KR102372122B1 - 아실-보호된 l-lna-구아노신 단량체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 분야, 및 뉴클레오시드 단량체 및 이의 합성 방법에 관한 것이다. 본원에는 개선된 용해성 및 안정성 특성을 갖고, 올리고뉴클레오티드 합성에 있어서 개선된 효능을 유도하는 아실 보호된 L-LNA-G 단량체가 개시되어 있다.

Description

아실-보호된 L-LNA-구아노신 단량체
본 발명은 입체구조 정의된 (stereodefined) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 분야, 및 뉴클레오시드 단량체 및 이의 합성 방법에 관한 것이다. 본원에는 개선된 용해성 및 안정성 특성을 가지며, 따라서 올리고뉴클레오티드 합성에서 개선된 효율을 유도하는, 아실 보호된 L-LNA-G 단량체가 개시되어 있다.
최근, 본 발명자들은, LNA 올리고뉴클레오티드에서의 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 사용이, LNA 올리고뉴클레오티드의 약리학적 프로파일의 최적화를 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 제조는, 현재 입체구조 정의되지 않은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와의 비교 시 상대적으로 비효율적이다. 따라서, 입체구조 정의된 올리고뉴클레오티드의 합성 효율을 개선시킬 필요가 있다.
WO2014/010250 에는, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때 상응하는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 위치에서 키랄 정의된 입체중심을 제공하는, 뉴클레오시드 단량체가 개시되어 있다. LNA 단량체가 고려되었지만, 제조되거나 시험된 경우는 없었다. 본 발명은, 구아닌 단량체 (L-XNA-G 단량체로서 지칭됨) 가 다수의 용매에서 불용성이고/이거나 불안정하다는 놀라운 관찰에 기초한다. 본 발명은, 구아닌 잔기의 환외 (exocyclic) 질소가 표준 DMF 보호기가 아닌 아실 보호기로 보호되어 있는 L-XNA-G 단량체를 제공하는 것에 기초한다. 상기와 같은 단량체는 용액에서 주목할 만한 가용성 및 안정성을 갖는다.
본 발명은 화학식 1, 1a 또는 1b 의 화합물을 제공한다:
Figure 112018102227793-pct00001
[식 중,
Z 는 구아닌 뉴클레오시드이며, 여기서 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하고, 화학식 1 의 환외 산소는 뉴클레오시드 Z 의 3' 탄소에 공유결합으로 부착되어 있고;
R5 및 R6 은 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 화학식 1 의 N 원자와 함께, 탄소수 3 - 16 의 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R9 는 수소이고;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌 및 치환된 플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택됨].
치환되는 경우, R 은 C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다. 다중 치환은, 종속적으로 또는 독립적으로, C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
화학식 1 의 화합물은 화학식 1a 및 화학식 1b 에 제시된 바와 같은, 대안적인 부분입체이성질체이거나, 또는 일부 구현예에서는, 부분입체이성질체의 혼합물일 수 있다.
일부 구현예에서, Z 는 하기와 같다:
Figure 112018102227793-pct00002
[식 중, B 는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하는 구아닌 핵염기 기이고, R2, R3 및 R4 는 본원에 정의된 바와 같음]. 일부 구현예에서, R4 및 R2 는 바이시클릭 뉴클레오시드 (본원에서 LNA 참조) 를 형성하기 위한 바이라디클 (biradicle) 브릿지를 형성한다. 점선은 화학식 1, 1a 또는 1b 의 화합물 내 비(非)시클릭 산소에의 연결을 나타낸다. 대표적인 뉴클레오시드기 Z 는, 3'OH 기가 화학식 1, 1a 및 1b 에 제시된 환외 산소기에의 결합으로 대체된 것을 제외하고는, 본원에 개시된 화학식 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및 74 의 뉴클레오시드에 예시된 바와 같다.
일부 구현예에서, R 이 치환된 아릴인 경우, R 은 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환될 수 있다.
본 발명은 화학식 1 의 화합물 및 용매를 포함하는 용액 (조성물) 을 제공한다. 본 발명은 화학식 1a 의 화합물 및 용매를 포함하는 용액 (조성물) 을 제공한다. 본 발명은 화학식 1b 의 화합물 및 용매를 포함하는 용액 (조성물) 을 제공한다. 용액은 안정한 용액일 수 있으며, 즉 실온에서 적어도 24 시간 동안 안정하다 (예를 들어 실시예 6 에 제공된 검정을 사용함). 일부 구현예에서, 안정한 용액은 24 시간 동안 용액에서 본 발명의 화합물의 어느 정도의 분해를 초래할 수는 있지만, 예를 들어 화합물 1 의 초기 양의 적어도 20% (예컨대, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%) 가 24 시간 후에 용액 중에 존재한다는 것이 인정되어야 한다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 합성 또는 제조에서의 본 발명의 화합물 또는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 화학식 1 (1a) 에 따른 화합물의 합성 방법으로서, 3'-OH 기를 포함하는 구아닌 뉴클레오시드를; 화학식 8 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
Figure 112018102227793-pct00003
[식 중, X 는 할라이드, 예컨대 요오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드이고; 구아닌 뉴클레오시드 상의 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하고, R, R1, R9, R5 및 R6 은 본 발명의 화합물에서와 같으며, 구아닌 뉴클레오시드 상의 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함함].
본 발명은 화학식 1a 및 1b 의 화합물의 혼합물을 제공한다. 본 발명은 화학식 1a 의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 혼합물은 부분입체이성질체 혼합물일 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 단량체, 예컨대 LNA 단량체의 L 및 D 입체이성질형태 (stereoisoform) 의 용해성은, 상이한 용매에서 현저하게 상이한 용해성 및 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서, 본 발명의 화합물 (본 발명의 구아닌 뉴클레오시드 단량체) 을, 고체 지지체에 부착된 -OH 기에 대한 뉴클레오시드의 5'-OH 기에 커플링시키는 단계, 이어서 황화 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 황화 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있는 캡핑 (capping) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 아실 보호기는 사슬 연장이 완료된 후에 후속으로, 예를 들어 전반적인 탈보호 및 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단량체는, 올리고뉴클레오티드 내에 입체구조 정의된 키랄 중심을 도입하기 위하여, 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성에 사용될 수 있다.
도 2: 용매의 선택에 있어서의 다양한 L 및 D 뉴클레오시드 단량체의 용해성.
도 1: 용매의 선택에 있어서의 다양한 L 및 D 뉴클레오시드 단량체 안정성. 3 = 비교적 불안정, 2 = 중간 안정, 1 = 비교적 안정
도 3: 다양한 용매에서 24 시간 후 측정된 L-LNA-G-iBu 단량체 (3a) 및 L-LNA-G-DMF 단량체의 안정성 (실시예 6 참조). 도 3a: i-Bu-대조군은 t = 0 h 에서의 출발 물질 (L-LNA G-i-Bu) 을 나타냄. 도 3b: DMF-대조군은 t = 0 h 에서의 출발 물질 (L-LNA G-DMF) 을 나타냄.
본원에서 사용된 바, 용어 "아릴" 은, 고리를 형성하는 각각의 원자가 탄소 원자인 방향족 고리를 나타낸다. 아릴 고리는 5, 6, 7, 8, 9 또는 9 개 초과의 탄소 원자로 형성된다. 아릴기는 치환되거나 미치환된다. 하나의 양태에서, 아릴은 페닐 또는 나프탈레닐이다. 구조에 따라, 아릴기는 모노라디칼 또는 디라디칼 (즉, 아릴렌기) 일 수 있다. 하나의 양태에서, 아릴은 C6-10 아릴이다. 일부 구현예에서, 아릴은 페닐이다. 치환되는 경우, 아릴은 C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다. 다중 치환은, 종속적으로 또는 독립적으로, C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군; 또는 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있으며, 예컨대 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환된 페닐일 수 있다.
"알킬" 기는, 지방족 탄화수소기를 나타낸다. 알킬 모이어티 (moiety) 는 포화된 알킬기 (이는 임의의 불포화 유닛, 예를 들어 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하지 않는 것을 의미함) 일 수 있거나, 또는 알킬 모이어티는 불포화된 알킬기 (이는 적어도 하나의 불포화 유닛을 함유하는 것을 의미함) 일 수 있다. 포화되거나 불포화된 알킬 모이어티는, 분지형, 직쇄이거나, 또는 시클릭 부분을 포함할 수 있다. 알킬의 부착 지점은, 고리의 일부가 아닌 탄소 원자에 있다. "알킬" 모이어티는 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가질 수 있다 (본원에서 언급되는 경우, "1 내지 10" 과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내 각각의 정수를 나타내며; 예를 들어 "1 내지 10 개의 탄소 원자" 는, 알킬기가 1 개의 탄소 원자, 2 개의 탄소 원자, 3 개의 탄소 원자 등 (10 개의 탄소 원자까지) 으로 이루어질 수 있으나, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬" 의 존재를 포함한다는 것을 의미함). 알킬은 분지쇄 및 직쇄 알킬기를 모두 포함한다. 본원에 기재된 화합물의 알킬기는, "C1-6 알킬" 또는 유사한 지정으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C1-6 알킬" 은, 알킬 사슬에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 탄소 원자가 존재하며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다는 것을 나타낸다. 전형적인 알킬기에는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 알릴, 시클로프로필메틸, 시클로부틸메틸, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸 등이 포함된다. 하나의 양태에서, 알킬은 C1-6 또는 C1-4 알킬, 또는 C1-3 알킬이다. C1-3 알킬기는, 1 내지 3 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. C1-3 알킬기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필 및 이소프로필이다. C1-4 알킬기는, 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬기를 의미한다. C1-4 알킬기의 예는, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 tert-부틸이다.
"알케닐" 기는, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄, 분지형 및 시클릭 탄화수소기이다. 알케닐기는 치환될 수 있다.
"알키닐" 기는, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄, 분지형 및 시클릭 탄화수소기이다. 알키닐기는 치환될 수 있다.
"알콕시" 기는, 산소에 연결된 알킬기, 즉 (알킬)-O- 기를 나타내며, 여기서 알킬은 본원에 정의된 바와 같다. 예에는, 메톡시 (-OCH3) 또는 에톡시 (-OCH2CH3) 기가 포함된다.
"알케닐옥시" 기는, 산소에 연결된 알케닐기, 즉 (알케닐)-O- 기를 나타내며, 여기서 알케닐은 본원에 정의된 바와 같다.
"알키닐옥시" 기는, 산소에 연결된 알키닐기, 즉 (알키닐)-O- 기를 나타내며, 여기서 알키닐은 본원에 정의된 바와 같다.
"아릴옥시" 기는, 산소에 연결된 아릴기, 즉 (아릴)-O- 기를 나타내며, 여기서 아릴은 본원에 정의된 바와 같다. 예에는, 페녹시 (-OC6H5) 기가 포함된다.
"실릴" 은 H3Si- 를 나타낸다. 본원에서 사용된 바, "치환된 실릴" 은, 실릴 치환된 수소를 하나 이상 갖는 모이어티를 나타낸다. 예에는, 비제한적으로, TBDMS (tert-부틸디메틸실릴), TBDPS (tert-부틸디페닐실릴) 또는 TMS (트리메틸실릴) 기가 포함된다.
용어 "할로겐" 은, 플루오린, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "할라이드" 는, 플루오라이드, 브로마이드, 요오다이드 및 클로라이드를 포함한다.
"아실 보호기" 는 아실기 -C(=O)-R7 를 포함하며, 여기서 R7 은 말단기, 예를 들어 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 시클로알킬- 및 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 미치환된 알킬-, 미치환된 알케닐-, 미치환된 알키닐-, 미치환된 시클로알킬- 또는 미치환된 아릴-기로부터 선택되는 기; 또는 치환된 알킬-, 치환된 알케닐-, 치환된 알키닐-, 치환된 시클로알킬- 또는 치환된 아릴-기로부터 선택되는 기이다. 일부 구현예에서, R7 은 미치환된 C1-6-알킬-, 미치환된 C2-6-알케닐-, 미치환된 C2-6-알키닐-, 미치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 미치환된 페닐-기 또는 치환된 C1-6-알킬-, 치환된 C2-6-알케닐-, 치환된 C2-6-알키닐-, 치환된 C3-7-시클로알킬- 또는 치환된 페닐-기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며; 여기서 치환되는 경우, 치환기는, 예를 들어 할로겐, C1-6-알킬, C2-6-알케닐, C2-6-알키닐, C1-6-알콕시, 임의로 치환된 아릴옥시 또는 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 단일 또는 다중 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 아실 보호기는 이소부투릴 (isobuturyl) (-C(O=)CH(CH3)2) (또한 본원에서 iBu 로 지칭됨) 이다. 용어 이소부투릴은 또한 이소부티릴 (isobutyryl) 로 쓰여질 수 있다.
본 발명은, 화학식 1, 예컨대 화학식 1a 또는 1b 의 뉴클레오시드 단량체, 및 뉴클레오시드 단량체를 포함하는 용매 조성물 (용액), 및 올리고뉴클레오티드의 합성에서의 이의 용도를 제공한다.
화학식 1a 의 뉴클레오시드의 R 및 R1 (R/R1) 기는, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 뉴클레오시드의 3' 에 Sp 입체구조 정의된 포스포로티오에이트기의 형성을 유도하는 입체중심 (L) 을 제공한다. 화학식 1a 에 제시된 바와 같은 R 및 R1 기에 의해 형성된 입체중심을 포함하는 단량체는, 본원에서 L 단량체로서 언급되며, 이는 Sp 입체중심의 형성을 유도한다. 일부 구현예에서, 본 발명은, DMF 보호된 구아닌 L 단량체, 예컨대 L-LNA-G 단량체가, 다수의 용매에서 용해되기 어려우며, 심지어 용해되는 경우 너무 불안정하여, 입체구조 정의된 올리고뉴클레오티드를 상업적으로 적절한 규모로 제조하는 능력을 제한한다는 놀라운 관찰에 기초한다. 문제는, 당 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 바이시클릭 뉴클레오시드, 예컨대 L-LNA-G 뉴클레오시드에 비해, L-DNA-G 단량체의 경우에 덜 심각하다. 사실, DMF 보호된 L-LNA-G 및 D-LNA-G (화학식 1 의 입체중심 R/R1 및 R6/R9 의 입체화학이 화학식 1b 에 제시된 바와 같이 반전된 것) 의 용해성을 나란히 비교하면, DMF 보호된 D-LNA-G 는 대부분의 용매에서 가용성이며 안정하고, DMF 보호된 L-LNA-G 는 용해되기가 매우 어렵고, 용액에서 24 시간 미만의 안정성을 갖는다.
화학식 1b 의 뉴클레오시드의 R 및 R1 (R/R1) 기는, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 뉴클레오시드의 3' 에 Rp 입체구조 정의된 포스포로티오에이트기의 형성을 유도하는 입체중심 (D) 를 유도한다. 화학식 1b 에 제시된 바와 같은 R 및 R1 기에 의해 형성된 입체중심을 포함하는 단량체는, 본원에서 D 단량체로서 언급되며, 이는 Rp 입체중심의 형성을 유도한다.
부분입체이성질체의 혼합물
본 발명은 화학식 1a 의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 화학식 1b 의 화합물을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 1% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 2% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 3% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 4% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 5% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 10% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1a 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1b 의 화합물을 20% 초과로 포함하지 않는다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 용액 (조성물)의 형태일 수 있다.
본 발명은 화학식 1b 의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 화학식 1a 의 화합물을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 1% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 2% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 3% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 4% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 5% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 10% 초과로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 (화학식 1b 의 화합물의 몰비로 측정 시) 화학식 1a 의 화합물을 20% 초과로 포함하지 않는다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 용액 (조성물)의 형태일 수 있다.
L-단량체
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 1a 의 화합물을 제공한다:
Figure 112018102227793-pct00004
[식 중,
Z 는 구아닌 뉴클레오시드이며, 여기서 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하고, 화학식 1a 의 환외 산소는 뉴클레오시드 Z 의 3' 탄소에 공유결합으로 부착되어 있고;
R5 및 R6 은 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 화학식 1a 의 N 원자와 함께, 탄소수 3 - 16 의 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R9 는 수소이고;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌 및 치환된 플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택됨].
본원의 기 R, R1, R6, R9 및 R5 의 기재는, L 및 D 입체이성질형태를 모두 포함하여, 본원에 기재된 화합물에 일반적으로 적용될 수 있다.
치환되는 경우, R 은 C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 기로 치환될 수 있다. 다중 치환은, 종속적으로 또는 독립적으로, C1-4 알킬기, C6-14 아릴기, C1-4 알콕시기, C7-14 아르알킬기, C1-4 알킬 C6-14 아릴기, C1-4 알콕시 C6-14 아릴기 또는 C6-14 아릴 C1-4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌 및 치환된 플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이다.
일부 구현예에서, R 이 치환된 아릴인 경우, R 은 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환될 수 있으며, 예컨대 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환된 페닐일 수 있다.
일부 구현예에서, R1 은 수소이다. 일부 구현예에서 R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다. 일부 구현예에서, R1 은 메틸이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
일부 구현예에서, R 은 하기와 같다:
Figure 112018102227793-pct00005
[식 중, G31, G32 및 G33 은 C1-4 알킬, C6-14 아릴C1-4 알콕시, C7-14 아르알킬, C1-4 알킬C6-14 아릴, C1-4 알콕시C6-14 아릴 및 C6-14 아릴C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨].
일부 구현예에서, R 은 하기와 같다:
Figure 112018102227793-pct00006
[식 중, G21, G22 및 G23 은 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 시아노 또는 C1-3 알킬임].
일부 구현예에서, R 은 하기와 같다:
Figure 112018102227793-pct00007
[식 중, G51, G52 및 G53 은 독립적으로 수소, 니트로, 할로겐, 시아노 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 알킬옥시기임].
일부 구현예에서, R5 및 R6 은 함께, (화학식 1 에 제시된 시클릭 질소와 함께) 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 헤테로시클릭 고리는, 예를 들어 3-16 개의 탄소 원자, 예컨대 4 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, R5 및 R6 은 함께, (화학식 1 에 제시된 시클릭 질소와 함께) 헤테로시클릭 고리에 총 5 개의 원자 (화학식 1 에 제시된 질소 및 4 개의 탄소) 를 만들도록 4 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 화학식 2 의 화합물일 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00008
[식 중, R, R1, R9 및 Z 는 본 발명의 화합물에서와 같음].
일부 구현예에서, R5 및 R6 은 함께, (화학식 1 에 제시된 시클릭 질소와 함께) 헤테로시클릭 고리에 총 5 개의 원자 (화학식 1 에 제시된 질소 및 4 개의 탄소) 를 만들도록 4 개의 탄소 원자를 포함하는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소 또는 메틸이다. R9 는 수소이다.
상기 Z 기는, 뉴클레오시드의 3' 산소가 화학식 1 에 제시된 환외 산소인 뉴클레오시드이다. 일부 구현예에서, Z 기는 LNA 뉴클레오시드 모이어티이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 3 의 화합물과 같이 표시될 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00009
[식 중, R, R1, R5, R6 및 R9 는 본 발명의 화합물에서와 같으며;
B 는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하는 구아닌 핵염기 기이고;
R3 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬에닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴 (alkaryl), 아르알킬, O-알카릴, O-아르알킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3 및 -O-CH3 으로 이루어진 군으로부터 선택되고, Rm 및 Rn 은 각각 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환되거나 미치환된 C1-10 알킬이고;
R4 는 알킬, 시클로알킬, 시클로헤테로알킬, O-알킬, S-알킬, NH-알킬 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
R2 및 R4 는 함께, 예컨대 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, O, -Si(Ra)2-, S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 개의 기/원자로 이루어진 2가 브릿지를 나타내고;
여기서, Ra 및, 존재하는 경우, Rb 는 각각, 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 (geminal) 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 뉴클레오시드 (Z) 는 등가의 DNA 뉴클레오시드보다 상보적 RNA 표적에 대하여 보다 높은 결합 친화성을 부여한다. 상기와 같은 뉴클레오시드는 고친화성 뉴클레오시드로 지칭된다. 고친화성 뉴클레오시드의 예에는, 2'-O-MOE, 2'-플루오로, 2'-O-메틸 및 LNA 뉴클레오시드가 포함된다. 구현예에서, 뉴클레오시드가 고친화성 뉴클레오시드인 경우, R3 은, 예를 들어 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있다.
일부 구현예에서, R2 는 플루오로 (-F), -O-(CH2)2OCH3 및 -O-C1-3 알킬, 예컨대 -O-CH3 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기와 같은 구현예에서, 임의로 R4 는 수소이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드는 2' - 4'브릿지 (바이라디클) 을 포함하는 LNA 뉴클레오시드 (또한 바이시클릭 뉴클레오시드로서 공지됨) 이다.
일부 구현예에서, R2 및 R4 는 함께, 브릿지 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb) C(RaRb)-O-, -CH2-O-, -CH2CH2-O-, -CH(CH3)-O- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 브릿지를 나타낸다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 2가 브릿지 -CH2-O- (또한 옥시-LNA 로서 공지되는 메틸렌-옥시) 또는 -CH(CH3)-O- (메틸-메틸렌-옥시) 를 나타낸다. -CH(CH3)-O- 브릿지는 브릿지 내 탄소 원자에 키랄 중심을 도입하며, 일부 구현예에서, 이는 S 위치에 있다 (예를 들어 당업계에 (S)cET 로서 공지된 뉴클레오시드 - EP1984381 참조). 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 브릿지가 베타-D 위치에 있는 2가 브릿지 -CH2-O- (베타-D-옥시 LNA) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 브릿지가 알파-L 위치에 있는 2가 브릿지 -CH2-O- (알파-L-옥시 LNA) 를 나타낸다. 일부 구현예에서, R2 및 R4 는 2가 브릿지 -CH2-S- (티오 LNA), 또는 -CH2-NH2- (아미노 LNA) 를 나타낸다. R2 및 R4 가 함께 2가 브릿지를 나타내는 구현예에서, R3 은, 예를 들어 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있다.
뉴클레오시드 (Z) 가 바이시클릭 뉴클레오티드 (LNA), 예컨대 베타-D-옥시 LNA 인 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소 또는 C1-3 알킬이다. 상기와 같은 구현예에서, R5 및 R6 은 함께 헤테로시클릭 고리, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 5 원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다 (예를 들어 화학식 2 참조).
본 발명의 화합물은 아실 보호된 구아닌 뉴클레오시드 (Z) 를 포함한다.
본 발명의 화합물은, 일부 구현예에서, 화학식 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 의 화합물로 표시될 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00010
Figure 112018102227793-pct00011
Figure 112018102227793-pct00012
Figure 112018102227793-pct00013
Figure 112018102227793-pct00014
Figure 112018102227793-pct00015
Figure 112018102227793-pct00016
[식 중, R, R1, R2, R3, R4, R5, R9 및 R6 은 본 발명의 화합물에서와 같으며, -C(=O)-R7 은 구아닌 염기의 환외 질소 상의 아실 보호기이고, R8 은, 존재하는 경우, 구아닌 환외 산소 상의 보호기임]. 일부 구현예에서, R8 은 시아노에틸이다. 일부 구현예에서, R9 는 수소이다.
본 발명의 화합물의 일부 구현예에서, R7 은 임의로 치환된 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 시클로알킬- 또는 아릴-기로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 임의로 치환된 C1-6-알킬-, C2-6-알케닐-, C2-6-알키닐-, C3-7-시클로알킬- 또는 페닐-기로부터 선택되고; 여기서 치환되는 경우, 치환기는, 예를 들어 할로겐, C1-6-알킬, C2-6-알케닐, C2-6-알키닐, C1-6-알콕시, 임의로 치환된 아릴옥시 또는 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 단일 또는 다중 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 알킬은 분지형 알킬, 예컨대 C3-10 또는 C3-6 분지형 알킬이다.
일부 구현예에서, R7 은 분지형 알킬, 예컨대 치환되거나 미치환된 분지형 알킬, 예컨대 이소-프로필, 이소-부틸, sec-부틸 및 tert-부틸이다. 일부 구현예에서, R7 은 이소-프로필이다.
일부 구현예에서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기 (예를 들어 -C(=O)-R7) 는, 이소부투릴 (iBu), 아세틸 (Ac), 페녹시아세틸 (PAC), p-이소프로필페녹시아세틸 (iPrPAC), 페닐아세틸, 이소프로필옥시아세틸, 메톡시아세틸, 벤조일, p-메톡시페닐아세틸, 디페닐아세틸, 시클로헥실카르보닐, 1,1-디메틸프로파노일 및 p-tert-부틸-페녹시아세틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기는, 이소부투릴 (iBu), 아세틸 (Ac), 페녹시아세틸 (PAC) 및 p-이소프로필페녹시아세틸 (iPrPAC) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기는 이소부투릴 (iBu) 말단기이다.
R2 및 R4 가 함께 2가 브릿지를 나타내는 구현예에서, R3 은 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 일 수 있고, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기 (예를 들어 -C(=O)-R7) 는 이소부투릴 (iBu) 이고, R 은 페닐일 수 있고, R1 은 수소 또는 메틸일 수 있고, R5 및 R6 은 함께, 화학식 2 에 제시된 바와 같은 5 원 헤테로사이클을 형성한다.
본 발명의 화합물은, 일부 구현예에서, 화학식 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 61 의 화합물로 표시될 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00017
Figure 112018102227793-pct00018
[식 중, R3 및 R8 (존재하는 경우) 은 본 발명의 화합물에서와 같음]. 일부 구현예에서, R3 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어진 군으로부터 선택되고, R8 (존재하는 경우) 은 시아노에틸일 수 있고; 여기서 Ra 및 Rb 는 본 발명의 화합물에서와 같다.
일부 구현예에서, 본 발명은 화학식 75, 76 및 77 중 어느 하나에 따른 화합물을 제공한다:
Figure 112018102227793-pct00019
일부 구현예에서, 화학식 75, 76 및 77 의 화합물은 (수소가 아니라) 메틸인 R1 을 가질 수 있다고 인식될 것이다.
용매 조성물
본 발명은 본 발명의 화합물 및 용매, 예컨대 극성 비(非)양성자성 용매를 포함하는 용매 조성물을 제공한다. 적합하게는, 본 발명의 화합물은 용매에 가용성이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 용액을 제공한다. 용액은 안정한 용액일 수 있다. 안정한 용액, 즉 본 발명의 화합물은 용매에 가용성이고, 실온에서 (예를 들어 20℃) 적어도 24 시간 동안 안정하다. 실시예는 본 발명의 화합물을 포함하는 용액 조성물의 용해성 및 안정성을 측정하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 용액 (예를 들어 용액 조성물) 중 본 발명의 화합물의 안정성은, 실시예 6 에 제공된 안정성 측정 검정 (Stability Determination Assay) (전형적으로 실온에서, 예컨대 20 - 25℃ 수행됨) 을 사용하여 24 시간 후 측정 시, 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 30%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75% 이다. 24 시간 후에 안정성을 나타내는, 용액에 용해된 본 발명의 화합물을 포함하는 상기와 같은 용액 (즉 실시예 6 의 안정성 측정 검정을 사용하여 측정 시, 24 시간 후 남아있는 화합물의 양이, 적어도 약 20%, 예컨대 적어도 약 30%, 예컨대 적어도 약 40%, 예컨대 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 예컨대 적어도 약 70%, 예컨대 적어도 약 75% 임) 은, 본원에서 안정한 용액으로 언급된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 용매, 예컨대 본원에 언급된 것들을 포함하는 안정한 용액을 제공한다.
일부 구현예에서, 용매는 극성 용매이다. 일부 구현예에서, 용매는 비양성자성 용매이다.
일부 구현예에서, 용매는 아세토니트릴, DMF, DMSO, 디옥산, 테트라히드로푸란, 디클로로메탄 및 디클로로에탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 용매 아세토니트릴 또는 디옥산이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 용매는 아세토니트릴 및 아세톤을, 예를 들어 약 1:1 비로 포함한다.
일부 구현예에서, 용매는 DMSO 또는 DMF 이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 용매는 테트라히드로푸란이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 용매는 디클로로메탄 또는 디클로로에탄이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 용매는 톨루엔 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 용매는 톨루엔을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 용매는 DMSO 또는 DMF 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 용매는 DMSO 또는 DMF 를 포함하지 않는다.
본 발명의 화합물의 합성 방법
본 발명은 본 발명의 화합물의 합성 방법으로서, 3'-OH 기를 포함하는 구아닌 뉴클레오시드 (Z) 를; 화학식 4 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
Figure 112018102227793-pct00020
[식 중, X 는 할로, 예컨대 브로마이드, 클로라이드 또는 요오다이드이고, R, R1, R5, R6 및 R9 는 본 발명의 화합물에서와 같으며;
구아닌 뉴클레오시드 상의 구아닌 핵염기 기는, 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기, 예컨대 아실 보호기 -C(=O)-R7 을 포함함].
일부 구현예에서, 화학식 4 의 화합물은 화학식 5, 6, 7 및 8 로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112018102227793-pct00021
[식 중, X 는 할로, 예컨대 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드임].
일부 구현예에서, 화학식 4 또는 5 의 X 는 클로라이드이다. 하기는 화학식 4, 5, 6, 7 및 8 의 화합물에 임의로 적용될 수 있다:
일부 구현예에서, R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌 및 치환된 플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이다.
일부 구현예에서, R 이 치환된 아릴인 경우, R 은 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환될 수 있으며, 예컨대 할라이드, 예컨대 요오다이드, 플루오라이드, 브로마이드 또는 클로라이드로 치환된 페닐일 수 있다.
일부 구현예에서, R1 은 수소이다. 일부 구현예에서, R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다. 일부 구현예에서, R1 은 메틸이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 수소이다.
일부 구현예에서, R 은 아릴, 예컨대 페닐이고, R1 은 C1-3 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이다.
일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 수소이고, X 는 브롬이고, R5 및 R6 은 함께 5 원 헤테로사이클을 형성한다. 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 메틸이고, X 는 브롬이고, R5 및 R6 은 함께 5 원 헤테로사이클을 형성한다. 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 수소이고, X 는 염소이고, R5 및 R6 은 함께 5 원 헤테로사이클을 형성한다. 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 메틸이고, X 는 염소이고, R5 및 R6 은 함께 5 원 헤테로사이클을 형성한다.
화학식 4, 또는 화학식 5, 6, 7 또는 8 의 화합물은, 본 발명의 화합물의 합성 방법에 사용될 수 있는 중간체 화합물이며, 따라서 본 발명은 화학식 4, 5, 6, 7 또는 8 의 화합물, 및 뉴클레오시드 단량체, 예컨대 아실 보호된 L-XNA-G, 예컨대 아실 보호된 L-LNA-G 단량체의 합성에서의 이의 용도를 제공한다.
화학식 4 의 중간체 화합물 (예컨대 화학식 5, 6, 7 및 8 의 화합물) 은, 화학식 9 또는 화학식 9a 의 화합물을, 포스포러스 트리할라이드, 예컨대 PCl3, PBr3 또는 PI3, 예컨대 PCl3 와 반응시키는 예비단계 (단계 A) 로 제조될 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00022
[식 중, R, R1, R5, R9 및 R6 은 본 발명의 화합물에서와 같음].
화학식 9 또는 9a 의 화합물과 포스포러스 트리할라이드 사이의 반응은, 전형적으로 3차 비(非)친핵성 염기, 예컨대 N-메틸모르폴린 (NMM), 트리에틸아민, 피리딘, N-메틸이미다졸, 또는 1,4-디아자바이시클로[2.2.2]옥탄 존재 하에서 수행되고, 용매, 예컨대 톨루엔, THF, 디옥산, 디에틸에테르 또는 벤젠, 예컨대 THF 또는 톨루엔 중에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 3차 비친핵성 아민은 NMM 이고, 용매는 톨루엔 또는 THF 이다.
화학식 9 또는 9a 의 일부 구현예에서, R 은 페닐이고, R1 은 수소이다. 일부 구현예에서, R 은 페닐이고. R1 은 메틸이다.
본 발명은 화학식 4, 5, 6, 7 또는 8 의 화합물의 합성 방법 (이는 본원에 기재된 일부 구현예에서 단계 A 로서 지칭될 수 있음) 을 제공한다.
상기 방법은, 화학식 9 또는 9a 의 화합물을; 포스포러스 트리할라이드 (화학식 4 및 5* 의 화합물을 제조하기 위하여), 예컨대 포스포러스 트리클로라이드 (화학식 6* 의 화합물을 제조하기 위하여), 포스포러스 트리요오다이드 (화학식 7* 의 화합물을 제조하기 위하여), 또는 포스포러스 트리브로마이드 (화학식 8* 의 화합물을 제조하기 위하여) 의 용매 (예를 들어 톨루엔) 용액과, 0℃ 미만의 온도에서 반응시켜, 화학식 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 의 화합물을 제조하는 단계를 포함한다. 용매는, 예를 들어 톨루엔, THF, 디옥산, 디에틸에테르 또는 벤젠, 예컨대 THF 또는 톨루엔으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전구체 9a 는 어떠한 포스포러스 트리할라이드가 사용되는 지에 따라, 화학식 5, 6, 7, 8 또는 9 의 중간체를 제조하는데 사용될 수 있다고 인식될 것이다 (화학식 5, 6, 7 및 8 과 관련하여 * 로 표시됨). 따라서, 포스포러스 트리할라이드와 화학식 9 또는 9a 의 화합물의 반응은, 화학식 4, 5, 6, 7 또는 8 의 중간체 화합물을 형성한다.
일부 구현예에서, 화합물 9 (또는 9a) 와 포스포러스 트리할라이드의 반응은, 약 마이너스 45℃ 내지 약 마이너스 65℃, 예컨대 약 마이너스 50℃ 내지 약 마이너스 60℃, 예컨대 약 마이너스 55℃ 의 온도에서 수행된다. 용어 "약" 은, 제시된 특정 정수 값을 포함한다.
일부 구현예에서, 포스포러스 트리할라이드, 예컨대 PCl3 은, 화학식 9 또는 9a 의 화합물보다 크지 않은 몰 농도로 사용된다. 일부 구현예에서, 포스포러스 트리할라이드의 몰량과 비교하여, 화학식 9 또는 9a 의 화합물의 몰 과량이 단계 A 에서 사용된다. 일부 구현예에서, 단계 A 에서 포스포러스 트리할라이드에 대한 화학식 9 또는 9a 의 전구체 화합물의 몰비는, 약 1 초과, 예컨대 1.05 초과이다. 일부 구현예에서, 단계 A 에서 포스포러스 트리할라이드에 대한 화학식 9 또는 9a 의 전구체 화합물의 몰비는, 1.5 보다 크지 않다.
합성 이후에, 화학식 4, 5, 6, 7 또는 8 의 화합물은, 본원에서 단계 B 로서 지칭될 수 있는 후속 합성 단계에서의 사용을 위하여, 예컨대 진공에서 건조되고, 임의로 용매, 예컨대 톨루엔, THF, 디옥산, 디에틸에테르 또는 벤젠, 예컨대 THF 또는 톨루엔 중에 재용해될 수 있다.
본 발명은 화학식 3 의 화합물의 합성 방법 (이는 본원에 기재된 일부 구현예에서 단계 B 로서 지칭될 수 있음) 을 제공한다.
상기 방법은, 화학식 4 의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것으로,
Figure 112018102227793-pct00023
[식 중, X 는 할로, 예컨대 브로마이드, 요오다이드 또는 클로라이드 (예컨대 화학식 5, 6, 7 또는 8 의 화합물) 이고, R, R1, R5, R9 및 R6 은 본 발명의 화합물에서와 같음],
화학식 4 의 화합물을 화학식 X 의 뉴클레오시드와,
Figure 112018102227793-pct00024
[식 중, R2, R3 및 R4 는 본 발명의 화합물에서와 같음];
용매, 예컨대 톨루엔, THF, 디옥산, 디에틸에테르 또는 벤젠, 예컨대 THF 또는 톨루엔 중에서; 0℃ 미만의 온도에서 반응시켜, 화학식 3 의 화합물을 제조하는 것을 포함한다:
Figure 112018102227793-pct00025
.
일부 구현예에서, 상기 단계의 반응은 유기 염기, 예컨대 3차 비(非)친핵성 아민 염기, 예컨대 n-메틸모르폴린 및 트리에틸아민 존재 하에서 수행된다.
일부 구현예에서, 화학식 4 (또는 화학식 5, 6, 7 또는 8) 의 화합물과 뉴클레오시드 X 의 반응은, 약 마이너스 60℃ 내지 약 마이너스 80℃, 예컨대 약 마이너스 65℃ 내지 약 마이너스 75℃, 예컨대 약 마이너스 77℃ 의 온도에서 수행된다. 용어 "약" 은 제시된 특정 정수 값을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 B 에서 사용되는 화학식 4 (또는 화학식 5, 6, 7 또는 8) 의 화합물과 뉴클레오시드 X 의 몰 농도비는, 적어도 2, 예컨대 약 2 내지 약 4, 예컨대 약 2 내지 약 3 이다. 일부 구현예에서, 화학식 4 (또는 화학식 5, 6, 7 또는 8) 의 화합물은 화학식 X 의 화합물에 비해 몰 과량으로 사용된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드 X 의 용액은 화학식 4 (또는 화학식 5, 6, 7 또는 8) 의 화합물의 용액에 점진적으로, 즉 단일 첨가 단계가 아닌 것으로, 예컨대 적어도 15 초, 예컨대 적어도 30 초의 기간에 걸쳐, 예컨대 적어도 1 분, 예컨대 적어도 90 초, 예컨대 적어도 2 분, 예컨대 5 내지 30 분, 예컨대 10 내지 20 분, 예컨대 약 15 분의 기간에 걸쳐 첨가된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오시드는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112018102227793-pct00026
[식 중, B, R2, R3, R4 는 본원에 정의된 바와 같음].
일부 구현예에서, 단계 B 에서의 반응은 염기 및 용매 존재 하에서 일어난다. 일부 구현예에서, 염기는 유기 염기, 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기이다. 일부 구현예에서, 용매는 톨루엔 또는 테트라히드로푸란 (임의로 피리딘을 추가로 포함) 이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 극성 비양성자성 용매이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 아세토니트릴, DMF, DMSO, 디옥산, 테트라히드로푸란, N-메틸-2-피롤리돈, 디클로로메탄 및 디클로로에탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 테트라히드로푸란 (THF) 이거나 이를 포함하고, 염기는 트리메틸아민이다. 일부 구현예에서, 단계 B 에서의 반응은 0℃ 미만, 예컨대 -10℃ 미만, 예컨대 -20℃ 미만, 예컨대 -30℃ 미만, 예컨대 -40℃ 미만, 예컨대 -50℃ 미만, 예컨대 -60℃ 미만, 예컨대 -70℃ 미만, 예컨대 -75 내지 -80℃, 예컨대 약 -77℃ 의 온도에서 일어난다. "약" 은 언급된 정확한 정수를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식 X 의 화합물은 화학식 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 및 71 의 화합물로부터 선택된다:
Figure 112018102227793-pct00027
Figure 112018102227793-pct00028
[식 중, R2, R3, R4, R7 및 R8 은 본 발명의 화합물에서와 같음].
일부 구현예에서, 화학식 X 의 화합물은 화학식 72, 73 또는 74 의 화합물일 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00029
본 발명은 후속 단계 A 및 B 를 포함하는 화학식 1 의 화합물 (예를 들어 화학식 3 의 화합물) 의 합성 방법을 제공한다. 방법의 일례로서, 단계 A 및 단계 B 는 하기 반응식에 제시된 바와 같고, 여기서 R 및 R1 은 본 발명의 화합물에서와 같으며, PX3 은 포스포러스 할라이드이고, X 는 할라이드, 예컨대 요오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드이고, B 는 본 발명의 아실 보호된 구아닌 핵염기이다.
Figure 112018102227793-pct00030
올리고뉴클레오티드 합성
본 발명은 올리고뉴클레오티드의 합성에서의, 본 발명에 따른 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 용매 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 뉴클레오시드 단량체는, 올리고뉴클레오티드 합성을 통해 올리고뉴클레오티드에 혼입될 때, 혼입된 뉴클레오시드의 3' 에 Sp 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 형성을 유도한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 L-LNA-G 단량체는 임의의 적합한 올리고뉴클레오티드 합성 방법, 예컨대 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성을 통해 올리고뉴클레오티드에 혼입될 수 있다. 본 발명의 L-LNA-G 단량체는 포스포르아미다이트이다. 일부 구현예에서, L-LNA-G 단량체는 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성 동안 올리고뉴클레오티드에 혼입된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 LNA 올리고뉴클레오티드는, 적어도 1 개의 G 단량체, 예컨대 적어도 2 개의 G 단량체, 예컨대 적어도 3 개의 G 단량체, 예컨대 적어도 4 개의 G 단량체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 다수의 디자인이 공지되어 있으며, 본 발명의 방법은, 예를 들어 LNA 갭머 (gapmer), 믹스머 (mixmer), 토탈머 (totalmer) 및 TINY LNA 를 제조하는데 사용될 수 있다.
하기 그림은 하기 예시되는 바와 같은 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 사용될 수 있는 산화, 캡핑 및 탈보호의 반복 사이클의 도식적 표현을 나타낸다:
Figure 112018102227793-pct00031
또는
Figure 112018102227793-pct00032
올리고뉴클레오티드의 제조 방법은 임의의 적합한 올리고뉴클레오티드 합성 방법, 예컨대 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드 합성을 이용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성은 고체 지지체, 예컨대 유니링커 (unylinker) 지지체 상에서 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성은 커플링, 산화, 캡핑 및 탈보호의 순차적 단계에 의해 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 합성되면, 임의의 잔류 보호기 (예를 들어 -C(=O)-R7 및, 존재하는 경우, R8) 가 제거될 수 있고, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 60℃ 에서 NH4OH 를 사용하여 고체 지지체로부터 유리될 수 있다.
입체구조 정의된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드
전형적으로, 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트는 Rp 및 Sp 포스포로티오에이트 연결의 랜덤 혼합물 (또한 부분입체이성질체 혼합물로서 지칭됨) 로 합성된다. 본 발명의 방법에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트 연결 중 적어도 하나가 입체구조 정의된 것으로, 즉 올리고뉴클레오티드 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드 분자의 적어도 75%, 예컨대 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%, 또는 (본질적으로) 전부가 Rp 또는 Sp 인 것으로 제공된다. 입체구조 정의된 올리고뉴클레오티드는 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 연결을 적어도 하나 포함한다. 용어 입체구조 정의된은, Rp 또는 Sp 로서 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결의 정의된 키랄성을 기재하는데 사용될 수 있거나, 또는 상기와 같은 하나 (또는 그 이상의) 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하는데 사용될 수 있다. 입체구조 정의된 올리고뉴클레오티드가 임의의 한 위치에서 소량의 대안적인 입체이성질체를 포함할 수 있다고 인식된다 (예를 들어 Wan 등은 2014 년 11 월 NAR 에서 보고된 갭머에 대하여 98% 입체선택성을 보고함).
LNA 올리고뉴클레오티드
LNA 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. LNA 올리고뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 올리고뉴클레오티드는, 일반적으로 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 2 개 이상의 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 분자로서 정의된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서의 사용을 위하여, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 7 - 30 개의 뉴클레오티드 길이로 합성된다.
본원에서 사용된 바, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는, 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상에 인접한 서열에 하이브리드화함으로써, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 이것이 표적 핵산에 대하여 상보적이라는 것으로 정의될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니며, 따라서 siRNA 가 아니다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 상보적인 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 전형적으로 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하고, 비제한적인 예로서, LNA 갭머 또는 혼합 윙 (mixed wing) 갭머의 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 믹스머 (LNA 및 비(非)-LNA 뉴클레오티드, 예를 들어 LNA 및 DNA (예를 들어 본원에 참조로서 인용되는 WO2007/112754 참조), 또는 LNA 및 2'-O-MOE 뉴클레오티드, 또는 LNA, DNA 및 2'-O-MOE 뉴클레오티드), 또는 LNA 토탈머 (오로지 LNA 뉴클레오티드 - 예를 들어 본원에 참조로서 인용되는 WO2009/043353 참조) 일 수 있다.
용어 "변형된 뉴클레오시드간 연결" 은, 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이, 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유결합으로 연결시키는 포스포디에스테르 (PO) 연결 이외의 연결로서 정의된다. 변형된 뉴클레오시드간 연결은 특히 생체내 사용을 위한 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는데 유용하며, 뉴클레아제 절단에 대하여 보호하는 역할을 할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결은 특히 뉴클레아제 내성, 유익한 약물동력학 및 제조 용이성으로 인해 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열 중 적어도 70%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90% 의 뉴클레오시드간 연결이, 포스포로티오에이트이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 모든 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트이며, 여기서 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결 중 적어도 하나는 입체구조 정의된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다 (올리고뉴클레오티드 합성 동안 본 발명의 아실 보호된 L-XNA-G 단량체의 올리고뉴클레오티드에의 혼입에서 유래함). 추가의 뉴클레오시드간 링커는 WO2009/124238 (본원에 참조로서 인용됨) 에 개시되어 있다.
용어 핵염기에는, 핵산 하이브리드화에서 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 (예를 들어 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘 (예를 들어 우라실, 티민 및 시토신) 모이어티가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 핵염기는 또한 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만, 핵산 하이브리드화 동안 기능적인 변형된 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵염기 모이어티는 핵염기를 변형시키거나 대체함으로써 변형된다. 이러한 맥락에서, "핵염기" 는, 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 히포잔틴 뿐 아니라, 비(非)자연 발생 변이체를 모두 나타낸다. 상기와 같은 변이체는, 예를 들어 [Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 [Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1] 에 기재되어 있다.
뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록이며, 본 발명의 목적을 위하여, 자연 발생 및 비자연 발생 뉴클레오티드 둘 모두를 포함한다. 본질적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는, 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트기 (뉴클레오시드에는 존재하지 않음) 를 포함한다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 리보오스 당 모이어티, 핵염기 모이어티, 또는 변형된 뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오시드간 연결에 대한 변형의 도입에 의해, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드/뉴클레오티드와 비교하여 변형된 것이다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "유닛" 또는 "단량체" 로서 교환가능하게 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바, 용어 "변형된 뉴클레오시드" 또는 "뉴클레오시드 변형" 은, 당 모이어티 또는 (핵)염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입에 의해, 등가의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드와 비교하여 변형된 뉴클레오시드를 나타낸다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본원에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "유닛" 또는 변형된 "단량체" 와 교환가능하게 사용될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 예는 별도의 "올리고머 변형" 섹션 및 이의 하위 섹션에 기재되어 있다.
아실 보호된 환외 질소
구아닌의 환외 질소기는 하기 예시된 바와 같다 (원형으로 표시됨). 이러한 기는 본 발명의 화합물에서 아실기에 의해 보호된다. 산소기는 임의로 또한 보호될 수 있다.
Figure 112018102227793-pct00033
L-XNA-G 단량체
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 DNA 또는 RNA 이외의 뉴클레오시드 모이어티 (Z) 를 포함하며, 상기와 같은 단량체는 L-XNA-G 단량체로서 지칭된다. L-XNA-G (및 L-LNA-G) 에서 주석 "L" 은, 화학식 1, 2 및 3 에 제시된 바와 같이, 입체중심 R/R1 (및 R9 위치, 예컨대 R6/R9 위치에서의 입체중심) 에서의 입체화학을 나타낸다. 대안적인 입체이성질체, D-형태는 R/R1 및 R9 입체중심에서 반전된 (reverse) 입체화학을 갖는다. DNA 및 RNA 이외의 뉴클레오시드는 뉴클레오시드 유사체로서 지칭될 수 있다. 뉴클레오시드는 고친화성 뉴클레오시드 (고친화성 뉴클레오시드 유사체) 일 수 있다. 상기와 같은 단량체에는, 비제한적으로, LNA 단량체 (L-LNA-G 단량체) 뿐 아니라, 2' 치환된 뉴클레오시드, 예컨대 2'-O-MOE, 2'-플루오로 또는 2'-O메틸이 포함된다. 다른 2' 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 일부는 본원에서 R2 의 정의 하에 열거되어 있다.
LNA G 단량체
용어 LNA-G 는, 구아닌 핵염기 및 푸라노오스 고리에 2'-4' 바이라디칼을 포함하는 뉴클레오시드를 나타낸다. 본 발명은 비시클릭 질소기가 아실 보호기의 사용에 의해 보호된, L-LNA-G 단량체를 제공한다. 임의로, G 잔기의 산소 원자는 또한 보호된다.
잠금 핵산 뉴클레오시드 (Locked Nucleic Acid Nucleoside (LNA))
LNA 뉴클레오시드는, 뉴클레오티드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커기 (바이라디클 또는 브릿지로서 지칭됨) 를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다 (즉, R2 및 R4 가 함께 2가 브릿지를 나타내는 구현예).
이러한 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 브릿지된 핵산 또는 바이시클릭 핵산 (BNA) 으로 칭해진다.
일부 구현예에서, 본 발명의 단량체는 LNA 뉴클레오시드이거나 이를 포함하며, 예를 들어 본 발명의 화합물은 화학식 I 또는 II 일 수 있다:
Figure 112018102227793-pct00034
주석 Z 는, 본 발명의 화합물의 아실 보호된 구아닌 뉴클레오시드 (Z) 를 나타내며 - 이는 예시적인 목적으로 포함된다.
B 는 아실 보호된 구아닌 핵염기를 나타내고; R, R1, R6, R3, R9, R5 는 본 발명의 화합물에서와 같다.
X 는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z 로 이루어진 목록으로부터 선택되는 기를 나타낸다.
일부 구현예에서, X 는 -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)- 및 -C(=CRaRb)- 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, X 는 -O- 이다.
Y 는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z 로 이루어진 군으로부터 선택되는 기를 나타낸다.
일부 구현예에서, Y 는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)- 및 -C(Ra)=N- 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, Y 는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRb- 로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
-X-Y- 는 함께, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3 개의 기/원자로 이루어지는 2가 링커기 (또한 라디클로서 지칭됨) 를 나타낸다.
일부 구현예에서, -X-Y- 는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이라디클을 나타낸다: -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa-, -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-, -O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-.
일부 구현예에서, -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-CH(CH3)- 를 나타낸다.
Ra 및, 존재하는 경우, Rb 는 각각, 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있다.
R10 은 수소일 수 있거나, 또는 일부 구현예에서, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기는 함께 옥소, 티옥소, 이미노 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 및 수소로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 는 수소 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, 존재하는 경우, Rb 는 수소 또는 메틸이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 수소이고, 다른 하나는 수소 이외의 것이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 중 하나는 메틸이고, 다른 하나는 수소이다.
일부 구현예에서, Ra 및 Rb 둘 모두는 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -NH-CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 이고, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 모두는 수소 이외의 것, 예컨대 메틸이고, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 2가 링커기 -O-CH(CH2OCH3)- 를 나타낸다 (2'O-메톡시에틸 바이시클릭 핵산 - [Seth at al., 2010, J. Org. Chem., 2010, 75 (5), pp 1569-1581]). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 2가 링커기 -O-CH(CH2CH3)- 를 나타낸다 (2'-O-에틸 바이시클릭 핵산 - [Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CHRa- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH2OCH3)- 이고, R10 은 수소이다. 상기와 같은 LNA 뉴클레오시드는 또한 당업계에 시클릭 MOE (cMOE) 로서 공지되어 있으며, WO07090071 에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 R- 또는 S- 입체배치의 2가 링커기 -O-CH(CH3)- 를 나타낸다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 함께 2가 링커기 -O-CH2-O-CH2- 를 나타낸다 ([Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH(CH3)- 이고, R10 은 수소이다. 상기와 같은 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 또한 당업계에 cET 뉴클레오시드로서 공지되어 있으며, WO07090071 (베타-D) 및 WO2010/036698 (알파-L) 에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체이성질체일 수 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CRaRb- 이고, 여기서 Ra 도 Rb 도 수소가 아니고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, Ra 및 Rb 는 둘 모두 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -S-CHRa- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2- 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)- 이고, R10 은 수소이다.
일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -N(-ORa)- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, Ra 는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 함께 2가 링커기 -O-NRa-CH3- 를 나타낸다 ([Seth at al., 2010, J. Org. Chem]). 일부 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -N(Ra)- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서, Ra 는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, R10 은 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 상기와 같은 구현예에서, 바이라디클 -X-Y- 는 -O-CH2- 또는 -O-C(HCRa)-, 예컨대 -O-C(HCH3)- 로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 -CH2-O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
일부 구현예에서, 바이라디클은 -O-CRaRb-O-CRaRb-, 예컨대 -O-CH2-O-CH2- 이고, R10 은 수소이다. 일부 구현예에서 Ra 는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
명시되지 않는 경우, LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 입체이성질형태일 수 있다고 인식될 것이다.
실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이거나 이를 포함하며, 예컨대 2' - 4' 브릿지가 화학식 1 에서와 같고, 식 중 X 는 산소이고, Y 는 CH2 이고, R10 은 수소인 것이다.
갭머
본원에서 사용된 바, 용어 갭머는, 하나 이상의 친화성 향상 변형된 뉴클레오시드 (플랭크 (flank)) 에 의해 5' 및 3' 플랭크된, RNase H 모집 올리고뉴클레오티드의 영역 (갭 (gap)) 을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기재되어 있다. 헤드머 (headmer) 및 테일머 (tailmer) 는, 플랭크 중 하나가 결여된, 즉 올리고뉴클레오티드의 말단 중 단지 하나만 친화성 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, RNase H 를 모집할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 헤드머의 경우에는, 3' 플랭크가 결여되어 있으며 (즉 5' 플랭크는 친화성 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함함), 테일머의 경우에는 5' 플랭크가 결여되어 있다 (즉 3' 플랭크는 친화성 향상 변형된 뉴클레오시드를 포함함).
LNA 갭머
용어 LNA 갭머는, 친화성 향상 변형된 뉴클레오시드 중 적어도 하나가 LNA 뉴클레오시드인, 갭머 올리고뉴클레오티드이다.
혼합 윙 갭머
용어 혼합 윙 갭머는, 플랭크 영역이 적어도 하나의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 하나의 비(非)-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 하나의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예를 들어 2'-O-알킬-RNA, 2'-O-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-O-메톡시에틸-RNA (MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산 (ANA), 2'-플루오로-ANA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드(들)을 포함하는, LNA 갭머를 나타낸다. 일부 구현예에서, 혼합 윙 갭머는, LNA 뉴클레오시드 (예를 들어 5' 또는 3') 를 포함하는 하나의 플랭크, 및 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드(들)을 포함하는 다른 하나의 플랭크 (각각 3' 또는 5') 를 갖는다.
길이
본원에 언급된 뉴클레오티드 분자의 길이를 언급할 때, 길이는, 단량체 유닛이 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체인지 여부에 관계없이, 단량체 유닛, 즉 뉴클레오티드의 수에 해당한다. 뉴클레오티드와 관련하여, 용어 단량체 및 유닛은 본원에서 교환가능하게 사용된다.
본 발명의 방법은, 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 7 내지 30 개의 뉴클레오티드, 예컨대 7 - 10 개, 예컨대 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 내지 20 개의 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 18 개의 뉴클레오티드, 예를 들어 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개의 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 정제에 특히 적합하다.
본 발명의 추가 구현예
1. 화학식 1 의 화합물:
Figure 112018102227793-pct00035
[식 중,
Z 는 구아닌 뉴클레오시드이며, 여기서 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하고, 화학식 1 의 환외 산소는 뉴클레오시드 Z 의 3' 탄소에 공유결합으로 부착되어 있고;
R5 및 R6 은 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R5 및 R6 은 함께, 화학식 (I) 의 N 원자와 함께, 탄소수 3 - 16 의 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R1 은 수소 및 C1-3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; R9 는 수소이고; R 은 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 니트로, 할로겐, 시아노, 실릴, 치환된 실릴, 술폰, 치환된 술폰 (아릴 치환된 술폰), 플루오렌 및 치환된 플루오렌으로 이루어진 군으로부터 선택됨].
2. 구현예 1 에 있어서, R 이 아릴, 헤테로아릴, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
3. 구현예 1 에 있어서, R 이 아릴, 예컨대 페닐인 화합물.
4. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, R1 이 수소인 화합물.
5. 구현예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, R1 이 C1-3 알킬, 예컨대 메틸인 화합물.
6. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, R5 및 R6 이 함께, 화학식 (I) 의 N 원자와 함께, 탄소수 3 - 16 (예를 들어 탄소수 4) 의 헤테로시클릭 고리를 형성하는 화합물.
7. 구현예 1 - 5 중 어느 하나에 있어서, R5 및 R6 이 함께, 화학식 (I) 의 N 원자와 함께, 탄소수 4 의 헤테로시클릭 고리를 형성하는 화합물.
8. 구현예 6 또는 7 에 있어서, 화학식 2 의 화합물인 화합물:
Figure 112018102227793-pct00036
[식 중, Z, R 및 R1 은 구현예 1 - 7 중 어느 하나에서와 같음].
9. 구현예 1 - 8 중 어느 하나에 있어서, 화학식 3 의 화합물인 화합물:
Figure 112018102227793-pct00037
[식 중,
R, R1, R5, R6 및 R9 는 구현예 1 - 8 중 어느 하나에서와 같으며;
B 는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기를 포함하는 구아닌 핵염기 기이고;
R3 은 CH2ODMTr, CH2-알킬-O-DMTr, CH-Me-O-DMTr, CH2OMMTr, CH2-알킬-O-MMTr, CH(Me)-O-MMTr, CH-Ra-O-DMTrRb 및 CH-Ra-O-MMTrRb 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2 는 할로, 예컨대 -F, 아미노, 아지도, -SH, -CN, -OCN, -CF3, -OCF3, -O(Rm)-알킬, -S(Rm)-알킬, -N(Rm)-알킬, -O(Rm)-알케닐, -S(Rm)-알케닐, -N(Rm)-알케닐; -O(Rm)-알키닐, -S(Rm)-알키닐 또는 -N(Rm)-알키닐; O-알킬에닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴, O-아르알킬, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) 또는 O-CH2C(=O)-N(Rm)(Rn), -O-(CH2)2OCH3 및 -O-CH3 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Rm 및 Rn 은 각각 독립적으로, H, 아미노 보호기 또는 치환되거나 미치환된 C1-10 알킬이고;
R4 는 알킬, 시클로알킬, 시클로헤테로알킬, O-알킬, S-알킬, NH-알킬 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
R2 및 R4 는 함께, -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N, O, -Si(Ra)2-, S-, -SO2-, -N(Ra)- 및 >C=Z 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3 개의 기/원자로 이루어진 2가 브릿지를 나타내고;
Ra 및, 존재하는 경우, Rb 는 각각, 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 C2-6-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카르복시, C1-6-알콕시카르보닐, C1-6-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노- C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 2 개의 같은자리 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 모든 키랄 중심에 대하여, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있음].
10. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기가 -C(=O)-R7 이고, 여기서 R7 은 임의로 치환된 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 시클로알킬- 또는 아릴-기로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 임의로 치환된 C1-6-알킬-, C2-6-알케닐-, C2-6-알키닐-, C3-7-시클로알킬- 또는 페닐-기로부터 선택되고; 여기서 치환되는 경우, 치환기는, 예를 들어 할로겐, C1-6-알킬, C2-6-알케닐, C2-6-알키닐, C1-6-알콕시, 임의로 치환된 아릴옥시 또는 임의로 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 단일 또는 다중 치환될 수 있는 화합물.
11. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기가 이소부투릴 (iBu), 아세틸 (Ac), 페녹시아세틸 (PAC), p-이소프로필페녹시아세틸 (iPrPAC), 페닐아세틸, 이소프로필옥시아세틸, 메톡시아세틸, 벤조일, p-메톡시페닐아세틸, 디페닐아세틸, 시클로헥실카르보닐, 1,1-디메틸프로파노일 및 p-tert-부틸-페녹시아세틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
12. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기가 이소부투릴 (iBu), 아세틸 (Ac), 페녹시아세틸 (PAC) 및 p-이소프로필페녹시아세틸 (iPrPAC) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
13. 구현예 1 - 9 중 어느 하나에 있어서, 구아닌 환외 질소기 상의 아실 보호기가 이소부투릴 (iBu) 인 화합물.
14. 구현예 9 - 13 중 어느 하나에 있어서, 화학식 3 에서, R2 및 R4 가 함께, 브릿지 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)C(RaRb)-O-, -CH2-O-, -CH2CH2-O- 및 -CH(CH3)-O- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 2가 브릿지를 나타내는 화합물.
15. 구현예 9 - 13 중 어느 하나에 있어서, R2 및 R4 가 2가 브릿지 -CH2-O- (메틸렌-옥시) 또는 -CH(CH3)-O- (메틸-메틸렌-옥시) 를 나타내는 화합물.
16. 구현예 1 - 15 중 어느 하나에 있어서, R3 이 CH2-O-DMTr 또는 CH2-O-MMTr 인 화합물.
17. 구현예 1 - 16 중 어느 하나에 있어서, 화학식 16 또는 17 의 화합물인 화합물:
Figure 112018102227793-pct00038
[식 중, R, R1, R9, R3, R7 및 R8 은 구현예 1 - 16 중 어느 하나에서와 같음].
18. 구현예 17 에 있어서, R 이 페닐이고, R1 이 수소 또는 메틸인 화합물.
19. 구현예 17 에 있어서, R 이 페닐이고, R1 이 수소인 화합물.
20. 구현예 17 에 있어서, R 이 페닐이고, R1 이 메틸인 화합물.
21. 구현예 17 - 20 중 어느 하나에 있어서, 아실 보호기 (-C(=O)-R7) 가 이소부투릴인 화합물.
22. 구현예 1 - 21 중 어느 하나의 화합물 및 용매를 포함하는 용액.
23. 구현예 22 에 있어서, 용매가 극성 비양성자성 용매이거나 이를 포함하는 용액.
24. 구현예 22 또는 23 에 있어서, 용매가 아세토니트릴, DMF, DMSO, 디옥산, 테트라히드로푸란, N-메틸-2-피롤리돈, 디클로로메탄 및 디클로로에탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용액.
25. 올리고뉴클레오티드의 합성에서의, 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 따른 화합물, 또는 구현예 22 - 24 에 따른 용액의 용도.
26. 구현예 1 - 21 중 어느 하나에 따른 화합물의 합성 방법으로서, 3'-OH 기를 포함하는 구아닌 뉴클레오시드를, 화학식 4 의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 방법:
Figure 112018102227793-pct00039
[식 중, X 는 할라이드, 예컨대 요오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드이고, R, R1, R5, R9 및 R6 은 상기 구현예 중 어느 하나에서와 같으며, 구아닌 뉴클레오시드 상의 구아닌 핵염기 기는 구아닌 환외 질소기 상에 아실 보호기, 예컨대 구현예 10 - 13 중 어느 하나의 아실 보호기를 포함함].
27. 구현예 26 에 있어서, 화학식 4 의 화합물에서 X 가 클로라이드인 방법.
28. 구현예 26 또는 27 에 있어서, 화학식 4 의 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
Figure 112018102227793-pct00040
.
29. 구현예 26 - 28 중 어느 하나에 있어서, R, R1, R5, R6 및 R9 가 구현예 1 - 25 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 방법.
30. 구현예 26 - 29 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오시드가 하기 화학식을 갖는 화합물:
Figure 112018102227793-pct00041
[식 중, B, R2, R3, R4 는 구현예 9 - 25 중 어느 하나에 정의된 바와 같음].
31. 구현예 26 - 30 중 어느 하나에 있어서, 반응 단계가 염기 및 용매 존재 하에서 수행되는 방법.
32. 구현예 32 에 있어서, 염기가 유기 염기, 예컨대 3차 비친핵성 유기 염기, 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 N-메틸모르폴린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기인 방법.
33. 구현예 31 또는 32 에 있어서, 용매가 구현예 22 - 24 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
34. 구현예 26 - 33 중 어느 하나에 있어서, 용매가 테트라히드로푸란 (THF) 또는 톨루엔이거나 이를 포함하며, 여기서 임의로 용매는 피리딘을 추가로 포함할 수 있는 방법.
35. 구현예 26 - 34 중 어느 하나에 있어서, 반응이 0℃ 미만, 예컨대 -50℃ 미만의 온도에서 일어나는 방법.
실시예
실시예 1 - 일반적인 합성 방법:
톨루엔 (50 mL) 중의 N-메틸모르폴린의 용액에, PCl3 (2.93 mL, 33.4 mmol) 를 -70 ℃ 에서 10 min 의 시간에 걸쳐 첨가하였다. 그 후, 톨루엔 (50 mL) 중의 프롤린 (P5-D 또는 P5-L) 보조제 (6.24 g, 35.2 mmol) 를 30 min 에 걸쳐 첨가하였다 (P5-D 및 P5-L 의 합성에 대하여 [J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 16031-16037] 참조). 수득한 혼합물을 실온에서 1.5 h 동안 교반하고, 그 후 용매 및 휘발성 물질을 진공에서 (40 ℃ 및 15 mbar) 제거하였다. 이어서, 남아있는 잔류물을 THF (50 mL) 중에 용해시킨 후, -70 ℃ 까지 냉각시키고, 먼저 NEt3 (17.8 mL, 128 mmol) 를 첨가하고, 이어서 30 min 에 걸쳐, 5'-ODMT-DNA-뉴클레오시드 (16 mmol) 를 THF (50 mL) 중의 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -77 ℃ 에서 30 min 동안, 이어서 실온에서 2 h 동안 교반하였다. 그 후, 냉각된 EtOAc (200 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (150 mL), 염수 (150 mL) 로 세정하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물을 실리카 상에서의 분해를 방지하기 위하여 용리액에 7% NEt3 를 포함시켜, 아르곤 하에서 플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
생성물을, 예를 들어 EtOAc, THF 및 NEt3 로부터의 소량의 잔류 용매를 잠재적으로 함유하는 고체로서 수득하였다.
상기 절차를 사용하여, 하기 단량체들을 합성하였다:
Figure 112018102227793-pct00042
.
실시예 2
D-LNA-G-DMF 의 합성
5'-ODMT-LNA-G (3.51 g, 5.00 mmol) 를 피리딘 및 이어서 톨루엔과 함께 동시증발시켜, 임의의 잔류하는 물 또는 다른 용매를 제거하였다. 이어서, 잔류물을 피리딘 (10 mL) 및 THF (10 mL) 에 용해시켰다. 이러한 용액을 -77 ℃ 에서, D-옥스아자포스폴리딘 (D-oxazaphospholidine) (3.51 g, 5.00 mmol), PCl3 (0.88 mL, 10.0 mmol) 및 NEt3 (3.50 mL, 25.0 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 이어서, 수득한 반응 혼합물을 -77 ℃ 에서 15 min 동안, 이어서 실온에서 1.5 h 동안 교반하였다. 그 후, EtOAc (150 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (100 mL) 및 염수 (100 mL) 로 세정하고, Na2SO4 를 사용하여 건조시키고, 여과하고, 최종적으로 톨루엔과 함께 증발시켰다.
수득한 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (용리액: EtOAc 중의 THF 10% → 30% + 7% NEt3) 로 정제하여, D-LNA-G-DMF (3.91 g, 추정 수율 84%) 를 수득하였다.
Figure 112018102227793-pct00043
실시예 3
L-LNA-G-DMF 의 합성
5'-ODMT-LNA-G (4.91 g, 7.00 mmol) 를 피리딘 및 이어서 톨루엔과 함께 동시증발시켜, 임의의 잔류하는 물 또는 다른 용매를 제거하였다. 이어서, 잔류물을 피리딘 (10 mL) 및 THF (15 mL) 에 용해시켰다. 이러한 용액을 -77 ℃ 에서, L-옥스아자포스폴리딘 (2.48 g, 14.0 mmol), PCl3 (1.22 mL, 14.0 mmol) 및 NEt3 (4.90 mL, 35.0 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 이어서, 수득한 반응 혼합물을 -77 ℃ 에서 15 min 동안, 이어서 실온에서 1.5 h 동안 교반하였다. 그 후, EtOAc (150 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (100 mL) 및 염수 (100 mL) 로 세정하고, Na2SO4 를 사용하여 건조시키고, 여과하고, 최종적으로 톨루엔과 함께 증발시켰다.
수득한 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (용리액: EtOAc/DCM 1:1 중의 THF (15% → 25% 의 구배 사용) + 7% NEt3) 로 정제하여, D-LNA-G-DMF (3.41 g, 추정 수율 84%) 를 수득하였다. 생성물을 상기 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
Figure 112018102227793-pct00044
실시예 4
D-DNA G-DMF 의 합성
톨루엔 (50 mL) 중의 N-메틸모르폴린의 용액에, PCl3 (2.93 mL, 33.4 mmol) 를 -70 ℃ 에서 10 min 의 시간에 걸쳐 첨가하였다. 그 후, 톨루엔 (50 mL) 중의 P5-D (6.24 g, 35.2 mmol) 를 30 min 에 걸쳐 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 실온에서 1.5 h 동안 교반하고, 그 후 용매 및 휘발성 물질을 진공에서 (40 ℃ 및 15 mbar) 제거하였다. 이어서, 남아있는 잔류물을 THF (50 mL) 중에 용해시킨 후, -70 ℃ 까지 냉각시키고, 먼저 NEt3 (17.8 mL, 128 mmol) 를 첨가하고, 이어서 30 min 에 걸쳐, 5'-ODMT-DNA-G (9.99 g, 16.0 mmol) 를 THF (50 mL) 중의 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -77 ℃ 에서 30 min 동안, 이어서 실온에서 2 h 동안 교반하였다. 그 후, 냉각된 EtOAc (200 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (150 mL), 염수 (150 mL) 로 세정하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 미정제 생성물을 아르곤 하에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용리액 DCM/EtOAc=2/1 + 7% NEt3) 로 정제하였다. D-DNA-G-DMF 를 미량의 용매 불순물 (EtOAc, 톨루엔 및 NEt3) 을 포함하는 백색 발포체 (10.6 g, 72%) 로서 단리하였다.
Figure 112018102227793-pct00045
실시예 5
L-DNA G-DMF 의 합성
톨루엔 (25 mL) 중의 N-메틸모르폴린의 용액에, PCl3 (1.33 mL, 15.2 mmol) 를 -55 ℃ 에서 5 분 동안 첨가하고, 이어서 톨루엔 (25 mL) 중의 P5-L (2.84 g, 16.00 mmol) 를 15 min 동안 첨가하였다. 수득한 반응 혼합물을 -55 내지 -45 ℃ 에서 10 min 동안, 이어서 실온에서 1.5 h 동안 교반하였다. 이어서, 용매 및 다른 휘발성 물질을 진공에서 (40 ℃ 및 6 mbar) 제거하였다. 이어서, 남아있는 잔류물을 THF (25 mL) 중에 용해시키고, -77 ℃ 까지 냉각시켰다. 그 후, NEt3 (8.92 mL, 64 mmol) 를 첨가하고, 이어서 THF (25 mL) 중의 5'-ODMT-DNA-G-DMF (4.5 g, 7.2 mmol) 의 용액을 15 min 동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 -77 ℃ 에서 15 min 동안, 이어서 실온에서 3 h 동안 교반하였다. 그 후, EtOAc (150 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (100 mL), 염수 (50 mL) 로 추출하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하고, 증발시켰다.
생성물을 아르곤 하에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (용리액: EtOAc/DCM=1/2 + 7% NEt3) 로 단리하여, 미량의 EtOAc 와 함께 백색 발포체 (3.77 g, 63%) 로서 수득하였다.
Figure 112018102227793-pct00046
실시예 6
L-LNA-G-iBu 단량체의 합성
5'-OAP-LNA-G-iBu 유도체의 합성 절차
Figure 112018102227793-pct00047
단계 A: 톨루엔 (15 mL) 중의 N-메틸모르폴린 (1.76 mL, 16.0 mmol) 의 용액에, PCl3 (0.66 mL, 7.6 mmol) 를 -55 ℃ 에서 5 min 에 걸쳐 첨가하였다. 그 후, 톨루엔 (12 mL) 중의 (S)-페닐-(R)-피롤리딘-2-일)메탄올 (P5-D) (1.42 g, 8.00 mmol) 의 용액을 이후 15 min 동안 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 -55 내지 -45 ℃ 에서 10 min 동안, 이어서 실온에서 1.5 h 동안 교반하였다.
용매 및 다른 휘발성 화합물을 진공에서 40 ℃ 및 6 mbar 에서 제거한 후, THF (13 mL) 를 첨가하였다.
단계 B: 이어서, 반응 혼합물을 -77 ℃ 까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민 (5.54 mL, 40 mmol) 을 첨가하고, 이어서 THF (13 mL) 중의 5'-ODMT-LNA-G-iBu (2.67 g, 4 mmol) 의 용액을 15 min 에 걸쳐 첨가하였다. 수득한 혼합물을 -77 ℃ 에서 15 min 동안, 이어서 실온에서 3 h 동안 교반하였다. 그 후, EtOAc (75 mL) 를 첨가하고, 혼합물을 냉각된 NaHCO3 (50 mL) 및 염수 (50 mL) 로 세정하고, Na2SO4 를 사용하여 건조시키고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 미정제 생성물을 Ar 하에서 플래시 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc:헥산, 1:4 + 7% NEt3) 로 정제하였다.
생성물을 백색 발포체로서 수득하였다 (1.95 g, 추정 수율 55%).
DMSO 에서의 31P-NMR 148.8 ppm + 28.8 ppm 에서 1%.
D-LNA G-iBu 및 L-LNA G-iBu 둘 모두에 대한 합성의 부가적인 최적화
Figure 112018102227793-pct00048
전구체 (예를 들어 P5) 에 대하여 약간의 과량의 PCl3 가 생성물 (예를 들어 OAP-LNA-G-iBu) 의 수율을 유의하게 감소시키는 부산물의 형성을 야기한다는 것을 발견하였다. 따라서, 적어도 몰 당량의 전구체 및 PCl3 를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 단계 A 에서 PCl3 에 대한 전구체의 몰비는 약 1 초과, 예컨대 1.05 초과이다. 일부 구현예에서, 단계 A 에서 PCl3 에 대한 전구체의 몰비는 1.5 이하이다.
단계 B 에서 중간체를 2 배 초과 몰 당량으로 사용하면 생성물의 가장 높은 수율이 수득된다는 것을 확인하였다 (표의 3 및 5 번 참조). 일부 구현예에서, 중간체 (예를 들어 5'-ODMT-G-iBu) 대 전구체 및 PCl3 의 몰비는 2 초과이다.
생성물의 순도는 31P-NMR 스펙트럼으로부터 측정하였다.
실시예 6
생성물의 안정성 및 용해성 측정
L-LNA G-DMF 및 L-LNA G-iBu 의 안정성 및 용해성을 조사하기 위하여, 하기 실험 절차를 수행하였다:
1.5 mL 바이알에, 0.013 mmol 의 아미다이트를 첨가한 후, 고체 물질을 0.13 mL 의 용매 중에 용해시켰다. 그 후, 바이알을 캡핑하고, 볼텍싱하고, 최종적으로 실온에서 24 시간 동안 정치시켰다. 이어서, 용해된 물질의 용해성을 육안으로 조사하였다 (도 2). 용액이 흐리거나 다르게는 비균질하게 보이는 경우, 용해성을 "없음" 으로 설정하였다. 용액이 완전히 균질하게 보이는 경우, 용해성을 "있음" 으로 설정하였다 (조사를 24 시간 후에 반복하였음).
안정성 측정 방법: 분석을 완료하기 위하여, 아미다이트의 안정성을 하기 사양의 Agilent 1100 시리즈 HPLC-MS 를 사용하여 조사하였다:
컬럼: Waters XTerra, MS C-18, 5 ㎛, 2.1 x 100 mm
온도: 40℃
유량: 0.3 mL/ min
검출: 254 nm 에서 UV
실행 시간: 12 min
용리액: A: H2O 중의 0.1 % sat. NH4OH (aq), B: CH3CN 중의 20 % A
시간 (min): % B 용리액:
0.00 : 80
0.50 : 80
3.00 : 100
7.00 : 100
8.00 : 80
12.00 : 80
모 (mother) 화합물의 질량 및 UV 피크를 0 시간 및 24 시간에서 확인하였다. 그 후, 다른 부산물과 비교한 상대적 안정성을, UV 크로마토그램 (254 nm) 을 적분하고, 0 시간에서 기록된 크로마토그램으로 면적을 정규화하여 기록하였다 (도 1).
3 개의 단량체에 대한 합성 후, 0 시간 및 24 시간에서의 용해성 데이터는 도 2 에 예시되어 있다. 다양한 용매에서 24 시간 후에 측정된 안정성 데이터는, 도 1, 및 도 3a (L-LNA-G-iBu) 및 3b (L-LNA-G-DMF) 에 제시되어 있다.
단량체 L-LNA G-DMF 는 대부분의 용매에서 (MeCN, MeCN:DCE, MeCN:Tol, MeCN:아세톤, 디옥산 및 THF) 불용성이다. 단량체를 용해시키는 용매 (MeCN:DCM, DMF, DMSO, NMP, DCM, DCE 및 톨루엔) 는, 엄청난 불안정성을 나타낸다. 최상의 용매는 24 시간 후 10% 의 아미다이트가 남아있는 DCM 이다.
단량체 L-LNA G-i-Bu 는 조사된 모든 용매 (12 가지) 에 가용성이며, 여기서 최상의 성능을 갖는 것은 MeCN, MeCN:아세톤, DCM 및 DCE 이다. L-LNA G-i-Bu 단량체에 대하여 조사된 모든 용매는, 용해성 및 안정성에 있어서 유의한 개선을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 화학식 50 또는 51 의 화합물
    Figure 112021141976746-pct00059

    [식 중,
    R3 은 CH2ODMTr 또는 CH2OMMTr 이고, DMTr 은 디메톡시트리틸이고, MMTr 은 모노메톡시트리틸이고; 또한, DMTr 은 디메톡시트리틸 기를 나타내고, MMTr 은 모노메톡시트리틸 기를 나타내고; R8 은 시아노에틸을 나타냄].
  2. 제 1 항에 있어서, R3 이 CH2ODMTr 인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 76 의 화합물인 화합물:
    Figure 112021141976746-pct00060
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