CN108713061B - Rna杂交形成用核酸低聚物 - Google Patents

Rna杂交形成用核酸低聚物 Download PDF

Info

Publication number
CN108713061B
CN108713061B CN201780016095.8A CN201780016095A CN108713061B CN 108713061 B CN108713061 B CN 108713061B CN 201780016095 A CN201780016095 A CN 201780016095A CN 108713061 B CN108713061 B CN 108713061B
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
nucleic acid
general formula
acid oligomer
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780016095.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108713061A (zh
Inventor
和田猛
吉野怜次郎
原伦太朗
额贺阳平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo University of Science
Original Assignee
Tokyo University of Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo University of Science filed Critical Tokyo University of Science
Publication of CN108713061A publication Critical patent/CN108713061A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108713061B publication Critical patent/CN108713061B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一种RNA杂交形成用核酸低聚物，其包含下述通式(1)和下述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一个单元接连3个～50个而成的结构，且碱基长为8个碱基～50个碱基。式中，R1表示氢原子、烷氧基、烯氧基、酰氧基、三烷基甲硅烷氧基或卤素基团。各Bs1各自独立地为可具有保护基的嘧啶碱基，与上述嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子可被氢原子以外的基团取代。X各自独立地表示S‑Z+或BH3 ‑Z+。R2和R3各自独立地表示氢原子或碳原子数1～10的烷基。R2和R3可彼此结合而形成环。

Description

RNA杂交形成用核酸低聚物
技术领域
本发明涉及RNA杂交形成用核酸低聚物。
背景技术
具有与靶核酸互补的碱基序列的反义分子能够形成与靶核酸互补的双链而阻碍由靶核酸生成蛋白质。在选择疾病相关基因作为靶核酸的情况下，反义分子直接对疾病相关基因产生作用，因此作为对基因治疗有效的药物而受到关注。
对于反义分子(核酸低聚物)，从高效阻碍作为靶的蛋白质生成的观点考虑，主要要求具有细胞膜透过性、核酸酶抗性、体内(例如，pH7.4的环境下)的化学稳定性、以及仅与特定的碱基序列形成稳定的双链的性质。作为反义分子，例如已知使用硫代磷酸酯化合物而得的核酸低聚物(以下，称为“硫代磷酸酯型核酸低聚物”)、使用硼烷磷酸酯化合物而得的核酸低聚物(以下，称为“硼烷磷酸酯型核酸低聚物”)，到目前为止有大量广泛的研究例，作为医药品而被实用化。硫代磷酸酯型核酸低聚物具有如下优点：由于具有非天然型结合而核酸酶抗性高，并且因脂溶性高而能够期待细胞膜透过性，进而免疫应答性也低。
另一方面，由于作为反义分子的靶的RNA等核酸为手性分子，因此认为反义分子的手性对与该互补链的结合亲和性、即双链形成能力产生影响，实际上报道了，硫代磷酸酯型核酸低聚物的磷原子上的绝对立体构型对与 RNA的结合亲和性产生影响(例如，NucleicAcids Res.1995,Vol.23, pp.5000)。
此外，施用核酸低聚物时，需要考虑在到达作为靶的核酸之前与生物体内的很多手性分子的相互作用。由此认为还需要明确施用的核酸低聚物所具有的手性。
对此报道了硫代磷酸酯型核酸低聚物、硼烷磷酸酯型核酸低聚物的立体选择性合成，且报道了被高度立体控制的DNA低聚物和RNA低聚物中的一部分与互补链的双链形成能力提高(例如，国际公开第2011/108682号、日本特开2015-093853号公报以及Org.Lett.2009,Vol.11,pp.967)。
发明内容
发明要解决的问题
但是，例如Org.Lett.2009,Vol.11,pp.967、国际公开第2011/108682号以及日本特开2015-093853号公报的硫代磷酸酯型核酸低聚物通过控制立体从而提高双链形成能力，但是难以说其水平是充分的。此外，在这些文献中，仅仅着眼于与核酸低聚物中的立体选择性有关的结构，对于其他结构几乎没有考虑。如此，可以说光学活性核酸低聚物与互补链(RNA)的结合亲和性(双链形成能力)有进一步提高的余地。
鉴于上述情况，本发明的问题在于提供与互补链的双链形成能力优异的RNA杂交形成用核酸低聚物。
用于解决问题的手段
用于解决上述问题的具体的手段如下。
＜1＞一种RNA杂交形成用核酸低聚物，其包含下述通式(1)所表示的核苷酸单元和下述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一种单元接连3个～50个而成的结构，且碱基长为8个碱基～50个碱基。
[化1]
Figure GDA0003244847870000031
(通式(1)中，R1表示氢原子、烷氧基、烯氧基、酰氧基、三烷基甲硅烷氧基或卤素基团。通式(1)和通式(2)中，各Bs1各自独立地为可具有保护基的嘧啶碱基，与上述嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子被氢原子以外的基团取代。通式(1)和通式(2)中，X各自独立地表示S-Z+或BH3 -Z+。Z+表示抗衡阳离子。R2和R3各自独立地表示氢原子或碳原子数1～10的烷基。 R2和R3可彼此结合而形成环。)
＜2＞根据＜1＞所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，上述通式(1)和上述通式(2)中，Bs1为下述通式(3)或通式(4)所表示的基团。
[化2]
Figure GDA0003244847870000032
(通式(3)中，R4表示氢原子、碳原子数1～10的烷基、碳原子数2～10的烯基、碳原子数2～10的炔基或卤素基团。通式(3)中的羰基和氨基可以具有保护基。通式(4)中，R5表示氢原子、碳原子数1～10的烷基、碳原子数2～10 的烯基、碳原子数2～10的炔基或卤素基团。通式(4)中的羰基和氨基可以具有保护基。)
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，上述碱基长为10个碱基～30个碱基。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，其包含上述通式(1)所表示的核苷酸单元和上述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一个单元接连5个～30个而成的结构。
发明效果
根据本发明，能够提供与互补链的双链形成能力优异的RNA杂交形成用核酸低聚物。
附图说明
图1A中(A)为表示所有的硫代磷酸酯结合中的磷原子的绝对立体构型为Sp的核酸低聚物与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线的图表。
图1B中(B)为表示所有的硫代磷酸酯结合中的磷原子的绝对立体构型为Rp的核酸低聚物与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线的图表。
图2A中(A)为表示所有的硫代磷酸酯结合中的磷原子的绝对立体构型为Sp的核酸低聚物与天然型互补链DNA的双链的熔解曲线的图表。
图2B中(B)为表示所有的硫代磷酸酯结合中的磷原子的绝对立体构型为Rp的核酸低聚物与天然型互补链DNA的双链的熔解曲线的图表。
图3A中(A)为表示核酸低聚物d(ATA(Cs)6TAT)、(Rp)-d(ATA(Cps)6TAT) 或(Sp)-d(ATA(Cps)6TAT)与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线的图表。
图3B中(B)为表示核酸低聚物d(ATA(MeCs)6TAT)、(Rp)-d(ATA(MeCps)6TAT)或(Sp)-d(ATA(MeCps)6TAT)与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线的图表。
图3C中(C)为表示核酸低聚物(Rp)-d(ATA(pCps)6TAT)或 (Sp)-d(ATA(pCps)6TAT)与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线的图表。
具体实施方式
本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物包含上述通式(1)所表示的核苷酸单元和下述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一个单元接连3个～50 个而成的结构，且碱基长为8个碱基～50个碱基。
本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物具有与作为互补链的RNA的双链形成能力优异这样的特征。
在此，与互补链的双链形成能力是指，与作为互补链的RNA形成双链的容易程度。双链形成能力例如可以由本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物与天然型互补链RNA的双链的熔解温度(Tm)表示。Tm例如可以通过使用安装有温度可变的小室的紫外可见分光光度计，在各温度下测定 260nm处的吸光度，获得熔解曲线而求出。
虽然本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物与互补链的双链形成能力优异的理由不明，但本发明人等认为如下。即，在形成RNA与DNA的双链、以及RNA与RNA的双链的情况下，形成A型双螺旋结构。该情况下，本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物中的与磷原子结合的硫原子或硼烷基会靠近与同一个分子内的核酸碱基中的嘧啶基的第5位碳原子结合的基团。此时，我们认为在磷原子的绝对立体构型为其中一种的情况下，例如为硫原子的情况下，当绝对立体构型为Rp时，容易在空间上与该嘧啶基的第5 位基团发生相互作用；而在硼烷基的情况下，当绝对立体构型为Sp时，容易在空间上与该嘧啶基的第5位基团发生相互作用。
因此认为，在核酸碱基为嘧啶的情况下，通过与该硫原子、硼烷基发生强的相互作用，从而使分子内的结构更稳定，结果，与互补链的结合也变得更加牢固，结果，A型螺旋结构更加稳定。
因此认为，这样的相互作用越大，结果是与互补链(RNA)的结合变得更加牢固，由此例如通过使上述通式(1)所表示的核苷酸单元和下述通式 (2)所表示的核苷酸单元中的至少一种接连3个以上而成的结构存在于RNA 杂交形成用核酸低聚物中，从而不论该结构部分是否接连，都会使该核酸低聚物与互补链的结合更加牢固，Tm值进一步上升。
在本说明书中，有时适当将“与嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子”简称为“嘧啶碱基的第5位氢原子”，将取代上述氢原子的氢原子以外的基团称为“嘧啶碱基的第5位取代基”。
在本说明书中，“单体”是指，在制造核酸低聚物时，为了导入核酸低聚物的核苷酸单元而使用的核酸。
有时将通式(1)所表示的核苷酸单元和上述通式(2)所表示的核苷酸单元称为“特定核苷酸单元”，有时将特定核苷酸单元以外的核苷酸单元简称为“其他核苷酸单元”。此外，有时将RNA杂交形成用核酸低聚物中、特定核苷酸单元接连3个～50个而成的部分的结构称为“特定核苷酸结构”。
RNA杂交形成用核酸低聚物的磷原子的绝对立体构型例如可以在将合成的上述低聚物用HPLC等纯化后，利用酶分解法和31P-核磁共振波谱 (31P-NMR)来确定。此外，RNA杂交形成用核酸低聚物中的立体化学纯度(非对映体的纯度)可以通过使用上述31P-核磁共振波谱和旋光仪等进行测定而得到。
在本说明书中，“工序”这一词不仅包括独立的工序，即使在无法明确区别于其他工序的情况下，只要能够实现该工序的预期目的，则也包含于本术语中。
此外，在本说明书中，“～”表示包含其前后记载的数值分别作为最小值和最大值的范围。
进而，在本说明书中，关于组合物中各成分的量，在组合物中存在多种对应于各成分的物质的情况下，只要没有特别指明，则是指组合物中存在的该多种物质的合计量。
以下，对本发明进行说明。
＜RNA杂交形成用核酸低聚物＞
RNA杂交形成用核酸低聚物包含接连3个～50个下述通式(1)所表示的核苷酸单元和下述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一种单元而成的结构，且碱基长为8个碱基～50个碱基。
[化3]
Figure GDA0003244847870000071
通式(1)中，R1表示氢原子、烷氧基、烯氧基、酰氧基、三烷基甲硅烷氧基或卤素基团。通式(1)和通式(2)中，各Bs1各自独立地为可具有保护基的嘧啶碱基，与上述嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子可被氢原子以外的基团取代。通式(1)和通式(2)中，X各自独立地表示S-Z+或BH3 -Z+。Z+表示抗衡阳离子。通式(2)中，R2和R3各自独立地表示氢原子或碳原子数 1～10的烷基。R2和R3可彼此结合而形成环。
RNA杂交形成用核酸低聚物的长度(碱基长)只要是8个碱基～50个碱基即可，可以根据作为本靶的核酸(RNA)的种类、长度等而适当选择所期望的长度。本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物的长度虽然没有特别限定，但从应用于反义药物的观点考虑，优选为10个碱基～30个碱基，更优选为10个碱基～21碱基。
关于RNA杂交形成用核酸低聚物的碱基序列，从双链形成能力的观点考虑，适当选择了能够成为与作为靶的RNA的碱基序列互补的碱基序列，但根据情况，也可以为包含1个以上不同的碱基的碱基序列。
通式(1)和通式(2)中，作为X，只要是S-Z+或BH3 -Z+即可。作为Z+，可以举出例如来源于有机胺化合物的阳离子、或无机和金属阳离子。作为来源于有机胺化合物的阳离子，可以举出烷基叔铵离子、杂芳香族亚胺离子、杂环亚胺离子，作为无机和金属阳离子，可以举出铵离子或一价金属离子等。具体而言，可以举出三乙基铵离子、N,N-二异丙基乙基铵离子、吡啶离子、1,8-二氮杂二环〔5,4,0〕十一-7-烯离子、铵离子、锂离子、钠离子和钾离子等。
RNA杂交形成用核酸低聚物中的5’末端可以为羟基或羟基的保护基， 3’末端可以为氢原子或羟基的保护基。羟基的保护基例如可以使用乙酰基、苯氧基乙酰基(Pac)等乙酰基保护基，苄基、4-甲氧基苄基等苄基保护基，苯甲酰基、新戊酰基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)等三苯甲基保护基，三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)等甲硅烷基保护基，2-(氰基乙氧基)乙基(CEE)、氰基乙氧基甲基(CEM)等醚保护基等适宜的保护基。关于羟基的保护基，可以参照Green等、Protective Groups in Organic Synthesis、3rd Edition、1999、John Wiley&Sons、Inc.等书籍。在RNA杂交形成用核酸低聚物中的5’末端和/或3’末端为保护基的情况下，优选该保护基为与其他保护基不同的保护基，以便能够在合成过程中使该保护基或其他保护基选择性地脱离。作为RNA杂交形成用核酸低聚物中的5’末端和/或3’末端的保护基，例如优选使用三苯甲基保护基，更优选使用4,4’-二甲氧基三苯甲基。
RNA杂交形成用核酸低聚物中的特定核苷酸结构只要是通式(1)所表示的核苷酸单元和通式(2)所表示的核苷酸单元中的任一种接连3个～50个而成的结构即可，例如，可以为仅由通式(1)所表示的核苷酸单元形成的结构，也可以为仅由通式(2)所表示的核苷酸单元形成的核酸低聚物。此外，还可以为通式(1)所表示的核苷酸单元和通式(2)所表示的核苷酸单元以一定的重复模式接连而成的结构、或者无序地接连而成的结构。
此外，本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物只要包含特定核苷酸单元接连3个～50个而成的结构，则也可以为具有其他核苷酸单元的低聚物(以下，适宜称为“嵌合低聚物”)。在为嵌合低聚物的情况下，对于其他核苷酸单元没有特别限制，可以举出例如日本特开2015-093853号公报的0051 段的(V)中记载的天然型单体以及将衍生的天然型单体缩合而得的核苷酸单元等。
RNA杂交形成用核酸低聚物中，特定核苷酸结构不管是否为嵌合低聚物都优选包含接连5个～30个而成的结构。通过设为5个以上，从而能够更加提高RNA杂交形成用核酸低聚物的与RNA的双链形成能力，通过设为 30个以下，从而使用性更加提高。进而，更优选接连7个～25个而成。
在嵌合低聚物的情况下，对于嵌合低聚物中的特定核苷酸结构在RNA 杂交形成用核酸低聚物中的位置，没有特别限制，例如可以存在于5’末端侧、3’末端侧，也可以在嵌合低聚物中连续存在。此外，有时将嵌合低聚物中构成各个特定核苷酸结构的核苷酸单元的合计数量简称为“特定核苷酸单元的总和”。
RNA杂交形成用核酸低聚物中，特定核苷酸单元的总和相对于上述核酸低聚物的碱基长的比率虽然没有特别限定，但从双链形成能力的观点考虑，优选为40％以上。通过设为40％以上，从而更容易提高Tm值。此外，进一步优选为60％以上，特别优选为70％以上。
关于上述通式(1)和上述通式(2)中的R1，作为烷氧基，可以举出例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基等。
作为烯氧基，可以举出例如乙烯氧基、烯丙氧基、1-丙烯氧基、异丙烯氧基、2-甲基-1-丙烯氧基、2-甲基烯丙氧基、2-丁烯氧基等。
作为酰氧基，可以举出例如碳原子数1至6的烷基-羰氧基(例如，甲基羰氧基、乙基羰氧基等)、碳原子数6至10的芳基-羰氧基(例如，苯甲酰氧基)等。
作为三烷基甲硅烷氧基，可以举出例如三甲基甲硅烷氧基、三乙基甲硅烷氧基等。
作为卤素基团，可以举出例如氟基、氯基、溴基等。
作为R1，从双链形成能力的方面考虑，上述基团中优选氢原子、烷氧基和三烷基甲硅烷氧基。
此外，作为烷氧基，优选为碳原子数1～12的烷氧基，进而，更优选为碳原子数1～6的烷氧基。
此外，作为卤素基团，更优选为氟基。
上述通式(1)和上述通式(2)中，Bs1表示嘧啶碱基，可以具有保护基。在嘧啶碱基具有保护基的情况下，保护基的种类没有特别限定。在选择具有氨基的胞嘧啶碱基作为嘧啶碱基的情况下，从保护胞嘧啶碱基的氨基的观点考虑，作为保护基，可以举出例如苄基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基等。
此外，与嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子可被氢原子以外的原子取代。作为可被取代的取代基，没有特别限制。但是，从本发明的RNA 杂交形成用核酸低聚物的与RNA的双链形成能力的观点考虑，上述取代基优选为从烷基、环烷基、烯基、芳基、杂烷基、炔基、酰基和卤素基团中选择的任一个基团。此外，上述核酸低聚物中的与各嘧啶碱基的第5位碳原子结合的各个取代基可以为相同的基团，也可以是不同的。
作为上述烷基，可以举出例如直链状或支链状的碳原子数1～10的基团。具体而言，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基和正辛基等。
作为上述环烷基，可以举出环丙基和环己基。
作为上述烯基，可以举出碳原子数2～10的直链、支链或环状的烯基。具体而言，可以举出例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和烯丙基等。
作为上述芳基，可以举出碳原子数6～12的芳基。具体而言，可以举出例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基等。
作为上述杂烷基，可以举出碳原子数3～10的杂烷基。具体而言，可以举出1,2,3-三唑基、咪唑基和噻吩基等。
作为上述炔基，可以举出碳原子数2～10的直链或支链的炔基。具体而言，可以举出例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3- 丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-甲基-3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-3-戊炔基、1-己炔基、1,1-二甲基 -2-丁炔基等。
作为上述酰基，可以举出例如直链状或支链状的碳原子数1～10的烷酰基。具体而言，可以举出例如乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基和己酰基等。
上述取代基之中，从双链形成能力的观点考虑，优选为碳原子数2～5 的烷基、碳原子数2～5的烯基、碳原子数2～5的炔基和卤素基团，进而，更优选为碳原子数2～5的炔基和卤素基团，特别优选为碳原子数3～4的炔基。
上述通式(2)中，R2和R3只要各自独立地为氢原子或碳原子数1～10的烷基即可。作为上述烷基，可以举出例如直链状或支链状的碳原子数1～10 的烷基。具体而言，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基和正辛基等。
此外，R2和R3也可以彼此结合而形成环。具体而言，例如R2R3、以及 R2所结合的R3以外的碳原子可以形成环丙烷环、环丁烷环、环己烷环等环状结构。
此外，作为上述通式(1)和上述通式(2)中的嘧啶碱基，从双链形成能力的观点考虑，优选为下述通式(3)或通式(4)所表示的基团。
[化4]
Figure GDA0003244847870000121
通式(3)和通式(4)中，R4和R5各自独立地表示氢原子、碳原子数1～10 的烷基、碳原子数2～10的烯基、碳原子数2～10的炔基或卤素基团。通式(3)和通式(4)中的羰基和氨基可以具有保护基。
作为碳原子数1～10的烷基，可以举出直链状或支链状的烷基。具体而言，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等。
作为碳原子数2～10的烯基，可以举出乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
作为碳原子数2～10的炔基，可以举出乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、 1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-甲基-3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基等。
上述基团中，R4和R5更优选为碳原子数2～5的烷基、碳原子数2～5的烯基、碳原子数2～5的炔基，进而，特别优选为碳原子数3～4的烷基、碳原子数3～4的烯基、碳原子数3～4的炔基。
此外，作为保护基，只要是公知的保护基就没有特别限制，例如，作为上述通式(4)中的保护基，可以举出乙酰基、异丁基、苯甲酰基和二甲基氨基亚甲基等，可以根据作为靶的RNA的碱基序列的种类、长度等而适当调整。
此外，从与RNA的双链形成能力的观点考虑，通式(1)和通式(2)中的 Bs1优选为上述通式(3)和(4)中的通式(3)所表示的碱基。
关于上述RNA杂交形成用核酸低聚物，只要能够以连续包含3个～50 个特定核苷酸单元的方式制造，则作为制造方法没有特别限定。但是，从制造容易程度的方面考虑，优选在合成能够构成特定核苷酸单元的单体的工序(单体合成工序)之后，利用使通过上述单体合成工序而得到的上述单体依次缩合而成的工序(缩合工序)，制造上述RNA杂交形成用核酸低聚物。
在上述单体合成工序中，作为用于形成上述通式(1)所表示的核苷酸单元的单体的合成方法，例如可以通过参考文献[J.Am.Chem.Soc.，Vol.130， 16031-16037]以及日本特开2015-44842号公报中记载的单体的合成方法，合成作为在嘧啶碱基的第5位导入有合适的取代基的核苷酸的衍生物的、并且磷原子的绝对立体构型被控制的核苷酸的衍生物，从而可以获得能够用于后续缩合工序的单体。此外，作为用于形成上述通式(2)所表示的核苷酸单元的单体的合成方法，可以参考合成锁核酸(Locked Nucleic acid，LNA) 的核酸碱基单元的公知的方法、例如日本特开2015-093853号公报等中记载的单体的合成方法而合成。
此外，作为以下的缩合工序中使用的单体的立体化学纯度，例如优选使用97％以上的纯度。
关于缩合工序，例如可以举出：参考和田等的文献[J.Org.Chem.Vol.77， 7913(2012)]，以成为所期望的碱基序列和所期望的核苷酸单元的种类的方式，将单体合成工序中得到的单体依次缩合的方法。即，通过考虑作为靶的RNA的碱基序列，使上述单体缩合，从而可以获得RNA杂交形成用核酸低聚物。
在上述文献中记载的单体的缩合反应中，能够高度维持磷原子的绝对立体构型地进行缩合，因此通过使用上述单体合成工序中得到的单体进行该缩合反应，结果是，能够得到立体化学纯度高的本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物。此外，在单体的缩合中，作为使用的单体中的嘧啶碱基的第5位取代基的种类，例如可以使用具有结合有全部相同的取代基的碱基的单体，也可以使用具有结合有不同的取代基的碱基的单体。
在RNA杂交形成用核酸低聚物为嵌合低聚物的情况下，可以通过上述单体合成工序而合成单体之后，上述缩合工序中，考虑作为靶的RNA的碱基序列，例如使用上述单体和能够构成其他核苷酸单元的单体这两者，进行适当缩合从而合成。具体而言，例如可以通过参考额贺等的文献[额贺阳平；冈夏央；前田雄介；和田猛，“控制磷原子的立体的PS/PO嵌合寡核苷酸的固相合成”，反义/基因/传递研讨会2014讲演预备稿集，p.52]以及Oka等的文献[J.Am.Chem.Soc.，Vol.130，16031-16037]中记载的方法，使上述单体和能够构成其他核苷酸单元的单体与由上述单体合成工序得到的单体适当缩合从而得到。
在上述RNA杂交形成用核酸低聚物的制造方法中，缩合工序后可以适宜设置保护基脱离工序。作为保护基脱离工序中可使用的脱保护剂，可以举出例如三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸等。
由上述方法得到的核酸低聚物可以通过例如反相高效液相色谱(反相 HPLC)、离子交换HPLC、柱色谱、再结晶等公知的纯化方法而纯化。
本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物通过设计成与作为靶的RNA的碱基序列互补，从而能够用作相对于作为靶的RNA的双链形成能力优异的反义分子。例如，在作为靶的RNA相当于疾病相关基因的部分序列的情况下，本发明的RNA杂交形成用核酸低聚物优选用于翻译阻碍能力高的反义药物等医药用途。
实施例
以下，利用实施例具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
各种分析器使用了以下所示的机型。
1H-核磁共振波谱(1H-NMR)：JNM-LA 400(400MHz)
13C-核磁共振波谱(13C-NMR)：JNM-LA 400(100.5MHz)
31P-核磁共振波谱(31P-NMR)：JNM-LA 400(161.8MHz)
需要说明的是，在1H-NMR中使用四甲基硅烷(TMS)作为内部标准，在13C-NMR中使用CDCl3(δ77.16ppm)作为内部标准，在31P-NMR中使用85％H3PO4作为外部标准。
ESI MS：Varian 910-MS
紫外可见分光光度计：JASCO V-550UV/VIS分光光度计
需要说明的是，只要没有特别指明，则“％”为质量基准。实施例中， HNEt3表示三乙胺，DMTr表示4,4’-二甲氧基三苯甲基，其他的简码与上述说明中的物质同义。
＜噁唑磷烷单体的合成＞
噁唑磷烷单体是使以DMTr基保护的各核苷(化合物3a～3e)与由氨基醇衍生的化合物(化合物D2或化合物L2)反应而合成的。
以下，对详细内容进行说明。
(2-氯噁唑磷烷D2的合成)
将作为氨基醇的化合物D1(1.77g、10mmol)用甲苯反复共沸干燥，在该甲苯溶液5mL中加入甲基吗啉2.20mL(20mmol)而作为混合溶液。向该混合溶液中，在0℃一边搅拌一边添加包含三氯化磷870μL(10mmol) 的甲苯5.0mL溶液，进而在室温搅拌2小时进行反应。将反应后生成的盐在Ar气氛下、于-78℃进行过滤，在氩气氛下进行减压浓缩，从而得到黄色油状的2-氯-1,3,2-噁唑磷烷(化合物D2)2.09g。对于所得的化合物D2不进行进一步的纯化，用于下面的化合物的合成。
[化5]
Figure GDA0003244847870000161
此外，关于作为D2的非对映体的L2，使用化合物L1代替化合物D1，用与上述同样的方法合成。
[化6]
Figure GDA0003244847870000171
化合物3a～化合物3e的准备
以下，各噁唑磷烷单体的合成中使用的5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧尿苷(化合物3a)、5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基 (DMTr)-胸苷(化合物3b)、5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’- 脱氧溴尿苷(化合物3c)、5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’- 脱氧碘尿苷(化合物3d)和5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’- 脱氧丙炔基尿苷(化合物3e)是参考文献[J.Am.Chem.Soc.，Vol.104， 1316-1319]中记载的方法，由2’-脱氧尿苷(TCI公司制)、胸苷(和光纯药工业株式会社)、2’-脱氧溴尿苷(和光纯药工业株式会社)、2’-脱氧碘尿苷(和光纯药工业株式会社)合成的。5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基 (DMTr)-2’-脱氧丙炔基尿苷(化合物3e)是参考TetrahedronLett.，Vol.45， 2457-2461中记载的方法，由5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧碘尿苷(化合物3d)合成的。
噁唑磷烷单体的合成
<化合物(Sp)-4a的合成>
将化合物3a(531mg、1.0mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物D2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2 小时。之后，加入氯仿300mL、饱和碳酸氢盐水溶液(100mL)而进行分液操作，将有机相用饱和碳酸氢盐水溶液100mL清洗2次，进而在回收的清洗液中添加氯仿后进行分液操作，回收有机层。将回收的全部有机层用无水硫酸钠干燥后，过滤，将溶剂减压蒸馏去除而得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(16g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(70/30/0.1，v/v/v)]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率43％得到(Sp)-4a(313mg、0.43mmol)。
[化7]
Figure GDA0003244847870000181
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ7.88-7.86(d,1H),7.41-7.18(m,37H), 6.85-6.83(d,7H),6.32-3.29(t,1H),5.74-5.73(d,1H),5.34-5.31(d,1H), 4.94(m,1H),4.16(m,1H),3.89(m,1H),3.79(s,6H),3.59(m,2H), 3.18(m,1H),2.76(br,1H),2.49(m,1H),2.34(m,1H),1.85(m,2H), 1.65(m,1H),1.25-1.16(m,4H),0.99(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.89
<化合物(Sp)-4b的合成>
将化合物3b(544mg、1.0mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物D2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2 小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(70/30/0.1，v/v/v)]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率44％得到(Sp)-4b(330mg、0.44mmol)。
[化8]
Figure GDA0003244847870000191
<化合物(Sp)-4c的合成>
将化合物3c(611mg、1.0mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物D2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2 小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.5(v/v/v)至0/100/0.5(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率30％得到化合物(Sp)-4c(280mg、 0.44mmol)。
[化9]
Figure GDA0003244847870000201
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ81.2(s,1H),δ7.44-7.23(d,19H), 6.82-6.84(d,4H),6.32(t,1H),5.71-5.70(d,1H),4.91(m,1H),4.21 (m,1H),3.89(m,1H),3.78(s,6H),3.55(m,1H),3.(m,1H),2.53 (m,1H),2.33(m,1H),1.64(m,2H),1.28-1.20(m,1H),1.01-0.96(m, 1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.10
<化合物(Sp)-4d的合成>
将化合物3d(658mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物D2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(17g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.1(v/v/v)至0/100/0.1(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率49％得到化合物(Sp)-4d(420mg、0.49mmol)。
[化10]
Figure GDA0003244847870000211
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ8.17(s,1H),δ7.46-7.25(d,19H), 6.87-6.85(d,4H),6.32(t,1H),5.70-5.68(d,1H),4.89(m,1H),4.21 (m,1H),3.92-3.89(m,1H),3.79(s,6H),3.55(m,1H),3.48(dd,1H), 3.37(dd,1H),2.89(m,1H),2.56-2.50(m,1H),2.36-2.23(m,1H),1.67-1.56 (m,2H),1.03-0.95(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ155.55
<化合物(Sp)-4e的合成>
将化合物3e(612mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物D2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.1(v/v/v)至0/100/0.1(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率49％得到化合物(Sp)-4e(350mg、0.49mmol)。
[化11]
Figure GDA0003244847870000221
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ8.04(s,1H),δ7.47-7.23(d,19H), 6.86-6.84(d,4H),6.30(t,1H),5.72-5.70(d,1H),4.91(m,1H),4.21 (m,1H),3.92-3.89(m,1H),3.79(s,6H),3.56(m,1H),3.42(m,2H), 3.18(m,1H),2.52(m,1H),2.33(m,1H),1.69-1.52(m,5H),1.26-1.20 (m,1H),1.01-0.96(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.01
<化合物(Rp)-4a的合成>
将化合物3a(530mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物L2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(70/30/0.1(v/v/v)]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率49％得到化合物(Rp)-4a(360mg、0.49mmol)。
[化12]
Figure GDA0003244847870000231
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ7.82-7.81(d,1H),7.38-7.23(m,16H), 6.82-6.79(dd,4H),6.33-(t,1H),5.75-5.73(d,1H),5.31-5.29(d,1H), 4.95(m,1H),4.11(m,1H),3.88(m,1H),3.77(s,3H),3.76(s,3H), δ3.56(m,1H),3.48(dd,H),3.44(dd,1H),3.19(m,1H),2.62(m,1H), 2.34(m,1H),1.66(m,4H),1.32(m,1H),1.19(m,1H),0.94(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.87
<化合物(Rp)-4b的合成>
将化合物3b(545mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物L2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(70/30/0.1(v/v/v)]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率47％得到化合物(Rp)-4b(350mg、0.35mmol)。
[化13]
Figure GDA0003244847870000241
<化合物(Rp)-4c的合成>
将化合物3c(611mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物L2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.1(v/v/v)至0/100/0.1(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率41％得到化合物(Rp)-4c(330mg、0.41mmol)。
[化14]
Figure GDA0003244847870000251
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ8.06(s,1H),δ7.42-7.21(d,19H), 6.83-6.80(d,4H),6.35(t,1H),5.74-5.72(d,1H),4.90(m,1H),4.15 (m,1H),3.87-3.83(m,1H),3.76(s,6H),3.58(m,1H),3.39(m,2H), 3.18(m,1H),2.65(m,1H),2.33(m,1H),1.64(m,2H),1.21-1.15(m, 1H),0.99-0.91(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.46
<化合物(Rp)-4d的合成>
将化合物3d(657mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物L2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(15g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.1(v/v/v)至0/100/0.5(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率42％得到化合物(Rp)-4d(360mg、0.42mmol)。
[化15]
Figure GDA0003244847870000261
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ8.13(s,1H),δ7.43-7.16(d,22H), 6.83-6.81(d,4H),6.34(t,1H),5.73-5.71(d,1H),4.89(m,1H),4.16 (m,1H),3.85-3.05(m,1H),3.77(s,6H),3.61-3.55(m,1H),3.38(m, 2H),3.20-3.14(m,1H),2.64(m,1H),2.32(m,2H),1.64(m,2H),1.21 (m,3H),1.19-1.15(m,1H),0.96-0.91(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.23
<化合物(Rp)-4e的合成>
将化合物3e(531mg、1mmol)用吡啶、甲苯反复共沸，制成四氢呋喃 5mL溶液，加入三乙胺0.97mL(7mmol)并混合后冷却至-78℃，滴加溶解有化合物L2(725mg)的四氢呋喃(THF)6mL之后，在室温搅拌2小时。之后，利用与化合物(Sp)-4a的方法同样的方法得到残余物。将所得的残余物用硅胶柱色谱(17g的NH-硅胶，富士Silysia公司制)[展开溶剂：甲苯 /乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.1(v/v/v)至0/100/0.1(v/v/v))]分离纯化后，将溶剂减压蒸除，从而以收率40％得到化合物(Rp)-4e(420mg、0.29mmol)。
[化16]
Figure GDA0003244847870000271
1HNMR(400MHz,CDCl3),δ7.98(s,1H),δ7.45-7.20(d,19H), 6.82-6.80(d,4H),6.34(t,1H),5.74-5.72(d,1H),4.90(m,1H),4.15 (m,1H),3.88-3.84(m,1H),3.77(s,6H),3.58(m,1H),3.38(m,2H), 3.19(m,1H),2.65(m,1H),2.33(m,1H),1.71-1.61(m,5H),1.26-1.16 (m,1H),0.99-0.92(m,1H)
31P NMR(400MHz,CDCl3),δ156.6
化合物5a、化合物5b和化合物5e的准备
以下，各噁唑磷烷单体的合成中使用的5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧胞苷(化合物5a)、5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基 (DMTr)-甲基胞苷(化合物5b)、5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’ -脱氧碘胞苷(化合物5d)和5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’ -脱氧丙炔基胞苷(化合物5e)是参考文献[J.Am.Chem.Soc.，Vol.104， 1316-1319]中记载的方法，由2’-脱氧胞苷(TCI公司制)、5’-甲基胞苷 (利用美国注册专利4,754,026号中记载的方法由胸苷合成)、2’-脱氧溴胞苷(和光纯药工业株式会社)、2’-脱氧碘胞苷(和光纯药工业株式会社) 合成的。5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧丙炔基胞苷(化合物5e)是参考Tetrahedron Lett.，Vol.45，2457-2461中记载的方法，由5’ -O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧碘胞苷(化合物5d)合成的。
<化合物(Sp)-6a的合成>
关于化合物(Sp)-6a，使用化合物5a(0.96g、1.5mmol)代替化合物3a，除此以外，与上述化合物(Sp)-4a的合成同样地操作，合成化合物(Sp)-6a。此外，在纯化中，将硅胶柱色谱的条件设为[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/ 三乙胺(80/20/0.1、v/v/v)]，除此以外，与化合物(Sp)-4a的纯化同样地操作，得到无色化合物(Sp)-6a(0.70g、0.84mmol、收率56％)。
[化17]
Figure GDA0003244847870000281
<化合物(Sp)-6b的合成>
关于化合物(Sp)-6b，使用化合物5b(0.97g、1.5mmol)代替化合物3b，除此以外，与上述化合物(Sp)-4b的合成同样地操作，合成和纯化化合物 (Sp)-6b。得到无色(Sp)-6b(0.74g、0.87mmol、收率58％)。
[化18]
Figure GDA0003244847870000291
1HNMR(300MHz,CHCl3)δ8.29(d,J＝7.3Hz,2H),7.87(s,1H), 7.51-7.26(m,17H),6.85(d,J＝8.4Hz,4H),6.42(t,J＝6.4Hz,1H),5.70 (d,J＝6.2Hz,1H),4.98-4.90(m,1H),4.22-4.21(m,1H),3.93-3.85(m, 1H),3.79(s,6H),3.60-3.37(m,3H),3.22-3.08(m,1H),2.56-2.45(m, 1H),2.44-2.35(m,1H),1.76-1.56(m,5H),1.29-1.16(m,1H),1.04-0.95(m,1H)
31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.18.FAB-HR MS：理论值(Calcd. for)[M+H]+；853.3361.实测值(Found)；853.3364.
<化合物(Sp)-6e的合成>
关于化合物(Sp)-6e，使用化合物5e(0.67g、1mmol)代替化合物3e，并且将化合物D2的量变更为483mg，除此以外，与上述化合物(Sp)-4e的合成同样地操作，合成化合物(Sp)-6e。此外，在纯化中，将硅胶柱色谱的条件设为[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(90/10/0.5(v/v/v)至80/20/0.5 (v/v/v))]，除此以外，与化合物(Sp)-4e的纯化同样地进行纯化，得到无色化合物(Sp)-6e(0.40g、0.45mmol、收率45％)。
[化19]
Figure GDA0003244847870000301
1HNMR(400MHz,CHCl3)δ8.33-8.23(br,3H),7.53-7.23(m,17H), 6.85(d,J＝8.8Hz,4H),6.34-6.29(m,1H),5.72(d,J＝6.3Hz,1H),4.95-4.89 (m,1H),4.24(m,1H),3.94-3.87(m,1H),3.78(s,6H),3.61-3.51(m, 1H),3.49-3.38(m,2H),3.23-3.14(m,1H),2.65-2.59(m,1H),2.42-2.35 (m,1H),1.72-1.59(m,5H),1.26-1.18(m,1H),1.03-0.94(m,1H)
31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.50.FAB-HR MS：理论值[M+H]+； 877.3361.实测值；877.3364.
<化合物(Rp)-6a的合成>
关于化合物(Rp)-6a，使用化合物5a(1.27g、2mmol)代替化合物3a，并且将化合物L2的量变更为967mg，除此以外，与上述化合物(Rp)-4a的合成同样地操作，合成化合物(Rp)-6a。此外，在纯化中，将硅胶柱色谱的条件设为[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(90/10/0.1(v/v/v)至80/20/0.1 (v/v/v))]，除此以外，与化合物(Rp)-4a的纯化同样地进行纯化，得到无色(Rp)-6a(0.54g、0.65mmol、收率33％)。
[化20]
Figure GDA0003244847870000311
<化合物(Rp)-6b的合成>
关于化合物(Rp)-6b，使用化合物5b(0.97g、1.5mmol)代替化合物3b，除此以外，与上述化合物(Rp)-4b的合成同样地操作，合成化合物(Rp)-6b。此外，在纯化中，将硅胶柱色谱的条件设为[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/ 三乙胺(90/10/0.1(v/v/v)至80/20/0.1(v/v/v)]，除此以外，与化合物(Rp)-4b 同样地进行纯化，得到无色(Rp)-6b(0.54g、0.63mmol、42％)。
[化21]
Figure GDA0003244847870000321
1HNMR(400MHz,CHCl3)δ8.29(d,J＝7.3Hz,2H),7.81(s,1H), 7.50-7.23(m,17H),6.81(dd,J＝8.9,2.1Hz,4H),6.44(t,J＝6.6Hz,1H), 5.72(d,J＝6.3Hz,1H),4.96-4.90(m,1H),4.17-4.15(m,1H),3.86-3.79 (m,1H),3.78(s,6H),3.62-3.54(m,1H),3.52-3.39(m,2H),3.14-3.22 (m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.43-2.35(m,1H),1.67-1.57(m,5H),1.19-1.15(m,1H),0.98-0.90(m,1H)
31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.55.FAB-HR MS：理论值[M+H]+； 853.3361.实测值；853.3361.
<化合物(Rp)-6e的合成>
关于化合物(Rp)-6e，使用化合物5e(0.68g、1mmol)代替化合物3e，并且将化合物L2的量变更为483mg，除此以外，与上述化合物(Rp)-4e的合成同样地操作，合成化合物(Rp)-6e。此外，在纯化中，将硅胶柱色谱的条件设为[展开溶剂：甲苯/乙酸乙酯/三乙胺(80/20/0.5、v/v/v)]，除此以外，与化合物(Rp)-4e的纯化同样地进行纯化，得到无色(Rp)-6e(0.53g、 0.60mmol、收率60％)。
[化22]
Figure GDA0003244847870000331
1HNMR(400MHz,CHCl3)δ8.25-8.22(m,3H),7.55-7.20(m,17H), 6.81(d,J＝8.8Hz,4H),6.34(t,J＝6.3Hz,1H),5.73(d,J＝6.3Hz,1H), 4.93-4.87(m,1H),4.19-4.18(m,1H),3.90-3.83(m,1H),3.76(s,7H), 3.63-3.53(m,1H),3.40(d,J＝2.9Hz,2H),3.23-3.14(m,1H),2.77-2.73 (m,1H),2.42-2.35(m,1H),1.75(s,3H),1.67-1.61-(m,2H),1.22-1.14(m,1H),0.99-0.90(m,1H)
31P NMR(161MHz,CDCl3)δ156.65.FAB-HR MS：理论值[M+H]+； 877.3361.实测值；877.3366.
将以上得到的噁唑磷烷单体的收率和纯度示于以下的表1。需要说明的是，上述得到的各化合物的立体化学纯度均为99％以上。
[表1]
化合物名 立体构型 取代基 收率(％) 纯度
(Sp)-4a Sp H 43 98
(Sp)-4b Sp 甲基 44 ＞99
(Sp)-4c Sp 溴 49 99
(Sp)-4d Sp 碘 49 96
(Sp)-4e Sp 丙炔基 49 98
(Rp)-4a Rp H 49 98
(Rp)-4b Rp 甲基 60 98
(Rp)-4c Rp 溴 41 97
(Rp)-4d Rp 碘 42 97
(Rp)-4e Rp 丙炔基 40 ＞99
(Sp)-6a Sp H 56 ＞99
(Sp)-6b Sp 甲基 58 ＞99
(Sp)-6e Sp 丙炔基 45 ＞99
(Rp)-6a Rp H 33 ＞99
(Rp)-6b Rp 甲基 42 ＞99
(Rp)-6e Rp 丙炔基 60 ＞99
由以上结果可知，所有的单体都以高纯度且以高立体化学纯度得到。
<RNA杂交形成用核酸低聚物的合成>
按照额贺等的文献[额贺阳平；冈夏央；前田雄介；和田猛，控制磷原子的立体的PS/PO嵌合寡核苷酸的固相合成，反义/基因/传递研讨会2014 讲演预备稿集，p.52]以及Oka等的文献[J.Am.Chem.Soc.，Vol.130， 16031-16037]中记载的方法，使用上述得到的各种噁唑磷烷单体等，合成了作为在5’末端和3’末端具有天然型CG的碱基序列的嵌合低聚物的硫代磷酸酯型核酸低聚物(5’-CGTTTTTTTTCG-3’，12mer)、作为在末端具有天然型ATA和TAT的碱基序列的嵌合低聚物的硫代磷酸酯型核酸低聚物 (5’-ATACCCCCCTAT-3’，12mer)、或者利用磷酸结合代替硫代磷酸酯结合而结合的核酸低聚物。另外，在使用作为卤素修饰体的单体((SP)-4C、 (RP)-4C、(SP)-4d和(RP)-4d)的情况下，根据上述文献中记载的“超温和(Ultramild)”的条件进行合成。
将具体的条件的一部分示于表2。
[表2]
Figure GDA0003244847870000351
此外，对于通过上述合成方法而得到的全部核酸低聚物(12聚物)利用下面的反相HPLC(RP-HPLC)进行分离纯化。关于RP-HPLC和分离纯化，使用GE-Healthcare公司制的连接于HPLC装置(Box-900)的反相柱 (SOUCE TM5RPC ST 5μm column(5μm，4.6mm×150mm))，在室温，使用线性梯度5～26％乙腈的0.1M的三乙基碳酸铵缓冲溶液(pH7.0)作为洗脱液，以流速1.0ml/分钟的条件进行。
以下，在表3-1和表3-2中示出所得的核酸低聚物和基于ESI MS的测定结果。需要说明的是，在表3-1和表3-2的低聚物的名称中，“(Sp)”和“(Rp)”表示低聚物中的硫代磷酸酯结合的绝对立体构型为Sp或Rp中的任一者。
此外，“ps”表示具有5-甲基尿嘧啶基的核苷酸残基(T)彼此、具有尿嘧啶基的核苷酸残基(U)彼此、具有胞苷酰基(cytidylyl)的核苷酸残基(C)彼此、或者具有第5位被修饰的尿嘧啶基的核苷酸残基彼此或具有第5位被修饰的胞苷酰基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，例如，“(Ups)8”表示具有8个连续的尿嘧啶基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合。此外，(Tps)8表示具有8个连续的5-甲基尿嘧啶基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，(Cps)6表示具有6个连续的胞苷酰基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，(Cps)2表示具有2个连续的胞苷酰基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合。(BrUps)8表示具有在第5位结合有溴原子 (Br)的8个尿嘧啶基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，(IUps)8表示具有在第5位结合有碘原子(I)的8个尿嘧啶基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，(pUps)8表示具有在第5位结合有丙炔基的8个尿嘧啶基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合，(MeCps)6表示具有在第5位结合有甲基(Me)的6个胞苷酰基的核苷酸残基彼此进行了硫代磷酸酯结合。 (Cps)2(pCps)2(Cps)2表示具有2个胞苷酰基的核苷酸残基、具有在第5位结合有丙炔基的2个胞苷酰基的核苷酸残基、以及具有2个胞苷酰基的核苷酸残基以该顺序进行了硫代磷酸酯结合。
此外，表3-1和3-2中的全部低聚物中，CG表示在低聚物的5’位和3’位以天然型结合有胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的2个残基，ATA或TAT表示在低聚物的5’位和3’位以天然型结合有腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的3个残基。
[表3-1]
Figure GDA0003244847870000371
[表3-2]
编号 核酸低聚物 收率(％)
10 (Rp)-d(CG(<sup>I</sup>Ups)8CG)
11 (Rp)-d(ATA(Cps)6TAT) 12
12 (Sp)-d(ATA(Cps)6TAT) 6
13 (Rp)-d(ATA(<sup>Me</sup>Cps)6TAT) 42
14 (Sp)-d(ATA(<sup>Me</sup>Cps)6TAT) 11
15 (Rp)-d(ATA(<sup>p</sup>Cps)6TAT) 19
16 (Sp)-d(ATA(<sup>p</sup>Cps)6TAT) 12
17 (Rp)-d(ATA(Cps)2(<sup>p</sup>Cps)2(Cps)2TAT) 42
18 (Sp)-d(ATA(Cps)2(<sup>p</sup>Cps)2(Cps)2TAT) 14
由基于ESI MS的测定结果表示，能够得到上述编号1～18的核酸低聚物(以下，有时称为核酸低聚物1～18)。将所得的核酸低聚物1～18供于以下的实施例和比较例(与RNA或DNA的双链的熔解温度测定)等。
mix-d(CG(Tps)8CG)的调制
关于mix-d(CG(Tps)8CG)，使用5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基 (DMTr)-2’-脱氧胸苷的亚磷酰胺单体(Rp体和Sp体的1：1混合物， GlenRsearch公司制)，用与上述同样的方法合成硫代磷酸酯型核酸低聚物。 mix-d(CG(Tps)8CG是(Tps)8的T为随机的Rp体或Sp体。
mix-d(CG(pUps)8CG)的调制
关于mix-d(CG(pUps)8CG)，使用5-丙炔基-5’-O-二(对甲氧基苯基)苯基甲基(DMTr)-2’-脱氧胸苷的亚磷酰胺单体(Rp体和Sp体的1：1混合物、 GlenRsearch公司制)，用与上述同样的方法合成硫代磷酸酯型核酸低聚物。 mix-d(CG(pUps)8CG)是(pUps)8的pU为随机的Rp体或Sp体。
磷酸结合型核酸低聚物的调制
调制了以下所示的磷酸结合型核酸低聚物。
·d(CG(U)8CG)
·d(CG(T)8CG)
·d(CG(BrU)8CG)
·d(CG(IU)8CG)
·d(CG(pU)8CG)
·d(ATA(C)6TAT)
·d(ATA(MeC)6TAT)
对碱基没有附加“ps”的情况表示具有5-甲基尿嘧啶基的核苷酸残基(T) 彼此、具有尿嘧啶基的核苷酸残基(U)彼此、具有胞苷酰基的核苷酸残基(C) 彼此、或者具有第5位被修饰的尿嘧啶基的核苷酸残基彼此或具有第5位被修饰的胞苷酰基的核苷酸残基彼此进行了磷酸结合，例如，“(U)8”表示 8个连续的尿嘧啶基彼此以作为天然型的磷酸结合进行了结合。(T)8表示8 个连续的5-甲基尿嘧啶基彼此进行了磷酸结合。(C)6表示6个连续的胞苷酰基彼此进行了磷酸结合。(BrU)8表示在第5位结合有溴原子(Br)的8个尿嘧啶基彼此进行了磷酸结合，(IU)8表示在第5位结合有碘原子(I)的8个尿嘧啶基彼此进行了磷酸结合，(pU)8表示在第5位结合有丙炔基的8个尿嘧啶基彼此进行了磷酸结合，(MeC)6表示在第5位结合有甲基的6个胞苷酰基彼此进行了磷酸结合。
靶核酸的调制
关于作为靶核酸的天然型RNA和DNA，通过日本Bio Service公司的受托合成(HPLC级)而获得序列编号1～2中所示的碱基序列的RNA低聚物(序列编号1)和DNA低聚物(序列编号2)。
＜评价＞
＜实施例1～5和比较例1-1～5-3：各核酸低聚物与RNA的双链，参考例1～8：各核酸低聚物与DNA的双链的熔解温度测定＞
〔实施例1～5〕
将以下表4的实施例1～5中所示的各个核酸低聚物的Rp体(核酸低聚物2、4、6、9、10)0.4nmol、靶核酸(天然型互补链RNA)(序列编号1) 0.4nmol溶解于10mM NaH2PO4-Na2HPO4、100mM NaCl缓冲液(pH 7.0) 160μL，并分别将140μL分注于8连孔。使紫外可见分光光度计的小室温度从室温以5℃/min的速度升高至95℃，然后将95℃的状态保持5分钟，使温度以-0.5℃/分钟的速度下降至0℃，进行退火。将低聚物溶液直接在0℃静置30分钟后，将核酸低聚物溶液放入小室，在氮气气氛下，一边使温度以0.5℃/min的速度升高至95℃，一边以0.25℃间隔测定260nm处的吸光度，从而得到熔解曲线。根据所得的双链熔解曲线，利用中线法，算出Tm 值。
〔比较例1-1～5-3〕
将核酸低聚物的Rp体(核酸低聚物2、4、6、9、10)变更为核酸低聚物的Sp体(核酸低聚物1、3、5、7、8)或磷酸结合型核酸低聚物，除此以外，与实施例1～5同样地操作而进行测定，如表3的比较例1-1～5-3所示得到双链熔解温度(Tm)。
将测定结果示于图1。图1(A)表示核酸低聚物的Sp体(核酸低聚物1、 3、5、7、8)与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线，图1(B)表示核酸低聚物的Rp体(核酸低聚物2、4、6、9)与天然型互补链RNA的双链的熔解曲线。由这些熔解曲线得到双链熔解温度(Tm)。另外，熔解温度(Tm) 由中线法求出。具体而言，在所得的熔解曲线的前过渡区域和后过渡区域中分别指定2个点，通过回归计算而求出基线，将2个基线的中线与熔解曲线的交点作为熔解温度。将其结果示于表3。此外，ΔTm(Rp-Sp)表示作为Rp体的核酸低聚物的Tm与作为Sp体的核酸低聚物的Tm的温度差。ΔTm(ps-po)表示作为Rp体或Sp体的硫代磷酸酯结合低聚物的Tm与磷酸结合低聚物的Tm的温度差。另外，关于随机核酸低聚物10(mix-PS-dT)、 mix-d(CG(Tps)8CG和mix-d(CG(pUps)8CG，也与上述同样地得到双链熔解温度(Tm)。
〔参考例1～8〕
关于参考例1～4和参考例6～8，在实施例1～5中，将核酸低聚物的Rp 体(核酸低聚物2、4、6)变更为核酸低聚物的Sp体(核酸低聚物1、3、 5、7)，进而将作为靶核酸的天然型互补链RNA变更为天然型互补链DNA (序列编号2)，除此以外，与实施例1～5同样操作，与实施例1～5同样地进行测定，如表4的参考例1～4和参考例6～8中所示那样，得到双链熔解温度(Tm)。此外，关于参考例5，使用上述合成的mix-d(CG(Tps)8CG)，上述参考例1～4等同样地进行测定，如表4的参考例5所示那样，得到双链熔解温度(Tm)。此外，将参考例1～4和参考例6～8的Tm值的计算中使用的熔解曲线的结果示于图2。图2(A)表示核酸低聚物的Sp体(核酸低聚物1、3、5、7、8)与天然型互补链DNA的双链的熔解曲线，图2(B)表示核酸低聚物的Rp体(核酸低聚物2、4、6、9)与天然型互补链DNA的双链的熔解曲线。
[表4]
Figure GDA0003244847870000411
如表4所示，将靶核酸设为RNA的实施例1～5与比较例1-1～5相比，分别显示高Tm值。特别是，在作为Rp体的实施例5中显示Tm值与作为 Sp体的比较例5-1相比显著高。此外，实施例5还显示Tm值高于作为磷酸结核酸低聚物的比较例5-2、以及通常用作硫代磷酸酯型核酸低聚物的 Rp体的核苷酸和Sp体的核苷酸混合而成的核酸低聚物。由此表明，包含结合有丙炔基的嘧啶碱基的硫代磷酸酯型核酸低聚物(Rp体)的双链形成能力更高。此外，实施例1～4虽然Tm值低于天然型核酸低聚物，但双链形成能力高于以往型硫代磷酸酯型核酸低聚物，并且具有比天然型核酸低聚物显著高的稳定性，作为核酸药物具有优异的特性。
相对于此，在将靶核酸作为DNA的参考例1～8中显示，Rp体的Tm 值与Sp的Tm值为相同程度，进而在参考例1～4和6～7中显示，Rp体的 Tm值反而略低于Sp的Tm值。
〔实施例6～9〕
示出表3中所示的以下的Rp体的硫代磷酸酯型核酸低聚物的基于ESI MS的测定结果。
·(Rp)-d(ATA(Cps)6TAT)(核酸低聚物11，实施例6)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1205.49151.实测值；1205.49124.
·(Rp)-d(ATA(MeCps)6TAT)(核酸低聚物13，实施例7)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1233.52281.实测值；1233.52511.
·(Rp)-d(ATA(pCps)6TAT)(核酸低聚物15，实施例8)
ESI-HR MS：理论值[M]4-；960.89029.实测值；960.89180.
·(Rp)-d(ATA(Cps)2(pCps)2(Cps)2TAT)(核酸低聚物17，实施例9)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1230.83527.实测值；1230.83978.
代替实施例1～5中使用的核酸低聚物(核酸低聚物2、4、6、9、10)，变更为实施例6、7或9的核酸低聚物(核酸低聚物11、13、17)，并且在测定Tm值时，使温度以0.2℃/min的速度升高至95℃，而不是以0.5℃/min 的速度升高至95℃，除此以外，与实施例1～5同样地操作并进行测定，得到双链熔解温度(Tm)。
〔比较例6-1～9-1〕
示出上述记载的以下所示的Sp体的硫代磷酸酯型核酸低聚物的基于 ESI MS的测定结果。
·(Sp)-d(ATA(Cps)6TAT)(核酸低聚物12，比较例6-1)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1205.49151.实测值；1205.49371.
·(Sp)-d(ATA(MeCps)6TAT)(核酸低聚物14，比较例7-1)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1233.52281.实测值；1233.52225.
·(Sp)-d(ATA(pCps)6TAT)(核酸低聚物16，比较例8-1)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1281.52281.实测值；1281.52197.
·(Sp)-d(ATA(Cps)2(pCps)2(Cps)2TAT)(核酸低聚物18，比较例9-1)
ESI-HR MS：理论值[M]3-；1230.83527.实测值；1230.83793.
代替实施例1～5中使用的核酸低聚物(核酸低聚物2、4、6、9、10)，变更为比较例6-1、7-1或9-1的核酸低聚物(核酸低聚物12、14、18)，除此以外，与实施例1～5同样地操作并进行测定，得到双链熔解温度(Tm)。将结果示于表5。
〔比较例6-2和7-2〕
磷酸型核酸低聚物的Tm测定
代替实施例1～5中使用的核酸低聚物(核酸低聚物2、4、6、9、10)，变更为作为磷酸型核酸低聚物的d(ATA(C)6TAT)或d(ATA(MeC)6TAT)，除此以外，与实施例1～5同样地操作并进行测定，得到双链熔解温度(Tm)。将结果示于表5。
[表5]
Figure GDA0003244847870000431
实施例6、7和9的Rp体的硫代磷酸酯型核酸低聚物与Sp体的硫代磷酸酯型核酸低聚物(比较例6-1、7-1和9-1)相比，双链形成能力显著高。此外，实施例6和7的Rp体的硫代磷酸酯型核酸低聚物具有与天然型磷酸结合核酸低聚物同等或其以上的双链形成能力。
将实施例6、比较例6-1和比较例6-2的双链熔解曲线示于图3A。将实施例7、比较例7-1和比较例7-2的双链熔解曲线示于图3B。将实施例9 和比较例9-1的双链熔解曲线示于图3BC。
如此表明，在RNA杂交形成用硫代磷酸酯型核酸低聚物中，由于绝对立体构型为Rp，因此带来明显高的Tm值、即双链形成能力的提高。即表明，能够提供双链形成能力优异的RNA杂交形成用核酸低聚物。
2016年3月9日申请的日本专利申请2016-046181的公开的全部内容通过参照而引入到本说明书中。
与具体且分别记载了各个文献、专利申请和技术标准可通过参照而引入的内容的情况相同程度地，本说明书中记载的全部文献、专利申请和技术标准通过参照而引入到本说明书中。
关于本发明的例示的实施方式的以上记载用于例示和说明的目的，并非意旨穷举的或者将发明限定于所公开的方式本身。很显然，多种改变或变更对于本领域技术人员来说是显而易见的。选择并记载上述实施方式的理由是，最有效地说明发明的原理和实际应用，使得其他技术人员都能够理解发明适合于预想的特定的用途那样的各种实施方式、各种改变。本发明的范围由以下的权利要求及其等同物确定。
序列表
<110> 学校法人东京理科大学
<120> 核酸低聚物
<130> CO-F04459-00
<150> JP 2016-046181
<151> 2016-03-09
<160> 2
<210> 1
<211> 12
<212> RNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成RNA寡聚核苷酸
<400> 1
cgaaaaaaaa cg丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成DNA寡聚核苷酸
<400> 2
cgaaaaaaaa cg丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂12

Claims (7)

1.一种RNA杂交形成用核酸低聚物，其包含下述通式(1)所表示的核苷酸单元和下述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一种单元接连3个～50个而成的结构，且碱基长为8个碱基～50个碱基，
[化1]
Figure FDA0003244847860000011
通式(1)中，R1表示氢原子、烷氧基、烯氧基、酰氧基、三烷基甲硅烷氧基或卤素基团；通式(1)和通式(2)中，各Bs1各自独立地为能够具有保护基的嘧啶碱基，与所述嘧啶碱基的第5位碳原子结合的氢原子被丙炔基取代；通式(1)和通式(2)中，X各自独立地表示S-Z+或BH3 -Z+；Z+表示抗衡阳离子；R2和R3各自独立地表示氢原子或碳原子数1～10的烷基；R2和R3能够彼此结合而形成环。
2.根据权利要求1所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，所述通式(1)和所述通式(2)中，Bs1表示下述通式(3)或通式(4)所表示的基团，
[化2]
Figure FDA0003244847860000021
通式(3)中，R4表示丙炔基；通式(3)中的羰基和氨基能够具有保护基；通式(4)中，R5表示丙炔基；通式(4)中的羰基和氨基能够具有保护基。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，所述碱基长为10个碱基～30个碱基。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的RNA杂交形成用核酸低聚物，其包含所述通式(1)所表示的核苷酸单元和所述通式(2)所表示的核苷酸单元中的至少一种单元接连5个～30个而成的结构。
5.一种RNA杂交成型剂，含有根据权利要求1至4中任一项所述的RNA杂交形成用核酸低聚物。
6.一种RNA杂交成型方法，使用权利要求1至4中任一项所述的RNA杂交形成用核酸低聚物。
7.权利要求1至4中任一项所述的RNA杂交形成用核酸低聚物作为RNA杂交成型剂的使用。
CN201780016095.8A 2016-03-09 2017-03-09 Rna杂交形成用核酸低聚物 Active CN108713061B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-046181 2016-03-09
JP2016046181 2016-03-09
PCT/JP2017/009566 WO2017155058A1 (ja) 2016-03-09 2017-03-09 Ｒｎａハイブリッド形成用核酸オリゴマー

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108713061A CN108713061A (zh) 2018-10-26
CN108713061B true CN108713061B (zh) 2022-04-05

Family

ID=59789570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780016095.8A Active CN108713061B (zh) 2016-03-09 2017-03-09 Rna杂交形成用核酸低聚物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190194746A1 (zh)
EP (1) EP3431591B1 (zh)
JP (1) JP7039800B2 (zh)
CN (1) CN108713061B (zh)
WO (1) WO2017155058A1 (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085272A1 (ja) * 2004-03-05 2005-09-15 Takeshi Wada ボラノホスフェートモノマーおよびそれを用いたオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
PT1991678E (pt) * 2006-02-15 2015-11-25 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composições e métodos para formulações de oligonucleótidos
PT2078080E (pt) * 2006-09-27 2015-09-18 Coley Pharm Gmbh Análogos dos oligonucleotídeos cpg que contêm análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulante potenciada
KR101881596B1 (ko) * 2008-12-02 2018-07-24 웨이브 라이프 사이언시스 재팬 인코포레이티드 인 원자 변형된 핵산의 합성 방법
PT2726613T (pt) * 2011-06-30 2018-10-26 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para inibição da expressão de genes do vírus da hepatite b
JP6128529B2 (ja) * 2011-07-19 2017-05-17 ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッドＷａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ． 官能化核酸の合成のための方法
CN110257379B (zh) * 2012-07-03 2023-08-11 马林生物科技有限公司 用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸
WO2015137121A1 (ja) * 2014-03-10 2015-09-17 国立大学法人東北大学 アジド基を有するリボヌクレオシド類縁体及びその製造方法、並びに該類縁体から形成されるトリアゾール連結型オリゴリボヌクレオチドを含むキメラ型オリゴリボヌクレオチド類縁体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antisense Gene Inhibition by Oligonucleotides Containing C-5 Propyne Pyrimidines;Richard W. Wagner et al;《SCIENCE》;19930604;第260卷;第1510-1513页 *
Natsuhisa Oka et al.Solid-Phase Synthesis of Stereoregular Oligodeoxyribonucleoside Phosphorothioates Using Bicyclic Oxazaphospholidine Derivatives as Monomer Units.《J. AM. CHEM. SOC.》.2008,第130卷(第47期),第16031-16037页. *
Solid-Phase Synthesis of Stereoregular Oligodeoxyribonucleoside Phosphorothioates Using Bicyclic Oxazaphospholidine Derivatives as Monomer Units;Natsuhisa Oka et al;《J. AM. CHEM. SOC.》;20081126;第130卷(第47期);第16031-16037页 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3431591A4 (en) 2019-03-20
JPWO2017155058A1 (ja) 2019-03-14
EP3431591A1 (en) 2019-01-23
EP3431591B1 (en) 2020-09-16
CN108713061A (zh) 2018-10-26
JP7039800B2 (ja) 2022-03-23
US20190194746A1 (en) 2019-06-27
WO2017155058A1 (ja) 2017-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3756313B2 (ja) 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
TW202031267A (zh) S-抗原運輸抑制寡核苷酸聚合物及方法
JP3207915B2 (ja) オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド類似体の固相合成のための方法と化合物
US6043060A (en) Nucleotide analogues
CN106795197B (zh) 改性寡核苷酸及其制备方法
ES2586683T3 (es) Grupo protector novedoso para sintetizar ARN y derivados del mismo
JPH08508493A (ja) ７−デアザプリン修飾オリゴヌクレオチド
JP5231032B2 (ja) オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションにユニバーサル・ヌクレオシドとして使用されるｎ８−及びｃ８−連結プリン塩基、並びに構造的に関連したヘテロ環
WO1997030064A1 (en) Hexitol containing oligonucleotides and their use in antisense strategies
JPH1087689A (ja) ２’−ｏ−アルキル化グアノシン ３’−ｏ−ホスホロアミダイトの製造方法
WO2001085751A1 (en) Polymeric compounds useful as prodrugs
MXPA05004504A (es) Nuevos di-esteres de fosfato ciclicos de 1,3-propano-1-aril-dioles y su uso en la preparacion de profarmacos.
KR102375480B1 (ko) 인 보호기 및 이의 제조 방법 및 용도
WO2005014609A2 (en) Method of producing a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analogue
JP3781879B2 (ja) 新規ヌクレオチド類縁体
JP3119871B2 (ja) オリゴデオキシリボヌクレオチド類
CN108713061B (zh) Rna杂交形成用核酸低聚物
CN107073002A (zh) 作为呼吸道合胞体病毒rna复制抑制剂的4’‑乙烯基取代的核苷衍生物
US20040033967A1 (en) Alkylated hexitol nucleoside analogues and oligomers thereof
WO2006095739A1 (ja) リボヌクレオシドの２’水酸基の脱保護方法
JP4180681B2 (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチド
Moriguchi et al. Novel method of the synthesis and hybridization properties of an oligonucleotide containing non-ionic diisopropylsilyl internucleotide linkage
CN115261385A (zh) 对小核酸进行序列修饰的方法及其应用
CN117412983A (zh) 包含硫代磷酸酯及硼烷磷酸酯的嵌合型核酸低聚物及其制造方法
WO2005085270A1 (ja) ピリジン環５位にピロリル基を導入した核酸誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant