CN107831225B - 硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用，利用高通量的GC‑MS代谢组学技术，筛选出造血干细胞移植早期受体内硬脂酸/软脂酸比值水平可作为aGVHD的潜在血清代谢标志物，在诊断aGVHD疾病中具有较高的准确度，能够实现aGVHD疾病的早查、早诊、早发现，提高患者生存率、降低死亡率。同时可以使用本发明的代谢标志物制备成诊断试剂盒，为发展快速、无创、特异、准确、早期预测aGVHD疾病提供了新标志物试剂盒的研发方向，具备广阔的临床应用前景。

Description

硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于代谢组学、临床检测技术领域，具体涉及利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢组学技术筛选出造血干细胞移植后早期受体血清的硬脂酸/软脂酸比值水平可作为aGVHD的潜在标志物。

背景技术

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celltransplantation, allo-HSCT)是目前治疗恶性血液病的有效手段。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease, aGVHD)是影响其预后的重要并发症，在同胞全相合异基因移植中发生率为30%-50%，而在无关全相合供体异基因移植中发生率高达50-70%。目前aGVHD的诊断主要依靠临床症状和活检病理等，这些传统检测手段往往比较滞后，一般都在aGVHD发生后才能确诊，从而延误治疗，致感染、出血等并发症，移植死亡率增加。因此我们急需一种简单、无创的方法对aGVHD进行预测，以尽早诊断，及时治疗，改善移植后患者的生存质量，提高生存率，同时对aGVHD的治疗转归进行评估。寻找和aGVHD发生相关的体液标志物已成为研究的热点，目前比较公认的有三大类: 微小RNA标志物，免疫细胞标志物和蛋白标志物，这些研究方向主要集中在基因组学和蛋白质组学。而随着基因组学、蛋白组学研究的发展，学者们逐步认识到基因组发生变化不一定会在蛋白水平得到表达，从而并不对系统产生影响。而某中蛋白质的体液浓度在外部条件的影响下会升高，但由于其本身没有活性，对系统也不产生影响。同时，由于基因或蛋白的功能补偿作用，某个基因或蛋白的缺失引起的功能变化会由于其它基因或蛋白的存在而得到补偿，最后反应的净结果为零。小分子的产生和代谢才是以上一系列事件的最终结果，它能够更准确的反应机体的状态。实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢层面的，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢物是基因表达的最终产物，是蛋白质在酶的作用下形成的，处于生物系统生化活动调控的末端，包含更全面的生物标记物信息，能够准确反映生物体系的状态。许多代谢物反映了病人在疾病不同时期的生化改变，为临床判断和治疗提供了有参考价值的资料。这个新出现的概念称为代谢组(metabolomics)，关于其研究的相关学科被称为代谢组学。代谢组学是是系统生物学的重要组成部分，它处于基因组和蛋白质组的下游，是基因组和蛋白质组的补充，是生物体系整体功能或状态最终结果的表现，能够更灵敏地鉴定出基因改变、疾病发生和环境刺激等因素作用时的特定代谢表(metabotype)。代谢组学研究可能成为未来预测和评估aGVHD预后的一种全新有效的方法。造血干细胞移植后早期aGVHD的代谢表型目前研究非常少。饱和脂肪酸与体内炎性反应具有密切关系，它可能作为TLR2和TLR4体内配体参与体内免疫，也可能激活JNY而参与体内的众多免疫应答。目前研究集中在糖尿病的发病治疗方法，我们利用代谢组学方法进行了小样本代谢物筛选和大样本验证，发现造血干细胞患者体内软脂酸/硬脂酸水平具有成为aGVHD特定代谢表型的潜力。

发明内容

本发明的目的在于以aGVHD患者为研究对象，利用代谢组学方法，采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，结合多种统计分析方法，筛选出造血干细胞移植早期受体血清硬脂酸/软脂酸比值水平是aGVHD的潜在代谢标志物，为临床诊治aGVHD提供新的血清代谢标志物。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用中。

进一步的，本发明所述的硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用中，所述硬脂酸和软脂酸来源于血清。

进一步的，本发明所述的硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用中，以常规的方法检测血清中的硬脂酸和软脂酸。

进一步的，本发明所述的硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用中，所述的常规检测方法为气相色谱-质谱联用法。

进一步的，本发明所述的硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用中，气相色谱分析条件为：进样1μL，分流比为10:1，初始温度80℃保持5min，以10℃/min的速度匀速上升至170℃，再以5℃/min升至250℃，最后以10℃/min升至300℃维持5min，整个程序共计46min，载气为氦气，恒流，流速：1.0mL/min；

质谱分析条件为：进样口温度300℃，离子化电压为70eV；离子源温度为230℃；检测器电压为1.2kV，电离方式为：电子轰击离子源（EI），离子化电压为70eV，质量扫描范围为30-600 m/z，溶剂切割时间为5min。

本发明所述的硬脂酸/软脂酸组合在制备治疗或缓解aGVHD疾病的药物中的应用。

一种用于诊断aGVHD疾病的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括本发明所述硬脂酸/软脂酸组合的标准品，所述标准品为硬脂酸和软脂酸的化学单体或两者的混合物。

进一步的，所述检测试剂盒还包括缓冲液及显色剂。

进一步的，所述检测试剂盒还包括溶解所述标准品的溶剂和提取所述代谢组合物的溶剂。

本发明所述的检测试剂盒在筛选治疗或缓解aGVHD疾病的药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物的应用，利用高通量的GC-MS代谢组学技术，筛选出造血干细胞移植早期受体内硬脂酸/软脂酸比值水平可做为aGVHD的潜在血清代谢标志物，在诊断aGVHD疾病中具有较高的准确度，能够实现aGVHD疾病的早查、早诊、早发现，提高患者生存率、降低死亡率。可以使用本发明的代谢标志物制备成诊断试剂盒，为发展快速、无创、特异、准确、早期预测aGVHD疾病提供了新标志物试剂盒的研发方向，具备广阔的临床应用前景。

附图说明

图1 患者在移植后7天血清的GC-MS总离子流图，A为aGVHD阳性组，B为aGVHD阴性组。

图2 偏最小二乘判别法(OSC-PLSDA)按不同组别进行模式识别分析，得到的移植不同时间点aGVHD阳性组和aGVHD阴性组的不同代谢轮廓图，其中图A代表-9天，图B代表0天，图C代表+7天，图D代表+14天，图C显示的+7天两组可以明显区分，1是aGVHD阴性组，2是aGVHD阳性组。

图3 软脂酸（图A）、硬脂酸（图B）、硬脂酸/软脂酸的比值（图C）在发现阶段样本中的统计结果图。小样本物质筛选中发现硬脂酸、软脂酸在aGVHD阳性组和阴性组中有差异，并且趋势相反，两者的比值在两组患者中差异更加明显。

图4 软脂酸（图A）、硬脂酸（图B）、硬脂酸/软脂酸的比值（图C）在小样本物质ROC检验验证图，硬脂酸/软脂酸的AUC面积最大。

图5 硬脂酸/软脂酸比值在另一批大样本验证的t检验（A）和ROC检验（B）结果图，两种统计学方法均提示在验证样本中差异存在统计学意义。

图6 建立aGVHD预测的基础模型，A为加入硬脂酸、软脂酸及其比值与基础模型比较的综合模型图，B为软脂酸与基础模型的比较图，C为硬脂酸与基础模型的比较图，D为硬脂酸/软脂酸比值与基础模型的比较图，D图显示两者比值的AUC面积最大，统计学上具有更好的预测效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、材料和方法

1.1 随机选择在苏州大学附属第一医院进行allo-HSCT的114位患者，并且根据移植后100天内是否发生aGVHD分为阳性组和阴性组。入选患者发生aGVHD的时间是10-89天，中位时间56天。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 实验试剂

(1) 乙腈：美国 TEDIA 公司。

(2) 2,4-二氯苯甲酸（内标）：美国 Sigma-Aldrich 公司。

(3) 三甲基氯硅烷（TMCS）：美国 Sigma-Aldrich 公司。

(4) 甲氧胺：美国 Sigma-Aldrich 公司。

(5) 吡啶：美国 Sigma-Aldrich 公司。

(6) N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：美国 Sigma-Aldrich 公司。

(7) 正庚烷：购自美国 TEDIA 公司。

(8) 氨基酸标准品、脂肪酸标准品：购自美国Sigma-Aldrich 公司。

(9) 肝素钠抗凝管：上海新睿生物科技有限公司，规格：6mL。

1.2.2 主要仪器设备

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，美国Agilent公司）、AgilentDB-5MS毛细管柱（30m╳0.25mm╳0.25μm）、实验室超纯水系统（Direct-Q 5UV，广州佰能仪器有限公司），通用冰冻高速离心机(德国 Eppendorf公司)，恒温水浴锅(HSC-24A)，冷冻干燥机等。

1.3 实验设计和方法

本实验采用GC-MS联用技术对aGVHD阳性和阴性患者的血清小分子代谢物进行研究，我们随机选取了aGVHD阳性组15例和aGVHD阴性组15例患者不同时间点标本作为发现物质模型，根据小样本筛选出来的物质进行大样本验证。实验方法包括样品采集及预处理、样品的分离与检测、数据处理。

1.3.1血清标本的采集

所有患者分别于干细胞移植前-9天，移植0天，移植后7天内、移植后第14天留取115位患者的共460份静脉血样本每份样本4mL，全血用肝素抗凝。进入实验室立即离心1500rpm/min，10min，提取血清，分装后-80℃冰箱冻存备用。

1.3.2 GC-MS血清样品制备方法

将血清从-80℃冰箱中取出后常温下解冻，涡旋混匀，首先用乙腈将血清中的蛋白进行有效沉淀并离心去除，随后采用肟化-硅烷化两步衍生的方法并对这些代谢物进行衍生化处理。步骤简述如下：取50µL血清，加入300µL乙腈和100µL内标物溶液（2,4-二氯苯甲酸乙腈溶液，0.2mg/mL），涡旋混匀后，超声冰浴15 min后13000 r/min （4℃）离心15 min。取320µL上清液于新EP管中进行真空冷冻干燥处理，向冻干后的样品中加入50µL甲氧胺吡啶溶液（15 mg/mL），振荡均匀后加入50 µL N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺MSTFA（含1% 三甲基氯硅烷TMCS作为催化剂），混合均匀后于13000 r/min（4℃）离心取上清进行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS

色谱条件：进样1μL，分流比为10:1。初始温度80℃（保持5min），以10℃/min的速度匀速上升至170℃，再以5℃/min升至250℃，最后以10℃/min升至300℃（维持5min），整个程序共计46min。载气：氦气；恒流，流速：1.0mL/min。

质谱条件：进样口温度300℃，离子化电压为70eV；离子源温度为230℃；检测器电压为1.2kV，电离方式为：电子轰击离子源（EI），离子化电压为70eV，质量扫描范围为30-600m/z，溶剂切割时间为5min。

将GC-MS采集得到的原始数据导入自动质谱退卷积定性系统（AMDIS）进行去卷积和离子峰筛选。对信噪比S/N>3的离子峰建立定量积分表，利用GC-MS工作站进行批量样本积分，并用内标物（2,4二氯苯甲酸）进行归一化。血清代谢物的鉴定主要通过谱库检索（NIST），在线数据库（Human Metabolome Database, HMDB）和标准品验证。

1.3.4数据处理

在aGVHD相关特征代谢物的发现阶段，我们将小样本归一化的积分数据存储为CSV格式，进而导入在线MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca)数据处理系统。将aGVHD阳性组和aGVHD阴性组进行比较，利用单变量统计分析（t-test），ROC筛选与aGVHD相关的差异特征变量。在特征性代谢物验证阶段我们也进行了单变量统计分析和ROC分析。用SIMCA-P v13.0软件(瑞典Umetrics)进行正交滤噪(OSC)的有监督的偏最小二乘判别法(partial least squares diseriminant analysis，PLS-DA) 进行分析，Logistic回归风险模型用在评估差异性代谢物对aGVHD预测作用。P<0.05视为差异有统计学意义。统计学处理由R软件完成。将兼具VIP＞1及P＜0.05的代谢物筛选出来认为是不同组别之间的差异代谢物。

二、结果

2.1 血清代谢谱分析

图1为aGVHD阴性患者和aGVHD阳性患者血清在GC-MS中的总离子流图，在某些保留时间内血清代谢物水平表现出不同程度的差异，提示两组间存在血清代谢表型的差异。图2为将数据导入SIMCA-P 13.0软件进行模式识别分析，采用经正交信号滤噪的有监督的偏最小二乘判别法(OSC-PLSDA)按不同组别进行模式识别分析，得到移植不同时间点aGVHD阳性组和aGVHD阴性组的不同代谢轮廓（1是aGVHD阴性组，2是aGVHD阳性组）。从图2中可以看出，其中+7天aGVHD阳性组和aGVHD阴性组可以进行区分。将GC-MS采集到的数据导入AMDIS软件联合NIST11.0数据库进行色谱峰识别及匹配，最终通过数据库标准图谱、标准品和保留指数验证鉴定出16种代谢物（表1）。

表1 血清内源性代谢物鉴定

2.2 aGVHD候选标志物的筛选和验证

我们考察了患者造血干细胞移植前-9天，0天，+7天和+14天血清代谢物的变化，发现+7天代谢差异最明显，这个可能与我们研究的患者均在移植后+7天后就出现aGVHD症状有关。根据独立样本t检验的P值和ROC曲线筛选差异性表达代谢物。有两个代谢物（经鉴定为软脂酸和硬脂酸）变量筛选为与aGVHD相关的差异变量，从图3A和B中可以看出，软脂酸和硬脂酸在aGVHD阳性组和aGVHD阴性组具有相反的变化趋势，此外这两种代谢物具有相近的代谢通路并且可以相互转化。因此，将这两个代谢物的比值（硬脂酸/软脂酸，S/P）作为一个新的与aGVHD相关标志物。硬脂酸/软脂酸的比值在发现阶段样本中的统计结果见图3C，与aGVHD阴性组相比，硬脂酸/软脂酸的比值在aGVHD阳性组中显著性下降。同样我们在ROC筛选中也得到了同样的结论（图4），于是我们将硬脂酸/软脂酸进行ROC曲线分析，根据约登指数(Youden index)选取最佳分界点，即0.731，将患者分成高比值组（≥0.731）和低比值组(<0.731)。此外，我们在另外一批独立大样本中同样观察到aGVHD阳性组硬脂酸/软脂酸的比值显著性下降（图5）。

2.3 硬脂酸/软质素比值对aGVHD移植后预测模型的作用

根据之前筛选出+7天的硬脂酸、软脂酸和两者比值在aGVHD阳性组和aGVHD阴性组存在差异，我们对移植后受体+7天的硬脂酸、软脂酸和两者比值，以及对病人的性别、年龄、疾病类型、疾病状态、疾病风险分层、干细胞来源、供受体性别和HLA匹配程度、供受体ABO血型匹配程度、预处理方案、回输CD34+细胞数量和有核细胞数量对移植后aGVHD的影响进行了单因素分析（见表2），并在此基础上建立aGVHD预测模型(图6)，我们发现硬脂酸、软脂酸和两者比值、干细胞来源和供受体性别的匹配可以影响aGVHD发生。进行多因素分析发现高硬脂酸/软脂酸比值(≥0.731)可能降低aGVHD发生的可能性。进行ROC曲线分析，硬脂酸、软脂酸、硬脂酸/软脂酸比值都可以预测aGVHD。但是硬脂酸/软脂酸比值具有更大AUC面积，提示这个指标可能具有更好的预测性。我们比较了aGVHD基础模型以及分别加入硬脂酸、软脂酸以及硬脂酸/软脂酸比值这三个变量后基础模型对aGVHD的预测效果，从图6中发现硬脂酸/软脂酸比值较单一硬脂酸和软脂酸可以更好的提高模型的预测性。

表2 aGVHD阳性组和aGVHD阴性组病例特点比较

Claims (6)

1.硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物在制备诊断aGVHD疾病的检测试剂盒中的应用，硬脂酸和软脂酸来源于血清；将硬脂酸/软脂酸进行ROC曲线分析，根据约登指数选取最佳分界点0.731，当硬脂酸/软脂酸的比值小于0.731时，为发生aGVHD的高概率样本。

2.一种权利要求1所述的诊断aGVHD疾病的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述硬脂酸/软脂酸组合的标准品，所述标准品为硬脂酸和软脂酸的化学单体或两者的混合物。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括缓冲液及显色剂。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括溶解所述标准品的溶剂和提取硬脂酸/软脂酸组合物的溶剂。

5.权利要求2-4任一项所述的检测试剂盒在筛选治疗或缓解aGVHD疾病的药物中的应用。

6.硬脂酸/软脂酸组合作为aGVHD疾病诊断标志物在制备治疗或缓解aGVHD疾病的药物中的应用。

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