JP2001514508A - Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を同定するための新規なスクリーニング法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を同定するための新規なスクリーニング法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、インターフェロンにより誘導されるウイルス感染に対する細胞防衛機構を無効にするウイルスタンパク質を選択的に妨害する抗ウイルス薬を同定するための新規方法に関する。インターフェロン感受性決定領域を含むウイルスタンパク質と、インターフェロン誘導型のPKRプロテインキナーゼとの相互作用を選択的に妨害する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を 同定するための新規なスクリーニング法
本出願は、1997年3月5日出願の米国仮出願番号第60/038,596号の恩恵を受ける
ものである。
1. 序
本発明は、インターフェロン(IFN)により誘導されるウイルス感染に対する細
胞防衛機構を無効にするウイルスタンパク質を選択的に妨害する抗ウイルス薬を
同定するための新規な方法に関する。特に、本発明は、インターフェロン感受性
決定領域(interferon sensitivity determining region:ISDR)を含むウイルスタ
ンパク質とIFN誘導型のPKRプロテインキナーゼとの相互作用を選択的に抑制する
薬剤を同定するスクリーニングアッセイに関する。本発明は、さらに特定すると
、ISDRを含むＣ型肝炎ウイルス(HCV)の非構造5Aタンパク質(NS5A)と、IFN誘導型
PKRプロテインキナーゼと、の相互作用を選択的に抑制する薬剤を同定するため
のスクリーニングアッセイに関する。ウイルスISDRとIFN誘導型PKRプロテインキ
ナーゼとの相互作用はウイルス感染を撲滅するためのIFNにより誘導される細胞
防衛機構を無効にさせる。それゆえに、本発明のアッセイにより同定された薬剤
は抗ウイルス薬としての有用性を有する。
2. 背景
2.1 ウイルス感染を治療するIFN療法
インターフェロンは免疫刺激、腫瘍抑制、細胞増殖抑制を含めて多岐にわたる
作用を有する細胞外シグナル伝達タンパク質である。インターフェロンはMxタン
パク質、2',5'-オリゴアデニル酸シンテターゼ、RNアーゼをはじめとする多数の
遺伝子産物の宿主細胞産生を引き出す(Senら，1992，J．Biol．Chem．267:5017-
5020;Senら，1993，Adv．Virus．Res．42:57に概説)。さらに、cAMP非依存性セ
リン／トレオニンキナーゼであるPKRも30を越えるIFN誘導型の遺伝子産物の
一つである(Meursら，1990，Cell 62:379-590)。これらのタンパク質はウイルス
感染に対する防衛作用を有し、したがってウイルス感染の治療におけるIFN療法
の有益な効果に貢献することが見いだされている。
IFN誘導型の遺伝子産物がウイルス感染に対する防衛を与える作用機構は多数
存在している。例を挙げると、IFN誘導型の二本鎖RNA依存性酵素である2',5'-オ
リゴアデニル酸シンテターゼはRNアーゼを活性化させて細胞およびウイルスのRN
Aを開裂し、ウイルスの複製、例えばピコルナウイルスの複製を不活性化する(Ku
marら，1988，J．Virol．62:3175-3181)。IFN誘導型の二本鎖RNA依存性プロテイ
ンキナーゼは、翻訳開始因子eIF-2αのαサブユニットをリン酸化して失活させ
ることにより、ウイルスおよび細胞のタンパク質合成を抑制する。IFNはまた、
ウイルスの生活環のさまざまな段階でウイルス抑制効果を有する。IFNはＢ型肝
炎ウイルス粒子のアンコーティング(uncoating)を阻止することで、ウイルス複
製を抑制する。IFNは水庖性口炎ウイルスが細胞の中に入り込むのを妨げる(Whit
aker-Dowlingら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．80:1083-1086)。IFNはまた、
センダイウイルスなどのウイルスが原因となる細胞融合を抑制する(Tomitaら，1
981，J．Gen．Virol．55:289-295)。
IFNにより誘導される細胞防衛機構の有害作用に対抗するために、多くの真核
生物ウイルスはIFN誘導型のタンパク質の活性をブロックする作用機構を進化さ
せてきた。多数のウイルスはIFNにより誘導される宿主細胞の翻訳シャットアウ
トを無効にするRNA、例えばアデノウイルスが産生するVAI RNA分子、ヒト免疫不
全ウイルス(HIV)のTAR領域、およびエプスタイン-バーウイルスが産生するEBER-
1 RNA分子を産生する(Katzら，1987，Embo．J．6:689-697;McMillanら，1995，V
irology 213:413-424;Carrollら，1993;Beattieら，1995，Virology 210:254-26
3;Beattieら，1991，Virology 183:419-422)。多くのウイルス、例えばワクシニ
アウイルスのK3Lタンパク質はIFNにより誘導されるPKRプロテインキナーゼに結
合して、それを阻害する(Gale Jr．ら，1996，Mol．Cell．Biol．16:4172-4181)
。インフルエンザウイルスの新参の細胞性因子、例えばP58はPKRプロテインキナ
ーゼに結合して、それをブロックする(Leeら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．8
7:6208-6212;Leeら，1994，Mol．Cell．Biol．14:
2331-2342)。
2.2 Ｃ型肝炎ウイルス
Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)による感染は世界的に重要な臨床上の問題となってい
る。米国だけでも、概算で400万人が慢性的にHCVに感染している。非Ａ非Ｂ型肝
炎の主な病因であるHCVは、主として感染した血液や血液製剤の輸血により伝播
される(Cuthbertら，1994，Clin．Microbiol．Rev．7:505-532;Mansellら，1995
，Semin．Liver Dis．15:15-32)。1990年の中頃に抗HCVスクリーニングが導入さ
れる前は、HCVが米国の輸血後肝炎の症例の80〜90%を占めていた。現在では、注
射薬の使用がおそらくHCV感染の最も普通の危険要因であり、この集団のおよそ8
0%がHCVに対して血清陽性である。高比率のHCV感染は、血液や血液製剤に頻繁に
さらされているグループである出血性障害または慢性腎不全の患者にも見られる
。
HCVに急性感染すると、永続的なウイルスの複製が生じ、約90%が慢性肝炎へと
移行する。多くの患者の場合、慢性HCV感染は徐々に肝臓を損傷させて、肝硬変
を発症させる。攻撃的な感染にかかった患者は2年ほどで肝硬変を発症しうるが
、10〜20年の期間がより典型的である。慢性HCV患者の30〜50%は肝臓の損傷が進
行して肝細胞癌を発症する可能性がある。一般的に、肝細胞癌は後期に発症し、
発症までに30年以上かかる(Bisceglieら，1995，Semin．Liver Dis．15:64-69)
。病気の進行を決定する際にウイルスまたは宿主因子が相対的にどのようにかか
わっているかは不明である。
HCVは約9.5kbのポジティブ-センス一本鎖RNAゲノムを含むエンベロープウイル
スである。そのゲノム構成およびビリオン特性に基づいて、HCVはペスチウイル
ス属やフラビウイルス属を含むフラビウイルス科の別個の属として分類されてい
る(Alter，1995，Semin．Liver Dis．15:5-14)。このウイルスゲノムは非常に長
い5'非翻訳領域(UTR)、約3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする長
いオープンリーディングフレーム、および短い3'UTRから構成される。5'UTRはHC
Vゲノムの最も高度に保存された部分であり、ポリタンパク質翻訳の開始および
制御にとって重要である。HCVゲノムの翻訳は内部リボソームエント
リー(internal ribosome entry)として知られたキャップ非依存性機構により開
始される。この機構は内部リボソームエントリー部位(IRES)として知られたRNA
配列へのリボソームの結合を必要とする。最近、RNAシュードノット(pseudoknot
)構造がHCV IRESの必須構造エレメントであると決定された。HCV複製を可能にす
る信頼できる組織培養系はまだ開発されていないが、ウイルスタンパク質は組換
えワクシニアウイルス構築物および転写／翻訳系の使用を含めた様々な技法によ
り同定されている。ポリタンパク質前駆体は宿主とウイルスの両プロテアーゼに
より開裂されて、成熟ウイルス構造タンパク質と非構造タンパク質をもたらす。
ウイルス構造タンパク質には、ヌクレオキャプシドコアタンパク質(C)および2種
のエンベロープ糖タンパク質E1およびE2が含まれる。HCVは2種のプロテイナーゼ
、すなわち、NS2-NS3領域によりコードされる亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ
およびNS3領域においてコードされるセリンプロテイナーゼをもコードしている
。これらのプロテイナーゼ類は成熟ペプチドへの前駆体ポリタンパク質の特定領
域の開裂にとって必要である。非構造タンパク質5のカルボキシル末端側の半分
であるNS5BはRNA依存性RNAポリメラーゼを含んでいる。残りの非構造タンパク質
NS4AおよびNS4Bの機能、並びにNS5A(非構造タンパク質5のアミノ末端側の半分)
の機能は不明のままである。
HCV複製および病因の理解は、その進行具合が細胞培養系の欠如により非常に
阻まれている。その結果、HCV感染に対する有効な抗ウイルス戦略が今後開発さ
れねばならない。現在、慢性HCV感染のための唯一の治療法はαインターフェロ
ンによる治療である。しかし、患者の50%未満が治療後HCVの根絶により回復して
いるにすぎない(Hoofnagleら，1994;Linoら，1994，Intervirology 37:87-100)
。上述したように、HCV遺伝子型とインターフェロン療法に対する応答の間には
相関関係が存在する(Enomotoら，1996，N．Engl．J．Med．334:77-81;Enomotoら
，1995，J．Clin．Invest．96:224-230)。例えば、HCV-1bに感染した患者の応答
率は40%より低い。始原型である米国遺伝子型HCV-1aに感染した患者の場合にも
同様に低い応答率が報告されている(Hoofnagleら，Linoら，1994，Intervirolog
y 37:87-100)。これに対して、HCV遺伝子型-2に感染した患者の応答率はほぼ80%
である(Friedら，1995，Semin．Liver Dis．15:82-91)。
遺伝子型1bのNS5Aタンパク質の特定の領域のアミノ酸配列がインターフェロン
に対する感受性と関係があることが判明した(Enomotoら，1996;Enomotoら，1995
)。インターフェロン感受性決定領域(ISDR)と名づけられたこの領域はNS5Aのア
ミノ酸残基237〜276[ポリタンパク質のアミノ酸2209〜2248;完全なゲノム配列が
決定されているHCV-1b株であるHCV-Jのナンバリングに基づく]の範囲にある(Eno
motoら，1995)。インターフェロン耐性株(すなわち、インターフェロン療法前に
存在しかつインターフェロン療法後6カ月存在する準種(quasispecies))は始原型
HCV-1b株のISDR配列と同じものを保有する(Enomotoら，1996)。対照的に、イン
ターフェロン感受性株（インターフェロン療法前に存在していたが、治療後6カ
月存在しないHCV準種）はISDR内に多数のアミノ酸置換が存在する。この研究に
おいて、ISDR内に4〜11のアミノ酸変化を含むHCV分離株に感染した患者はインタ
ーフェロン療法に対して完全な応答を示した。これに対して、始原型ISDR配列を
含むHCV分離株に感染した患者（およびISDR内に1〜3のアミノ酸変化を含むHCV分
離株に感染した患者の87%）においては、治療に対する応答が全く認められなか
った。HCV-1bのISDRがインターフェロン応答に影響を及ぼす作用機構は知られて
いない。
3. 発明の概要
本発明は、インターフェロン(IFN)により誘導されるウイルス感染に対する細
胞防衛機構を無効にするウイルスタンパク質を選択的に不活性化する抗ウイルス
薬を同定するための新規な方法に関する。特に、本発明は、ISDRを発現するウイ
ルスタンパク質とIFN誘導型のPKRプロテインキナーゼとの相互作用を選択的に抑
制する薬剤を同定するスクリーニングアッセイに関する。本発明は、さらに特定
すると、ISDRを含むHCV非構造5Aタンパク質(NS5A)とIFN誘導型PKRプロテインキ
ナーゼとの相互作用を選択的に抑制する薬剤を同定するためのスクリーニングア
ッセイに関する。ある実施形態において、本発明は、PKRの二量体化を妨害する
ウイルスタンパク質を選択的に抑制する薬剤を同定するためのスクリーニングア
ッセイに関する。本発明はさらに、PKRプロテインキナーゼのNS5A抑制を無効に
させるレベルへとIFN発現を誘導する新規な外因性または内因性薬剤を同定
するためのスクリーニングアッセイに関する。ISDRを含むウイルスタンパク質と
IFN誘導型PKRプロテインキナーゼとの相互作用はウイルス感染を撲滅するための
IFNにより誘導される細胞防衛機構を無効にさせる。それゆえに、この相互作用
を妨げることが確認された薬剤は抗ウイルス薬としての有用性を有するだろう。
本発明は、一部には、(1)HCVタンパク質NS5AがIFN誘導型PKRプロテインキナー
ゼと直接相互作用して、それを阻害し、かつ(2)NS5AがPKRプロテインキナーゼと
相互作用して阻害するのにISDRが必要である、という本出願人の知見に基づくも
のである。
本発明はさらに、ここに記載したスクリーニングアッセイにより同定された新
規薬剤を包含する。本発明は、介入標的としてISDR含有タンパク質を用いてウイ
ルス感染を治療するための方法および医薬組成物に関する。本発明は、さらに特
定すると、NS5AおよびそれとIFN誘導型PKRプロテインキナーゼとの相互作用をタ
ーゲッティングすることによりHCV感染を治療するための方法および医薬組成物
に関する。
この種の薬剤は現在使用されている薬剤よりも有効であるだろう。というのは
、それらが細胞プロセスを妨げるのではなく、むしろウイルス感染に対する細胞
防衛機構のウイルスによる阻害をブロックするという点で有利であるからである
。これらの薬剤は宿主相同性をもたないウイルスタンパク質をターゲッティング
するので副作用が最小限ですみ、それゆえに宿主細胞には有害とならないだろう
。かくして、それらの最小限の副作用はそれらを比較的高用量で使用することを
可能にする。
本発明はまた、本発明により同定された抗ウイルス薬を、ウイルス複製を抑制
することが知られた他の抗ウイルス薬との併用療法で使用することに関する。本
発明のスクリーニングアッセイにより同定された薬剤はまた、ウイルスのIFN耐
性を低減させるのに有用であり、それゆえにHCV感染を脅かす現在のIFN療法の効
力を増強させるのに有用であろう。
3.1 定義
本明細書中で用いる「ISDR」または「インターフェロン感受性決定領域」とい
う用語は、図1Aに示したアミノ酸配列を有するタンパク質のドメイン、または前
記配列の任意の誘導体、または前記配列を有する断片もしくはペプチドであって
、IFN耐性を賦与する活性またはIFN誘導型PKRプロテインキナーゼと結合する活
性を有するものを意味する。
本明細書中で用いる「PKR」または「IFN誘導型PKRプロテインキナーゼ」とい
う用語は、p68キナーゼ、P1、DAI、dsIまたはelF-1キナーゼとしても知られてい
る、インターフェロンにより活性化される宿主細胞プロテインキナーゼ、および
そのPKR誘導体、またはPKRに対応するアミノ酸配列を有する断片もしくはペプチ
ドを意味する。
本明細書中で用いる「スクリーニング」または「スクリーニングする」とは、
大多数の潜在的に有用な薬剤が本発明方法において処理されるプロセスのことで
ある。
本明細書中で用いる「ターゲッティングする」とは、遺伝子発現、酵素活性ま
たは他の細胞因子もしくはウイルス因子との相互作用を抑制し、ブロックし、あ
るいは阻害することを意味する。
本明細書中で用いる「HCV感染を治療または予防する」とは、HCV伝播を阻止す
ること、またはHCVがその宿主内でそれ自体を確立するのを妨げること、およびH
CV感染が原因となる疾病の症状を改善または軽減することを意味する。ウイルス
負荷量の減少または死亡率および／または罹患率の低下が見られる場合、この処
置は治療とみなされる。
本明細書中で用いる「ウイルス感染を治療または予防する」とは、ウイルス伝
播を阻止すること、またはウイルスがその宿主内で自らを確立するのを妨げるこ
と、およびウイルス感染が原因となる疾病の症状を改善または軽減することを意
味する。ウイルス負荷量の減少または死亡率および／または罹患率の低下が見ら
れる場合、この処置は治療とみなされる。
本明細書中で用いる「製薬上許容される担体」とは、活性成分の生物学的活性
の有効性を害さず、化学的に不活性であり、投与される患者に毒性でないキャリ
アー媒質をさす。
「治療薬」という用語は、治療用の分子化合物をいい、好ましくはウイルス感
染またはそれが原因で起こる疾病を治療するのに役立つ抗ウイルス薬をさす。
4. 図面の簡単な説明
図1. (A)上のパネル、IFN耐性HCV-J株由来のNS5Aの始原型ISDRと、本研究で
用いたHCV-1aおよび-1b株由来のNS5Aの対応領域とのアミノ酸配列比較。下のパ
ネル、我々のNS5A構築物中に含まれるHCV-1aおよび-1b株由来の447アミノ酸から
なるタンパク質を表すHCV NS5Aの構成図。ISDRは黒で示してあり、HCV-1a由来の
ISDR構築物から欠失されている。NS5A内のアミノ酸位置は太字で示し、HCVポリ
ペプチド内の位置に対応するものは普通字で示す。
(B)PKRの構成図。調節ドメイン内の2つのdsRNA結合モチーフの位置を黒で示す
。触媒ドメインはアミノ酸265〜551にわたっており、ローマ数字で示した11のプ
ロテインキナーゼ触媒ドメイン保存領域(Hanksら，1988，Science 241:42-52)を
含む。PKR阻害性分子であるアデノウイルスVA1 RNA、ワクシニアウイルスK3Lお
よびP58IPKとの相互作用の領域が示してある(Katzeら，1987，Embo J．6:689-69
7;Gala Jr.ら，1996，Mol．Cell．Biol．16:4172-4181)。NS5A結合領域も示して
ある。
図2. in vitro結合分析。図2は、単独の(レーン1，4および7)または各レーン
の上に示したように粗製大腸菌抽出物内のGSTもしくはGST-NS5Aとの結合により
選択された[35S]-メチオニン標識PKR in vitro翻訳産物のオートラジオグラムを
示す。PKRのアミノ酸(aa)1-551(レーン2と3)、1-242(レーン5と6)、または244-5
51(レーン8と9)を含む結合複合体がグルタチオン-アガロース上での選択により
回収された。結合した翻訳産物はSDSサンプル緩衝液中に溶出し、12.5%アクリル
アミドSDS-PAGEで分離した。右側の矢印は、レーン8と9に見えるバックグラウン
ドバンドより下に泳動するPKR aa 244-251の位置を示す。分子量標準品の位置を
kDaで示してある（左）。
図3. 酵母2-ハイブリッド分析。HCV-1b由来のNS5Aはin vivoでPKRと相互作用
する。HCV-1b由来の全長野生型NS5AをGAL4転写活性化ドメイン(AD)に融合させて
、GAL4 DNA結合ドメイン(BD)(位置2)またはBD-PKR融合構築物BD-PKR K296Rおよ
びBD-PKR 98-551(それぞれ、位置4と8)と共に酵母において共発現させた。2-
ハイブリッドアッセイのための対照GAL4構築物の共発現はAD-ベクター/BD-ベク
ター(位置１)、AD-ベクター/BD-PKR K296R(位置3)、AD-P58IPK/BD-PKRK296R(位
置5)、AD-ベクター/BD-PKR 98-551(位置6)、およびAD-P58IPKK/BD-PKR 98-551(
位置7)を含んでいた。トランスフェクションした酵母を+His培地(上)および-His
培地(下)にレプリカプレートした。-His培地上での増殖が2-ハイブリッドタンパ
ク質の相互作用を示す。
図4. HCV-1a由来のNS5AはPKRプロテインキナーゼの触媒ドメインと相互作用
する。BD単独(BD-ベクター)またはHCV-1a由来のBD-NS5A融合タンパク質(BD-NS5A
)を発現する酵母を、表示したAD-PKR融合構築物または対照のAD-ベクター(最下
行)を発現するプラスミドでコトランスフェクションし、+His培地(左)および-Hi
s培地(右)にレプリカプレートして増殖についてアッセイした。
図5. 組換えNS5AはPKR活性をin vitroで抑制する。精製した天然PKR(1.8pmol
)を緩衝液(レーン1)または次第に増加する量の精製した組換えGST-NS5A(HCV-1a
，レーン2-5)またはGST(レーン6-9)と共にプレインキュベートし、ヒストンH2a
基質の存在下でin vitroキナーゼ活性についてアッセイした。キナーゼ反応の終
了後、リン酸化産物を12.5% SDS-PAGEで分離し、乾燥ゲルのオートラジオグラフ
ィーにより視覚化した。矢印はPKRおよびヒストンの位置を示す。インプットGST
-NS5AまたはGSTタンパク質のモル量は0.2pmol(レーン2と6)、0.4pmol(レーン3と
7)、0.8pmol(レーン4と8)、および1.2pmol(レーン5と9)とした。
図6. NS5Aは酵母においてPKR介在増殖抑制を逆転させる。酵母RYI-1株を2m酵
母発現構築物pYES2-NS5A(NS5A;HCV-1a由来)、pEMBLYex4K3L(ワクシニアウイルス
K3L;陽性対照)または陰性対照ベクターpEMBLYex4(pYex)およびpYes2(pYes)でト
ランスフェクションした。トランスフェクタントを、炭素源として2%デキストロ
ース(SD，左)または10%ガラクトース/2%ラフィノース(SGAL，右)を含む最少合成
培地にプレートし、増殖について評価した。SGALプレートは5日間の増殖を表す
。
図7. eIF-2αリン酸化分析。上に示した酵母株からの抽出物を調製し、記載
したように等電点電気泳動およびイムノブロット分析にかけた。最初にタンパク
質(20mg)を等電点電気泳動により分離し、その後ニトロセルロース膜に移行させ
、続いて酵母eIF-2αに特異的な抗血清を用いて検索した。矢印は基礎的にリン
酸化されたeIF-2α(下段のバンド)およびPKRによるリン酸化の部位であるSer51
でリン酸化されたeIF-2α(上段のバンド)の位置を示す。基礎的にリン酸化され
たeIF-2αの全体に対するレベルは、レーザー濃度計を走査することで定量し、
ベクター，0.9%(レーン1);NS5A，9.8%(レーン2);およびK3L，11.7%(レーン3)で
ある。
図8. PKRのNS5A結合ドメイン。（上のパネル）示したADおよびBD発現構築物
を保有するHf7c酵母株を+His培地(左)および-His培地(右)にレプリカプリントし
、30℃で4日間インキュベートして増殖についてアッセイした。AD-PKRおよびBD-
NS5A 1b-wt構築物の発現をイムノブロット分析により確認した。-His培地で増殖
した株を2-ハイブリッドタンパク質相互作用について陽性と評価した。（下のパ
ネル）PKRの構成図。2つのdsRNA結合モチーフ(dsRBM)および11のプロテインキナ
ーゼ触媒ドメイン保存領域の位置を黒で示す。ウイルスによりコードされる阻害
剤であるアデノウイルスVA1 RNA、ワクシニアウイルスK3LおよびHCV NS5Aタンパ
ク質との相互作用を媒介するPKRの領域には下線を引いてある。
図9. NS5AはPKRの二量体化を破壊する。大腸菌AG1688を、示した希釈率のλK
H54ファージと混合したCI-PKR K296RおよびGST(カラム1)、GST-NS5A 1b-wt(カラ
ム2)、GST-K3L(カラム3)、またはGST-NSI(カラム4)をコードする発現プラスミド
の組合せで共形質転換し、寒天培地を含むプレート上に点在させた。カラム5はC
I-RopおよびGST-NS5A1b-wt発現プラスミド（対照）を保有する大腸菌を含む。CI
融合タンパク質の二量体化はコロニー形成により示される。
図10．NS5AのPKR結合ドメイン。図10A. GAL4DNA結合ドメイン-NS5A融合構築
物の構成図。NS5A 1b-wtから欠失変異体を作製したが、ΔISDR構築物はNS5A 1a-
wtから作製した。ISDRおよびPKR結合領域をそれぞれ白の四角と黒の四角で示す
。末端アミノ酸の位置を示してあるが、その番号付けは始原型HCV Jポリタンパ
ク質配列に基づく。図10B. 酵母2-ハイブリッドアッセイ。AD-PKR K296Rを保有
するHf7c酵母を、示したBD-NS5A欠失構築物で共形質転換した。30℃で3日間イン
キュベートした-Hisプレートを示してある。-His培地上での増殖は2-ハイ
ブリッドタンパク質相互作用を示す。図10C. イムノブロット分析。酵母株から
調製した抽出物をSDS-PAGEで分離し、抗NS5A(レーン1-6)または抗BD(レーン7-9)
モノクローナル抗体を用いてイムノブロット分析にかけた。レーン1と7はpGBT9
BDベクターを保有する菌株から調製した抽出物を含む（対照）。抽出物はそれぞ
れの対応レーンの上に示した構築物名により確認される。BD-NS5A構築物1973-24
19は右に示したブロットの陽性対照として含められた。タンパク質標準品の位置
をkDaで示してある。
図11．NS5A-PKR相互作用に及ぼすISDR突然変異の影響。図11A. 酵母2-ハイブ
リッドアッセイ。AD-PKR K296R(AD-PKR)またはAD単独(AD-ベクター)をコードす
るpGAD425を保有するHf7c酵母株を、BD単独(ベクター)、BD-NS5A 1a-wt、BD-NS5
A-ΔISDR、または表1に示したISDR配列を含むBD-NS5A 1b-wt構築物の同質遺伝子
セットをコードするpGBT9で共形質転換した。-His培地上での増殖が2-ハイブリ
ッドタンパク質相互作用を示す。図11B. イムノブロット分析。Aに示した菌株
から抽出物を調製し、抗AD(左パネル)または抗BD(右パネル)モノクローナル抗体
を用いてイムノブロット分析にかけた。レーン1と2はそれぞれAD-ベクター(v，
対照)およびAD-PKR(PKR，矢印)の発現を示す。レーン3-9はBD-ベクター(v，レー
ン3)、BD-NS5AΔISDR(Δ，レーン4)、BD-NS5A 1a-wt(wt，レーン5)、BD-NS5A 1b
-wt(wt，レーン6)、BD-NS5A 1b-2(2，レーン7)、BD-NS5A 1b-4(4，レーン8)、お
よびBD-NS5A 1b-5(5，レーン9)の発現を示す。右の矢印はΔISDRおよび全長BD-N
S5A構築物の位置を示す。タンパク質標準品の位置をkDaで示してある。
図12．ISDR突然変異はNS5A機能を壊滅させる。図12A. 酵母増殖アッセイ。ガ
ラクトース誘導性URA3発現プラスミドpYes-NS5A 1b-wt(1b-wt)、pYes-NS5A 1b-2
(1b-2)、pYes-NS5A 1b-4(1b-4)、pYes-NS5A 1b-5(1b-5)、またはpYes対照(ベク
ター)を保有するRY1-1酵母株の細胞均等物を段階的に希釈し、デキストロース(B
D)またはガラクトース(SGAL)を含有する培地に点在させた。パネルは30℃で5日
間増殖させた後のコロニー形成を示す。図12B. Aに示した酵母株から調製した
タンパク質抽出物のイムノブロット分析。抗PKR、抗NS5A、または抗アクチン(対
照)モノクローナル抗体で順次検索した、同一ブロットから得られた結果
を示してある。右の矢印はPKR、NS5Aおよびアクチンの位置を示す。各レーンは5
0μgの全タンパク質を表す。
図13．eIF-2αリン酸化。eIF-2αの検出はブロットを抗酵母eIF-2α血清で検
索することにより促進された。各レーンは、pYes(V，レーン1)、pYes-NS5A 1b-w
t(1b-wt,レーン2)、pYes-NS5A 1b-2(1b-2,レーン3)、pYes-NS5A 1b-4(1b-4,レー
ン4)、pYes-NS5A 1b-5(1b-5,レーン5)、またはpYes-PKR A295-300[PKR A295-300
(対照)，レーン6]を保有するRY1-1株から調製した20μgのタンパク質を表す。右
の矢印は低リン酸化eIF-2α(下)およびセリン51でPKRによりリン酸化されている
高リン酸化eIF-2αの位置を示す。
図14．ISDR突然変異は哺乳動物細胞におけるNS5A-PKR会合を破壊する。Cos-I
細胞を、PKR K296RおよびNS5AをコードするCMV発現プラスミド、またはPKR K296
RをコードするCMV発現プラスミドとベクター対照で同時トランスフェクションし
た。抽出物を調製し、抗NS5Aモノクローナル抗体(A)または抗FLAGレジン(B)と混
合した。図14A. ベクター対照(neo，レーン1)またはNS5A 1a-wt(1a-wt，レーン
2)と共にPKR K296Rを保有する抽出物、およびインプット抽出物(IP-input,レー
ン3と4)から調製した抗NS5A免疫複合体をSDS-PAGEで分離し、抗PKR(レーン1-3)
または抗NS5A(レーン4)モノクローナル抗体を用いてイムノブロット分析にかけ
た。レーン３と４はレーン２に示した免疫沈降反応からの出発物質を表す。左の
垂直線は免疫グロブリン(Ig)重鎖に対応する幅広のバンドを示す。タンパク質標
準品の位置をkDaで示してある。図14B. ベクター単独(neo，レーン1と4)、FLAG
-NS5A 1b-wt(1b-wt，レーン2と5)またはFLAG-NS5A 1b-5(1b-5，レーン3と6)と共
にPKR K296Rを保有する抽出物を抗FLAGレジンと混合することにより回収した、
インプットタンパク質(レーン1-3)またはタンパク質複合体(レーン4-6)のイムノ
ブロット分析。ヒトPKRに特異的なモノクローナル抗体を用いてブロットを検索
した。矢印はPKRバンドを示す。
図15．NS5Aの細胞系および腫瘍での発現。NIH3T3細胞系neo 5-10(neo，レーン
1)およびNS5A 5C6(5C6，レーン2)、またはin vivo由来のNS5A 5C6腫瘍細胞(腫瘍
，レーン3)から調製した抽出物を抗NS5Aモノクローナル抗体で検索したイムノブ
ロット。矢印はNS5Aの位置を示す。タンパク質標準品の位置を示してある(kDa)
。
５．発明の詳細な説明
本発明は、ＩＦＮ−誘導型細胞防御機構のウイルス抑制を妨害する抗ウイルス
薬の新規同定方法に関する。本発明は、ＩＳＤＲドメインを含むウイルスタンパ
ク質と細胞ＰＫＲプロテインキナーゼとの相互作用を標的にする抗ウイルス薬の
スクリーニング方法に関する。本発明は、より詳しくは、ＨＣＶ ＮＳ５ＡとＩ
ＦＮ−誘導型ＰＫＲプロテインキナーゼの相互作用をターゲットにする新規抗ウ
イルス薬をスクリーニングする方法に関する。別の実施態様においては、本発明
は、より詳しくは、ＰＫＲ二量体化のＨＣＶＮＳ５Ａ阻害をターゲットにする抗
ウイルス薬をスクリーニングする方法に関する。
本発明は、一部は、（１）ＮＳ５ＡのＩＳＤＲ領域はＨＣＶのＩＦＮ−耐性表
現型に機能的に寄与し；（２）ＮＳ５ＡとＰＫＲの相互作用にはＩＳＤＲを取り
囲む追加の配列が必要であり：（３）ＮＳ５Ａは、プロテインキナーゼ触媒ドメ
イン、特にアミノ酸244〜296との直接的な相互作用によりＩＦＮ−誘導型ＰＫＲ
を阻害し；（４）ＰＫＲアミノ酸244〜296は二量体化ドメインであり、このドメ
インに結合しているＮＳ５ＡがＰＫＲ二量体化を破壊し；（５）ＩＳＤＲ領域は
、ＮＳ５ＡとＰＫＲの相互作用、ならびにその結果得られるプロテインキナーゼ
の阻害の両方について必須であるという本発明者らの驚くべき発見に基づくもの
である。
本発明は、ＰＫＲプロテインキナーゼのような、ＩＳＤＲを発現するウイルス
タンパク質とＩＦＮ−誘導型細胞タンパク質の相互作用をターゲットにする新規
抗ウイルス薬を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本発明は、さ
らに、ＰＫＲプロテインキナーゼのＮＳ５Ａ阻害が無効になるレベルまでＩＦＮ
−発現を誘導する新規外因性または内因性物質を同定するためのスクリーニング
アッセイに関する。ＩＳＤＲとＩＦＮ−誘導型ＰＫＲの相互作用は、例えば、Ｐ
ＫＲの二量体化を阻害することによりＩＦＮ−誘導型細胞防御機構の無効化を生
じさせる。したがってＩＳＤＲを含むウイルスタンパク質とＰＫＲの相互作用を
妨害する化合物を同定する本発明のスクリーニングを用いることにより、宿主の
翻訳停止のウイルス無効化を抑制する薬剤を同定することができる。さらに、Ｉ
ＳＤＲを含むウイルスタンパク質の細胞ＰＫＲとの相互作用を妨げる化合物の同
定において、本発明のスクリーニングアッセイによりウイルス感染と関連した悪
性疾患の発生を抑制する物質も同定される。種々のプロトコルおよび技術を利用
することにより、ウイルス発現タンパク質のＩＳＤＲとＩＦＮ−誘導型ＰＫＲの
相互作用を妨害および／または阻害する物質をスクリーニングし得る。そのよう
にして同定された物質は、ウイルスが感染した宿主の治療に有用であり、好都合
なことにＩＦＮ−耐性ウイルスに対して有効である。
本発明は、さらに、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイによって同
定された新規物質を含む医薬組成物を含む。本発明は、本発明のターゲットとし
てＩＳＤＲ含有タンパク質を用いてウイルス感染を治療するための治療様式およ
び医薬組成物に関する。本発明は、より詳しくは、ＮＳ５ＡおよびそのＩＦＮ−
誘導型ＰＫＲとの相互作用を用いたＨＣＶ−感染の治療のための治療様式および
医薬組成物に関する。そのような治療は、ＨＣＶのインターフェロンに対する感
受性をだんだん強めるという利点も有するので、ＩＦＮとの薬剤組合せ治療にお
いて有用である。
本発明の治療様式は、さらに、ＮＳ５ＡとＩＦＮ−誘導型ＰＫＲの相互作用を
妨害する物質、またはＰＫＲのＮＳ５Ａ阻害が無効になるレベルまでＩＦＮ−発
現のレベルを誘導する物質、ならびに少なくとも１種のその他の治療剤を、例え
ば混合物として一緒に、別個であるが共にもしくは同時に；またはサイクリング
療法(cycling therapy)などのように連続して投与する併用療法を含む。サイク
リング療法は、治療薬の一方に対する耐性の発生を低減させるために、一定期間
の第１の抗ウイルス化合物の投与およびこの連続投与の繰り返し、すなわちサイ
クルを含むものである。
本発明の新規の抗ウイルス薬の併用は、抗ウイルス活性に必要などちらかの薬
剤の有効投与量を低減し、それによって毒性を低減するだけでなく、複合的な機
構によってウイルスを攻撃する結果、絶対的な抗ウイルス効果も改善し得る治療
方法を提供する。同様に、新規の抗ウイルス薬併用は、単独の治療に対するウイ
ルス耐性の発生を回避する方法を提供するものであり、それによって、臨床医に
、より有効な処置を提供する。ＮＳ５ＡとＰＫＲの相互作用をターゲットにする
薬剤と併用して用いられる治療剤には、α−ＩＦＮなどの広範な種類の公知の治
療薬が含まれる。
５．１ ＨＣＶ感染におけるＨＣＶ ＮＳ５ＡとＩＦＮ−誘導型ＰＫＲとの相 互作用の役割
本発明は、一部は、（１）ＮＳ５ＡのＩＳＤＲ領域はＨＣＶの株のＩＦＮ−耐
性表現型に機能的に寄与し；（２）ＮＳ５Ａはプロテインキナーゼ触媒ドメイン
との直接的な相互作用によりＩＦＮ−誘導型ＰＫＲを阻害し；そして（３）ＰＫ
Ｒの阻害ならびにＮＳ５ＡとＰＫＲとの相互作用にはＩＳＤＲが必要であるとい
う本発明者らの驚くべき発見に基づくものである。これらの発見は、下記の第６
、７、８および９節に例示されており、ＮＳ５Ａが直接的な相互作用によりＰＫ
Ｒを阻害することを示す、生化学的戦略と遺伝学的戦略の組み合わせを記載する
ものである。
下記に示した実施例は、in vitro ＧＳＴ結合アッセイおよびin vivo酵母ツー
ハイブリッドアッセイを用いてＮＳ５ＡとＰＫＲとの直接的な相互作用を示すも
のであり、ＮＳ５Ａは、プロテインキナーゼのカルボキシル触媒部分、すなわち
ＰＫＲ二量体化ドメインアミノ酸244〜296と直接相互作用することが分かった。
組換え精製ＮＳ５Ａは、in vitroでＰＫＲキナーゼ活性を阻害することが分かっ
た。哺乳動物細胞における共同トランスフェクション研究により、ＮＳ５Ａはin
vivoでＰＫＲ二量体化を阻害し、ＰＫＲ機能の阻害が生じ、ＰＫＲ介在ｅＩＦ
−２αリン酸化の阻害が生じることが判明した。さらに、酵母内で発現した場合
、ＮＳ５ＡはＰＫＲ誘導型緩慢増殖表現型を阻害し、ＰＫＲの天然基質ｅＩＦ−
２αのリン酸化を低減させることが分かった。より重要なことには、ＩＳＤＲを
欠くＮＳ５Ａ欠失突然変異体は、ＰＫＲと相互作用すること、またはプロテイン
キナーゼ活性を阻害することができなかった。さらに、ＨＣＶ−１ｂのインター
フェロン感受性株内で観察されたように、多重ＩＳＤＲ突然変異の導入により、
哺乳動物細胞内においてＮＳ５ＡのＰＫＲを結合する能力が排除された。興味深
いことに、ＰＫＲに結合する能力を依然として維持しながら、ＮＳ５ＡのＰＫＲ
調節機能を妨害するには１個のＩＳＤＲ点突然変異で十分であった。実施例は、
さらに、細胞系がＮＳ５Ａを過剰発現する場合、その細胞系は悪性形質転換され
、ヌードマウスにおいて腫瘍を引き起こすことを示すものである。これらの結
果は、ＮＳ５Ａ遺伝子産物によるＰＫＲの不活性化が、ＨＣＶがＩＦＮの抗ウイ
ルス作用を回避する一つの機構であり、よってこの相互作用は、慢性ＨＣＶ感染
から生じる悪性腫瘍を治療するための治療薬に加えて、ＨＣＶ抗ウイルス治療薬
の開発において重要なターゲットとして役立つものであることを初めて示すもの
である。
５．２ スクリーニングアッセイ用の成分としてのＨＣＶ ＮＳ５ＡおよびＰ ＫＲの産生
本発明は、さらに、ＮＳ５ＡとＰＫＲの相互作用、より具体的にはＩＳＤＲと
ＰＫＲの触媒ドメインとの相互作用をターゲットにするそれらの化合物を同定す
るためのスクリーニングアッセイに関する。本発明の一つの実施態様においては
、本発明のスクリーニングアッセイの重要な成分はウイルスＮＳ５Ａおよび細胞
ＰＫＲタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドをコードするヌクレオチドコー
ド配列である。特に、本発明は、ＩＳＤＲおよびＰＫＲプロテインキナーゼの触
媒ドメインに対応するペプチド断片をコードするヌクレオチドコード配列を含む
。本発明は、さらに、（ａ）前記ＮＳ５ＡまたはＰＫＲコード配列および／また
はその相補配列のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）宿主細胞において前記
ＮＳ５ＡまたはＰＫＲコード配列の発現を誘導する調節エレメントと機能的に結
合した該コード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター；ならびに（ｃ）宿主
細胞において前記ＮＳ５ＡまたはＰＫＲコード配列の発現を誘導する調節エレメ
ントと機能的に結合した該コード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細
胞を含む。
５．２．１ ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列
本発明は、ＮＳ５Ａタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質のペプチド断片およびＮ
Ｓ５Ａ融合タンパク質をコードするヌクレオチドコード配列を含む。好ましい実
施態様においては、本発明は、図１Ａに示したようなＩＳＤＲアミノ酸配列、そ
のアミノ酸配列を含むペプチド断片および融合タンパク質をコードするヌクレオ
チドコード配列を含む。さらに別の好ましい実施態様においては、本発明は、Ｐ
ＫＲとの相互作用にも必要なＩＳＤＲに対するそれらの配列カルボキシルもコー
ドするヌクレオチドコード配列、ならびにこれらのヌクレオチドコード配列によ
ってコードされるアミノ酸配列を含むペプチド断片および融合タンパク質を含む
。さらなる実施態様においては、本発明は、ＨＣＣＶのＩＦＮ−感受性株内に見
出される多重ＩＳＤＲ突然変異、ならびにこれらのＩＳＤＲ突然変異を含むペプ
チド断片および融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明は、さらに、ＰＫＲプロテインキナーゼ、ＰＫＲプロテインキナーゼの
ペプチド断片およびＰＫＲタンパク質融合タンパク質をコードするヌクレオチド
コード配列を含む。好ましい実施態様においては、本発明は、ＰＫＲの触媒ドメ
インおよびＰＫＲの触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチ
ドコード配列を含む。さらに別の好ましい実施態様においては、本発明は、ＰＫ
Ｒ二量体化ドメイン、アミノ酸244〜246、ならびにＰＫＲアミノ酸244〜296を含
むペプチド断片および融合タンパク質を含むヌクレオチドコード配列を含む。
融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、限定するものではないが
、全長ＮＳＤＲまたはＰＫＲ、非関連タンパク質またはペプチドに融合されたＮ
ＳＤＲまたはＰＫＲの末端切断型(truncated)タンパク質またはペプチド断片、
例えばＧＳＴまたは酵素もしくは蛍光タンパク質に融合したＩＳＤＲが挙げられ
る。
また、本発明は、（ａ）前記ＮＳ５ＡまたはＰＫＲプロテインキナーゼコード
配列および／またはそれらの相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含
むＤＮＡベクター；（ｂ）前記ＮＳ５ＡまたはＰＫＲプロテインキナーゼコード
配列の発現を誘導する調節エレメントと機能的に結合した該コード配列のいずれ
かを含むＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞において前記ＮＳ５Ａまた
はＰＫＲプロテインキナーゼコード配列の発現を誘導する調節エレメントと機能
的に結合した該コード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞も含む。
本明細書で用いられる場合、調節エレメントとしては、限定するものではないが
、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を誘
導し、調節する当業者に公知のその他のエレメントが挙げられる。そのような調
節エレメントとしては、限定するものではないが、熱ショックプロモーター、ガ
ラクトース誘導プロモーターなどの誘導プロモーター、タバコモザイクウイルス
（ＴＭＶ）のプロモーターなどのウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス
ｈＣＭＶ前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、la
c系、trp系、TAC系、TRC系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター
領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、3-ホスホグリセレートキナーゼ、酸ホ
スファターゼのプロモーター、および酵母α−接合因子のプロモーターが挙げら
れる。
５．２．２ ＮＳ５ＡおよびＰＫＲタンパク質およびポリペプチド
ＮＳ５ＡおよびＰＫＲタンパク質、ポリペプチド、ペプチド断片、ＮＳ５Ａお
よびＰＫＲタンパク質の突然変異体、末端切断型または欠失体、ならびにＩＳＤ
ＲまたはＰＫＲの触媒ドメインを含む融合タンパク質は、限定するものではない
が、抗体の作製、ＩＦＮ−誘導型細胞防御機構のウイルスバイパスに関与するそ
の他の因子の同定などの種々の用途のために作製され得る。
ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列を突然変異することにより、選択された宿主
細胞における発現、大量生産等により適したタンパク質およびペプチドを作製す
ることができる。
ＩＳＤＲおよびＰＫＲの触媒ドメインを含む、ターゲット、末端切断型もしく
は欠失ＮＳ５ＡまたはＰＫＲタンパク質の１以上のドメインに対応するペプチド
、ならびに全長ＮＳ５ＡまたはＰＫＲが非関連タンパク質に融合されている融合
タンパク質も本発明の範囲に含まれる。そのような融合タンパク質としては、限
定するものではないが、ＮＳ５ＡまたはＰＫＲタンパク質またはペプチドを安定
化し、in vivoでの半減期を延長するＩｇＦｃ融合物；融合タンパク質を固体担
体に固定させる、またはＩＳＤＲを安定な表面上に提示させる任意のアミノ酸配
列への１個または複数のＧＳＴ融合物；またはマーカー機能を付与する酵素、蛍
光タンパク質、または発光タンパク質への融合物が挙げられる。
本発明のポリペプチドおよびペプチドは化学合成され得る一方（例えば、Crei
ghton，1983，Proteins:Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman &
Co.，ニューヨークを参照されたい）、ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列から誘
導された大型ポリペプチドは、ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列を含む核酸を発
現させるための当技術分野で周知の技術を用いて組換えＤＮＡ技術によって都合
よく産生され得る。そのような方法を用いることにより、５．２．１項に記載
したヌクレオチド配列および適当な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベク
ターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換え
ＤＮＡ技術、合成技術、および遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら
，1989（上記のとおり）およびAusubelら，1989（上記のとおり）に記載された
技術を参照されたい。一方、ＮＳ５ＡまたはＰＫＲヌクレオチド配列をコードす
る能力を有するＲＮＡは、例えば、合成装置を用いて化学合成され得る。例えば
、"Oligonucleotide Synthesis"，1984，Gait，M.J.編，IRL Press，Oxford（こ
れは参照により本明細書に含まれるものである）に記載された技術を参照された
い。
種々の宿主発現ベクター系を利用することにより、本発明のＮＳ５ＡおよびＰ
ＫＲヌクレオチド配列を発現させることができる。
当業者に周知の方法を用いることにより、ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列な
らびに適当な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができ
る。これらの方法としては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およびin viv
o組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular C
loning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ニューヨーク
およびAusubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pu
blishing Associates and Wiley Interscience，ニューヨークを参照されたい。
種々の宿主発現ベクター系を利用することにより、ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコー
ド配列を発現させることができる。これらには、限定するものではないが、ＮＳ
５ＡおよびＰＫＲコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミ
ドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物
：ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換さ
れた酵母；ＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベ
クター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）を感染させた、またはＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列を含む
組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換したＮＳ
５ＡおよびＰＫＲ細胞系；または組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノ
ウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系が含まれる。
これらの系の発現エレメントは、その強度および特異性の点で相違する。利用
される宿主／ベクター系に依存して、構成プロモーターおよび誘導プロモーター
などのいくつかの適当な転写および翻訳エレメントのいずれかが発現ベクターに
おいて使用され得る。例えば、細菌系でクローニングする場合、バクテリオファ
ージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘
導プロモーターが用いられ得るものであり；昆虫細胞系でクローニングする場合
、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターが使用され得
るものであり；植物細胞系でクローニングする場合、植物細胞のゲノムから誘導
されたプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小型サブユ
ニットについてのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質についての
プロモーター）または植物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、Ｃａ
ＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）
が使用され得るものであり；哺乳動物細胞系でクローニングする場合には、哺乳
動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えば、メタロチオネインプロ
モーター）または哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、アデ
ノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Ｋプロモーター）が使用
され得るものであり；ＮＳ５ＡまたはＰＫＲ ＤＮＡの多数のコピーを含む細胞
系を作製する場合には、SV40-、BPV-およびEBV-基ベクターが適当な選択可能な
マーカーとともに使用され得る。
細菌系においては、いくつかの発現ベクターが、発現させるＮＳ５ＡおよびＰ
KRに対して意図した使用に依存して都合よく選択され得る。例えば、大量のＮＳ
５ＡおよびＰＫＲを抗体の作製またはペプチドライブラリーのスクリーニングの
ために製造させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現
を誘導するベクターが望ましくあり得る。そのようなベクターとしては、限定す
るものではないが、E.coll発現ベクターpUR278（Rutherら，1983，EMBO J．2:17
91）（ここで、そのＮＳ５ＡおよびＰＫＲコード配列は、ハイブリッドＮＳ５Ａ
およびＰＫＲ lac Zタンパク質が産生されるようにlac Zコード領域を有するフ
レーム内でベクターにライゲートされ得る）；pINベクター(Inouye & Inouye，
1985，Nucleic acids Res．13:3101-3109;Van Heeke & Schuster，1989，J．Bio
l．Chem．264:5503-5509)などが挙げられる。また、pGEXベクターを使用するこ
とによっても、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク
質として外来ポリペプチドを発現させ得るものである。一般的に、そのような融
合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに対して吸着さ
せ、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより溶解細胞から容易に精製
され得るものである。pGEXベクターは、興味の対象であるクローニングされたポ
リペプチドがＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたはXa因子プロテ
アーゼ切断部位を含むようにデザインされる。
酵母においては、構成または誘導プロモーターを含むいくつかのベクターが使
用され得る。概要については、Current Protocols in Molecular Biology，Vol
．2，1988，Ausubelら編，Greene Publish．Assoc. & Wiley Interscience，第1
3章;Grantら，1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Method
s in Enzymology，Wu & Grossman編，1987，Acad．Press，ニューヨーク，Vol.1
53，pp.516-544;Glover，1986，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D．C
.，第３章;およびBitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Met
hods in Enzymology，Berger & Kimmel編，Acad．Press，ニューヨーク，Vol.15
2，pp.673-684;およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，19
82，Strathernら編，Cold Spring Harbor Press，Vols．IおよびIIを参照された
い。
組換えタンパク質の長期間の高収量産生のためには安定な発現が好ましい。例
えば、ＮＳ５ＡまたはＰＫＲを安定に発現する細胞系が操作され得る。本発明の
好ましい実施態様においては、ＮＳ５ＡおよびＰＫＲを安定に発現する酵母細胞
が操作され得る。そのような細胞系は、ＰＫＲのＮＳ５Ａ阻害の阻害物質をスク
リーニングするためのin vivoシステムとして役立ち得る。ウイルスの複製起点
を含む発現ベクターを使用する代わりに、酵母宿主細胞は、適当な発現調節エレ
メント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポ
リアデニル化部位など）により調節されたＮＳ５ＡおよびＰＫＲ ＤＮＡ、およ
び選択可能なマーカーで形質転換することができる。さらに、そのような宿主細
胞は、その発現がＰＫＲキナーゼの活性化に応答して増大されるレポーター遺伝
子をコードするＤＮＡでも形質転換され得る。そのようなレポーター遺伝子の例
は、β−ガラクトースレポーター遺伝子に融合されたＧＣＮ４プロモーターであ
る。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は富化培地中で１〜２日間増殖され得
るものであり、次いで選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド内の選択可
能なマーカーは、選択に対する耐性を付与するものであり、細胞の染色体にプラ
スミドを安定に組み込ませ、その細胞を増殖させて、クローニングされ、細胞系
に広げられ得るフォーカスを形成させる。この方法は、ＮＳ５Ａ遺伝子、ＰＫＲ
遺伝子、さらにその発現がＰＫＲプロテインキナーゼの活性化に応答して増大さ
れるレポーター遺伝子を発現する細胞系を操作するのに都合よく用いられ得る。
そのような操作された細胞系は、ＮＳ５Ａの阻害物質のスクリーニングに特に有
用である。
限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら
，1977，Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Szybalska & Szybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48:202
6）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら，1980，Cell
22:817）遺伝子などのいくつかの選択系が用いられ得るものであり、それぞれ、
tk-、hgprt-、aprt-細胞において用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性
は、dhfr（これはメトトレキセートに対する耐性を付与するものである）（Wigl
erら，1980，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567;O'Hareら，1981，Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA 78:1527）；gpt（これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する
ものである）（Mulllgan & Berg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072
）；neo（これはアミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するものである）（
Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol．150:1）；およびhygro（これはヒグ
ロマイシン遺伝子に対する耐性を付与するものである）（Santerreら，1984，Ge
ne 30:147）の選択の基礎として用いられ得る。最近、さらなる選択可能な遺伝
子、すなわちtrpB（これは細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用さ
せる）；hisD（これは細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させる）
（Hartman & Mulligan，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047）およ
びODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（これはオルニチンデカルボキシラー
ゼ阻害物質、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチンＤＦＭＯに対する耐性を付与
する（McConlogue L.，1987，In:Current Communications in Molecular Biolog
y，Cold Spring Harbor Laboratory編）が記載された。また、本発明は、（ａ）
前記コード配列および／またはその相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれ
かを含むＤＮＡベクター；（ｂ）前記コード配列の発現を誘導する調節エレメン
トと機能的に結合した該コード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター；およ
び（ｃ）宿主細胞において前記コード配列の発現を誘導する調節エレメントと機
能的に結合した該コード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞も含む
。本明細書で用いられる場合、調節エレメントとしては、限定するものではない
が、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を
誘導し、調節する当技術分野で公知のその他のエレメントが挙げられる。
さらに、遺伝子型配列を含む今まで知られていないＩＳＤＲが、興味の対象で
ある遺伝子内のアミノ酸配列を基礎としてデザインされた２つの縮重オリゴヌク
レオチドプライマープールを用いて、または６．１項に記載されたＰＣＲプライ
マーを用いてＰＣＲを行うことによって単離され得る。この反応の鋳型は、ＩＳ
ＤＲを含むタンパク質を発現することが知られた、または疑われるウイルスを感
染させた細胞系または組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃ
ＤＮＡであり得るものである。
ＰＣＲ産物をサブクローニングして配列決定することにより、増幅配列はＮＳ
５Ａの配列またはＩＳＤＲ遺伝子様核酸配列を示すものであるということが確認
され得る。次いで、ＰＣＲ断片を用いることにより、種々の方法によって全長ｃ
ＤＮＡクローンを単離することができる。例えば、増幅断片を標識し、使用する
ことによりバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
ができる。一方、標識断片を使用することにより、ゲノムライブラリーをスクリ
ーニングすることができる。
また、ＰＣＲ技術を利用することにより、全長ｃＤＮＡ配列を単離することも
できる。例えば、標準操作にしたがって、適当な細胞または組織源からＲＮＡを
単離し得る。逆転写反応は、第１鎖合成のプライミング用の増幅断片の大部分の
5'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＮＡ上で行われ得る
。次いで、得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、標準末端トランスフェラー
ゼ反応を用いてグアニンを「末端につなぐ」ことができ、そのハイブリッドをＲ
ＮＡアーゼは消化することができ、次いで第２鎖合成はポリ−Ｃプライマーでプ
ライミングすることができる。したがって、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は簡
単に単離され得る。使用され得るクローニング戦略の概要については、例えば、
Sambrookら，1989（上記のとおり）を参照されたい。
同定されたＩＳＤＲ配列が正常な、または野生型遺伝子である場合、この遺伝
子を用いることにより、遺伝子の突然変異対立遺伝子を単離することができる。
突然変異対立遺伝子は、その感染力に寄与するＩＦＮ−耐性表現型を有すること
が知られているか、提案されているウイルスから単離され得る。次いで、突然変
異対立遺伝子および突然変異対立遺伝子産物は、下記に示したようなin vitroア
ッセイ、発現系、およびスクリーニングアッセイの開発において利用され得る。
突然変異遺伝子のｃＤＮＡは、例えば、当業者に周知の技術であるＰＣＲを用
いることにより単離され得る。この場合、第１のｃＤＮＡ鎖は、オリゴ−ｄＴオ
リゴヌクレオチドを、突然変異対立遺伝子を有するものと推定される個体におい
て発現することが知られているか疑われている組織から単離されたｍＲＮＡにハ
イブリダイズすることによって、そして逆転写酵素を用いて新たな鎖を伸長させ
ることによって合成され得る。次に、ｃＤＮＡの第２の鎖を、正常遺伝子の5'末
端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成する。次いで
、これらの二つのプライマーを用いて、産物をＰＣＲにより増幅し、適当なベク
ターにクローニングし、そして当業者に周知の方法によりＤＮＡ配列分析にかけ
る。突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を正常遺伝子のものと比較することにより、突
然変異遺伝子産物の機能の消失または変更の原因である突然変異を確認すること
ができる。
一方、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーは、ＩＦＮに対して耐性があり、よ
ってＩＳＤＲまたはその突然変異体を含む遺伝子を発現する疑いがあるウイルス
を感染させた細胞から、それぞれＤＮＡまたはＲＮＡを用いて構築され、スクリ
ーニングされ得るものである。次いで、正常な遺伝子またはその任意の適当な断
片を標識することができ、ライブラリーにおける対応する突然変異対立遺伝子を
同定するためのプローブとして使用することができる。次に、当業者に周知の方
法にしたがってこの遺伝子を含むクローンを精製し、配列分析にかけることがで
きる。
さらに、発現ライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが疑われてい
るか、知られている個体において興味の対象である遺伝子を発現させる疑いのあ
るＩＦＮ−耐性ウイルスを感染させた細胞または組織から単離されたＤＮＡまた
は合成されたｃＤＮＡを利用して構築され得る。この様式においては、突然変異
していると推定される組織によって製造された遺伝子産物が発現され、標準的な
抗体スクリーニング技術を、下記の５．３項に示したように、正常な遺伝子産物
に対して生じた抗体とともに用いてスクリーニングされ得るものである（スクリ
ーニング技術については、例えば、Harlow，E.およびLane編，1988，"Antibodie
s:A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harborを参
照されたい）。突然変異により機能が変更された（例えば、ミスセンス変異の結
果として）発現遺伝子産物が生じる場合、抗体のポリクローナル群は、突然変異
遺伝子産物と交差反応しやすい。そのような標識抗体との反応によって検出され
たライブラリークローンは、当業者に周知の方法にしたがって精製し、配列分析
にかけることができる。
5.2.3 宿主細胞および発現系
NS5AおよびPKRコード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿
主細胞は、以下に示す少なくとも４つの一般的なアプローチによって同定するこ
とができる：(a)DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション；(b)「マーカー
」遺伝子機能の有無；(c)NS5AおよびPKR mRNA転写産物の宿主細胞内における発
現によって測定されるような転写レベルの評価；並びに(d)イムノアッセイまた
は生物活性によって測定されるような遺伝子産物の検出。
第１のアプローチでは、NS5AおよびPKRコード配列若しくはその一部またはそ
れらの誘導体に相同なヌクレオチド配列を含むプローブを使用したDNA-DNAまた
はDNA-RNAハイブリダイゼーションによって、発現ベクター中に挿入された
NS5AおよびPKRコード配列の存在を検出することができる。
第２のアプローチでは、一定の「マーカー」遺伝子の機能（例えば、チミジン
活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキサートに対する耐性、形質転換の表現
型、バキュロウイルスにおける閉塞性体形成(occlusion body formation)等）の
有無に基づいて組換え発現ベクター／宿主系を同定および選択することができる
。例えば、NS5AおよびPKRコード配列がベクターのマーカー遺伝子の配列内にあ
る場合には、マーカー遺伝子の機能が働かないことでNS5AおよびPKRコード配列
を含有する組換え体を同定することができる。あるいは、NS5AおよびPKRコード
配列の発現を制御するのに使用する同一のまたは異なるプロモーターの制御下に
て、マーカー遺伝子をNS5AおよびPKR配列と縦列させることができる。導入また
は選択に応答したマーカーの発現は、NS5AおよびPKRコード配列の発現を意味す
る。
第３のアプローチでは、ハイブリダイゼーションアッセイによって、NS5Aおよ
びPKRコード領域の転写活性を評価することができる。例えば、NS5RおよびPKRコ
ード配列またはその特定の部分に相同なプローブを使用するノーザンブロットに
よって、RNAを単離および分析することができる。あるいは、宿主細胞の全核酸
を抽出し、このようなプローブに対するハイブリダイゼーションについてアッセ
イしてもよい。
第４のアプローチでは、例えば、ウエスタンブロット、イムノアッセイ（例え
ば、放射性免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ）等によって、NS5AおよびPKRタ
ンパク質産物の発現を免疫学的に評価することができる。しかしながら、発現系
の成功を確認する最終試験には、生物学的に活性なNS5AおよびPKR遺伝子産物の
検出が必要である。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場合には、トランスフェク
タント宿主細胞を培養して得られる無細胞培地を、NS5AおよびPKR活性について
アッセイすればよい。遺伝子産物が分泌されない場合には、このような活性につ
いて細胞溶解物をアッセイすればよい。いずれの場合にも、NS5AおよびPKR活性
を検出するのに複数のアッセイを使用することができ、限定するものではないが
、外部からアラキドン酸基質を添加し（30μM、37℃にて15分間）、プロスタグ
ランジンE2産物をメチルオキシメート(methyl oximate)形態へ変換さ
せることによって、シクロオキシゲナーゼ活性を培養培地中で測定することが挙
げられる。次いで、ラジオイムノアッセイ（Amersham Corp製のキット）によっ
てこの２環式誘導体を定量すればよい。
所望のNS5AおよびPKR細胞は、本明細書に記載の遺伝子構築物を様々なNS5Aお
よびPKR細胞型（組織培養細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、組織および器官移植
片、胚、並びに完全な動物を含むが、これらに限定されない）へ遺伝子操作する
ことで得られる。本発明の実施形態では、以下に記載するアプローチおよび方法
に続けて、遺伝子操作した物質を形質転換体（即ち、導入遺伝子構築物を組み込
んだものまたは一体化させたもの）に対して選択またはスクリーニングする。
形質転換された細胞、組織または動物は、遺伝子操作した物質を、形質転換DN
Aに含まれるマーカー遺伝子でコードされた形質について選択またはスクリーニ
ングすることによって同定および単離することができる。例えば、選択は、形質
転換マーカー遺伝子構築物によって耐性が付与される抗生物質の抑制量を含有す
る培地上で、遺伝子操作細胞を増殖させて行うことができる。さらに、形質転換
細胞は、本発明の組換え核酸構築物に含まれる任意の可視マーカー遺伝子（例え
ば、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、BまたはC1遺伝子）の活性をスクリ
ーニングすることで同定することもできる。このような選択およびスクリーニン
グの方法論は当業者には周知である。
物理的方法および生化学的方法を使用して、本発明の遺伝子構築物を含む細胞
形質転換体を同定することも可能である。これらの方法としては、1)組換えDNA
インサートの構造を検出および決定するためのサザン分析またはPCR増幅；2)遺
伝子構築物のRNA転写産物を検出および試験するためのノーザンブロット、S-1RN
アーゼプロテクション、プライマー伸長または逆転写酵素-PCR増幅；3)このよう
な遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている場合には、酵素またはリ
ボザイムの活性を検出するための酵素アッセイ；4)遺伝子構築物の産物がタンパ
ク質である場合には、タンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット技術、免疫
沈降、または酵素結合イムノアッセイ；5)導入遺伝子構築物が発現した結果産生
される化合物の生化学的測定が挙げられるが、これらに限定されない。in situ
ハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色等の追加の技術を使
用して、特定の細胞、器官および組織における組換え構築物の存在または発現を
検出することもできる。これら全てのアッセイを行う方法は、当業者には周知で
ある。
5.2.4 NS5A またはPKR遺伝子産物の精製
生物学的に活性なNS5AまたはPKRを高レベルに産生する細胞を同定したら、こ
の細胞をクローニングして拡大増殖させ、これらのタンパク質を大量生産するの
に使用することができる。遺伝子産物は、当該分野で周知の技術（イムノアフィ
ニティー精製、高速液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフ法等が挙げら
れるが、これらに限定されない）を使用して精製することができる。遺伝子産物
が培養細胞によって分泌される場合には、培養培地からNS5AまたはPKRのポリペ
プチドもしくはペプチドを容易に回収することができる。
切断可能な融合タンパク質をコードするようにNS5AまたはPKRコード配列を遺
伝子操作した場合には、NS5AまたはPKRの精製は、アフィニティー精製技術を使
用して容易に実施することができる。例えば、異種ペプチドまたは異種タンパク
質に特異的な抗体を使用して、永続的な(durable)融合タンパク質を例えば、固
相表面やカラム等に捕捉することができる。連結部位を切断する適切な酵素で処
理することにより、NS5AまたはPKR部分を遊離させることができる。
ポリメラーゼ連鎖反応、トランスフェクションおよび発現されたタンパク質の
精製を用いてcDNAを容易に構築できるため、タンパク質の物理的特性や動力学的
特性の特性決定用に、少量であるが充分な量のNS5AまたはPKRを単離することが
できる。部位特異的突然変異誘発または天然に存在する突然変異配列を使用する
ことで、この系より、タンパク質の機能に及ぼす改変一次構造の影響を判定する
合理的なアプローチが得られる。切断可能なタンパク質のアミノ末端の上流にNS
5AまたはPKRのドメインを有する融合構築物と、それに対して反対の配置を有す
る構築物を遺伝子工学的に作製し、タンパク質の生物学的機能と精製能を妨害す
るとしても最も妨害が少ない融合構築物はどの融合構築物であるかを評価するこ
ともできる。
本発明のこの態様を利用して、NS5AまたはPKR配列と、精製に利用し得る結
合相手（例えば、イムノアフィニティーカラムを調製し得る任意の抗原）を有す
る第２のペプチドまたはタンパク質との間に、任意の切断部位または酵素切断基
質を遺伝子工学的に組み込むことができる。
5.3 NS5A タンパク質に対する抗体
NS5A遺伝子産物を規定する抗体は本発明の範囲内にあり、1つ以上のNS5A遺伝
子産物エピトープ（例えば、ISDR）を特異的に認識し得る抗体が挙げられる。こ
のような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト
化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリ
ーによって産生される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のいずれ
かのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗
体を、例えば、生物学的サンプル（血漿および血清が挙げられるが、これらに限
定されない）に含まれるNS5A遺伝子産物の検出に使用することができる。あるい
は、抗体を、NS5A遺伝子産物の活性を阻害する方法として使用してもよい。
特定の抗原に対する抗体の均一集団であるモノクローナル抗体は、培養中の連
続的継代細胞系によって抗体分子を産生させる任意の技術によって得ることがで
きる。この技術としては、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技術（1975，
Nature 256:495-497;および米国特許第4,376,110号）、ヒトB細胞ハイブリドー
マ技術（Kosborら，1983，Immunology Today 4:72;Coleら，1983，Proc Natl．A
cad．Sci．USA 80:2026-2030）、並びにEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら，1985
，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-9
6）が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE
、IgA、IgDおよびこれらの任意のサブクラスを含むどのようなクラスの免疫グロ
ブリンであってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまた
はin vivoで培養できる。
さらに、適切な抗原特異性を有するマウスの抗体分子由来の遺伝子を適切な生
物学的活性を有するヒトの抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすること
により「キメラ抗体」を産生する技術（Morrlsonら，1984，Proc．Natl．Acad．
Sci.，81:6851-6855;Neubergerら，1984，Nature，312:604-608;Takedaら，1985
，Nature，314:452-454）が利用できる。キメラ抗体は、異なる動物種から異な
る部分を誘導した分子であり、例えば、マウスmAbから誘導した可変領域とヒト
免疫グロブリンの定常領域を有するものである。
あるいは、一本鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第4,946,77
8号；Bird，1988，Science 242:423-426;Hustonら，1988，Proc．Natl．Acad．S
ci．USA 85:5879-5883;およびWardら，1989，Nature 334:544-546）を、NS5A遺
伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するように改変することもできる。一本鎖抗
体は、Fv領域のH鎖断片とL鎖断片をアミノ酸架橋で結合し、一本鎖ポリペプチド
を生成させることにより形成する。
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術で作製することができる
。例えば、このような断片としては、抗体分子のペプシン消化で生成し得るF(ab
')2断片とF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元して作製できるFab断片が挙げ
られるが、これらに限定されない。あるいは、望ましい特異性を有するモノクロ
ーナルFab断片を迅速かつ容易に同定するために、Fab発現ライブライーを構築し
てもよい（Huseら，1989，Science，246:1275-1281）。
5.4 NS5A とIFN誘発PKRとの相互作用を選択的に阻害する物質を同定するスクリ ーニングアッセイ
本発明は、ISDRを含有するウイルスタンパク質およびこれらのタンパク質とIF
N誘発PKRプロテインキナーゼとの相互作用を標的とする物質をスクリーニングす
るin vitroおよびin vivo方法に関する。
可能性のある物質を、翻訳に対するウイルスの作用を阻止もしくは緩和する能
力についてスクリーニングする方法は、NS5AがPKRと直接相互作用し、この相互
作用にはISDRとPKRの触媒ドメインとが必要であるという本発明者らの発見に基
づいて設計することができる。さらに、可能性のある物質を、ウイルスの作用を
阻止もしくは緩和する能力についてスクリーニングする方法は、NS5AがPKRの２
量体化ドメイン（アミノ酸244〜296）に結合し、その結果PKRの機能が阻害およ
び抑制されるという本発明者らの発見に基づいて設計することができる。
原則としては、これらの成分間における相互作用の妨害を検出するように、当業
者に公知の多くの方法を容易に改変することができる。従って、例えば、被験物
質に応答してPKRプロテインキナーゼの触媒活性が活性化されれば、その物質がN
S5AによるPKRの阻害を妨害する能力を有することが分かる。
スクリーニングは、ウイルスに感染させておいた無傷の細胞へ被験物質を添加
し、次いで、目的の成分に対するウイルスの作用を実証できる任意の手法で目的
の成分を検討することによって実施できる。あるいは、スクリーニングは、被験
物質をin vitro翻訳反応へ添加し、次いで、確立された分析を続けて行うことに
よって実施できる。もう一つの代案としては、上述の方法によって互いに相互作
用することが判明している精製されたまたは部分的に精製された成分を、被験物
質の存在下または不在下にて、これらの成分間の相互作用が正常に起こる条件下
に置き、相互作用を分析するために確立された手法を用いて被験物質の影響を評
価することができる。このアプローチでは、精製されたまたは部分的に精製され
た成分は、未感染細胞および感染細胞由来の抽出物を分画することで、またはク
ローニングされた遺伝子若しくはcDNAまたはそれらの断片を発現させ、必要によ
り発現物質を精製することで調製することができる。
in vitroにおける選択方法の広範囲なカテゴリー内では、複数の種類の方法が
被験物質のスクリーニングに特に簡便および／または有利である可能性が高い。
これらの方法としては、２つ以上の成分間の結合相互作用を測定する方法、相互
作用する成分の一つである酵素の活性を測定する方法、および成分のうちの一つ
を制御する条件下に置いた「レポーター」タンパク質（即ち、酵素または検出可
能なもしくは選択可能な他のタンパク質）の活性または発現を測定する方法が挙
げられるが、これらに限定されない。
２つ以上の成分間の結合相互作用は、様々な方法で測定することができる。一
つのアプローチは、検出が容易な標識で成分の一つを標識し、正常に相互作用す
る条件下で残りの成分と共存させ、結合標識成分を未結合標識成分から分離する
分離工程を実施して結合成分の量を測定するものである。結合反応に含まれる被
験物質の作用は、被験物質の存在下で結合する標識成分の量を被験物質の不在下
で結合する量と比較することで判定できる。
この種の手法における分離工程は、各種の方法で実施できる。一つのアプロー
チでは、結合反応前に標識成分に対する結合相手（の一つ）を固相上へ固定化し
、結合反応後に固相を洗浄して未結合標識成分を除去することができる。結合相
手の固相への結合は、当業者に公知の各種の方法で実施でき、例として化学的な
架橋、プラスチック表面への非特異的な接着、固相へ結合させた抗体との相互作
用、結合相手に結合させたリガンド（ビオチン等）と固相に結合させたリガンド
結合タンパク質（アビジンまたはストレプトアビジン等）との間の相互作用など
が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、分離工程は、溶液中で標識成分をその結合相手と相互作用させた後
に実施することもできる。標識成分とその結合相手のサイズが異なることでこの
ような分離が可能な場合には、結合反応の産物を限外濾過器へ通過させることで
分離を達成できる。限外濾過器の細孔は、未結合標識成分は通過させるが、結合
相手または結合相手に結合した標識成分は通さない。分離は、標識成分の結合相
手を溶液から捕捉できる任意の試薬（例えば、結合相手に対する抗体、予め結合
相手に結合させておいたリガンドと相互作用可能なリガンド結合タンパク質など
）を使用して達成することもできる。
酵素活性の測定に基づく試験方法は、個々の場合で酵素の特徴に従って実施す
る。上述したように、ウイルスの翻訳作用への関与について様々な酵素活性を判
定でき、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシラーゼ(glycosylase)、デグリコ
シラーゼ(deglycosylase)、トランスフェラーゼ、リパーゼ、デオキシリボヌク
レアーゼ、リボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、シンセターゼ、ポリメラーゼ等、
並びに上述した他の酵素活性を有するものが挙げられるが、これらに限定されな
い。一般に、酵素活性の測定には、他の物質の存在下で反応生成物を測定する能
力が必要であり、多くの場合、その反応生成物を反応基質から識別または分離す
る能力が必要である。反応生成物の測定に使用し得る方法としては、放射性標識
または他の標識で標識した原子もしくは基の移行または取り込みの測定、生成物
の濃度の分光光度測定または比色測定、発光または化学発光反応からの光出力の
測定、蛍光生成物からの蛍光の測定、イムノアッセイ、他の免疫化学的手法、お
よび他の競合結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。酵素活性は
、
上述した手法のいずれかを使用して、目的の反応生成物を基質もしくは補因子と
する二次反応の生成物を検出することでも測定できる。
例えば、無色の色素基質から着色生成物が生じるか、または生成物の吸収スペ
クトルが基質の吸収スペクトルと異なる場合には、生成物のみの吸光度を測定す
る波長を選択できるため、多くの場合において酵素反応の生成物は、反応混合物
の他の成分から生成物を分離しないで検出することができる。イムノアッセイ、
他の免疫化学的手法および他の競合結合アッセイも、初めに目的の生成物を分離
しなくても実施できる場合が多い。
他のケースでは、測定する前に、反応混合物の他の構成成分から該生成物を分
離するための分離ステップを追加することが必要な場合もある。このような場合
、この必要な分離ステップは、さまざまな手法によって行うことができる。例え
ば遠心分離、トリクロロ酢酸沈殿法、エタノール沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿
法、フィルター結合法、他の分別沈殿法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、分別抽出、等電点電気泳動法、電気泳動法、等速
電気泳動法等が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルスが翻訳に及ぼす作用に関与する酵素の活性を測定する方法以外にも、
ウイルスの作用に関与する成分が「レポーター」タンパク質（すなわち酵素また
は他の検出可能なもしくは選択可能なたんぱく質）の活性または発現を制御する
ように構成された試験方法を使用することもできる。この場合、例えばキナーゼ
がウイルスの作用に関与していた場合、キナーゼによる特定のタンパク質のリン
酸化が、そのタンパク質もしくはそのタンパク質により制御される他のタンパク
質を活性化または阻害するような試験方法を、構成することができる。例えば酵
母の場合、GCN2タンパク質による（またはGCN2の代わりとなる哺乳動物のPKRキ
ナーゼによる）eIF2-αのリン酸化は翻訳開始を阻害し、続いてGCN4タンパク質
の合成を増加させ、その後アミノ酸の生合成に関与する他のタンパク質の合成を
誘導する。「レポーター」タンパク質は、遺伝子レベルでGCN4タンパク質に簡単
に融合することができ、その結果GCN2または咄乳動物のPKRにより触媒された初
期リン酸化によって、これらのレポーターの合成が効果的に誘導される。
同様の方法を用いて、ウイルスが翻訳に及ぼす作用に関与し得る他の様々な成
分の活性の被検物質によるモジュレーションを検出することが可能である。例え
ば、プロテアーゼに対する被験物質の効果は、そのプロテアーゼの標的であるレ
ポータータンパク質のin vitro反応において残存物を追跡することにより、モニ
タリングすることができる。同様に、ヌクレアーゼに対する被験物質の効果は、
その反応に提供された好適に構成されたコード配列から翻訳されたレポータータ
ンパク質のin vitro翻訳反応またはin vitro転写翻訳反応におけるその出現を追
跡することにより、モニタリングすることができる。
このようなアッセイでレポーターとして使用するのに適したタンパク質として
は、簡単にアッセイされる酵素、例えばβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ
、β-グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、
および分泌された胚性アルカリホスファターゼ；イムノアッセイが簡単に利用可
能であるタンパク質、例えばホルモンやサイトカイン；細胞に選択的増殖の利点
を付与するタンパク質、例えばアデノシンデアミナーゼ、アミノ-グリコシドホ
スホトランスフェラーゼ（neo遺伝子の産物）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハ
イグロマイシン-Bホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（HAT培地とと
もに使用する場合）、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
（XGPRT）、および栄養要求株から失われている生合成能を提供するタンパク質
；細胞に増殖不利を付与するタンパク質、例えば（ブロモデオキシウリジンを含
む培地とともに用いる場合の）チミジンキナーゼ、および（5-フルオロオロチン
酸とともに使用する場合の）オロチジン-5'-ホスフェートデカルボキシラーゼな
どの、非毒性基質を毒性産物に変える酵素；および毒性のあるタンパク質、例え
ばリシン、コレラ毒素またはジフテリア毒素が挙げられるが、これらに限定され
ない。
これまでに記載された被験物質選択方法の多くは、in vitro反応においてこれ
らの物質が２以上の成分間の相互作用に与える影響力を調べることを含んでいた
。in vitro反応ではなく細胞内においてこれらの相互作用成分を互いに接触させ
ることも可能である。この方法では、成分の一部または全体をコードするコード
配列を選択した細胞型に導入する。この方法で用いるコード配列としては、
クローン化した遺伝子もしくはcDNA、これらのうちいずれかの断片、ポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）により増幅した断片、天然RNA、あるいは転写されたRNAなど
が挙げられる。この方法の幾つかの変法が可能である。１つの変法では、第１成
分のコード領域が、この第１成分と相互作用する成分を含むことが分かっている
細胞の中に導入される。こうして例えば、ウイルス成分のコード配列は、問題と
なるウイルスが感染する通常の標的である細胞の中に導入される。物質を試験し
て、該コード配列が導入された細胞内でウイルス成分の作用をブロックするもの
を選択する。他の変法では、互いに相互作用する２以上の成分のコード配列を細
胞の中に導入し、これらの成分間の相互作用を調節する能力について物質を試験
する。この相互作用は、この目的に適するものとして以前に確立された方法によ
って追跡する。該コード配列が導入される細胞は、問題となるウイルス感染で通
常標的となるものであってもよい。あるいは有効に、該細胞は、増殖、操作、お
よび試験しやすいもの（例えば酵母細胞）であってもよい。実際に、異種細胞に
おいて翻訳制御機構を再構築することは、関与する成分同士間の相互作用が、こ
れらの成分がその通常の環境にあるときよりも研究しやすい点で、著しく有利で
ある。特に酵母の場合、利用可能な強力な遺伝子的アプローチにより、高等真核
生物由来の遺伝子の酵母相同体は、この高等真核生物において対応する遺伝子を
同定することができるよりも迅速に、同定し単離することができるようになる。
先の記述より、当業者であれば、翻訳に与えるウイルスの作用に関与する成分
の同定、これらの成分間の相互作用の特徴付け、およびこれらの成分間の相互作
用を緩和するもしくは破壊する化合物を選択するためのスクリーニングテストの
実施における、各段階で、種々の方法から選択することができることが明らかで
あろう。
以下に、本発明に有用な具体的なスクリーニングおよび関連するプロトコール
の要点をより詳細に記す。PKRプロテインキナーゼのISDR阻害を発現するウイル
スタンパク質を妨げるのに有効な薬剤をスクリーニングするための方法を記載す
る。１つの詳細な実施例として、選択された系は、宿主細胞のインターフェロン
誘導型二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼの活性を妨げるウイルス阻害剤を該
ウイルスが中で産生することができる系である。しかし、先述のとおり、この
実施例は本発明において非限定的なものであり、広範な本発明の単なる例示的な
ものである。
この方法は一般に、ウイルス阻害剤がプロテインキナーゼの活性化を妨げるの
に有効な条件下で、プロテインキナーゼ、ウイルス阻害剤および検査する化合物
をインキュベートするステップと、該混合物の干渉を検査するステップとを含む
。本発明は、以下に詳細に記載するように、４つの一般的な実施形態を想定する
。
5.4.1. in vitro スクリーニングアッセイ
１つの例において、この方法は、PKRプロテインキナーゼに結合して二本鎖RNA
（dsRNA）によりその活性化をブロックすることができるウイルス阻害剤を産生
するウイルスの、宿主細胞内における複製を阻害するのに有効な化合物をスクリ
ーニングするために使用される。ここで、インキュベーションステップは、該ウ
イルス阻害剤をプロテインキナーゼに結合させるのに有効な条件下において、該
混合物をインキュベートすることを含み、検査ステップは、結合したウイルス阻
害剤について該プロテインキナーゼを検査することを含む。
インキュベーションは、例えば液相中で行うことができ、検査ステップは該混
合物をフィルターに通過させることを含む。このフィルターは、該ウイルス阻害
剤がプロテインキナーゼに結合したときだけ該阻害剤を保持するものである。
あるいは、プロテインキナーゼを固相支持体に結合させ、ウイルス阻害剤をレ
ポーターで標識し、そして該固相支持体に結合したレポーターの量を測定するこ
とにより検査ステップを行っても良い。
あるいは、ウイルス阻害剤への結合の不在下で、プロテインキナーゼが自己リ
ン酸化される条件下でインキュベートを行い、PKRキナーゼのリン酸化の程度を
測定することにより検査ステップを行ってもよい。
第２の例において、インキュベーションステップは、ウイルス阻害剤の不在下
で、PKRキナーゼを活性化させるのに有効な条件下において該混合物をインキュ
ベートすることを含み、該検査ステップは、該阻害剤の存在下でPKRキナーゼの
活性を検査することを含む。
インキュベーションは、例えば精製したまたは部分的に精製したPKRキナーゼ
調製物を用いて行うことができ、検査ステップは、キナーゼの自己リン酸化、ま
たはキナーゼに提供されたeIF2-αもしくはヒストン基質のリン酸化を測定する
ことを含む。
あるいは、インキュベーションは、PKRキナーゼを含むin vitro翻訳混合物に
おいて行うことができ、検査ステップは、特定のmRNAの翻訳により産生されたレ
ポーターポリペプチドの量を測定することを含む。mRNAは、その翻訳がPKRキナ
ーゼの活性化により低減されるもの、好ましくは、その翻訳が増加するもの（例
えばその5'-非翻訳リーダーが酵母GCN4遺伝子に由来するキメラRNAなど）であり
うる。
第３の例において、この方法は、活性化した状態でプロテインキナーゼの活性
化をブロックするかまたは活性化したキナーゼを阻害することができる宿主細胞
成分を活性化するために有効なウイルス阻害剤を産生するウイルスの複製をブロ
ックするのに有効な化合物をスクリーニングするために使用される。ここで、形
成された混合物は（活性型の）宿主細胞成分を含み、インキュベーションステッ
プは活性型成分の不在下で、プロテインキナーゼが活性化される条件下に実行さ
れ、検査ステップは、プロテインキナーゼ活性の阻害について該混合物を検査す
ることを含む。あるいは、形成された混合物は、非活性型宿主細胞成分、および
該宿主細胞成分を活性化させるウイルス阻害剤を含み、インキュベーションステ
ップは、プロテインキナーゼが活性化される条件下にウイルス阻害剤および活性
型宿主細胞成分の不在下で行われ、検査ステップは、プロテインキナーゼ活性の
阻害について該混合物を検査することを含む。
5.4.2. in vivo スクリーニングアッセイ
また本発明は、宿主細胞内においてウイルス複製を阻害するのに有効な化合物
を同定するためのin vivoスクリーニングアッセイに関する。これらのアッセイ
では、試験化合物を加える宿主細胞は、第５．２節で記載したように、NS5Aおよ
びPKRまたはその断片の両方を発現するように遺伝子操作されたものでありうる
。宿主細胞内におけるNS5AおよびPKRの発現は、一過性のもの、誘導性または構
成的なもの、あるいは安定なものであってもよい。NS5A／PKRの相互作用を
妨害する試験化合物の能力は、該試験化合物を宿主細胞に加えてPKR活性を直接
測定することにより（すなわち既知の基質のPKRキナーゼアッセイにより）；ま
たは間接的に（すなわちその遺伝子発現が活性化されたPKRキナーゼの存在に依
存するレポーター遺伝子のコトランスフェクションにより）測定することができ
る。本発明のスクリーニング方法のために使用することができる種々の宿主細胞
には、組織培養細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、および細菌が含まれるが、これ
らに限定されない。各細胞型は、それぞれ利点および欠点を有する。培養した肝
細胞などの哺乳動物細胞は、本発明のアッセイを行うのに好適な細胞型であるが
、これらの細胞型はときとして培養することが難しい。細菌および酵母は、比較
的培養しやすいが、哺乳動物細胞とは異なる様にタンパク質をプロセシングする
。in vivoスクリーニング法は、酵母宿主細胞発現系について言及することで説
明するつもりであるが、この方法の原理は、第５．２節に記載したような遺伝子
操作されたあらゆる宿主細胞に適用することができる。
本発明の例示的な実施形態において、ウイルス阻害剤またはウイルス活性化阻
害剤は、活性型PKRキナーゼの存在下においてレポーターポリペプチドの発現を
増加させるように構築される酵母細胞の中で発現し、検査ステップは、該レポー
ターポリペプチドの発現の増大についてこの酵母細胞を検査することを含む。
酵母タンパク質のうち、翻訳制御に関与するものの１つは、タンパク質GCN２
である。このタンパク質は、帯電していないtRNAの結合により活性化されるキナ
ーゼであり、このtRNAは、アミノ酸の供給不足のときに蓄積する。この活性化さ
れたタンパク質は、開始因子eIF2のαサブユニットをリン酸化することにより、
酵母の翻訳レベルを阻害する。GCN２活性化の他の結果は、酵母GCN４タンパク質
の産生の増大であり、これにより、合成アミノ酸の同化経路が活性化される。
in vivoでのスクリーニングのために本発明で使用される構築物は、その中で
調節プロモーターの制御下においてGCN２遺伝子が哺乳動物PKR遺伝子で置き換え
られた酵母細胞である。この細胞は、以下に記載するようにさらなる修飾も含む
。酵母へのPKR遺伝子の導入は、選択されたコード配列を酵母へ導入するための
標準的な組換え技術を用いて実施することができる。つまり、PKR遺伝子はダ
ウンレギュレーション可能プロモーターの制御下におかれ、細胞選択はダウンレ
ギュレーションされた条件下で生じる。これは、おそらく内因性dsRNAにより、
酵母細胞の中でPKRタンパク質が構成的に活性化されるためであり、あまりに高
すぎるレベルで発現される場合は、PKRタンパク質ばその活性化した状態におい
て細胞の翻訳を阻害する。
つぎに、酵母細胞はさらに、活性化されたPKR酵素の存在にその産生が依存す
るレポーターポリペプチドのレベルを調べることにより、PKRの調節を試験でき
るように、構築される。このようなレポーターは、GCN4酵母遺伝子に融合された
β-gal遺伝子から産生することができる。GCN4酵母遺伝子は、GCN２が活性化さ
れた条件下で発現するようになり、GCN２がPKRで置き換えられた酵母細胞の中で
PKRリン酸化系の制御下にあることが証明された。かくして、活性化されたPKRの
存在は、一般には酵母の翻訳停止をもたらすが、GCN４/β-gal融合タンパク質は
産生増加へと至らせる。この融合タンパク質の発現は、β-gal活性を測定するこ
とにより簡単に測定することができる。
スクリーニングシステムは、PKRタンパク質の活性化により、宿主細胞が細胞
の翻訳を停止しようとするのに対するウイルス病原体の対抗防衛を破壊するのに
有効な薬物をスクリーニングするように設計される。ウイルスの対抗防衛として
は、なかでも（a）PKR上の結合部位を占有して、dsRNAがPKRに結合してこれを活
性化するのを妨げるVA1、EBER−１、またはTARウイルス阻害剤RNA、（b）PKRの
活性化を妨げたり活性化酵素を失活させたりするのに有効な細胞成分を誘導また
は活性化するウイルス（例えばインフルエンザウイルス）の能力、（c）PKRの活
性化もしくは活性をブロックするレオウイルスσ３タンパク質やワクシニアウイ
ルスK3LおよびE3Lタンパク質などのウイルスタンパク質、または（d）ポリオウ
イルスがPKRキナーゼを分解するのに使用する複合体などの、細胞成分とウイル
スRNAとの複合体が挙げられる。
ウイルス阻害剤の場合、スクリーニングに用いる酵母細胞は、さらに、誘導可
能プロモーターの制御下で該ウイルス阻害剤をコードする遺伝子を含むように構
築される。ウイルス阻害剤が発現しない（しかしPKRタンパク質は発現する）非
誘導増殖条件下では、おそらく前述のように内因性dsRNAによりPKRタンパク質
が活性化され、活性化されたPKRの存在は、比較的高い測定レベルのGCN４/β-ga
l融合タンパク質により示される。誘導増殖条件下では、例えば増殖培地がウイ
ルス阻害剤の発現を制御する誘導可能プロモーターのための誘導物質を含む場合
、細胞は、ウイルス阻害剤の存在により低レベルの活性化PKRを示し、これは比
較的低レベルのGCN４/β-gal融合タンパク質により示される。潜在的な抗ウイル
ス薬は、ウイルス阻害剤の誘導条件下でGCN４/β-gal融合タンパク質の測定レベ
ルに対するその影響力を評価することにより試験される。比較的高レベルの融合
タンパク質を合成させるこれらの薬剤が選択される。というのはこれらの薬剤は
ウイルス阻害剤が内因性二本鎖RNAによるPKRの活性化を妨げるのを防ぐからであ
る。
PKRキナーゼの活性化を妨げるまたは活性化されたキナーゼを阻害するように
ウイルスにより誘導または活性化された細胞成分の場合、この細胞成分をコード
する遺伝子は、（上記ウイルス阻害剤RNA遺伝子のかわりに）誘導可能プロモー
ターの制御下でスクリーニング用に使用される酵母細胞の中に配置される。つぎ
にこの酵母菌株は、ウイルス阻害剤について主に先に述べたスクリーニングで使
用される。このように、非誘導増殖条件下ではこの細胞成分は発現せず、比較的
高レベルのGCN４-β-gal融合タンパク質が観察される。これは、内因性二本鎖RN
Aにより活性化されたPKRの存在を反映している。誘導増殖条件下では、GCN４/β
-gal融合タンパク質のレベルは低く、該細胞成分によりPKRの活性化または活性
が阻害されたことを反映している。潜在的な抗ウイルス薬は、該細胞成分の誘導
条件下でGCN４/β-gal融合タンパク質の測定レベルに対するその影響力を評価す
ることにより試験する。その際、比較的高レベルの融合タンパク質を合成させる
薬剤が選択される。
同様な方法を、細胞成分とPKRキナーゼを分解するウイルス成分との複合体の
場合に使用する。この場合、この酵母菌株はさらに、誘導可能制御下で細胞成分
とウイルス成分の両方のコード遺伝子を含むように構築され、スクリーニングは
主に先に記載したように行われる。
以下の実施例は、上記のスクリーニング方法を例示するものであるが、本発明
の範囲を制限するものではない。５．５ HCVの治療におけるNS５Aのターゲッティング
NS5AをターゲッティングしてNS5Aの活性を阻害するため、またはNS5AとIFN誘
導型タンパク質との間の相互作用を阻害し、これにより、HCV感染を阻害するた
めに、種々の技術および組成物を使用することができる。
例えば、本発明に使用される化合物は、NS5Aの活性を阻害するため、またはNS
5AとIFN誘導型PKRとの間の相互作用を妨げるために、NS5Aをターゲティングする
、あらゆる化合物を包含する。例えばNS5AまたはISDRを中和する抗体が挙げられ
るが、これに限定されない。化合物の他の例としては、ペプチド（IFN誘導型PKR
との相互作用に必要なNS5Aの領域を表すペプチドなど、例えばISDR）、ホスホペ
プチド、小さな有機分子もしくは無機分子、または抗体（例えばポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、
一本鎖抗体、Fab発現ライブラリー断片、F(ab')2発現ライブラリー断片、Fab発
現ライブラリー断片、およびこれらのエピトープ結合断片）などが挙げられるが
、これらに限定されない。このような化合物の有効用量決定法および投与法につ
いては、以下第５．６節に記載する。
さらに、本発明に使用され得る化合物には、NS5A活性を抑制する細胞内薬物、
つまりIFNにより誘導されたPKRがNS5Aと相互作用するのを防ぐ競合リガンドが含
まれる。
本発明に従って、NS5AとIFN誘導型タンパク質と間の相互作用を阻害するため
に、遺伝子治療を使用することもできる。NS5A、とくにISDRとその細胞標的との
間の相互作用を破壊する化合物の中には、アンチセンス、リボザイム、および三
重らせん分子がある。このような分子は、HCVに感染した宿主細胞内において、
標的遺伝子であるNS5Aの発現を阻害するように設計される。アンチセンス、リボ
ザイムおよび/又は三重らせん分子の製造技術および使用技術は当業者には周知
であり、図１Aに示したようなISDRのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列に関して設計することができる。
アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的のmRNAにハイブリダイズし、タンパク
質翻訳を妨げることによってmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。
アンチセンスDNAについては、翻訳開始部位(例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオ
チド配列の-10領域と+10領域との間)から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ま
しい。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できるRNA酵素分子である。(詳細につ
いては、Rossi，J.，1994，Current Biology 4:469-471を参照)。リボザイム作
用の機構は、リボザイム分子の相補的標的RNAに対する配列特異的ハイブリダイ
ゼーション、次いでヌクレオチド鎖内分解的(endonucleolytic)切断を伴う。リ
ボザイム分子の組成は、標的遺伝子mRNAに対して相補的な配列を１つ以上、およ
びmRNAを切断できる周知の触媒配列を含まなければならない。この配列について
は、その全内容が参考として本明細書に組み込まれる米国特許第5,093,246号を
参照されたい。このように、本発明の範囲には、標的遺伝子タンパク質をコード
するRNA配列のヌクレオチド鎖内分解的切断を特異的かつ効率的に触媒する、遺
伝子操作で作製されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。
全ての可能性のあるRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、まず目的の分
子を、GUA、GUU、およびGUCを含むリボザイム切断部位について走査することに
よって同定される。いったん同定されたら、この切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15から20リボヌクレオチドの短いRNA配列は、このオリゴヌクレオ
チド配列を不適合にする、例えば二次構造などの予測できる構造的特徴について
評価される。候補となる配列の適合性は、リボヌクレアーゼプロテクションアッ
セイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズし易さを試験する
ことによっても評価できる。
転写を阻害するための三重らせん形成に使用する核酸分子は、一本鎖で且つデ
オキシヌクレオチドで構成されていなければならない。これらのオリゴヌクレオ
チドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対規則に従って三重らせん形成を促
進するように設計されなければならず、この規則は通常プリンまたはピリミジン
のいずれかの相当な大きさの広がり(stretch)が二重らせんの一方の鎖上に存在
することを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンを基本とすることができ
、これは得られる三重らせんの３本の会合鎖を横切ってTATおよびCGC+トリ
プレットを生じる。ピリミジンの豊富な分子は、二重らせんの一本鎖のプリンの
豊富な領域に対する塩基相補性を該鎖と平行な方向で提供する。さらに、プリン
の豊富な(例えば、Ｇ残基の広がりを含む)核酸分子を選択してもよい。これらの
分子は、GC対に富むDNA二重らせんと共に三重らせんを形成し、その場合標的と
する二重らせんの一本鎖にプリン残基のほとんどが位置づけられて、該三重らせ
んの三本の鎖を横切ってGGCトリプレットを生じる。
あるいはまた、三重らせん形成の標的となり得る可能性のある配列は、いわゆ
る「スイッチバック(switchback)」核酸分子を作ることによって増やすことがで
きる。スイッチバック分子は、5'−3'、3'−5'が交互し、二重らせんのまず一方
の鎖と、次いで他方の鎖と塩基対合するように合成される。これにより、プリン
またはピリミジンのいずれかの相当な長さの広がりが二重らせんの一方の鎖に存
在する必要がなくなる。
本明細書中に記載のアンチセンス、リボザイム、および/または三重らせん分
子を変異型遺伝子発現を阻止するために利用する実例において、この方法は、正
常な標的遺伝子の対立遺伝子により生成されたmRNAの転写(三重らせん)および/
または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を非常に効率的に減少または阻止するの
で、正常な標的遺伝子産物の存在する濃度が、正常な表現型に必要な濃度よりも
低くなる可能性がある。この場合、従って実質的に正常なレベルの標的遺伝子活
性を確実に維持するために、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチ
ドをコードし且つ発現する核酸分子が、アンチセンス、リボザイム、または三重
らせん処置の何を利用しようとそれらに影響を受けやすい配列を含まないすでに
記載されているような遺伝子治療法により細胞に導入される。あるいはまた、標
的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする実例においては、正常な標的遺伝子タ
ンパク質を同時に投与して、標的遺伝子活性の必要レベルを維持することが好ま
しい。
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、ならびに三重らせん分子は
、当該分野において公知のDNAおよびRNA分子の合成方法のいずれによっても調製
できる。これらには、当該分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド
およびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法が挙げられ、例
えば固相ホスホルアミダイト化学合成などがある。あるいはまた、アンチセンス
RNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写によってRNA分子を生
成することができる。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモー
ター等の適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込まれた広範な種類のベク
ターに組み込むことができる。あるいはまた、使用するプロモーターに応じてア
ンチセンスRNAを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスcDNA構築物を細
胞系に安定して導入することができる。
細胞内安定性および半減期を上昇するために、DNA分子に対して種々の周知の
修飾を導入することができる。可能な修飾として、リボヌクレオチドまたはデオ
キシヌクレオチドのフランキング配列を該分子の5'端および/もしくは3'端に付
加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格においてホスホジエス
テラーゼ結合の代わりにホスホロチオエートもしくは2'O-メチルを使用すること
が挙げられるが、これらに限らない。
5.6 医薬製剤および投与方法
本発明は、ISDR含有タンパク質を介入の標的として使用するウイルス感染の治
療のための医薬組成物および治療様式において使用される、本発明のスクリーニ
ング法により同定される新規の抗ウイルス薬を包含する。本発明の一実施形態に
よれば、本発明のスクリーニングアッセイにより同定される新規の抗ウイルス薬
は、他の公知の抗ウイルス薬と組み合わせてウイルス感染を治療するために使用
してもよい。
5.6.1 NS5A 阻害剤と組み合わせて使用する抗ウイルス薬
本発明によれば、本発明のスクリーニング法により同定される新規の抗ウイル
ス薬は、得られる抗ウイルス効果を向上するために、その他の治療薬と組み合わ
せて使用することができる。好ましくは、NS5A阻害剤をその他の抗ウイルス薬と
組み合わせて使用する。本発明の他の実施形態において、PKRのNS5A阻害が無効
になるようなレベルまでIFN発現を誘導する薬剤を、その他の抗ウイルス薬と組
み合わせて使用してもよい。NS5A阻害剤と共に使用できるこのような追加の抗ウ
イルス薬としては、ウイルス複製に関わる異なる標的分子に対して機能する抗ウ
イルス薬(例えば、優先的翻訳の阻害剤)；ウイルス伝播に関わる異な
る標的分子に対して作用する抗ウイルス薬；同じ分子の異なる遺伝子座に対して
作用する抗ウイルス薬；ならびにウイルス耐性の発生を防ぐまたは減少する抗ウ
イルス薬が挙げられるが、これらに限らない。当業者であれば、上記活性様式を
示す広範な種類の抗ウイルス治療を知っているであろう。
本発明の一実施形態では、本発明のスクリーニング法により同定される新規抗
ウイルス薬を、IFN治療と組み合わせて使用する。また、本発明のスクリーニン
グ法によって同定された抗ウイルス薬を、IFN発現を誘導する外因性薬剤または
内因性薬剤と組み合わせて使用してもよい。さらに別の実施形態によれば、ウイ
ルス生活環に必要な２つの異なる分子を標的とするために、NS5Aの阻害剤を優先
的翻訳の阻害剤と組み合わせて使用する。
上記抗ウイルス治療と組合わせたNS5A阻害剤の潜在的な治療効力を評価するた
めに、これらの組合わせを当該分野において公知の方法により抗ウイルス活性に
ついて試験した。
本発明の化合物は、HCV感染に伴う種々の症状を治療または緩和するような用
量で、単独で、または適切な担体または賦形剤と混合して製薬的組成物としてヒ
ト患者に投与できる。さらに、治療上有効な用量とは、HCV感染を阻害するのに
十分な化合物の量を指す。治療上有効な用量をそのまま投与するか、または補助
的治療としてHCV感染またはそれに伴う疾患のためのその他の治療と組合わせて
投与してもよい。本願の化合物を処方および投与するための方法は、“Remingto
n's Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co.，Easton，PAの最新版に記
載されている。
5.6.2 投与経路
適切な投与経路には、例えば、経口投与、直腸投与、粘膜経由投与、または腸
投与；筋内注射、皮下注射、骨髄内注射、髄腔内注射、直接心室内注射、静脈注
射、腹腔内注射、鼻内注射、または眼内注射などの非経口送達が挙げられ、また
任意にデポー製剤または持続放出性製剤としてもよい。
さらに、本発明の薬剤は、例えば肝臓へ標的指向されたリポソーム等の標的薬
剤送達系に入れられて投与してもよい。リポソームは肝細胞を標的とし、肝細胞
に選択的に取り込まれる。
5.6.3 組成物/製剤
本発明の医薬組成物は、それ自体で既知の手法(例えば、従来の混合、溶解、
糖衣製造、浮揚(levitating)、乳化、カプセル化、包括(entrapping)、または凍
結乾燥のプロセス)で製造することができる。
従って、本発明に使用する医薬組成物は、活性化合物を医薬的に使用可能な調
製物に加工し易くする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学上許容可能な
担体を使用して従来通りに処方してもよい。適切な処方は、選択される投与経路
に依存する。
注射の場合には、本発明の薬剤は、水溶液、好ましくは生理学上適合性のある
緩衝液(ハンクス溶液、リンガー溶液または生理的食塩水緩衝液など)に加えて処
方できる。粘膜経由投与の場合には、浸透すべき障壁(barrier)に適した浸透剤
を製剤に加える。このような浸透剤は、通常当該分野において知られている。
経口投与の場合には、活性化合物を、当業者に周知の製薬上許容可能な担体と
組合わせることにより化合物を容易に処方できる。
そのような担体は、治療患者による経口摂取のために、本発明の化合物を、錠
剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液にする
ことを可能にする。経口用途のための医薬調製物は、固体賦形剤として得られ、
任意に得られた混合物を摩砕し、所望に応じて適切な補助剤を加えてから、微粒
混合物を加工して錠剤または糖衣コアを得る。適した賦形剤は、特に、ラクトー
ス、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖；例えばトウモロ
コシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン
、ゴムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロー
ス、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリ
ドン(PVP)等のセルロース調製物などの充填剤である。所望であれば、架橋ポリ
ビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩(例えばアルギン酸
ナトリウム)などの崩壊剤(disintegrating agent)を添加してもよい。
糖衣コアには適切なコーティングを施す。このためには、濃縮糖液を使用して
もよく、これには任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボ
ポルゲル(carbopol gel)、ポリエチレングリコール、および/または二酸化
チタン、ラッカー溶液、ならびに適した有機溶剤または溶剤混合液が含まれても
よい。染料または色素を錠剤または糖衣コーティングに添加して、異なる活性化
合物用量の組み合わせのものを識別したり特徴づけてもよい。
経口的に使用できる医薬調製物には、ゼラチンからなるプッシュフィット(pus
h-fit)カプセル、ゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤
からなる軟質の封入カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、活性
成分を、ラクトース等の充填剤、デンブン等の結合剤、および/またはタルクま
たはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ならびに任意に安定剤と共に混合し
たものを含んでもよい。軟質カプセル中で、活性化合物は、脂肪油、液体パラフ
ィン、または液体ポリエチレングリコール等の適した液体に溶解または懸濁され
てもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用の製剤は全て、そのよ
うな投与に適した用量でなければならない。
口腔投与の場合には、組成物は従来の手法で処方された錠剤または舐剤の形態
でもよい。
吸入による投与の場合には、本発明において使用される化合物は、適切な推進
剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適したガス)を使用して、
圧縮パックまたは噴霧器からエアロゾールスプレー状の形態で都合よく送達され
る。圧縮エアロゾールの場合、弁を取りつけることによって用量単位を決定して
、計量用量だけ送達することができる。呼吸器または注入器において使用される
例えばゼラチンからなるカプセルおよびカートリッジは、上記化合物と、ラクト
ースまたはデンブン等の適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように処方されて
もよい。
化合物を、例えば大量投与注射または連続注入のような注射による非経口投与
用に処方することができる。注射用の製剤は、保存剤を加えて、例えばアンプル
のような一回量ずつの形態で、または複数回用量容器に入れて提供される。組成
物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取って
よく、また、懸濁剤、安定剤および/または分散剤のような処方薬を含んでいて
もよい。
非経口投与用の医薬製剤には、水溶性の形態の活性化合物の水溶液が含まれる
。また、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として調製されてよい
。好ましい親油性溶媒または賦形剤には、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイ
ン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリボソー
ムが含まれる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含
んでいてもよい。任意に懸濁液は、必要に応じて適当な安定剤、または化合物の
溶解度を増加させて非常に高濃度の溶液を調製することを可能にするような薬剤
を含んでいてもよい。
あるいはまた、活性成分は、粉末の形態で提供され、使用前に適当な賦形剤、
例えば、無菌の発熱物質を含まない水と混合するようにしてもよい。
また、化合物は、坐剤または保持浣腸(retention enemas)のような直腸用の組
成物として処方され、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通
常坐剤に用いられる基剤を含んでいてもよい。
先に記載した製剤に加えて、化合物をデポ調製物として処方してもよい。この
ような長時間活性な製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋内に）または筋肉
内注射によって投与することができる。そのため、例えば、化合物は、適当な高
分子または疎水性の材料（例えば、許容される油中の乳濁液のような）またはイ
オン交換樹脂と共に処方されるか、または、例えば溶解度の低い塩のような、溶
解度の低い誘導体として処方される。
リポソームと乳濁液は、疎水性の薬物を送達する賦形剤または担体の例として
よく知られている。ジメチルスルホキシドのようなある種の有機溶媒も用いるこ
とができるが、通常毒性の危険性が大きくなる。さらに、治療薬を含む固体の疎
水性ポリマーの半透性のマトリックスのような徐放性システムを用いて化合物を
送達することもできる。さまざまな徐放性材料が確立されており、それらは当業
者に周知である。徐放性カプセルは、それらの化学的な性質に応じて、化合物を
数週間から100日にわたり放出することができる。治療用の試薬の化学的な性質
および生物学的な安定性に応じて、さらにタンパク質の安定化に対する方策を実
施してもよい。
また、医薬組成物は、適当な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでい
てよい。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カ
ルシウム、さまざまな糖、でんぷん、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリ
エチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。
NS5AとIFN-誘導PKRの間の相互作用の阻害剤として同定された本発明の化合物
の多くは、製薬上互換性のある対イオンとの塩として提供することができる。製
薬上互換性のある塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸
等が含まれるがこれらに限定されるものではない多くの酸、または塩基で形成さ
れる。塩は水性溶媒または相当する塩基の遊離型である他のプロトン性溶媒に対
してより溶解度が大きい傾向がある。製薬上許容可能な塩、担体または賦形剤の
例は当業者に周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，18t
h Edition，A.R．Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990に記
載されている。このような塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウ
ム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、酢酸、クエン
酸、酒石酸、リンゴ酸の塩、等が含まれるが、これらに限定されるものではない
。
5.6.4 有効投与量
本発明における使用に適した医薬組成物は、活性成分がその目的を達成するの
に有効な量で含まれている組成物を含む。より詳細には、治療上有効な量とは、
治療される患者に存在する症状が悪化するのを防ぐか、またはこれを軽減するた
めに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書に記載された詳細な開
示を参照すれば、当業者が容易に実施することができる。
本発明の方法において使用するすべての化合物について、最初に細胞培養アッ
セイから治療上の有効量を概算することができる。この知識を利用してヒトにお
ける有用な用量をより精密に決定することができる。
治療上の有効量は、患者における、感染の強度の軽減または症状の緩和または
生存の延長を引き起こすような化合物の量のことである。このような化合物の毒
性および治療上の有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的、
薬理学的および毒物学的方法、例えば、LD50（集団の50%が死に至る用量）およ
びED50（集団の50%に治療上有効な用量）を決定する方法によって決定すること
ができる。毒性と治療上の有効性の用量比が治療指数であり、これはLD50とED50
の比で表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイまた
は動物実験から得られたデータをヒトに対して使用するための用量の範囲を処方
するために用いることができる。このような化合物の用量は、血液濃度が、毒性
がほとんどまたは全くなく、ED50を含むような範囲内となるようにするのが好ま
しい。用量は採用される用量形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内
で変わり得る。正確な処方、投与経路および用量は、個々の医師が患者の状態を
見て選択することができる。（例えば、Fingl et al.，1975，“The Pharmacolo
glcal Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1を参照されたい）。
投与の量および間隔は、所望の調節効果、または最小有効濃度(MEC)を維持す
るのに十分な活性部分の血漿レベルが得られるように個々に調整される。MECは
それぞれの化合物によって異なるが、in vitroのデータから概算することができ
、例えば、本明細書に記載されたアッセイを用いてHCV感染の50-90%阻害を達成
するのに必要な濃度を求めることができる。MECを達成するために必要な用量は
個々の特性および投与の経路に依存する。HPLCアッセイ、バイオアッセイまたは
イムノアッセイを血漿濃度を決定するために用いることができる。
投与間隔もまた、MEC値を用いて決定することができる。化合物は10-90%の時
間、好ましくは30-90%の間、最も好ましくは50-90%の間にわたってMECを上回る
血漿レベルを維持するような計画に従って投与されなければならない。
局所投与または選択的取り込みの場合には、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度
とは必ずしも関係がない。
投与される化合物の量は、もちろん治療される患者により、患者の体重、苦痛
の程度、投与の方法および処方する医師の判断に依存する。
免疫化の過程において、使用される免疫原の量および免疫化のスケジュールは
当業者の医師により決定され、患者の免疫反応および抗体力価を参考にして投与
される。
5.6.5 包装
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１以上の単位形態を含む包装または
分注装置に入れて提供される。包装は、例えば、ブリスターパック(blister pac
k)のような金属またはプラスチック箔からなる。包装または分注装置に投与の指
示書を付けてもよい。互換性のある医薬担体中に処方された本発明の化合物を含
む組成物についても、調製し、適当な容器の中に入れ、明示した症状の治療につ
いて記載したラベルを付けることができる。
6. 実施例：in vitroでのNS5AとPKRの相互作用
以下のin vitroの実験は、HCVタンパク質NS5Aがインターフェロン誘導型のPKR
とin vitroで会合することを証明するもので、HCV NS5Aが、キナーゼとの物理的
相互作用を通じてPKRの活性を直接抑制するという仮説をテストするために実施
された。
6.1. 材料および方法
プラスミドの構築：野生型のHCV laNS5Aの構築物を作るために、pSPns%(HCV-l
a)から得たNS5A完全コード領域を、オリゴヌクレオチドプライマーA、5'-GGAATT C
GAGCTCGCCCGおよびB、5'-GCTCTAGAAGCACACGACATCTTC（EcoRIおよびXbaI部位に
下線を引いた）を用いてPCRにより増幅した。得られた生成物をpCR2.1(Invitrog
en)に直接クローン化し、プラスミドpNS5A/CR2.1を得た。pNS5A/CR2.1からNS5A
コード領域を、EcoRI断片として取り出してpBD(Strategene)に挿入してpBD-NS5A
を得るか、またはEcoRI-XbaI断片として取り出してpcDNA3.1/HisおよびpYES2(In
vitrogen)に挿入してそれぞれpcDNA3.1/His-NS5AおよびpYES2-NS5Aを得た。NS5A
のISDR欠失変異体を作るために、それぞれ、ISDRを欠いている、N-末端およびC-
末端をコードした個々の断片を作った。アミノ酸1-236をコードするN-末端領域
を、プライマーAおよびプライマーC、5'-CCACTCGAGCGGACAGTTGGCTGG（XhoI部位
に下線を引いた）を用いてPCRにより増幅した。アミノ酸278-447をコードするC-
末端領域を、プライマーBおよびプライマーD、5'-
CCGCTCGAGTGGTGATTCTGGTCTC（XhoI部位に下線を引いた）を用いて増幅した。得
られたPCR生成物をpCR2.1に直接クローン化して、それぞれpN/CR2.1およびpC/CR
2.1を得た。次に、NS5AのN-末端コード領域をpN/CR2.1から取り出してpcDNA-3,1
/Hisに挿入して、pcDNA3.1/His-NS5A 1-236を作った。アミノ酸278-447と読み枠
を合わせて融合してISDR全体を欠失したpcDNA3.1/His-NS5A 1-236のXhoIおよびX
baI部位にC-末端コード断片を挿入することにより、ISDR欠失構築物を調製した
。次いで、pcDNA3.1/His-ΔISDRからの挿入物を、2μ酵母発現ベクターpBDおよ
びpYES2にサブクローニングし、それぞれ、pBD-ΔISDRおよびpYES2-ΔISDRを得
た。HCV-1bからNS5Aコード領域を得るために、IFNによる治療に反応しなかった
遺伝子型1bの患者からインフォームドコンセントのもとに採取した100μｌの血
清（ChomczynskiおよびSacchi，1987，Anal．Biochem．162:156-159）からウイ
ルスRNAを抽出した。INFに対する反応は、先に記載された方法に従って（Gretch
ら，1993，J．Clin．Micro．31:289-291）、RT-PCRおよびbDNAアッセイによって
決定した。ウイルスの5'非翻訳領域およびコアタンパク質をコードする配列のそ
れぞれについて、RFLPおよび遺伝子型特異的PCR分析を組み合わせておこなうこ
とにより、HCV遺伝子型を証明した(Davidsonら，1995，J．Gen．Virol．76:1197
-1204;Okamotoら，1992，J．Gen．Virol．73:673-679)。オリゴヌクレオチド、5
'GTGGTGACGCAGCAGAGAGT（HCV-Jのnt 7681-7700に対応する）(Bukhら，1995，Sem
in．Liver Dis．15:41-63)をプライマーとして使用した逆転写によりウイルスcD
NAを合成した後、上流領域のプライマー、5'CAGCCTCACCATCACTCAGC（HCV-J nt 6
256-6275に対応する）を加えて第１回のPCRをおこなった。NS5Aの方向性（direc
tional）クローニングのために、NS5A特異的ネステッドセット(nested-set)オリ
ゴヌクレオチドプライマー対、5'CCTTCCATGGGCTCCGGCTCGTGGCTAAAGおよび5'ATCG GATCC
TTAGGACATTGAGCAGCAGACGA（それぞれ、NcolおよびBamHl部位に下線を引い
た）を使用して、第１回のPCRの生成物をさらに増幅した。制限酵素で消化を行
った後、精製したPCR生成物をpACT2(Clontech)の対応する部位にクローン化して
、HCV-1bに対応するAD-NS5A融合タンパク質をコードするpAD-NS5Aを得た。HCV-1
aのISDRアミノ酸配列とIFN感受性との間の関係は正確には決定されていないが、
NS5Aのこの領域(アミノ
酸237-276)は、以前に決定されたプロトタイプなIFN-抵抗性ISDR配列(Enomotoら
，1996，N．Engl．J．Med．334:77-81;Enomotoら，1995，J．Clin．Invest．96:
224-230)に対して顕著なアミノ酸同一性を有し、我々のHCV-1b NS5Aクローン（
図1A）中に存在する。PKRプラスミドPBD-PKR K296Rの構築、pAD-PKRアミノ酸構
築物K296R、1-242、244-551、244-366、367-551およびpAD-P58IPKwtについては
先に記載されている(Gale，Jr．ら，1996，Mol．Cell．Biol．16:4172-4181)。p
ET11A-PKR M7から1.6kb Ndel/BamHl断片を回収することにより、pBD-PKR 99-551
を構築し(Barberら，1995，Mol．Cell．Blol．15:3188-3146)、これをpGBT10の
対応する部位にクローン化した(Gale，Jr．ら，1996，Mol．Cell．Biol．16:417
2-4181)。pEMBLYex4-K3LはpEMBLYex4に挿入されたワクシニアウイルスK3L遺伝子
全体を含んでおり、これについては別の原稿に記載されている。HCV-1a NS5クロ
ーンpSPns5から得たBamHl断片をプラスミドpGEX2Tに導入して(Smith and Johnso
n，1988，Gene 67:31-40)pGST-NS5Aを得ることにより、GST-NS5Aを製造した。こ
の構築物は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質と読み枠を合わせ
て融合したNS5Aアミノ酸1-427をコードしている。この研究に使用したすべての
構築物のヌクレオチド配列は、Applied Biosystems自動シークエンサーを用いた
二本鎖DNA配列分析により確認された。
in vitroでのタンパク質相互作用の分析：pGEX2TまたはpGST-NS5Aを保有した
大腸菌を培養液中で発育させ、培養液にイソプロピルチオガラクトピラノシドを
加えることによりGSTまたはGST-NS5Aの発現を誘導した。細菌を収集し、抽出物
を調製し、先に記載された方法に従って(Gale，Jr．ら，1996，Mol．Cell．Blol
．16:4172-4181)結合分析をおこなった。結合分析のために、GST-特異的抗血清
またはスーパーオキシドジスムターゼ-NS5融合タンパク質に特異的な抗血清（抗
-NS5;Chiron Corporation)のいずれかを用いたイムノブロット分析により、組換
え抽出物中にGSTrまたはGST-NS5Aが発現されていることを確認した。発現してい
る組換え抽出物をin vitroの結合分析に使用した。in vitroでpcDNA1neoのT7プ
ロモーターからWtヒトPKRおよびPKR欠失変異体を転写し、先に記載された方法に
従って(Katze et al.，1991，Mol．Cell．Biol．11:5497-5505)、[35Ｓ]-メチオ
ニンの存在下で翻訳した。in vitroでの結合分析のために、
それぞれの翻訳反応から得られた約1×105カウントのトリクロロ酢酸で沈殿する
物質を、GSTまたはGST-NS5Aのいずれかを含む粗大腸菌抽出物に加えて、文献に
記載されたとおりに処理した(Gale，Jr．ら，1996，Mol．Cell．Blol．16:4172-
4181)。GSTまたはGST-NS5Aに結合した標識されたタンパク質をSDS-PAGEによって
分離し、乾燥したゲルのオートラジオグラフィーによって可視化した。
PKR機能のin vitroでのアッセイ：PKRのin vitroキナーゼのアッセイのために
、グルタチオン-アガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて大腸菌
抽出物からGSTNS5Aを精製した。天然のPKRを、IFN処理したヒト293細胞からアフ
ィニティーにより精製した(GalabruおよびHovanessian，1987，J．Biol．Chem．
262:15538-15544)。すべての精製されたタンパク質の濃度を、標準としてBSAを
用いて定量的SDS-PAGEによりアッセイした。in vitroキナーゼアッセイを、基本
的には文献（Tangら，1996，J．Biol．Chem.）に記載されるとおりだが、ヒスト
ン基質および[32P]-γATPを加える前に、GSTまたはGST-NS5Aの濃度を増加させて
PKRをプレインキュベートする点のみ異なる方法で実施した。キナーゼ反応生成
物をSDS-PAGEによって分離し、リン酸化した基質を可視化するために、乾燥した
ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。in vitroにおいて、ヒストンのリン酸
化とPKRにより精製されたeIF-2αとの間に完全な相関関係が存在することが先に
示されている(Katzeら，1991，Mol．Cell．Biol．11:5497-5505)。
6.2. 結果
NS5AがPKRと直接相互作用する能力をテストするために、HCV l-aから得られた
NS5A(図１)を用いた。大腸菌でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タ
ンパク質として発現されたNS5A(GST-NS5A)は、GST-プルダウンアッセイを用いて
、in vitroで翻訳された完全長PKRと特異的に相互作用した。図２に示されるよ
うに、PKRアミノ酸244-551は、GST-NS5Aと複合体を形成するために必要かつ十分
であった。このように、組換えNS5Aは、in vitroでPKRと特異的に複合体を形成
することができ、プロテインキナーゼ触媒ドメインを含むPKRのC-末端の中に位
置する。
7. 実施例：NS5Aのin vivoでのPKRキナーゼ触媒ドメインとの相互作用
以下の実験はin vivoでのNS5AとPKRの間の相互作用を決定するために実施され
た。
7.1. 材料と方法
in vivoにおけるタンパク質相互作用の分析：タンパク質相互作用の分析には
、サツカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株Hf7c（MATa ura
3-52 his 3-200lys2-801 ade2-101 trp 1-901 lea2-3，112 gal4-542 gal80-538
LYS2::GAL1-HIS3 URA3::(GAL4 17-mers)3-cycl-lacZ)を、2-ハイブリッドアッセ
イに用いた（Fields and Song,1989,Nature 340:245-246）。以下に記載する2-
ハイブリッドアッセイおよび酵母アッセイでは、酢酸リチウム法により、指示さ
れた発現構築物で細胞をトランスフェクトした。2-ハイブリッド分析では、先ず
、トランスフェクトした酵母クローン中の全てのAD-およびBD-融合タンパク質の
発現を、抗ADもしくは抗BDモノクローナル抗体（Clontech）を使って製造者記載
のとおりに免疫ブロット分析により実証した。酵母株Hf7c中で、ヒスチジンの合
成は2-ハイブリッドタンパク質の相互作用に依存する。したがって、2-ハイブリ
ッドタンパク質の相互作用が存在すると、株はヒスチジン欠乏培地で増殖するで
あろう。最近Gale,Jr.ら（1996、前掲）が記載したように、2-ハイブリッドタン
パク質相互作用のアッセイにHISレポータータンパク質の合成を使った。最初の
トランスフェクタントは、aa TrpおよびLeuを含まないSD培地(+His培地)上で選
択した。次に、トランスフェクタントをaa His，TrpおよびLeuを含まないSD培地
(-His培地)上にストリーキングし、３〜６日間増殖させて残留するヒスチジン貯
蔵を枯渇させた。コロニーを-His培地上に再びストリーキングし、３〜７日間後
に増殖をスコアした。本発明者の２-ハイブリッド酵母クローンにおけるレポー
ター遺伝子の発現の誘導は、CaoおよびGeballe（1994，Virology 205:151-160）
が記載したとおり、液体アッセイおよび蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル
-β-D-ガラクトシド（MUG）を用い、LacZ発現を測定することにより確認した。
in vivoでのNS5AおよびPKRの機能を測定するための酵母増殖抑制アッセイ：NS
5AおよびPKRのin vivoでの機能を測定するために、LEU2座中に組み込まれたヒト
PKRの２つのコピーを保持するSaccharomyces cerevisiae株RY1-1(MATa ura3-52
leu2-3 leu2-112 gcn2Δtrp1-Δ63 LEU2::(GAL-CYC1-PKR)2を、ガラクトース誘
導性GAL1-CYC1ロモーターの制御下で用いた（Romanoら,1995,Mol.Cell.Biol.15:
365-378）。誘導性培地上で増殖させると、この株は、酵母eIF-2αのPKR媒介性
リン酸化による遅い増殖表現型を示す。タンパク質発現は、免疫ブロット分析に
より、抗PKR mab（Laurentら,1985,Proc.Natl.Acad.Scl.USA 82:4341-4345）ま
たは組換えNS5タンパク質（α-NS5）に対して作製された抗血清のいずれかを使
って実証した。NS5AおよびΔISDR構築物は両方とも、pYesプラスミドから効率的
に発現された。さらに、NS5AまたはΔISDRの同時発現はPKRレベルに影響を与え
ず、効率的に両方のトランスフェクトされた株に等しいレベルで発現することが
見出された。RY1-1トランスフェクタントの増殖を評価するために、酵母コロニ
ーをウラシル欠乏SD培地およびSGAL培地にRomanoら（1995、前掲）が記載したと
おリストリーキングした。増殖は、コロニーのストリーキング後３〜７日に評価
した。
7.2. 結果
これらの結果を確認し拡張するために、NS5A-PKR相互作用の研究を酵母2-ハイ
ブリッド系を使って実施し、ヒスチジン欠乏培地上の増殖を陽性の2-ハイブリッ
ドタンパク質相互作用としてスコアした。比較のため、先にGale,Jr.ら（1996、
前掲）が記載したP58IPK-PKR相互作用の評価を含めた。GAL4活性化ドメイン（AD
-NS5A）に融合した株HCV-1bのIFN耐性単離物由来の全長NS5Aは、GAL4 DNA結合ド
メイン（BD）にそれぞれ融合された非活性全長PKR変異体、PKR K296Rおよび末端
切断型変異体PKR 98-551と特異的に相互作用することが見出された（図２）。BD
-PKR 98-551は、第１dsRNA結合ドメインを欠き（図1Ｂ）、dsRNAとの結合がない
（Barberら，1995，Mol．Cell．Biol．15:3138-3146）。したがって、細胞PKR阻
害剤であるP58IPKと同様
に、HCV-1b NS5Aは物理的にPKRと相互作用することができる。さらに、これらの
結果は、NS5A-PKR相互作用はdsRNA媒介性現象でないことを示す。
2-ハイブリッドアッセイを使うHCV-1A単離物由来のBD-NS5AがAD-PKRとin vivo
で相互作用する能力。図４に示されるように、HCV 1a由来のBD-NS5Aは、-HIS培
地中の増殖により決定されるように、特異的に酵母の同時トランスフェクタント
中のAD-PKR K296Rと相互作用した。したがって、独立株HCV-1aおよびHCV-1b由来
のNS5Aは、物理的にPKRとin vivoで相互作用することができる。PKRのNS5A相互
作用領域をマッピングするために、HCV1a BD-NS5A構築物を保有する酵母をトラ
ンスフェクトする一連のAD-PKR変異体を用いた。BD-NS5Aは特異的にPKR触媒ドメ
インと相互作用し、-HIS培地上のAD構築物PKR 244-551およびPKR 244-366が共に
増殖に介在するので、PKR aa 244-366内にマッピングした（図４）。AD-PKR 367
-551およびAD-PKR 1-242を保有する酵母同時トランスフェクタントは-HIS培地で
増殖しなかったので、PKRのNS5A相互作用領域は、Ｃ末端184aaおよびＮ末端242a
aの両方を除外した。これらの結果は、HCV NS5Aは、PKRプロテインキナーゼ触媒
ドメイン内の構造物と相互作用することを示す。PKRのNS5A相互作用領域(aa 244
-366)は、細胞PKR阻害剤、P58IPKと相互作用する領域を含む（図１Ｂ）（Gale，
Jr.ら，1996）。プロテインキナーゼ触媒ドメインのこの領域は、ヌクレオチド
結合および触媒に協働的に機能する（Hanksら，1988,Science 241:42-52;Bossem
eyer,1995,FEBS.Lett.369:57-61;Taylorら,1993,Mol.Cell.Biol.16:6295-6302）
。
８． 実施例：NS5AはPKR機能を抑制する
次の実験はNS5A-PKR相互作用がPKR機能の阻害を生じうるかを決定するために
実施した。
８．１ 材料および方法
in vitroでのタンパク質の相互作用の分析:pGEX2TまたはpGST-NS5Aを保有する
大腸菌を液培養中で増殖し、イソプロピルチオガラクトプリアノシドを
培地に添加してGSTまたはGST-NS5Aの発現を誘導した。Gale，Jr.ら（1996）が先
に記載したように、細菌を回収し、結合分析のための抽出物を調製した。結合分
析では、免疫ブロット分析により、GSTに特異的な抗血清またはスーパーオキシ
ドジスムターゼ-NS5融合タンパク質に特異的な抗血清（抗NS5；Chiron Corporat
ion）を使い、組換え抽出物中のGSfr GST-NS5Aの発現を確認した。陽性組換え抽
出物をin vitro結合分析用に使用した。wtヒトPKRおよびPKR欠失変異体を、pcDN
A1neoのT7プロモーターからin vitroで転写し、既にKatzeら（1991，Mol．Cell
，Biol．11:5497-5505）が記載したように、[35S]-メチオニンの存在下で翻訳し
た。in vitro結合分析では、およそ1ｘ105カウントの各翻訳反応からのトリクロ
ロ酢酸沈降可能物質を、GSTまたはGST-NS5Aを含有する粗大腸菌抽出物に加え、G
ale,Jr.ら（1996）が記載したように処理した。GSTまたはGST-NS5Aに結合された
標識タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、乾燥ゲルのオートラジオグラフィーに
より可視化した。
PKR機能のin vitroアッセイ：PKRのin vitroでのキナーゼアッセイでは、大腸
菌抽出物から、グルタチオン−アガロースのアフィニティクロマトグラフィーを
使ってGSTNS5Aを精製した。天然のPKRをIFN処理したヒト293細胞からアフィニテ
ィ精製した（Galabru and Hovanessian，1987，J．Biol，Chem．262:15538-1554
4）。全ての精製タンパク質の濃度を定量的SDS-PAGEにより、BSAを標準として使
い評価した。in vitroキナーゼアッセイは、ヒストン基質および[32P]-γATPの
添加前にPKRをGSTもしくはGST-NS5Aの濃度を増加して予めインキュベートしたこ
とを除いて、本質的にTangら（1996，J．Biol．Chem．271:28660-28666）が記載
したように実施した。キナーゼ反応産物をSDS-PAGEにより分離し、リン酸化基質
の可視化のために、乾燥ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。既に、ヒスト
ンと精製eIF-2αのPKRによるin vitroリン酸化の間に完全な相関があることはKa
tzeら（1991）により示されている。
8.2. 結果
最初に組換えNS5Aの存在下においてPKR活性のin vitro分析を実施した。
精製した天然のPKRをHCV-1a由来の組換えGST-NS5Aとインキュベートすると、PKR
自己リン酸化および外因性ヒストン基質のリン酸化の両方に特異的阻害を生じた
（図５）。0.2pmolの低いNS5Aが1.8pmolのPKRを阻害しうるのは注目に値する。
これが、相対的に小さな％のPKRが活性であることから生じるのか、またはNS5A
が恐らく高次のPKR二量体の破壊により低いレベルで機能しうるのか、現在のと
ころ決定することができない。PKR活性の消失は、PKRの分解またはATPのNS5A媒
介性加水分解によるものではなかった。さらに、本発明者のin vitroアッセイに
おけるPKRおよびヒストンのリン酸化の阻害は、GST-NS5A媒介性ホスファターゼ
活性による可能性があるが、NS5Aはホスファターゼ機能を示す構造的属性を持た
ないので、これはあり得ないと考えられる。等モルレベルのGSTはPKR活性に影響
を与えない（図５、レーン６〜９）。したがって、他のウイルスがコードするＰ
ＫＲ阻害タンパク質の作用と同様に、NS5A-PKR相互作用の直接的作用を通して、
NS5Aは特異的にPKRの機能をin vitroで阻害することができる。
酵母におけるPKRの発現は、PKR活性の直接測定のためのin vivo機能アッセイ
を提供する（Romanoら，1995,Mol.Cell.Blol.15:365-378）。そのeIF-2αリン酸
化活性を通じて、酵母に発現すると、PKRは増殖抑制的である。PKRと、トランス
ドミナント（transdominant）阻害PKR変異体またはHIV Tatもしくはワクシニア
ウイルスK3LのようなウイルスによりコードされるPKR阻害タンパク質との同時発
現は、PKRの阻害およびeIF-2αリン酸化の付随的減少によって、酵母内のPKR媒
介性低速増殖表現型を逆転する（Romanoら，1995；McMillanら,1995；M.Kobayas
hi,E.Locke,J.Silverman.T.Ung and T．Dever，提出文書）。PKR機能に与えるNS
5Aの影響を評価するために、Romanoら(1995)により開発された酵母株RY1-1中のG
AL1ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でNS5Aを発現した。RY1-1は、GAL1
-CYC1ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にあるヒトPKRの２つの組み込ま
れたコピーを持ち、ガラクトース培地上で増殖したとき、PKR媒介性増殖抑制表
現型を維持する。比較のために、同じくGAL1-CYC1プロモーターの制御下にある
、よく特性決定されたワクシニアウイルスPKR阻害剤であるK3Lを保有する
RY1-1の平行分析を含めた（M．Kobayashi，E．Locke，J．Silverman，T．Ungand
T．Dever，提出文書）。NS5A機能の試験は、RY1-1トランスフェクタントの増殖
特性を決定することから始めた。非誘導性デキストローズ（SD）培地上では全て
のトランスフェクタントは効率的な増殖を維持した（図６、左）が、PKR発現の
条件下ではNS5AまたはK3Lに保有するもののみが増殖を持続することができた（
図６、右）。ベクター対照トランスフェクタントはひどく低速な増殖表現型を現
し、PKR発現の高レベルと関係する増殖抑制活性と一致した（図６）（Romanoら
，1995）。これらの結果は、NS5Aが、酵母中のPKR媒介性増殖抑制を逆転するに
十分であることを実証し、NS5Aが直接PKR機能を抑制することができることを示
した。PKR機能がNS5Aの存在下で抑制されたことを確認するために、RY1-1トラン
スフェクタント中のeIF-2αリン酸化のレベルを定量した。K3Lと同様に、NS5Aの
発現により、ベクターのみを保有する対照トランスフェクタントで観察されたそ
れに対し、非リン酸化eIF-2αのレベルにほぼ11倍の増加を生じた（図７）。こ
れら細胞中の大部分のeIF-2αは高リン酸化状態のままであったが、これらの結
果は、eIF-2αリン酸化の全体的なレベルの変化が相対的に小さいにも関わらず
細胞増殖に著しい影響を与えうることを示唆する。まとめると、これらの観察は
、NS5Aが、PKRとの直接的な相互作用を通してin vivoのPKR機能を抑制し、これ
によりPKR基質であるeIF-2αのリン酸化状態に変化が生じることを示す。
９． 実施例：PKR機能のNS5A抑制の分子機構
NS5A-PKR相互作用の機構およびISDR変異がPKRのNS5A調節にあたえる影響を決
定するために、次の実験を実施した。
9.1. 材料と方法
プラスミドpGBT10およびpGAD425は、それぞれGAL4 DNA結合ドメイン（BD）お
よび転写活性化ドメイン（AD）をコードする（Gale，Jr.ら，1966 Mol．Cell．B
iol．16:4172 4181）。pAD-PKR K296R、pAD-PKR 244-5515、pAD-PKR 244-296は
、示されたAD-PKR融合構築物をコードし、既にゲール
ら（Gale，Jr.ら，1996）が記載している。全てのNS5A-1b発現構築物は、IFN耐
性HCV-1bの臨床単離物由来のNS5A（NS5A 1b-wt）を保有するpAD-NS5Aから作製さ
れた（Galeら,1997,Virology 230:217-227）。酵母2-ハイブリッドタンパク質相
互作用分析を容易にするため、pAD-NS5AをNdeIおよびBamHI制限酵素で切断し、
全長NS5A（aa 1973-2419）をコードする1.4kbインサートをpGBT10の対応部位に
クローニングしてpBD-NS5A 1b-wtを得た。pBD-NS5A 1973-2361は、NS5A aa 1973
-2361のBD融合体をコードし、pBD-NS5A 1b-wt由来のNdeI/Sal １インサートをpG
BT10の対応部位にサブクローニングして作製した。pBC-NS5A 2120-2274は、NS5A
aa 2120-2274のBD-融合体をコードし、pBD-NS5A 1b-wt由来の内部462bp EcoRI/
BstYI断片をpGBT10のEcoRI/BamHI部位に連結することにより構築した。pBD-NS5A
1973-2208、pBD-NS5A 2209-2274、およびpBD-NS5A 2180-2251は、それぞれNS5A
aa 1973-2208、2209-2274、および2180-2251のBD融合体をコードし、対応するpB
D-NS5A 1b-wtコード領域のPCR増幅により制限酵素切断部位に連結した表３(上側
)に示したオリゴヌクレオチドプライマー対を使って作製した。PCR産物は、プラ
スミド製造者の記載の通り、直接pCR2.1（Invitrogen）中にクローニングした。
NS5A aa 1973-2208および2209-2274をコードするPCR産物は、NdeI/SalIまたはEc
oRI/SalIの制限酵素の組合わせでの消化によりそれぞれpCR2.1から遊離した。生
じたインサートDNAをpGBT10およびpGBT9（Clontech）のそれぞれの部位に連結し
て、pBD-NS5A1973-2208およびpBD2209-2274を得た。NS5A aa 2180-2251をコード
するPCR産物は、pCR2.1からNco/BamHIによる消化により遊離し、生じた213bp断
片をpAS2-1(Clontech)の同一部位に連結してpBD-NS5A 2180-2251を得た。PBD-λ
ISDBは、IFN耐性HCV-1a由来のNS5AのISDR欠失変異体をコードする（Galeら,1997
,Virology 230:217-227.）。
部位特異的突然変異誘発（Chameleon Double-Stranded Site-Directed Mutage
nesis Kit;Strategene）を利用して、HCV-1bのIFN感受性株に対応するISDR変異
をpBD-NS5A 1b-wtに導入した。突然変異誘発反応は、製造者記載の通り、表３（
下側）に示した突然変異誘発プライマーを使って実施した。テ
ンプレートDNAは100℃で５分間、インキュベーションすることにより変性し、そ
の後表に示した突然変異誘発プライマーおよびScaIをStuI選択プライマー5'GTGA
CTGGTGAGGCCTCAACCAAGTC（下線は、StuI制限酵素切断部位）へアニーリングさせ
た。T7 DNAポリメラーゼープライマー伸長産物を連結させ、プライマーがコード
する変異をScaI制限酵素の消化により選択させ、続いてX1mut S E．coli（Strag
ene）に形質転換させた。この方法により、ISDRに導入され定義された突然変異
（表１参照）を除くNS5A 1b-wtと同一の１セットの同質遺伝子型NS5A構築物が構
築された。pBD-NS5A 1b-2およびpBD-NS5A 1b-4は、pBS-NS5A 1b-wtから直接作製
され、それぞれ単一（A2224V）、または多重（P2209L、2214A、およびT2217G）I
SDRを突然変異としてコードする（表１）。pBD-NS5A-5は、ISDR突然変異P2209L
、2214A、T2217GおよびA2224Vをコードし、A2224V突然変異をpBD-NS5A-4に導入
することにより作製した。
S．ceredsiae中のNS5Aの発現に対しては、pBD-NS5A 1b-wtの全1.4kbインサー
トをPCRにより表３（上側）に示した制限酵素結合オリゴヌクレオチドを使って
増幅した。PCR産物は、pCR-Script（Stratagene）のSrf1部位にクローニングし
、生じたプラスミドからHindIII消化により遊離した。ゲル精製したインサートD
NAは、pYES2（Invitrogen）のHindIII部位にクローニングして、ガラクトース誘
導性GALIプロモーターの制御下でNS5Aを発現するpYES-NS5A 1b-wtを得た。pYES-
NS5A 1b-2、pYES-NS5A 1b-4およびpYES-NS5A 1b-5の構築は、pYES-NS5A 1b-wtの
内部1.1kbSacII/SaII断片をそれぞれのpBD構築物からの内部SacII/SaII断片と置
き換えて実施した。
哺乳類細胞のNS5Aの発現については、PYES-NS5A 1b-wtおよびPYES-NS5A 1b-5
の全1.4kbNS5Aコード領域をHindIII消化により遊離し、pFLAG-CMV2（Eastman Ko
dak Co.）のHindIII部位にクローニングした。生じたプラスミドpFlagNS5A 1b-w
tおよびpFlagNS5A 1b-5は、それぞれＮ末端で8aa FLAGエピトープタグ配列にCMV
前初期プロモーターの制御下で融合した全長wtおよび変異体NS5A（FLAG-NS5A）
をコードする。pNeo-NS5A 1a-wtは、pYES2-NS5A（Galeら，1997 virology）の1.
4kbHindIII/XbaIインサート
のpcDNA1NEOの対応部位へのクローニングにより構築した。pNeo-PKR K296Rは、
全長不活性ヒトPKR K296R変異体をコードする（Barberら，1993 J．Biol．Chem
．170:17423-17428）。pGST-NS5A 1b-wtの構築については、pAD-NS5A由来の1.4k
b NcoI/XhoIインサートDNA（Galeら，1997 Virology 230:217-227）を単離し、3
'-側のへこんだ（recessed）末端をKlenowポリメラーゼでフィルインした（Samb
rookら，1989 Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press）
。生じた平滑末端DNAをpGex-2TK（Pharmacia Biotech）のSmall部位にクローニ
ングし、インフレームのNS5Aコード領域をGSTタンパク質をコードしたプラスミ
ドに融合した。pGST-K3Lは、88 aaワクシニアウイルスK3Lタンパク質のGST融合
体をコードする。pGST-NS1は、インフルエンザウイルスNS1タンパク質のGST融合
体をコードする。ファージλcIリプレッサーのＮ末端132 aaと触媒的に不活性な
PKR K296Rの間の融合をpcI168内に構築して、pcI-PKRK296Rを得た。それぞれの
新しい構築物の最終配列は、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した（
Applied Biosystems）。
細胞培養とトランスフェクション
NIH3T3、Cos-1細胞（ATCC）および腫瘍由来の細胞系を、タングら（Tangら，1
996 J．Biol．Chem 271;28660-28666）が記載したように、10％胎児ウシ血清を
含有するダルベコ（Dulbecco）の改変イーグル（Eagle）培地（DMEM）で増殖さ
せた。一時的なトランスフェクションの場合は、先にタングら（Tangら，1996J
．Biol．Chem．271-28660-28666）が記載したとおり正確にDEAE-デキストラン／
クロロキノン法により、または製造者（Qiagen）が記載したとおりSuperfectト
ランスフェクション試薬を使う方法により、発現プラスミドの組合わせをCos-1
細胞中に導入した。トランスフェクションの各セットは、以下の組合わせの5μ
ｇの各発現プラスミドで同時トランスフェクトしたほぼ6x105細胞のサブコンフ
ルエントな25cm2培養からなった：pcDNA1neo/pNeoPKR K296RおよびpNeoNS5A1a-w
t/pNeoPKR K296R、またはpFlag/pNeoPKR K296R、pFlagNS5A1b-wt/pNeoPKR K296R
もしくはpFlagNS5A 1b-5/
pNeoPKR K296R。細胞はトランスフェクション後48時間で回収し、記載されたと
おり、抽出物を免疫沈降または免疫ブロット分析用に処理した。PKR阻害タンパ
ク質P58IPKを安定して発現するNIH3T3細胞系はバーバーらが既に記載している（
Barberら，1994Proc.Natl,Acad.Scl.91:4278-4282)。ベクター制御NIH3T3細胞系
またはNS5A 1a-wtを発現する細胞系は、DEAE−デキストラン／クロロキノン法を
経てそれぞれ３〜10μｇのpcDNA1neoまたはpNeoNS5A 1a-wtにより細胞をトラン
スフェクトすることにより誘導した。トランスフェクトした細胞は、600μｇ/ml
のネオマイシン類似体G418を含有する培地中での増殖により選択した。薬物耐性
クローンを単離し、拡大増殖させ、NS5Aの安定な発現について試験した。この方
法により、NS5Aを高または低レベルで発現する複数のクローンを単離した。さら
なる分析のために、２つの代表的クローン、5C6（高発現）および4A1（低発現）
を選択した。タンパク質分析
酵母抽出物は、20ml液体培養物からの細胞を採集し、１回氷冷水で洗浄し、氷
冷酵母溶解バッファー（40mM PIPES(pH6.6)、100ｍM NaCl、1mM DTT、50mM NaF
、37mM β-グリセロールホスフェート、120mM AMSO4、10mM2-アミノプリン、15m
M EDTA、0.2mMフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)）中に再懸濁して
調製し、ゲールら（Gale，Jr.ら，1996 Mol．Cell．Biol．16:4172-418）が記載
したとおリガラスビース法により溶解した。3T3、Cos-1および腫瘍由来細胞抽出
物をバッファーI（50mM KCl、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、20％グリセロー
ル、0.5％トリトン(Triton)X-100単位/mlアプロチニン、1mM PMSF、20mMトリス
（Tris）(pH7.5)）中で、タングら（Tangら，1996 J．Biol．Chem．271:28660-2
8666）が記載した通り正確に調製した。抽出物は、４℃、12,000×gの遠心分離
により清澄化し、上清を回収して、-70℃で貯蔵した。細胞抽出タンパク質濃度
は、Biorad Bradfordアッセイを使って製造者（BioRad）記載のとおり定量した
。
タンパク質発現の定量は、先に記載の細胞抽出物からの全タンパク質25〜50μ
gの免疫ブロット分析により実施した。タンパク質は、SDS-PAGEにより分
離し、ニトロセルロース膜に移した。結合したタンパク質は、膜をNS5A(抗NS5A
）、ヒトPKR（抗PKR（Laurentら，1985 Proc．Natl．Acad．Sci．82:4341-4345
））、FLAGエピトープ（抗FLAG;Eastman Kodak Co.）、GAL4活性化ドメインまた
はGAL4 DNA結合ドメイン（それぞれ抗ADおよび抗BD（Clontech））に対する特異
的な一次モノクローナル抗体によりプローブして検出した。タンパク質を増強化
学発光（ECL）およびオートラジオグラフィーにより可視化した。タンパク質ロ
ーディングの潜在誤差に対する対照として、ブロットはアクチン特異的モノクロ
ーナル抗体（抗アクチン；ICN）でもプローブした。
２ｘ106のトランスフエクトしたCos-1細胞に相当する抽出物から、免疫沈降を
実施した。抽出物（150μl）を氷上で解凍し、タンパク質G-アガロースビーズ（
Boehringer Mannheim）で、４℃、１時間インキュベーションして予備清澄した
。４℃で遠心分離（12,000×g）することにより上清を回収して、抗NS5A（1：50
0）または抗FLAG M2-アフィニティゲル（Eastman Kodak Co.）と混合してバッフ
ァーIで最終容積600μlとし、４℃で２時間または16時間、それぞれインキュベ
ートした。抗NS5A免疫複合体は、バッファーIで平衡化したタンパク質G-アガロ
ースビーズでさらにインキュベーションして回収した。免疫複合体は、それぞれ
氷冷バッファーI（1ml）を用いて５回洗浄した。抗FLAG M2アフィニティゲル免
疫複合体は、さらに冷TBS（50mMトリス(Tris)(pH7.5)）で３回洗浄し、製造者（
Eastman Kodak Co.）が記載したとおり、競合するFLAGペプチドを加えて溶出し
た。免疫複合体は、遠心分離により回収し、SDSサンプルバッファー中に希釈し
、100℃で５分間インキュベートした。免疫沈降産物を電気泳動により12％アク
リルアミド／SDSゲル上で分離し、上に記載のとおり免疫ブロット分析で処理し
た。
eIF-2αの等電点電気泳動の場合には、酵母株は、16時間、2％デキストロース
を含有するウラシル欠乏合成規定培地（SD）内で増殖させ、2％ラフィフィオー
スおよび10％ガラクトースを含有するウラシル欠乏合成規定培地（SGAL）中に0.
4のOD600まで希釈し、そしてさらに４〜９時間、30℃で増殖させた。免疫ブロッ
ト分析の場合に記載したように、酵母抽出物を調製した。タンパク質
（16μg）を垂直等電点電気泳動により分離し（Deverら，1993 Proc．Hatl．Aca
d．Sci．90:4616-4620）、ニトロセルロース膜にブロットした。eIF-2αは、免
疫ブロット分析により、酵母eIF-2αに特異的なウサギポリクローナル抗血清を
使って検出した。これらの実験において、eIF-2αの低酸性の基本的なリン酸化
形のレベルの増加は、セリン51上でPKRによりリン酸化される高リン酸化eIF-2α
のレベルの同時減少を示す（Deverら，1993 Proc．Natl．Acad．Sci．90:4616-4
620；Romanoら，1995 Mol．Cell．Biol．15:365-378）。全体に対する基本的な
リン酸化eIF-2αのレベルを走査レーザ濃度計により定量し、それぞれのサンプ
ルに対して全eIF-2αの百分率として報じた。酵母法
酵母2-ハイブリッドアッセイの詳細は、広く記載されている（Gale，Jr.ら，1
996）。このアッセイは、2-ハイブリッドタンパク質相互作用の指標として、ヒ
スチジン欠乏培地上の酵母株Hf7c（Clontech）の増殖を支援するHisレポーター
遺伝子の特異的誘導を用いる。Saccharomyces cerevisiae株Hf7c（MATaura 3-52
his 3-200 1ys2-801 ade2-101 trp1-901 lea2-3，112 ga14-542 gal80-538 LYS
2::GAL1-HIS3 URA3::(GAL4 17-mers)3-CYCl-1acZ)を対応するGALAAD-およびBD-
融合構築物を保有する２μのTrp1およびLeu2発現プラスミドで形質転換した。形
質転換した株を、トリプトファンおよびロイシン欠乏SD培地（+His）にまいた。
３日後、30℃で、株をトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを含まないSD
培地（-His）上にストリーキングし、３〜６日間、30℃で培養した。生じたヒス
チジン消耗コロニーを+Hisおよび-His培地上にレプリカストリーキングして、３
〜５日間、30℃で培養した。-His培地上の特異的増殖を2-ハイブリッドタンパク
質相互作用が陽性であるとしてスコアした。
in vivoにおけるPKRおよびNS5Aの機能を測定するために、wtまたは変異体NS5A
Ura3発現プラスミドを、S．cerevisiae株RY1-1(MATa Ura3-52leu2-3 leu2-112
gcn2Δtrp1-A63LEU2::(GAL-CYC1-PKR)2(Romanoら，1995）中に形質転換した。こ
の株は酵母eIF-2αキナーゼGCN2を欠き、ガラクトース誘導性GAL/CYC1ハイブリ
ッドプロモーターの制御下でLEU2遺伝子
座中に組み込まれたwtヒトPKRの２コピーを保有する。SGAL培地で増殖させると
、PKRが発現され、セリン51上の内因性eIF-2αをリン酸化してmRNA翻訳の阻害お
よび増殖抑制をもたらす（Deverら，1993；Romanoら，1995）。逆に、wt NS5Aの
同時発現は、この系のPKR機能と関連するこれらの毒性効果を抑制し、株が同時
発現する機能的NS5AがSGAL培地で増殖することを可能にする（Galeら，1997）。
示したNS5A発現構築物を保有するRY1-1株を、非誘導性ウラシル欠乏SD培地上に
まき、30℃で３日間培養した。単一コロニーを拾い、16時間、30℃でウラシル欠
乏液体SD培地で培養した。それぞれの培養のアリコートを0.2のOD600に正規化し
、無菌H2Oで10倍ごとに段階希釈した。各希釈液の２μlをウラシル欠乏SDおよび
SGAL培地へ繰り返し適用し、３〜６日間30℃で培養した。株を、PKRのNS5A介在
抑制の指標であるSGAL培地上の高い希釈増殖についてスコアした（Galeら，1997
）。二量体化破壊アッセイ
PKR二量体化破壊（dimerization disruption）を測定するアッセイはヒュー（
Hu,1990 Science 250:1400-1403;Hu，1995 Structure 3:431-433）により既に記
載されている。このアッセイはファージλ介在細胞溶解への感度を、大腸菌のpc
I-PKR K296Rから発現されるcI-PKR K296R融合タンパク質の二量化状態の指標と
して用いる。pcI-PKR K296Rは、p15 Aoriの制御下で複製され、従って、colEi o
riを含有するプラスミドと共存することができる低コピーレプリコンであり、pG
EXシリーズのベクターを含む（Smithら，1988，Gene 67，31-40）。cI-PKR K296
Rおよび示されたGST融合タンパク質を同時発現する大腸菌株AG1688(Hu，1990)を
、ファージλ cI欠失変異体λKH54（Hu，1990）により介在される細胞溶解に対
する耐性について評価した。AG1688大腸菌は、10mM MgSO4および0.2％マルトー
スを補給したルリア（Luria）ブロスからなる液体培養中で中対数期（mid log p
hase）まで増殖させた。細菌（2.5μlアリコート）を、等容積のそれぞれ102〜1
06プラーク形成単位を含有するλKH54の10倍段階希釈液と混合した。細菌ファー
ジ混合物を抗生物質含有寒天プラーク形成単位にそれぞれ適用した。細菌ファー
ジ混合物を、0.1ｍＭイソプロピル
チオ-B-Dガラクトシド（IPTG）を含有する抗生物質含有寒天プレートに適用して
プラスミドがコードする融合タンパク質の発現を誘発した。プレートを空気乾燥
し、16時間、37℃で培養し、機能性cI-PKR K296Rホモ二量体のin vivo形成の指
標であるλKH54介在細胞溶解に対する耐性をスコアした。それぞれのプラスミド
がコードする融合タンパク質の発現を免疫ブロット分析により確認した。細胞増殖分析および腫瘍原性（tumorogenicity）アッセイ
トランスフェクトしたNS5AまたはP58IPK（対照）を構成的に発現する安定なNI
H3T3細胞系（Barberら，1994）の増殖特性を、表２に記載したとおり判定した。
腫瘍表現型の分析については、腫瘍をnu/nuマウスから無菌条件で切除し、リン
酸緩衝生理食塩水（PBS）中で洗浄し、１〜５ｍｍ断片に細かく刻んだ。腫瘍断
片を最初に１％コラゲナーゼ／0.1％ジスパーゼ（Gibco BRL）を含むPBS中でイ
ンキュベートし、その後、ダウンス（Dounce）容器ホモジナイザー中でブレンド
して、ホモジナイズした。ホモジナイズした腫瘍は、37℃で２時間インキュベー
トし、600×gで10分間遠心分離し、そして10％FCSと共に新鮮なＤＭＥＭ中で再
懸濁した。腫瘍由来のクローン細胞系を作製するために、細胞懸濁液をマルチウ
エルプレート中に接種した。
8.2. 結果 NS5A によるPKR制御の機構： プロテインキナーゼ二量体化の破壊
PKRのウイルス制御は、PKRの成熟、活性化および触媒プロセス内の特定段階を
規定する多重レベルで起こる。これらの段階は、限定されるものでないが、PKR
レベルの調節、dsRNA結合現象の制御、プロテインキナーゼ二量体化、およびPKR
触媒活性の制御を含む。本出願人により本明細書に記載されたように、PKRへのN
S5A結合は、PKR aa 244-355により定義されたPKR触媒ドメインの広い領域内でマ
ッピングされた。PKRのNS5A介在制御を理解するために、まずプロテインキナー
ゼ上のNS5A結合ドメインの分子機構を研究した。プロテインキナーゼ上のNS5A結
合ドメインを確認するために、タンパク質相互作
用分析を、GAL4 DNA結合ドメインに融合したHCV-1b（1b-wt；表１参照）のIFN耐
性単離体由来の野生型（wt）NS5A（BD-NS5A 1b-wt）を使って実施した。酵母中
のGAL4転写活性化ドメイン（AD）に融合したPKR欠失変異体との相互作用を媒介
する、この構築物の能力を、2-ハイブリッドアッセイで試験した。2-ハイブリッ
ドタンパク質相互作用は、Hf7c Hisレポーターの活性化に因る同時形質転換され
た酵母のヒスチジン欠乏（-His）培地で増殖する能力により決定した。それは、
それぞれの構築物が効率的に対応株中で発現されることで決定した。図８に見ら
れるように、BD-NS5A 1b-wtをAD-PKR（PKRK296R）またはAD-PKR欠失構築物であ
るPKR 244-551もしくはPKR 244-296と共に同時発現するHf7c酵母株は、全て-His
培地中で増殖を示し、これらの株内の2-ハイブリッドタンパク質相互作用を実証
した。したがって、PKR aa 244-296により規定される52 aa配列がNS5Aとの相互
作用を介在するために十分であることが決定された。これらの結果は、PKRのNS5
A結合ドメインをaa 244-296内であると規定し、本明細書中で記載するように重
要なPKR二量体化ドメインである。
NS5A 1b-wtのPKR二量体化をin vivoで阻害する能力を、大腸菌におけるファー
ジλに基づく遺伝子アッセイを用いて試験した。このアッセイでは、ファージλ
CIリプレッサーのDNA結合ドメインにインフレームで融合している二量体化タン
パク質が、λプロモーターへの結合に必要なCI DNA結合ドメインの二量体化を介
在する（Hu，1995 Structure 3:431-433）。大腸菌中で発現されると、ハイブ
リッドCIリプレッサーは、λファージのCI欠失変異体（λKH54；（Hu，1990 Sci
ence 250:1400-1403））により誘発される細胞溶解に対する耐性を、二量体化と
λプロモーターへの結合により介在する。これは、ハイブリッドCIリプレッサー
を発現するλKH54感染大腸菌内のファージ遺伝子発現の抑制をもたらす。逆に、
この系の二量体化阻害剤の同時発現は、CI二量体の破壊を通じてλ遺伝子抑制を
解除し、大腸菌溶解をもたらす。CI DNA-結合ドメイン（CI-PKR）のＮ末端に融
合した全長不活性PKR K296Rの発現は、大腸菌のλKH54感染でのλ遺伝子発現を
抑制するのに十分である。これは図９で実証され、高濃度のファージへの曝露し
た後でも細胞溶解への耐性が観察された
ので（図９、レーン１）、GSTが同時発現するとCI-PKR介在λ遺伝子抑制に影響
を与えなかった。したがって、CI-PKRのPKR成分は、in vivoでタンパク質二量体
化およびλ遺伝子抑制を容易にする。λKH54介在細胞溶解への耐性は、CI-PKRを
GST-NS5Aと同時発現する大腸菌でほぼ1000倍低下し（図９、レーン１と２を比較
）、NS5AはCI-PKR二量体化プロセスを破壊していることを示した。GST-NS5A 1b-
wtのこの効果は、CI-PKRに特異的であることが示された。従って、NS5Aは特異的
にPKR二量体化プロセスをin vivoで破壊する。
さらに、NS5Aの介在するPKR二量体化の破壊は、NS5AによるPKRとの結合の標的
とされた領域と一致し、PKR二量体化ドメインに局在した（図８）。事実、それ
ぞれPKR基質を標的とするワクシニアウイルスK3L（GST-K3L；レーン３）および
インフルエンザウイルスNS1（GST-NS1；レーン４）を含むPKRの他のウイルス阻
害剤をコードするGST構築物（Craigら，1996J，Biol,Chem．271-24526-24533；G
ale,Jr.ら,1996 Mol.Cell.Biol.16:4172-4181）および-dsRNA相互作用（Katzeら
，1991）は、CI-PKRが同時発現すると、大腸菌のλKH54介在細胞溶解に抵抗する
能力に影響を与えなかった。かくして、NS5Aは、PKR二量体化を破壊することに
よりPKR機能を抑制する新しいクラスのPKR阻害剤に該当し、かくして、二量体化
工程をPKRの成熟、活性化および触媒機能のプロセスにおける重要な構成要素と
して、ならびに新規抗ウイルス剤を同定するためのスクリーニングアッセイの鍵
となる目標として定義するものである。
９．実施例：NS5A、PKR調節およびIFN感受性：ISDRの再定義
最近の分子疫学的研究は、ISDRを、HCV-1bのIFN耐性株のHCVゲノムをもつ保存
領域として同定している。本出願人らは、HCV遺伝子型1aおよび1bのIFN耐性株由
来のNS5Aは、PKRと結合してNS5A ISDRに依存するプロセスであるキナーゼ機能を
in vitroで抑制できると判定した。NS5A 1b-wtと同質遺伝子型である一連のNS5A
ISDR変種を用い、本出願人らは、ISDR内の変異体はNS5AのPKR制御特性をin viv
oで抑止できることを実証した。
9.1 NS5A のPKR相互作用ドメインの同定：ISDRはNS5A-PKR複合体形成に必要であ るが十分ではない
NS5A-PKR相互作用の詳細な構造分析を酵母2-ハイブリッドアッセイを使って実
施し、この相互作用におけるISDRの役割を決定した。BD-NS5A 1b-wtの全長また
は欠失変異体をコードするTRP1プラスミド（図10A；表１参照）を、AD-PKRをコ
ードするLEU2プラスミドを保有する酵母株Hf7c中に導入した。全構築物は、同時
形質転換した株中に効率的に発現した（図10c）。それぞれBD-NS5A構築物および
AD-PKRもしくはAD-ベクター（相互作用ネガティブ対照）を保有する株を全て、
ヒスチジンを含有する培地で増殖した。相互作用ネガティブ対照株は、-His培地
で増殖せず、記載された相互作用の特異性を実証した。重要なことは、ISDRを含
むNS5Aの66aa領域がPKRとのin vivoにおける複合体形成に必要なことであった（
図10）。NS5A N末端236aaだけでは、この構築物を保有する株が-His培地で増殖
できない（図10b）ことから明らかなように、AD-PKRと相互作用をするのに不十
分であった。さらに、NS5Aaa2180-2251をコードするISDR包含構築物は、AD-PKR
とともに発現すると、-His培地での増殖を支援しないことが見出された。逆に、
BD-NS5A構築物1973-2419、1973-236Lまたは2120-2274を保有するこれらの株は、
-His培地での増殖を示し、２-ハイブリッドタンパク質相互作用を暗示した。こ
れらの分析により、NS5AのPKR結合領域は、ISDRおよび隣接するＣ末端26aaを含
んでなる66aa領域内に位置するものと判定した（図10B下側）。かくして、ISDR
はNS5A-PKR相互作用に必要であるが十分ではなかった。
9.2 NS5A-PKR 相互作用はISDRの配列に依存する
酵母2-ハイブリッドアッセイを使って、定義されたISDR変異体はNS5AとPKRの
間のin vivo複合体形成に何らかの影響を与えるかを試験した。野生型（wt）な
らびにHCVのIFN耐性および感受性株に対応するNS5AのISDR変種をコードする一連
のNS5A発現プラスミドそれぞれについて。無作為に選んだISDR変異体よりむしろ
、部位特異的突然変異誘発を使って、HCVのIFN感
受性株の臨床単離物内で既に確認され定義された突然変異に基づいてNS5AのISDR
変種を構築した（Enomotoら，1996N.Eng J.Med．334:77-8）。表１に示されたこ
れらの突然変異を、先にIFN耐性HCVから単離されたNS5A 1b-wt（Galeら，1997）
のISDR中に導入した。IFN耐性HCV由来の表現型ISDR配列から２つ、４つおよび５
つのaa変化をそれぞれ含有する一式の同質遺伝子型NS5A構築物、1b-2、1b-4およ
び1b-5を作製した。これらの構築物は、ISDR内の定義された突然変異を除くNS5A
1b-wtと配列が同じであり、したがって、HCV-1bNS5A機能に与える特異的ISDR突
然変異の影響を判定し得る。表１は表現型IFN耐性HCV-J株のISDR配列およびIFN
応答（Katoら，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524-9528）を、各wtおよび変
異NS5A構築物由来の対応ウイルス単離物に対して決定されたISDR配列およびIFN
への応答と比較する。
全長1b-wt NS5Aおよび同質遺伝子型ISDR変種をコードするBD-NS5A構築物（表
１）を、AD-PKRをコードしたプラスミドまたはAD対照ベクターを保有するHf7c酵
母中に形質転換した。追加の対照として、AD-PKRおよびHCV-1a NS5A構築物BD-1a
-wt（ポジティブ対照）またはBD-ΔISDR（ネガティブ対照）をコードするプラス
ミドを保有する株を平行評価に含めたが、後者は対応する1a-wt構築物の完全なI
SDRを欠いている（Galeら，1997）。生じた酵母株を+Hisおよび-His培地上にレ
プリカプリントした。図11に示すように、+His培地上では全ての株が増殖した。
しかし、-His培地ではBD-NS5A構築物を発現する株、すなわち1b-wt．1b-2もしく
は1a-wt対照だけが増殖を示し、これらの構築物はin vivoでPKRと結合できるこ
とを示した。ΔISDR対照と同様に、BD-NS5AのISDR変種、1b-4および1b-5は、こ
れらの構築物を含有する株が-His培地上で増殖できなかったので、AD-PKRと相互
作用できなかった（図11A）。免疫ブロット分析は、全てのBD-NS5A構築物および
AD-PKR構築物は、同時形質転換した酵母中で効率よく発現されることを実証した
（図11B）。したがって、ISDR配列が異なる同質遺伝子型NS5A構築物は、PKRとの
in vivo相互作用が異なった。単一ISDR点突然変異の導入（NS5A1b-2）は、NS5A-
PKR相互作用を無効化するには十分でなかったが、
逆に、多重ISDR突然変異はPKRとの複合体形成を無効化したのであった（図11A）
。従って、NS5AがPKRとの結合能を有さないことは、ISDR内の多重突然変異に帰
することができ、重要なことは、これがIFN感受性HCVと関連していることである
。
9.3 ISDR 突然変異はNS5A機能を無効化する
NS5Aは、プロテインキナーゼに直接相互作用して、PKR機能を抑制する（Gale
ら，1997b）。多重ISDR突然変異はNS5A-PKR複合体形成を妨害する（図11）。そ
れ故に、NS5AのwtおよびISDR変種のPKR機能を制御する能力をin vivoで比較した
。NS5A構築物1b-wt、1b-2、1b-4および1b-5をコードする発現プラスミドを、Gal
プロモーターの制御下でgcn2ΔS.cerevisiae株RY1-1（Romanoら，1995 Mol．Cel
l．Biol．15:365-378）に導入した。この株は内因性GCN2プロテインキナーゼを
欠き、ガラクトース誘導性GAL/CYCハイブリッドプロモーターの制御下のwtヒトP
KRの２つの組み込まれたコピーを保有する。ガラクトース培地に置くと、PKRが
発現され、eIF-2α上のセリン51をリン酸化し、細胞増殖の抑制を生じる（Roman
oら，1995 Mol．Cell．Biol.15:365-378）。図12Aに示すように、それぞれNS5A
発現プラスミドまたは発現プラスミドのみ（ベクター；対照）を保有する株は、
細胞当量を連続してデキストロースを唯一の炭素源として含む非誘導性培地上に
段階的にまくと、同様によく増殖した（左パネル）。対照的に、誘導性培地上で
はNS5A 1b-wtを同時発現する株のみが、著しい増殖を示した（図12A、右パネル
）。この方法により、ガラクトース培地で増殖すると、NS5A1b-4もしくは1b-5お
よびPKRを同時発現する株と比較して、NS5A 1b-wtおよびPKRを同時発現する株は
プレーティング効率で100倍以上の増加を示すものと判定された。PKRおよびNS5A
1b-2を同時発現する株にも、10〜100倍減少に相当するプレーティング効率の低
下が観察された（図12A）。本発明者の酵母２-ハイブリッドアッセイにおいてこ
の構築物はPKRと結合することが可能であるので、これは驚くべきことであった
（図11参照）。これらの結果は、1B-wtのISDR内に単一のaa点突然変異（A252V）
を導入すれば、PKRの抑制をNS5A-PKR複合体形成か
ら外すのに十分であることを実証した。HCVのIFN感受性株に対応する多重ISDRaa
突然変異は、同質遺伝子型NS5A 1b-wtに関連する増殖回復表現型の喪失を生じた
。これらの結果は、NS5A 1b-wtがPKRのin vivoにおける翻訳制御特性を抑制し、
細胞増殖の回復およびタンパク質合成の刺激をもたらすことを示す。NS5A ISDR
変種に関連する機能の喪失は、NS5AのPKR制御特性がISDR内の突然変異導入によ
り破壊されたことを示唆する。
NS5AのPKR制御機能にあたえるISDR突然変異の影響を決定するために、PKR基質
であるeIF-2αの内因性in vivoリン酸化状態の分析を実施した。RY1-1酵母株に
おけるPKR機能の抑制は、専らセリン51K上のPKRによりリン酸化されたeIF-2αの
高リン酸化形のレベルの低下を生じる（Romanoら，1995Mol．Cell．Biol．15:36
5-378）。単次元等電点電気泳動（IEF）を使い、eIF-2αの高リン酸化形を電気
泳動的に、セリン51リン酸化を欠く低酸性、低リン酸化形から分離することがで
きる（Deverら，1993）。図10は、酵母eIF-2αに特異的な抗血清でプローブした
図12に示されたRY1-1株から調製した抽出物のIEFゲルからの免疫ブロットを示す
。対照として、インサートを欠く発現プラスミドを保有する株からの抽出物（Ｖ
、レーン１）、またはトランスドミナント（transdominant）ネガティブPKR変異
体、PKR Δ295-300（図12、レーン６）を含めた。PKR Δ295-300は、酵母中で同
時発現すると、wt PKRを阻害し、ガラクトース培地上にまくと、セリン51リン酸
化の低下したレベルおよび細胞増殖の回復をもたらす（Romanoら，1995）。図13
にみられるように、NS5A 1b-wtまたはPKR Δ295-300を発現する株は、ベクター
対照株に比べて低リン酸化eIF-2αイソ型の発現量が同時増加していることより
実証されるように（レーン１と２を比較）、高リン酸化eIF-2αのレベルの著し
い低下を示した。同質遺伝子型NS5A変種、1b-2、1b-4または1b-5を発現する株は
、ベクター対照株と同様に、eIF-2αの高リン酸化イソ型を主に有していた（図1
3、レーン３〜５をレーン１と比較）。セリン51リン酸化eIF-2αのそれぞれのレ
ベルは、ガラクトース培地上の各株の増殖表現型に対応し（図12A）、NS5A 1b-w
tの発現はガラクトース上の増殖およびセリン51リン酸化の低下を容易にした。
この表現型は、NS5AへのISDR突然変異の導入により逆転した。総括すると、これ
らの結果は、IFN感受性HCV（表１）に対応するISDR変異はNS5AのPKR制御特性を
破壊しうることを実証する。さらに、本発明者のNS5A 1b-2構築物の分析で観察
されたNS5Aを指定したPKR阻害からPKR結合事象を外すことにより（図11および12
を参照）、NS5A機能の抑止は多重のレベルで起こり得て、NS5A-PKR複合体形成の
破壊に限定されないことが示される。
9.4 哺乳動物細胞内でのNS5A−PKR相互作用はISDR突然変異により破壊される
IFN耐性HCV由来のNS5Aは、哺乳動物細胞内で発現されると、PKRの翻訳調節特
性を抑制する（Galeら，1997）。酵母２-ハイブリッドアッセイの結果（図11）
および増殖アッセイの結果（図12）から示唆されるように、本出願人らは、哺乳
動物細胞内で起こるNS5A指令型（NS5A-directed）のPKRの抑制が直接的なNS5A−
PKR相互作用によって同様に媒介される、という仮説を立てた。本出願人らは、N
S5AおよびPKRが哺乳動物細胞内で安定な複合体を形成し得るのか、そして、複合
体形成に対してISDRの突然変異が（もしも及ぼすとしたら）どのような影響を及
ぼすのか、について調べようと試みた。NS5AのwtまたはISDR改変体をコードする
プラスミドおよび完全長不活性ヒトPKRをコードするプラスミドで一過性に同時
トランスフェクトしたCos-1細胞から同時免疫沈降分析を行った。これらの分析
では、IFN耐性HCV-1a（1a-wt）、1b-wtおよび1b同遺伝子系改変体である1b-5（
後者はIFN感受性HVCに該当）由来のNS5Aをコードするプラスミドを用いた（表１
）。同時トランスフェクトした細胞から調製した抽出物の免疫ブロット分析から
、全ての構築物がトランスフェクションの48時間以内に効率的に発現されたこと
が実証された（図14）。1a-wtで同時トランスフェクトした細胞から調製した抗N
S5A免疫沈降物、およびFLAGタグ付けした1b-wtを保有する細胞から調製した抗FL
AG免疫沈降物からPKRを回収した（それぞれ、図14Aおよび14B）。比較すると、F
lagタグ付けした1b-5の免疫沈降物ではPKRは全く検出されなかった（図14；レー
ン５および６を比較されたい）。本出願人らはwt NS5Aを含まない抽出物から調
製したNS5A特異的免疫沈降物においてPKRを検出できなかったことから、PKRの回
収率は、抽出物中のNS5Aの存在に依存性のものであった（図10Aおよび10Bのそれ
ぞれレーン１および４）。こ
れらの結果から、HVC-1aおよびHCV-1bのIFN耐性株由来のNS5Aは、哺乳動物細胞
内で発現されると、PKRとの安定で特異的な複合体を形成し得ることが実証され
る。酵母2-ハイブリッドアッセイでの結果（図11）と同様に、哺乳動物細胞にお
いて、IFN感受性HCVに該当するISDR内での突然変異（表１）はNS5A-PKR相互作用
を破壊した。これらの結果と酵母の研究において観察された結果とが一致するこ
とから（図11および12を参照）、酵母系がNS5A−PKR相互作用の研究に有用なモ
デルであること、およびこの相互作用がPKR機能に影響を及ぼすことが実証され
る。
10．実施例：NS5Aは潜在的腫瘍形成能を有する
PKR調節経路は細胞増殖の制御と結びついているので、本出願人らは、NS5Aに
よるPKRの調節が慢性HCV感染による悪性腫瘍の発生の一端を担い得るのかどうか
の問題に取り組んだ。この研究では、悪性形質転換がPKR依存的eIF-2αリン酸化
の抑制により起こっており、mRNAの翻訳を調節解除(deregulate)することを提案
した。哺乳動物細胞において、IFN耐性HCV由来のNS5AはPKRに結合し（図14）、P
KRの翻訳調節特性を抑制する。酵母系から得た結果から、NS5AがPKR媒介eIF-2α
リン酸化の抑制による増殖促進(growth-stimulatory)特性を有することが示され
る（図12および13）。PKRのNS5A抑制が同様に哺乳動物細胞に増殖促進をもたら
すかどうかを調べるために、CMV即時型初期プロモーターからNS5A 1a-wtを構成
的に発現するNIH-3T3細胞を樹立した。２種類のそのような細胞系、NS5A 5C6お
よびNS5A 4A1を研究のために選んだ。免疫ブロット分析から、NS5A 5C6は高レベ
ルのNS5Aを発現するが（図15）、NS5A 4A1細胞はNS5Aを有意に低いレベルで発現
すること（データは示さず）がわかった。無胸腺症のnu／nuマウスに注入した場
合のこれらの細胞系の増殖特性（腫瘍形成能を含む）を調べた（表２）。この分
析の対照として、以下の対照細胞系を含めた：何もトランスフェクトされていな
い（empty transfection）プラスミドを用いて同様に誘導したNIH-3T3細胞系（n
eo5-10）、または先の文献に記載の細胞系であるP58-20（PKR阻害タンパク質P58IPK
を過剰発現するもの）（Barberら，1994）。P58-20細胞系と同様に、NS5A 5C
6細胞は、対照neo5-10と比較した場
合、約40％の倍加時間の短縮を示し、培養物の飽和密度を2.5〜３倍増大させた
（表２）。NS5A低発現性細胞であるNS5A 4A1の増殖速度は、対照neo5-10とは有
意な差異はなかった。しかしながら、これらの細胞は、対照の培養物と比較した
場合、培養物の飽和密度において再現性のある２倍の増大を示した（表２）。し
たがって、NIH-3T3細胞内でのNS5Aの構成的発現は、コンフルエントになった後
の(post-confluent)培養物中での細胞分裂を裏付けるものであり、細胞増殖の速
度増大と関連付けられた。これらの結果は、悪性形質転換されたP58-20対照細胞
の表現型（Barberら，1994）と一致した。
NS5A細胞系の表現型をさらに特徴付けるために、これらの細胞の、in vitroで
足場非依存的増殖を受けて無胸腺症マウス体内で腫瘍を形成する能力を評価した
。P58-20対照と同様に、NS5A 5C6細胞は、軟寒天培地上で培養するとコロニーを
形成し、この場合、クローニング効率はneo5-10細胞と比較して約14倍増大した
。足場非依存的増殖は、有意に低い頻度ではあるがNS5A 4A1細胞でも同様に観察
された（表２）。重要なことは、両方のNS5A細胞系が無胸腺症マウスに注入した
後で腫瘍を生じたことである。５匹のマウス中５匹においてNS5A5C6細胞は精力
的に腫瘍を形成し、この時の潜伏期間は細胞への注入後17〜25日間の範囲であっ
た。本出願人らは、NS5A 4A1細胞を取り込んだマウスにおいて有意に長い腫瘍形
成の潜伏期間（22〜24日間）を観察した。対照P58-20細胞を取り込んだマウスは
精力的な腫瘍増殖を示し、この時の潜伏期間は12〜20日間の範囲であったが、こ
れは先に報告されている結果（Barberら,1994）と同様である。NS5A発現は、NS5
A 5C6（図15）および4A1マウスから回収した腫瘍から調製した腫瘍由来細胞にお
いて確認された。さらに、これらの細胞の予備実験から、内因性のeIF-2αリン
酸化が有意に低減したことが判明し、これは、NS5Aで媒介されるPKRの抑制と一
致している。この研究から、NIH-3T3細胞内において、NS5Aの構成的発現（IFN耐
性HCV-1aに該当）が細胞増殖の調節解除および悪性形質転換を誘導し得ることが
実証される。
上記の結果は、NS5A指令型のPKRの抑制が、HCVがIFN療法に対してどのように
応答するのか、について意味を持つことを示すものであるが、このプロセスが慢
性HCV感染に関係する悪性腫瘍の発生の一因となり得ることも示唆している。
したがって、これらの知見から、NS5AのPKRダイマー化の破壊を抑制する抗ウイ
ルス剤を特定するためのスクリーニングアッセイにより、慢性HCV感染に関係す
る悪性腫瘍の発生を抑制する物質も特定できることが実証される。
幾つかの参考文献が引用されており、参考としてそれらの開示内容全体を本明
細書に組み入れる。
本発明は記載されている特定の実施形態による範囲に限定されるものではなく
、それら特定の実施形態は本発明のそれぞれの態様の単なる説明のためのもので
あり、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内とする。当業者であれば
、上記の記載および添付の図面から、本明細書中に示され説明されているもの以
外にも、本発明の実に様々な改変が明らかとなろう。そのような改変は添付した
請求の範囲の範疇内にあるものとする。
表１：ISDR配列および対応する同遺伝子系NS5A発現構築物の
IFN感受性 apt、HCV-J始原型基準配列（GenBankTM受け入れ番号No．D90208）；we、野生型
親HCV-1bクローン［GenBankTM受け入れ番号No．AF03415l(NS5Aコード領域のみ)
］。b
R、IFN耐性；Ｓ、IFN感受性；Ｒ／Ｓ、別々研究では互いとは無関係にIFN感受
性であると報告されている。lb-4に対応するIFN応答性の表現型は調べられてい
ない。しかし、本出願人らは、公表済みの研究（Enomotoら，1996；Hurosakiら
，1997）に基づいて、この配列がIFNに対する感受性に関連していると予測する
。
表２：NS5Aを発現している細胞の増殖特性 aneo5-10およびP58-20は、それぞれ−（ネガティブ）および＋（ポジティブ）の
対照細胞系を表わす。NS5A 5C6細胞はNS5A 4A1細胞よりも約５倍高いレベルまで
NS5Aを発現する。b
細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）および400μg/mlのG418を含有するDMEM選択
培地に105個／55mm培養皿で蒔種した。24時間毎に細胞をカウントし、コンフル
エントな状態に達した４日後に培養物中の細胞総数を測定することにより飽和密
度を求めた。数値は４回の実験の平均である。c
５×102、５×103または104個の細胞を、20％FBSを含む0.35％寒天／DMEM溶液
に懸濁し、
10％FBSを含む0.7％寒天／DMEMが入っている６ウエル培養皿に２シリーズで上層
した。14日後にクローニング効率を測定し、観察されたコロニーの数／蒔種した
細胞総数の割合（％）として表わす。コロニーは、細胞４個以上の独立したクラ
スターとして定義した。d
４〜６週齢の無胸腺症ヌードマウス［nu／nu（チャールスリバー社）］に細胞
２×106個を含むPBSを左後肢近傍から皮下注射した。マウスを病原体のいない施
設内のマイクロアイソレーター(microisolator)ケージに入れ、最大100日間まで
観察した。潜伏期間は、３mm径の腫瘍を形成するまでの時間（日数）として定義
した。
表２：NS5Aを発現している細胞の増殖特性
aaa（アミノ酸）およびnt（ヌクレオチド）の位置はPCR増幅領域に該当する。
番号付けは始原型HCV-J配列（Katoら，1990）に基づく。b
下線部の配列はクローニング制限部位を示す（本文中に説明あり）。c
下線部のコドンは表示のaa（アミノ酸）突然変異に該当する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＷ，ＨＵ，Ｉ
Ｄ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
，ＹＵ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. インターフェロン感受性決定領域(ISDR)を含むウイルスタンパク質の活性を 抑制するのに有効な潜在的新規抗ウイルス薬のスクリーニング方法であって、 PKRプロテインキナーゼと、ウイルスタンパク質と、被験物質とを含む混合 物をインキュベートし、 PKRプロテインキナーゼの活性を測定し、そして 被験物質の非存在下でのPKRプロテインキナーゼの活性と比較する、 ことを含んでなる方法。 2. 抗ウイルス薬がＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する、請求項1に記載の方法 。 3. ウイルスタンパク質がNS5Aである、請求項1に記載の方法。 4. ISDR含有ウイルスタンパク質とインターフェロン誘導型のPKRプロテインキ ナーゼとの直接相互作用を阻止するのに有効な潜在的抗ウイルス薬のスクリー ニング方法であって、 ISDR含有タンパク質と、PKRプロテインキナーゼと、被験物質とを含む混合 物をインキュベートし、 ISDR含有タンパク質とPKRプロテインキナーゼとの結合を測定し、そして 被験物質の非存在下での結合の程度と比較する、 ことを含んでなる方法。 5. ウイルスタンパク質がNS5Aである、請求項4に記載の方法。 6. 抗ウイルス薬がＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する、請求項4に記載の方法 。 7. PKRプロテインキナーゼおよびISDR含有タンパク質が、活性化されたPKRプロ テインキナーゼの存在下でレポーター遺伝子の発現を増強するように遺伝子操 作された酵母細胞において発現され、そして被験物質の存在下および非存在下 でのレポーター遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項1に 記載の方法。 8. レポータータンパク質がGCN4/β-galタンパク質に融合されている、請求項 7に記載の方法。 9. 抗ウイルス薬のスクリーニングに使用するための酵母細胞であって、 (a) ISDR領域を含むポリペプチド、 (b) インターフェロン誘導型のPKRプロテインキナーゼ、および (c) PKRプロテインキナーゼの活性化に応答して発現が増強されるレポータ ー遺伝子、 を発現するように遺伝子操作されている酵母細胞。 10．ISDR領域を含むポリペプチドがNS5Aである、請求項9に記載の酵母細胞。 11．レポーター遺伝子がGCN4/β-gal遺伝子に融合されている、請求項10に記載 の酵母細胞。 12．Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)に感染した細胞におけるHCV複製の抑制方法であって 、前記細胞に、NS5AとPKRの相互作用を妨害する有効量の薬剤を投与すること を含んでなる方法。 13．前記薬剤がNS5Aの阻害剤である、請求項13に記載の方法。 14．前記薬剤がISDRに相補的なアンチセンス分子である、請求項14に記載の方法 。
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