ES2545383T3 - Métodos y composiciones basados en microARN para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama.

Description

Métodos y composiciones basados en microARN para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama

Apoyo del gobierno

La presente invención fue apoyada, en su totalidad o en parte, por una subvención bajo las Subvenciones del Proyecto de Programa Nº P01CA76259, P01CA81534 y P30CA56036 del Instituto de Cáncer Nacional. El Gobierno tiene determinados derechos sobre esta invención.

Antecedentes

El cáncer de mama es un problema de salud significativo para mujeres en los Estados Unidos y en todo el mundo. Aunque se han realizado avances en la detección y el tratamiento de la enfermedad, el cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en mujeres, afectando a más de 180.000 mujeres en los Estados Unidos cada año. Para las mujeres en Norteamérica, las probabilidades en tiempo de vida de tener cáncer de mama son ahora de una de cada ocho.

No está disponible en la actualidad ningún método universalmente exitoso para el tratamiento o prevención de cáncer de mama. El tratamiento del cáncer de mama se basa en la actualidad en una combinación de diagnóstico temprano (por ejemplo, mediante procedimientos de exploración de mama rutinarios) y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de diversos tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal. El ciclo de tratamiento para un cáncer de mama particular se selecciona con frecuencia basándose en diversos parámetros de pronóstico incluyendo un análisis de marcadores tumorales específicos. Véase, por ejemplo, Porter-Jordan y Lippman, Breast Cancer 8: 73-100 (1994).

Aunque el descubrimiento de BRCA1 y BRCA2 fueron etapas importantes en la identificación de factores genéticos clave implicados en cáncer de mama, se ha hecho evidente que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 representan solamente una fracción de la susceptibilidad heredada a cáncer de mama (Nathanson, K. L., et al., Human Mol. Gen. 10(7): 715-720 (2001); Anglican Breast Cancer Study Group. Br. J. Cancer 83(10): 1301-08 (2000); y Syrjakoski, K., et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1529-31 (2000)). A pesar de investigación considerable sobre terapias para cáncer de mama, el cáncer de mama sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente, y la alta mortalidad observada en pacientes con cáncer de mama indica que se necesitan mejoras en el diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad.

Los microARN son una clase de ARN no codificantes, pequeños que controlan la expresión génica hibridando con y desencadenando la represión de la traducción o, menos frecuentemente, la degradación de una diana de ARN mensajero (ARNm). El descubrimiento y estudio de los miARN ha revelado mecanismos reguladores de genes mediados por miARN que desempeñan papeles importantes en el desarrollo de los organismos y diversos procesos celulares, tales como diferenciación celular, crecimiento celular y muerte celular (Cheng, A. M., et al., Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005)). Estudios recientes sugieren que la expresión aberrante de los miARN particulares puede estar implicada en enfermedades humanas, tales como trastornos neurológicos (Ishizuka, A., et al., Genes Dev. 16: 2497-2508 (2002)) y cáncer. En particular, se ha descubierto expresión errónea de miR-16-1 y/o miR-15a en leucemias linfocíticas crónicas humanas (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-15529 (2002)).

El desarrollo y el uso de micromatrices que contienen todos los microARN humanos conocidos ha permitido un análisis simultáneo de la expresión de cada miARN en una muestra (Liu, C.G., et al., Proc Natl. Acad. Sci U.S.A.

101: 9740-9744 (2004)). Estas micromatrices de microARN no se han usado solamente para confirmar que miR-16-1 está desregulado en células CLL humanas, sino también para generar identificaciones de expresión de miARN que se asocian con características clínico patológicas bien definidas de CLL humano (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 1175-11760 (2004)).

Se usó un método de realización de perfiles de expresión de miARN citométrico basado en perlas en un estudio para presentar un análisis de expresión sistemática de miARN de mamífero de muestras, incluyendo cánceres humanos. Los perfiles de miARN reflejaron el linaje de desarrollo y estado de diferenciación de los tumores (Lu et al., Nature

435: 835-838 (2004)). Otro estudio sugiere que la mayoría de genes de miR pueden hallarse en regiones genómicas asociadas con cáncer o en sitios frágiles (Calin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 2999-3004 (2004)).

El uso de micromatrices de microARN para identificar un grupo de microARN, que se expresan diferencialmente entre células normales y células de cáncer de mama (es decir, una identificación de expresión o perfil de expresión), puede ayudar a determinar miARN específicos que están implicados en el cáncer de mama. Además, la identificación de dianas potenciales de estos miARN puede ayudar a desentrañar su papel patógeno. La presente divulgación proporciona nuevos métodos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama.

Sumario

La presente divulgación se basa, en parte, en la identificación de un distintivo específico de cáncer de mama de miARN que se expresan diferencialmente en células de cáncer de mama, en relación con células de control normales. En consecuencia, en un aspecto la invención proporciona un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene

o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama. Una alteración (por ejemplo, un aumento, una reducción) en el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama. En ciertas realizaciones, el al menos un producto génico de miR se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-21, miR-155, miR-10 y combinaciones de los mismos.

El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse usando diversas técnicas que se conocen bien por los expertos en la materia. En una realización, el nivel del al menos un producto génico de miR se mide usando análisis de transferencia de Northern. En otra realización, el nivel del al menos un producto génico se mide por transcripción inversa de ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado de una muestra de control. Una alteración en la señal de al menos un miARN en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer de mama. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial del miRNoma humano. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR-204, miR-213, let7a-2, let-7a-3, let-7d (let-7dv1), let-7f-2, let-7i (let-7d-v2), miR-101-1, miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-143, miR149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-203, miR205, miR-206, miR-210 y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, la invención también proporciona un método para diagnosticar un cáncer de mama asociado con estadio tumoral avanzado en un sujeto, que comprende medir el nivel de expresión de al menos miR21 en el que un aumento en el nivel de expresión del al menos miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene un cáncer de mama asociado con estadio tumoral avanzado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un método para diagnosticar cáncer de mama de estadio tumoral avanzado, que comprende:

(1)

transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana;

(2)

hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

(3)

comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado de una muestra de control,

en el que un aumento en el nivel de expresión de al menos miR-21 en la muestra de ensayo en comparación con un nivel de expresión de miR-21 en una muestra de control es indicativo de que el sujeto tiene cáncer de mama de estadio tumoral avanzado.

La presente divulgación también proporciona métodos para diagnosticar un cáncer de mama asociado con uno o más marcadores de pronóstico, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de ensayo de cáncer de mama de un sujeto y comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo de cáncer de mama con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. El cáncer de mama puede asociarse con uno o más marcadores de pronóstico adversos asociados con el cáncer de mama, tales como, pero sin limitación, expresión de receptor de estrógenos, expresión del receptor de progesterona, metástasis de ganglios linfáticos positivos, alto índice proliferativo, expresión de p53 detectable, estadio tumoral avanzado y alta invasión vascular. En una realización, el nivel del al menos un producto génico de miR se mide transcribiendo de forma inversa ARN a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control. Una alteración en la señal de al menos un miARN en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, un cáncer de mama asociado con el o los marcadores de pronóstico. La micromatriz puede comprender al menos un oligonucleótido sonda específico de miARN para un miARN seleccionado del grupo que consiste en miR-26a, miR26b, miR102 (miR-29b), miR-30a-5p, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-185, miR-191, miR-206, miR-212, let-7c,

miR-9-2, miR-15-a, miR-21, miR-30a-s, miR-133a-1, miR-137, miR-153-2, miR-154, miR-181a, miR-203, miR-213, let-7f-1, let-7a-3, let-7a-2, miR-9-3, miR-10b, miR25 27a, miR-29a, miR-123, miR-205, let-7d, miR-145, miR-16a, miR-128b y combinaciones de los mismos.

La presente divulgación también abarca métodos descritos para tratar cáncer de mama en un sujeto, en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo, regulado negativamente, regulado positivamente) en las células de cáncer del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células de cáncer de mama, el método comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR, de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas en el sujeto. El método puede comprender administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR aislado siempre que el gen de miR no sea miR15a o miR-16-1, de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas en el sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un gen de miR de modo que se inhiba la proliferación de células cancerosas de mama.

La presente divulgación también proporciona métodos para tratar cáncer de mama en un sujeto que comprende determinar la cantidad de al menos un producto génico de miR en células cancerosas de mama del sujeto, en relación con células de control. Si la expresión del producto génico de miR está desregulada en células cancerosas de mama, los métodos comprenden además alterar la cantidad del al menos un producto génico de miR expresado en las células cancerosas de mama. Si la cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas es menor que la cantidad de producto génico de miR expresado en células de control, el método comprende administrar una cantidad eficaz de al menos un producto génico de miR aislado. El producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1. Si la cantidad del producto génico de miR expresado en las células cancerosas es mayor que la cantidad del producto génico de miR expresado en células de control, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un gen de miR. El producto génico de miR puede no ser miR-15a o miR-16-1.

La presente divulgación proporciona además composiciones farmacéuticas para tratar cáncer de mama. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR aislado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tenga una nivel reducido de expresión en células cancerosas de mama en relación con las células de control adecuadas. El producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR10b, miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR-204, let-7a-2, let-7a-3, let7d (let-7d-vl), let-7f-2, miR-101-1, miR-143 y combinaciones de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico de un gen de miR cuya expresión es mayor en células cancerosas de mama que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión de miR puede ser específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-155, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR29b), miR-213, let-7i (let-7d-v2), miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-149, miR-191, miR196-1, miR-196-2, miR202, miR-203, miR-206, miR-210, miR-213 y combinaciones de los mismos.

La presente divulgación proporciona además métodos para identificar un agente anti cáncer de mama, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos células de cáncer de mama. Un aumento en el nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un agente anti cáncer de mama. El al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células de cáncer de mama pueden seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-10b, miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR204, let-7a-2, let-7a-3, let-7d (lef-7d-v1), let-7f-2, miR-101-1, miR-143 y combinaciones de los mismos.

El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con aumento de los niveles de expresión en células de cáncer de mama. Una reducción en el nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativa de que el agente de ensayo es un agente anti cáncer de mama. Al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células de cáncer sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR155, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR-213, let-7i (let7dv2), miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR202, miR-203, miR-206, miR-210, miR-213 y combinaciones de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de solicitud de patente contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color se proporcionarán por la Oficina tras la petición y pago de la

tasa necesaria.

La FIGURA 1 representa un árbol generado por análisis de grupos que muestra una separación de cáncer de mama de tejidos normales basándose en la expresión de microARN diferencial (p<0,05). La barra en la parte de abajo de la figura indica el grupo de tejidos de mama con cáncer (rojos) o normales (amarillos). La FIGURA 2 es una gráfica que representa la probabilidad (0,0 a 0,1) de que cada muestra sea un tejido canceroso o normal basándose en análisis de PAM. Todos los tejidos normales y de cáncer de mama se predijeron correctamente por la identificación de miR mostrada en la Tabla 2. La FIGURA 3A es una transferencia de Northern que representa el nivel de expresión de miR-125b, usando una sonda complementaria de miR-125b, en una muestra normal, así como varias muestras tumorales de pacientes con cáncer de mama (P). La sonda U6 se usó para la normalización de los niveles de expresión para cada muestra. La FIGURA 3B es una transferencia de Northern que representa el nivel de expresión de miR-145, usando una sonda complementaria de miR-145, en una muestra normal, así como varias muestras tumorales de pacientes con cáncer de mama (P). La sonda U6 se usó para normalización de los niveles de expresión para cada muestra. La FIGURA 3C es una transferencia de Northern que representa el nivel de expresión de miR-21, usando una sonda complementaria de miR-21; en una muestra normal, así como varias muestras tumorales de pacientes con cáncer de mama (marcados como pacientes aquejados). La sonda U6 se usó para normalización de los niveles de expresión para cada muestra. La FIGURA 3D es una transferencia de Northern que representa los niveles de expresión de microARN miR125b, miR-145 y miR-21 en diversas líneas celulares de cáncer de mama. El nivel de expresión de cada microARN se determinó también en una muestra de tejidos normales. La sonda U6 se usó para normalización de los niveles de expresión para cada muestra. La FIGURA 4A es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con la presencia (ER+) o ausencia (ER-) del receptor de estrógenos. La FIGURA 4B es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con la presencia (PR+) o ausencia (PR-) del receptor de progesterona. La FIGURA 4C es una tabla que enumera los miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con tumores de estadio 1 (pT1) o estadio 2 o 3 (pT2-3). La FIGURA 4D es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con la presencia (pN0) o ausencia (pun10+) de metástasis de ganglios linfáticos. La FIGURA 4E es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con la presencia o ausencia de invasión vascular. La FIGURA 4F es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con un índice proliferativo alto (MIB-1>30) o bajo (MIB-1<20) (PI). La FIGURA 4G es una tabla que enumera miARN que se expresan diferencialmente en muestras de cáncer de mama asociadas con inmunotinción positiva (p53+) o negativa (p53-) de p53.

Descripción detallada

La presente divulgación se basa, en parte, en la identificación de miARN particulares cuya expresión está alterada en células de cáncer de mama en relación con células de control normales, y microARN cuya expresión está alterada en células cancerosas de mama asociadas con elementos de pronóstico particulares, en relación con células de cáncer de mama tales como cáncer de colon, de estómago, pancreático, de pulmón, de mama y de próstata, en relación con células de control normales que carecen de estos elementos.

Como se usa en la presente memoria de forma intercambiable un "producto génico de miR", "microARN", "miR" o "miARN" se refiere al transcrito de ARN no procesado o procesado de un gen de miR. Ya que los productos génicos de miR no se traducen a proteína, la expresión "productos génicos de miR" no incluye proteínas. El transcrito génico de miR no procesado también se denomina un "precursor de miR" y normalmente comprende un transcrito de ARN de aproximadamente 70-100 nucleótidos de longitud. El precursor de miR puede procesarse por digestión con una RNAsa (por ejemplo, Dicer, Argonaut o RNAsa III, por ejemplo RNAsa III de E. coli)) en una molécula de ARN de 1925 nucleótidos activa. Esta molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también se denomina el transcrito génico de miR "procesado" o miARN "maduro".

La molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa puede obtenerse del precursor de miR mediante vías de procesamiento naturales (por ejemplo, usando células intactas o lisados celulares) o mediante vías de procesamiento sintéticas (por ejemplo, usando enzimas de procesamiento aisladas, tales como Dicer, Argonaut o RNAsa III aislada). Se entiende que la molécula de ARN de 19-25 nucleótidos activa también puede producirse directamente por síntesis biológica o química, sin haberse procesado a partir del precursor de miR.

Las secuencias de productos génicos de 187 miR se proporcionan en la Tabla 1. Todas las secuencias de ácido nucleico del presente documento se proporcionan en la dirección 5’ a 3’. Además, los genes se representan en cursiva, y los productos génicos se representan por tipo normal; por ejemplo, mir-17 es el gen y miR-17 es el producto génico.

La presente divulgación abarca métodos de diagnóstico bien si un sujeto tiene, o bien si está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de ensayo del sujeto y comparar el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. Como se usa en el presente documento, un

5 “sujeto” puede ser cualquier mamífero que tenga, o se sospeche que tenga, cáncer de mama. El sujeto puede ser un ser humano que tenga, o se sospeche que tenga, cáncer de mama.

El cáncer de mama puede ser cualquier forma de cáncer de mama y puede asociarse con uno o más marcadores de pronóstico o características, incluyendo, pero sin limitación, expresión del receptor de estrógenos, expresión del

10 receptor de progesterona, metástasis de ganglios linfáticos, índice proliferativo alto, expresión de p53 detectable, estadio tumoral avanzado y alta invasión vascular. El marcador de pronóstico puede asociarse con un pronóstico adverso o negativo, o puede asociarse con un pronóstico bueno o positivo.

El nivel de al menos un producto génico de miR puede medirse en células de una muestra biológica obtenida del sujeto. Por ejemplo, puede retirarse una muestra tisular de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer de mama asociado por técnicas de biopsia convencionales. En otro ejemplo, puede retirarse una muestra sanguínea del sujeto, y pueden aislarse glóbulos blancos para extracción de ADN por técnicas convencionales. La muestra de sangre o tejido se obtiene preferentemente del sujeto antes del inicio de la radioterapia, quimioterapia u otro tratamiento terapéutico. Puede obtenerse una muestra de tejido o sangre de control correspondiente de tejidos no afectos del sujeto, de un individuo humano normal o población de individuos normales, o de células cultivadas correspondientes a la mayoría de las células en la muestra del sujeto. La muestra de tejido o sangre de control se procesa después junto con la muestra del sujeto, de modo que los niveles de producto génico de miR producido a partir de un gen de miR dado en células de la muestra del sujeto puede compararse con los niveles de producto génico de miR correspondientes de células de la muestra de control.

Una alteración (es decir, un aumento o reducción) del nivel de un producto génico de miR en la muestra obtenida un sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en la muestra de control, es indicativa de la presencia de un cáncer de mama en el sujeto. El nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo es mayor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está "regulada positivamente"). Como se usa en la presente memoria, la expresión de un producto génico de miR está "regulada positivamente" cuando la cantidad de producto génico de miR en una muestra celular o tisular de un sujeto es mayor que la cantidad del mismo producto génico en una muestra celular o tisular de control. El nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo puede ser menor que el nivel del producto génico de miR correspondiente en la muestra de control (es decir, la expresión del producto génico de miR está "regulada negativamente"). Como se usa en la presente memoria, la expresión de un gen de miR está "regulada negativamente" cuando la cantidad de producto génico de miR producida de ese gen en una muestra celular o tisular de un sujeto es menor que la cantidad producida del mismo gen en una muestra celular o tisular de control. La expresión génica de miR relativa en las muestras de control y normales puede determinarse con respecto a uno o más patrones de expresión de ARN. Los patrones pueden comprender, por ejemplo, un nivel de expresión génica de miR cero, el nivel de expresión génica de miR en una línea celular convencional, o el nivel medio de expresión génica de miR previamente obtenido para una población de controles humanos normales.

El nivel de un producto génico de miR en una muestra puede medirse usando cualquier técnica que sea adecuada para detectar los niveles de expresión de ARN en una muestra biológica. Se conocen bien por los expertos en la materia técnicas adecuadas para determinar los niveles de expresión de ARN en células de una muestra biológica (por ejemplo, análisis de transferencia de Northern, RT-PCR, hibridación in situ). El nivel de al menos un producto génico de miR puede detectarse usando análisis de transferencia de Northern. Por ejemplo, puede purificarse ARN celular total de células por homogeneización en presencia de tampón de extracción de ácidos nucleicos, seguido de centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan, y el ADN se retira por tratamiento con DNasa y precipitación. Las moléculas de ARN se separan después por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con técnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa. Después se inmoviliza el ARN en los filtros por calentamiento. Se consigue detección y cuantificación de ARN específico usando sondas de ADN o ARN marcadas de forma apropiada complementarias del ARN en cuestión. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 7.

Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación de transferencia de Northern de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1. Se describen métodos para preparación de sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones para hibridación de las mismas con secuencias de nucleótidos diana en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulos 10 y 11.

Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede marcarse con, por ejemplo, un radionúclido, tal como 3H, 32P, 33P, 14C

o 35S; un metal pesado; o un ligando capaz de actuar como un miembro de par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo); una molécula fluorescente; una molécula quimioluminiscente; una enzima o similares.

Las sondas pueden marcarse a alta actividad específica por el método de traslación de muesca de Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251 o por el método de cebadores aleatorios de Fienberg et al. (1983), Anal. Biochem.

132: 6-13. Este último es el método elegido para sintetizar sondas marcadas con 32P de alta actividad específica a partir de ADN monocatenario o de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos de acuerdo con el método de traslación de muescas, es posible preparar sondas de ácido nucleico marcadas con 32P con una actividad específica bastante mayor de 108 cpm/microgramo. Después puede realizarse detección autorradiográfica de la hibridación exponiendo los filtros hibridados a película fotográfica. La exploración densitométrica de las películas fotográficas expuestas a los filtros hibridados proporciona una medición precisa de los niveles de transcrito génico de miR. Usando otro enfoque, los niveles de transcrito génico de miR pueden cuantificarse por sistemas de formación de imágenes computarizada, tales como el Phosphorimager Molecular Dynamics 400-B 2D disponible de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ.

Cuando el marcaje con radionúclidos de sondas de ADN o ARN no es práctico, puede usarse el método de cebadores aleatorios para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-épsilonaminocaproil)-3-aminoalil)desoxiuridina trifosfato, en la molécula sonda. El oligonucleótido sonda biotinilado puede detectarse por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos antibiotina) acoplados a colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.

Además de Northern y otras técnicas de hibridación de ARN, la determinación de los niveles de transcritos de ARN puede conseguirse usando la técnica de hibridación in situ. Esta técnica requiere menos células que la técnica de transferencia de Northern, e implica depositar células completas en un cubreobjetos de microscopio y explorar el contenido de ácido nucleico de la célula con una solución que contenga sondas de ácido nucleico radiactivas o marcadas de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica es particularmente adecuada para analizar muestras de biopsia tisular de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se describe en más detalle en la Patente de Estados Unidos Nº 5.427.916. Pueden producirse sondas adecuadas para hibridación in situ de un producto génico de miR dado a partir de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la Tabla 1, como se ha descrito anteriormente.

El número relativo de transcritos génicos de miR en células también puede determinarse por transcripción inversa de transcritos génicos de miR, seguido de amplificación de los transcritos de transcripción inversa por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de los transcritos génicos de miR pueden cuantificarse en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen "constitutivo" presente en la misma muestra. Un gen "constitutivo" adecuado para su uso como un patrón interno incluye, por ejemplo, miosina y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Los métodos para RT-PCR cuantitativa, y variaciones de la misma están dentro de la experiencia de la técnica.

En algunos casos, puede ser deseable determinar simultáneamente el nivel de expresión de una pluralidad de productos génicos de miR diferentes en una muestra. En otros casos, puede ser deseable determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los genes de miR conocidos correlacionados con cáncer. La evaluación de los niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de genes de miR consume tiempo y requiere una gran cantidad de ARN total (al menos 20 µg para cada transferencia de Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos.

Para superar estas limitaciones, puede construirse una oligobiblioteca, en formato de microplaca (es decir, una micromatriz), que contenga un conjunto de oligodesoxinucleótidos sonda que son específicas para un conjunto de genes de miR. Usando dicha micromatriz, puede determinarse el nivel de expresión de múltiples microARN en una muestra biológica por transcripción inversa de los ARN para generar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, e hibridarlos con oligodesoxinucleótidos sonda de la micromatriz para generar un perfil de hibridación, o expresión. El perfil de hibridación de la muestra de ensayo puede después compararse con el de una muestra de control para determinar qué microARN tienen un nivel de expresión alterado en células de cáncer de mama. Como se usa en la presente memoria, "oligonucleótido sonda" u "oligodesoxinucleótido sonda" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridar con un oligonucleótido diana. "Oligonucleótido diana" u "oligodesoxinucleótido diana" se refiere a una molécula para detectar (por ejemplo, mediante hibridación). Por "oligonucleótido sonda específico de miR" u "oligonucleótido sonda específico para un miR" se entiende un oligonucleótido sonda que tiene una secuencia seleccionada para hibridar con un producto génico de miR específico, o con un transcrito inverso del producto génico de miR específico.

Un "perfil de expresión" o "perfil de hibridación" de una muestra particular es esencialmente una identificación del estado de la muestra; aunque dos estados pueden tener cualquier gen particular expresado de forma similar, la evaluación de varios genes permite simultáneamente la generación de un perfil de expresión génica que es único para el estado de la célula. Es decir, el tejido normal puede distinguirse del tejido de cáncer de mama, y dentro del tejido de cáncer de mama, pueden determinarse diferentes estados de pronóstico (por ejemplo, buenas o malas perspectivas de supervivencia a largo plazo). Comparando los perfiles de expresión de tejido de cáncer de mama en diferentes estados, se obtiene información con respecto a qué genes son importantes (incluyendo regulación tanto positiva como negativa de los genes) en cada uno de estos estados. La identificación de secuencias que se expresan diferencialmente en tejido de cáncer de mama o tejido de mama normal, así como la expresión diferencial que da como resultado diferentes resultados de pronóstico, permiten el uso de esta información de varias maneras. Por ejemplo, puede evaluarse un régimen de tratamiento particular (por ejemplo, para determinar si un fármaco quimioterapéutico actúa para mejorar el pronóstico a largo plazo en un paciente particular). De forma similar, el diagnóstico puede realizarse o confirmarse comparando muestras de pacientes con los perfiles de expresión conocidos. Además, estos perfiles de expresión génica (o genes individuales) permiten la exploración de candidatos farmacológicos que suprimen el perfil de expresión de cáncer de mama o convierten un perfil de pronóstico malo en un perfil de pronóstico mejor.

En consecuencia, la presente divulgación proporciona métodos para diagnosticar si un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama, que comprenden transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN

para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en el que una alteración de la señal de al menos un miARN es indicativa de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, un cáncer de mama. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial del miRNoma humano. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-125b, miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR125b-2, miR-194, miR-204, miR-213, let-7a-2, let-7a-3, let-7d (let-7d-v1), let-7f-2, let-7i (let-7d-v2), miR-101-1, miR122a, miR-128b, miR-136, miR-143, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-203, miR-206, miR210 y combinaciones de los mismos. El al menos un producto génico de miR puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-125b, miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b y combinaciones de los mismos.

La micromatriz puede prepararse a partir de sondas oligonucleotídicas específicas de genes generadas de secuencias de miARN conocidas. La serie puede contener dos sondas oligonucleotídicas diferentes para cada miARN, una que contiene la secuencia activa, madura y la otra que es específica para el precursor del miARN. La serie también puede contener controles, tales como una o más secuencias de ratón que difieren de ortólogos humanos en solamente algunas bases, que pueden actuar como controles para las condiciones de rigurosidad de hibridación. También pueden imprimirse ARNt de ambas especies en la microplaca, proporcionando un control positivo interno, relativamente estable, para hibridación específica. También pueden incluirse en la microplaca uno o más controles apropiados para hibridación no específica. Para este fin, las secuencias se seleccionan basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquier miARN conocido.

La micromatriz puede fabricarse usando técnicas conocidas en este campo. Por ejemplo, los oligonucleótidos sonda de una longitud apropiada, por ejemplo, 40 nucleótidos, se modifican con amina 5’ en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de micromatrices disponibles en el mercado, por ejemplo, el Microarrayer GeneMachine OmniGrid™ 100 y portaobjetos activados Amersham CodeLink™. El oligómero de ADNc marcado correspondiente a los ARN diana se prepara por transcripción inversa del ARN diana con cebador marcado. Después de la síntesis de primera cadena, los híbridos de ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan después con la microplaca de micromatriz en condiciones de hibridación, por ejemplo, SSPE 6X/formamida 30 % a 25 ºC durante 18 horas, seguido de lavado en TNT 0,75X a 37 ºC durante 40 minutos. En las posiciones de la serie en las que el ADN sonda inmovilizado reconoce un ADNc diana complementario en la muestra, se produce hibridación. El ADNc diana marcado marca la posición exacta en la serie donde se produce unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. El resultado consiste en una lista de acontecimientos de hibridación, que indican la abundancia relativa de secuencias de ADNc específicas, y por lo tanto la abundancia relativa de los miR complementarios correspondientes, en la muestra del paciente. El oligómero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de un cebador marcado con biotina. La micromatriz se procesa después por dirección directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, conjugado de estreptavidina-Alexa 647, y se explora utilizando métodos de exploración convencionales. Las intensidades de la imagen de cada punto en la serie son proporcionales a la abundancia del miR correspondiente en la muestra del paciente.

El uso de la serie tiene varias ventajas para la detección de expresión de miARN. En primer lugar, la expresión global de varios cientos de genes puede identificarse en la misma muestra en un punto temporal. En segundo lugar, mediante el diseño cuidadoso de las sondas oligonucleotídicas, puede identificarse la expresión de moléculas tanto maduras como precursoras. En tercer lugar, en comparación con análisis de transferencia de Northern, la microplaca requiere una cantidad pequeña de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando 2,5 µg de ARN total. El número relativamente limitado de miARN (algunos cientos por especie) permite la construcción de una micromatriz común para varias especies, con sondas oligonucleotídicas distintas para cada una. Dicha herramienta permitiría el análisis de expresión entre especies para cada miR conocido en diversas condiciones.

Además del uso para los ensayos de nivel de expresión cuantitativa de miR específicos, una microplaca que contiene oligonucleótidos sonda específicos de miARN correspondientes a una parte sustancial del miRNoma, preferentemente el miRNoma completo, puede emplearse para llevar a cabo la determinación de perfiles de expresión génica de miR, para análisis de patrones de expresión de miR. Las identificaciones de miR distintas pueden asociarse con marcadores de enfermedad establecidos, o directamente con una patología.

De acuerdo con los métodos de realizaciones de perfiles de expresión descritos en la presente memoria, el ARN total de una muestra de un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer (por ejemplo, un cáncer de mama) se transcribe de forma inversa cuantitativamente para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana marcados complementarios del ARN en la muestra. Los oligodesoxinucleótidos diana se hibridan después con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra. El resultado es un perfil de hibridación para la muestra que representa el patrón de expresión de miARN en la muestra. El perfil de hibridación comprende la señal de la unión de los oligodesoxinucleótidos diana de la muestra con los oligonucleótidos sonda específicos de miARN en la micromatriz. El perfil puede registrarse como la presencia o ausencia de unión (señal frente a señal cero). Más preferentemente, el perfil registrado incluye la intensidad de la señal de cada hibridación. El perfil se compara con el perfil de hibridación generado de una muestra

de control normal, es decir, no cancerosa. Una alteración en la señal es indicativa de la presencia del cáncer en el sujeto.

Otras técnicas para medir la expresión génica de miR también están dentro de la experiencia de este campo, e incluyen diversas técnicas para medir las tasas de transcripción y degradación de ARN.

La presente divulgación también proporciona métodos para diagnosticar un cáncer de mama asociado con uno o más marcadores de pronóstico, que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de ensayo de cáncer de mama de un sujeto y comparar el nivel del al menos un producto génico de miR en la muestra de ensayo de cáncer de mama con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control. Una alteración (por ejemplo, un aumento, una reducción) en la señal de al menos un miARN en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama asociado con el o los marcadores de pronóstico.

El cáncer de mama puede asociarse con uno o más marcadores de pronóstico o características, incluyendo, un marcador asociado con un pronóstico adverso (es decir, negativo), o un marcador asociado con un pronóstico bueno (es decir, positivo). El cáncer de mama que se diagnostica usando los métodos descritos en el presente documento puede asociarse con una o más características de pronóstico adversas seleccionadas del grupo que consiste en expresión del receptor de estrógenos, expresión del receptor de progesterona, metástasis de ganglios linfáticos positivos, alto índice proliferativo, expresión de p53 detectable, estadio tumoral avanzado y alta invasión vascular. Se describen en el presente documento microARN particulares cuya expresión se altera en células de cáncer de mama asociadas con cada uno de estos marcadores de pronóstico (véase, por ejemplo, Ejemplo 3 y Figura 4). El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse por ARN de transcripción inversa a partir de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que las alteraciones en el nivel de uno o más productos génicos de miR en células pueden dar como resultado la desregulación de una o más dianas pretendidas para estos miR, lo que puede conducir a la formación de cáncer de mama. Por lo tanto, la alteración del nivel del producto génico de miR (por ejemplo, reduciendo el nivel de un miR que está regulado positivamente en células de cáncer de mama, aumentando el nivel de un miR que está regulado negativamente en células de cáncer) puede tratar exitosamente el cáncer de mama. Se describen en el presente documento ejemplos de dianas génicas potenciales para miARN que se desregulan en tejidos de cáncer de mama (véase, por ejemplo, Ejemplo 2 y Tabla 4).

En consecuencia, la presente divulgación abarca métodos para tratar el cáncer de mama en un sujeto, en el que al menos un producto génico de miR está desregulado (por ejemplo, regulado positivamente, regulado negativamente) en las células cancerosas del sujeto. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado negativamente en las células de cáncer de mama, el método comprende administrar una cantidad eficaz del al menos un producto génico de miR aislado, siempre que el gen miR no sea miR15 o miR16, de modo que la proliferación de células cancerosas en el sujeto se inhibe. Cuando el al menos un producto génico de miR aislado está regulado positivamente en las células cancerosas, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto para inhibir la expresión del al menos un gen miR, denominado en la presente memoria compuesto de inhibición de la expresión génica de miR, de modo que se inhiba la proliferación de células de cáncer de mama.

Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento", como se usan en la presente memoria, se refieren a aliviar síntomas asociados con una enfermedad o afección, por ejemplo, un cáncer de mama, incluyendo prevenir o retardar la aparición de los síntomas de la enfermedad, y/o reducir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad

o afección. Se define que los términos "sujeto" e "individuo" en la presente memoria incluyen animales, tales como mamíferos, incluyendo, pero sin limitación, primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, cobayas, ratas, ratones u otras especies bovinas, ovinas, equinas, caninas, felinas, roedoras o murinas. El animal puede ser un ser humano.

Como se usa en la presente memoria, una "cantidad eficaz" de un producto génico de miR aislado es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece cáncer de mama. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un producto génico de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y peso del sujeto; el alcance de la penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en la que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado basándose en el peso de una masa tumoral puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-500 microgramos/gramo de masa tumoral. La masa tumoral puede ser de al

menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral o al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.

Una cantidad eficaz de un producto génico de miR aislado también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o por vía entérica, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, una cantidad eficaz del producto génico de miR aislado que se administra a un sujeto puede variar de aproximadamente 53.000 microgramos/kilogramo de peso corporal, de aproximadamente 700-1000 microgramos/kg de peso corporal o más de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.

Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para la administración de un producto génico de miR aislado a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un producto génico de miR al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa, puede administrarse un producto génico de miR una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más particularmente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. En un régimen de dosificación particular, se administra un producto génico de miR una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del producto génico de miR administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de producto génico administrado durante el régimen de dosificación completo.

Como se usa en la presente memoria, un producto génico de miR "aislado" es uno que se sintetiza, o se altera o retira del estado natural mediante intervención humana. Por ejemplo, un producto génico de miR sintético, o un producto génico de miR parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural, se considera que está "aislado". Un producto génico de miR aislado puede existir en forma sustancialmente purificada,

o puede existir en una célula en la que se ha suministrado el producto génico de miR. Por lo tanto, un producto génico de miR que se suministra deliberadamente a, o se expresa en, una célula se considera un producto génico de miR "aislado". También se considera que un producto génico de miR producido dentro de una célula a partir de una molécula precursora de miR es una molécula "aislada".

Pueden obtenerse productos génicos de miR aislados usando varias técnicas convencionales. Por ejemplo, los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente o producirse recombinantemente usando métodos conocidos en este campo. Los productos génicos de miR pueden sintetizarse químicamente usando fosforamiditas ribonucleosídicas protegidas apropiadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis incluyen, por ejemplo, Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, Estados Unidos), Pierce Chemical (parte de Perbio Science, Rockford, IL, Estados Unidos), Glen Research (Sterling, VA, Estados Unidos), ChemGenes (Ashland, MA, Estados Unidos) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).

Como alternativa, los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de plásmidos de ADN circulares o lineales recombinantes usando cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar ARN a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los plásmidos recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para expresión de los productos génicos de miR en células cancerosas.

Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes pueden aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales. Los productos génicos de miR que se expresan a partir de plásmidos recombinantes también pueden suministrarse a, y expresarse directamente en, las células cancerosas. El uso de plásmidos recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.

Los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de un plásmido recombinante separado, o pueden expresarse a partir del mismo plásmido recombinante. Los productos génicos de miR pueden expresarse como moléculas precursoras de ARN a partir de un único plásmido, y las moléculas precursoras se procesan en el producto génico de miR funcional por un sistema de procesamiento adecuado, incluyendo, pero sin limitación, sistemas de procesamiento existentes dentro de una célula cancerosa. Otros sistemas de procesamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el sistema de lisado celular de Drosophila in vitro (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada en Estados Unidos N 2002/0086356 de Tuschl et al.) y el sistema de RNAsa III de E. coli (por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0014113 de Yang et al.).

La selección de plásmidos adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico en el plásmido para expresar los productos génicos, y métodos para suministrar el plásmido recombinante a las células de interés están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9: 1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison et al. (2002), Genes

Dev. 16: 948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; y Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508.

Un plásmido que expresa los productos génicos de miR comprende una secuencia que codifica un ARN precursor de miR bajo el control del promotor intermedio-temprano de CMV. Como se usa en la presente memoria, "bajo el control" de un promotor significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican el producto génico de miR se localizan 3’ del promotor, de modo que el promotor puede iniciar la transcripción de las secuencias codificantes del producto génico de miR.

Los productos génicos de miR también pueden expresarse a partir de vectores virales recombinantes. Se contempla que los productos génicos de miR pueden expresarse a partir de dos vectores virales recombinantes separados, o del mismo vector viral. El ARN expresado a partir de dos vectores virales recombinantes puede aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas por técnicas convencionales, o puede expresarse directamente en células cancerosas. El uso de vectores virales recombinantes para suministrar los productos génicos de miR a células cancerosas se analiza en más detalle posteriormente.

Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican los productos génicos de miR y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARN. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de pol III de ARN U6 o H1, o los promotores de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la experiencia de la técnica. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión de los productos génicos de miR en una célula cancerosa.

Puede usarse cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificantes para los productos génicos de miR; por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), Rhabdovirus, virus de leucemia murina); virus del herpes y similares. El tropismo de los vectores virales pueden modificarse por seudotipación de los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos superficiales de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de cápsida viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden seudotiparse con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV), rabia, Ébola, Mokola y similares. Pueden realizarse vectores de AAV para dirigirse a células diferentes modificando por ingeniería genética los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápsida. Por ejemplo, un vector de AAV que expresa una cápsida de serotipo 2 en un genoma de serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de cápsida de serotipo 2 en el vector de AAV 2/2 puede reemplazarse por un gen de cápsida de serotipo 5 para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápsida están dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz, J. E., et al. (2002), J. Virol. 76: 791-801.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar ARN en el vector, métodos para suministrar el vector viral a las células de interés y recuperación de los productos de ARN expresados están dentro de la experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Domburg (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1: 514; y Anderson (1998), Nature 392: 25-30.

Son vectores virales particularmente adecuados los derivados de AV y AAV. Se describen un vector de AV adecuado para expresar los productos génicos de miR, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para suministrar el vector a células diana, en Xia et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Se describen vectores de AAV adecuados para expresar los productos génicos de miR, métodos para construir el vector de AAV recombinante y métodos para suministrar los vectores a células diana en Samulski et al. (1987), J. Virol. 61: 30963101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente de Estados Unidos Nº 5.252.479; Patente de Estados Unidos Nº 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional Nº WO 93/24641. Los productos génicos de miR se pueden expresar a partir de un único vector de AAV recombinante que comprende el promotor intermedio temprano de CMV.

Un vector viral de AAV recombinante puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique un ARN precursor de miR en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT bajo el control de un promotor de ARN U6 humano. Como se usa en la presente memoria, "en conexión operativa con una secuencia de terminación poliT" significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas con sentido o antisentido están inmediatamente adyacentes a la señal de terminación poliT en la dirección 5’. Durante la transcripción de las secuencias de miR del vector, las señales de terminación poliT actúan para terminar la transcripción.

Como alternativa, puede administrarse al sujeto una cantidad eficaz de al menos un compuesto que inhibe la expresión de miR. Como se usa en la presente memoria, "inhibir la expresión de miR" significa que la producción de la forma madura, activa del producto génico de miR después del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si se ha inhibido la expresión de miR en una célula cancerosa, usando, por ejemplo, las técnicas para determinar el nivel de transcrito de miR analizadas anteriormente para el método de diagnóstico. La inhibición puede producirse al nivel de la expresión génica (es

decir, inhibiendo la transcripción de un gen de miR que codifica el producto génico de miR) o el nivel de procesamiento (por ejemplo, inhibiendo el procesamiento de un precursor de miR en un miR activo, maduro).

Como se usa en la presente memoria, una "cantidad eficaz" de un compuesto que inhibe la expresión de miR es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece un cáncer asociado con una característica cromosómica asociada con cáncer. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de un compuesto de inhibición de la expresión de miR para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el alcance de la penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto de inhibición de la expresión puede basarse en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. El peso aproximado de una masa tumoral puede determinarse calculando el volumen aproximado de la masa, en el que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Una cantidad eficaz basada en el peso de una masa tumoral puede estar entre aproximadamente 10 y 500 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 10 microgramos/gramo de masa tumoral, al menos aproximadamente 60 microgramos/gramo de masa tumoral y al menos aproximadamente 100 microgramos/gramo de masa tumoral.

Una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la expresión de miR también puede basarse en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o por vía entérica, entre otras, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz del compuesto inhibidor de la expresión administrado a un sujeto puede variar de aproximadamente 5 a 3000 microgramos/kg de peso corporal, de aproximadamente 700 a 1000 microgramos/kg de peso corporal o puede ser mayor de aproximadamente 1000 microgramos/kg de peso corporal.

Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para administrar un compuesto que inhibe la expresión de miR a un sujeto dado. Por ejemplo, puede administrarse un compuesto inhibidor de la expresión al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa, puede administrarse un compuesto inhibidor de la expresión una vez o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más preferentemente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. En un régimen de dosificación particular, se administra un compuesto inhibidor de la expresión una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de la expresión administrado al sujeto puede comprender la cantidad total de compuesto administrado sobre el régimen de dosificación completo.

Los compuestos adecuados para inhibir la expresión génica de miR incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia corto o pequeño o "ARNip"), ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ARN enzimático, tales como ribozimas. Cada uno de estos compuestos puede dirigirse a un producto génico de miR dado y destruir o inducir la destrucción del producto génico de miR diana.

Por ejemplo, la expresión de un gen de miR dado puede inhibirse induciendo la interferencia de ARN del gen de miR con una molécula de ARN bicatenario ("ARNbc") aislada que tiene al menos 90 %, por ejemplo al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de homología de secuencia con al menos una parte del producto génico de miR. La molécula de ARNbc puede ser un "ARN de interferencia corto o pequeño" o "ARNip".

El ARNip útil en los presentes métodos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una cadena de ARN con sentido y una cadena de ARN antisentido complementaria, hibridadas entre sí por interacción de formación de pares de bases de Watson-Crick convencionales (en lo sucesivo en la presente memoria "con formación de pares de bases"). La cadena con sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del producto génico de miR diana.

Como se usa en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico en un ARNip que es "sustancialmente idéntico" a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las cadenas con sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias, complementarias, o pueden comprender una única molécula en la que dos partes complementarias forman pares de bases y están ligadas covalentemente por un área de "horquilla" monocatenaria.

El ARNip también puede ser ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo o los extremos del ARNip o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen al ARNip resistente a la digestión por nucleasa, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con desoxirribonucleótidos.

Una o ambas cadenas del ARNip también puede comprender un saliente 3’. Como se usa en la presente memoria, un "saliente 3’" se refiere a al menos un nucleótido no emparejado que se extiende desde el extremo 3’ de una cadena de ARN bicatenaria. Por lo tanto, el ARNip puede comprender al menos un saliente 3’ de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. El saliente 3’ está presente en ambas cadenas del ARNip, y es de 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

El ARNip puede producirse de forma química o biológica, o puede expresarse a partir de un plásmido recombinante

o vector viral, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2002/0173478 de Gewirtz y en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos Nº 2004/0018176 de Reich et al.

La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico antisentido. Como se usa en la presente memoria, un "ácido nucleico antisentido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se une a ARN diana por medio de interacciones de ARN-ARN, ARN-ADN o ARN-ácido peptidonucleico, que alteran la actividad del ARN diana. Son ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en los presentes métodos ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras de ARN-ADN, PNA) que generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. El ácido nucleico antisentido puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Se proporcionan secuencias de ácido nucleico para los productos génicos de miR en la Tabla 1. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que los ácidos nucleicos antisentido activan RNasa H u otra nucleasa celular que digiere la doble cadena de producto génico de miR/ácido nucleico antisentido.

Los ácidos nucleicos antisentido también pueden contener modificaciones de la cadena principal de ácido nucleico o de los restos de azúcar y base (o su equivalente) para potenciar la especificidad diana, resistencia a nucleasa, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molécula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercaladores bicatenarios, tales como acridina, o uno o más grupos resistentes a nucleasa.

Pueden producirse ácidos nucleicos antisentido de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Están dentro de la experiencia de la técnica métodos ejemplares para producir y ensayar; véase, por ejemplo, Stein y Cheng (1993), Science 261: 1004 y Patente de Estados Unidos Nº 5.849.902 de Woolf et al.

La expresión de un gen de miR dado también puede inhibirse por un ácido nucleico enzimático. Como se usa en la presente memoria, un "ácido nucleico enzimático" se refiere a un ácido nucleico que comprende una región de unión a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia de ácido nucleico contigua de un producto génico de miR, y que es capaz de escindir específicamente el producto génico de miR. La región de unión al sustrato de ácido nucleico enzimático puede ser, por ejemplo, 50-100 % complementaria, 75-100 % complementaria o 95-100 % complementaria de una secuencia de ácido nucleico contigua en un producto génico de miR. Los ácidos nucleicos enzimáticos también pueden comprender modificaciones en los grupos de base, azúcar y/o fosfato. Un ácido nucleico enzimático ejemplar para su uso en los presentes métodos es una ribozima.

Los ácidos nucleicos enzimáticos pueden producirse de forma química o biológica, o pueden expresarse a partir de un plásmido o vector viral recombinante, como se ha descrito anteriormente para los productos génicos de miR aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o ARNip en Werner y Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23: 2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9: 25-31; y Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071 de Cech et al.

La administración de al menos un producto génico de miR, o al menos un compuesto para inhibir la expresión de miR, inhibirá la proliferación de células cancerosas en un sujeto que tiene un cáncer asociado con una característica cromosómica asociada con cáncer. Como se usa en la presente memoria, "inhibir la proliferación de una célula cancerosa" significa destruir la célula, o detener permanente o temporalmente o ralentizar el crecimiento de la célula. La inhibición de la proliferación de células cancerosas puede inferirse si el número de dichas células en el sujeto permanece constante o se reduce después de la administración de los productos génicos de miR o los compuestos inhibidores de la expresión del gen de miR. Una inhibición de la proliferación de células cancerosas puede también inferirse si el número absoluto de dichas células aumenta, pero la tasa de crecimiento tumoral disminuye.

El número de células cancerosas en el cuerpo de un sujeto puede determinarse por medición directa, o mediante estimación del tamaño de las masas tumorales primaras o metastásicas. Por ejemplo, el número de células cancerosas en un sujeto puede medirse por métodos inmunohistológicos, citometría de flujo, u otras técnicas diseñadas para detectar marcadores de superficie característicos de células cancerosas.

El tamaño de una masa tumoral puede determinarse por observación visual directa, o por métodos de formación de imágenes de diagnóstico, tales como rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética, ultrasonidos y escintigrafía. Pueden emplearse métodos de formación de imágenes de diagnóstico usados para determinar el tamaño de la masa tumoral con o sin agentes de contraste, como se conoce en la técnica. El tamaño de una masa tumoral también puede determinare por medios físicos, tales como palpación de la masa tisular o medición de la masa tisular con un instrumento de medición, tal como un calibrador.

Los productos génicos de miR o compuestos inhibidores de la expresión génica de miR pueden administrarse a un sujeto por cualquier medio adecuado para suministrar estos compuestos a células cancerosas del sujeto. Por ejemplo, los productos génicos de miR o compuestos inhibidores de la expresión de miR pueden administrarse por métodos adecuados para transfectar células del sujeto con estos compuestos, o con ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican estos compuestos. Las células pueden transfectarse con un vector plasmídico

o viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto génico de miR o compuesto inhibidor de la expresión génica de miR.

Se conocen bien en la técnica métodos de transfección para células eucariotas e incluyen, por ejemplo, inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia de liposomas o transferencia mediada por materiales lipófilos; suministro de ácidos nucleicos mediado por receptor, biobalística o aceleración de partículas; precipitación con fosfato cálcico y transfección mediada por vectores virales.

Por ejemplo, las células pueden transfectarse con un compuesto de transferencia liposómico, por ejemplo, DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio metilsulfato, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTINA. La cantidad de ácido nucleico usada no es crítica; pueden conseguirse resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de ácido nucleico/105 células. Por ejemplo, puede usarse una relación de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmídico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105 células.

También puede administrarse un producto génico de miR o compuesto inhibidor de la expresión génica de miR a un sujeto por cualquier vía de administración entérica o parenteral adecuada. Las vías de administración entéricas adecuadas para los presentes métodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vías de administración parenterales adecuadas incluyen, por ejemplo, administración intravascular (por ejemplo, inyección de embolada intravenosa, infusión intravenosa, inyección de embolada intraarterial, infusión intraarterial e instilación por catéter en la vasculatura); inyección peri e intratisular (por ejemplo, inyección peritumoral e intratumoral, inyección intrarretinal o inyección subretinal); inyección o deposición subcutánea, incluyendo infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas); aplicación directa al tejido de interés, por ejemplo por un catéter y otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un gránulo retinal o un supositorio o un implante que comprenda un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalación. Son vías de administración particularmente adecuadas inyección, infusión e inyección directa en el tumor.

En los presentes métodos, puede administrarse un producto génico de miR o compuesto inhibidor de la expresión de producto génico de miR al sujeto como ARN desnudo, en combinación con un reactivo de suministro, o como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido recombinante o vector viral) que comprende secuencias que expresan el producto génico de miR o compuesto inhibidor de la expresión. Los reactivos de suministro adecuados incluyen, por ejemplo, el reactivo lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina) y liposomas.

Se analizan en la presente memoria plásmidos recombinantes y vectores virales que comprenden secuencias que expresan los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR, y técnicas para suministrar dichos plásmidos y vectores a células cancerosas.

Se pueden usar liposomas para suministrar un producto génico de miR o compuestos inhibidores de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a un sujeto. Los liposomas también pueden aumentar la semivida en sangre de los productos génicos o ácidos nucleicos. Pueden formarse liposomas adecuados a partir de lípidos formadores de vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos generalmente se guía por la consideración de factores, tales como el tamaño de liposoma deseado y la semivida de los liposomas en el torrente sanguíneo. Se conocen diversos métodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; y Patentes de Estados Unidos Nº 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.

Los liposomas para su uso en los presentes métodos pueden comprender una molécula ligando que dirige el liposoma a células cancerosas. Se prefieren ligandos que se unan a receptores prevalentes en células cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos celulares tumorales.

Los liposomas para su uso en los presentes métodos también pueden modificarse para evitar la eliminación por el sistema de macrófagos mononucleares ("MMS") y el sistema reticuloendotelial ("RES"). Dichos liposomas modificados tienen restos de inhibición de la opsonización en la superficie o incorporados en la estructura del

liposoma. Un liposoma puede comprender tanto restos de inhibición de la opsonización como un ligando.

Los restos inhibidores de la opsonización para su uso en la preparación de los liposomas son normalmente polímeros hidrófilos grandes que se unen a la membrana del liposoma. Como se usa en la presente memoria, un resto inhibidor de opsonización está "unido" a una membrana del liposoma cuando está química o físicamente unido a la membrana, por ejemplo, por la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la membrana en sí misma, o por unión directamente con grupos activos de lípidos de membrana. Estos polímeros hidrófilos inhibidores de opsonización forman una capa superficial protectora que reduce significativamente la captación de los liposomas por el MMS y RES; por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.920.016.

Los restos inhibidores de opsonización adecuados para modificar liposomas son preferentemente polímeros solubles en agua con un peso molecular medio en número de aproximadamente 500 a aproximadamente 40.000 Dalton, y más preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 Dalton. Dichos polímeros incluyen derivados de polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG y estearato de PEG o PPG; polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas

o dendriméricas; ácidos poliacrílicos; polialcoholes, por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol a los que se unen químicamente grupos carboxílicos o amino, así como gangliósidos, tales como gangliósido GM1. También son adecuados copolímeros de PEG, metoxi PEG o metoxi PPG o derivados de los mismos. Además, el polímero inhibidor de opsonización puede ser un copolímero en bloque de PEG y un poliamino ácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleótido. Los polímeros inhibidores de opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílicos, por ejemplo, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina; polisacáridos u oligosacáridos aminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxilados, por ejemplo, que han reaccionado con derivados de ácidos carbónicos con enlace resultante de grupos carboxílicos. Preferentemente, el resto de inhibición de la opsonización es un PEG, PPG o derivados de los mismos. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG se denominan en ocasiones "liposomas PEGilados".

El resto inhibidor de la opsonización puede estar unido a la membrana del liposoma por una cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimida de PEG puede estar unido a un anclaje soluble en lípidos de fosfatidiletanolamina, y después unido a una membrana. De forma similar, un polímero de dextrano puede derivatizarse con un anclaje soluble en lípidos de estearilamina mediante aminación reductora usando Na(CN)BH3 y una mezcla de disolvente, tal como tetrahidrofurano y agua en una relación 30:12 a 60 ºC.

Los liposomas modificados con restos inhibidores de opsonización permanecen en la circulación durante mucho más tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razón, dichos liposomas se denominan en ocasiones liposomas "sigilosos". Se sabe que los liposomas sigilosos se acumulan en tejidos alimentados por microvasculatura porosa o "filtrante". Por lo tanto, el tejido caracterizado por dichos defectos de microvasculatura, por ejemplo, tumores sólidos, acumularán eficazmente estos liposomas; véase Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18: 6949-53. Además, la captación reducida por el RES reduce la toxicidad de los liposomas sigilosos evitando la acumulación significativa de los liposomas en el hígado y el bazo. Por lo tanto, los liposomas que se modifican con restos inhibidores de la opsonización son particularmente adecuados para suministrar los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a células tumorales.

Los productos génicos de miR o compuestos de inhibición de la expresión génica de miR pueden formularse como composiciones farmacéuticas, denominadas en ocasiones "medicamentos", antes de administrarlos a un sujeto, de acuerdo con técnicas conocidas en este campo. En consecuencia, también se desvelan composiciones farmacéuticas para tratar un cáncer de mama. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR aislado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El al menos un producto génico de miR puede corresponder a un producto génico de miR que tiene un nivel reducido de expresión en células de cáncer de mama en relación con células de control adecuadas, El producto génico de miR aislado puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-145, miR-10b, miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR-204, let-7a-2, let-7a-3, let-7d (let-7d-v1), let-7f-2, miR-101-1, miR-143 y combinaciones de los mismos.

Como alternativa, las composiciones farmacéuticas comprenden al menos un compuesto de inhibición de la expresión de miR. El al menos un compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede ser específico para un gen de miR cuya expresión es mayor en células de cáncer de mama que en células de control. El compuesto de inhibición de la expresión génica de miR puede ser específico para uno o más productos génicos de miR seleccionados del grupo que consiste en miR-21, miR-155, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR29b), miR-213, let-7i (let-7d-v2), miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-203, miR-206, miR-210, miR-213 y combinaciones de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas pueden caracterizarse como al menos estériles y sin pirógenos. Como se usa en la presente memoria, las "formulaciones farmacéuticas" incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas están dentro de la experiencia de la técnica, por ejemplo como se describe en Remington’s Pharmaceutical Science, 17ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).

Las presentes formulaciones farmacéuticas comprenden al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) (por ejemplo, de 0,1 a 90 % en peso), o una sal fisiológicamente aceptable de los mismos, mezclados con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticas también pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican), que están encapsulados por liposomas y un vehículos farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un gen o producto génico de miR que no es miR-15, miR-16, miR-143 y/o miR-145.

Son vehículos farmacéuticamente aceptables especialmente adecuados agua, agua tamponada, solución salina normal, solución salina 0,4 %, glicina 0,3 %, ácido hialurónico y similares.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) que es resistente a la degradación por nucleasas. Un experto en la materia puede sintetizar fácilmente ácidos nucleicos que son resistentes a nucleasa, por ejemplo, incorporando uno o más ribonucleótidos que se modifican en la posición 2’ en los productos génicos de miR. Los ribonucleótidos modificados 2’ adecuados incluyen los modificados en la posición 2’ con fluoro, amino, alquilo, alcoxi y O-alilo.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de ajuste de la osmolalidad, tampones y agentes de ajuste de pH. Los aditivos adecuados incluyen, por ejemplo, tampones fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, clorhidrato de trometamina), adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelado de calcio (tales como, por ejemplo, DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida) u, opcionalmente, adiciones de sales de calcio o sodio (por ejemplo cloruro cálcico, ascorbato cálcico, gluconato cálcico o lactato cálcico). Las composiciones farmacéuticas pueden envasarse para su uso en forma líquida, o pueden liofilizarse.

Para composiciones farmacéuticas sólidas, pueden usarse vehículos farmacéuticamente aceptables sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para administración oral puede comprender cualquiera de los vehículos y excipientes enumerados anteriormente y 10-95 %, preferentemente 25 %-75 %, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican). Una composición farmacéutica para administración por aerosol (de inhalación) puede comprender 0,01-20 % en peso, preferentemente 1 %-10 % en peso, del al menos un producto génico de miR o compuesto de inhibición de la expresión génica de miR (o al menos un ácido nucleico que comprende secuencias que los codifican) encapsulado en un liposoma como se ha descrito anteriormente, y un propulsor. También puede incluirse un vehículo según se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.

La presente divulgación también abarca métodos para identificar un agente anti cáncer de mama, que comprenden proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR en la célula. El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión reducidos en células de cáncer de mama. Un aumento del nivel del producto génico de miR de la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativo de que el agente de ensayo es un agente anti cáncer de mama. Al menos un producto génico de miR asociado con los niveles de expresión reducidos en células de cáncer de mama puede seleccionarse del grupo que consiste en miR145, miR-10b, miR-123 (miR-126), miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR-204, let-7a-2, let7a-3, let-7d (let-7d-v1), let-7f-2, miR-101-1, miR-143 y combinaciones de los mismos.

El método puede comprender proporcionar un agente de ensayo a una célula y medir el nivel de al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células de cáncer de mama. Una reducción del nivel del producto génico de miR en la célula, en relación con una célula de control adecuada, es indicativa de que el agente de ensayo es un agente anti cáncer de mama. Al menos un producto génico de miR asociado con niveles de expresión aumentados en células de cáncer de mama puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-21, miR-155, miR-009-1 (miR131-1), miR-34 (miR-170), miR-102 (miR-29b), miR-213, let-7i (let-7dv2), miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-203, miR-206, miR210, miR-213 y combinaciones de los mismos.

Los agentes adecuados incluyen, pero sin limitación fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos) y macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos). El agente puede producirse de forma recombinante, sintética o puede aislarse (es decir purificarse) de una fuente natural. Se conocen bien en la técnica diversos métodos para proporcionar dichos agentes a una célula (por ejemplo, transfección), y varios de dichos métodos se han descrito anteriormente en la presente memoria. También se conocen bien en la técnica métodos para detectar la expresión de al menos un producto génico de miR (por ejemplo, transferencia de Northern,

hibridación in situ, RT-PCR, perfiles de expresión). Varios de estos métodos también se han descrito anteriormente en la presente memoria.

La presente divulgación se ilustrará ahora por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Identificación de un distintivo de expresión de microARN que diferencia tejidos de cáncer de mama de tejidos normales.

Materiales y métodos

Muestras y líneas celulares de cáncer de mama. Se obtuvo ARN de tumores primarios de 76 muestras recogidas en la Universidad de Ferrara (Italia), Istituto Nazionale dei Tumori, Milán (Italia) y Universidad Thomas Jefferson (Filadelfia, PA). Había información clínico patológica disponible para 58 muestras tumorales. El ARN de muestras normales consistió en 6 grupos de ARN de 5 tejidos de mama normales cada uno, así como ARN de 4 tejidos de mama individuales adicionales. También se obtuvieron ARN de cáncer de mama de las siguientes líneas celulares: Hs578-T, MCF7, T47D, BT20, SK-BR-3, HBL100, HCC2218, MDA-MB-175, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB435, MDA-MB-436, MDA-MB-453 y MDAMB-468.

Micromatrices de miARN. Se realizó aislamiento de ARN total con Reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó marcaje de ARN e hibridación en microplacas de micromatrices de microARN como se ha descrito previamente (Liu, C.-G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101: 9740-9744 (2004)). Brevemente, se marcaron 5 µg de ARN de cada muestra con biotina durante la transcripción inversa usando exámenes aleatorios. Se llevó a cabo hibridación en una microplaca de micromatrices de miARN (KCI versión 1.0) (Liu, C.-G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101: 9740-9744 (2004)), que contiene 368 sondas, incluyendo 245 genes de miARN humanos y de ratón, por triplicado. Se detectaron señales de hibridación mediante unión de biotina con un conjugado de Estreptavidina-Alexa647 usando un Perkin-Elmer ScanArray XL5K. Las imágenes exploradas se cuantificaron por el software Quantarray (Perkin Elmer).

Análisis estadístico y bioinformático de datos de micromatriz. Se normalizaron datos sin procesar y se analizaron usando el software GeneSpring®, versión 7.2 (SiliconGenetics, Redwood City, CA). Los datos de expresión se centraron en la mediana. Se realizaron comparaciones estadísticas por ANOVA (Análisis de Varianza) usando la corrección de Benjamini y Hochberg para reducción de falsos positivos. Se determinaron miARN de pronóstico para predicción de clase normal o tumoral usando tanto el software PAM (Análisis de Predicción de Micromatrices disponibles en http://www.stat.staiiford.edu/-tibs/PAM/index.htnil) (Tibshirani, R., et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.

99: 6567-6572 (2002)) y el software de Máquina de Vector de Apoyo (Furey, T.S., et al. Bioinformatics 16: 906914(2000)). Ambos algoritmos se usaron para validación cruzada y predicción de conjunto de ensayo. Todos los datos se enviaron usando MIAMExpress a la base de datos Array Express (los números de referencia se recibirán tras la revisión).

Transferencia de Northern. Se realizó análisis de transferencia de Northern como se ha descrito previamente (Calin,

G. A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-29(2002)). Se sometieron a electroforesis muestras de ARN (10 µg cada una) en acrilamida al 15 %, geles premoldeados Criterion de urea 7 M (Bio-Rad) y se transfirieron a membrana Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech). La hibridación se realizó a 37 ºC en dodecilsulfato sódico al 7 % (SDS)/Na2PO4 0,2 M (pH 7,0) durante 16 horas. Las membranas se lavaron dos veces a 42 ºC con fosfato salino convencional 2x (NaCl 0,18 M/fosfato 10 mM, pH 7,4), complementado con EDTA 1 mM (SSPE) y SDS 0,1 %, y dos veces con SSPE 0,5X/SDS 0,1 %. Las sondas oligonucleotídicas eran complementarias a la secuencia del microARN maduro correspondiente (véase Registro de miR en http://www.sanger.ac.uk/Soft-ware/Rfam/mirna/): miR-21 5’-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A-3’(SEC ID Nº: 287); miR-125b1: 5’-TCA CAA GTT AGG GTC TCA. GGG A -3’ (SEC ID Nº: 288); miR-145: 5’-AAG GGA TTC CTG GGA AAA CTG GAC -3’ (SEC ID Nº: 289). Se usó un oligonucleótido que era complementario del ARN U6 (5’-GCA GGG GCC ATG CTA ATC TTC TCT GTA TCG -3’ (SEC ID Nº: 290)) para normalizar los niveles de expresión. Se marcaron en los extremos 200 ng de cada sonda con 100 mCi de [gamma-32P]-ATP usando una polinucleótido quinasa (Roche). Las Transferencias de Northern se separaron en una solución de SDS al 0,1 % hirviendo durante 10 minutos antes de la rehibridación.

Resultados

Se usó una micromatriz de microARN (Liu, C.-G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101: 9740-9744 (2004)) para generar perfiles de expresión de microARN para 10 tejidos de mama normales y 76 neoplásicos. Cada muestra tumoral derivó de una única muestra de ensayo, mientras que 6 de las 10 muestras normales consistían en grupos de ARN preparados a partir de cinco tejidos de mama normales diferentes. Por lo tanto, se examinaron de hecho en el estudio 34 muestras de mama normales.

Para identificar miARN que se expresaban diferencialmente entre muestras normales y tumorales y, por lo tanto, pueden usarse para distinguir tejidos de mama normales de cancerosos, se utilizaron análisis de varianza y herramientas estadísticas de predicción de clase. Los resultados del análisis de ANOVA sobre datos normalizados generaron un perfil de miARN expresados diferencialmente (p<0,05) entre tejidos de mama normales y cancerosos

(Tabla 2). El análisis de grupos, basados en miARN expresados diferencialmente, generó un árbol que tiene una clara distinción entre tejidos normales y cancerosos (FIGURA 1A).

Para identificar con precisión un conjunto de miARN predictivos capaces de diferenciar tejidos normales de cáncer

5 de mama, se usó Máquina de Vector de Apoyo (GeneSpring software) y PAM (Análisis de Micromatrices de Predicción) (http://www-stat.stanford.edu/—tibs/). Los resultados de los análisis de predicción de dos clases se solaparon en gran medida (Tabla 3 y FIGURA 1B). Entre los miARN enumerados en la Tabla 3, 11 de 15 tienen un p valor de ANOVA menor de 0,05. Para confirmar los resultados obtenidos por análisis de micromatrices, se realizó análisis de transferencia de Northern para evaluar los niveles de expresión para un subconjunto de microARN,

10 concretamente, mir-125b, mir-145 y mir-21, que se expresaron diferencialmente en tejidos de mama normales y cancerosos. El análisis de Transferencia de Northern confirmó resultados obtenidos por análisis de micromatrices. En muchos casos, las diferencias de expresión parecían más fuertes que las anticipadas por los estudios de micromatrices (FIGURA 1C).

15 Tabla 2. miARN expresados diferencialmente entre tejidos de carcinoma de mama y de mama normal.

P-valor

Cáncer de Mama Mediana Normalizada Intervalo Mín Máx Mama Normal Mediana Normalizada Intervalo Mín Máx

let-7a-2

1,94E-02 1,67 0,96 -6,21 2,30 1,34 -5,00

let-7a-3

4,19E-02 1,26 0,81 -3,79 1,58 1,02 -2,91

let-7d(=7d-v1)

4,61E-03 0,90 0,59 -1,54 1,01 0,83 -1,25

let-7f-2

6,57E-03 0,84 0,51 -1,59 0,92 0,76 -1,03

let-7i (= let-7d-v2)

3,38E-02 2,05 1,02 -7,49 1,53 1,01 -3,47

mir-DD9-1 (mir-131-1)

9,12E-03 1,36 0,69 -4,16 1,01 0,61 -2,44

mir-D1Db

4,49E-02 1,11 0,69 -4,79 1,70 0,96 -6,32

mir-D21

4,67E-03 1,67 0,66 -26,43 1,08 0,60 -2,31

mir-034 (mir-170)

1,05E-02 1,57 0,70 -6,40 1,09 0,65 -3,17

mir-1D1-1

4,15E-03 0,63 0,52 -1,26 0,90 0,77 -1,05

mir-122a

3,43E-03 2,21 0,93 -8,08 1,48 1,06 -3,67

mir-125a

3,28E-03 1,20 0,69 -2,36 1,73 1,21 -3,34

mir-125b-1

2,65E-02 1,30 0,55 -8,65 2,37 1,45 -18,38

mir-125b-2

2,33E-02 1,26 0,69 -6,29 2,63 1,40 -16,73

mir-126b

1,60E-02 1,12 0,68 -7,34 1,02 0,69 -1,27

mir-136

2,42E-03 1,32 0,74 -10,26 1,05 0,78 -1,47

mir-143

7,11E-03 0,87 0,68 -1,33 8,96 0,81 -1,17

mir-145

4,02E-03 1,52 0,92 -8,46 3,61 1,65 -14,45

mir-149

2,75E-02 1,11 0,53 -1,73 1,03 0,83 -1,22

mir-155(SIC)

1,24E-03 1,75 0,95 -11,45 1,37 1,11 -1,83

mir-191

4,26E-02 5,17 1,03 -37,91 3,12 1,45 -14,59

mir-196-1

1,07E-02 1,20 0,57 -3,95 0,95 0,66 -1,75

mir-196-2

1,16E-03 1,46 0,57 -5,55 1,04 0,79 -1,80

mir-2D2

125E-02 1,05 0,71 -2,03 0,99 0,65 -1,20

mir-203

4,06E-07 1,12 0,50 -5,69 0,86 0,71 -1,04

mir-204

2,15E-03 0,78 0,46 -1,64 0,89 0,72 -1,03

mir-206

1,42E-02 2,55 1,22 -6,42 1,95 1,34 -3,22

mir-210

6,40E-13 1,60 0,98 -12,13 1,12 0,97 -1,29

mir-213

1,08E-02 3,72 1,42 -40,53 2,47 1,35 -5,91

Tabla 3. MicroARN predictivos de clase de tejidos de mama normales y tumorales a – Análisis de varianza (ensayo de t de Welch en paquete de software Genespring) como se calcula en la Tabla 2.

Nombre del

Mediana de la Probabilidad Fuerza de Puntuación de PAMc Mapa

miARN

expresión de ANOVAa predicción de cromosómico

SVMb

Cáncer

Normal Cáncer Normal

mir-009-1

1,36 1,01 0,0091 8,05 0,011 -0,102 1q22

mir-010b

1,11 1,70 0,0449 8,70 -0,032 0,299 2q31

mir-021

1,67 1,08 0,0047 10,20 0,025 -0,235 17q23.2

mir-034

1,67 1,09 0,0106 8,05 0,011 -0,106 1p36.22

mir-102 (mir

1,36 1,14 > 0,10 8,92 0,000 -0,004 1q32.2-32.3

29b)

mir-123 (mir

0,92 1,13 0,0940 9,13 -0,015 0,138 9q34

126)

mir-125a

1,20 1,73 0,0033 8,99 -0,040 0,381 19q13.4

mir-125b-1

1,30 2,87 0,0265 14,78 -0,096 0,915 11q24.1

mir-125b-2

1,26 2,63 0,0233 17,62 -0,106 1,006 21q11.2

mir-140-as

0,93 1,10 0,0695 11,01 -0,005 0,050 16q22.1

mir-145

1,52 3,61 0,0040 12,93 -0,158 1,502 5q32-33

mir-155(BIC)

1,75 1,37 0,0012 10,92 0,003 -0,030 21q21

mir-194

0,96 1,09 > 0,10 11,12 -0,025 0,234 1q41

mir-204

0,78 0,89 0,0022 8,10 -0,015 0,144 9q21.1

mir-213

3,72 2,47 0,0108 8,44 0,023 -0,220 1q31.3-q32.1

b – Herramienta de Análisis de Predicción de Máquina de Vector de apoyo (del paquete de software Genespring 7.2). Las fuerzas de predicción se calculan como el logaritmo natural negativo de la probabilidad de predecir el número de muestras observado, en una de las dos clases, al azar. Cuanto mayor sea la puntuación, mejor es la fuerza de predicción. c – Puntuaciones centroides para las dos clases del Análisis de Predicción de Mictromatrices (Tibshirani, R., et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99: 6567-6572 (2002)).

De los 29 miARN cuya expresión está significativamente desregulada (p<0,05) de acuerdo con el análisis de micromatrices, un conjunto de 15 miARN fueron capaces de predecir correctamente la naturaleza de la muestra analizada (es decir, normal frente a tumoral) con un 100 % de precisión. Entre los miARN expresados diferencialmente, miR-10b, miR-125b, miR145, miR-21 y miR-155 fueron los miARN más uniformemente desregulados en muestras de cáncer de mama. Tres de estos, concretamente, miR-10b, miR-125b y miR-145, estaban regulados negativamente, mientras que los dos restantes, miR-21 y miR-155, estaban regulados positivamente, lo que sugiere que podrían actuar como genes supresores de tumores u oncogenes, respectivamente.

Ejemplo 2: Determinación de dianas génicas potenciales de miARN que están desregulados en tejidos de cáncer de mama.

En la actualidad, la falta de conocimiento acerca de dianas génicas de miARN auténticas dificulta un entendimiento completo de qué funciones biológicas están desreguladas en cánceres caracterizados por expresión de miARN aberrante. Para identificar dianas potenciales de los miARN más significativamente desregulados del estudio de los inventores: miR-10b, miR125b, miR-145, miR-21 y miR-155 (véase Ejemplo 1), se utilizaron múltiples enfoques computacionales. En particular, el análisis se realizó usando tres algoritmos, miRanda, TargetScan y PicTar, que se usan habitualmente para predecir dianas génicas de miARN humano (Enright, A. J., et al. Genome Biol. 5: R1 (2003); Lewis, B. P. et al., Cell 115: 787-798 (2003); Krek, A., et al., Nat. Genet. 37: 495-500 (2005)). Los resultados obtenidos usando cada uno de los tres algoritmos se cruzan entre sí para validar las dianas potenciales y solamente se tuvieron en cuenta dianas que se identificaron en al menos 2 de los 3 algoritmos. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 4.

Varios genes con funciones oncogénicas potenciales se han identificado como dianas potenciales de miARN que están regulados negativamente en muestras de cáncer de mama. Notablemente, se han identificado oncogenes como dianas de miR-10b (por ejemplo, FLT1, el homólogo de v-crk, el factor de crecimiento BDNF y el factor de transducción SHC1), miR-125b (por ejemplo, YES, ETS1, TEL, AKT3, el receptor del factor de crecimiento FGFR2 y miembros de la ruta de transducción de señal activada por mitógeno VTS58635, MAP3K10, MAP3K11, MAPK14), y miR-145 (por ejemplo, MYCN, FOS, YES y FLI1, sitio de integración del virus de leucemia de Friend, promotores del ciclo celular, tales como ciclinas D2 y L1, proteínas de transducción de MAPK, tales como MAP3K3 y MAP4K4). El protooncogén, YES, y el factor de transcripción de unión a núcleo, CBFB, se determinaron como dianas potenciales tanto de miR-125 como de miR-145.

Coherentemente con estos hallazgos, se han identificado múltiples genes supresores de tumores como dianas de miR-21 y miR-155, miARN que están regulados positivamente en células de cáncer de mama. Para miR-21, el gen TGFB se predijo como diana por los tres métodos. Para miR-155, las dianas potenciales incluyeron los genes supresores de tumores, SOCS1 y APC, y la quinasa, WEE1, que bloquea la actividad de Cdc2 y evita la entrada en mitosis. El factor inducible por hipoxia, HIF1A, también fue una diana predicha de miR-155. Notablemente, la proteína que contenía motivo tripartito TRIM2, el protooncogén, SKI, y los homólogos de RAS, RAB6A y RAB6C, se hallaron como dianas potenciales tanto de miR-21 como de miR-155.

Ejemplo 3: características biopatológicas y expresión de microARN

Materiales y métodos

Análisis inmunohistoquímico de muestras de cáncer de mama

Se han realizado procedimientos de tinción como se ha descrito (Querzoli, P., et al., Anal. Quant. Cytol. Histol. 21: 151-160 (1999)). Se han evaluado receptores hormonales con anticuerpo 6F11 para receptor de estrógenos α (RE) y anticuerpo PGR-1A6 para receptor de progesterona (RP) (Ventana, Tucson, AZ, Estados Unidos). El índice de proliferación se evaluó con anticuerpo MIB1 (DAKO, Copenhague). Se detectó ERBB2 con anticuerpo CB11 (Ventana, Tucson, AZ, Estados Unidos), y la expresión de la proteína p53 se examinó con anticuerpo DO7 (Ventana, Tucson, AZ, Estados Unidos). Solamente las células tumorales con inmunotinción nuclear definida para RE, RP, Mib1 y p53 se registraron como positivas. Las células tumorales se consideraron positivas para ERBB2 cuando mostraron inmunorreactividad de membrana definida.

Para realizar un análisis cuantitativo de la expresión de estos diversos marcadores biológicos, se usó el sistema de análisis de imágenes computarizado Eureka Menarini. Para cada sección tumoral, se midieron al menos 20 campos microscópicos de carcinoma invasivo usando un objetivo 40x. Se emplearon los siguientes valores de punto de corte: 10 % de área nuclear positiva para RE, RP, c-erbB2 y p53, se introdujo el 13 % de núcleos que expresaban Mib1 para diferenciar casos con actividad proliferativa alta y baja.

Resultados

Para evaluar si existe una correlación entre diversas características biopatológicas asociadas con cáncer de mama y la expresión de miARN particulares, se generaron y compararon perfiles de expresión de miARN para diversas muestras de cáncer asociadas con la presencia o ausencia de un elemento de cáncer de mama particular. En particular, se analizaron cánceres de mama con histotipos lobulares o ductales, cánceres de mama con expresión diferencial de receptor de estrógeno alfa (RE) o receptor de progesterona, y cánceres de mama con diferencias en metástasis de ganglios linfáticos, invasión vascular, índice de proliferación y expresión de ERBB2 y p53.

Los perfiles de expresión de lobular o ductal y clases de expresión +/-ERBB2 no revelaron ningún microARN que se expresaba diferencialmente, mientras que todas las otras comparaciones revelaron un número pequeño de microARN expresados diferencialmente (P<0,05). No se analizó el grado tumoral. Los resultados de este análisis se muestran en la FIGURA 4.

Se identificaron familias de miARN expresadas diferencialmente con respecto a diversos elementos biopatológicos que se asocian con el cáncer de mama humano. Por ejemplo, todos los miARN miR-30 están regulados negativamente en tumores tanto RE como RP, lo que sugiere que la expresión de los miARN miR-30 está regulada por estas hormonas. Además, la expresión de diversos miARN let-7 estaba regulada negativamente en muestras de cáncer de mama con metástasis de ganglios linfáticos o un índice de proliferación alto, lo que sugiere que la expresión reducida de let-7 podría estar asociada con un mal pronóstico, un resultado que es coherente con hallazgos previos (Takamizawa, J., et al., Cancer Res. 39: 167-169 (2004)). El descubrimiento de que la familia de miARN let-7 regula la expresión de miembros de la familia de oncogén RAS proporciona una explicación potencial para el papel de miARN let-7 en cáncer humano (Johnson, S. M., et al., Cell 120: 635-647 (2005)).

miR-145 y miR-21, dos miARN cuya expresión podría diferenciar tejidos cancerosos o normales, también se han expresado diferencialmente en cánceres con un índice de proliferación diferente o estadio tumoral diferente. En particular, miR-145 se regula negativamente de forma progresiva de mama normal a cánceres con un alto índice de proliferación. De forma similar, miR-21 se regula positivamente de forma progresiva de mama normal a cánceres con alto estadio tumoral. Estos hallazgos sugieren que la desregulación de estos dos miARN puede afectar a acontecimientos moleculares críticos implicados en la progresión tumoral.

Otro miARN implicado potencialmente en la progresión del cáncer es miR-9-3. miR-9-3 estaba regulado negativamente en cáncer de mama con alta invasión vascular o metástasis de ganglios linfáticos, lo que sugiere que su regulación negativa se adquirió durante el transcurso de la progresión tumoral y, en particular, durante la adquisición de potencial metastásico.

Las enseñanzas relevantes de todas las publicaciones citadas en el presente documento que no se han incorporado de forma explícita por referencia, se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Aunque la presente invención se ha mostrado particularmente y se ha descrito con referencia a realizaciones preferidas de la misma, se entenderá por los expertos en la materia que pueden realizarse diversos cambios en forma y detalles de la misma sin alejarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de al menos miR-21 se mide usando análisis de transferencia de Northern.

3. 3.

   Un método para diagnosticar un cáncer de mama asociado a estadio tumoral avanzado en un sujeto, que comprende medir el nivel de expresión de al menos miR-21 en donde un aumento en el nivel de expresión del al menos miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene un cáncer de mama asociado a estadio tumoral avanzado.

4. 4.

   Un método para diagnosticar cáncer de mama en estadio tumoral avanzado, que comprende:

   (1)

   transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana;

   (2)

   hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

   (3)

   comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en donde un aumento en el nivel de expresión de al menos miR-21 en la muestra de ensayo en comparación con un nivel de expresión de miR-21 en una muestra de control es indicativo de que el sujeto tiene cáncer de mama en estadio tumoral avanzado.

5. 5.

   Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 3 o 4 en el que se usa miR-21 en combinación con uno o más de miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-155, miR-10b y combinaciones de los mismos.