') 區域的糖修飾核苷。所述側翼可進一步定義為在距離所述缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，也就是在 5' 側翼的 5' 端及在 3' 側翼的 3' 端。

區域 F-G-F' 形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式 F-G-F' 的缺口體區域。

所述缺口體設計 F-G-F' 的整體長度可為，例如 12 至 32 個核苷，諸如 13 至 24 個，諸如 14 至 22 個核苷，諸如 14 至 17 個，諸如 16 至 18 個核苷，諸如 16 至 20 個核苷。

舉例而言，本發明之缺口體寡核苷酸可由下式代表： F_1-8 -G_6-16 -F'_2-8 ，例如 F_2-8 -G_6-14 -F'_2-8 ，諸如 F_3-8 -G_6-14 -F'_2-8

附帶條件是所述缺口體區域 F-G-F' 的整體長度為至少 10 個、諸如至少 12 個、諸如至少 14 個核苷酸。

在本發明之態樣中，該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列由式 5'-F-G-F'-3' 之缺口體組成或包含式 5'-F-G-F'-3' 之缺口體，其中區域 F 及 F' 獨立地包含 1 個至 8 個核苷或由 1 個至 8 個核苷組成，其中 2 個至 4 個係經 2' 糖修飾且界定該 F 及 F' 區域之 5' 及 3' 端，且 G 係能夠召募核糖核酸酶 H 的介於 6 個與 16 個核苷之間之區域。

區域 F、G 和 F' 係進一步定義如下，並且可結合到 F-G-F' 式中。 缺口體-區域 G

缺口體的區域 G (缺口區域) 是使得寡核苷酸能夠召募核糖核酸酶 H、諸如人核糖核酸酶 H1 的核苷 (通常是 DNA 核苷) 之區域。核糖核酸酶 H 是一種細胞酶，可識別 DNA 和 RNA 之間的雙鏈體，並酶促 RNA 分子裂解。適當的缺口體可具有至少 5 或 6 個連續 DNA 核苷的缺口區域 (G)，諸如 5-16 個連續 DNA 核苷，諸如 6-15 個連續 DNA 核苷，諸如 7-14 個連續 DNA 核苷，諸如 8-12 個連續 DNA 核苷，諸如長度為 8-12 個連續 DNA 核苷。在一些實施例中，缺口區域 G 可由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續 DNA 核苷組成。缺口區域中的胞嘧啶 (C) DNA 在某些情況下可以是甲基化的，這些殘基或者註解為 5'-甲基-胞嘧啶 (^me C 或用 e 而不是 c)。如果 cg 二核苷酸存在於缺口中以減少潛在毒性，則缺口中胞嘧啶 DNA 的甲基化是有利的，該修飾對寡核苷酸的功效沒有顯著影響。據報導，5' 取代的 DNA 核苷，諸如 5' 甲基 DNA 核苷用於 DNA 缺口區域 (EP 2 742 136)。

在一些實施例中，缺口區域 G 可由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續硫代磷酸酯連接的 DNA 核苷組成。在一些實施例中，缺口中的所有核苷間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。

雖然傳統的缺口體具有 DNA 缺口區域，但是有許多經修飾之核苷的例子，當它們用於缺口區域內時允許核糖核酸酶 H 召募。已報導當包含在缺口區域內時能夠召募核糖核酸酶 H 的經修飾之核苷包括例如 α-L-LNA、C4' 烷基化 DNA (如 PCT/EP2009/050349 和 Vester等人 ，Bioorg. Med. Chem. Lett.18 (2008) 2296 – 2300，兩者均以引用方式併入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷如 ANA 和 2'F-ANA (Mangos 等人，2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (解鎖核酸 (unlocked nucleic acid)) (如 Fluiter 等人，Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 所述，其以引用方式併入本文)。UNA 是解鎖核酸，通常其中核糖的 C2 和 C3 之間的鍵已被除去，形成解鎖的「糖」殘基。在這種缺口體中使用的修飾核苷可係當引入缺口區域時採用 2' 內 (類 DNA) 結構 (2' endo (DNA like) structure) 的核苷，即 允許核糖核酸酶 H 召募的修飾。在一些實施例中，本文所述的 DNA 缺口區域 (G) 可任選地含有 1 至 3 個糖修飾的核苷，其在引入缺口區域時採用 2' 內 (類 DNA) 結構。 區域 G - 「缺口-中斷者 (Gap-breaker)」

或者，有許多關於插入修飾核苷的報導，其賦予缺口體的缺口區域 3' 內構形，同時保留一些核糖核酸酶 H 活性。具有包含一個或多個 3' 內修飾的核苷的缺口區域的這種缺口體被稱為「缺口中斷者 (gap-breaker)」或「經缺口中斷(之) (gap-disrupted)」缺口體，參見例如 WO2013/022984。缺口中斷者寡核苷酸在缺口區域內保留足夠的 DNA 核苷區域以允許核糖核酸酶 H 召募。缺口中斷者寡核苷酸設計以召募核糖核酸酶 H 的能力通常是序列甚至化合物特異性-參見 Rukov 等人，2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487，其揭示「缺口中斷者」寡核苷酸，其召募在一些情況下提供標靶 RNA 的更特異性裂解核糖核酸酶 H。在缺口中斷者寡核苷酸的缺口區域內使用的修飾核苷可例如係賦予 3' 內構形之修飾核苷，例如 2'-O-甲基 (OMe) 或 2'-O-MOE (MOE) 核苷，或 β-D LNA 核苷 (核苷的核糖環的 C2' 和 C4' 之間的橋是 β 構形)，諸如 β-D-氧基 LNA 或 ScET 核苷。

與上述含有區域 G 的缺口體一樣，缺口中斷者或缺口破壞中斷缺口體的缺口區域在缺口的 5' 端 (鄰近區域 F 區 3' 核苷) 具有 DNA 核苷，及在缺口的 3' 端 (鄰近區域 F' 的 5' 核苷) 具有 DNA 核苷。包含中斷缺口的缺口體通常在缺口區的 5' 端或 3' 端保留至少 3 或 4 個連續 DNA 核苷的區域。

缺口中斷者寡核苷酸的示例性設計包括 F_1-8 -[D_3-4 -E₁ - D_3-4 ]_- F'_1-8 F_1-8 - [D_1-4 -E₁ - D_3-4 ]-F'_1-8 F_1-8 - [D_3-4 -E₁ - D_1-4 ]-F'_1-8

其中區域 G 在括號 [D_n -E_r - D_m ] 內，D 是 DNA 核苷的連續序列，E 是修飾核苷 (缺口中斷者或缺口中斷核苷)，且 F 和 F' 是如本文所定義之側翼區域，且惟缺口體區域 F-G-F' 的整體長度為至少 12、諸如長度為至少 14 個核苷酸。

在一些實施例中，缺口中斷缺口體的區域 G 包含至少 6 個 DNA 核苷，諸如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個 DNA 核苷。如上所述，DNA 核苷可係連續或可任選地散佈有一個或多個經修飾核苷，惟缺口區 G 能夠介導核糖核酸酶 H 召募。 缺口體 - 側翼區域，F 及 F'

區域 F 緊鄰區域 G 的 5' DNA 核苷。區域 F 的最 3' 核苷是糖修飾核苷，諸如高親和力糖修飾的核苷，例如 2' 取代核苷，諸如 MOE 核苷或 LNA 核苷。

區域 F' 緊鄰區域 G 的 3' DNA 核苷。區域 F' 的最 5' 核苷是糖修飾核苷，諸如高親和力糖修飾的核苷，例如 2' 取代核苷，諸如 MOE 核苷或 LNA 核苷。

區域 F 長度為 1-8 個連續核苷酸，諸如長度為 2-6 個、諸如 3-4 個連續核苷酸。有利地，區域 F 的最 5' 核苷是糖修飾的核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個最 5' 核苷是糖修飾的核苷。在一些實施例中，區域 F 的最 5' 核苷是 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個最 5' 核苷是 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個最 5' 核苷是 2' 取代核苷，諸如兩個 3' MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F 的最 5' 核苷是 2' 取代核苷，諸如 MOE 核苷。

區域 F' 長度為 2-8 個連續核苷酸，諸如長度為 3-6 個、諸如 4-5 個連續核苷酸。有利地，實施例區域 F' 的最 3' 核苷是糖修飾的核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個最 3' 核苷是糖修飾的核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個最 3' 核苷是 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的最 3' 核苷是 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個最 3' 核苷是 2' 取代核苷，諸如兩個 3' MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的最 3' 核苷是 2' 取代核苷，諸如 MOE 核苷。

應注意，當區域 F 或 F' 的長度為一時，它有利地是 LNA 核苷。

在一些實施例中，區域 F 和 F' 獨立地由糖修飾核苷的連續序列組成或包含糖修飾核苷的連續序列。在一些實施例中，區域 F 之糖修飾核苷可係獨立地選自 2'-O-烷基-RNA 單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA 單元、2'-氟-DNA 單元、2'-烷氧基-RNA、MOE 單元、LNA 單元、阿拉伯糖核酸 (arabino nucleic acid) (ANA) 單元、及 2'-氟-ANA 單元。

在一些實施例中，區域 F 和 F' 獨立地包含 LNA 和 2' 取代的修飾核苷兩者 (混合側翼設計)。

在一些實施例中，區域 F 和 F' 由僅一種類型的糖修飾核苷組成，諸如僅 MOE 或僅 β-D-氧基 LNA 或僅 ScET。這種設計也稱為均一側翼或均一缺口體設計。

在一些實施例中，區域 F 或 F'，或 F 和 F' 的所有核苷都是 LNA 核苷，諸如獨立地選自 β-D-氧基 LNA、ENA 或 ScET 核苷。在一些實施例中，區域 F 由 1-5 個，諸如 2-4 個，諸如 3-4 個，諸如 1、2、3、4 或 5 個連續的 LNA 核苷組成。在一些實施例中，區域 F 和 F' 的所有核苷都是 β-D-氧基 LNA 核苷。

在一些實施例中，區域 F 或 F'，或 F 和 F' 的所有核苷都是 2' 取代核苷，諸如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F 可由 1、2、3、4、5、6、7、或 8 個連續 OMe 或 MOE 核苷組成。在一些實施例中，僅一個側翼區域可由 2' 取代核苷組成，諸如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，5' (F) 側翼區域由 2' 取代核苷組成，諸如 OMe 或 MOE 核苷，而 3' (F') 側翼區域包含至少一個 LNA 核苷，諸如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。在一些實施例中，3' (F') 側翼區域由 2' 取代核苷組成，諸如 OMe 或 MOE 核苷，而 5' (F) 側翼區域包含至少一個 LNA 核苷，諸如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。

在一些實施例中，區域 F 和 F' 的所有經修飾核苷是 LNA 核苷，諸如獨立地選自 β-D-氧基 LNA、ENA 或 ScET 核苷，其中區域 F 或 F'、或 F 和 F' 可任選地包含 DNA 核苷 (交替側翼 (alternating flank)，詳見這些的定義)。在一些實施例中，區域 F 和 F' 的所有經修飾核苷是 β-D-氧基 LNA 核苷，其中區域 F 或 F'，或 F 和 F' 可任選地包含 DNA 核苷 (交替側翼 (alternating flank)，詳見這些的定義)。

在一些實施例中，區域 F 和 F' 的最 5' 核苷和最 3' 核苷是 LNA 核苷，諸如 β-D-氧基 LNA 核苷或 ScET 核苷。

在一些實施例中，位在區域 F 與區域 G 之間的核苷間鍵聯是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，位在區域 F' 與區域 G 之間的核苷間鍵聯是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，區域 F 或 F'，F 和 F' 的核苷之間的核苷間鍵聯是硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 LNA 缺口體

LNA 缺口體是指其中區域 F 及 F' 中任一者或兩者都包含或具有 LNA 核苷的缺口體。β-D-氧基缺口體是指其中區域 F 及 F' 中任一者或兩者都包含或具有 β-D-氧基 LNA 核苷的缺口體。

在某些實施例中，所述 LNA 缺口體係如下式：[LNA]_1-5 -[區域 G] -[LNA]_1-5 ，其中區域 G 具有如所述缺口體區域 G 定義中的定義。

在一個實施例中，LNA 缺口體係式 [LNA]₄ -[區域 G]_10-12 -[LNA]₄ 者。 MOE 缺口體

MOE 缺口體是其中區域 F 及 F' 由 MOE 核苷所構成的缺口體。在某些實施例中，該 MOE 缺口體的設計為 [MOE]_1-8 -[區域 G]_5-16 -[MOE]_1-8 ，諸如 [MOE]_2-7 -[區域 G]_6-14 -[MOE]_2-7 ，諸如 [MOE]_3-6 -[區域 G]_8-12 -[MOE]_3-6 ，其中區域 G 具有如所述缺口體定義中的定義。具有 5-10-5 設計 (MOE-DNA-MOE) 的 MOE 缺口體已廣泛用於本技術領域中。 混合型翼缺口體

混合型翼缺口體是一種 LNA 缺口體，其中區域 F 及 F' 中的一者或兩者都包含 2' 取代核苷，例如獨立選自以 2'-O-烷基-RNA 單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA 單元、2'-氟-DNA 單元、2'-烷氧基-RNA、MOE 單元、阿糖基核酸 (ANA) 單元及 2'-氟-ANA 單元所構成之群組的 2' 取代核苷，例如 MOE 核苷。在某些實施例中，其中區域 F 及 F' 中之至少一者或區域 F 及 F' 兩者均包含至少一個 LNA 核苷，區域 F 及 F' 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些實施例中，其中區域 F 或 F' 中的至少一者或區域 F 及 F' 兩者均包含至少兩個 LNA 核苷，區域 F 及 F' 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域 F 及 F' 中的一者或兩者可進一步包含一個或多個 DNA 核苷。

混合型翼缺口體設計已揭示於 WO2008/049085 及 WO2012/109395，彼等兩者在此以引用方式併入。 交替側翼缺口體

側翼區域可包含 LNA 及 DNA 核苷兩者，並且由於其包含 LNA-DNA-LNA 核苷的交替模體，因此稱為「交替側翼」。包含此種交替側翼的缺口體稱為「交替側翼缺口體」。「選擇性側翼缺口體 (alternative flank gapmer)」是指 LNA 缺口體寡核苷酸，其中至少一個側翼 (F 或 F') 在 LNA 核苷之外還包含 DNA。在某些實施例中，區域 F 或 F' 中的至少一者或兩者都包含 LNA 核苷及 DNA 核苷這兩者。在該等實施例中，側翼區域 F 或 F'，或 F 和 F' 兩者，包含至少三個核苷，其中 F 及/或 F' 區域的 5' 及 3' 多數核苷為 LNA 核苷。

交替側翼 LNA 缺口體揭示於 WO2016/127002。

一種交替側翼區域可包含至多 3 個連續 DNA 核苷，例如 1 個至 2 個或 1 個或 2 個或 3 個連續 DNA 核苷。

交替側翼可註解為一系列整數，代表許多 LNA 核苷 (L)，然後是許多 DNA 核苷 (D)，例如 [L]_1-3 -[D]_1-4 -[L]_1-3 [L]_1-2 -[D]_1-2 -[L]_1-2 -[D]_1-2 -[L]_1-2

在寡核苷酸設計中，這些通常表示為數字，使得 2-2-1 代表 5' [L]₂ -[D]₂ -[L] 3'，並且 1-1-1-1-1 代表 5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'。具有交替側翼的寡核苷酸中側翼 (區域 F 和 F') 的長度可獨立地為 3 個至 10 個核苷，諸如 4 個至 8 個、諸如 5 個至 6 個核苷，諸如 4 個、5 個、6 個或 7 個經修飾的核苷。在一些實施例中，缺口體寡核苷酸中僅一個側翼是交替型，而另一個側翼由 LNA 核苷酸構成。可能有利的是，在 3' 側翼 (F') 的 3' 端具有至少兩個 LNA 核苷以賦予額外的核酸外切酶抗性。在一個實施例中，該交替側翼缺口體中的側翼具有整體長度 5 至 8 個核苷中的 3 至 5 個係 LNA 核苷。具有交替側翼的寡核苷酸的一些實例是： [L]_1-5 -[D]_1-4 -[L]_1-3 -[G]_5-16 -[L]_2-6 [L]_1-2 -[D]_2-3 -[L]_3-4 --[G]_5-7 -[L]_1-2 -[D]_2-3 -[L]_2-3 [L]_1-2 -[D]_1-2 -[L]_1-2 -[D]_1-2 -[L]_1-2 -[G]_5-16 -[L]_1-2 -[D]_1-3 -[L]_2-4 [L]_1-5 -[G]_5-16 -[L]-[D]-[L]-[D]-[L]₂ [L]₄ -[G]_6-10 -[L]-[D]₃ -[L]₂

惟所述缺口體的整體長度為至少 12 個，諸如至少 14 個核苷酸。 寡核苷酸中的區域 D' 或 D''

本發明之寡核苷酸可在某些實施例中包含或具有所述寡核苷酸的所述連續核苷酸序列，其與所述標靶核酸互補，所述連續核苷酸序列如是缺口體 F-G-F' 以及進一步的 5' 及/或 3' 核苷。所述進一步的 5' 及/或 3' 核苷可與或不與所述標靶核酸為完全互補。該等進一步的 5' 及/或 3' 核苷本文中可稱為區域 D' 及 D''。

區域 D' 或 D'' 的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如缺口體，連接至共軛體部分或另一官能基團。當用於接合所述連續核苷酸序列與共軛體部分時，其可做為生物可切斷型連接子。或者，其可用於提供核酸外切酶保護或促進合成或製造。

區域 D' 及 D'' 可分別連附至區域 F 的 5' 端或區域 F' 的 3' 端，以產生下式設計：D'-F-G-F'、F-G-F'-D'' 或 D'-F-G-F'-D''。在此實例中，F-G-F' 是所述寡核苷酸的缺口體部位，且區域 D' 或 D'' 構成所述寡核苷酸的一個分離部分。

區域 D' 或 D'' 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述標靶核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F' 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D' 或 D'' 區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5' 及/或 3' 端核苷酸是與磷酸二酯鍵聯連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D' 或 D'' 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。生物可切斷型連接子在聚寡核苷酸構造中的使用可參照 WO2015/113922 的揭露，在該案中其係用於連結單一寡核苷酸中的多重反義構造 (例如缺口體區域)。

在一實施例中，本發明之寡核苷酸除包含構成所述缺口體的連續核苷酸序列之外，還包含區域 D' 及/或 D''。

在某些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式代表： F-G-F'；特定言之F_2-8 -G_6-16 -F'_2-8 D'-F-G-F'，特定言之D'_2-3 -F_1-8 -G_6-16 -F'_2-8 F-G-F'-D''，特定言之F_2-8 -G_6-16 -F'_2-8 -D''_1-3 D'-F-G-F'-D''，特定言之D'_1-3 - F_2-8 -G_6-16 -F'_2-8 -D''_1-3

在某些實施例中，所述位在區域 D' 與區域 F 之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。在某些實施例中，所述位在區域 F' 與區域 D'' 之間的核苷間鍵聯是磷酸二酯鍵聯。 共軛體

本文所用的共軛體一詞是指共價連結至非核苷酸部分 (共軛體部分或區域 C 或第三區域) 的寡核苷酸。

本發明之寡核苷酸對一個或多個非核苷酸部分的接合可例如藉由影響寡核苷酸的活性、細胞分佈、細胞攝入或穩定性，來改善寡核苷酸的藥理學。在某些實施例中，所述共軛體部分是藉由改善寡核苷酸的細胞分佈、生物利用度、新陳代謝、排泄、滲透性及/或細胞攝入來調整或提升寡核苷酸的藥效學特性。具體而言，所述共軛體將所述寡核苷酸標定至特定器官、組織或細胞類型，並藉此提升所述寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中的效應。同時，所述共軛體可降低所述寡核苷酸在非標靶細胞類型、組織或器官中的活性，例如脫靶活性或對非標靶細胞類型、組織或器官中的活性。

寡核苷酸共軛體及其合成也已報導在 Manoharan 的 Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 和 Manoharan 的 Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103，彼等各者以引用方式全部併入本文。

在一實施例中，所述非核苷酸部分 (共軛體部分) 選自以碳水化合物 (例如 GalNAc)、細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素 (例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白質 (例如衣殼) 或其組合所構成之群組。

在某些實施例中，所述共軛體是對運鐵蛋白受體具有特定親和力的抗體或抗體片段，例如 WO 2012/143379 中所揭露者，該案經參照併入本文。在某些實施例中，所述非核苷酸部分是抗體或抗體片段，例如一種有助於跨腦血管障壁提供藥性的抗體或抗體片段，特別是一種標定運鐵蛋白受體的抗體或抗體片段。 連接子

鍵聯或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一個或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。共軛體部分可直接或經由連結部分 (例如連接子或繫鏈) 連附至所述寡核苷酸。連接子可將第三區域，例如共軛體部分 (區域 C)，共價連接至第一區域，例如與所述標靶核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列 (區域 A)。

在本發明的某些實施例中，本發明之共軛體或寡核苷酸共軛體可隨選性包含一連接子區域 (第二區域或區域 B 及/或區域 Y)，其位在互補於所述標靶核酸的所述寡核苷酸或所述連續核苷酸序列 (區域 A 或第一區域) 與共軛體部分 (區域 C 或第三區域) 之間。

區域 B 意指包含或具有一個生理不安定鍵的生物可切斷型連接子，所述生理不安定鍵在哺乳動物體內常態存在或與之類似的條件下會成為可切斷的鍵。生理不安定連接子經歷化學轉換 (例如，切斷) 的條件包括化學條件，例如 pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一實施例中，所述生物可切斷型連接子易感於 S1 核酸酶切斷。於一較佳實施例中，所述核酸酶易感連接子包含的核苷數量在 1 與 10 之間，例如 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個、8 個、9 個或 10 個核苷，更佳的是 2 個至 6 個核苷，最佳的是 2 個至 4 個相連結的核苷，所述相連結的核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵聯，例如至少 3 個或 4 個或 5 個連續磷酸二酯鍵聯。該核苷較佳的是 DNA 或 RNA。包含生物可切斷型連接子的磷酸二酯的詳細說明請參閱 WO 2014/076195 (以引用方式併入本文)。

區域 Y 意指未必為生物可切斷型但主要功能是將共軛體部分 (區域 C 或第三區域) 共價連接至寡核苷酸 (區域 A 或第一區域) 的連接子。區域 Y 連接子可包含鏈狀結構或例如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基團等重複單元的寡聚物。本發明之寡核苷酸共軛體可由以下區域元素建構而成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C 或 A-Y-C。在某些實施例中，所述連接子 (區域 Y) 是胺基烷基，例如 C2 至 C36 胺基烷基團，包括，例如 C6 至 C12 胺基烷基團。於一較佳實施例中，所述連接子 (區域 Y) 是一個 C6 胺基烷基團。 治療

本文所用的「治療」一詞意指治療既有疾病 (例如本文所提及之疾病或疾患)，或防範疾病，也就是預防。因此應知，本文中所稱的治療，於某些實施例中，是屬於預防疾病性質。

在一些實施例中，對已被診斷患有神經障礙的患者進行治療，該神經障礙諸如選自神經退化性疾病，包括 Tau 異常沉積病變、阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、皮質基底核退化症 (CBD)、慢性創傷性腦病變 (CTE)、額顳葉失智症 (FTD) 及 FTD 伴隨與染色體 17 相關之帕金森症 (FTDP-17)、匹克症 (PiD)、嗜銀顆粒病 (AGD)、纏結為主的老年失智症 (TPSD)、與原發性年齡相關的 Tau 異常沉積病變 (PART)、唐氏症及關島 lytico-bodig 病。病理性 Tau 的上調與嬰兒型 Tau 異常沉積病變相關，包括半邊巨腦症 (HME)、結節性硬化症 (tuberous sclerosis complex)；局灶性皮質發育不良第 2b 型；及神經節性神經膠質瘤。此外，異常的 Tau 表現及/或功能亦可能與其他疾病相關，諸如 Hallervorden-Spatz 二氏症候群，也稱為腦鐵沉積性第 1 型的神經退化 (NBIA1)、神經節細胞瘤、及亞急性硬化性泛腦炎。Tau 亦可在癲癇發作(seizure disorder) (例如癲癇)、網路功能障礙 (例如抑鬱)、及運動障礙 (movement disorder) (例如帕金森病) 扮演角色。 本發明之寡核苷酸

本發明係涉及能夠調制 Tau 的表現，諸如抑制 (調降) Tau 表現的寡核苷酸。調制係藉由與編碼 Tau 的標靶核酸雜交來達成。標靶核酸可為哺乳動物 MAPT mRNA 序列，諸如選自以SEQ ID NO：1 及 2 所組成之群組的序列。

本發明之寡核苷酸係反義寡核苷酸，其靶定 MAPT，導致 Tau 表現減少。

在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠藉由抑制或調降目標的表現而對其產生調制的效果。較佳的是，上述調制相較於目標的正常表現水平可產生至少 20% 的表現抑制，更佳的是產生相較於正常表現水平至少 30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%，或至少 90% 的表現抑制。在一些實施例中，依據活體外實驗，在對初代神經元細胞使用 5 µM 寡核苷酸之後，本發明之寡核苷酸能夠將 Tau mRNA 的表現水平抑制至少 60% 或 70%。在一些實施例中，依據活體外實驗，在對初代神經元細胞使用 0.5 µM 寡核苷酸之後，本發明之化合物能夠將 Tau 蛋白質的表現水平抑制至少 50%。適合的是，實例中提供了可用於測量 Tau RNA 或蛋白質抑制的檢驗 (例如實例 1 及實例 3)。藉由寡核苷酸的連續核苷酸序列與標靶核酸之間的雜交觸發靶定調制。在一些實施例中，本發明的寡核苷酸包含寡核苷酸和標靶核酸之間的錯配。儘管錯配，與標靶核酸的雜交仍可足以顯示出對 Tau 表現的所需調制。由錯配引起的結合親和力降低可以有利地藉由增加寡核苷酸中核苷酸的數量和/或增加數量的能夠增加與目標的結合親和力的修飾核苷來補償，諸如存在於寡核苷酸序列內的 2' 糖修飾核苷，包括 LNA 。

本發明的一種態樣涉及的反義寡核苷酸，其包含長度為至少 10 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與SEQ ID NO：3、4 或 5 具有至少 90% 互補性。

在某些實施例中，所述寡核苷酸包含一個長度為 10 個至 30 個核苷酸的連續序列，所述序列與所述標靶核酸或標靶序列的一個區域為至少 90% 互補，例如至少 91%，例如至少 92%，例如至少 93%，例如至少 94%，例如至少 95%，例如至少 96%，例如至少 97%，例如至少 98%，或 100% 互補。

有利的是，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與所述標靶核酸之區域完全互補 (100% 互補)，或者，在一些實施例中，所述寡核苷酸與所述標靶核酸之間可存有一組或兩組錯配。

在一些實施例中，所述寡核苷酸包含長度為 10 個至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12111、39562 至 39593 或 72837 至 72940 內連續核苷酸為至少 90% 互補，例如完全 (或 100%) 互補。

在一些實施例中，寡核苷酸序列與SEQ ID NO：1 和SEQ ID NO：2 中存在的相應標靶核酸區域 100% 互補。

如果反義寡核苷酸與選自表 4 中列出的區域之一的標靶序列互補，則是有利的。在一些實施例中，反義寡核苷酸的連續核苷酸序列與選擇的 R1-R2254 (表 4) 的標靶序列至少 90% 互補，例如完全互補。在一些實施例中，寡核苷酸序列與 R_223、R_738 或 R_1298 (見表 4) 100% 互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸區域 90% 互補，例如完全互補，其中標靶核酸區域選自由SEQ ID NO：1 的位置 12051-12111 所組成之群組，例如SEQ ID NO：1 的位置 12051-12079、位置 12085-12111 或位置 12060-12078。

在另一實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸區域 90% 互補、諸如完全互補，其中標靶核酸區域選自由SEQ ID NO：1 的位置 39562-39593 所組成之群組，諸如SEQ ID NO：1 的位置 39573-39592。

在另一實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸區域 90% 互補、諸如完全互補，其中標靶核酸區域選自由SEQ ID NO：1 的位置 72837-72940 所組成之群組，諸如SEQ ID NO：1 的位置 72861-72891 或位置 72862-72890。

在一些實施例中，該寡核苷酸包含長度為 16 個至 22 個核苷酸、諸如 16 至 20 個核苷酸的連續核苷酸序列，其與SEQ ID NO：1 的位置 12060 至 12078 或 39573 至 39592 或 72862 至 72890 內連續核苷酸為100% 互補。

在某些實施例中，本發明之寡核苷酸在長度上包含或具有 10 個至 35 個核苷酸，其長度例如為 10 個至 30 個，例如 11 個至 25 個，例如 12 個至 22 個，例如 14 個至 20 個或 14 個至 18 個連續核苷酸。於一實施例中，所述寡核苷酸的長度包含或具有 16 個至 22 個核苷酸。於一較佳實施例中，所述寡核苷酸的長度包含或具有 16 個至 20 個核苷酸。

在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含或具有 22 個或更少之核苷酸，例如 20 個或更少之核苷酸，例如 16 個、17 個、18 個、19 個或 20 個核苷酸。應知在本文中給定之所有範圍均包括範圍端點。據此，若本文中描述一寡核苷酸包括自 10 個至 30 個核苷酸，則 10 個及 30 個核苷酸均包含在內。

在某些實施例中，所述連續核苷酸序列在長度上包含或具有 10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個、21 個、22 個、23 個、24 個、25 個、26 個、27 個、28 個、29 個或 30 個連續核苷酸。於一較佳實施例中，所述寡核苷酸在長度上包含或由 16 個、17 個、18 個、19 個或 20 個核苷酸組成。

在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：表 5 (材料和方法部分) 中列出的序列。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與選自由SEQ ID NO：6 至 65 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與選自由SEQ ID NO：9、11、49、53、56 及 62 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與選自由SEQ ID NO：6 至 37 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與SEQ ID NO：9 或 11 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與選自由SEQ ID NO：38 至 51 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與SEQ ID NO：49 或 51 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與選自由SEQ ID NO：52 至 65 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

在一些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含下列或由下列組成：在長度上 10 個至 30 個、與SEQ ID NO：56 或 62 (表 5 中所列之模體序列) 所組成之群組之序列具有至少 90% 相同度、較佳的是 100% 相同度之核苷酸。

應理解的是，修飾連續核鹼基序列 (模體序列) 可經修飾以例如增加核酸酶抗性和/或對標靶核酸的結合親和力。

將修飾的核苷 (諸如高親和力修飾的核苷) 併入寡核苷酸序列中的模式通常稱為寡核苷酸設計。

本發明的寡核苷酸設計有修飾核苷和 DNA 核苷。有利地，使用高親和力修飾的核苷。

在一實施例中，寡核苷酸包含至少 1 個修飾核苷，諸如至少 2 個、至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、至少 8 個、至少 9 個、至少 10 個、至少 11 個、至少 12 個、至少 13 個、至少 14 個、至少 15 個或至少 16 個修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含 1 個至 10 個修飾核苷，諸如 2 個至 9 個修飾核苷，諸如 3 個至 8 個修飾核苷，諸如 4 個至 7 個修飾核苷，諸如 6 個或 7 個修飾核苷。合適的修飾描述於「修飾核苷」、「高親和力修飾核苷」、「糖修飾」、「2'糖修飾」和鎖核酸 (LNA) 的「定義」部分中。

在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個糖修飾核苷，諸如 2' 糖修飾核苷。較佳的是，本發明之寡核苷酸包含一個或多個 2' 糖修飾核苷，其係獨立選自於 2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖基核酸 (ANA)、2'-氟-ANA 及 LNA 核苷所組成之群組。如果一種或多種修飾核苷是鎖核酸 (LNA) 是有利的。

在進一步實施例中，寡核苷酸包含至少一個修飾核苷間鍵聯。合適的核苷間修飾描述於「修飾核苷間鍵聯」下的「定義」部分中。有利的是，連續核苷酸序列內至少 75%、諸如 80%、諸如全部的核苷間鍵聯是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸的連續序列中的所有核苷酸間鍵聯是硫代磷酸酯鍵聯。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個 LNA 核苷，諸如 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個、6 個、7 個或 8 個 LNA 核苷，諸如 2 個至 6 個 LNA 核苷，諸如 3 個至 7 個 LNA 核苷，4 個至 8 個 LNA 核苷或 3 個、4 個、5 個、6 個、7 個或 8 個 LNA 核苷。在一些實施例中，寡核苷酸中至少 75% 的修飾核苷是 LNA 核苷，例如 80%、例如 85%、例如 90% 的修飾核苷是 LNA 核苷，特定言之β-D-氧基 LNA 或 ScET 。在又進一步實施例中，寡核苷酸中的所有修飾核苷都是 LNA 核苷。在進一步實施例中，寡核苷酸可包含 β-D-氧基-LNA 和一種或多種下列 LNA 核苷：硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA、ScET 和/或 ENA，為 β-D 或 α-L 構形或其組合。在進一步的實施例中，所有 LNA 胞嘧啶單元都是 5-甲基-胞嘧啶。有利於核酸酶穩定性的是，寡核苷酸或連續核苷酸序列具有至少 1 個 LNA 核苷在核苷酸序列 5' 端且至少 2 個 LNA 核苷在核苷酸序列 3' 端。

在本發明的一個實施例中，本發明的寡核苷酸能夠召募核糖核酸酶 H。

在本發明中，有利的結構設計是如「定義」部分中所述的缺口體設計，例如「缺口體」、「LNA 缺口體」、「MOE 缺口體」和「混合型翼缺口體」、「交替側翼缺口體」。缺口體設計包括具有均一側翼、混合型翼側翼、交替側翼及缺口中斷者設計的缺口體。在本發明中，如果本發明的寡核苷酸是具有 F-G-F' 設計的缺口體，特別是式 5'-F-G-F'-3' 的缺口體，則是有利的，其中區域 F 及 F' 獨立地包含 1 至 8 個核苷，其中 2 至 5 個係經 2' 糖修飾且界定該 F 及 F' 區域之 5' 及 3' 端，且 G 係能夠召募核糖核酸酶 H 的介於 6 與 16 個核苷之間之區域，諸如包含 6 至 16 個 DNA 核苷之區域。

在一些實施例中，該缺口體係 LNA 缺口體。

在本發明之一些實施例中，LNA 缺口體係選自下列均一側翼設計：4-10-4、3-11-4、4-11-4、4-12-4 或 4-14-2。

在本發明之一些實施例中，LNA 缺口體係選自下列交替側翼設計：3-1-3-10-2、1-3-4-6-1-3-2、1-2-1-2-2-8-4 或 3-3-1-8-2-1-2。

表 5 (材料與方法一節) 列出各模體序列之較佳設計。

在所有情況下，F-G-F' 設計可進一步包括區域 D' 和/或 D''，如「寡核苷酸中區域 D' 或 D''」下中的「定義」一節中所述。在一些實施例中，本發明的寡核苷酸在缺口體區域的 5' 或 3' 端具有 1 個、2 個或 3 個磷酸二酯連接的核苷單元，例如 DNA 單元。

對於本發明之一些實施例，該寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物之群組，其具有下列之 CMP-ID-NO：6_1；7_1；8_1；9_1；9_2；9_3；9_4；9_5；9_6；9_7；9_8；9_9；9_10；9_11；9_12；9_13；9_14；9_15；9_16；9_17；9_18；9_19；9_20；9_21；9_22；9_23；9_24；9_25；9_26；9_27；9_28；9_29；9_30；9_31；9_32；9_33；9_34；9_35；9_36；9_37；9_38；9_39；9_40；9_41；9_42；9_43；9_44；9_45；9_46；9_47；9_48；9_49；9_50；9_51；9_52；9_53；9_54；9_55；9_56；9_57；9_58；9_59；9_60；9_61；9_62；9_63；9_64；9_65；9_66；9_67；9_68；9_69；9_70；9_71；9_72；9_73；9_74；9_75；9_76；9_77；9_78；9_79；9_80；9_81；9_82；9_83；9_84；9_85；9_86；9_87；9_88；9_89；9_90；9_91；9_92；9_93；9_94；9_95；9_96；9_97；9_98；9_99；9_100；9_101；9_102；9_103；9_104；9_105；9_106；10_1；10_2；10_3；10_4；10_5；10_6；10_7；10_8；10_9；10_10；10_11；10_12；10_13；10_14；10_15；10_16；10_17；10_18；10_19；10_20；10_21；10_22；10_23；10_24；10_25；10_26；10_27；10_28；10_29；10_30；10_31；10_32；10_33；10_34；10_35；10_36；10_37；10_38；10_39；10_40；10_41；10_42；10_43；10_44；10_45；10_46；10_47；10_48；10_49；10_50；10_51；10_52；10_53；10_54；10_55；10_56；10_57；10_58；10_59；10_60；10_61；10_62；10_63；10_64；10_65；10_66；10_67；10_68；10_69；10_70；10_71；10_72；10_73；10_74；10_75；10_76；10_77；10_78；10_79；10_80；10_81；10_82；10_83；10_84；10_85；10_86；10_87；10_88；10_89；11_1；12_1；13_1；14_1；15_1；16_1；17_1；18_1；19_1；20_1；21_1；22_1；23_1；24_1；24_2；24_3；24_4；24_5；24_6；24_7；24_8；24_9；24_10；24_11；24_12；24_13；24_14；24_15；24_16；24_17；24_18；24_19；24_20；24_21；24_22；24_23；24_24；24_25；24_26；24_27；24_28；24_29；24_30；24_31；24_32；24_33；24_34；24_35；24_36；24_37；24_38；24_39；24_40；24_41；24_42；24_43；24_44；24_45；24_46；24_47；24_48；24_49；24_50；24_51；24_52；24_53；24_54；24_55；24_56；24_57；24_58；24_59；24_60；24_61；24_62；25_1；25_2；25_3；25_4；25_5；25_6；25_7；25_8；25_9；25_10；25_11；25_12；25_13；25_14；25_15；25_16；25_17；25_18；25_19；25_20；25_21；25_22；25_23；25_24；25_25；25_26；25_27；25_28；25_29；25_30；25_31；25_32；25_33；25_34；25_35；25_36；25_37；25_38；25_39；25_40；25_41；25_42；25_43；26_1；26_2；26_3；26_4；26_5；26_6；26_7；26_8；26_9；26_10；26_11；26_12；26_13；26_14；26_15；26_16；26_17；26_18；26_19；26_20；26_21；26_22；26_23；26_24；26_25；26_26；26_27；26_28；26_29；26_30；26_31；27_1；28_1；28_2；28_3；28_4；28_5；28_6；28_7；28_8；28_9；28_10；28_11；28_12；28_13；28_14；28_15；28_16；28_17；28_18；28_19；28_20；28_21；28_22；28_23；28_24；28_25；28_26；28_27；28_28；28_29；28_30；28_31；28_32；28_33；29_1；29_2；29_3；29_4；29_5；29_6；29_7；29_8；29_9；29_10；29_11；29_12；29_13；29_14；30_1；30_2；30_3；30_4；30_5；30_6；30_7；30_8；30_9；30_10；30_11；30_12；30_13；30_14；30_15；30_16；30_17；30_18；30_19；30_20；30_21；30_22；30_23；30_24；30_25；31_1；31_2；31_3；32_1；32_2；32_3；32_4；32_5；32_6；32_7；32_8；32_9；32_10；32_11；32_12；32_13；32_14；32_15；32_16；32_17；32_18；32_19；32_20；32_21；32_22；32_23；32_24；32_25；32_26；32_27；32_28；32_29；32_30；32_31；32_32；32_33；32_34；32_35；32_36；32_37；32_38；32_39；32_40；32_41；32_42；32_43；32_44；32_45；32_46；32_47；32_48；32_49；32_50；32_51；33_1；33_2；33_3；33_4；33_5；33_6；33_7；33_8；33_9；33_10；33_11；33_12；33_13；33_14；33_15；33_16；33_17；33_18；33_19；33_20；33_21；33_22；33_23；33_24；33_25；33_26；33_27；33_28；33_29；33_30；33_31；33_32；33_33；34_1；35_1；35_2；35_3；36_1；37_1；38_1；39_1；40_1；41_1；42_1；43_1；44_1；45_1；46_1；47_1；48_1；49_1；49_2；49_3；49_4；49_5；49_6；49_7；49_8；49_9；49_10；49_11；49_12；49_13；49_14；49_15；49_16；49_17；49_18；49_19；49_20；49_21；49_22；49_23；49_24；49_25；49_26；49_27；49_28；49_29；49_30；49_31；49_32；49_33；49_34；49_35；49_36；49_37；49_38；49_39；49_40；49_41；49_42；49_43；49_44；49_45；49_46；49_47；49_48；49_49；49_50；49_51；49_52；49_53；49_54；49_55；49_56；49_57；49_58；49_59；49_60；49_61；49_62；49_63；49_64；49_65；49_66；49_67；49_68；49_69；49_70；49_71；49_72；49_73；49_74；49_75；49_76；49_77；49_78；49_79；49_80；49_81；49_82；49_83；49_84；49_85；49_86；49_87；49_88；49_89；49_90；49_91；49_92；49_93；49_94；49_95；49_96；49_97；49_98；49_99；49_100；49_101；49_102；49_103；49_104；49_105；49_106；49_107；49_108；49_109；49_110；49_111；49_112；49_113；49_114；49_115；49_116；49_117；49_118；49_119；49_120；49_121；49_122；49_123；49_124；49_125；49_126；49_127；49_128；49_129；49_130；49_131；49_132；49_133；49_134；49_135；49_136；49_137；49_138；49_139；49_140；49_141；49_142；49_143；49_144；49_145；49_146；49_147；49_148；49_149；49_150；49_151；49_152；49_153；49_154；49_155；49_156；49_157；49_158；49_159；49_160；49_161；49_162；49_163；49_164；49_165；49_166；49_167；49_168；49_169；49_170；49_171；49_172；49_173；49_174；49_175；49_176；49_177；49_178；49_179；49_180；49_181；49_182；49_183；49_184；49_185；49_186；49_187；49_188；49_189；49_190；49_191；49_192；50_1；51_1；52_1；53_1；54_1；55_1；56_1；57_1；58_1；59_1；60_1；61_1；62_1；63_1；64_1 及 65_1。

對於本發明之某些實施例，該寡核苷酸係選自具有下列 CMP-ID-NO之寡核苷酸化合物之群組：CMP-ID-NO：9_102；9_103；9_104；11_1；49_38；49_51；49_179；49_189；53_1；56_1 及 62_1。

對於本發明之某些實施例，該寡核苷酸係選自具有下列 CMP-ID-NO之寡核苷酸化合物之群組：CMP-ID-NO：9_102；9_103；9_104 及 11_1。

對於本發明之某些實施例，該寡核苷酸係選自具有下列 CMP-ID-NO之寡核苷酸化合物之群組：CMP-ID-NO：49_38；49_51；49_179 及 49_189。

對於本發明之某些實施例，該寡核苷酸係選自具有下列 CMP-ID-NO 的寡核苷酸化合物之群組：CMP-ID-NO: 53_1；56_1 及 62_1。

依據本發明情況中特別有利的反義寡核苷酸是一種寡核苷酸化合物，其係選自由下列項目所組成之群組：

其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

在一個實施例中，該反義寡核苷酸係如圖 2 中所示之 CMP-ID-NO：9_103。

在一個實施例中，該反義寡核苷酸係如圖 3 中所示之 CMP-ID-NO：9_104。

在一個實施例中，該反義寡核苷酸係如圖 4 中所示之 CMP-ID-NO：11_1。

在一個實施例中，該反義寡核苷酸係如圖 5 中所示之 CMP-ID-NO：49_38。

在一個實施例中，該反義寡核苷酸係如圖 6 中所示之 CMP-ID-NO：49_189。 製造方法

在又一態樣中，本發明提供用以製造本發明之寡核苷酸的方法，所述方法包含使核苷酸單元進行反應，藉此在所述寡核苷酸中形成共價連結連續核苷酸單元。較佳的是，所述方法是利用亞磷醯胺化學 (見例如 Caruthers 等人，1987 年，Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313)。在又一實施例中，所述方法進一步包含使所述連續核苷酸序列與一接合部分 (配體) 反應，以使共軛體部分共價連附至所述寡核苷酸。在又一態樣中，提供一種用以製造本發明組成物的方法，所述方法包含將本發明之寡核苷酸或共軛寡核苷酸與一種醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐劑混合。 藥用鹽

根據本發明的化合物可以其醫藥上可接受的鹽的形式存在。用語「醫藥上可接受之鹽」是指習知的酸加成鹽或鹼加成鹽，其保留本發明化合物的生物有效性和性質，並且由合適的無毒有機或無機酸或有機或無機鹼形成。酸加成鹽包括例如衍生自無機酸者，諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸和硝酸，以及衍生自有機酸者，諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸，及類似者。鹼加成鹽包括衍生自銨、鉀、鈉和四級銨氫氧化物者，諸如像是四甲基氫氧化銨。將醫藥化合物化學修飾成鹽是藥物化學家熟知的技術，以獲得化合物的物理和化學穩定性、吸濕性、流動性和溶解性改善。例如，描述於 Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 或 Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 及 1456-1457 者。例如，本文中所提供的化合物的醫藥上可接受之鹽可係鈉鹽。

在又一態樣中，本發明提供上述反義寡核苷酸或其共軛體的醫藥上可接受之鹽。於一較佳實施例中，所述醫藥上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。 醫藥組成物

在又一態樣中，本發明提供的醫藥組成物包含任一上述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛體或其鹽以及一種醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS)，而醫藥上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在某些實施例中，所述醫藥上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。在某些實施例中，所述寡核苷酸用於所述醫藥上可接受之稀釋劑的濃度為 50 至 300 微莫耳溶液。

適合用於本發明的製劑可參閱 Remington 的 Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985。有關藥物遞送方法的簡要說明，請參閱例如 Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091 進一步針對醫藥上可接受之稀釋劑、載體及佐劑提供適當且較佳的實例 (經參照併入於此)。WO2007/031091 對於適當劑量、製劑、給藥途徑、組成物、劑型、與其他治療劑的組合、前驅藥物製劑等方面亦有提供。

本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛體可與醫藥上可接受之有效或惰性物質混合，用以製備醫藥組成物或製劑。組成物及用以調配醫藥組成物的方法取決於若干標準，包括但不限於，給藥途徑、疾病程度或要施予的劑量。

這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行給藥。製劑的 pH 通常為介於 3 和 11 之間，更佳的是介於 5 和 9 之間或是介於 6 和 8 之間，最佳的是介於 7 和 8 之間，例如 7 至 7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。也可將固態組成物裝入容器中，以利靈活調整用量，例如裝入便於局部施用乳霜或軟膏的擠壓管。

在某些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛體為前驅藥。特別在寡核苷酸共軛體方面，待前驅藥遞送至如標靶細胞等作用位置之後，便將共軛體部分自寡核苷酸上裂解。 應用

本發明之寡核苷酸可於例如診斷學、治療法及預防法等領域用為研究試劑。

在研究中，可利用此種寡核苷酸特別調制 Tau 蛋白質在細胞 (例如活體外細胞培養) 及實驗動物中的合成，藉此促進目標的功能分析，或評估以其做為治療介入目標的實用性。一般而言，目標調制的做法是藉由調降或抑制可產生此蛋白質的 mRNA，從而預防蛋白質形成，或藉由對致使基因或 mRNA 產生此蛋白質的調控物進行調降或抑制。

若在研究或診斷中使用本發明之寡核苷酸，則該標靶核酸可係 cDNA 或源自 DNA 或 RNA 的合成核酸。

本發明提供一種用以調制表現 Tau 的標靶細胞中之 Tau 表現的活體內或活體外方法，該方法包含對該細胞投予有效量之本發明寡核苷酸。

在某些實施例中，所述標靶細胞是哺乳動物細胞，特別是人類細胞。所述標靶細胞可為體外細胞培養或為哺乳動物組織中的體內細胞形成部分。在較佳的實施例中，標靶細胞存在於腦或中樞神經系統中。在腦幹的特定細胞中，小腦、大腦皮質、額葉皮質、髓質/橋腦和中腦和脊髓是相關的目標區域。對於進行性上眼神經核麻痺 (PSP) 的治療，腦區域中的髓質/橋腦和中腦的目標減少是有利的。對於阿茲海默症的治療，腦區域中的大腦皮質、髓質/橋腦和中腦的目標減少是有利的。特別是在神經元中，神經細胞、軸突和基底神經節是相關的細胞類型。

在診斷學上，可藉由北方墨點法、原位 雜交或類似技術，利用寡核苷酸偵測並定量細胞及組織內的 MAPT 表現。

在治療方面，可對於疑似罹有可經由調制 Tau 表現而治療之疾病或疾患的動物或人投予寡核苷酸。

本發明提供用以治療或預防疾病的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患該疾病的受試者施用治療或預防上有效量之本發明寡核苷酸、寡核苷酸共軛體或醫藥組成物。

本發明亦涉及如本文中定義而可用為藥劑的寡核苷酸、組成物或共軛體。

依據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛體或醫藥組成物通常是以有效量施用。

本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛體在製造用以治療本文中所述疾患的藥劑上的用途，或提供治療本文中所提及之疾患的方法。

本文中所提及之疾病或疾患與 Tau 的表現有關。在一些實施例中，疾病或病症可與 Tau 基因中的突變或基因之蛋白質產物與 Tau 相關或交互作用相關。因此，在一些實施例中，標靶核酸是 Tau 序列的突變形式，並且在其他實施例中，標靶核酸是 Tau 序列的調制物。

本發明之方法較佳的是用於治療或預防因 Tau 異常含量及/或活性所導致的疾病。

本發明進一步涉及如本文中所定義之寡核苷酸、寡核苷酸共軛體或醫藥組成物在製造用以治療 Tau 異常含量及/或活性的藥劑上的用途。

在一個實施例中，本發明涉及用於治療選自下列疾病之寡核苷酸、寡核苷酸共軛體或醫藥組成物：Tau 異常沉積病變、阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、皮質基底核退化症 (CBD)、慢性創傷性腦病變 (CTE)、額顳葉失智症 (FTD) 及 FTDP-17、匹克症 (PiD)、嗜銀顆粒病 (AGD)、纏結為主的老年失智症 (TPSD)、與原發性年齡相關的Tau異常沉積病變 (PART)、唐氏症、關島 lytico-bodig 病、嬰兒型 Tau 異常沉積病變相關，包括半邊巨腦症 (HME)、結節性硬化症 (tuberous sclerosis complex)、局灶性皮質發育不良第 2b 型、神經節性神經膠質瘤、Hallervorden-Spatz 二氏症候群、腦鐵沉積性第 1 型的神經退化 (NBIA1)、神經節細胞瘤、亞急性硬化性泛腦炎、癲癇發作(癲癇)、網路功能障礙 (例如抑鬱) 及運動障礙 (movement disorder) (例如帕金森病)。

在某些實施例中，該疾病係選自由阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (progressive supranuclear palsy) (PSP)、額顳葉失智症 (fronto- temporal dementia) (FTD) 或 FTDP-17。 給藥

本發明之寡核苷酸或醫藥組成物可經由胃腸外方式施用 (例如靜脈注射、皮下、肌内、腦內、腦室內、眼內或鞘內給藥)。

在某些實施例中，所述給藥是經由鞘內給藥。

有利的是，例如在治療神經性疾患時，本發明之寡核苷酸或醫藥組成物是以鞘內或顱內方式施用，例如經由腦內或腦室內給藥。

本發明亦提供本發明之寡核苷酸或其共軛體，例如藥用鹽或組成物，在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於皮下給藥的劑型。

本發明亦提供本發明之寡核苷酸，或其共軛體，例如本發明之藥用鹽或組成物，在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於鞘內給藥的劑型。

本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛體在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於鞘內給藥的劑型。 組合療法

在某些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛體或醫藥組成物是用以與另一治療劑進行結合治療。所述治療劑可例如為用以照護上述疾病或疾患的標準品。 實施例 下列之本發明之實施例可與本文所述之任何其他實施例結合使用。 1.     一種長度 10 至 50 個核苷酸的反義寡核苷酸，其包含長度至少 10 個核苷酸、諸如長度 10 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列具有與表 4 中任何標靶序列 (R_1 至 R_2254) 至少 90% 互補性，諸如 100% 互補性。 2.     如實施例 1 之寡核苷酸，其中該標靶序列係選自目標區域 R_223、R_738 或 R_1298 之一者，分別對應SEQ ID NO：3、4 或 5。 3.     如實施例 1 或 2 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列係與SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12111、39562 至 39593 或 72837 至 72940 內之連續核苷酸 100%互補。 4.     如實施例 1 至 3 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列係至少 16 個核苷酸且與SEQ ID NO：1 的位置 12060 至 12078、位置 39573 至 39592 或位置 72862 至 72890 內之連續核苷酸 100% 互補。 5.     如實施例 1 至 4 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO：6 至 65 所組成之群組之序列。 6.     如實施例 1 至 5 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：9 或 11 之序列。 7.     如實施例 1 至 5 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含SEQ ID NO：49 之序列。 8.     如實施例 1 至 5 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含選自由SEQ ID NO：53、56 及 62 所組成之群組之序列。 9.     如實施例 1、2 或 5 或 6 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列相較於其互補之標靶序列具有零個至三個錯配。 10.   如實施例 9 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列相較於該標靶序列具有一個錯配。 11.   如實施例 9 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列相較於該標靶序列具有兩個錯配。 12.   如實施例 9 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列係與該標靶序列完全互補。 13.   如實施例 1 至 12 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係能夠調制 Tau 之表現。 14.   如實施例 13 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係能夠減少 Tau 之表現。 15.   如實施例 1 至 14 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係能夠以 ΔG° 低於 -10 kcal 雜交至該標靶序列。 16.   如實施例 1 至 15 之寡核苷酸，其中該標靶序列係位於 RNA。 17.   如實施例 16 之寡核苷酸，其中該 RNA 係 mRNA。 18.   如實施例 17 之寡核苷酸，其中該 mRNA 係前 mRNA。 19.   如實施例 1 至 18 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由至少 14 個連續核苷酸、特定言之15、16、17、18、19、20、21、或 22 個連續核苷酸所組成。 20.   如實施例 1 至 18 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由 16 至 22 個核苷酸組成。 21.   如實施例 20 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含或由 18 至 20 個核苷酸組成。 22.   如實施例 1 至 21 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含或由長度 14 至 30 個核苷酸組成。 23.   如實施例 22 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含或由長度 16 至 24 個核苷酸組成。 24.   如實施例 22 或 24 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含或由長度 18 至 20 個核苷酸組成。 25.   如實施例 1 至 24 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或連續核苷酸序列係單股。 26.   如實施例 1 至 25 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸既不為 siRNA 亦不為自互補 (self-complementary)。 27.   如實施例 1 至 26 之寡核苷酸，其包含一個或多個修飾核苷。 28.   如實施例 27 之寡核苷酸，其中該一個或多個修飾核苷係高親和力修飾核苷。 29.   如實施例 27 或 28 之寡核苷酸，其中該一個或多個修飾核苷係 2' 糖修飾核苷。 30.   如實施例 29 之寡核苷酸，其中該一個或多個 2' 糖修飾核苷係獨立選自由 2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、2'-氟-ANA 及 LNA 核苷所組成之群組。 31.   如實施例 29 或 30 之寡核苷酸，其中該一或多個 2' 糖修飾核苷係 LNA 核苷。 32.   如實施例 31 之反義寡核苷酸，其中該 LNA 核苷係選自氧基-LNA、胺基-LNA、硫代-LNA、cET 及 ENA。 33.   如實施例 31 或 32 之反義寡核苷酸，其中該修飾 LNA 核苷係氧基-LNA 具有下列 2'-4' 橋 -O-CH₂ -。 34.   如實施例 33 之反義寡核苷酸，其中該氧基-LNA 係 β-D-氧基-LNA。 35.   如實施例 31 或 32 之反義寡核苷酸，其中該修飾 LNA 核苷係 cET 具有下列 2'-4' 橋 -O-CH(CH₃ )-。 36.   如實施例 35 之反義寡核苷酸，其中該 cET 係 (S)cET，即 6'(S) 甲基-β-D-氧基-LNA。 37.   如實施例 31 或 32 之反義寡核苷酸，其中該 LNA 係 ENA，具有下列 2' – 4' 橋 -O-CH₂ -CH₂ -。 38.   如實施例 29 或 30 之寡核苷酸，其中該一或多個 2' 糖修飾核苷係 MOE 核苷。 39.   如實施例 1 至 38 中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷間鍵聯。 40.   如實施例 39 之寡核苷酸，其中該經修飾之核苷間鍵聯係抗核酸酶。 41.   如實施例 39 或 40 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列內的該等核苷間鍵聯之至少 50% 係硫代磷酸酯核苷間鍵聯或硼烷磷酸酯核苷間鍵聯。 42.   如實施例 39 或 41 之寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列內的該等核苷間鍵聯之 80% 係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 43.   如實施例 39 至 42 之寡核苷酸，其中所有該連續核苷酸序列內的該等核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 44.   如實施例 1 至 43 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係能夠召募核糖核酸酶 H。 45.   如實施例 44 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或該連續核苷酸序列係缺口體。 46.   如實施例 45 之寡核苷酸，其中該缺口體具有式 5'-F-G-F'-3'，其中該 F 及 F' 翼區域獨立地包含或由 1 至 8 個核苷組成，其中 2 至 5 個係如實施例 32 至 38 之 2' 糖修飾核苷，且 G 係能夠召募核糖核酸酶 H 的介於 6 與 16 個核苷之間之區域。 47.   如實施例 46 之反義寡核苷酸，其中各翼區域 (F 及 F') 係特徵在於具有至少一個 2' 糖修飾核苷在 5' 端，且 該翼之 3' 端及該 G 區域具有一個 DNA 核苷相鄰於該翼區域 (如 G 區域 5' 及 3' 端)。 48.   如實施例 46 或 47 之寡核苷酸，其中在區域 F 及 F' 中之所有 2' 糖修飾核苷係相同 LNA 核苷。 49.   如實施例48 之寡核苷酸，其中所有 LNA 核苷係氧基-LNA 核苷。 50.   如實施例 46 或 47 之寡核苷酸，其中在區域 F 及 F' 中之所有 2' 糖修飾核苷係相同 MOE 核苷。 51.   如實施例 46 至 50 之寡核苷酸，其中 a)     該 F 區域長度為介於 3 與 8 個核苷酸之間，且由 3 至 5 個相同的 LNA 核苷和 0 至 4 個 DNA 核苷組成；且 b)     該 F' 區域長度為介於 2 與 6 個核苷酸之間，且由 2 至 4 個相同的 LNA 核苷和 0 至 2 個 DNA 核苷組成；且 c)     區域 G 係介於 6 與 14 個 DNA 核苷酸。 52.   如實施例 46 或 47 之寡核苷酸，其中區域 F 或 F' 中的至少一者進一步包含至少一個 2' 取代修飾核苷，其獨立地選自由下列所組成之群組：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA 及 2'-氟-DNA。 53.   如實施例 46 至 50 或 52 之寡核苷酸，其中在區域 G 中之核糖核酸酶 H 召募核苷係選自 DNA、α-L-LNA、C4' 烷基化 DNA、ANA 及 2'F-ANA 及 UNA。 54.   如實施例 53 之寡核苷酸，其中在區域 G 中之核苷係 DNA 及/或 α-L-LNA 核苷。 55.   如實施例 53 或 54 之寡核苷酸，其中區域 G 由至少 75% DNA 核苷組成。 56.   如實施例 53 至 55 之寡核苷酸，其中該區域 G 中之所有核苷酸係 DNA。 57.   如實施例 1-56之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自 CMP-ID-NO：9_102；9_103；9_104；11_1；49_38；49_51；49_179；49_189；53_1；56_1 及 62_1。 58.   如實施例 57 之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由下列所組成之群組之化合物：

其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 59.   如實施例 1 至 58 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 2 中所示之 CMP-ID-NO：9_103。 60.   如實施例 1 至 58 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 3 中所示之 CMP-ID-NO：9_104。 61.   如實施例 1 至 58 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 4 中所示之 CMP-ID-NO：11_1。 62.   如實施例 1 至 58 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 5 中所示之 CMP-ID-NO：49_38。 63.   如實施例 1 至 58 中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 6 中所示之 CMP-ID-NO：49_189。 64.   一種共軛體，其包含如申請專利範圍 1 至 58 中任一項之寡核苷酸，以及至少一個共價接附於該寡核苷酸之共軛體部分。 65.   如實施例 59 之寡核苷酸共軛體，其中該共軛體部分係選自碳水化合物、細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素、維生素、病毒蛋白質或其組合。 66.   如實施例 59 或 65 之寡核苷酸共軛體，其中該共軛體有助於跨血腦障壁遞送。 67.   如實施例 66 之寡核苷酸共軛體，其中該共軛體係靶定運鐵蛋白受體的抗體或抗體片段。 68.   如實施例 59 至 67 之寡核苷酸共軛體，其包含連接子，其位在介於該寡核苷酸與該共軛體部份之間。 69.   如實施例 68 之寡核苷酸共軛體，其中該連接子係生理上不安定之連接子。 70.   一種醫藥組成物，其包含實施例 1 至 58 之寡核苷酸或實施例 59 至 69 之共軛，及醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑。 71.   一種製造實施例 1 至 58 之寡核苷酸之方法，其包含使核苷酸單元進行反應，藉此形成包含在該寡核苷酸中之共價連接之連續核苷酸單元。 72.   如實施例 71 之方法，其進一步包含使該連續核苷酸序列與非核苷酸共軛部分反應。 73.   一種製造實施例 70 之組成物之方法，其包含將該寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐劑混合。 74.   一種於活體內或活體外調制表現 Tau 的標靶細胞中之 Tau 表現之方法，該方法包含對該細胞投予有效量之如實施例 1 至 57 之寡核苷酸或如實施例 59 至 69 之共軛體或如實施例 70 之醫藥組成物。 75.   一種治療或預防疾病之方法，其包含對已罹患或易於罹患該疾病之個體投予治療或預防上有效量之如實施例 1 至 58 之寡核苷酸或如實施例 59 至 69 之共軛體或如實施例 70 之醫藥組成物。 76.   如實施例 1 至 57 之寡核苷酸或如實施例 59 至 69 之共軛體或如實施例 70 之醫藥組成物，其係用為治療或預防個體之疾病的藥物。 77.   一種如實施例 1 至 58 之寡核苷酸或如實施例 59 至 69 之共軛體之用途，其係用於製備供治療或預防個體之疾病的藥物。 78.   如實施例 75 至 77 之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係與 Tau 活體內活性相關。 79.   如實施例 75 至 78 之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係與 Tau 之過量表現及/或 Tau 異常含量相關。 80.   如實施例 79 之方法、寡核苷酸或用途，其中該 Tau比沒有如實施例 1 至 58 之寡核苷酸或如實施例 59 至 69 之共軛體或如實施例 70 之醫藥組成物時之表現，減少至少 30%、或至少 40%、或至少 50%、或至少 60%、或至少 70%、或至少 80%、或至少 90%、或至少 95%。 81.   如實施例 75 至 79 之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係選自 Tau 異常沉積病變、阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (PSP)、皮質基底核退化症 (CBD)、慢性創傷性腦病變 (CTE)、額顳葉失智症 (FTD) 及 FTDP-17、匹克症 (PiD)、嗜銀顆粒病 (AGD)、纏結為主的老年失智症 (TPSD)、與原發性年齡相關的 Tau 異常沉積病變 (PART)、唐氏症、關島 lytico-bodig 病、嬰兒型 Tau 異常沉積病變相關，包括半邊巨腦症 (HME)、結節性硬化症 (tuberous sclerosis complex)、局灶性皮質發育不良第 2b 型、神經節性神經膠質瘤、Hallervorden-Spatz 二氏症候群、腦鐵沉積性第 1 型的神經退化 (NBIA1)、神經節細胞瘤、亞急性硬化性泛腦炎、癲癇發作(癲癇)、網路功能障礙 (例如抑鬱) 及運動障礙 (movement disorder) (例如帕金森病)。 82.   如實施例 75 至 79 之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係選自阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (progressive supranuclear palsy) (PSP)、額顳葉失智症 (fronto- temporal dementia) (FTD) 或 FTDP-17。 83.   如實施例 75至 82 之方法、寡核苷酸或用途，其中該個體係哺乳動物。 84.   如實施例 83 之方法、寡核苷酸或用途，其中該哺乳動物係人。 實例 材料與方法 寡核苷酸模體序列與寡核苷酸化合物 表 5：寡核苷酸模體序列 (以SEQ ID NO表示)、其設計以及基於模體序列所設計的具體寡核苷酸化合物 (以 CMP-ID-NO表示) 的清單。 模體序列代表寡核苷酸中存在的核鹼基的連續序列。 設計指的是缺口體設計，F-G-F'。在經典的缺口體設計中，例如 3-10-3，側翼 (F 和 F') 中的所有核苷酸由相同的 2'-糖修飾核苷所構成，例如 LNA、cET、或 MOE，並且在中間的一段 DNA 形成缺口 (G)。在具有交替側翼設計的缺口體中，寡核苷酸之側翼係經註解為一系列整數，表示許多 2' 糖修飾核苷 (M)，隨後是許多 DNA 核苷 (D)。例如，具有 2-2-1 模體之側翼表示 5' [M]₂ -[D]₂ -[M] 3' 且 1-1-1-1-1 模體表示 5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'。兩個側翼在 5' 和 3' 端均具有 2' 糖修飾核苷。由許多 DNA 核苷 (通常在 6 和 16 之間) 構成的缺口區 (G) 位於側翼之間。 表中的標題「寡核苷酸化合物」代表基元序列的特定設計。大寫字母代表 β-D-氧基 LNA 核苷，有劃底線大寫字母代表 MOE 核苷，小寫字母代表 DNA 核苷，所有 LNA C 是 5-甲基胞嘧啶，e 代表 5-甲基胞嘧啶 DNA，所有核苷間鍵聯都是硫代磷酸酯核苷間鍵聯 (除非在核苷酸之間用下標字母標記)，下標 o 代表磷酸二酯鍵。 寡核苷酸合成

寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。

在 Oligomaker 48 上，以 1 微莫耳刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於 60℃ 處理 5 至 16 小時，將所述寡核苷酸自撐體上裂解。使用逆相 HPLC (RP-HPLC) 或固相萃取來進行所述寡核苷酸的純化，之後以 UPLC 進行特性分析，再用 ESI-MS 進一步確定分子質量。 寡核苷酸的延長：

利用 5'-O-DMT-保護醯胺在乙腈中的 0.1 莫耳溶液以及 DCI (4,5–二氰基咪唑) 的乙腈 (0.25 莫耳) 溶液做為激活物，進行 β-氰乙基-亞磷醯胺 (DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf) 或 LNA-T) 的耦合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附複合基團的 C6 連接子，或複合基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵聯，使用氫化黃原素 (0.01 莫耳於乙腈/吡啶 9:1) 執行硫醇化處理。可利用 0.02 莫耳的碘於 THF/吡啶/水 7:2:1 導入磷酸二酯鍵聯。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。

可於固相合成的最後循環使用經商購取得的 C6 胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自撐體裂解後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入共軛體。 以 RP-HPLC 純化：

使用製備性 RP-HPLC 在 Phenomenex Jupiter C18 10µ 150x10 毫米管柱上對粗產化合物進行純化。使用 0.1 莫耳 pH 為 8 的醋酸銨及乙腈為緩衝液，流速為每分鐘 5 毫升。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。 縮寫：

DCI：         4,5-二氰基咪唑 DCM：        二氯甲烷 DMF：        二甲基甲醯胺 DMT：        4,4'-二甲氧三苯甲基 THF：         四氫呋喃 Bz：           苯甲醯基 Ibu：          異丁醯基 RP-HPLC： 逆相高效液相層析 T_m 檢驗：

將寡核苷酸及 RNA 目標 (磷酸鹽連結，PO) 雙鏈體在 500 毫升無 核糖核酸酶水中稀釋至 3 毫莫耳，而後與 500 毫升 2x T_m 緩衝液 (200 毫莫耳氯化鈉、0.2 毫莫耳 EDTA、20 毫莫耳磷酸鈉，pH 7.0) 混合。將所述溶液加熱至 95℃ 並維持 3 分鐘，而後放置在室溫中退火 30 分鐘。在配備有 Peltier 溫度編程器 PTP6 的 Lambda 40 UV/VIS 分光光度計上利用 PE Templab 軟體 (Perkin Elmer) 測量雙鏈體融化溫度 (T_m )。溫度自 20℃ 漸升至 95℃，然後降至 25℃，於 260 奈米處記錄吸收度。利用第一衍生物及融化和退火的局部最大值來評估雙鏈體 T_m 。 初代神經元細胞培養

初代神經元培養物係建立自小鼠 tau 基因剔除背景上表現人 tau 轉殖基因的 E18 基因轉殖小鼠的前腦。(Andorfer 等人，J Neurochem 86:582–590 (2003))。根據製造商的操作方案 (Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)，藉由木瓜酶消化產生初代神經元。簡言之，從小鼠 MAPT 無效之背景上表現完整的人微管相連蛋白 Tau (MAPT) 基因之 hTau 小鼠 E18 BAC-Tg 胚胎解剖前腦，且在木瓜酶/DNase (DNA水解酶)/Earle 平衡鹽溶液 (EBSS) 溶液中於 37°C 培育 30 至 45 分鐘。在研磨和離心細胞沉澱後，將反應藉由與含有蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白 (BSA) 和 DNA 水解酶的 EBSS 一起培育來終止。將細胞研磨並用補充有 2% B-27、100 μg/ml 青黴素、85 μg/ml 鏈黴素和 0.5 mM 麩醯胺酸的 Neurobasal (NB, Invitrogen) 洗滌。 基因轉殖 Tau 小鼠 (hTau 小鼠)

雄性和雌性基因轉殖小鼠 (30-40g) 表現 tau 轉殖基因，其源自人 PAC (係由 tau 啟動子驅動的 H1 單倍型) (Polydor 等人，J. Neurosci. (2009) 29(34): 10741-9)，且其中天然小鼠 Tau 基因係已刪除，係用於評估耐受性、藥效學終點和組織藥物濃度。

使動物居住於維持在固定溫度 (21 ± 2℃) 及濕度 (50 ± 10%) 的聚落室中，並且每天照光 12 小時 (早晨 6:00 開始光照)。所有動物在研究期間均可任意 取用食物及飲水。行為研究係在 0700 至 1500 小時進行。

根據 Haley 和 McCormick 的方法，使用配有 27 或 30 號針頭的 Hamilton 微注射器進行腦室內 (ICV) 注射。針頭在離尖端 2.5 mm 處配有聚乙烯護罩，以限制其穿透腦部。使用異氟烷麻醉劑 (1.5-4%) 麻醉小鼠。待予注射之小鼠係用一手的拇指和食指將頸部後方的鬆弛皮膚抓住。施加溫和但穩定的壓力，然後藉由壓靠在堅固平坦表面上來固定動物的頭部。然後將針尖插入穿過頭皮及頭骨，前囟的側向約 1 mm 及尾部 1 mm 處。一旦針被定位，ASO 在鹽水載劑中以 5 微升的體積給予，並在 20 至 30 秒注射到右側 (或左側) 側腦室。在移除之前將針留在原位 10 秒。此程序不需要手術或切開。將動物置於加熱墊上保溫，直到他們從程序中恢復為止。

投予後 3 天和/或 4 週，用過量異氟醚犧牲小鼠，然後快速斷頭，在乾冰上收集腦組織 (右側，額葉皮質區域) 以用於後來的 Tau qPCR。 用於細胞培養和分化人幹細胞衍生神經元的培養基 N2B27 + SFA 培養基 = N2B27 + S,F,A 細胞介素

N2B27 + BGAA 培養基 = N2B27 + B,G,Aa,cA 細胞介素 +P/S+ 層連結蛋白

實例 1 ASO 靶向 MAPT 內含子之活體外篩選

在來自人源化 Tau 小鼠 (807 ASO 靶向 MAPT 內含子) 的初代神經元細胞中進行反義寡核苷酸 (ASO) 篩選。

藉由 QUANTIGENE® 分析測量 ASO 在活體外減少 MAPT mRNA 的能力。各個 tau mRNA 減少係藉由減去檢定背景信號並經由持家基因微管蛋白 mRNA 信號使每個孔歸一化來標準化。

初代神經元細胞培養係如「材料和方法」部分中所述來製備，且以每孔 10,000 個細胞平板接種在聚-D-離胺酸塗覆的 384 孔平板上，並維持在含有 B27、glutamax 和 青黴素-鏈黴素的 Neurobasal 培養基中。將 ASO 稀釋在水中並加入到 DIV01 的細胞中至最終濃度為 0.5 µM。加入 ASO 後，將神經元在 37℃ 和 5% CO₂ 下培育 5 天，以達到 mRNA 的穩態減少。除去培養基並將細胞在 DPBS 中洗滌 1 次。溶裂物訊息 RNA 的測量使用 QUANTIGENE® 2.0 Reagent System (AFFYMETRIX®) 來進行，其使用分支 DNA 訊號擴增方法定量 RNA 依賴於特異設計的 RNA 捕獲探針 (capture probe) 組。細胞係使用藉由將 50 µl 蛋白酶 K 加入到 5 ml 預熱的溶裂混合物中所製的工作細胞溶胞緩衝液來溶裂，並用 dH₂ O 稀釋至 1:4 最終稀釋。將工作溶胞緩衝液加入平板 (45 µl/孔) 中、研磨混合、密封並在 55℃ 培育 30 分鐘。溶裂後，將孔儲存在 -80℃ 或立即檢定。

取決於所用的特異性捕獲探針 (tau 或微管蛋白)，將溶裂物稀釋在溶裂混合物中。然後將 27 µl/孔總量加入捕獲平板 (塗覆有捕獲探針的 384 孔聚苯乙烯平板)。根據製造商的說明 (QUANTIGENE® 2.0 AFFYMETRIX®)，工作探針組試劑係藉由組合 2.2 ml 無核酸酶水、1.2 ml 之溶裂混合物、184 µl 封阻試劑、和 66.8 µl specific 2.0 探針組 (人 MAPT，目錄 #15486) 及小鼠 β3 微管蛋白 (目錄 #SB-17245) 而產生。然後將 7 µl 工作探針組試劑加入到捕獲平板上的 27 µl 溶裂物稀釋液 (或 27 µl 溶裂混合物用於背景樣本)。將平板離心，然後在 55℃ 培育 16-20 小時以雜交 (目標 RNA 捕獲)。藉由用緩衝液洗滌平板 3 次以除去未結合的物質，開始信號放大和目標 RNA 的偵測。將 2.0 Pre-Amplifier 雜交試劑 (30 µl/孔) 加入，在 55℃ 下培育 1 小時，然後吸出並加入洗滌緩衝液並吸出 3 次。然後如所述加入 2.0 Amplifier 雜交試劑 (30 µl/孔)，在 55℃ 培育 1 小時並如前所述重複洗滌。接下來加入 2.0 Label Probe 雜交試劑 (30 µl/孔)，在 50℃ 培育 1 小時並如前所述重複洗滌。最後，將平板離心以除去任何過量的洗滌緩衝液，並加入 2.0 基質 (30 µl/孔)。將平板在室溫下培育 5 分鐘，並在 15 分鐘內以光度計模式在 PerkinElmer Envision 多重標記讀數器上對平板成像。

對於關注之基因，從每個技術重複的平均信號中減去平均測定背景信號。將關注之基因的已減去背景之平均信號除以持家微管蛋白 RNA 的已減去背景之平均信號。經處理樣本之抑制百分比係相對於未經處理樣本來計算 (即，該值越低，抑制越大)。未經處理樣品的背景變異性可導致經處理樣本的抑制百分比等於或高於背景，並且在這些情況下，抑制百分比表示為 100% 對照抑制 (即無抑制)。

圖 1 顯示所有 807 ASO 所達到的 MAPT mRNA 減少。在圖中，顯示 MAPT 標靶核酸上的三個區域 A、B 和 C。這些區域的 ASO 盛行率高，與對照組 (100%) 相比，使目標降低到 40% 或更低。 實例 2 ASO 靶定 MAPT 上的選定區域之活體外篩選

基於實例 1 中的篩選，設計新的 ASO 庫以靶定區域 A、B 和 C，如圖 1 所示。模體序列及寡核苷酸化合物係示於上述表 5。

如實例 1 中所述進行篩選。結果示於表 6 中。 表 6 抗 MAPT 化合物的活體外篩選

實例 3 選擇之寡核苷酸的 IC50 值

使用 96 孔檢定，在初代神經元細胞中活體外判定來自實例 2 的一些表現最佳的寡核苷酸的 IC 50。

初代神經元細胞培養係如「材料和方法」部分中所述來製備，且以每孔 50,000 個細胞平板接種在聚-D-離胺酸塗覆的 96 孔平板上，並維持在含有 B27、glutamax 和青黴素-鏈黴素的 Neurobasal 培養基中。將 ASO 稀釋於水中 (用於 IC50 測定) 並在平板接種後 1 天 (DIV01) 加入細胞中。對於 IC₅₀ 測定，將神經元以 0.5 至 5 μM 的最高濃度來處理，並使用約 1:4 的濃度反應稀釋度來定義 IC50。對應於 WO2016/126995 中的 ASO-001933 的 CMP-ID-NO：66_1 係作為陽性對照。ASO 處理後，將神經元在 37℃ 下培育 5 天，以達到 mRNA 的穩態減少。除去培養基並如下溶裂細胞。溶裂物訊息 RNA 的測量使用 QUANTIGENE^® 2.0 Reagent System (AFFYMETRIX^® ) 來進行，其使用分支 DNA 訊號擴增方法定量 RNA 依賴於特異設計的 RNA 捕獲探針 (capture probe) 組。工作細胞溶胞緩衝液係藉由將 50 µl 蛋白酶 K 加入到 5 ml 預熱的溶裂混合物中所製成，並用 dH₂ O 稀釋至 1:4 最終稀釋。將工作溶胞緩衝液加入平板 (150 µl/孔) 中、研磨混合、密封並在 55℃ 培育 30 分鐘。溶裂後，將孔儲存在 -80℃ 或立即檢定。

取決於所用的特異性捕獲探針 (tau 或微管蛋白)，將溶裂物稀釋在溶裂混合物中。然後將 80 µl/孔總量加入捕獲平板 (塗覆有捕獲探針的 96 孔聚苯乙烯平板)。根據製造商的說明 (QUANTIGENE^® 2.0 AFFYMETRIX^® )，工作探針組試劑係藉由組合 12.1 µl 無核酸酶水、6.6 µl 之溶裂混合物、1 µl 封阻試劑、0.3 µl specific 2.0 探針組 (人MAPT ，目錄 #15486) 及或是小鼠 β3 微管蛋白 (目錄 #SB-17245) 而產生。然後將 20 µl 工作探針組試劑加入到捕獲平板上的 80 µl 溶裂物稀釋液 (或 80 µl 溶裂混合物用於背景樣本)。將平板離心，然後在 55℃ 培育 16-20 小時以雜交 (捕捉標靶 RNA)。藉由用緩衝液洗滌平板 3 次以除去未結合的物質，來開始信號放大和標靶 RNA 的偵測。將 2.0 Pre-Amplifier 雜交試劑 (100 µl/孔) 加入，在 55℃ 下培育 1 小時，然後吸出並加入洗滌緩衝液並吸出 3 次。然後如所述加入 2.0 Amplifier 雜交試劑 (100 µl/孔)，在 55℃ 培育 1 小時並如前所述重複洗滌。接下來加入 2.0 Label Probe 雜交試劑 (100 µl/孔)，在 50℃ 培育 1 小時並如前所述重複洗滌。最後，將平板離心以除去任何過量的洗滌緩衝液，並加入 2.0 基質 (100 µl/孔)。將平板在室溫下培育 5 分鐘，並在 15 分鐘內以光度計模式在 PerkinElmer Envision 多重標記讀數器上對平板成像。

數據判定：對於關注之基因，從每個技術重複的平均信號中減去平均測定背景信號。將關注之基因的已減去背景之平均信號除以持家微管蛋白 RNA 的已減去背景之平均信號。經處理樣本之抑制百分比係相對於未經處理樣本來計算 (即，該值越低，抑制越大)。未經處理樣品的背景變異性可導致經處理樣本的抑制百分比等於或高於背景，並且在這些情況下，抑制百分比表示為 100% 對照抑制 (即無抑制)。結果示於表 7 中。 表 7：抗 MAPT 化合物之 IC50

實例 4 活體內耐受性和活體內 Tau mRNA 減少

來自實例 2 的一些表現最佳的寡核苷酸係於人源化 Tau 小鼠中活體內測定以評估單一注射後的 3 天或 28 天在 CNS 的急性耐受性及 MAPT mRNA 減少。

藉由腦室內 (ICV) 注射投予基因轉殖 Tau 小鼠 100 µg ASO (參見材料和方法部分，基因轉殖 Tau 小鼠)。對應於 WO2016/126995 中的 ASO-001933 的 CMP-ID-NO：66_1 係作為陽性對照。在單一注射 ASO ICV 後觀察動物一小時的行為副作用。對副作用嚴重程度的急性耐受性評分為零 (無副作用) 至 20 (痙攣導致安樂死)。耐受性量表分為 5 個神經行為類別：1) 過動 2) 活動和喚起減少 3) 運動功能障礙/共濟失調 4) 異常姿勢和呼吸以及 5) 震顫/抽搐。每個類別的評分為 0-4 程度，最差可能總分為 20。觀察動物在家籠中的行為變化，然後將它們從家籠中取出以進行更詳細的觀察，包括測量握力和翻正反射。來自本發明的 ASO 的急性耐受性的數據列於表 8 中。

藉由 qPCR 如下分析右側額葉皮質區域中的 MAPT mRNA 減少。使用 Quiagen TissueLyzer II，將收集的小鼠腦組織 (參見材料和方法部分，基因轉殖 Tau 小鼠) 在 10 倍體積的高鹽/蔗糖緩衝液 (10 mM Tris-HCl，pH 7.4，800 mM NaCl，10% 蔗糖 (w/v)，1 mM EGTA) 中 (補充有磷酸酶抑制劑混合物組 2 和 3、1 mM PMSF (Sigma，Saint Louis，MO) 和完全蛋白酶抑制劑混合液 (無 EDTA) (Roche, Indianapolis, In) 均質。將均質物在 4℃ 以 20,000 × g 離心 20 分鐘。將上清液在 4℃ 以 100,000 × g 離心 1 小時。

對於 cDNA 合成和隨後的 PCR，將來自腦組織上清液的 300 ng RNA 加到 96 孔板 (Axygen, PCR-96-C-S) 的 1 孔中。向每個孔中加入 7.5 µl 主混合物 (每次反應 5 µl 的 2.5 mM NTP 混合物和 2.5 µl 隨機引子)，將平板以 1000 rpm 離心並在 70℃ 下置於熱循環儀中 3 分鐘。將平板立即在冰上冷卻並加入 4 µl 反應主混合物。在 PCR 之前，將平板短暫離心以收集孔底部的樣本。cDNA 合成在 42℃ 下進行 60 分鐘，在 95℃ 下進行 10 分鐘，然後在 4℃ 下保持。cDNA 樣本用分子生物學等級水 1:3 稀釋，並儲存在 -20℃ 直至進一步使用。

對於 PCR，每個樣本用兩個探針組一式三份進行 (MAPT：Taqman Expression assays Hs00902193_m1；GAPDH Taqman Expression assays Hs01922876_u1)。向每個反應中加入 4 µl 先前稀釋的 cDNA 和 6 µl 的主混合物，並將平板離心。將樣本在 95℃ 下培育 20 秒，然後依95℃ 培育 1 秒及在 60℃ 培育 20 秒循環 40 次。

使用 ΔCt 方法分析數據，其中首先將各樣本標準化為 GAPDH，然後以未處理對照的百分比來表示 (抑制百分比)。如果抑制百分比等於或高於對照細胞，則抑制百分比表示為零抑制。 表 8 hTau 小鼠的急性耐受性和活體內處理後 3 天和 4 週 MAPT mRNA的減少

NA = 未評估 實例 5：在人胚胎幹細胞 (hESC) 衍生神經元中的活體外功效。

在使用人胚胎幹細胞 (hESC) 衍生的神經元的替代活體外檢定中，在三種不同濃度 (200 nM、8 nM 及 0.32 nM) 下測試來自實例 2 的選定 ASO。出於比較目的，包括兩種先前技術的靶定 MAPT 的寡核苷酸，即對應於 WO2016/126995 中的 ASO-001933 的 CMP-ID-NO：66_1 和對應於 WO2018/064593 中的化合物 No 814907 的 CPM ID NO：67:1。人胚胎幹細胞 (ESC) 的培養和 ASO 處理：

神經幹細胞 (NSC) 係根據已發表之程序 (Chambers 等人，2009 Nat. Biotech. 7, 275–280) 而衍生自人 ESC。神經幹細胞 (NSC) 在 SFA 培養基中在 1 週內增殖成腹側化前驅細胞 (ventralized progenitor)，然後在 6 週期間分化為 BGAA 培養基中的神經元，對於培養基內含物，請參見材料和方法部分。

將細胞以 10,000 個細胞/cm² 的密度接種在塗覆聚鳥胺酸和層連結蛋白的燒瓶中的 N2B27 + SFA 培養基中。在第 4 天更換培養基。在 N2B27 + SFA 培養基中 7 天後，將細胞經胰蛋白酶處理，並以腹側化前驅細胞以密度為 50,000 個細胞/孔接種在 96 孔平板中之 N2B27 + BGAA 培養基中。

每週更換培養基兩次，並在第一次更換培養基時開始用 ASO 處理並持續 6 週。然後如下所述收獲細胞。qPCR 分析：

如下收獲經處理的神經元：去除培養基，然後加入 125 µl PURELINK^® Pro 96 溶胞緩衝液和 125 µl 70% 乙醇。根據製造商的說明純化 RNA，並在 50 µl 水的終體積中沖提，得到 10-20 ng/µl 的 RNA 濃度。接下來，在一步 qPCR 反應之前，將 RNA 在水中稀釋 10 倍。

對於一步 qPCR 反應，將 qPCR-混合物 (來自QauntaBio 的 qScriptTMXLE 1-step RT-qPCR TOUGHMIX^® Low ROX) 與二個 Taqman 探針以 10:1:1 的比例 (qPCR 混合物:探針 1:探針 2) 混合以產生主混合物。qPCR 以技術重複進行，且 Taqman 探針從 LifeTechnologies 獲得：MAPT_Hs00902193_m1；GAPDH 4325792 (用於標準化的持家基因)。

然後將主混合物 (6 µL) 和 RNA (4 µL，1-2 ng/µL) 在 qPCR 板 (MICROAMP^® optical 384 well，目錄號 4309849) 中混合。在密封平板後，將平板在室溫下以 1000 g 快速離心 1 分鐘，並轉移至 ViiaTM 7 系統 (Applied Biosystems, Thermo)。使用以下 PCR 條件：50°C，15 分鐘；95°C，3 分鐘；40 個循環：95℃ 5 秒，然後溫度降低 1.6 ℃/秒，然後 60℃ 45 秒。使用 QuantStudioTM Real_time PCR Software 分析數據。經 ASO 處理的樣本的抑制百分比係相對於對照處理的樣本來計算 (低值表明 MAPT 的大量減少)。結果在表 9 中顯示，為兩次技術重複的平均值。hESC 神經元中的 Tau 蛋白和 pTau 蛋白測量：

將經 PBS 洗滌的細胞萃取到含有 Cytobuster 蛋白質萃取試劑 (Merck-Millipore #71009)、1% 磷酸酶抑制劑混合物 3 (Sigma #P0044)、1% 蛋白酶抑制劑組 III (Calbiochem #539134)、1% DNA酶-I (Roche # 4536282001) 和 10 mM MgCl₂ 的緩衝液中。將細胞萃取物藉由吸量管上下吸吐而溶裂，然後在 -20℃ 下儲存直至使用。

藉由 AlphaLISA 使用包含 Tau 特異性抗體 5A6 (DSHB 抗體登記號：AB_528487) 和 Roche 內部 Tau 單株抗體 Tau 4/2 的內部檢定形式測量細胞萃取物中的總 Tau 水平。後者抗體係藉由以人全長 Tau (即最長的人腦同功異構體，441 個胺基酸) 免疫化小鼠來產生。Tau 4/2 與位於胺基酸 369 和 441 之間的 Tau 中的 C 端表位結合。簡而言之，將細胞萃取物稀釋到 AlphaLISA Hi Block 檢定緩衝液 (PerkinElmer AL004C) 中並與生物素化的 5A6 和 Tau 4/2 塗覆的 AlphaLISa 受體珠混合。在室溫下培育 1 小時後，將鏈黴抗生物素蛋白塗覆的供體珠加入混合物中。培育 30 分鐘後，在 Envision 平板讀數器 (ex 680 nm，em 615 nm) 中測量樣本。使用重組人 Tau (Merck-Millipore #AG960) 構建標準曲線。

使用包含 Tau 特異性抗體 5A6 (DSHB 抗體登記號：AB_528487) 和 Tau-pS422 特異性抗體 5.6.11 (描述於 WO2010/142423 及 Collin 等人 2014，Brain vol 137 P 2834-2846) 的 Roche 內部檢定形式，藉由 AlphaLISA 測量細胞萃取物中的 PhosphoTau (Tau-pS422) 水平。在檢定前將細胞萃取物稀釋到檢定緩衝液 B 中。緩衝液 B 包含 25 mM HEPES pH7.4、0.5% Triton X-100、0.1% Top Block (LuBio Science)、1 mg/ml Dextran500、10 % ELISA 封阻試劑 (Roche)。使用如下製備的 ERK-磷酸化 Tau 製備標準曲線：如 Grueninger等人 (Neurobiology of Disease37 [2010] pp294-306) 中所述來製造重組人 Tau。藉由與活化的 MEKK1 (內部製造) 培育來活化重組 His-標記的 ERK2 (內部產生)。然後將活化的 ERK2 與 Tau 在含有 2mM ATP 的緩衝液中以 1:50 的莫耳比來培育。隨後藉由通過 Ni-NTA 瓊脂糖 (Qiagen) 除去 ERk2。隨後通過質譜術確定 S422 處的磷酸化程度。

結果示於表 9 中。 表 9 在三種不同濃度處理後，hESC 衍生的神經元中的 MAPT 減少和 Tau 蛋白減少。

實例 6：自實例 5 的所選化合物的 IC50

來自實例 5 的有效 ASO 的選擇係在相同的 hESC 衍生的神經元檢定中與兩個先前技術對照 (CMP-ID-NO 66_1 和 CMP-ID-NO 67_1) 一起測試，以判定標靶 mRNA 減少及 Tau 蛋白減少的 IC50。

如實例 5 中所述，使用以下寡核苷酸濃度進行實驗：1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128、0.00256 nM。

使用 GraphPad PRISM 軟體配適 IC50 值。結果示於表 10 中。

表 10 有關 MAPT 和 TAU 蛋白的 IC50 和最大功效 (為對照之 %)

從這些數據可以看出，在所有參數上，本發明的 CMP-ID-NO 9_103 和 CMP-ID-NO 49_38 更有效並且具有比先前技術化合物更好的 IC 50，而 CMP-ID-NO 53_1 似乎具有比先前技術化合物更好的最大減弱 (maximal knockdown) 和如 CMP-ID-NO：66_1 類似的 IC50。 實例 7 hTau 小鼠特定腦區的活體內活動

在單次低劑量 ICV 投予四周後，測試選自實例 5 的 ASO 在人源化 Tau 小鼠 (hTau 小鼠) 的特定腦區域中降低活體內標靶的能力。

在此實例中使用的人源化 Tau 小鼠是內部 Roche hTau P301S 基因轉殖小鼠品系，其在小鼠 Tau 背景上過量表現具有點突變 P301S 的人 Tau (最長的人腦同功異構體)。

如下所述，將人源化 Tau 小鼠藉由腦室內 (ICV) 注射投予 25 µg ASO。CMP-ID-NO：66_1 對應 WO2016/126995 中的 ASO-001933，係包括以供比較目的。體內 ICV 小鼠評估： 動物照護：

使不同性別且重量 16-23 克的動物居住於維持在固定溫度 (22 ± 2℃) 及濕度 (55 ± 10%) 的聚落室中，並且每天照光 12 小時 (早晨 6:00 開始光照)。所有動物在研究期間均可任意取用食物及飲水。所有小鼠實驗方式均經丹麥國家動物實驗倫理委員會核准。 腦室內注射：

經由腦室內 (ICV) 注射對小鼠施用化合物。每個處理組包括 6-8 隻混合性別的小鼠。進行 ICV 用藥前，先將小鼠秤重，並以異氟醚或異丙酚 (每公斤 30 毫克) 麻醉。進行腦室內注射時，將附有 FEP 導管及 23 號針的 Hamilton 微注射器固定在支架上，調整至刺穿正確距離 (3.9 毫米)，通過皮膚及頭骨後進入右側腦室。以一手拇指及食指握住待注射小鼠的頸背。施加輕柔但穩定的壓力，將頭部向上壓迫，使針頭在中間偏右 (中間外側) 的 1-2 毫米及眼睛後方的 1-2 毫米處刺穿頭骨。將 5 µl 測試化合物的快速推注劑或載體在 30 秒時間內以預設的輸注率注入。為避免回流，將小鼠在此位置多固定 5 秒鐘，然後小心放下，離開針頭。此程序不需要手術或切開。將動物置於加熱燈下，直到從麻醉中恢復為止。

在研究終止 (4 週) 時，在乾冰上收集腦組織 (皮質、髓質/橋腦和中腦) 以供分析 tau mRNA 和蛋白質。

組織均質：

使用 Qiagen TissueLyzer II 以 MagNA Pure LC RNA 分離組織裂解液 (Roche，美國印地安納州印第安納波利斯) 對小鼠腦組織樣本進行均質化。均質物在室溫下培養 30 分鐘，使其完全裂解。將裂解後的均質物以 13000 rpm 速度離心處理 3 分鐘，取上層液進行分析。自組織之 RNA 純化：

使用 MagNA Pure 96 儀器搭配套件 Cellular RNA Large Volume Kit (Roche，美國印地安納州印第安納波利斯)，自 350 微升的上層液中將 RNA 純化出來。RNA 樣本以無核糖核酸酶水標準化至每微升 2 奈克，並存放於 -20℃ 備用。如實例 5 中所述定量 MAPT mRNA 水平。小鼠腦組織的 Tau 蛋白測量：

預先稱重的冷凍組織係用 10 體積 (wt/vol) 的萃取緩衝液來萃取，該萃取緩衝液包含 10 mM TrisCl pH 7.4、800 mM NaCl、1 mM EGTA、10% 蔗糖、1% 磷酸酶抑制劑混合物 3 (Sigma #P0044)、1% 蛋白酶抑制劑組 III (Calbiochem #539134)。使用 PreCellys 組織破碎器 (20 秒，6500 rpm) 製備均質物。然後將均質物在 4℃ 下以 10'000×g 離心 20 分鐘並保留上清液用於分析。

使用 Perkin Elmer 提供的總 Tau AlphaLISA 套組 (Cat. Nr. AL271C)，藉由 AlphaLISA 測量萃取物中的 Tau 水平。該檢定中使用的抗體是套組提供的 BT2 和 Tau-12，兩者都與 tau 的中心區域結合。將萃取物稀釋到 HiBlock 檢定緩衝液中，然後將 5 µl 每種樣本用於檢定。或者，如供應商所述進行檢定

mRNA 和蛋白質定量的結果顯示在表 11 中 表 11：在單次 ICV 劑量的 25 µg ASO 後 4 週，在選定的腦區域中的活體內功效。對於四個腦區域顯示 MAPT mRNA (對照 %)，並且對於一個腦區域顯示 Tau 蛋白質 (對照 %)

從這些數據可以觀察到，即使在 25 µg 的相當低的濃度下，針對本發明之化合物，大多數腦區中也觀察到減少超過 20％，其中對照化合物顯示在此濃度下近乎在標靶處沒有減少標靶。 實例 8 hTau 小鼠的體內劑量反應和時程

使用三種不同劑量 (25 µg、50 µg 和 100 µg) 評估兩種 ASO (CMP-ID-NO：9_103 和 49_189) 的劑量反應，並且在投予後 1 週和 4 週測量特定腦區域中之標靶減少。為比較目的，在一周研究中的一些劑量中包括兩種先前技術化合物 (CMP-ID-NO：66_1_103 及 67_1)。

該實驗基本上如實例 7 中所述進行。然而，由於 Tau 蛋白具有超過一週的半衰期，在進行一週的劑量反應研究中，未測量 Tau 蛋白。結果示於表 12 及 13 中。

表 12 在單次 ICV 劑量 25 µg、50 µg 或 100 µg ASO 後 1 週或在 100 µg ASO 的單次 ICV 劑量後 4 週，選擇的腦區域中的活體內功效。針對四個腦區域顯示 MAPT mRNA (以對照 %)。

NA = 未評估

表 13 在 100 µg ASO 的單次 ICV 劑量後 4 週，Tau 蛋白的活體內減少 (以對照之 %)。

從表 12 和 13 中的數據可以看出，本發明化合物的表現明顯優於先前技術化合物，特別是當以 100 µg 給藥時。亦可觀察到 MAPT 減少在 4 週仍維持。此外，在用單劑量的 100 µg 化合物處理 4 週後，本發明的化合物顯示 Tau 蛋白的顯著降低。

圖 1： 從涵蓋 MAPT 上所有內含子區域的寡核苷酸庫 (實例 1) 篩選結果。每個點代表寡核苷酸化合物，x 軸描繪其在 MAPT 轉錄本上的位置，且 y 軸顯示相較於對照組時的 MAPT mRNA 餘留量 (低數量對應於 MAPT 的大量減少)。A、B 和 C 表示經選擇作為另外寡核苷酸化合物的標靶區域的 MAPT 轉錄本上的三個區域。 圖 2：化合物 9_103 (核鹼基之序列顯示於SEQ ID NO 9) 圖 3：化合物 9_104 (核鹼基之序列顯示於SEQ ID NO 9) 圖 4：化合物 11_1 (核鹼基之序列顯示於SEQ ID NO 11) 圖 5：化合物 49_38 (核鹼基之序列顯示於SEQ ID NO 49) 圖 6：化合物 49_189 (核鹼基之序列顯示於SEQ ID NO 49) 圖 2、圖 3、圖 4、圖 5 及圖 6 中所示的化合物以質子化形式示出，也就是硫代磷酸酯鍵聯上的硫原子經質子化；應知質子的存在將取決於分子的環境酸性以及是否有選擇性陽離子的存在 (例如當所述寡核苷酸的形式為鹽時)。質子化硫代磷酸酯是以互變異構的形式存在。

Claims (21)

1. 一種長度 10 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸包含長度至少 10 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1 的位置 12051 至 12111、39562 至 39593 或 72837 至 72940 內之連續核苷酸至少 90% 互補性。
2. 如請求項 1 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列係至少 16 個核苷酸且與SEQ ID NO：1 的位置 12060 至 12078、39573 至 39592 或位置 72862 至 72890 內之連續核苷酸 100% 互補。
3. 如請求項 1 或 2 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列選自由SEQ ID NO：9、11、49、53、56 及 62 所組成之群組。
4. 如請求項 1 或 2 之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠減少 Tau 之表現。
5. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含一或多個獨立選自下列所組成群組中之經 2' 糖修飾之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖基核酸 (ANA)、2'-氟-ANA 及 LNA 核苷。
6. 如請求項 5 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含 4 至 8 個 LNA 核苷。
7. 如請求項 2 或 6 之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列內的核苷間鍵聯中至少 80% 係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
8. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列係由式 5'-F-G-F'-3' 之缺口體 (gapmer) 組成或包含式 5'-F-G-F'-3' 之缺口體，其中 F 及 F' 區域獨立地包含 1 至 8 個核苷，其中 2 至 5 個係經 2' 糖修飾且界定該 F 及 F' 區域之 5' 及 3' 端，且 G 係能夠召募核糖核酸酶 H 的 6至 16 個核苷之區域，諸如包含 6 至 16 個 DNA 核苷之區域。
9. 如請求項 2 或 3中任一項之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自由下列所組成之群組之化合物： CTTtAATttaatcactcAT        SEQ ID NO：9；CMP-ID-NO：9_102 CTTTaatttaatcacTCAT        SEQ ID NO：9；CMP-ID-NO：9_103 CTTTaatttaatcaCtCAT        SEQ ID NO：9；CMP-ID-NO：9_104 CTTTaatttaatcaCTCA         SEQ ID NO：11；CMP-ID-NO：11_1 TtaaCTCAaatcaaTtctCA     SEQ ID NO：49；CMP-ID-NO：49_38 TtaActCAaatcaattCTCA     SEQ ID NO：49；CMP-ID-NO：49_51 TTAactCaaatcaatTCtCA     SEQ ID NO：49；CMP-ID-NO：49_179 TTAActcaaatcaattCTCA     SEQ ID NO：49；CMP-ID-NO：49_189 CAACaccttttaattcATTA      SEQ ID NO：53；CMP-ID-NO：53_1 CTCAtcaacaccttttaaTT       SEQ ID NO：56；CMP-ID-NO：56_1 TTAactcatcaacaCCTT        SEQ ID NO：62；CMP-ID-NO：62_1 其中大寫字母為 β-D-氧基 LNA 核苷，小寫字母為 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
10. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 2 中所示之 CMP-ID-NO：9_103。
11. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 3 中所示之 CMP-ID-NO：9_104。
12. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 4 中所示之 CMP-ID-NO：11_1。
13. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 5 中所示之 CMP-ID-NO：49_38。
14. 如請求項 2 或 3 之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係如圖 6 中所示之 CMP-ID-NO：49_189。
15. 一種共軛體，其包含如請求項 1 至 14 之反義寡核苷酸，及至少一個共價接附該寡核苷酸之共軛體部分。
16. 一種如請求項 1 至 14 中任一項之反義寡核苷酸或如請求項 15 之共軛體之醫藥上可接受之鹽。
17. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 14 之反義寡核苷酸或如請求項 15 之共軛體，及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐劑。
18. 一種如請求項 1 至 14 中任一項之反義寡核苷酸或如請求項 15 之共軛體或如請求項 17 之醫藥組成物之用途，其係用於製備供治療或預防疾病之藥物。
19. 如請求項 18 之用途，其中該疾病係藉由調制標靶細胞中之 Tau 表現來治療或預防。
20. 如請求項 18 之用途，其中該疾病係選自由阿茲海默症 (AD)、進行性上眼神經核麻痺 (progressive supranuclear palsy) (PSP)、額顳葉失智症 (fronto- temporal dementia) (FTD) 或 FTDP-17 所組成之群組。
21. 如請求項 20 之用途，其中該疾病係進行性上眼神經核麻痺 (PSP)。

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