KR20190135494A - 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 직교 보호기 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 아민 함유 키랄 보조물 기를 포함하는 뉴클레오시드 단량체의 입체한정, 및 올리고뉴클레오티드 합성 동안 키랄 보조물의 질소를 직교 보호하고, 연장후 사슬 절단을 방지하고, 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 수율 및 순도를 증가시키는 방법의 분야에 관한 것이다. 직교 보호 기는 또한, 전형적으로 4 시간 내에, 신속히 제거된다.
Description
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 아민 함유 키랄 보조물 기를 포함하는 뉴클레오시드 단량체의 입체한정, 및 올리고뉴클레오티드 합성 동안 키랄 보조물의 질소를 직교 보호 (orthogonal protection) 하고, 연장후 사슬 절단을 방지하고, 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 수율 및 순도를 증가시키는 방법의 분야에 관한 것이다. 직교 보호 기는 또한, 전형적으로 4 시간 내에, 신속히 제거된다.
올리고뉴클레오티드에서 입체한정된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 (linkage) 의 사용은 치료적 올리고뉴클레오티드의 약물학적 프로파일의 최적화를 허용한다. 그러나, 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 제조는 현재로서는 비-입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 비교시 비교적 비효율적이다. 그러므로 입체한정된 올리고뉴클레오티드의 합성의 효율을 개선할 필요가 있다.
Oka et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 16031-16037 은 바이시클릭 옥사자포스폴리딘 유도체를 사용하는 입체규칙성 DNA 포스포로티오에이트의 고체상 합성에 대해 보고한다. Oka et al. 프로세스에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 상의 아민은 트리플루오로아세틸화에 의해 보호된다.
EP 2 620 428A1 단락 [0015] 는 트리플루오로아세틸 기의 제거가, 아마도 가닥의 분해로 인해, 긴 DNA 가닥 또는 화학적으로 불안정한 RNA 가닥의 합성에서 문제를, 또는 기의 완전한 제거에서 문제를 야기한다는 것을 보고한다. EP 2 620 428A1 은 상이한 키랄 보조물의 사용을 제안한다.
본 발명은 Oka et al. 방법이 유의한 조기 사슬 종결을 초래한다는 발견, 및 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 상에서 트리플루오로아세틸 보호기 대신 카르바메이트 보호기의 사용이 키랄 보조물의 신속하고 효율적인 탈보호 및 절단을 허용하는 한편 조기 사슬 종결을 회피한다는 발견에 기초한다.
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링시키는 단계, 그에 뒤이어 (ii) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 단계, 및 (iii) 황화 단계를 포함하며, 황화 단계 (iii) 는 커플링 단계 (i) 후에 및 아민 보호 단계 (ii) 에 앞서 또는 그에 후속하여 수행된다.
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링시켜 포스파이트 트리에스테르 중간체를 생성하는 단계, 그에 뒤이어 (ii) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 단계, 및 (iii) 포스파이트 트리에스테르 중간체를 황화 시약으로 산화시키는 단계를 포함하며, 황화 단계 (iii) 는 커플링 단계 (i) 후에 및 아민 보호 단계 (ii) 에 앞서 또는 그에 후속하여 수행된다.
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를 고체 지지체에 결합된 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링시켜, 포스파이트 트리에스테르 중간체를 생성하는 단계, 그에 뒤이어 (ii) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 단계, 및 (iii) 포스파이트 트리에스테르 중간체를 황화 시약으로 산화시키는 단계를 포함하며, 황화 단계 (iii) 는 커플링 단계 (i) 후에 및 아민 보호 단계 (ii) 에 앞서 또는 그에 후속하여 수행되며, 그에 뒤이어 카르바메이트 보호기의 제거 및 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단이 수행된다.
본 발명은 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 올리고뉴클레오티드의 가닥 절단을 방지하기 위한 키랄 보조물 기 상의 카르바메이트 보호기, 예컨대 직교 카르바메이트 보호기의 용도를 제공한다. 방지되는 가닥 절단은 포스페이트 트리에스테르에서의 가닥 절단일 수 있다.
본 발명은 식 21 또는 22 의 화합물을 제공한다
식에서 X 는 고체 지지체 또는 고체 지지체에 부착된 선행하는 뉴클레오시드 (말단 5'-OH 기) 이며; 염기는 핵염기이며;
R5 및 R6 은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로-알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로-알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 식 (I) 의 N 원자와 함께, 3 - 16 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하며;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되며; R9 는 수소이며;
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌, 및 치환된 불소로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R3 = 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb, 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3, 및 -O-CH3 로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 각각의 Rm 및 Rn 은 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환된 또는 미치환된 C1-10 알킬이며;
R4 = 는 알킬, 시클로-알킬, 시클로-헤테로알킬, O-알킬, S-알킬, NH-알킬, 및 수소로 이루어지는 군으로부터 선택되거나;
또는 R2 및 R4 는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, O, -Si(Ra)2-, S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 개의 기/원자로 이루어지는 이가 브릿지를 나타내고;
여기에서 Ra 및, 존재할 때 Rb, 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 두 개의 같은 자리 (geminal) 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에서, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있고; Z 는 카르바메이트 보호기이다.
도 1: 본 발명의 예시적 올리고뉴클레오티드 합성 사이클. 예시된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 이지만, 본원에서 상세 설명된 기타 뉴클레오시드가 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 도면은 단계 (i), (iii) 및 그 후 (ii) 이 순차적으로 수행되는 프로세스를 예시하고, 임의로, 단계 (ii) 후에 캡핑 단계가 수행될 수 있다.
도 2: 본 발명의 예시적 올리고뉴클레오티드 합성 사이클. 예시된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 이지만, 본원에서 상세 설명된 기타 뉴클레오시드가 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 도면은 단계 (i), (ii) 및 그 후 (iii) 이 순차적으로 수행되는 프로세스를 예시하고, 임의로, 단계 (iii) 후에 캡핑 단계가 수행될 수 있다.
도 3: 본 발명의 예시적 올리고뉴클레오티드 합성 사이클. 예시된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 이지만, 본원에서 상세 설명된 기타 뉴클레오시드가 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 도면은 단계 (i), (ii) 및 그 후 (iii) 이 순차적으로 수행되는 프로세스를 예시하고, 임의로, 단계 (ii) 후에 및 단계 (iii) 전에 캡핑 단계가 수행될 수 있다.
도 4: 캡핑 전에 Fmoc 보호가 수행될 때, Fmoc 보호가 수행되지 않을 때와 비교되는, 키랄 보조물의 매우 신속한 탈보호가 관찰된다는 것을 보여주는 크로마토그램.
도 5: 오직 Fmoc 보호가 수행될 때에만 신속한 탈보호가 관찰된다는 것을 보여주는, 4 시간 탈보호 후에 분석된, Fmoc 보호가 수행되지 않을 때와 비교되는, 도 1 의 합성 사이클에 따라 합성된 완전히 입체한정된 올리고뉴클레오티드의 크로마토그램.
도 2: 본 발명의 예시적 올리고뉴클레오티드 합성 사이클. 예시된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 이지만, 본원에서 상세 설명된 기타 뉴클레오시드가 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 도면은 단계 (i), (ii) 및 그 후 (iii) 이 순차적으로 수행되는 프로세스를 예시하고, 임의로, 단계 (iii) 후에 캡핑 단계가 수행될 수 있다.
도 3: 본 발명의 예시적 올리고뉴클레오티드 합성 사이클. 예시된 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 이지만, 본원에서 상세 설명된 기타 뉴클레오시드가 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 도면은 단계 (i), (ii) 및 그 후 (iii) 이 순차적으로 수행되는 프로세스를 예시하고, 임의로, 단계 (ii) 후에 및 단계 (iii) 전에 캡핑 단계가 수행될 수 있다.
도 4: 캡핑 전에 Fmoc 보호가 수행될 때, Fmoc 보호가 수행되지 않을 때와 비교되는, 키랄 보조물의 매우 신속한 탈보호가 관찰된다는 것을 보여주는 크로마토그램.
도 5: 오직 Fmoc 보호가 수행될 때에만 신속한 탈보호가 관찰된다는 것을 보여주는, 4 시간 탈보호 후에 분석된, Fmoc 보호가 수행되지 않을 때와 비교되는, 도 1 의 합성 사이클에 따라 합성된 완전히 입체한정된 올리고뉴클레오티드의 크로마토그램.
상세한 설명
본원에서 사용되는, 용어 "아릴" 은, 고리를 형성하는 각각의 원자가 탄소 원자인 방향족 고리를 나타낸다. 아릴 고리는 5, 6, 7, 8, 9 또는 9 개 초과의 탄소 원자로 형성된다. 아릴기는 치환되거나 미치환된다. 하나의 양태에서, 아릴은 페닐 또는 나프탈레닐이다. 구조에 따라, 아릴기는 모노라디칼 또는 디라디칼 (즉, 아릴렌기) 일 수 있다. 하나의 양태에서, 아릴은 C6-10 아릴이다. 일부 구현예에서, 아릴은 페닐이다. 치환되는 경우, 아릴은 C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다. 다중 치환은, 종속적으로 또는 독립적으로, C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군; 또는 할라이드, 예컨대 아이오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있으며, 예컨대 할라이드, 예컨대 아이오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환된 페닐일 수 있다.
"알킬" 기는, 지방족 탄화수소기를 나타낸다. 알킬 모이어티 (moiety) 는 포화된 알킬기 (이는 임의의 불포화 유닛, 예를 들어 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하지 않는 것을 의미함) 일 수 있거나, 또는 알킬 모이어티는 불포화된 알킬기 (이는 적어도 하나의 불포화 유닛을 함유하는 것을 의미함) 일 수 있다. 포화되거나 불포화된 알킬 모이어티는, 분지형, 직쇄이거나, 또는 시클릭 부분을 포함할 수 있다. 알킬의 부착 지점은, 고리의 일부가 아닌 탄소 원자에 있다. "알킬" 모이어티는 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가질 수 있다 (본원에서 언급되는 경우, "1 내지 10" 과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내 각각의 정수를 나타내며; 예를 들어 "1 내지 10 개의 탄소 원자" 는, 알킬기가 1 개의 탄소 원자, 2 개의 탄소 원자, 3 개의 탄소 원자 등 (10 개의 탄소 원자까지) 으로 이루어질 수 있으나, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬" 의 존재를 포함한다는 것을 의미함). 알킬은 분지쇄 및 직쇄 알킬기를 모두 포함한다. 본원에 기재된 화합물의 알킬기는, "C1-6 알킬" 또는 유사한 지정으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬" 은, 알킬 사슬에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 탄소 원자가 존재하며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다는 것을 나타낸다. 전형적인 알킬기에는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로필메틸, 시클로부틸메틸, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸 등이 포함된다. 하나의 양태에서, 알킬은 C1-6 또는 C1-4 알킬, 또는 C1-3 알킬이다. C1-3 알킬기는, 1 내지 3 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. C1-4 알킬기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필이다. C1-3 알킬기는, 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. C1-3 알킬기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 tert-부틸이다.
"알케닐" 기는, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄, 분지형 및 시클릭 탄화수소기이다. 알케닐기는 치환될 수 있다.
"알키닐" 기는, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄, 분지형 및 시클릭 탄화수소기이다. 알키닐기는 치환될 수 있다.
"알콕시" 기는, 산소에 연결된 알킬기, 즉 (알킬)-O- 기를 나타내며, 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같다. 예에는, 메톡시 (-OCH3) 또는 에톡시 (-OCH2CH3) 기가 포함된다.
"알케닐옥시" 기는, 산소에 연결된 알케닐기, 즉 (알케닐)-O- 기를 나타내며, 여기서 알케닐은 본원에 정의된 바와 같다.
"알키닐옥시" 기는, 산소에 연결된 알키닐기, 즉 (알키닐)-O- 기를 나타내며, 여기서 알키닐은 본원에 정의된 바와 같다.
"아릴옥시" 기는, 산소에 연결된 아릴기, 즉 (아릴)-O- 기를 나타내며, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같다. 예에는, 페녹시 (-OC6H5) 기가 포함된다.
"실릴" 은 H3Si- 를 나타낸다. 본원에서 사용되는, "치환된 실릴" 은, 실릴 치환된 수소를 하나 이상 갖는 모이어티를 나타낸다. 예에는, 비제한적으로, TBDMS (tert-부틸디메틸실릴), TBDPS (tert-부틸디페닐실릴) 또는 TMS (트리메틸실릴) 기가 포함된다.
용어 "할로겐" 은, 플루오린, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "할라이드" 는, 플루오라이드, 브로마이드, 아이오다이드 및 클로라이드를 포함한다.
"아실 보호기" 는 아실기 -C(=O)-R7 를 포함하며, 여기서 R7 은 말단기, 예를 들어 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 시클로알킬- 및 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 미치환된 알킬-, 미치환된 알케닐-, 미치환된 알키닐-, 미치환된 시클로알킬- 또는 미치환된 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 치환된 알킬-, 치환된 알케닐-, 치환된 알키닐-, 치환된 시클로알킬- 또는 치환된 아릴-기로부터 선택되는 기이다. 일부 구현예에서, R7 은 미치환된 C1-6-알킬-, 미치환된 C2-6-알케닐-, 미치환된 C2-6-알키닐-, 미치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 미치환된 페닐-기 또는 치환된 C1-6-알킬-, 치환된 C2-6-알케닐-, 치환된 C2-6-알키닐-, 치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 치환된 페닐-기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며; 여기서 치환되는 경우, 치환기는, 예를 들어 할로겐, C1-6-알킬, C2-6-알케닐, C2-6-알키닐, C1-6-알콕시, 임의로 치환된 아릴옥시 또는 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 단일 또는 다중 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실 보호기는 이소부투릴 (isobuturyl) (-C(O=)CH(CH3)2) (또한 본원에서 iBu 로 지칭됨) 이다. 용어 이소부투릴은 또한 이소부티릴로 쓰여질 수 있다.
옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트
옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 (본원에서 또한 뉴클레오시드 단량체, 단량체 또는 아미다이트로서 언급됨), 예컨대 아세토니트릴, 뉴클레오시드 단량체, 및 방향족 헤테로시클릭 용매를 포함하는 식 1 의 뉴클레오시드 단량체로서 언급될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드 단량체는 식 A 를 갖는다:
식에서 X 는 뉴클레오시드의 3' 이며,
R5 및 R6 은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로-알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로-알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 식 A 의 N 원자와 함께, 3 - 16 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하며;
R9 는 수소이며;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 및,
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌, 및 치환된 불소로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
치환될 때, R 은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다: C1- 4 알킬 기, C6-14 아릴 기 C1-4, 알콕시 기, C7-14 아랄킬 기, C1- 4 알킬, C6-14 아릴 기, C1-4 알콕시, C6-14 아릴 기, 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬 기. 복수의 치환기는 종속적으로 또는 독립적으로 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: C1- 4 알킬 기, C6-14 아릴 기 C1-4, 알콕시 기, C7-14 아랄킬 기, C1- 4 알킬, C6-14 아릴 기, C1-4 알콕시, C6-14 아릴 기, 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬 기.
식 1 에서 보여지는 단량체는 아래에서 보여지는 바와 같이 두 가지 키랄 동형 (isoform) 으로 존재할 수 있다:
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 A(i) 를 갖는다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 A(ii) 를 갖는다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 1 또는 2 를 갖는다:
식에서 염기는 핵염기이며;
R3 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb, 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어지는 군으로부터 선택되며; R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3, 및 -O-CH3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 각각의 Rm 및 Rn 은 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환된 또는 미치환된 C1-10 알킬이며;
R4 = 는 알킬, 시클로-알킬, 시클로-헤테로알킬, O-알킬, S-알킬, NH-알킬, 및 수소로 이루어지는 군으로부터 선택되거나;
또는 R2 및 R4 는 함께 이가 브릿지, 예컨대 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, O, -Si(Ra)2-, S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 개의 기/원자로 이루어지는 이가 브릿지를 나타내며;
여기에서 Ra 및, 존재할 때 Rb, 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 두 개의 같은 자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에서, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있다.
일부 구현예에서 R3 은 -CH2-O-DMTr 이고, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이고, R9 는 수소이다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 9 또는 10 을 갖는다:
일부 구현예에서, R4 및 R2 는 수소이다. 일부 구현예에서 뉴클레오시드 X 는 DNA 뉴클레오시드이다. 대표적 DNA 단량체는 하기를 포함한다:
B 는 핵염기를 나타낸다.
일부 구현예에서 뉴클레오시드 X 가 DNA 뉴클레오시드인 경우에 (즉, R4 및 R2 는 수소이다) , R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다.
일부 구현예에서 R4 및 R2 는 이가 브릿지를 형성한다. 일부 구현예에서 뉴클레오시드 X 는 잠긴 핵산 뉴클레오시드 (LNA) 이다. 일부 구현예에서 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 3 또는 4 (베타-D-옥시 LNA) 를 갖는다:
일부 구현예에서 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 11 또는 12 의 LNA 단량체이다:
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체가 LNA 단량체, 예컨대 식 11 또는 12 에서 보여지는 것일 때, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다.
일부 구현예에서 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 5 또는 6 을 갖는다:
일부 구현예에서 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 15 또는 16 을 갖는다:
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체가 식 15 또는 16 의 LNA 단량체일 때, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다.
일부 구현예에서, 예컨대 R4 가 수소일 때, R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3, 및 -O-CH3 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 각각의 Rm 및 Rn 은 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환된 또는 미치환된 C1-10 알킬이다. 이들은 본원에서 2' 치환된 단량체로서 언급된다.
일부 구현예에서 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 7 또는 8 의 2'-O-메톡시에틸 (2'MOE) 단량체이다:
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체가 2' 치환된 단량체, 예컨대 식 7, 8, 13 또는 14 의 단량체일 때, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다.
식 A 의 뉴클레오시드의 R 및 R1 (R/R1) 기는 입체중심을 제공하여, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때 뉴클레오시드의 3' 에서 Sp 또는 Rp 입체한정된 포스포로티오에이트 기의 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 입체중심은 L 배치로 존재하며, 이는 식 A(i), 1, 9, 3, 11, 5, 15, 7 & 13 에서 예시되는 바와 같다. 그러한 단량체는 본원에서 L 단량체로서 언급되며, Sp 입체중심의 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 입체중심은 D 배치로 존재하며, 이는 식 A(ii), 2, 10, 4, 12, 6, 16, 8 & 14 에서 예시되는 바와 같다. 그러한 단량체는 본원에서 D 단량체로서 언급되며, Rp 입체중심의 형성을 초래한다
DMF 보호된 L-LNA-G
실시예에서 예시되는 바와 같이, DMF 보호된 L-LNA-G 단량체는 아세토니트릴 용매에 난용성이다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 DMF 보호된 구아닌 핵염기 (염기) 를 포함하는 L-LNA 단량체가 아니다.
일부 구현예에서 DMF 보호된 구아닌 기는 하기 구조를 갖는다:
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 식 31 또는 32 의 단량체가 아니다:
식에서 R, R1, R3, R5, R6 & R9 는 식 1 의 단량체 및 식 11 의 단량체에 따르고, X 및 Y 는 함께 이가 브릿지 (예를 들어 본원에서 R2 및 R4 에 따르는 것), 예컨대 브릿지 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb) C(RaRb)-O-, -CH2-O-, -CH2 CH2-O-, -CH(CH3)-O- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 브릿지를 나타낸다. 일부 구현예에서, X 및 Y 는 이가 브릿지 -CH2-O- (또한 옥시-LNA 로서 알려진 메틸렌-옥시) 또는 -CH(CH3)-O- (메틸-메틸렌-옥시) 를 나타낸다. -CH(CH3)-O- 브릿지는 브릿지 내의 탄소 원자에서 키랄 중심을 도입하며, 일부 구현예에서 이는 S 위치에 존재한다 (예를 들어 기술분야에서 (S)cET 로서 알려진 뉴클레오시드 - EP1984381 참고). 일부 구현예에서, X 및 Y 는 이가 브릿지 -CH2-O- 를 나타내며, 여기에서 브릿지는 베타-D 배치 (베타-D-옥시 LNA) 로 존재한다. 일부 구현예에서, X 및 Y 는 이가 브릿지 -CH2-O- 를 나타내며, 여기에서 브릿지는 알파-L 배치 (알파-L-D-옥시 LNA) 로 존재한다. 일부 구현예에서, X 및 Y 는 이가 브릿지 -CH2-S- (티오 LNA), 또는 -CH2-NH2- (아미노 LNA) 를 나타낸다. 구현예에서 X 및 Y 가 함께 이가 브릿지를 나타낼 때, R3 은, 예를 들어 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 식 33 또는 34 의 단량체가 아니다
식에서 X, Y, R, R1, R9 및 R3 은 식 1 에 따른다. 구아닌 염기의 엑소시클릭 산소는, 예를 들어 시아노 기로, 임의로 보호될 수 있다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 식 35 또는 36 의 단량체가 아니다:
식에서 X, Y, R1 및 R3 은 식 1 에 따른다. 구아닌 염기의 엑소시클릭 산소는, 예를 들어 시아노 기로, 임의로 보호될 수 있다. 식 35 또는 36 의 일부 구현예에서, R1 은 수소이다. 식 35 또는 36 의 일부 구현예에서, R3 은 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 아실 보호된 뉴클레오시드 (Z) 를 포함한다.
아실 보호된 L-LNA-G
실시예에서 예시되는 바와 같이, DMF 보호된 L-LNA-G 단량체는 아세토니트릴 용매에 난용성이다. 그러나, 발명자들은 L-LNA-G 단량체의 구아닌 뉴클레오시드 상에서 아실 보호 기의 사용이 용해도 문제를 극복한다는 것을 확인했다.
구아닌의 엑소시클릭 질소 기는 아래에서 예시된다 (동그라미 그려져 있음). 이 기는 본 발명의 LNA 단량체에서 아실 기, 예를 들어 이소부티릴 기에 의해 보호될 수 있다. 그러한 아실 보호된 L-LNA-G 단량체는 통상적인 DMF 보호된 L-LNA-G 단량체보다 더욱 가용성이고 안정적인 것으로 발견되었고, 그러므로 아민 함유 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체가 L-LNA-G 단량체일 때 특히 유용하다. 산소 기는, 예를 들어 시아노 기로, 임의로 또한 보호될 수 있다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 아실 보호된 구아닌 핵염기, 예컨대 이소부티릴 보호된 구아닌을 포함하는 L-LNA 단량체이다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 식 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 의 L-LNA-G 단량체이다:
식에서, R, R1, R2, R3, R4, R5, R9 및 R6 은 본 발명의 화합물에 따르고, -C(=O)-R7 은 구아닌 염기의 엑소시클릭 질소 상의 아실 보호기이고, R8 은 존재할 때 구아닌 엑소시클릭 산소 상의 보호기이다. 일부 구현예에서 R8 은 시아노에틸이다. 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이고, R3 은 임의로 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 이다. 일부 구현예에서, R7 은 이소부티릴이다. 식 31 및 32 에서, Y 및 X 는 식 11 에 따른다.
일부 구현예에서, 예컨대 옥사자포스폴리딘 단량체가 식 3, 11, 5 또는 15 를 가질 때, 옥사자포스폴리딘 단량체의 뉴클레오시드 상에 존재하는 핵염기 (염기) 는 구아닌 뉴클레오시드이며, 여기에서 구아닌 핵염기 기는 구아닌 엑소시클릭 질소 기 상에 아실 보호기를 포함한다.
"아실 보호기" 는 아실 기 -C(=O)-R7 을 포함하며, 여기에서 R7 은 말단 기, 예를 들어, 알킬-, 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 시클로알킬- 및 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 미치환된 알킬-, 미치환된 알케닐-, 미치환된 알키닐-, 미치환된 시클로알킬- 또는 미치환된 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 치환된 알킬-, 치환된 알케닐-, 치환된 알키닐-, 치환된 시클로알킬- 또는 치환된 아릴-기로부터 선택되는 기이다. 일부 구현예에서 R7 은 미치환된 C1-6-알킬-, 미치환된 C2-6-알케닐-, 미치환된 C2-6-알키닐-, 미치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 미치환된 페닐-기 또는 치환된 C1-6-알킬-, 치환된 C2-6-알케닐-, 치환된 C2-6-알키닐-, 치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 치환된 페닐-기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며; 여기에서 치환될 때, 치환기는, 예를 들어 할로겐, C1-6-알킬, C2-6-알케닐, C2-6-알키닐, C1-6-알콕시, 임의로 치환된 아릴옥시 또는 임의로 치환된 아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 단일 또는 다중치환될 수 있다. 일부 구현예에서 아실 보호기는 이소부투릴 (-C(O=)CH(CH3)2) (또한 본원에서 iBu 로서 언급됨) 이다. 용어 이소부투릴은 또한 이소부티릴로 쓰여질 수 있다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 단량체는 식 3, 11, 5 또는 15 를 갖고, 옥사자포스폴리딘 단량체의 뉴클레오시드 상에 존재하는 핵염기 (염기) 는 구아닌 뉴클레오시드이며, 여기에서 구아닌 핵염기 기는 구아닌 엑소시클릭 질소 기 상에 아실 보호기를 포함한다. 일부 구현예에서, 구아닌 엑소시클릭 질소 기 상에 존재하는 아실 보호기는 이소부투릴이다. 일부 구현예에서, "L-LNA-G" 옥사자포스폴리딘 단량체는 식 1 의 LNA 단량체이다. 일부 구현예에서, "L-LNA-G" 옥사자포스폴리딘 단량체는 식 1 의 고친화도 LNA 단량체이다.
키랄 보조물 상의 R 기
치환될 때, R 은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다: C1- 4 알킬 기, C6-14 아릴 기 C1-4, 알콕시 기, C7-14 아랄킬 기, C1- 4 알킬, C6-14 아릴 기, C1-4 알콕시, C6-14 아릴 기, 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬 기. 복수의 치환기는 종속적으로 또는 독립적으로 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: C1- 4 알킬 기, C6-14 아릴 기 C1-4, 알콕시 기, C7-14 아랄킬 기, C1- 4 알킬, C6-14 아릴 기, C1-4 알콕시, C6-14 아릴 기, 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬 기.
일부 구현예에서 R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌, 및 치환된 플루오렌로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서 R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서 R 은 아릴, 예컨대 페닐이다.
일부 구현예에서, R 이 치환된 아릴일 때, R 은 할라이드, 예컨대 아이오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환, 예컨대 할라이드, 예컨대 아이오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환된 페닐일 수 있다.
일부 구현예에서 R1 은 수소이다. 일부 구현예에서 R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다. 일부 구현예에서 R1 은 메틸이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐 및 R1 은 수소이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
일부 구현예에서 R 은 하기이다:
식에서 G31, G32 및 G33 은 C1-4 알킬, C6-14 아릴C1-4 알콕시, C7-14 아랄킬, C1-4 알킬C6-14 아릴, C1-4 알콕시C6-14 아릴, 및 C6-14 아릴C1-4 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서 R 은 하기이다:
식에서 G21, G22 및 G23 은 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 시아노 또는 C1-3 알킬이다.
일부 구현예에서 R 은 하기이다:
식에서 G51, G52 및 G53 은 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 시아노 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 알킬옥시 기이다.
일부 구현예에서 R5 및 R6 은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성한다 (식 1 에서 보여지는 시클릭 질소와 함께) - 바이시클릭 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트로서 언급되는 뉴클레오시드 단량체. 헤테로시클릭 고리는, 예를 들어 3-16 개의 탄소 원자, 예컨대 4 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
바이시클릭 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체
일부 구현예에서 단량체는 바이시클릭 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체이며, 예를 들어 일부 구현예에서 R5 및 R6 은 함께 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서 R5 및 R6 은 함께 4 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하여 (식 1 에서 보여지는 시클릭 질소와 함께), 총 5 개의 원자가 헤테로시클릭 고리에 있게 된다 (식 A 또는 A(i) 또는 A(ii) 에서 보여지는 4 개의 탄소 및 질소). 예를 들어, 본 발명의 화합물은 식 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 을 가질 수 있다.
일부 구현예에서 R5 및 R6 은 함께 4 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하여 (식 I 에서 보여지는 시클릭 질소와 함께), 총 5 개의 원자가 헤테로시클릭 고리에 있게 되고 (식 1 에서 보여지는 4 개의 탄소 및 질소), R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다. R9 는 수소이다.
핵염기
일부 구현예에서 B 는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 크산틴, 하이포크산틴, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵염기이다.
일부 구현예에서 B 는 퓨린 핵염기이다. 일부 구현예에서 염기 (B) 는 피리미딘 핵염기이다. 일부 구현예에서, 염기 (B) 는 아데닌이다. 일부 구현예에서, 염기 (B) 는 티미딘이다. 일부 구현예에서, 염기 (B) 는 구아닌이다. 일부 구현예에서, 염기 (B) 는 시토신이다. 일부 구현예에서, 염기 (B) 가 시토신일 때, 그것은 5-메틸-시토신이다.
올리고뉴클레오티드 합성에서 사용하기 위해서 핵염기 기 (염기) 는 아미다이트 단량체에서 보호될 수 있다 (티미딘은 종종 보호기 없이 사용된다) 는 것이 이해될 것이다. 적합한 보호 기는 디메틸포름아미드 (DMF), 디메톡시트리틸 (DMT) 또는 아실 보호기, 예컨대 이소부티릴 (iBu), 또는 아세틸 보호기 (Ac) 또는 벤조일 보호기 (Bz) 를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 단량체가 L-LNA-G (구아닌) 일 때 핵염기 (염기 (B)) 는 DMF 보호된 구아닌 (G) 이외의 것이다. R3 = 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb, 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
고친화도 단량체
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 뉴클레오시드 (Z) 는 상보적 RNA 표적에 대한 등가 DNA 뉴클레오시드보다 더 높은 결합 친화도를 제공한다. 그러한 뉴클레오시드는 고친화도 뉴클레오시드로서 언급된다. 고친화도 뉴클레오시드의 예는 2'-O-MOE, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 및 LNA 뉴클레오시드를 포함한다. 구현예에서, 뉴클레오시드가 고친화도 뉴클레오시드인 경우에 R3 은, 예를 들어, CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있다.
일부 구현예에서, R2 는 플루오로 (-F), -O-(CH2)2OCH3, 및 -O-C1-3 알킬, 예컨대 -O-CH3 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 그러한 구현예에서, 임의로 R4 는 수소이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드는 2' - 4' 브릿지 (바이라디클 (biradicle)) 를 포함하는 LNA 뉴클레오시드 (또한 바이시클릭 뉴클레오시드로서 알려짐) 이다.
일부 구현예에서, R2 및 R4 는 함께 브릿지 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb) C(RaRb)-O-, -CH2-O-, -CH2 CH2-O-,-CH(CH3)-O- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이가 브릿지를 나타낸다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 이가 브릿지 -CH2-O- (또한 옥시-LNA 로서 알려진 메틸렌-옥시) 또는 -CH(CH3)-O- (메틸-메틸렌-옥시) 를 나타낸다. -CH(CH3)-O- 브릿지는 브릿지 내의 탄소 원자에서 키랄 중심을 도입하며, 일부 구현예에서 이는 S 위치에 존재한다 (예를 들어 기술분야에서 (S)cET 로서 알려진 뉴클레오시드 - EP1984381 참고). 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 이가 브릿지 -CH2-O- 를 나타내며, 여기에서 브릿지는 베타-D 위치 (베타-D-옥시 LNA) 에 존재한다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 이가 브릿지 -CH2-O- 를 나타내며, 여기에서 브릿지는 알파-L 위치 (알파-L-D-옥시 LNA) 에 존재한다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 이가 브릿지 -CH2-S- (티오 LNA), 또는 -CH2-NH2- (아미노 LNA) 를 나타낸다. 구현예에서 R2 및 R4 가 함께 이가 브릿지를 나타내는 경우에, R3 은, 예를 들어 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있다.
일부 구현예에서 뉴클레오시드 (X) 가 바이시클릭 뉴클레오티드 (LNA) 예컨대 베타-D-옥시 LNA 또는 6'메틸 베타-D-옥시-LNA (또한 예를 들어 (S)cET 로서 언급됨) 인 경우에, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소 또는 C1-3 알킬이다. 그러한 구현예에서, R5 및 R6 은 함께 헤테로시클릭 고리, 예컨대 본원에서 기재된 바와 같이 5 원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다.
뉴클레오시드 및 고체 지지체의 5'-OH 기
본 발명에 따른 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 선행하는 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링하는 단계를 포함한다. 선행하는 뉴클레오시드는 고체 지지체 (올리고뉴클레오티드 합성 지지체) 에, 직접 또는 추가의 기타 뉴클레오티드를 통해 부착될 수 있고, 커플링 단계 (i) 전에, 5'-OH 기는, 예를 들어, 3' 보호기 (이는 본원에서 R3, 예컨대 DMTr (-CH2-O-DMTr) 로서 정의될 수 있음) 의 제거를 통해 탈보호될 수 있다. 적합한 올리고뉴클레오티드 지지체는 UnyLinker 모이어티 (참고, Ravikumar et al., Org. Process Res. Dev., 2008, 12 (3), pp 399-410) 또는 뉴클레오시드 3'-숙시네이트 연결을 함유하는 폴리스티렌 또는 조절 공극 유리 지지체를 포함한다:
식에서 Re 는 아릴 또는 C1-10 알킬, 예컨대 페닐, 이소프로필 또는 메틸이고, 고체 원형은 고체 지지체 매트릭스, 예컨대 폴리스티렌 또는 조절 공극 유리를 나타낸다. Re 가 페닐 또는 메틸인 UnyLinker 지지체가 상업적으로 입수가능하고, 올리고뉴클레오티드 합성에서 널리 사용된다.
일부 구현예에서 Re 는 페닐 또는 메틸 이외의 것일 수 있으며, 예를 들어 기타 알킬 또는 아릴 기가 사용될 수 있다.
특정 지지체 매트릭스는 하기를 포함한다:
선행하는 뉴클레오시드는, 그것이 고체 지지체에 커플링된 첫번째 뉴클레오시드일 때 하기와 같이 나타낼 수 있다:
또는, 고체 지지체에 이미 부착된 추가의 선행하는 뉴클레오시드가 존재하는 경우에, 고체 지지체에 부착된 선행하는 뉴클레오티드는 하기와 같이 나타낼 수 있다:
식에서 R2, R4, R3 은 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체에서 정의된 바와 같고, Re 는 아릴 또는 C1-10 알킬, 예컨대 페닐, 이소프로필 또는 메틸이고, Rf 는 H 또는 시아노에틸이고, X 는 O 또는 S 이고, n 은 선행하는 뉴클레오티드의 수를 나타낸다. n 은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 일 수 있다.
차단해제는 커플링 단계 전에, R3 기 (예컨대 DMTr) 의 제거에 의해 3'-OH 기를 남김으로써 수행될 수 있다. 차단해제는 불활성 용매 (예를 들어 디클로로메탄 또는 톨루엔) 중 산, 예컨대 3% 트리클로로아세트산 (TCA) 또는 3% 디클로로아세트산 (DCA) 의 용액을 사용하여 수행될 수 있다. R3 기가 DMTr 기를 함유할 때, 형성된 오렌지색 DMT 양이온은 세척 제거된다; 이 단계는 자유 5'-말단 히드록실 기를 보유하는 고체 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드 전구체를 초래한다:
(오직 예시적 목적을 위함)
커플링 단계
커플링 단계 (i) 은 선행하는 단량체의 5'-OH 기에 대한 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체 (아미다이트) 의 반응을 포함한다. 커플링 단계는 적합한 용매, 예컨대 아세토니트릴에서 및 활성화제의 존재 하에 수행될 수 있다.
(오직 예시적 목적을 위함)
바람직한 구현예에서, 커플링 단계는 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매, 및 임의로 활성화제를 포함하는 아세토니트릴 용매 조성물에서 수행된다. 일부 구현예에서 방향족 헤테로시클릭 용매는 피리딘이다.
커플링 용매
본 발명의 방법에서 사용되는 커플링 용매는 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 염기 용매일 수 있다.
본 발명은 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단, 또는 고체 지지체 (예를 들어 unylinker) 에 부착된 히드록실 기에 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체를 커플링하는 프로세스를 제공하며, 이 방법은 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 또는 고체 지지체를, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체와 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 반응은 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매를 포함하는 아세토니트릴 용매 조성물에서 일어난다.
본 발명은 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단, 또는 고체 지지체 (예를 들어 unylinker) 에 부착된 히드록실 기에 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체를 커플링하는 프로세스를 제공하며, 이 방법은 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 또는 고체 지지체를, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체와 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 반응은 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매, 및 활성화제를 포함하는 아세토니트릴 용매 조성물에서 일어난다.
본 발명은 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체를 본 발명의 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 커플링하는 프로세스를 포함하는 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 제공한다.
본 발명은 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체, 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매를 포함하는 아세토니트릴 용액 조성물을 제공한다.
본 발명은 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체의 용해 방법을 제공하며, 상기 방법은 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매, 및 임의로 활성화제를 포함하는 용매 조성물에 단량체를 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명은 아세토니트릴 중 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트의 안정성 및/또는 용해도를 향상시키기 위한 방향족 헤테로시클릭 용매의 용도를 제공한다.
본 발명은 아세토니트릴 중 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트의 반응성, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 합성 커플링 단계에서의 반응성을 향상시키기 위한 방향족 헤테로시클릭 용매의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 20℃ 에서 물 중 pKa 가 4 - 7 또는 7 - 17 이다.
일부 구현예에서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 방향족 헤테로시클릭 염기이다.
일부 구현예에서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 방향족 헤테로시클릭 산이다.
일부 구현예에서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 피리딘, 2-피콜린, 4-피콜린, 3-피콜린, 루티딘, 및 피롤로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 피리딘, 예컨대 아세토니트릴 중 0.5 내지 5% 피리딘이다.
일부 구현예에서, 아세토니트릴 중 방향족 헤테로시클릭 용매의 농도 (v/v) 는 약 0.1% 내지 약 50% (v/v) 이다.
일부 구현예에서, 아세토니트릴 중 방향족 헤테로시클릭 용매의 농도 (v/v) 는 약 0.5% 내지 약 10%, 예컨대 약 1% 내지 약 5%, 예컨대 약 2 - 3%, 예컨대 약 2.5% 이다.
일부 구현예에서, 활성화제는 N-메틸이미다졸을 포함한다.
일부 구현예에서, 용매 조성물은 N-메틸이미다졸을 0.01 - 약 1 M N-메틸이미다졸, 예컨대 약 0.1 M N-메틸이미다졸의 농도로 포함한다.
일부 구현예에서, 활성화제는 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 테트라졸, 또는 5-(벤질티오)-1H-테트라졸을 포함한다.
일부 구현예에서, 용매 조성물은 약 0.5 - 약 2 M DCI 을 포함한다.
아민 보호에 앞선 황화
커플링 단계 후에, 일부 구현예에서 커플링된 단량체는 황화 반응을 겪는다. 황화는 황화 시약, 예컨대 적합한 용매 예컨대 아세토니트릴 및 임의로 방향족 헤테로시클릭 용매 예컨대 피리딘, 또는 3-메틸피리딘 중 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥시드 또는 페닐 아세틸 다이설파이드, 또는 크산탄 하이드라이드로 처리하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 황화는 아세토니트릴 및 피리딘 중 크산탄 하이드라이드 1:1 v/v 의 0.1 M 용액에서 수행된다. 황화는 전형적으로 실온에서 수행된다.
(오직 예시적 목적을 위함)
대안적으로, 황화는 아민 보호 단계 (ii) 후에 수행될 수 있다.
아민 보호
본 발명의 방법의 단계 (ii) 는 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 것을 포함한다:
(오직 예시적 목적을 위함)
그러므로, 단계 (ii) 는 카르바메이트 전구체 및 단계 (i) 에서 제공되는 커플링된 아민 함유 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를, 키랄 보조물의 질소를 카르바메이트 보호기로 보호하는 것을 허용하는 조건 하에, 예컨대 염기, 예컨대 비-친핵성 염기, 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민을 임의로 함유하는 적합한 용매에서 반응시키는 것을 포함한다.
대안적으로 말하면, 단계 ii) 동안, 카르바메이트 전구체는 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기에 커플링된다. 일부 구현예에서 카르바메이트 전구체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
식에서 Rd 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, R' 는 이탈기, 예컨대 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기이다:
일부 구현예에서, 카르바메이트 전구체는 하기이다:
일부 구현예에서, 카르바메이트 전구체는 하기이다:
일부 구현예에서, 카르바메이트 전구체는 하기이다:
일부 구현예에서, 카르바메이트 전구체는 하기이다:
일부 구현예에서, 카르바메이트 전구체는 하기이다:
카르바메이트 보호된 아민
일부 구현예에서, 아민 카르바메이트 보호기는 하기 식의 치환된 에틸 카르바메이트 보호기이다:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 질소이고, Ra, 및 임의로 존재할 때, Rb, 는 -CN, -SO2Rc, -SiRc 3, -F, -Cl, -CF3, 및 -CO-Rc 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 기이며, 여기에서 Rc 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는 Rb 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, C2-6 알케닐-, C2-6 알키닐-, C3-7 시클로알킬- 및 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택되거나;
또는 Ra 및 Rb 는 함께 플루오레닐 기를 형성한다 (Fmoc 구현예에 의해 예시되는 바와 같음).
일부 구현예에서, Ra, 및 임의로 존재할 때, Rb 는 전자 끄는 기이다. 전자 끄는 기는 베타-제거가 일어나는 것을 허용하여, 키랄 보조물은 알칼리성 조건 하에 탈보호될 수 있다.
일부 구현예에서 Rb 는 수소이다.
일부 구현예에서, 아민 카르바메이트 보호기는 하기 식의 임의로 치환된 2'-술포닐 카르바메이트 보호기이다:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 질소이고, Rc 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
일부 구현예에서 Rb 는 임의로 치환된 C1-10 알킬 또는 아릴 기, 예컨대 페닐이다.
일부 구현예에서 아민 카르바메이트 보호기 [단계 (ii) 에서 언급됨] 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 N 이고, Rd 은 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Rd 는 메틸 치환된 페닐 기이다.
일부 바람직한 구현예에서, 카르바메이트 보호기는 Fmoc 이다:
일부 바람직한 구현예에서, 카르바메이트 보호기는 시아노-에틸 카르바메이트이다:
하기 반응식은 선택된 카르바메이트 전구체와 키랄 보조물 상의 아민 기 사이의 반응을 예시한다:
아민 보호 후의 황화
키랄 보조물의 아민 기의 보호 후에, 아민 보호 전에 수행되지 않는 경우에, 커플링된 및 아민 보호된 단량체는 황화 반응을 겪는다.
황화는 황화 시약, 예컨대 적합한 용매 예컨대 아세토니트릴 및 임의로 방향족 헤테로시클릭 용매 예컨대 피리딘, 또는 3-메틸피리딘 중 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥시드 또는 페닐 아세틸 다이설파이드, 또는 크산탄 하이드라이드로 처리하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 황화는 아세토니트릴 및 피리딘 중 크산탄 하이드라이드 1:1 v/v 의 0.1 M 용액에서 수행된다. 황화는 전형적으로 실온에서 수행된다.
(오직 예시적 목적을 위함)
임의적 캡핑 단계
일부 구현예에서, 캡핑 단계는 단계의 순서 (ii) 및 그 후 (iii) 또는 (iii) 및 그 후 (ii) 와 무관하게 키랄 보조물 아민 보호 단계 (ii) 및 황화 단계 (iii) 에 후속하여 수행된다. 캡핑은 미반응 선행하는 뉴클레오시드 -OH 기가 추가의 사슬 연장으로부터 차단되어 내부 염기 결실 (n-1) 쇼트머 (shortmer) 로 올리고뉴클레오티드의 형성을 방지하는 프로세스이다. 캡핑은 하나 이상의 용매 (전형적으로 아세토니트릴, 피리딘 및/또는 THF) 중 아세트산 무수물 및 N-메틸 이미다졸의 용액을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (i), (ii) 및 (iii) 을 포함하는 연장 사이클 동안 캡핑 단계가 수행되지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 합성 방법 동안 다른 연장 사이클에서 캡핑 단계는 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 캡핑은 황화에 후속하여 수행되며, 그 이유는 황화에 앞서는 캡핑은 올리고뉴클레오티드 내의 포스포디에스테르 연결의 수준의 증가를 초래할 수 있기 때문이다.
추가의 연장 사이클
황화 및 키랄 보조물 아민 보호, 및 임의로 캡핑이 완료되면, 생성물은 올리고뉴클레오티드 합성의 추가의 (사슬 연장) 사이클로 계속될 수 있거나 또는 연장후 탈보호, 키랄 보조물 제거 및 고체 지지체로부터의 절단으로 진행될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 추가의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 연장 사이클을 포함한다. 그러한 연장 사이클은 본 발명의 방법의 단계 (i) - (iii) 또는 하기 본 발명의 방법에서 단계 b) - f) 에 따를 수 있다:
올리고뉴클레오티드 합성 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 제공한다:
a)
차단된 말단 -OH 기 (말단 5'-OH 기) 를 갖는 뉴클레오시드 (선행하는 뉴클레오시드) 를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계;
b)
선행하는 뉴클레오시드의 말단 -OH 기를 차단해제하는 단계;
c)
옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를 선행하는 뉴클레오시드의 미차단된 5'-OH 기에 커플링하는 단계;
d)
옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 단계;
e)
보호 단계 (d) 에 앞서 또는 그에 후속하여 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 인 원자를 황화하는 단계;
f)
임의의 미반응 말단 5'-OH 기를 임의로 캡핑하는 단계, 여기에서 캡핑 단계는 황화 단계 (e) 후에 수행되거나 또는 황화가 단계 (d) 전에 수행되는 구현예에서, 캡핑 단계는 단계 (d) 후에 수행될 수 있다;
g)
임의로 단계 b) - f) 를 반복하는 단계 (추가의 사슬 연장 사이클);
h)
카르바메이트 보호기를 제거하는 단계;
i)
키랄 보조물 기(들)을 제거하는 단계;
j)
고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단계.
여기에서 단계 h), i) 및 j) 는 순차적으로 또는 동시에 수행되거나, 또는 단계 h) 는 키랄 보조물의 제거 및 고체 지지체로부터의 절단 단계 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 단계 b) 내지 f) 는 7 - 25 회, 예컨대 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24 회, 올리고뉴클레오티드 합성에서, 예컨대 7 - 16 회 반복된다. 일부 구현예에서 단계 b)-f) 의 반복은 올리고뉴클레오티드 합성에서 연속적 사이클이다.
일부 구현예에서, 단계 g) 후에 또는 단계 h) 후에, 임의적 아민 세척 단계가 수행된다. 아민 세척 단계는 올리고뉴클레오티드를 절단 단계에서 사용되는 강염기성 조건에 노출시키기에 앞서 올리고뉴클레오티드가 유기 용매 중 약염기의 용액으로 처리되는, 예컨대 아세토니트릴 중 20% 디에틸아민, 또는 1:1 트리에틸아민/아세토니트릴로 처리되는, 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 임의적 절차를 언급한다. 아민 세척은 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단을 수행하지 않고 시아노에틸 포스페이트 보호 기의 제거를 초래한다. 아민 세척을 포함시키는 것의 유익은 시아노에틸 포스페이트 보호기, 및 헤테로시클릭 염기, 특히 티민의 부반응으로 인해 형성되는 원치 않는 시아노에틸 부가물, 예컨대 아크릴로니트릴의 회피를 초래한다. 일부 구현예에서, 키랄 보조물 상의 직교 보호기의 제거 (단계 h) 는, 아민 세척 단계 동안 수행될 수 있고 (즉, 단계 h 는 조합된 아민 세척 및 카르바메이트 탈보호 단계일 수 있다), 시아노에틸 포스페이트 보호기, 및 직교 보호기, 예를 들어 키랄 보조물의 아민 상에 존재하는 시아노에틸 카르바메이트 보호기의 제거 둘 모두를 조합할 수 있다. 일부 구현예에서, 아민 세척은 시아노에틸 보호기, 카르바메이트 보호기 및 키랄 보조물 둘 모두를 제거할 수 있다.
대안적으로, 예컨대 카르바메이트 보호기가 시아노에틸 보호기 이외의 것일 때, 예를 들어 카르바메이트 보호기가 Fmoc 보호기 또는 2'-술포닐 카르바메이트일 때, 카르바메이트 보호기는 아민 세척 단계에 앞서 제거될 수 있다. 대안적으로, 예컨대 카르바메이트 보호기가 시아노에틸 보호기 이외의 것일 때, 예를 들어 카르바메이트 보호기가 Fmoc 보호기 또는 2'-술포닐 카르바메이트일 때, 카르바메이트 보호기는 아민 세척 단계에 후속하여 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 j) 후에 올리고뉴클레오티드는 정제될 수 있다. 정제 단계 i) 는 올리고뉴클레오티드 정제를 위한 임의의 적합한 방법 예컨대 이온 교환 정제 또는 역상 크로마토그래피, 또는 이온 교환 정제와 역상 크로마토그래피 둘 모두를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서 정제는 하기 순차적 단계를 포함한다: a) 이온 교환 정제, b) 예를 들어 투석여과를 통한, 탈염, 그에 뒤이어 c) 동결건조 및 d) 역상 크로마토그래피. 정제에 앞서 암모늄 하이드록사이드가 제거되거나 또는 적어도 희석되는 것이 전형적이다. 대안적으로, DMT-ON 역상 정제 및 그에 뒤이어 탈트리틸화가 또한 올리고뉴클레오티드 정제에 관한 옵션이다 (참고, Capaldi and Scozzari, Chapter 14, Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications, CRC Press 2008).
옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 도입하므로, 본 발명의 방법을 사용하여 입체한정된 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 본 발명은 그러므로 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 개선된 합성 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 입체한정된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 혼입에 더하여, 합성 방법은, 표준 포스포라미다이트 단량체의 사용을 통해, 입체무작위 (stereorandom) 뉴클레오시드간 연결을 혼입시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 그러므로 도입된 단량체의 3' 에 대한 입체한정된 뉴클레오시드간 연결을 초래하는 본 발명에 따른 연장 사이클, 뿐만 아니라 입체무작위 뉴클레오시드간 연결을 도입하는 표준 포스포아미다이트 단량체를 사용하는 기타 연장 사이클을 포함할 수 있다.
도 1, 2 & 3 은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 합성 방법의 예시적 실시예를 제공한다.
카르바메이트 보호기 제거
사슬 연장이 완료되면, 키랄 보조물의 아민 상의 카르바메이트 보호 기가 제거된다. 카르바메이트 보호기의 제거는 선행기술 (Oka et al) 에서 사용되는 방법보다 훨씬 신속하게 및 더 낮은 온도에서 달성될 수 있다. 전형적으로, 약 4 시간 이하면 충분하다. 실시예에서 예시된 바와 같이, 직교 카르바메이트 탈보호는 일상적으로 약 3 시간 미만, 예컨대 2 시간 미만 또는 약 2 시간 예컨대 1 시간 미만 또는 약 1 시간으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호는 약 55℃ 미만, 예컨대 약 50℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 미만, 예컨대 약 30℃ 미만의 온도에서, 예컨대 25℃ 또는 약 25℃ 에서 또는 실온에서 달성된다. 일부 구현예에서 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호는 약 4 시간 미만의 기간에 약 55℃ 미만, 예컨대 약 50℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 미만, 예컨대 약 30℃ 미만의 온도에서, 예컨대 25℃ 또는 약 25℃ 에서 또는 실온에서 달성된다. 일부 구현예에서 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호는 약 2 시간 미만의 기간에 약 55℃ 미만, 예컨대 약 50℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 미만, 예컨대 약 30℃ 미만의 온도에서, 예컨대 25℃ 또는 약 25℃ 에서 또는 실온에서 달성된다. 일부 구현예에서 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호는 약 1 시간의 기간에 약 55℃ 미만, 예컨대 약 50℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 미만, 예컨대 약 30℃ 미만의 온도에서, 예컨대 25℃ 또는 약 25℃ 에서 또는 실온에서 달성된다.
1 포트 프로세스
일부 구현예에서, 카르바메이트 보호기 제거는 전반적 탈보호 및 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단 동안 수행되며 (일어나며), 본원에서 1 포트 프로세스로서 언급된다. 전반적 탈보호 및 절단은, 예컨대 약 55℃ 내지 약 60℃ 에서 암모늄 하이드록사이드를 사용하는, 포스포라미다이트 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 표준 절차를 사용할 수 있다. 전형적으로 물 중 NH3 의 포화 한계에 의해 한정되는 농축 암모늄 하이드록사이드가 사용된다 (~28-35%).
2 포트 프로세스
일부 구현예에서, 카르바메이트 보호기는 전반적 탈보호 (직교 탈보호) 에 앞서 제거된다. 카르바메이트 보호기의 선택적 제거는 전형적으로 유기 용매 중 적합한 염기, 예를 들어 아세토니트릴 중 20% 디에틸아민, 또는 디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘으로 처리하여 달성된다. 그러나, 예를 들어 실릴 카르바메이트의 제거는, 전형적으로 용매 테트라히드로푸란 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 형태의, 플루오라이드 이온에 의한 처리를 통해 달성될 수 있다.
2-포트 또는 3-포트 프로세스 (및 임의로 1 포트 프로세스) 에서 사용되는 카르바메이트 보호기는 키랄 보조물의 제거를 수행하거나 또는 수행하지 않고, 그러나 고체 지지체로부터의 전반적 탈보호/절단을 수행하지 않고 특이적으로 제거 (탈보호) 될 수 있는 직교 보호기이다.
카르바메이트 보호기의 제거에 사용되는 시약은 각각의 특정 카르바메이트 기에 최적화될 수 있다. 예는 N,N-디메틸포름아미드 중 20% 피페리딘 (예를 들어 Fmoc 의 경우에) 또는 아세토니트릴 중 20% 트리에틸아민 또는 디에틸아민 (예를 들어 시아노에틸 카르바메이트의 경우에), 또는 테트라히드로푸란 중 1 M 테트라부틸 플루오라이드 (이는 Si-함유 보호기의 경우에) 에 의한 처리를 포함한다.
예를 들어, 카르바메이트 보호기가 Fmoc 일 때, 피페리딘 용액, 예컨대 DMF 중 20% 피페리딘 (이는 예를 들어 실온에서 1 시간 동안 사용될 수 있음) 과의 반응에 의해 Fmoc 보호기는 키랄 보조물의 질소로부터 직교 제거될 수 있다.
대안적으로, 카르바메이트 보호기시 시아노-에틸 카르바메이트일 때, 그것은, 본원에서 기재된 바와 같은 (참고, 또한 예를 들어, US7186822), 아민 세척을 사용하여 직교 제거될 수 있다. 직교 보호 기, 예컨대 시아노-에틸의 제거를 위한 하나의 바람직한 시약은, 예를 들어 25℃ 에서, 아세토니트릴 중 트리에틸아민 (1:1, v/v), 또는, 예를 들어 25℃ 에서, 아세토니트릴 중 10% 디에틸아민이다.
일부 구현예에서 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호는 약 55℃ 미만, 예컨대 약 50℃ 미만, 예컨대 약 40℃ 미만, 예컨대 약 30℃ 미만의 온도에서, 예컨대 25℃ 또는 약 25℃ 에서 또는 실온에서 달성된다.
카르바메이트 보호기의 직교 제거에 후속하여, 올리고뉴클레오티드는 전반적 탈보호, 키랄 보조물의 절단 및 고체 지지체로부터의 절단을 겪을 수 있다 (2 포트 프로세스로서 언급됨). 제 1 단계 (포트 1) 는 키랄 보조물의 아민으로부터 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호이며, 그에 뒤이어 제 2 단계 (포트 2) 는 전반적 탈보호이다. 전반적 탈보호 및 절단은 포스포라미다이트 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용되는 표준 절차를 사용할 수 있으며, 예컨대 55℃에서 암모늄 하이드록사이드를 사용할 수 있다.
3 포트 프로세스
일부 구현예에서, 카르바메이트 보호기의 직교 제거 후에, 및 전반적 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단에 앞서, 키랄 보조물의 절단 단계가 수행된다. 키랄 보조물의 선택적 제거는 DBU (1,8-디아자바이시클로(5.4.0)운데크-7-엔) (예를 들어 이는 1 시간 동안 실온에서 사용될 수 있다) 로 처리하여 수행될 수 있다. 3 포트 프로세스는 키랄 보조물의 아민으로부터 카르바메이트 보호기의 직교 탈보호의 제 1 단계 (포트 1), 그에 뒤이어 키랄 보조물 기(들)의 제거의 제 2 단계 (포트 2), 그에 뒤이어 전반적 탈보호 및 고체 지지체로부터의 절단의 제 3 단계 (포트 3) 를 포함한다.
2 포트 또는 3 포트 프로세스의 사용은 더욱 신속한 탈보호, 및 더 낮은 온도에서 수행될 수 있는 절단 프로세스를 허용하고, 개선된 올리고뉴클레오티드 순도/품질을 초래할 수 있다. 직교 보호 프로세스 (2 포트 및 3 포트 프로세스) 는 그러므로 트리플루오로아세틸 아민 보호기를 사용하는 선행 기술 프로세스의 비-직교 프로세스와 비교시 유익하다.
3'-LNA 올리고뉴클레오티드
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 합성되는 올리고뉴클레오티드는 LNA 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 뉴클레오시드는 LNA 올리고뉴클레오티드이다. 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명자들은 고체 지지체 (예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같은, UnyLinker 모이어티를 함유하는 지지체) 에 결합된 3' 말단 LNA 를 포함하는 LNA 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체의 UnyLinker 모이어티로부터 전반적 탈보호 및 절단을 위한 조건 하에 약 1 - 약 4 시간에 절단될 수 있다 (예를 들어 약 55℃ - 약 60℃ 에서 암모늄 하이드록사이드) 는 것을 발견했다. 실제로 전반적 탈보호의 약 4 시간 내에, 3' LNA 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-CH2-4' 브릿지를 갖는 LNA 를 포함하는 LNA 올리고뉴클레오티드는 UnyLinker 고체 지지체로부터 효과적으로 절단 및 탈보호될 수 있다.
활성화제
활성화제는 올리고뉴클레오티드 합성의 커플링 단계에 앞서 또는 그 동안 사용되는 시약이며, 포스포라미다이트 단량체를 활성화시켜 단량체를 고체 지지체 또는 올리고뉴클레오티드 사슬에 부착된 5' 말단 기에 커플링시키는 것을 허용한다.
일부 구현예에서, 활성화제는 N-메틸이미다졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화제는 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 테트라졸, 또는 5-(벤질티오)-1H-테트라졸을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화제는 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 테트라졸, 또는 5-(벤질티오)-1H-테트라졸 및 N-메틸이미다졸을 포함한다.
본원에서 개시된 바와 같이, 일부 구현예에서, 커플링 반응 (i) 은 방향족 헤테로시클릭 용매, 및 활성화제를 임의로 포함하는 아세토니트릴 용액에서 수행된다. 일부 구현예에서 방향족 헤테로시클릭 용매는 피리딘이다.
일부 구현예에서, 사용되는 N-메틸이미다졸의 농도는 0.01 M - 약 1 M N-메틸이미다졸, 예컨대 약 0.1 M N-메틸이미다졸이다. 일부 구현예에서, 아세토니트릴 용액은 N-메틸이미다졸을 0.01 M - 약 1 M N-메틸이미다졸, 예컨대 약 0.1 M N-메틸이미다졸의 농도로 포함한다.
일부 구현예에서, 활성화제는 DCI 또는 테트라졸, 또는 5-(벤질티오)-1H-테트라졸이며, 이는 약 0.5 - 약 2 M, 예컨대 약 1 M 의 농도 (예를 들어 아세토니트릴 용액 중) 로 사용될 수 있다.
입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
전형적으로, 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트는 Rp 및 Sp 포스포로티오에이트 연결의 무작위 혼합물 (또한 부분입체이성질체 혼합물로서 지칭됨) 로 합성된다. 본 발명의 방법에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트 연결 중 적어도 하나가 입체한정된 것으로, 즉 올리고뉴클레오티드 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드 분자의 적어도 75%, 예컨대 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 또는 (본질적으로) 전부가 Rp 또는 Sp 인 것으로 제공된다. 입체한정된 올리고뉴클레오티드는 입체한정된 포스포로티오에이트 연결을 적어도 하나 포함한다. 용어 입체한정된은, Rp 또는 Sp 로서 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 정의된 키랄성을 기재하는데 사용될 수 있거나, 또는 상기와 같은 하나 (또는 그 이상의) 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하는데 사용될 수 있다. 입체한정된 올리고뉴클레오티드가 임의의 한 위치에서 소량의 대안적인 입체이성질체를 포함할 수 있다고 인식된다 (예를 들어 Wan 등은 2014 년 11 월 NAR 에서 보고된 갭머 (gapmer) 에 대하여 98% 입체선택성을 보고함).
LNA 올리고뉴클레오티드
LNA 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. LNA 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 올리고뉴클레오티드는, 일반적으로 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2 개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서의 사용을 위하여, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 7 - 30 개의 뉴클레오티드 길이로 합성된다.
본원에서 사용되는, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는, 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상에 인접한 서열에 하이브리드화함으로써, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 이것이 표적 핵산에 대하여 상보적이라는 것으로 정의될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니며, 따라서 siRNA 가 아니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 상보적인 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 전형적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 비제한적인 예로서, LNA 갭머 또는 혼합 윙 (mixed wing) 갭머의 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 믹스머 (mixmer) (LNA 및 비(非)-LNA 뉴클레오티드, 예를 들어 LNA 및 DNA (예를 들어 본원에 참조로서 인용되는 WO2007/112754 참조), 또는 LNA 및 2'-O-MOE 뉴클레오티드, 또는 LNA, DNA 및 2'-O-MOE 뉴클레오티드), 또는 LNA 토탈머 (totalmer) (오로지 LNA 뉴클레오티드 - 예를 들어 본원에 참조로서 인용되는 WO2009/043353 참조) 일 수 있다.
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결" 은, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이, 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합으로 연결시키는 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결은 특히 생체내 사용을 위한 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 유용하며, 뉴클레아제 절단에 대하여 보호하는 역할을 할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 특히 뉴클레아제 내성, 유익한 약물동력학 및 제조 용이성으로 인해 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 의 뉴클레오시드간 연결이, 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트이며, 여기서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 입체한정된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다 (올리고뉴클레오티드 합성 동안 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체의 올리고뉴클레오티드에의 혼입에서 유래함). 추가의 뉴클레오시드간 링커는 WO2009/124238 (본원에 참조로서 인용됨) 에 개시되어 있다.
용어 핵염기에는, 핵산 하이브리드화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만, 핵산 하이브리드화 동안 기능적인 변형된 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵염기 모이어티는 핵염기를 변형시키거나 대체함으로써 변형된다. 이러한 맥락에서, "핵염기" 는, 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 히포잔틴 뿐 아니라, 비(非)자연 발생 변이체를 모두 나타낸다. 상기와 같은 변이체는, 예를 들어 Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 및 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 에 기재되어 있다.
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이며, 본 발명의 목적을 위하여, 자연 발생 및 비자연 발생 뉴클레오티드 둘 모두를 포함한다. 본질적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는, 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트기 (뉴클레오시드에는 존재하지 않음) 를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티, 또는 변형된 뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결에 대한 변형의 도입에 의해, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드/뉴클레오티드와 비교하여 변형된 것이다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "유닛" 또는 "단량체" 로서 호환되게 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형" 은, 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 나타낸다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본원에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "유닛" 또는 변형된 "단량체" 와 호환되게 사용될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 예는 별도의 "올리고머 변형" 섹션 및 이의 하위 섹션에 기재되어 있다.
잠긴 핵산 뉴클레오시드 (LNA)
LNA 뉴클레오시드는, 뉴클레오티드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커기 (바이라디클 또는 브릿지로서 지칭됨) 를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다 (즉, R2 및 R4 가 함께 2가 브릿지를 나타내는 구현예).
이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 브릿지된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA) 으로 칭해진다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 LNA 뉴클레오시드이거나 또는 그것을 포함하며, 예를 들어 단량체는 식 17 또는 식 18 을 가질 수 있다:
식에서 B 는 핵염기를 나타내며; R, R1, R6, R3, R9, R5 는 식 A, A(i), A(ii) 또는 식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 임의의 하나에 따른다.
식 17 의 일부 구현예에서, B 는 DMF 보호된 구아닌 이외의 것이다. 일부 구현예에서 B 는 아데닌 또는 티민이다. 일부 구현예에서 B 는 DMF 보호된 아데닌이다.
X 는 하기로 이루어지는 목록으로부터 선택되는 기를 나타낸다: -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z.
일부 구현예에서, X 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)-, 및 -C(=CRaRb)-.
일부 구현예에서, X 는 -O- 이다.
Y 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기를 나타낸다: -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z.
일부 구현예에서, Y 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, 및 -C(Ra)=N-.
일부 구현예에서, Y 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: -CH2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRb-.
또는 -X-Y- 는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 또는 3 개의 기/원자로 이루어지는 이가 링커 기 (또한 라디클 (radicle) 로서 언급됨) 를 나타낸다.
일부 구현예에서, -X-Y- 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이라디클을 나타낸다: -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-.
일부 구현예에서 -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)- 를 나타낸다.
그리고 Ra 및, 존재할 때 Rb, 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 두 개의 같은 자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에서, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있다.
R10 은 수소일 수 있거나 또는 일부 구현예에서 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 두 개의 같은 자리 치환기는 함께 옥소, 티옥소, 이미노, 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서 R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 및 수소로부터 선택된다.
일부 구현예에서 R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 는 수소 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, 존재할 때, Rb 는 수소 또는 메틸이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소 이외의 것이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 둘 모두는 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -NH-CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2- CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이며, 여기에서 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소 이외의 것, 예컨대 메틸이고, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 이가 링커 기 -O-CH(CH2OCH3)- (2' O-메톡시에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem., 2010, 75 (5), pp 1569-1581) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 이가 링커 기 -O-CH(CH2CH3)- (2'O-에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CHRa- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH2OCH3)- 이고, R10 은 수소이다. 그러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 선행 기술에서 시클릭 MOE (cMOE) 로서 알려져 있고, WO07090071 에서 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 R- 또는 S- 배치의 이가 링커 기 -O-CH(CH3)- 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 함께 이가 링커 기 -O-CH2-O-CH2- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH3)- 이고, R10 은 수소이다. 그러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 또한 선행 기술에서 cET 뉴클레오시드로서 알려져 있고, WO07090071 (베타-D) 및 WO2010/036698 (알파-L) 개시된 바와 같은, (S)cET 또는 (R)cET 입체이성질체일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이며, 여기에서 Ra 또는 Rb 둘 모두 수소가 아니고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, Ra 및 Rb 는 둘 모두 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CHRa- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2-, 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서 바이라디클 -X-Y- 는 -N(-ORa)- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 함께 이가 링커 기 -O-NRa-CH3- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 를 나타낸다. 일부 구현예에서 바이라디클 -X-Y- 는 -N(Ra)- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, R10 은 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다. 그러한 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)- 로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬 예컨대 메틸이다.
다르게 명시되지 않으면, LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 입체동형으로 존재할 수 있다고 이해될 것이다.
실시예에서 예시되는 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이거나 또는 그것을 포함하며, 예컨대 2' - 4' 브릿지가 식 I 에 따르는 경우, 및 X 는 산소이고, Y 는 CH2 이고, R10 은 수소인 경우이다.
DNA 뉴클레오시드
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 DNA 뉴클레오시드이거나 또는 그것을 포함하며, 예를 들어 단량체는 식 19 또는 식 20 을 가질 수 있다:
식에서 B 는 핵염기를 나타내며; R, R1, R6, R3, R9, R5 는 식 A, A(i), A(ii) 또는 식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 임의의 하나에 따른다. 식 20 의 일부 구현예에서, B 는 아데닌, 예컨대 보호된 아데닌, 예컨대 Bz 보호된 아데닌이다.
일부 구현예에서, 옥사자포스폴리딘 포스포라미다이트 단량체는 식 21 및 22 에 따른다:
식에서 염기는 핵염기를 나타내며; R, R1, R3, R9 는 식 A, A(i), A(ii) 또는 식 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 중 임의의 하나에 따른다. 식 20 또는 22 의 일부 구현예에서, B 는 아데닌, 예컨대 보호된 아데닌, 예컨대 Bz 보호된 아데닌이다. 식 19, 20, 21, 또는 22 의 단량체의 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다. 식 19, 20, 21 또는 22 의 단량체의 일부 구현예에서, R3 은 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 이다.
DNA 및/또는 친화도 향상 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다. DNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 오직 DNA 뉴클레오시드를 포함하고, 일부 구현예에서 오직 입체한정된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. DNA 포스포로티오에이트는 예를 들어 18 - 25 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 친화도 향상 뉴클레오시드, 예컨대 본원에서 기재된 LNA 또는 2' 치환된 뉴클레오시드를 포함한다. 친화도 향상 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-MOE 또는 2'-O메틸은 종종 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 다른 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드와의 조합으로, 예를 들어 믹스머 또는 갭머의 형태로 사용되거나, 또는 완전히 당 변형된 올리고뉴클레오티드에서 사용될 수 있으며, 이 경우에 모든 뉴클레오시드는 DNA 또는 RNA 이외의 것이다.
일부 구현예에서 본 발명의 프로세스 또는 방법에 의해 합성되는 올리고뉴클레오티드는 갭머, 및 LNA 갭머, 또는 혼합된 윙 갭머일 수 있다.
갭머
본원에서 사용되는, 용어 갭머는, 하나 이상의 친화도 향상 변형된 뉴클레오시드 (플랭크 (flank)) 에 의해 5' 및 3' 에서 플랭크된, RNase H 동원 올리고뉴클레오티드의 영역 (갭 (gap)) 을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기재되어 있다. 헤드머 (headmer) 및 테일머 (tailmer) 는, 플랭크 중 하나가 결여된, 즉 올리고뉴클레오티드의 말단 중 단지 하나만 친화도 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, RNase H 를 동원할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우에는, 3' 플랭크가 결여되어 있으며 (즉 5' 플랭크는 친화도 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우에는 5' 플랭크가 결여되어 있다 (즉 3' 플랭크는 친화도 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 LNA 갭머는, 친화도 향상 변형된 뉴클레오시드 중 적어도 하나가 LNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
혼합된 윙 갭머
용어 혼합된 윙 갭머는, 플랭크 영역이 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 비(非)-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 하나의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드(들)을 포함하는, LNA 갭머를 나타낸다. 일부 구현예에서, 혼합된 윙 갭머는, LNA 뉴클레오시드 (예를 들어 5' 또는 3') 를 포함하는 하나의 플랭크, 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드(들)을 포함하는 다른 하나의 플랭크 (각각 3' 또는 5') 를 갖는다.
길이
본원에 언급된 뉴클레오티드 분자의 길이를 언급할 때, 길이는, 단량체 유닛이 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체인지 여부에 관계없이, 단량체 유닛, 즉 뉴클레오티드의 수에 해당한다. 뉴클레오티드와 관련하여, 용어 단량체 및 유닛은 본원에서 호환되게 사용된다.
본 발명의 방법은, 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 7 내지 30 개의 뉴클레오티드, 예컨대 7 - 10 개, 예컨대 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 내지 20 개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 18 개의 뉴클레오티드, 예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개의 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 정제에 특히 적합하다.
실시예
우리는 이전에 G 잔기가 아실 보호된 L-LNA-G 단량체는 커플링 용매에서 크게 증가된 용해도 및 안정성을 갖는다고 설명했다 - EP 16161089.4 를 참고하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. EP 16161089.4 의 실시예 1-6 은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
우리는 이전에 단계 (i) 에서 사용되는 커플링 용매에 대한 방향족 헤테로시클릭 용매의 첨가가 커플링 효율을 크게 향상시킨다고 설명했다 - EP 16169429.4 를 참고하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. EP 16169429.4 의 실시예 1-12 는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
1 μmole 규모 합성을 T-숙시네이트 로딩된 CPG 고체 지지체를 사용하여 수행했다. 종래의 5'-디메톡시트리틸-3'-β-시아노에틸 데옥시티미딘 포스포라미다이트를 사용하여, 9 회의 입체무작위 커플링, 그에 뒤이어 식 23 의 데옥시티미딘 포스포라미다이트를 사용하여 1 회의 입체한정된 커플링, 그에 뒤이어 다시 5'-디메톡시트리틸-3'-β-시아노에틸 데옥시티미딘 포스포라미다이트를 사용하여 5 회의 입체무작위 커플링을 수행했다. 모든 합성 단계를 도 1 에 도시된 사이클에 따라, 아래 열거된 시약으로 수행한다. 단일 입체한정된 커플링에서, 황화 단계 후에, 그러나 캡핑 단계에 앞서 합성기에서 디클로로메탄 중 0.5M 9-플루오레닐메틸 N-숙신이미딜 카르보네이트의 용액을 0.5 M 디이소프로필에틸아민의 용액과 다양한 비 (도 4 에 나타낸 바와 같음) 로 혼합한다. 고체 지지체를 그 후에 1 mL 농축 암모늄 하이드록사이드와 혼합하고, 1 h 동안 55℃ 에서 놔두고, 그에 뒤이어 진공 중에서 증발시킨다.
합성 사이클에서 사용되는 시약:
Deblock 디클로로메탄 중 3% 디클로로아세트산 (v/v)
활성화제
아세토니트릴 중 1 M 디시아노이미다졸 및 0,1 M N-메틸이미다졸
Cap A 아세토니트릴 중 20% 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중 40% 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
황화 시약 1 중 0,1 M 크산탄 하이드라이드
맨 아래 크로마토그램에서 합성을 상기와 유사하게 그러나 Fmoc 보호를 수행하지 않고 수행했다. 이 경우에, N-아세틸화된 키랄 보조물을 함유하는 생성물에 해당하는 큰 피크가 존재하는 것이 보인다. Fmoc 보호가 캡핑 전에 도입되는 경우에, 이 피크는 거의 소멸했으며, 이는 Fmoc 보호가 매우 효과적이고, 올리고뉴클레오티드로부터 키랄 보조물의 매우 신속한 절단을 유도했다는 것을 나타낸다. 도 4 참조.
실시예 2: 캡핑에 앞서 Fmoc 보호를 수행하는 및 수행하지 않는 완전히 입체한정된 올리고뉴클레오티드의 합성의 비교
하기 완전히 입체한정된 올리고뉴클레오티드의 1 μmole 합성을 식 23 으로부터의 구조를 갖는 포스포라미다이트를 사용하여 수행했다:
식에서 대문자는 LNA 뉴클레오티드를 나타내고, 소문자는 DNA 뉴클레오티드를 나타내고, 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트의 입체배치가 2 개의 관련 뉴클레오티드 사이에 표시되어 있다. "srP" 는 R-배치 포스포로티오에이트를 나타내고, "ssP" 는 S-배치 포스포로티오에이트를 나타낸다.
사용되는 합성 사이클은 도 1 에 도시된 것이고, 시약은 실시예 1 에서와 동일하다.
4 h 탈보호 후의 결과가 도 5 에서 보여진다.
Claims (44)
- 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서, 상기 방법은 (i) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링시키는 단계, 그에 뒤이어 (ii) 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물의 아민 기를 카르바메이트 보호기로 보호하는 단계, 및 (iii) 황화 단계를 포함하며, 황화 단계 (iii) 는 커플링 단계 (i) 후에 및 아민 보호 단계 (ii) 에 앞서 또는 그에 후속하여 수행되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 황화 단계 (iii) 는 아민 보호 단계에 앞서 수행되는 합성 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 황화 단계 (iii) 는 아민 보호 단계에 후속하여 수행되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 아민 보호 단계 (ii) 에 후속하여 수행되는 캡핑 단계 (iv) 를 추가로 포함하는 합성 방법.
- 제 4 항에 있어서, 캡핑 단계는 황화 단계 (iv) 에 앞서 또는 그에 후속하여 수행되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체 상에서 합성되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 사슬 연장이 완료되면, 아민 카르바메이트 보호기가 고체 지지체로부터의 전반적 올리고뉴클레오티드 탈보호/절단 동안 제거되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 사슬 연장이 완료되면, 아민 카르바메이트 보호기가 고체 지지체로부터의 전반적 탈보호/절단에 앞서 제거되는 합성 방법.
- 제 8 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기가 제거된 후에, 키랄 보조물이 고체 지지체로부터의 전반적 탈보호/절단에 앞서 제거되는 합성 방법.
- 제 8 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기가 제거된 후에, 키랄 보조물이 고체 지지체로부터의 전반적 탈보호/절단 동안 제거되는 합성 방법.
- 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기 제거의 단계는 8 시간 미만 동안 수행되는 합성 방법.
- 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기 제거의 단계는 실온에서 수행되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 에서 사용되는 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 A 를 갖는 합성 방법:
식에서 X 는 뉴클레오시드의 3' 산소이며,
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되며; R9 는 수소이며;
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌, 및 치환된 불소로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R5 및 R6 은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로-알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로-알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 식 A 의 N 원자와 함께, 3 - 16 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성함. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기 [단계 (ii) 에서 언급됨] 는 하기 식의 치환된 에틸 카르바메이트 보호기인 합성 방법:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 질소이고, Ra, 및 임의로 존재할 때, Rb 는 베타-제거를 통해 카르바메이트 보호기의 탈보호를 허용하는 기, 예컨대 -CN, -SO2Rc, -SiRc 3, -F, -Cl, -CF3, 및 -CO-Rc 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 기이며, 여기에서 Rc 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되거나,
또는 Rb 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택됨. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기 [단계 (ii) 에서 언급됨] 는 하기 식의 임의로 치환된 2'-술포닐 카르바메이트 보호기인 합성 방법:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 질소이고, Rc 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되거나;
또는 Rb 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기임. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 카르바메이트 보호기 [단계 (ii) 에서 언급됨] 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 합성 방법:
식에서 N 은 키랄 보조물에 존재하는 N 이고, Rd 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택됨. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 는 카르바메이트 전구체 및 단계 (i) 에서 제공되는 커플링된 아민 함유 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체를, 키랄 보조물의 질소를 카르바메이트 보호기로 치환하는 것을 허용하는 조건 하에, 반응시키는 것을 포함하는 합성 방법.
- 제 17 항에 있어서, 카르바메이트 전구체는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 합성 방법:
식에서 Rd 는 수소, 임의로 치환된 C1-10 알킬-, 임의로 치환된 C2-6 알케닐-, 임의로 치환된 C2-6 알키닐-, 임의로 치환된 C3-7 시클로알킬-, 임의로 치환된 C1-10 알킬옥시 또는 아릴-기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, R' 는 이탈기, 예컨대 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기임
.
- .
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 옥사자포스폴리딘 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 1 또는 2 를 갖는 합성 방법:
식에서 염기는 핵염기이며;
R5 및 R6 은 독립적으로 수소, 알킬, 시클로-알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로-알킬, 치환된 아릴, 및 치환된 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 식 (I) 의 N 원자와 함께, 3 - 16 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하며;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되며; R9 는 수소이며;
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌, 및 치환된 불소로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R3 = 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb, 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3, 및 -O-CH3 로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 각각의 Rm 및 Rn 은 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환된 또는 미치환된 C1-10 알킬이며;
R4 = 는 알킬, 시클로-알킬, 시클로-헤테로알킬, O-알킬, S-알킬, NH-알킬, 및 수소로 이루어지는 군으로부터 선택되거나;
또는 R2 및 R4 는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, O, -Si(Ra)2-, S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 개의 기/원자로 이루어지는 이가 브릿지를 나타내고;
여기에서 Ra 및, 존재할 때 Rb, 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 두 개의 같은 자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에서, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있음. - 제 17 항에 있어서, R4 및 R2 는 수소인 합성 방법.
- 제 17 항에 있어서, 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 3 또는 4 를 갖는 합성 방법:
식에서 염기는 핵염기이고, R, R1, R3, R5, R6 및 R9 는 제 16 항에서 정의된 바와 같음. - 제 17 항에 있어서, 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 5 또는 6 을 갖는 합성 방법:
식에서 염기는 핵염기이고, R, R1, R3, R5, R6 및 R9 는 제 16 항에서 정의된 바와 같음. - 제 17 항에 있어서, 키랄 보조물 포스포라미다이트 단량체는 식 7 또는 8 을 갖는 합성 방법:
식에서 염기는 핵염기이고, R, R1, R3, R5, R6 및 R9 는 제 16 항에서 정의된 바와 같음. - 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 커플링 단계 (i) 는 아세토니트릴 및 방향족 헤테로시클릭 용매, 및 임의로 활성화제를 포함하는 아세토니트릴 용매 조성물에서 수행되는 합성 방법.
- 제 25 항에 있어서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 20℃ 에서 물 중 pKa 가 4 - 7 또는 7 - 17 인 합성 방법.
- 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 방향족 헤테로시클릭 염기인 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 방향족 헤테로시클릭 산인 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 방향족 헤테로시클릭 용매는 피리딘, 2-피콜린, 4-피콜린, 3-피콜린, 루티딘, 및 피롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 아세토니트릴 중 방향족 헤테로시클릭 용매의 농도 (v/v) 는 약 0.1% 내지 약 50% (v/v) 인 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 아세토니트릴 중 방향족 헤테로시클릭 용매의 농도 (v/v) 는 약 0.5% 내지 약 10%, 예컨대 약 1% 내지 약 5%, 예컨대 약 2 - 3%, 예컨대 약 2.5% 인 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화제는 N-메틸이미다졸을 포함하는 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 조성물은 N-메틸이미다졸을 0.01 - 약 1 M N-메틸이미다졸, 예컨대 약 0.1 M N-메틸이미다졸의 농도로 포함하는 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화제는 4,5-디시아노이미다졸 (DCI), 테트라졸, 또는 5-(벤질티오)-1H-테트라졸을 포함하는 합성 방법.
- 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 조성물은 약 0.5 - 약 2 M DCI (또는 제 11 항의 기타 활성화제), 예컨대 약 1 M DCI (또는 제 11 항의 기타 활성화제) 을 포함하는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 커플링, 황화 및 보호 단계, (i), (ii), & (iii) 를 각각 포함하는 적어도 2 개의 합성 사이클을 포함하는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법에 의해 합성되는 올리고뉴클레오티드는 LNA 올리고뉴클레오티드인 합성 방법.
- 제 37 항에 있어서, 3' 가장 마지막의 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드인 합성 방법.
- 제 38 항에 있어서, 고체 지지체로부터의 전반적 탈보호 및 절단의 단계는 8 시간 미만, 예컨대 약 4 시간의 기간 내에 수행되는 합성 방법.
- 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 하기 단계를 포함하는 합성 방법:
a) 고체 지지체 또는 고체 지지체에 부착된 선행하는 뉴클레오시드에 부착된 차단된 말단 -OH 기 (말단 5'-OH 기) 를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계,
b) 말단 -OH 기를 차단해제하는 단계,
c) 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계,
d) 임의로 단계 a) - c) 를 하나 이상의 추가의 사이클 동안 반복하는 단계 (사슬 연장),
e) 카르바메이트 보호기를 제거하는 단계,
f) 키랄 보조물 기(들)을 제거하는 단계,
g) 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하는 단계,
여기에서 단계 e), f) 및 g) 는 순차적으로 또는 동시에 수행되거나, 또는 단계 e) 는 키랄 보조물의 제거 및 고체 지지체로부터의 절단의 단계에 앞서 수행됨. - 입체한정된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 올리고뉴클레오티드의 가닥 절단을 방지하기 위한 키랄 보조물 기 상의 카르바메이트 직교 보호기의 용도.
- 식 21 또는 22 의 화합물:
식에서 X 는 고체 지지체 또는 고체 지지체에 부착된 선행하는 뉴클레오시드 (말단 5'-OH 기) 이며; 염기는 핵염기이며; R, R1, R3, R5, R6 및 R9 는 제 16 항에서 정의된 바와 같고, Z 는 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항의 카르바메이트 보호기임. - 제 42 항에 있어서, 카르바메이트 보호기는 식 21 에 따른 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물.
- 제 42 항 또는 제 43 항에 있어서, R2 및 R4 는 수소이거나 또는 제 18 항, 제 19 항 또는 제 20 항 중 어느 한 항의 키랄 보조물 단량체에서 나타낸 바와 같은 화합물.
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