JP3207915B2 - オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド類似体の固相合成のための方法と化合物 - Google Patents

オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチド類似体の固相合成のための方法と化合物

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドの
固相合成に関し、さらに特に、Ｐ−キラルオリゴヌクレ
オチド類似体を合成するための方法と化合物に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ポリヌクレオチドの固相合成のために信
頼性のある便利な方法の開発は、分子生物学とそれに関
連する分野で進められており、例えばイタクラのサイエ
ンス、209 巻、1401〜1405頁(1980)；カルザースのサイ
エンス、230 巻、 281〜285 頁(1985)；およびエックス
タイン編のオリゴヌクレオチドおよび類似体：プラクチ
カルアプローチ（ＩＲＬプレス、オクスフォード、199
1) がある。特に、合成オリゴヌクレオチドおよび種々
のヌクレアーゼ耐性類似体、例えばホスホロチオエー
ト、メチルホスホネート等の有用性は、固有および／ま
たは外来の遺伝子の不適当な表現に関連して様々の状態
を処理するための治療化合物としての用途の研究を奨励
してきた。
【０００３】例としては、コーヘン編のオリゴヌクレオ
チド：アンチセンス、インヒビターズ・オブ・ジーン・
イクスプレッション（マクミランプレス、ニューヨー
ク、1989) ；バン・デル・クロルら、バイオテクニク
ス、６巻、958 〜976 頁(1988)；マツクラら、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ
・サイエンス、86巻、4244〜4248頁(1989)；イエルら、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、18巻、2855〜2859
頁(1990)；ライターら、プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス、87巻、
3430〜3434頁(1990)；マクマナウェイら、ランセット、
335 巻、808 〜811 頁(1990)；マンソンら、リムホキン
・リサーチ、９巻、35〜42頁(1990)；サンカーら、ヨー
ロッパ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリィ、184
巻、39〜45頁(1989)；アグラワルら、プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエ
ンス、86巻、7790〜7794頁(1989)；ミラー、バイオテク
ノロジィ、９巻、358 〜362 頁(1991)；チアングら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ、266
巻、18162 〜18171 頁(1991)；カラブレッタ、カンサー
・リサーチ、51巻、4505〜4510頁(1991)等がある。
【０００４】通常これらの化合物は「アンチセンス」化
合物として用いられる。すなわち、これらの化合物はオ
リゴヌクレオチドまたはその類似体であり、二本鎖また
は三本鎖の何れかが各ターゲットを酵素分解、ブロック
翻訳またはプロセッシング、またはブロックまたは阻害
発現に一層影響されやすくなっているような、ターゲッ
ト核酸、通常はＲＮＡの、セグメントに相補の塩基配列
をもっている。例えばコーヘン（上記参照）；モーセル
ら、サイエンス、238 巻、645 〜650 頁(1987)がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】これらのアンチセンス
化合物のリン酸塩類似体結合、並びに関連した非ヌクレ
オシドポリマーのリン酸塩類似体結合の多くは、リンで
キラルである。例えば、ホスホロチオエート、ホスホロ
セレノエート、メチルホスホネート等である。ゾン、フ
ァーマスーチカル・リサーチ、５巻、539 〜549 頁(198
8)；およびウールマンとペイマン、ケミカル・レビュ
ー、90巻、543 〜584 頁(1990)。一般に、固相合成中に
これらのリン結合のキラリティをコントロールする方法
がない。従って、このようなポリマーの合成は、ジアス
テレオ異性体の混合物を生じ、混合物の各ポリマーはバ
ックボーンに沿ってＲP とＳP キラルリン結合のランダ
ムな配列をもつ。このような混合物は現在有効な技術的
方法によって調製され、２n ジアステレオ異性体（ｎは
ポリマー中のＰ−キラル結合の数である）から成る。例
えば、２つのＰ−キラル結合をもつ三量体は、次の５’
−＞３’結合配列：ＲP−ＲP 、ＲP −ＳP 、ＳP −Ｒ
P 、およびＳp −ＳP によって示される２2 ＝４の可能
なジアステレオ異性体をもつ。予定されたキラリティの
ポリマーを合成する方法が不足している他に、４量体以
上のものについてＰ−キラル結合をもつポリマーのジア
ステレオ異性体個体群を調製する再現性を直接測定する
ための分析道具が入手し難い。ゾン、301 〜349 頁、ハ
ンコック編、生物工学における高性能液体クロマトグラ
フィー（ジョン・ウイリィ、ニューヨーク、1990) 。
【０００６】予定された配列、長さ、およびキラリティ
をもつオリゴヌクレオチド類似体および関連する非ヌク
レオチドポリマーを調製できないことは、キラリティが
二本鎖の安定性とヌクレアーゼ耐性の重要な要素である
ことから問題がある。例、ロスニコウスキィら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ、18巻、2109〜2115頁(199
0)；バーガースら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリィ、254巻、7476〜7478頁(1979)；ミラー
ら、バイオケミストリィ、18巻、5134〜5143(1979)；ゾ
ン、ファーマスーチカル・リサーチ（上記参照）；エッ
クステイン、アナリチカル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリィ、54巻、367 〜402 頁(1985)等。この証拠は
各Ｐ−ステレオゲン中心で予定されたキラリティをもつ
アンチセンスと関連する化合物の立体コントロール合成
が、最も安定な二本鎖を形成し、核様(nucleolytic) 酵
素に対し最も安定な特別な治療上のジアステレオ異性体
を設計し、有効な寿命を伸ばし、この方法で与えられた
治療効果に対して必要な分量の生体異物の物質を減らす
ことができることを示唆している。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明はモノマー単位が
リン酸基によって結合しているオリゴヌクレオチドとそ
れに関連するポリマー、またはそれらの類似体を合成す
る新しい方法である。本発明の好適例では、本方法はリ
ン結合がキラルであるときはいつでも予定されたキラリ
ティをもつような化合物の合成を含む。本発明はこの種
のポリマーを製造するためのシンソン(synthons)および
シンソン前駆体、並びにリン結合がキラルであるときは
いつでもポリマーそれ自身、および予定されたキラリテ
ィの配列を含む。本発明のシンソンは、適当な場合に
は、ＲP またはＳP 結合の予定された配列をもつポリマ
ーの固相合成を可能にするような、ＲP とＳP キラル形
態に分離できるヒドロキシル保護モノマー−Ｏ−〔１，
３，２−ジカルコゲン置換ホスホラン〕である。
【０００８】本発明の方法は次の工程からなる。 （ａ）固相支持体に結合し、保護されたヒドロキシルを
もつ第一のモノマーを用意し；（ｂ）遊離ヒドロキシル
を形成するように保護されたヒドロキシルを脱保護し、
（ｃ）後に記載する〔化１７〕の化学式から選ばれたシ
ンソンを触媒塩基の存在で遊離ヒドロキシルと反応し；
そして（ｄ）予定された長さのポリマーが得られるまで
（ｂ）と（ｃ）の工程を繰り返す。好ましくは、本方法
は、さらに反応する工程の後に未反応のヒドロキシル基
をキャッピングする工程を含む。本発明の方法の重要な
面は、触媒塩基の存在で分解しない結合基によって固相
支持体に第一のモノマーを結合することである。
【０００９】好ましくは、Ｐ−キラル結合がモノマー間
に形成されるときはいつでも（ｄ）の工程が予定された
長さのポリマーとキラリティが得られるまで（ｂ）と
（ｃ）の工程を繰り返すことからなる。最も好ましく
は、Ｐ−キラル結合がモノマー間に形成され、モノマー
がヌクレオシドまたはそれらの類似体であるときは常
に、（ｃ）の工程が〔化１７〕のシンソンの所定のＰ−
キラル形態を選択し、（ｄ）の工程が予定された長さの
Ｐ−キラルオリゴヌクレオチドが得られるまで（ｂ）と
（ｃ）の工程を繰り返すことからなる。
【００１０】本発明は、リン酸塩またはリン酸塩類似体
の結合をもつオリゴヌクレオチドおよび関連するポリマ
ーを合成するための新しい化学を提供する。特に、リン
酸塩類似体の結合がＰ−キラルであるときはいつでも、
本発明はポリマーバックボーンに沿ってＰ−キラリティ
の予定された配列をもつポリマーを合成する方法を提供
する。本発明のＰ−キラルオリゴヌクレオチドは抗ウイ
ルス剤、アンチセンス治療化合物、ハイブリッド形成プ
ローブ等として用いられる。
【００１１】本発明はヒドロキシル保護モノマー−Ｏ−
〔１，３，２−ジカルコゲン置換ホスホラン〕シンソン
を用いてオリゴヌクレオチドおよび関連するポリマーを
固相合成する新しい方法を提供する。特に、本発明は前
記シンソンの２−Ｎ−置換−１，３，２−ジカルコゲン
置換ホスホラン前駆体、ヒドロキシル保護モノマー−Ｏ
−〔１，３，２−ジカルコゲン置換ホスホラン〕シンソ
ンそれ自身、および４〜数百の範囲のモノマー長、好ま
しくは12〜60の範囲のモノマー長をもつＰ−キラルオリ
ゴヌクレオチドおよび関係するＰ−キラルポリマーを含
む。
【００１２】本発明の方法によって合成されるポリマー
は一般に次式によって表される。
【００１３】
【化１７】
【００１４】式中、Ｑは１〜８の炭素原子をもつアルキ
ルまたはアルケニル；１〜８の炭素原子および１〜２の
酸素または硫黄ヘテロ原子をもつアルコキシまたはアル
キルチオ；または両隣の酸素原子をひとまとめに考える
ときはヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。
好ましくは、Ｑは３〜６の炭素原子をもつアルキルまた
はアルケニル、または３〜６の炭素原子と１の酸素原子
をもつアルコキシ、または両隣の酸素原子をひとまとめ
に考えるときはヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体
である。さらに好ましくは、Ｑは、３〜６の炭素原子を
もつアルキル、または４〜５の炭素原子と１の酸素原子
をもつ環状アルコキシ、または両隣の酸素原子をひとま
とめに考えるときはヌクレオシドまたはヌクレオシド類
似体である。
【００１５】Ｒ1 は、水素またはヒドロキシル保護基、
例えば、トリフェニルメチル（すなわち、トリチル）、
Ｐ−アニシルジフェニルメチル（すなわち、モノメトキ
シトリチルまたはＭＭＴ）、ジ−ｐ−アニシルフェニル
メチル（すなわち、ジメトキシトリチルまたはＤＭ
Ｔ）、ピバロイル、アセチル、４−メトキシテトラヒド
ロピラン−４−イル、テトラヒドロピラニル、フェノキ
シアセチル、イソブチロキシカルボニル、ピキシル、ベ
ンジル、３〜９の炭素原子をもつトリアルキルシリル、
９−フルオレニルメチルカルバメート (Ｆｍｏｃ) 等で
ある。グリーネおよびウッツの有機合成における保護
基、２版（ジョン・ウィリィ、ニューヨーク、1991)
は、本発明の種々の具体例のための保護基の選択に関し
て詳細な手引きとなる。
【００１６】Ｘはカルコゲン、好ましくはＳ、Ｏ、また
はＳｅ、または＝ＮＲ2(式中のＲ2は１〜６の炭素原子
をもつアルキル、またはＲ2 は６〜12の炭素原子をもつ
アリール、アルキル置換アリール、またはアルケニル置
換アリールである) の形態の置換イミノである。Ｙはカ
ルコゲン、好ましくはＳ、Ｏ、またはＳｅである。ｎは
１〜数百の範囲である。好ましくはｎは５〜200 の範囲
であり、さらに好ましくは、ｎは12〜60の範囲であり、
最も好ましくは、ｎは15〜30の範囲である。
【００１７】本発明のシンソンはヒドロキシル保護モノ
マー−０−〔１，３，２−ジカルコゲン置換ホスホラ
ン〕であり、好ましくは次式によって定義される。
【００１８】
【化１８】
【００１９】式中のＱ、Ｒ1 、ＸおよびＹは上記と同じ
である。ＺはＳまたはＳｅであり；さらに好ましくはＺ
はＳである。Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ 5およびＲ6 は別々に水素
または電子を引っ張る基である。好ましくは、Ｒ3 、Ｒ
4 、Ｒ5 およびＲ6 は別々に１〜４の炭素原子をもつア
ルキルであり、または、別々にまたは共に６〜12の炭素
原子をもつアリールまたはアルキル置換アリールに結合
する炭素原子をもつ。Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 の特
別な選択がキラリティになるときはいつでも、〔化１
８〕のシンソンはこれらの環置換基の所定の立体化学配
列と共に使用される。〔化１８〕のシンソンは次の環状
亜燐酸塩を適当なモノマーの遊離ヒドロキシルと反応さ
せて作られる。
【００２０】
【化１９】
【００２１】式中、Ｙ、ＺおよびＲ3 〜Ｒ6 は上記と同
じであり、Ｗはモノマーの遊離ヒドロキシルによって求
核攻撃を受け易い残基である。好ましくはＷはハロゲ
ン、２〜６の炭素原子をもつジアルキルアミノ、モルホ
リニル、ピペリジニルまたはピロリジニルである。さら
に好ましくは、Ｗは塩素原子、モルホリノ、およびジイ
ソプロピルアミノからなる群から選ばれる。
【００２２】本発明のＰ−キラルポリマーは一般に〔化
１７〕によって表され、但し、ＸおよびＹは少なくとも
１の結合で同一ではなく、同じポリマーの全部の結合が
同一である必要はない。さらに特に、本発明のＰ−キラ
ルオリゴヌクレオチドは次式によって表される。
【００２３】
【化２０】
【００２４】式中のＸ、ＹおよびＲ1 は上記と同じであ
る。但し、ＸとＹは少なくとも１の結合で同一ではな
く、同じオリゴヌクレオチドの全部の結合が同一である
必要はない。Ｂは天然または合成によって修飾されたプ
リンまたはピリミジン塩基である。Ｄ’は３’−ヒドロ
キシル保護基である。Ｄは水素、ハロゲン、ヒドロキシ
ル、またはＯＲ'(式中のＲ’は１〜３の炭素原子をもつ
アルキル、またはアルキルシリル、例えばｔ−ブチルジ
メチルシリル等の２’−ヒドロキシル保護基）である。
好ましくは、ｎは５〜200 であり、さらに好ましくは、
12〜60の範囲にある。〔化２０〕から、本発明のＰ−キ
ラルオリゴヌクレオチドは〔化１８〕のシンソンの適当
な選択によって、ヌクレオシド間の5'−3'、5'−2'、5'
−5'、3'−3'、2'−2'および3'−2'結合を含むことがで
きる。
【００２５】ここで使用する「オリゴヌクレオチド」の
語は、大きさが例えば３〜４の数モノマー単位から数百
モノマー単位までの範囲のホスホジエステル結合または
その類似体によって通常結合している、デオキシリボヌ
クレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー
形態等を含む、天然または改良されたヌクレオシドの線
形オリゴマーを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌク
レオチドは12〜60のモノマー単位の長さをもち、さらに
好ましくは、15〜30のモノマー単位の長さをもつ天然ヌ
クレオシドのオリゴマーである。オリゴヌクレオチドが
「ATGCCTG 」のような文字の配列で表されるときはいつ
でも、ヌクレオチドは左から右へ５’−＞３’のオーダ
ーである。
【００２６】ヌクレオシドモノマー間のリン酸結合はホ
スホジエステル結合およびホスホジエステル結合の類似
体、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、
ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート等を
含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドのモノ
マーとホスホジエステル、ホスホロチオエート、または
ホスホロジチオエート結合によって結合する。
【００２７】ここで使用する「ヌクレオシド」は、例え
ば、コーンベルグおよびベーカー、ＤＮＡ複製、２版
（フリーマン、サンフランシスコ、1992) に記載されて
いるような２' −デオキシおよび２' −ヒドロキシ形態
を含む、天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関
係がある「類似体」は、例えば、シャイト、ヌクレオチ
ド類似体（ジョン・ウィリィ、ニューヨーク、1980) に
より一般に記載されている、修飾された塩基部分および
／または修飾された糖部分をもつ合成ヌクレオシドを含
む。このような類似体は、本発明による合成のための適
当な保護基をもつかまたはもたない天然および合成のヌ
クレオシドを含む。ヌクレオシド類似体の具体例のリス
トには、２−アミノプリン、デオキシイノシン、Ｎ4 −
メトキシデオキシシチジン、Ｎ4 −アミノデオキシシチ
ジン、５−フルオロデオキシウリジン等を含む。
【００２８】「電子を引っ張る」の語は、離れている分
子の価電子を引きつける置換基の傾向、すなわち電気陰
性を示す、マーチ・アドバンスド・オーガニック・ケミ
ストリィ、16〜18頁（ジョン・ウィリィ、ニューヨー
ク、1985) 。本発明の一面は、オリゴヌクレオチドの固
相合成、例えば保護基の選択、固相支持体の選択等への
他のアプローチに共通である。従って、本発明の関連に
おいて、このような選択をするときに考慮できるガイダ
ンスを、次に示すような刊行物に見出すことができる。
編集者ガイト、オリゴヌクレオチド合成：実際的アプロ
ーチ（ＩＲＬプレス、オックスフォード、1984) ；アマ
ルナスとブルーム、ケミカルレビュー、77巻、183 〜21
7 頁 (1977) ；ポンら、バイオテクニクス、６巻、768
〜775 (1988)；オオツカら、ニュークレイクアシズリサ
ーチ、10巻、6653〜6507 (1982) ；編集者エックスタイ
ン（上記）、グリーンとウッツ（上記）編集者ナラン
グ、ＤＮＡとＲＮＡの合成と応用（アカデミックプレ
ス、ニューヨーク、1987) 等がある。
【００２９】本発明のシンソン前駆体物質は、一般に次
の式に従って合成される。
【００３０】
【化２１】
【００３１】一般に、シンソン前駆物質は、適当に１，
２−置換されたエタン誘導体と三塩化リンを、アプロチ
ク（aprotic)溶媒、好ましくはヘキサン、ジエチルエー
テルまたは塩化メチレン中、−10℃〜30℃の範囲内の温
度で、トリアルキルアミンまたはピリジンのような塩基
の存在で反応させることによって合成される。塩基とし
てはピリジンが好ましい。得られた２−クロロ−１，
３，２−ジカルコホスホランを、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルアミンまたはモルホリンのような第二アミンと反応さ
せて、好適なシンソン前駆物質を与える。
【００３２】本発明のシンソンは次式に従って一般に合
成される。
【００３３】
【化２２】
【００３４】式中、Ｒ1 、Ｒ3 〜Ｒ6 、Ｗ、Ｘ、Ｑ、Ｙ
およびＺは上記と同じである。〔Ｘ〕はＸ部分をリンへ
移すための試薬を表す。ＸがＳであるとき、〔Ｘ〕は元
素硫黄、１，１−ジオキソ−３Ｈ−１，２−ベンゾジチ
オール−３−オン、またはアシルジスルフィドまたは相
当するジホスホロチオールジスルフィドであり、例えば
ステックらのＰＣＴ／US91／01010 がある。ＸがＳｅで
あるとき、〔Ｘ〕は元素セレニウムまたはカリウムセレ
ノシアネートの飽和溶液、たとえばステックら（J. Am.
Chem. Soc., 106巻、6077〜6079頁(1984)) によって教
示されたような95％ピリジン／５％トリエチルアミンの
飽和溶液である。ＸがＮＲ2 であるとき、〔Ｘ〕はＮ3
Ｒ2 のアジド（式中、Ｒ2 は６〜12の炭素原子をもつア
リール）である。また、好ましくはＲ2 はフェニルであ
る。好ましくは、反応はアプロチック有機溶媒、例えば
メチレンクロリド、または類似の溶媒中で行われ、Ｗが
ハロゲンでないときは、テトラゾールまたは置換したテ
トラゾールのようなマイルドな酸で触媒される、例えば
ダールら（Nucleic Acids Research, 15巻、1729〜1743
頁 (1987) がある。Ｗがハロゲンであるとき、反応は好
ましくは、ピリジン、置換したピリジン、またはトリア
ルキルアミンのようなマイルドな塩基によって触媒され
る。好ましいマイルドな塩基はトリエチルアミンまたは
ジイソプロピルエチルアミンである。
【００３５】シンソンがＰ−キラルであるようにＱ、
Ｘ、ＹおよびＺが選ばれるときはいつでも、シンソンの
Ｒp とＳp の形態は、Ｐ−立体的中心で予定されたキラ
リティのポリマーを合成する前に分離されなければなら
ない。ここで使用するように、「Ｒp 」および「Ｓp 」
はポリマー中のシンソンまたはリン結合におけるキラル
リン原子の二者択一の立体配置を指す。具体的なＲp お
よびＳp 二量体を以下に示す。
【００３６】
【化２３】
【００３７】Ｐ−キラルポリマーに関して、キラルリン
原子の配列はモノマー間で「ｐｓ」または「ｐｒ」の下
付き文字で示され、例えば、４個のＳp リン結合をもつ
五量体については、ＱpsＱpsＱpsＱpsＱ、または二者択
一のＲs およびＲp リン結合をもつ11量体のオリゴヌク
レオチドについては、ＡpsＴprＧpsＡprＣpsＴprＴpsＧ
prＧpsＡprＣ（式中のＡ、Ｃ、ＧおよびＴは、明記しな
い限り、天然の２’−デオキシヌクレオシドデオキシア
デノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、お
よびデオキシチミジンをそれぞれ示す）で示される。リ
ン結合がアキラルであるとき、モノマー間では呼称はな
い。従って、ＱpsＱＱＱＱはＳp タイプの単一のＰ−キ
ラル結合をもつ五量体を示すが、結合の残りは、アキラ
ルまたはＲp とＳp キラリティの混合である。
【００３８】ヌクレオシドモノマーに関して、シンソン
のホスホラン部分は、オリゴヌクレオチドの３’−＞
５’または５’−＞３’合成を行うことができる、３’
または５’ヒドロキシル基に結合する。好ましくは、ホ
スホラン部分は３’ヒドロキシル基を介して結合する。
シンソンのＲp とＳp のキラル形態の分離は、標準技
術、通常はシリカゲルクロマトグラフィまたは高性能液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行われ、例
えばミスロウの立体化学概論（Introduction to Stereo
chemistry W. A.Benjamin, New York, 1966) がある。
ヌクレオシドシンソンに関して、幾つかの場合はＲp と
Ｓp の形態はよく知られているヌクレアーゼに対するオ
リゴマーの消化を受けやすい差異によって同定すること
ができるが、一般にＲp 形態は下記のＨＰＬＣ条件下で
より遅く溶出するジアステレオ異性体である。従来のＸ
線結晶学と２−Ｄ ＮＭＲ法もまた使用でき、モノマー
のキラリティが知られている場合にリンの絶対的な立体
化学を与える。ここで使用されるように、本発明のシン
ソンのＲp とＳp の形態に関して、またはＲp とＳp キ
ラリテイの特別な配列をもつオリゴマーに関して、「ジ
アステレオ異性体として純粋」は、他のすべてのリン配
置を殆ど含まない指示された立体化学を意味する。好ま
しくは、モルを基礎として、各結合に対して指示された
立体化学が95％以上、各結合に対して他のリン配置が５
％以下からなる化合物を意味する。さらに好ましくは、
モルを基礎として、各結合に対して指示された立体化学
が99％以上、各結合に対して他のリン配置が１％以下か
らなる化合物を意味する。
【００３９】本発明のポリマーは一般に次式に従って合
成される。
【００４０】
【化２４】
【００４１】式中、Ｑ、Ｘ、ＹおよびＺは上記と同じで
あり、ＳＳは固相支持体およびＲ7はキャッピング剤、
例えばアシル、イソプロピルホスホネート等である。カ
ップリング反応の重要な特徴は触媒塩基、好ましくは非
求核性の例えばカリウム第三ブトキシド、１−メチルイ
ミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、４−ジメチルア
ミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８−ジアザビシクロ
〔５．４．０〕ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）等の存在
である。好ましくは、ＤＢＵを触媒塩基として用い、反
応物よりも過剰のモル（例えば100 〜300 倍) で用い
る。カップリング反応は無水有機溶媒、例えばアセトニ
トリル、メチレンクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド等の中で行うことができる。ＳＳは異なる化学作用
を用いて、例えばリンアミドのシンソンを用いて合成さ
れたオリゴヌクレオチドと結合した固相支持体を含むこ
とができる。
【００４２】種々の固相支持体を本発明に使用できる
が、調整ポアガラスまたはポリスチレンが好ましい。好
ましくは、固相支持体を合成すべきポリマー鎖の最初の
モノマーに誘導し、例えば、支持体にモノマーを結合す
る連結基が合成サイクルで使用される触媒塩基その他の
反応物の存在で安定であるようにする。好ましくは、本
発明のポリマーは固相支持体、例えば調整ポアガラス
（ＣＰＧ）に、ブラウンら(J. Chem. Soc. Chem. Commu
n., 1989, 891 〜893 頁) およびフレイデラーら（Tetr
ahedron Letters, 31 巻、2549頁 (1990))によって教示
されたように、サルコシニルリンカーによって結合され
る。簡単には、固相支持体は次のように機能的にする：
９−フルオレニルメトキシカルボニル−サルコシン（Ｆ
ＭＯＣ−サルコシン)(10当量) およびジシクロヘキシル
カルボジンミド（ＤＣＣ)(15当量) をＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）およびジシクロロメタンの混合
物中で長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧに添加する。ピリミ
ジン中でピペリジンとＦＭＯＣ基の除去は、続いてＤＣ
Ｃ（15当量) の存在で、ヒドロキシル基保護モノマー−
Ｏ−サクシネート（10当量) にサルコシンメチルアミノ
基をカップリングする。５' −Ｏ−ＤＭＴ−保護ヌクレ
オシドに対して、これは乾燥支持体１グラム当り約20ミ
クロン当量の荷重となる。
【００４３】好ましくは、上記の合成サイクルの一般工
程の他に、各カップリング工程の後に、キャッピング工
程を加えて、さらにモノマーを付加することを妨げる基
と未反応の遊離ヒドロキシル基を反応させる。好ましく
は、未反応の遊離ヒドロキシル基を、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）中に一部の無水酢酸／ルチジン（10：10：
80 v/v/v) およびＴＨＦ中に一部のＮ−メチルイミダゾ
ール（16：84 v/v) から成るキャッピング溶液と反応さ
せる。さらに好ましくは、各脱保護、カップリング、お
よびキャッピング工程の後に、固相支持体を適当な溶
媒、通常はアセトニトリルを用いて洗浄する。
【００４４】好ましくは、本発明を自動化する。自動化
するための装置は幾つかの形態をとることができる。一
般に、装置は一連の反応物貯蔵器、固相支持体を含む合
成チャンバ、および反応物貯蔵器から合成チャンバと精
製チャンバまで、合成チャンバから精製チャンバまで、
予定された方法で反応物を移送するためのコンピュータ
ー制御手段から成る。反応物を移送するためのコンピュ
ーター制御手段は、ウルソンら（Biotechniques,６巻、
779 頁(1988)) によって開示されたような、一般の実験
室ロボットによって、または専用の配管システムおよび
電子制御手段によって実行することができる。好ましく
は、コンピューター制御手段は複数の貯蔵器とチャンバ
を連結する弁と配管の専用システムによって実行するこ
とができる。さらに好ましくは、広く入手できる多くの
自動化合成体（例えばアプライド・バイオシステムズ社
のモデル380Bまたは381AＤＮＡ合成体）によって使用さ
れるように、アルゴンのような加圧希ガスによって反応
物貯蔵器中に正圧を保持することによって、試薬を配管
を介して送る。
【００４５】本発明のオリゴヌクレオチドを、ハメスら
（著者、Nucleic Acid Hybridization : A practical A
pproach (IRL Press, OXFORD, 1985))に教示されている
ように、ハイブリッド形成プローブとして用いることが
できる。本発明のポリマーはまた製薬組成物の成分とし
て用いることができる。本発明のポリ（アルキルまたは
アルケニルホスフェート）の場合には、このような組成
物は少なくとも１種のポリ（アルキルまたはアルケニル
ホスフェート）および／または少なくとも１種のそれら
のチオホスフェート類似体の抗ウイルス性治療量を製薬
学的に有効な担体中に含む。ポリ（アルキルまたはアル
ケニルホスフェート）およびそれらのチオ類似体を、単
鎖長（すなわちｎが１）として、または１以上の鎖長の
のポリマーを含む限定された混合物として投与すること
ができる。最も好ましくは、単鎖長を15〜30モノマーの
範囲内で用いる。
【００４６】種々の病気や疾患を本発明の抗過敏オリゴ
ヌクレオチドからなる組成物の投与によって、治療する
ことができる。核酸表現の抗過敏抑制によって治療でき
るウイルス性病気は、これらに限られるものではない
が、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘ
ルペスウイルスＩまたはII、ヒト免疫不全ウイルスタイ
プＩまたはII、インフルエンザウイルス、呼吸性シンシ
チアルウイルス、およびヒト乳頭腫ウイルスによって引
き起こされるものを含む。本発明の抗過敏化合物の投与
によって治療できる悪性腫瘍は、これらに限られるもの
ではないが、肺癌（例えば小細胞肺癌）、結腸癌、前立
腺癌、胸部癌、および白血病とリンパ腫を含む。この種
の病気では、抗過敏化合物を病気と結合した異常表現腫
瘍遺伝子、あるいは病気の状態の一部として不適当に表
現された他の遺伝子にターゲットする（例えば、Aarons
on, Science, 254巻、1146〜1153頁(1991)) 。
【００４７】急性の炎症性およひ免疫反応、例えば敗血
症性ショック、好酸球増加症等も、本発明の抗過敏化合
物で治療でき、不適当におよび／または異常に表現され
たサイトカイン遺伝子を抑制する（例えばトラシイら、
Nature, 330 巻、662 〜664頁 (1987) 、米国特許第5,0
55,447 号およびワージら、J. Exp. Med., 169 巻、333
〜338 頁 (1989)(抗過敏ＴＮＦ−αおよび／またはＴ
ＮＦ−β）；スターンスら、J. Immunol., 145巻、4185
〜4191頁 (1990) 、およびフォングら、J. Immunol., 1
42巻、2321〜2324頁（アンチセンスIL-6) ；コフマン
ら、Science, 245巻、308 〜310 頁（アンチセンスIL-
5) ；フィンケルマンら、J. Immunol., 141巻、2335〜2
341頁 (1988)(アンチセンスIL-4) ；ヤングら、Blood,
68 巻、1178〜1181頁 (1986)(アンチセンスGM-CSF) 等
がある) 。
【００４８】製薬キャリアは、本発明の組成物を患者に
与えるのに適した任意の相溶性無毒物質であることがで
きる。殺菌水、アルコール、脂肪ワックス、中性脂質、
カチオン脂質、および不活性固体をキャリヤに含ませる
ことができる。製薬学的に容認できるアジュバント、例
えば、緩衝剤、分散剤等も製薬組成物に混入してもよ
い。局所投与のため、本発明の組成物は、一般にこの分
野で知られているような軟膏、塗剤、ゲル、またはクリ
ームに配合する。一般に薬剤の経口投与用の組成物は良
く知られている（例えば、レミングストンの Pharmaceu
tical Science, 15 版（Mack Publishing Company, Eas
ton, PA, 1980)) 。本発明の組成物は、挿入または注射
可能な薬剤デリバリイシステムによって投入することも
できる（例えば、Urquhart et al, Ann. Rev. Pharmaco
l. Toxicol., 24 巻、199 〜236 頁(1984); Lewis, ed.
Controlled Release of Pesticides and Pharmaceutic
als(Plenum Press, New York, 1981); ＵＳ特許3,773,9
19 ; ＵＳ特許3,270,960 等である) 。本発明の化合物
も組織をターゲットするかまたは細胞膜等に浸透するこ
とを促す移送部分に結合させることができる（例えば L
atham ら、ＰＣＴ出願ＷＯ91／14696)。
【００４９】好ましくは、本発明の組成物は非経口投与
され、さらに好ましくは静脈注射で投与される。このよ
うな場合、製薬キャリヤは生理食塩水溶液、ブドウ糖溶
液、これら２つの組合せ、オレイン酸エチルのような非
水溶液等を含む。本発明の組成物のための投与管理の選
択には、血清中の特定の化合物の分解速度、ターゲット
の組織や細胞の接近性、薬物動力学、毒性等を含む幾つ
かの要因に依存する。好ましくは、投与管理は副作用を
受容できる水準と矛盾なく、患者への化合物の投与量を
最大にする。従って、化合物の投与量は特定の化合物と
ウイルス感染または他の治療条件の厳しさに依存するこ
とできる。好ましくは、本発明の化合物の一日当りの投
与量は、約１〜２μg/kgから約10〜20mg/kg までの範囲
にある。
【００５０】
【発明の効果】本発明は、リン酸塩またはリン酸塩類似
体の結合をもつオリゴヌクレオチドおよび関連するポリ
マーを合成するための新しい化学を提供する。特に、リ
ン酸塩類似体の結合がＰ−キラルであるときはいつで
も、本発明はポリマーバックボーンに沿ってＰ−キラリ
ティの予定された配列をもつポリマーを合成する方法を
提供する。本発明のＰ−キラルオリゴヌクレオチドは抗
ウイルス剤、アンチセンス治療化合物、ハイブリッド形
成プローブ等として用いられる。
【００５１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を説明する。 実施例１２−クロロ−１，３，２−オキサチアホスホラン ピリジン（79.1ｇ、1.0 モル) とベンゼン (400ml)の混
合物に、室温にて攪拌しながら、２−メルカプトエタノ
ール（39.1ｇ、0.5 モル) および三塩化リン (68.7ｇ、
0.5 モル) を添加した。0.5 時間攪拌を続け塩化ピリジ
ニウムを濾過除去し、濾液を減圧下に濃縮した。粗生成
物を減圧下に蒸留によって精製し、70〜72℃／20mmHgの
沸点の留分を集めた。31P ＮＭＲ：δ205.0ppm（ベンゼ
ン）。収率：72％。
【００５２】実施例２Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−１，３，２−オキサチ
アホスホラン 実施例１の２−クロロ−１，３，２−オキサチアホスホ
ラン（28.5ｇ、0.2 モル) をｎ−ペンタン（300ml)に溶
解した溶液に、室温にてかきまぜながら、Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミン（40.5ｇ、0.4 モル) を滴下しながら
添加した。0.5時間後、ジイソプロピルアミン塩酸塩を
濾過によって除去し、溶媒を減圧下に蒸発させ、生成物
を蒸留した。
【００５３】70℃／0.1mmHg にて集めた留分は31P ＮＭ
Ｒによって均質であることがわかった。収率：70％。31
P ＮＭＲ：δ147.8ppm（ベンゼン）。ＭＳ：m/z 207 (M
- ,E.I., 15eV) 。 実施例３２−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−４，４−ジメチル
−１，３，２−オキサチアホスホラン 20ミリモルの無水ピリジンのベンゼン25ml溶液に、０〜
５℃の温度にて、かきまぜながら、10ミリモルの２−メ
チル−２−メルカプトプロパノール−１および10ミリモ
ルの三塩化リンの混合物を滴下して添加した。次いで、
反応混合物を室温にて１時間保持した。ピリジン塩酸塩
を濾過により除去し、濾液を減圧下に濃縮した。蒸留に
よって２−クロロ−４，４−ジメチル−１，３，２−オ
キサチアホスホラン、b.p. 48 〜52℃／0.1mmHg を与え
た。この化合物の10ミリモルを25mlのｎ−ヘキサンに溶
解し、この溶液に、かきまぜながら、室温にて、20ミリ
モルのＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンを添加した。１時
間後、ジイソプロピルアミン塩酸塩を濾過によって除去
し、生成物の２−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−４，
４−ジメチル−１，３，２−オキサチアホスホランを減
圧下に蒸留した。86〜90℃／0.1mmHg の留分、31P ＮＭ
Ｒ(C6D6) d 154.3ppm を集めた。
【００５４】実施例４２−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−１，３，２−ジチ
アホスホラン Ａ．20ミリモルの無水ピリジンのベンゼン（25ml）溶液
に、０〜５℃の温度にて、攪拌しながら、同時に、10ミ
リモルの１，２−エタンジチオールと10ミリモルの三塩
化リンを滴下して添加した。次いで、反応混合物を室温
にて１時間攪拌した。ピリジン塩酸塩を濾過により除去
し、濾液を減圧下に濃縮した。残渣を14mmHgにて蒸留
し、1.15ｇ（73％) の２−クロロ−１，３，２−ジチア
ホスホランを無色の液体の形で得た。 沸点110 ℃、31P ＮＭＲ：δ 170.7ppm (C6D6)。
【００５５】Ｂ．２−クロロ−１，３，２−ジチアホス
ホラン（10ミリモル) をベンゼン25mlに溶解した溶液
に、０〜５℃の温度にて、攪拌しながら、Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミン（20ミリモル) を添加した。次いで反
応混合物を室温にて１時間攪拌した。ジイソプロピルア
ミン塩酸塩を濾過し、濾液を減圧下に留去した。残渣を
0.6mmHg にて蒸留し、1.4g (63％) の２−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノ−１，３，２−ジチアホスホランを無
色液体の形で得た。 沸点110 ℃、31P ＮＭＲ：δ 93.9ppm (CD3CN)。
【００５６】実施例５Ｎ6-イソプロポキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−
ジメトキシトリフェニルメチル）−２−デオキシアデノ
シン−３’−Ｏ−〔１，３，２−オキサチアホスホラン
−２−スルフィド〕 １ミリモルのＮ6-イソプロポキシアセチル−５’−Ｏ−
ＤＭＴ−２’−デオキシアデノシンおよび１ミリモルの
１−Ｈ−テトラゾールを50℃にて真空下に乾燥した。無
水の三塩化メチレン（３ml) に溶解した後、２−ジイソ
プロピルアミノ−１，３，２−オキサチアホスホラン
（1.1 ミリモル) を、攪拌しながら添加した。１時間室
温にて攪拌を続け、次いで10ミリモルの元素イオウを添
加し一晩攪拌した。反応混合物を濃縮乾燥し、シリカゲ
ルカラムで精製した。収率：90％、31P ＮＭＲ：δ 10
3.6 ;δ103.58ppm (C6D6)、外部標準として85％H3P
O4 。
【００５７】実施例６Ｎ4-イソプロポキシアセチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’
−デオキシシチジン−３’−Ｏ−〔１，３，２−オキサ
チアホスホラン−２−スルフィド〕 出発物質として、Ｎ4-イソプロポキシアセチル−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシシチジンを使用したことを
除いて、実施例５と同じ方法を行った。収率：87〜88
％、31P ＮＭＲ：δ 104.38 ; δ104.36ppm (C6D6)、外
部標準として85％H3PO4 。
【００５８】実施例７Ｎ2-イソプロポキシアセチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’
−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−〔１，３，２−オキ
サチアホスホラン−２−スルフィド〕 出発物質として、Ｎ2-イソプロポキシアセチル−５’−
Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシグアノシンを使用したこと
を除いて、実施例５と同じ方法を行った。収率：72％、
31P ＮＭＲ：δ 103.66 ; δ103.58ppm (C6D6)、外部標
準として85％H3PO4 。
【００５９】実施例８５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシチミジン−３’−Ｏ
−〔１，３，２−オキサチアホスホラン−２−スルフィ
ド〕 出発物質として、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシチ
ミジンを使用したことを除いて、実施例５と同じ方法を
行った。収率：92％、31P ＮＭＲ：δ 104.14; δ104.1
2ppm (C6D6)、外部標準として85％H3PO4 。
【００６０】実施例９実施例５〜８のシンソンの立体異性体の分離 シンソン（Ａipa 、Ｃipa 、Ｇipa およびＴは実施例５
〜８の生成物を、それぞれ示す）のジアステレオマー異
性体混合物を下表に示すようにシリカゲル（キーゼルゲ
ル60Ｈ）カラム（200 ×60mm) で分離した。１グラムの
生成物を各ケースに適用した。
【００６１】 速く溶離した異性体 遅く溶離した異性体 シンソン 溶離剤 比率 分量 31ＰＮＭＲ 分量 31ＰＮＭＲ Ａipa 酢酸エチル： 2 : 1 ヘプタン 300mg 103.58 250mg 103.63 Ｃipa 酢酸エチル： 1 : 1 塩化メチレン 350mg 104.36 200mg 104.38 Ｇipa 酢酸エチル： 2 : 1 : 0.2 塩化メチレン ：メタノール 230mg 103.50 150mg 103.66 Ｔ 酢酸エチル： 2 : 1 ヘプタン 350mg 104.12 200mg 104.14 実施例１０ヌクレオシド−３’−Ｏ−〔２−チオノ−１，３，２−
オキサチアホスホラン〕シンソンをさらに合成 ヌクレオシドシンソンを次のような保護塩基部分の環外
アミンを用いて調製した：Ｎ6-ベンゾイルアデニン、Ｎ
4-ベンゾイルシトシン、およびＮ2-イソブチリルグアニ
ン（対応するシンソンは、それぞれＡbz、Ｃbz、および
Ｇibu であり、Ｔとしてチミジンシンソン）。４つのシ
ンソンの各々を次のように調製した：それぞれの保護さ
れた５’−ＤＭＴ−Ｏ−（２’−デオキシリボヌクレオ
シド）（10ミリモル) と１Ｈ−テトラゾール（0.77ｇ、
11ミリモル) の混合物を高真空下に５時間乾燥し、次い
でジクロロメタン（25ml) に溶解した。この溶液に実施
例２の生成物（2.28ｇ、11ミリモル) を10分間かけて滴
下しながら添加し、得られた混合物を室温にてかきまぜ
ながら、２時間保持した。前もって数時間真空系で乾燥
した元素イオウ（0.48ｇ、15ミリモル) を反応混合物に
一部ずつ添加し、かきまぜながら一晩放置した。未反応
のイオウを濾過して除去し、溶媒を回転エバポレーター
で蒸発させた。残渣をクロロホルム（３ml）に溶解し、
シリカゲル（30cm×６cmカラム、230 〜400 メッシュの
シリカ 170g)にかけた。まずCHCl3(200ml) 、次にCHCl
3 : CH3OH (97 : 3 v/v)を用いて溶離させた。集められ
た画分のＨＰＴＬＣによって単離をモニターした。各生
成物を含んでいる集められた画分を一緒にプールして、
蒸発させた。溶媒を蒸発させた後、生成物全部が白色泡
状固体として得られ、それぞれＳp とＲp のジアステレ
オ異性体（Ａbz、ＣbzおよびＧibu 、Ｔのそれぞれの収
率は90％、89％、85％および92％) の混合物から成って
いた。
【００６２】全部の場合、純粋なジアステレオ異性体は
Ｃbzのために続ける方法に似た方法によって得られた。
１ｇのＣbz生成物を酢酸エチル（４ml) に溶解し、シリ
カゲル60Ｈ（200g、メルク、Art. No. 7736)のカラム
(30cm×６cm) に装填した。ジアステレオ異性体を酢酸
エチルを用いて溶離し、15mlの各画分を収集した。生成
物の溶離をＨＰＴＬＣ（酢酸エチルの３回の展開；検
出：HCl スプレー) によって続けた。分離したジアステ
レオ異性体を含有する画分（速い：画分61〜73、遅い：
画分87〜98) を一緒にプールし、それぞれ、減圧下に濃
縮乾燥し、残渣は、31P ＮＭＲとＨＰＬＣによって（Li
chrospher Si 100、５μm (30cm ×7.8mm)を用い溶離液
流速３ml／分として酢酸エチルを用いて) 調べた。速い
ジアステレオ異性体について：250mg の回収（収率25
％) 、31P ＮＭＲ（C6D6中、外部標準としてH3PO4)：δ
104.31ppm （ベンゼン）100 ％ジアステレオ異性体とし
て純粋。遅いジアステレオ異性体について：180mg の回
収（収率18％) 、31P ＮＭＲ：δ104.26ppm （ベンゼ
ン）100 ％d.p.。画分74〜86は異性体を繰り返し単離す
るため再循環した。単離したシンソンのデータを下表に
まとめて示す。 速く溶離した異性体 遅く溶離した異性体 シンソン 31P ＮＭＲ Ｒｆ 31P ＮＭＲ Ｒｆ Ａbz 103.23 0.34 103.18 0.31 Ｃbz 104.31 0.27 104.26 0.22 Ｇibu 104.52 0.22 104.17 0.20 Ｔ 104.27 0.59 104.23 0.57 実施例１１５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’−Ｏ−〔２−チオノ
−４，４−ジメチル−１，３，２−オキサチアホスホラ
ン １ミリモルの５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジンと１ミリモル
の１Ｈ−テトラゾールを真空下に３時間乾燥した。４ml
のCH2Cl2を添加し、次いで得られた溶液を１ミリモルの
２−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−４，−ジメチル−
１，３，２−オキサチアホスホランと混合した。ホスフ
ィチル化をＴＬＣ（CHCl3 : MeOH＝９：１）によって続
けた。ホスフィチル化剤が消失した後、反応混合物に１
ミリモルの元素イオウを添加し、反応物を室温にて２時
間かきまぜた。CHCl3 を用いて生成物をシリカゲルカラ
ムで精製した。収率：68％, Ｒｆ（ＴＬＣ）0.74 (CHCl
3:MeOH 9：1) 31PＮＭＲ： 108.08; 107.80ppm (CD3C
N)。
【００６３】実施例１２ヌクレオシド−５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−〔２−チ
オノ−１，３，２−ジチアホスホラン〕シンソン 実施例４の生成物を実施例１１で述べたように５’−Ｄ
ＭＴ保護ヌクレオシド（外環アミンを実施例１０と同様
に保護した）を用いて反応させて、２−チオノ−１，
３，２−ジチアホスホランシンソンを得た。硫化の効果
が少量のピリジンの存在で促進されることを見出した。
結果を下表に示す。
【００６４】シンソン 収率 Ｒｆ（ＴＬＣ） 31P ＮＭＲ Ａbz 62.4％ 0.80 123.95 (CD3CN) Ｃbz 81.4％ 0.74 124.70 (CD3CN) Ｇibu 50.4％ 0.61 124.96 (CD3CN)Ｔ 74.4％ 0.65 121.93 (C6D6) 実施例１３５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’−Ｏ−〔２−セレノ
−１，３，２−オキサチアホスホラン ５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジンを実施例１１と同じ条件下
に２−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−１，３，２−オ
キサチアホスホランおよび元素セレニウムと反応させ
た。収率80％、31P ＮＭＲ：99.05, 98.90ppm, (CHC
l3), Jpse 952.16Hz,Ｒｆ0.77 (CHCl3 : MeOH＝９：
１）。
【００６５】実施例１４サルコシニルリンカーを介して固相支持体に結合した
５’−Ｏ−ＤＭＴ−ヌクレオシドの合成 Ａ．長鎖アルキルアミンＣＰＧ（ＬＣＡ−ＣＰＧ、シグ
マ、Cat. No. L-8638,500A, 80〜130 メッシュ、２ｇ）
およびＮ−Ｆｍｏｃ−サルコシン（Bachem Bioscience,
Inc., Prod. No. B-1720, 0.5g, 1.6ミリモル) を共に
混合し、高真空下に３時間乾燥した。乾燥ジメチルホル
ムアミド（５ml) 、ピリジン (0.5ml)、およびジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（0.5g、2.4 ミリモル) を添加
し、混合物全部を密閉したガラス瓶（7.4ml)に入れて12
時間静かに振った。固相支持体の懸濁液を焼結ガラス漏
斗に移し、溶媒を吸引して除去し、支持体を３回メタノ
ール／アセトニトリル／ピリジン（１：１：１ v/v/v,
3×20ml) を用いて洗浄した。残りの溶媒を高真空下に
除去し、Ｎ−Ｆｍｏｃ−サルコシニル化ＬＣＡ−ＣＰＧ
をピリジン（v/v, 10ml)の10％ピペリジン溶液に0.5 時
間懸濁し、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。Ｎ−サルコシニ
ル化ＬＣＡ−ＣＰＧを濾去し、メタノール／アセトニト
リル／ピリジン（１：１：１ v/v/v, 3×20ml) を用い
て洗浄し、続いて高真空下に５時間乾燥させた。
【００６６】Ｂ．Ａ (0.5g) によって得られた生成物を
各３’−Ｏ−サクシニル化５’−Ｏ−ＤＭＴ−ｄＡbz、
−ｄＧibu 、−ｄＣbz、および−ｄＴと混合し、混合物
を高真空下に２時間乾燥し、その後、ＤＭＦ（２ml) 、
ピリジン（0.2ml ）およびＤＣＣ(50mg)を添加し、得ら
れた混合物を密閉したガラス瓶の中で、12時間室温で適
度に振った。各混合物からの固相支持体の懸濁液を、焼
結ガラスの漏斗にそれぞれ移し、メタノール／アセトニ
トリル／ピリジン（１：１：１ v/v/v, 3×20ml) を用
いて３回洗浄し、最後に、アセトニトリル（３×10ml)
を用いて洗浄した。乾燥窒素流を用いて、乾燥後、アシ
ル化剤（Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ、１ml, Appl
ied Biosystems, Inc., Cat. No.400785、および無水酢
酸／ルチジン／ＴＨＦ、１ml, Applied Biosystems, In
c., Cat. No.400607) で15分間処理した。メタノール／
アセトニトリル／ピリジン（１：１：１ v/v/v, 3 ×10
ml) とアセトニトリル（３×10ml) を用いて完全に洗浄
した後、得られた固相支持体を、高真空下に乾燥した。
トリチルアッセイによって決定された各ヌクレオシドを
用いた支持体の装填量は次のようであった。ＣＰＧ−サ
ルコシニル−ｄＡbz：42.7μモル／ｇ；ＣＰＧ−サルコ
シニル−ｄＧibu ：46.7μモル／ｇ；ＣＰＧ−サルコシ
ニル−ｄＣbz：31.6μモル／ｇ；およびＣＰＧ−サルコ
シニル−ｄＴ：35.0μモル／ｇ。
【００６７】実施例１５２’−デオキシアデニル−（３’，５’）−２’−デオ
キシアデノシンホスホロチオエート（Ｒp 異性体） Ａ．各端部にフィルターを確保したカラム（容量110 μ
l)に固体支持体に結合した１μモルのＮ6 −イソプロポ
キシアセチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシアデ
ノシン（ウズナンスキイら、Nucleic Acids Research,
17巻、4863〜4868頁(1989)) を含ませ、塩化メチレンに
溶解した２％ジクロロ酢酸５mlを１分間通過させ、次い
で支持体を15mlのアセトニトリルで洗浄し、高真空下に
乾燥させた。
【００６８】Ｂ．上記のように調製したカラムに、30μ
モルのＮ6-イソプロポキシアセチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ
−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−１，３，２−
オキサチアホスホラン−２−スルフィド（遅く溶離する
ジアステレオ異性体）および300μモルの１，８−ジア
ザビシクロ〔５．４．０〕−ウンデセ−７−エン（ＤＢ
Ｕ）を含む溶液 110μリットルを導入した。反応は20分
間18〜24℃で続けた。カラムを10mlのアセトニトリルで
洗浄し、次いで塩化メチレンに溶解した２％ジクロロ酢
酸５mlを通して５’−ヒドロキシル官能基を脱保護し
た。
【００６９】Ｃ．アセトニトリルで完全に洗浄した後、
固体支持体から二量体を引き離し、外環アミノ官能基を
脱保護するため、１mlの25％アンモニア溶液を１時間ゆ
っくりとカラムに通した。５〜20％のアセトニトリル−
水のグラディエント、0.１Ｍトリエチルアンモニウムビ
カーボネート（ＴＥＡＢ）、流速３ml／分を用いてＨＰ
ＬＣ（ＰＲＰ１ハミルトンカラム、30×７mm) によって
精製した。
【００７０】実施例１６（Ｒp Ｒp Ｒp Ｒp Ｒp Ｒp Ｒp Ｒp ）−オクタチミジ
ルホスホロチオイックアシッド ５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’−Ｏ−１，３，２−
オキサチアホスホランシンソン（遅く溶離するジアステ
レオ異性体）を７カップリングサイクルで用いたことを
除いて、実施例１４で述べたように合成した。生成物を
洗浄し、引き離し、脱保護し、実施例１４に述べたよう
に精製した。
【００７１】ホスホロチオエートのＲP 異性体を加水分
解することで知られているヘビ毒ホスホジエステラーゼ
（ｓｖＰＤＥ）（クロタルス・アダマンテウス）によっ
て、およびホスホロチオエートのＳP 異性体を加水分解
することで知られているヌクレアーゼＰ１（ペニシリウ
ム・シトリヌム）によって検定した。バッファＩをｓｖ
ＰＤＥのために調製した：100mM Tris HCl pH 8.5 1mM
MgCl2 。バッファIIをヌクレアーゼＰ１のために調製し
た：100mM Tris HCl pH 7.2 1mM ZnCl2 。ｓｖＰＤＥア
ッセイに対して、１光学濃度単位のオクタチミジルホス
ホロチオ酸生成物を 500μリットルのバッファＩに溶解
した20μｇのｓｖＤＰＥに添加し、24時間37℃にてイン
キュベートした。実施例１４に述べたようなＨＰＬＣ分
析は、生成物がチミジン−５’−ホスホロチオエートに
完全に加水分解されたことを示した。ヌクレアーゼＰ１
アッセイに対して、１光学濃度単位のオクタチミジルホ
スホロチオ酸生成物を 500μリットルのバッファIIに溶
解した10μg ｓｖＰＤＥに添加し、37℃にて24時間イン
キュベートした。実施例１４に述べたようなＨＰＬＣ分
析は生成物が酵素による分解に完全に耐えたことを示し
た。
【００７２】実施例１７（Ｓp Ｓp Ｓp Ｓp Ｓp Ｓp Ｓp Ｓp ）−オクタチミジ
ルホスホロチオイックアシッド 速く溶離する５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’−Ｏ−
１，３，２−オキサチアホスホラン−２−スルフィドの
（Ｓp ）ジアステレオ異性体をシンソンとして使用した
ことを除いて、実施例１５と同様に完全にＳp キラルな
オクタチミジルホスホロチオ酸を合成した。生成物を実
施例１５と同様にｓｖＰＤＥとヌクレアーゼＰ１に対し
て検定し、ｓｖＰＤＥに完全に耐えられ、ヌクレアーゼ
Ｐ１によって完全に加水分解されることを見出した。
【００７３】実施例１８ジチミジル−（３’，５’）−ホスホロジチオエート Ａ．溶液中 ５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’−Ｏ−〔２−チオノ
−１，３，２−ジチアホスホラン〕（0.3 ミリモル) と
３’−Ｏ−アセチルチミジン（0.3 ミリモル)の混合物
を３時間真空下に乾燥し、次いで３mlの無水CH3CN に溶
解した。この溶液に0.33ミリモルのＤＢＵを添加し、こ
の混合物を、かきまぜながら、３時間室温にて保持し
た。31P ＮＭＲ試験は70％の３’−Ｏ−５’−Ｏ−保護
ジチミジル（３’，５’）−ホスホロジチオエート（δ
116.7ppm) 、２％の未反応シンソンおよび28％の副生成
物（δ71.8およびδ72.2ppm)の存在を示した。溶媒を蒸
発して残った固体を３mlの80％CH3COOH に溶解した。２
時間後、減圧下に酢酸を除去し、残渣を５mlの25％NH4O
H に再溶解した。この溶液を55℃で15時間インキュベー
トした。濃縮し、５mlの水に溶解した後、固体粒子を濾
去し、濾液をＤＥＡＥ−セファデックスＡ−25で充填し
たカラムに入れた。ＴＥＡＢを用いてグラディエント0.
05〜１Ｍで生成物を溶離した。ＵＶ吸収画分を集めて濃
縮した。31P ＮＭＲ（D2O)は生成物の存在を示した。δ
113.8ppm、純度＞95％、ＵＶ吸収プロフィルからの収
率、46.6％。さらにＦＡＢ−ＭＳによって分析し、生成
物をジチミジル−（３’，５’）−ホスホロジチオエー
トとして確認した。
【００７４】Ｂ．固体支持体上 カラム（Applied Biosystems, Inc.）内の１μモルのＣ
ＰＧ−Ｔを脱トリチル化して、140 μリットルのCH3CN
で希釈した（真空下に乾燥した）５’−Ｏ−ＤＭＴ−チ
ミジン−３’−Ｏ−〔２−チオノ−１，３，２−ジチア
ホスホラン〕10μモルを15μリットルのCH3CN 中10μモ
ルのＤＢＵと共にカラムに入れた。10分後（時々振りな
がら）、カラムをCH3CN で洗浄し、脱トリチル化し、脱
保護し、標準法を用いて切り離した。ＨＰＬＣ分析（Ｏ
ＤＳハイパーシル、リニア−グラディエント 0.1M ＴＥ
ＡＢ中 CH3CN 5−＞20％、20分、R.T. 12.3 分) は８％
チミジンで汚染されたジチミジルホスホロジチオ酸から
成る生成物を示した。
【００７５】実施例１９ジチミジル−（３’，５’）−ホスホロセレノエート Ａ．溶液中 0.5ml のCH3CN に溶解した実施例１３の生成物 0.1ミリ
モルを、 0.1ミリモルの３’−Ｏ−メトキシアセチルチ
ミジンと0.15ミリモルのＤＢＵの混合物に添加した。10
分後、31P ＮＭＲ試験は80％の３’，５’−保護ジチミ
ジル−（３’，５’）−ホスホロセレノエート（δ49.7
およびδ49.5ppm)と20％の未同定の副生成物（δ59.7お
よびδ59.6ppm)の存在を示した。
【００７６】Ｂ．固体支持体上 カラム（Applied Biosystems, Inc.）内の１μモルのＣ
ＰＧ−Ｔを脱トリチル化して、50μリットルのCH3CN で
希釈した10μモルの５’−Ｏ−ＤＭＴ−チミジン−３’
−Ｏ−〔２−セレノ−１，３，２−オキサチアホスホラ
ン〕を100 μリットルのピリジン中20μモルのＤＢＵと
共にカラムに入れた。10分後、カラムをアセトニトリル
で洗浄し、脱トリチル化し生成物を支持体から切り離し
た。ＨＰＬＣ分析（ＯＤＳハイパーシル、リニア−グラ
ディエント 0.1M ＴＥＡＢ中 CH3CN 5−＞20％、20分以
上、8.87および9.54の R.T. 収率：85％（ＨＰＬＣを介
して) 。
【００７７】実施例２０自動化固相合成の条件下の立体特異性の制御 ＤＮＡ合成器を自動化したアプライド・バイオシステム
ズ・インコーポレイテッド（ホスター市、ＣＡ，ＵＳ
Ａ）のモデル380Bを使用し、同社のカラム（１μモルの
スケール）を用いた。２−シアノエチルホスホルアミジ
ド方法によってオリゴヌクレオチドの合成のためにルー
チン的に使用される同社のプログラムを次表に示したプ
ロトコルに従って変更した。
【００７８】 １合成サイクルのための化学工程 工程 試薬または溶媒 目的 時間（分 ） １ a) CH2Cl2中ジクロロ酢酸（98：２ v/v) ２ml 脱トリチル化 1.5 b) アセトニトリル ５ml 洗浄 2 ２ a) アセトニトリル中活性化ヌクレオチド*) カップリング 10 b) アセトニトリル ５ml 洗浄 2 ３ a) ＴＨＦ中無水酢酸／ルチジン （80：10：10 v/v/v) １ml キャッピング 1 ＴＨＦ中Ｎ−メチルイミダゾール （84：16 v/v) １ml b) アセトニトリル ５ml 洗浄 1 ＊１μモルの合成スケールに対してピリジン（150 μリ
ットル) 中２M ＤＢＵ、およびアセトニトリル中0.1M
5’−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド−３’−Ｏ−
〔２−チオノ−１，３，２−オキサチアホスホラン〕
（実施例１０のもの）（50μリットル) を用いた。
【００７９】ＤＮＡ合成器の貯蔵器１〜４をアセトニト
リル（0.1M) 中純粋ジアステレオ異性体（実施例１０）
の溶液で充填し、貯蔵器９（通常は１Ｈ−テトラゾール
活性化物質を含む）をピリジン中２ＭのＤＢＵで充填し
た。各場合において、合成の完了にて、酸性脱トリチル
化をアンモニア分解と塩基脱保護によって続けた。生成
物（二量体）は、アセトニトリルのリニアーグラディエ
ントで溶離するＯＤＳハイパーシル（５μｍ）カラム
（30cm×4.6mm)を用いる逆相ＨＰＬＣによって分析と精
製を行った：5-＞20％ CH3CN／0.1 モルＴＥＡＢ；0.75
％／分；流速 1.5ml／分。結果を下表にまとめる。ＨＰ
ＬＣプロフィルは、ステックら（NucleicAcids Researc
h, 19巻、5883〜5888頁(1991)) において与えられる。
【００８０】 ジヌクレオチド−（３’，５’）−ホスホロチオエートの生成の立体特異性 シンソン(a) ジアステレオマー純度(b) 生成物 ジアステレオマー純度(c) Ｔ 速い 100 ％ 〔ＳP 〕-d(TT) 99.0 ％ Ｔ 遅い 100 ％ 〔ＲP 〕-d(TT) 100.0 ％ Ａbz 速い 100 ％ 〔ＳP 〕-d(AA) 99.4 ％ Ａbz 遅い 100 ％ 〔ＲP 〕-d(AA) 99.5 ％ Ｃbz 速い 100 ％ 〔ＳP 〕-d(CC) 99.3 ％ Ｃbz 速い 95 ％(d) 〔ＳP 〕-d(CC) 95.0 ％ Ｃbz 遅い 100 ％ 〔ＲP 〕-d(CC) 99.5 ％ Ｃbz 遅い 95 ％(d) 〔ＲP 〕-d(CC) 95.0 ％ Ｇibu 速い 100 ％ 〔ＳP 〕-d(GG) 99.3 ％ Ｇibu 遅い 100 ％ 〔ＲP 〕-d(GG) 98.0 ％ (a) 実施例１０と同じ名称。 (b) ジアステレオ異性体シンソン全部は、ステックら
（J. Amer. Chem. Soc.,Vol.106, 6077〜6079頁 (198
4))によって調製された真正試料と一致させてＨＰＬＣ
によって同定した。 (c) ＨＰＬＣによって。 (d) 分離されたジアステレオ異性体を混合して調製。
【００８１】上記データから見られるように、遅く溶離
するジアステレオ異性体は常にＲp配置でジヌクレオチ
ド生成物を与えるが、速く溶離するジアステレオ異性体
は常にＳP 配置でジヌクレオチド生成物を与える。 実施例２１サルコシニルリンカーを介して固相支持体に結合したヌ
クレオシドを用いる自動化固相合成の条件下の立体特異
性のコントロール 製造業者のカラムの代わりに、実施例１４で述べたよう
にサルコシニルリンカーを介して固相支持体に結合した
５’−ＤＭＴ−ヌクレオシドを用いて充填したカラムを
供することを除いて実施例２０の方法に従った。
【００８２】実施例２２（ＲP ＲP ＲP ＲP ＲP ）−ペンタ−（２’−Ｏ−デオ
キシシチジンホスホロチオエート） 実施例２０に述べたようにＣＰＧ−サルコシニル−ｄＣ
bz固相支持体に用いる実施例１９に記載したような自動
化ＤＮＡ合成器を用いて、（ＲP ＲP ＲP ＲPＲP ）−
ペンタ−（２’−Ｏ−デオキシシチジンホスホロチオエ
ート）を合成した。アセトニトリル（1.2ml)に溶解した
実施例１０(100mg) の遅く溶離するシンソン溶液を用い
た。トリチル化および脱トリチル化生成物を２工程逆相
ＨＰＬＣで単離した。ＨＰＬＣ（実施例１９と同じカラ
ム）によるトリチル化および脱トリチル生成物両方の分
析は、シングルピークを与えた（流速 1.5ml／分）。ト
リチル化化合物について：r.t. 20.40分（５〜30％ CH3
CN／0.1MＴＥＡＢ、ｔ＝20分、べき指数0.25) 。脱トリ
チル化合物生成物について：r.t. 11.80、５〜20％CH3C
N ／0.1MＴＥＡＢ、0.75％／分) 。調製収率：14％。上
記のような酵素分析は生成物が全−ＲP 形態であること
を示した。
【００８３】実施例２３（ＳP ＳP ＳP ＳP ＳP ）−ペンタ−（２’−Ｏ−デオ
キシシチジンホスホロチオエート） 早く溶離するシンソンを使用したことを除いて、実施例
２１に述べたように、（ＳP ＳP ＳP ＳP ＳP ）−ペン
タ−（２’−Ｏ−デオキシシチジンホスホロチオエー
ト）を調製した。実施例２１と同じ分析を用いてトリチ
ル化合物は20.7分のr.t.であり、脱トリチル生成物は 1
2.00分のr.t.であった。調製収率：15％。上述のような
酵素分析は生成物が全−ＳP 形態であることを示した。
【００８４】実施例２４Ｐ−キラル抗過敏化合物の合成 28量体の抗過敏オリゴヌクレオチドホスホロチオエー
ト、５’−ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴ
ＴＣＣＴＧＣＣＡの全−Ｒp および全−Ｓp 形態を、そ
れぞれ実施例１０の遅くおよび早く溶離するシンソンを
用いる実施例１９および２０によって記載されたような
自動化ＤＮＡ合成器を用いて合成した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドルツエイ グライコウスキイ ポーランド国 ロッツ90−363，シーン キイウイツア ストリート112，センタ ー オブ モレキュラー アンド マク ロモレキュラー スタデイズ，ポリッシ ュ アカデミイ オブ サイエンシーズ (72)発明者 ボグダン ウツナンスキイ ポーランド国 ロッツ90−363，シーン キイウイツア ストリート112，センタ ー オブ モレキュラー アンド マク ロモレキュラー スタデイズ，ポリッシ ュ アカデミイ オブ サイエンシーズ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/04 C07F 9/6564 C07H 19/10 C07H 19/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 予定された長さのポリマーを合成する方
    法において、このポリマーがモノマーとリン結合の配列
    からなり、リン結合がＲp キラル、Ｓp キラル、または
    アキラルであり、ポリマーが次式で表され、 【化１】 （式中、Ｑは両隣の酸素原子をひとまとめに考えるとき
    はヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、 Ｒ1 は水素またはヒドロキシル保護基であり； ｎは１〜200 の範囲であり、 ＸはＳ、Ｏ、またはＳｅまたは＝ＮＲ2(式中Ｒ2 は１〜
    ６の炭素原子をもつアルキル、または６〜12の炭素原子
    をもつアリール、アルキル置換アリール、またはアルケ
    ニル置換アリール）の置換イミノであり；およびＹは
    Ｓ、ＯまたはＳｅである）、 本方法が次の工程、（ａ）固相支持体に結合し、保護さ
    れたヒドロキシルをもつ第一のモノマーを用意し； （ｂ）遊離ヒドロキシルを形成するように保護されたヒ
    ドロキシルを脱保護し； （ｃ）次式によって定義された群から選ばれるシンソン
    （synthon)を遊離ヒドロキシルと反応し； 【化２】 （式中、Ｑ、Ｒ1、ＸおよびＹは上記と同じであり、Ｚ
    はＳまたはＳｅであり、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6 は
    別々に水素または１〜４の炭素原子をもつアルキルであ
    る）；そして （ｄ）予定された長さのポリマーが得られるまで（ｂ）
    と（ｃ）の工程を繰り返す、 から成る予定長のポリマーの合成方法。
  2. 【請求項２】 前記反応工程が触媒塩基の存在で反応す
    ることを含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 さらに前記（ｃ）の工程の後に未反応の
    遊離ヒドロキシル基をキャッピングする工程を含む請求
    項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 ｎが12〜60の範囲である、 請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ポリマーがオリゴヌクレオチドであ
    り、前記シンソンが次式で定義された群から選ばれる請
    求項４記載の方法。 【化３】 （式中のＢはプリンまたはピリミジンであり；Ｄ’は水
    素、ヒドロキシルまたはＯＲ" （Ｒ" は３’−ヒドロキ
    シル保護基）であり；Ｄは水素、ハロゲン、ヒドロキシ
    ル、またはＯＲ’（Ｒ’は１〜３の炭素原子をもつアル
    キル、または２'−ヒドロキシル保護基）であり、Ｒ 3 、
    Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 は前記と同じである）。
  6. 【請求項６】 前記シンソンが次式によって定義される
    群から選ばれる請求項５記載の方法。 【化４】
  7. 【請求項７】 Ｄが水素である請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＸがＯまたはＳであり、ＹがＯまたはＳ
    である請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 ＸがＯまたはＳであり、ＹがＯまたはＳ
    であり、ＸまたはＹの少なくとも１がＯであり、Ｘまた
    はＹの少なくとも１がＳである請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ｎが15〜30の範囲にある請求項９記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】 前記触媒塩基が１，８−ジアザビシク
    ロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンである請求項１０
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ポリマーの前記リン結合の１また
    はそれ以上が、各々Ｒp またはＳp キラルであり、Ｒp
    またはＳp キラルリン結合の１またはそれ以上の位置と
    キラリティーが予定されている請求項２記載の方法。
  13. 【請求項１３】 さらに前記（ｃ）の工程の後に未反応
    遊離ヒドロキシル基をキャッピングする工程を含む請求
    項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ｎが12〜60の範囲である、 請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ポリマーがオリゴヌクレオチドで
    あり、前記シンソンが次式で定義された群から選ばれる
    請求項１４記載の方法。 【化５】 （式中、Ｂはプリンまたはピリミジンであり、Ｄ’は水
    素、ヒドロキシルまたはＯＲ" （Ｒ" は３’−ヒドロキ
    シル保護基）であり、Ｄは水素、ハロゲン、ヒドロキシ
    ル、またはＯＲ'(Ｒ' は１〜３の炭素原子をもつアルキ
    ルまたは２’−ヒドロキシル保護基）であり、Ｒ 3 、
    Ｒ 4 、Ｒ 5 、およびＲ 6 は前記と同じである）。
  16. 【請求項１６】 前記シンソンが次式によって定義され
    た群から選ばれる請求項１５記載の方法。 【化６】
  17. 【請求項１７】 Ｄが水素である請求項１６記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 ＸがＯまたはＳであり、ＹがＯまたは
    Ｓである請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＸがＯまたはＳであり、ＹがＯまたは
    Ｓであり、ＸまたはＹの少なくとも１がＯであり、Ｘま
    たはＹの少なくとも１がＳである請求項１８記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 ｎが15〜30の範囲である請求項１９記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記触媒塩基が１，８−ジアザビシク
    ロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンである請求項２０
    記載の方法。
  22. 【請求項２２】 次式によって定義された群から選ばれ
    る化合物。 【化７】 （式中、Ｑは両隣の酸素とひとまとめに考えるときは、
    ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体であり、 Ｒ1は水素またはヒドロキシル保護基であり； ＸはＳ、Ｏ、またはＳｅ、または＝ＮＲ2(式中、Ｒ2は
    １〜６の炭素原子をもつアルキル、または６〜12の炭素
    原子をもつアリール、アルキル置換アリール、またはア
    ルケニル置換アリール) の置換イミノであり； ＹはＳ、Ｏ、またはＳｅ；ＺはＳまたはＳｅ；およびＲ
    3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6に別々に水素または１〜４の炭素
    原子をもつアルキルである）。
  23. 【請求項２３】 予定された長さのＰ−キラルオリゴヌ
    クレオチドホスホロチオエートを合成する方法におい
    て、Ｐ−キラルオリゴヌクレオチドがヌクレオシドまた
    はヌクレオシド類似体およびホスホロチオエートまたは
    ホスホジエステル結合の配列からなり、ホスホロチオエ
    ート結合がＲｐキラルまたはＳｐキラルであり、本方法
    が次の工程； （ａ）固相支持体に結合し、保護されたヒドロキシルを
    もつ第１のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を用
    意し、 （ｂ）遊離ヒドロキシルを形成するように保護されたヒ
    ドロキシルを脱保護し； （ｃ）次式によって定義された群から選ばれるシンソン
    を遊離ヒドロキシルと反応し； 【化１５】 （式中、Ｂはプリンまたはピリミジンであり；Ｄ’は水
    素、ヒドロキシルまたはＯＲ" （Ｒ" は３’−ヒドロキ
    シル保護基）であり；Ｄは水素、ハロゲン、ヒドロキシ
    ル、またはＯＲ’（Ｒ’は１〜３の炭素原子をもつアル
    キル、または２'−ヒドロキシル保護基）であり；Ｘは
    Ｓ、Ｏ、またはＳｅまたは＝ＮＲ2(式中Ｒ2 は１〜６の
    炭素原子をもつアルキル、または６〜12の炭素原子をも
    つアリール、アルキル置換アリール、またはアルケニル
    置換アリール）の置換イミノであり；ＹはＳ、Ｏまたは
    Ｓｅであり、；ＺはＳまたはＳｅであり、Ｒ1はヒドロ
    キシル保護基；およびＲ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は別々に
    水素または１〜４の炭素原子をもつアルキルであ
    る。）； そして （ｄ）予定された長さのＰ−キラルオリゴヌクレオチド
    ホスホロチオエートが得られるまで（ｂ）と（ｃ）の工
    程を繰り返す、 からなる、予定長のＰ−キラルオリゴヌクレオチドホス
    ホロチオエートの合成方法。
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