CN104502601B - Scn3a作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及SCN3A作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。本发明用ITRAQ蛋白质组学的方法对开放和闭合的人动脉导管组织进行鉴定分析,筛选出132个有差异的蛋白,进行信号通路分析后,挑选SCN3A蛋白,用Western?Blot、Qrt-PCR和免疫组化三种方法进行了鉴定,首次证明该蛋白在人动脉导管组织中表达,并且该蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织具有明显的差异,可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子,可用于动脉导管未闭的临床诊断,且诊断的准确度高。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域,具体地说,涉及SCN3A作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。
【背景技术】
动脉导管(ductusarteriosus,DA)为胎儿时期降主动脉和肺动脉之间的正常通道,正常新生儿生后10-15h可达到功能性关闭,3个月达解剖学上的关闭。如果DA关闭机制异常,即为动脉导管未闭(patentductusarteriosus,PDA)。PDA是常见的先天性心脏病,发病率在先天性心脏畸形中占第2位。早产儿因为生后氧诱导DA收缩机制不成熟,且DA对血管活性物质的反应敏感性下降,PDA的发病率较高,体重低于1750g的早产儿中45%有PDA。及时关闭动脉导管有助于改善缺氧,控制心脏衰竭,降低早产儿死亡率。
动脉导管未闭的临床表现取决于主动脉至肺动脉分流血量的多少以及是否产生继发肺动脉高压和其程度。轻者可无明显症状,重者可发生心力衰竭。常见的症状有劳累后心悸、气急、乏力,易患呼吸道感染和生长发育迟缓。晚期肺动脉高压严重,产生逆向分流时可出现下半身发绀。动脉导管未闭体检时,典型的体征是胸骨左缘第2肋间听到响亮的连续性机器样杂音,伴有震颤,肺动脉第2音亢进,但常被响亮的杂音所掩盖。对于婴幼儿动脉导管未闭合患者,仅可听到收缩期杂音,或收缩期杂音亦消失而代之以肺动脉瓣关闭不全的舒张期杂音,诊断难度较大。因此提供诊断动脉导管闭合或开放的标志物是十分必要的。
电压门控型钠通道(voltage-gatedsodiumchannelsVGSCS)在脑兴奋过程中发挥重要角色,主要负责神经元动作电位的产生与传导,VGSCs是一个蛋白质复合物,是由一个α亚基和1个或多个β亚基(β1~β4)组成。目前已从哺乳动物中鉴定出9个钠通道α亚基(Nav1.1~Nav1.9),其中Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.6主要在中枢神经系统中表达,编码这4种亚型的基因分别是SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A,这些基因在中枢神经系统中的表达及VGSCs的定位受到严格的调控。关于SCN3A作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供了SCN3A蛋白或其特异性抗体的用途。
本发明的再一的目的是,提供一种用于诊断动脉导管未闭合的试剂盒。
本发明的另一的目的是,提供一种芯片或阵列。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
SCN3A蛋白在作为诊断动脉导管开放或闭合的标志物中的应用。
SCN3A蛋白或其特异性抗体的用途,用于制备诊断动脉导管未闭合的试剂或试剂盒。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种用于诊断动脉导管未闭合的试剂盒,所述的试剂盒包含检测SCN3A蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
所述的检测SCN3A蛋白含量的试剂为SCN3A蛋白的特异性抗体,所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
一种芯片或阵列,所述的芯片或阵列上具有检测SCN3A蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
所述的检测SCN3A蛋白含量的试剂为SCN3A蛋白的特异性抗体,所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
本发明优点在于:
本发明使用ITRAQ蛋白质组学的方法对开放和闭合的人动脉导管组织进行鉴定分析,筛选出132个有差异的蛋白,通过信号通路分析,挑选出SCN3A蛋白,用WesternBlot,Qrt-PCR和免疫组化三种方法进行了鉴定,首次证明该蛋白在人动脉导管组织中表,并且这些蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织具有明显的差异,可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子。本发明提供了一个用于区分闭合动脉导管和未闭合动脉导管的蛋白标志物SCN3A,利用该标志物制备诊断动脉导管未闭合的试剂、试剂盒、芯片和阵列。本发明为有效判断动脉导管开放或闭合提供可靠的检测手段。
【附图说明】
附图1是闭合(Constricted)和开放(Patent)动脉导管组织形态学的比较。
附图2是SCN3A蛋白的western-blot结果。
附图3是SCN3A蛋白的RT-PCR结果。
附图4是SCN3A蛋白的免疫组化结果。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一、材料和方法
1.1分离人动脉导管组织
根据国家卫生部有关医学伦理审查方法,本实验所有步骤和过程均获得上海交通大学医学院伦理委员会审查批准并与患者签订知情同意书。
开放(n=10,年龄=30.2±6.3days)或闭合(n=10,年龄=25.3±7.9days)的动脉导管组织取自于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心手术过程中的动脉导管依赖的先天性心脏病患儿(患儿详细信息见表1)。所有病人在手术前均使用前列腺素E1,但闭合组的动脉导管在手术前依然闭合了。所有样本离体后,用生理盐水冲洗数遍,分成四部分,然后迅速冻存于液氮中。所有样品的状态(开放或闭合)均经过心脏超声和CT确认,并在手术过程加以确认。
表1
注:TGA/IVS,完全性大动脉转位/室间隔完整型;PA/IVS;肺动脉闭锁;IAA,中动脉弓中断;PS,肺动脉阻滞;NA,无法获取。*提示两组差别具有统计学差异。
1.2蛋白质的提取及ITRAQ试剂标记
取组织样本,经裂解液(7Murea,2Mthiourea,65mMdithiothreitol,0.1mMphenylmethylsulfonylfluoride)在4℃条件下匀浆裂解1小时,将裂解液在4℃下12000rpm离心30分钟。收集上清液,用2D定量试剂盒(AmershamBiosciences公司)定量蛋白浓度。为减少因生物变异所导致的样本误差将5个不同样本混合获得一个共同的样本(闭合组和开放组各一个),再进行蛋白质组学分析。因此,一共获得4个共同样本(对应2种不同的组织)进行ITRAQ标记。胰酶消化和ITRAQ标记根据试剂盒说明书进行。简而言之,每个混合的共同样本获得的100μg蛋白先还原烷基化,而后37度胰酶(massspectrometrygrade;Promega)消化过夜。样本用iTRAQTM试剂(AppliedBiosystems公司)进行标记,标记如下:闭合动脉导管组织,iTRAQ试剂114;开放动脉导管组织,iTRAQ试剂115。总共两组不同的IsobaricTags运用于四种共同蛋白标本。
1.32DLC-MS/MS
混合肽段经强阳离子交换色谱(SCX)分馏,分馏系统为20AD高效液相色谱系统(HPLC,岛津公司)。简而言之,混合肽段先用Sep-PakCartridge(Waters,USA)脱盐,加样缓冲液(10mMKH2PO4in25%acetonitrile[ACN],pH2.8)稀释,加载于分离柱上。缓冲液A成分与加样缓冲液相同,缓冲液B为加样缓冲液加350mMKCl。肽段的分离使用线性二元梯度分离,即0-80%缓冲液B溶于缓冲液A中,流速为200μl每分钟,时间为60分钟。监测214nm和280nm处的吸光度,顺着分离柱,一共收集到30段SCX片段。每个分离段干燥后,溶解于缓冲液C(5%ACN,0.1%formicacid[FA]),并在QSTARXL质谱仪(AppliedBiosystems)上进行分析。简言之,肽段分离使用的是20ADHPLC系统(岛津)的逆相(RB)分离柱(ZORBAX300SB-C18柱,5微米,300埃,0.1mm×15mm;Micromass)。HPLC的梯度是5%-35%的缓冲液D(95%CAN,0.1%FA)溶于缓冲液C中,流速为0.2μl每分钟,时间为65分钟。ITRAQ标记的肽段在碰撞诱导的分离条件下在114.1和115.1Th产生报告离子。报告离子峰值面积的比率反映了肽段的相对含量,结果显示出样本中蛋白的相对含量。
1.4数据分析
iTRAQ获得的蛋白定性和定量分析采用ProteinPilot软件(version4.2,revisionnumber:1340;AppliedBiosystems)。数据分析参数设置如下:样本类型:ITRAQ(标记过的肽);半胱氨酸烷基化:甲基硫甲磺酸酯;消化:胰酶;设备:QSTARESI;种属:人类;ID焦点:生物调节;数据库:国际蛋白指数人类数据库(version:3.45;143,958entries);查询范围:全部;最大丢失剪切:2;FDR分析:是;用户调节参数文件:否;偏差矫正:自动;背景矫正:是。获得的蛋白经软件富集以尽可能减少重复。所有用来计算蛋白比率的肽对于给定的蛋白均是唯一的。蛋白质置信度阈值截止为1.3(未使用的ProtScore),与至少一种肽具有95%置信。
1.5组织学染色
动脉导管组织经4%多聚甲醛4度过夜后,样本经PBS洗涤,脱水后,蜡块包埋。莱卡切片机切片(5μm)Superfrost玻片封片,37度干燥过夜。二甲苯脱蜡,水化,蒸馏水中洗涤。而后,组织用苏木精-伊红染色。胞浆染成红色,胞核染成蓝色。
1.6基因本体(GO)及网络分析
差异表达蛋白通过DAVID软件(6.7版本)的GO分析注明。GO术语与计算P值小于0.05被视为是显著丰富。蛋白表达形式的通路分析采用IPA软件(IngenuitySystemsInc.)IPA软件分析是基于IngenuityKnowledgeBase数据库,当中包含了已知的分子关系,功能以及疾病的关联。
1.7Westernblotting分析
选择以下蛋白对蛋白质组学结果进行验证:Voltage-gatedsodiumchannels1.3(SCN3A)。进行Westernblotting分析所用一抗体信息如下:humanSCN3Apolyclonalantibody(Ab83962,Abcam)和β-actinrabbitmonoclonalantibody(4970,CellSignalingTechnology)。
将提纯的蛋白用10%的分离胶进行分离,80伏,1小时。蛋白进行常规转膜,5%脱脂奶粉封闭1小时。按照抗体说明书,加入一抗,常温下孵育2小时后,加入相应的HRP耦合的二抗(1:5000;ThermoScientificPierce)孵育1小时后,加入ECL化学发光液(Merck,Milipore,USA)。条带的光密度用Chemi-Doc成像系统(Bio-RadLaboratories)进行分析。
1.8实时荧光定量PCR分析
采用SYBRGreen(AppliedBiosystems)两步法检测上述蛋白的mRNA水平。用总RNA提取试剂盒(天根)从冰冻组织中提取RNA,而后用Takara反转录试剂盒反转录合成cDNA,再用SYBRGreenPowerPremix(ABI)进行聚合酶链反应。反应体系为10μl,DNA模板为1.0μl。ABI7900实时荧光定量PCR反应体系如下:95度10秒1个循环,95度15秒40个循环,60度60秒。引物由中国杰瑞生物科技有限公司合成,序列见表2。所有样本均做3个复孔,复孔间Ct值的差异如果大于0.3,则该复孔不予考虑。
表2引物序列
1.9免疫组化分析
动脉导管组织经4%多聚甲醛4度过夜后,PBS洗涤,脱水,蜡块包埋。莱卡切片机切片(5μm)Superfrost玻片封片,37度干燥过夜。二甲苯脱蜡,水化,蒸馏水中洗涤。.将切片浸入含0.3%H2O2的甲醛中20分钟以灭火内源性的过氧化酶。室温下5%脱脂奶粉封闭2小时后,加入一抗4度过夜。抗原抗体复合物用DAB过氧化酶底物试剂盒(Dako)进行检测。所用一抗为anti-SCN3A(ab83962,Abcam)。
2.0统计分析
结果以均数±标准差表示,成组设计定量资料t检验,P<0.05认为统计上有差异。
2.1制作受试者工作特征(ROC)曲线
对动脉导管开放组做ROC曲线,以评价具有表达差异的SCN3A蛋白的诊断效果。
二、实验结果
SCN3A蛋白的western-blot结果见图2;SCN3A蛋白的RT-PCR结果见图3;SCN3A蛋白的免疫组化结果见图4。以上结果表明,SCN3A蛋白在人动脉导管组织中表达,且在开放组和闭合组中,SCN3A蛋白表达量差异达到显著水平(*P<0.05),SCN3A蛋白的mRNA相对含量差异也达到显著水平(*P<0.05),提示SCN3A可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子。
针对10名动脉导管开放患者SCN3A蛋白水平进行ROC曲线分析,该蛋白的诊断价值如表3所示。结果表明SCN3A蛋白对动脉导管未闭具有较高的诊断价值,ACU可达0.826。
表3SCN3A蛋白相对含量对动脉导管未闭的诊断价值
诊断指标 | AUC | 灵敏度 | 特异度 |
SCN3A相对表达量=0.63(SCN3A/β-actin) | 0.826 | 92.9% | 83.6% |
SCN3A相对表达量=0.54(SCN3A/β-actin) | 0.728 | 87.6% | 79.3% |
注:AUC为ROC曲线下面积;AUC越接近于1,说明诊断效果越好;AUC在0.5~0.7时有较低准确性,AUC在0.7~0.9时有一定准确性,AUC在0.9以上时有较高准确性。
实施例2
对20名疑似动脉导管未闭患者以SCN3A蛋白相对含量为标志物进行诊断。采用Westernblotting进行分析,具体方法同实施例1。以SCN3A相对表达量=0.63(SCN3A/β-actin)为诊断临界值,高于以上临界值即判定为动脉导管未闭,SCN3A蛋白标志物的诊断结果显示14名患者为动脉导管未闭。后期14名患者均实施了动脉导管闭合手术,手术中确认该14名患者均为动脉导管未闭。其他6名患者有5名进一步实施了心脏手术,手术中确认5名均非动脉导管未闭。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.SCN3A蛋白或其特异性抗体的用途,其特征在于,用于制备诊断动脉导管未闭合的试剂或试剂盒。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的试剂盒包含检测SCN3A蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的检测SCN3A蛋白含量的试剂为SCN3A蛋白的特异性抗体,所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
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