ES2627059T3 - Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc - Google Patents

Abstract

Un método para identificar riesgo de cáncer relativo en un sujeto humano, que comprende identificar si una muestra de tejido de ensayo del ser humano de ensayo comprende al menos un perfil de expresión de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) que tiene una correlación estadísticamente significativa con el carcinoma hepatocelular (CHC); en el que el perfil de expresión de RUC-T comprende una identificación de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198; en el que una correlación estadísticamente significativa indica un riesgo relativo de CHC; y en el que las RUC-T en el perfil de expresión de RUC-T se expresan diferencialmente entre células normales y malignas.

Description

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DESCRIPCION

Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc Antecedentes

Tomados en su conjunto, los canceres son una fuente significativa de mortalidad y morbilidad en los Estados Unidos y en todo el mundo. Sin embargo, los canceres son una clase de enfermedades grande y diversa con diversas etiologlas. Los investigadores por lo tanto han sido incapaces de desarrollar tratamientos o ensayos de diagnostico que abarquen mas que algunos tipos de cancer.

Por ejemplo, los canceres se asocian a muchas clases diferentes de caracterlsticas cromosomicas. Una de dichas clases de caracterlsticas cromosomicas son perturbaciones en la estructura genomica de ciertos genes, tales como la delecion o la mutacion de genes supresores de tumores. La activacion de protooncogenes por amplificacion genica o activacion de promotores (por ejemplo, por integracion viral), modificaciones epigeneticas (por ejemplo, un cambio en la metilacion de ADN) y translocaciones cromosomicas tambien pueden provocar carcinogenesis. Dichas perturbaciones en la estructura genomica que estan implicadas en la etiologla de canceres se denominan “regiones genomicas asociadas a cancer” o “RGAC”.

Los sitios fragiles cromosomicos son otra clase de elemento cromosomico implicado en la etiologla de canceres. Los sitios fragiles cromosomicos son regiones de ADN genomico que muestran una aparicion anormalmente alta de huecos o roturas cuando se altera la slntesis de ADN durante la metafase. Estos sitios fragiles se clasifican como “raros” o “habituales”. Como su nombre sugiere, los sitios fragiles raros son poco habituales.

Dichos sitios se asocian a repeticiones di- o trinucleotldicas, pueden inducirse en cromosomas en metafase por deficiencia de acido folico y se segregan de una manera Mendeliana. Un sitio fragil raro a modo de ejemplo es el sitio Fragil X.

Los sitios fragiles habituales se revelan cuando se cultivan celulas en presencia de afidocolina o 5-azacitidina, que inhiben la ADN polimerasa. Se han identificado al menos ochenta y nueve sitios fragiles habituales, y se encuentra al menos uno de dichos sitios en cada cromosoma humano. Por lo tanto, aunque su funcion apenas se entiende, los sitios fragiles habituales representan un componente basico de la estructura cromosomica humana.

La induccion de sitios fragiles in vitro conduce a aumento de intercambio de cromatidas hermanas y una alta tasa de supresiones, amplificaciones y translocaciones cromosomicas, mientras que los sitios fragiles se han colocalizado con puntos de rotura cromosomicos in vivo. Ademas, la mayorla de los sitos fragiles habituales estudiados en celulas tumorales contienen grandes supresiones o translocaciones intralocus, y se han identificado varios tumores con supresiones en multiples sitios fragiles. Los sitios fragiles cromosomicos estan por lo tanto implicados de forma mecanica en la produccion de muchas de las lesiones cromosomicas habituales vistas en celulas cancerosas.

Todas las celulas malignas tienen alteraciones especlficas en loci de ADN que codifican genes para oncoprotelnas o supresores tumorales (Balmain et al., 2003; Wooster y Weber, 2003). Esta caracterlstica comun se han expandido recientemente para incluir una gran clase de ARN no codificantes (ARNnc) denominados microARN (miARN) (Ambros, 2004) que tambien estan implicados en el inicio y la progresion del cancer (Calin et al., 2002; Croce y Calin, 2005; Berezikov y Plasterk, 2005a; Esquela-Kerscher y Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a). Los miARN afectan a la regulacion de la expresion genica en los niveles tanto transcripcional como postranscripcional (Ambros, 2003; Ambros, 2004).

El alcance de la implicacion de los miARN y la implicacion de otras clases de ARNnc en la tumorogenesis humana es desconocido. Por lo tanto, existe la necesidad de investigacion adicional acerca de los mecanismos moleculares y las rutas de transduccion de senales alteradas en el cancer.

Existe una necesidad adicional de identification de nuevos marcadores moleculares y agentes terapeuticos potenciales.

Las regiones ultraconservadas (RUC) del genoma humano (Bejerano et al., 2004b) tambien son miARN que estan casi completamente conservados entre diversas especies (Berezikov et al., 2005b). Por ejemplo, se ha mostrado que las moleculas activas del grupo miR-16-1/miR-15a, son un agente esencial en el inicio de la leucemia linfocltica cronica (LLC) (Calin et al., 2005a), y estan completamente conservadas en ser humano, raton y rata y altamente conservadas en nueve de las diez especies de primates secuenciados (Berezikov et al., 2005b). El analisis de secuencias comparativo ha identificado varias secuencias genomicas altamente conservadas. Algunas de estas regiones no producen un transcrito que se traduce a protelna y se consideran por lo tanto no genicas. Se han aplicado diversos nombres a esta clase de secuencias: secuencias no genicas conservadas (NGC) (Dermitzakis et al., 2005), secuencias no codificantes conservadas (SNC/NCC) (Meisler, 2001), secuencias conservadas de multiples especies (SCM) (Thomas et al., 2003) o regiones altamente conservadas (RAC) (Duret et al., 1993).

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Las RUC son un subconjunto de secuencias conservadas que se localizan en regiones tanto intra como intergenicas. Estan absolutamente conservadas (100 %) entre regiones ortologas de los genomas humano, de rata y de raton (Bejerano et al., 2004b). A diferencia de otras regiones de secuencia conservada, el 53 % de las RUC se ha clasificado como no exonicas (“N”, 256/481 sin pruebas de protelnas codificantes), mientras que el otro 47 % se ha designado bien exonico (“E”, 111/481, que solapa con ARNm de genes codificantes de protelnas conocidos), o bien posiblemente exonicos (“P”, 114/481, con pruebas no concluyentes de solapamiento con genes codificantes de protelnas).

Una gran parte de los productos de transcripcion de las regiones genomicas funcionales no codificantes tienen estructuras secundarias de ARN significativas y son componentes de grupos que contienen otras secuencias con significacion no codificante funcional (Bejerano et al., 2004a). Las RUC representan una fraccion pequena del genoma humano que probablemente sea funcional pero que no codifica protelnas, y se ha denominado la “materia oscura” del genoma humano (Bejerano et al., 2004a). Debido al alto grado de conservacion, las RUC pueden tener importancia funcional fundamental para la ontogenia y filogenia de mamlferos y otros vertebrados. Esto se ilustro por el hallazgo reciente de un potenciador distante y un exon ultraconservador derivado de un nuevo retroposon activo en peces de aletas lobuladas y vertebrados terrestres hace mas de 400 millones de anos y se mantienen activos en un “fosil viviente”, celacanto (Bejerano et al., 2006).

Pruebas experimentales adicionales de la importancia funcional de las RUC se basan en el analisis de ratones con mutaciones dirigidas. Las supresiones de megabases de desiertos genicos que carecen de elementos ultraconservados o secuencias altamente conservadas dieron como resultado ratones viables que se desarrollaron aparentemente sin fenotipos detectables (Nobrega et al., 2004). Por el contrario, se ha mostrado que desiertos genicos que contienen varias RUC (tales como los dos desiertos genicos que rodean al gen de DA CHI en el cromosoma humano 13g21.33) contienen potenciadores de largo alcance, algunos de ellos compuestos de secuencias de RUC (Nobrega et al., 2003).

A pesar de la investigacion considerable acerca de terapias para enfermedades relacionadas con cancer, estas enfermedades siguen siendo diflciles de diagnosticar y tratar eficazmente. En consecuencia, existe la necesidad en la tecnica de metodos mejorados para diagnosticar y/o tratar el cancer. La presente invencion satisface estas necesidades y proporciona ademas otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invencion

Se describe en el presente documento una consulta genomica exhaustiva del estado de RUC en un gran panel de leucemias y carcinomas humanos.

Los inventores investigaron la expresion en todo el genoma de RUC en diversas muestras normales y cancerosas, y los inventores evaluaron la relacion entre la localizacion genomica de estas secuencias y las regiones conocidas implicadas en canceres.

Ademas, se identifico un papel funcional para los miARN en la regulacion de la transcripcion de RUC asociadas a cancer.

Tambien se describen en el presente documento pruebas en sistemas cancerosos de que una RUC expresada diferencialmente podrla alterar las caracterlsticas funcionales de celulas malignas.

Tambien se describe en el presente documento, combinando estos datos con los modelos elaborados que implican miARN en tumorogenesis humana, un modelo en el que la alteracion de ARN tanto codificantes como no codificantes coopera en el inicio y la progresion del tumor maligno.

En un aspecto general, se describen en el presente documento metodos para diferenciar canceres humanos que comprenden usar uno o mas perfiles de expresion de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) en los que la asociacion entre la localizacion genomica de las RUC y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es altamente estadlsticamente significativa y comparable a la indicada para miARN.

Diversos objetivos y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripcion detallada de la realizacion preferida, cuando se lea a la luz de los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Se proporcionaran copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujo o dibujos a color por la Oficina tras la peticion y el pago de la tasa necesaria.

Figuras 1A - 1E. Caracterlsticas transcripcionales de diversos tipos de RUC:

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Figura 1A. Transferencias de Northern que muestran la expresion de diversas RUC en tejidos normales. En el caso de uc.246(E) y uc.269A(N), la presencia del transcrito largo se confirmo por los experimentos de clonacion de RACE. Para algunos tejidos, se proporcionaron muestras por duplicado para confirmar la reproducibilidad. Se realizo normalizacion con U6. Las flechas en el lado izquierdo muestran los transcritos identificados.

Figura 1B. Se confirmo la expresion de las RUC-T 291 y 73A (normalizada a ARNr 18S) por qRT-PCR (graficos) y analisis de micromatrices (numero normalizado bajo el grafico) en linfocitos CD5+/CD19+ normales y muestras de LLC malignas. Los p valores fueron significativos para comparacion estadlstica de datos tanto de qRT-PCR como de micromatrices. Cada caja representa la distribucion de la expresion medida para pacientes normales (azul) y con LLC (rojo), los extremos de las cajas definen los percentiles 25° y 75°, una llnea indica la mediana, las barras definen los percentiles 10° y 90°.

Figura 1C. Numero de RUC expresadas en uno o mas de 19 tejidos, como se revela por analisis de micromatrices; se indican los numeros de tipo RUC (E, N, P). Se descubrieron cuatro tipos de transcripcion: RUC expresadas de forma ubicua (en 18 o 19 de 19 tejidos diferentes), RUC expresadas en la mayorla de los tejidos (10 a 17), RUC expresadas en una minorla de tejidos (2 a 9) y RUC expresadas de forma especlfica de tejido.

Figura 1D. Porcentaje de cada tipo de RUC (E, N, P) que se transcribe de forma ubicua (tanto uni- como bidireccionalmente) en todos los tejidos analizados; los numeros absolutos para cada tipo de RUC se muestran en las cajas.

Figura 1E. Expresion de las RUC de cadena con sentido o antisentido 73, 133 y 269, en relacion con ARNr 18S. en linfocitos B CD19+ de tres donantes diferentes. Se uso RT-PCR en tiempo real especlfica de cadena con sentido/antisentido para validar la expresion especlfica de cadena de las RUC observadas con analisis de micromatriz; la desviacion tlpica +1 promedio de los resultados de micromatrices para muestras CDS+ esta bajo cada grafico. Las sondas de micromatrices se denominan de la siguiente manera: la sonda genomica con sentido se denomina “+”, mientras que la sonda para la secuencia complementaria se denomina “A+”.

Figuras 2A-2B. Agrupamiento jerarquico de tejidos y tumores de acuerdo con la expresion de RUC. Grupo no supervisado de (Figura 2A) 22 tejidos humanos normales y (Figura 2A\B) 133 leucemias y carcinomas realizado usando las RUC no exonicas de la microplaca. Algunas de las RUC-T que diferencian bien los tipos tisulares (Figura 2A) o carcinomas de leucemias (Figura 2B) se expanden a la derecha. Las muestran estan en columnas, las RUC-T en filas. Un gen de color verde esta regulado negativamente en comparacion con su expresion mediana en todas las muestras, el rojo esta regulado positivamente y el amarillo significa sin variacion. El perfil de RUC completo de tejidos y tumores puede encontrarse en las Figuras 5 y 6.

Figuras 3A-3E. Las RUC-T representan dianas directas de miARN (SEC ID N° 1-3, 2, 4-8 y 2, respectivamente, en orden de aparicion):

Figura 3A. Ejemplos de sitios de complementariedad RUC-T::miARN. El emparejamiento uc.348::miR-155 se muestra como un ejemplo de bajos niveles de complementariedad en contraste con los otros 4 genes emparejados que interaccionan para los que se encuentran niveles mayores de complementariedad.

Figura 3B. La correlacion por qRT-PCR para expresion de miR-155, uc.160 y uc.346A en 9 pacientes con LLC. Se usaron linfocitos de cuatro individuos diferentes como controles normales.

Figura 3C. La interaccion directa de miARN::RUC-T. Represion relativa de expresion de luciferasa de luciernaga normalizada para un control de transfeccion, luciferasa de Renilla. Se uso pGL-3 (Promega) como el vector vaclo. Todos los experimentos se realizaron de cuatro a ocho veces por triplicado (n=12-24).

Figura 3D. Los efectos de la transfeccion de miR-155 en celulas MEG-O1 en los niveles de expresion de uc.160 y uc.346A. Los efectos se midieron por qRT-PCR a las 0, 24 y 48 horas despues de la transfeccion.

Figura 3E. Se presentan dos representaciones de dispersion entre valores de expresion de mir-24-1 y uc.160 y de miR-155 y uc.346A. La llnea de regresion muestra la correlacion negativa entre estos dos genes. El nombre de las sondas de matrices correspondientes se presentan en los ejes Y y X. Ambas sondas reconocen la forma madura del gen de miARN.

Figuras 4A-4D. RUC-T 73A(P) actua como un oncogen en celulas de cancer de colon:

Figura 4A. La inhibicion de la expresion por diversos ARNip en celulas COLO-320. Como valor de referencia se uso un control de ARNip de Dharmacon. Se usaron los dos ARNip mas eficaces y un grupo de cuatro ARNip diferentes, incluyendo estos dos.

Figura 2B. Los efectos antiproliferativos de la reduccion en la expresion genica de uc.73A(P) usando ARNip- uc73A en celulas de cancer colorrectal COLO-320. Todos los resultados representan la mediana de tres

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experimentos por triplicado independientes. Los niveles de expresion de uc. 73A (P) se midieron por RT-PCR. Dos asteriscos indican un efecto estadisticamente significativo en P<0,01, mientras que uno en P<0,05.

Figura 4C. Los niveles reducidos de uc.73A(P) (usando diversos ARNip) dan como resultado apoptosis potenciada como se muestra por el ensayo de tincion de Anexina V en celulas COLO-329. Como valor de referencia se uso un control de ARNip de Dharmacon.

Figura 4D. La inhibicion de uc.73A(P) por diversos ARNip no influyo en la supervivencia de celulas de cancer de colon SW620. Todos los resultados representan la mediana de tres experimentos por triplicado independientes.

Figura 5. Expresion de RUC en tejidos normales y malignos humanos por transferencia de Northern. Se presenta la expresion para uc.192(N) y uc.246(E) en celulas mononucleares normales (CMN) y muestras de LLC. Se realizo normalization con sonda U6. Las flechas en el lado izquierdo muestran los transcritos identificados. Bajo la imagen del gel estan los promedios de valores de expresion normalizados para RUC en muestras de LLC y CMN de experimentos de micromatrices; los p valores fueron de estadistica de ANOVA.

Figura 6. Expresion de RUC en tejidos normales y malignos humanos por qRT-PCR. Muestras de expresion genica relativa por qRT-PCR en linfocitos positivos para CD5+/CD19+ y leucemia linfocitica cronica humana (LLC). Se indican los valores de micromatrices de RUC de muestras de LLC y CD5+ bajo el grafico; los p valores fueron de estadistica de ANOVA.

Figura 7. Perfil de expresion de RUC-T de 22 tejidos humanos normales. El agrupamiento de tejidos y RUC revelo un patron definido de expresion de RUC en tejidos humanos normales. Las muestras se muestran en columnas, las RUC-T en filas. Un gen en color verde esta regulado negativamente en comparacion con su expresion mediana en todas las muestras, el rojo esta regulado positivamente y el amarillo significa sin variation.

Figura 8. Perfil de expresion de RUC-T de 173 canceres y tejidos normales correspondientes. Se separan muestras de celulas de sangre con leucemia y normal de cancer y tejido de origen epitelial. Las muestras se muestran en columnas, las RUC-T en filas. Un gen en color verde esta regulado negativamente en comparacion con su expresion mediana en todas las muestras, el rojo esta regulado positivamente y el amarillo significa sin variacion.

Figura 9. La expresion de gen uc.73A(P) en diversas lineas celulares de cancer de colon por RT-PCR cuantitativa. La expresion en colon normal representa el valor mediano de 4 muestras diferentes. Para normalizacion se uso beta actina.

Figura 10. La inhibition de uc.73A(P) por ARNip1 en celulas COLO-320 y SW-620 a las 48 horas. Se consiguieron niveles comparables de inhibicion con respecto a un ARNip de control (Dharmacom) en ambos tipos de celulas. A pesar de esto, los efectos biologicos se vieron solamente en celulas COLO-320, en las que la RUC-T se sobreexpresa aproximadamente 2,5 veces en comparacion con la expresion en colon normal.

Figura 11. Regulation negativa por interferencia pequena de uc.73A(P) induce apoptosis en celulas COLO-320 pero no en celulas SW-620. Datos obtenidos con ensayo de caspasa-3 en COLO-320 (panel superior), en el que se encontro un aumento significativo en celulas apoptoticas, y en las celulas de control SW620 (panel inferior), en las que no pudo encontrarse diferencia. cOlO-320 expresan altos niveles de uc.73A(P), mientras que en SW620 la expresion es comparable con la de los niveles de colon normales.

Figura 12 - Tabla 1. RUC expresadas diferencialmente mas significativas en leucemias y carcinomas.

Figura 13 - Tabla 2. Resultados de regresion de Poisson de efecto mixto como asociacion de RUC con regiones de interes.

Figura 14 - Tabla 3. RUC-T cuya expresion se correlaciona de forma inversa con miARN complementario expresado diferencialmente en pacientes con LLC.

Figura 15 - Tabla 4. Expresion de RUC-T en 22 tejidos normales humanos (3 por duplicado, de 2 individuos diferentes).

Figura 16 - Tabla 5. RUC-T expresadas diferencialmente en LLC, CCR y CHC identificadas por analisis de ANOVA a P<0,005 (software GeneSpring GX).

Figura 17 - Tabla 6. La localization genomica de RUC se correlaciona con RGAC (bases de datos como en (Bejerano et al., 2004); (Calin et al., 2004)).

Figura 18 - Tabla 7. Correlaciones negativas entre la expresion de miARN y RUC-T en pacientes con LLC. Toda la correlation negativa validada por el metodo de TFD a umbral de 0,01, o 1 % de resultados de falso positivo, y

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con una correlacion R menor de 0,40 se tuvo en cuenta.

Descripcion de realizaciones

Como se usa en el presente documento, una “RGAC” incluye cualquier region del ADN genomico que comprende un cambio genetico o epigenetico (o el potencial de un cambio genetico o epigenetico) que difiere de ADN normal, y que se correlaciona con un cancer. Los cambios geneticos a modo de ejemplo incluyen roturas mono y bicatenarias (incluyendo regiones de punto de rotura habituales en o cerca de posibles oncogenes o genes supresores de tumores); translocaciones cromosomicas; mutaciones, supresiones, inserciones (incluyendo integraciones virales, plasmldicas o transposonicas) y amplificaciones (incluyendo duplicaciones genicas) en el ADN; regiones mlnimas de perdida de heterocigosidad (pDh) que sugieren la presencia de genes supresores de tumores; y regiones mlnimas de amplificacion que sugieren la presencia de oncogenes. Los cambios epigeneticos a modo de ejemplo incluyen cualquier cambio en los patrones de metilacion de ADN (por ejemplo, hiper o hipometilacion de ADN, especialmente en regiones promotoras).

Muchos de los genes de miR conocidos en el genoma humano estan en o cerca de RGAC, incluyendo 80 genes de miR que se localizan exactamente en regiones mlnimas de PDH o regiones mlnimas de amplificacion correlacionada con diversos canceres. Otros genes de miR se localizan en o cerca de regiones de punto de rotura, areas suprimidas o regiones de amplificacion.

Por ejemplo, los canceres asociados a RGAC incluyen leucemia (por ejemplo, LMA, LLC, leucemia prolinfocltica), cancer de pulmon (por ejemplo, carcinoma de pulmon microcltico y no microcltico), cancer esofagico, cancer gastrico, cancer colorrectal, cancer cerebral (por ejemplo, astrocitoma, glioma, glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, neuroblastoma), cancer de vejiga, cancer de mama, cancer del cuello uterino, cancer epitelial, cancer nasofarlngeo (por ejemplo, carcinoma de celulas escamosas oral o larlngeo), linfoma (por ejemplo, linfoma folicular), cancer uterino (por ejemplo, histiocitoma fibroso maligno), cancer hepatico (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), cancer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello), cancer renal, tumores de celulas germinales masculinas, mesotelioma maligno, slndrome mielodisplasico, cancer ovarico, cancer pancreatico o biliar, cancer de prostata, cancer de tiroides (por ejemplo, tumores tiroideos foliculares esporadicos) y cancer urotelial.

Como se usa en el presente documento, un “FRA” incluye cualquier sitio fragil poco habitual o habitual en un cromosoma; por ejemplo, uno que pueda inducirse sometiendo una celula a tension durante la replicacion del ADN. Por ejemplo, puede inducirse un FRA poco habitual sometiendo la celula a deficiencia de acido folico durante la replicacion de ADN. Puede inducirse un FRA habitual tratando la celula con afidocolina o 5-azacitidina durante la replicacion del ADN. La identificacion o induccion de sitios fragiles cromosomicos esta dentro de la experiencia de la tecnica; vease, por ejemplo, Arlt et al. (2003), Cytogenet. Genome Res. 100: 92-100 y Arlt et al. (2002), Genes, Chromosomes and Cancer 33: 82-92. Aproximadamente el 20 % de los genes de miR humanos conocidos se localizan en (13 miR) o a una distancia de 3 Mb (22 miR) de FRA clonados. De hecho, la incidencia relativa de genes de miR dentro de sitios fragiles aparece a una tasa 9,12 veces mayor que en sitios no fragiles. Ademas, despues de estudiar 113 sitios fragiles en un cariotipo humano, se ha descubierto que 61 genes de miR se localizan en la misma banda cromosomica que un FRA.

Por ejemplo, los canceres asociados a FRA incluyen cancer de vejiga, cancer esofagico, cancer de pulmon, cancer de estomago, cancer de rinon, cancer del cuello uterino, cancer ovarico, cancer de mama, linfoma, sarcoma de Ewing, tumores hematopoyeticos, tumores solidos y leucemia.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Deberla apreciarse por los expertos en la materia que las tecnicas desveladas en los ejemplos a continuation representan tecnicas que el inventor ha descubierto que actuan bien en la practica de la invencion, y por lo tanto pueden considerarse constituyentes de modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la materia deberlan apreciar, a la luz de la presente divulgation, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones especlficas que se desvelan y aun obtener un resultado parecido o similar sin alejarse del esplritu y alcance de la invencion.

Ejemplo 1

Los perfiles de todo el genoma revelan transcription extensiva de regiones ultraconservadas (RUC) en tejidos humanos normales.

Para investigar la implication de las RUC en canceres humanos, los inventores analizaron 481 regiones genomicas de mas de 200 pb de longitud (Bejerano et al., 2004b) por transferencia de Northern, PCR cuantitativa (qRT-PCR) y micromatrices.

Las sondas de RUC tanto exonicas (E) como no exonicas (N) detectaron transcritos (en orientation con sentido o antisentido - A) sobre un amplio intervalo de longitudes de diversos tejidos normales (Figura 1A y Figura 5).

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La longitud de dos de los transcritos se confirmo clonando el ADNc por 5' y 3'-RACE para el uc.246(E) exonico de colon humano normal y el uc.269A(N) no exonico de medula osea humana normal. Ninguno de estos ADNc contenla fases abiertas de lectura (ORF) de longitud significativa, lo que confirma su probable naturaleza no codificante de protelnas. Estos ADNc de longitud completa no cortados y empalmados, que se han denominado genes ultraconservados no codificantes, GUC-nc, son de longitud variable (aproximadamente 0,8 kb para el gen ultraconservador GUC.246 y aproximadamente 1,8 kb y 2,8 kb para el gen ultraconservador GUC.269A).

La transcripcion de estos GUC-nc puede iniciarse a partir de regiones genomicas ricas en poliadenina, como se propuso recientemente para varios ARNnc largos de raton (Furuno et al., 2006).

Los inventores compararon los niveles de transcripcion de varias RUC de tejido normal y enfermo usando analisis de micromatrices seguido de qRT-PCR y confirmation por transferencia de Northern. La expresion de uc.291(P) y uc. 73A(P) fue significativamente mayor en linfocitos CD5+/CD19+ normales que en celulas LLC (P < 0,05) (Figura 1B). Los datos obtenidos con esta plataforma de micromatrices se han confirmado en diversos estudios (Calin et al., 2005a; Yanaihara et al., 2006; Volinia et al., 2006).

La potencia de los datos de los inventores se refuerza por el hecho de que dos conjuntos independientes de celulas CD5 normales se incluyeron en experimentos de micromatrices y de RT-PCR cuantitativa. Cuando se investigaron tanto uc.291(P) como uc.73A(P) por qRT-PCR y micromatrices en dos conjuntos diferentes de linfocitos B CD5/CD19 positivos y linfocitos B malignos, la expresion diferencial fue estadlsticamente significativa por ambos ensayos (Figura 1B).

Ademas, la qRT-PCR y transferencia de Northern para once y seis RUC, respectivamente, proporcionaron resultados que eran concordantes con resultados de micromatrices (Figura 5 y Figura 6).

Usando analisis de micromatrices, se descubrio que la mayorla de las RUC transcritas (que se han nombrado aqul RUC-T) se expresaban en tejidos humanos normales tanto de forma ubicua como de manera especlfica de tejido (Figura 1C).

Aproximadamente el 34 % de las RUC-T potenciales (325/962) tenlan senales de hibridacion con una intensidad sobre el fondo (calculada como senal promedio de puntos blancos + 2 DT) en las 19 muestras tisulares. El mayor numero de RUC-T se encontro en linfocitos B, mientras que el menor fue en ovarios. Aproximadamente el 93 % de las RUC (890 de 962) se expresaron sobre el fondo en al menos una muestra, y por lo tanto los inventores consideraron estas como RUC-T. Los tres tipos diferentes de RUC se transcribieron con frecuencias similares: 41 % de RUC exonicas, 33 % de RUC posiblemente exonicas y 30 % de RUC no exonicas.

La plataforma de micromatrices contiene RUC-T potenciales en orientation tanto con sentido como antisentido. Ochenta y cuatro de las 962 RUC (9 %) se transcribieron bidireccionalmente, mientras que 241 se transcribieron solamente a partir de una cadena, en todos los tejidos normales analizados (Figura 1D, Figura 1E y Tabla 4).

Ya que la identification de la transcripcion bidireccional por analisis de micromatrices puede impedirse por contamination de trazas con ADN genomico, se realizo una comparacion de resultados de micromatrices con qRT- PCR especlfica de cadena para uc.2 69(N), uc.233(E) y uc. 73(P). En los tres casos los datos fueron concordantes, mostrando transcripcion predominante de una cadena (Figura 1E).

Debe observarse que de las 156 RUC-T no exonicas expresadas en los 19 tejidos, 92 (-60 %) son intergenicas, mientras que 64 son intronicas. De estas ultimas, 37 estan en la orientacion antisentido en comparacion con el gen hospedador, lo que sugiere que aproximadamente el 83 % (129/156) de las RUC-T no exonicas no representaban transcripcion intronica de transcritos precursores largos de genes hospedadores conocidos, sino transcritos no codificantes independientes autenticos.

Como con los miARN (Liu et al., 2004), los inventores realizaron un agrupamiento jerarquico de la expresion de RUC-T en tejidos hematopoyeticos (representados por linfocitos B, linfocitos T y celulas mononucleares, cada uno recogido de dos individuos sanos) y tejidos no hematopoyeticos. Los mismos tipos de tejido de diferentes individuos se agruparon como los vecinos mas cercanos (Figura 2A y Figura 7).

Estos hallazgos demuestran que las RUC representan, en una proportion de casos significativa, transcritos no codificantes en tejidos humanos normales y que la expresion de estas RUC-T es especlfica de tejido.

Identificaciones de RUC distintas en leucemias y carcinomas humanos

Ya que se han descrito ampliamente alteraciones de la expresion genica extensivas en celulas cancerosas tanto para genes codificantes de protelnas como para miARN (Esquela-Kerscher y Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a; Calin y Croce, 2006b; Lu et al., 2005), los inventores han investigado la expresion de RUC en un panel de 173 muestras, que inclula 133 canceres humanos y 40 tejidos normales correspondientes.

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El agrupamiento jerarquico de las muestras mostro que diversos tipos de canceres se agrupaban de forma diferente segun sus origenes de desarrollo: las leucemias (LLC) y los tejidos hematopoyeticos normales se ramificaron por separado de los carcinomas colorrectal (CCR) y hepatocelular (CHC) con sus homologos normales (Figura 8); ademas, los grupos especificos de RUC parecian expresarse diferencialmente en tipos tumorales (Figura 2B).

Ya que diferentes tejidos tienen identificaciones de RUC especificas, este patron de agrupamiento podria ser la consecuencia de un diferente origen especifico de tejido de los tumores. Por lo tanto, se comparo la expresion de RUC entre las celulas normales y las tumorales del mismo origen. De las 962 RUC-T posibles, 88 (9,1 %) se expresaron diferencialmente a un nivel estadisticamente muy significativo (P< 0,005) en al menos un tipo de cancer (Tabla 1 y Tabla 5).

Se descubrieron RUC-T tanto reguladas negativamente como reguladas positivamente en canceres en comparacion con la expresion en tejidos normales correspondientes. Comparando cada tipo de cancer con los tejidos normales correspondientes, se descubrio que la identificacion de LLC estaba compuesta de 19 RUC (8 reguladas positivamente y 11 reguladas negativamente), la identificacion de CCR de 61 RUC (59 reguladas positivamente y 2 reguladas negativamente) y la identificacion de CHC de 8 RUC (3 reguladas positivamente y 5 reguladas negativamente) (Tabla 5).

Dieciocho transcritos de las identificaciones fueron RUC exonicas (20 %), 28 fueron RUC posiblemente exonicas (32 %) y 42 fueron RUC no exonicas (48 %). De las 18 RUC-T exonicas, 9 representaban la direccion antisentido de los transcritos de genes codificantes de proteinas hospedadores conocidos. Se demostro por lo tanto que los perfiles de expresion de RUC-T pueden usarse para diferenciar canceres humanos.

Las RUC se localizan frecuentemente en sitios fragiles y regiones genomicas implicadas en canceres

Se comparo la localization genomica de RUC con la de alteraciones geneticas no aleatorias previamente indicadas identificadas en tumores humanos y sitios fragiles clonados (FRA) como se ha descrito (Calin et al., 2004b). Los inventores usaron el conjunto de 186 miARN previamente indicado (Calin et al., 2004b) y un conjunto de 297 genes codificantes de proteinas de dedos de cinc (ZNF) (genome.ucsc.edu), una familia bien conocida de factores de transcription que se ha mostrado que estan asociados a cancer (Huntley et al., 2006).

Los inventores han indicado previamente que se localizan frecuentemente genes de miARN en sitios de FRA, grupos de genes HOX y regiones genomicas implicadas en cancer, tales como regiones minimas de perdida de heterocigosidad (PDH), y regiones minimas de amplification, denominadas globalmente regiones genomicas asociadas a cancer (RGAC) (Calin et al., 2004b).

Un estudio reciente, usando hibridacion genomica comparativa de matriz de alta resolution (aCGH), confirmo que los loci de miARN mostraban alteraciones genomicas a alta frecuencia en canceres humanos (Zhang et al, 2006). Ademas, analizando la expresion de miARN en lineas celulares NCI-60, otro grupo descubrio que los miARN supresores de tumores y oncogenicos candidatos se localizan en RGAC (Gaur et al, 2007).

Aqui, los inventores muestran que la asociacion entre la localizacion genomica de RUC y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es estadisticamente muy significativa y comparable con la indicada para miARN. Los factores de transcripcion de ZNF no mostraron ninguna asociacion significativa con ninguna de las regiones de interes analizadas (Tabla 2 y Tabla 6).

Hubo una falta similar de asociacion para la menor familia de genes codificantes de proteinas implicados en el corte y empalme de ARN (80 genes, datos no mostrados). Por ejemplo, la probabilidad de asociacion de RUC o miARN con regiones de PDH minimas frente a regiones genomicas no suprimidas fue menor de 0,001 en ambos casos (IRR de 2.02 y 4,08, respectivamente). Como control interno, se usaron los sitios de integration del virus del papiloma humano 16 (VPH 16), que aparecen frecuentemente en sitios FRA. Si las RUC se asocian significativamente con FRA, entonces los inventores esperaban encontrar una asociacion con el sitio de integracion de VPH 16. Esto es exactamente lo que se observo tanto para RUC como para miARN, pero no para genes codificantes de proteinas de ZNF (Tabla 2) o para los genes codificantes de proteinas implicados en el corte y empalme de ARN (datos no mostrados).

Datos adicionales ilustran la importancia de la localizacion genomica de RUC. En primer lugar, se descubrio que las RUC-T expresadas de forma ubicua (expresadas en 18 o 19 tejidos normales en la Figura 1C) se localizan significativamente mas frecuentemente en RGAC (P< 0,005, ensayo exacto de Fisher) en comparacion con todas las otras RUC (97 de 189 frente a 71 de 292). En segundo lugar, las RUC-T expresadas diferencialmente en canceres humanos se localizan en RGAC asociadas especificamente con ese tipo de cancer. Por ejemplo, la region cromosomica 13g21.33-g22.2 se ha ligado a la susceptibilidad a LLC familiar (Ng et al, 2007). No se han descubierto mutaciones en ninguno de los 13 genes codificantes de proteinas explorados dentro de este intervalo.

Los inventores identificaron un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353) localizadas dentro de esta RGAC. Dos de ellas, uc.349A(P) y uc.352(N) estan entre las RUC-T que se expresan diferencialmente entre celulas CD5 positivas

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de LLC-B malignas y normales.

Esto sugiere, al menos en este caso, que no son los genes codificantes de proteinas sino las RUC lo que representa a los culpables “desconocidos” localizados en la RGAC. Tomados juntos estos datos proporcionan pruebas de que las RUC se localizan en regiones genomicas alteradas durante el proceso maligno, y sugieren que las RUC-T podrian ser genes candidatos para susceptibilidad a cancer.

Regulacion negativa de RUC-T por interaccion directa con microARN

Para comenzar a caracterizar funcionalmente algunas RUC implicadas en canceres humanos, se realizo un estudio de expresion en todo el genoma en el mismo conjunto de muestras de LLC investigado anteriormente. Se descubrio que una identificacion de cinco RUC, uc.269A(N), uc.160(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N), fue capaz de diferenciar entre dos grupos de pronostico de LLC principales previamente diferenciados por la expresion de proteina asociada a zeta de 70 kDa (ZAP-70).

Estas cinco RUC-T presentaron variaciones en su nivel de expresion que se correlacionaban negativamente con la identificacion de expresion de miARN presentada en LLC (Cahn et al., 2005a) (Tabla 3).

Aunque sin desear quedar ligado a la teoria, el inventor del presente documento cree ahora que este hallazgo aumenta la posibilidad de mecanismos reguladores complejos entre miARN y RUC-T. Los inventores han identificado, por alineamiento de secuencias, que tres de las 5 RUC tienen complementariedad antisentido significativa con 5 de los 13 miARN de la identificacion, dando lugar a seis posibles pares de interaccion: uc.160::miR-24, uc.160::miR-155, uc.160::miR-223, uc.160::miR-146a, uc.346A::miR-155 y uc.-348::miR-29b (Figura 3A).

En este conjunto analizado de pares de miARN::RUC, la regla de complementariedad de “semilla de 6 bases” del extremo 5' descrita para la interaccion de miARN::ARNm era valida; ademas, los niveles de complementariedad en el extremo 3' podrian ser variables: mas del 60 % de complementariedad para pares de miR-24::uc160 o miR- 155::uc.346A a menos del 25 % para el par miR-155::uc.160. Como control, cuando se generan aleatoriamente combinaciones de cinco RUC y se compararon 13 miARN, la complementariedad con sentido y antisentido no fue significativa.

Las correlaciones negativas entre los valores de expresion de micromatriz de RUC-T especificas y miARN de interaccion predichos se confirmo por qRT-PCR para RUC-T seleccionadas y miARN de linfocitos de un conjunto independiente de pacientes con LLC y controles normales (Figura 3B).

Los inventores realizaron ensayos in vitro de interaccion de miARN::RUC que implicaban miR-155 que se sobreexpresa en la forma agresiva de LLC (Calin et al., 2005), algunos linfomas y carcinomas (Eis et al., 2005; Kluiver et al., 2005; Volinia et al., 2006) y miR-24-1 y miR29-b que portan mutaciones en transcritos primarios de pacientes con LLC (Calin et al., 2005a).

Los inventores clonaron las RUC uc.160(N), uc.346A(P) y uc.348(N) en vectores indicadores de luciferasa para evaluar la posible interaccion directa con miR-155, miR-24-1 o miR-29-b. Los inventores observaron reduccion uniforme y reproducible en expresion de luciferasa con cuatro emparejamientos miR::RUC-T coherentes con interacciones que tienen lugar in vitro (Figura 3C).

Por el contrario, uc.348(N) no interacciono con miR155 como se indica por el ensayo de luciferasa, un resultado que esta de acuerdo con la correlation de expresion positiva de estos dos genes en pacientes con LLC y la baja complementariedad de secuencia (Figura 3A).

Interacciones in vivo

Para determinar si estas interacciones se producen in vivo, los inventores transfectaron miR-155 en celulas de leucemia MEG01 y evaluaron los niveles de uc.346A y uc.160 (ambos bien expresados en esta linea celular). A las 24 horas despues de transfection, miR-155 redujo significativamente el nivel de expresion de ambas RUC-T; despues de 48 horas, la reduccion de los niveles de miR-155 exogenos fue analoga a un aumento en la expresion de RUC-T (Figura 3D).

Este efecto reversible apoya una regulacion de RUC-T por miARN especificos. Ya que esta interaccion se demostro para los genes de la “identificacion de ZAP-70”, los inventores investigaron las correlaciones entre la expresion de todos los miARN y RUC-T en cuanto a todo el genoma en los 50 pacientes con LLC. Resulta interesante que los inventores descubrieron una correlacion negativa significativa (a una tasa de falsa detection (TFD) de menos de 0,01) entre 87 miARN (de los 235 aplicados puntualmente en la microplaca, 37 %) y los niveles de expresion de RUC-T (Tabla 7).

Ademas, entre los genes correlacionados los inventores identificaron los pares miR-24-1::uc.160 y miR-

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155::uc346A(P), que se ha demostrado experimentalmente que interaccionan (Figura 3E).

Ademas, miR-155 y uc.348, que no interaccionaron experimentalmente, no eran miembros de esta lista. Otros pares de posibles agentes de interaccion para los que los inventores identificaron ensayos de luciferasa positivos fueron miR-15-a:: uc.78 y miR16:: uc. 78 (datos no mostrados). Por lo tanto, las RUC-T no codificantes representan posibles dianas de miARN, y estas interacciones pueden tener importancia biologica y de pronostico para pacientes de cancer.

Los RUC-T pueden actuar como oncogenes

Para expandir la caracterizacion funcional de RUC-T, se examinaron los efectos biologicos de uc. 73A (P) en un modelo de cancer. Ya que esta es una de las RUC-T reguladas positivamente mas estadlsticamente significativas en canceres de colon (P < 0,001), los inventores decidieron investigar los efectos de su regulacion negativa en celulas de cancer colorrectal COLO-320 que expresaban altos niveles de uc.73A(P). Como control los inventores usaron las celulas de cancer de colon SW620 en las que la expresion de este gen no difiere de celulas colonicas normales (Figura 9).

Se disenaron dos ARN de interferencia pequenos (ARNip1 y ARNip3), as! como un grupo de cuatro ARNip (grupo de ARNip), para dirigirse a uc. 73A(P) y se transfectaron en celulas COLO-320 y SW620. Hubo significativamente menos expresion de uc.73A(P) despues de 48 (Figura 4A y Figura 10), 72 y 144 horas (datos no mostrados) en las celulas COLO-320 tratadas con ARNip 1, 3 y el grupo. Se descubrio lo mismo tambien para celulas SW-620 (Figura 6).

El crecimiento de celulas COLO-320 se redujo significativamente despues de 144 horas de tratamiento con ARNip especlficos en comparacion con celulas de control no tratadas (nulas) o tratadas con ARNip (P < 0,05 a 96 horas y P < 0,005 a 144 horas) (Figura 4B).

En comparacion, la proliferacion de las celulas de control SW620 no cambio significativamente (P = 0,83 y P = 0,23 a las 96 y 144 horas, respectivamente) (datos no mostrados). Los estudios de ciclo celular revelaron un aumento en la fraccion sub-G1 de celulas (lo que sugiere la presencia de celulas apoptoticas, datos no mostrados) en celulas COLO-320, pero no en celulas SW620, un hallazgo confirmado por el ensayo de AnexinaV especlfica de apoptosis (Figura 4C y Figura 4D) y por ensayo de caspasa 3 (Figura 11).

Ademas, la intensidad de los efectos en la proliferacion celular y la supervivencia fueron proporcionales al grado de inhibicion por ARNip (Figura 4).

Estos datos sugieren que en canceres colorrectales, uc. 73A(P) se comporta como un oncogen aumentando el numero de celulas malignas como consecuencia de la apoptosis reducida.

Analisis

De acuerdo con el dogma de la oncologla molecular, el cancer es una enfermedad genetica que implica protelnas supresoras de tumores y oncogenicas (Bishop, 1991; Hunter, 1991; Weinberg, 1991). Recientes hallazgos apoyan en fuerte medida la implication de microARN en la patogenesis de una mayorla de los canceres analizados y anaden una mayor complejidad a la arquitectura molecular de canceres humanos (Calin et al., 2002; Esquela- Kerscher y Slack, 2006; Calin y Croce, 2006a). Los miARN representan, sin embargo, solamente un grupo particular de ARNnc implicados en canceres humanos. Se ha mostrado que los niveles de ARNnc intronico antisentido se correlacionan con el grado de diferenciacion tumoral en cancer de prostata (Reis et al., 2005) y que la expresion de ARNnc de MALAT-1 predice la metastasis y supervivencia en cancer de pulmon no microcltico de estadio temprano (Ji et al., 2003), lo que sugiere una mayor relation entre los ARNnc y la biologla tumoral.

Para abordar con claridad esta cuestion, los inventores investigaron al nivel genomico una nueva clase completa de ARNnc, concretamente las regiones ultraconservadas no codificantes transcritas (RUC-T). Los inventores usaron herramientas bioinformaticas para demostrar que las RUC se localizan en regiones genomicas que son diana durante el proceso de formation de tumores lo que es indicativo de una implicacion potencial en la tumorogenesis humana.

Como se muestra ahora en el presente documento, los inventores fueron capaces de clonar por amplification de RACE ADNc correspondientes a uc.246(E) y uc.269A(N), lo que demuestra que las RUC son genes autenticos (nombrados en el presente documento GUC-nc) que se expresan y pueden clonarse por metodos convencionales.

Diversas tecnicas de expresion incluyendo transferencia de Northern, qRT-PCR y realization de perfiles de micromatrices de todo el genoma, demostraron que las RUC se transcriben con frecuencia y que hay distintas identificaciones en leucemias y carcinomas humanos. Los inventores se centraron en la leucemia linfocltica cronica, la leucemia del adulto mas frecuente en el mundo Occidental (Chiorazzi et al., 2005), en carcinoma colorrectal, uno de los canceres mas comunes en palses industrializados (de la Chapelle, 2004) y en carcinoma hepatocelular, el

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tipo de cancer de mas rapido crecimiento en America (Wilson, 2005).

Los inventores descubrieron que para todos los tipos tumorales examinados, las celulas malignas tienen un espectro unico de RUC expresadas en comparacion con las celulas normales correspondientes, lo que sugiere que estan implicadas variaciones significativas en la expresion de RUC-T en el proceso de formacion de tumores.

La caracterizacion de la significacion funcional de alteraciones de la RUC-T en canceres humanos no es un asunto trivial. Se puede plantear la hipotesis de multitud de funciones potenciales de RUC-T, incluyendo un papel inhibidor antisentido para genes codificantes de protelnas y otros ARN no codificantes, o un papel como miARN “especlficos”, lo que significa miARN con peculiaridades tales como precursores muy largos (por ejemplo uc.339(P) que tiene una longitud de precursor que es el doble del miARN habitual). Este puzle se hace mas complicado por el hecho de que varias RUC no actuan como genes y se descubrio que tenlan funciones reguladoras como potenciadores (Nobrega et al., 2003; Pennacchio et al., 2006), mientras que otros representan exones de genes codificantes de protelnas con conexiones de cancer conocidas/desconocidas. Una region particularmente interesante es el locus DA CHI que contiene 7 RUC en aproximadamente 700 kb (Bejerano et al., 2004b). Tres de las RUC de esta region se expresan diferencialmente en canceres analizados, dos de los cuales son miembros de la identificacion de LLC. La mayorla de las regiones conservadas exploradas de este locus en un modelo de raton son potenciadores, incluyendo la uc.351(N) que no se expreso en ninguno de los tejidos analizados en el estudio de los inventores.

Resulta interesante que las dos unicas regiones que no consiguieron tener funcion potenciadora son uc.348(N) y uc.352(N), ambas clasificadas como no codificantes y ambas expresadas diferencialmente en canceres humanos. Aumenta adicionalmente el interes en estas RUC-T especlficas el hallazgo de que esta region genomica se ha ligado a susceptibilidad a LLC familiar y que ninguno de los genes codificantes de protelnas conocidos se mutaron (Ng et al, 2007).

Recientemente, se ha descubierto que aparecen bloques cortos de varias decenas de pb de las regiones no codificantes del genoma humano (denominados piknones) aparecen dentro de casi todos los genes codificantes de protelnas conocidos (Rigoutsos et al., 2006). Aunque los piknones son distintos de las RUC, el elemento ultraconservado que contiene el mayor numero de piknones (cuatro) fue uc. 73(P), que los inventores descubrieron que era una de las RUC-T mas diferencialmente expresadas tanto en LLC como en CCR. Estas intrigantes observaciones sugieren un posible papel regulador para uc. 73(P) en los genes codificantes con secuencias complementarias.

Expandiendo adicionalmente la implicacion de esta RUC-T en canceres humanos, los inventores fueron capaces de demostrar una funcion oncogenica para uc.73(P) en cancer de colon, ya que la disminucion de su sobreexpresion indujo apoptosis y tuvo efectos antiproliferativos especlficamente en celulas de cancer de colon que expresaban de forma anomala esta RUC-T.

Los hallazgos de los inventores de que otra clase de ARNnc, las RUC-T, esta alterada uniformemente a nivel genomico en un alto porcentaje de leucemias y carcinomas analizados, apoya un modelo en el que estan implicados genes tanto codificantes como no codificantes y cooperan en tumorogenesis humana (Calin y Croce, 2006b).

Ademas, las correlaciones entre la expresion de RUC y miARN en pacientes con LLC plantea la intrigante posibilidad de rutas reguladoras funcionales complejas en las que dos o mas tipos de ARNnc interaccionan e influyen en el fenotipo.

Los inventores tambien demostraron la existencia de la interaccion de miR-NA::RUC-T en la que interaccionan dos tipos diferentes de ARNnc.

Los inventores descubrieron que los GUC-nc estan uniformemente alterados a nivel genomico en un alto porcentaje de leucemias y carcinomas, y pueden interaccionar con miARN en leucemias. Los hallazgos proporcionan apoyo para un modelo en el que genes tanto codificantes como no codificantes estan implicados en y cooperan en tumorogenesis humana.

Ejemplo I

Procedimientos experimentales

A) Clonacion por RACE y analisis de expresion por micromatrices, qRT-PCR y transferencia de Northern

1) Clonacion por RACE

Se analizo la expresion de seis RUC (uc.47(N), uc.110(N), uc.192(N), uc.246(E), uc.269A(N) y uc.352(N)) en el cerebro, el testlculo, la medula osea, el intestino delgado, colon y tejido hepatico usando diversas combinaciones de cebadores de PCR disenados para amplificar productos cortos. Estos productos incluyeron 40meros usados para sondas en analisis de micromatrices y la secuencia de RUC completa de > 200 pb. Dos de los productos de RUC,

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uno exonico, uc.246(E) y uno no exonico, uc.269A(N), se clonaron por Amplificacion Rapida de Extremos de ADNc (RACE) en las direcciones tanto 5' como 3'. Las fuentes de tejido del que se clonaron secuencias fueron medula osea, leucocitos, cerebro fetal y clon de acuerdo con el protocolo del fabricante (Marathon-ready cDNAs, Clontech, Palo Alto, CA).

2) Estudio de expresion de RUC por micromatrices.

Se extrajo ARN total con Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de 19 tejidos humanos normales (Liu et al., 2004) y de 50 muestras de LLC de pacientes a los que se diagnostico LLC. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes en las instituciones del Consorcio de Investigation de LLC en los Estados Unidos. Como controles, se usaron linfocitos B CDS+ de 6 individuos sanos (cuatro muestras distintas, siendo dos grupos de dos individuos sanos diferentes) y celulas mononucleares (MNC) de 3 individuos como se indica en (Calin et al., 2005a). Tambien se extrajo ARN de 78 carcinomas colorrectales primarios, 21 mucosas colonicas normales, 9 carcinomas hepatocelulares primarios y 4 hlgados normales, recogidos en la Universidad de Ferrara, Universidad de Bolonia y Universidad Tor Vergata, Roma (Italia). Todas las muestras se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices institucionales para la protection de sujetos humanos.

Se desarrollaron microplacas de micromatrices con un total de 481 secuencias de RUC humanas como en (soe.ucsc.edu/-jill/ultra). Para cada RUC se disenaron dos sondas de 40 unidades, una correspondiente a la secuencia genomica con sentido (denominada “+”) y la otra a la secuencia complementaria (denominada “A+”). Los criterios de diseno fueron como se ha descrito (Liu et al., 2004). Cada oligo se imprimio por duplicado en dos localizaciones de portaobjetos diferentes, y por lo tanto estuvieron disponibles valores numericos por cuadruplicado para su analisis. Se usaron varios miles de puntos en blanco (3484) para resta de fondo. Se realizaron experimentos de extraction de ARN y micromatrices, consistentes en el ensamblaje de micromatriz de RUC, preparation de diana e hibridacion de matrices, como se describe en detalle en otra parte (Liu et al., 2004; Calin et al., 2004a).

Brevemente, se marcaron 5 mg de ARN de cada muestra tisular con biotina por transcription inversa usando hexameros aleatorios. Se llevo a cabo hibridacion en la segunda version de la microplaca de miARN de los inventores (numero de referencia de ArrayExpress: A-MEXP-258) que contenla las 962 sondas de RUC, 238 sondas para miARN maduro y 143 sondas para miARN precursores. Cada oligo se imprimio por duplicado en dos localizaciones de portaobjetos diferentes. Se detectaron senales de hibridacion por union con biotina de un conjugado de Estreptavidina - Alexa647 (senal de un color) usando un explorador GenePix 4000B (Axon Instruments). Se cuantificaron imagenes usando el GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments).

Se normalizaron los datos sin procesar y se analizaron en GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Los datos de expresion de las 22 muestras tisulares se normalizaron con funcion Lowess en Bioconductor (paquete de Limma) y despues se centraron en la mediana usando normalization de Gene-Spring; el umbral usado para determinar el nivel de expresion de RUC se calculo como el promedio de puntos blancos + 2 DT (desviacion tlpica). Los tumores se normalizaron usando la mediana de normalizacion en microplaca y en gen del software GeneSpring. Se realizo analisis de agrupamiento jerarquico usando enlace promedio y correlation de Pearson como medidas de similitud. Se realizaron comparaciones estadlsticas de tumores y tejidos normales filtrando segun factor de cambio y usando despues la estadlstica de ANOVA (Analisis de Varianza) del software Gene-Spring y la correction de Benjamin y Hochberg para reduction de falsos positivos. El filtro en factor de cambio se ajusto en 1,2 debido a que se demostro que este umbral, ya usado para microARN analizados con la misma microplaca [vease por ejemplo (Cahn et al., 2005a; Cimmino et al., 2005; Iorio et al., 2005)], reflejaba una diferencia biologica real. Las RUC-T expresadas diferencialmente entre pacientes con LLC, se agruparon de acuerdo con la expresion de protelna asociada a zeta de 70 kDa (ZAP-70), se identificaron combinando los resultados de ANOVA con el analisis de SAM (Analisis de Signification de Micromatrices) y PAM (Analisis de Prediction de Micromatrices). Su expresion se comparo con la de microARN (Calin et al., 2005a). Todos los datos se presentaron usando MIAMExpress a la base de datos ArrayExpress y pudieron recuperarse usando el numero de referencia E-TABM-184.

3) RT-PCR Cuantitativa para RUC

La RT-PCR cuantitativa fue el primer metodo que usaron los inventores para confirmar los resultados de micromatrices. Los inventores validaron los datos de micromatrices para once RUC, incluyendo uc. 73 (P)/73A (P), uc.135(E), uc. 160(N), uc.233(E)/233A(E), uc.269(N)/269A(N), uc.289(N), uc.291(P) y uc.346A(P) en diversas combinaciones de muestras, incluyendo de 15 a 17 muestras de LLC seleccionadas aleatoriamente del conjunto de matriz de 50, y diversos linfocitos B CD 19+/CD5+ normales y controles de linfocitos B y T por qRT-PCR. Se obtuvo un conjunto adicional de 3 linfocitos B normales CD19+/CD5+ positivos, no usados para estudios de micromatrices, de AllCells (Berkeley, CA), y se uso como un conjunto de confirmation independiente. En todos los casos los datos de qRT-PCR confirmaron los datos de micromatrices. El ARN se trato con DNasa I sin RNasa y se transcribio de forma inversa a ADNc usando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa SuperScript II. Para determinar si el transcrito de RUC con sentido o antisentido se expresaba, el ARN total se transcribio de forma inversa usando Thermoscript RT y un cebador especlfico de gen (es decir con sentido o antisentido). Las condiciones de RT fueron como se ha descrito (Schmittgen et al., 2004). Se amplifico ADNc usando PCR en tiempo real y detection de verde SYBR usando cebadores de PCR disenados para amplificar las mismas regiones de 40 pb que la sonda de oligo en

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la micromatriz. La cantidad relativa de cada RUC para ARNr 18S se determino usando la ecuacion 2”dcT, en la que dCT = (CTUCR- CTARNr18s). En relacion con la expresion genica los datos se multiplicaron por 106 para simplificar la presentacion.

4) Analisis de transferencia de Northern de RUC-T.

Los inventores analizaron cinco RUC, uc.110(N), uc.192(N), uc.246(E), uc.269A(N) y uc.352(N), por transferencia de Northern, dos de los cuales se clonaron despues por experimentos de RACE. Para una sexta, la uc. 47(N), los datos no se muestran. Se sometio ARN total a electroforesis en geles de PAA-urea al 15 % (Calin et al., 2002). Las fuentes de ARN inclulan 11 tejidos normales (mama, hlgado, pulmon, rinon y pancreas) por duplicado o triplicado (obtenidos de Ambion y Clontech) y 4 muestras de MNC normales y 16 muestras de LLC preparadas en el laboratorio. Como esto representa la investigacion por transferencia de Northern de la expresion de RUC, se usaron multiples muestras de los mismos tejidos para confirmar la reproducibilidad de los datos. Las sondas se disenaron para ser identicas a los oligonucleotidos en la microplaca para detectar los mismos transcritos que la micromatriz, y la hibridacion se realizo como se ha descrito (Calin et al., 2002).

B) Bases de datos y analisis estadlsticos.

1) Bases de datos para localizaciones genomicas.

Las bases de datos de RUC usadas para todos los estudios presentados en el presente documento son como se ha publicado (Bejerano et al., 2004b). Los inventores restringieron sus analisis a 481 segmentos de mas de 200 pares de bases (pb) de longitud. La base de datos de sitio Fragil (FRA) y las bases de datos de regiones genomicas asociadas con cancer (RGAC) son como se ha publicado previamente (Cain et al., 2004b).

2) Analisis estadlsticos para localizaciones genomicas.

Para ensayar las hipotesis que asocian la incidencia de regiones ultraconservadas (RUC) con sitios fragiles, regiones amplificadas en cancer y regiones de delecion en cancer, los inventores utilizaron modelos de regresion binomial negativa y de Poisson de efecto aleatorio. Segun estos modelos, los “acontecimientos” se definieron como el numero de RUC, y el “tiempo” de exposicion (es decir sitio fragil frente a sitio no fragil) se definio como longitudes no solapantes de la region de interes. La “longitud” de una region fue exacta, si se conocla, o estimada como 1 Mb si se desconocla. Por ejemplo, para cada cromosoma la longitud total de todos los sitios fragiles no solapantes se calculo y se uso como el tiempo de exposicion para sitios fragiles. Los inventores contaron despues el numero de RUC que apareclan dentro de sitios fragiles para cada cromosoma. Se supuso que la longitud restante de cada cromosoma (Mb total - Mb de sitios fragiles) era no fragil, y se supuso que las RUC restantes en cada cromosoma apareclan en la region no fragil. Despues para cada region, se ajustaron modelos de efectos aleatorios alternativos, los modelos de Poisson de ceros inflados y los binomiales negativos de ceros inflados y, de los tres, se selecciono el mejor modelo usando los Criterios de Information de Akaike (basandose en la probabilidad logarltmica y el numero de parametros). Este mismo enfoque se uso para analisis de los datos de expresion de protelnas de dedos de cinc. El modelo de mejor ajuste para sitios fragiles con RUC y PDH con protelnas de dedos de cinc fue el binomial negativo de ceros inflados. Para todos los otros casos, se presenta el modelo de Poisson. Cuando el numero de categorlas con cero acontecimientos era mayor de lo esperado para una distribution de Poisson, se prefirio el modelo binomial negativo de ceros inflados. Cuando el numero total de acontecimientos fue demasiado pequeno para una region, las probabilidades modelo fueron incapaces de converger y no se presentan los resultados. El efecto aleatorio en los modelos de Poisson, Poisson de ceros inflados y de regresion binomial negativa de ceros inflados, fue el cromosoma individual, porque se supuso que los datos dentro de un cromosoma estaban correlacionados. El efecto fijo en cada modelo consistla en una variable o variables indicadoras para el tipo de region que se compara. Los inventores presentan la relacion de tasa de incidencia (IRR), intervalo de confianza al 95 % de 2 caras de la relacion de tasa de incidencia, y p valores de 2 caras para ensayar la hipotesis de que la relacion de tasa de incidencia es de 1,0. Una IRR significativamente > 1 indica un aumento en el numero de RUC dentro de una region sobre lo esperado al azar.

Las proporciones de agrupamiento de miARN y protelnas de dedos de cinc se compararon usando un ensayo asintotico de la diferencia en dos proporciones independientes, en el que se indica la diferencia, el intervalo de confianza al 95 % de la diferencia y el p valor. Debe observarse que la clase de factores de transcription de ZNF de los genes mostro un agrupamiento significativamente menor (un grupo se define como la localization de al menos dos genes de la misma clase a menos de 50 kb de distancia genomica) en comparacion con los microARN (32 %, 95/297 genes de ZNF agrupados frente a 48 %, 90/186 miARN agrupados, diferencia=16,4 %, IC al 95 %=(7,5 %, 25,2 %), P< 0,001). Todos los calculos se completaron usando STATA v7.0 y StatXact v7.0.

3) Analisis estadlsticos para correlaciones negativas entre la expresion de micromatrices de RUC y miARN.

Se proporciona una description detallada en el Ejemplo II y los datos en el mismo. Brevemente, los datos aportados se constituyeron por una lista de RUC-T y por una lista de miARN (las “semillas”) y la matriz correspondiente de valores de expresion. Los inventores calcularon r, el coeficiente de rango de Spearman de correlation para cada par

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de genes (miR, UC); concretamente, los inventores evaluan los P valores de los ensayos de correlation y seleccionan los genes cuyo valor de correlacion es significativo a un valor dado de rechazo. Dado el gran numero de ensayos de correlacion realizados, se corrigieron los P valores para ensayo multiple usando la tasa de falsa detection (TFD), como en (Benjamini y Hochberg, 1995). De esta manera, los P valores controlan el numero de falsos positivos sobre el numero de ensayos verdaderamente nulos, mientras que la TFD controla el numero de falsos positivos sobre el numero de ensayos significativos.

C) Estudios funcionales

1) Regulation negativa de RUC por interaction directa con microARN.

Las secuencias genomicas de uc.160, uc.346A y uc.348 se clonaron en el vector de control pGL3 (Clontech) usando el sitio Xbal inmediatamente cadena abajo del codon de termination de luciferasa. Se cultivaron llneas celulares megacariocltica humana MEG-O1 y la de carcinoma del cuello uterino HeLa como se recomendo por la ATCC. Se cotransfectaron celulas en placas de 12 pocillos usando siPORT neoFX (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante usando 0,4 mg del vector indicador de luciferasa de luciernaga y 0,08 mg del vector de control que contiene luciferasa de Renilla, pRL-TK (Promega). Para cada pocillo se usaron 10 nM de precursor con sentido de miARN y oligonucleotidos mezclados (Ambion). Se midieron las actividades de luciferasa de Luciernaga y Renilla usando consecutivamente los ensayos de luciferasa dobles (Promega) 24 horas despues de la transfection. Todos los experimentos se realizaron por triplicado en de cuatro a seis dlas diferentes (n=12 a 18).

Se analizo la expresion tanto del ARN ultraconservado como del miARN maduro usando PCR en tiempo real. La expresion del ARN de RUC se determino por PCR en tiempo real como se ha descrito anteriormente. La expresion del miARN maduro se realizo usando ensayos de cebadores en bucle TaqMan para miR-155 (Applied Biosystems) como se describe (Chen et al., 2005). Se presento la expresion de miARN maduro como 2-dCT en la que dCT = CTmiARN - CT1 ARNr mc); los datos se multiplicaron por 106 para simplificar la presentation.

Para la correlacion del paciente se uso un conjunto de 13 muestras (incluyendo 9 pacientes con LLC y 4 muestras de linfocitos normales) y se analizaron los niveles de miR-155, uc.346A y uc.160 como se describe en el presente documento. Para la identification de los efectos “in vivo" en MEG01 de la transfeccion de miR-155, se midieron los niveles de uc.346A y uc.160 por qRT-PCR como se describe a las 0, 24 y 48 horas despues de la transfeccion con el pre-miARN 155 (Ambion) usando reactivo de Lipofectamine.

2) Efectos en la proliferation de celulas cancerosas por inhibition de uc. 73A(P).

El ARNip contra la uc. 73A(P) se diseno usando el algoritmo de Dharmacon (Dharmacon siDESIGN (harmacon.com/sidesign)) introduciendo la secuencia completa del RUC. Se ensayaron las ocho secuencias diana de mayor rango. El rendimiento se evaluo despues de 48, 72 y 144 horas despues de la transfeccion por RT-PCR semicuantitativa. Se usaron los dos ARNip mas eficaces y un grupo de cuatro ARNip diferentes, incluyendo estos dos. Los inventores denominaron a estos ARNip1, ARNip3 y grupoARNip. Para el ensayo de crecimiento celular, se cultivaron las llneas celulares de cancer de colon humano COLO-320 y SW620 en medio RPMI1640 complementado con FBS al 10 % y se sembraron 1 x 104 celulas en una placa de 96 pocillos un dla antes de la transfeccion. Las celulas se transfectaron con ARNip uc.73A(P) a una concentration final de 200 nM usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se uso el Grupo de ARNip Sin Direction siCONTROL (Dharmacon Research, La-Fayette, CO, Estados Unidos) como un control negativo. La transfeccion se repitio en las mismas condiciones cada dos dlas, a las 48 y a las 96 horas. Para evaluar el numero de celulas se uso el Ensayo de Proliferacion Celular CellTiter 96 Aqueous One (Promega U.S., Madison, WI, Estados Unidos). Las lecturas se realizaron a 0, 48, 96 y 144 horas, midiendo respectivamente la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de ELISA (Spectra mAx, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). El ensayo de crecimiento celular se realizo tres veces por triplicado para cada tratamiento. Las diferencias estadlsticas entre el numero de celulas en diversos puntos temporales con respecto al tiempo 0, se calcularon usando el ensayo de t.

Para los ensayos tanto de ciclo celular como de apoptosis, se sembraron celulas en placas de 6 pocillos a 6x105 celulas por pocillo. El dla despues y luego cada 48 horas, las celulas se transfectaron con ARNip 200 nM. Las celulas se recogieron y se fijaron en etanol al 70 % frlo durante al menos 30 minutos. Se realizo tincion con yoduro de propidio (PI) a las 48, 96 y 144 horas en una solution de PBS de PI 50 mg/ml (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y RNAsa sin DNAsa 5 mg/ml (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. Estados Unidos). La tincion de apoptosis se realizo con el Kit de Deteccion de Apoptosis de Anexina V-FITC (BD Pharmingen, San Jose, CA, Estados Unidos) y con el kit de apoptosis de anticuerpo de Caspasa-3 activo monoclonal conjugado con PE (BD Biosciences) a las 0 y 144 horas de acuerdo con el procedimiento del fabricante usando un FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, Estados Unidos) para adquirir los datos. Cada experimento se realizo tres veces.

Los numeros de referencia de GeneBank para las RUC-T clonadas descritas en este estudio son los siguientes: DQ644536 (UCG.246), DQ644537 (UCG.269A, forma corta), y DQ644538 (UCG.269A, forma larga).

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EJEMPLO II

Procedimientos experimentales

Analisis Estadisticos para correlaciones negativas entre la expresion de micromatrices de RUC y miARN.

Los datos de entrada se constituyeron por una lista de GUC y por una lista de miARN (las “semillas”) y la matriz correspondiente de valores de expresion. Los inventores calcularon r, el coeficiente de correlation por rangos de Spearman, una medida no parametrica de correlacion de tendencia de datos basada en clasificaciones, para cada par de genes (miR, RUC); concretamente, los inventores evaluan los P valores de los ensayos de correlacion y seleccionaron los genes cuyo valor de correlacion es significativo a un valor de rechazo dado. Se realizo evaluation de P valores suponiendo que los valores de correlacion se distribuyen usando distribucion acumulada de t de Student, con un numero de grados de libertad correspondiente al numero de muestras en el experimento de micromatrices. Los P-valores miden la “bondad” de las correlaciones individuales (entre pares de genes), por lo tanto, para entender si la correlacion real deriva por casualidad o representa una information biologicamente importante, los inventores eligen el metodo de permutaciones, cambiando el orden de las muestras para cada fila (miR o RUC) y calculando las correlaciones entre pares de genes (miR, RUC) con diferentes ordenes de muestras cambiados. Los inventores repitieron la permutation de muestras y correlaciones calculadas 100 veces, de esta manera, cada correlacion real tiene 100 correlaciones aleatorias con las que comparar. Usando todas las correlaciones aleatorias (100 * n° MIR * n° UC) y correlaciones reales, los inventores recalcularon los P-valores basandose en clasificacion de correlaciones aleatorias y position de las correlaciones reales.

Dado el alto numero de ensayos de correlaciones realizados, los P valores se corrigieron para multiples ensayos usando la tasa de falsa detection (TFD), como se define en (Benjamini y Hochberg, 1995). De esta manera, los P- valores controlan el numero de falsos positivos sobre el numero de ensayos verdaderamente nulos, mientras que la TFD controla el numero de falsos positivos sobre el numero de ensayos significativos. Se han propuesto varios modos de estimar este numero, y los inventores han adoptado la solution presentada por Tom Nichols (vease froi.sourceforge.net/documents/technical/ matlab/FDR), que cambia de escala el P valor obtenido en un unico ensayo multiplicandolo por una combination de indices relacionados con el numero total de ensayos realizados. Se realizo correction semilla a semilla, lo que significa que los genes en la lista de semillas se consideraron ensayos independientes. Esta triple filtration validada estadisticamente permite la extraction dirigida de una lista de genes candidatos, ahorrando de este modo recursos para el siguiente analisis genetico costoso y que requiere mucho tiempo.

Para construir una representation de dispersion entre los valores de expresion de miR-24-1 y uc.160, los inventores representaron una linea de regresion usando la funcion de MatLab ROBUSTFIT para explicar las hipotesis de correlacion negativa entre estos dos genes. Observese que solamente 11,67 % (7/60) de los puntos (pares de valores de expresion) son atipicos.

EJEMPLO III

Ejemplos adicionales e informacion

Como se usan en el presente documento, miR y RUC se usan indistintamente; incluyendo de una manera no limitante: un “producto genico de miR”, “microARN”, “miR” o “miARN” se refiere al transcrito de ARN no procesado (por ejemplo, precursor) o procesado (por ejemplo, maduro) de un gen de miR.

Diagnostico usando RUC (miARN)

En un aspecto, se proporcionan en el presente documento metodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer, que comprende medir el nivel de al menos una RUC en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del producto genico de miR en la muestra de ensayo con el nivel del producto genico de miR correspondiente en una muestra de control. Como se usa en este documento, un “sujeto” puede ser cualquier mamifero que tenga, o se sospeche que tiene, un cancer. En una realization preferida, el sujeto es un ser humano que tiene, o se sospecha que tiene, un cancer.

El nivel de al menos un producto genico de miR puede medirse en una muestra biologica (por ejemplo, celulas, tejidos) obtenida del sujeto. Por ejemplo, puede retirarse una muestra tisular (por ejemplo, de un tumor) de un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad relacionada con cancer por tecnicas de biopsia convencionales. En otra realizacion, puede retirarse una muestra de sangre del sujeto, y pueden aislarse celulas sanguineas (por ejemplo, globulos blancos) para extraccion de ADN por tecnicas convencionales. La muestra de sangre o tejido se obtiene preferentemente del sujeto antes del inicio de la radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento terapeutico. Puede obtenerse una muestra de tejido o sangre de control correspondiente de tejidos no aquejados del sujeto, de un individuo humano normal o de una poblacion de individuos normales, o de celulas cultivadas correspondientes a la mayoria de celulas en la muestra del sujeto. La muestra de tejido o sangre de control se procesa despues junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles del producto genico de miR producidos a partir de un gen de miR

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dado en celulas de la muestra del sujeto pueden compararse con los niveles del producto genico de miR correspondientes de celulas de la muestra de control. Tambien puede usarse como control un patron de expresion del miR de referencia para la muestra biologica.

Una alteracion (por ejemplo, un aumento o una reduccion) del nivel de un producto genico del miR en la muestra obtenida del sujeto, en relacion con el nivel de un producto genico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con cancer en el sujeto.

En una realizacion, el nivel del al menos un producto genico de miR en la muestra de ensayo es mayor que el nivel del producto genico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresion del producto genico de miR esta “regulada positivamente”). Como se usa en el presente documento, la expresion de un producto genico de miR esta “regulada positivamente” cuando la cantidad del producto genico de miR en una muestra celular o tisular de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto genico en una muestra celular o tisular de control.

En otra realizacion, el nivel del al menos un producto genico de miR en la muestra de ensayo es menor que el nivel del producto genico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresion del producto genico de miR esta “regulada negativamente”). Como se usa en el presente documento, la expresion de un gen de miR esta “regulada negativamente” cuando la cantidad de producto genico de miR producido a partir de ese gen en una muestra celular o tisular de un sujeto es menor que la cantidad producida del mismo gen en una muestra celular o tisular de control.

La expresion genica de miR relativa en las muestras de control y normales puede determinarse con respecto a uno o mas patrones de expresion de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresion de gen de miR cero, el nivel de expresion del gen de miR en una llnea celular convencional, el nivel de expresion del gen de miR en tejidos no aquejados del sujeto, o el nivel promedio de expresion del gen de miR previamente obtenido para una poblacion de controles humanos normales.

El nivel de un producto genico de miR en una muestra puede medirse usando cualquier tecnica que sea adecuada para detectar los niveles de expresion de ARN en una muestra biologica. Se conocen bien por los expertos en la materia tecnicas adecuadas (por ejemplo, analisis de transferencia de Northern, RT-PCR, hibridacion in situ) para determinar los niveles de expresion de ARN en una muestra biologica (por ejemplo, celulas, tejidos). En una realizacion particular, el nivel de al menos un producto genico de miR se detecta usando analisis de transferencia de Northern. Por ejemplo, puede purificarse ARN celular total de celulas por homogeneizacion en presencia de tampon de extraccion de acido nucleico, seguido por centrifugacion. Los acidos nucleicos se precipitan, y el ADN se retira por tratamiento con DNasa y precipitacion. Las moleculas de ARN se separan despues por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con tecnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. El ARN se inmoviliza despues en los filtros por calentamiento. La detection y cuantificacion del ARN especlfico se consigue usando sondas de ADN o ARN marcadas de forma apropiada complementarias con del ARN en cuestion. Vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capltulo 7, cuya divulgation completa se incorpora por referencia.

Pueden producirse sondas adecuadas para hibridacion de transferencia de Northern de un producto genico de miR dado a partir de las secuencias de acido nucleico e incluyen, pero sin limitation, sondas que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o complementariedad completa con un producto genico de miR de interes. Se describen metodos para la preparation de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para hibridacion de las mismas con secuencias de nucleotidos diana, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capltulos 10 y 11, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia.

En un ejemplo no limitante, la sonda de acido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionuclido, tal como

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H, P, P, C o S; un metal pesado; un ligando capaz de actuar como un miembro de par de union especlfico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo); una molecula fluorescente; una molecula quimioluminiscente; una enzima o similares.

Las sondas pueden marcarse con alta actividad especlfica mediante el metodo de traslacion de muesca de Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251 o mediante el metodo de uso aleatorio de cebadores de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132: 6-13, cuyas divulgaciones completas se incorporan en el presente documento por referencia. Este ultimo es el metodo elegido para sintetizar sondas marcadas con 32P de alta actividad especlfica de ADN monocatenario o de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleotidos preexistentes con nucleotidos altamente radiactivos de acuerdo con el metodo de traslacion de muesca, es posible preparar sondas de acido nucleico marcadas con 32P con una actividad especlfica bastante superior a 108 cpm/microgramo. Despues puede realizarse deteccion autorradiografica de hibridacion exponiendo los filtros hibridados a pellcula fotografica. La exploration densitometrica de las pellculas fotograficas expuestas por los filtros hibridados proporciona una medida precisa de los niveles de transcrito genico de miR. Usando otro enfoque, los niveles de transcrito genico de miR pueden cuantificarse por sistemas de captura de imagenes computarizadas, tales como el Molecular Dynamics 400- B 2D Phosphorimager disponible de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.

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Cuando el marcaje de radionuclidos de sondas de ADN o ARN no sea practico, puede usarse el metodo de cebador aleatorio para incorporar un analogo, por ejemplo, el analogo de dTTP 5-(W-(W-biotinil-epsilon-aminocaprollo)-3- aminoalilo) desoxiuridina trifosfato, en la molecula de sonda. El oligonucleotido sonda biotinilado puede detectarse por reaccion con protelnas de union a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-biotina) acoplados con colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.

Ademas de las tecnicas de hibridacion de Northern y otros ARN, puede conseguirse determinar los niveles de transcritos de ARN usando la tecnica de hibridacion in situ. Esta tecnica requiere menos celulas que la tecnica de transferencia de Northern e implica la deposicion de celulas completas en un cubreobjetos de microscopio y explorar el contenido de acido nucleico de la celula con una solucion que contiene sondas de acido nucleico marcado con radioactividad o de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta tecnica esta particularmente bien adaptada para analizar muestras de biopsia tisular de sujetos. La practica de la tecnica de hibridacion in situ se describe en mas detalle en la Patente de Estados Unidos n.° 5.427.916, cuya divulgacion completa se incorpora en el presente documento por referencia.

En un ejemplo no limitante, las sondas adecuadas para hibridacion in situ de un producto genico de miR dado pueden producirse a partir de las secuencias de acido nucleico, e incluyen, pero sin limitacion, sondas que tienen al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o complementariedad completa con un producto genico de miR de interes, como se ha descrito anteriormente.

El numero relativo de transcritos genicos de miR en celulas tambien puede determinarse por transcripcion inversa de transcritos genicos de miR, seguido de amplificacion de los transcritos de transcripcion inversa por reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de transcritos genicos de miR puede cuantificarse en comparacion con un patron interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen “constitutivo” presente en la muestra. Un gen “constitutivo” adecuado para uso como un patron interno incluye, por ejemplo, miosina o gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Se conocen bien por los expertos en la materia metodos para realizar RT-PCR cuantitativa y semi-cuantitativa y variaciones de las mismas.

En algunos casos, puede ser deseable determinar simultaneamente el nivel de expresion de una pluralidad de productos genicos de miR diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresion de los transcritos de todos los genes de miR conocidos correlacionados con un cancer. La evaluation de los niveles de expresion especlficos de cancer para cientos de genes de miR o productos genicos consume mucho tiempo y requiere una gran cantidad de ARN total (por ejemplo, al menos 20 mg para cada transferencia de Northern) y tecnicas autorradiograficas que requieren isotopos radiactivos.

Para superar estas limitaciones, puede construirse una oligobiblioteca, en formato de microplaca (es decir, una micromatriz), que contiene un conjunto de sondas oligonucleotldicas (por ejemplo, oligodesoxinucleotidos) que son especlficas para un conjunto de genes de miR. Usando dicha micromatriz, el nivel de expresion de multiples microARN en una muestra biologica puede determinarse por transcripcion inversa del ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana, e hibridarlos para explorar los oligonucleotidos en la micromatriz para generar un perfil de hibridacion, o expresion. El perfil de hibridacion de la muestra de ensayo puede despues compararse con el de una muestra de control para determinar que microARN tienen un nivel de expresion alterado en celulas cancerosas.

Como se usa en el presente documento, “oligonucleotido sonda” u “oligodesoxinucleotido sonda” se refiere a un oligonucleotido que es capaz de hibridar con un oligonucleotido diana. “Oligonucleotido diana” u “oligodesoxinucleotido diana” se refiere a una molecula para detectar (por ejemplo, mediante hibridacion). Por “oligonucleotido sonda especlfico de miR” u “oligonucleotido sonda especlfico para un miR” se entiende un oligonucleotido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto genico de miR especlfico, o con un transcrito inverso del producto genico de miR especlfico.

Un “perfil de expresion” o “perfil de hibridacion” de una muestra particular es esencialmente una identification genetica del estado de la muestra; mientras que dos estados pueden tener cualquier gen particular expresado de forma similar, la evaluacion de varios genes simultaneamente permite la generation de un perfil de expresion genica que es unico del estado de la celula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse de tejido canceroso (por ejemplo, tumor), y dentro del tejido canceroso, pueden determinarse diferentes estados de pronostico (por ejemplo, perspectivas de supervivencia a largo plazo buenas o malas). Comparando los perfiles de expresion del tejido canceroso en diferentes estados, se obtiene information acerca de que genes son importantes (incluyendo regulation positiva y negativa de genes) en cada uno de estos estados. La identificacion de secuencias que se expresan diferencialmente en tejido canceroso, as! como expresion diferencial que da como resultado resultados de pronostico diferentes, permite el uso de esta informacion de varias maneras.

En un ejemplo no limitante, puede evaluarse un regimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un farmaco quimioterapeutico actua para mejorar el pronostico a largo plazo en un paciente particular. De forma similar, puede realizarse o confirmarse el diagnostico comparando muestras de pacientes con perfiles de expresion

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En consecuencia, tambien se proporcionan en el presente documento metodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer, que comprenden transcribir de forma inversa ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana, hibridar los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleotidos sonda especlficos de miARN para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo, y comparar el perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra de control o patron de referencia, en el que una alteracion en la senal de al menos un miARN es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, cancer.

En una realizacion, la micromatriz comprende oligonucleotidos sonda especlficos de miARN para una parte sustancial de todos los miARN humanos conocidos. En una realizacion particular, la micromatriz comprende oligonucleotidos sonda especlficos de miARN para uno o mas miARN seleccionados del grupo que consiste en miR29a, miR-29b, miR-29c y combinaciones de los mismos.

La micromatriz puede prepararse a partir de sondas oligonucleotldicas especlficas de gen generadas a partir de secuencias de miARN conocidas. La matriz puede contener dos sondas oligonucleotldicas diferentes para cada miARN, conteniendo una la secuencia activa, madura y siendo la otra especlfica para el precursor del miARN. La matriz tambien puede contener controles, tales como una o mas secuencias de raton que difieren de ortologos humanos en solamente algunas bases, que pueden actuar como controles para condiciones de rigurosidad de hibridacion. Tambien pueden imprimirse ARNt u otros ARN (por ejemplo, ARNr, ARNm) de ambas especies en la microplaca, proporcionando un control positivo, interno, relativamente estable, para hibridacion especlfica. Tambien pueden incluirse en la microplaca uno o mas controles apropiados para hibridacion no especlfica. Para este fin, se seleccionan secuencias basandose en la ausencia de cualquier homologla con cualquier miARN conocido.

La micromatriz puede fabricarse usando tecnicas conocidas en este campo. Por ejemplo, oligonucleotidos sonda de una longitud apropiada, por ejemplo, 40 nucleotidos, se modifican con amina 5' en la posicion C6 y se imprimen usando sistemas de micromatrices disponibles en el mercado, por ejemplo, el aparato de micromatrices Gen- eMachine OmniGrid™ 100 y Portaobjetos activados Amersham CodeLink™. Se prepara oligomero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana por transcription inversa del ARN diana con cebador marcado. Despues de la slntesis de primera cadena, los hlbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan despues con la microplaca de micromatrices en condiciones hibridantes, por ejemplo, SSPE 6X/formamida al 30 % a 25 °C durante 18 horas, seguido de lavado en TNT 0,75X (Tris HCl/NaCl/Tween 20) a 37 °C durante 40 minutos. En posiciones en la matriz en las que el ADN sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce hibridacion. El ADNc diana marcado senala la posicion exacta en la matriz en la que se produce la union, permitiendo la detection y cuantificacion automatica. El resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridacion, que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc especlficas, y por lo tanto la abundancia relativa de los miR complementarios correspondientes, en la muestra del paciente.

De acuerdo con una realizacion, el oligomero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de una sonda marcada con biotina. La micromatriz se procesa despues por deteccion directa de los transcritos que contienen biotina, usando, por ejemplo, conjugado de Estreptavidina-Alexa647 y se explora utilizando metodos de exploracion convencionales. Las intensidades de imagenes de cada punto de la matriz son proporcionales a la abundancia del miR correspondiente en la muestra del paciente.

El uso de la matriz tiene varias ventajas para deteccion de expresion de miR. En primer lugar, la expresion global de varios cientos de genes puede identificarse en la misma muestra en un punto temporal. En segundo lugar, mediante un diseno cuidadoso de las sondas oligonucleotldicas, puede identificarse la expresion de moleculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparacion con el analisis de transferencia de Northern, la microplaca requiere una cantidad pequena de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 mg de ARN total. El numero relativamente limitado de miARN (algunos cientos por cada especie) permite la construction de una micromatriz comun para varias especies, con sondas olignucleotldicas definidas para cada una. Dicha herramienta permite el analisis de expresion trans-especie para cada miR conocido en diversas condiciones.

Ademas del uso para ensayos del nivel de expresion cuantitativa de miR especlficos, puede emplearse una microplaca que contienen oligonucleotidos sonda especlficos de miARN correspondientes a una parte sustancial de miRNoma, preferentemente el miRNoma completo, para llevar a cabo el perfil de expresion genica de miR, para analisis de los patrones de expresion de miR. Pueden asociarse identificaciones de miR definidas con marcadores de enfermedades establecidos, o directamente con una patologla.

De acuerdo con los metodos de realizacion de perfiles de expresion descritos en el presente documento, se transcribio de forma inversa cuantitativamente ARN total de una muestra de un sujeto que se sospechaba que tenia

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una enfermedad relacionada con cancer para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana marcados complementarios del ARN en la muestra. Los oligodesoxinucleotidos diana se hibridan despues con una micromatriz que comprende oligonucleotidos sonda especlficos de miARN para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra. El resultado es un perfil de hibridacion para la muestra que representa el patron de expresion de miARN en la muestra. El perfil de hibridacion comprende la senal de la union de los oligodesoxinucleotidos diana de la muestra con los oligonucleotidos sonda especlficos de miARN en la micromatriz. El perfil puede registrarse como la presencia o ausencia de union (senal frente a senal cero).

Mas preferentemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la senal de cada hibridacion. El perfil se compara con el perfil de hibridacion generado a partir de una muestra de control normal, es decir, no cancerosa. Una alteracion en la senal es indicativa de la presencia de, o propension a desarrollar, cancer en el sujeto.

Otras tecnicas para medir la expresion genica de miR tambien estan dentro de la experiencia de este campo, e incluyen diversas tecnicas para medir las tasas de transcripcion y degradacion de ARN.

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para determinar el pronostico de un sujeto con un cancer, que comprenden medir el nivel de al menos un producto genico de miR que se asocia a un pronostico particular en una enfermedad relacionada con cancer (por ejemplo, un pronostico bueno o positivo, un pronostico malo o adverso), en una muestra ensayo del sujeto.

De acuerdo con estos metodos, una alteracion en el nivel de un producto genico de miR que se asocia a un pronostico particular en la muestra de ensayo, en comparacion con el nivel de un producto genico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene un cancer con un pronostico particular. En una realization, el producto genico de miR se asocia a un pronostico adverso (es decir, malo). Los ejemplos de un pronostico adverso incluyen, pero sin limitation, baja tasa de supervivencia y rapida progresion de la enfermedad. En ciertas realizaciones, el nivel del al menos un producto genico de miR se mide por transcripcion inversa de ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana, hibridacion de los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleotidos sonda especlficos de miARN para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo, y comparacion del perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra de control.

Sin desear quedar ligado a ninguna teorla, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o mas productos genicos de miR en celulas pueden dar como resultado la desregulacion de una o mas dianas pretendidas para estos miR, lo que puede conducir a la formation de canceres. Por lo tanto, la alteracion del nivel del producto genico de miR (por ejemplo, reduciendo el nivel de un producto genico de miR que esta regulado positivamente en celulas cancerosas, aumentando el nivel de un producto genico de miR que esta regulado negativamente en celulas cancerosas) puede tratar con exito el cancer.

En consecuencia, se proporciona adicionalmente en el presente documento metodos para inhibir la tumorogenesis en un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, un cancer en el que al menos un producto genico de miR esta desregulado (por ejemplo, regulado negativamente, regulado positivamente) en las celulas cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un producto genico de miR aislado esta regulado negativamente en las celulas cancerosas (por ejemplo, familia de miR-29), el metodo comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto genico de miR aislado, o una variante aislada o fragmento biologicamente activo de la misma, de modo que la proliferation de celulas cancerosas en el sujeto esta inhibida.

Por ejemplo, cuando un producto genico de miR esta regulado negativamente en una celula cancerosa en un sujeto, la administration de una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado al sujeto puede inhibir la proliferacion de la celula cancerosa. El producto genico de miR aislado que se administra al sujeto puede ser identico al producto genico de miR de tipo silvestre endogeno (por ejemplo, un producto genico de miR) que esta regulado negativamente en la celula cancerosa o puede ser una variante o un fragmento biologicamente activo del mismo.

Como se define en el presente documento, una “variante” de un producto genico de miR se refiere a un ARNm que tiene menos de 100 % de identidad con un producto genico de miR de tipo silvestre correspondiente y posee una o mas actividades biologicas del producto genico de miR de tipo silvestre correspondiente. Los ejemplos de dichas actividades biologicas incluyen, pero sin limitacion, inhibition de la expresion de una molecula de ARN diana (por ejemplo, inhibicion de la traduction de una molecula de ARN diana, modulation de la estabilidad de una molecula de ARN diana, inhibicion del procesamiento de una molecula de ARN diana) e inhibicion de un proceso celular asociado a cancer (por ejemplo, diferenciacion celular, crecimiento celular, muerte celular). Estas variantes incluyen variantes de especie y variantes que son la consecuencia de una o mas mutaciones (por ejemplo, una sustitucion, una deletion, una insertion) en un gen de miR. En ciertas realizaciones, la variante es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% identica a un producto genico de miR de tipo silvestre correspondiente.

Como se define en el presente documento, un “fragmento biologicamente activo” de un producto genico de miR se refiere a un fragmento de ARN de un producto genico de miR que posee una o mas actividades biologicas de un

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producto genico de miR de tipo silvestre correspondiente. Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de dichas actividades biologicas incluyen, pero sin limitation, inhibition de la expresion de una molecula de ARN diana e inhibicion de un proceso celular asociado a un cancer. En ciertas realizaciones, el fragmento biologicamente activo es de al menos aproximadamente 5, 7, 10, 12, 15 o 17 nucleotidos de longitud.

En una realization particular, un producto genico de miR aislado puede administrarse a un sujeto en combination con uno o mas tratamientos antineoplasicos adicionales. Los tratamientos antineoplasicos adecuados incluyen, pero sin limitacion, quimioterapia, radioterapia y combinaciones de los mismos (por ejemplo, quimiorradiacion).

Cuando el al menos un producto genico de miR aislado esta regulado positivamente en las celulas cancerosas, el metodo comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un producto genico de miR, denominado en el presente documento compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR, de modo que se inhiba la proliferation de las celulas cancerosas. En una realizacion particular, el al menos un compuesto de inhibicion de la expresion de miR es especlfico para un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en la familia de miR29, incluyendo miR-29a, miR-29b, miR-29c, y combinaciones de los mismos.

Los terminos “tratar”, “tratando” y “tratamiento”, como se usan en el presente documento, se refieren a aliviar slntomas asociados a una enfermedad o afeccion, por ejemplo, un cancer, incluyendo prevenir o retardar la aparicion de los slntomas de enfermedad y/o reducir la gravedad o frecuencia de los slntomas de la enfermedad o afeccion. Se define en el presente documento que los terminos “sujeto”, “paciente” e “individuo” incluyen animales, tales como mamlferos, incluyendo, pero sin limitacion , primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas. En una realizacion preferida, el animal es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” de un producto genico de miR aislado es una cantidad suficiente para inhibir la proliferacion de una celula cancerosa en un sujeto que padece un cancer. Un experto en la materia puede determinar facilmente una cantidad eficaz de un producto genico de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el alcance de penetration de enfermedad; la edad, la salud y el sexo del sujeto; la via de administration; y si la administration es regional o sistemica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en el que un centlmetro cubico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto genico de miR aislado basandose en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. En ciertas realizaciones, la masa tumoral puede ser al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral o al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.

Una cantidad eficaz de un producto genico de miR aislado puede basarse tambien en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por via parenteral o por via enterica, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz del producto genico de miR aislado que se administra a un sujeto puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 3000 microgramos/kg de peso corporal, de aproximadamente 700 a 1000 microgramos/kg de peso corporal, o mas de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.

Un experto en la materia tambien puede determinar facilmente un regimen de dosificacion apropiado para la administracion de un producto genico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un producto genico de miR al sujeto una vez (por ejemplo, como una unica inyeccion o deposition). Como alternativa, una producto genico de miR puede administrarse una vez o dos veces al dla a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho dlas, mas particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez dlas. En un regimen de dosificacion particular, se administra un producto genico de miR una vez al dla durante siete dlas. Cuando un regimen de dosificacion comprende multiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto genico de miR administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de producto genico de miR administrado durante el regimen de dosificacion completo.

Como se usa en el presente documento, un producto genico de miR “aislado” es uno que se sintetiza, o se altera o retira del estado natural mediante intervention humana. Por ejemplo, se considera que un producto genico de miR sintetico, o un producto genico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural esta “aislado”. Un producto genico de miR aislado puede existir en forma sustancialmente purificada, o puede existir en una celula en la que se ha suministrado el producto genico de miR. Por lo tanto, un producto genico de miR que se suministra deliberadamente a, o se expresa en, una celula se considera un producto genico de miR “aislado”. Tambien se considera que un producto genico de miR producido dentro de una celula a partir de una molecula precursora de miR es una molecula “aislada”. De acuerdo con una realizacion particular, los productos genicos de miR aislados descritos en el presente documento pueden usarse para la fabrication de un medicamento

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para tratar un cancer en un sujeto (por ejemplo, un ser humano).

Pueden obtenerse productos genicos de miR aislados usando varias tecnicas convencionales. Por ejemplo, los productos genicos de miR pueden sintetizarse qulmicamente o producirse de forma recombinante usando metodos conocidos en la tecnica. En una realizacion, los productos genicos de miR se sintetizan qulmicamente usando ribonucleosido fosforamiditas protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores comerciales de moleculas de ArN sinteticas o reactivos de slntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, Estados Unidos), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, Estados Unidos), Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos), ChemGenes (Ashland, MA, Estados Unidos) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).

Como alternativa, los productos genicos de miR pueden expresarse a partir de plasmidos de ADN circular o lineal recombinante usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar ARN a partir de un plasmido incluyen por ejemplo, las secuencias promotoras de ARN pol III U6 o Hi, o los promotores de citomegalovirus. La seleccion de otros promotores adecuados esta dentro de la experiencia de la tecnica. Los plasmidos recombinantes de la invencion tambien pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresion de los productos genicos de miR en celulas cancerosas.

Los productos genicos de miR que se expresan a partir de plasmidos recombinantes pueden aislarse de sistemas de expresion de celulas cultivadas por tecnicas convencionales. Los productos genicos de miR que se expresan a partir de plasmidos recombinantes tambien pueden suministrarse a, y expresarse directamente en, las celulas cancerosas. El uso de plasmidos recombinantes para suministrar los productos genicos de miR a celulas cancerosas se analiza en mas detalle posteriormente.

Los productos genicos de miR pueden expresarse a partir de un plasmido recombinante separado, o pueden expresarse a partir el mismo plasmido recombinante. En una realizacion, los productos genicos de miR se expresan como moleculas precursoras de ARN a partir de un unico plasmido, y las moleculas precursoras se procesan en el producto genico de miR funcional por un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, pero sin limitacion, sistemas de procesamiento existentes dentro de una celula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular de Drosophila in vitro (por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2002/0086356 de Tuschl et al.), cuya divulgacion completa se incorpora en el presente documento por referencia y el sistema de RNAsa III de E. coli (por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2004/0014113 de Yang et al. cuya divulgacion completa se incorpora en el presente documento por referencia).

La seleccion de plasmidos adecuados para expresar los productos genicos de miR, metodos para insertar secuencias de acido nucleico en el plasmido para expresar los productos genicos, y metodos para suministrar el plasmido recombinante a las celulas de interes estan dentro de la experiencia de la tecnica. Vease, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; y Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508.

En una realizacion, un plasmido que expresa los productos genicos de miR comprende una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en el presente documento “bajo el control” de un promotor significa que las secuencias de acido nucleico que codifican el producto genico de miR se localizan 3' del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripcion de las secuencias codificantes del producto genico de miR.

Los productos genicos de miR tambien pueden expresarse a partir de vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos genicos de miR puedan expresarse a partir de dos vectores virales recombinantes separados, o a partir del mismo vector viral. El ARN expresado a partir de los vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas de expresion de celulas cultivadas por tecnicas convencionales, o puede expresarse directamente en celulas cancerosas. El uso de vectores virales recombinantes para suministrar los productos genicos de miR a celulas cancerosas se analiza en mas detalle posteriormente.

Los vectores virales recombinantes de la invencion comprenden secuencias que codifican los productos genicos de miR y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitacion, las secuencias promotoras de ARN pol III U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La seleccion de otros promotores adecuados esta dentro de la experiencia de la tecnica. Los vectores virales recombinantes de la invencion tambien pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresion de los productos genicos de miR en una celula cancerosa.

Puede usarse cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los productos genicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociado (VAA); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales puede modificarse por pseudotipacion de los vectores con protelnas de envoltura u otros antlgenos de superficie de otros

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virus, o sustituyendo diferentes protelnas de la capsida viral, segun sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivirales de la invencion pueden pseudotipificarse con protelnas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VEV), rabia, ebola, Mokola y similares. Puede hacerse que los vectores de VAA de la invencion se dirijan a celulas diferentes modificando tecnicamente los vectores para expresar diferentes serotipos de protelnas de la capsida. Por ejemplo, un vector de VAA que expresa una capsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina VAA 2/2. Este gen de la capsida de serotipo 2 en el vector de VAA 2/2 puede reemplazarse por un gen de en la capsida de serotipo 5 para producir un vector de VAA 2/5. Las tecnicas para construir vectores de VAA que expresan diferentes serotipos de protelnas de la capsida estan dentro de la experiencia de la tecnica; vease, por ejemplo, Rabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801, cuya divulgacion completa se incorpora en el presente documento por referencia.

La seleccion de vectores virales recombinantes adecuados para su uso en la invencion, metodos para insertar secuencias de acido nucleico para expresar ARN en el vector, metodos para suministrar el vector viral a las celulas de interes y recuperacion de los productos de ARN expresados estan dentro de la experiencia de la tecnica. Vease, por ejemplo, Dornburg (1995), Gene Therapy 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therapy 1:5-14; y Anderson (1998), Nature 392:25-30.

Son vectores virales particularmente adecuados los derivados de AV y VAA. Un vector de AV adecuado para expresar los productos genicos de miR, un metodo para construir el vector de AV recombinante, y un metodo para suministrar el vector a celulas diana, se describen en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010, cuya divulgacion completa se incorpora en el presente documento por referencia. Se describen vectores de VAA adecuados para expresar los productos genicos de miR, metodos para construir el vector de VAA recombinante, y metodos para suministrar los vectores a celulas diana en Samulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826; patente de Estados Unidos N.° 5.252.479; patente de Estados Unidos N.° 5.139.941; solicitud de patente internacional N.° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional N.° WO 93/24641. En una realizacion, los productos genicos de miR se expresan a partir de un unico vector de VAA recombinante que comprende el promotor temprano intermedio de CMV.

En una cierta realizacion, un vector viral de VAA recombinante de la invencion comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un ARN precursor de miR en conexion operativa con una secuencia de termination poliT bajo el control de un promotor de ARN U6 humano. Como se usa en el presente documento, “en conexion operativa con una secuencia de terminacion poliT” significa que las secuencias de acido nucleico que codifican las cadenas con sentido o antisentido estan inmediatamente adyacentes a la senal de terminacion poliT en la direction 5'. Durante la transcription de las secuencias de miR del vector las senales de terminacion poliT actuan para terminar la transcripcion.

En otras realizaciones de los metodos de tratamiento de la invencion, puede administrarse una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresion de miR al sujeto. Como se usa en el presente documento, “inhibir la expresion de miR” significa que la production de la forma precursora y/o activa, madura de producto genico de miR despues del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la materia puede determinar facilmente si la expresion de miR se ha inhibido en una celula cancerosa, usando, por ejemplo, las tecnicas para determinar el nivel de transcrito de miR analizado anteriormente para el metodo de diagnostico. La inhibition puede producirse en cuanto a expresion genica, (es decir, inhibiendo la transcripcion de un gen de miR que codifica el producto genico de miR) o en cuanto a procesamiento (por ejemplo, inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR maduro, activo).

Como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” de un compuesto que inhibe la expresion de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferation de una celula cancerosa en un sujeto que padece un cancer (por ejemplo, un cancer). Un experto en la materia puede determinar facilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibicion de la expresion de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores, tales como la talla y el peso del sujeto; el grado de penetration de la enfermedad; la edad, la salud y el sexo del sujeto; la via de administration; y si la administration es regional o sistemica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto de inhibicion de la expresion puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar, como se describe en el presente documento. Una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la expresion de miR tambien puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar, como se describe en el presente documento.

Un experto en la materia tambien puede determinar facilmente un regimen de dosificacion apropiado para administrar un compuesto que inhibe la expresion de miR a un sujeto dado.

Los compuestos adecuados para inhibir la expresion genica de miR incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia pequeno o corto o “ARNip”), acidos nucleicos antisentido y moleculas de ARN enzimaticas, tales como ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede dirigirse a un producto genico de miR dado e interferir con la expresion (por ejemplo, inhibir la traduction, inducir la escision o destruction) del producto genico de miR diana.

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Por ejemplo, la expresion de un producto genico de miR dado puede inhibirse induciendo interferencia de ARN del gen de miR con una molecula de ARN bicatenario (“ARNbc”) aislada que tiene al menos 90 %, por ejemplo, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %, de homologla de secuencia con al menos una parte del producto genico de miR. En una realizacion particular, la molecula de ARNbc es un “ARN de interferencia pequeno o corto” o “ARNip”.

El ARNip util en los presentes metodos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleotidos a aproximadamente 29 nucleotidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos de longitud. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria hibridadas entre si por interacciones de formacion de pares de bases de Watson-Crick convencionales (en lo sucesivo en el presente documento “con pares de bases”). La cadena con sentido comprende una secuencia de acido nucleico que es sustancialmente identica a una secuencia de acido nucleico contenida dentro del producto genico de miR diana.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de acido nucleico en un ARNip que es “sustancialmente identica” a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de acido nucleico que es identica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleotidos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moleculas de ARN monocatenario, complementarias, o pueden comprender una unica molecula en la que dos partes complementarias han formado pares de bases y estan unidas covalentemente por una unica area “en horquilla” monocatenaria.

El ARNip tambien puede ser ARN alterado que difiere de ARN de origen natural por la adicion, delecion, sustitucion y/o alteracion de uno o mas nucleotidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adicion de material no nucleotldico, tal como al extremo o los extremos de ARNip o a uno o mas nucleotidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestion por nucleasa, o la sustitucion de uno o mas nucleotidos en el ARNip con deoxirribonucleotidos.

Una o ambas cadenas del ARNip tambien pueden comprender un saliente 3'. Como se usa en el presente documento, un “saliente 3'” se refiere a al menos un nucleotido no emparejado que se extiende desde el extremo 3' de una cadena de ARN bicatenaria. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el ARNip comprende al menos un saliente 3' de 1 a aproximadamente 6 nucleotidos (que incluye ribonucleotidos o desoxirribunucleotidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleotidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleotidos de longitud, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleotidos de longitud. En una realizacion particular, el saliente 3' esta presente en ambas cadenas del ARNip y es de 2 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3' de acido ditimidllico (“TT”) o acido diuridllico (“uu”).

El ARNip puede producirse de forma qulmica o biologica, o puede expresarse a partir de un plasmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos genicos de miR aislados. Se describen metodos a modo de ejemplo para producir y ensayar moleculas de ARNbc o ARNip en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos N.° 2002/0173478 de Gewirtz y en la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n.° 2004/0018176 de Reich et al.

La expresion de un gen de miR dado tambien puede inhibirse por un acido nucleico antisentido. Como se usa en el presente documento un “acido nucleico antisentido” se refiere a una molecula de acido nucleico que se une con ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN, ARN-ADN o ARN-acido nucleico peptldico, que altera la actividad del ARN diana. Los acidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en los presentes metodos son acidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras de ARN-ADN, acido nucleico peptldico (PNA)) que generalmente comprenden una secuencia de acido nucleico complementaria de una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR. El acido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de acido nucleico que es 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria, o 95-100 % complementaria de una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR.

Sin desear quedar ligado a ninguna teorla, se cree que los acidos nucleicos antisentido activan RNasa H u otra nucleasa celular que digiere el producto genico de miR/doble cadena de acido nucleico antisentido.

Los acidos nucleicos antisentido tambien pueden contener modificaciones de la cadena principal de acido nucleico o de los restos de azucares y bases (o sus equivalentes) para potenciar la especificidad de diana, la resistencia nucleasa, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molecula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercaladores de doble cadena, tales como acridina, o uno o mas grupos resistentes a nucleasa.

Pueden producirse acidos nucleicos antisentido de forma qulmica o biologica, o pueden expresarse a partir de un plasmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos genicos de miR aislados. Estan dentro de la experiencia de la tecnica metodos a modo de ejemplo para producir y ensayar; vease, por ejemplo., Stein y Cheng (1993), Science 261:1004 y patente de Estados Unidos N.° 5.849.902 de Woolf et al.

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La expresion de un gen de miR dado tambien puede inhibirse por un acido nucleico enzimatico. Como se usa en el presente documento, un “acido nucleico enzimatico” se refiere a un acido nucleico que comprende una region de union a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de acido nucleico contigua de un producto genico de miR, y que es capaz de escindir especlficamente el producto genico de miR. La region de union al sustrato de acido nucleico enzimatico puede ser, por ejemplo, 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria, o 95100 % complementaria de una secuencia de acido nucleico contigua en un producto genico de miR. Los acidos nucleicos enzimaticos tambien pueden comprender modificaciones en los grupos de base, azucar y/o fosfato.

Los acidos nucleicos enzimaticos a modo de ejemplo para uso en los presentes metodos incluyen metiltransferasas de novo, incluyendo DNMT3A y DNMT3B, como se describe en los ejemplos del presente documento.

Los acidos nucleicos enzimaticos pueden producirse de forma qulmica o biologica, o pueden expresarse a partir de un plasmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos genicos de miR aislados. Se describen metodos a modo de ejemplo para producir y ensayar moleculas de ARNbc o ARNip en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense y Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31; y patente de Estados Unidos N.° 4.987.071 de Cech et al.

La administracion de al menos un producto genico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresion de miR, inhibira la proliferacion de celulas cancerosas en un sujeto que tiene un cancer.

Como se usa en el presente documento, “inhibir la proliferacion de una celula cancerosa” significa destruir la celula, o detener o ralentizar permanente o temporalmente el crecimiento de la celula. La inhibition de la proliferacion de celulas cancerosas puede inferirse si el numero de dichas celulas en el sujeto permanece constante o se reduce despues de la administracion de los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR. Tambien puede inferirse una inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas si el numero absoluto de dichas celulas aumenta, pero la velocidad del crecimiento tumoral se reduce.

El numero de celulas cancerosas en el cuerpo de un sujeto puede determinarse por medicion directa, o por estimation del tamano de masas tumorales primarias o metastasicas. Por ejemplo, el numero de celulas cancerosas en un sujeto puede medirse por metodos inmunohistologicos, citometrla de flujo u otras tecnicas disenadas para detectar marcadores de superficie caracterlsticos de celulas cancerosas.

El tamano de una masa tumoral puede determinarse por observation visual directa, o por metodos de captura de imagenes de diagnostico, tales como rayos X, captura de imagenes por resonancia magnetica, ultrasonidos y escintigrafla. Pueden emplearse metodos de captura de imagenes de diagnostico usados para determinar el tamano de la masa tumoral con o sin agentes de contraste, como se conoce en la tecnica. El tamano de una masa tumoral tambien puede determinarse por medios flsicos, tales como palpation de la masa tisular o medicion de la masa tisular con un instrumento de medicion, tal como un calibrador.

Los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR pueden administrarse a un sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar estos compuestos a celulas cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion de miR pueden administrarse por metodos adecuados para transfectar celulas del sujeto con estos compuestos, o con acidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos.

En una realization, las celulas se transfectan con un plasmido o vector viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR.

Se conocen bien en la tecnica metodos de transfection para celulas eucariotas, por ejemplo, inyeccion directa del acido nucleico en el nucleo o pronucleo de una celula; electroporation; transferencia de liposoma o transferencia mediada por materiales lipofilos; suministro de acido nucleico mediado por receptor, bioballstica o aceleracion de partlculas; precipitation de fosfato calcico y transfeccion mediada por vectores virales.

Por ejemplo, las celulas pueden transfectarse con un compuesto de transferencia liposomico, por ejemplo, DOTAP (N-[1-(2,3- dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio metil-sulfato, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTIN. La cantidad de acido nucleico usada no es crltica para la practica de la invention; pueden conseguirse resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de acido nucleico/105 celulas. Por ejemplo, puede usarse una relation de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmldico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105 celulas.

Un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR tambien puede administrarse a un sujeto por cualquier via de administracion enterica o parenteral adecuada. Las vlas de administracion entericas adecuadas para los presentes metodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vlas de administracion parenterales adecuadas incluyen, por ejemplo, administracion intravascular (por ejemplo, inyeccion de embolada intravenosa, infusion intravenosa, inyeccion de embolada intraarterial, infusion intraarterial e instilacion por cateter en la vasculatura); inyeccion peri- e intratisular (por ejemplo, inyeccion peritumoral e intratumoral,

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inyeccion intrarretiniana o inyeccion subretiniana); inyeccion o deposicion subcutanea, incluyendo infusion subcutanea (tal como por bombas osmoticas); aplicacion directa al tejido de interes, por ejemplo por un cateter u otro dispositivo de colocacion (por ejemplo, un microgranulo retiniano o un supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalacion. Son vlas de administracion particularmente adecuadas inyeccion, infusion e inyeccion directa en el tumor.

En los presentes metodos, puede administrarse un producto genico de miR o un compuesto de inhibicion de la expresion de producto genico de miR al sujeto bien como ARN desnudo, en combinacion con un reactivo de suministro, o como un acido nucleico (por ejemplo, un plasmido o vector viral recombinante) que comprende secuencias que expresan el producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion de producto genico de miR. Los reactivos de suministro adecuados incluyen, por ejemplo el reactivo lipofilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina), y liposomas.

Se analizan en el presente documento y/o se conocen bien en la tecnica plasmidos y vectores virales recombinantes que comprenden secuencias que expresan los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR y tecnicas para suministrar dichos plasmidos y vectores a celulas cancerosas.

En una realizacion particular, se usan liposomas para suministrar un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o acidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a un sujeto. Los liposomas tambien pueden aumentar la semivida en sangre de los productos genicos o acidos nucleicos. Pueden formarse liposomas adecuados para uso en la invencion a partir de llpidos formadores de veslculas convencionales, que generalmente incluyen fosfollpidos neutros o con carga negativa y un esterol, tal como colesterol. La seleccion de llpidos generalmente se gula por consideracion de factores, tales como el tamano de liposomas deseado y la semivida de los liposomas en el torrente sangulneo. Se conoce diversos metodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; y patentes de Estados Unidos N.° 4.235,871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Los liposomas para su uso en los presentes metodos pueden comprender una molecula ligando que dirige el liposoma a celulas cancerosas. Se prefieren ligandos que se unan con receptores prevalentes en celulas cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unan con antlgenos de celulas tumorales.

Los liposomas para su uso en los presentes metodos tambien pueden modificarse para evitar la elimination por el sistema de macrofagos mononucleares (“MMS”) y sistema reticuloendotelial (“RES”). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibicion de la opsonization en la superficie o incorporados en la estructura liposomica. En una realizacion particularmente preferida, un liposoma de la invencion puede comprender tanto un resto de inhibicion de la opsonizacion como un ligando.

Los restos inhibidores de la opsonizacion para su uso en la preparation de los liposomas de la invencion son normalmente pollmeros hidrofilos grandes que se unen con la membrana liposomica. Como se usa en el presente documento, un resto de inhibicion de la opsonizacion esta “unido” a una membrana liposomica cuando se une qulmica o flsicamente a la membrana, por ejemplo, por la intercalation de un anclaje soluble en llpidos en la membrana en si misma, o mediante union directamente con grupos activos de llpidos de membrana. Estos pollmeros hidrofilos inhibidores de la opsonizacion forman una capa superficial protectora que reduce significativamente la captation de los liposomas por los MMS y RES; por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 4.920.016.

Los restos inhibidores de la opsonizacion adecuados para modificar liposomas son preferentemente pollmeros solubles en agua con un peso molecular promedio en numero de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 dalton, y mas preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 dalton. Dichos pollmeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG, y estearato de PEG o PPG; pollmeros sinteticos, tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas o dendrimericas; acidos poliacrllicos; polialcoholes, por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol con los que se unen qulmicamente grupos carboxllicos o amino, as! como gangliosidos, tales como gangliosido GM1. Tambien son adecuados copollmeros de PEG, metoxi PEG, o metoxi PPG, o derivados de los mismos. Ademas, el pollmero inhibidor de la opsonizacion puede ser un copollmero en bloque de PEG y un poliaminoacido, polisacarido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleotido. Los pollmeros inhibidores de la opsonizacion tambien pueden ser polisacaridos naturales que contienen aminoacidos o acidos carboxllicos, por ejemplo, acido galacturonico, acido glucuronico, acido manuronico, acido hialuronico, acido peptico, acido neuramlnico, acido alglnico, carragenina; polisacaridos u oligosacaridos aminados (lineales o ramificados); o polisacaridos u oligosacaridos carboxilados, por ejemplo, que han reaccionado con derivados de acidos carbonicos con union resultante de grupos carboxllicos. Preferentemente, el resto inhibidor de la opsonizacion es un PEG, PPG o un derivado de los mismos. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan en ocasiones "liposomas PEGilados”.

El resto de inhibicion de la opsonizacion puede unirse con la membrana liposomica por una cualquiera de numerosas tecnicas bien conocidas. Por ejemplo, un N-hidroxi-succinimida ester de PEG puede unirse con un anclaje soluble en llpidos de fosfatidiletanolamina y despues unirse con una membrana. De forma similar, un

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pollmero de dextrano puede derivatizarse con un anclaje soluble en llpidos de estearilamina mediante aminacion reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla disolvente, tal como tetrahidrofurano y agua en una relacion 30:12 a 60 °C.

Los liposomas modificados con restos inhibidores de la opsonizacion permanecen en circulacion mucho mas tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razon, dichos liposomas se denominan en ocasiones liposomas “sigilosos”. Se sabe que los liposomas sigilosos se acumulan en tejidos alimentados por microvasculatura porosa o “filtrante”. Por lo tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de microvasculatura, por ejemplo, tumores, acumulara eficazmente estos liposomas; vease Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53. Ademas, la captation reducida por el RES reduce la toxicidad de liposomas sigilosos evitando la acumulacion significativa de los liposomas en el hlgado y el bazo. Por tanto, los liposomas que se modifican con restos de inhibition de la opsonizacion son particularmente adecuados para suministrar los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR (o acidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a celulas tumorales.

Los productos genicos de miR o compuestos de inhibicion de la expresion genica de miR pueden formularse como composiciones farmaceuticas, denominadas en ocasiones “medicamentos”, antes de administrarlos a un sujeto, de acuerdo con tecnicas conocidas en este campo. En consecuencia, la invention abarca composiciones farmaceuticas para tratar un cancer.

En una realization, la composition farmaceutica comprende al menos un producto genico de miR aislado o una variante aislada o fragmento biologicamente activo del mismo, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion particular, el al menos un producto genico de miR corresponde a un producto genico de miR que tiene un nivel de expresion reducido en celulas cancerosas en relacion con celulas de control adecuadas.

En otras realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden al menos un compuesto de inhibicion de la expresion de miR. En una realizacion particular, el al menos un compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR es especlfico para un gen de miR cuya expresion es mayor en celulas cancerosas que en celulas de control.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se caracterizan como al menos esteriles y sin pirogenos. Como se usa en el presente documento, las “composiciones farmaceuticas” incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los metodos para preparar composiciones farmaceuticas de la invencion estan dentro de la experiencia de la tecnica, por ejemplo como se describe en Remington's Pharmaceutical Science, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).

Las presentes composiciones farmaceuticas comprenden al menos un producto genico de miR o un compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (por ejemplo, 0,1 al 90 % en peso), o una sal fisiologicamente aceptable del mismo, mezclado con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden adicionalmente uno o mas agentes antineoplasicos (por ejemplo, agentes quimioterapeuticos). Las formulaciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden comprender al menos un producto genico de miR o un compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que estan encapsulados por liposomas y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende un gen o producto genico de miR que es uno o mas de miR29a, miR-29b y miR-29c.

Son vehlculos farmaceuticamente aceptables especialmente adecuados agua, agua tamponada, solution salina normal, solucion salina al 0,4 %, glicina al 0,3 %, acido hialuronico y similares.

En una realizacion particular, las composiciones farmaceuticas de la invencion comprenden al menos un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradation por nucleasas.

Un experto en la materia puede sintetizar facilmente acidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, por ejemplo, incorporando uno o mas ribonucleotidos que se modifican en la position 2' al producto genico de miR. Los ribonucleotidos modificados 2' adecuados incluyen los modificados en la posicion 2' con fluoro, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.

Composiciones farmaceuticas

Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien pueden comprender excipientes y/o aditivos farmaceuticos convencionales. Los excipientes farmaceuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste del pH. Los aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiologicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA O DTPA-bisamida) o complejos de quelados de calcio (tales como, por

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ejemplo, DTPA calcico, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo, cloruro calcico, ascorbato calcico, gluconato calcico o lactato calcico). Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden envasarse para su uso en forma llquida, o pueden liofilizarse.

Para composiciones farmaceuticas solidas de la invencion, pueden usarse vehlculos farmaceuticamente aceptables solidos no toxicos convencionales; por ejemplo, usos farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

Por ejemplo, una composicion farmaceutica solida para administration oral puede comprender cualquiera de los vehlculos y excipientes enumerados anteriormente y 10-95 %, preferentemente 25 %-75 %, del al menos un producto genico de miR o compuesto de inhibition de la expresion genica de miR (o a menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composicion farmaceutica para administracion de aerosol (por inhalation) puede comprender 0,01-20 % en peso, preferentemente 1%- 10% en peso, del al menos un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, y un propulsor. Tambien puede incluirse un vehlculo segun se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender ademas uno o mas agentes antineoplasicos. En una realization particular, las composiciones comprenden al menos un producto genico de miR o compuesto de inhibicion de la expresion genica de miR (o al menos un acido nucleico que comprende secuencias que los codifican) y al menos un agente quimioterapeutico. Los agentes quimioterapeuticos que son adecuados para los metodos de la invencion incluyen, pero sin limitation, agentes alquilantes de ADN, agentes antibioticos antitumorales, agentes anti metabolicos, agentes estabilizantes de tubulina, agentes desestabilizantes de tubulina, agentes antagonistas de hormonas, inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de protelna quinasa, inhibidores de HMG-CoA, inhibidores de CDK, inhibidores de ciclina, inhibidores de caspasa, inhibidores de metaloproteinasa, acidos nucleicos antisentido, ADN de triple helice, aptameros de acidos nucleicos y agentes virales, bacterianos y exotoxicos modificados molecularmente. Los ejemplos de agentes adecuados para las composiciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, arabinosido de citidina, metotrexato, vincristina, etoposido (VP-16), doxorrubicina (adriamicina), cisplatino (CDDP), dexametasona, arglabina, ciclofosfamida, sarcolisina, metilnitrosourea, fluorouracilo, 5-fluorouracilo (5FU), vinblastina, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, peroxido de hidrogeno, oxaliplatino, irinotecan, topotecan, leucovorina, carmustina, estreptozocina, CPT-11), taxol, tamoxifeno, dacarbacina, rituximab, daunorrubicina, 1-p-D-arabinofuranosilcitosina, imatinib, fludarabina, docetaxel, FOLFOX4.

Inhibidores de la tumorogenesis

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para identificar un inhibidor de tumorogenesis, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR en la celula. En una realizacion, el metodo comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado a los niveles de expresion reducidos en celulas cancerosas. Un aumento en el nivel del producto genico de miR en la celula despues de proporcionarse el agente, en relation con una celula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativo de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorogenesis.

En otras realizaciones, el metodo comprende proporcionar un agente de ensayo a una celula y medir el nivel de al menos un producto genico de miR asociado a niveles de expresion aumentados en celulas cancerosas. Una reduction en el nivel del producto genico de miR en la celula despues de proporcionarse el agente, en relacion con una celula de control adecuada (por ejemplo, no se proporciona agente), es indicativa de que el agente de ensayo es un inhibidor de la tumorogenesis. En una realizacion particular, al menos un producto genico de miR asociado a niveles de expresion aumentados en celulas cancerosas se selecciona del grupo que consiste en miR29a, miR-29b, miR-29c, y combinaciones de los mismos.

Los agentes adecuados incluyen, pero sin limitacion, farmacos (por ejemplo, moleculas pequenas, peptidos), y macromoleculas biologicas (por ejemplo, protelnas, acidos nucleicos). El agente puede producirse de forma recombinante, sintetica o puede aislarse (es decir, purificarse) a partir de una fuente natural. Se conocen bien en la tecnica diversos metodos para proporcionar dichos agentes a una celula (por ejemplo, transfection), y varios de dichos metodos se han descrito anteriormente en el presente documento. Tambien se conocen bien en la tecnica metodos para detectar la expresion de al menos un producto genico de miR (por ejemplo, transferencia de Northern, hibridacion in situ, RT-PCR, realizacion de perfiles de expresion). Varios de estos metodos tambien se han descrito anteriormente en el presente documento.

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EJEMPLO IV

Metodos, reactivos y kits para diagnostico, estadificacion, pronostico, supervision y tratamiento de enfermedades relacionadas con cancer

Debe entenderse que todos los ejemplos en el presente documento deben considerarse no limitantes en su alcance. Se describen diversos aspectos en mas detalle en las siguientes subsecciones.

Metodos de diagnostico

En una realizacion, se proporciona un metodo de diagnostico para evaluar si un paciente tiene una enfermedad relacionada con cancer o tiene un riesgo mayor de lo normal para desarrollar una enfermedad relacionada con cancer, que comprende las etapas de comparar el nivel de expresion de un marcador en una muestra de paciente y el nivel normal de expresion del marcador en un control, por ejemplo, una muestra de un paciente sin una enfermedad relacionada con cancer.

Un nivel de expresion significativamente mayor del marcador en la muestra del paciente en comparacion con el nivel normal es un indicio de que el paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer o tiene un riesgo mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer.

Los marcadores se seleccionan de modo que el valor predictivo positivo de los metodos sea al menos aproximadamente 10 %, y en ciertas realizaciones no limitantes, aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 % o aproximadamente 90 %. Tambien se prefieren para su uso en los metodos marcadores que se expresan diferencialmente, en comparacion con celulas normales, al menos el doble en al menos aproximadamente el 20 %, y en ciertas realizaciones no limitantes, aproximadamente el 50 % o aproximadamente el 75 %.

En un metodo de diagnostico para evaluar si un paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer (por ejemplo, nueva deteccion (“exploration”), detection de reaparicion, ensayo de reflejos), el metodo comprende comparar: a) el nivel de expresion de un marcador en una muestra de paciente, y b) el nivel normal de expresion del marcador en una muestra de enfermedad no relacionada con cancer de control. Un nivel de expresion significativamente mayor del marcador en la muestra de paciente en comparacion con el nivel normal es un indicio de que el paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer.

Tambien se proporcionan metodos de diagnostico para evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente. Dichos metodos comprenden comparar: a) la expresion de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente antes de proporcionar al menos una parte de la terapia al paciente, y b) expresion del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente despues de proporcionar la parte de la terapia. Un nivel significativamente menor de expresion del marcador en la segunda muestra en relation con la de la primera muestra es un indicio de que la terapia es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en el paciente.

Se apreciara que en estos metodos la “terapia” puede ser cualquier terapia para tratar una enfermedad relacionada con cancer incluyendo, pero sin limitation, composiciones farmaceuticas, terapia genica y terapia biologica tal como la administration de anticuerpos y quimiocinas. Por lo tanto, los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar un paciente antes, durante y despues de la terapia, por ejemplo, para evaluar la reduction en la patologla.

En ciertos aspectos, los metodos de diagnostico se dirigen a terapia usando un agente qulmico o biologico. Estos metodos comprenden comparar: a) la expresion de un marcador en una primera muestra obtenida del paciente y mantenida en presencia del agente qulmico o biologico, y b) expresion del marcador en una segunda muestra obtenida del paciente y mantenida en ausencia del agente. Un nivel significativamente menor de expresion del marcador en la segunda muestra en relacion con la de la primera muestra es un indicio de que el agente es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en el paciente. En una realizacion, las primera y segunda muestras pueden ser partes de una unica muestra obtenida del paciente o partes de muestras agrupadas obtenidas del paciente.

Metodos para evaluar el pronostico

Tambien se proporciona un metodo de supervision para evaluar la progresion de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente, comprendiendo el metodo: a) detectar en una muestra de paciente en un primer punto temporal, la expresion de un marcador; b) repetir la etapa a) en un punto temporal posterior en el tiempo; y c) comparar el nivel de expresion detectado en las etapas a) y b), y a partir del mismo supervisar la progresion de una enfermedad relacionada con cancer en el paciente. Un nivel significativamente mayor de expresion del marcador en la muestra en el punto temporal posterior en comparacion con el de la muestra en el primer punto temporal es un indicio de que la enfermedad relacionada con cancer ha progresado, mientras que un nivel significativamente menor de expresion es un indicio de que la enfermedad relacionada con cancer ha retrocedido.

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Se proporciona ademas un metodo de diagnostico para determinar si una enfermedad relacionada con cancer ha empeorado o es probable que empeore en el futuro, comprendiendo el metodo comparar: a) el nivel de expresion de un marcador en una muestra de paciente, y b) el nivel normal de expresion del marcador en una muestra de control. Un nivel significativamente mayor de expresion en la muestra de paciente en comparacion con el nivel normal es un indicio de que la enfermedad relacionada con cancer ha empeorado o es probable que empeore en el futuro.

Metodos para evaluar composiciones inhibidoras, terapeuticas y/o perjudiciales

Tambien se proporciona un metodo de ensayo para seleccionar una composition para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente. Este metodo comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende celulas del paciente; b) mantener por separado allcuotas de la muestra en presencia de una pluralidad de composiciones de ensayo; c) comparar la expresion de un marcador en cada una de las allcuotas; y d) seleccionar una de las composiciones de ensayo que reduce significativamente el nivel de expresion del marcador en la allcuota que contiene esa composicion de ensayo, en relation con los niveles de expresion del marcador en presencia de las otras composiciones de ensayo.

Se proporciona adicionalmente un metodo de ensayo para evaluar el potencial perjudicial de un compuesto para provocar una enfermedad relacionada con cancer. Este metodo comprende las etapas de: a) mantener allcuotas separadas de celulas en presencia y ausencia del compuesto; y b) comparar la expresion de un marcador en cada una de las allcuotas. Un nivel significativamente mayor de expresion del marcador en la allcuota mantenida en presencia del compuesto, en relacion con el de la allcuota mantenida en ausencia del compuesto, es un indicio de que el compuesto posee dicho potencial perjudicial.

Ademas, se proporciona adicionalmente un metodo para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente. Este metodo comprende las etapas de: a) obtener una muestra que comprende celulas del paciente; b) mantener por separado allcuotas de la muestra en presencia de una pluralidad de composiciones; c) comparar la expresion de un marcador en cada una de las allcuotas; y d) administrar al paciente al menos una de las composiciones que reducen significativamente el nivel de expresion del marcador en la allcuota que contiene esa composicion, en relacion con los niveles de expresion del marcador en presencia de las otras composiciones.

El nivel de expresion de un marcador en una muestra puede evaluarse, por ejemplo, detectando la presencia en la muestra de: la protelna marcadora correspondiente o un fragmento de la protelna (por ejemplo usando un reactivo, tal como un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario, que se une especlficamente con la protelna o el fragmento de protelna), el acido nucleico marcador correspondiente (por ejemplo, un transcrito de nucleotido, o un complemento del mismo), o un fragmento del acido nucleico (por ejemplo poniendo en contacto polinucleotidos transcritos obtenidos de la muestra con un sustrato que tiene fijado en el mismo uno o mas acidos nucleicos que tienen la secuencia de acido nucleico completa o un segmento de ella o un complemento de la misma), un metabolito que se produce directamente (es decir, se cataliza) o indirectamente por la protelna marcadora correspondiente.

Cualquiera de los metodos anteriormente mencionados puede realizarse usando al menos uno o una pluralidad (por ejemplo, 2, 3, 5 o 10 o mas) de marcadores de enfermedad relacionada con cancer. En dichos metodos, el nivel de expresion en la muestra de cada uno de una pluralidad de marcadores, al menos uno de los cuales es un marcador, se compara con el nivel normal de expresion de cada uno de la pluralidad de marcadores en muestras del mismo tipo obtenido de seres humanos de control no aquejados de una enfermedad relacionada con cancer. Un nivel significativamente alterado (es decir, aumentado o reducido como se ha especificado en los metodos anteriormente descritos usando un unico marcador) de expresion en la muestra de uno o mas marcadores, o alguna combination de los mismos, en relacion con el nivel normal o de control correspondiente de ese marcador, es un indicio de que el paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer. Para todos los metodos anteriormente mencionados, el marcador o los marcadores se seleccionan de modo que el valor predictivo positivo del metodo sea al menos aproximadamente 10 %.

Ejemplos de agentes candidatos

Los agentes candidatos pueden ser agentes farmacologicos ya conocidos en la tecnica o pueden ser agentes que previamente se desconocla que tuvieran ninguna actividad farmacologica. Los agentes pueden ser de origen natural o disenarse en el laboratorio. Pueden aislarse a partir de microorganismos, animales o plantas, o pueden producirse de forma recombinante, o sintetizarse por cualquier metodo qulmico adecuado. Pueden ser moleculas pequenas, acidos nucleicos, protelnas, peptidos o peptidomimeticos. En ciertas realizaciones, los agentes candidatos son compuestos organicos pequenos que tienen un peso molecular de mas de 50 y menos de aproximadamente 2.500 dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para interaction estructural con protelnas. Los agentes candidatos tambien se encuentran entres biomoleculas incluyendo, pero sin limitation: peptidos, sacaridos, acidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, analogos estructurales o combinaciones de los mismos.

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Se obtienen agentes candidatos de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Existen, por ejemplo, numerosos medios disponibles para sintesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos organicos y biomoleculas, incluyendo expresion de oligonucleotidos y oligopeptidos seleccionados aleatoriamente. Como alternativa, estan disponibles o se producen facilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales. Adicionalmente, se modifican facilmente bibliotecas y compuestos naturales o producidos de forma sintetica mediante medios quimicos, fisicos y bioquimicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. En ciertas realizaciones, los agentes candidatos pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en la tecnica de metodos de bibliotecas combinatorias, incluyendo, como ejemplo no limitante: bibliotecas biologicas; bibliotecas de fase solida o fase en solucion paralelas espacialmente direccionables; metodos de bibliotecas sinteticas que requiere desconvolucion; el metodo de biblioteca de “una perla un compuesto”; y metodos de bibliotecas sinteticas usando secuencias de cromatografia de afinidad.

En ciertas realizaciones adicionales, ciertos agentes farmacologicos pueden someterse a modificaciones quimicas dirigidas o aleatorias, tales como acilacion, alquilacion, esterificacion, amidificacion, etc. para producir analogos estructurales.

Los mismos metodos para identificar agentes terapeuticos para tratar una enfermedad relacionada con cancer tambien pueden usarse para validar compuestos/agentes candidatos generados a partir de estudios in vitro.

El agente candidato puede ser un agente que regule positiva o negativamente una o mas rutas de respuesta a enfermedad relacionada con cancer. En ciertas realizaciones, el agente candidato puede ser un antagonista que afecte a dicha ruta.

Metodos para tratar una enfermedad relacionada con cancer

Se proporcionan en el presente documento metodos para tratar, inhibir, aliviar o invertir una respuesta de enfermedad relacionada con cancer. En los metodos descritos en el presente documento, un agente que interfiere con una cascada de senalizacion se administra a un individuo que lo necesite, tal como, pero sin limitacion, pacientes con enfermedad relacionada con cancer en los que dichas complicaciones no son aun evidentes y los que ya tienen al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cancer.

En el primer caso, dicho tratamiento es util para evitar la aparicion de dicha respuesta de enfermedad relacionada con cancer y/o reducir el grado en el que se produce. En este ultimo caso, dicho tratamiento es util para reducir el grado en que se produce dicha respuesta de enfermedad relacionada con cancer, evitar su desarrollo posterior o invertir la respuesta de enfermedad relacionada con cancer.

En ciertas realizaciones, el agente que interfiere con la cascada de respuesta de enfermedad relacionada con cancer puede ser un anticuerpo especifico para dicha respuesta.

Expresion de marcadores

La expresion de un marcador puede inhibirse de varias maneras, incluyendo, como ejemplo no limitante, un oligonucleotido antisentido puede proporcionarse a las celulas con enfermedad relacionada con cancer para inhibir la transcription, traduction, o ambos, del marcador o los marcadores. Como alternativa, un polinucleotido que codifica un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especificamente con una proteina marcadora, y unido operativamente con una region promotora/reguladora apropiada, puede proporcionarse a la celula para generar anticuerpos intracelulares que inhibiran la funcion o la actividad de la proteina. La expresion y/o funcion de un marcador tambien puede inhibirse tratando la celula con enfermedad relacionada con cancer con un anticuerpo, derivado de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une especificamente con una proteina marcadora. Usando los metodos descritos en el presente documento, puede explorarse diversas moleculas, particularmente incluyendo moleculas suficientemente pequenas para que puedan cruzar la membrana celular, para identificar moleculas que inhiban la expresion de un marcador o inhiban la funcion de una proteina marcadora. El compuesto identificado de este modo puede proporcionarse al paciente para inhibir celulas con enfermedad relacionadas con cancer del paciente.

Puede usarse cualquier marcador o combination de marcadores, asi como cualquiera de ciertos marcadores en combination con los marcadores, en las composiciones, kits y metodos descritos en el presente documento. En general, es deseable usar marcadores para los que la diferencia entre el nivel de expresion del marcador en celulas con enfermedad relacionada con cancer y el nivel de expresion del mismo marcador de celulas normales sea tan grande como sea posible. Aunque esta diferencia puede ser tan pequena como el limite de detection del metodo para evaluar la expresion del marcador, es deseable que la diferencia sea al menos mayor que el error tipico del metodo de evaluation y, en ciertas realizaciones, una diferencia de al menos 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 100-, 500-, 1000 veces o mas con respecto al nivel de expresion del mismo marcador en tejido normal.

Se reconoce que ciertas proteinas marcadoras se secretan al espacio extracelular que rodea a las celulas. Estos marcadores se usan en ciertas realizaciones de las composiciones, los kits y los metodos, debido al hecho de que

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dichas protelnas marcadoras pueden detectarse en una muestra de fluido corporal asociada a cancer, que puede recogerse mas facilmente de un paciente humano que una muestra de biopsia tisular. Ademas, las tecnicas in vivo para deteccion de una protelna marcadora incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra la protelna. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localizacion en un sujeto puede detectarse por tecnicas de captura de imagenes convencionales.

Para determinar si cualquier protelna marcadora particular es una protelna secretada, la protelna marcadora se expresa, por ejemplo, en una celula de mamlfero, tal como una llnea celular humana, se recoge fluido extracelular, y se evalua la presencia o ausencia de la protelna en el fluido extracelular (por ejemplo usando un anticuerpo marcado que se une especlficamente con la protelna).

Se apreciara que pueden usarse muestras de paciente que contienen tejido y/o celulas en fluido en los metodos descritos en el presente documento. En estas realizaciones, el nivel de expresion del marcador puede evaluarse evaluando la cantidad (por ejemplo, cantidad absoluta o concentracion) del marcador en una muestra. La muestra celular puede, por supuesto, someterse a diversas tecnicas preparatorias y de almacenamiento despues de la recogida (por ejemplo, extraction de acido nucleico y/o protelna, fijacion, almacenamiento, congelation, ultrafiltracion, concentracion, evaporation, centrifugation, etc.) antes de evaluar la cantidad del marcador en la muestra.

Tambien se apreciara que los marcadores pueden desprenderse de las celulas en el sistema digestivo, el torrente sangulneo y/o espacios intersticiales. Los marcadores desprendidos pueden ensayarse, por ejemplo, examinando el suero o el plasma.

Las composiciones, los kits y los metodos pueden usarse para detectar la expresion de protelnas marcadoras que tienen al menos una parte que se presenta en la superficie de celulas que la expresan. Por ejemplo, pueden usarse metodos inmunologicos para detectar dichas protelnas en celulas completas, o pueden usarse metodos de analisis de secuencia basados en ordenador para predecir la presencia de al menos un dominio extracelular (es decir, incluyendo tanto protelnas secretadas como protelnas que tienen al menos un dominio de superficie celular). La expresion de una protelna marcadora que tiene al menos una parte que se presenta en la superficie de una celula que la expresa puede detectarse sin lisar necesariamente la celula (por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une especlficamente con un domino de superficie celular de la protelna).

La expresion de un marcador puede evaluarse por cualquiera de una amplia diversidad de metodos para detectar la expresion de un acido nucleico o una protelna transcritos. Los ejemplos no limitantes de dichos metodos incluyen metodos inmunologicos para la deteccion de protelnas secretadas, de superficie celular, citoplasmaticas o nucleares, metodos de purification de protelnas, ensayos de la funcion o actividad proteica, metodos de hibridacion de acido nucleico, metodos de transcription inversa de acido nucleico y metodos de amplification de acido nucleico.

En una realization particular, la expresion de un marcador se evalua usando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo radiomarcado, marcado con cromoforos, marcado con fluoroforos o marcado con enzimas), un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la protelna o el ligando de un par de protelna-ligando), o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monocatenario, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) que se une especlficamente con una protelna marcadora o fragmento de la misma, incluyendo una protelna marcadora que ha experimentado toda o una parte de su modification postraduccional normal.

En otra realizacion particular, la expresion de un marcador se evalua preparando ARNm/ADNc (es decir, un polinucleotido transcrito) a partir de celulas en una muestra de paciente e hibridando el ARNm/ADNc con un polinucleotido de referencia que es un complemento de un acido nucleico marcador, o un fragmento del mismo. Puede amplificarse ADNc, opcionalmente, usando cualquiera de diversos metodos de reaction en cadena de la polimerasa antes de hibridacion con el polinucleotido de referencia; preferentemente, no se amplifica. La expresion de uno o mas marcadores puede detectarse de forma similar usando PCR cuantitativa para evaluar el nivel de expresion del marcador o los marcadores. Como alternativa, puede usarse cualquiera de los muchos metodos para detectar mutaciones o variantes (por ejemplo, polimorfismos de un unico nucleotido, deleciones, etc.) de un marcador para detectar la aparicion de un marcador en un paciente.

En una realizacion relacionada, se pone en contacto una mezcla de los polinucleotidos transcritos obtenidos de la muestra con un sustrato que tiene fijado al mismo un polinucleotido complementario de u homologo de al menos una parte (por ejemplo, al menos 7, l0, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500, o mas restos de nucleotidos) de un acido nucleico marcador. Si los polinucleotidos complementarios u homologos son detectables diferencialmente en el sustrato (por ejemplo, detectables usando diferentes cromoforos o fluoroforos, o fijados en diferentes posiciones seleccionadas), entonces los niveles de expresion de una probabilidad de marcadores pueden evaluarse simultaneamente usando un unico sustrato (por ejemplo, una micromatriz de “microplaca genica” de polinucleotidos fijados en posiciones seleccionadas). Cuando se usa un metodo para evaluar la expresion de marcadores que implica hibridacion de un acido nucleico con otro, se desea que la hibridacion se realice en condiciones de hibridacion rigurosas.

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Ensayos de biomarcadores

En ciertas realizaciones, los ensayos de biomarcadores pueden realizarse usando espectrometrla de masas o resonancia de plasmon superficial. En diversas realizaciones, el metodo para identificar un agente activo contra una enfermedad relacionada con cancer 1 puede incluir a) proporcionar una muestra de celulas que contienen uno o mas marcadores o derivados de los mismos; b) preparar un extracto de dichas celulas; c) mezclar dicho extracto con una sonda de acido nucleico marcada que contiene un sitio de union a marcadores; y d) determinar la formacion de un complejo entre el marcador y la sonda de acido nucleico en presencia o ausencia del agente de ensayo. La etapa de determinacion puede incluir someter dicha mezcla de extracto/sonda de acido nucleico a un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforetico.

En ciertas realizaciones, la etapa de determinacion comprende un ensayo seleccionado de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos basados en fluorescencia y ensayos de rendimiento ultraalto, por ejemplo resonancia de plasmon superficial (SPR) o ensayos de espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS). En dichas realizaciones, el sensor de SPR es util para observation en tiempo real directa de interacciones biomoleculares ya que SPR es sensible a cambios en el Indice refractario mlnimos en una superficie dielectrica metalica. SPR es una tecnica superficial que es sensible a cambios de unidades del Indice refractario (IR) de 105 a 10-6 dentro de aproximadamente 200 nm de la interfaz de sensor/muestra de SPR. Por lo tanto, la espectroscopia de SPR es util para supervisar el crecimiento de pellculas organicas finas depositadas en la capa sensora.

Debido a que las composiciones, los kits y los metodos se basan en la detection de una diferencia en los niveles de expresion de uno o mas marcadores, se desea que el nivel de expresion de marcador sea significativamente mayor que el llmite de deteccion mlnimo del metodo usado para evaluar la expresion en al menos una de celulas normales y celulas aquejadas de cancer.

Se entiende que por exploration rutinaria de muestras de pacientes adicionales usando uno o mas de los marcadores, se determinara que algunos de los marcadores se sobreexpresan en celulas de diversos tipos, incluyendo enfermedades relacionadas con cancer especlficas.

Ademas, a medida que se evalua un mayor numero de muestras de pacientes con respecto a la expresion de los marcadores y los resultados de los pacientes individuales de los que se obtuvieron las muestras se correlacionan, tambien se confirmara que la expresion alterada de algunos de los marcadores esta correlacionada fuertemente con una enfermedad relacionada con cancer y que la expresion alterada de otros marcadores esta correlacionada fuertemente con otras enfermedades. Las composiciones, los kits y los metodos son por lo tanto utiles para caracterizar uno o mas del estadio, grado, tipo histologico y naturaleza de una enfermedad relacionada con cancer en pacientes.

Cuando las composiciones, los kits y los metodos se usan para caracterizar uno o mas del estadio, el grado, el tipo histologico, y la naturaleza de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente, se desea que el marcador o panel de marcadores se seleccione de modo que se obtenga un resultado positivo en al menos aproximadamente el 20 %, y en ciertas realizaciones, al menos aproximadamente el 40 %, 60 % u 80 %, y en sustancialmente todos los pacientes aquejados de una enfermedad relacionada con cancer del estadio, grado, tipo histologico o naturaleza correspondientes. El marcador o el panel de marcadores de la invention pueden seleccionarse de modo que se obtenga un valor predictivo positivo de mas de aproximadamente el 10 % para la poblacion general (en un ejemplo no limitante, acompanado de una especificidad de ensayo mayor del 80 %).

Cuando se usa una pluralidad de marcadores en las composiciones, los kits y metodos, el nivel de expresion de cada marcador en una muestra de paciente puede compararse con el nivel normal de expresion de cada uno de la pluralidad de marcadores en muestras no cancerosas del mismos tipo, bien en una unica mezcla de reaction (es decir usando reactivos, tales como sondas fluorescentes diferentes, para cada marcador) o en mezclas de reaccion individuales correspondientes a uno o mas de los marcadores. En una realization, un nivel significativamente aumentado de expresion de mas de uno de la pluralidad de marcadores en la muestra, en relation con los niveles normales correspondientes, es un indicio de que esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer. Cuando se usa una pluralidad de marcadores, pueden usarse 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 20, 30 o 50 o mas marcadores individuales; en ciertas realizaciones, puede desearse el uso de menos marcadores.

Para maximizar la sensibilidad de las composiciones, los kits y metodos (es decir por interferencia atribuible a celulas de origen no tisular y/o fluido en una muestra de paciente), es deseable que el marcador usado en los mismos sea un marcador que tenga una distribution tisular restringida, por ejemplo, normalmente no expresado en una celula no tisular.

Se reconoce que las composiciones, los kits y los metodos seran particularmente utiles para pacientes que tengan un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer y sus asesores medicos. Los pacientes que se ha reconocido que tienen un riesgo potenciado de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer incluyen, por ejemplo, pacientes que tienen un historial familiar de una enfermedad relacionada con cancer.

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El nivel de expresion de un marcador en celulas humanas normales puede evaluarse de diversas formas. En una realizacion, este nivel normal de expresion se evalua evaluando el nivel de expresion del marcador en una parte de las celulas que parecen ser normales y comparando este nivel normal de expresion con el nivel de expresion en una parte de las celulas que se sospecha que son anomalas. Como alternativa, y particularmente a medida que este disponible mas informacion como resultado de la realizacion rutinaria de los metodos descritos en el presente documento, pueden usarse valores de poblacion promedios para expresion normal de los marcadores. En otras realizaciones, el nivel “normal” de la expresion de un marcador puede determinarse evaluando la expresion del marcador en una muestra de pacientes obtenida de un paciente no aquejado de cancer, de una muestra de paciente obtenida de un paciente antes de la aparicion sospechada de una enfermedad relacionada con cancer en el paciente, de muestras de paciente archivadas, y similares.

Tambien se proporcionan en el presente documento composiciones, kits y metodos para evaluar la presencia de celulas con enfermedad relacionada con cancer en una muestra (por ejemplo una muestra tisular archivada o una muestra obtenida de un paciente). Estas composiciones, kits y metodos son sustancialmente iguales que los descritos anteriormente, excepto que, cuando sea necesario, las composiciones, los kits y metodos se adaptan para su uso con muestras distintas de las muestras de pacientes. Por ejemplo, cuando la muestra para usar es una muestra tisular humana archivada, parafinizada, puede ser necesario ajustar la relacion de compuestos en las composiciones, en los kits o los metodos usados para evaluar los niveles de expresion de marcadores en la muestra.

Metodos para producir anticuerpos

Tambien se proporciona en el presente documento un metodo para preparar un hibridoma aislado que produce un anticuerpo util para evaluar si un paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer. En este metodo, se sintetiza o alsla una protelna o un peptido que comprende la totalidad o un segmento de una protelna marcadora (por ejemplo por purificacion a partir de una celula en la que se expresa o por transcripcion y traduccion de un acido nucleico que codifica la protelna o el peptido in vivo o in vitro). Se inmuniza un vertebrado, por ejemplo, un mamlfero tal como un raton, una rata, un conejo o una oveja, usando la protelna o el peptido. El vertebrado puede opcionalmente (y preferentemente) inmunizarse al menos una vez mas con la protelna o el peptido, de modo que el vertebrado muestre una respuesta inmunitaria robusta a la protelna o el peptido. Se alslan esplenocitos del vertebrado inmunizado y se fusionan con una llnea celular inmortalizada para formar hibridomas, usando cualquiera de diversos metodos. Despues se exploran hibridomas formados de esta manera usando metodos convencionales para identificar uno o mas hibridomas que producen un anticuerpo que se une especlficamente con la protelna marcadora o un fragmento de la misma. Tambien se proporcionan en el presente documento hibridomas preparados por este metodo y anticuerpos preparados usando dichos hibridomas.

Metodos para evaluar la eficacia

Tambien se proporciona en el presente documento un metodo para evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo para inhibir celulas con enfermedad relacionada con cancer. Como se describe en el presente documento, las diferencias en el nivel de expresion de los marcadores se correlacionan con el estado anomalo de las celulas. Aunque se reconoce que los cambios en los niveles de expresion de algunos de los marcadores probablemente resulten del estado anomalo de las celulas, probablemente se reconozca que cambios en los niveles de expresion de otros de los marcadores induces, mantienen y promueven el estado anomalo de esas celulas. Por lo tanto, los compuestos que inhiben una enfermedad relacionada con cancer en un paciente provocaran que el nivel de expresion de uno o mas de los marcadores cambie a un nivel mas cercano al nivel normal de expresion para ese marcador (es decir el nivel de expresion para el marcador de celulas normales).

Este metodo comprende por lo tanto comparar la expresion de un marcador en una primera muestra celular y mantenida en presencia del compuesto de ensayo y expresion del marcador en una segunda muestra celular y mantenida en ausencia del compuesto de ensayo. Una expresion significativamente reducida de un marcador en presencia del compuesto de ensayo es un indicio de que el compuesto de ensayo inhibe una enfermedad relacionada con cancer. Las muestras celulares pueden, por ejemplo, ser allcuotas de una unica muestra de celulas normales obtenidas de un paciente, muestras agrupadas de celulas normales obtenidas de un paciente, celulas de una llnea celular normal, allcuotas de una unica muestra de celulas con enfermedad relacionada con cancer obtenidas de un paciente, muestras agrupadas de celulas con enfermedad relacionada con cancer obtenidas de un paciente, celulas de una llnea celular con enfermedad relacionada con cancer, o similares.

En una realizacion, las muestras son celulas con enfermedad relacionada con cancer obtenidas de un paciente y se ensaya una pluralidad de compuestos que se cree que son eficaces para inhibir diversas enfermedades relacionadas con cancer para identificar el compuesto que probablemente inhiba mejor la enfermedad relacionada con cancer en el paciente.

Este metodo puede usarse probablemente para evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente. En este metodo, se evalua el nivel de expresion de uno o mas marcadores

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en un par de muestras (una sometida a la terapia, la otra no sometida a la terapia). Como con el metodo para evaluar la eficacia de compuestos de ensayo, si la terapia induce un nivel un nivel significativamente menor de expresion de un marcador entonces la terapia es eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cancer. Como antes, si se usan muestras de un paciente seleccionado en este metodo, entonces pueden evaluarse terapias alternativas in vitro para seleccionar una terapia que mas probablemente sea eficaz para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en el paciente.

Metodos para evaluar potenciales perjudiciales

Como se describe en el presente documento, el estado anomalo de celulas humanas se correlaciona con cambios en los niveles de expresion de los marcadores. Tambien se proporciona un metodo para evaluar el potencial perjudicial de un compuesto de ensayo. Este metodo comprende mantener allcuotas separadas de celulas humanas en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. Se compara la expresion de un marcador en cada una de las allcuotas. Un nivel significativamente mayor de expresion de un marcador en la allcuota mantenido en presencia del compuesto de ensayo (en relacion con la allcuota mantenida en ausencia del compuesto de ensayo) es un indicio de que el compuesto de ensayo posee un potencial perjudicial. El potencial perjudicial relativo de diversos compuestos de ensayo puede evaluarse comparando el grado de potenciacion o inhibicion del nivel de expresion de los marcadores relevantes, comparando el numero de marcadores para los que el nivel de expresion se potencia o inhibe, o comparando ambos.

Protefnas y anticuerpos aislados

Un aspecto se refiere a protelnas marcadoras aisladas y partes biologicamente activas de las mismas, as! como a fragmentos polipeptldicos adecuados para su uso como inmunogenos para inducir anticuerpos dirigidos contra una protelna marcadora o un fragmento de la misma. En una realization, la protelna marcadora nativa puede aislarse de celulas o fuentes tisulares por un esquema de purification apropiado usando tecnicas de purification de protelnas convencionales. En otra realizacion, una protelna o un peptido que comprende la protelna marcadora completa o un segmento de la misma se produce por tecnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresion recombinante, dicha protelna o dicho peptido puede sintetizarse qulmicamente usando tecnicas de slntesis de peptidos convencionales.

Una protelna “aislada” o “purificada” o parte biologicamente activa de la misma esta sustancialmente libre de material celular u otras protelnas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que deriva la protelna, o sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos cuando se sintetiza qulmicamente. La expresion “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de protelna en las que la protelna se separa de componentes celulares de las celulas de las que se alsla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, la protelna que esta sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de protelna que tienen menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco) de protelna heterologa (tambien denominada en el presente documento “protelna contaminante”).

Cuando la protelna o parte biologicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, tambien esta preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparation de protelnas. Cuando la protelna se produce por slntesis qulmica, esta preferentemente sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros productos qulmicos, es decir, esta separada de precursores qulmicos u otros productos qulmicos que estan implicados en la slntesis de la protelna. En consecuencia dichas preparaciones de la protelna tienen menos de aproximadamente el 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores qulmicos o compuestos distintos del polipeptido de interes.

Las partes biologicamente activas de una protelna marcadora incluyen polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente identicas a o derivadas de la secuencia de aminoacidos de la protelna marcadora, que incluyen menos aminoacidos que la protelna de longitud completa, y muestran al menos una actividad de la protelna de longitud completa correspondiente. Normalmente, las partes biologicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la protelna de longitud completa correspondiente. Una parte biologicamente activa de una protelna marcadora puede ser un polipeptido que es, por ejemplo, de 10, 25, 50, 100 o mas aminoacidos de longitud. Ademas, otras partes biologicamente activas, en las que se suprimen otras regiones de la protelna marcadora, pueden prepararse por tecnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o mas de las actividades funcionales de la forma nativa de la protelna marcadora. En ciertas realizaciones, las protelnas utiles son sustancialmente identicas (por ejemplo, al menos aproximadamente 40 %, y en ciertas realizaciones, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %) a una de estas secuencias y conservan la actividad funcional de la protelna marcadora de origen natural correspondiente pero difieren en su secuencia de aminoacidos debido a variation alelica natural o mutagenesis.

Ademas, pueden usarse bibliotecas de segmentos de una protelna marcadora para generar una poblacion abigarrada de polipeptidos para exploration y posterior selection de protelnas marcadoras variantes o segmentos de las mismas.

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Medicina predictiva

Tambien se proporcionan en el presente documento usos de los modelos animales y marcadores en el campo de la medicina predictiva en los que se usan ensayos de diagnostico, ensayos de pronostico, farmacogenomica y supervision de ensayos cllnicos para fines de pronostico (predictivos) para tratar de este modo a un individuo de forma profilactica. En consecuencia tambien se proporcionan en el presente documento ensayos de diagnostico para determinar el nivel de expresion de una o mas protelnas marcadoras o acidos nucleicos, para determinar si un individuo esta en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer. Dichos ensayos pueden usarse para fines de pronostico o predictivos para tratar de este modo de forma profilactica a un individuo antes de la aparicion de la enfermedad relacionada con cancer.

En otro aspecto, los metodos son utiles para exploracion al menos periodica del mismo individuo para ver si ese individuo se ha expuesto a productos qulmicos o toxinas que cambien sus patrones de expresion.

Otro aspecto mas se refiere a supervisar la influencia de agentes (por ejemplo, farmacos u otros compuestos administrados bien para inhibir una enfermedad relacionada con cancer o bien para tratar o prevenir cualquier otro trastorno (por ejemplo, para entender cualquier efecto sistemico que pueda tener dicho tratamiento) en la expresion o actividad de un marcador en estadios cllnicos.

Farmacogenomica

Los marcadores tambien son utiles como marcadores farmacogenomicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacogenomico” es un marcador bioqulmico objetivo cuyo nivel de expresion se correlaciona con una respuesta o susceptibilidad a farmaco cllnico especlfico en un paciente. La presencia o cantidad de la expresion del marcador farmacogenomico esta relacionada con la respuesta predicha del paciente y mas particularmente el tumor del paciente a terapia con un farmaco o una clase de farmacos especlficos. Evaluando la presencia o cantidad de la expresion de uno o mas marcadores farmacogenomicos en un paciente, puede seleccionarse una terapia farmacologica que sea mas apropiada para el paciente, o que se prediga que tenga un mayor grado de exito.

Supervision de los ensayos cllnicos

La supervision de la influencia de los agentes (por ejemplo, compuestos farmacologicos) en el nivel de expresion de un marcador puede aplicarse no solamente en exploracion farmacologica basica, sino tambien en ensayos cllnicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente para afectar a la expresion de marcadores puede controlarse en ensayos cllnicos de sujetos que reciben tratamiento para una enfermedad relacionada con cancer.

En una realization no limitante, la presente invention proporciona un metodo para supervisar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimetico, protelna, peptido, acido nucleico, molecula pequena u otro candidato farmacologico) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra preadministracion de un sujeto antes de la administration del agente; (ii) detectar el nivel de expresion de uno o mas marcadores seleccionados en la muestra preadministracion; (iii) obtener una o mas muestras postadministracion del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresion del marcador o los marcadores en las muestras postadministracion; (v) comparar el nivel de expresion del marcador o los marcadores en la muestra preadministracion con el nivel de expresion del marcador o los marcadores en la muestra o las muestras postadministracion; y (vi) alterar la administracion del agente al sujeto en consecuencia.

Por ejemplo, la expresion aumentada del gen o los genes marcadores durante el transcurso del tratamiento puede indicar dosificacion ineficaz y la idoneidad de aumentar la dosificacion. Por el contrario, la reduction de la expresion del gen o los genes marcadores puede indicar tratamiento eficaz y ausencia de necesidad de cambiar la dosificacion.

Medio lefble por aparato electronico, sistemas, matrices y metodos de uso del mismo

Como se usa en el presente documento, “medio lefble por aparato electronico” se refiere a cualquiera medio adecuado para almacenar, retener o contener datos o information que puedan leerse y a los que puede accederse directamente por un aparato electronico. Dichos medios pueden incluir, pero sin limitation: medio de almacenamiento magnetico, tales como disquetes, medio de almacenamiento de disco duro y cinta magnetica; medios de almacenamiento opticos tales como discos compactos; medios de almacenamiento electronicos tales como RAM, ROM, EPROM, EEPROM y similares; y discos duros generales e hlbridos de estas categorlas tales como medios de almacenamiento magneticos/opticos. El medio se adapta o se configura para tener registrado en el mismo un marcador como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresion “aparato electronico” pretende incluir cualquier aparato de computation o procesamiento adecuado u otro dispositivo configurado o adaptado para almacenar datos o informacion. Los ejemplos de aparatos electronicos adecuados para su uso con la presente invencion incluyen aparatos de computacion independientes; redes, incluyendo una red de area local (LAN), una red de area extensa

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(WAN), Internet, Intranet y Extranet; aparatos electronicos tales como asistentes personales digitales (PDA), telefonos moviles, localizadores y similares; y sistemas de procesamiento locales y distribuidos.

Como se usa en el presente documento, “registrado” se refiere a un proceso para almacenar o codificar informacion en el medio lelble por aparato electronico. Los expertos en la materia pueden adaptar facilmente cualquier metodo para registrar informacion en medios para generar materiales que comprendan los marcadores descritos en el presente documento.

Puede usarse diversos programas informaticos y formatos para almacenar la informacion del marcador de la presente invencion en el medio libre por aparato electronico. Puede emplearse cualquier variedad de formatos de estructuracion de procesadores de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos) para obtener o crear un medio que tenga registrado en el mismo los marcadores. Proporcionando los marcadores en forma lelble, se puede acceder rutinariamente a la informacion de secuencia de marcadores para diversos fines. Por ejemplo, un experto en la materia puede usar las secuencias de nucleotidos o aminoacidos en forma lelble para comparar una secuencia diana o un motivo estructural diana con la informacion de secuencia almacenada dentro de los medios de almacenamiento de datos. Se usan medios de busqueda para identificar fragmentos o regiones de las secuencias que coincidan con una secuencia diana o un motivo diana particular.

Por lo tanto, tambien se proporciona en el presente documento un medio para contener instrucciones para realizar un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer, en el que el metodo comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia de un marcador y basandose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer y/o recomendar un tratamiento particular para una enfermedad relacionada con cancer o afeccion previa a la enfermedad relacionada con cancer.

Tambien se proporciona en el presente documento un sistema electronico y/o en una red, un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer asociada a un marcador en el que el metodo comprende las etapas de determinar la presencia o ausencia del marcador, y basandose en la presencia o ausencia del marcador, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer y/o recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cancer o afeccion previa a la enfermedad relacionada con cancer. El metodo puede comprender ademas la etapa de recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto y/o adquirir de una red de informacion fenotlpica asociada al sujeto. Tambien se proporciona en el presente documento una red, un metodo para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer asociada a un marcador, comprendiendo el metodo las etapas de recibir informacion asociada al marcador, recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto, adquirir informacion de la red correspondiente al marcador y/o una enfermedad relacionada con cancer, y basandose en uno o mas de la informacion fenotlpica, el marcador y la informacion adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer. El metodo puede comprender ademas la etapa de recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cancer o afeccion previa a la enfermedad relacionada con cancer.

Tambien se proporciona en el presente documento un metodo de negocio para determinar si un sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer, comprendiendo el metodo las etapas de recibir informacion asociada al marcador, recibir informacion fenotlpica asociada al sujeto, adquirir informacion de la red correspondiente al marcador y/o una enfermedad relacionada con cancer, y basandose en uno o mas de la informacion fenotlpica, el marcador y la informacion adquirida, determinar si el sujeto tiene una enfermedad relacionada con cancer o una predisposicion a una enfermedad relacionada con cancer. El metodo puede comprender ademas la etapa de recomendar un tratamiento particular para la enfermedad relacionada con cancer o la afeccion previa a la enfermedad relacionada con cancer.

Matrices

Tambien se proporciona en el presente documento una matriz que puede usarse para ensayar la expresion de uno o mas genes en la matriz. En una realizacion, la matriz puede usarse para ensayar la expresion genica en un tejido para determinar la especificidad tisular de genes en la matriz. De esta manera, pueden ensayarse simultaneamente hasta aproximadamente 7000 o mas genes con respecto a expresion. Esto permite desarrollar un perfil que muestra una baterla de genes que se expresan especlficamente en uno o mas tejidos.

Ademas de dicha determinacion cualitativa, se proporciona en el presente documento la cuantificacion de la expresion genica. Por lo tanto, puede determinarse no solamente la especificidad tisular, sino tambien el nivel de expresion de una baterla de genes en el tejido. Por lo tanto, los genes pueden agruparse basandose en su expresion tisular en si misma y el nivel de expresion en ese tejido. Esto es util, por ejemplo, en la determinacion de la relacion de la expresion genica entre o dentro de tejidos. Por lo tanto, se puede alterar un tejido y determinarse el efecto en la expresion genica en un segundo tejido. En este contexto, puede determinarse el efecto de un tipo

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celular en otro tipo celular en respuesta a un estlmuio biologico.

Dicha determinacion es util, por ejemplo, para conocer el efecto de la interaccion celula-celula en el nivel de expresion genica. Si se administra un agente de forma terapeutica para tratar un tipo celular pero tiene un efecto indeseable en otro tipo celular, el metodo proporciona un ensayo para determinar la base molecular del efecto indeseable y proporciona de este modo la oportunidad de coadministrar un agente que contrarreste o tratar de otro modo el efecto no deseado. De forma similar, incluso dentro de un unico tipo celular, pueden determinarse efectos biologicos indeseables en el nivel molecular. Por lo tanto, los efectos de un agente en la expresion de un gen distinto del diana pueden determinarse y contrarrestarse.

En otra realization, la matriz puede usarse para supervisar la evolution temporal de la expresion de uno o mas genes en la matriz. Esto puede realizarse en diversos contextos biologicos, como se desvela en el presente documento, por ejemplo el desarrollo de una enfermedad relacionada con cancer, progresion de una enfermedad relacionada con cancer, y procesos, tales como transformation celular asociada a una enfermedad relacionada con cancer.

La matriz tambien es util para determinar el efecto de la expresion de un gen o la expresion de otros genes en la misma celula o en diferentes celulas. Esto proporciona, por ejemplo, una selection de dianas moleculares alternativas para intervention terapeutica si la diana ultima o corriente abajo no puede regularse.

La matriz tambien es util para determinar patrones de expresion diferenciales de uno o mas genes en celulas normales y anomalas. Esto proporciona una baterla de genes que podrlan actuar como una diana molecular para diagnostico o intervencion terapeutica.

Marcadores sustitutos

Los marcadores pueden actuar como marcadores sustitutos para uno o mas trastornos o patologlas o para afecciones que conducen a una patologla relacionada con el cancer. Como se usa en el presente documento, un “marcador sustituto” es un marcador bioqulmico objetivo que se correlaciona con la ausencia o presencia de una enfermedad o un trastorno, o con la progresion de una enfermedad o un trastorno. La presencia o cantidad de dichos marcadores es independiente de la enfermedad. Por lo tanto, estos marcadores pueden actuar para indicar si un curso de tratamiento particular es eficaz en la reduction de una patologla o un trastorno. Los marcadores sustitutos son de uso particular cuando la presencia o el alcance de una patologla o un trastorno es diflcil de evaluar mediante metodologlas convencionales, o cuando se desea una evaluation de la progresion de enfermedad antes de alcanzar un punto final cllnico potencialmente peligroso.

Los marcadores tambien son utiles como marcadores farmacodinamicos. Como se usa en el presente documento, un “marcador farmacodinamico” es un marcador bioqulmico objetivo que se correlaciona especlficamente con efectos farmacologicos. La presencia o cantidad de un marcador farmacodinamico no se relaciona con la patologla o el trastorno para el que se administra el farmaco; por lo tanto, la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la presencia o actividad del farmaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinamico puede ser indicativo de la concentration del farmaco en un tejido biologico, porque el marcador se expresa o se transcribe o no se expresa o no se transcribe en ese tejido en relation con el nivel del farmaco. De esta manera, la distribution o la captation del farmaco pueden controlarse por el marcador farmacodinamico. De forma similar, la presencia o cantidad del marcador farmacodinamico puede estar relacionada con la presencia o cantidad del producto metabolico de un farmaco, de modo que la presencia o cantidad del marcador es indicativa de la velocidad de degradation relativa del farmaco in vivo.

Los marcadores farmacodinamicos son de uso particular en el aumento de la sensibilidad de detection de efectos farmacologicos, particularmente cuando el farmaco se administra en dosis bajas. Ya que incluso una cantidad pequena de un farmaco puede ser suficiente para activar multiples ciclos de transcription o expresion de marcadores, el marcador amplificado puede estar en una cantidad que es mas facilmente detectable que el farmaco en si mismo. Ademas, el marcador puede detectarse mas facilmente debido a la naturaleza del marcador en si mismo; por ejemplo, usando los metodos descritos en el presente documento, pueden emplearse anticuerpos en un sistema de deteccion basado en inmunidad para un marcador proteico, o pueden usarse sondas radiomarcadas especlficas de marcador para detectar un marcador de ARNm. Ademas, el uso de un marcador farmacodinamico puede ofrecer prediction basa en el mecanismo del riesgo debido al tratamiento farmacologico mas alla de la serie de observaciones directas posibles.

Protocolos para ensayo

El metodo para ensayar la enfermedad relacionada con cancer comprende, por ejemplo medir el nivel de expresion de cada gen marcador en una muestra biologica de un sujeto a lo largo del tiempo y comparar el nivel con el del gen marcador en una muestra biologica de control.

Cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento y el nivel de expresion se expresa diferencialmente (por ejemplo, es mayor o menor que el del control), se valora que el sujeto esta afectado por una

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enfermedad relacionada con cancer. Cuando el nivel de expresion del gen marcador queda dentro del intervalo permisible, es poco probable que el sujeto este afectado por una enfermedad relacionada con cancer.

El valor convencional para el control puede predeterminarse midiendo el nivel de expresion del gen marcador en el control, para comparar los niveles de expresion. Por ejemplo, el valor convencional puede determinarse basandose en el nivel de expresion del gen marcador anteriormente mencionado en el control. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el intervalo permisible se toma como ± 2 D.T. basandose en el valor convencional. Una vez que se ha determinado el valor convencional, el metodo de ensayo puede realizarse midiendo solamente el nivel de expresion en una muestra biologica de un sujeto y comparando el valor con el valor convencional determinado para el control.

Los niveles de expresion de genes marcadores incluyen transcripcion de los genes marcadores a ARNm, y traduccion en protelnas. Por lo tanto, un metodo para ensayar una enfermedad relacionada con cancer se realiza basandose en una comparacion de la intensidad de expresion de ARNm correspondiente a los genes marcadores, o el nivel de expresion de protelnas codificadas por los genes marcadores.

Sondas

La medicion de los niveles de expresion de genes marcadores en el ensayo para una enfermedad relacionada con cancer puede llevarse a cabo de acuerdo con diversos metodos de analisis de genes. Especlficamente, se puede usar, por ejemplo, una tecnica de hibridacion usando acidos nucleicos que hibridan con estos genes como sondas, o una tecnica de amplificacion genica usando ADN que hibrida con los genes marcadores como cebadores.

Las sondas o los cebadores usados para el ensayo pueden disenarse basandose en las secuencias de nucleotidos de los genes marcadores. Los numeros de identificacion para las secuencias de nucleotidos de los genes marcadores respectivos se describen en el presente documento.

Ademas, debe entenderse que los genes de animales superiores generalmente acompanan al polimorfismo en una alta frecuencia. Tambien hay muchas moleculas que producen isoformas que comprenden secuencias de aminoacidos mutuamente diferentes durante el proceso de corte y empalme. Cualquier gen asociado a una enfermedad relacionada con cancer que tenga una actividad similar a la de un gen marcador se incluye en los genes marcadores, incluso si tiene diferencias de secuencias de nucleotidos debidas a polimorfismo o que es una isoforma.

Tambien debe entenderse que los genes marcadores pueden incluir homologos de otras especies ademas de seres humanos. Por lo tanto, a no ser que se especifique de otro modo, la expresion “gen marcador” se refiere a un homologo del gen marcador unico de la especie o un gen marcador ajeno que se ha introducido en un individuo.

Ademas, debe entenderse que un “homologo de un gen marcador” se refiere a un gen derivado de una especie distinta de un ser humano, que puede hibridar con el gen marcador humano como una sonda en condiciones rigurosas. Dichas condiciones rigurosas se conocen por los expertos en la materia que pueden seleccionar una condicion apropiada para producir una rigurosidad igual de forma experimental o emplrica.

Un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleotidos de un gen marcador o una secuencia de nucleotidos que es complementaria de la cadena complementaria de la secuencia de nucleotidos de un gen marcador y tiene al menos 15 nucleotidos, puede usarse como un cebador o una sonda. Por lo tanto, una “cadena complementaria” significa una cadena de un ADN bicatenario con respecto a la otra cadena y que esta compuesto de pares de bases A:T (U para ARN) y G:C.

Ademas, “complementario” significa no solamente los que son completamente complementarios para una region de al menos 15 nucleotidos continuos, sino tambien los que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos de al menos 40 % en ciertos casos, 50 % en ciertos casos, 60 % en ciertos casos, 70 % en ciertos casos, 80 % en ciertos casos, al menos 80 %, 90 % y 95 % o mayor. El grado de homologla entre secuencias de nucleotidos puede determinarse por un algoritmo, BLAST, etc.

Dichos polinucleotidos son utiles como una sonda para detectar un gen marcador, o como un cebador para amplificar un gen marcador. Cuando se usa como un cebador, el polinucleotido comprende habitualmente de 15 pb a 100 pb, y en ciertas realizaciones de 15 pb a 35 pb de nucleotidos. Cuando se usa como una sonda, un ADN comprende la secuencia de nucleotidos completa del gen marcador (o la cadena complementaria de la misma); o una secuencia parcial de la misma que tiene al menos 15 pb de nucleotidos. Cuando se usa como un cebador, la region 3' debe ser complementaria del gen marcador, mientras que la region 5' puede estar unida a una secuencia de reconocimiento de enzimas de restriction o un marcador.

Los “polinucleotidos” pueden ser ADN o ARN. Estos polinucleotidos pueden ser sinteticos o de origen natural. Ademas, el ADN usado como una sonda para hibridacion esta habitualmente marcado. Los expertos en la materia entienden facilmente dichos metodos de marcaje. En el presente documento, el termino “oligonucleotido” significa un polinucleotido con un grado relativamente bajo de polimerizacion. Los oligonucleotidos se incluyen en polinucleotidos.

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Ensayos para enfermedades relacionadas con cancer

Pueden realizarse ensayos para una enfermedad relacionada con cancer usando tecnicas de hibridacion usando, por ejemplo, hibridacion de Northern, hibridacion de transferencia puntual o la tecnica de micromatrices de ADN. Ademas, pueden usarse tecnicas de amplificacion genica, tales como el metodo de RT-PRC. Usando el metodo de supervision de amplificacion por PCR durante la etapa de amplificacion genica en RT-PCR, se puede conseguir un analisis mas cuantitativo de la expresion de un gen marcador.

En el metodo de supervision de la amplificacion genica por PCR, la diana de deteccion (ADN o transcrito inverso de ARN) se hibrida con sondas que estan marcadas con un colorante fluorescente y un interruptor que absorbe la fluorescencia. Cuando avanza la PCR y la Taq polimerasa degrada la sonda con su actividad 5'-3' exonucleasa, el colorante fluorescente y el interruptor se separan y se detecta la fluorescencia. La fluorescencia se detecta en tiempo real. Midiendo simultaneamente una muestra convencional en la que se conoce el numero de copias de una diana, es posible determinar el numero de copias de la diana en la muestra objeto con el numero de ciclo cuando la amplificacion por PCR sea lineal. Ademas, un experto en la materia reconoce que el metodo de supervision de amplificacion por PCR puede llevarse a cabo usando cualquiera metodo adecuado.

El metodo de ensayo para una enfermedad relacionada con cancer tambien puede llevarse a cabo detectando una protelna codificada por un gen marcador. En lo sucesivo en el presente documento, una protelna codificada por un gen marcador se describe como una “protelna marcadora”. Para dichos metodos de ensayo, por ejemplo, pueden emplearse el metodo de transferencia de Western, el metodo de inmunoprecipitacion y el metodo de ELISA usando un anticuerpo que se una con cada protelna marcadora.

Pueden producirse anticuerpos usados en la deteccion que se unen con la protelna marcadora por cualquier tecnica adecuada. Ademas, para detectar una protelna marcadora, puede marcarse de forma apropiada un anticuerpo tal. Como alternativa, en lugar de marcar el anticuerpo, puede marcarse una sustancia que se una especlficamente con el anticuerpo, por ejemplo, protelna A o protelna G, para detectar la protelna marcadora indirectamente. Mas especlficamente, dicho metodo de deteccion puede incluir el metodo de ELISA.

Puede obtenerse una protelna o un peptido parcial de la misma usada como un antlgeno, por ejemplo, insertando un gen marcador o una parte del mismo en un vector de expresion, introduciendo la construction en una celula hospedadora apropiada para producir un transformante, cultivar el transformante para expresar la protelna recombinante, y purificar la protelna recombinante expresada del cultivo o el sobrenadante de cultivo. Como alternativa, la secuencia de aminoacidos codificada por un gen o un oligopeptido que comprende una parte de la secuencia de aminoacidos codificada por un ADNc de longitud completa se sintetizan qulmicamente para su uso como un inmunogeno.

Ademas, puede realizarse un ensayo con respecto a una enfermedad relacionada con cancer usando como un Indice no solamente el nivel de expresion de un gen marcador sino tambien la actividad de una protelna marcadora en una muestra biologica. La actividad de una protelna marcadora significa la actividad biologica intrlnseca a la protelna. Pueden usarse diversos metodos para medir la actividad de cada protelna.

Incluso si no se diagnostica que un paciente este afectado por una enfermedad relacionada con cancer en un ensayo rutinario a pesar de slntomas que sugieran estas enfermedades, si dicho paciente padece o no una enfermedad relacionada con cancer puede determinarse facilmente realizando un ensayo de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento.

Mas especlficamente, en ciertas realizaciones, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un aumento o una reduction en el nivel de expresion del gen marcador en un paciente cuyos slntomas sugieren al menos una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con cancer indica que los slntomas estan causados principalmente por una enfermedad relacionada con cancer.

Ademas, los ensayos son utiles para determinar si una enfermedad relacionada con cancer esta mejorando en un paciente. En otras palabras, los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para valorar el efecto terapeutico de un tratamiento para una enfermedad relacionada con cancer. Ademas, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, un aumento o una reduccion en el nivel de expresion del gen marcador en un paciente, al que se ha diagnosticado que esta afectado por una enfermedad relacionada con cancer, implica que la enfermedad ha progresado mas.

La gravedad y/o susceptibilidad a una enfermedad relacionada con cancer tambien puede determinarse basandose en la diferencia en los niveles de expresion. Por ejemplo, cuando el gen marcador es uno de los genes descritos en el presente documento, el grado de aumento en el nivel de expresion del gen marcador se correlaciona con la presencia y/o gravedad de una enfermedad relacionada con cancer.

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Control de la expresion del marcador

Ademas, la expresion en si misma de un gen marcador puede controlarse introduciendo una mutacion o mutaciones en la region reguladora de la transcripcion del gen. Los expertos en la materia entienden dichas sustituciones de aminoacidos. Ademas, el numero de aminoacidos que se mutan no esta particularmente restringido, siempre que la actividad se mantenga. Normalmente, esta a una distancia de 50 aminoacidos, en ciertas realizaciones no limitantes, a una distancia de 30 aminoacidos, a una distancia de 10 aminoacidos, o a una distancia de 3 aminoacidos. El sitio de mutacion puede ser cualquier sitio, siempre que se mantenga la actividad.

Metodos de exploracion

En otro aspecto mas, se proporcionan en el presente documento metodos de exploracion para compuestos candidatos con respecto a agentes terapeuticos para tratar una enfermedad relacionada con cancer. Uno o mas genes marcadores se seleccionan del grupo de genes descritos en el presente documento. Un agente terapeutico para una enfermedad relacionada con cancer puede obtenerse seleccionando un compuesto capaz de aumentar o reducir el nivel de expresion del gen o los genes marcadores.

Debe entenderse que la expresion “un compuesto que aumenta el nivel de expresion de un gen” se refiere a un compuesto que promueve una cualquiera de las etapas de transcripcion genica, traduccion genica o expresion de una actividad proteica. Por otro lado, la expresion “un compuesto que reduce el nivel de expresion de un gen”, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que inhibe una cualquiera de estas etapas.

En aspectos particulares, el metodo para explorar con respecto a un agente terapeutico para una enfermedad relacionada con cancer puede llevarse a cabo bien in vivo o bien in vitro. Este metodo de exploracion puede realizarse, por ejemplo, (1) administrando un compuesto candidato a un sujeto animal; (2) midiendo el nivel de expresion de un gen o genes marcadores en una muestra biologica del sujeto animal; o (3) seleccionando un compuesto que aumenta o reduce el nivel de expresion de un gen o genes marcadores en comparacion con el de un control con el que no se ha puesto en contacto el compuesto candidato.

En otro aspecto mas, se proporciona en el presente documento un metodo para evaluar la eficacia de un compuesto candidato para un agente farmaceutico en el nivel de expresion de un gen o genes marcadores poniendo en contacto un sujeto animal con el compuesto candidato y supervisando el efecto del compuesto en el nivel de expresion del gen o los genes marcadores en una muestra biologica derivada del sujeto animal. La variacion en el nivel de expresion del gen o los genes marcadores en una muestra biologica derivada del sujeto animal puede supervisarse usando la misma tecnica que se ha usado en el metodo de ensayo descrito anteriormente. Ademas, basandose en la evaluacion, puede seleccionarse un compuesto candidato para un agente farmaceutico por exploracion.

Kits

En otro aspecto, se proporcionan diversos kits de diagnostico y ensayo. En una realizacion, un kit es util para evaluar si un paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer. El kit comprende un reactivo para evaluar la expresion de un marcador. En otra realizacion, un kit es util para evaluar la idoneidad de un agente qulmico o biologico para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente. Dicho kit comprende un reactivo para evaluar la expresion de un marcador, y tambien puede comprender uno o mas de dichos agentes.

En una realizacion adicional, los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas con enfermedades relacionadas con cancer o tratar enfermedades relacionadas con cancer. Dichos kits comprenden un anticuerpo, un derivado de anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se une especlficamente con una protelna marcadora o un fragmento de la protelna. Dichos kits tambien pueden comprender una pluralidad de anticuerpos, derivados de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo en los que la pluralidad de dichos agentes de anticuerpo se une especlficamente con una protelna marcadora o un fragmento de la protelna.

En una realizacion adicional, los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas de enfermedad relacionada con cancer, en los que el kit comprende una sonda de acido nucleico que se une especlficamente con un acido nucleico marcador o un fragmento del acido nucleico. El kit tambien puede comprender una pluralidad de sondas, en las que cada una de las sondas se une especlficamente con un acido nucleico marcador, o un fragmento del acido nucleico.

Las composiciones, los kits y metodos descritos en el presente documento pueden tener los siguientes usos, entre otros: 1) evaluar si un paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer; 2) evaluar el estadio de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente humano; 3) evaluar el grado de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 4) evaluar la naturaleza de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 5) evaluar el potencial de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 6) evaluar el tipo histologico de celulas asociadas con una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 7) realizar anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo que son utiles para tratar una enfermedad relacionada con cancer y/o evaluar si un paciente esta aquejado de una enfermedad relacionada con cancer; 8) evaluar la presencia

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de celulas con enfermedad relacionada con cancer; 9) evaluar la eficacia de uno o mas compuestos de ensayo para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 10) evaluar la eficacia de una terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 11) supervisar la progresion de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 12) seleccionar una composicion o terapia para inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 13) tratar a un paciente aquejado de una enfermedad relacionada con cancer; 14) inhibir una enfermedad relacionada con cancer en un paciente; 15) evaluar el potencial perjudicial de un compuesto de ensayo; y 16) prevenir la aparicion de una enfermedad relacionada con cancer en un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad relacionada con cancer.

Los kits son utiles para evaluar la presencia de celulas con enfermedad relacionada con cancer (por ejemplo en una muestra tal como una muestra de paciente). El kit comprende una pluralidad de reactivos, cada uno de los cuales es capaz de unirse especlficamente con un acido nucleico o una protelna marcadores. Los reactivos adecuados para union con una protelna marcadora incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpo, fragmentos de anticuerpo y similares. Los reactivos adecuados para union con un acido nucleico marcador (por ejemplo un ADN genomico, un ARNm, un ARNm con corte y empalme, un ADNc o similares) incluyen acidos nucleicos complementarios. Por ejemplo, los reactivos de acido nucleico pueden incluir oligonucleotidos (marcados o no marcados) fijados en un sustrato, oligonucleotidos marcados no unidos a un sustrato, pares de cebadores de PCR, sondas de balizas moleculares y similares.

Los kits pueden comprender opcionalmente componentes adicionales utiles para realizar los metodos descritos en el presente documento. Como ejemplo, el kit puede comprender fluidos (por ejemplo tampon SSC) adecuados para hibridar acidos nucleicos complementarios o para unir un anticuerpo con una protelna con la que se una especlficamente, uno o mas compartimentos de muestras, un material didactico que describe la realization del metodo, una muestra de celulas normales, una muestra de celulas con enfermedad relacionada con cancer y similares.

Modelo animal

Puede producirse un modelo animal no humano para la evaluation de al menos una enfermedad relacionada con cancer. El metodo incluye exponer al animal a dosis repetidas de al menos un producto qulmico que se cree que provoca el cancer de interes. En ciertos aspectos, el metodo incluye ademas recoger una o mas muestras seleccionadas del animal; y comparar la muestra recogida con uno o mas indicios de inicio o desarrollo de cancer potencial.

Un metodo para producir el modelo animal incluye: mantener el animal en un ambiente sin productos qulmicos especlfico y sensibilizar al animal con al menos un producto qulmico que se cree que provoca el cancer. En ciertas realizaciones, al menos una parte del animal se sensibiliza por multiples exposiciones secuenciales.

Un metodo para explorar un agente con respecto a eficacia frente a al menos una enfermedad relacionada con cancer generalmente incluye: administrar al menos un agente a un animal de ensayo, determinar si el agente reduce o agrava uno o mas de los slntomas de la enfermedad relacionada con cancer; correlacionar una reduction en uno o mas slntomas con la eficacia del agente frente a la enfermedad relacionada con cancer; o correlacionar una falta de reduccion en uno o mas slntomas con la ineficacia del agente. El modelo animal es util para evaluar una o mas rutas metabolicas que contribuyen a al menos uno de inicio, progresion, gravedad, patologla, agresividad, grado, actividad, discapacidad, mortalidad, morbilidad, subclasificacion de enfermedad u otra caracterlstica patogenica o patologica subyacente de al menos una enfermedad relacionada con cancer. El analisis puede ser por uno o mas de: agrupamiento jerarquico, construction de red de identification, analisis proteomico por espectroscopia de masas, resonancia de plasmon superficial, modelizacion estadlstica lineal, analisis discriminante de mlnimos cuadraticos parcial, y analisis de regresion lineal multiple.

El modelo animal puede evaluarse con respecto a al menos una enfermedad relacionada con el cancer, examinando un nivel de expresion de uno o mas marcadores, o un equivalente funcional de los mismos.

Los modelos animales pueden usarse para la exploration de agentes terapeuticos utiles para el tratamiento o prevention de una enfermedad relacionada con cancer. En consecuencia, los metodos son utiles para identificar agentes terapeuticos para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con cancer. Los metodos comprenden administrar un agente candidato a un modelo animal preparado por los metodos descritos en el presente documento, evaluar al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cancer en el modelo animal en comparacion con un modelo animal de control al que no se ha administrado el agente candidato. Si se reducen los slntomas o se retarda la aparicion de al menos una respuesta de enfermedad relacionada con cancer, el agente candidato es un agente para tratar o prevenir la enfermedad relacionada con cancer.

Los modelos animales para una enfermedad relacionada con cancer pueden incluir un animal en el que el nivel de expresion de uno o mas genes marcadores o un gen funcionalmente equivalente al gen marcador se ha elevado en el modelo animal. Un “gen funcionalmente equivalente” como se usa en el presente documento generalmente es un gen que codifica una protelna que tiene una actividad similar a una actividad conocida de una protelna codificada

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por el gen marcador. Un ejemplo representative de un gen funcionalmente equivalente incluye un homologo de un gen marcador de un animal objeto, que es intrlnseco del animal.

El modelo animal para una enfermedad relacionada con cancer es util para detectar cambios fisiologicos debidos a una enfermedad relacionada con cancer. En ciertas realizaciones, el modelo animal es util para revelar funciones adicionales de genes marcadores y para evaluar farmacos cuyas dianas son los genes marcadores.

En una realizacion, un modelo animal para una enfermedad relacionada con cancer puede crearse controlando el nivel de expresion de un gen homologo o administrando un gen homologo. El metodo puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con cancer controlando el nivel de expresion de un gen seleccionado del grupo de genes descritos en el presente documento. En otra realizacion, el metodo puede incluir crear un modelo animal para una enfermedad relacionada con cancer administrando la protelna codificada por un gen descrito en el presente documento, o administrando un anticuerpo contra la protelna. Tambien debe entenderse que en ciertas otras realizaciones, el marcador puede sobreexpresarse de modo que el marcador pueda medirse despues usando metodos apropiados.

En otra realizacion, puede crearse un modelo animal para una enfermedad relacionada con cancer introduciendo un gen seleccionado de dichos grupos de genes, o administrando una protelna codificada por dicho gen.

En otra realizacion, puede inducirse una enfermedad relacionada con cancer suprimiendo la expresion de un gen seleccionado de dichos grupos de genes o la actividad de una protelna codificada por dicho gen. Puede usarse un acido nucleico antisentido, una ribozima o un ARNi para suprimir la expresion. La actividad de una protelna puede controlarse eficazmente administrando una sustancia que inhiba la actividad, tal como un anticuerpo.

El modelo animal es util para dilucidar el mecanismo que subyace a una enfermedad relacionada con cancer y tambien para ensayar la seguridad de compuestos obtenidos explorando. Por ejemplo, cuando un modelo animal desarrolla los slntomas de una enfermedad relacionada con cancer, o cuando un valor medido implicado en una cierta enfermedad relacionada con cancer se altera en el animal, puede construirse un sistema de exploracion para explorar compuestos que tienen actividad para aliviar la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresion “un aumento en el nivel de expresion” se refiere a uno cualquiera de los siguientes: cuando un gen marcador introducido como un gen ajeno se expresa artificialmente; cuando la transcripcion de un gen marcador intrlnseco al animal objeto y la traduccion del mismo en la protelna se potencian; o cuando la hidrolisis de la protelna, que es el producto de traduccion, se suprime. Como se usa en el presente documento, la expresion “una reduccion en el nivel de expresion” se refiere al estado en el que se inhiben la transcripcion de un gen marcador del animal objeto y la traduccion del mismo a la protelna, o el estado en el que se potencia la hidrolisis de la protelna, que es el producto de traduccion. El nivel de expresion de un gen puede determinarse, por ejemplo, por una diferencia en la intensidad de senal en una microplaca de ADN. Ademas, la actividad del producto de traduccion, la protelna, puede determinarse comparando con la del estado normal.

Tambien esta dentro del alcance contemplado que el modelo animal puede incluir animales transgenicos, incluyendo, por ejemplo animales en los que se ha introducido y se ha expresado artificialmente un gen marcador; animales con anulacion de gen marcador; y animales con introduccion en los que otro gen ha sustituido a un gen marcador. Un animal transgenico, en el que se ha introducido un acido nucleico antisentido de un gen marcador, una ribozima, un polinucleotido que tiene un efecto de ARNi, o un ADN que actua como un acido nucleico senuelo o similares, puede usarse como el animal transgenico. Dichos animales transgenicos tambien incluyen, por ejemplo, animales en los que se ha potenciado o suprimido la actividad de una protelna marcadora introduciendo una mutacion o mutaciones en la region codificante del gen, o la secuencia de aminoacidos se ha modificado para hacerse resistente o susceptible a hidrolisis. Las mutaciones en una secuencia de aminoacidos incluyen sustituciones, deleciones, inserciones y adiciones.

Aplicaciones terapeuticas

La invencion es ampliamente aplicable a diversas situaciones en las que es deseable poder regular el nivel de expresion genica, tal como “encendiendo” y “apagando” la expresion genica, de una manera rapida, eficaz y controlada sin provocar efectos pleiotropicos o citotoxicidad. La invencion pude ser particularmente util para fines de terapia genica en seres humanos, en tratamientos para enfermedades geneticas o adquiridas. El enfoque general de la terapia genica implica la introduccion de una o mas moleculas de acido nucleico en celulas de modo que se produzcan uno o mas productos genicos codificados por el material genetico introducido en las celulas para restaurar o potenciar una actividad funcional. Para revisiones sobre los enfoques de terapia genica Anderson, et al. (1992); Miller et al. (1992); Friedmann et al. (1989); y Cournoyer et al. (1990). Sin embargo, los vectores de terapia genica actuales utilizan normalmente elementos reguladores constitutivos que son sensibles a factores de transcripcion endogenos. Estos sistemas de vectores no permiten la capacidad de modular el nivel de expresion genica en un sujeto. Por el contrario, el sistema regulador de la invencion proporciona esta capacidad.

Para usar el sistema de la invencion para fines de terapia genica, se introduce al menos una molecula de ADN en

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celulas de un sujeto que necesite terapia genica (por ejemplo, un sujeto humano que padece una enfermedad genetica o adquirida) para modificar las celulas. Las celulas se modifican para comprender: 1) acido nucleico que codifica un regulador inducible de la invention en una forma adecuada para expresion del regulador inducible en las celulas hospedadoras; y 2) un ARNip (por ejemplo, para fines terapeuticos) unido operativamente con un promotor especlfico de tejido tal como un promotor s-ship1. Puede usarse una unica molecula de ADN que codifica componentes del sistema regulador de la invencion o, como alternativa, pueden usarse moleculas de ADN separadas que codifican cada componente. Las celulas del sujeto pueden modificarse ex vivo y despues introducirse en el sujeto o las celulas pueden modificarse directamente in vivo por tecnicas convencionales para introducir acidos nucleicos en celulas. Por lo tanto, el sistema regulador de la invencion no ofrece la ventaja sobre los sistemas reguladores constitutivos de permitir la modulation del nivel de expresion genica dependiendo de los requisitos de la situation terapeutica.

Los genes de interes particular para anular o reducir en celulas de un sujeto para tratamiento de enfermedades geneticas o adquiridas incluyen los que codifican un producto genico deletereo, tal como una protelna anomala. Los ejemplos de enfermedades especlficas no limitantes incluyen anemia, canceres relacionados con la sangre, enfermedad de Parkinson y diabetes.

La presente invencion puede aplicarse para desarrollar llneas celulares autologas o alogenicas para fines terapeuticos. Por ejemplo, se utilizan aplicaciones de terapia genica de interes particular en trasplante de celulas y/u organos con la presente invencion. En realizaciones a modo de ejemplo, la regulation negativa de antlgenos de trasplante (tales como, por ejemplo, por regulacion negativa de expresion de beta2-microglobulina mediante ARNip) permite el trasplante de celulas alogenicas mientras que minimiza el riesgo de rechazo por el sistema inmunitario del paciente. La presente invencion permitirla una desconexion del ARNi en caso de efectos adversos (por ejemplo replication incontrolable de las celulas trasplantadas).

Los tipos celulares que pueden someterse a la presente invencion incluyen celulas madre hematopoyeticas, mioblastos, hepatocitos, linfocitos, epitelio de las vlas respiratorias, epitelio cutaneo, islotes, neuronas dopaminergicas, queratinocitos y as! sucesivamente. Para descripciones adicionales de tipos celulares, genes y metodos para terapia genica vease por ejemplo, Armentano et al. (1990); Wolff et al. (1990); Chowdhury et al.

(1991) ; Ferry et al. (1991); Quantin et al (1992); Dai et al. (1992); van Beusechem et al. (1992); Rosenfeld et al.

(1992) ; Kay et al. (1992); Cristiano et al (1993); Hwu et al (1993); y Herz y Gerard (1993).

En realizaciones particulares de la presente divulgation hay un metodo para tratar cualquier condition de enfermedad susceptible de tratamiento con un promotor s-ship. En realizaciones especlficas, el metodo comprende preparar una construction polinucleotldica que tiene una region que codifica un gen (marcador) terapeutico o de diagnostico que esta unido operativamente con un promotor, en el que el gen codificado por la construccion es para el tratamiento de la condicion de enfermedad.

A. Formulaciones farmaceuticas, suministro y reglmenes de tratamiento

En una realization de la presente invencion, se contemplan metodos de tratamiento. Una cantidad eficaz de la composition farmaceutica, en general, se define como la cantidad suficiente para aliviar, reducir, minimizar o limitar de forma detectable y repetidamente el alcance de la enfermedad o sus slntomas. Pueden aplicarse definiciones mas rigurosas, incluyendo elimination, eradication o cura de la enfermedad.

Las vlas de administration variaran, de forma natural, con la localization y naturaleza de la lesion, e incluiran, por ejemplo, administracion y formulation intradermica, transdermica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutanea, percutanea, intratraqueal, intraperitoneal, intratumoral, de perfusion, de lavado, de inyeccion directa y oral.

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacologicamente aceptables en agua convenientemente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles llquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparation extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles (Patente de Estados Unidos n.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y deben conservarse contra la action contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehlculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol llquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevention de la accion de microorganismos puede proporcionarse por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. Puede proporcionarse absorcion

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prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion deberla taponarse convenientemente si es necesario y el diluyente llquido hacerse en primer lugar isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intratumoral e intraperitoneal. En relacion con esto, los expertos en la materia conoceran medio acuoso esteril que puede emplearse a la luz de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion puede disolverse en 1 ml de solucion de NaCl isotonica y anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusion (vease por ejemplo “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15a Edicion, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producira necesariamente alguna variacion de la dosificacion dependiendo de la condicion del sujeto que se trate. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para administracion humana, las preparaciones deberlan cumplir patrones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza segun se requiere por la Oficina de patrones biologicos de la FDA.

Se preparan soluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehlculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vaclo y liofilizacion que producen un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.

Las composiciones desveladas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acidos (formadas con los grupos amino libres de la protelna) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhldrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidroxidos ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procalna y similares. Tras la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que es terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en diversas formas de dosificacion tales como soluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmacos y similares.

Como se usa en el presente documento, “vehlculo” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vehlculos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, tampones, soluciones de vehlculo, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas se conoce bien en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.

La expresion “farmaceuticamente aceptable” o “farmacologicamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reaccion alergica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano. La preparacion de una composicion acuosa que contiene una protelna como un principio activo se entiende bien en la tecnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, bien como soluciones o bien como suspensiones llquidas; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, llquido antes de la inyeccion.

B. Tratamientos de combination

Los compuestos y metodos de la presente divulgacion pueden usarse en el contexto de terapias tradicionales. Para aumentar la eficacia de un tratamiento con las composiciones de la presente invention, puede ser deseable combinar estas composiciones con otros agentes eficaces en el tratamiento de estas enfermedades y afecciones. Por ejemplo, el tratamiento de un cancer puede implementarse con compuestos terapeuticos de la presente invencion y otras terapias antineoplasicas, tales como agentes antineoplasicos o cirugla. De forma similar, el tratamiento de una enfermedad o afeccion vascular puede implicar tanto la presente invencion como agentes o terapias vasculares convencionales.

Pueden emplearse diversas combinaciones; por ejemplo, una celula hospedadora de la presente invencion es “A” y el agente/la terapia antineoplasico secundario es “B”: TABLA-US-00005 A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/BB/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A.

La administracion de las construcciones de expresion terapeutica de la presente divulgacion a un paciente seguiran

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protocolos generales para la administracion de esa terapia secundaria particular, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hubiera, del tratamiento. Se espera que los ciclos del tratamiento se repitan segun sea necesario. Tambien se contempla que pueden aplicarse diversas terapias convencionales, as! como intervencion quirurgica, en combinacion con la terapia descrita.

Aunque la invencion se ha descrito y se ha ejemplificado en suficiente detalle para que los expertos en esta materia la preparen y la usen, deberlan ser evidentes diversas alternativas, modificaciones y mejoras sin alejarse del alcance de la invencion. Un experto en la materia aprecia facilmente que la presente invencion esta bien adaptada para llevar a cabo los objetivos y obtener los fines y las ventajas mencionados, as! como los inherentes en los mismos.

Los metodos y reactivos descritos en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo y no se pretende que sean limitaciones del alcance de la invencion. Los expertos en la materia se daran cuenta de modificaciones de los mismos y otros usos. Estas modificaciones estan abarcadas dentro de la invencion y se definen por el alcance de las reivindicaciones. Tambien resultara evidente para un experto en la materia que pueden realizarse diversas sustituciones y modificaciones a la invencion desvelada en el presente documento sin alejarse del alcance de la invencion definida en las reivindicaciones adjuntas.

Deberla entenderse que aunque la presente invencion se ha desvelado especlficamente por realizaciones preferidas y caracterlsticas opcionales, puede acudirse a modificaciones y variaciones de los conceptos desvelados en el presente documento por los expertos en la materia, y que se considera que dichas modificaciones y variaciones estan dentro del alcance de la presente invencion como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Aunque la presente invencion se ha descrito en referencia a diversas realizaciones preferidas, los expertos en la materia deberlan entender que pueden realizarse diversos cambios y pueden sustituirse elementos de las mismas por equivalentes sin alejarse del alcance esencial de la invencion. Ademas, pueden realizarse muchas modificaciones para adaptar una situacion o un material particular a las ensenanzas de la invencion sin alejarse del alcance esencial de las mismas.

Por lo tanto, se pretende que la invencion no este limitada a la realizacion particular desvelada en el presente documento, contemplada para llevar a cabo la presente invencion, sino que la invencion incluira todas las realizaciones que quedan dentro del alcance de las reivindicaciones.

Todas las composiciones y/o los metodos y/o aparatos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden prepararse y ejecutarse sin experimentacion indebida a la luz de la presente divulgacion. Aunque las composiciones y los metodos de la presente invencion se han descrito con respecto a realizaciones preferidas, resultara evidente para los expertos en la materia que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o los metodos y/o aparatos y en las etapas o en la secuencia de etapas del metodo descrito en el presente documento. Mas especlficamente, resultara evidente que ciertos agentes que estan relacionados tanto qulmica como fisiologicamente pueden sustituir a los agentes descritos en el presente documento obteniendose aun as! los mismos resultados o similares. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la materia estan dentro del esplritu, alcance y el concepto de la invencion como se definen por las reivindicaciones adjuntas.

A lo largo de la presente divulgacion, se hace referencia a diversas publicaciones, patentes y memorias descriptivas de patentes publicadas por una cita identificativa.

A no ser que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genetica molecular, qulmica de acidos nucleicos, tecnicas de hibridacion y bioqulmica). Se usan tecnicas convencionales para metodos moleculares, geneticos y bioqulmicos que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliografla. Vease, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumenes I y II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de Estados Unidos n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (Hames y Higgins eds., 1984); Transcription And Translation (Hames y Higgins eds., 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986); The Laboratory Rat, editor in chief: Mark A. Suckow; autores: Sharp y LaRegina. CRC Press, Boston, 1988) y metodos qulmicos.

Referencias

La publicacion y otro material usado en el presente documento para ilustrar la invencion o proporcionar detalles adicionales con respecto a la practica de la invencion, y para mayor conveniencia se proporcionan en la siguiente

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bibliografla.

La cita de cualquiera de los documentos enumerados en el presente documento no se entiende como una admision de que ninguno de los siguientes sea tecnica anterior pertinente. Todas las declaraciones con respecto a la fecha o representacion con respecto a los contenidos de estos documentos se basan en la informacion disponible para el solicitante y no constituye ninguna admision con respecto a la correccion de los datos o contenidos de estos documentos.

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El Apendice comprende las reivindicaciones de la solicitud principal expuestas como clausulas, y estas se incluyen aqul para conservar toda la materia objeto. Representan realizaciones adicionales de la presente divulgacion y pueden formar la base de reivindicaciones posteriores.

APENDICE

1. Un metodo para diferenciar canceres humanos que comprende usar uno o mas perfiles de expresion de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) en el que la asociacion entre la localizacion genomica de las RUC y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es estadlsticamente muy significativa y comparable a la indicada para los miARN.

2. El metodo de la clausula 1, en el que una o mas RUC-T expresadas diferencialmente en canceres humanos se localizan en regiones genomicas asociadas a cancer (RGAC) especlficamente asociadas con ese tipo de cancer.

3. El metodo de la clausula 1, en el que se localiza un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353) dentro de la RGAC.

4. La clausula 3 del metodo, en la que, dos RUC: uc.349A(P) y uc.352(N) estan entre los RUC-T que se expresan diferencialmente entre celulas CD5 positivas LLC-B normales y malignas.

5. El metodo de la clausula 4, en el que una o mas de las RUC se localizan en regiones genomicas alteradas durante el proceso maligno.

6. El metodo de la clausula 5, en el que una o mas RUC-T son genes candidatos para susceptibilidad al cancer.

7. El metodo de la clausula 1, en el que se usa una identificacion de cinco RUC, uc.269A(N), uc.160(N), uc.215(N), uc.346A(P) y uc.348(N), para diferenciar entre dos grupos de pronostico de LLC.

8. El metodo de la clausula 1, en el que tres de las 5 RUC tienen complementariedad antisentido significativa con 5 de los 13 miARN de la identificacion, dando lugar a seis posibles pares de interaccion: uc.160::rniR-24, uc.160:: miR-155, uc.160:: miR-223, uc.160::miR-146a, uc.346A::miR-155 y uc.-348::miR-29b.

9. El metodo de la clausula 8, en el que las RUC se localizan en regiones genomicas que son diana durante el proceso maligno y son identificativas de implicacion potencial en tumorigenesis humana.

10. Un ADNc correspondiente a uc.246(E).

11. El ADNc de la clausula 10 clonado y expresado por metodos convencionales.

12. Un ADNc correspondiente a uc.269A(N).

13. El ADNc de la clausula 12 clonado y expresado por metodos convencionales.

14. El metodo de la clausula 1, en el que la RUC-T tiene una funcion oncogenica para uc.73(P) en cancer de colon, en el que la disminucion de su sobre-expresion induce apoptosis y tiene efectos antiproliferativos en celulas de cancer de colon que expresan de forma anomala la RUC-T.

15. Un metodo para evaluar una ruta reguladora funcional en la que dos o mas tipos de ARNnc interaccionan con e influyen en el fenotipo que comprende determinar correlaciones entre la expresion de RUC y miARN en un paciente de cancer.

16. El metodo de la clausula 15, en el que el cancer es LLC.

17. El metodo de la clausula 16, en el que la correlacion comprende la existencia de la interaccion miARN::RUC-

T.

18. El metodo de la clausula 15, en el que uno o mas GUC-nc se alteran al nivel genomico en paciente de cancer.

19. El metodo de la clausula 18, en el que el paciente de cancer tiene leucemia.

20. Un modelo en el que estan implicados genes tanto codificantes como no codificantes en y cooperan en tumorigenesis humana que comprende una o mas RUC.

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21. Un metodo para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer ligado a un elemento cromosomico asociado a cancer, que comprende evaluar el estado en el sujeto de al menos un gen de RUC localizado en proximidad estrecha al elemento cromosomico asociado a cancer: (i) midiendo en una muestra de ensayo de dicho sujeto el nivel de al menos un producto genico de RUC del gen de RUC en la muestra de ensayo, en el que una alteracion en el nivel del producto genico de RUC en la muestra de ensayo en relacion con el nivel del producto genico de RUC correspondiente en una muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, el cancer; (ii) analizar el al menos un gen de RUC en la muestra de ensayo con respecto a una delecion, mutacion o amplificacion, en el que la deteccion de una delecion, mutacion y/o amplificacion en el gen de RUC en comparacion con el gen de RUC correspondiente en la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, el cancer; y/o (iii) medir el numero de copias del al menos un gen de RUC en la muestra de ensayo, en el que un numero de copias distinto de dos para un gen de RUC en un cromosoma somatico o cromosoma sexual en una mujer, o distinto de uno para un gen de RUC en un cromosoma sexual en un hombre, es indicativo de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, el cancer.

22. El metodo de la clausula 21, en el que el elemento cromosomico asociado a cancer se selecciona del grupo que consiste en: una region genomica asociada a cancer; un sitio fragil cromosomico; un sitio de integracion de papilomavirus humano; y un gen o grupo de genes de caja homeotica.

23. El metodo de la clausula 1, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en: cancer de vejiga; cancer esofagico; cancer de pulmon; cancer de estomago; cancer de rinon; cancer de cuello uterino; cancer ovarico; cancer de mama; linfoma; sarcoma de Ewing; tumores hematopoyeticos; tumores solidos; cancer gastrico; cancer colorrectal; cancer cerebral; cancer epitelial; cancer nasofarlngeo; cancer uterino; cancer hepatico; cancer de cabeza y cuello; cancer renal; tumores de celulas germinales masculinas; mesotelioma maligno; slndrome mielodisplasico; cancer pancreatico o biliar; cancer de prostata; cancer de tiroides; cancer urotelial; cancer renal; tumor de Wilm; cancer de pulmon microclcito; melanoma; cancer de piel; osteosarcoma; neuroblastoma; leucemia (leucemia linfocltica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocltica cronica); glioblastoma multiforme; meduloblastoma; linfoma linfoplasmacitoide; y rabdomiosarcoma.

24. El metodo de la clausula 1, en el que elemento cromosomico asociado a cancer es un sitio fragil cromosomico.

25. El metodo de la clausula 10, en el que el gen de RUC se selecciona del grupo que consiste: un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353); y combinaciones de las mismas.

25. El metodo de la clausula 17, en el que el cancer es una leucemia.

27. Un metodo para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer, que comprende:

(1) transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana; (2) hibridar los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende uno o mas oligonucleotidos sonda especlficos de RUC para proporcionar un perfil de hibridacion para la muestra de ensayo; y (3) comparar el perfil de hi bridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra de control, en el que una alteracion en la senal es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrolla,r el cancer.

28. El metodo de la clausula 27, en el que el cancer es un cancer asociado a un elemento cromosomico asociado a cancer.

29. El metodo de la clausula 27, en el que el cancer es leucemia linfocltica cronica de linfocitos B.

30. Un metodo para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer asociado a uno o mas marcadores de pronostico adverso en un sujeto, que comprende: (1) transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleotidos diana; (2) hibridar los oligodesoxinucleotidos diana con una micromatriz que comprende uno o mas oligonucleotidos sonda especlficos de RUC para proporcionar un perfil de hibridacion para dicha muestra de ensayo; y (3) comparar el perfil de hibridacion de la muestra de ensayo con un perfil de hibridacion generado a partir de una muestra de control, en el que una alteracion en la senal es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, el cancer.

31. El metodo de la clausula 30, en el que el cancer es leucemia linfocltica cronica de linfocitos B.

32. Un metodo para diagnosticar si el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, un cancer, que comprende analizar en una muestra de ensayo de dicho sujeto al menos un gen o producto genico de RUC asociado a un cancer, en el que la deteccion de una mutacion en el gen o producto genico de RUC, en comparacion con el gen o producto genico de RUC correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, el cancer.

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33. El metodo de la clausula 46, en el que el al menos un gen o producto genico de miR es un gen de miR seleccionado del grupo que consiste en que el gen de RUC se selecciona del grupo que consiste en: un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353); y combinaciones de las mismas.

34. El metodo de la clausula 33, en el que el cancer es leucemia linfocltica cronica de linfocitos B.

35. Una composicion farmaceutica que comprende un producto genico de RUC y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, en el que el producto genico de RUC aislado es de un gen de RUC localizado en proximidad estrecha a un elemento cromosomico asociado a cancer.

36. La composicion farmaceutica de la clausula 35, en la que el elemento cromosomico asociado a cancer se selecciona del grupo que consiste en una region genomica asociada a cancer y un sitio fragil cromosomico.

37. Una composicion farmaceutica que comprende un acido nucleico que codifica un producto genico de RUC aislado de un gen UC localizado en proximidad estrecha a un elemento cromosomico asociado a cancer, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

38. La composicion farmaceutica de la clausula 37, en la que el elemento cromosomico asociado a cancer se selecciona del grupo que consiste en un region genomica asociada a cancer, un sitio fragil cromosomico, un sitio de integracion de papilomavirus humano y un gen o un grupo genico de caja homeotica.

39. Un metodo para tratar el cancer en un sujeto, que comprende:

(1) proporcionar a un sujeto que tiene un cancer asociado a un elemento cromosomico asociado a cancer, en el que al menos un producto genico de RUC aislado de un gen de RUC localizado en proximidad estrecha al elemento cromosomico asociado a cancer esta regulado negativamente o regulado positivamente en celulas cancerosas en un sujeto en comparacion con celulas de control; y

(2) (a) cuando el al menos un producto genico de miR aislado esta regulado negativamente en las celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto genico de miR aislado del al menos un gen de RUC, de modo que se inhiba la proliferacion de celulas cancerosas en el sujeto; o (b) cuando el al menos un producto genico de RUC aislado esta regulado positivamente en las celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un gen de RUC, de modo que se inhiba la proliferacion de celulas cancerosas en el sujeto.

40. El metodo de la clausula 39, en el que el elemento cromosomico asociado a cancer se selecciona del grupo que consiste en una region genomica asociada a cancer y un sitio fragil cromosomico.

41. El metodo de tratamiento de cancer asociado a un elemento cromosomico asociado a cancer, que comprende:

(1) determinar la cantidad de producto genico UC expresado a partir de al menos un gen de RUC localizado en proximidad estrecha al elemento cromosomico asociado a cancer en celulas cancerosas de un sujeto, en relacion con celulas de control; y

(2) alterar la cantidad de producto genico UC expresado en las celulas cancerosas: (i) administrando al sujeto una cantidad eficaz de al menos un producto genico de miR aislado del gen de RUC, si la cantidad del producto genico de RUC expresado en las celulas cancerosas es menor que la cantidad del producto genico de miR expresado en celulas de control; o (ii) administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresion del al menos un gen de RUC, si la cantidad del producto genico de RUC expresado en las celulas cancerosas es mayor que la cantidad del producto genico de RUC expresado en celulas de control, de modo que se inhiba la proliferacion de celulas cancerosas en el sujeto.

42. El metodo de la clausula 41, en el que el elemento cromosomico asociado a cancer se selecciona del grupo que consiste en una region genomica asociada a cancer, y un sitio fragil cromosomico.

43. El metodo de la clausula 42, en el que el elemento cromosomico asociado a cancer es un sitio fragil cromosomico.

44. El metodo de la clausula 43, en el que el elemento cromosomico asociado a cancer es una region genomica asociada a cancer.

45. El metodo de cualquiera de las clausulas precedentes, en el que el cancer se seleccionado del grupo que consiste en: leucemia; cancer de pulmon; cancer esofagico; cancer gastrico; cancer colorrectal; cancer de cerebro; cancer de vejiga; cancer de mama; cancer de cuello uterino; cancer epitelial; cancer nasofarlngeo; linfoma; cancer uterino; cancer hepatico; cancer de cabeza y cuello; cancer renal; tumores de celulas germinales masculinas; mesotelioma maligno; slndrome mielodisplasico; cancer ovarico; cancer pancreatico o biliar; cancer

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de prostata; cancer de tiorides; y cancer urotelial.

46. Un marcador para evaluar una o mas rutas metabolicas que contribuyen a al menos uno de inicio, progresion, gravedad, patologla, agresividad, grado, actividad, discapacidad, mortalidad, morbilidad, subclasificacion de enfermedad u otro elemento patogenico o patologico subyacente de al menos una enfermedad relacionada con cancer de pulmon, en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de RUC.

47. Una composicion que comprende uno o mas de los marcadores de la clausula precedente.

48. Un metodo para identificar un potencial para el inicio o desarrollo de al menos una enfermedad relacionada con cancer en un sujeto, proporcionando el metodo medir uno o mas de los marcadores de cualquiera de las clausulas precedentes.

49. El metodo de la clausula 48, en el que el o los marcadores estan presentes en una muestra aislada y todas las etapas del metodo se realizan in vitro.

50. Un reactivo para ensayar con respecto a una enfermedad relacionada con cancer, en el que el reactivo comprende un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleotidos de al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes o una secuencia de nucleotidos complementaria de la secuencia de nucleotidos del marcador.

51. Un reactivo para sellar con respecto a una enfermedad relacionada con cancer, en el que el reactivo comprende un anticuerpo que reconoce una protelna codificada por al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes.

52. Una microplaca de ADN para ensayar con respecto a una enfermedad relacionada con cancer, en la que se ha inmovilizado una sonda para ensayar al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes.

53. Un metodo para evaluar la eficacia de una terapia para prevenir, diagnosticar y/o tratar al menos una enfermedad relacionada con cancer de pulmon que comprende:

(1) someter un animal a una terapia cuya eficacia se esta evaluando, y

(2) determinar el nivel de eficacia del tratamiento que se ensaya en el tratamiento o prevencion de la enfermedad relacionada con cancer de pulmon evaluando al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes.

54. El metodo de la clausula 53, en el que el agente terapeutico candidato comprende uno o mas de: composiciones farmaceuticas, composiciones nutraceuticas y composiciones homeopaticas.

55. El metodo de la clausula 54, en el que la terapia que se evalua es para uso en un sujeto humano.

56. El metodo de la clausula 55, en el que el metodo no es un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugla o terapia.

57. Un metodo para evaluar el potencial de al menos un material con respecto a una capacidad para iniciar una respuesta a enfermedad relacionada con cancer en un modelo animal, proporcionando el metodo:

(1) medir uno o mas marcadores regulados positiva o negativamente de cualquiera de las clausulas precedentes despues de exposicion del animal a uno o mas materiales en cantidades suficientes para iniciar una respuesta de enfermedad relacionada con cancer en el animal; y

(2) determinar si al menos uno de los marcadores regulados positiva o negativamente tiene la capacidad de iniciar una respuesta de enfermedad relacionada con cancer.

58. Una composicion farmaceutica para tratar una enfermedad relacionada con cancer, que comprende: al menos un producto genico de RUC seleccionado del grupo que consiste en un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353); y combinaciones de los mismos; y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

59. La composicion farmaceutica de la clausula 59, en la que el al menos un producto genico de miR corresponde a un producto de RUC que esta regulado positiva o negativamente en celulas cancerosas en relacion con celulas de control adecuadas.

60. La composicion farmaceutica de la clausula 59, en la que la enfermedad relacionada con cancer de pulmon es adenocarcinoma.

61. Una composicion farmaceutica para tratar un cancer de pulmon, que comprende: al menos un compuesto de inhibicion de la expresion de RUC, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable; en el que al menos un

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compuesto de inhibicion de la expresion de RUC es especlfico para un producto genico de miR seleccionado del grupo que consiste en un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353); y combinaciones de las mismas.

62. La composicion farmaceutica de la clausula 61, en la que el al menos un compuesto de inhibicion de expresion de RUC es especlfico para un producto genico de RUC que esta regulado positiva o negativamente en celulas cancerosas en relacion con celulas de control adecuadas.

63. Un artlculo de fabricacion que comprende: al menos un reactivo de captura que se une con un marcador para una enfermedad relacionada con cancer seleccionado de al menos uno de los marcadores de cualquiera de las clausulas precedentes.

64. Un kit para explorar con respecto a un compuesto candidato para un agente terapeutico para tratar una enfermedad relacionada con cancer, en el que el kit comprende: uno o mas reactivos de al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes, y una celula que expresa al menos un marcador.

65. El kit de la clausula 64, en el que la presencia del marcador se detecta usando un reactivo que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une especlficamente con al menos un marcador.

66. El kit de la clausula 65, en el que el reactivo esta marcado, radiomarcado o marcado con biotina y/o en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta radiomarcado, marcado con cromoforo, marcado con fluoroforo o marcado con enzimas.

67. El kit de la clausula 66, que incluye ademas un recipiente que comprende al menos uno de los marcadores.

68. El kit de la clausula 67, en el que el reactivo comprende uno o mas de: un anticuerpo, una sonda con la que el reactivo se une o puede unirse, y un quelado metalico inmovilizado.

69. Un ensayo de exploracion con respecto a una enfermedad relacionada con cancer de pulmon que comprende: poner en contacto uno o mas de los marcadores de cualquiera de las clausulas precedentes con un sustrato para dicho marcador y con un agente de ensayo y determinar si el agente de ensayo modula la actividad del marcador.

70. Un ensayo de exploracion de la clausula 69, en el que todas las etapas del metodo se realizan in vitro.

71. Una micromatriz para predecir la presencia de una enfermedad relacionada con cancer en un sujeto que comprende un anticuerpo dirigido a al menos un marcador de cualquiera de las clausulas precedentes.

72. El metodo de la clausula 71, en el que se evaluo un nivel de expresion del marcador detectando la presencia la presencia de un polinucleotido transcrito o parte del mismo, en el que el polinucleotido transcrito comprende una region codificante del marcador.

73. El metodo de la clausula 72, en el que la muestra es un fluido o tejido corporal asociado a cancer.

74. El metodo de la clausula 73, en el que la muestra comprende celulas obtenidas del paciente.

75. Un metodo para tratar, prevenir, invertir o limitar la gravedad de una complicacion de enfermedad relacionada con cancer en un individuo que lo necesite, que comprende: administrar al individuo un agente que interfiere con al menos una ruta de senalizacion de respuesta a enfermedad relacionada con cancer, en una cantidad suficiente para interferir con dicha senalizacion, en el que el agente comprende al menos un producto genico de RUC.

76. Uso de un agente que interfiere con al menos una ruta de senalizacion de respuesta a enfermedad relacionada con cancer de pulmon, para la fabricacion de un medicamento para tratar, prevenir, invertir o limitar la gravedad de una complicacion de enfermedad relacionada con cancer en un individuo, en el que el agente comprende al menos un producto genico de RUC.

77. Un metodo para tratar, prevenir, invertir o limitar la gravedad de una complicacion de enfermedad relacionada con cancer en un individuo que lo necesite, que comprende: administrar al individuo un agente que interfiere con al menos una cascada de respuesta a enfermedad relacionada con cancer, en el que el agente comprende al menos un producto genico de RUC.

78. Uso de un agente que interfiere con al menos una cascada de respuesta a enfermedad relacionada con cancer, para la fabricacion de un medicamento para tratar, prevenir, invertir o limitar la gravedad de una complicacion de enfermedad relacionada con cancer en un individuo, en el que el agente comprende al menos un producto genico de RUC.

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79. Un medio lelble por ordenador que comprende una base de datos que tiene una pluralidad de perfiles de referenda codificados digitalmente, en el que al menos un primer perfil de referencia representa un nivel de al menos un primer marcador en una o mas muestras de uno o mas sujetos que muestran un indicio de una respuesta a enfermedad relacionada con cancer, en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de RUC.

80. El medio lelble por ordenador de la clausula 79, que incluye al menos un segundo perfil de referencia que representa un nivel de al menos un segundo marcador en una o mas muestras de uno o mas sujetos que muestran indicios de una respuesta de enfermedad relacionada con cancer; o sujetos que tienen una enfermedad relacionada con cancer.

81. Un sistema informatico para determinar si un sujeto tiene, esta predispuesto a tener o tiene un mal pronostico de supervivencia para una enfermedad relacionada con cancer, que comprende: la base de datos de cualquiera de las clausulas precedentes, y un servidor que comprende un codigo ejecutable por ordenador para provocar que el ordenador reciba un perfil de un sujeto, identificar a partir de la base de datos un perfil de referencia coincidente que sea diagnosticamente relevante para el perfil del sujeto, y generar un indicio de si ese sujeto tiene, o esta predispuesto a tener, una enfermedad relacionada con cancer.

82. Un metodo asistido por ordenador para evaluar la presencia, ausencia, naturaleza o alcance de una enfermedad relacionada con cancer en un sujeto, que comprende:

(1) proporcionar un ordenador que comprende un modelo o un algoritmo para clasificar datos de una muestra obtenida del sujeto, en el que la clasificacion incluye analizar los datos con respecto a la presencia, ausencia o cantidad de al menos un marcador, y en el que el marcador comprende uno o mas productos genicos de miR;

(2) introducir datos de la muestra biologica obtenida del sujeto; y

(3) clasificar la muestra biologica para indicar la presencia, ausencia, naturaleza o alcance de una enfermedad relacionada con cancer.

83. El metodo de la clausula 82, en el que el al menos un producto genico de RUC y combinaciones del mismo incluye variantes aislantes o fragmentos biologicamente activos o equivalentes funcionales de los mismos, o anticuerpos que se unen con los mismos.

84. El metodo de la clausula 83, en el que el producto genico de RUC se selecciona del grupo que consiste en un grupo de siete RUC (uc.347 a uc.353); y combinaciones de los mismos.

85. Un modelo animal para cancer en el que al menos uno de una expresion alterada de uno o mas productos genicos de RUC esta presente.

86. El modelo animal de la clausula 85, en el que el modelo animal es un vertebrado no humano.

87. El modelo animal de la clausula 86, en el que el modelo animal es un raton, una rata, un conejo o un primate.

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para identificar riesgo de cancer relativo en un sujeto humano, que comprende identificar si una muestra de tejido de ensayo del ser humano de ensayo comprende al menos un perfil de expresion de regiones ultraconservadas transcritas (RUC-T) que tiene una correlacion estadlsticamente significativa con el carcinoma hepatocelular (CHC);

   en el que el perfil de expresion de RUC-T comprende una identificacion de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198;

   en el que una correlacion estadlsticamente significativa indica un riesgo relativo de CHC; y

   en el que las RUC-T en el perfil de expresion de RUC-T se expresan diferencialmente entre celulas normales y malignas.
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198 estan reguladas negativamente en tumores y uc.20, uc.402 y uc.252 estan reguladas positivamente en tumores.
3. 3. Un metodo para diferenciar canceres humanos que comprende usar un perfil de expresion de RUC-T, en donde la asociacion entre la localizacion genomica de RUC y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es estadlsticamente muy significativa y comparable a la indicada para miARN;

   en el que el perfil de expresion tiene una correlacion estadlsticamente significativa con CHC, comprendiendo dicho perfil de expresion una identificacion de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198.
4. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que las RUC-T en el perfil de expresion se localizan en regiones genomicas asociadas a cancer (RAGC) especlficamente asociadas a CHC.
5. 5. Una composicion farmaceutica para tratar CHC, que comprende productos genicos de RUC que comprenden una identificacion de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
6. 6. Un metodo para diagnosticar si un sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, CHC, que comprende evaluar el estado en el sujeto de las RUC-T en un perfil de expresion que comprende una identificacion de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198:

   (i) midiendo en una muestra de ensayo de dicho sujeto el nivel de las RUC-T en el perfil de expresion en la muestra de ensayo, en donde una alteracion en el nivel de RUC-T en la muestra de ensayo en relacion con el nivel de las RUC-T en una muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, CHC;

   (ii) analizar las RUC-T en el perfil de expresion en la muestra de ensayo con respecto a una delecion, una mutacion o una amplification, en el que la detection de una delecion, mutation y/o amplification en las RUC-T en comparacion con las RUC-T correspondientes en la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, CHC; y/o

   (iii) medir el numero de copias de las RUC-T en el perfil de expresion en la muestra de ensayo, en donde un numero de copias distinto de dos para RUC-T en un cromosoma somatico o un cromosoma sexual en una mujer, o distinto de uno para RUC-T en un cromosoma sexual en un hombre, es indicativo de que el sujeto tiene, o esta en riesgo de desarrollar, CHC.
7. 7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198 estan reguladas negativamente en tumores CHC y uc.20, uc.402 y uc.252 estan reguladas positivamente en tumores CHC.
8. 8. Un metodo para diferenciar entre celulas de carcinoma hepatocelular (CHC) y celulas no CHC, que comprende usar uno o mas perfiles de expresion de region ultraconservada transcrita (RUC-T) en donde la asociacion entre la localizacion genomica de RUC y los elementos genomicos relacionados con cancer analizados es estadlsticamente muy significativa y comparable a la indicada para miARN; en donde el metodo usa una identificacion de ocho RUC: uc.20, uc.402, uc.252, uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198 para diferenciar entre celulas de carcinoma hepatocelular (CHC) y celulas no CHC.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que uc.396, uc.274, uc.27, uc.23 y uc.198 estan reguladas negativamente en tumores CHC y uc.20, uc.402 y uc.252 estan reguladas positivamente en tumores CHC.