WO2017155058A1 - Ｒｎａハイブリッド形成用核酸オリゴマー - Google Patents

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acid oligomer
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猛 和田
怜次郎 吉野
倫太朗 原
陽平 額賀
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Definitions

  • An antisense molecule having a base sequence complementary to the target nucleic acid forms a duplex complementary to the target nucleic acid, and can inhibit protein production from the target nucleic acid.
  • an antisense molecule directly acts on a disease-related gene, and thus has attracted attention as a drug effective for gene therapy.
  • Antisense molecules are mainly composed of cell membrane permeability, nuclease resistance, chemical stability in the body (for example, in an environment of pH 7.4), and from the viewpoint of efficiently inhibiting the production of a target protein. It is required to have a property of forming a stable duplex only with a specific base sequence.
  • Examples of the antisense molecule include a nucleic acid oligomer obtained using a phosphorothioate compound (hereinafter referred to as “phosphorothioate type nucleic acid oligomer”) and a nucleic acid oligomer obtained using a boranophosphate compound (hereinafter referred to as “boranophosphate type nucleic acid”).
  • oligomer (Referred to as “oligomer”), and there have been many extensive research examples, which have been put into practical use as pharmaceuticals.
  • the phosphorothioate-type nucleic acid oligomer has a non-natural type bond, and thus has high nuclease resistance and high lipid solubility, so that it can be expected to be permeable to cell membranes and has low immunity.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid oligomer for RNA hybridization that is excellent in duplex forming ability with a complementary strand.
  • a nucleotide unit represented by the following general formula (1) and at least one unit of the nucleotide unit represented by the following general formula (2) includes a structure of 3 to 50 consecutive units, and has a base length of 8 Nucleic acid oligomer for RNA hybridization having a base to 50 bases.
  • ⁇ 3> The nucleic acid oligomer for RNA hybridization according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the base length is 10 to 30 bases.
  • nucleic acid oligomer for RNA hybridization that is excellent in ability to form a double strand with a complementary strand.
  • (B) is a graph showing a double-stranded melting curve of a nucleic acid oligomer in which the absolute configuration of a phosphorus atom in all phosphorothioate bonds is Rp and a natural complementary strand DNA.
  • (A) is a nucleic acid oligomer d (ATA (Cs) 6TAT), (Rp) -d (ATA (Cps) 6TAT) or (Sp) -d (ATA (Cps) 6TAT) and a natural complementary strand RNA. It is a graph which shows the melting curve of a double strand.
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention has 3 to 50 consecutive nucleotide units represented by the general formula (1) and at least one nucleotide unit represented by the following general formula (2). Including the structure, the base length is 8 to 50 bases.
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention is characterized by being excellent in duplex forming ability with RNA as a complementary strand.
  • the ability to form a double strand with a complementary strand refers to the ease of forming a double strand with RNA serving as a complementary strand.
  • the duplex forming ability can be represented, for example, by the melting temperature (Tm) of the duplex between the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention and the natural complementary strand RNA. Tm can be determined, for example, by measuring the absorbance at 260 nm at each temperature using an ultraviolet-visible spectrophotometer equipped with a cell capable of changing the temperature and obtaining a melting curve.
  • the absolute configuration of the phosphorus atom is one, for example, when it is a sulfur atom, it is considered that it easily interacts spatially with the 5-position group of the pyrimidine group when the absolute configuration is Rp. It is done.
  • a borano group it is considered that when the absolute configuration is Sp, it is likely to interact spatially with the 5-position group of the pyrimidine group. Therefore, when the nucleobase is a pyrimidine, a strong interaction with the sulfur atom or borano group occurs, resulting in a more stable structure in the molecule, resulting in a stronger bond with the complementary strand, As a result, it is considered that the A-type helical structure is further stabilized.
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization is represented by the general formula (1).
  • the structure portion is continuous or not. The bond with the complementary strand of the nucleic acid oligomer becomes stronger and the Tm value is further increased.
  • the absolute configuration of the phosphorus atom of the nucleic acid oligomer for RNA hybridization is determined by, for example, enzymatic degradation and 31 P-nuclear magnetic resonance spectrum ( 31 P-NMR) after the synthesized oligomer is purified by HPLC or the like. Can do.
  • the stereochemical purity (diastereomeric purity) in the nucleic acid oligomer for RNA hybridization can be obtained by measuring using the 31 P-nuclear magnetic resonance spectrum and polarimeter.
  • X may be S ⁇ Z + or BH 3 ⁇ Z + .
  • Z + include cations derived from organic amine compounds, or inorganic and metal cations.
  • cations derived from organic amine compounds include tertiary alkyl ammonium ions, heteroaromatic iminium ions, and heterocyclic iminium ions.
  • inorganic and metal cations include ammonium ions or monovalent metal ions. Can be mentioned.
  • Trityl protecting groups such as the group (DMTr), silyl protecting groups such as the trimethylsilyl group (TMS) and Tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS), 2- (cyanoethoxy) ethyl group (CEE) and cyanoethoxymethyl group (CEM)
  • TMS trimethylsilyl group
  • TDMS Tert-butyldimethylsilyl group
  • CEE 2- (cyanoethoxy) ethyl group
  • CEM cyanoethoxymethyl group
  • nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention has other nucleotide units as long as it contains a structure in which 3 to 50 specific nucleotide units are continuous (hereinafter referred to as “chimeric oligomer” as appropriate). ).
  • Other nucleotide units in the case of a chimeric oligomer are not particularly limited.
  • the natural type monomer and the derived natural type described in paragraph 0051 (V) of JP-A-2015-093853 examples thereof include nucleotide units obtained by condensing monomers.
  • the specific nucleotide structure preferably includes a continuous structure of 5 to 30 regardless of whether it is a chimeric oligomer or not.
  • the ability of the nucleic acid oligomer for RNA hybridization to form a duplex with RNA can be further increased, and when it is 30 or less, usability is further improved. Further, it is more preferable that 7 to 25 are continuous.
  • examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an i-propoxy group, an n-butoxy group, and a sec-butoxy group. Group, tert-butoxy group, n-pentyloxy group and the like.
  • examples of the alkenyloxy group include a vinyloxy group, an allyloxy group, a 1-propenyloxy group, an isopropenyloxy group, a 2-methyl-1-propenyloxy group, a 2-methylallyloxy group, and a 2-butenyloxy group. Can do.
  • Examples of the acyloxy group include an alkyl-carbonyloxy group having 1 to 6 carbon atoms (eg, methylcarbonyloxy group, ethylcarbonyloxy group, etc.), and an aryl-carbonyloxy group having 6 to 10 carbon atoms (eg, benzoyloxy group).
  • Etc examples of the trialkylsilyloxy group include a trimethylsilyloxy group and a triethylsilyloxy group.
  • Examples of the halogenyl group include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom, an alkoxy group, or a trialkylsilyloxy group from the viewpoint of the ability to form a double chain.
  • the alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms, and more preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the halogenyl group is more preferably a fluoro group.
  • Bs1 represents a pyrimidine base and may have a protecting group.
  • the type of the protecting group is not particularly limited.
  • examples of the protecting group include a benzyl group, 4-methoxybenzoyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group.
  • the hydrogen atom bonded to the 5-position carbon atom of the pyrimidine base may be substituted with an atom other than a hydrogen atom.
  • the substituent which may be substituted is not particularly limited. However, from the viewpoint of duplex formation ability with the RNA of the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention, the substituent is an alkyl group, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkynyl group, an acyl group. It is preferably any one group selected from a group and a halogenyl group. Further, the substituents bonded to the 5-position carbon atom of each pyrimidine base in the nucleic acid oligomer may be the same group or different.
  • Examples of the alkyl group include linear or branched ones having 1 to 10 carbon atoms. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a t-butyl group, an n-hexyl group, and an n-octyl group.
  • Examples of the cycloalkyl group include a cyclopropyl group and a cyclohexyl group.
  • Examples of the alkenyl group include linear, branched or cyclic groups having 2 to 10 carbon atoms.
  • Specific examples include a vinyl group, propenyl group, butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, heptenyl group, octenyl group, nonenyl group, and allyl group.
  • Examples of the aryl group include those having 6 to 12 carbon atoms. Specific examples include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, biphenyl and the like.
  • Examples of the heteroaryl group include those having 3 to 10 carbon atoms. Specific examples include 1,2,3-triazole, imidazole and thiophene.
  • Examples of the alkynyl group include linear or branched groups having 2 to 10 carbon atoms.
  • ethynyl group 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, 1-methyl-2-propynyl group, 2-methyl-3- Butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-2-butynyl, 2-methyl-3-pentynyl, 1-hexynyl, 1,1- Examples thereof include a dimethyl-2-butynyl group.
  • the acyl group include linear or branched alkanoyl having 1 to 10 carbon atoms.
  • an alkyl group having 2 to 5 carbon atoms an alkenyl group having 2 to 5 carbon atoms, an alkynyl group having 2 to 5 carbon atoms, and a halogenyl group are preferable. Further, an alkynyl group and a halogenyl group having 2 to 5 carbon atoms are more preferable, and an alkynyl group having 3 to 4 carbon atoms is particularly preferable.
  • R 2 and R 3 are each independently, it may be a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • the alkyl group include linear or branched ones having 1 to 10 carbon atoms. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a t-butyl group, an n-hexyl group, and an n-octyl group.
  • R 2 and R 3 may be bonded to each other to form a ring.
  • carbon atoms other than R 3 to which R 2 R 3 and R 2 are bonded may form a cyclic structure such as a cyclopropane ring, a cyclobutane ring, or a cyclohexane ring.
  • the pyrimidine base in the general formula (1) and the general formula (2) is a group represented by the following general formula (3) or general formula (4) from the viewpoint of the ability to form a double chain. Preferably there is.
  • Examples of the alkyl group having 1 to 10 carbon atoms include linear or branched ones. Specific examples include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a t-butyl group, etc.
  • Examples of the alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms include a vinyl group, Examples thereof include a propenyl group, a butenyl group, a pentenyl group, and a hexenyl group.
  • alkynyl group having 2 to 10 carbon atoms examples include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, 1-methyl-2-propynyl group, 2- Examples thereof include a methyl-3-butynyl group, 1-pentynyl group, 2-pentynyl group, 3-pentynyl group, 4-pentynyl group, 1-methyl-2-butynyl group, and the like.
  • R 4 and R 5 are more preferably an alkyl group having 2 to 5 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 5 carbon atoms, and an alkynyl group having 2 to 5 carbon atoms, and further 3 to 3 carbon atoms. Particularly preferred are 4 alkyl groups, alkenyl groups having 3 to 4 carbon atoms, and alkynyl groups having 3 to 4 carbon atoms.
  • the protecting group is not particularly limited as long as it is a known group, and examples of the protecting group in the general formula (4) include an acetyl group, an isobutyl group, a benzoyl group, and a dimethylaminomethylene group.
  • the RNA is appropriately adjusted according to the type and length of the base sequence of the target RNA.
  • Bs1 in the general formulas (1) and (2) is represented by the general formula (3) among the above general formulas (3) and (4). It is preferable that it is a base.
  • the above-mentioned nucleic acid oligomer for RNA hybridization is not particularly limited as long as it can be produced so as to contain 3 to 50 specific nucleotide units in succession.
  • the step of synthesizing a monomer capable of constituting a specific nucleotide unit (monomer synthesis step)
  • the step of sequentially condensing the monomers obtained by the monomer synthesis step It is preferable to produce the nucleic acid oligomer for RNA hybridization described above by the condensation step.
  • the monomer synthesis step as a method for synthesizing a monomer for forming the nucleotide unit represented by the general formula (1), for example, literature [J. Am. Chem. Soc. , Vol. 130, 16031-16037] and a method for synthesizing monomers described in JP-A-2015-44842, a derivative of a nucleotide in which a substituent is appropriately introduced at the 5-position of a pyrimidine base, and an absolute phosphorus atom By synthesizing a derivative of a nucleotide having a controlled configuration, a monomer that can be used in the subsequent condensation step can be obtained.
  • literature J. Am. Chem. Soc. , Vol. 130, 16031-16037
  • JP-A-2015-44842 a derivative of a nucleotide in which a substituent is appropriately introduced at the 5-position of a pyrimidine base, and an absolute phosphorus atom
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization is a chimeric oligomer
  • the condensation step in consideration of the base sequence of the target RNA, for example, the monomers and other It can synthesize
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention is designed to be complementary to the base sequence of the target RNA, and thus used as an antisense molecule excellent in the ability to form a double strand for the target RNA. Can do.
  • the nucleic acid oligomer for RNA hybridization of the present invention is preferably used for pharmaceutical use such as an antisense drug having a high translation inhibitory ability.
  • the compound was synthesized from 5′-O-di (p-methoxyphenyl) phenylmethyl (DMTr) -2′-deoxyiodouridine (Compound 3d) with reference to the method described in No. 45,2457-2461.
  • the obtained residue was subjected to silica gel column chromatography (15 g NH-silica gel, manufactured by Fuji Silysia) [developing solvent: toluene / ethyl acetate / triethylamine (80/20 / 0.5 (v / v / v) to 0/100 /0.5 (v / v / v))], and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Compound (Sp) -4c (280 mg, 0.44 mmol) in a yield of 30%.
  • the compound was synthesized from 5′-O-di (p-methoxyphenyl) phenylmethyl (DMTr) -2′-deoxyiodocytidine (Compound 5d) with reference to the method described in No. 45,2457-2461.
  • the conditions of silica gel column chromatography in the purification are [developing solvent: toluene / ethyl acetate / triethylamine (90/10 / 0.5, v / v / v to 80/20 / 0.5, v / v / v)
  • the compound (Sp) -4e was purified in the same manner as in the purification of the compound (Sp) -4e, except that the colorless compound (Sp) -6e was obtained (0.40 g, 0.45 mmol, yield 45%).
  • the conditions of silica gel column chromatography in the purification are [developing solvent: toluene / ethyl acetate / triethylamine (90/10 / 0.1, v / v / v to 80/20 / 0.1, v / v / v)
  • the compound (Rp) -4a was purified in the same manner as in the purification of compound (Rp) -4a, except that colorless (Rp) -6a was obtained (0.54 g, 0.65 mmol, yield 33%).
  • a phosphorothioate-type nucleic acid oligomer (5'-CGTTTTTTTG-3 ', 12mer), which is a chimeric oligomer having a natural CG base sequence at the 5' end and 3 'end,
  • a phosphorothioate-type nucleic acid oligomer (5′-ATACCCCCCCTAT-3 ′, 12mer), which is a chimeric oligomer having natural ATA and TAT base sequences, or a nucleic acid oligomer that binds by a phosphate bond instead of a phosphorothioate bond is obtained above. It was synthesized using various oxazaphosphoridine monomers obtained.
  • RP-HPLC reverse phase HPLC
  • SOUCE TM 5RPC ST 5 ⁇ m column 5 ⁇ m, 4.6 mm ⁇ 150 mm
  • HPLC apparatus Box-900
  • a linear gradient of 5 to 26% acetonitrile in 0.1 M triethylammonium carbonate buffer (pH 7.0) was used as an eluent, and the flow rate was 1.0 ml / min.
  • Table 3-1 and Table 3-2 show the obtained nucleic acid oligomers and the measurement results by ESI MS.
  • “(Sp)” and “(Rp)” indicate that the absolute configuration of the phosphorothioate bond in the oligomer is either Sp or Rp.
  • “Ps” is modified between nucleotide residues (T) having a 5-methyluracil group, nucleotide residues (U) having a uracil group, nucleotide residues (C) having a cytidyl group, or the 5-position.
  • nucleotide residues having a modified uracil group or the nucleotide residues having a cytidyl group modified at the 5-position are phosphorothioate-linked, for example, “(Ups) 8” It shows that nucleotide residues having the uracil group are phosphorothioate-bonded.
  • (Tps) 8 indicates that nucleotide residues having 8 consecutive 5-methyluracil groups are phosphorothioate-bonded
  • (Cps) 6 has 6 consecutive cytidyl groups.
  • Nucleotide residues are phosphorothioate-linked, and (Cps) 2 indicates that nucleotide residues having two consecutive cytidyl groups are phosphorothioate-bonded.
  • ( Br Ups) 8 indicates that nucleotide residues having 8 uracil groups having a bromine atom (Br) bonded to the 5-position are phosphorothioate-bonded, and ( I Ups) 8 is positioned at the 5-position. It shows that nucleotide residues having 8 uracil groups bonded with iodine atom (I) are phosphorothioate bonded, and ( p Ups) 8 is 8 uracil groups bonded with propynyl group at the 5-position.
  • ( Me Cps) 6 indicates that nucleotide residues having six cytidyl groups having a methyl group (Me) bonded to the 5-position are phosphorothioate-bonded to each other.
  • (Cps) 2 (p Cps) 2 (Cps) 2 is a nucleotide residue having two cytidylic groups, with the nucleotide residues having two cytidylic group propynyl group is bonded to the 5-position, two It shows that the nucleotide residues having a cytidyl group are phosphorothioate-bonded in this order.
  • CG is bound to the 5′-position and 3′-position of the oligomer and two residues of cytosine (C) and guanine (G) are bound in a natural form.
  • ATA or TAT indicates that 3 residues of adenine (A) and thymine (T) are naturally bound to the 5 ′ and 3 ′ positions of the oligomer.
  • mix-d (CG (Tps) 8CG) is a phosphoramidite monomer of 5′-O-di (p-methoxyphenyl) phenylmethyl (DMTr) -2′-deoxythymidine (1: 1 of Rp and Sp forms).
  • a phosphorothioate-type nucleic acid oligomer was synthesized by the same method as above using a mixture (manufactured by GlenRsearch). In mix-d (CG (Tps) 8CG, T in (Tps) 8 is randomly Rp or Sp.
  • mix-d (CG ( p Ups) 8CG) is a phosphoramidite monomer (Rp and Sp) of 5-propynyl-5′-O-di (p-methoxyphenyl) phenylmethyl (DMTr) -2′-deoxythymidine.
  • Rp and Sp phosphoramidite monomer
  • a phosphorothioate-type nucleic acid oligomer was synthesized in the same manner as described above using a 1: 1 mixture of the body, manufactured by GlenRsearch.
  • the p U of ( p Ups) 8 is randomly Rp or Sp.
  • (T) 8 indicates that eight consecutive 5-methyluracil groups are phosphate-bonded.
  • (C) 6 indicates that 6 consecutive cytidyl groups are phosphate-bonded.
  • ( Br U) 8 indicates that eight uracil groups having a bromine atom (Br) bonded to the 5-position are bonded to each other by phosphoric acid, and
  • ( I U) 8 indicates an iodine atom (I) at the 5-position.
  • ( PU ) 8 indicates that 8 uracil groups having a propynyl group bonded to the 5-position are phosphate-bonded to each other.
  • ( MeC ) 6 indicates that 6 cytidyl groups having a methyl group bonded to the 5-position are phosphate-bonded to each other.
  • RNA oligomers SEQ ID NO: 1
  • DNA oligomers SEQ ID NO: 2
  • FIG. 1 (A) shows a melting curve of a duplex of a nucleic acid oligomer Sp form (nucleic acid oligomers 1, 3, 5, 7, 8) and a natural complementary RNA
  • FIG. 1 (B) shows a nucleic acid 2 shows melting curves of duplexes of oligomer Rp bodies (nucleic acid oligomers 2, 4, 6, 9) and natural complementary RNA. From these melting curves, the duplex melting temperature (Tm) was obtained. The melting temperature (Tm) was determined by the midline method.
  • ⁇ Tm (Rp-Sp) represents a temperature difference between the Tm of the Rp nucleic acid oligomer and the Tm of the Sp nucleic acid oligomer.
  • ⁇ Tm (ps-po) indicates a temperature difference between Tm of the phosphorothioate-linked oligomer that is Rp-form or Sp-form and Tm of the phosphate-bonded oligomer.
  • FIG. 2 shows the results of melting curves used for calculating Tm values in Reference Examples 1 to 4 and Reference Examples 6 to 8.
  • FIG. 2 (A) shows a double-stranded melting curve of nucleic acid oligomer Sp form (nucleic acid oligomers 1, 3, 5, 7, 8) and natural complementary DNA
  • FIG. 2 shows melting curves of double strands of oligomeric Rp bodies (nucleic acid oligomers 2, 4, 6, 9) and natural complementary DNA.
  • Example 5 which is an Rp body has a significantly higher Tm value than Comparative Example 5-1 which is an Sp body. Further, Example 5 shows a Tm higher than that of Comparative Example 5-2, which is a phosphonucleic acid oligomer, and a nucleic acid oligomer in which Rp nucleotides and Sp nucleotides are usually used as phosphorothioate type nucleic acid oligomers. The value was also shown to be high.
  • bonded has higher duplex formation ability.
  • Examples 1 to 4 have lower Tm values than natural nucleic acid oligomers, but have higher duplex formation ability than conventional phosphorothioate nucleic acid oligomers, and significantly higher stability than natural nucleic acid oligomers. And has excellent properties as a nucleic acid drug.
  • the nucleic acid oligomer of Example 6, 7 or 9 was changed.
  • the temperature was raised to 95 ° C. at a rate of 0.2 ° C./min instead of increasing the temperature to 95 ° C. at a rate of 0.5 ° C./min. Measurement was carried out in the same manner as in 1 to 5 to obtain the double chain melting temperature (Tm).
  • the Rp-type phosphorothioate-type nucleic acid oligomers of Examples 6, 7 and 9 had significantly higher duplex formation ability than the Sp-type phosphorothioate-type nucleic acid oligomers (Comparative Examples 6-1, 7-1 and 9-1). .
  • the phosphorothioate-type nucleic acid oligomers of the Rp bodies of Examples 6 and 7 had a duplex forming ability equal to or higher than that of natural phosphate-binding nucleic acid oligomers.
  • the double strand melting curves of Example 6, Comparative Example 6-1 and Comparative Example 6-2 are shown in FIG. 3A.
  • the double chain melting curves of Example 7, Comparative Example 7-1 and Comparative Example 7-2 are shown in FIG. 3B.
  • the double chain melting curves of Example 9 and Comparative Example 9-1 are shown in FIG. 3BC.
  • the absolute configuration is Rp, so that a significantly high Tm value, that is, an improvement in duplex forming ability is brought about. That is, it was shown that a nucleic acid oligomer for RNA hybridization having excellent duplex forming ability can be provided.

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Abstract

下記一般式（１）及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が３個～５０個連続する構造を含み、塩基長が８塩基～５０塩基であるＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。式中、Ｒ１は、水素原子、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリアルキルシリルオキシ基又はハロゲニル基を表す。各Ｂｓ１は、それぞれ独立して、保護基を有していてもよいピリミジン塩基であり、前記ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子は、水素原子以外の基で置換されていてもよい。Ｘは、それぞれ独立して、Ｓ－Ｚ＋又はＢＨ３ －Ｚ＋を表す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を表す。Ｒ２及びＲ３は互いに結合して環を形成してもよい。

Description

ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー
　本発明は、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーに関する。
　標的核酸と相補的な塩基配列を有するアンチセンス分子は、標的核酸と相補的な二重鎖を形成し、標的核酸からのタンパク質生成を阻害することができる。標的核酸として疾病関連遺伝子を選択した場合には、アンチセンス分子は、疾病関連遺伝子に直接働きかけるため、遺伝子治療に有効な医薬として注目されている。
　アンチセンス分子（核酸オリゴマー）は、標的となるタンパク質の生成を効率よく阻害する観点から主として、細胞膜透過性、ヌクレアーゼ耐性、体内（例えば、ｐＨ７．４の環境下）での化学的安定性、及び特定の塩基配列とのみ安定な二重鎖を形成する性質を有することが求められる。アンチセンス分子としては、例えば、ホスホロチオエート化合物を用いて得られる核酸オリゴマー（以下、「ホスホロチオエート型核酸オリゴマー」と称する）やボラノホスフェート化合物を用いて得られる核酸オリゴマー（以下、「ボラノホスフェート型核酸オリゴマー」と称する）が知られており、これまでに多くの広汎な研究例があり、医薬品としても実用化されている。ホスホロチオエート型核酸オリゴマーは、非天然型の結合を有するのでヌクレアーゼ耐性が高く、かつ脂溶性が高いために細胞膜透過性が期待でき、さらに免疫応答性も低いという利点を有する。
　一方、アンチセンス分子の標的となるＲＮＡ等の核酸はキラル分子であるため、該相補鎖との結合親和性、すなわち二重鎖形成能に、アンチセンス分子のキラリティーが影響すると考えられ、実際、ホスホロチオエート型核酸オリゴマーのリン原子上の絶対立体配置がＲＮＡとの結合親和性に影響することが報告されている（例えば、Nucleic Acids Res. 1995, Vol.23, pp.5000）。
　また、核酸オリゴマーの投与時には、標的となる核酸に到達するまでに生体内の多くのキラルな分子との相互作用を考慮する必要がある。このためには、投与する核酸オリゴマーが有するキラリティーも明確にする必要があると考えられる。
　これに対し、ホスホロチオエート型核酸オリゴマーやボラノホスフェート型核酸オリゴマーの立体選択的な合成が報告されており、立体的に高度に制御されたＤＮＡオリゴマー及びＲＮＡオリゴマーのうちの一部は、相補鎖との二重鎖形成能が向上することが報告されている（例えば、国際公開第２０１１／１０８６８２号、特開２０１５－０９３８５３号公報及びOrg. Lett. 2009, Vol.11, pp.967）。
　しかし、例えば、Org. Lett. 2009, Vol.11, pp.967、国際公開第２０１１／１０８６８２号及び特開２０１５－０９３８５３号公報のホスホロチオエート型核酸オリゴマーは、立体を制御することで、二重鎖形成能を向上させているものの、そのレベルとしては十分とは言い難い。また、これらの文献では、核酸オリゴマー中の立体選択性に関する構造のみに着目しており、その他の構造についてはほとんど考慮されていない。このように、光学活性な核酸オリゴマーと相補鎖（ＲＮＡ）との結合親和性（二重鎖形成能）については、さらに向上させる余地があるといえる。
　本発明は、上記の状況に鑑み、相補鎖との二重鎖形成能に優れたＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを提供することを課題とする。
　前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
　＜１＞　下記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、３個～５０個連続する構造を含み、塩基長が８塩基～５０塩基であるＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 
（一般式（１）中、Ｒ１は、水素原子、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリアルキルシリルオキシ基又はハロゲニル基を表す。一般式（１）及び一般式（２）中、各Ｂｓ１は、それぞれ独立して、保護基を有していてもよいピリミジン塩基であり、前記ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子は、水素原子以外の基で置換されていてもよい。一般式（１）及び一般式（２）中、Ｘは、それぞれ独立して、Ｓ－Ｚ＋又はＢＨ３ －Ｚ＋を表す。Ｚ＋は、カウンターカチオンを示す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を表す。Ｒ２及びＲ３は互いに結合して環を形成してもよい。）
　＜２＞　前記一般式（１）及び前記一般式（２）中、Ｂｓ１は、下記一般式（３）又は一般式（４）で表される基である＜１＞に記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 
（一般式（３）中、Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基又はハロゲニル基を表す。一般式（３）中のカルボニル基及びアミノ基は、保護基を有していてもよい。一般式（４）中、Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基又はハロゲニル基を表す。一般式（４）中のカルボニル基及びアミノ基は、保護基を有していてもよい。）
　＜３＞　前記塩基長が、１０塩基～３０塩基である＜１＞又は＜２＞に記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
　＜４＞　前記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び前記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、５個～３０個連続する構造を含む＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
　本発明によれば、相補鎖との二重鎖形成能に優れたＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを提供することができる。
（Ａ）は、すべてのホスホロチオエート結合中のリン原子の絶対立体配置がＳｐである核酸オリゴマーと天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ｂ）は、すべてのホスホロチオエート結合中のリン原子の絶対立体配置がＲｐである核酸オリゴマーと天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ａ）は、すべてのホスホロチオエート結合中のリン原子の絶対立体配置がＳｐである核酸オリゴマーと天然型相補鎖ＤＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ｂ）は、すべてのホスホロチオエート結合中のリン原子の絶対立体配置がＲｐである核酸オリゴマーと天然型相補鎖ＤＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ａ）は、核酸オリゴマーｄ（ＡＴＡ（Ｃｓ）６ＴＡＴ）、（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）６ＴＡＴ）または（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）６ＴＡＴ）と、天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ｂ）は、核酸オリゴマーｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣｓ）６ＴＡＴ）、（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣｐｓ）６ＴＡＴ）または（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣｐｓ）６ＴＡＴ）と、天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。 （Ｃ）は、核酸オリゴマー（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ｐＣｐｓ）６ＴＡＴ）または（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ｐＣｐｓ）６ＴＡＴ）と、天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示すグラフである。
　本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、上記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、３個～５０個連続する構造を含み、塩基長が８塩基～５０塩基である。
　本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、相補鎖であるＲＮＡとの二重鎖形成能に優れるという特徴を有する。
　ここで、相補鎖との二重鎖形成能とは、相補鎖となるＲＮＡと、二重鎖の形成しやすさをいう。二重鎖形成能は、例えば、本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーと、天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解温度（Ｔｍ）で表すことができる。Ｔｍは、例えば、温度の可変が可能なセルを装備した紫外可視分光光度計を用い、２６０ｎｍにおける吸光度を各温度で測定し、融解曲線を得ることによって求めることができる。
　本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーが、相補鎖との二重鎖形成能に優れる理由は不明であるが、本発明者らは以下のように考えている。すなわち、ＲＮＡとＤＮＡとの二重鎖、及びＲＮＡとＲＮＡとの二重鎖を形成する場合には、Ａ型の二重らせん構造を形成する。この場合に、本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中のリン原子に結合した硫黄原子又はボラノ基が、同一分子内の核酸塩基中のピリミジン基の５位の炭素原子に結合した基と近接するようになる。この際、リン原子の絶対立体配置が一方の場合、例えば硫黄原子である場合は、絶対立体配置がＲｐの場合に、該ピリミジン基の５位の基と、空間的に相互作用しやすくなると考えられる。ボラノ基の場合には、絶対立体配置がＳｐの場合に、該ピリミジン基の５位の基と、空間的に相互作用しやすくなると考えられる。
　従って、核酸塩基がピリミジンである場合には、該硫黄原子やボラノ基との強い相互作用が生じることにより、分子内の構造がより安定化する結果、さらに相補鎖との結合もより強固となり、結果としてＡ型のらせん構造がより安定化するものと考えられる。
　従って、このような相互作用があるほど、結果として相補鎖（ＲＮＡ）との結合がより強固となると考えられるため、例えば、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中に、上記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つを３個以上連続している構造を存在させることにより、当該構造部分が連続しているか否かにかかわらず、該核酸オリゴマーの相補鎖との結合がより強固となり、Ｔｍ値はより上昇する。
　本明細書では、適宜「ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子」を単に、“ピリミジン塩基の５位の水素原子”と称し、前記水素原子を置換した水素原子以外の基を、“ピリミジン塩基の５位の置換基”と称することがある。
　本明細書において「モノマー」とは、核酸オリゴマーを製造する際に、核酸オリゴマーのヌクレオチド単位を導入するために使用される核酸をいう。
　一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び上記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位を“特定ヌクレオチド単位”と称することがあり、特定ヌクレオチド単位以外のヌクレオチド単位を、単に“他のヌクレオチド単位”と称することがある。また、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中、特定ヌクレオチド単位が３個～５０個連続している部分の構造を、“特定ヌクレオチド構造”と称することがある。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーのリン原子の絶対立体配置は、例えば、合成した前記オリゴマーを、ＨＰＬＣ等で精製後に、酵素分解法及び３１Ｐ－核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ－ＮＭＲ）によって決定することができる。また、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーにおける立体化学的純度（ジアステレオマー的な純度）は、前記３１Ｐ－核磁気共鳴スペクトル及び旋光計等を用いて測定することで得ることができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　また本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
　さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　以下、本発明について説明する。
＜ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー＞
　下記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、３個～５０個連続する構造を含み、塩基長が８塩基～５０塩基であるＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　一般式（１）中、Ｒ１は、水素原子、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリアルキルシリルオキシ基又はハロゲニル基を表す。一般式（１）及び一般式（２）中、各Ｂｓ１は、それぞれ独立して、保護基を有していてもよいピリミジン塩基であり、前記ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子は、水素原子以外の基で置換されていてもよい。一般式（１）及び一般式（２）中、Ｘは、それぞれ独立して、Ｓ－Ｚ＋又はＢＨ３ －Ｚ＋を表す。Ｚ＋は、カウンターカチオンを示す。一般式（２）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を表す。Ｒ２及びＲ３は互いに結合して環を形成してもよい。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーの長さ（塩基長）は、８塩基～５０塩基であればよく、本標的となる核酸（ＲＮＡ）の種類、長さ等に応じて所望の長さを適宜選択できる。本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーの長さは、特に限定されないが、アンチセンス医薬への応用の観点から、１０塩基～３０塩基であることが好ましく、１０塩基～２１塩基がより好ましい。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーの塩基配列は、二重鎖形成能の観点から、標的となるＲＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように適宜選択されるが、場合によって、異なる塩基を１つ以上含む塩基配列であってもよい。
　一般式（１）及び一般式（２）中、Ｘとしては、Ｓ－Ｚ＋又はＢＨ３ －Ｚ＋であればよい。Ｚ＋としては、例えば、有機アミン化合物由来のカチオン、又は無機及び金属カチオンを挙げることができる。有機アミン化合物由来のカチオンとしては、三級アルキルアンモニウムイオン、ヘテロ芳香族イミニウムイオン、ヘテロ環イミニウムイオンを挙げることができ、無機及び金属カチオンとしては、アンモニウムイオン又は一価の金属イオン等が挙げられる。具体的には、トリエチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオン、１，８－ジアザビシクロ〔５，４，０〕ウンデカ－７－エニウムイオン、アンモニウムイオン、リチウムイオン、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等が挙げられる。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中の５’末端は、水酸基又は水酸基の保護基であってよく、３’末端は水素原子又は水酸基の保護基であってよい。水酸基の保護基は、例えば、アセチル基やフェノキシアセチル基（Ｐａｃ）などのアセチル保護基、ベンジル基や４－メトキシベンジル基などのベンジル保護基、ベンゾイル基、ピバロイル基、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）などのトリチル保護基、トリメチルシリル基（ＴＭＳ）やＴｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）などのシリル保護基、２－（シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）やシアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）などのエート保護基など適宜の保護基を用いることができる。水酸基の保護基についてはＧｒｅｅｎら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．などの成書を参照することができる。ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中の５’末端及び／又は３’末端が保護基である場合には、合成過程においてこの保護基又は他の保護基を選択的に脱離させることができるように、該保護基は他の保護基とは異なる保護基であることが好ましい。ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中の５’末端及び／又は３’末端の保護基としては、例えばトリチル保護基を用いることが好ましく、４，４’－ジメトキシトリチル基を用いることがより好ましい。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中の特定ヌクレオチド構造は、一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくともいずれかが３個～５０個連続している構造であればよく、例えば、一般式（１）で表されるヌクレオチド単位のみで形成される構造であってもよいし、一般式（２）で表されるヌクレオチド単位のみで形成される核酸オリゴマーであってもよい。また、一般式（１）で表されるヌクレオチド単位と一般式（２）で表されるヌクレオチド単位とが一定の繰り返しパターンで連続している構造、あるいは無秩序に連続している構造であってもよい。
　また、本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、特定ヌクレオチド単位が３個～５０個連続している構造を含んでいれば、他のヌクレオチド単位を有するもの（以下、適宜「キメラオリゴマー」と称する）であってもよい。キメラオリゴマーである場合の、他のヌクレオチド単位については特に制限はなく、例えば、特開２０１５－０９３８５３号公報の段落００５１の（Ｖ）に記載されている天然型のモノマー及び誘導された天然型のモノマーを縮合して得られるヌクレオチド単位等が挙げられる。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中、特定ヌクレオチド構造は、キメラオリゴマーであるか否かに関わらず、５個～３０個連続している構造を含むことが好ましい。５個以上であることで、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーのＲＮＡとの二重鎖形成能をより高めることができ、３０個以下であることで、より使用性が向上する。さらに、７個～２５個連続していることがより好ましい。
　キメラオリゴマーの場合、キメラオリゴマー中の特定ヌクレオチド構造の、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中での位置については、特に制限はなく、例えば、５’末端側や３’末端側に存在してもよく、キメラオリゴマー中に連続して存在してもよい。また、キメラオリゴマー中、特定ヌクレオチド構造それぞれを構成するヌクレオチド単位の合計数を、単に、「特定ヌクレオチド単位の総和」、と称することがある。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー中、特定ヌクレオチド単位の総和の、前記核酸オリゴマーの塩基長に対する比率は、特に限定されないが、二重鎖形成能の観点からは、４０％以上であることが好ましい。４０％以上であることで、よりＴｍ値を向上させやすい。また、６０％以上がさらに好ましく、７０％以上が特に好ましい。
　前記一般式（１）及び前記一般式（２）中のＲ１において、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基等を挙げることができる。
　アルケニルオキシ基としては、例えば、ビニルオキシ基、アリルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、２－メチル－１－プロペニルオキシ基、２－メチルアリルオキシ基、２－ブテニルオキシ基等を挙げることができる。
　アシルオキシ基としては、例えば、炭素数１から６のアルキル－カルボニルオキシ基（例えば、メチルカルボニルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基等）、炭素数６から１０のアリール－カルボニルオキシ（例えば、ベンゾイルオキシ基）などが挙げられる。
　トリアルキルシリルオキシ基としては、例えば、トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基などを挙げることができる。
　ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基などを挙げることができる。
　Ｒ１としては、二重鎖形成能の点から、上記の中でも、水素原子、アルコキシ基及びトリアルキルシリルオキシ基が好ましい。
　また、アルコキシ基としては、炭素数１～１２のアルコキシ基が好ましく、さらに炭素数１～６のアルコキシ基がより好ましい。
　また、ハロゲニル基としてはフルオロ基がより好ましい。
　前記一般式（１）及び前記一般式（２）中、Ｂｓ１はピリミジン塩基を表し、保護基を有していてもよい。ピリミジン塩基が保護基を有する場合、保護基の種類は特に限定されない。ピリミジン塩基として、アミノ基を有するシトシン塩基が選択される場合、シトシン塩基のアミノ基を保護する観点から、保護基として、例えば、ベンジル基、４－メトキシベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、（ジメチルアミノ）メチレン基等を挙げることができる。
　また、ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子は、水素原子以外の原子で置換されていてもよい。置換されていてもよい置換基としては、特に制限されない。しかし、本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーのＲＮＡとの二重鎖形成能の観点から、前記置換基は、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキニル基、アシル基及びハロゲニル基から選ばれるいずれか１つの基であることが好ましい。また、前記核酸オリゴマー中の各ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する置換基は、それぞれが同じ基であっても、異なっていてもよい。
　前記アルキル基としては、例えば、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１～１０のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基及びｎ－オクチル基等が挙げられる。
　前記シクロアルキル基としては、シクロプロピル基及びシクロヘキシル基が挙げられる。
　前記アルケニル基としては、炭素数２～１０の直鎖、分岐鎖もしくは環状のものを挙げることができる。具体的には、例えばビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基及びアリル基などがあげられる。
　前記アリール基としては、炭素数６～１２のものを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、ビフェニル等を挙げることができる。
　前記ヘテロアリール基としては、炭素数３～１０のものを挙げることができる。具体的には、１，２，３－トリアゾール、イミダゾール及びチオフェン等が挙げられる。
　前記アルキニル基としては、炭素数２～１０の直鎖もしくは分岐のものを挙げることができる。具体的には、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－メチル－３－ブチニル基、１－ペンチニル基、２－ペンチニル基、３－ペンチニル基、４－ペンチニル基、１－メチル－２－ブチニル基、２－メチル－３－ペンチニル基、１－ヘキシニル基、１，１－ジメチル－２－ブチニル基等などがあげられる。
　前記アシル基としては、例えば、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１～１０のアルカノイルを挙げることができる。具体的には、例えば、アセチル基、ｎ－プロピオニル基、イソプロピオニル基、ｎ－ブチリル基及びヘキサノイル基などがあげられる。
　上記の置換基のうち、二重鎖形成能の観点からは、炭素数２～５のアルキル基、炭素数２～５のアルケニル基、炭素数２～５のアルキニル基及びハロゲニル基が好ましく、さらに、炭素数２～５のアルキニル基及びハロゲニル基がより好ましく、炭素数３～４のアルキニル基が特に好ましい。
　前記一般式（２）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であればよい。前記アルキル基としては、例えば、直鎖状又は分岐鎖状の炭素数１～１０のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基及びｎ－オクチル基等が挙げられる。
　また、Ｒ２及びＲ３は、互いに結合して環を形成してもよい。具体的には、例えば、Ｒ２Ｒ３、及びＲ２が結合するＲ３以外の炭素原子が、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロヘキサン環等の環状構造を形成してもよい。
　また、前記一般式（１）及び前記一般式（２）中のピリミジン塩基としては、二重鎖形成能の観点からは、下記一般式（３）又は一般式（４）で表される基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 
　一般式（３）及び一般式（４）中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基又はハロゲニル基を表す。一般式（３）及び一般式（４）中のカルボニル基及びアミノ基は、保護基を有していてもよい。
　炭素数１～１０のアルキル基としては、直鎖状又は分岐鎖状のものを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基等が挙げられる
　炭素数２～１０のアルケニル基としては、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
　炭素数２～１０のアルキニル基としては、エチニル基、１－プロピニル基、２－プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－メチル－３－ブチニル基、１－ペンチニル基、２－ペンチニル基、３－ペンチニル基、４－ペンチニル基、１－メチル－２－ブチニル基、などが挙げられる。
　上記の中でも、Ｒ４及びＲ５は、炭素数２～５のアルキル基、炭素数２～５のアルケニル基、炭素数２～５のアルキニル基であることがより好ましく、さらに、炭素数３～４のアルキル基、炭素数３～４のアルケニル基、炭素数３～４のアルキニル基であることが特に好ましい。
　また、保護基としては、公知のものであれば特に制限はなく、例えば、上記一般式（４）中の保護基としては、アセチル基、イソブチル基、ベンゾイル基及びジメチルアミノメチレン基等が挙げられ、標的となるＲＮＡの塩基配列の種類や長さ等に応じて、適宜調整される。
　また、ＲＮＡとの二重鎖形成能の観点から、一般式（１）及び一般式（２）中のＢｓ１は、上記一般式（３）及び（４）のうち、一般式（３）で表される塩基であることが好ましい。
　上記のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、特定ヌクレオチド単位を３個～５０個連続して含むように製造することができれば、製造方法としては特に限定されない。しかし、製造し易さの点からは、特定ヌクレオチド単位を構成することができるモノマーを合成する工程（モノマー合成工程）の後、前記モノマー合成工程によって得られた前記モノマーを、順次縮合させる工程（縮合工程）によって、上記のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを製造することが好ましい。
　上記モノマー合成工程において、上記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位を形成するためのモノマーの合成方法としては、例えば、文献［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１３０，１６０３１－１６０３７］及び特開２０１５－４４８４２号公報に記載のモノマーの合成方法を参考に、ピリミジン塩基の５位に適宜置換基が導入されたヌクレオチドの誘導体であって、かつリン原子の絶対立体配置が制御されたヌクレオチドの誘導体を合成することで、次の縮合工程に用いることができるモノマーを得ることができる。また、上記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位を形成するためのモノマーの合成方法としては、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＬＮＡ）の核酸塩基単位を合成する公知の方法、例えば、特開２０１５－０９３８５３号公報等に記載のモノマーの合成方法を参考に、合成することができる。
　また、以下の縮合工程に用いるモノマーの立体化学的純度としては、例えば、９７％以上のものを用いることが好ましい。
　縮合工程においては、例えば、和田らの文献［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７７，７９１３（２０１２）］を参考にして、所望の塩基配列及び所望のヌクレオチド単位の種類になるように、モノマー合成工程で得たモノマーを、順次縮合する方法が挙げられる。すなわち、標的となるＲＮＡの塩基配列を考慮して、上記のモノマーを縮合させることで、ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを得ることができる。
　前記文献に記載のモノマーの縮合反応では、リン原子の絶対立体配置を高度に維持して縮合することが可能であるため、上記モノマー合成工程で得られたモノマーを用いて当該縮合反応させることにより、結果として、立体化学的純度の高い本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを得ることができる。また、モノマーの縮合においては、用いるモノマー中のピリミジン塩基の５位の置換基の種類として、例えば、すべて一定の置換基が結合した塩基を有するモノマーを用いてもよく、異なる置換基が結合した塩基を有するモノマーを用いてもよい。
　ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーがキメラオリゴマーである場合には、上記モノマー合成工程によってモノマーを合成した後、上記縮合工程において、標的となるＲＮＡの塩基配列を考慮して、例えば、上記のモノマー及び他のヌクレオチド単位を構成することができるモノマーの両方を用いて、適宜縮合させることで合成することができる。具体的には、例えば、額賀らの文献［額賀陽平; 岡夏央; 前田雄介; 和田猛, “リン原子の立体を制御したＰＳ／ＰＯキメラオリゴヌクレオチドの固相合成”, アンチセンス・遺伝子・デリバリーシンポジウム2014 講演予稿集, p. 52］及びＯｋａらの文献［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１３０，１６０３１－１６０３７］に記載の方法を参考に、上記のモノマー合成工程によって得られたモノマーに、前記モノマー及び他のヌクレオチド単位を構成することができるモノマーを適宜縮合させることで得ることができる。
　上記のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーの製造方法においては、縮合工程後に、適宜保護基脱離工程を設けてもよい。保護基脱離工程で使用し得る脱保護剤としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸等を挙げることができる。
　上記の方法で得られた核酸オリゴマーは、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）、イオン交換ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の精製方法により精製することができる。
　本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、標的とするＲＮＡの塩基配列に相補的となるように設計することにより、標的とするＲＮＡに対する二本鎖形成能に優れたアンチセンス分子として使用することができる。例えば、標的とするＲＮＡが疾患関連遺伝子の部分配列に相当する場合には、本発明のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーは、翻訳阻害能の高いアンチセンス医薬等の医薬用途に好ましく用いられる。
　以下、本発明を実施例にて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　各種分析器は以下に示した機種を用いた。
１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）：ＪＮＭ-ＬＡ　４００（４００ＭＨｚ）
１３Ｃ－核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ－ＮＭＲ）：ＪＮＭ-ＬＡ　４００（１００．５ＭＨｚ）
３１Ｐ－核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ－ＮＭＲ）：ＪＮＭ-ＬＡ　４００（１６１．８ＭＨｚ）
　なお、１Ｈ－ＮＭＲにはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を、１３Ｃ－ＮＭＲにはＣＤＣｌ３（δ７７．１６ｐｐｍ）を内部標準として用い、３１Ｐ－ＮＭＲは８５％Ｈ３ＰＯ４を外部標準として用いた。
ＥＳＩ　ＭＳ：　Ｖａｒｉａｎ　９１０－ＭＳ
紫外可視分光光度計：ＪＡＳＣＯ　Ｖ－５５０　ＵＶ／ＶＩＳ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
　なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。実施例中、ＨＮＥｔ３はトリエチルアミンを示し、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチルを示し、その他の略号は上記説明中のものと同義である。
＜オキサザホスホリジンモノマーの合成＞
　オキサザホスホリジンモノマーは、ＤＭＴｒ基で保護した各ヌクレオシド（化合物３a～３e）とアミノアルコールから誘導した化合物（化合物Ｄ２又は化合物Ｌ２）とを反応させて合成した。
　以下、詳細について述べる。
（２－クロロオキサザホスホリジンＤ２の合成）
　アミノアルコールである化合物Ｄ１（１．７７ｇ、１０ｍｍｏｌ）をトルエンで繰り返し共沸乾燥し、該トルエン溶液５ｍＬにメチルモルホリン２．２０ｍＬ（２０ｍｍｏｌ）を加え混合溶液とした。該混合溶液に三塩化リン８７０μＬ（１０ｍｍｏｌ）を含むトルエン５．０ｍＬ溶液を、０℃で撹拌しつつ添加し、さらに室温で２時間撹拌して反応を行った。反応後に生じた塩をＡｒ雰囲気下、－７８℃でろ別し、アルゴン雰囲気下、減圧濃縮することで、黄色オイル状の２－クロロ－１，３，２－オキサザホスホリジン（化合物Ｄ２）２．０９ｇを得た。得られた化合物Ｄ２はこれ以上の精製はおこなわず、次の化合物の合成に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 
　また、Ｄ２のジアステレオマーであるＬ２については、化合物Ｄ１の代わりに化合物Ｌ１を用い、上記と同様の方法で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 
（化合物３ａ～化合物３ｅの準備）
　以下、各オキサザホスホリジンモノマーの合成に用いる、５’－Ｏ－ジ（p－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシウリジン（化合物３ａ）、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－チミジン（化合物３ｂ）、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシブロモウリジン（化合物３ｃ）、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシヨードウリジン（化合物３ｄ）及び５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシプロピニルウリジン（化合物３ｅ）は、文献［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０４，１３１６－１３１９］に記載の方法を参考に、２’－デオキシウリジン（ＴＣＩ社製）、チミジン（和光純薬工業株式会社）、２’－デオキシブロモウリジン（和光純薬工業株式会社）、２’－デオキシヨードウリジン（和光純薬工業株式会社）から合成した。５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシプロピニルウリジン（化合物３ｅ）は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．４５，２４５７－２４６１に記載の方法を参考に５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシヨードウリジン（化合物３ｄ）から合成した。
（オキサザホスホリジンモノマーの合成）
<化合物（Ｓｐ）－４ａの合成>
　化合物３ａ（５３１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｄ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、クロロホルム３００ｍＬ、飽和炭酸水素水溶液（１００ｍＬ）を加えて分液操作を行い、有機相を飽和炭酸水素水溶液１００ｍＬで２回洗浄し、さらに、回収した洗浄液にクロロホルムを添加した後分液操作を行い、有機層を回収した。回収したすべての有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、溶媒を減圧蒸留去して残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１６ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（７０／３０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、（Ｓｐ）－４ａ（３１３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を収率４３％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ7.88-7.86(d, 1H), 7.41-7.18(m, 37H), 6.85-6.83(d, 7H), 6.32-3.29(t, 1H), 5.74-5.73(d, 1H), 5.34-5.31(d, 1H), 4.94(m, 1H), 4.16(m, 1H), 3.89(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.59(m, 2H), 3.18(m, 1H), 2.76(br, 1H), 2.49(m, 1H), 2.34(m, 1H), 1.85(m, 2H), 1.65(m, 1H), 1.25-1.16(m, 4H), 0.99(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.89
<化合物（Ｓｐ）－４ｂの合成>
　化合物３ｂ（５４４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｄ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（７０／３０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、（Ｓｐ）－４ｂ（３３０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を収率４４％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 
<化合物（Ｓｐ）－４ｃの合成>
　化合物３ｃ（６１１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｄ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．５（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．５（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｓｐ）－４ｃ（２８０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を収率３０％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ81.2(s, 1H), δ7.44-7.23(d, 19H), 6.82-6.84(d, 4H), 6.32(t, 1H), 5.71-5.70(d, 1H), 4.91(m, 1H), 4.21(m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.78(s, 6H), 3.55 (m, 1H), 3.(m, 1H), 2.53(m, 1H), 2.33(m, 1H), 1.64(m, 2H), 1.28- 1.20(m, 1H), 1.01-0.96(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.10
<化合物（Ｓｐ）－４ｄの合成>
　化合物３ｄ（６５８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｄ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１７ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．１（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｓｐ）－４ｄ（４２０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を収率４９％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ8.17(s, 1H), δ7.46-7.25(d, 19H), 6.87-6.85(d, 4H), 6.32(t, 1H), 5.70-5.68(d, 1H), 4.89(m, 1H), 4.21(m, 1H), 3.92-3.89(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.55(m, 1H), 3.48(dd, 1H), 3.37(dd, 1H), 2.89(m, 1H), 2.56-2.50(m, 1H), 2.36-2.23(m, 1H), 1.67-1.56(m, 2H), 1.03-0.95(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ155.55
<化合物（Ｓｐ）－４ｅの合成>
　化合物３ｅ（６１２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｄ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．１（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｓｐ）－４ｅ（３５０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を収率４９％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ8.04(s, 1H), δ7.47-7.23(d, 19H), 6.86-6.84(d, 4H), 6.30(t, 1H), 5.72-5.70(d, 1H), 4.91(m, 1H), 4.21(m, 1H), 3.92-3.89(m, 1H), 3.79(s, 6H), 3.56(m, 1H), 3.42(m, 2H), 3.18(m, 1H), 2.52(m, 1H), 2.33(m, 1H), 1.69-1.52(m, 5H), 1.26-1.20(m, 1H), 1.01-0.96(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.01
<化合物（Ｒｐ）－４ａの合成>
　化合物３ａ（５３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｌ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（７０／３０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｒｐ）－４ａ（３６０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を収率４９％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ7.82-7.81(d, 1H), 7.38-7.23(m, 16H), 6.82-6.79(dd, 4H), 6.33-(t, 1H), 5.75-5.73(d, 1H), 5.31-5.29(d, 1H), 4.95(m, 1H), 4.11(m, 1H), 3.88(m, 1H), 3.77(s, 3H), 3.76(s, 3H), δ3.56(m, 1H), 3.48(dd, H), 3.44(dd, 1H), 3.19(m, 1H), 2.62(m, 1H), 2.34(m, 1H), 1.66(m, 4H), 1.32(m, 1H), 1.19(m, 1H), 0.94(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.87
<化合物（Ｒｐ）－４ｂの合成>
　化合物３ｂ（５４５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｌ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（７０／３０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｒｐ）－４ｂ（３５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を収率４７％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 
<化合物（Ｒｐ）－４ｃの合成>
　化合物３ｃ（６１１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｌ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．１（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｒｐ）－４ｃ（３３０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を収率４１％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ8.06(s, 1H), δ7.42-7.21(d, 19H), 6.83-6.80(d, 4H), 6.35(t, 1H), 5.74-5.72(d, 1H), 4.90(m, 1H), 4.15(m, 1H), 3.87-3.83(m, 1H), 3.76(s, 6H), 3.58(m, 1H), 3.39(m, 2H), 3.18(m, 1H), 2.65(m, 1H), 2.33(m, 1H), 1.64(m, 2H), 1.21-1.15(m, 1H), 0.99-0.91(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.46
<化合物（Ｒｐ）－４ｄの合成>
　化合物３ｄ（６５７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｌ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．５（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｒｐ）－４ｄ（３６０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を収率４２％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ8.13 (s, 1H), δ7.43-7.16(d, 22H), 6.83-6.81(d, 4H), 6.34(t, 1H), 5.73-5.71(d, 1H), 4.89(m, 1H), 4.16(m, 1H), 3.85-3.05(m, 1H), 3.77(s, 6H), 3.61-3.55(m, 1H), 3.38(m, 2H), 3.20-3.14(m, 1H), 2.64(m, 1H), 2.32(m, 2H),1.64(m, 2H), 1.21(m, 3H), 1.19-1.15(m, 1H), 0.96-0.91(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.23
<化合物（Ｒｐ）－４ｅの合成>
　化合物３ｅ（５３１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンで繰り返し共沸し、テトラヒドロフラン５ｍＬ溶液とし、トリエチルアミン０．９７ｍＬ（７ｍｍｏｌ）を加えて混合し－７８℃に冷却し、化合物Ｌ２（７２５ｍｇ）を溶解したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）６ｍＬを滴下した後、室温で２時間攪拌した。その後、化合物（Ｓｐ）－４ａの方法と同様の方法によって残渣を得た。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１７ｇのＮＨ－シリカゲル、富士シリシア社製）［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）から０／１００／０．１（ｖ／ｖ／ｖ））］で分離精製後、溶媒を減圧留去することで、化合物（Ｒｐ）－４ｅ（４２０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を収率４０％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 
　1H NMR(400 Hz, CDCl3), δ7.98(s, 1H), δ7.45-7.20(d, 19H), 6.82-6.80(d, 4H), 6.34(t, 1H), 5.74-5.72(d, 1H), 4.90(m, 1H), 4.15(m, 1H), 3.88-3.84(m, 1H), 3.77(s, 6H), 3.58(m, 1H), 3.38(m, 2H), 3.19(m, 1H), 2.65(m, 1H), 2.33(m, 1H), 1.71-1.61(m, 5H), 1.26-1.16(m, 1H), 0.99-0.92(m, 1H)
31P NMR(400 Hz, CDCl3), δ156.6
（化合物５ａ、化合物５ｂ及び化合物５ｅの準備）
　以下、各オキサザホスホリジンモノマーの合成に用いる、５’－Ｏ－ジ（p－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシシチジン（化合物５ａ）、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－メチルシチジン（化合物５ｂ）、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシヨードシチジン（化合物５ｄ）及び５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシプロピニルシチジン（化合物５ｅ）は、文献［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０４，１３１６－１３１９］に記載の方法を参考に、２’－デオキシシジチン（ＴＣＩ社製）、５’－メチルシチジン（米国登録特許４，７５４，０２６号に記載の方法によりチミジンから合成した社）、２’－デオキシブロモシチジン（和光純薬工業株式会社）、２’－デオキシヨードシチジン（和光純薬工業株式会社）から合成した。５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシプロピニルシチジン（化合物５ｅ）は、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．４５，２４５７－２４６１に記載の方法を参考に５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシヨードシチジン（化合物５ｄ）から合成した。
<化合物（Ｓｐ）－６ａの合成>
　化合物（Ｓｐ）－６ａは、化合物３ａに代えて化合物５ａ（０．９６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記した化合物（Ｓｐ）－４ａの合成と同様にして、化合物（Ｓｐ）－６ａを合成した。また、精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件を［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）］とした以外は、化合物（Ｓｐ）－４ａの精製と同様にして無色の化合物（Ｓｐ）－６ａ（０．７０ｇ、０．８４ｍｍｏｌ、収率５６％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 
<化合物（Ｓｐ）－６ｂの合成>
　化合物（Ｓｐ）－６ｂは、化合物３ｂに代えて化合物５ｂ（０．９７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を用いた以外は、上記した化合物（Ｓｐ）－４ｂの合成と同様にして、化合物（Ｓｐ）－６ｂを合成および精製した。無色の（Ｓｐ）－６ｂを得た（０．７４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ、収率５８％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 
1H NMR (300 MHz, CHCl3) δ 8.29 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.87 (s, 1H), 7.51-7.26 (m, 17H), 6.85 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.42 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 5.70 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.98-4.90 (m, 1H), 4.22-4.21 (m, 1H), 3.93-3.85 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.60-3.37 (m, 3H), 3.22-3.08 (m, 1H), 2.56-2.45 (m, 1H), 2.44-2.35 (m, 1H), 1.76-1.56 (m, 5H), 1.29-1.16 (m, 1H), 1.04-0.95 (m, 1H)
31P NMR (161 MHz, CDCl3) δ 156.18. FAB-HR MS: Calcd. for [M+H]+; 853.3361. Found; 853.3364.
<化合物（Ｓｐ）－６ｅの合成>
　化合物（Ｓｐ）－６ｅは、化合物３ｅに代えて化合物５ｅ（０．６７ｇ、１ｍｍｏｌ）を用いたこと、および化合物Ｄ２の量を４８３ｍｇに変更した以外は、上記した化合物（Ｓｐ）－４ｅの合成と同様にして、化合物（Ｓｐ）－６ｅを合成した。また、精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件を［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（９０／１０／０．５、ｖ／ｖ／ｖから８０／２０／０．５、ｖ／ｖ／ｖ）］とした以外は、化合物（Ｓｐ）－４ｅの精製と同様に精製を行って、無色の化合物（Ｓｐ）－６ｅを得た（０．４０ｇ、０．４５ｍｍｏｌ、収率４５％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 
1H NMR (400 MHz, CHCl3) δ 8.33-8.23 (br, 3H), 7.53-7.23 (m, 17H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.34-6.29 (m, 1H), 5.72 (d, J= 6.3 Hz, 1H), 4.95-4.89 (m, 1H), 4.24 (m, 1H), 3.94-3.87 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.61-3.51 (m, 1H), 3.49-3.38 (m, 2H), 3.23-3.14 (m, 1H), 2.65-2.59 (m, 1H), 2.42-2.35 (m, 1H), 1.72- 1.59 (m, 5H), 1.26 -1.18 (m, 1H), 1.03-0.94 (m, 1H)
31P NMR (161 MHz, CDCl3) δ 156.50. FAB-HR MS: Calcd. for [M+H]+; 877.3361. Found; 877.3364.
<化合物（Ｒｐ）－６ａの合成>
　化合物（Ｒｐ）－６ａは、化合物３ａに代えて化合物５ａ（１．２７ｇ、２ｍｍｏｌ）を用いたこと、及び化合物Ｌ２の量を９６７ｍｇに変更した以外は、上記した化合物（Ｒｐ）－４ａの合成と同様にして、化合物（Ｒｐ）－６ａを合成した。また、精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件を［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（９０／１０／０．１、ｖ／ｖ／ｖから８０／２０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）］とした以外は、化合物（Ｒｐ）－４ａの精製と同様に精製を行って、無色の（Ｒｐ）－６ａを得た（０．５４ｇ、０．６５ｍｍｏｌ、収率３３％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
<化合物（Ｒｐ）－６ｂの合成>
　化合物（Ｒｐ）－６ｂは、化合物３ｂに代えて化合物５ｂ（０．９７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を用いた以外は、上記した化合物（Ｒｐ）－４ｂの合成と同様にして、化合物（Ｒｐ）－６ｂを合成した。また、精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件を［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（９０／１０／０．１、ｖ／ｖ／ｖから８０／２０／０．１、ｖ／ｖ／ｖ）］とした以外は、化合物（Ｒｐ）－４ｂと同様に精製を行って、無色の（Ｒｐ）－６ｂを得た（０．５４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ、４２％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
1H NMR (400 MHz, CHCl3) δ 8.29 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.50-7.23 (m, 17H), 6.81 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 4H), 6.44 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.96-4.90 (m, 1H), 4.17-4.15 (m, 1H), 3.86-3.79 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.62-3.54 (m, 1H), 3.52-3.39 (m, 2H), 3.14-3.22 (m, 1H), 2.68 -2.62 (m, 1H), 2.43-2.35 (m, 1H), 1.67-1.57 (m, 5H), 1.19 -1.15 (m, 1H), 0.98-0.90 (m, 1H)
31P NMR (161 MHz, CDCl3) δ156.55. FAB-HR MS: Calcd. for [M+H]+; 853.3361. Found; 853.3361.
<化合物（Ｒｐ）－６ｅの合成>
　化合物（Ｒｐ）－６ｅは、化合物３ｅに代えて化合物５ｅ（０．６８ｇ、１ｍｍｏｌ）を用いたこと、および化合物Ｌ２の量を４８３ｍｇに変更した以外は、上記した化合物（Ｒｐ）－４ｅの合成と同様にして、化合物（Ｒｐ）－６ｅを合成した。また、精製においてシリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件を［展開溶媒：トルエン／酢酸エチル／トリエチルアミン（８０／２０／０．５、ｖ／ｖ／ｖ）］とした以外は、化合物（Ｒｐ）－４ｅの精製と同様に精製を行って、無色の（Ｒｐ）－６ｅを得た（０．５３ｇ、０．６０ｍｍｏｌ、収率６０％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 
1H NMR (400 MHz, CHCl3) δ 8.25-8.22 (m, 3H), 7.55-7.20 (m, 17H), 6.81 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.34 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.93-4.87 (m, 1H), 4.19-4.18 (m, 1H), 3.90-3.83  (m, 1H), 3.76 (s, 7H), 3.63-3.53 (m, 1H), 3.40 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 3.23-3.14 (m, 1H), 2.77-2.73 (m, 1H), 2.42-2.35 (m, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.67-1.61- (m, 2H), 1.22-1.14 (m, 1H), 0.99-0.90 (m, 1H)
31P NMR (161 MHz, CDCl3) δ 156.65. FAB-HR MS: Calcd. for [M+H]+; 877.3361. Found; 877.3366.
　以上によって得られたオキサザホスホリジンモノマーの収率と純度を以下の表１に示す。なお、上記で得られたそれぞれの化合物の立体化学的純度は、いずれも９９％以上であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
 
　以上の結果から、すべてのモノマーが高い純度でかつ高い立体化学的純度で得られた。
＜ＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーの合成＞
　額賀らの文献［額賀陽平; 岡夏央; 前田雄介; 和田猛, リン原子の立体を制御したPS/POキメラオリゴヌクレオチドの固相合成, アンチセンス・遺伝子・デリバリーシンポジウム2014 講演予稿集, p. 52］及びＯｋａらの文献［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，１６０３１－１６０３７］に記載の方法に従って、５’末端及び３’末端に天然型のＣＧの塩基配列を有するキメラオリゴマーであるホスホロチオエート型核酸オリゴマー（５’－ＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧ－３’、１２ｍｅｒ）、末端に天然型のＡＴＡ及びＴＡＴの塩基配列を有するキメラオリゴマーであるホスホロチオエート型核酸オリゴマー（５’－ＡＴＡＣＣＣＣＣＣＴＡＴ－３’、１２ｍｅｒ）又はホスホロチオエート結合に代えてリン酸結合により結合する核酸オリゴマーを、上記で得られた各種オキサザホスホリジンモノマー等を用いて合成した。なお、ハロゲン修飾体であるモノマー（（ＳＰ）－４Ｃ、（ＲＰ）－４Ｃ、（ＳＰ）－４ｄ及び（ＲＰ）－４ｄ）を用いる場合には、上記文献に記載の“ウルトラマイルド”の条件に従って合成を行った。
　具体的な条件の一部を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　また、上記の合成方法によって得られた核酸オリゴマー（１２量体）のうち全ては、次の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）にて分離精製した。ＲＰ－ＨＰＬＣ及び分離精製は、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＨＰＬＣ装置（Ｂｏｘ－９００）に接続した逆相カラム（ＳＯＵＣＥＴＭ５ＲＰＣ　ＳＴ　５μｍ　ｃｏｌｕｍｎ（５μｍ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ））を用いて、室温、直線勾配５～２６％アセトニトリルの０．１Ｍのトリエチルアンモニウム炭酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を溶離液とし用い、流速１．０ｍｌ／分の条件で行われた。
　以下、表３－１及び表３－２に、得られた核酸オリゴマー及びＥＳＩ　ＭＳによる測定結果を示す。なお、表３－１及び表３－２のオリゴマーの名称中、「（Ｓｐ）」及び「（Ｒｐ）」は、オリゴマー中のホスホロチオエート結合の絶対立体配置がＳｐ又はＲｐのどちらか一方であることを示す。
　また、「ｐｓ」は、５-メチルウラシル基を有するヌクレオチド残基（Ｔ）同士、ウラシル基を有するヌクレオチド残基（Ｕ）同士、シチジル基を有するヌクレオチド残基（Ｃ）同士又は５位が修飾されたウラシル基を有するヌクレオチド残基同士もしくは５位が修飾されたシチジル基を有するヌクレオチド残基同士、がホスホロチオエート結合していることを示し、例えば、「（Ｕｐｓ）８」は、連続した８個のウラシル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示す。また、（Ｔｐｓ）８は、８個の連続した５-メチルウラシル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示し、（Ｃｐｓ）６は、６個の連続したシチジル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示し、（Ｃｐｓ）２は、２個の連続したシチジル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示す。（ＢｒＵｐｓ）８は、５位に臭素原子（Ｂｒ）が結合した８個のウラシル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示し、（ＩＵｐｓ）８は、５位にヨウ素原子（Ｉ）が結合した８個のウラシル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示し、（ｐＵｐｓ）８は、５位にプロピニル基が結合した８個のウラシル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示し、（ＭｅＣｐｓ）６は、５位にメチル基（Ｍｅ）が結合した６個のシチジル基を有するヌクレオチド残基同士が、ホスホロチオエート結合していることを示す。（Ｃｐｓ）２（ｐＣｐｓ）２（Ｃｐｓ）２は、２個のシチジル基を有するヌクレオチド残基と、５位にプロピニル基が結合した２個のシチジル基を有するヌクレオチド残基と、２個のシチジル基を有するヌクレオチド残基とが、この順でホスホロチオエート結合していることを示す。
また、表３－１及び３－２中のすべてのオリゴマー中、ＣＧはオリゴマーの５’位及び３’位に、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）の２残基が天然型で結合していることを示し、ＡＴＡまたはＴＡＴは、オリゴマーの５’位及び３’位に、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）の３残基が天然型で結合していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　ＥＳＩ　ＭＳによる測定結果から、上記の番号１～１８の核酸オリゴマー（以下、核酸オリゴマー１～１８と称することがある）が得られたことが示された。得られた核酸オリゴマー１～１８を、以下の実施例及び比較例（ＲＮＡ又はＤＮＡとの二重鎖の融解温度測定）等に供した。
（ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（Ｔｐｓ）８ＣＧ）の調製）
　ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（Ｔｐｓ）８ＣＧ）は、５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシチミジンのホスホロアミダイトモノマー（Ｒｐ体及びＳｐ体の１：１混合物、ＧｌｅｎＲｓｅａｒｃｈ社製）を用い、上記と同様の方法でホスホロチオエート型核酸オリゴマーを合成した。ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（Ｔｐｓ）８ＣＧにおいては、（Ｔｐｓ）８のＴがランダムにＲｐ体またはＳｐ体である。
（ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（ｐＵｐｓ）８ＣＧ）の調製）
　ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（ｐＵｐｓ）８ＣＧ）は、５－プロピニル - ５’－Ｏ－ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）－２’－デオキシチミジンのホスホロアミダイトモノマー（Ｒｐ体及びＳｐ体の１：１混合物、ＧｌｅｎＲｓｅａｒｃｈ社製）を用い、上記と同様の方法でホスホロチオエート型核酸オリゴマーを合成した。ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（ｐＵｐｓ）８ＣＧ）においては、（ｐＵｐｓ）８のｐＵがランダムにＲｐ体またはＳｐ体である。
（リン酸結合型核酸オリゴマーの調製）
　以下に示すリン酸結合型核酸オリゴマーを調製した。
・ｄ（ＣＧ（Ｕ）８ＣＧ）
・ｄ（ＣＧ（Ｔ）８ＣＧ）
・ｄ（ＣＧ（ＢｒＵ）８ＣＧ）
・ｄ（ＣＧ（ＩＵ）８ＣＧ）
・ｄ（ＣＧ（ｐＵ）８ＣＧ）
・ｄ（ＡＴＡ（Ｃ）６ＴＡＴ）
・ｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣ）６ＴＡＴ）
　塩基に「ｐｓ」が付されていないことは、５-メチルウラシル基を有するヌクレオチド残基（Ｔ）同士、ウラシル基を有するヌクレオチド残基（Ｕ）同士、シチジル基を有するヌクレオチド残基（Ｃ）同士又は５位が修飾されたウラシル基を有するヌクレオチド残基同士もしくは５位が修飾されたシチジル基を有するヌクレオチド残基同士がリン酸結合していることを示し、例えば、「（Ｕ）８」は、連続した８個のウラシル基同士が、天然型であるリン酸結合で結合していることを示す。（Ｔ）８は、８個の連続した５-メチルウラシル基同士が、リン酸結合していることを示す。（Ｃ）６は、６個の連続したシチジル基同士が、リン酸結合していることを示す。（ＢｒＵ）８は、５位に臭素原子（Ｂｒ）が結合した８個のウラシル基同士がリン酸結合していることを示し、（ＩＵ）８は、５位にヨウ素原子（Ｉ）が結合した８個のウラシル基同士がリン酸結合していることを示し、（ｐＵ）８は、５位にプロピニル基が結合した８個のウラシル基同士がリン酸結合していることを示し、（ＭｅＣ）６は、５位にメチル基が結合した６個のシチジル基同士がリン酸結合していることを示す。
（標的核酸の調製）
　標的核酸となる天然型のＲＮＡ及びＤＮＡは、配列番号１～２に示す塩基配列のＲＮＡオリゴマー（配列番号１）及びＤＮＡオリゴマー（配列番号２）を、日本バイオサービス社の受託合成（ＨＰＬＣグレード）により入手した。
＜評価＞
＜実施例１～５及び比較例１－１～５－３：各核酸オリゴマーとＲＮＡの二重鎖、参考例１～８：各核酸オリゴマーとＤＮＡの二重鎖における融解温度測定＞
〔実施例１～５〕
　以下の表３の実施例１～５に示す核酸オリゴマーのＲｐ体（核酸オリゴマー２、４、６、９、１０）の各々０．４ｎｍｏｌと、標的核酸（天然型相補鎖ＲＮＡ）（配列番号１）の０．４ｎｍｏｌを１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ　ＮａＣｌ　緩衝液（ｐＨ　７．０）１６０μＬに溶かし、それぞれ、８連セルに１４０μＬ分を分注した。紫外可視分光光度計のセル温度を室温から５℃／ｍｉｎの速度で９５℃まで上昇させた後、９５℃の状態を５分間保持し、－０．５℃／分の速度で０℃になるまで温度を下降させ、アニーリングを行なった。オリゴマー溶液をそのまま０℃で３０間分静置した後、核酸オリゴマー溶液をセルに入れ、窒素雰囲気下、０．５℃／ｍｉｎの速度で９５℃まで温度を上昇させながら、０．２５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、融解曲線を得た。得られた二重鎖融解曲線から中線法により、Ｔｍ値を算出した。
〔比較例１－１～５－３〕
　核酸オリゴマーのＲｐ体（核酸オリゴマー２、４、６、９、１０）を核酸オリゴマーのＳｐ体（核酸オリゴマー１、３、５、７、８）又はリン酸結合型核酸オリゴマーに変更した以外は、実施例１～５と同様にして測定を行い、表３の比較例１－１～５－３に示す通り、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。
　測定結果を図１に示す。図１（Ａ）は、核酸オリゴマーのＳｐ体（核酸オリゴマー１、３、５、７、８）と天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示し、図１（Ｂ）は、核酸オリゴマーのＲｐ体（核酸オリゴマー２、４、６、９）と天然型相補鎖ＲＮＡとの二重鎖の融解曲線を示す。これらの融解曲線から、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。なお、融解温度（Ｔｍ）は、中線法で求めた。具体的には、得られた融解曲線の前遷移領域及び後遷移領域にそれぞれにおいて２点を指定し、回帰計算によりベースラインを求め、２つのベースラインの中線と融解曲線との交点を融解温度とした。その結果を表３に示す。また、ΔＴｍ（Ｒｐ－Ｓｐ）とは、Ｒｐ体である核酸オリゴマーのＴｍと、Ｓｐ体である核酸オリゴマーのＴｍとの温度差を示す。ΔＴｍ（ｐｓ－ｐｏ）は、Ｒｐ体またはＳｐ体であるホスホロチオエート結合オリゴマーのＴｍと、リン酸結合オリゴマーのＴｍとの温度差を示す。なお、ランダム核酸オリゴマー１０（ｍｉｘ－ＰＳ－ｄＴ）、ｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（Ｔｐｓ）８ＣＧ及びｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（ｐＵｐｓ）８ＣＧについても上記同様に二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。
〔参考例１～８〕
　参考例１～４及び参考例６～８は、実施例１～５において、核酸オリゴマーのＲｐ体（核酸オリゴマー２、４、６）を、核酸オリゴマーのＳｐ体（核酸オリゴマー１、３、５、７）に変更し、さらに標的核酸である天然型相補鎖ＲＮＡを、天然型相補鎖ＤＮＡ（配列番号２）に変更した以外は実施例１～５と同じにして、実施例１～５と同様に測定を行い、表３の参考例１～４及び参考例６～８にあるように、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。また、参考例５については、上記で合成したｍｉｘ－ｄ（ＣＧ（Ｔｐｓ）８ＣＧ）を用いて、上記参考例１～４等と同様に、測定を行い、表３の参考例５にあるように、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。また、参考例１～４及び参考例６～８のＴｍ値の算出に用いた融解曲線の結果を図２に示す。図２（Ａ）は、核酸オリゴマーのＳｐ体（核酸オリゴマー１、３、５、７、８）と天然型相補鎖ＤＮＡとの二重鎖の融解曲線を示し、図２（Ｂ）は、核酸オリゴマーのＲｐ体（核酸オリゴマー２、４、６、９）と天然型相補鎖ＤＮＡとの二重鎖の融解曲線を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
 
　表４に示すように、標的核酸をＲＮＡとした実施例１～５は、比較例１－１～５に比べてそれぞれ高いＴｍ値を示した。特に、Ｒｐ体である実施例５では、Ｓｐ体である比較例５－１に比べて顕著にＴｍ値が高いことが示された。また、実施例５は、リン酸結核酸オリゴマーである比較例５－２、及び、ホスホロチオエート型核酸オリゴマーとして通常使用されているＲｐ体のヌクレオチドとＳｐ体のヌクレオチドとが混合した核酸オリゴマーよりもＴｍ値が高いことも示された。従って、プロピニル基が結合したピリミジン塩基を含むホスホロチオエート型核酸オリゴマー（Ｒｐ体）がより二重鎖形成能が高いことが示された。また、実施例１～４は天然型の核酸オリゴマーよりＴｍ値は低いが、従来型のホスホロチオエート型核酸オリゴマーより二重鎖形成能が高く、かつ、天然型の核酸オリゴマーより顕著に高い安定性を有しており、核酸医薬として優れた特性を有している。
　これに対して、標的核酸をＤＮＡとした参考例１～８では、Ｒｐ体のＴｍ値とＳｐのＴｍ値が同程度であり、さらに、参考例１～４及び６～７では、むしろＲｐ体のＴｍ値がＳｐのＴｍ値よりも若干低下していることが示された。
〔実施例６～９〕
　表３に示した、以下のＲｐ体のホスホロチオエート型核酸オリゴマーのＥＳＩ　ＭＳによる測定結果を示す。
・（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１１、実施例６）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1205.49151. Found; 1205.49124.
・（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１３、実施例７）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1233.52281. Found; 1233.52511.
・（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ｐＣｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１５、実施例８）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]4-; 960.89029. Found; 960.89180.
・（Ｒｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）２（ｐＣｐｓ）２（Ｃｐｓ）２ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１７、実施例９）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1230.83527. Found; 1230.83978.
　実施例１～５に用いられた核酸オリゴマー（核酸オリゴマー２、４、６、９、１０）に代えて実施例６、７または９の核酸オリゴマー（核酸オリゴマー１１、１３、１７）に変更したこと、およびＴｍ値測定の際に、０．５℃／ｍｉｎの速度で９５℃まで温度を上昇させるのではなく０．２℃／ｍｉｎの速度で９５℃まで温度を上昇させたこと以外は実施例１～５と同様にして測定を行い、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。
〔比較例６－１～９－１〕
　上述に記載した、以下に示すＳｐ体のホスホロチオエート型核酸オリゴマーのＥＳＩ　ＭＳによる測定結果を示す。
・（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１２、比較例６－１）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1205.49151. Found; 1205.49371.
・（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１４、比較例７－１）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1233.52281. Found; 1233.52225.
・（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（ｐＣｐｓ）６ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１６、比較例８－１）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1281.52281. Found; 1281.52197.
・（Ｓｐ）－ｄ（ＡＴＡ（Ｃｐｓ）２（ｐＣｐｓ）２（Ｃｐｓ）２ＴＡＴ）（核酸オリゴマー１８、比較例９－１）
ESI-HR MS: Calcd. for [M]3-; 1230.83527. Found; 1230.83793.
　実施例１～５に用いられた核酸オリゴマー（核酸オリゴマー２、４、６、９、１０）に代えて比較例６－１、７－１または９－１の核酸オリゴマー（核酸オリゴマー１２、１４、１８）に変更した以外は実施例１～５と同様にして測定を行い二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。結果を表５に示す。
〔比較例６－２及び７－２〕
（リン酸型核酸オリゴマーのＴｍ測定）
　実施例１～５に用いられた核酸オリゴマー（核酸オリゴマー２、４、６、９、１０）に代えてリン酸型核酸オリゴマーであるｄ（ＡＴＡ（Ｃ）６ＴＡＴ）又はｄ（ＡＴＡ（ＭｅＣ）６ＴＡＴ）に変更した以外は実施例１～５と同様にして測定を行い、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を得た。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　実施例６、７および９のＲｐ体のホスホロチエート型核酸オリゴマーでは、Ｓｐ体のホスホロチエート型核酸オリゴマー（比較例６－１、７－１および９－１）より二重鎖形成能が顕著に高かった。また、実施例６および７のＲｐ体のホスホロチエート型核酸オリゴマーは、天然型のリン酸結合核酸オリゴマーと比較して、同等かそれ以上の二重鎖形成能を有していた。
　実施例６、比較例６－１および比較例６－２の二重鎖融解曲線を図３Ａに示す。実施例7、比較例７－１および比較例７－２の二重鎖融解曲線を図３Ｂに示す。実施例９および比較例９－１の二重鎖融解曲線を図３ＢＣ示す。
　このように、ＲＮＡハイブリッド形成用のホスホロチオエート型核酸オリゴマーにおいては、絶対立体配置がＲｐであることで有意に高いＴｍ値、すなわち二重鎖形成能の向上をもたらすことが示された。すなわち、二重鎖形成能に優れたＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマーを提供できることが示された。
　２０１６年３月９日に出願された日本国特許出願２０１６ー０４６１８１の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
　本発明の例示的実施形態についての以上の記載は例示および説明の目的でされたものであり、網羅的であることあるいは発明を開示されている形態そのものに限定することを意図するものではない。明らかなことではあるが、多くの改変あるいは変更が当業者には自明である。上記実施形態は発明の原理及び実用的応用を最もうまく説明し、想定される特定の用途に適するような種々の実施形態や種々の改変と共に他の当業者が発明を理解できるようにするために選択され、記載された。本発明の範囲の範囲は以下の請求項およびその均等物によって規定されることが意図されている。

Claims (4)

  1. 　下記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、３個～５０個連続する構造を含み、塩基長が８塩基～５０塩基であるＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     
    （一般式（１）中、Ｒ１は、水素原子、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリアルキルシリルオキシ基又はハロゲニル基を表す。一般式（１）及び一般式（２）中、各Ｂｓ１は、それぞれ独立して、保護基を有していてもよいピリミジン塩基であり、前記ピリミジン塩基の５位の炭素原子に結合する水素原子は、水素原子以外の基で置換されていてもよい。一般式（１）及び一般式（２）中、Ｘは、それぞれ独立して、Ｓ－Ｚ＋又はＢＨ３ －Ｚ＋を表す。Ｚ＋は、カウンターカチオンを示す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基を表す。Ｒ２及びＲ３は互いに結合して環を形成してもよい。）
  2. 　前記一般式（１）及び前記一般式（２）中、Ｂｓ１は、下記一般式（３）又は一般式（４）で表される基である請求項１に記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     
    （一般式（３）中、Ｒ４は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基又はハロゲニル基を表す。一般式（３）中のカルボニル基及びアミノ基は、保護基を有していてもよい。一般式（４）中、Ｒ５は、水素原子、炭素数１～１０のアルキル基、炭素数２～１０のアルケニル基、炭素数２～１０のアルキニル基又はハロゲニル基を表す。一般式（４）中のカルボニル基及びアミノ基は、保護基を有していてもよい。）
  3. 　前記塩基長が、１０塩基～３０塩基である請求項１又は請求項２に記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
  4. 　前記一般式（１）で表されるヌクレオチド単位及び前記一般式（２）で表されるヌクレオチド単位の少なくとも１つの単位が、５個～３０個連続する構造を含む請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のＲＮＡハイブリッド形成用核酸オリゴマー。
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