KR102658962B1 - 미셀 나노입자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 (i) 수용성 중합체, (ii) 양으로 하전된 담체, 및 (iii) 보조제 모이어티를 포함하는 양이온성 담체 단위를 포함하며, 여기서 양이온성 담체 단위가 양이온성 담체 단위와 정전기적으로 상호작용하는 음이온성 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)와 혼합될 때, 생성된 조성물은 코어에 음이온성 페이로드를 캡슐화하는 미셀로 자가-조직화된다. 양이온성 담체 단위는 또한 미셀의 표면에 표시될, 조직 특이적 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 양이온성 담체 단위를 포함하는 미셀, 양이온성 담체 단위 및 미셀의 제조 방법, 미셀을 포함하는 약제학적 조성물, 및 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 미셀을 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 병태의 치료 방법을 포함한다.

Description

미셀 나노입자 및 이의 용도
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(이름 4366_002PC02_Seqlisting_ST25; 크기: 5,392바이트, 생성 날짜: 2020년 6월 26일)의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 개시내용은 생리학적 투과 장벽, 예를 들어, 뇌 혈액 장벽을 가로질러 음이온성 페이로드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 전달하는데 사용될 수 있는 양이온성 담체 단위 및 미셀 시스템을 제공한다.
신체에는 특정 장벽이 존재하는데, 이는 막을 통한 약물의 투과성을 제한한다. 따라서, 선택적 물질만이 이러한 유형의 막을 통과할 수 있다. 일부 중요하고 전문화된 생리학적 장벽은 혈액 뇌 장벽 및 세포막이다. 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 순환하는 혈액을 뇌 및 추신경계(CNS)의 세포외액으로부터 분리하는 고도로 선택적인 반투과성 경계이다. 혈액-뇌 장벽은 모세혈관벽의 내피세포, 모세혈관을 감싸고 있는 말단-발 성상세포, 및 모세혈관 기저막에 박혀 있는 혈관주위세포에 의해 형성된다. 이 시스템은 신경 기능에 중요한 글루코스 및 아미노산과 같은 분자의 선택적 수송뿐만 아니라 수동 확산에 의한 물, 일부 기체 및 지용성 분자의 통과를 허용한다.
혈액-뇌 장벽은 병원체의 통과, 혈액 내 용질의 확산, 및 크거나 친수성인 분자가 뇌척수액(CSF)으로 들어가는 것을 제한하는 반면, O2, CO2, 소수성 분자(예를 들어, 호르몬) 및 작은 극성 분자의 확산은 허용한다(Johansen et al., (2017) Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. Epub(4): 659-668). BBB는 대형 분자 신경치료제의 거의 100% 및 모든 분자 약물의 98% 초과를 뇌에서 배제한다(Daneman & Prat(2015)“The Blood Brain Barrier”Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 7(1):a020412). 뇌의 특정 영역에 치료제를 전달하는 어려움을 극복하는 것은 대부분의 뇌 장애 치료에 있어 주요한 도전과제이다. 따라서, 진단 및 치료에 효과적일 수 있는 치료 분자는 적절한 양으로 BBB를 통과하지 못한다.
세포질에 도달하기 위해 외인성 분자가 먼저 세포막을 횡단해야 하기 때문에 세포내 표적화는 종종 또한 도전적이다. 지용성이며 세포막을 통과할 수 있는 비-극성 치료제에 대해 세포막은 선택적으로 투과성이다. 한편, 올리고뉴클레오티드와 같은 매우 하전된 치료제는 세포막에 의해 효과적으로 배제된다.
폴리뉴클레오티드는 음으로 하전된 막과 폴리뉴클레오티드 상의 높은 음전하 사이의 전하 반발로 인해 세포막을 쉽게 투과하지 못한다. 그 결과, 폴리뉴클레오티드는 생체이용률이 낮고 세포로의 흡수가 일반적으로 1% 미만이다(Dheur et al, Nucleic Acid Drug Dev., 9:522(1999); Park et al, J Controlled Release, 93:188(2003)). 대부분의 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 5,000Da 초과이므로 세포막을 통해 쉽게 확산될 수 없으며, 세포로의 흡수는 주로 음세포 또는 세포내이입 과정으로 제한된다. 세포 내부에 들어가면, 폴리뉴클레오티드가 리소좀 구획에 축적되어 세포질이나 핵에 대한 접근이 제한될 수 있다. 비경구로 투여된 폴리뉴클레오티드는 또한 세포질 내부 및 외부 모두에서 빠른 뉴클레아제 분해에 매우 민감하다. 연구에 따르면 i.v. 투여 후, 약 30분의 반감기로 혈액 중 빠른 폴리뉴클레오티드 분해를 보여준다(Geary et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 296:890-897(2001)).
따라서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전달이 직면한 문제는 대략 두 부분으로 나눌 수 있다. 첫째, 치료용 폴리뉴클레오티드는 세포질에 전달될 수 있는 방식으로 제형화되어야 하고, 둘째, 폴리뉴클레오티드는 손상되지 않고 완전히 기능하면서 세포 핵에 도달해야 한다. 치료제로서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체의 적용이 발전함에도 불구하고, 개선된 약리학적 특성, 예를 들어 혈청 안정성, 올바른 기관, 조직 또는 세포로의 전달, 및 막횡단 전달을 제공하는 전달 시스템에 대한 요구가 존재한다.
핵산 및 올리고뉴클레오티드의 막횡단 전달을 개선하기 위한 노력은 단백질 담체, 항체 담체, 리포솜 전달 시스템, 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 바이러스 벡터 및 인산칼슘-매개 형질전환을 이용하였다. 그러나 이러한 기술 중 다수는 막횡단 수송이 가능한 세포의 유형과 그러한 수송을 달성하는 데 필요한 조건에 의해 제한된다. 따라서, 동시에 혈청 안정성 및/또는 내인성 용해 효소(예를 들어,RNase)에 대한 내성을 개선하면서, 하전된 치료제(예를 들어, 안티미르와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 특정 표적 세포 또는 조직으로, 그리고 투과 장벽(예를 들어, 원형질막 또는 BBB)을 가로질러 선택적으로 유도할 수 있는 전달 시스템이 필요하다.
본 개시내용은
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (도식 I) 또는
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (도식 II)을 포함하는 양이온성 담체 단위를 제공하며, 여기서,
WP는 수용성 생중합체 모이어티이고;
CC는 양으로 하전된 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고; 그리고
L1 및 L2는 독립적으로 임의의 링커이고, 그리고
여기서 양이온성 담체 단위는 약 1:1의 이온비로 핵산과 혼합될 때 미셀을 형성한다.
일부 측면에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ"), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG")을 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 중합체는 다음을 포함한다:
여기서, n은 1-1000이다.
일부 측면에서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141이다. 일부 측면에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 또는 약 150 내지 약 160이다.
일부 측면에서, 수용성 중합체는 선형, 분지형 또는 수지상이다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 또는 적어도 50의 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40의 라이신 단량체를 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증 반응, 또는 조직 미세환경을 조절할 수 있다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 면역 반응을 조절할 수 있다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 종양이 있는 대상체에서 종양 미세환경을 조절할 수 있다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 종양 미세환경에서 저산소증을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 다음을 포함한다:
여기서,
(i) 각각의 G1 및 G2는 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬로부터 독립적으로 선택되고; 또는,
(ii) G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고; 그리고
n은 1-10이다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 다음을 포함한다:
여기서, Ar은 또는 이고, 여기서 Z1 및 Z2는 각각 독립적으로 H 및 OH로부터 선택된다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 염증 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 비타민이다. 일부 측면에서, 비타민은 사이클릭 고리 또는 사이클릭 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다.
일부 측면에서, 비타민은 다음을 포함한다:
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 C, N, O 및 S로부터 선택되고, n은 1 또는 2이다.
일부 측면에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서 비타민은 비타민 B3이다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20의 비타민 B3 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 또는 적어도 약 50의 비타민 B3 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 10의 비타민 B3 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 20의 비타민 B3 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 30의 비타민 B3 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 40의 비타민 B3 단위를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 120 내지 약 130의 PEG 단위를 갖는 수용성 생중합체 모이어티, 약 30 내지 약 40의 라이신 단위를 갖는 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10의 비타민 B3 단위를 갖는 보조제 모이어티을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 음이온성 페이로드를 추가로 포함하고, 이는 이온 결합을 통해 양이온성 담체 단위와 상호작용한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 120 내지 약 130의 PEG 단위를 갖는 수용성 수용성 생중합체 모이어티, 약 70 내지 약 90, 예를 들어, 약 80의 라이신 단위를 갖는 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 20 내지 약 40의 비타민 B3 단위, 예를 들어, 약 30의 비타민 B3 단위를 갖는 보조제 모이어티을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 음이온성 페이로드를 추가로 포함하고, 이는 이온 결합을 통해 양이온성 담체 단위와 상호작용한다.
또한, 본 개시내용은 본원에 개시된 양이온성 담체 단위 및 음이온성 페이로드를 포함하는 미셀을 제공하며, 여기서 양이온성 담체 복합체의 양이온성 담체 모이어티 및 음이온성 페이로드는 서로 회합된다. 일부 측면에서, 회합은 공유 결합이다. 다른 측면에서, 회합은 비-공유 결합이다. 일부 측면에서, 회합은 이온 결합이다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 양전하는 용액에서 음이온성 페이로드와 혼합될 때 미셀을 형성하기에 충분하며, 여기서 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 음이온성 페이로드의 음전하의 전체 이온비는 용액에서 약 1:1이다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 DNase 및/또는 RNase에 의한 분해로부터 음이온성 페이로드를 보호할 수 있다. 일부 측면에서, 음이온성 페이로드는 공유 결합에 의해 양이온성 담체 단위에 접합되지 않고/않거나 음이온성 페이로드는 이온 상호작용을 통해서만 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티와 상호작용한다.
일부 측면에서, 음이온성 페이로드의 반감기는 미셀에 혼입되지 않은 유리 음이온성 페이로드의 반감기에 비해 연장된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 미셀 내의 음이온성 페이로드의 음전하는 약 3:1, 약 2.9:1, 약 2.8:1, 약 2.7:1, 약 2.6:1, 약 2.5:1, 약 2.4:1, 약 2.3:1, 약 2.2:1, 약 2:1, 약 2:1, 약 1.9:1, 약 1.8:1, 약 1.7:1, 약 1.6:1, 약 1.5:1, 약 1.4:1, 약 1.3:1, 약 1.2:1, 약 1.1:1, 약 1:1, 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9 또는 약 1:3의 이온비에 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 미셀 내의 음이온성 페이로드의 음전하는 약 3:1 내지 약 1:3의 이온비에 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 미셀 내의 음이온성 페이로드의 음전하는 1:1의 전하비에 있다. 일부 측면에서, 미셀의 직경은 약 1nm 내지 100nm, 약 10nm 내지 약 100nm, 약 10nm 내지 약 90nm, 약 10nm 내지 약 80nm, 약 10nm 내지 약 70nm, 약 20nm 내지 약 100nm, 약 20nm 내지 약 90nm, 약 20nm 내지 약 80nm, 약 20nm 내지 약 70nm, 약 30nm 내지 약 100nm, 약 30nm 내지 약 90nm, 약 30nm 내지 약 80nm, 약 30nm 내지 약 70nm, 약 40nm 내지 약 100nm, 약 40nm 내지 약 90nm, 약 40nm 내지 약 80nm, 또는 약 40nm 내지 약 70nm 사이이다.
일부 측면에서, 음이온성 페이로드는 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 mRNA, miRNA, miRNA 스펀지, 터프 디코이 miRNA, 안티미르, 작은 RNA, rRNA, siRNA, shRNA, gDNA, cDNA, pDNA, PNA, BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 앱타머, 사이클릭 디뉴클레오티드, 또는 이들의 조합를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 측면에서, 뉴클레오시드 유사체는 잠금 핵산(LNA); 2'-O-알킬-RNA; 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산(ANA); 2'-플루오로-ANA, 헥시톨 핵산(HNA), 삽입 핵산(INA), 구속된 에틸 뉴클레오시드(cEt), 2'-O-메틸 핵산(2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 핵산(2'-MOE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 핵산은 5 내지 30의 뉴클레오티드 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포스포네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 이들의 조합을 포함하는 골격(backbone)을 갖는다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 임의로 링커를 통해 수용성 중합체에 연결된 표적화 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 조직을 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 조직은 간, 뇌, 신장, 폐, 난소, 췌장, 갑상선, 유방, 위, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 조직은 암 조직이다. 일부 측면에서 조직은 간이다. 일부 측면에서, 간 표적화 모이어티는 콜레스테롤을 포함한다. 일부 측면에서, 조직은 췌장이다. 일부 측면에서, 췌장 표적화 모이어티는 인테그린 수용체에 결합하는 리간드를 포함한다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 중추신경계를 표적화한다. 일부 측면에서, 뇌 표적화 모이어티는 대형 중성 아미노산 수송체 1(LAT1)에 의해 수송될 수 있다. 일부 측면에서, 뇌 표적화 모이어티는 아미노산이다. 일부 측면에서, 뇌 표적화 모이어티는 분지쇄 또는 방향족 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 아미노산은 발린, 류신 및/또는 이소류신이다. 일부 측면에서, 아미노산은 트립토판 및/또는 티로신이다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 양이온성 담체 단위 및 음으로 하전된 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본원에 개시된 양이온성 담체 단위, 조성물 또는 미셀, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 양이온성 담체 단위를 합성하는 것을 포함하는, 양이온성 담체 단위의 제조 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 미셀의 제조 방법은 양이온성 담체 단위를 용액 중에서 1:1의 이온비로 음으로 하전된 분자와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 미셀을 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 미셀을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 미셀의 코어에 있는 음이온성 페이로드는 미셀에 혼입되지 않은 상응하는 음이온성 페이로드보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 일부 측면에서, 대상체는 포유동물이다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 미셀의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 암은 신경교종, 유방암, 췌장암, 간암, 피부암 또는 자궁경부암이다. 일부 측면에서, 췌장암은 췌장 선암종이다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 미셀의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 대상체에서 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 미셀의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 대상체에서 신경발생을 회복 및/또는 유도하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 미셀의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 대상체에서 인지 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 미셀의 치료학적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 앓고 있는 대상체에서 아밀로이드 플라크 부담을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 미셀은 LAT1을 표적화하는 양이온성 담체 단위 및 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 서열번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 페이로드를 포함한다. 일부 측면에서, 단편은 서열번호: 18의 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 측면에서, 변이체는 서열번호: 18에 대한 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 측면에서, 유도체는 적어도 하나의 당 변형 및/또는 적어도 하나의 골격 변형을 포함한다.
도 1은 본 개시내용의 담체 단위의 예시적인 구조를 도시한다. 예시적인 담체 단위는 임의의 조직-특이적 표적화 모이어티, 수용성 중합체, 및 양이온성 또는 음이온성 담체 단위(각각 음이온성 또는 양이온성 페이로드와 상호작용할 수 있다)를 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성/음이온성 담체 및 음이온성/양이온성 페이로드는 테더되지 않고 정전기적으로 상호작용한다. 일부 측면에서, 양이온성/음이온성 담체 및 음이온성/양이온성 페이로드는 테더되고 정전기적으로 상호작용한다. 단순화를 위해, 수용성 중합체 및 양이온성/음이온성 담체 사이, 또는 양이온/음이온성 담체의 말단에 있을 수 있는 보조제 모이어티는 도면에 도시되어 있지 않다.
도 2는 중성 페이로드(예를 들어, 소수성 치료제)가 어댑터에 공유적으로 부착된 본 개시내용의 담체 단위 사용하여 중성 페이로드를 로딩하기 위한 대안적인 방법을 도시하며, 어댑터는 차례로 담체 단위의 양이온성 또는 음이온성 담체 모이어티와 정전기적으로 상호작용할 수 있다.
도 3은 본 개시내용의 담체 단위의 예시적인 구조를 도시한다. 제시된 예는 음이온 페이로드, 예를 들어 유전자, 예를 들어 miRNA(안티미르)를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산과 정전기적으로 상호작용할 수 있는 양이온 담체 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, AM은 WP와 CC 사이에 위치할 수 있다. CC 및 AM 성분은 단순성을 위해 선형 배열로 묘사된다. 그러나, 도 4에 예시된 바와 같이, CC 및 AM은 비계 방식으로 배열될 수 있다.
도 4는 음이온성 페이로드에 결합한 후 미셀 구조를 형성할 수 있는 뇌 표적화 모이어티를 포함하는 담체 단위의 1H-NMR 특성을 보여준다. 뇌-표적화 모이어티("뇌 표적 분자"로 표지된)에 상응하는 1H-NMR 차트는 뇌-표적화 모이어티(뇌 내피 상의 LAT1 표적에 결합하는 고리 구조를 함유하는 아미노산 모이어티)가 성공적으로 합성되었음을 보여준다. 두 번째 1H-NMR 차트("중합체"로 표지된)는 양이온성 PEG 블록 공중합체(양이온성 담체 모이어티 및 보조제 모이어티도 포함하는)가 또한 합성되었음을 보여준다.
도 5는 조직 특이적 표적화 모이어티가 미셀의 외부 표면을 장식하고 핵산 페이로드는, 예를 들어 미셀의 코어에 위치하는 미셀(다중이온 복합체 안티센스 올리고뉴클레오티드)에 본 개시내용의 담체 단위가 삽입되는 방법을 보여주는 개략도이다.
도 6은 수용성 생중합체(예를 들어, PEG)와 양이온성 담체(예를 들어, 폴리 라이신) 사이의 비율을 변경함으로써 본 개시내용의 미셀의 형태 및 크기, 및 그에 따른 로딩 용량이 어떻게 변형될 수 있는지를 보여준다. 비율에 따라 담체 단위는 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀으로 구성될 수 있다. 용어 "본 개시내용의 미셀"은 고전적 미셀 뿐만 아니라 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 7은 본 개시내용의 미셀에 함유된 페이로드가 중추 신경계의 표적 위치에 전달되는 메커니즘의 개략도를 도시한다. 미셀은 수용체 매개 통과세포외배출(transcytosis)에 이어 뇌 세포, 예를 들어 뉴런, 성상교세포 또는 미세아교세포에 의한 세포 흡수를 통해 혈액 뇌 장벽을 통과한다. 미셀은 세포질에서 분해되어 페이로드, 예를 들어 항-miRNA의 방출을 유도하며, 이는 표적 mRNA에 결합시 표적 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하거나 하향조절한다.
도 8은 본 개시내용의 미셀에서 페이로드의 캡슐화로 인한 안정성의 증가(혈장 반감기의 증가)를 나타낸다. 미셀이 없으면 항-microRNA(안티미르)는 혈장 반감기가 5분 미만이다. 본 발명의 미셀에 혼입된 후, 안티미르의 혈장 반감기는 80-120분으로 증가한다. 캡슐화 후, 실시예에 개시된 안티미르의 반감기는 5분 미만에서 약 93분으로 증가했다(즉, 혈장 반감기가 약 20배 증가).
도 9는 PBS에서 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 항-miRNA)-로드된 미셀의 입자 크기 분포를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 항-miRNA)-로드된 미셀은 32nm 입자 크기를 나타내며 미셀 집단이 균질함을 나타내는 낮은 PDI(다분산 지수) 분포를 나타낸다.
도 10은 상이한 조직에서 LAT1(SLC7A5) 용질 담체 계열 7 구성원 5[호모 사피엔스(인간)]의 분포를 나타낸다. 데이터는 NCBI에서 얻었고 20개의 인간 조직에서 총 RNA의 RNA 시퀀싱에 해당한다.
도 11은 상이한 마우스 조직에서 생체내 LAT1 발현 수준을 나타낸다.
도 12는 본 개시내용의 뇌 표적화 담체 단위를 이용한 LAT1 표적화를 나타낸다. 형광(Cy5.5) 표지된 뇌 표적화 담체 단위는 뇌 실질에서 발현되는 LAT1에 결합하고, 비-표적화된 Cy5.5 분자보다 더 높은 축적을 보인다.
도 13은 인간 미세아교세포, 성상교세포, 신경아세포-유사 SH-5Y 세포, 및 1차 간세포에 의한 Cy5.5 표지된 항-microRNA 로드된 미셀의 세포 흡수를 나타낸다. 각 유형의 세포를 Cy5.5로 배양한 후, 표지된 항-microRNA를 세포에 형질감염시키고 형광 이미지를 인큐사이트(IncuCyte) 이미징 플랫폼을 사용하여 48시간 동안 추적했다. 인간의 뇌세포(미세아교세포, 성상교세포, SH-5Y)에서는 항-microRNA의 흡수가 상당히 나타났으나, 간세포주인 간세포에서는 흡수가 관찰되지 않았다.
도 14는 표면에서 LAT1을 과발현하는 GL-26 세포에서 LAT1 표적성을 비교한 것이다. 도면은 LAT1 억제제를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 보여준다. 표적 미셀의 흡수는 비-표적 미셀에 대해 관찰된 흡수보다 3배 더 높았다. LAT1이 억제되었을 때, 비-표적 미셀 및 표적-미셀 사이에 유의한 흡수 차이는 관찰되지 않았다.
도 15는 정맥 주사 후 Cy5.5 표지된 유리 항-microRNA 및 본 개시내용의 미셀(ASO-MDS; 안티센스 올리고뉴클레오티드-미셀 운반 시스템)에 로드된 Cy5.5 표지된 유리 항-microRNA의 생체 분포를 비교한다. 주사를 통해 두 샘플을 마우스에 투여한 후, 전신 형광 이미지를 16시간 동안 시간 간격으로 캡처하였다.
도 16은 노출된(naked) 항-miRNA 투여(노출된 ASO)와 비교한 본 개시내용의 항-miRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)의 뇌 축적을 나타낸다. Cy5.5 표지된 항-miRNA-로드된 미셀을 정맥내 주사하고 뇌 조직의 용해 후 잔류 형광 강도를 측정하였다. 뇌 표적화 미셀은 비-표적 미셀에 비해 상당한 뇌 축적을 보였다.
도 17은 실험 절차의 개략도를 나타낸다. ASO-MDS 미셀, 즉, miRNA 485-3p 페이로드에 대한 LAT1 표적화 모이어티 및 안티미르를 포함하는 본 개시내용의 미셀을 8개월령 5XFAD 형질전환 마우스에 4주 동안 매주 주사하였다. ASO-MDS는 (i) miR485-3p에 대한 안티미르 및 (ii) 100개의 양이온성 담체 단위를 포함하며, 여기서 각 50개의 양이온성 담체 단위 각각은 페닐 알라닌(표적 모이어티)에 연결되고 50개의 양이온성 담체 단위는 각각은 모든 표적 모이어티에 연결되지 않는다. ASO-MDS의 각각의 양이온성 담체 단위는 47개의 라이신에 융합된 (PEG)5000을 포함하며, 여기서 10개의 라이신 각각은 양이온성 담체 단위에서 니코틴아미드, 즉 총 10개의 니코틴아미드에 연결된다.
도 18a는 ASO-MDS 처리 후 마우스 1차 신경교세포에서 Aβ의 식균작용의 향상을 나타낸다.
도 18b는 ASO-MDS 처리 후 마우스 1차 미세아교세포에서 Aβ의 식균작용의 향상을 보여준다.
도 18c는 ASO-MDS 처리 후 마우스 1차 미세아교세포에서 Aβ의 식균 작용의 향상을 보여준다. 이미지는 대조군 또는 ASO-MDS 처리된 1차 미세아교세포에서 Iba1(미세아교세포) 및 β-아밀로이드 1-16(6E10, Aβ 플라크 검출을 위해)의 면역 세포계측법을 보여준다.
도 19a는 5XFAD 마우스의 해마에서 ASO-MDS 전달이 신경염증을 감소시키는 것을 보여준다. 이미지는 모의(miR 단독 및 미셀 단독(각각 왼쪽 및 중간 패널) 및 ASO-MDS 처리된 5XFAD 마우스(오른쪽 패널)의 관상 뇌 절편에서 항-TNF-알파(상단 패널) 및 GFAP(하단 패널)을 사용한 면역조직화학 염색을 보여준다. (x 20) n = 3.
도 19b는 도 19a의 동일한 데이터의 막대 그래프를 도시한다. 왼쪽 막대는 miR 단독, 가운데 막대는 미셀 단독, 오른쪽 막대는 미셀 + miR이다.
도 20a는 5XFAD 마우스의 피질에서 ASO-MDS 전달이 신경염증을 감소시키는 것을 보여준다. 이미지는 모의(miR 단독 및 미셀 단독(각각 왼쪽 및 중간 패널) 및 ASO-MDS 처리된 5XFAD 마우스(오른쪽 패널)의 관상 뇌 절편에서 항-TNF-알파(상단 패널) 및 GFAP(하단 패널)을 사용한 면역조직화학 염색을 보여준다. (x 20)n = 3.
도 20b는 도 20a의 동일한 데이터의 막대 그래프를 도시한다. 왼쪽 막대는 miR 단독, 가운데 막대는 미셀 단독, 오른쪽 막대는 미셀 + miR이다.
도 21a는 ASO-MDS 전달이 5XFAD에서 아밀로이드 플라크 부담을 감소시킨다는 것을 보여준다. 모의(miR 단독 및 미셀 단독(각각 왼쪽 및 중간 패널) 또는 ASO-MDS(오른쪽 패널)를 투여한 후 해마의 치상회에 대한 면역조직화학 분석. 뇌 절편의 확산 플라크는 항-아밀로이드 베타(클론 6E10)및 핵에 의해 염색되었다.
도 21b는 도 21a의 동일한 데이터의 막대 그래프를 도시한다. 왼쪽 막대는 miR 단독, 가운데 막대는 미셀 단독, 오른쪽 막대는 미셀 + miR이다.
도 22a는 ASO-MDS의 투여가 5XFAD에서 신경발생을 회복함을 보여준다. 모의(miR 단독 및 미셀 단독(각각 왼쪽 및 중간 패널) 또는 ASO-MDS(오른쪽 패널) 투여 후 측뇌실의 면역조직화학 분석. 뇌 절편의 신경발생은 항-DCX 염색으로 식별되었다. 그래프는 mm2당 DCX-염색된 세포의 평균 수를 보여준다. 상부 패널은 항-DCX 염색, 즉 신경발생 마커에 의해 염색된다. 하부 패널은 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)에 의한 염색을 나타낸다.
도 22b는 도 22a에 도시된 동일한 데이터의 막대 그래프를 도시한다.
도 23a는 ASO-MDS 전달이 5XFAD 마우스에서 인지 기능(Y 미로)을 개선함을 보여준다.
도 23b는 ASO-MDS 전달이 5XFAD 마우스에서 인지 기능(수동적 회피 테스트)을 개선함을 보여준다. 도 23a 및 도 23b에 대한 Y 미로 및 수동 회피 테스트는 모의(각각 miR 단독 및 미셀 단독(왼쪽 및 중간 패널)) 및 ASO-MDS 주입 5XFAD 마우스(오른쪽 패널)에서 수행되었다(8~10개월 모의 처리된 5XFAD 마우스의 경우 n=5, 8~10개월 ASO-MDS 주사된 5XFAD 마우스의 경우 n=7).
도 24는 알츠하이머병에서 miRNA 485-3p의 역할을 보여준다.
도 25는 본 개시내용의 미셀 전달 시스템의 암 표적화 적용의 개략도를 도시한다. 본원에 개시된 미셀 시스템은 암 치료 뿐만 아니라 뇌 질환을 위한 다용도 전달 시스템이다. 다양한 암 표적화 리간드는 치료제, 예를 들어 폴리뉴클레오티드를 암세포로 전달하기 위해 이 담체 시스템에 적용될 수 있다.
도 26a는 본 개시내용의 미셀 전달 시스템을 사용한 췌장암에서의 K-Ras 유전자 침묵 효능을 나타낸다. 도 26a는 K-Ras 유전자 침묵 효능의 타임라인을 보여준다.
도 26b는 도 26a에서 K-Ras 유전자 침묵 처리 후 상대적인 K-Ras mRNA의 막대 그래프를 나타낸다. 도 26a 및 26b에 도시된 바와 같이, K-Ras를 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 미셀 전달 시스템에 로드되었다. 상이한 조직을 표적화하기 위해, 본 개시내용의 미셀 전달 시스템은 사이클릭 RGD 펩티드(α(v)β(3) 인테그린을 표적화) 또는 X(표적)에 융합되었다.
도 27은 근육내 주사 후 Cy5.5 표지된 항-microRNA(노출된 ASO; 왼쪽 마우스) 및 Cy5.5 표지된 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS; 오른쪽 마우스)의 생체 분포를 비교한다. 두 샘플을 모두 마우스에 주입한 후 최대 120시간 동안 전신의 형광 이미지를 얻었다.
본 개시내용은 수용성 생중합체 모이어티(예를 들어, PEG) 및 하전된 모이어티(예를 들어, 폴리라이신)을 포함하는 담체 단위에 관한 것이다. 하전된 모이어티 및 하전된 페이로드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)와 반대 전하 및 유사하거나 동일한 전하 로드(즉, 담체 단위의 하전된 모이어티 및 하전된 페이로드 상의 전하 수가 유사하거나 동일)사이의 정전기적 상호작용 시에, 담체 단위의 하전된 모이어티의 전하와 하전된 페이로드의 전하는 서로를 중화시켜 담체 단위:페이로드 복합체를 생성한다. 담체 단위:페이로드 복합체는 자가-결합하여 페이로드가 미셀의 코어에 위치하고 수용성 생중합체 모이어티는 용매를 향하고 있는 미셀을 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 담체 단위는 음이온성 페이로드와 상호작용할 수 있는 양이온성 하전된 모이어티를 포함한다. 역으로, 담체 단위는 양이온성 페이로드와 상호작용할 수 있는 음이온성 하전된 모이어티를 포함할 수 있다. 다양한 측면의 비제한적인 예가 본 개시내용에 제시되어 있다.
본 개시내용이 더 상세하게 설명되기 전에, 본 개시내용은 설명된 특정 조성물 또는 공정 단계에 제한되지 않고, 물론 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 측면은 본 개시내용의 범위 또는 정신으로부터 이탈하지 않고 다른 여러 측면 중 임의의 것의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 언급된 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 표제는 본 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면의 제한이 아니다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 측면를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
따라서, 바로 아래에서 정의되는 용어들은 그 전체가 명세서를 참조하여 보다 완전하게 정의된다.
I. 정의
본 명세서를 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 추가 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시된다.
"하나"라는 용어는 해당 실재 중 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, "하나의 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음을 추가로 유의한다. 이와 같이, 이 진술은 청구 요소의 인용 또는 부정적인 제한의 사용과 관련하여 "단독", "오직"과 같은 배타적 용어의 사용에 대한 선행 근거로 사용하기 위한 것이다.
또한, 본원에서 사용된 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 지정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본 원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하도록 의도된다. 유사하게, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용된 "및/또는"이라는 용어는 A, B, 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)을 포함하도록 의도된다.
측면이 "포함하는"이라는 언어로 본원에 기술되는 곳마다, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"과 관련하여 설명된 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 관련된 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌은 본 개시에 사용된 많은 용어의 일반 사전을 숙련가에게 제공한다(The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press).
단위, 접두사 및 기호는 SI(Systeme International de Unites) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 값의 범위가 인용되는 경우, 해당 범위의 인용된 상한 및 하한 사이의 각각의 중간 정수 값 및 이의 각 분수가 또한 이러한 값 사이의 각 하위 범위와 함께 구체적으로 개시되는 것으로 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있으며, 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 모두가 포함되지 않는 각각의 범위는 또한 본 개시내용 내에 포함된다. 따라서, 본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 그룹의 임의의 수, 숫자의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 인용된 경우, 인용된 값과 거의 동일한 양 또는 양인 값도 본 개시의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 조합이 기재되는 경우, 해당 조합의 요소들의 각 하위 조합도 구체적으로 개시되며 개시 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소들 또는 요소들의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합도 개시된다. 개시물의 임의의 요소가 다수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제되는 개시의 예도 여기에 개시된다; 본 개시의 하나 이상의 요소가 그러한 배제를 가질 수 있고, 그러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 이로써 개시된다.
뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭된다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에서 권장하는 일반적으로 알려진 한 글자 기호로 여기에서 참조된다. 따라서 'a'는 아데닌, 'c'는 시토신, 'g'는 구아닌, 't'는 티민, 'u'는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성된다. 아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 한 글자 기호로 본원에서 언급된다.
용어 "약"은 대략적으로, 대충, 주위에, 또는 ~의 영역을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우 명시된 수치 값의 위아래 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 예를 들어 10퍼센트, 위 또는 아래(더 높거나 더 낮음)의 분산에 의해 명시된 값 위 및 아래의 수치 값을 수정할 수 있다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 문법적 변형은 본 개시내용의 미셀과 같은 조성물을 약제학적으로 허용되는 경로를 통해 대상체에 도입하는 것을 지칭한다. 본 개시내용의 미셀과 같은 조성물의 대상체 내로의 도입은 종양내, 경구, 폐내, 비강내, 비경구(정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장내, 임파내, 경막내, 안구주위 또는 국소를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의한다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여가 포함된다. 적절한 투여 경로는 조성물 또는 제제가 그의 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물 또는 제제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 조성물을 투여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략"은 언급된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 측면에서, 용어 "대략"은 달리 명시되지 않거나 문맥에서 명백하지 않은 한 명시된 기준 값의 어느 방향(크거나 작음)으로든(해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만에 속하는 값의 범위를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "보존된"은 비교되는 둘 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않고 발생하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 각각 지칭한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열 사이에서 보존되는 것이다.
일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우 "완전히 보존된" 또는 "동일한" 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 이들이 서로에 대해 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일한 경우 "매우 보존된"이라고 한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 이들이 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일, 또는 약 99% 서로 동일하다면 "매우 보존된"이라고 한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열은 이들이 적어도 30% 동일, 적어도 40% 동일, 적어도 50% 동일, 적어도 60% 동일, 적어도 70% 동일, 적어도 서로 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일하다면 "보존된"이라고 한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일 또는 약 99% 동일하다면 "보존"된 것으로 언급된다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 부분, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "부터 유래된"은 특정 분자 또는 유기체, 또는 특정 분자 또는 유기체로부터의 정보(예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열)로부터 단리되거나 이를 사용하여 만들어진 성분을 지칭한다. 예를 들어, 제 2 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열은 제 2 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우, 유도된 종은, 예를 들어 자연 발생 돌연변이유발, 인공 지시 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 유도하는 데 사용되는 돌연변이유발은 의도적으로 지시되거나 의도적으로 무작위적이거나 각각의 혼합물일 수 있다. 첫 번째로부터 유도된 상이한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성하기 위한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이유발은 무작위 사건(예를 들어, 중합효소 불충실에 의해 유발되는)일 수 있고 유도된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 확인은, 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같은 적절한 스크리닝 방법에 의하여 행해질 수 있다. 폴리펩티드의 돌연변이유발은 전형적으로 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조작을 수반한다. 일부 측면에서, 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 각각의 서열 동일성을 가지며, 여기서 제 1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 유지한다.
"상보적" 및 "상보성"이라는 용어는 왓슨-크릭크(Watson-Crick) 염기쌍 규칙에 의해 서로 관련된 2개 이상의 올리고머(즉, 각각 핵염기 서열을 포함하는), 또는 올리고머 및 표적 유전자 사이를 지칭한다. 예를 들어, 핵염기 서열 "T-G-A(5'→3')"는 핵염기 서열 "A-C-T(3'→ 5')"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기서 주어진 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 염기 짝짓기 규칙에 따라 다른 핵염기 서열과 매치된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 사이의 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95%일 수 있다. 또는, 예시를 계속하기 위해 주어진 핵염기 서열 및 다른 핵염기 서열 사이에 "완전한" 또는 "완벽한"(100%) 상보성이 있을 수 있다. 핵염기 서열 간의 상보성 정도는 서열 간의 혼성화 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
용어 "다운스트림"는 기준 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 측면에서, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 시작점을 따르는 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 다운스트림에 위치한다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 상호교환적으로 사용되며 화합물의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상동성"은 중합체 분자, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일반적으로 "상동성"이라는 용어는 두 분자 간의 진화적 관계를 의미한다. 따라서 상동인 두 분자는 공통의 진화적 조상을 갖게 된다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 상동성은 동일성 및 유사성을 모두 포함한다.
일부 측면에서, 중합체 분자는 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 분자 내 단량체가 동일하거나(정확히 동일한 단량체) 또는 유사(보존적 치환)한 경우에 서로 "상동성"으로 간주된다. "상동성"이라는 용어는 반드시 적어도 2개의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 간의 비교를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "동일성"은 중합체 분자 사이, 예를 들어 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의 전체 단량체 보존을 지칭한다. 추가 수식어가 없는 "동일한"이라는 용어는, 예를 들어 단백질 A가 단백질 B와 동일하다는 서열이 100% 동일함(100% 서열 동일성)을 의미한다. 2개의 서열을, 예를 들어 "70% 동일한"으로 기술하는 것은, 예를 들어 "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 기술하는 것과 동일하다.
예를 들어, 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고 서열과 동일하지 않은 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있다). 특정 측면에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%이다. 상응하는 아미노산 위치의 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드의 경우 염기가 그 다음 비교된다.
첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수와 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 비교 및 두 서열 간의 퍼센트 동일성 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.
단백질 및 뉴클레오티드 서열의 정렬을 위해 다양한 소스에서 적합한 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 한 가지 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 사용할 수 있는 BLAST 프로그램 제품군의 일부인 bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어 EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics Institute, EBI)의 www.ebi.ac.uk/Tools/psa 에서도 이용가능하다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내의 상이한 영역은 각각 고유한 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림된다. 예를 들어 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 내림하고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 올림한다. 또한 길이 값은 항상 정수이다.
특정 측면에서, 제 2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제 1 아미노산 서열(또는 핵산 서열) 또는 퍼센트 동일성(%ID)은 %ID = 100 x(Y/ Z), 여기서 Y는 제 1 및 제 2 서열의 정렬에서 동일한 매치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수(시각 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)이고 Z는 제 2 서열에서 잔기의 총 수이다. 제 1 서열의 길이가 제 2 서열보다 길다면, 제 2 서열에 대한 제 1 서열의 퍼센트 동일성은 제 1 서열에 대한 제 2 서열의 퍼센트 동일성보다 높을 것이다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동되는 이진 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, 서열 데이터를 구조 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능 데이터(예를 들어, 돌연변이 위치) 또는 계통발생 데이터와 같은 이질적 소스로부터의 데이터와 통합함으로써 서열 정렬이 생성될 수 있음을 이해할 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용가능한 T-Coffee이며, 대안적으로 예를 들어 EBI에서 이용 가능하다. 또한 퍼센트 서열 동일성을 계산하기 위해 사용된 최종 정렬이 자동 또는 수동으로 큐레이트될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "단리된", "정제된", "추출된" 및 이들의 문법적 변형은 상호교환가능하게 사용되며, 하나 이상의 정제의 과정을 거친 본 개시내용의 원하는 조성물의 제조 상태를 지칭한다. 일부 측면에서, 본원에 사용된 단리 또는 정제는 오염물을 함유하는 샘플로부터 본 개시내용의 조성물을 제거, 부분적으로 제거(예를 들어, 분획)하는 과정이다. 일부 측면에서, 단리된 조성물은 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 측면에서, 단리된 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도 및/또는 활성 이상에서, 본 개시내용의 원하는 조성물의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 측면에서, 단리된 조성물은 조성물이 수득되는 출발 물질과 비교하여 농축되었다. 이러한 농축은 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과이다. 일부 측면에서, 단리된 제제에는 잔류 생물학적 생성물이 실질적으로 없다. 일부 측면에서, 단리된 제제는 임의의 오염성 생물학적 물질이 100% 부재, 적어도 약 99% 부재, 적어도 약 98% 부재, 적어도 약 97% 부재, 적어도 약 96% 부재, 적어도 약 95% 부재, 적어도 약 94% 부재, 적어도 약 93% 부재, 적어도 약 92% 부재, 적어도 약 91% 부재, 또는 적어도 약 90% 부재이다. 잔류 생물학적 생성물에는 비생물적 물질(화학물질 포함) 또는 원치 않는 핵산, 단백질, 지질 또는 대사산물이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 각각 제 2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 제 1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제 1 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 제 2 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나 병치될 수 있거나 대안적으로 개입 서열은 제 1 서열을 제 2 서열에 공유적으로 연결할 수 있다. "연결된"이라는 용어는 5'-말단 또는 3'-말단에서 제 1 폴리뉴클레오티드 서열과 제 2 폴리뉴클레오티드 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 전체 제 1 폴리뉴클레오티드 서열(또는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열)의 제 2 폴리뉴클레오티드 서열(또는 각각 제 1 폴리뉴클레오티드 서열)의 임의의 2개의 뉴클레오티드로 삽입을 포함한다. 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는, 예를 들어 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "miRNA" 또는 "miR" 또는 "microRNA"는 상호교환적으로 사용되며 RNA- 기반 유전자 조절에 관여하는 진핵생물에서 발견되는 microRNA 분자를 지칭한다. 이 용어는 전구체로부터 처리된 단일-가닥 RNA 분자를 나타내는 데 사용될 것이다. 본 개시내용과 관련된 miRNA의 명칭 및 이의 서열이 본원에 제공된다. MicroRNA는 불완전한 염기쌍을 통해 표적 mRNA를 인식하고 결합하여 표적 mRNA의 불안정화 또는 번역 억제를 유도하여 표적 유전자 발현을 하향조절한다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자(일반적으로 miRNA의 시드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통한 miRNA 표적화는 표적 유전자의 상향조절을 유도하는 miRNA-유도된 번역 억제를 감소 또는 억제할 수 있다.
용어 "미스매치" 또는 "미스매치들"는 염기쌍 규칙에 따라 표적 예비(pre)-mRNA와 매치하지 않는 올리고머 핵염기 서열 내의 하나 이상의 핵염기(인접한 것이든 분리된 것이든)를 지칭한다. 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 측면은 표적 예비-mRNA에 대해 하나 이상, 그러나 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 미스매치를 포함할 수 있다. 올리고머 내 임의의 위치에서 변형이 포함된다. 특정 측면에서, 본 개시내용의 안티센스 올리고머는 말단 근처의 핵염기 서열의 변이, 내부의 변이를 포함하고, 존재하는 경우 전형적으로 5' 및/또는 3' 말단의 약 6, 5, 4, 3, 2, 1개의 하부단위 내에 있다. 특정 측면에서, 1, 2 또는 3개의 핵염기가 제거될 수 있고 여전히 표적에 결합을 제공할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절하다", "수정하다" 및 이들의 문법적 변형은 일반적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동에 적용될 때 증가 또는 감소함으로써 변경하는 능력, 예를 들어, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동을 직접 또는 간접적으로 촉진/자극/상향-조절 또는 방해/억제/하향-조절하는 것, 예를 들어 길항제 또는 작용제로서 작용하는 것을 지칭한다. 일부 예에서, 조절자는 대조군에 비해, 또는 일반적으로 예상되는 활성의 평균 수준에 대해 또는 대조군 활성 수준에 비해 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드" 및 이들의 문법적 변형은 상호교환적으로 사용되며 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 이들의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 단일 가닥 형태 또는 이중-가닥 나선 형태로 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일-가닥 DNA(ssDNA) 또는 단일-가닥 RNA(ssRNA)를 의미한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하며 특정 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편), 플라스미드, 초나선 DNA 및 염색체에서 발견되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중-가닥 DNA 분자의 구조를 논의할 때, 서열은 DNA의 전사되지 않은 가닥(즉, mRNA와 상동인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로만 서열을 제공하는 일반적인 관례에 따라 본원에 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이며, cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 세미-합성 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 "핵산 조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 문구는 일반적으로 장내 및 국소 투여 이외의 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 제한없이 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체", "약제학적으로 허용되는 부형제" 및 그의 문법적 변형은 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함하는동물에 사용하기 위해 미국 약전에 열거된 임의의 제제뿐만 아니라 대상체에 대한 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성을 일으키지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다. 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 본원에 기재된 화합물, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제같은 다른 화학 성분과 혼합 또는 뒤섞이거나 현탁된, 본 개시내용의 미셀을 지칭한다. 약제학적 조성물의 한 가지 목적은 대상체에게 미셀 제제의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 분자의 1차 구조를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산("DNA") 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산("RNA")을 포함한다. 이는 또한, 예를 들어 알킬화에 의해 및/또는 캡핑에 의해 변형된 및 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드 형태를 포함한다.
보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스를 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스를 함유), tRNA, rRNA, hRNA, siRNA 및 mRNA를 포함하며, 스플라이싱 여부에 상관없이, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 폴리뉴클레오티드의 임의의 기타 유형, 및 노르뉴클레오티드 골격을 함유하는 기타 중합체, 예를 들어 폴리아미드(예를 들어, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체, 및 DNA 및 RNA에서 발견되는 것과 같은 염기 쌍 및 염기 스태킹을 허용하는 구성으로 핵염기를 함유하는 중합체를 제공하는 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면에서 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 측면에서, RNA는 합성 RNA이다. 일부 측면에서, 합성 RNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 측면에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다(예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들어 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다).
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 당업계에 공지된 다른 변형 뿐만 아니라, 예를 들어 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산 및 크레아틴과 같은 비천연 아미노산 포함) 유사체를 함유하는 폴리펩티드도 정의 내에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드는 유전자 산물, 천연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동족체, 오솔로그, 패럴로그, 단편 및 기타 등가물, 변이체 및 전술한 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단일 폴리펩타이드일 수 있거나 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 가장 일반적으로 이황화 결합은 다중 사슬 폴리펩티드에서 발견된다. 용어 폴리펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 일부 측면에서, "펩티드"는 50 이하의 아미노산 길이, 예를 들어 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50의 아미노산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 이의 변형은 질병, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 임상 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 특정 질병, 장애 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 질병, 장애 및/또는 병태와 관련된 병리 발생 위험 감소시키는 것을 지칭한다. 일부 측면에서, 결과를 예방하는 것은 예방적 치료를 통해 달성된다.
본원에 사용된 "예방적"은 질병 또는 병태의 발병을 예방하거나 질병 또는 병태와 관련된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 사용되는 치료 또는 작용 과정을 의미한다.
본원에 사용된 "예방"은 건강을 유지하고 출혈 에피소드의 발병을 예방 또는 지연시키거나 질병 또는 병태와 관련된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 취해진 조치를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유사성"은 중합체 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체 분자의 퍼센트 유사성 계산은 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있으며, 단 퍼센트 유사성 계산은 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려한다. 유사성의 백분율은 사용된 비교 척도, 즉 아미노산이 비교되는지 여부, 예를 들어 진화적 근접성, 전하, 부피, 유연성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성 또는 이들의 조합에 따라 달라진다.
용어 "대상체", "환자", "개체" 및 "숙주" 및 이의 변이체는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며 진단, 치료 또는 치료가 필요한 인간, 애완 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그 등), 특히 인간을 지칭한다. 본원에 설명된 방법은 인간 치료 및 수의학 적용 모두에 적용할 수 있다.
본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상체"라는 문구는, 예를 들어 지혈을 개선하기 위해 본 개시내용의 미셀 투여로부터 이익을 얻을 대상체, 예를 들어 포유동물 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 "전신 투여", "전신적으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여된"라는 문구는 중추 신경계 내로의 직접 이외로 화합물, 약물 또는 기타 물질의 투여를 의미하며, 환자의 시스템에 들어가고, 따라서 신진대사 및 기타 유사한 과정, 예를 들어 피하 투여의 대상이 된다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 치료가 필요한 대상체에서 원하는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하기에 충분한 본 개시내용의 미셀을 포함하는 시약 또는 약제학적 화합물의 양이다. 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 치료적 유효량은 "예방적 유효량"일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은, 예를 들어 질병 또는 병태의 중증도 감소; 질병 경과 기간의 감소; 질병 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거; 질병이나 병태를 반드시 치료하지 않으면서 질병이나 병태를 가진 대상에게 유익한 효과를 제공하는 것을 지칭한다. 이 용어는 또한 질병 또는 병태 또는 이의 증상의 예방 또는 방지를 포함한다. 한 측면에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 항원에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다.
용어 "업스트림"는 기준 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
II. 담체 단위
본 개시내용은 미셀 내로 자가-조립될 수 있거나 미셀 내로 혼입될 수 있는 담체 단위를 제공한다. 본 개시내용의 담체 단위는 수용성 생중합체 모이어티(예를 들어, PEG) 및 하전된 담체 모이어티를 포함한다. 일부 측면에서, 하전된 담체 모이어티는 양이온성(예를 들어, 폴리라이신)인 반면, 다른 측면에서 하전된 담체 모이어티는 도 1에 예시된 바와 같이 음이온성(예를 들어, 폴리글루탐산)이다.
본 개시내용의 담체 단위는 하전된 페이로드(예를 들어, 치료제 또는 진단제)를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 양이온성 하전된 담체 모이어티를 갖는 담체 단위는 음이온성 페이로드, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 전달을 위해 사용될 수 있다. 음이온성 하전된 담체 모이어티를 갖는 담체 단위는 양이온성 페이로드, 예를 들어 양으로 하전된 소분자 약물의 전달에 사용될 수 있다(도 1 참조)
중성 또는 소수성 페이로드는 어댑터(예를 들어, 도 2에 도시된 바와 같은 양이온성 또는 음이온성 어댑터)를 사용함으로써 본 개시내용의 담체 단위를 사용하여 또한 전달될 수 있다. 어댑터는, 예를 들어 소수성 페이로드에 공유적으로 결합하고 이러한 페이로드에 적절한 전하 로드를 제공하여 본 개시내용의 담체 단위의 하전된 담체 모이어티와 상호작용한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용의 페이로드는 (예를 들어, 정전기 상호작용을 통해) 본 개시내용의 담체 단위의 하전된 담체 모이어티와 상호작용할 수 있는 하전된 모이어티("어댑터" 모이어티), 및 생물학적 활성 모이어티(예: 치료 모이어티)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서 어댑터 모이어티 및 생물학적 활성 모이어티는 직접 연결되는 반면, 일부 다른 측면에서는 링커를 통해 연결될 수 있다.
(i) 하전된 담체 모이어티; 및,
(ii) 하전된 페이로드(예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 등) 또는 이의 하전된 부분(예를 들어, 어댑터 모이어티)사이의 정전기 상호작용 시, 하전된 모이어티의 전하 및 하전된 페이로드 또는 어댑터의 전하가 서로를 중화시켜 담체 단위:페이로드 복합체를 생성하며, 여기서,
a. 하전된 담체 모이어티 및 하전된 페이로드 또는 이의 하전된 부분은 상이한 순 전하를 가지며(즉, 하나는 양이온성이고 다른 하나는 음이온성이다); 및
b. 순 전하 로드가 유사하거나 동일(즉, 담체 단위의 하전된 모이어티 및 하전된 페이로드 또는 이의 하전된 부분에 대한 전하 수가 유사하거나 동일하다)하다.
생성된 담체 단위:페이로드 복합체는 수용성 생중합체 모이어티를 포함하는 친수성 "머리" 및 페이로드에 정전기적으로 결합된 하전된 담체 모이어티를 포함하는 소수성 "꼬리"를 갖는 양친매성이다.
담체 단위:페이로드 복합체는 단독으로 또는 다른 양친매성 분자와 조합하여 자가-회합하여 페이로드가 미셀의 코어에 위치하고 수용성 생중합체 모이어티가 용매를 향하는 미셀을 생성할 수 있다. "본 내시내용의 미셀"이라는 용어는 고전적 미셀 뿐만 아니라 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀을 포함한다. 폴리머좀이 내강 공간을 포함한다는 점을 감안할 때, 고전적인 미셀의 "코어"와 관련된 모든 개시 내용은 본 개시내용의 담체 단위를 포함하는 폴리머좀의 내강 공간에 동일하게 적용가능함을 이해해야 한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 본 개시내용의 담체 단위에 부착된 페이로드 분자 및 미셀의 내강 공간(예를 들어, 폴리머좀의 내강)에 있는 페이로드 분자를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 담체 단위에 부착된 페이로드 및 내강 공간의 페이로드는 동일하다. 일부 측면에서, 담체 단위에 부착된 페이로드 및 내강 공간의 페이로드는 상이하다.
본 개시내용의 담체 단위는 또한 하나 이상의 임의의 링커를 통해 수용성 생중합체 모이어티에 공유적으로 연결된 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일단 미셀이 형성되면, 표적화 모이어티는 미셀의 표면 상에 위치하며 미셀을 특이적 표적 조직, 특이적 세포 유형에 전달할 수 있고/거나 생리학적 장벽(예를 들어, 세포 원형질막 또는 BBB)을 가로질러 수송을 촉진할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 하나 초과의 유형의 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 담체 단위는 또한 하전된 담체 모이어티에 공유적으로 결합된 보조제 모이어티를 포함할 수 있다. 보조제 모이어티는 이중 목적을 수행할 수 있다: 페이로드와의 정전기적 상호작용을 위한 전하를 제공할 수 있고/있거나, 예를 들어, 치료적, 공동-치료적 효과를 가질 수 있거나, 표적 세포 또는 표적 조직의 항상성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.
도 1에 개략적인 형태로 도시된 바와 같이, 일부 측면에서, 페이로드는 담체 단위에 공유적으로 연결되지 않는다. 그러나, 다른 측면에서, 페이로드는 담체 단위, 예를 들어 절단가능한 링커와 같은 링커에 공유적으로 연결될 수 있다.
다양한 측면의 비제한적인 실시예가 본 개시내용에 제시되어 있다. 본 개시내용은 특히, 예를 들어 핵산과 같은 음이온성 페이로드를 전달하기 위한 양이온성 담체 단위의 용도에 관한 것이다. 그러나, 담체 모이어티 및 페이로드의 전하를 역전시킴으로써(즉, 양이온성 페이로드를 전달하기 위한 담체 단위 내의 음이온성 담체 모이어티를 사용하여), 또는 각각 음이온성 또는 양이온성 담체 모이어티와 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 또는 음이온성 어댑터에 연결된 중성 페이로드를 사용함으로써, 본 개시 내용은 양이온성 페이로드의 전달 또는 중성 페이로드의 전달에 동일하게 적용될 수 있음은 해당 분야의 숙련된 사람에게 명백할 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시 내용은 도식 I 또는 도식 II의 양이온성 담체 단위를 제공한다:
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (도식 I)
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (도식 II)
여기서,
WP는 수용성 생중합체 모이어티(예를 들어, PEG)이고;
CC는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 폴리라이신이고;
AM은 보조제 모이어티, 예를 들어 비타민, 예를 들어 비타민 B3이고; 그리고,
L1 및 L2는 독립적으로 임의의 링커이다.
본 개시내용은 또한 도식 III 또는 도식 IV의 음이온성 담체 단위를 제공한다:
[WP]-L1-[AC]-L2-[AM] (도식 III)
[WP]-L1-[AM]-L2-[AC] (도식 IV)
여기서,
WP는 수용성 생중합체 모이어티(예를 들어, PEG)이고;
AC는 음이온성 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고; 그리고,
L1 및 L2는 독립적으로 임의의 링커이다.
본 개시내용은 또한 도식 V 내지 VIII의 양이온성 및 음이온성 담체 단위를 제공한다:
[WP]-L1-[AC]-L2-[AM]-L3-[P] (도식 V)
[WP]-L1-[AM]-L2-[AC]-L3-[P] (도식 VI)
[WP]-L1-[AC]-L2-[AM]-L3-[P] (도식 VII)
[WP]-L1-[AM]-L2-[AC]-L3-[P] (도식 VIII)
여기서,
WP는 수용성 생중합체 모이어티(예를 들어, PEG)이고;
AC는 음이온성 담체 모이어티이고;
CC는 양이온성 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고;
L1 및 L2는 독립적으로 임의의 링커이고;
L3는 절단될 수 있는 임의의 링커이고; 그리고,
P는 페이로드이다.
위에 나타낸 도식 I 내지 VIII의 구조물의 일부 측면에서, [WP] 성분은 적어도 하나의 표적화 모이어티에 연결될 수 있고, 즉, [T]n-[WP]-… 여기서 n은 정수이고, 예를 들어 1, 2 또는 3이다.
도 3은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 개략도를 나타낸다. 단순화를 위해, 도 3의 단위를 선형으로 표현하였다. 그러나, 일부 측면에서, 담체 단위는, 예를 들어 양으로 하전된 단위를 포함하는 중합체 CC 모이어티 및 CC 모이어티를 따라 하나 이상의 지점에서 부착된 AM을 갖는 분지형 비계 배열로 조직화된 CC 및 AM 모이어티를 포함할 수 있다(도 4 및 도 5 참조). 다른 측면에서, CC 및 AM은 도 5에 도시된 바와 같이 비계형 모이어티에 부착될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
(화학식I)
A는 표적화 모이어티, 예를 들어 LAT1 수송체를 표적화하는 분자이고,
B는 양이온성 담체 모이어티의 양이온성 중합체 블록이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고; 그리고,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
X는 보조제 모이어티, 예를 들어 비타민, 예를 들어 (화학식 II)이고; 여기서 Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N, O 또는 S이고, n은 1 또는 2이다. 일부 측면에서, X는 -SH(예를 들어, 설파닐 기, 알칸티올 또는 알킬 티올)일 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 비타민, 예를 들어, 비타민 B3에 접합된 한 유형의 양이온성 담체 단위, 및 설파닐기(예를 들어, 알칸티올 또는 알킬 티올)에 접합된 다른 유형의 양이온성 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 비타민, 예를 들어, 비타민 B3에 접합된 제 1 유형의 양이온성 담체 단위, 설파닐기(예를 들어, 알칸티올 또는 알킬 티올)에 접합된 제 2 유형의 양이온성 담체 단위; 및 유리 염기인 제 3 유형의 양이온성 담체 단위를 포함한다.
본 개시내용의 양이온성 담체 단위가 약 1:약 1의 이온비로 음이온성 페이로드(예를 들어, 핵산)와 혼합되는 경우, 즉, 음이온성 페이로드의 음전하의 수 및 양이온성 담체 모이어티의 양전하의 수는 거의 동일하며, 주로 정전기 상호작용을 통해 양이온성 담체 모이어티의 양전하에 의한 음이온성 페이로드의 음전하 중화는 양이온성 담체 단위:음이온성 페이로드 복합체의 형성으로 이어지며, 이는 변경되지 않은 친수성 부분(WP 모이어티를 포함) 및 실질적으로 더 소수성인 부분(양이온성 담체 모이어티 플러스 보조제 모이어티 및 음이온성 페이로드 사이의 회합에 기인하는)을 가진다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 음이온성 페이로드의 음전하와 상호작용할 양이온성 담체 모이어티의 양전하에 그 자신의 양전하를 기여할 수 있다. 양이온성 담체 모이어티와 음이온성 페이로드 사이의 상호작용(예를 들어, 정전기적 상호작용)에 대한 언급은 또한 양이온성 담체 모이어티 플러스 보조제 모이어티의 전하 및 음이온성 페이로드의 전하 사이의 상호작용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
음이온성 페이로드의 음전하와의 정전기적 상호작용을 통한 양전하의 중화로 인한 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티의 소수성의 증가는 양친매성 복합체를 초래한다. 그러한 양친매성 복합체는 단독으로 또는 다른 양친매성 성분과 조합하여 미셀로 자가-조직화될 수 있다. 생성된 미셀은 용매를 향하는 WP 모이어티를 포함하는 반면(즉, WP 모이어티는 미셀의 외부 표면을 향한다), CC 및 AM 모이어티 뿐만 아니라 회합 페이로드(예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, "안티미르(antimir)" 또는 이들의 조합)는 미셀의 코어에 있다.
일부 특정 측면에서, 양이온성 담체 단위는 다음을 포함한다:
(a) 수용성 생중합체가, n이 약 120 내지 약 PEG 130(예를 들어, PEG는 PEG5000 또는 PEG6000이다)인 화학식 III의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(하기 참조)인, WP 모이어티;
(b) 양이온성 담체 모이어티가 약 30 내지 약 40개의 라이신(예를 들어, 선형 폴리(L-라이신)n, 여기서 n은 약 30 내지 약 40이다), 폴리에틸렌이민(PEI), 또는 키토산을 포함하는, CC 모이어티; 및,
(c) 보조제 모이어티가 약 5 내지 약 10의 비타민 B3 단위(예를 들어, 약 5 내지 약 10의 연결된 비타민 B3 단위)를 갖는, AM 모이어티.
일부 특정 측면에서, 양이온성 담체 단위는 다음을 포함한다:
(a) 수용성 생중합체가, n이 약 120 내지 약 PEG 130(예를 들어, PEG는 PEG5000 또는 PEG6000이다)인 화학식 III의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(하기 참조)인, WP 모이어티;
(b) 양이온성 담체 모이어티가 약 60 내지 약 100의 라이신(예를 들어, 선형 폴리(L-라이신)n, 여기서 n은 약 60 내지 약 100이다), 약 70 내지 약 90의 라이신, 약 80의 라이신, 폴리에틸렌이민(PEI), 또는 키토산을 포함하는, CC 모이어티; 및,
(c) 보조제 모이어티가 약 10 내지 약 50의 비타민 B3 단위(예를 들어, 약 10 내지 약 50의 연결된 비타민 B3 단위, 20 내지 약 40, 약 30 단위)를 갖는, AM 모이어티.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 양이온성 담체 단위의 WP 모이어티에 부착된 적어도 하나의 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 미셀의 표면 상에 표시되는 표적화 모이어티의 수 및/또는 밀도는 표적화 모이어티를 갖는 양이온성 담체 단위 대 표적화 모이어티를 갖지 않는 양이온성 담체 단위의 특이적 비율을 사용하여 조절될 수 있다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티를 갖는 양이온성 담체 단위 대 표적화 모이어티를 갖지 않는 양이온성 담체 단위의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 적어도 약 1:20, 적어도 약 1:30, 적어도 약 1:40, 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:60, 적어도 약 1:70, 적어도 약 1:80, 적어도 약 1:90, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:120, 적어도 약 1:140, 적어도 약 1:160, 적어도 약 1:180, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450, 적어도 약 1:500, 적어도 약 1:600, 적어도 약 1:700, 적어도 약 1:800, 적어도 약 1:900, 또는 적어도 약 1:1000이다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는
(i) 수송체 LAT1을 표적화하는 표적화 모이어티(A)(예를 들어, 페닐알라닌),
(ii) PEG인, 수용성 중합체,
(iii) 라이신인 양이온성 중합체 블록을 포함하는, 양이온성 담체 모이어티, 및
(iv) 비타민 B3인, 2 이상의 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는
(i) 수송체 LAT1을 표적화하는 표적화 모이어티(A)(예를 들어, 페닐알라닌),
(ii) n이 100 내지 200, 예를 들어, 100 내지 150, 예를 들어 120 내지 130인 PEG인, 수용성 중합체,
(iii) 양이온성 중합체 블록, 예를 들어 폴리라이신을 포함하는, 양이온성 담체 모이어티, 및
(iv) 비타민 B3인, 2 이상의 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는
(i) 수송체 LAT1을 표적화하는 표적화 모이어티(A)(예를 들어, 페닐알라닌),
(ii) n이 100 내지 200, 예를 들어, 100 내지 150, 예를 들어 120 내지 130인 PEG인, 수용성 중합체,
(iii) 양이온성 중합체 블록, 예를 들어 10 내지 100의 라이신, 예를 들어, 10 내지 50의 라이신, 예를 들어, 30 내지 40의 라이신, 예를 들어, 70 내지 80의 라이신을 포함하는, 양이온성 담체 모이어티, 및
(iv) 예를 들어, 비타민 B3, 예를 들어 25 내지 30의 비타민 B3의, 2 이상의 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는
(i) 수송체 LAT1을 표적화하는 표적화 모이어티(A)(예를 들어, 페닐알라닌),
(ii) n이 100 내지 200, 예를 들어, 100 내지 150, 예를 들어 120 내지 130인 PEG인, 수용성 중합체,
(iii) 양이온성 중합체 블록, 예를 들어 10 내지 100의 라이신, 예를 들어, 10 내지 50의 라이신, 예를 들어, 30 내지 40의 라이신, 예를 들어, 70 내지 80의 라이신을 포함하는, 양이온성 담체 모이어티, 및
(iv) 예를 들어, 5 내지 50의 비타민 B3, 예를 들어 5 내지 30의 비타민 B3, 예를 들어 5 내지 20의 비타민 B3, 예를 들어 5 내지 15의 비타민 B3, 예를 들어 5 내지 10의 비타민 B3, 예를 들어 25 내지 30의 비타민 B3의, 2 이상의 보조제 모이어티를 포함한다.
(도식 I)에 예시된 바와 같이, CC 모이어티는 다수의 B 단위(여기서 각 B 단위는 예를 들어, 라이신일 수 있다)를 포함하는 중합체일 수 있고, AM 모이어티는 CC 모이어티 상의 측쇄 부착 지점에 공유적으로 부착된 다수의 X 단위(예를 들어, 비타민 단위)를 포함하는 비-개별 분자 실재일 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 양이온성 담체 단위는
(i) 수송체 LAT1을 표적화하는 표적화 모이어티(A)(예를 들어, 페닐알라닌),
(ii) n이 120 내지 130의 PEG인, 수용성 중합체,
(iii) 라이신인 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 또는 70내지 80 B 양이온성 중합체 블록을 포함하는, 양이온성 담체 모이어티, 및
(iv) 비타민 B3인, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 25, 또는 25 내지 30 X 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 miR-485-3p를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC(서열번호: 18) 페이로드와 상호작용한다. 일부 양태에서, 페이로드와 복합화체된 담체 단위는 미셀을 형성한다.
일부 측면에서, 비타민 B3 단위는, 예를 들어 적절한 접합 시약, 예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시 숙신이미드(NHS)의 존재 하에, 라이신 내의 NH2 기와 비타민 B3의 COOH 기 사이의 커플링 반응에 의해 CC 모이어티의 측쇄 내로 도입된다.
본 개시내용은 본 개시내용의 담체 단위(예를 들어, 양이온성 담체 단위)를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 페이로드(예를 들어, 음이온성 페이로드, 예컨대 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, "안티미르", 또는 이들의 임의의 조합)에 비-공유적으로 부착된 본 개시 내용의 담체 단위를 포함하는 복합체를 제공하며, 여기서 담체 단위 및 페이로드는 정전기적으로 상호작용한다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 페이로드(예를 들어, 음이온성 페이로드, 예를 들어 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, "안티미르", 또는 이들의 임의의 조합)에 공유적으로 부착된 본 개시 내용의 담체 단위(예를 들어, 양이온성 담체 단위)를 포함하는 접합체를 제공하며, 여기서 담체 단위 및 페이로드는 정전기적으로 상호작용한다. 일부 양태에서, 담체 단위 및 페이로드는 절단가능한 링커를 통해 연결될 수 있다. 일부 양태에서, 담체 단위 및 페이로드는 정전기적으로 상호작용하는 것 이외에 공유적으로 상호작용할 수 있다(예를 들어, 정전기 상호작용 후에 담체 단위 및 페이로드는 이황화 결합 또는 절단가능한 결합을 통해 "잠금"될 수 있다).
일부 특정 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 120 내지 약 130의 단위를 갖는 PEG를 포함하는 수용성 중합체, 약 30개의 라이신 단위를 갖는 폴리라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드), siRNA, shRNA, "안티미르", 또는 임의의 이들의 조합)와 회합되며, 이는 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티와 적어도 하나의 이온 결합을 통해(즉, 정전기적 상호작용을 통해) 양이온성 담체 단위와 상호작용한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 도 6에 제시된 식에 기초하여 구성될 수 있다. 일부 측면에서, 미셀의 mB/(nA+mB)는 0 초과 1 미만, 예를 들어, 약 0.25 내지 약 1, 약 0.3 내지 약 1, 약 0.4 내지 약 1, 약 0.5 내지 약 1, 약 0.25 내지 약 0.9, 약 0.3 내지 약 0.9, 약 0.4 내지 약 0.9, 약 0.5 내지 약 0.9, 약 0.25 내지 약 0.8, 약 0.3 내지 약 0.8, 약 0.4 내지 약 0.8, 약 0.5 내지 약 0.8, 약 0.25 내지 약 0.75, 약 0.3 내지 약 0.75, 약 0.4 내지 약 0.75, 약 0.5 내지 약 0.75, 약 0.25 내지 약 0.7, 약 0.3 내지 약 0.7, 약 0.4 내지 약 0.7, 약 0.5 내지 약 0.7, 약 0.25 내지 약 0.6, 약 0.3 내지 약 0.6, 약 0.4 내지 약 0.6, 약 0.5 내지 약 0.6, 약 0.45 내지 약 0.55, 약 0.4 내지 약 0.65, 또는 약 0.5 내지 약 0.65이고, 여기서 nA는 이고 mB는 이다.
일부 측면에서, 미셀의 mB/(nA+mB)는 약 0.4 내지 약 0.6, 약 0.5 내지 약 0.6, 또는 약 0.4 내지 약 0.5이고, 여기서 nA는 이고 mB는 이다. 일부 측면에서, 미셀의 mB/(nA+mB)는 약 0.5이고, 여기서 nA는 이고 mB는 이다.
본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 특정 성분은 하기에 상세히 개시되어 있다.
a. 수용성 생중합체
일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 적어도 하나의 수용성 생중합체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "수용성 생중합체"는 생체적합성, 생물학적으로 불활성, 비-면역원성, 무독성 및 친수성 중합체, 예를 들어 PEG를 지칭한다.
일부 측면에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ"), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 수용성 생중합체는 선형, 분지형 또는 수지상이다.
일부 측면에서, 수용성 생중합체는 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리글리세롤("PG"), 또는 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG")을 포함한다. PPG는 PEG보다 독성이 적기 때문에 많은 생물학적 생성물이 현재 PEG 대신 PPG로 생산된다.
일부 측면에서, 수용성 생중합체는 화학식 R3-(O-CH2-CH2)n- 또는 R3-(O-CH2-CH2)nO-를 특징으로 하는 PEG를 포함하며, 여기서 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 2 내지 200의 값을 갖는다. 일부 측면에서, PEG는 하기 화학식을 갖는다:
(화학식 III)
여기서, n은 1 내지 1000이다.
일부 측면에서, PEG의 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 측면에서, n은 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 910, 적어도 약 920, 적어도 약 930, 적어도 약 940, 적어도 약 950, 적어도 약 960, 적어도 약 970, 적어도 약 980, 적어도 약 990, 또는 적어도 약 1000이다.
일부 측면에서, n은 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 300, 약 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 400, 약 400 내지 약 450, 약 450 내지 약 500, 약 500 내지 약 550, 약 550 내지 약 600, 약 600 내지 약 650, 약 650 내지 약 700, 약 700 내지 약 750, 약 750 내지 약 800, 약 800 내지 약 850, 약 850 내지 약 900, 약 900 내지 약 950, 또는 약 950 내지 약 1000이다.
일부 측면에서, n은 적어도 약 80, 적어도 약 81, 적어도 약 82, 적어도 약 83, 적어도 약 84, 적어도 약 85, 적어도 약 86, 적어도 약 87, 적어도 약 88, 적어도 약 89, 적어도 약 90, 적어도 약 91, 적어도 약 92, 적어도 약 93, 적어도 약 94, 적어도 약 95, 적어도 약 96, 적어도 약 97, 적어도 약 98, 적어도 약 99, 적어도 약 100, 적어도 약 101, 적어도 약 102, 적어도 약 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 적어도 약 141, 적어도 약 142, 적어도 약 143, 적어도 약 144, 적어도 약 145, 적어도 약 146, 적어도 약 147, 적어도 약 148, 적어도 약 149, 적어도 약 150, 적어도 약 151, 적어도 약 152, 적어도 약 153, 적어도 약 154, 적어도 약 155, 적어도 약 156, 적어도 약 157, 적어도 약 158, 적어도 약 159, 또는 적어도 약 160이다.
일부 측면에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 85 내지 약 95, 약 95 내지 약 105, 약 105 내지 약 115, 약 115 내지 약 125, 약 125 내지 약 135, 약 135 내지 약 145, 약 145 내지 약 155, 약 155 내지 약 165, 약 80 내지 약 100, 약 100 내지 약 120, 약 120 내지 약 140, 약 140 내지 약 160, 약 85 내지 약 105, 약 105 내지 약 125, 약 125 내지 약 145, 또는 약 145 내지 약 165이다.
일부 측면에서, n은 약 100 내지 약 150이다. 일부 측면에서, n은 약 100 내지 약 140이다. 일부 측면에서, n은 약 100 내지 약 130이다. 일부 측면에서, n은 약 110 내지 약 150이다. 일부 측면에서, n은 약 110 내지 약 140이다. 일부 측면에서, n은 약 110 내지 약 130이다. 일부 측면에서, n은 약 110 내지 약 120이다. 일부 측면에서, n은 약 120 내지 약 150이다. 일부 측면에서, n은 약 120 내지 약 140이다. 일부 측면에서, n은 약 120 내지 약 130이다. 일부 측면에서, n은 약 130 내지 약 150이다. 일부 측면에서, n은 약 130 내지 약 140이다.
따라서, 일부 측면에서, PEG는 분지형 PEG이다. 분지형 PEG는 중앙 코어 기에서 나오는 3 내지 10의 PEG 사슬을 가지고 있다. 특정 측면에서, PEG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용의 맥락에서, 단분산 폴리에틸렌 글리콜(mdPEG)은 단일의 정의된 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PEG이다. mdPEG는 일반적으로 크로마토그래피에 의한 중합 혼합물로부터의 분리에 의해 생성된다. 특정 공식에서, 단분산 PEG 모이어티는 약어 mdPEG로 지정된다.
일부 측면에서, PEG는 별형 PEG이다. 별형 PEG는 중앙 코어 기에서 나오는 10 내지 100의 PEG 사슬을 가지고 있다. 일부 측면에서, PEG는 빗살형 PEG이다. 빗살형 PEG는 일반적으로 중합체 골격에 접목된 여러 PEG 사슬을 가지고 있다.
특정 측면에서, PEG는 약 1000g/mol 내지 약 2000g/mol, 약 2000g/mol 내지 약 3000g/mol, 약 3000g/mol 내지 약 4000g/mol, 약 4000g/mol 내지 약 5000g/mol, 약 5000g/mol 내지 약 6000g/mol, 약 6000g/mol 내지 약 7000g/mol, 또는 7000g/mol 내지 약 8000g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PEG는 PEG100, PEG200, PEG300, PEG400, PEG500, PEG600, PEG700, PEG800, PEG900, PEG1000, PEG1100, PEG1200, PEG1300, PEG1400, PEG1500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG1600, PEG1700, PEG1800, PEG1900, PEG2000, PEG2100, PEG2200, PEG2300, PEG2400, PEG2500, PEG2600, PEG2700, PEG2800, PEG2900, PEG3000, PEG3100, PEG3200, PEG3300, PEG3400, PEG3500, PEG3600, PEG3700, PEG3800, PEG3900, PEG4000, PEG4100, PEG4200, PEG4300, PEG4400, PEG4500, PEG4600, PEG4700, PEG4800, PEG4900, PEG5000, PEG5100, PEG5200, PEG5300, PEG5400, PEG5500, PEG5600, PEG5700, PEG5800, PEG5900, PEG6000, PEG6100, PEG6200, PEG6300, PEG6400, PEG6500, PEG6600, PEG6700, PEG6800, PEG6900, PEG7000, PEG7100, PEG7200, PEG7300, PEG7400, PEG7500, PEG7600, PEG7700, PEG7800, PEG7900, 또는 PEG8000 이다. 일부 측면에서, PEG는 PEG5000 이다. 일부 측면에서, PEG는 PEG6000 이다. 일부 측면에서, PEG는 PEG4000 이다.
일부 측면에서, PEG는 단분산, 예를 들어 mPEG100, mPEG200, mPEG300, mPEG400, mPEG500, mPEG600, mPEG700, mPEG800, mPEG900, mPEG1000, mPEG1100, mPEG1200, mPEG1300, mPEG1400, mPEG1500, mPEG1600, mPEG1700, mPEG1800, mPEG1900, mPEG2000, mPEG2100, mPEG2200, mPEG2300, mPEG2400, mPEG2500, mPEG1600, mPEG1700, mPEG1800, mPEG1900, mPEG2000, mPEG2100, mPEG2200, mPEG2300, mPEG2400, mPEG2500, mPEG2600, mPEG2700, mPEG2800, mPEG2900, mPEG3000, mPEG3100, mPEG3200, mPEG3300, mPEG3400, mPEG3500, mPEG3600, mPEG3700, mPEG3800, mPEG3900, mPEG4000, mPEG4100, mPEG4200, mPEG4300, mPEG4400, mPEG4500, mPEG4600, mPEG4700, mPEG4800, mPEG4900, mPEG5000, mPEG5100, mPEG5200, mPEG5300, mPEG5400, mPEG5500, mPEG5600, mPEG5700, mPEG5800, mPEG5900, mPEG6000, mPEG6100, mPEG6200, mPEG6300, mPEG6400, mPEG6500, mPEG6600, mPEG6700, mPEG6800, mPEG6900, mPEG7000, mPEG7100, mPEG7200, mPEG7300, mPEG7400, mPEG7500, mPEG7600, mPEG7700, m PEG7800, mPEG7900, 또는 mPEG8000 이다. 일부 측면에서, mPEG는 mPEG5000 이다. 일부 측면에서, mPEG는 mPEG6000 이다. 일부 측면에서, mPEG는 mPEG4000 이다.
일부 측면에서, 수용성 생중합체 모이어티는 식 ((R3-O-(CH2-CHOH-CH2O)n-)에 의해 기술된 폴리글리세롤(PG)이고, 여기서 R3는 수소, 메틸 또는 에틸이고, n은 3 내지 200의 값을 갖는다. 일부 측면에서, 수용성 생중합체 모이어티는 식 (R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)에 의해 기술된 분지형 폴리글리세롤이고, 여기서 R5는 수소 또는 식 (R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)에 의해 기술된 선형 글리세롤 사슬이고 R3은 수소, 메틸 또는 에틸이다. 일부 측면에서, 수용성 생중합체 모이어티는 식 (R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)에 의해 기술되는 과분지형 폴리글리세롤이고, 여기서 R5는 수소 또는 식 (R3-O-(CH2-CHOR6-CH2-O)n-)에 의해 기술된 글리세롤 사슬이고, 여기서 R6은 수소 또는 식 (R3-O-(CH2-CHOR7-CH2-O)n-)에 의해 기술된 글리세롤 사슬이고, 여기서 R7은 수소 또는 식 (R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)에 의해 기술되는 선형 글리세롤 사슬이고, 여기서 R3는 수소, 메틸 또는 에틸이다. 과분지형 글리세롤 및 합성 방법은 문헌에 기술되어 있으며, 본원에 참조로 포함된다(Oudshorn et al.(2006) Biomaterials 27:5471-5479; Wilms et al. (20100 Acc. Chem. Res. 43, 129-41).
특정 측면에서, PG는 약 1000g/mol 내지 약 2000g/mol, 약 2000g/mol 내지 약 3000g/mol, 약 3000g/mol 내지 약 4000g/mol, 약 4000g/mol 내지 약 5000g/mol, 약 5000g/mol 내지 약 6000g/mol, 약 6000g/mol 내지 약 7000g/mol, 또는 7000g/mol 내지 약 8000g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PG는 PG100, PG200, PG300, PG400, PG500, PG600, PG700, PG800, PG900, PG1000, PG1100, PG1200, PG1300, PG1400, PG1500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG1600, PG1700, PG1800, PG1900, PG2000, PG2100, PG2200, PG2300, PG2400, PG2500, PG2600, PG2700, PG2800, PG2900, PG3000, PG3100, PG3200, PG3300, PG3400, PG3500, PG3600, PG3700, PG3800, PG3900, PG4000, PG4100, PG4200, PG4300, PG4400, PG4500, PG4600, PG4700, PG4800, PG4900, PG5000, PG5100, PG5200, PG5300, PG5400, PG5500, PG5600, PG5700, PG5800, PG5900, PG6000, PG6100, PG6200, PG6300, PG6400, PG6500, PG6600, PG6700, PG6800, PG6900, PG7000, PG7100, PG7200, PG7300, PG7400, PG7500, PG7600, PG7700, PG7800, PG7900, 또는 PG8000 이다. 일부 측면에서, PG는 PG5000 이다. 일부 측면에서, PG는 PG6000 이다. 일부 측면에서, PG는 PG4000 이다.
일부 측면에서, PG는 단분산, 예를 들어 mPG100, mPG200, mPG300, mPG400, mPG500, mPG600, mPG700, mPG800, mPG900, mPG1000, mPG1100, mPG1200, mPG1300, mPG1400, mPG1500, mPG1600, mPG1700, mPG1800, mPG1900, mPG2000, mPG2100, mPG2200, mPG2300, mPG2400, mPG2500, mPG1600, mPG1700, mPG1800, mPG1900, mPG2000, mPG2100, mPG2200, mPG2300, mPG2400, mPG2500, mPG2600, mPG2700, mPG2800, mPG2900, mPG3000, mPG3100, mPG3200, mPG3300, mPG3400, mPG3500, mPG3600, mPG3700, mPG3800, mPG3900, mPG4000, mPG4100, mPG4200, mPG4300, mPG4400, mPG4500, mPG4600, mPG4700, mPG4800, mPG4900, mPG5000, mPG5100, mPG5200, mPG5300, mPG5400, mPG5500, mPG5600, mPG5700, mPG5800, mPG5900, mPG6000, mPG6100, mPG6200, mPG6300, mPG6400, mPG6500, mPG6600, mPG6700, mPG6800, mPG6900, mPG7000, mPG7100, mPG7200, mPG7300, mPG7400, mPG7500, mPG7600, mPG7700, m PG7800, mPG7900, 또는 mPG8000 이다.
일부 측면에서, 수용성 생중합체는 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG")을 포함한다. 일부 측면에서, PPG는 하기 화학식을 특징으로 하며, n은 1 내지 1000의 값을 갖는다.
(화학식IV)
일부 측면에서, PPG의 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 189, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200의 값을 갖는다.
일부 측면에서, PPG의 n은 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 110, 적어도 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 310, 적어도 약 320, 적어도 약 330, 적어도 약 340, 적어도 약 350, 적어도 약 360, 적어도 약 370, 적어도 약 380, 적어도 약 390, 적어도 약 400, 적어도 약 410, 적어도 약 420, 적어도 약 430, 적어도 약 440, 적어도 약 450, 적어도 약 460, 적어도 약 470, 적어도 약 480, 적어도 약 490, 적어도 약 500, 적어도 약 510, 적어도 약 520, 적어도 약 530, 적어도 약 540, 적어도 약 550, 적어도 약 560, 적어도 약 570, 적어도 약 580, 적어도 약 590, 적어도 약 600, 적어도 약 610, 적어도 약 620, 적어도 약 630, 적어도 약 640, 적어도 약 650, 적어도 약 660, 적어도 약 670, 적어도 약 680, 적어도 약 690, 적어도 약 700, 적어도 약 710, 적어도 약 720, 적어도 약 730, 적어도 약 740, 적어도 약 750, 적어도 약 760, 적어도 약 770, 적어도 약 780, 적어도 약 790, 적어도 약 800, 적어도 약 810, 적어도 약 820, 적어도 약 830, 적어도 약 840, 적어도 약 850, 적어도 약 860, 적어도 약 870, 적어도 약 880, 적어도 약 890, 적어도 약 900, 적어도 약 910, 적어도 약 920, 적어도 약 930, 적어도 약 940, 적어도 약 950, 적어도 약 960, 적어도 약 970, 적어도 약 980, 적어도 약 990, 또는 약 1000이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 300, 300 내지 약 350, 약 350 내지 약 400, 약 400 내지 약 450, 약 450 내지 약 500, 약 500 내지 약 550, 약 550 내지 약 600, 약 600 내지 약 650, 약 650 내지 약 700, 약 700 내지 약 750, 약 750 내지 약 800, 약 800 내지 약 850, 약 850 내지 약 900, 약 900 내지 약 950, 또는 약 950 내지 약 1000이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 적어도 약 80, 적어도 약 81, 적어도 약 82, 적어도 약 83, 적어도 약 84, 적어도 약 85, 적어도 약 86, 적어도 약 87, 적어도 약 88, 적어도 약 89, 적어도 약 90, 적어도 약 91, 적어도 약 92, 적어도 약 93, 적어도 약 94, 적어도 약 95, 적어도 약 96, 적어도 약 97, 적어도 약 98, 적어도 약 99, 적어도 약 100, 적어도 약 101, 적어도 약 102, 적어도 약 103, 적어도 약 104, 적어도 약 105, 적어도 약 106, 적어도 약 107, 적어도 약 108, 적어도 약 109, 적어도 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 적어도 약 141, 적어도 약 142, 적어도 약 143, 적어도 약 144, 적어도 약 145, 적어도 약 146, 적어도 약 147, 적어도 약 148, 적어도 약 149, 적어도 약 150, 적어도 약 151, 적어도 약 152, 적어도 약 153, 적어도 약 154, 적어도 약 155, 적어도 약 156, 적어도 약 157, 적어도 약 158, 적어도 약 159, 또는 적어도 약 160이다.
일부 측면에서, PPG의 n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 85 내지 약 95, 약 95 내지 약 105, 약 105 내지 약 115, 약 115 내지 약 125, 약 125 내지 약 135, 약 135 내지 약 145, 약 145 약 155, 약 155 내지 약 165, 약 80 내지 약 100, 약 100 내지 약 120, 약 120 내지 약 140, 약 140 내지 약 160, 약 85 내지 약 105, 약 105 내지 약 125, 약 125 내지 약 145, 또는 약 145 내지 약 165이다.
따라서, 일부 측면에서, PPG는 분지형 PPG이다. 분지형 PPG는 중앙 코어 기에서 나오는 3 내지 10개의 PPG 사슬을 갖는다. 특정 측면에서, PPG 모이어티는 단분산 폴리에틸렌 글리콜이다. 본 개시내용의 맥락에서, 단분산 폴리에틸렌 글리콜(mdPPG)은 단일의 정의된 사슬 길이 및 분자량을 갖는 PPG이다. mdPEG는 일반적으로 크로마토그래피에 의한 중합 혼합물로부터의 분리에 의해 생성된다. 특정 식에서, 단분산 PPG 모이어티는 약어 mdPPG로 지정된다.
일부 측면에서, PPG는 별형 PPG이다. 별형 PPG는 중앙 코어 기에서 나오는 10 내지 100개의 PPG 사슬을 갖는다. 일부 측면에서, PPG는 빗살형 PPG이다. 빗살형 PPG에는 일반적으로 중합체 골격에 접목된 여러 PPG 사슬을 갖는다.
특정 측면에서, PPG는 약 1000g/mol 내지 약 2000g/mol, 약 2000g/mol 내지 약 3000g/mol, 약 3000g/mol 내지 약 4000g/mol, 약 4000g/mol 내지 약 5000g/mol, 약 5000g/mol 내지 약 6000g/mol, 약 6000g/mol 내지 약 7000g/mol, 또는 7000g/mol 내지 약 8000g/mol의 몰 질량을 갖는다.
일부 측면에서, PPG는 PPG100, PPG200, PPG300, PPG400, PPG500, PPG600, PPG700, PPG800, PPG900, PPG1000, PPG1100, PPG1200, PPG1300, PPG1400, PPG1500, PPG1600, PPG1700, PPG1800, PPG1900, PPG2000, PPG2100, PPG2200, PPG2300, PPG2400, PPG2500, PPG1600, PPG1700, PPG1800, PPG1900, PPG2000, PPG2100, PPG2200, PPG2300, PPG2400, PPG2500, PPG2600, PPG2700, PPG2800, PPG2900, PPG3000, PPG3100, PPG3200, PPG3300, PPG3400, PPG3500, PPG3600, PPG3700, PPG3800, PPG3900, PPG4000, PPG4100, PPG4200, PPG4300, PPG4400, PPG4500, PPG4600, PPG4700, PPG4800, PPG4900, PPG5000, PPG5100, PPG5200, PPG5300, PPG5400, PPG5500, PPG5600, PPG5700, PPG5800, PPG5900, PPG6000, PPG6100, PPG6200, PPG6300, PPG6400, PPG6500, PPG6600, PPG6700, PPG6800, PPG6900, PPG7000, PPG7100, PPG7200, PPG7300, PPG7400, PPG7500, PPG7600, PPG7700, PPG7800, PPG7900, 또는 PPG8000 이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG5000 이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG6000 이다. 일부 측면에서, PPG는 PPG4000 이다.
일부 측면에서, PPG는 단분산, 예를 들어 mPPG100, mPPG200, mPPG300, mPPG400, mPPG500, mPPG600, mPPG700, mPPG800, mPPG900, mPPG1000, mPPG1100, mPPG1200, mPPG1300, mPPG1400, mPPG1500, mPPG1600, mPPG1700, mPPG1800, mPPG1900, mPPG2000, mPPG2100, mPPG2200, mPPG2300, mPPG2400, mPPG2500, mPPG1600, mPPG1700, mPPG1800, mPPG1900, mPPG2000, mPPG2100, mPPG2200, mPPG2300, mPPG2400, mPPG2500, mPPG2600, mPPG2700, mPPG2800, mPPG2900, mPPG3000, mPPG3100, mPPG3200, mPPG3300, mPPG3400, mPPG3500, mPPG3600, mPPG3700, mPPG3800, mPPG3900, mPPG4000, mPPG4100, mPPG4200, mPPG4300, mPPG4400, mPPG4500, mPPG4600, mPPG4700, mPPG4800, mPPG4900, mPPG5000, mPPG5100, mPPG5200, mPPG5300, mPPG5400, mPPG5500, mPPG5600, mPPG5700, mPPG5800, mPPG5900, mPPG6000, mPPG6100, mPPG6200, mPPG6300, mPPG6400, mPPG6500, mPPG6600, mPPG6700, mPPG6800, mPPG6900, mPPG7000, mPPG7100, mPPG7200, mPPG7300, mPPG7400, mPPG7500, mPPG7600, mPPG7700, m PPG7800, mPPG7900, 또는 mPPG8000 이다. 일부 측면에서, mPPG는 mPPG5000 이다. 일부 측면에서, mPPG는 mPPG6000 이다. 일부 측면에서, mPPG는 mPPG4000 이다.
b. 양이온 담체
일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 적어도 하나의 양이온성 담체 모이어티를 포함한다. 용어 "양이온성 담체"는 음이온성 페이로드(또는 페이로드에 부착된 음이온성 담체)와 상호작용하고 정전기적으로 결합할 수 있는 다수의 양전하를 포함하는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 모이어티 또는 부분을 지칭한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 상의 양전하 또는 양으로 하전된 기의 수는 음이온성 페이로드(또는 페이로드에 부착된 음이온성 담체) 상의 음전하 또는 음으로 하전된 기의 수와 유사하다. 일부 측면에서, 양이온성 담체는 생중합체, 예를 들어 펩티드(예를 들어, 폴리라이신)를 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체는 하나 이상의 염기성 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 또는 이들의 조합)을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체는 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 적어도 약 30, 적어도 약 31, 적어도 약 32, 적어도 약 33, 적어도 약 34, 적어도 약 35, 적어도 약 36, 적어도 약 37, 적어도 약 38, 적어도 약 39, 적어도 약 40, 적어도 약 41, 적어도 약 42, 적어도 약 43, 적어도 약 44, 적어도 약 45, 적어도 약 46, 적어도 약 47, 적어도 약 48, 적어도 약 49, 적어도 약 50, 적어도 약 51, 적어도 약 52, 적어도 약 53, 적어도 약 54, 적어도 약 55, 적어도 약 56, 적어도 약 57, 적어도 약 58, 적어도 약 59, 적어도 약 60, 적어도 약 61, 적어도 약 62, 적어도 약 63, 적어도 약 64, 적어도 약 65, 적어도 약 66, 적어도 약 67, 적어도 약 68, 적어도 약 69, 적어도 약 70, 적어도 약 71, 적어도 약 72, 적어도 약 73, 적어도 약 74, 적어도 약 75, 적어도 약 76, 적어도 약 77, 적어도 약 78, 적어도 약 79, 적어도 약 80의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 40의 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 45의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 50의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 55의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 60의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 65의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 70의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 75의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 적어도 약 80의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 30 내지 약 1000, 약 30 내지 약 900, 약 30 내지 약 800, 약 30 내지 약 700, 약 30 내지 약 600, 약 30 내지 약 500, 약 30 내지 약 400 내지, 약 30 내지 약 300, 약 30 내지 약 200, 약 30 내지 약 100, 약 40 내지 약 1000, 약 40 내지 약 900, 약 40 내지 약 800, 약 40 내지 약 700, 약 40 내지 약 600, 약 40 내지 약 500, 약 40 내지 약 400, 약 40 내지 약 300, 약 40 내지 약 200, 또는 약 40 내지 약 100의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 90, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 70, 약 30 내지 약 60, 약 30 내지 약 50, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 100, 약 40 내지 약 90, 약 40 내지 약 80, 약 40 내지 약 70, 약 40 내지 약 60, 약 70 내지 약 80, 약 75 내지 약 85, 약 65 내지 약 75, 약 65 내지 약 80, 약 60 내지 약 85, 또는 약 40 내지 약 500의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 약 100 내지 약 1000, 약 100 내지 약 900, 약 100 내지 약 800, 약 100 내지 약 700, 약 100 내지 약 600, 약 100 내지 약 500, 약 100 내지 약 400, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 200, 약 200 내지 약 1000, 약 200 내지 약 900, 약 200 내지 약 800, 약 200 내지 약 700, 약 200 내지 약 600, 약 200 내지 약 500, 약 200 내지 약 400, 약 200 내지 약 300, 약 300 내지 약 1000, 약 300 내지 약 900, 약 300 내지 약 800, 약 300 내지 약 700, 약 300 내지 약 600, 약 300 내지 약 500, 약 300 내지 약 400, 약 400 내지 약 1000, 약 400 내지 약 900, 약 400 내지 약 800, 약 400 내지 약 700, 약 400 내지 약 600, 약 400 내지 약 500, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 900, 약 500 내지 약 800, 약 500 내지 약 700, 약 500 내지 약 600, 약 600 내지 약 1000, 약 600 내지 약 900, 약 600 내지 약 800, 약 600 내지 약 700, 약 700 내지 약 1000, 약 700 내지 약 900, 약 700 내지 약 800, 약 800 내지 약 1000, 약 800 내지 약 900, 또는 약 900 내지 약 1000의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신을 포함한다.
일부 측면에서, 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 또는 이들의 조합의 수는 음이온성 페이로드의 길이에 기반하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 더 긴 서열을 가진 음이온성 페이로드는 더 많은 수의 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신과 쌍을 이룰 수 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9, 또는 약 3이 되도록 계산될 수 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.3 내지 약 1.7, 예를 들어, 약 1.5가 되도록 계산된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.4가 되도록 계산된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.6이 되도록 계산된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.3이 되도록 계산된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위에서 염기성 아미노산, 예를 들어, 라이신의 수는 음이온성 페이로드, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 안티미르에서 포스페이트에 대한 중합체의 양성자화된 아민의 몰비(N/P)가 약 1.7이 되도록 계산된다.
당업자는 양이온성 담체 모이어티의 역할이 페이로드 상의 음전하(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 포스페이트 골격의 음전하)를 정전기 상호작용을 통해 중화시키는 것이기 때문에, 일부 측면에서 (예를 들어, 페이로드가 안티미르와 같은 핵산인 경우), 양이온성 담체의 길이, 양이온성 담체 상에 있는 양으로 하전된 기의 수, 및 양이온성 담체 상에 존재하는 전하의 분포 및 방향은 페이로드 분자 상의 길이 및 전하 분포에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다.
다른 측면에서, 예를 들어 페이로드가 다중 소분자(예를 들어, 음이온성 소분자 약물)인 경우, 양이온성 담체의 길이 및 양이온성 담체 상의 양으로 하전된 기의 수는 원하는 페이로드와 상관관계가 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위에 의해 운반되는 소분자 약물의 수는 양이온성 담체 모이어티의 전하 수에 의존할 것이다.
일부 측면에서, 양이온성 담체는 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 약 35 내지 약 40, 약 40 내지 약 45, 약 45 내지 약 50, 약 50 내지 약 55, 약 55 내지 약 60, 약 60 내지 약 65, 약 65 내지 약 70, 약 70 내지 약 75, 또는 약 75 내지 약 80의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 30 내지 약 50의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 70 내지 약 80의 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 측면에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 염기성 아미노산은 D-아미노산이다. 일부 측면에서, 염기성 아미노산은 L-아미노산이다. 일부 측면에서, 양으로 하전된 담체는 D-아미노산 및 L-아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 염기성 아미노는 적어도 하나의 비천연 아미노산 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 측면에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, L-4-아미노메틸-페닐알라닌, L-4-구아니딘-페닐알라닌, L-4-아미노메틸-N-이소프로필-페닐알라닌, L-3-피리딜-알라닌, L-트랜스-4-아미노메틸사이클로헥실-알라닌, L-4-피페리디닐-알라닌, L-4-아미노사이클로헥실-알라닌, 4-구아니디노부티르산, L-2-아미노-3-구아니디노프로피온산, DL-5-하이드록시라이신, 피롤라이신, 5-하이드록시-L-라이신, 메틸라이신, 하이푸신, 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 약 40의 라이신을 포함한다. 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 약 50의 라이신을 포함한다. 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 약 60의 라이신을 포함한다. 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 약 70의 라이신을 포함한다. 특정 측면에서, 양으로 하전된 담체는 약 80의 라이신을 포함한다.
다른 측면에서, 양이온성 담체는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 또는 적어도 80의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 알킬 사슬, 예를 들어 C3 내지 C50 을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체는 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 35, 약 35 내지 약 40, 약 40 내지 약 45, 약 45 내지 약 50, 약 50 내지 약 55, 약 55 내지 약 60, 약 60 내지 약 65, 약 65 내지 약 70, 약 70 내지 약 75, 또는 약 75 내지 약 80의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 알킬 사슬, 예를 들어 C3 내지 C50을 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양이온성 담체는 30 내지 약 50의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 알킬 사슬, 예를 들어 C3 내지 C50을 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양이온성 담체는 70 내지 약 80의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 알킬 사슬, 예를 들어 C3 내지 C50을 포함한다.
다른 측면에서, 양이온성 담체는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 적어도 50, 적어도 51, 적어도 52, 적어도 53, 적어도 54, 적어도 55, 적어도 56, 적어도 57, 적어도 58, 적어도 59, 적어도 60, 적어도 61, 적어도 62, 적어도 63, 적어도 64, 적어도 65, 적어도 66, 적어도 67, 적어도 68, 적어도 69, 적어도 70, 적어도 71, 적어도 72, 적어도 73, 적어도 74, 적어도 75, 적어도 76, 적어도 77, 적어도 78, 적어도 79, 또는 적어도 80의 양이온성 기(예: 아미노 기)를 포함하는 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체는 약 5 내지 약 10의 양이온성 기, 약 10 내지 약 15의 양이온성 기, 약 15 내지 약 20의 양이온성 기, 약 20 내지 약 25의 양이온성 기, 약 25 내지 약 30의 양이온성 기, 약 30 내지 약 35의 양이온성 기, 약 35 내지 약 40의 양이온성 기, 약 40 내지 약 45의 양이온성 기, 약 45 내지 약 50의 양이온성 기, 약 50 내지 약 55의 양이온성 기, 약 55 내지 약 60의 양이온성 기, 약 60 내지 약 65의 양이온성 기, 약 65 내지 약 70의 양이온성 기, 약 70 내지 약 75의 양이온성 기, 또는 약 45 내지 약 50의 양이온성 기(예를 들어, 아미노기)를 포함하는 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양이온성 담체는 30 내지 약 50의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 일부 특정 측면에서, 양이온성 담체는 70 내지 약 80의 양이온성 기(예를 들어, 아미노 기)를 포함하는 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 일부 측면에서, 중합체 또는 공중합체는 아크릴레이트, 폴리알코올, 또는 폴리사카라이드이다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 단일 페이로드 분자에 결합한다. 다른 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 페이로드 분자에 결합할 수 있다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 핵산 페이로드의 음전하는 약 3:1, 약 2.9:1, 약 2.8:1, 약 2.7:1, 약 2.6:1, 약 2.5:1, 약 2.4:1, 약 2.3:1, 약 2.2:1, 약 2:1, 약 2:1, 약 1.9:1, 약 1.8:1, 약 1.7:1, 약 1.6:1, 약 1.5:1, 약 1.4:1, 약 1.3:1, 약 1.2:1, 약 1.1:1, 약 1:1, 약 1:1.1, 약 1:1.2, 약 1:1.3, 약 1:1.4, 약 1:1.5, 약 1:1.6, 약 1:1.7, 약 1:1.8, 약 1:1.9, 약 1:2, 약 1:2.1, 약 1:2.2, 약 1:2.3, 약 1:2.4, 약 1:2.5, 약 1:2.6, 약 1:2.7, 약 1:2.8, 약 1:2.9, 또는 약 1:3의 이온비로 존재한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 핵산 페이로드의 음전하는 1:1의 전하비로 존재한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 핵산 페이로드의 음전하는 3:2의 전하 비로 존재한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 핵산 페이로드의 음전하는 2:3의 전하비로 존재한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
여기서, A는 트립토판 또는 페닐알라닌이고, B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 및 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고; 그리고,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
X는 이고; 여기서 Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N O 또는 S이고, n은 1 또는 2이다. 일부 측면에서, X는 -SH(예를 들어, 설파닐 기, 알칸티올 또는 알킬 티올)일 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 비타민, 예를 들어, 비타민 B3에 접합된 양이온성 담체 단위의 한 유형, 및 설파닐 기(예를 들어, 알칸티올 또는 알킬 티올)에 접합된 양이온성 담체 단위의 다른 유형를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 비타민, 예를 들어, 비타민 B3에 접합된 제 1 유형의 양이온성 담체 단위, 설파닐 기(예를 들어, 알칸티올 또는 알킬 티올)에 접합된 제 2 유형의 양이온성 담체 단위; 및 유리 염기인 제 3 유형의 양이온성 담체 단위를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
여기서, A는 트립토판 또는 페닐알라닌이고, B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 및 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고;
(iii) k는 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고; 그리고,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
X1은 이고; 여기서 Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N O 또는 S이고, n은 1 또는 2이고; X2는 이고, 여기서 p는 0 내지 5이다. 일부 측면에서, p는 0이다. 일부 측면에서, X2는 SH이다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 말단 기가 반응성 기인 유리 말단을 갖는다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 유리 말단(예를 들어, 폴리-라이신 양이온성 담체 모이어티에서 C-말단)을 가지며, 여기서 말단 기는 아미노(-NH2) 기이다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티는 말단기가 설프히드릴 기인 유리 말단을 갖는다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 모이어티분의 반응성 기는 보조제 모이어티, 예를 들어 비타민 B3 보조제 모이어티에 부착된다.
c. 보조제 모이어티
일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 적어도 하나의 보조제 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "보조제 모이어티"는, 예를 들어 (i) 페이로드의 치료 또는 예방 활성을 보완하고, (ii) 페이로드의 치료 또는 예방 활성을 조절하고, (iii) 표적 조직 또는 표적 세포에서 치료제 및/또는 예방제로서의 기능하고, (iv) 생리학적 장벽, 예를 들어 BBB 및/또는 원형질막을 가로질러 양이온성 담체 단위의 수송 촉진하고, (v) 표적 조직 또는 표적 세포의 항상성을 개선하고, (vi) 양이온 운반 모이어티에 양전하 기를 제공하거나, (vii) 이들의 임의의 조합을 할 수 있는 분자 실재를 지칭한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는, 예를 들어 면역 반응, 염증 반응, 또는 조직 미세환경을 조절할 수 있다.
일부 측면에서, 면역 반응을 조절할 수 있는 보조제 모이어티는, 예를 들어 티로신 또는 도파민을 포함할 수 있다. 티로신은 L-DOPA로 전환된 다음 2-단계 효소 반응을 통해 도파민으로 전환될 수 있다. 일반적으로 파킨슨병 환자의 도파민 수치는 낮다. 따라서, 일부 측면에서 티로신은 파킨슨병 치료에 사용되는 양이온성 담체 단위의 보조제 모이어티이다. 트립토판은 식욕, 감정, 운동, 인지 및 자율 기능에 역할을 하는 것으로 생각되는 신경 전달 물질인 세로토닌으로 전환될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 낮은 세로토닌 수준과 관련된 질병 또는 병태의 치료에 사용되는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 보조제 모이어티로서 트립토판을 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는, 예를 들어 종양 미세환경에서 저산소증을 억제하거나 감소시킴으로써 종양이 있는 대상체에서 종양 미세환경을 조절할 수 있다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는, 예를 들어 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 다음을 포함하는 이미다졸 유도체이다:
(화학식 VI)
여기서, G1 및 G2는 각각 독립적으로 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, 또는 G1 및 G2가 함께 방향족 고리를 형성하고, 여기서 n은 1-10이다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 니트로이미다졸은 항생제로 작용한다. 니트로이미다졸의 니트로헤테로사이클은 저산소 세포에서 환원적으로 활성화된 다음 산화환원 재활용을 거치거나 세포독성 생성물로 분해될 수 있다. 환원은 일반적으로 혐기성 세균이나 무산소 조직에서만 일어나므로, 인간 세포나 호기성 세균에 미치는 영향은 상대적으로 적다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 니트로이미다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 다음을 포함한다:
(화학식 VII)
여기서, Ar은 또는 이고, 여기서 각각의 Z1 및 Z2는 H 또는 OH이다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 염증 반응을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 비타민이다. 일부 측면에서, 비타민은 사이클릭 고리 또는 사이클릭 헤테로원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다. 일부 측면에서, 비타민은 다음을 포함한다:
(화학식 VIII)
여기서, Y1 및 Y2는 각각 C, N, O 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
일부 측면에서, 비타민은 비타민 A(레티놀), 비타민 B1(티아민 클로라이드), 비타민 B2(리보플라빈), 비타민 B3(나이아신아미드), 비타민 B6(피리독살), 비타민 B7(비오틴), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12(코발라민), 비타민 C(아스코르브산), 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(토코페롤), 비타민 M, 비타민 H, 이들의 유도체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 비타민은 비타민 B3(나이아신 또는 니코틴산으로도 알려진)이다.
(화학식 IX)
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 적어도 약 20, 적어도 약 21, 적어도 약 22, 적어도 약 23, 적어도 약 24, 적어도 약 25, 적어도 약 26, 적어도 약 27, 적어도 약 28, 적어도 약 29, 또는 적어도 약 30의 비타민 B3을 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 10의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 7의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 8의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 9의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 10의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 11의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 12의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 13의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 14의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 15의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 20의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 25의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 30의 비타민 B3를 포함한다.
일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 5 내지 약 10의 비타민 B3, 약 10 내지 약 15의 비타민 B3, 약 15 내지 약 20의 비타민 B3, 약 20 내지 약 25의 비타민 B3, 약 25 내지 약 30의 비타민 B3개, 약 30 내지 약 35의 비타민 B3, 약 35 내지 약 40의 비타민 B3, 약 40 내지 약 45의 비타민 B3, 약 45 내지 약 50의 비타민 B3를 포함한다. 일부 측면에서, 보조제 모이어티는 약 10 내지 약 20의 비타민 B3, 약 20 내지 약 30의 비타민 B3, 약 30 내지 약 40의 비타민 B3, 약 40 내지 약 50의 비타민 B3, 약 5 내지 약 15의 비타민 B3, 약 15 내지 약 25의 비타민 B3, 약 25 내지 약 35의 비타민 B3, 약 35 내지 약 45의 비타민 B3, 약 45 내지 약 55의 비타민 B3를 포함한다.
나이아신은 생체내 조효소 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)의 전구체이다. NAD는 효소 NAD+ 키나제의 존재 하에서 인산화에 의해 NADP로 전환된다. NADP 및 NAD는 많은 수소 전달 과정에 참여하는 많은 탈수소효소의 조효소이다. NAD는 지방, 탄수화물, 단백질 및 알코올의 이화작용 뿐만 아니라 세포 신호전달 및 DNA 복구에 중요하며 NADP는 대부분 지방산 및 콜레스테롤 합성과 같은 동화작용 반응에서 중요하다. 높은 에너지 요구량(뇌) 또는 높은 회전율(장, 피부) 기관은 일반적으로 이들의 결핍에 가장 취약하다.
나이아신은 NIACR1의 활성화를 통해 뇌, 위장관, 피부 및 혈관 조직을 포함하는 다양한 조직에서 현저한 항염증 효과를 생성한다. 나이아신은 신경염증을 약화시키는 것으로 나타났으며 다발성 경화증 및 파킨슨병과 같은 신경면역 장애 치료에 효능이 있을 수 있다(Offermanns & Schwaninger(2015) Trends in Molecular Medicine 21:245-266; Chai et al(2013) Current Atherosclerosis Reports 15:325; Graff et al(2016) Metabolism 65:102-13; and Wakade & Chong (2014) Journal of the Neurological Sciences 347:34-8, 이들은 본원에서 전체가 참조로 포함된다).
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
X는 비타민 B3이고;
A는 표적화 모이어티이고,
B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고; 그리고,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
X는 비타민 B3이고;
A는 표적화 모이어티이고,
B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고;
(iii) k는 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150; 및,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
여기서, X1은 이고, 여기서 Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N, O 또는 S이고, n은 1 또는 2이고; X2는 이고, 여기서 p는 0 내지 5이다. 일부 측면에서, p는 0이다. 일부 측면에서, X2는 SH이다.
d. 표적화 모이어티
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 임의로 링커를 통해 수용성 중합체에 연결된 표적화 모이어티를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "표적화 모이어티"는 특이적 생물학적 물질 또는 부위에 결합하는 생체인식 분자를 의미한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 특정 표적 분자(예를 들어, 수용체를 표적으로 하는 리간드, 또는 표면 단백질을 표적으로 하는 항체), 조직(예를 들어, 미셀을 특정 기관 또는 조직, 예를 들어 간, 뇌 또는 내피에 우선적으로 운반하는 분자)에 특이적이거나, 또는 생리학적 장벽(예를 들어, 뇌 혈액 장벽 또는 원형질막을 가로질러 수송을 촉진할 수 있는 펩티드 또는 기타 분자)을 통한 수송을 촉진한다.
본 개시내용에 따른 페이로드(예를 들어, 뉴클레오티드 분자, 예를 들어, microRNA에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 표적화하기 위해, 표적화 모이어티는 양이온성 담체 단위에 커플링될 수 있고, 따라서 미셀의 외부 표면에 결합될 수 있는 반면, 미셀은 코어 내에 포획된 페이로드를 갖는다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 본 개시내용의 미셀을 조직에 표적화할 수 있는 표적화 모이어티이다. 일부 측면에서, 조직은 간, 뇌, 신장, 폐, 난소, 췌장, 갑상선, 유방, 위, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 측면에서, 조직은 암 조직, 예를 들어 간암, 뇌암, 신장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 갑상선암, 유방암, 위암, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 측면에서, 조직은 간이다. 특정 측면에서, 간을 표적화하는 표적화 모이어티는 콜레스테롤이다. 다른 측면에서, 간 표적화 모이어티는 아시알로글리코단백질 수용체 표적화 모이어티에 결합하는 리간드이다. 일부 측면에서, 아시알로글리코단백질 수용체 표적화 모이어티는 GalNAc 클러스터를 포함한다. 일부 측면에서, GalNAc 클러스터는 1가, 2가, 3가 또는 4가 GalNAc 클러스터이다.
또 다른 측면에서, 조직은 췌장이다. 일부 측면에서, 췌장 표적화 모이어티는 췌장 세포 상의 αvβ3 인테그린 수용체를 표적화하는 리간드를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 아르기닐글리실아스파르트산(RGD) 펩티드 서열(L-아르기닐-글리실-L-아스파르트산; Arg-Gly-Asp)을 포함한다.
일부 측면에서, 조직은 중추신경계의 조직, 예를 들어, 신경 조직이다. 일부 측면에서, 중추 신경계를 표적으로 하는 표적화 모이어티는 대형-중성 아미노산 수송체(Large-neutral Amino Acid Transporter 1, LAT1)에 의해 수송될 수 있다. LAT1(SLC7A5)은 대형 중성 아미노산 및 여러 의약품의 흡수를 위한 수송체이다. LAT1은 L-도파 또는 가바펜틴과 같은 약물을 수송할 수 있다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 글루코스 수송체 1(또는 GLUT1)에 결합할 수 있고 BBB를 통과할 수 있는 글루코스, 예를 들어 D-글루코스를 포함한다. 용질 운반체 계열 2, 촉진 글루코스 수송체 구성원 1(SLC2A1)로도 알려진 GLUT1은 인간에서 SLC2A1 유전자에 의해 인코딩되는 단일수송체(uniporter) 단백질이다. GLUT1은 포유동물 세포의 원형질막을 통한 글루코스 수송을 촉진한다. 이 유전자는 포유류의 혈액-뇌 장벽에서 주요 글루코스 수송체를 인코딩한다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 BBB를 가로질러 GLUT1 수송체에 결합할 수 있는 갈락토스, 예를 들어 D-갈락토스를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 아세틸콜린에스테라제 억제제(AChEI) 및/또는 EAAT 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 글루탐산을 포함한다. 아세틸콜린에스테라아제는 콜린에스테라아제 효소 계열의 주요 구성원인 효소이다. 아세틸콜린에스테라아제 억제제(AChEI)는 아세틸콜린에스테라아제가 아세틸콜린을 콜린과 아세테이트로 분해하는 것을 억제하여 아세틸콜린 수용체가 풍부한 중추신경계, 자율신경절 및 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 작용의 수준과 지속시간을 모두 증가시키는 억제제이다. 아세틸콜린에스테라제 억제제는 두 가지 유형의 콜린에스테라제 억제제 중 하나이고; 다른 하나는 부티릴-콜린에스테라제 억제제이다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA이며, 이는 BBB를 가로질러 GABA 수용체에 결합할 수 있다. GABA 수용체는 성숙한 척추동물 중추신경계의 주요 억제 화합물인 신경전달물질 감마-아미노부티르산(GABA)에 반응하는 수용체 부류이다. GABA 수용체에는 GABAA와 GABAB의 두 가지 부류가 있다. GABAA 수용체는 리간드-개폐 이온 채널(이온성 수용체라고도 한다)이고; 반면 GABAB 수용체는 대사지향성 수용체라고도 하는 G 단백질-커플된 수용체이다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 LAT1에 결합하고 BBB를 가로지를 수 있는 티로신을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 LAT1에 결합하고 BBB를 가로지를 수 있는 라이신을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 LAT1에 결합하고 BBB를 가로지를 수 있는 글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA 수용체, LAT1, CNS 역전사효소 억제제, 및/또는 도파민(DA) 수용체에 결합하고 BBB를 가로지를 수 있는 페닐알라닌을 포함한다. 도파민 수용체는 척추동물 중추신경계(CNS)에서 두드러지는 G 단백질-커플된 수용체의 한 부류이다. 도파민 수용체는 G-단백질 커플링뿐만 아니라 다른 단백질(도파민 수용체-상호작용 단백질) 상호작용을 통한 신호전달을 통해 다른 이펙터를 활성화한다. 신경 전달 물질인 도파민은 도파민 수용체의 주요 내인성 리간드이다.
도파민 수용체는 동기 부여, 쾌감, 인지, 기억, 학습, 미세 운동 조절 뿐만 아니라 신경내분비 신호의 조절을 포함하는 많은 신경학적 과정에 연루되어 있다. 비정상적인 도파민 수용체 신호 전달 및 도파민성 신경 기능은 여러 신경정신 질환과 관련이 있다. 따라서 도파민 수용체는 일반적인 신경 약물 표적이고; 항정신병제는 종종 도파민 수용체 길항제인 반면, 정신자극제는 일반적으로 도파민 수용체의 간접 작용제이다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 CNS 역전사효소 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 발린을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA 수용체 및/또는 CNS 역전사효소 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 트립토판을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA 수용체 및/또는 CNS 역전사효소 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 류신을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA 수용체 및/또는 CNS 역전사효소 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 메티오닌을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GABA 수용체에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 히스티딘을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 CNS 역전사효소 억제제에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 이소류신을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GSH 수송체에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 글루타티온을 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 GSH 수송체에 결합할 수 있고 BBB를 가로지를 수 있는 글루타티온-Met를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 산화질소 합성효소(NOS)에 결합할 수 있고 BBB에 결합할 수 있는 우레아/티오우레아를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 REDOX 메카니즘에 의해 BBB를 가로지를 수 있는 NAD+/NADH를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 퓨린을 포함하고 BBB를 가로지를 수 있다. CNS 표적화를 위한 표적화 모이어티의 추가 예는 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌에 기재되어 있다(Sutera et al.(2016): Small endogenous molecules as moiety to improve targeting of CNS drugs, Expert Opinion on Drug Delivery, DOI: 10.1080/17425247.2016.1208651).
일부 측면에서, 표적화 모이어티에 의해 표적화된 조직은 골격근이다. 일부 측면에서, 골격근을 표적화하는 표적화 모이어티는 대형-중성 아미노산 수송체 1(LAT1)에 의해 수송될 수 있다.
이는 T-세포, 암 세포 및 뇌 내피 세포를 포함하는 수많은 세포 유형에서 발현된다. LAT1은 뇌 미세혈관 내피 세포에서 지속적으로 높은 수준으로 발현된다. 주로 BBB에 위치하는 용질 운반체이기 때문에, 본 개시내용의 미셀을 LAT1에 표적화함으로써 BBB를 통한 전달을 허용한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀을 LAT1 수송체로 표적화하는 표적화 모이어티는 아미노산, 예를 들어 분지쇄 또는 방향족 아미노산이다. 일부 측면에서, 아미노산은 발린, 류신 및/또는 이소류신이다. 일부 측면에서, 아미노산은 트립토판 및/또는 티로신이다. 일부 측면에서, 아미노산은 트립토판이다. 다른 측면에서, 아미노산은 티로신이다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 티록신, 멜팔란, L-DOPA, 가바펜틴, 3,5-I-디요오도티로신, 3-요오도-I-티로신, 펜클로닌, 아시비신, 류신, BCH, 메티오닌, 히스티딘, 발린, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 LAT1 리간드이다.
일부 측면에서, LAT1 리간드는 하기에 표시된 바와 같은 [1] 1-페닐알라닌, [2] o-사르코라이신, [3] m-사르코라이신, [4] 멜팔란, [5] 2-아미노-2-노르보르난카르복실산(BCH), [6] (±)-2-아미노-1,2,3,4-테트라하이드로-2-나프토산, [7] dl-2-NAM-5, [8] dl-2-NAM-6, [9] ] dl-2-NAM-7, [10] dl-2-NAM-8, [11] dl-탈염소화-NAM, [12] dl-1-NAM-7, [13] (±)-2-아미노인단-2 카르복실산, [14](±)-2-아미노벤조-비사이클로-[2.2.1]헵탄-2'-엑소-카르복실산, [15](±)-2-아미노-(비스-2-클로로에틸)-5-아미노인단-2-카르복실산, [16] (±)-2-엔도-아미노-비스(2-클로로에틸)-7'-아미노벤조비사이클로[2.2.1]헵탄-2-엑소-카르복실산, [17] 1-6-디아조-5-옥소-노르류신(l-DON), [18] 아시비신, [19] 아자세린, [20] 부티오닌 설폭스이민(BSO), [21] l-1-나프틸알라닌, [22] o-벤질-1-티로신, [23] 1-2-아미노-노나노산, [24] l-티로신, [25] α-메틸티로신, [26] l-DOPA, [27] α-메틸도파, [28] 3-o-메틸도파, [29] 드록시도파, [30] 카르비도파, [31] 도파민, [32] 티라민, [33] α-메틸페닐알라닌, [34] N-메틸페닐알라닌, [35] 페닐알라닌 메틸 에스테르, [36] 가바펜틴, [37] 3,3'-디요오드티로닌, [38] l-T3, [39] 3',5',3-트리요오도티로닌(r l-T3), 또는 [40] l-T4, 또는 임의의 조합이다.
또는 이들의 조합.
일부 측면에서, LAT1 리간드는 하기에 나타낸 LAT1-표적화 전구약물 또는 이들의 조합이다.
그 전체가 참고로 본원에 포함되는 문헌을 참조한다(Singh & Ecker (2018) "Insights into the Structure, Function, and Ligand Discovery of the Large Neutral Amino Acid Transporter 1, LAT1," Int. J. Mol. Sci. 19:1278; Geier et al.(2013) "Structure-based ligand discovery for the Large-neutral Amino Acid Transporter 1, LAT-1," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:5480-85; and Chien et al.(2018) "Reevaluating the Substrate Specificity of the L-type Amino Acid Transporter (LAT1)," J. Med. Chem. 61:7358-73).
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
여기서, A는 트립토판 또는 페닐알라닌이고,
B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고; 그리고,
(iii) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
X는 이고, n은 1 또는 2이고; Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N, O 또는 S이고, n은 1 또는 2, 예를 들어 비타민 B3이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 담체 단위는 다음을 포함한다:
여기서, A는 트립토판 또는 페닐알라닌이고,
B는 양이온성 담체 모이어티, 예를 들어 라이신이고,
(i) l은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
(ii) m은 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150이고;
(iii) k는 1 내지 150 사이의 정수, 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150; 및,
(iv) n은 약 1 내지 약 200 사이의 정수; 예를 들어, 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 130 내지 약 140, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160, 약 160 내지 약 170, 약 170 내지 약 180, 약 180 내지 약 190, 또는 약 190 내지 약 200이고;
X1은 이고; 여기서, Y1은 C, N, O 또는 S이고, Y2는 C, N, O 또는 S이고, n은 1 또는 2이고; X2는 이고, 여기서 p는 0 내지 5이다. 일부 측면에서, p는 0이다. 일부 양태에서, X2는 SH이다.
표적화 모이어티의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
i. 리간드
리간드는 다른 물질에 대한 선택적(또는 특이적) 친화도를 갖는 선택적으로 결합가능한 물질로 정의되는 표적화 모이어티의 유형으로서 기능한다. 리간드는 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 더 큰 특이적 결합체 또는 "결합 파트너" 또는 "수용체"에 의해 인식되고 결합된다. 표적화에 적합한 리간드의 예는 항원, 합텐, 비오틴, 비오틴 유도체, 렉틴, 갈락토사민 및 푸코실아민 모이어티, 수용체, 기질, 보조효소 및 보조인자이다.
본 개시내용의 미셀에 적용될 때 리간드는 이의 상응하는 항체 또는 이의 분획에 의해 또는 이에 결합될 수 있는 항원 또는 합텐을 포함한다. 또한 바이러스 항원 또는 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 및 DNA 및 RNA 바이러스로부터의 것을 포함하여 뉴클레오캡시드, AIDS, HIV 및 간염 바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 아레나바이러스, 코로나바이러스, 플라비바이러스, 헤르페스바이러스, 믹소바이러스, 온코르나바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르보바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 랍도바이러스, 라이노바이러스, 토가바이러스 및 바이로이드; 그람-음성 및 그람-양성 박테리아를 포함한 임의의 박테리아 항원, 아시네토박터(Acinetobacter), 아크로모박터(Achromobacter), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 클라미디아(Chlamydia), 엔테로박터(enterobacteria), 헤모필루스(Haemophilus), 락토바실루스(Lactobacillus), 나이세리아(Neisseria), 스타필로코커스(Staphyloccus) 또는 스트렙토코커스(Streptoccocus); 아스페르길루스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 코시디오데스(Coccidiodes), 진균, 식물균 및 효모를 포함한 모든 곰팡이 항원; 모든 마이코플라스마 항원; 모든 리케차 항원; 모든 원생동물 항원; 모든 기생충 항원; 혈액 세포, 바이러스 감염 세포, 유전자 마커, 심장 질환, 종양단백질, 혈장 단백질, 보체 인자, 류마티스 인자의 항원을 포함한 모든 인간 항원이 포함된다. 알파-태아단백질, 전립선 특이적 항원(PSA) 및 CEA와 같은 암 및 종양 항원, 암 마커 및 종양단백질이 포함된다.
본 개시내용의 미셀을 표적화하기 위한 리간드로서 기능할 수 있는 다른 물질은 특정 비타민(즉, 엽산, B12), 스테로이드, 프로스타글란딘, 탄수화물, 지질, 항생제, 약물, 디곡신, 살충제, 마취제, 신경전달물질 및 리간드로서 기능하도록 사용되거나 변형된 물질이다.
일부 측면에서, 표적화 모이어티는 단백질 또는 단백질 단편(예를 들어, 호르몬, 독소), 및 세포 친화도를 갖는 합성 또는 천연 폴리펩티드를 포함한다. 리간드에는 또한 재조합 DNA, 유전 및 분자 공학을 통해 생성되는 리게이터에 대해 선택적 친화도를 갖는 다양한 물질이 포함된다. 달리 언급된 경우를 제외하고, 본 개시내용의 리간드는 또한 미국 특허 3,817,837에 정의된 바와 같은 리간드를 포함하여, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
ii. 리게이터
리게이터는 본 개시내용에 대해 특이적 결합체 또는 "파트너" 또는 "수용체"로서 정의된 표적화 모이어티의 유형으로서 기능하며, 이는 일반적으로, 반드시 그렇지는 않지만 결합할 수 있는 리간드보다 더 크다. 본 개시의 목적을 위해, 특이적 리간드와 선택적 친화도 결합을 할 수 있는 특이적 물질 또는 재료 또는 화학 물질 또는 "반응물"일 수 있다. 리게이터는 항체, 비단백질 결합체 또는 "특이적 반응기"와 같은 단백질일 수 있다.
본 개시내용에 적용될 때, 리게이터는 모든 부류의 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, Fab 분획, 이의 단편 및 유도체를 포함하는 것으로 정의되는 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 천연 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성으로 생성된 면역글로불린 및 이의 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 면역글로불린 결합 도메인과 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 다룬다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편으로부터의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 항체라는 용어의 사용은 전체 항체, 다중클론, 단일클론 및 재조합 항체, 이의 단편을 포함하는 것을 의미하고, 단일-사슬 항체, 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단일클론 항체, 항-개별특이형 항체, 항체 단편, 예를 들어 scFv, scFab, (scFab)2, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 디아바디 및 항체-관련 폴리펩티드을 추가로 포함한다. 항체는 원하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 이중특이성 항체 및 다중특이성 항체를 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 분자이다. 일부 측면에서, 항체는 나노바디이다. 일부 측면에서, 항체는 ADC이다. 용어 "항체-약물 접합체" 및 "ADC"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 치료제(본원에서 종종 제제, 약물 또는 활성 약제학적 성분으로 지칭된다) 또는 제제에 공유적으로 연결된 항체를 지칭한다. 본 개시내용의 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 항체-약물 접합체이다.
특정 조건 하에, 본 개시내용은 또한 다른 물질을 리게이터로서 사용하는 데에도 적용가능하다. 예를 들어, 표적화에 적합한 다른 리게이터는 자연 발생 수용체, 임의의 혈구응집소 및 세포막 및 호르몬, 비타민, 약물, 항생제, 암 마커, 유전적 마커, 바이러스 및 조직적합성 마커에 특이적으로 결합하는 핵 유도체를 포함한다. 리게이터의 또 다른 군에는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 RNA 및 DNA 결합 물질과 히스톤 및 프로타민과 같은 폴리펩티드 또는 단백질이 포함된다.
다른 리게이터는 또한 효소, 특히 세포 표면 효소, 예를 들어 뉴라미니다제, 혈장 단백질, 아비딘, 스트렙타비딘, 샬론, 카비탄드, 티로글로불린, 내인자, 글로불린, 킬레이터, 계면활성제, 유기금속 물질, 포도구균 단백질 A, 단백질 G, 리보솜, 박테리오파지, 시토크롬, 렉틴, 특정 수지 및 유기 중합체를 포함한다.
표적화 모이어티는 또한 재조합 DNA, 유전 및 분자 공학을 통해 생성되는 임의의 세포, 조직 또는 미생물의 표면에 친화도를 갖는 임의의 단백질, 단백질 단편 또는 폴리펩티드와 같은 다양한 물질을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 표적화 모이어티는 본 개시내용의 미셀을 특정 조직(즉, 간 조직 또는 뇌 조직), 특정 유형의 세포(예를 들어, 특정 유형의 암세포) 또는 생리학적 구획 또는 생리학적 장벽(예를 들어, BBB)으로 지시한다.
e. 링커
상기 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 양이온성 담체 단위는, 예를 들어, 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커"는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 합성 펩티드 또는 폴리펩티드 서열), 또는 이의 주요 기능이 본원에 개시된 양이온성 담체 단위에서 2개의 모이어티를 연결하는 것인 비-펩티드 링커를 지칭한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 조직-특이적 표적화 모이어티(TM)를 수용성 중합체(WS)와 연결하는 적어도 하나의 링커, 수용성 생중합체(WP)를 양이온성 담체(CC) 또는 보조제 모이어티(AM)와 연결하는 적어도 하나의 링커, 양이온성 담체(CC)를 보조제 모이어티(AM)와 연결하는 하나 이상의 링커, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 링커가 나란히 연결될 수 있다.
다수의 링커가 본원에 개시된 양이온성 담체 단위에 존재할 때, 각각의 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로 링커는 양이온성 담체 단위에 유연성을 제공한다. 링커는 일반적으로 절단되지 않으나; 특정 측면에서 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서 링커는 하나 이상의 프로테아제-절단가능한 부위를 포함할 수 있으며, 이는 링커의 서열 내에 위치하거나 링커 서열의 어느 한쪽 말단에서 링커의 측면에 위치할 수 있다.
한 측면에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 측면에서, 펩티드 링커는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 35, 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 또는 적어도 100의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 펩티드 링커는 적어도 약 110, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 또는 적어도 약 200의 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 펩티드 링커는 적어도 약 200, 적어도 약 250, 적어도 약 300, 적어도 약 350, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 500, 적어도 약550, 적어도 약 600, 적어도 약 650, 적어도 약 700, 적어도 약 750, 적어도 약 800, 적어도 약 850, 적어도 약 900, 적어도 약 950, 또는 적어도 약 1,000의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩티드 링커는 1 내지 약 5의 아미노산, 1 내지 약 10의 아미노산, 1 내지 약 20의 아미노산, 약 10 내지 약 50의 아미노산, 약 50 내지 약 100의 아미노산, 약 100 내지 약 200의 아미노산, 약 200 내지 약 300의 아미노산, 약 300 내지 약 400의 아미노산, 약 400 내지 약 500의 아미노산, 약 500 내지 약 600의 아미노산, 약 600 내지 약 700의 아미노산, 약 700 내지 약 800의 아미노산, 약 800 내지 약 900의 아미노산, 또는 약 900 내지 약 1000의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩티드 링커의 예는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 측면에서, 링커는 글리신/세린 링커이다. 일부 측면에서, 펩티드 링커는 식 [(Gly)n-Ser]m에 따른 글리신/세린 링커이고, 여기서 n은 1 내지 100의 임의의 정수이고 m은 1 내지 100의 임의의 정수이다. 다른 측면에서 글리신/세린 링커는 식 [(Gly)x-Sery]z(서열번호: 1)에 따르며, 여기서 x는 1 내지 4의 정수이고, y는 0 또는 1이고, z는 1 내지 50의 정수이다. 한 측면에서, 펩티드 링커는 서열 Gn을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 100의 정수일 수 있다. 특정 측면에서, 펩티드 링커의 서열은 GGGG(서열번호: 2)이다.
일부 측면에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyAla)n(서열번호: 3)을 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 100 사이의 정수이다. 다른 측면에서, 펩티드 링커는 서열 (GlyGlySer)n(서열번호: 4)을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 1과 100 사이의 정수이다.
다른 측면에서, 펩티드 링커는 서열 (GGGS)n(서열번호: 5)을 포함한다. 또 다른 측면에서, 펩티드 링커는 서열 (GGS)n(GGGGS)n(서열번호: 6)을 포함한다. 이러한 경우 n은 1-100의 정수일 수 있다. 다른 예에서, n은 1 내지 20의 정수, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다
링커의 예에는 GGG, SGGSGGS(서열번호: 7), GGSGGSGGSGGSGGG(서열번호: 8), GGSGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 9), GGSGGSGGSGGSGGSGGS(서열번호: 10), 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 11)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 측면에서, 링커는 폴리-G 서열(GGGG)n(서열번호: 12)이고, 여기서 n은 1-100의 정수일 수 있다.
한 측면에서, 펩티드 링커는 합성, 즉 비-천연 발생이다. 한 측면에서, 펩티드 링커는 자연에서는 자연적으로 연결되거나 유전적으로 융합되지 않는, 아미노산의 제 1 선형 서열을 아미노산의 제 2 선형 서열에 연결하거나 유전적으로 융합하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(또는 폴리펩티드)(예를 들어, 천연 또는 비-천연 발생 펩티드)를 포함한다. 예를 들어, 한 측면에서 펩티드 링커는 자연 발생 폴리펩티드의 변형된 형태(예를 들어, 첨가, 치환 또는 결실과 같은 돌연변이를 포함)인 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 펩티드 링커는 비-천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 펩티드 링커는 자연에서 발생하지 않는 선형 서열에서 발생하는 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 펩티드 링커는 천연 발생 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 링커는 비-펩티드 링커를 포함한다. 다른 측면에서, 링커는 비-펩티드 링커로 구성된다. 일부 측면에서, 비-펩티드 링커는, 예를 들어 말레이미도 카프로일(MC), 말레이미도 프로파노일(MP), 메톡실 폴리에틸렌글리콜(MPEG), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(SMPB), N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조네이트(SIAB), 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트(LC-SPDP), 4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜디티오)톨루엔(SMPT) 등(예를 들어, 미국 특허 번호 7,375,078 참조)일 수 있다.
링커는 당업계에 공지된 기술(예를 들어, 화학적 접합, 재조합 기술, 또는 펩티드 합성)을 사용하여 폴리펩티드 서열 내로 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석으로 확인할 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 재조합 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 다른 측면에서, 링커는 고체상 펩티드 합성을 사용하여 도입될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 양이온성 담체 단위는 재조합 기술을 사용하여 도입된 하나 이상의 링커 및 고체상 펩티드 합성 또는 당업계에 공지된 화학적 접합 방법을 사용하여 도입된 하나 이상의 링커를 동시에 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 링커는 절단 부위를 포함한다.
III. 페이로드
본원에 사용된 용어 "페이로드"는 생물학적 활성 분자, 예를 들어 치료제 또는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위와 어댑터를 통해 또는 자체적으로 상호작용할 수 있고 본 개시내용의 미셀의 코어 내에 포함될 수 있는 생물학적 활성 분자를 지칭한다. 본 개시내용에서 고려되는 페이로드는 치료 약물, 예를 들어 전구약물, 항암 약물, 항신생물 약물, 항진균 약물, 항균 약물, 항바이러스 약물, 심장 약물, 신경 약물 및 남용 약물; 알칼로이드, 항생제, 생활성 펩티드, 스테로이드, 스테로이드 호르몬, 폴리펩티드 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 마취제, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한 핵산, 살충제 및 프로스타글란딘을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 생물학적 활성 분자에는 아플라톡신, 리신, 붕가로톡신, 이리노테칸, 간시클로비르, 푸로세미드, 인도메타신, 클로르프로마진, 메토트렉세이트, 세바딘을 포함하는 세빈 유도체 및 유사체, 데사트린, 베라트리딘 등을 포함한다.
생물학적 활성 분자는 또한 다양한 플라본 유도체 및 유사체, 예를 들어 디하이드록시플라본(크리신), 트리하이드록시플라본(아피게닌), 펜타하이드록시플라본(모린), 헥사하이드록시플라본(미리세틴), 플라빌륨, 케르세틴, 피세틴; 유도체 및 유사체를 포함한 다양한 항생제, 예를 들어 페니실린 유도체(즉, 암피실린), 안트라사이클린(즉, 독소루비신, 다우노루비신, 미톡산트론), 부토코나졸, 캄프토테신, 칼코마이신, 차트로이신, 크리소마이신(V 및 M), 클로람페니콜, 클로로리포테트라사이클린, 클로모사이클린, 사이클로스포린, 엘립티신, 필리핀, 진균크로민, 그리세오풀빈, 그리세오비리딘, 구아메사이클린, 마크로라이드(즉, 암포테리신, 클로로트리신), 메티실린, 니스타틴, 크리무타신, 엘사미신, 길보카린, 라비도마이신, 란카시딘-계 항생제(예: 란카마이신), 미토마이신, 테트라마이신, 테트라사이클린, 워트만닌; 다양한 항균제, 예를 들어 레세르핀, 스피로노락톤, 술프아세트아미드 나트륨, 술폰아미드, 티암페니콜, 티오루틴; 다양한 퓨린 및 피리미딘 유도체 및 유사체, 예를 들어 5'-플루오로우라실, 5'-플루오로-2'-데옥시우리딘 및 알로푸리놀; 다양한 감광제 물질, 메조-클로린 e6 모노에틸렌디아민(Mce6), 피탈로시아닌, 포르피린 및 이들의 유도체 및 유사체 포함하는 특히 광역학 치료에 유용한 일중선 및 삼중선 산소 형성에 사용되는 물질(van Lier, JE In "Photodynamic Therapy of Neoplastic Disease"; Kessel, D., Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 1990, Vol 1); 다양한 스테로이드 물질, 예를 들어 코르티손, 에스트라디올, 하이드로코르티손, 테스토스테론, 프레드니솔론, 프로게스테론, 덱사메타손, 베클로메타손 및 기타 메타손 유도체, 다른 스테로이드 유도체 및 유사체, 예를 들어, 콜레스테롤, 디지톡신, 디곡신, 디곡시제닌; 다양한 쿠마린 유도체 및 유사체, 예를 들어 디하이드록시쿠마린(에스큘레틴), 디쿠마롤, 크리사로빈, 크리소판산, 에모딘, 세칼론산; 다양한 도파, 유도체 및 유사체, 예를 들어 도파, 도파민, 에피네프린 및 노르에피네프린(아르테레놀); 다양한 항신생물제 또는 세포 성장 억제제, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 탁산 및 시스플라틴; 다양한 바르비투레이트, 예를 들어 페노바르비톤, 아모바르비탈, 알로바르비탈, 펜토바르비탈 및 기타 바르비탈 유도체; 다양한 벤젠 유도체, 예를 들어 아미노벤조산, 브로모벤조산, 벤조카인, 벤조디아제핀, 벤조티아지드, 부틸-p-아미노벤조에이트; 다양한 폴리펩타이드 유도체; 다양한 카르복실산 유도체, 예를 들어 브로모이소발레릴우레아, 페닐-부티르산, 페닐발레르산, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
다른 생물학적 활성 분자에는 디페닐 히단토인, 아디페닌, 아네톨, 아스피린, 아조프로파존, 벤시클란, 클로랄하이드레이트, 클로람부실, 클로르프로마진, 클로로게닌, 신남산, 클로피브레이트, 코엔자임 A, 사이클로헥실 안트라닐레이트,디아제팜, 플루페남산, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루르비프로펜, 구아이아줄렌, 이부프로펜, 인디칸, 인도메타신, 요오드, 케토프로펜, 메파남산, 메나디온, 메트로니다졸, 니트라제팜, 페니토인, 프로필파라벤, 프로실라리딘, 퀴놀론, 탈리도마이드, 티아민 디라우릴설페이트, 티오펜탈, 트리암시놀론, 비타민 A, D3, E, K3, 와파린 또는 이들의 조합을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
다른 생물학적 활성 분자는 항바이러스 약물, 핵산 및 임의의 DNA 및 RNA 바이러스, AIDS, HIV 및 간염 바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 아레나바이러스, 코로나바이러스, 플라비바이러스, 헤르페스바이러스, 믹소바이러스, 온코르나바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 파르보바이러스, 피코마바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스, 탑도바이러스, 라이노바이러스, 토가바이러스 및 바이로이드에 대한 것을 포함하는 기타 항-바이러스 물질; 임의의 항균 약물, 핵산 및 그람-음성 및 그람-양성 박테리아, 아시네토박터(Acinetobacter), 아크로모박터(Achromobacter), 박테로이데스(Bacteroides), 클로스트리디움(Clostridium), 클라미디아(Chlamydia), 엔테로박테리아, 헤모필루스(Haemophilus), 락토바실루스(Lactobacillus), 나이세리아(Neisseria), 스타필로코커스(Staphyloccus) 또는 스트렙토코커스(Streptoccocus)에 대한 것을 포함하는 기타 항균 물질; 항진균제, 핵산 및 아스페르길루스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 코시디오데스(Coccidiodes), 진균, 식물균 및 효모에 대한 것들을 포함하는 기타 항진균제; 마이코플라스마 및 리케차에 대한 모든 약물, 핵산 및 기타 물질; 모든 항원충제, 핵산 및 기타 물질; 모든 구충제, 핵산 및 기타 물질; 심장 질환, 종양 및 바이러스 감염 세포에 대한 모든 약물, 핵산 및 기타 물질이다.
(a) 핵산
일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA이다. 본 개시내용의 미셀을 사용한 전달에 적합한 핵산 활성제는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 혼성화 또는 DNA 시퀀싱에 사용되는 프로브 및 프라이머와 같은 올리고뉴클레오티드도 포함하는 모든 유형의 RNA 및 모든 유형의 DNA를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산은 mRNA, miRNA, miRNA 스펀지, 터프 디코이 miRNA(TD), 안티미르(안타고미르), 작은 RNA, rRNA, siRNA, shRNA, gDNA, cDNA, pDNA, PNA, BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 앱타머, 사이클릭 디뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 서열 특이적 전사후 유전자 침묵을 유도하여 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA인 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. 예를 들어, siRNA 및 표적 RNA 사이의 서열 동일성 영역 내에서 mRNA와 같은 상동 RNA 분자의 특이적 분해를 siRNA가 유발할 수 있다. 비제한적인 예시적인 siRNA는 그 전체가 참고로 포함되는 WO 02/44321에 개시되어 있다.
일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함한다. 일부 측면에서, 생물학적 활성 분자는 miRNA 또는 miRNA 억제제(antimiR)를 포함한다. 일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 10-30의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 14-25의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 16-30의 뉴클레오티드, 18-25의 뉴클레오티드, 특히 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
miRNA에 대한 서열은, 예를 들어 miRBase 레지스트리(Griffiths-Jones, et al., Nucleic Acids Res., 36(Database Issue):D154-D158 (2008); Griffiths-Jones, et al., Nucleic Acids Res., 36(Database Issue):D140-D144 (2008); Griffiths-Jones, et al., Nucleic Acids Res., 36(Database Issue):D109-D111 (2008))및 기타 공개적으로 접근가능한 데이터베이스를 통해 공개적으로 이용가능하다.
일부 측면에서, miRNA 억제제는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 이들의 변형이다. 일부 측면에서, miRNA 길항제는 안티미르이다. 안티미르는, 예를 들어 스토펠(Stoffel) 등의 US2007/0213292에 기재된 miRNA 억제제의 특정 부류이다. 안티미르는 RNase 보호 및 향상된 조직 및 세포 흡수와 같은 약리학적 특성에 대한 다양한 변형을 함유하는 RNA-유사 올리고뉴클레오티드이다. 안티미르는 당의 완전한 2'-O-메틸화, 포스포로티오에이트 골격 및 3'-말단에 콜레스테롤-모이어티가 있다는 점에서 보통의 RNA와 다르다.
안티미르 및 기타 miRNA 억제제의 비제한적인 예는 WO2009/020771, WO2008/091703, WO2008/046911, WO2008/074328, WO2007/090073, WO2007/027775, WO2007/027894, WO2007/021896, WO2006/093526, WO2006/112872, WO2007/112753, WO2007/112754, WO2005/023986, 또는 WO2005/013901에 기재되어 있으며, 이들은 모두 본원에 참조로 포함된다.
일부 측면에서, 핵산은 포스포디에스테르 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 당-포스페이트 "골격"이 유도체화되거나, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트, 알킬 포스포트리에스테르 또는 메틸포스포네이트 연결과 같은 "골격 유사체"로 대체된 임의의 올리고뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 핵산 활성제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 설파메이트, 3'-티오포름아세탈, 메틸렌(메틸이미노)(MMI), 3'-N-카바메이트, 또는 모르폴리노 카바메이트와 같은 비-포스포러스 골격 유사체를 갖는 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고데옥시뉴클레오티드이다.
일부 측면에서, 생물학적 활성 분자(페이로드)는 안티미르이다. 본원에 사용된 용어 "안티미르", "항 microRNA," "항 miRNA" 및 이들의 변이체는 원하는 반응을 위해 세포에서 microRNA(miRNA) 기능을 중화하는 데 사용되는 분자(예를 들어, 합성적으로 생성된 분자)를 지칭한다. miRNA는 RNA 절단 또는 번역 억제에 관여하는 mRNA에 대한 상보적 서열(약 20-22bp)이다. 세포에서 mRNA를 조절하는 miRNA를 조절함으로써, 안티미르(항-miRNA 올리고뉴클레오티드, AMO 또는 안타고미르라고도 한다)는 특정 세포 장애에 대한 치료뿐만 아니라 추가 조절에 사용될 수 있다. 이 조절은 입체 차단 메커니즘 뿐만 아니라 miRNA에 대한 혼성화를 통해 발생할 수 있다.
안티미르와 miRNA 사이의 신체 내 이러한 상호작용은 과발현/과소발현이 발생하거나 miRNA의 이상이 코딩 문제를 유발하는 장애의 치료를 위한 것일 수 있다. 인간에서 발생하는 miRNA 관련 장애에는 암, 근육 질환, 자가면역 장애 및 바이러스가 포함된다.
안티미르의 다양한 성분은 안티미르의 결합 친화도 및 효능에 영향을 미치도록 조작될 수 있다. 안티미르의 2'-당은 불소 및 다양한 메틸기로 치환되도록 변형될 수 있으며, 거의 모두 결합 친화도가 증가한다. 그러나 이러한 변형된 2'-당 안티미르 중 일부는 세포 성장에 부정적인 영향을 미친다. 5'-3' 포스포디에스테르 골격 연결을 포스포로티오에이트(P-S) 골격 연결로 변형하는 것도 표적 친화도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. P-S 돌연변이를 사용하는 것은 올리고뉴클레오티드의 Tm을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 더 낮은 표적 친화도로 이어진다. 안티미르에 대한 최종 요구 사항은 미스매치 특이성과 길이 제한이다. "시드"(공유) 서열을 공유하는 동일한 계열의 miRNA로 인해 몇 개의 추가 뉴클레오티드만 상이하다; 하나의 안티미르는 잠재적으로 여러 miRNA 서열을 표적으로 할 수 있다. 안티미르 또는 miRNA 서열의 하나 이상의 예가 하기 표에 나와 있다.
표 1
일부 측면에서, 페이로드는 5 내지 30의 뉴클레오티드 길이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 hsa-miR-485, 예를 들어, hsa-miR-485-3p를 표적화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 측면에서, hsa-miR-485-3p는 서열 GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU(서열번호: 17)를 갖는다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC(서열번호: 18)를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T일 수 있다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC(서열번호: 18)를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 3개의 미스매치 또는 4개의 미스매치를 갖는다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC(서열번호: 18)를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 하나 또는 두 개의 미스매치를 갖는다. 다른 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 has-miR-485-3p의 시드 서열(UCAUACA; 서열번호 19)을 표적화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 UCAUACA(서열번호: 19)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T(시드의 상보체)일 수 있고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 30 뉴클레오티드(예를 들어, 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 또는 10 내지 18) 길이이다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 UGUAUGA(서열번호: 20)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T(시드의 상보체)일 수 있고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 시드 서열 상보체의 5'말단에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 핵산 및/또는 시드 서열 상보체의 3'말단에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 페이로드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열이다: 5'-UGUAUGA-3'(서열번호: 23), 5'-GUGUAUGA-3'(서열번호: 24), 5'-CGUGUAUGA-3'(서열번호: 25), 5'-CCGUGUAUGA-3'(서열번호S: 26), 5'-GCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 27), 5'-AGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 28), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 29), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 30), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 31), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 32), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 33), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 34), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 35), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3'(서열번호: 36); 5'-UGUAUGAC-3'(서열번호: 37), 5'-GUGUAUGAC-3'(서열번호: 38), 5'-CGUGUAUGAC-3'(서열번호: 39), 5'-CCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 40), 5'-GCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 41), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 42), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 43), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 44), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 45), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 46), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 47), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 48), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 49), 또는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 50).
일부 측면에서, 페이로드는 5'-TGTATGA-3'(서열번호: 51), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 52), 5'-CGTGTATGA-3'(서열번호: 53), 5'-CCGTGTATGA-3'(서열번호: 54), 5'-GCCGTGTATGA-3'(서열번호: 55), 5'-AGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 56), 5'-GAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 57), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 58), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 59), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 60), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 61), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 62), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 63), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3'(서열번호: 64); 5'-TGTATGAC-3'(서열번호: 65), 5'-GTGTATGAC-3'(서열번호: 66), 5'-CGTGTATGAC-3'(서열번호: 67), 5'-CCGTGTATGAC-3'(서열번호: 68), 5'-GCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 69), 5'-AGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 70), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 71), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 72), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 73), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 74), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 75), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 76), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 77), 또는 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3'(서열번호: 78)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 hsa-miR-204, 예를 들어 has-miR-204-5p를 표적화하는 뉴클레오티드 서열이다. has-miR-204-5p는 표 1에 UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU(서열번호: 13)로 표시되어 있다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA(서열번호: 15)를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 구성되는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T일 수 있다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA(서열번호: 15)를 포함하거나 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T일 수 있고, 뉴클레오티드 서열은 1개의 미스매치, 2개의 미스매치, 3개의 미스매치 또는 4개의 미스매치를 갖는다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA (서열번호: 15)를 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T일 수 있고, 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 두 개의 미스매치를 갖는다. 다른 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 has-miR-204-5p의 시드 서열(UCCCUUU; 서열번호 21)을 표적화하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AAAGGGA(서열번호: 22)(시드의 상보체)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 U는 임의로 T일 수 있고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 약 10 뉴클레오티드 내지 30 뉴클레오티드(예를 들어, 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 또는 10 내지 18) 길이이다. 일부 측면에서, 페이로드(예를 들어, 안티미르)는 AAAGGGA(서열번호: 22)(시드에 대한 상보체)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 시드 서열의 상보체의 5' 말단에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 핵산 및/또는 시드 서열의 상보체의 3' 말단에 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20의 핵산을 포함한다.
i. 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드가 화학적으로 변형된 경우, 폴리뉴클레오티드는 "변형된 폴리뉴클레오티드"로 지칭될 수 있다.
"뉴클레오시드"는 당 분자(예를 들어, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 유기 염기(예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체와 조합하여 함유하는 화합물(본원에서 "핵염기"로도 언급된다)을 지칭한다.
"뉴클레오티드"는 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 또는 비천연 뉴클레오시드를 포함하도록, 예를 들어 화학적으로, 효소적으로 또는 재조합적으로와 같은 임의의 유용한 방법에 의해 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 연결된 뉴클레오시드의 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 다양한 골격 연결을 가질 수 있다. 연결은 표준 포스포디에스테르 연결일 수 있으며, 이 경우 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 영역들을 포함할 것이다.
본원에 개시된 변형된 폴리뉴클레오티드는 다양한 별개의 변형을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 1, 2 또는 그 이상(임의로 상이한) 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 변형을 함유한다. 일부 측면에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들어, 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드와 비교하여 개선된 열적 또는 화학적 안정성, 감소된 면역원성, 감소된 분해, 표적 microRNA에 대한 증가된 결합, 다른 microRNA 또는 다른 분자에 대한 감소된 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "화학적 변형" 또는 적절한 경우 "화학적 변형된"은 아데노신(A), 구아노신(G), 우리딘(U), 티미딘(T) 또는 시티딘(C) 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드와 관련하여 핵염기, 당, 골격, 또는 이들의 임의의 조합에서 이들의 위치, 패턴, 퍼센트 또는 집단 중 하나 이상에서 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르)는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 균일한 화학적 변형, 또는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 동일한 개시 변형의 하향 적정에 의해 생성된 변형 집단, 또는 모든 동일한 뉴클레오시드 유형의 무작위 혼입을 갖는 화학적 변형의 측정된 퍼센트를 가질 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르)는 전체 폴리뉴클레오티드에 걸쳐 동일한 뉴클레오시드 유형의 2, 3 또는 4의 균일한 화학적 변형을 가질 수 있다(예를 들어, 모든 우리딘 및/또는 모든 시티딘 등이 동일한 방식으로 변형된다).
변형된 뉴클레오티드 염기쌍은 표준 아데닌-티민, 아데닌-우라실 또는 구아닌-시토신 염기쌍뿐만 아니라 뉴클레오티드 및/또는 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 변형된 뉴클레오티드 사이에 형성된 염기쌍을 포함하며, 여기서 수소 결합 공여체와 수소 결합 수용체의 배열은 비-표준 염기 및 표준 염기 사이 또는 두 개의 상보적인 비-표준 염기 구조 사이에 수소 결합을 허용한다. 이러한 비-표준 염기쌍의 한 예는 변형된 핵염기 이노신 및 아데닌, 시토신 또는 우라실 사이의 염기쌍이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합이 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다.
당업자는 달리 언급되지 않는 한, 본 출원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열이 대표적인 DNA 서열에서 "T"를 언급할 것이지만, 서열이 RNA를 나타내는 경우, "T"가 "U"로 대체된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 TD는 RNA로서, DNA로서, 또는 RNA 및 DNA 단위 둘 다를 포함하는 하이브리드 분자로서 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)는 적어도 2(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20 또는 초과)의 변형된 핵염기 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어 miR485 안티미르)에서 핵염기, 당, 골격 연결, 또는 이들의 임의의 조합은 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 변형된다.
1. 염기 변형
특정 측면에서, 화학적 변형은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)의 핵염기에 있다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘(예를 들어, 슈도우리딘(ψ), 2-티오우리딘(s2U), 1-메틸-슈도우리딘(m1ψ), 1-에틸-슈도우리딘(e1ψ), 또는 5-메톡시-우리딘(mo5U)), 변형된 시토신(예를 들어, 5-메틸-시티딘(m5C)), 변형된 아데노신(예를 들어, 1-메틸-아데노신(m1A), N6-메틸-아데노신(m6A), 또는 2 -메틸-아데닌(m2A)), 변형된 구아노신(예를 들어, 7-메틸-구아노신(m7G) 또는 1-메틸-구아노신(m1G)), 또는 이들의 조합이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)는 특정 변형을 위해 균일하게 변형(예를 들어, 완전히 변형, 전체 서열에 걸쳐 변형)된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 동일한 유형의 염기 변형, 예를 들어 5-메틸-시티딘(m5C)으로 균일하게 변형될 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드 서열의 모든 시토신 잔기가 5-메틸-시티딘(m5C)으로 대체됨을 의미한다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 것들 중 임의의 것과 같은 변형된 뉴클레오시드로 대체함으로써 서열에 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대해 균일하게 변형될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)는 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4 또는 초과)의 변형된 핵염기의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에서 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 핵염기 유형이 변형된 핵염기이다.
2. 골격 변형
일부 측면에서, 페이로드는 "본 개시내용의 폴리뉴클레오티드"(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르 포함)를 포함할 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오시드 사이의 연결에 대한 임의의 유용한 변형을 포함한다. 본 개시내용의 조성물에 유용한 골격 변형을 포함하는 이러한 연결에는 3'-알킬렌 포스포네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 알켄 함유 골격, 아미노알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 보라노포스페이트, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, 키랄 포스포네이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌(메틸이미노), 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격, 모르폴리노 연결, -N(CH3)-CH2-CH2-, 헤테로원자 인터뉴클레오시드 연결이 있는 올리고뉴클레오시드, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 연결, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, PNA, 실록산 골격, 설파메이트 골격, 설파이드 설폭사이드 및 설폰 골격, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 티오노포스포르아미데이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
Figure 112022021061682-pct00041
일부 측면에서, 상기 개시된 골격 연결의 존재는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)의 안정성(예를 들어, 열적 안정성) 및/또는 분해(예를 들어, 효소 분해)에 대한 저항성을 증가시킨다. 일부 측면에서, 안정성 및/또는 분해에 대한 저항성은 변형이 없는 상응하는 폴리뉴클레오티드(참조 또는 대조 폴리뉴클레오티드)와 비교하여 변형된 폴리뉴클레오티드에서 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 증가한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 골격 연결이 변형된다(예를 들어, 모두는 포스포로티오에이트이다).
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21의 골격 연결이 변형된다(예를 들어, 포스포로티오에이트).
일부 측면에서, 골격은 포스포디에스테르 연결, 포스포트리에스테르 연결, 메틸포스포네이트 연결, 포스포르아미데이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 연결을 포함한다.
3. 당 변형
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 핵산의 당에서 변형될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 페이로드는 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 당 변형을 갖는 뉴클레오시드)를 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 측면에서, 당 변형은 표적 miRNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시킨다. LNA 또는 2'-치환된 당과 같은 폴리뉴클레오티드에서 친화도-향상 뉴클레오티드 유사체를 혼입하면 폴리뉴클레오티드의 길이를 줄일 수 있으며, 또한 비-특이적 또는 비정상적인 결합이 일어나기 전에 폴리뉴클레오티드 크기의 상한을 줄일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에서 뉴클레오티드의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%는 당 변형(예를 들어, LNA)을 함유한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22의 뉴클레오티드 단위는 당 변형(예를 들어, LNA)된다.
일반적으로, RNA는 산소를 갖는 5-원 고리인 당 기 리보스를 포함한다. 예시적이며 비제한적인 변형된 뉴클레오티드는 리보스에서 산소의 대체(예를 들어, S, Se, 또는 메틸렌 또는 에틸렌과 같은 알킬렌으로); 이중 결합의 첨가(예를 들어, 리보스를 사이클로펜테닐 또는 사이클로헥세닐로 대체); 리보스의 고리 수축(예를 들어, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성); 리보스의 고리 확장(예를 들어, 추가 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6- 또는 7-원 고리를 형성하기 위해, 예를 들어 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 또한 포스포르아미데이트 골격을 갖는 모르폴리노); 다중고리 형태(예를 들어, 트리사이클로; 및 "잠금 해제된" 형태, 예를 들어 글리콜 핵산(GNA)(예를 들어, R-GNA 또는 S-GNA, 여기서 리보스는 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위로 대체된다), 트레오스 핵산(TNA, 여기서 리보스가 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')으로 대체된다)), 및 펩티드 핵산(PNA, 여기서 2-아미노-에틸-글리신 결합이 리보스 및 포스포디에스테르 골격을 대체한다)을 포함한다. 당 기는 리보스에서 상응하는 탄소와 반대 입체화학적 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어 아라비노스를 당으로서 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
리보스의 2'하이드록실 기(OH)는 다수의 상이한 치환기로 변형되거나 대체될 수 있다. 2'-위치에서의 예시적인 치환은 H, 할로, 임의로 치환된 C1-6알킬; 임의로 치환된 C1-6알콕시; 임의로 치환된 C6-10아릴옥시; 임의로 치환된 C3-8사이클로알킬; 임의로 치환된 C3-8사이클로알콕시; 임의로 치환된 C6-10아릴옥시; 임의로 치환된 C6-10 아릴-C1-6알콕시, 임의로 치환된 C1-12(헤테로사이클릴)옥시; 당(예를 들어, 리보스, 펜토스, 또는 본원에 기재된 임의의 것); 폴리에틸렌글리콜(PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, 여기서 R은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20의 정수(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20); 브릿지의 예로 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 아미노 브릿지, 아미노알킬, 아미노알콕시, 아미노 및 아미노산을 포함하고, 2'-하이드록실이 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4'-탄소에 연결된 "잠금" 핵산(LNA)을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)에 존재하는 뉴클레오시드 유사체는, 예를 들어, 2'-O-알킬-RNA 단위, 2'-OMe-RNA 단위, 2'-O-알킬-SNA, 2'-아미노-DNA 단위, 2'-플루오로-DNA 단위, LNA 단위, 아라비노 핵산(ANA) 단위, 2'-플루오로-ANA 단위, HNA 단위, INA(삽입 핵산) 단위, 2'MOE 단위, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, LNA는, 예를 들어 옥시-LNA(예를 들어, 베타-D-옥시-LNA 또는 알파-L-옥시-LNA), 아미노-LNA(예를 들어, 베타-D-아미노-LNA 또는 알파-L-아미노-LNA), 티오-LNA(예를 들어, 베타-D-티오0-LNA 또는 알파-L-티오-LNA), ENA(예를 들어, 베타-D-ENA 또는 알파-L-ENA), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오시드 유사체는 잠금 핵산(LNA); 2'-O-알킬-RNA; 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산(ANA); 2'-플루오로-ANA, 헥시톨 핵산(HNA), 삽입 핵산(INA), 구속된 에틸 뉴클레오시드(cEt), 2'-O-메틸 핵산(2'-OMe), 2'-O-메톡시에틸 핵산(2'-MOE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티미르, 예를 들어, miR485 안티미르)는 변형된 RNA 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, LNA) 및 DNA 단위 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 갭머(gapmer)이다(U.S. Pat. 8,404,649; 8,580,756; 8,163,708; 9,034,837; 이들 모두는 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다). 일부 측면에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 마이크로미르(micromir)이다(U.S. Pat. 출원공개 US20180201928에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다).
IV. 미셀
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 양이온성 담체 단위를 포함하는 미셀을 제공한다. 본 개시내용의 미셀은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및 음으로 하전된 페이로드를 포함하고, 여기서 음으로 하전된 페이로드 및 양이온성 담체 단위는 서로 회합된다. 일부 측면에서, 회합은 공유 결합을 포함한다(도 1 참조). 다른 측면에서, 회합은 공유 결합을 포함하지 않는다(도 1 참조). 다른 측면에서, 회합은 이온 결합을 통해, 즉 정전기 상호작용을 통해 이루어진다. 일부 측면에서, 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)는 공유 결합에 의해 양이온성 담체 단위에 접합되지 않고/않거나 음으로 하전된 페이로드는 이온 상호 작용을 통해서만 양이온성 담체 단위의 양이온성 담체 모이어티와 상호작용한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및 미셀은 (예를 들어, DNase 및/또는 RNase에 의한) 분해로부터 페이로드(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)를 보호한다. 첫째, 양이온 담체 단위는 정전기적 상호작용을 통해 페이로드를 보호할 수 있다. 둘째, 미셀은 미셀의 코어로, 즉, DNase 및/또는 RNase의 손길이 닿지 않는 곳으로 페이로드를 격리한다. 일부 측면에서, 순환 효소(예를 들어, 뉴클레아제)로부터 페이로드의 보호는 유리 페이로드와 비교하여 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)의 반감기를 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 페이로드의 혈장 반감기를 유리 페이로드와 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 적어도 약 22배, 적어도 약 23배, 적어도 약 24배, 적어도 약 25배, 적어도 약 26배, 적어도 약 27배, 적어도 약 28배, 적어도 약 29배, 또는 적어도 약 30배 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 양전하, 특히 양이온성 담체 모이어티의 전하는 용액에서 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 핵산)와 혼합될 때 미셀을 형성하기에 충분하며, 여기서 양이온성 담체 단위, 특히 이의 양이온성 담체 모이어티와 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 핵산) 사이의 전체 이온비는 약 1:1이다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위, 특히 이의 양이온성 담체 모이어티와 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 핵산) 사이의 전체 이온비는 1:1 초과, 즉 과량의 양이온성 담체 단위가 사용된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위, 특히 이의 양이온성 담체 모이어티와 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 핵산) 사이의 전체 이온비는 1:1 미만이며, 즉 과량의 음으로 하전된 페이로드가 사용된다.
일부 측면에서, 적합한 완충제(예를 들어, PBS)와 조합 시, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위와 페이로드(예를 들어, 안티미르와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드) 사이에 형성된 복합체는 자가-조직화되어 미셀을 생성한다. 도 5 참조.
미셀은 수용성 또는 콜로이드 구조 또는 하나 이상의 양친매성 분자로 구성된 집합체이다. 양친매성 분자는 적어도 하나의 친수성(극성) 모이어티 및 적어도 하나의 소수성(비극성) 모이어티를 포함하는 분자이다. "고전적 미셀"은 친수성 층 또는 "쉘"로 둘러싸인 단일 중심 및 주로 소수성 영역 또는 "코어"를 가지고 있다. 수용액에서 미셀은 주변 용매와 접촉하는 양친매성 분자의 친수성 "머리" 영역과 집합체를 형성하여 미셀 코어에서 양친매성 분자의 소수성 단일-꼬리 영역을 격리한다. 미셀은 모양이 거의 구형이다. 타원체, 실린더, 막대형 구조 또는 폴리머솜과 같은 다른 모양도 가능하다. 개시된 미셀의 모양 및 크기, 따라서 로딩 용량은 수용성 생중합체(예를 들어, PEG)와 양이온성 담체(예를 들어, 폴리 라이신) 사이의 비율을 변경하여 변형될 수 있다. 비율에 따라, 담체 단위는 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀으로 구성될 수 있다(도 6 참조). 따라서, "본 개시내용의 미셀"이라는 용어는 고전적 미셀 뿐만 아니라 작은 입자, 작은 미셀, 미셀, 막대형 구조 또는 폴리머좀을 포함한다.
본 개시내용의 미셀은 소수성 및 친수성 모이어티를 함유하는 단일 단분자 중합체 또는 극성(즉, 수용액) 용액에서 임계 미셀 농도(CMC) 이상에서 형성된 많은 양친매성(즉, 계면활성) 분자를 함유하는 집합체 혼합물로 구성될 수 있다. 미셀은 하나 이상의 양친매성 분자로부터 자가-조립되며, 여기서 모이어티는 주로 소수성 내부 코어 및 주로 친수성 외부를 제공하도록 배향된다.
본 개시내용의 미셀은 크기가 5 내지 약 2000 나노미터 범위일 수 있다. 일부 측면에서, 미셀의 직경은 약 10nm 내지 약 200nm이다. 일부 측면에서, 미셀의 직경은 약 1nm 내지 약 100nm, 약 10nm 내지 약 100nm, 약 10nm 내지 약 90nm, 약 10nm 내지 약 80nm, 약 10nm 내지 약 70nm, 약 20nm 내지 약 100nm, 약 20nm 내지 약 90nm, 약 20nm 내지 약 80nm, 약 20nm 내지 약 70nm, 약 30nm 내지 약 100nm, 약 30nm 내지 약 90nm, 약 30nm 내지 약 80nm, 약 30nm 내지 약 70nm, 약 40nm 내지 약 100nm, 약 40nm 내지 약 90nm, 약 40nm 내지 약 80nm, 또는 약 40nm 내지 약 70nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 30nm 내지 약 60nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 90nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 80nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 70nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 60nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 15nm 내지 약 50nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20nm 내지 약 60nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20nm 내지 약 50nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 20 nm 내지 약 40nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 25nm 내지 약 35nm이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 직경은 약 32nm이다. 미셀 크기의 예시적인 분포가 도 9에 도시되어 있다.
일부 측면에서, 미셀은 단일 유형의 안티미르, 예를 들어 miR485 안티미르를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미셀은 하나 이상의 유형의 안티미르, 예를 들어 (i) 동일한 miRNA를 표적으로 하는 상이한 구조를 갖는 안티미르; (ii) 상이한 miRNA를 표적으로 하는 상이한 구조를 갖는 안티미르; (iii) 동일한 miRNA를 표적으로 하는 동일한 구조를 갖는 안티미르; 또는, (iv) 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 단일 유형의 양이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 하나 초과 유형의 양이온성 담체 단위(예를 들어, 표적 세포의 표면 상의 상이한 수용체를 표적화)를 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 상이한 표적화 모이어티, 상이한 양이온성 담체 모이어티(예를 들어, 상이한 페이로드를 수용하기 위해), 및/또는 상이한 보조제 단위를 갖는 양이온성 담체 단위를 포함할 수 있다.
페이로드를 갖는 미셀을 형성하기 위해, 상이한 유형의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위가 함께 조합될 수 있다. 예를 들어, 혈액 뇌 장벽을 표적화하기 위해, 본 개시내용의 미셀은 표적화 모이어티에 연결된 양이온성(또는 음이온성) 담체 단위 및 표적화 모이어티에 연결되지 않은 양이온성(또는 음이온성) 담체 단위를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 미셀은 약 50 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 50 내지 약 150, 약 50 내지 약 140, 약 50 내지 약 130, 약 50 내지 약 120, 약 50 내지 약 110, 또는 약 50 내지 약 100개의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 약 60 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 60 내지 약 150, 약 60 내지 약 140, 약 60 내지 약 130, 약 60 내지 약 120, 약 60 내지 약 110, 약 60 내지 약 100, 약 60 내지 약 90, 약 60 내지 약 80, 또는 약 60 내지 약 70의 양이온 또는 음이온 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 약 70 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 70 내지 약 150, 약 70 내지 약 140, 약 70 내지 약 130, 약 70 내지 약 120, 약 70 내지 약 110, 약 70 내지 약 100, 약 70 내지 약 90, 또는 약 70 내지 약 80의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 약 80 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 80 내지 약 150, 약 80 내지 약 140, 약 80 내지 약 130, 약 80 내지 약 120, 약 80 내지 약 110, 약 80 내지 약 100, 또는 약 80 내지 약 90의 양이온 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 약 90 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 90 내지 약 150, 약 90 내지 약 140, 약 90 내지 약 130, 약 90 내지 약 120, 약 90 내지 약 110, 또는 약 90 내지 약 100의 양이온 또는 음이온 담체 단위를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 약 100 내지 약 200의 양이온성 또는 음이온성 담체 단위를 포함한다. 다른 측면에서, 미셀은 약 100 내지 약 150, 약 100 내지 약 140, 약 100 내지 약 130, 약 100 내지 약 120, 약 100 내지 약 110, 또는 약 100 내지 약 100 양이온 또는 음이온 담체 단위를 포함한다.
본 개시내용은 또한 (i) 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24의 뉴클레오티드 길이인 올리고뉴클레오티드) 및 (ii) 본원에 기재된 양이온성 담체 단위를 포함하는 미셀을 또한 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 (i) 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 miRNA, 또는 miRNA 억제제(예를 들어, 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드), 및 (ii) 약 80 내지 약 120(예를 들어, 약 85 내지 약 115, 약 90 내지 약 110, 약 95 내지 약 105)의 본원에 기재된 양이온성 담체 단위, 예를 들어 TM-WP-CC-AM, WP-CC-AM, 또는 이들의 조합(도 3 참조)을 포함하는 미셀에 관한 것이다. 일부 측면에서, 미셀은 (i) 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, miRNA, 또는 miRNA 억제제(예를 들어 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드), 및 (ii) 약 80 내지 약 120(예를 들어 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 105, 또는 약 110)의 본원에 기재된 양이온성 담체 단위, 예를 들어 임의의 TM-WP-CC-AM(도 3 참조)를 포함한다. 일부 측면에서, 미셀은 (i) 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, miRNA, 또는 miRNA 억제제(예를 들어 약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드), 및 (ii) 약 90 내지 약 110, 예를 들어, 약 100의 양이온성 담체 단위를 포함하며, 여기서 (a) 약 45 내지 약 55, 예를 들어 약 50의 양이온성 담체 단위는 TM-WP-CC-AM을 포함하고 및 (b) 양이온성 담체 단위의 약 45 내지 약 55, 예를 들어, 약 50은 WP-CC-CM을 포함하고, 여기서 TM은 페닐 알라닌이고, WP는 (PEG)5000이고, CC는 약 40 내지 약 50 라이신, 예를 들어, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 또는 약 50의 라이신이고, 여기서 각각 약 5 내지 약 15의 라이신, 약 10의 라이신이 비타민 B3(니코틴아미드)에 융합된다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 (i) 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 miR485-3p 억제제, 예를 들어 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3'(서열번호: 18), 및 (ii) 약 100의 양이온성 담체 단위를 포함하고, 여기서 (a) 약 50의 양이온성 담체 단위가 TM-WP-CC-AM을 포함하고, (b) 약 50의 양이온성 담체 단위가 WP-CC-CM을 포함하고, 여기서 TM은 페닐 알라닌이고, WP는 (PEG)5000이고, CC는 약 47의 라이신이며, 여기서 각각 약 10의 라이신은 비타민 B3(니코틴아미드)에 융합된다.
일부 측면에서, 미셀은 단일 페이로드(예를 들어, 단일 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티미르)를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미셀은 하나 초과의 페이로드(예를 들어, 다중 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 다중 안티미르)를 포함할 수 있다.
V. 제조 방법
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및 미셀의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 개시내용은, 예를 들어 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 양이온성 담체 단위를 합성하는 것을 포함하는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 제조 방법을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "합성하는"은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 양이온성 담체 단위를 조립하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 성분(예를 들어, 항체 표적화 모이어티)은 재조합으로 제조될 수 있고, 이어서 양이온성 담체 단위의 다른 성분에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위의 성분 각각은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 재조합 단백질 생산, 고체상 펩티드 또는 핵산 합성, 화학적 합성, 효소적 합성, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 제조될 수 있고, 생성된 성분은 당업계에 공지된 화학적 및/또는 효소적 방법을 사용하여 접합될 수 있다.
본 개시내용의 양이온성 담체 단위는 오염물을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위는 양이온성 담체 단위의 균일한 집단을 포함한다. 그러나, 다른 측면에서, 양이온성 담체 단위는 다수의 종을 포함할 수 있다(예를 들어, 이들 중 일부는 표적화 모이어티를 포함하고 일부는 나머지 모이어티를 포함하지만 표적화 모이어티는 없다). 일부 측면에서, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 제조는 동결건조 또는 재구성에 적합한 임의의 다른 형태의 건조 저장을 포함한다. 일부 측면에서, 건조 형태의 양이온성 담체 단위의 제조는 양이온성 담체 단위와 페이로드(예를 들어, 핵산)의 조합 후에 일어난다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀을 제조하는 방법은 1:1의 이온비에서 양이온성 담체 단위를 음으로 하전된 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산, 예를 들어 안티미르)와 혼합하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 양이온성 담체 단위 및 음으로 하전된 페이로드는 용액에서 조합된다. 일부 측면에서, 용액 중 양이온성 담체 및 음으로 하전된 페이로드의 조합 후, 생성된 용액은 동결건조되거나 건조된다. 일부 측면에서, 양이온성 담체와 음으로 하전된 페이로드의 조합은 건조 형태로 수행된다.
도 6에 도시된 바와 같이, 양이온성 담체 모이어티(B, 예를 들어, 폴리 라이신)에서 단량체 단위(예를 들어, 라이신)의 수 m에 대한 수용성 중합체(A, 예를 들어, PEG)에서 단량체 단위의 수 n의 비율은 생성되는 미셀의 크기와 모양에 영향을 주며, 여기서 각 경우에 단위 n 또는 m의 수는 최대 1,000단위가 될 수 있다. 0.5의 mB/(nA+mB) 비율에서 수득된 미셀은 클래식 미셀이다. mB/(nA+mB)가 0.5를 초과하면, 수득된 미셀은 막대형 미셀 또는 폴리머좀이다. mB/(nA+mB)가 0.5 미만이면 수득된 미셀은 작은 미셀 또는 작은 입자이다.
본 개시내용의 미셀은 당업계에 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 볼텍싱, 압출 또는 초음파 처리를 사용하여 생성될 수 있다. 미셀의 형성은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위를 포함하는 용액의 임계 미셀 농도(CMC) 초과의 적용 조건에 의존한다. 특정 농도 값에 도달한 후, 계면활성제는 회합하기 시작하고 미셀과 같은 더 복잡한 단위로 조직화된다. 본 개시내용의 양이온성 담체를 포함하는 용액의 CMC는 CMC 주위에 뚜렷한 전이를 나타내는 임의의 물리적 특성(예를 들어, 표면 장력)에 의해 결정될 수 있다.
잘 알려진 스미스-이와트(Smith-Ewart) 이론은 CMC 초과에서 미셀 형성을 유도하는 핵형성된 입자의 수가 0.6의 거듭제곱에 대한 계면활성제(본 개시내용에서, 양이온성 담체 단위는 음이온성 페이로드와 복합체화되거나 회합된다)의 농도에 비례한다고 예측한다. 이것은 주어진 계면활성제에 대해 형성되는 미셀의 수가 일반적으로 계면활성제 농도의 증가에 따라 증가하기 때문이다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은, 예를 들어 오염물을 제거하고/하거나 미셀의 균일한 집단(예를 들어, 동일한 크기를 갖는 미셀, 또는 동일한 페이로드 또는 동일한 표적화 모이어티를 갖는 미셀)을 생성하기 위해 정제될 수 있다.
VI. 약제학적 조성물
본 개시내용은 또한 대상체에 투여하기에 적합한 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및/또는 미셀(즉, 본 개시내용의 양이온성 담체 단위를 포함하는 미셀)을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 미셀은 균질할 수 있다(즉, 모든 미셀은 동일한 표적화 모이어티 및 동일한 페이로드를 갖는 동일한 유형의 양이온성 담체 단위를 포함한다). 그러나, 다른 측면에서, 미셀은 다중 표적화 모이어티, 다중 페이로드 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 일반적으로 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및/또는 미셀 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 대상체에 투여하기에 적합한 형태로 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다.
본 개시내용의 미셀을 포함하는 약제학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990)). 약제학적 조성물은 일반적으로 무균으로 제형화되고 미국 식품 의약국(FDA)의 모든 좋은 제조 관행(Good Manufacturing Practice, GMP) 규정을 완전히 준수한다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 미셀을 포함한다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 미셀은 약제학적으로 허용되는 담체에서 하나 이상의 추가 치료제와 공동-투여된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제(들)의 투여 전에 투여된다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제(들)의 투여 후에 투여된다. 추가 측면에서, 본원에 기재된 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 추가 치료제(들)와 동시에 투여된다.
일부 양태에서, 약제학적 담체는 미셀 형성 후에 첨가된다. 다른 측면에서, 약제학적 담체는 미셀 형성 전에 첨가된다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자(예: 동물 또는 인간)에게 무독성이며 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, m-크레졸); 저분자량(약 10 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 화합물의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 화합물이 본원에 개시된 양이온성 담체 단위 또는 미셀과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
보충 치료제가 또한 본 개시내용의 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 본원에 기재된 미셀은 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내, 종양내, 근육내 경로 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물 미셀은 정맥내, 예를 들어, 주사로 투여된다. 본원에 기재된 미셀은 본원에 기재된 미셀이 의도하는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 조합하여 임의로 투여될 수 있다.
용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 물, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알코올, 메틸파라벤 등의 항균성 화합물; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트 화합물; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절용 화합물. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다중 용량 바이알에 포장될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체에는 생리적 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 상기 조성물은 일반적으로 멸균되고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동적이다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균 및 항진균 화합물에 의해 달성될 수 있다. 원하는 경우, 등장성 화합물, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가알코올 및 염화나트륨이 조성물에 첨가될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 야기될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 통상적이고 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수용액은 사용을 위해 포장되거나 무균 조건 하에 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조 제제는 투여 전에 멸균 수용액과 조합된다.
멸균 주사 용액은 원하는 대로 본원에 기재된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 유효량 및 적절한 용매에 본원에 기재된 미셀을 혼입함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 임의의 원하는 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 본원에 기재된 미셀을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 본원에 기재된 미셀은 본원에 기재된 미셀의 지속적 또는 박동성 방출을 허용하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제의 형태로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 미셀을 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한 경점막 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 투여의 경우, 투과되는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여를 위한 세제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는, 예를 들어 비강 스프레이의 사용을 통해 달성될 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로부터 이익을 얻을 대상체에 정맥내 투여된다. 특정 측면에서, 조성물은 림프계에, 예를 들어, 림프내 주사 또는 결절내 주사에 의해(Senti et al., PNAS 105(46): 17908(2008) 참조), 또는 근육내 주사에 의해, 피하로 투여, 종양내 주사, 흉선 또는 간에 직접 주사에 의해 투여된다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로 투여된다. 특정 측면에서, 약제학적 조성물은 투여 후 데포를 형성할 수 있는 제형으로서 투여된다. 특정 바람직한 측면에서, 데포는 본원에 기술된 미셀을 순환으로 서서히 방출하거나 데포 형태로 남아 있다.
전형적으로, 약제학적으로 허용되는 조성물은 오염물이 없도록 고도로 정제되고, 생체적합성이고 독성이 없으며, 대상체에 투여하기에 적합하다. 물이 담체의 구성 요소인 경우, 물은 고도로 정제되고 오염 물질, 예를 들어, 내독소가 없도록 처리된다.
약제학적으로 허용되는 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 미네랄 오일을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미료, 향미 증강제, 유화제, 현탁제 및/또는 방부제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 본원에 기재된 미셀 및 임의로 약제학적 활성제 또는 치료제를 포함한다. 치료제는 생물학적 제제, 소분자 제제, 또는 핵산 제제일 수 있다.
본원에 기재된 미셀을 포함하는 투여 형태가 제공된다. 일부 측면에서, 투여 형태는 정맥내 주사용 액체 현탁액으로 제형화된다.
본원에 개시된 미셀 또는 미셀을 포함하는 약제학적 조성물은 다른 약물과 동시에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용의 미셀 또는 약제학적 조성물은 호르몬 치료제, 화학요법제, 면역치료제, 세포 성장 인자 또는 세포 성장 인자 수용체의 작용을 억제하는 약제와 같은 약제와 함께 사용될 수 있다.
VII. 치료 및 사용 방법
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 미셀 또는 이들의 조합을 대상체, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 개시내용의 미셀 또는 본 개시내용의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 장애 또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입를 통해 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 본원에 개시된 질환 및 병태의 치료에 적합한 다른 약제 또는 치료와 동시에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 페이로드, 예를 들어 핵산(예를 들어, 안티미르)과 같은 음이온성 페이로드를 본 개시내용의 미셀 내로 혼입하는 것을 포함하여, 전달을 위한 페이로드를 캡슐화하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 페이로드, 예를 들어 핵산(예를 들어, 안티미르)과 같은 음이온성 페이로드를 본 개시내용의 미셀 내로 혼입하는 것을 포함하여, 분해(예를 들어, 뉴클레아제-매개 분해)에 대한 페이로드의 저항성을 증가시키는 방법을 또한 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 미셀, 예를 들어, 트립토판 및/또는 티로신을 표적화 모이어티로서 포함하는 미셀을 투여하는 것을 포함하여 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통과하는 방법을 제공한다. 도 7에 예시된 바와 같이, 항-miRNA가 로드된 본 개시내용의 미셀은 상기 개시된 바와 같이 BBB 수용체, 예를 들어 LAT1에 표적화될 수 있다. 미셀이 수용체 매개 통과세포외배출을 통해 BBB를 가로질러 전위되고 뇌 세포(예를 들어, 뉴런, 성상교세포 또는 미세아교세포)에 의한 세포 흡수를 거치면, 페이로드(예를 들어, 안티미르)가 방출되어 세포내 표적과 상호작용할 수 있다(예를 들어, 안티미르는 표적 microRNA에 결합하여 RNAse H 매개 분해를 유발할 수 있다).
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드(즉, 미셀에서가 아니라, 예를 들어 용액에서 유리)와 비교하여 페이로드의 분해 저항성을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 페이로드의 분해 저항성을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 적어도 약 22배, 적어도 약 23배, 적어도 약 24배, 적어도 약 25배, 적어도 약 26배, 적어도 약 27배, 적어도 약 28배, 적어도 약 29배, 또는 적어도 약 30배 증가시킬 수 있다.
본 개시내용은 또한 페이로드, 예를 들어 핵산(예를 들어, 안티미르)과 같은 음이온성 페이로드를 본 개시내용의 미셀 내로 혼입하는 것을 포함하여, 투여 동안 (예를 들어, 대상체의 혈류에 있는 동안) 페이로드의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 페이로드의 안정성(예를 들어, 뉴클레아제에 대한 저항성 증가)을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 페이로드의 안정성(예를 들어, 뉴클레아제에 대한 저항성 증가)을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 적어도 약 22배, 적어도 약 23배, 적어도 약 24배, 적어도 약 25배, 적어도 약 26배, 적어도 약 27배, 적어도 약 28배, 적어도 약 29배, 또는 적어도 약 30배 증가시킬 수 있다.
본 개시내용은 또한 페이로드, 예를 들어 핵산(예를 들어, 안티미르)과 같은 음이온성 페이로드를 본 개시내용의 미셀 내로 혼입하는 것을 포함하여, 페이로드의 혈장 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 페이로드의 혈장 반감기를 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700%, 적어도 약 800%, 적어도 약 900%, 적어도 약 1000%, 적어도 약 1100%, 적어도 약 1200%, 적어도 약 1300%, 적어도 약 1400%, 적어도 약 1500%, 적어도 약 1600%, 적어도 약 1700%, 적어도 약 1800%, 적어도 약 1900%, 또는 적어도 약 2000% 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 페이로드의 혈장 반감기를 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 적어도 약 22배, 적어도 약 23배, 적어도 약 24배, 적어도 약 25배, 적어도 약 26배, 적어도 약 27배, 적어도 약 28배, 적어도 약 29배, 또는 적어도 약 30배 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 캡슐화된 페이로드는 본원에 개시된 안티미르, 예를 들어 서열번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체(예를 들어, 서열번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 약 70% 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드)이고, 여기서 본 개시내용의 미셀 내 안티미르의 캡슐화는 유리 안티미르의 혈장 반감기에 비교하여 안티미르의 혈장 반감기를 적어도 약 10배, 적어도 약 12배, 적어도 약 14배, 적어도 약 16배, 적어도 약 18배, 또는 적어도 약 20배 증가시킨다. 한 특정 측면에서, 캡슐화된 페이로드는 본원에 개시된 안티미르, 예를 들어 서열 번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 변이체 또는 유도체(예를 들어, 서열번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 적어도 약 70% 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드)이고, 여기서 본 개시내용의 미셀 내 안티미르의 캡슐화는 유리 안티미르의 혈장 반감기에 비교하여 안티미르의 혈장 반감기를 적어도 약 20배 증가시킨다, 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 캡슐화된 안티미르의 혈장 반감기는 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분, 적어도 약 60분, 적어도 약 70분, 적어도 약 80분, 적어도 약 90분, 적어도 약 100분, 또는 적어도 약 120분이다. 한 특정 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 캡슐화된 안티미르(예를 들어, 서열번호: 18의 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈장 반감기는 적어도 약 90분이다.
본 개시내용은 페이로드, 예를 들어 핵산(예를 들어, 안티미르)과 같은 음이온성 페이로드를 본 개시내용의 미셀 내로 혼입하는 것을 포함하여, 생리학적 장벽, 예를 들어, BBB 또는 원형질막을 통한 페이로드의 투과, 전달, 전이 또는 수송을 증가시키는 방법을 또한 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 생리학적 장벽, 예를 들어, BBB 또는 원형질막을 통한 페이로드의 투과, 전달, 전이 또는 수송을 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀 내 페이로드의 캡슐화는 유리 페이로드와 비교하여 생리학적 장벽, 예를 들어, BBB 또는 원형질막을 통한 페이로드의 투과, 전달, 전이 또는 수송을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 16배, 적어도 약 17배, 적어도 약 18배, 적어도 약 19배, 적어도 약 20배, 적어도 약 21배, 적어도 약 22배, 적어도 약 23배, 적어도 약 24배, 적어도 약 25배, 적어도 약 26배, 적어도 약 27배, 적어도 약 28배, 적어도 약 29배, 또는 적어도 약 30배 증가시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 줄기 세포를 표적화하기 위해, 예를 들어 치료 분자(예를 들어, 치료 폴리뉴클레오티드) 또는 유전자 요법 성분을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미셀은 특정 유형의 암, 예를 들어 신경교종, 유방암, 췌장암, 간암, 피부암 또는 자궁경부암에 대해 특이적인 마커를 표적화하고 페이로드로서 치료 분자(예를 들어, 치료용 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 소분자)를 운반할 수 있다.
특정 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 췌장암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀을 췌장 조직으로 지시하는 표적화 모이어티는 사이클릭 RGD 펩티드이다. 다른 측면에서, 본 개시내용의 미셀을 췌장 조직으로 지시하는 표적화 모이어티는 정상 또는 암성 췌장 세포의 표면 상에서 우세하게 또는 독점적으로 발현되는 바이오마커이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀의 페이로드는 K-Ras를 표적화하는 올리고뉴클레오티드이고, 췌장 조직으로의 페이로드의 전달은 K-Ras의 발현을 효과적으로 감소시킨다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 알츠하이머병의 증상을 치료하거나 개선하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀은 알츠하이머병 신경 조직, 예를 들어 miRNA-485-3p에서 과발현된 분자를 표적으로 하는 페이로드, 예를 들어 안티미르를 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용의 미셀(예를 들어, BBB를 가로질러 미셀을 효과적으로 수송하기 위한 LAT1 표적화 모이어티 및 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티미르 페이로드를 포함하는 미셀)을 알츠하이머병 환자에게 투여하면 세포자연사, 미토콘드리아 기능 상실 또는 염증과 같은 알츠하이머병의 증상을 예방하거나 개선한다(도 24 참조).
일부 측면에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본 개시내용의 미셀을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에서 염증, 예를 들어 신경염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 미셀은 대상체에서 염증, 예를 들어 신경염증을 효과적으로 감소시킬 수 있는 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 신경염증은 피질 염증이다. 일부 측면에서, 신경염증은 해마 염증이다. 일부 측면에서, 치료제는 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티미르(예를 들어, 서열번호: 18의 안티미르 또는 이의 단편 또는 변이체)이고, 여기서 안티미르는 대상체에서 miRNA-485-3p의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에게 본 개시내용의 미셀을 투여하면 신경염증 수준을 본 개시내용의 미셀로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 집단에서 관찰된 신경염증의 수준과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 개시내용의 미셀을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 알츠하이머병을 앓고 있는 대상체에서 아밀로이드플라크 부담을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 미셀은 대상체에서 아밀로이드 플라크 부담을 효과적으로 감소시킬 수 있는 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 치료제는 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티미르(예를 들어, 서열번호: 18의 안티미르 또는 이의 단편 또는 변이체)이고, 여기서 안티미르는 대상체에서 miRNA-485-3p의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에 대한 본 개시내용의 미셀 투여는 본 개시내용의 미셀로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 집단에서 관찰된 아밀로이드 플라크 부담과 비교하여 대상체에서 아밀로이드 플라크 부담을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 개시내용의 미셀을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에서 신경발생을 회복 및/또는 유도하는 방법을 제공하며, 여기서 미셀은 대상체에서 효과적으로 신경발생을 회복 및/또는 유도할 수 있는 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 치료제는 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티미르(예를 들어, 서열번호: 18의 안티미르 또는 이의 단편 또는 변이체)이고, 여기서 안티미르는 대상체에서 miRNA-485-3p의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에 대한 본 개시내용의 미셀 투여는 본 개시내용의 미셀로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 집단에서 관찰된 신경발생 수준과 비교하여 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 신경발생을 회복 및/또는 유도시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본 개시내용의 미셀을 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에서 인지 기능을 개선하는 방법을 제공하며, 여기서 미셀은 대상체에서 효과적으로 인지 기능을 개선할 수 있는 치료제를 포함한다. 일부 측면에서, 치료제는 miRNA-485-3p를 표적화하는 안티미르(예를 들어, 서열번호: 18의 안티미르 또는 이의 단편 또는 변이체)이고, 여기서 안티미르는 대상체에서 miRNA-485-3p의 수준을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머병)을 앓고 있는 대상체에 대한 본 개시내용의 미셀 투여는 본 개시내용의 미셀로 치료되지 않은 대상체 또는 대상체 집단에서 관찰된 인지 기능과 비교하여 대상체에서 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 인지 기능을 개선시킬 수 있다.
VIII. 키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 미셀, 또는 약제학적 조성물 및 임의로 사용 설명서를 포함하는 키트, 또는 제조 제품을 제공한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 미셀, 또는 약제학적 조성물을 하나 이상의 용기에 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 미셀, 또는 약제학적 조성물 및 브로셔를 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 미셀, 또는 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함한다. 당업자는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 미셀, 또는 약제학적 조성물, 또는 이들의 조합이 당업계에 널리 공지된 확립된 키트 형식 중 하나로 용이하게 혼입될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 용기(예를 들어, 유리 바이알)에 건조 형태로 본 개시내용의 양이온성 담체 단위, 및 임의로 건조된 양이온성 담체 단위를 수화시키기에 적합한 용매, 및 임의로 양이온 담체 단위의 수화 및 미셀 형성에 대한 지침을 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 미셀의 음이온성 페이로드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 갖는 적어도 하나의 추가 용기(예를 들어, 유리 바이알)를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 건조 형태로 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및 동일한 용기 또는 상이한 용기에 또한 건조 형태로 미셀의 음이온성 페이로드를 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 용액 중에 본 개시내용의 양이온성 담체 단위 및 동일한 용기 또는 상이한 용기 내의 용액 중의 미셀의 음이온성 페이로드를 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 용액 중의 본 개시내용의 미셀, 및 사용 설명서를 포함한다. 일부 측면에서, 키트 또는 제조 제품은 건조 형태의 본 개시내용의 미셀, 및 사용 지침서(예를 들어, 재구성 및 투여 지침서)를 포함한다.
***
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다(Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); Crooke, Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007) and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
상기 인용된 모든 참고 문헌 뿐만 아니라 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
하기 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예
실시예 1
(a) 알킨 변형된 티로신의 합성: 알킨 변형된 티로신은 본 개시내용의 미셀을 BBB에서 LAT1 수송체에 지시하기 위한 양이온성 담체 단위의 조직 특이적 표적화 모이어티(TM, 도 3 참조)의 합성을 위한 중간체로서 생성되었다.
아세토니트릴(4.0ml) 중의 N-(tert-부톡시카보닐)-L-티로신 메틸 에스테르(Boc-Tyr-OMe)(0.5g, 1.69mmol) 및 K2CO3(1.5equiv., 2.54mmol)의 혼합물을 프로파길 브로마이드(1.2equiv., 2.03mmol)에 적가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 밤새 가열하였다. 반응 후, 반응 혼합물을 물:에틸 아세테이트(EA)를 사용하여 추출하였다. 그 다음, 유기층을 염수 용액으로 세척하였다. 조 물질을 플래시 컬럼(헥산 10% 중 EA)에 의해 정제하였다. 다음으로, 생성된 생성물을 1,4-디옥산(1.0ml) 및 6.0M HCl(1.0ml)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 100℃에서 밤새 가열하였다. 다음으로, 디옥산을 제거하고 EA로 추출하였다. pH 값이 7이 될 때까지 NaOH 수용액(0.5M)을 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 증발기로 농축하고 0℃에서 12,000rpm으로 원심분리하였다. 침전물을 탈이온수로 세척하고 동결건조시켰다.
(b) 폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신)(PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 수용성 생중합체(WP) 및 양이온성 담체(CC)를 생성하였다(도 3 참조).
폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 거대개시제로서 모노메톡시 PEG(MeO-PEG)로 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 요약하면, MeO-PEG(600mg, 0.12mmol) 및 Lys(TFA)-NCA(2574mg, 9.6mmol)를 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해시켰다. Lys(TFA)-NCA 용액을 마이크로 주사기로 MeO-PEG 용액에 적가하고 반응 혼합물을 37℃에서 4일 동안 교반하였다. 반응 병을 아르곤 및 진공으로 퍼징하였다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 진행되었다. 반응 후, 혼합물을 과량의 디에틸 에테르에 침전시켰다. 침전물을 메탄올에 재용해하고 차가운 디에틸 에테르에 다시 침전시켰다. 그런 다음 여과하고 진공에서 건조시킨 후 백색 분말을 얻었다. PEG-PLL(TFA)에서 TFA 기의 탈보호를 위해 다음 단계를 수행했다.
MeO-PEG-PLL(TFA)(500mg)을 메탄올(60mL)에 용해시키고 1N NaOH(6mL)를 교반하면서 중합체 용액에 적가하였다. 혼합물을 37℃에서 교반하면서 1일 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 10mM HEPES 및 증류수에 대해 4회 투석하였다. 동결 건조 후 PEG-PLL의 백색 분말을 얻었다.
(b) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신)(N 3 -PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 수용성 생중합체(WP) 및 양이온성 담체(CC)를 생성하였다(도 3 참조).
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 아지도-PEG(N3-PEG)로 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 요약하면, N3-PEG(300mg, 0.06mmol) 및 Lys(TFA)-NCA(1287mg, 4.8mmol)를 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해시켰다. Lys(TFA)-NCA 용액을 마이크로 주사기로 N3-PEG 용액에 적가하고 반응 혼합물을 37℃에서 4일 동안 교반하였다. 반응 병을 아르곤 및 진공으로 퍼징하였다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 진행되었다. 반응 후, 혼합물을 과량의 디에틸 에테르에 침전시켰다. 침전물을 메탄올에 재용해하고 차가운 디에틸 에테르에 다시 침전시켰다. 그런 다음 여과하고 진공에서 건조시킨 후 백색 분말을 얻었다. PEG-PLL(TFA)에서 TFA 기의 탈보호를 위해 다음 단계를 수행했다.
N3-PEG-PLL(500mg)을 메탄올(60mL)에 용해시키고 1N NaOH(6mL)를 교반하면서 중합체 용액에 적가하였다. 혼합물을 37℃에서 교반하면서 1일 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 10mM HEPES 및 증류수에 대해 4회 투석하였다. 동결건조 후에 N3-PEG-PLL의 백색 분말을 수득하였다.
(c) (메톡시 또는) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드)(N 3 -PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서, 조직-특이적 보조제 모이어티(AM, 도 3 참조)는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위의 WP-CC 성분에 부착되었다. 양이온성 담체 단위에 사용된 조직 특이적-보조제 모이어티(AM)는 니코틴아미드(비타민 B3)였다. 이 단계는 도 3에 도시된 양이온성 담체 단위의 WP-CC-AM 성분을 생산할 것이다.
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드)(N3-PEG-PLL(Nic/SH))는 EDC/NHS의 존재 하에 N3-PEG-PLL 및 니코틴산의 화학적 변형에 의해 합성되었다. N3-PEG-PLL(372mg, 25.8μmol) 및 니코틴산(556.7 mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.02equiv.)을 탈이온수 및 메탄올(1:1)의 혼합물에 별도로 용해시켰다. EDC·HCl(556.7mg, N3-PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5equiv.)을 니코틴산 용액에 첨가하고 NHS(334.2mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5equiv.)를 혼합물에 단계적으로 첨가하였다.
반응 혼합물을 N3-PEG-PLL 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 16시간 동안 37℃에서 유지하였다. 16시간 후, 3,3'-디티오디프로폰산(36.8mg, 0.1 equiv.)을 메탄올에 용해시키고, EDC·HCl(40.3mg, 0.15equiv.), 및 NHS(24.2mg, 0.15equiv.)를 탈이온수에 각각 용해시켰다. 그런 다음, NHS 및 EDC·HCl을 3,3'-디티오디프로폰산 용액에 순차적으로 첨가하였다. N3-PEG-PLL(Nic) 조 용액을 첨가한 후 혼합 용액을 37℃에서 4시간 동안 교반하였다.
정제를 위해, 혼합물을 메탄올에 대해 2시간 동안 투석하고, DL-디티오트레이톨(DTT, 40.6mg, 0.15equiv.)을 첨가한 다음, 30분 동안 활성화시켰다.
DTT를 제거하기 위해, 혼합물을 메탄올, 탈이온수 중 50% 메탄올, 탈이온수 순으로 투석하였다.
(d) 페닐 알라닌-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드)(Phe-PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서 조직-특이적 표적화 모이어티(TM)는 이전 단계에서 합성된 WP-CC-AM 성분에 부착되었다. TM 성분(페닐알라닌)은 단계(a)에서 생성된 중간체와 단계(c)의 생성물의 반응에 의해 생성되었다.
혈관 내 뇌 내피 조직을 표적화하기 위해, LAT1 표적화 아미노산으로서 페닐알라닌이 구리 촉매 존재하에 N3-PEG-PLL(Nic/SH) 및 알킨 변형 티로신의 클릭 반응에 의해 도입되었다. 간단히, N3-PEG-PLL(Nic/SH)(130mg, 6.5μmol) 및 알킨 변형된 페닐 알라닌(5.7mg, 4.0equiv.)을 탈이온수(또는 50mM 인산나트륨 완충액)에 용해시켰다. 그런 다음, CuSO4·H2O(0.4mg, 25mol%) 및 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(THPTA, 3.4mg, 1.2equiv.)을 탈이온수에 용해시키고 N3-PEG-PLL(Nic/SH) 용액을 첨가하였다. 이어서, 나트륨 아스코르베이트(3.2mg, 2.5equiv.)을 혼합물 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하면서 유지하였다. 반응 후, 혼합물을 투석막(MWCO = 7,000)으로 옮기고 탈이온수에 대해 1일 동안 투석하였다. 동결건조 후 최종 생성물을 수득하였다. 도 4는 담체 단위의 1H-NMR 특성을 보여준다.
실시예 2
다중이온 복합체(PIC) 미셀 제조
본 개시내용의 양이온성 담체 단위가 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성되면, 미셀이 생성되었다. 본 실시예에 기재된 미셀은 안티센스 올리고뉴클레오티드 페이로드와 조합된 양이온성 담체 단위를 포함하였다.
MeO- 또는 Phe-PEG-PLL(Nic) 및 miRNA를 혼합하여 나노 크기의 PIC 미셀을 제조하였다. PEG-PLL(Nic)을 HEPES 완충액(10mM)에 0.5mg/mL 농도로 용해시켰다. 그런 다음, RNAse가 없는 물 중 miRNA 용액(22.5μM)을 miRNA 대 중합체의 2:1(v/v) 비율로 중합체 용액과 혼합했다.
중합체 대 항-miRNA의 혼합 비율은 미셀 형성 조건, 즉, 항-miRNA(페이로드) 내 포스페이트에 대한 중합체(본 발명의 담체) 내 아민 간의 비율을 최적화하여 결정하였다. 중합체(담체) 및 항-miRNA(페이로드)의 혼합물을 3000rpm에서 다중-볼텍스에 의해 90초간 격렬하게 혼합하고, 미셀을 안정화시키기 위해 실온에서 30분 동안 유지하였다.
입자 크기 분포 및 산란광 강도(SLI)는 634nm 파장의 제타-사이저로 측정하였다. 도 9는 PBS에서 miRNA-로드된 다중이온 복합체 미셀의 입자 크기 분포를 나타낸다. 항-miRNA 로드된 미셀은 복합체가 균질한 입자임을 나타내는 낮은 PDI 분포와 함께 <60nm 입자 크기를 나타낸다. 도 9에 도시된 바와 같이 분포의 피크는 32nm에 있었다.
미셀(10μM의 항-miRNA 농도)은 사용 전에 4℃에서 보관했다. 동일한 방법으로 MeO- 또는 Phe-미셀을 제조하였고, 미셀 제조 동안 두 중합체를 혼합하여 상이한 양의 Phe-함유 미셀(25% ~75%)을 또한 제조하였다.
실시예 3
LAT1과 페닐알라닌을 이용한 뇌 표적화
LAT1은 BBB를 가로질러 본 개시내용의 미셀을 구동하기 위한 표적 분자로서 선택되었다. 도 10에 도시된 바와 같이, 인간에서 LAT1은 뇌에서 우선적으로 발현되었다. 도 11은 마우스에서 LAT1이 또한 뇌 조직에서 우선적으로 발현되었음을 보여준다.
LAT1 단백질을 이용하여 혈액 뇌장벽을 통과할 가능성을 조사하기 위해 Cy 5.5 염료 또는 Cy 5.5 표지된 페닐알라닌을 마우스(n=3)에 뇌실내 투여하고 주사 1시간 후 뇌 용해물의 형광 강도를 분석하였다. 측정을 위해 Cy 5.5는 알킨 변형 티로신 및 N3-Cy 5.5와의 클릭 반응에 의해 표지되었다.
Cy 5.5 표지된 페닐알라닌 또는 N3-Cy 5.5(20μg의 Cy5.5 농도)를 뇌실내 주사를 통해 별도로 투여하고, 대조군으로서 동일한 부피의 PBS도 주사하였다. 주사 1시간 후, 모든 마우스(n=3)를 희생시키고 남은 혈액을 관류를 위해 5mL PBS로 세척하였다. 마우스 뇌를 추출하고 프로브-형 초음파 분쇄기를 사용하여 용해 완충액으로 균질화하였다. 용해물 샘플을 96-웰 플레이트로 옮기고 Ex/Em = 650/690인 다중 플레이트 판독기로 형광 강도를 측정했다.
뇌를 표적으로 하는 형광(Cy5.5) 표지된 담체 단위는 실제로 뇌 실질에서 발현되는 LAT1에 결합할 수 있었고, 비-표적 Cy5.5 분자보다 더 높은 축적 수준을 나타냈다. 도 12 참조.
LAT1을 표적으로 하는 항-miRNA가 로드된 다중이온 복합체 미셀(즉, 본 발명의 미셀)은 BBB를 통과할 수 있고 비-표적 미셀에 비해 뇌에 상당하게 축적되었다.
실시예 4
본 개시내용의 미셀의 생체내 안정성
본원에 개시된 미셀의 생체내 안정성은 미셀의 전신 주사 후 혈액 순환 거동을 측정하여 평가하였다. Cy 5.5 표지된 miRNA 로드된 미셀과 노출된(naked) Cy 5.5 표지된 miRNA(20μg의 miRNA 농도)를 마우스에 전신 주사하고 원하는 시간에 꼬리 정맥에서 120μL의 혈액을 샘플링했다. 혈액 샘플을 2,500rpm에서 원심분리하고, 상청 혈장 샘플을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 혈장의 잔류 형광 강도는 Ex/Em = 650/690의 다중-플레이트 판독기로 분석되었다.
본 개시내용의 미셀에 항-microRNA 페이로드를 캡슐화하면 안정성의 증가를 가져왔다. 도 8 참조. 대조 조건에서, 항-microRNA(안티미르)의 혈장 반감기는 5분 미만이었다. 그러나, 본 개시내용의 미셀에 항-miRNA를 혼입한 후, 혈장 반감기는 80-120분으로 증가하였다. 미셀의 안정성은 다양한 항-miRNA 로드에 의해 영향을 받지 않았다. 담체 단위가 안티미르를 함유하지 않은 미셀은 담체 단위가 안티미르와 복합체화된 것의 25% 또는 50% 만큼 안정하였다.
실시예 5
알츠하이머병 모델에서의 실험
(i) 재료 및 방법
(a) 마우스: 5XFAD APP 형질전환 마우스(재고 번호: 34840-JAX)를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입했다. TG 및 연령-일치 야생형(WT) 한배 새끼를 연구에 사용했다. 모든 동물은 온도와 습도, 음식과 물이 조절된 12/12시간 명/암 주기에서 개별 케이지에 보관되었다. APP/PS1, Tg6799 또는 Tg-5xFAD로도 알려진 5xFAD 마우스는 알츠하이머병의 동물 모델 시스템이다. 5xFAD 마우스는 총 5개의 AD-연결된 돌연변이가 있는 인간 APP 및 PSEN1 이식유전자를 발현한다: APP에서 스웨덴(K670N/M671L), 플로리다(I716V), 런던(V717I) 돌연변이, PSEN1에서 M146L 및 L286V 돌연변이. 원래 Tg6799, Tg7031 및 Tg7092의 세 가지 라인이 생성되었다. 가장 높은 수준의 돌연변이 APP를 발현하는 Tg6799 라인은 세 가지 중 가장 많이 연구되었다. 이 널리 사용되는 마우스는 많은 AD-관련 표현형을 요약하고 비교적 초기에 공격적인 표현을 한다.
신경교증을 동반하는 아밀로이드 플라크는 생후 2개월 정도의 어린 마우스에서 볼 수 있다. 아밀로이드 병리는 수컷보다 암컷에서 더 심각하다. 뉴런 손실은 가장 두드러진 아밀로이드증이 있는 영역에서 약 6개월에 시작하여 여러 뇌 영역에서 발생한다. 마우스는 다양한 인지 및 운동 결함을 보인다.
3개의 인간 이식유전자, APP(Swe), PS1(M146V) 및 타우(P301L)를 보유하는 3xTg-AD 마우스를 잭슨 연구소(Jackson Laboratory)에서 구입하였다. 3xTg-AD 마우스는 C57BL6/129SvJ 하이브리드 배경에서 생성되었다. 마우스를 케이지당 4-5마리씩 수용하고 12시간 명/암 주기로 유지하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 했다. 과발현된 이식유전자의 번역은 해마와 대뇌 피질을 포함한 주로 알츠하이머병 관련 영역에서 중추 신경계로 제한되는 것으로 보인다. 이 마우스 라인의 초기 특성화는 아밀로이드 베타 펩타이드 침착의 점진적인 증가를 나타내었고, 세포내 면역반응은 3-4개월의 빠른 시기에 일부 뇌 영역에서 검출되었다. 시냅스 전달 및 장기 강화는 생후 6개월 마우스에서 명백하게 손상된다. 12-15개월 사이에 형태적으로 변형되고 과인산화된 타우의 집합체가 해마에서 감지된다. 이 돌연변이 마우스는 알츠하이머병 환자에서 관찰되는 것과 유사한 특성인 시냅스 기능 장애와 관련된 플라크 및 엉킴 병리를 나타낸다.
(b) ASO-MDS 치료(IV 주사): 정맥내(IV) 주사를 위해, 본 개시내용의 미셀(ASO-MDS) 또는 음성 대조군(miR 단독 및 미셀 단독) 내 miR-485-3p 안타고미르(안티미르)를 제조했다. 8개월 5XFAD 마우스의 모든 치료는 7, 14, 21 및 28일에 1.5mg/kg ASO-MDS의 정맥 주사를 통해 달성되었다. 도 17 참조
(c) 면역조직화학: 면역조직화학을 위해, 뇌를 제거하고, 후고정하고, 파라핀에 임베드하였다. 경색을 통한 관상 절편(두께 10μm)을 마이크로톰을 사용하여 절단하고 슬라이드에 장착했다. 파라핀을 제거하고, 절편을 PBS-T로 세척하고, 10% 소 혈청 알부민에서 2시간 동안 차단하였다. 그 후, 다음의 1차 항체가 적용되었다: 토끼 항-β-아밀로이드(1-42)(Cell Signaling Technology, Cat#14974), 마우스 항-GFAP(Merck, Cat#MAB360), 토끼 항-IL-1β(Abcam, Cat#9722), 마우스 항-TNF-α(Santa Cruz, Cat#sc-52746) 항-액틴(Santa Cruz, Cat#sc-47778). 행동 테스트 후, H/I 마우스로부터 해마 영역과 피질 영역을 절개하고, 뇌 조직을 프로테아제 억제제를 함유하는 빙냉 RIPA 완충액에서 균질화하였다. 균질물을 12,000r.p.m.에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집했다. 결과는 향상된 화학발광 시스템을 사용하여 시각화되었고 밀도계 분석(Image J 소프트웨어, NIH)에 의해 정량화되었다. 모든 실험은 적어도 3회 독립적으로 수행되었다.
(d) 행동 테스트(Y-미로 및 수동적 회피): Y-미로는 서로 120°인 3개의 검정색 불투명 플라스틱 팔(30cm x 8cm x 15cm)로 구성되었다. 5XFAD 마우스를 중앙에 배치하고 세 개의 팔을 모두 탐색할 수 있도록 했다. 교대 비율을 계산하기 위해 팔 진입 횟수와 시도 횟수(이동 횟수에 대한 표준은 중앙에서 10cm, 3개의 개별 팔로 진입)를 기록했다. 진입은 Y-미로 팔에 들어가는 3개의 부속물 모두로 정의되었다. 교대 행동은 트라이어드 수를 팔 진입 수에서 2를 뺀 값으로 나누고 100을 곱한 것으로 정의했다. 수동적 회피 챔버는 흰색(밝음)과 검은색(어두운) 구획(41cm×21cm×30cm)으로 구분되었다. 밝은 구획에는 60W 전기 램프가 들어 있다. (어두운) 바닥 부분에는 5mm 간격으로 여러 개의 (2mm) 스테인리스 스틸 막대가 포함되어 있다. 테스트는 3일 동안 진행되었다.
첫날에는 마우스를 밝은 영역에서 5분 동안 적응시켰다. 둘째 날은 2 단계로 구성된 훈련 단계였다. 첫 번째 단계에서 각 마우스를 밝은 영역에 놓고 어두운 영역으로 두 번 이동시켰다. 첫 번째 단계 후 1시간 후에 각 마우스를 밝은 구획에 넣었다. 30초 후에 두 칸을 나누는 문을 열었다. 마우스가 어두운 구획에 들어가면 문이 닫히고 전기 발 충격(0.3mA/10g)이 그리드 바닥을 통해 3초 동안 전달되었다. 마우스가 5분 초과 동안 어두운 영역에 들어가지 않으면 학습한 것으로 간주하여 최대 5회까지 훈련을 수행하였다. 훈련 시험 24시간 후, 마우스를 시험을 위해 밝은 챔버에 넣었다. 대기 시간은 두 구획을 분리하는 문이 열린 후 마우스가 어두운 방에 들어가는 데 걸리는 시간으로 정의되었다. 마우스가 어두운 영역에 들어가고 밝은 영역으로 나가는 데 걸리는 시간을 TDC(어두운 구획에서 보낸 시간)로 정의했다.
(e) 데이터 분석: 모든 데이터는 평균±s.d로 표현된다. 사후 비교(Student-Newman-Keuls 테스트)는 프리즘(Prism) 8을 사용하여 수행되었다. 행동 테스트는 비모수 통계 절차에 의해 평가되었다. 3개의 군(대조군(miR 단독 및 미셀 단독) 대 HI-485-3p) 비교를 만-위트니 U-테스트(Mann-Whitney U-test)로 분석했다.
(ii) 결과
miRNA-485-3p는 알츠하이머병 환자에서 상승하여, 예를 들어 염증, 미토콘드리아 기능의 변화 및 세포자연사를 유발할 수 있다. 도 23 참조. 이에 따라 miRNA-485-3p를 표적으로 하는 안티미르가 로드된 본 개시내용의 미셀을 알츠하이머병 마우스 모델에 투여하였다. 항-miR-485-3p를 포함하는 이들 미셀은 도면 및 본 출원 전체에서 "ASO-MDS"(안티센스 올리고뉴클레오티드-미셀 전달 시스템) 또는 "미셀+항-miR-485-3p"로 지칭된다.
8개월령 5XFAD 형질전환 마우스에 ASO-MDS 미셀을 4주 동안 매주 주입한 후, 주입 후 5XFAD 마우스의 피질 및 해마에서 신경염증이 감소됨을 관찰하였다. 도 19a, 19b, 20a, 20b 참조. 또한, ASO-MDS 미셀의 투여는 아밀로이드 플라크 부담을 감소시켰다. 도 21a 및 21b 참조. ASO-MDS를 사용한 치료는 또한 신경발생의 회복을 가져왔다. 도 22a 및 22b 참조. 염증, 아밀로이드 플라크 부담 및 신경발생의 개선 외에도 ASO-MDS 치료는 Y 미로 및 수동 회피 테스트에서 나타난 바와 같이 인지 기능도 개선했다. 도 23a 및 23b 참조.
ASO-MDS는 Y 미로 테스트에서 상당히 더 높은 %의 변경, 즉 약 80%의 변경을 보인 반면, 음성 대조군은 약 50%를 나타냈다. 도 23a 참조. ASO-MDS는 또한 음성 대조군에 비해 어두운 구획에서 보낸 시간(초)이 상당히 더 낮은 것으로 나타났다.
실시예 6
췌장암에서 K-Ras 침묵
본 개시내용의 미셀이 항암 요법제를 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해(도 25 참조), (i) 펩티드 리간드를 사용한 통상적인 cRGD 종양 표적화 또는 (ii) 대체 표적화 전략(X-표적)를 사용하여 본 개시내용의 미셀을 인간 췌장 세포에 표적화하였다. 미셀의 페이로드는 K-Ras를 표적화으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드였다.
췌장 종양 보유 마우스(n=3)는 Panc1-세포를 마우스에 주사한 후 10일 후에 확립되었다. Panc1은 췌장암 모델로 사용되는 인간 세포주이다. 세포주는 췌관 기원의 췌장 선암종(상피양 암종)으로부터 확립되었다. 세포는 G6PD의 B형 표현형을 가지고 있다(Lieber M, et al. "Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas." Int. J. Cancer 15: 741-747, 1975). 상술한 두 종류 미셀을 1일 1회로 3회 정맥주사하였다. 도 26a 참조. 종양을 추출한 후 RT-PCR로 유전자 침묵 효능을 평가하였다.
통상적인 cRGD 종양 표적화 펩티드 리간드를 갖는 미셀의 투여는 K-Ras의 약 20% 녹다운을 초래하였다. 대조적으로, 대체 X-표적 시스템을 사용하여 미셀을 투여하면 약 50%의 유전자 녹다운 효능이 나타났다. 도 26b 참조.
실시예 7
인간 뇌 세포에 대한 ASO-MDS의 세포 흡수 행동
인간 1차 미세아교세포, 성상교세포, 간세포 및 SH-5Y 세포를 6-웰 플레이트에 밤새 시딩하였다. 세포를 Cy5.5 표지된 ASO-MDS 100nM으로 처리하였다. 세포에서 ASO-MDS 흡수 측정은 총 48시간 동안 매시간 수집되었다. 인큐사이트(Incucyte) S3 기기를 사용하여 웰의 퍼센트 컨플루언시를 따라 흡수 용량을 계산했다.
세포 유형에 따른 흡수 능력을 조사하기 위해, Cy5.5 표지된 ASO-MDS를 제조하고 ASO-MDS 스톡을 PBS로 희석하였다. ASO-MDS의 흡수는 인간 1차 미세아교세포, 성상교세포 및 SH-5Y 세포에서 증가되었지만 인간 1차 간세포에서는 증가하지 않았다(도 13). 이것은 ASO-MDS가 뇌의 세포에 특이적으로 전달될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
시험관내 항-microRNA 로드된 미셀의 LAT1 표적성
GL-26 세포를 사용하여 ASO-MDS 미셀에 의한 LAT1의 표적화를 평가하였다. GL-26 세포를 DMEM을 함유하는 10% FBS, 1% P/S가 있는 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 4가지 유형의 샘플이 사용되었다: (i) LAT1을 표적으로 하는 ASO-MDS와 배양된 세포("표적 미셀"), (ii) LAT1을 표적으로 하지 않는 ASO-MDS와 배양된 세포("비-표적 미셀"), (iii) (i)와 같은 샘플, 단 세포에서 LAT1은 페닐 알라닌과의 사전배양에 의해 억제되었고("표적 미셀/억제제"), (iv) (ii)와 같은 샘플, 단 세포에서LAT1 활성은 페닐 알라닌과의 사전배양에 의해 억제되었다("비표적 미셀/억제제").
37℃에서 24시간 동안 1일 배양한 후, 배지를 새로 교환하고 1mM의 유리 페닐 알라닌을 샘플 (iii) 및 (iv)에 첨가하여 LAT1을 억제하였다. 그 다음, 세포를 1시간 동안 추가로 배양하고, Cy 5.5 표지된 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)을 300nM의 RNA 농도로 첨가하였다. 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 PBS 100μL를 첨가하였다. 세포의 잔류 형광 강도는 Ex 650/Em 690 파장의 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다.
표적-미셀 처리된 세포의 잔류 형광 강도는 비-표적 미셀 세포의 형광 강도보다 약 3배 더 높았는데, 이는 ASO-MDS 미셀이 LAT1을 표적으로 할 때 Cy5.5 표지된 항-microRNA의 흡수 증가가 있음을 시사한다.
표적 또는 비-표적 ASO-MDS로 처리된 세포를 LAT1 억제제와 사전배양한 경우 Cy5.5 표지된 항-microRNA의 세포 흡수에 유의한 차이가 없었다(도 14). 이것은 LAT1이 페닐 알라닌으로 억제되었을 때 ASO-MDS 미셀을 LAT1으로 표적화하는 것이 세포에 의한 Cy5.5 표지된 항-microRNA 흡수를 증가시키기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 즉, LAT1을 표적으로 하는 본 개시내용의 미셀에 캡슐화된 페이로드의 LAT1-매개된 흡수는 LAT1의 기능적 상태에 의존한다.
실시예 9
항-microRNA 로드된 미셀의 생체-분포
항-microRNA의 생체-분포는 IVIS 라이브 동물 이미징 스테이션을 사용하여 측정되었다. 노출된 항-microRNA 및 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)에 대한 항-microRNA 분포의 시간-의존적 차이를 비교하기 위해, 두 샘플(25μg의 RNA 농도)을 꼬리 정맥 주사를 통해 마우스에 투여했다. IVIS 라이브 동물 이미징 스테이션을 사용하여 원하는 시간에 마우스의 형광 이미지를 얻고 16시간 동안 관찰했다.
노출된 항-microRNA를 처리한 마우스의 잔류 형광 강도는 신장으로의 빠른 국소화를 보였고, 신호는 4시간 내에 거의 사라졌다. 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)의 경우, 형광 강도는 주로 뇌, 간 및 신장에 국소화되었다. 형광은 6시간까지 신장에서 점차 증가하고 시간이 지남에 따라 감소했다. 이러한 결과는 노출된 항-microRNA가 분자의 작은 크기로 인해 소변을 통해 빠르게(4시간 이내) 제거되었음을 나타낸다. 반면, 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)은 16시간까지 연장된 혈액순환을 나타냈으며 뇌 부위에 축적되었고, 잔류 항-microRNA는 소변을 통해 제거되었다. 도 15 참조.
실시예 10
시험관내 식균작용 검정(ELISA 및 면역세포화학)
1차 혼합 신경교 세포(2x105 세포) 또는 인간 1차 미세아교 세포(2x105 세포)를 6-웰 플레이트에 밤새 플레이팅하였다. 세포를 1μM의 최종 농도에서 4시간 동안 fAβ를 갖는 ASO-MDS로 처리하였다. 상등액에서 인간 Aβ(1-42)의 수준은 제조업체의 지침에 따라 인간 Aβ42 ELISA 키트(Invitrogen, Cat#KHB3441)를 사용하여 측정되었다.
또한, 인간 1차 미세아교세포의 식균작용을 형광현미경으로 확인하였다. 커버슬립은 24-웰 플레이트의 웰에서 커버슬립 레스팅 당 8x104 인간 1차 미세아교세포로 밤새 플레이팅되었다. 인간 1차 미세아교세포를 ASO-MDS로 처리하고 1μM의 최종 농도에서 표지되지 않은 fAβ와 함께 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하였다. Aβ 흡수 측정을 위해, 1차 신경교 세포를 100% 메탄올로 -20℃에서 1시간 동안 고정하고, PBS-T로 세척하고, 마우스 항-아밀로이드 베타 1-16 또는 토끼 항-Iba -1항체와 함께 4℃에서 배양했다.
신경교 세포에서 ASO-MDS의 식균작용 효과를 평가하기 위해, Aβ 단량체(100μM)를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 펩티드 스톡을 세포 배양 배지로 희석하여 Aβ 응집체를 제조하였다. 1차 혼합 신경교 세포를 ASO-MDS로 처리하고 4시간 동안 1μM 원섬유형 Aβ(fAβ)로 공동-처리했다. 조건화된 배지에서 Aβ 수준은 대조군 형질감염된 세포와 비교하여 ASO-MDS 형질감염된 세포에서 점진적으로 감소하였다. 도 18a 참조.
상기 결과와 일치하게, ASO-MDS는 용량 의존적으로 인간 1차 미세아교세포에 의한 Aβ 흡수 능력을 증가시켰다. 도 18b 참조.
이러한 결과는 ASO-MDS가 신경교 세포에서 Aβ 식균작용을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 신경교 세포의 역할을 추가로 탐색하기 위해, Iba1 및 6E10 항체를 사용하여 면역세포계측법(Immunocytometry) 분석을 수행하여 인간 미세아교 세포와 Aβ 플라크를 공동국소화했다. 면역세포계측법은 신경교 세포에서 Aβ의 발현이 ASO-MDS로 처리된 인간 1차 미세아교세포에서 상당히 상승되었음을 보여주었다. 도 18c 참조.
실시예 11
항-microRNA가 로드된 미셀의 생체-분포
IVIS 라이브 동물 이미징 스테이션을 사용하여 항-microRNA의 생체-분포를 측정하였다. 노출된 RNA 및 RNA 로드된 미셀(ASO-MDS) 사이의 시간 의존적 항-microRNA 분포를 비교하기 위해, 두 샘플(10μg의 RNA 농도)을 근육 주사를 통해 마우스에 투여했다. IVIS 라이브 동물 이미징 스테이션을 이용하여 원하는 시간에 마우스의 형광영상을 얻어 120시간까지 관찰하였다.
노출된 항-microRNA의 잔류 형광 강도는 신장으로의 빠른 국소화를 보였고, 신호는 6시간 이내에 거의 사라졌다. 항-microRNA 로드된 미셀(ASO-MDS)의 경우, 형광 강도는 주로 골격근 부위에 국소화되었다. 이러한 결과는 분자의 크기가 작기 때문에 노출된 RNA의 제거가 소변을 통해 6시간 이내에 빠르게 발생함을 나타낸다. 반면, 항-microRNA가 로드된 미셀은 주입 부위에서 지속적인 형광 강도를 보였고 림프절에서 부분적으로 형광 행동을 증가시켜 항-microRNA 로드된 미셀로부터 항-microRNA가 지속적으로 방출되었음을 나타낸다. 도 27 참조.
***
요약 및 초록 섹션이 아니라 상세한 설명 섹션이 청구범위를 해석하는 데 사용되도록 의도되었음을 이해해야 한다. 요약 및 초록 섹션은 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같이 본 개시의 모든 예시적인 측면이 아닌 하나 이상을 설명할 수 있으며, 따라서 본 개시 및 첨부된 청구범위를 어떤 식으로든 제한하도록 의도되지 않는다.
본 개시내용은 특정 기능의 구현 및 이들의 관계를 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 위에서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 여기에서 임의로 정의되었다. 지정된 기능과 그 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계를 정의할 수 있다.
특정 구현양태에 대한 전술한 설명은 본 개시내용의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 수 있으므로, 본 개시의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서 다른 사람들은 과도한 실험 없이도 이러한 특정 구현양태와 같은 다양한 적용에 대해 당업자의 지식을 적용함으로써 용이하게 수정 및/또는 적응할 수 있다. 따라서, 이러한 적응 및 수정은 여기에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 구현양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것이지 제한이 아니라, 본 명세서의 용어 또는 어구가 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 함을 이해해야 한다.
본 개시내용의 폭 및 범위는 전술한 예시적인 구현양태 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 이하의 청구범위 및 그 균등물에 따라서만 정의되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Biorchestra Co., Ltd. <120> MICELLAR NANOPARTICLES AND USES THEREOF <130> 4366.002PC02 <150> US 62/867,097 <151> 2019-06-26 <150> US 63/043,693 <151> 2020-06-24 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly-G linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Wherein Gly can be repeated 1 to 4 times <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Wherein Ser can be present or absent <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein the entire unit can be repeated 1 to 50 times <400> 1 Gly Ser 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Wherein the entire until can be repeted 1 to 100 times <400> 3 Gly Ala 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein the entire unit can be repeated 1 to 100 times <400> 4 Gly Gly Ser 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Wherein the entire unit can be repeated 1 to 100 times <400> 5 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Wherein the subsequence can be repeated 1 to 100 times <220> <221> misc_feature <222> (4)..(8) <223> Wherein the subsequence can be repeated 1 to 100 times <400> 6 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 7 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 10 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly-G linker sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> wherein the unit can be repeated 1 to 100 times <400> 12 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-204-5p <400> 13 uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-132-3p <400> 14 uaacagucua cagccauggu cg 22 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antiMIR nucleotide sequence <400> 15 aggcauagga ugacaaaggg aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-485-3p <400> 16 cgaccauggc uguagacugu ua 22 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antiMIR nucleotide sequence <400> 17 gucauacacg gcucuccucu cu 22 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antiMIR nucleotide sequence <400> 18 agagaggaga gccguguaug ac 22 <210> 19 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-485-3p <400> 19 ucauaca 7 <210> 20 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antiMIR nucleotide sequence <400> 20 uguauga 7 <210> 21 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> has-miR-204-5p <400> 21 ucccuuu 7 <210> 22 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antiMIR nucleotide sequence <400> 22 aaaggga 7

Claims (92)

  1. 하기의 구성을 포함하는, 양이온성 담체 단위:
    (i) 페닐알라닌을 포함하는 표적화 모이어티(A),
    (ii) 1 내지 200의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 반복 단위를 포함하는 수용성 중합체,
    (iii) 1 내지 200의 라이신 단위를 포함하는 폴리라이신을 포함하는 양으로 하전된 양이온성 담체 모이어티, 및
    (iv) 1 내지 150의 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티,
    상기 표적화 모이어티는 상기 수용성 중합체에 연결되고,
    상기 수용성 중합체 및 양으로 하전된 양이온성 담체 모이어티는 직접 또는 이관능성 링커를 통해 서로 연결되고,
    상기 폴리라이신은 (a) 보조제 모이어티에 공유적으로 결합된 일부 라이신 단위("AM-연결된 라이신 단위”) 및 (b) 양전하를 띤 일부 라이신 단위를 포함하고,
    상기 AM-연결된 라이신 단위는 상기 비타민 B3 단위에 공유적으로 결합되는 것을 특징으로 하는, 양이온성 담체 단위.
  2. 제 1항의 양이온성 담체 단위 및 음이온성 페이로드를 포함하는 미셀로서,
    상기 음이온성 페이로드는 mRNA, miRNA, miRNA 스펀지, 터프 디코이 miRNA, 안티미르, 작은 RNA, rRNA, siRNA, shRNA, gDNA, cDNA, pDNA, PNA, BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 앱타머, 사이클릭 디뉴클레오티드, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미셀.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 미셀 내 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 음이온성 페이로드의 음전하가 1:3 내지 3:1의 전하비인, 미셀.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 미셀 내 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 음이온성 페이로드의 음전하가 1:1의 전하비인, 미셀.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 핵산이 5 내지 30의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 미셀.
  6. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 미셀:
    (a) 40 내지 200의 PEG 반복 단위를 포함하는 수용성 중합체;
    (b) 3 내지 100의 라이신 단위를 포함하는 폴리라이신; 및
    (c) 1 내지 100의 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티.
  7. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 미셀:
    (a) 40, 100, 150, 또는 200의 PEG 반복 단위를 포함하는 수용성 중합체;
    (b) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100의 라이신 단위를 포함하는 폴리라이신; 및
    (c) 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100의 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티.
  8. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 80 내지 160의 PEG 반복 단위를 포함하는, 미셀.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 폴리라리신은 30 내지 100의 라이신 단위를 포함하는, 미셀.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 보조제 모이어티는 2 내지 20의 비타민 B3 단위를 포함하는, 미셀.
  11. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 미셀:
    (a) 100 내지 120의 PEG 반복 단위를 포함하는 수용성 중합체;
    (b) 30 내지 40의 라이신 단위를 포함하는 폴리라이신; 및
    (c) 5 내지 10의 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티.
  12. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는, 미셀:
    (a) 120 내지 130의 PEG 반복 단위를 포함하는 수용성 중합체;
    (b) 70 내지 90의 라이신 단위를 포함하는 폴리라이신; 및
    (c) 20 내지 50의 비타민 B3 단위를 포함하는 보조제 모이어티.
  13. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티 및 음이온성 페이로드는 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 회합된, 미셀.
  14. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티 및 음이온성 페이로드는 이온 결합에 의해 회합된, 미셀.
  15. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미셀의 직경은 10 nm 내지 100 nm인, 미셀.
  16. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미셀의 직경은 40 nm 내지 70 nm인, 미셀.
  17. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는, 미셀.
  18. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 골격근으로 전달될 수 있는, 미셀.
  19. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 미셀 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 미셀의 제조방법으로서, 상기 양이온성 담체 단위를 음이온성 페이로드와 1:3 내지 3:1의 이온비로 용액 중에서 혼합하는 단계를 포함하는, 미셀의 제조방법.
  21. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 미셀의 제조방법으로서, 상기 양이온성 담체 단위를 음이온성 페이로드와 1:1의 이온비로 용액 중에서 혼합하는 단계를 포함하는, 미셀의 제조방법.
  22. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 미셀을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 신경퇴행성 질환 또는 병태 치료용 약제학적 조성물.
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