CN104502603B - Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 - Google Patents

Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN104502603B
CN104502603B CN201410723745.0A CN201410723745A CN104502603B CN 104502603 B CN104502603 B CN 104502603B CN 201410723745 A CN201410723745 A CN 201410723745A CN 104502603 B CN104502603 B CN 104502603B
Authority
CN
China
Prior art keywords
myo1d
albumen
arterial duct
open
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201410723745.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104502603A (zh
Inventor
叶霖财
刘锦纷
洪海筏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN201410723745.0A priority Critical patent/CN104502603B/zh
Publication of CN104502603A publication Critical patent/CN104502603A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104502603B publication Critical patent/CN104502603B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Abstract

本发明涉及MYO1D作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。本发明用ITRAQ蛋白质组学的方法对开放和闭合的人动脉导管组织进行鉴定分析，筛选出132个有差异的蛋白，进行信号通路分析后，挑选MYO1D蛋白，用western？blot、Qrt-PCR和免疫组化三种方法进行了鉴定，首次证明该蛋白在人动脉导管组织中表达，并且该蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织具有明显的差异，可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子，可用于动脉导管未闭的临床诊断，且诊断的准确度高。

Description

MYO1D作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
技术领域
本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域，具体地说，涉及MYO1D作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物。
背景技术
动脉导管是主动脉与肺动脉之间的一根管道，为胎儿循环的重要通路。小儿出生后，动脉导管即在功能上关闭，绝大多数婴儿生后3个月左右在解剖上逐渐闭合成为动脉韧带，若不闭合即称动脉导管未闭。动脉导管的闭合分为两期：1.第一期为生理闭合期。婴儿出生啼哭后第一口吸气，肺泡即膨胀，肺血管阻力随之下降，肺动脉血流开始直接进入肺脏，建立正常的肺循环，而不流经动脉导管，促进其闭合。动脉导管的组织学结构与两侧的主动脉、肺动脉不同，管壁主要由平滑肌而不是弹性纤维组织组成，中层含粘性物质。足月婴儿出生后血氧张力升高，作用于平滑肌，使之环形收缩，同时管壁粘性物质凝固，内膜垫突入管腔，造成血流阻滞，营养障碍和细胞分解性坏死，因而导管发生生理性闭合。一般在出生后10～15小时内完成，但在7～8天内有潜在性再开放的可能。2.此后内膜垫弥漫性纤维增生完全封闭管腔，最终形成导管韧带。导管纤维化一般起始于肺动脉侧，向主动脉延伸，但主动脉端可以不完成，因而呈壶腹状。纤维化解剖性闭合，88％婴儿于8周内完成。如这闭合过程延迟称动脉导管延期未闭。动脉导管出生后6个月未能闭合，将终生不能闭合，则称持续动脉导管闭锁不全，临床上简称动脉导管闭锁不全。
肌球蛋白是真核细胞内的一类分子马达，对细胞的运动与传输起着重要的作用。例如肌球蛋白II就在肌肉收缩和细胞分裂的过程中扮演了重要的角色。其他种类的肌球蛋白也有着类似的功能。肌球蛋白有I—XVII型，其中肌球蛋白I型又包括MYO1A、MYO1B、MYO1C、MYO1D、MYO1E、MYO1F、MYO1G、MYO1H。
有许多从左向右分流心内畸形在胸骨左缘可听到同样的连续性机器样杂音或接近连续的双期心杂音，难以辨识，在建立动脉导管未闭诊断进行治疗前必须予以鉴别。目前尚未见关于动脉导管闭合诊断标志物的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供了MYO1D蛋白或其特异性抗体的用途。
本发明的再一的目的是，提供一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒。
本发明的另一的目的是，提供一种芯片或阵列。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
MYO1D蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于诊断动脉导管未闭的试剂盒，所述的试剂盒包含检测MYO1D蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测MYO1D蛋白含量的试剂为MYO1D蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种芯片或阵列，所述的芯片或阵列上具有检测MYO1D蛋白含量的试剂和检测β-actin蛋白含量的试剂。
优选地，所述的检测MYO1D蛋白含量的试剂为MYO1D蛋白的特异性抗体，所述的检测β-actin蛋白含量的试剂为β-actin蛋白的特异性抗体。
本发明优点在于：
本发明用ITRAQ蛋白质组学的方法对开放和闭合的人动脉导管组织进行鉴定分析，筛选出132个有差异的蛋白，进行信号通路分析后，挑选MYO1D蛋白，用westernblot、Qrt-PCR和免疫组化三种方法进行了鉴定，首次证明该蛋白在人动脉导管组织中表达，并且该蛋白在闭合和开放的两组动脉导管组织具有明显的差异，可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子，可用于动脉导管未闭的临床诊断，且诊断的准确度高。
附图说明
附图1是闭合(Constricted)和开放(Patent)动脉导管组织形态学的比较。
附图2是Myo1d蛋白的western-blot结果。
附图3是Myo1d蛋白的RT-PCR结果。
附图4是Myo1d蛋白的免疫组化结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一.材料和方法
1.1分离人动脉导管组织
该实验所有步骤和过程均获得上海交通大学医学院伦理委员会批准。开放(n＝10，年龄＝30.2±6.3天)或闭合(n＝10，年龄＝25.3±7.9天)的动脉导管组织取自于手术过程中的动脉导管依赖的先天性心脏病患儿(患儿详细信息见表1)。所有病人在手术前均使用前列腺素E1，但闭合组的动脉导管在手术前依然闭合了。动脉导管的状态(开放或闭合)均经过心脏超声和CT确认，并在手术过程加以确认。所有样本用生理盐水冲洗后，分成四部分，并迅速冻存于液氮中。
表1患儿临床信息
注：*P<0.05开放组vs闭合组；TGA/IVS：完全性大动脉转位/室间隔完整型；PA/IVS：肺动脉阻滞/室间隔完整型；IAA：主动脉弓中断；PS：肺动脉狭窄；NA，无法获取。
1.2蛋白质的提取及ITRAQ试剂标记
组织样本经裂解液(7Murea，2Mthiourea，65mMdithiothreitol，0.1mMphenylmethylsulfonylfluoride)匀浆裂解(4度1小时)后，再4度12000转离心30分钟。收集上清液，用2D定量试剂盒(AmershamBiosciences)定量蛋白浓度。为减少因生物变异性所导致的样本误差，将5个不同样本混合获得一个共同的样本(闭合组和开放组各一个)，再进行蛋白质组学分析。因此，一共获得4个共同样本(对应2种不同的组织)进行ITRAQ标记。胰酶消化和ITRAQ标记根据试剂盒说明书进行。简而言之，每个混合的共同样本获得的100μg蛋白先还原烷基化，而后37度胰酶(massspectrometrygrade；Promega)消化过夜。样本用iTRAQTM试剂(AppliedBiosystems)进行标记，标记如下：闭合动脉导管组织，iTRAQ试剂114；开放动脉导管组织，iTRAQ试剂115。总共两组不同的isobarictags运用于四种共同蛋白标本。
1.32DLC–MS/MS
混合肽段经强阳离子交换色谱(SCX)分馏，分馏系统为20AD高效液相色谱(HPLC)系统(岛津公司)。简而言之，混合肽段先用Sep-PakCartridge(Waters，USA)脱盐，加样缓冲液(10mMKH2PO4in25％acetonitrile[ACN]，pH2.8)稀释，加载于分离柱上。缓冲液A成分与加样缓冲液相同，缓冲液B为加样缓冲液加350mMKCl。肽段的分离使用线性二元梯度分离，即0％-80％缓冲液B溶于缓冲液A中，流速为200μl每分钟，时间为60分钟。监测214nm和280nm处的吸光度，顺着分离柱，一共收集到30段SCX片段。每个分离段干燥后，溶解于缓冲液C(5％CAN，0.1％formicacid[FA])，并在QSTARXL质谱仪(AppliedBiosystems)上进行分析。简言之，肽段分离使用的是20ADHPLC系统(岛津)的逆相(RB)分离柱(ZORBAX300SB-C18柱，5微米，300埃，0.1mm×15mm；Micromass)。HPLC的梯度是5％-35％的缓冲液D(95％CAN，0.1％FA)溶于缓冲液C中，流速为0.2μl每分钟，时间为65分钟。ITRAQ标记的肽段在碰撞诱导的分离条件下在114.1和115.1Th产生报告离子。报告离子峰值面积的比率反映了肽段的相对含量，结果显示出样本中蛋白的相对含量。
1.4iTRAQ数据分析
iTRAQ获得的蛋白定性和定量分析采用ProteinPilot软件(version4.2，revisionnumber：1340；AppliedBiosystems)。数据分析参数设置如下：样本类型：ITRAQ(标记过的肽)；半胱氨酸烷基化：甲基硫甲磺酸酯；消化：胰酶；设备：QSTARESI；种属：人类；ID焦点：生物调节；数据库：国际蛋白指数人类数据库(version:3.45；143,958entries)；查询范围：全部；最大丢失剪切：2；FDR分析：是；用户调节参数文件：否；偏差矫正：自动；背景矫正：是。获得的蛋白经软件富集以尽可能减少重复。所有用来计算蛋白比率的肽对于给定的蛋白均是唯一的。蛋白质置信度阈值截止为1.3(未使用的ProtScore)，与至少一种肽具有95％置信。
1.5组织学染色
动脉导管组织经4％多聚甲醛4度过夜后，样本经PBS洗涤，脱水后，蜡块包埋。莱卡切片机切片(5μm)Superfrost玻片封片，37度干燥过夜。二甲苯脱蜡，水化，蒸馏水中洗涤。而后，组织用苏木精-伊红染色。胞浆染成红色，胞核染成蓝色。
1.6基因本体(GO)及网络分析
差异表达蛋白通过DAVID软件(6.7版本)的GO分析注明。GO术语与计算P值小于0.05被视为是显著丰富。蛋白表达形式的通路分析采用IPA软件(IngenuitySystemsInc.)，IPA软件分析基于IngenuityKnowledgeBase数据库，当中包含了已知的分子关系、功能以及疾病的关联。
1.7Westernblotting分析
选择以下蛋白对蛋白质组学结果进行验证：myosin1d(Myo1d)。进行Westernblotting分析所用一抗信息如下：Myo1dpolyclonalantibody(sc32707，SantaCruz)和β-actinrabbitmonoclonalantibody(4970，CellSignalingTechnology)。
将提纯的蛋白用10％的分离胶进行分离，80伏，1小时。蛋白进行常规转膜，5％脱脂奶粉封闭1小时。按照抗体说明书，加入一抗，常温下孵育2小时后，加入相应的HRP耦合的二抗(1:5000；ThermoScientificPierce)孵育1小时后，加入ECL化学发光液(Merck，Milipore，USA)。条带的光密度用Chemi-Doc成像系统(Bio-RadLaboratories)进行分析。
1.8实时荧光定量PCR分析
采用SYBRGreen(AppliedBiosystems)两步法检测上述蛋白的mRNA水平。用总RNA提取试剂盒(天根)从冰冻组织中提取RNA，而后用Takara反转录试剂盒反转录合成cDNA，再用SYBRGreenPowerPremix(ABI)进行聚合酶链反应。反应体系为10μl，DNA模板为1.0μl。ABI7900实时荧光定量PCR反应体系如下：95度10秒1个循环，95度15秒40个循环，60度60秒。引物由中国杰瑞生物科技有限公司合成，序列见表2。所有样本均做3个复孔，复孔间Ct值的差异如果大于0.3，则该复孔不予考虑。
表2引物序列
1.9免疫组化分析
动脉导管组织经4％多聚甲醛4度过夜后，PBS洗涤，脱水，蜡块包埋。莱卡切片机切片(5μm)Superfrost玻片封片，37度干燥过夜。二甲苯脱蜡，水化，蒸馏水中洗涤。将切片浸入含0.3％H2O2的甲醛中20分钟以灭火内源性的过氧化酶。室温下5％脱脂奶粉封闭2小时后，加入一抗4度过夜。抗原抗体复合物用DAB过氧化酶底物试剂盒(Dako)进行检测。所用一抗信息如下：anti-Myo1d(sc32707，SantaCruz)。
2.0统计分析
结果以均数±标准差表示，成组设计定量资料t检验，P<0.05认为统计上有差异。
2.1制作受试者工作特征(ROC)曲线
对开放组作ROC曲线，以评价具有表达差异的Myo1d蛋白的诊断效果。二.实验结果
Myo1d蛋白的western-blot结果见图2，Myo1d蛋白的RT-PCR结果见图3，Myo1d蛋白的免疫组化结果见图4。以上结果表明，Myo1d蛋白在人动脉导管组织中表达，且在开放组和闭合组中，Myo1d蛋白的相对表达量差异达到显著水平(*P<0.05)，Myo1d蛋白的mRNA相对含量差异也达到显著水平(*P<0.05)，提示Myo1d可能是调控动脉导管闭合或开放的关键因子。
针对10名开放组患者Myo1d蛋白水平进行ROC曲线分析，该蛋白的诊断价值如表3所示。结果表明Myo1d蛋白对动脉导管未闭具有较高的诊断价值，AUC可达0.852。
表3Myo1d蛋白相对含量对动脉导管未闭的诊断价值
诊断指标 AUC 灵敏度 特异度
Myo1d相对表达量＝3.20(Myo1d/β-actin) 0.852 89.2％ 78.5％
Myo1d相对表达量＝3.00(Myo1d/β-actin) 0.631 75.8％ 70.4％
注：AUC为ROC曲线下面积；AUC越接近于1，说明诊断效果越好；AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
实施例2
对20名疑似动脉导管未闭患者以Myo1d蛋白相对含量为标志物进行诊断。采用Westernblotting进行分析，具体方法同实施例1。以Myo1d相对表达量＝3.20(Myo1d/β-actin)为诊断临界值，高于以上临界值即判定为动脉导管未闭，Myo1d蛋白标志物的诊断结果显示14名患者为动脉导管未闭。后期14名患者均实施了动脉导管闭合手术，手术中确认该14名患者均为动脉导管未闭。其他6名患者有5名进一步实施了心脏手术，手术中确认5名均非动脉导管未闭。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.MYO1D蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备诊断动脉导管未闭的试剂或试剂盒。
CN201410723745.0A 2014-12-03 2014-12-03 Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物 Expired - Fee Related CN104502603B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410723745.0A CN104502603B (zh) 2014-12-03 2014-12-03 Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410723745.0A CN104502603B (zh) 2014-12-03 2014-12-03 Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104502603A CN104502603A (zh) 2015-04-08
CN104502603B true CN104502603B (zh) 2016-04-06

Family

ID=52944016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410723745.0A Expired - Fee Related CN104502603B (zh) 2014-12-03 2014-12-03 Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104502603B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541977A (zh) * 2006-09-19 2009-09-23 诺瓦提斯公司 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物
CN101772511A (zh) * 2007-02-16 2010-07-07 太平洋艾瑞有限公司 通过影响粘连蛋白质表达阻止癌细胞的转移和新化合物及其应用
CN103025890A (zh) * 2010-04-06 2013-04-03 卡里斯生命科学卢森堡控股 疾病的循环生物标志物

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2104734A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541977A (zh) * 2006-09-19 2009-09-23 诺瓦提斯公司 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物
CN101772511A (zh) * 2007-02-16 2010-07-07 太平洋艾瑞有限公司 通过影响粘连蛋白质表达阻止癌细胞的转移和新化合物及其应用
CN103025890A (zh) * 2010-04-06 2013-04-03 卡里斯生命科学卢森堡控股 疾病的循环生物标志物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Balaji Olety等.Myosin 1G(Myo1G) is a haematopoietic speci&#64257 *
c myosin that localizes to the plasma membrane and regulates cell elasticity.《FEBS Letters》.2010,第584卷 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104502603A (zh) 2015-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Hepatocyte TAZ/WWTR1 promotes inflammation and fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis
Gross et al. Loss of collagen-receptor DDR1 delays renal fibrosis in hereditary type IV collagen disease
Tian et al. Quantitative proteomic characterization of lung tissue in idiopathic pulmonary fibrosis
CN104407153B (zh) Map2k1作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
US20110256105A1 (en) Cardiac stem cell and myocyte secreted paracrine factors
JP2014519018A5 (zh)
BR112020004439A2 (pt) diagnóstico não invasivo de doenças de fígado gorduroso não alcoólico, esteato-hepatite não alcoólica e/ou fibrose de fígado
JP2021184770A (ja) 診断および治療におけるｒ２ｒ１／２
CN115343479A (zh) Cf48肾损伤生物标志物及在肾损伤治疗药物中的用途
Caselli Inflammation in cardiac disease: focus on Interleukin-33/ST2 pathway
Zhai et al. miRNAs from plasma extracellular vesicles are signatory noninvasive prognostic biomarkers against atherosclerosis in LDLr-/-mice
Martini et al. Transcriptome analysis of human reninomas as an approach to understanding juxtaglomerular cell biology
CN104502603B (zh) Myo1d作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
CN106987634B (zh) 血浆外泌体源性miRNAs在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用
Kumar et al. Proteome analysis reveals that de novo regenerated mucosa over fibula flap-reconstructed mandibles resembles mature keratinized oral mucosa
KR101704828B1 (ko) 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법
Wu et al. Ca 2+-regulatory proteins in cardiomyocytes from the right ventricle in children with congenital heart disease
CN104502601B (zh) Scn3a作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
CN104502602B (zh) Arhgap26作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
RU2013104137A (ru) Изоформы bard1 при раке легкого и колоректальном раке и их применение
WO2023060066A2 (en) Supermere nanoparticles and methods of isolation and use thereof
CN110632327B (zh) 人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用
Wang et al. Upregulation of GLT25D1 in Hepatic Stellate Cells Promotes Liver Fibrosis via the TGF-β1/SMAD3 Pathway In Vivo and In vitro
CN104502604B (zh) Ncx1和nckx4作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物
CN111349698A (zh) 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160406

Termination date: 20201203