BR112020004439A2 - diagnóstico não invasivo de doenças de fígado gorduroso não alcoólico, esteato-hepatite não alcoólica e/ou fibrose de fígado - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um método não invasivo inovador para o diagnóstico de uma doença de fígado gorduroso não alcoólico, em particular, esteato-hepatite não alcoólica e/ou fibrose de fígado.

Description

“DIAGNÓSTICO NÃO INVASIVO DE DOENÇAS DE FÍGADO GORDUROSO NÃO ALCOÓLICO, ESTEATO-HEPATITE NÃO ALCOÓLICA E/OU FIBROSE DE FÍGADO” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a um método não invasivo inovador para o diagnóstico de uma doença de fígado gorduroso não alcoólico, em particular, esteato- hepatite não alcoólica e/ou fibrose de fígado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A doença de fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD) é uma doença silenciosa definida como um acúmulo de gordura no fígado (esteatose) por outras causas além de consumo excessivo de álcool. NAFLD é a causa mais comum de aminotransferases elevadas em pacientes denominados hepatologistas. Faixas de NAFLD de esteatose simples benigna a uma condição mórbida para alguns pacientes, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), em que um processo necro/inflamatório aciona acumulação progressiva de fibrose no fígado que, em última análise, leva à cirrose, insuficiência hepática, carcinoma hepatocelular (HCC), transplante de fígado e morte do fígado. Tanto da perspectiva epidemiológica quanto da perspectiva patofisiológica, NAFLD e NASH são rigorosamente associados à obesidade, síndrome metabólica e diabetes tipo 2. Portanto, paralelamente a epidemias de obesidade e diabetes tipo 2, a prevalescência de NAFLD e NASH aumentou drasticamente nas últimas décadas e NASH está se tornando a primeira causa de transplante de fígado nos EUA. Consequentemente, NASH é considerada como uma questão de saúde pública mundial crescente sabendo que não há solução ideal para diagnóstico e ainda nenhum tratamento aprovado para NASH.

[0003] Embora NAFLD possa ser diagnosticado detectando- se a presença de acúmulo de gordura no fígado com o uso de técnicas de ultrassom, NASH e fibrose de fígado associada a NASH pode ser apenas diagnosticada por examinação histológica de uma biópsia de fígado. Em examinação microscópica de uma biópsia de fígado, NASH é definida por acumulação de ácido graxo (gotículas de lipídio) associada a hepatócitos danificados (balonamento ou necrose dos hepatócitos) e sinais de inflamação lobular. Embora a fibrose não seja um recurso histológico necessário para diagnóstico de NASH, presença e preparação de fibrose de fígado é crítica para avaliar a gravidade da doença e o risco de evolução para cirrose, HCC (carcinoma hepatocelular) e morte do fígado que é a morte do paciente relacionada a fígado.

[0004] Os sistemas de pontuação/preparação histológicos foram desenvolvidos para avaliar nível de atividade de NAFLD e estágio de fibrose e estimar o risco de evolução para resultados clínicos de fígado. A Pontuação de Atividade de NALFD (NAS) foi desenvolvida para avaliar a atividade da doença.

[0005] A NAS é a soma das pontuações individuais da biópsia não pesada para esteatose (0 a 3), inflamação lobular (0 a 3), balonamento hepatocelular (0 a 2). De acordo com Kleiner et al., (Hepatology, 2005; 41:1313-21), NAS é a soma de três pontuações histológicas produzidas a partir de pedaços de biópsia de fígado:

- S: Pontuação de esteatose: 0: <5 %; 1: 5-33 %; 2: 34- 66 % e 3: >66 % - LI: Pontuação de inflamação lobular (focos por 20x de campo): 0: nenhum; 1: <2; 2: 2-4 e 3>4 - HB: Pontuação de degeneração por balonamento: 0: nenhum; 1: alguns; 2: muitas células/balonamento proeminente.

[0006] Ao usar esse sistema de pontuação, um paciente com NASH tem NAS≥3 e pelo menos 1 ponto em esteatose, pelo menos 1 ponto em inflamação lobular e pelo menos 1 ponto em balonamento de hepatócito. Um paciente é considerado como tendo uma NASH Ativa quando NAS≥4 com pelo menos 1 ponto em esteatose, pelo menos 1 ponto em inflamação e pelo menos 1 ponto em balonamento de hepatócito.

[0007] A localização e extensão de fibrose em exame histológico sinaliza a gravidade (avanço) da doença e a NASH-CRN tem desenvolvido um sistema de preparação de fibrose dedicado (Kleiner et al., Hepatology, 2005; 41:1313-21). Fibrose perissinusoidal ou periportal 1 Fibrose perissinusoidal branda (zona 3) 1a Fibrose perissinusoidal moderada (zona 3) 1b Fibrose Portal/periportal 1c Fibrose perissinusoidal e portal/periportal 2 Fibrose de extrapolação 3 Cirrose 4

[0008] Ao usar esse sistema de preparação de fibrose, pacientes com nenhuma fibrose ou fibrose mínima (F=0-1) são geralmente não considerados em risco de cirrose, HCC ou morte do fígado. Pacientes com fibrose significativa (F=2) e moderada (F=3) estão em risco crescente de desenvolver cirrose, insuficiência hepática, HCC e morte do fígado. Paciente com cirrose compensada tem fibrose severa (F=4) e está em alto risco de insuficiência hepática (cirrose descompensada), HCC e mortes relacionadas a fígado.

[0009] Derivado desses sistemas de preparação de duas pontuações amplamente aceitos, atenção especial foi dada recentemente ao Índice de Atividade (AI) que pode ser definido como a soma da pontuação de inflamação lobular e as pontuações de balonamento de hepatócito. Além de Munteanu et al., Aliment Pharmacol Ther., 2016, 44(8):877- 89 ter proposto assinatura de SAF para relatar separadamente pontuações de Esteatose, Atividade de doença e Fibrose.

[0010] O diagnóstico de NAFLD e NASH, e pontuação de atividade de doença com o uso da NAS anteriormente mencionada, AI e preparação de fibrose de fígado exige biópsia de fígado, que tem diversas desvantagens óbvias inviabilizando seu uso rotineiro. De fato, biópsia de fígado é um procedimento invasivo que pode ser complexo, preocupante e doloroso para o paciente e a biópsia de fígado é associada a riscos de hemorragias e mesmo mortes. Consequentemente, devido a crescimento epidêmico de NASH e fibrose de fígado e devido ao fato de que a biópsia não pode ser tida como um procedimento suficientemente eficaz e seguro, há uma necessidade urgente por novos métodos não invasivos para diagnóstico de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado.

[0011] Técnicas de imageamento de ultrassom

(ultrassonografia, parâmetro de atenuação controlada, Imageamento por Ressonância Magnética (MRI), e a fração de gordura de densidade de próton estimada por MRI (MRI-15 DPFF)) foram desenvolvidas para diagnosticar NAFLD. No entanto, essas técnicas são limitadas tanto por variabilidade interobservador quanto intra-observador, por custo e/ou são demoradas. Além disso, MRI-DPFF não está rotineiramente disponível e é muito complicado de ser usada em prática clínica. Ademais, estágio de fibrose é associado a todas as causas de mortalidade de uma maneira dependente de dose, com risco evidente aumento em pacientes com fibrose F2. Elastografia à base de ultrassom 20 como Fibroscan e eletrografia de onda de cisalhamento tem precisão de moderada a alta em diagnóstico de fibrose ou cirrose avançada. No entanto, fibrose F2 não é um estágio avançado de fibrose e, desse modo, não pode ser precisamente detectada com essas técnicas.

[0012] Além de técnicas de ultrassom e imageamento, esforços intensos têm sido realizados para identificação e validação de novos biomarcadores de circulação para uma detecção confiável, simples, econômica e não invasiva de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado. A tabela a seguir lista biomarcadores individuais que foram relatados como modulados em NAFLD/NASH e/ou fibrose de fígado.

Função de Tecido Metabolismo Estresse/ Fibrose Inflamação hepatócito adiposo apoptose oxidativa ALT Adiponect Glicose no Malondiald Fibronecti TNFa AST ina plasma em eído na IL1b, IL6, ALP Leptina jejum TBARS Ácido IL8, IFNg, GGT Resistina Insulina em Ox LDL hialurônic TGFb Haptoglobu jejum CK18 -M30 o hs -CRP lina Índice de CK18-M65 Colágeno MCP1 Albumina HOMA Ferritina tipo IV sCD14 Bilirubina Trigliceríde YKL-40 PIIINP Contagem os (CHI3L1) TIMP-1 de Colesterol Plaquetas HDL VLCL-C Apolipoprote ínas (ApoA1, ApoB, ApoCIII)

[0013] Diversos estudos sugeriram que alguns desses biomarcadores de soro tinham valores de diagnóstico melhores que os marcadores de soro comuns de disfunção de fígado como transaminases (Naveau S. et al., Clin Gastroenterol Hepatol., 2005; 3(2): 167-74; Castera L. et al., J. Hepatol. 2000; 32:412-8; Annoni G. et al. Hepatology. 1989; 9:693-7; Nojgaard C. et al. J Hepatol. 2003;39: 179-86; Chossegros P. 1995; 22(2 Suppl):96-9). No entanto, nenhum desses estudos identificou e validou realmente um biomarcador potente para diagnosticar NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado. Tentando aprimorar desempenhos de diagnóstico, pontuações de múltiplos parâmetros foram geradas combinando diversos biomarcadores e/ou variáveis comuns, mas seus desempenhos de diagnóstico para identificação de paciente com NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado permanecem amplamente improváveis.

[0014] NASH é associada a progressão rápida de fibrose que NAFLD e é atualmente o principal alvo para tratamento farmacológico. Os pacientes com NASH são mais prováveis de desenvolver cirrose e morrer de causas relacionadas a fígado ou cardiovasculares, com o prognóstico deterioração conforme o estágio de fibrose progride (Ekstedt et al, 2015). Independente do grande número de biomarcadores de soro, painéis de combinação, e biomarcadores de imageamento que foram propostos, a identificação de métodos eficaz, menos invasivos e mais acessível para diagnosticar e monitorar NAFLD, NASH e fibrose de fígado ainda são necessários, em particular, métodos confirmados com um painel de validação clínica independente.

[0015] Identificar pacientes que estão em risco de desenvolver HCC, complicações cirróticas e mortes relacionadas a fígado, é a principal razão para avaliação de fígado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Os inventores conduziram diversas análises muito boas e completas de diferentes coortes de pacientes para fornecer métodos de diagnóstico e monitoramento não invasivo altamente sensíveis e inovadores de doença de fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e fibrose de fígado. Os dados fornecidos no presente documento demonstram que miR-452 é um biomarcador de circulação potente ligado a NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado. Esse biomarcador foi validado em três coortes clínicas independentes. Portanto, os métodos da presente invenção permitem diagnosticar, monitorar e classificar o risco em um indivíduo que sofre de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado. Os inventores também fornecem um método para o diagnóstico, monitoramento e classificação de risco de indivíduos que sofrem potencialmente de NAFLD, NAFL, NASH e/ou fibrose de fígado. Os métodos da presente invenção também podem permitir o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos inovadores.

[0017] Consequentemente, a invenção fornece um método para o diagnóstico de uma NAFLD, NASH ou fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR- 452 em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0018] Esses métodos têm como base a determinação do nível de miR-452 em um fluido corporal do indivíduo. Em todos os métodos e modalidades apresentados no presente documento, o microRNA miR-452 implementado na presente invenção pode ser um microRNA hsa-miR-452, como um hsa-miR- 452 selecionado a partir do grupo que consiste em hsa-miR- 452-5p e hsa-miR-452-3p. Em uma modalidade particular, o nível de hsa-miR-452-5p é determinado. Em todos os métodos e modalidades apresentados no presente documento, a amostra de fluido corporal pode ser uma amostra de sangue, de um fluido derivado de sangue (como soro e plasma, em particular, plasma livre de plaquetas, por exemplo, uma amostra de plasma livre de células, derivado de citrato, livre de plaquetas), de saliva, de fluido cerebrospinal ou de urina. Em uma modalidade particular, o fluido corporal é plasma ou soro, privado de plaquetas ou não.

[0019] Nos métodos da presente invenção, o nível de fluido corporal de miR-452 no indivíduo pode ser comparado a um nível de referência de miR-452. O "nível de referência" representa um padrão predeterminado ou um nível determinado de modo experimental em uma amostra processada de modo similar de um indivíduo de referência. Dependendo do propósito dos métodos da presente invenção, o indivíduo de referência pode ser um indivíduo saudável, um indivíduo que tem NAFLD, mas não NASH, um indivíduo que tem NASH, mas nenhuma NASH ativa, ou um indivíduo com nenhuma fibrose ou fibrose mínima de fígado. O indivíduo de referência também pode ser um paciente tratado com placebo. O nível de referência também pode ser o nível de miR-452 determinado em uma amostra de fluido corporal processada de modo similar obtida no passado do mesmo indivíduo, permitindo determinar a evolução de NAFLD, NAFL, NASH ou fibrose de fígado no indivíduo, em particular, permitindo determinar a evolução da atividade de doença ou fibrose, ou a eficácia do tratamento da doença, dependendo do método que é implementado.

[0020] Em uma modalidade particular, o diagnóstico e/ou detecção de NAFLD, ou o diagnóstico e/ou detecção de uma NAFLD potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática.

[0021] Em uma modalidade particular, o diagnóstico e/ou detecção de NAFL, ou o diagnóstico e/ou detecção de uma NAFL potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática, nenhuma inflamação lobular e nenhum balonamento de hepatócito.

[0022] Em outra modalidade particular, o diagnóstico e/ou detecção de NASH, ou o diagnóstico e/ou detecção de uma NASH potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo não NASH como um indivíduo saudável, um indivíduo com uma NAS<3 ou um indivíduo com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0.

[0023] Em outra modalidade, o diagnóstico e/ou detecção de NASH Ativa, ou o diagnóstico e/ou detecção de uma NASH Ativa potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo saudável, um indivíduo com NAS<4 ou um indivíduo com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0. Em uma modalidade particular, para o diagnóstico e detecção de NASH Ativa ou de NASH Ativa potencial, o nível de referência é o nível de miR-452 medido em um indivíduo com NAS=3, 1 ponto em esteatose, 1 ponto em inflamação lobular e 1 ponto nas pontuações de balonamento de hepatócito.

[0024] Em uma modalidade adicional, o diagnóstico e detecção de fibrose de fígado (F≥1), ou de fibrose de fígado potencial (F≥1), em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo saudável com nenhuma fibrose de fígado (F=0).

[0025] Em outra modalidade, o diagnóstico e detecção de fibrose de fígado significativa (F=2), moderada (F=3) ou severa (F=4; isto é, cirrose), ou de fibrose de fígado significativa potencial, fibrose de fígado moderada potencial, ou fibrose de fígado severa potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo com nenhuma (F=0) ou mínima (F=1) fibrose de fígado.

[0026] Em outra modalidade, o diagnóstico e detecção de fibrose de fígado significativa (F=2), moderada (F=3), ou severa (F=4), ou de fibrose de fígado significativa potencial, fibrose de fígado moderada potencial, ou fibrose de fígado severa potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo com fibrose mínima (F=1). Em outra modalidade particular, o nível de referência é medido em um indivíduo com F=1a, 1b ou 1c.

[0027] Em outra modalidade, o diagnóstico e detecção de fibrose de fígado significativa, ou de fibrose de fígado significativa potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo com fibrose de fígado mínima.

[0028] Em outra modalidade, o diagnóstico e detecção de fibrose de fígado moderada ou de fibrose de fígado moderada potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo com fibrose de fígado significativa.

[0029] Em outra modalidade, o diagnóstico e detecção de fibrose severa de fígado, ou de fibrose de fígado severa potencial, em um indivíduo tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo com fibrose de fígado moderada.

[0030] De acordo com um objeto adicional, a invenção se refere a um método para a classificação de um indivíduo como sendo receptor potencial (a ser tratado, ou TBT) ou não receptor (a não ser tratado, ou NTBT) de um tratamento para NAFLD, NASH ou fibrose de fígado, com base na detecção de um nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência de miR-452 medido em pacientes com NTBT, conforme definido abaixo.

[0031] Em uma modalidade adicional, a invenção também fornece um método para a determinação de nível de atividade de NAFLD, nível de atividade de NASH e/ou estágio de fibrose de fígado em um indivíduo, com base na determinação do nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal de um indivíduo.

[0032] Através de outro aspecto, a invenção também permite o prognóstico clínico de fibrose, que é o prognóstico do risco de evolução de fibrose de fígado para cirrose e outros resultados de fígado (como HCC e mortes relacionadas a fígado) de um paciente com NAFLD ou NASH com base no nível de miR-452 determinado em uma amostra de fluido corporal de um indivíduo.

[0033] A invenção também fornece um método para monitorar a evolução de nível de atividade de NAFLD, nível de atividade de NASH, e/ou estágio de fibrose de fígado em um indivíduo, com base na evolução do nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal do indivíduo em relação a um nível de referência de miR-452 de uma ou mais amostras de fluido corporal coletadas no mesmo indivíduo no passado. Nesse método, um aumento do nível de miR-452 indica que a atividade de doença e fibrose cresce enquanto uma redução do nível de miR-452 indica que a atividade de doença e fibrose declina.

[0034] A invenção fornece ainda um método para determinar a eficácia de um tratamento de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado em um indivíduo com base na evolução do nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal do indivíduo em relação a um nível de referência de miR-452 de uma ou mais amostras de fluido corporal coletadas no mesmo indivíduo no passado. Nesse método, um aumento do nível de miR-452 ou um nível estável de miR-452 indica que o tratamento não é eficaz, enquanto uma redução do nível de miR-452 indica que o tratamento é eficaz. Em outra modalidade desse método, um nível estável de miR-193 também pode indicar que o tratamento é eficaz na estabilização do estado de NASH, NAFLD ou fibrose de fígado do indivíduo, reduzindo, dessa maneira, o risco para o indivíduo evoluir em relação a resultados críticos, como cirrose, HCC ou mortes relacionadas a fígado.

[0035] A invenção fornece ainda um método para prever a resposta de um indivíduo (por exemplo, predição de alterações em NAFLD, atividade de NASH e estágio de fibrose de fígado) para um tratamento específico (indivíduo respondente) com base na detecção de um nível diferencial de miR-452 na amostra de fluido corporal em relação a um nível de referência medido em um indivíduo não respondente.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0036] Figura 1: Nível de soro de hsa-miR-452-5p em pacientes A Não Serem Tratados (NTBT) e A Serem Tratados (TBT) de GOLDEN-DIAG de acordo com três diferentes definições de pacientes TBT: TBT1, TBT2 e TBT7. NTBT1 n=83, TBT1 n=187; NTBT2 n=169, TBT2 n=101, NTBT7 n=119, TBT7 n=151. Os resultados foram expressos como Meio ± SEM. Significância estatística foi calculada com o uso de teste de Mann Whitney: ***, valor p < 0,001.

[0037] TBT1 = Esteatose, inflamação lobular e pontuação de balonamento de hepatócito ≥1, NAS≥4, F≥1

[0038] TBT2= Esteatose, inflamação lobular e pontuação de balonamento de hepatócito ≥1, NAS≥4, F≥2

[0039] TBT7= Esteatose, inflamação lobular e pontuação de balonamento de hepatócito ≥1, NAS≥4, F = 1b, 1c, 2, 3 ou 4

[0040] Figura 2: Nível de soro de hsa-miR-452-5p em pacientes NTBT2 e TBT2 (esquerda), em pacientes com NAS<4 (n=56) e NAS≥4 (n=214) (meio) e em pacientes com F<2 (n=145) e F≥2 (n=125) (direita) de GOLDEN-DIAG. Os resultados foram expressos como Meio ± SEM. Significância estatística foi calculada com o uso de teste de Mann Whitney: ***, valor p < 0,001.

[0041] Figura 3: Nível de soro de hsa-miR-452-5p em pacientes NTBT2 e TBT2 (esquerda), em pacientes com NAS<4 (n=121) e NAS≥4 (n=129) (meio) e em pacientes com F<2 (n=190) e F≥2 (n=59) (direita) de OBESO. Os resultados foram expressos como Meio ± SEM. Significância estatística foi calculada com o uso de teste de Mann Whitney: ***, valor p < 0,001.

[0042] Figura 4: Nível de soro de hsa-miR-452-5p em pacientes NTBT2 e TBT2 (esquerda), em pacientes com NAS<4 (n=50) e NAS≥4 (n=212) (meio) e em pacientes com F<2 (n=108) e F≥2 (n=154) (direita) de RESOLVE-IT. Os resultados foram expressos como Meio ± SEM. Significância estatística foi calculada com o uso de teste de Mann Whitney: ***, valor p < 0,001.

[0043] Figura 5: A correlação entre níveis de soro de hsa-miR-452-5p com NAS, estágio de Fibrose, Índice de Atividade, Pontuação de esteatose, pontuação de Balonamento de Hepatócito, Pontuação de inflamação lobular em pacientes de coorte GOLDEN-DIAG na inclusão. Os resultados foram expressos como Meio ± SEM. Significância estatística foi calculada com o uso de teste de Kruskal Wallis ANOVA seguido por teste de comparação múltipla de Dunn: *, valor p < 0,05; ** valor p < 0,005; ***, valor p < 0,001

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0044] Os inventores fornecem um novo método para o diagnóstico, monitoramento e classificação de risco de indivíduos que sofrem ou que sofrem potencialmente de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado.

[0045] A presente invenção tem como origem a análise muito precisa de biópsias de pacientes durante um teste clínico, para correlacionar a presença ou nível de marcadores biológicos de circulação e para classificar pacientes como a ser tratado ou a não ser tratado. Em particular, a presente invenção define de modo não limitante três classes de pacientes com NASH a serem tratados. Esses pacientes são classificados em relação à pontuação de características de NASH.

[0046] Os dados experimentais fornecidos no presente documento surpreendentemente identificam miR-452 como um biomarcador de circulação para NAFLD, NAFL, NASH e/ou fibrose de fígado a partir de duas coortes grandes independentes de pacientes, a saber, GOLDEN-DIAG (N=270 na inclusão; N=223 na semana-52) e coorte OBESO (N=253) com biópsia de fígado pontuada e amostras sangue, plasma e soro correspondentes. Os resultados foram validados em uma terceira coorte independente RESOLVE-IT (N=263).

[0047] A invenção será agora apresentada em maiores detalhes. Definições

[0048] De acordo com a presente invenção, os termos “NAFLD” ou “Doença de Fígado Gorduroso Não Alcoólico” se refere a uma condição na qual a gordura é depositada no fígado (esteatose-hepática), com ou sem sinais de inflamação e fibrose, na ausência de consumo excessivo de álcool.

[0049] De acordo com a invenção, os termos “nível de atividade de NAFLD” se referem a progressão de NAFLD e é definida por um aumento na pontuação de esteatose, conforme definido no presente documento. O nível de atividade de NAFLD também se refere a progressão de NAFLD em relação a NASH ou Fibrose e gravidade de NASH.

[0050] De acordo com a presente invenção, os termos “NAFL” ou “Fígado Gorduroso Não Alcoólico” se refere a uma condição na qual a gordura é depositada no fígado (esteatose-hepática), sem sinais de inflamação e fibrose, na ausência de consumo excessivo de álcool.

[0051] De acordo com a invenção, o termo “esteatose” se refere ao processo que descreve a retenção anormal de lipídios ou acúmulo de gordura dentro do fígado.

[0052] De acordo com a invenção, o termo “NASH” ou “Esteato-Hepatite Não Alcoólica” se refere a uma condição de NAFLD caracterizada pela presença concomitante de esteatose de fígado, balonamento de hepatócito e fígado inflamação na examinação histológica, (isto é, NAS≥3, com pelo menos 1 ponto em esteatose, pelo menos 1 ponto em inflamação lobular e pelo menos 1 ponto nas pontuações de balonamento de hepatócito) na ausência de consumo excessivo de álcool e após a exclusão de outras doenças hepáticas, como hepatite viral (HCV, HBV).

[0053] De acordo com a invenção, o termo “nível de atividade de NASH” se refere a progressão de NASH e é definido por um aumento na pontuação de NAS acima dos parâmetros mínimos para definir uma NASH, que são S=1, LI=1 e HB=1. O nível de atividade de NASH também se refere a progressão de NASH em relação a NASH irreversível e/ou fibrose e gravidade de NASH.

[0054] De acordo com a invenção, o termo “NASH Ativa” se refere a uma NASH caracterizada por uma NAS≥4, com pelo menos 1 ponto em pontuação de esteatose, pelo menos 1 ponto na pontuação de inflamação lobular e pelo menos 1 ponto nas pontuações de balonamento de hepatócito.

[0055] De acordo com a presente invenção, o termo “balonamento hepatocelular” é geralmente definido, no nível microscópico de luz, com base em tingimento de hemotoxilina e eosina (H&E), como ampliação celular 1,5 a 2 vezes o diâmetro normal de hepatócito, com citoplasma rareficado. O mesmo se refere mais geralmente ao processo de morte celular de hepatócito.

[0056] De acordo com a presente invenção, o termo “inflamação lobular” se refere à presença de focos inflamatórios lobulares (células inflamatórias agrupadas) em examinação microscópica de uma fatia manchada de hematoxilina e eosina (H&E) de uma biópsia de fígado.

[0057] De acordo com a presente invenção, a “pontuação de Atividade de NAFLD” ou “NAS” se refere à soma de esteatose, balonamento hepatocelular, pontuações de inflamação lobular, como a seguir: - S: Pontuação de esteatose: 0: <5 %; 1: 5-33 %; 2: 34- 66 % e 3: >66 %; - LI: Pontuação de inflamação lobular (focos/campo x20): 0: nenhum; 1: <2; 2: 2-4 e 3: >4; - HB: Pontuação de degeneração por balonamento: 0: nenhum; 1: alguns; 2: muitas células/balonamento proeminente.

[0058] De acordo com a presente invenção, o “índice de Atividade” se refere à soma de balonamento hepatocelular e pontuações de inflamação lobular.

[0059] De acordo com a presente invenção, o termo “fibrose” ou “fibrose de fígado” se refere à presença de tecido conector fibroso em examinação microscópica de uma fatia manchada (H&E, tingimento vermelho de tricoma ou picrosirius) de uma biópsia de fígado.

[0060] No contexto da presente invenção, o termo “estágio de fibrose” representa a localização e extensão de fibrose em exame histológico, como a seguir: Fibrose perissinusoidal ou periportal 1 Fibrose perissinusoidal branda (zona 3) 1a

Fibrose perissinusoidal moderada (zona 3) 1b Fibrose Portal/periportal 1c Fibrose perissinusoidal e portal/periportal 2 Fibrose de extrapolação 3 Cirrose 4

[0061] De modo alternativo, o estágio de fibrose pode ser denominado como a seguir no contexto da presente invenção: F=0: nenhuma fibrose F=1: fibrose mínima F=2: fibrose significativa F=3: fibrose moderada F=4: fibrose severa (isto é, cirrose)

[0062] De acordo com a presente invenção, "indivíduo A Ser Tratado" ou "indivíduo TBT" é um indivíduo cuja pontuação de atividade de doença (por exemplo, NAS ou Índice de Atividade) e/ou estágio de fibrose de fígado torna o indivíduo elegível para um tratamento para NAFLD, NAFL, NASH e/ou fibrose de fígado (como para NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado). Em oposição, um "indivíduo A Não Ser Tratado" ou "indivíduo NTBT" é um indivíduo cuja pontuação de atividade de doença (por exemplo, NAS ou Índice de Atividade) e/ou estágio de fibrose de fígado não é alta o suficiente para poder ter tratamento para NAFLD, NAFL, NASH e/ou fibrose de fígado (como for NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado). Portanto, um indivíduo TBT também é denominado "receptor" ou "receptor potencial" para um tratamento de NAFLD, NAFL, NASH e/ou fibrose de fígado (como para um tratamento de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado). Na presente invenção, indivíduos TBT preferenciais são: i) indivíduos com NASH, ii) indivíduos com NASH Ativa, iii) indivíduos com fibrose fígado significativa, moderada ou severa, iv) indivíduos com NASH e fibrose.

[0063] A definição abrange diversas pontuações de atividade de NASH e estágios de fibrose que definem diferentes variantes da invenção.

[0064] As variantes preferenciais da invenção são detalhadas como a seguir. Primeira variante de TBT (TBT2):

[0065] Um indivíduo TBT2 é definido como um indivíduo que apresenta as seguintes classificações derivadas de biópsia de fígado: - S ≥ 1 - HB ≥ 1 - LI ≥ 1 - NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 - estágio de fibrose ≥ 2 (como um estágio de fibrose igual a 2, 3 ou 4, em particular, 2 ou 3).

[0066] Por extensão, um indivíduo NTBT2 difere de um indivíduo TBT2 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose.

[0067] Por questões de clareza, um indivíduo NTBT2 pode ser, por exemplo, um indivíduo NASH que tem NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e um estágio de fibrose de 1 (como um estágio de fibrose 1a, 1b ou 1c), ou um NAS de 3 e um estágio de fibrose ≥ 2 (como um estágio de fibrose igual a 2, 3 ou 4), ou qualquer outra combinação de pontuações, conforme definido acima Segunda variante de TBT (TBT1):

[0068] Um indivíduo TBT1 é definido como um indivíduo que apresenta as seguintes classificações derivadas de biópsia de fígado: - S ≥ 1 - HB ≥ 1 - LI ≥ 1 - NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 - estágio de fibrose ≥ 1 (como um estágio de fibrose igual a 1, 2, 3 ou 4).

[0069] Por extensão, um indivíduo NTBT1 difere de um indivíduo TBT1 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose. Por questões de clareza, um indivíduo NTBT1 pode ser, por exemplo, um indivíduo NASH que tem 35 NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e um estágio de fibrose de 0, ou a NAS de 3 e um estágio de fibrose ≥ 1 (como um estágio de fibrose igual a 1a, 1b ou 1c, 2, 3 ou 4), ou qualquer outra combinação de pontuações conforme definido acima. Terceira variante de TBT (TBT7):

[0070] Um indivíduo TBT7 é definido como um indivíduo que apresenta as seguintes classificações derivadas de biópsia de fígado: - S ≥ 1 - HB ≥ 1 - LI ≥ 1

- NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 - estágio de fibrose = 1b, 1c, 2, 3 ou 4.

[0071] Por extensão, um indivíduo NTBT7 difere de um indivíduo TBT7 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose. Por questões de clareza, um indivíduo NTBT7 pode ser, por exemplo, um indivíduo NASH que tem um NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e um estágio de fibrose de 0 ou 1a, ou um NAS de 3 e um estágio de fibrose igual a 1b, 1c, 2, 3 ou 4, ou qualquer outra combinação de pontuações conforme definido acima.

[0072] Em uma modalidade particular, o microRNA miR-452 implementado na presente invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em hsa-miR-452-5p, hsa-miR-452-3p, cujas sequências estão disponíveis a partir do banco de dados de miRBase (http://mirbase.org) sob os números de Acessão de miRBase MIMAT0001635 (SEQ ID NO:1) e MIMAT0001636 (SEQ ID NO:2), respectivamente.

[0073] Em outra modalidade, o microRNA miR-452 implementado na presente invenção é uma forma de laço de ramificação de miR-452, também chamada HGNC:MIR452, cuja sequência está disponível a partir do banco de dados de miRBase (http://mirbase.org) sob o número de Acessão de miRBase MI0001733 (SEQ ID NO:3). SEQ ID NO:1:

AACUGUUUGCAGAGGAAACUGA SEQ ID NO:2:

CUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUG SEQ ID NO:3:

GCUAAGCACUUACAACUGUUUGCAGAGGAAACUGAGACUUUGUAACUAUGUCUC AGUCUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUGCUUUGC

[0074] Em uma modalidade particular, o microRNA mir-452 implementado na presente invenção é hsa-miR-452-5p. Amostras e preparação de amostra

[0075] De acordo com a presente invenção, o termo "amostra de fluido corporal" representa qualquer amostra de fluido corporal obtida de um indivíduo como sangue e fluidos derivados de sangue (como plasma e soro), fluido linfático, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, urina, saliva, muco, fleuma e esputo. Em uma modalidade particular, o fluido corporal é selecionado a partir de sangue e fluidos derivados de sangue (como plasma e soro), saliva, fluido cerebrospinal e urina. Em uma modalidade particular, a amostra de fluido corporal é um sangue ou fluido derivado de sangue (como plasma e soro), saliva, fluido cerebrospinal ou urina. Em uma modalidade particular adicional, o fluido corporal é sangue, plasma ou soro. Uma amostra de fluido corporal pode ser coletada por qualquer meio adequado. Os fluidos corporais adequados podem ser fluidos acelulares. Tais fluidos corporais acelulares são geralmente produzidos processando-se um fluido corporal que contém célula por, por exemplo, centrifugação ou 5 filtragem, para remover as células. Tipicamente, um fluido corporal acelular contém nenhuma célula intacta, no entanto, alguns podem conter fragmentos de célula ou detritos celulares. A amostra de fluido corporal pode ser usada imediatamente ou pode ser armazenada para uso posterior. Qualquer método de armazenamento adequado conhecido na técnica pode ser usado para armazenar a amostra de fluido corporal: por exemplo, a amostra pode ser congelada em cerca de -20 °C a cerca de -80 °C. Quantificação e isolamento de miRNA

[0076] RNA total que inclui miRNA pode ser purificado a partir de uma amostra por diversos métodos de extração que incluem ou: extração de fenol:clorfórmio seguida por precipitação de álcool (TRIzol), fenol:clorofórmio seguido por extração de fase sólida (baseada em coluna; por exemplo, miRVana e miRNeasy) e separação de fase sólida com/sem afinidade com partículas magnéticas de resina (Norgen total e Isolate II), ou métodos de lise direta. Na prática da presente invenção, miRNA foi extraído com kit de extração Paris de miRVana para análise subsequente de RTqPCR ou capturado com sondas específicas para análise adicional de Sequência de Borda de HTG.

[0077] A seguir, miRNAs são detectados em amostras clínicas com o uso de qualquer técnica disponível para aqueles versados na técnica, como métodos baseados em sequenciamento, baseados em amplificação ou baseados em hibridização. Abordagens comuns para testes clínicos de miRNA incluem small RNA sequencing (Hafner et al, 2012; Vigneault et al, 2012), HTG Edge Whole Transcriptome assay, a next-generation 25 sequencing-based miRNA profiling platform (Lizarraga et al, 2016; Satake et al, 2018), quantitative miRNA real-time reverse-transcription PCR (qRT-PCR) (Chen et al, 2005), miRNA microarray (Castoldi et al, 2007), multiplexed miRNA detection with color-coded probe pairs (NanoString n Counter expression system) (Geiss et al, 2008), droplet digital PCR (ddPCR) after reverse transcription (Miotto et al, 2014), and miRNA in situ hybridization 30 (Nelson et al, 2006). O nível do miR-193 pode ser determinado por metodologias convencionais bem conhecidas na técnica, como imunoensaios (por exemplo ELISA), ou ensaios de biologia molecular (RT-PCR quantitativo ou Sequenciamento de Próxima Geração) ou ensaios bioquímicos (ensaios colorimétricos ou outros). Em uma modalidade particular do método da presente invenção, miRNA são detectados por ensaios de transcriptoma completo de Borda de HTG ou sequenciamento de Borda de HTG 35, e RT- qPCR

[0078] Na prática da presente invenção, qualquer um dos métodos descritos acima pode compreender ainda normalizar o nível de miR-452 na amostra de fluido corporal do indivíduo e na referência para o nível ou um microRNA cujo nível não varia em indivíduos com NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado em relação a pacientes saudáveis. Para reduzir fonte potencial de variabilidade técnica, um RNA spike-in ou micro-RNA sintético exógeno de sequência e quantidade conhecidas, como C. elegans miR-39, pode ser adicionado à amostra antes da extração de RNA. O RNA spike- in ou micro- RNA sintético exógeno pode ser um miRNA que não é expresso em amostras de seres humanos, como Caenorhabditis elegans cel-miR-38 ou Arabidopsis thaliana ath-miR-159a. Esse micro-RNA sintético pode ser adicionado após a adição do tampão de lise em amostras derivadas de sangue antes da extração de RNA e fornece um controle de processo para normalização técnica. A eficácia de extração de RNA, síntese de DNA complementar e amplificação de PCR podem ser, portanto, monitoradas com o uso desses micro-RNAs sintético exógenos.

[0079] Um normalizador de micro-RNA ou controles de RNA de não codificação pequena para a normalização de dados de qPCR, que representam controles endógenos que são afetados pelas mesmas fontes de variabilidade como os genes alvo, durante todas as etapas da tubulação experimental, podem ser usados para normalizar o nível do miRNA alvo, miR-452.

[0080] Um protocolo padrão para medir miR-452 por RT-PCR quantitativo é fornecido. Brevemente, as medições são realizadas a partir de RNA total extraído de uma amostra de fluido corporal como amostra de sangue, plasma ou soro, em particular, uma amostra de plasma livre de plaquetas derivadas de citrato, livre de células. Um controle interno apropriado (como um micro-RNA de sequência e quantidade conhecidas, por exemplo, C. elegans miR-39) pode ser adicionado à amostra antes da extração de RNA. Os valores de Cq são determinados com o uso de RT-PCR quantitativo. Kits comerciais estão disponíveis para conduzir tais ensaios. Por exemplo, o ensaio de RT-qPCR de miRNA Taqman: Kit de transcrição reversa de MicroRNA Taqman, Ensaio de MicroRNA Taqman 20X, e TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems) podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante. Transcrição reversa pode ser realizada com o uso de sistemas de PCR prontamente disponíveis, como o ciclador térmico de Sistema de PCR GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems), com parâmetros de ciclização apropriados como 16 °C por 30 minutos seguido por 42 °C por 30 minutos e 85 °C por 5 30 minutos antes de manter a 4 °C. A transcrição reversa pode ser implementada no formato multiplexado. PCR Quantitativo é, então, conduzido com o uso de um sistema de PCR quantitativo como o Sistema em Tempo Real CFX96TM (C1000 TouchTM Thermal Cycler, BioRad). De preferência, PCR quantitativo é conduzido com o uso de um Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real CFX96 - C1000 - Diagnóstico In Vitro (IVD) certificado, Bio-Rad.

Condições de ciclagem podem ser as 35 seguintes: 95 °C por 10 minutos seguido por 95 °C por 15 s e 60 °C por 60 s para um total de 50 ciclos e, então, 30 °C por 30 s.

Modo de determinação de Cq pode ser, por exemplo, o modo de Regressão no sistema de PCR quantitativo.

Em uma modalidade particular, o valor de Cq determinado de acordo com o método da invenção é o valor de Cq que é obtenível com o uso dos parâmetros e material específicos acima.

Os valores de Cq de amostras podem ser excluídos da análise se valores estivem acima do Cq máximo da curva padrão de cada miRNA.

A curva padrão pode ser usada para avaliar a eficácia de reação de PCR.

As diluições em série podem ser realizadas em oito pontos, começando da amostra de cDNA mais concentrada, para garantir que a curva padrão cobre todas as concentrações potenciais de modelo que podem ser encontradas durante o estudo.

A curva padrão pode ser construída por plotagem do registro da quantidade de partida do modelo em relação aos valores de Cq obtidos.

Para obter dados quantitativos absolutos, miRNAs sintéticos (por exemplo, de Integrated DNA Technologies, 5’Fosfato, 3’OH, HPLC purificado) diluídos, por exemplo, a 3,125 fmol/ml e 5 µl, podem ser usados para transcrição reversa de modo concorrente com RNA extraído das amostras de soro.

O produto pode, então, ser diluído em série e PCR pode ser realizado e todas as amostras (RNA padrão ou derivado de soro). Curva padrão pode ser realizada em simplicata,

duplicata ou triplicata e usada para converter dados de Cq em cópias/µl de fluido.

[0081] De modo alternativo, o método de Ct delta (limiar de Ciclo) ou Cq delta (quantificação de Ciclo) pode ser usado para estimar o nível de miR-452. Ct delta ou Cq delta corresponde à diferença entre o Ct ou o Cq do alvo em uma amostra testada de paciente e o Ct ou o Cq do alvo em uma amostra de referência (isto é, indivíduos saudáveis, amostra de referência.)

[0082] De modo alternativo, o nível do miR-452 pode ser determinado por RT-qPCR com o uso de reação de transcrição reversa de ciclo de haste (RT) combinada com qPCR de TaqMan, ou com uma RT poli(A) personalizada combinada com iniciadores de detecção de SYBR Green e Ácido Nucleico Bloqueado (LNA). Métodos da invenção

[0083] Em todos os aspectos, modalidades e variantes a seguir, uma modalidade preferencial se refere à determinação do nível de hsa-miR-452 em uma amostra de sangue, soro ou plasma. Uma variante preferencial desse aspecto se refere à determinação do nível de hsa-miR-452- 5p.

[0084] A presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NAFLD em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0085] A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NAFLD potencial em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, NAFLD ou NAFLD potencial é detectada com base em nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência medido em uma amostra de um indivíduo com nenhuma esteatose-hepática.

Em uma modalidade particular adicional, o diagnóstico ou detecção de NAFLD ou NAFLD potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 em uma amostra de fluido corporal em relação a níveis geralmente medidos em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática.

Em uma modalidade particular, o método compreende ainda uma etapa de confirmar que o indivíduo sofre de NAFLD.

Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por ultrassom ou técnicas de imageamento (como ultrassonografia, medição de parâmetro de atenuação controlada por elastografia transitória (Fibroscan), Imageamento por Ressonância Magnética (MRI), fração de gordura de densidade de próton estimada por MRI (MRI-DPFF), e a fração de gordura de densidade de espectroscopia de ressonância magnética (MRS-DPFF)). De modo alternativo, diversos índices e pontuações podem avaliar esteatose- hepática, incluindo, sem limitação: - o índice de fígado gorduroso (FLI) que compreende BMI, circunferência de cintura e níveis de soro de triglicerídeos e gama glutaril transferase (GGT), -o índice de esteatose-hepática (HIS) que inclui aspartato aminotransferase de soro (AST): razão de alanina aminotransferase (ALT), BMI, gênero e presença de diabetes mellitus,

-a pontuação de gordura no fígado NAFLD (síndrome metabólica, diabetes tipo 2, insulina no soro em jejum e AST, razão de AST:ALT, -o teste de esteato (alfa 2 Macroglobulina (A2M), Haptoglobina, apolipoproteína A1, Bilirubina Total, GGT, glicose no sangue em jejum e ajuste para idade, sexo, peso e altura), e -a pontuação de crista de NAFLD (ALT, colesterol, triglicerídeos, hemoglobina glicolisada A1c (HbA1c) e contagem de leucócitos) e dados de comorbidade (hipertensão).

[0086] Em uma modalidade particular, marcadores genéticos e genômicos podem avaliar riscos de NAFLD e gravidade (Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs):rs738409 (SNP in PNPLA3), RNAs de não codificação livres de célula, miR-122, painel de compósito de dados ômicos derivados de soro).

[0087] A presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NAFL em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0088] A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NAFL potencial em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, NAFL ou NAFL potencial é detectada com base em nível aumentado de miR-452 na amostra de fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência medido em uma amostra de um indivíduo com nenhuma esteatose-hepática. Em uma modalidade particular adicional,

o diagnóstico ou detecção de NAFL ou NAFL potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 em uma amostra de fluido corporal em relação a níveis geralmente medidos em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática.

Em uma modalidade particular, o método compreende ainda uma etapa de confirmar que o indivíduo sofre de NAFL.

Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por ultrassom ou técnicas de imageamento (como ultrassonografia, medição de parâmetro de atenuação controlada por elastografia transitória (Fibroscan), Imageamento por Ressonância Magnética (MRI), fração de gordura de densidade de próton estimada por MRI (MRI-DPFF), e a fração de gordura de densidade de espectroscopia de ressonância magnética (MRS-DPFF)). De modo alternativo, diversos índices e pontuações podem avaliar esteatose- hepática, incluindo, sem limitação: - o índice de fígado gorduroso (FLI) que compreende BMI, circunferência de cintura e níveis de soro de triglicerídeos e gama glutaril transferase (GGT), -o índice de esteatose-hepática (HIS) que inclui aspartato aminotransferase de soro (AST): razão de alanina aminotransferase (ALT), BMI, gênero e presença de diabetes mellitus, -a pontuação de gordura no fígado NAFLD (síndrome metabólica, diabetes tipo 2, insulina no soro em jejum e AST, razão de AST:ALT, -o teste de esteato (alfa 2 Macroglobulina (A2M), Haptoglobina, apolipoproteína A1, Bilirubina Total, GGT,

glicose no sangue em jejum e ajuste para idade, sexo, peso e altura), e -a pontuação de crista de NAFLD (ALT, colesterol, triglicerídeos, hemoglobina glicolisada A1c (HbA1c) e contagem de leucócitos) e dados de comorbidade (hipertensão).

[0089] Em uma modalidade particular, marcadores genéticos e genômicos podem avaliar riscos de NAFLD e gravidade (Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs):rs738409 (SNP in PNPLA3), RNAs de não codificação livres de célula, miR-122, painel de compósito de dados ômicos derivados de soro).

[0090] A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NASH em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma NASH potencial em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, o diagnóstico ou detecção de NASH ou de NASH potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 no fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência de miR-452 medido em um indivíduo saudável, em um indivíduo com NAS<3 ou em um indivíduo com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0. Em uma modalidade particular, a amostra de referência é de um indivíduo com uma NAS<3 com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0, como um indivíduo com as seguintes pontuações: S=1, LI=1 e HB=0; S=1, LI=0 e HB=1; S=0, LI=1 e

HB=1. Em uma modalidade particular, o diagnóstico ou detecção de NASH ou NASH potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de hsa-miR-452, particularmente de hsa-miR-452-5p, e hsa-miR-452-3p, no sangue, soro ou plasma em relação a níveis de referência medidos em indivíduos não NASH que inclui indivíduos saudáveis, indivíduos com NAS<3 ou indivíduos com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0. Em uma modalidade particular, o método compreende ainda uma etapa de confirmar que o indivíduo sofre de NASH.

Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por biomarcadores de imageamento medidos por técnicas de imageamento como técnicas baseadas em MRI, ácido gadoxético usado com MRI, MRI de óxido de ferro super paramagnético, P-MRS e MRE.

De modo alternativo, diversos índices e pontuações de nível de ATP Intracelular com o uso de 32P- MRS e MRE.

De modo alternativo, diversos índices e pontuações podem avaliar biomarcadores de NASH em potencial, que inclui, sem limitação: -marcadores de apoptose (fragmento de CK18, citoqueratina total, níveis de soro de antígeno de superfície mediado por apoptose FAS), -marcadores inflamatórios (proteína reativa a C (CRP), TNF, IL-8, ligante de quimiocina CXC 10 (CXCL10)), produtos de oxidação de lipídio ( ácido 11- hidoxieicosatetraenoico (HETE), ácido 9-hidroxidecadienoico (HODE), 13-HODE, ácido 13-oxo-octadecadienoico (ODE), LA- 13-HODE (pontuação de oxNASH), ácido 11,12-di-hidroxi- eicosatrienoico (diHETrE)), -adipocitocinas e hormônios

(adiponectina, leptina, resistina, visfatina, proteína de ligação de retinol (RBP)4, proteína de ligação de ácido graxo (FABP)4, fator de crescimento de fibroblasto (FGF21)), -enzimas lisossomais (catepsina D), e -painéis combinados (teste de NASH, painel de diagnóstico de NASH).

[0091] A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de NASH Ativa em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma Ativa NASH Ativa potencial em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR- 452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, o diagnóstico ou detecção de NASH Ativa ou de NASH Ativa potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 no fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência de miR-452 medido em um indivíduo saudável, em um indivíduo com NAS<4 ou em um indivíduo com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0. Em uma modalidade particular, a amostra de referência é de um indivíduo com uma NAS=3, com S=1, LI=1 e HB=1. Em uma modalidade particular, o diagnóstico ou detecção de NASH Ativa ou NASH Ativa potencial tem como base a detecção de um nível de expressão elevado de hsa-miR-452, particularmente de hsa-miR-452-5p, e hsa-miR-452-3p, em amostras de sangue, soro ou plasma de um indivíduo comparado a níveis de referência medidos em indivíduos saudáveis, indivíduos com NAS<4 ou indivíduos com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0. Em uma modalidade particular, o método compreende ainda uma etapa de confirmar que o indivíduo sofre de NASH Ativa. Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por técnicas de imageamento como técnicas baseadas em MRI, MRI de óxido de ferro super paramagnético, MRI, MRS e MRE multiparamétricos. De modo alternativo, diversos índices e pontuações podem avaliar biomarcadores de NASH em potencial, que inclui, sem limitação: -marcadores de apoptose (fragmento de CK18, citoqueratina total, níveis de soro de antígeno de superfície mediado por apoptose FAS), -marcadores inflamatórios (proteína reativa a C (CRP), TNF, IL-8, ligante de quimiocina CXC 10 (CXCL10)), produtos de oxidação de lipídio ( ácido 11- hidoxieicosatetraenoico (HETE), ácido 9-hidroxidecadienoico (HODE), 13-HODE, ácido 13-oxo-octadecadienoico (ODE), LA- 13-HODE (pontuação de oxNASH), ácido 11,12-di-hidroxi- eicosatrienoico (diHETrE)), -adipocitocinas e hormônios (adiponectina, leptina, resistina, visfatina, proteína de ligação de retinol (RBP)4, proteína de ligação de ácido graxo (FABP)4, fator de crescimento de fibroblasto (FGF21)), -enzimas lisossomais (catepsina D), e -painéis combinados (teste de NASH, painel de diagnóstico de NASH).

[0092] Tal confirmação pode ser implementada medindo-se riscos de NAFLD (progressão e relação a NASH ou Fibrose) e marcadores de gravidade como marcadores genéticos e genômicos como SNPs 20 (rs738409 em PNPLA3), RNAs de não codificação livres de célula (miR-122, miR-1290, miR-192 e miR7b), painel de compósito de dados ômicos derivados de soro como rs738409 e dados proteômicos que incluem ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 e SERPINC1, SNPs em múltiplos loci (PNPLA3, SOD2, KLF6 e LPIN1), miR-122, painel de compósito que inclui miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, DNA livre de célula como PPARG metilado de circulação.

[0093] A presente invenção também se refere a um método para caracterizar a ocorrência ou classificação de fígado inflamação lobular em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0094] A presente invenção também se refere a um método para caracterizar a ocorrência ou classificação de balonamento de hepatócito em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0095] A presente invenção também se refere a um método para caracterizar a ocorrência ou classificação de esteatose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0096] A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR- 452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. A presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou detecção de uma fibrose de fígado potencial em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-

452 em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

Em uma modalidade particular, a fibrose é, no mínimo, uma fibrose significativa (isto é, F≥2). Em uma variante dessa modalidade, o diagnóstico ou detecção de fibrose de fígado ou de fibrose de fígado potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 no fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência de miR-452 medido em um indivíduo com nenhuma fibrose ou fibrose mínima, em particular, com fibrose mínima.

Em uma modalidade particular adicional, a fibrose é, no mínimo, uma fibrose de fígado moderada ou cirrose (isto é, F≥3). Em uma variante dessa modalidade, o diagnóstico ou detecção de fibrose de fígado ou de fibrose de fígado potencial tem como base a detecção de um nível aumentado de miR-452 no fluido corporal do indivíduo, em relação a um nível de referência de miR-452 medido em um indivíduo com nenhuma fibrose, com fibrose mínima, ou com fibrose severa, em particular, com fibrose severa.

Em uma modalidade particular, o método compreende ainda uma etapa de confirmar que o indivíduo sofre de fibrose de fígado, ou confirmar o estágio de fibrose de fígado.

Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por biomarcadores de imageamento, incluindo, sem limitação: -FibroScan (elastografia transitória), -eletrografia de onda de cisalhamento de ponto pSWE, impulso de força de radiação acústica (ARFI) -eletrografia de onda de cisalhamento 2D 3D 2D-3D SWE, -eletrografia de ressonância magnética MRE,

-MRI multiparamétrica.

[0097] De modo alternativo, diversos testes não invasivos de fibrose de fígado e cirrose: -a razão de AST:ALT e o índice de razão de AST:plaqueta (APRI), -o índice de fibrose-4 (FIB-4) que compreende idade, AST, ALT, e contagem de plaqueta -a pontuação de fibrose de NAFLD (idade, BMI, glicose em jejum deficiente e/ou diabetes, AST, ALT, contagem de plaqueta, e albumina), -o núcleo de BARD (AST, ALT, BMI, e diabetes).

[0098] Em outra modalidade, marcadores específicos de fibrose de fígado e painel podem avaliar fibrose de fígado: -marcadores específicos de fibrose: ácido hialurônico, pró-peptídeo de terminal N de colágeno tipo III (PIIINP), ensaio de imunoabsorvente ligado à enzima competitiva específica de neo epítopo para PIIINP (PRO-C3), Metaloproteinase Inibidora de Tecido 1 (TIMP-1), Laminina. -painéis específicos de fibrose: Fibrose de Fígado Aperfeiçoada (ELF) que inclui PIIINP, ácido hialurônico, e TIMP-1; Fibroteste (gama glutamil transferase (GGT), bilirubina total, alfa 2 macroglobulina (A2M), apolipoproteína A1 e haptoglobulina; FibroMeter NAFLD (peso corporal, índice de protrombina, ALT, AST, ferritina e glicose em jejum).

[0099] A presente invenção também se refere a um método para a determinação de estágio de fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de miR-452 (como hsa-miR-452), em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0100] Em uma modalidade particular, um estágio F=4 pode ser determinado se o nível de miR-452 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-452 em uma amostra de referência de um indivíduo com um estágio de fibrose F≤4, como com F=0, F=1, F=2 ou F=3. Em uma variante particular, a amostra de referência é de um indivíduo com F=3.

[0101] Em uma modalidade particular, um estágio F=3 pode ser determinado se o nível de miR-452 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-452 em uma amostra de referência de um indivíduo com um estágio de fibrose F≤3, como com F=0, F=1 ou F=2. Em uma variante particular, a amostra de referência é de um indivíduo com F=2.

[0102] Em uma modalidade particular, um estágio F=2 pode ser determinado se o nível de miR-452 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-193 em uma amostra de referência de um indivíduo com um estágio de fibrose F≤2, como com F=0 ou F=1. Em uma variante particular, a amostra de referência é de um indivíduo com F=1.

[0103] Em uma modalidade particular, um estágio F=1 pode ser determinado se o nível de miR-452 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-452 em uma amostra de referência de um indivíduo com um estágio de fibrose F≤1, como com F=0.

[0104] Em uma modalidade particular, o método é para o diagnóstico e detecção de significativa para fibrose severa (F≥2) e de fibrose de fígado avançada (F≥3) em um indivíduo com NAFLD ou NASH, com base na detecção de um nível de expressão elevado de hsa-miR-452, particularmente de hsa- miR-452-5p e hsa-miR-452-3p, em amostras de sangue, soro ou plasma de um indivíduo comparado a níveis de referência medidos em pacientes com nenhuma fibrose e/ou fibrose mínima (F=0-1).

[0105] Em uma modalidade particular, o método para determinar o estágio de fibrose de fígado compreende ainda uma etapa de confirmar o estágio de fibrose de fígado no indivíduo. Tal confirmação pode ser implementada de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, como pela realização de uma biópsia de fígado ou por outros meios como biomarcadores de imageamento listados acima para o diagnóstico de fibrose.

[0106] Uma vez que a fibrose de fígado é uma consequência comum de maior parte das doenças hepáticas crônicas, a presente invenção também se refere a diagnóstico e detecção de significativa ou fibrose de fígado avançada devido a outras doenças hepáticas fibróticas, como: hepatite viral (HBV, HCV,..), esteato- hepatite alcoólica, doenças biliares (colangite biliar primária, colangite de esclerose primária, hepatite autoimune, doença de Wilson, deficiência de antitripsina Alfa 1).

[0107] A presente invenção também se refere a um método para classificar um indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NAFLD. Em outra modalidade particular, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NASH. Em uma modalidade adicional, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para fibrose de fígado.

[0108] A presente invenção também se refere a um método para classificar um indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NAFL, que compreende determinar o nível de miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NAFL. Em outra modalidade particular, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para NAFL. Em uma modalidade adicional, o método é para classificar o indivíduo como um receptor potencial ou não receptor para tratamento para fibrose de fígado.

[0109] A presente invenção, mais particularmente, se refere a um método para classificar um indivíduo como um receptor potencial (TBT) ou não receptor (NTBT) de um tratamento para NASH e/ou fibrose, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0110] Em uma modalidade particular, um indivíduo é classificado como um indivíduo TBT2 se o nível de miR-193 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-193 em uma amostra de referência de um indivíduo NTBT2. Em uma variante específica, o indivíduo NTBT2 é um indivíduo com uma NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e F=1

(por exemplo, um estágio de fibrose 1a, 1b ou 1c).

[0111] Em uma modalidade particular, um indivíduo é classificado como um indivíduo TBT1 se o nível de miR-193 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-193 em uma amostra de referência de um indivíduo NTBT1. Em uma variante específica, o indivíduo NTBT1 é um indivíduo com uma NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e F=0.

[0112] Em uma modalidade particular, um indivíduo é classificado como um indivíduo TBT7 se o nível de miR-193 na amostra de fluido corporal do dito indivíduo for maior que o nível de miR-193 em uma amostra de referência de um indivíduo NTBT7. Em uma variante específica, o indivíduo NTBT7 é um indivíduo com uma NAS=4, S≥1, LI≥1, HB≥1 e F=1a.

[0113] Em uma modalidade particular, o método da invenção é para classificar um indivíduo como um indivíduo TBT2.

[0114] Outras variantes da invenção se referem a um método para classificar pacientes como sendo receptor potencial (TBT) ou não receptor (NTBT) de um tratamento para NASH e/ou fibrose, com base na detecção de um nível de expressão elevado de hsa-miR-452, particularmente de hsa- miR-452-5p e hsa-miR-452-3p, em sangue, soro ou plasma comparado a níveis de referência de hsa-miR-452 medidos em pacientes com NTBT.

[0115] Tal classificação também pode ser a base para determinar se um indivíduo deve ser submetido a investigações adicionais no fígado, como investigações no fígado do estado da técnica antes tomar a decisão de tratar, como ultrassom, elastografia, técnicas de imageamento que incluem MRI, ou biópsia de fígado.

[0116] A definição de paciente TBT ou receptor vs NTBT ou não receptor pode variar dependendo da eficácia de fármaco para segurança de fármaco com valores variados de atividade de doença (NAS ou índice de atividade) e valor variado de estágio de fibrose, como fornecido acima.

[0117] A presente invenção também se refere a um método para a determinação de uma NAFLD ou atividade de NASH em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR- 452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0118] A invenção também se refere a um método para o prognóstico do risco de NAFLD ou evolução de atividade de NASH na ausência de um tratamento em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0119] A presente invenção também se refere a um método para a determinação de estágio de fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR- 452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0120] A invenção também se refere a um método para o prognóstico do risco de evolução de fibrose para cirrose e resultados clínicos de fígado na ausência de tratamento em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR- 452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo. Em uma modalidade particular, o método é para o prognóstico do risco evolução de fibrose para cirrose e resultados clínicos de fígado na ausência de um tratamento.

[0121] A invenção também se refere a um método para monitorar a evolução (isto é, progressão ou regressão) de NAFLD ou atividade de NASH em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0122] A invenção também se refere a um método para monitorar a evolução (isto é, progressão ou regressão) de fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0123] A invenção também se refere a um método para prever a resposta de um paciente a um tratamento específico de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo

[0124] A invenção também se refere a um método para prever a resposta de um paciente a um tratamento específico de NAFL em um indivíduo, que compreende determinar o nível de hsa-miR-452, em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

[0125] Desse modo, a invenção se refere a um método para o diagnóstico e detecção de NAFLD em um indivíduo, com base na detecção de um nível aumentado de miR-452 em uma amostra de fluido corporal em relação a níveis geralmente medidos em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática.

[0126] Desse modo, a invenção se refere a um método para o diagnóstico e detecção de NAFL em um indivíduo, com base na detecção de um nível aumentado de miR-452 em uma amostra de fluido corporal em relação a níveis geralmente medidos em indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática, nenhum balonamento hepático e nenhuma inflamação lobular.

[0127] De acordo com uma primeira variante, a invenção se refere a um método para o diagnóstico e detecção de NASH em um indivíduo, com base na detecção de um nível aumentado de expressão de hsa-miR-452, particularmente de hsa-miR- 452-5p e hsa-miR-452-3p, em sangue, soro ou plasma em relação a níveis de referência medidos em indivíduos não NASH, incluindo indivíduo saudável, indivíduos com NAS<3 ou indivíduos com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0.

[0128] De acordo com uma segunda variante, a invenção se refere a um método para o diagnóstico e detecção de NASH Ativa em um indivíduo, com base na detecção de um nível de expressão elevado de hsa-miR-452, particularmente de hsa- miR-452-5p e hsa-miR-452-3p, em amostras de sangue, soro ou plasma de um indivíduo comparado a níveis de referência medidos em indivíduos saudáveis, indivíduos com NAS<4 ou indivíduos com pelo menos um componente de NAS pontuado como 0.

[0129] De acordo com uma variante adicional, um método para caracterizar a ocorrência e classificação de esteatose no indivíduo, com base na detecção de nível de hsa-miR-452 e particularmente de hsa-miR-452-5p, e hsa-miR-452-3p em uma amostra de sangue, soro ou plasma de um indivíduo.

[0130] De acordo com uma variante adicional, um método para caracterizar a ocorrência e classificação de balonamento hepatocelular no indivíduo, com base na detecção de nível de hsa-miR-452 e particularmente de hsa- miR-452-5p, e hsa-miR-452-3p em uma amostra de sangue, soro ou plasma de um indivíduo.

[0131] De acordo com a variante adicional, a invenção se refere a um método para caracterizar a ocorrência e classificação de inflamação lobular no indivíduo, com base na detecção de nível de hsa-miR-452 e particularmente de hsa-miR-452-5p e hsa-miR-452-3p em uma amostra de sangue, soro ou plasma de um indivíduo.

[0132] Na prática da presente invenção, concentrações de corte de miR-452 podem ser calculadas para ajudar a tomar a decisão pela pessoa que implanta os métodos da presente invenção. A expressão "concentração de corte", como usado no presente documento, se refere a uma concentração de miR- 193 acima em que uma predição estatística de um sintoma ou doença é realizada, e abaixo em que uma predição estatística de uma ausência de uma doença ou sintoma é realizada. Tais concentrações de corte podem ser determinadas como a seguir para diferentes cenários.

[0133] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo com uma NAFLD (ou NAFLD potencial) ou como um indivíduo saudável sem uma NAFLD, S=0, pode ser determinada ao: i) medir a concentração de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos que incluem tanto indivíduos com uma NAFLD quanto indivíduos saudáveis sem NAFLD, ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte.

[0134] Em particular, o método estatístico do estado da técnica ROC (Características de Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar NAFLD e indivíduos saudáveis em coortes de referência.

[0135] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo com uma NAFL (ou NAFL potencial) ou como um indivíduo saudável sem uma NAFL, S=0, pode ser determinada ao: i) medir a concentração de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos que incluem tanto indivíduos com uma NAFL quanto indivíduos saudáveis sem NAFL, ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte.

[0136] Em particular, o método estatístico do estado da técnica ROC (Características de Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar NAFL e indivíduos saudáveis em coortes de referência.

[0137] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo com NASH (ou NASH potencial) ou como um indivíduo sem NASH pode ser determinada ao: i) medir concentrações de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos, incluindo tanto indivíduos com NASH quanto indivíduos sem NASH, ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte.

[0138] Em particular, o método estatístico do estado da técnica ROC (Características de Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar indivíduos com NASH (ou NASH potencial) e indivíduo sem NASH em coortes de referência.

[0139] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo com uma NASH Ativa (ou NASH Ativa potencial) ou como um indivíduo sem um NASH Ativa pode ser determinada ao: i) medir concentrações de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos, incluindo tanto indivíduos com NASH Ativa quanto indivíduos sem NASH Ativa, ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte. Em particular, o método estatístico do estado da técnica ROC (Características de Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar paciente com NASH Ativa (ou NASH Ativa potencial) e indivíduos sem NASH Ativa em coortes de referência.

[0140] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo com fibrose de fígado significativa (F≥2) (ou fibrose de fígado significativa potencial) ou como um indivíduo com nenhuma fibrose ou fibrose mínima pode ser determinada ao: i) medir concentrações de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos, incluindo tanto indivíduos com significativa para fibrose severa de fígado (F≥2) ou fibrose de fígado avançada (F≥3) quanto indivíduos com nenhuma fibrose ou fibrose mínima (F=0-1), ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte. Em particular, o método estatístico do estado da técnica ROC (Características de

Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar indivíduos com fibrose de fígado significativa (F≥2) ou fibrose de fígado avançada (F≥3) e indivíduos com nenhuma fibrose ou fibrose mínima (F=0-1) em coortes de referência.

[0141] Uma concentração de corte para classificar um indivíduo como um indivíduo TBT ou como um indivíduo NTBT pode ser determinada ao: i) medir concentrações de miR-452 em amostras de fluido corporal de coortes de referência de indivíduos, incluindo tanto indivíduos TBT quanto indivíduos com NTBT, ii) aplicar uma análise estatística dedicada ao conjunto de dados de referência para determinar uma concentração ideal de corte. Em particular, o método estatístico do estado da técnica, ROC (Características de Operação de Receptor) pode ser usado para calcular a concentração ideal de corte para discriminar indivíduos TBT e NTBT em coortes de referência.

[0142] Os dados apresentados no presente documento mostram que miR-452 é um biomarcador de diagnóstico de circulação para classificação não invasiva de lesões histológicas (esteatose, inflamação lobular, balonamento de hepatócito), avaliação de nível de atividade de NAFLD, nível de atividade de NASH e avaliação de fibrose de fígado gravidade em um indivíduo.

[0143] De acordo com outra variante da presente invenção, é fornecido um método para prognóstico o risco de NAFLD ou evolução de atividade de NASH em um indivíduo na ausência de um tratamento, com base no nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal de um indivíduo.

[0144] Outra variante da invenção se refere a um método para prognóstico do risco de evolução de fibrose para cirrose e resultados de fígado de um paciente com NAFLD ou NASH com base no nível de miR-452, medido em uma amostra de fluido corporal de um indivíduo. A presente invenção também é dedicada ao prognóstico do risco de evolução de fibrose em pacientes que sofrem de outras doenças hepáticas fibróticas, como: hepatite viral (HBV, HCV,..), esteato- hepatite alcoólica, doenças biliares (colangite biliar primária, colangite de esclerose primária, hepatite autoimune, doença de Wilson, deficiência de antitripsina Alfa 1).

[0145] Os inventores também mostraram que há uma correlação entre alterações em níveis de circulação de miR- 452 e evolução de pontuações histológicas, a saber, evolução do Índice de Atividade, NAS e estágio de fibrose. Essas análises suportam o uso de miR-452 em um método para monitorar evoluções histológicas em um indivíduo se o indivíduo for tratado ou não com um fármaco anti-NAFLD, anti-NASH ou fármaco anti-fibrótico. Ademais, o método da invenção pode ser usado para avaliar a atividade de anti- NAFLD, anti-NASH e/ou anti-fibrótico de um fármaco em testes intervencionais que assumem alterações em nível de soro miR-452 como substituições de evoluções histológicas.

[0146] Desse modo, outra variante da invenção se refere a um método para monitorar a evolução (isto é, progressão ou regressão) de atividade de NAFLD ou de NASH com base na evolução do nível de miR-452 em amostras de fluido corporal coletadas duas ou mais vezes separadamente do mesmo indivíduo.

[0147] Outra variante da invenção se refere a um método para monitorar a evolução (isto é, progressão ou regressão) de estágio de fibrose de fígado com base na evolução do nível de miR-452 em amostras de fluido corporal coletadas duas ou mais vezes separadamente de um mesmo indivíduo.

[0148] A presente invenção também é dedicada à determinação de estágio de evolução de fibrose em outras doenças hepáticas fibróticas, como: hepatite viral (HBV, HCV,..), esteato-hepatite alcoólica, doenças biliares (colangite biliar primária, colangite de esclerose primária, hepatite autoimune, doença de Wilson, deficiência de antitripsina Alfa 1).

[0149] Outra variante da invenção se refere a um método para prever a resposta de um indivíduo (predição de alterações em atividade de NAFLD, atividade de NASH e estágio de fibrose de fígado) a um tratamento específico (indivíduo respondente) com base na detecção de um nível de expressão diferencial de miR-452 em uma amostra de fluido corporal do indivíduo comparado a níveis de referência medidos em indivíduos não responsivos.

[0150] Desse modo, de acordo com a presente invenção, métodos são fornecidos para: - caracterizar a ocorrência de NAFLD em um indivíduo, - caracterizar a ocorrência de NAFL em um indivíduo, - caracterizar a ocorrência de NASH em um indivíduo, - caracterizar a ocorrência de fibrose de fígado em um indivíduo, - caracterizar a ocorrência de balonamento hepatocelular em um indivíduo, - caracterizar a ocorrência de inflamação lobular em um indivíduo, ou - caracterizar a ocorrência de esteatose de fígado em um indivíduo.

[0151] Ademais, de acordo com a presente invenção, métodos são fornecidos para: - diagnosticar o indivíduo como tendo NAFLD e/ou uma NAFLD mais avançada, - diagnosticar o indivíduo como tendo NAFL e/ou NAFL mais avançada, - diagnosticar o indivíduo como tendo NASH e/ou uma NASH mais avançada, - diagnosticar o indivíduo como tendo fibrose de fígado e/ou um estágio mais avançado de fibrose de fígado, - diagnosticar o indivíduo como tendo balonamento hepatocelular e/ou uma pontuação de balonamento hepatocelular mais avançada, - diagnosticar o indivíduo como tendo inflamação lobular e/ou pontuação mais avançada de inflamação lobular, ou - diagnosticar o indivíduo como tendo esteatose de fígado e/ou pontuação mais avançada de esteatose de fígado.

[0152] Ademais, os métodos de acordo com a presente invenção permitem: - determinar a atividade de uma NAFLD ou NASH em um indivíduo, - determinar o estágio de NAFL em um indivíduo, - determinar o estágio de fibrose em um indivíduo, - determinar a gravidade de uma NASH em um indivíduo, ou - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente com NASH,

[0153] Ademais, os métodos de acordo com a presente invenção permitem: - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para NAFLD, - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para NASH, - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para fibrose de fígado, - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para balonamento hepatocelular, - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para inflamação lobular, ou - classificar um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para esteatose de fígado.

[0154] Ademais, os métodos de acordo com a presente invenção permitem: - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar doença de NAFLD, - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar NAFL. - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar doença de NASH, - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar doença de fibrose, - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar doença de balonamento hepatocelular, - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar doença de inflamação lobular, ou - avaliar a eficácia de um tratamento médico com base em uma administração de fármaco para tratar esteatose de fígado.

[0155] Ademais, os métodos de acordo com a presente invenção permitem: - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente com NAFLD após a administração de um tratamento médico, - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente com NAFL após a administração de um tratamento médico, - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente com NASH após a administração de um tratamento médico, - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente que sofre de fibrose após a administração de um tratamento médico, - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente que sofre de doença de balonamento hepatocelular após a administração de um tratamento médico, ou - determinar a progressão ou regressão da patologia em um paciente que sofre de doença de inflamação lobular após a administração de um tratamento médico.

[0156] Ademais, os métodos de acordo com a presente invenção permitem:

- prever se um paciente responderá ou não, -isto é, respondedor potencial ou não respondedor para um tratamento médico particular para tratar NAFLD, - prever se um paciente responderá ou não, -isto é, respondedor potencial ou não respondedor para um tratamento médico particular para tratar NAFL, - prever se um paciente será receptivo ou não, isto é, (potencialmente) responder ou (potencialmente) não responder a um tratamento médico para tratar doença de NASH, - prever se um paciente será receptivo ou não, isto é, (potencialmente) responder ou (potencialmente) não responder a um tratamento médico para tratar fibrose de fígado, - prever se um paciente será receptivo ou não, isto é, (potencialmente) responder ou (potencialmente) não responder a um tratamento médico para tratar uma doença hepatocelular, ou - prever se um paciente será receptivo ou não, isto é, (potencialmente) responder ou (potencialmente) não responder a um tratamento médico para tratar uma doença de inflamação lobular.

[0157] Em algumas modalidades, os métodos para determinar se um indivíduo tem NAFLD ou NASH, ou NASH Ativa ou fibrose de fígado (como fibrose de fígado significativa), ou inflamação lobular, ou balonamento de hepatócito ou para determinar se um indivíduo é um receptor de fármaco (TBT) ou um respondedor potencial a um fármaco específico compreendem coletar uma amostra de um fluido corporal de um indivíduo suspeito de ter a condição avaliada, e detectar o nível de miR-452, em que um nível que é maior que um nível de referência de miR-452 indica a presença da condição avaliada, ou o diagnóstico do indivíduo como tendo NAFLD ou NASH, ou NASH Ativa ou fibrose de fígado (como fibrose de fígado significativa), ou inflamação lobular, ou balonamento de hepatócito ou o indivíduo como sendo um receptor potencial de fármaco (TBT) ou responsivo.

[0158] Em modalidades particulares, o indivíduo é um indivíduo em risco de ter NALFD, NASH, NASH Ativa ou fibrose de fígado ou um indivíduo em risco de desenvolver NAFLD, NASH, NASH Ativa ou fibrose de fígado no futuro, como um indivíduo que tem obesidade, diabetes, que sofre da síndrome metabólica, e/ou que tem enzimas elevadas no fígado e/ou que tem outros sinais de disfunções de fígado. O indivíduo também pode ser um indivíduo com anteriormente identificado como NAFLD, NASH ou NASH Ativa ou fibrose de fígado, em que o método da invenção, dessa maneira, permite determinar a atividade de doença e estágio de fibrose e estimar riscos de evolução da doença em relação a cirrose, complicações cirróticas, hepatocarcinoma, transplante de fígado, uma doença cardiovascular ou mortes relacionadas a fígado.

[0159] Em modalidades particulares, o indivíduo está sofrendo de NASH, em que o método da invenção, dessa maneira, permite determinar a eficácia de um fármaco para o tratamento da doença de NASH, classificar o indivíduo como responsivo/não responsivo a um tratamento para NASH, ou monitorar a evolução do estado de NASH do indivíduo.

[0160] Em modalidades particulares da presente invenção para diagnosticar NAFLD, NASH ou fibrose de fígado e/ou para determinar a atividade de doença, o estágio de fibrose, em um indivíduo, e/ou para a avaliação da eficácia de um tratamento médico, e/ou para a determinação da evolução (progressão ou regressão) da patologia em um indivíduo com NAFLD, NASH ou fibrose de fígado, e/ou para a classificação de um indivíduo como um respondedor potencial ou não respondedor a um tratamento médico, e/ou para a predição de resultado de doença para um indivíduo, a medição de miR-452 nível pode ser introduzida em modelos matemáticos (algoritmos) para combinação com outras variáveis, como sexo, idade, índice de massa corporal, peso, situação médica, pressão arterial ou outros marcadores de fluido corporal, como marcadores de circulação de sangue, soro ou plasma, a saber, aqueles mencionados na tabela a seguir. Função de Tecido Metabolismo Estresse/ Fibrose Inflamação hepatócito adiposo apoptose oxidativa ALT Adiponectin Glicose no Malondial Fibronec TNFa AST a plasma em jejum deído tina IL1b, IL6, ALP Leptina Insulina em TBARS Ácido IL8, IFNg, GGT Resistina jejum Ox LDL hialurôn TGFb Haptoglobu Índice de HOMA CK18 -M30 ico hs -CRP lina Triglicerídeos CK18-M65 Colágeno MCP1 Albumina Colesterol HDL Ferritina tipo IV sCD14 Bilirubina VLCL-C YKL-40 PIIINP Contagem Apolipoproteína (CHI3L1) TIMP-1 de s (ApoA1, ApoB, Plaquetas ApoCIII)

[0161] De acordo com outra modalidade, os métodos da presente invenção compreendem a determinação do nível de outros biomarcadores além de miR-452.

[0162] Em uma modalidade particular, tais biomarcadores são selecionados a partir do grupo que consiste em: alfa 2 macroglobulina (A2M), hemoglobulina glicolisada (HbA1c), nível de glicose em jejum ou nível de frutosamina, pró- peptídeo de colágeno tipo III de terminal N (PIIINP) e YKL-

40.

[0163] Em uma modalidade mais particular, tal biomarcador é YKL-40.

[0164] Em outra modalidade, tais biomarcadores são marcadores de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado, como o grau de esteatose, necroinflamação e fibrose, estimados por Imageamento de Ressonância Magnética (MRI), Elastografia de Ressonância Magnética (MRE), Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS), parâmetro de atenuação controlada (CAP) e medição de dureza do fígado por Elastografia Transitória (TE), Ultrassonografia (USG), FibroScan, Elastografia de Onda de Cisalhamento de Ponto (pSWE), Elastografia de Onda de Cisalhamento 2D (2D-SWE), Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNP), DNA livre de célula, RNA de não codificação livre de célula, e polimorfismos de gene (como PNPLA3 e TM6SF2).

[0165] Em uma modalidade particular, tais biomarcadores são marcadores de NAFLD como marcadores relacionados a índice de fígado gorduroso, marcadores relacionados a índice de esteatose-hepática, marcadores relacionados a pontuação de gordura no fígado NAFLD, parâmetros de SteatoTest, parâmetros de pontuação de crista de NAFLD, triglicerídeos de circulação, Índice de Massa Corporal (BMI); biomarcadores de imageamento como o grau de difusão de feixe pelo tecido (USG), o grau de atenuação de ultrassom por gordura hepática (CAP), a fração de gordura de densidade de próton (MRI- PDFF), o teor de triglicerídeo no fígado, fração de gordura de sinal (MRS).

[0166] Em uma modalidade particular, tais biomarcadores são marcadores de sangue bioquímicos de NASH como marcadores de apoptose (fragmento de CK18, citoqueratina total, níveis de soro de antígeno de superfície mediado por apoptose FAS), marcadores inflamatórios (proteína reativa a C (CRP), TNF, IL-8, ligante de quimiocina CXC 10 (CXCL10)), produtos de oxidação de lipídio (ácido 11- hidoxieicosatetraenoico (HETE), ácido 9-hidroxidecadienoico (HODE), 13-HODE, ácido 13-oxo-octadecadienoico (ODE), LA- 13-HODE (pontuação de oxNASH), ácido 11,12-di-hidroxi- eicosatrienoico (diHETrE)), adipocitocinas e hormônios (adiponectina, leptina, resistina, visfatina, proteína de ligação de retinol (RBP)4, proteína de ligação de ácido graxo (FABP)4, fator de crescimento de fibroblasto (FGF21)), enzimas lisossomais (catepsina D), e/ou painéis combinados (teste de NASH, painel de diagnóstico de NASH); biomarcadores de imageamento como função de admissão de célula de kupffer (MRI), aperfeiçoamento de fígado aumentado pelo uso de ácido gadoxético (MRI), rotatividade de membrana de hepatócito e ATP intracelular (MRS), dureza de fígado (MRE).

[0167] Em uma modalidade particular, tais biomarcadores são marcadores de fibrose de fígado: biomarcadores de imageamento como impulso mecanicamente induzido, medição quantitativa de velocidade de onda de cisalhamento (FibroScan-elastografia transitória, pSWE-ARFI, 2D-3D-SWE),

impulso de força de radiação focalizada induzida por ultrassom em morte (pSWE-ARFI), uso de método de contraste de fase modificado para imagear a propagação da onda de cisalhamento em parênquima de fígado (MRE); marcadores bioquímicos de sangue como a razão de AST:ALT, o índice de razão de AST:plaqueta (APRI), os parâmetros de índice de FIB4, a parâmetros de pontuação de fibrose de NAFLD, os parâmetros de pontuação de BARD, marcadores de fibrose específicos como HA, PIIINP, Pro-C3, TIMP-1, Laminina, painéis relacionados a ELF, parâmetros de fibroteste, parâmetros de NAFLD de fibroMeter.

[0168] Em outra modalidade adicional, como marcadores são riscos de NAFLD e marcadores de gravidade como marcadores genéticos e genômicos como SNPs (rs738409 em PNPLA3), RNAs de não codificação livres de célula (miR-122, miR-1290, miR-192 e miR-7b), painel de compósito de dados ômicos derivados de soro como rs738409 e dados proteômicos que incluem ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GNS, LGALS3BP, CHL1 e SERPINC1, SNPs em múltiplos loci (PNPLA3, SOD2, KLF6 e LPIN1), miR-122, painel de compósito que inclui miR-122, miR-192, miR-21, ALT, CK18 Asp396, DNA livre de célula como PPARG metilado de circulação.

[0169] De acordo com uma modalidade adicional, os outros biomarcadores são outros microRNAs de circulação além de miR-452. Em particular, microRNAs adicionais ilustrativos que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem: miR-34a, miR-122 e miR-200.

[0170] De acordo com essas modalidades, os métodos podem compreender as etapas de: i) medir o nível de miR-452 e pelo menos um outro marcador de circulação de danos ao fígado (como um marcador de circulação de sangue, soro ou plasma de danos ao fígado), e ii) combinar essas medições para gerar modelos matemáticos (algoritmos) através de abordagens bioinformáticas (por exemplo, regressão logística linear ou floresta aleatória) para obter uma pontuação de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado com altos desempenhos de diagnóstico/monitorar/prognóstico/preditivos para avaliação de NALFD, NASH, NASH Ativa ou fibrose de fígado em um indivíduo.

[0171] Em outra modalidade, o diagnóstico, detecção, monitorar, avaliação do risco ou avaliação da eficácia de um tratamento para NAFLD, NASH ou fibrose de fígado é conduzida ao determinar o nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal do indivíduo, e submeter o indivíduo a técnicas físicas, não invasivas, como ultrassom, elastografia ou técnicas de imageamento, como MRI.

[0172] Em outras modalidades, os métodos da presente invenção podem ser combinados com o método revelado no documento WO2017046181 de propriedade do mesmo Requerente.

[0173] Em algumas modalidades, graças aos métodos da invenção, uma decisão pode ser tomada para fornecer recomendações de estilo de vida a um indivíduo (como um regime de alimentos ou fornecer recomendações de atividade física), para cuidar medicamente de um indivíduo (por exemplo, definindo-se visitas regulares a uma examinação física ou regular, por exemplo, para monitorar regularmente marcadores de danos ao fígado), ou para administrar pelo menos uma terapia de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado a um indivíduo. Em uma modalidade particular, uma decisão pode ser tomada para fornecer recomendações de estilo de vida a um indivíduo ou para administrar pelo menos uma terapia de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado. Tal classificação de um indivíduo, como um receptor ou paciente de TBT tem como base um nível elevado em miR-452 comparado a níveis de referência de miR-452 medidos em pacientes não receptores (NTBT), como fornecido acima.

[0174] A invenção, desse modo, se refere ainda a um composto anti-NAFLD, anti-NASH ou anti-fibrótico para uso em um método para tratar NAFLD, NASH ou fibrose de fígado em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi identificado graças a um método de acordo com a invenção. A invenção também se refere ainda a um composto anti-NAFL para uso em um método para tratar NAFL em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi identificado graças a um método de acordo com a invenção.

[0175] Em particular, a invenção se refere a um composto anti-NAFLD para uso em um método para tratar NAFLD em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi classificado como um receptor do dito tratamento graças a um método de acordo com a invenção.

[0176] Em particular, a invenção se refere a um composto anti-NASH para uso em um método para tratar NASH em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi classificado como um receptor do dito tratamento graças a um método de acordo com a invenção.

[0177] Em particular, a invenção se refere a um composto anti-fibrótico para uso em um método para tratar fibrose de fígado em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi classificado como um receptor do dito tratamento graças a um método de acordo com a invenção.

[0178] Compostos anti-NAFLD anti-NASH e anti-fibróticos ilustrativos são listados abaixo: - um composto de fórmula (I): X1 A R4

O X2 R5 em que: X1 representa um halogênio, um grupo R1, ou G1-R1; A representa um grupo CH=CH ou um grupo CH2-CH2; X2 representa um grupo G2-R2; G1 e G2, idênticos ou diferentes, representam um átomo de oxigênio ou enxofre; R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila não substituído, um grupo arila ou um grupo alquila que é substituído por um ou mais átomos de halogênio, um grupo alcóxi ou alquiltio, grupos cicloalquila, grupos cicloalquiltio ou grupos heterocíclicos; R2 representa um grupo alquila substituída por pelo menos um grupo -COOR3, em que R3 representa um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, ou grupos heterocíclicos. R4 e R5, idênticos ou diferentes, que representam um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, grupos heterocíclicos;

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo;

[0179] - Inibidores de Acetil-CoA carboxilase como GS- 0976, ND-654, AC-8632, PF05175157, CP640186, gemcabene, MK- 4074, e PF05175157.

[0180] - Agonistas de receptor de adenosina A3 como 2- (1-hexinil)-N-metiladenosina, Piclidenoson CF101 (IB-MECA), Namodenoson CF-102, 2-CI-IB-MECA, CP-532.903, Inosina, LUF- 6000 e MRS-3558.

[0181] - Antagonistas de aldosterona e antagonistas de receptor de mineralocorticoide como Apararenona (MT 3995), Amilorida, Espironolactona, Eplerenona, Canrenona e canrenoato de potássio, progesterona, drospirenona, gestodeno e benidipina.

[0182] - Estimuladores de proteína quinase ativada por AMP como PXL-PXL-770, MB-11055 Debio-0930B metformina, CNX- 012, O-304, sal de cálcio da mangiferina, eltrombopag, carotuximab e Imeglimina.

[0183] - Agonista de receptor de amilina e agonistas de receptor de calcitonina incluem, porém sem limitação, KBP- 042 e KBP-089.

[0184] - Fator de crescimento beta 2 de transformação de alvejamento de oligonucleotídeo antissenso inclui, porém sem limitação, ASPH-0047, IMC-TR1 e ISTH-0047.

[0185] - Inibidores de proteína 3 relacionados a angiopoietina, como ARO-ANG3, IONIS-ANGGPTL3-LRx ou AKCEA- ANGPTL3LRx, evinacumab, e ALN-ANG.

[0186] - Anticorpos Anti-LPS como IMM-124-E

[0187] - Inibidores de transportador de ácido biliar copendente de sódio apical como A-4250, volixibat, maralixibat anteriormente SHP-625, GSK-2330672, elobixibat,

e CJ-14199.

[0188] - Betaína anidra ou RM-003;

[0189] - Ácidos biliares como ácido obeticólico (OCA) e UDCA, ácido norursodeoxicólico, e ursodiol.

[0190] - lipídios bioativos como ácido 5- hidroxieicosapentaenoico (15-HEPE, DS-102), ácidos graxos insaturados como 25 ácido araquidônico, éster icosapentetílico, ácido eicosapentaneoico e ácido docosa- hexaenoico.

[0191] - Antagonistas de receptor de CB1 canabinoide como GRC-10801, MRI-1569, MRI-1867, DBPR-211, AM-6527 : AM- 6545, NESS-11-SM, CXB-029, GCC-2680, TM-38837, Org-50189, PF-514273, BMS-812204, ZYO-1, AZD-2207, AZD-1175, otenabant, ibipinabant, surinabant, rimonabant, drinabant, SLV-326, V-24343 e O-2093.

[0192] - Imitações de receptor de CB2 canabinoide como anabasum (Resunab, JKT-101).

[0193] - Inibidor de iNOS/Receptor CB1 de canabinoide duplo

[0194] - Inibidores de caspase como emricasan, belnacasan, nivocasan, IDN-7314, F-573, VX-166, YJP-60107, MX-1122, IDN-6734, TLC-144, SB-234470, IDN-1965, VX-799, SDZ-220-976, e L-709049.

[0195] - Inibidores de catepsina como VBY-376, VBY-825, VBY-036, VBY-129, VBY-285, Org-219517, LY3000328, RG-7236, e BF/PC-18.

[0196] - Antagonistas de CCR como cenicriviroc (antagonista CCR2/5), PG-092, RAP-310, INCB-10820, RAP-103, PF-04634817, e CCX-872.

[0197] - Moduladores de quimiocina de CCR3 e inibidores de ligante de eotaxina 2.

[0198] - Inibidores de Diacilglicerol-O-aciltransferase (DGAT) como IONIS-DGAT2Rx, anteriormente ISIS-DGAT2Rx, LY- 3202328, BH-03004, KR-69530, OT-13540, AZD-7687, ABT-046.

[0199] - Inibidores de dipeptidil peptidase (DPP4) como evogliptina, vidagliptina, fotagliptina, alogliptina, saxagliptina, tilogliptina, anagliptina, sitagliptina, retagliptina, melogliptina, gosogliptina, trelagliptina, teneligliptina, dutogliptina, linagliptina, gemigliptina, iogliptina, betagliptina, imigliptina, omarigliptina, vidagliptina e denagliptina.

[0200] - Agonistas de receptor de insulina e ligante de insulina.

[0201] - Antagonista de receptor 1 de MCH e sensibilizadores de insulina

[0202] - Inibidores de NOX duplo (NADPH oxidase), inibidores 1&4, como GKT-831 (2-(2-clorofenil)-4-[3- (dimetilamino)fenil]-5-metil-1H-pirazol[4,3-c]piridina- 3,6(2H,5H)-diona), anteriormente GKT137831 e GKT-901.

[0203] - Modulares de proteína de matriz extracelular como CNX-024, CNX-025, e SB-030.

[0204] - Inibidores de estearoil CoA desaturase- 1/conjugados de ácido biliar de ácido graxo (FABAC);

[0205] - Agonistas de receptor de Farnesoid X (FXR) como ácido obeticólico (OCA), GS-9674, LJN-452, EDP-305, AKN- 083, INT-767, GNF-5120, LY2562175, INV-33, NTX-023-1, EP- 024297, Px-103, e SR-45023.

[0206] - Ácidos graxos como ácidos graxos omega-3, Omacor ou MF4637, óleos de peixe, ácidos graxos poliinsaturados (efamax, optiEPA).

[0207] - Inibidores de Sintase de Ácido Graxo (FAS) como TVB-2640; TVB-3199, TVB-3693BZL-101, ácido 2- octadecinóico, MDX-2, Fasnall, MT-061, G28UCM, MG-28, HS- 160, GSK-2194069, KD-023, e cilostazol.

[0208] Em uma modalidade particular, o inibidor de FAS é um composto selecionado na seguinte lista de compostos:

e TVB-2640.

[0209] Em uma outra modalidade particular, o inibidor de FAS é selecionado a partir de:

e TVB-2640.

[0210] Em uma modalidade particular, o inibidor de FAS é TVB-2640.

[0211] - Ligante de receptor de Fator de Crescimento de Fibroblasto 19 (FGF-19) ou variante geneticamente modificada funcional de FGF-19

[0212] - Recombinantes de Fator de Crescimento de Fibroblasto 19 (FGF-19) como NGM-282

[0213] - Agonistas de Fator de Crescimento de Fibroblasto 21 (FGF-21) como PEG-FGF21, anteriormente BMS- 986036, YH-25348, BMS-986171, YH-25723, LY-3025876, e NNC- 0194-0499.

[0214] - Inibidores de Galectina 3 como GR-MD-02, TD- 139, ANG-4021, Galectin-3C, LJPC-201, TFD-100, GR-MD-03, GR-MD-04, GM-MD-01, GM-CT-01, GM-CT-02, Gal-100, e Gal-200.

[0215] - Análogos de peptídeo-1 similar a Glucagon (GLP- 1) como semaglutide, liraglutide, exenatide, albiglutide, dulaglutide, lixisenatide, loxenatide, efpeglenatide,

taspoglutide, MKC-253, DLP-205, ORMD-0901.

[0216] - Agonistas de receptor de peptídeo-1 similar a Glucagon (GLP-1) como LY-3305677, e Oxintomodulina de atuação longa.

[0217] - Moduladores de receptor acoplado à proteína G (GPCR); CNX-023.

[0218] - Antagonista de receptor 84 acoplado à proteína G ilustrativo (antagonista de GPR84), inibidor de ligante de fator de crescimento de tecido conjuntivo e agonista de receptor 1 de ácido graxo livre (agonista de FFAR1) como PBI-4050, PBI-4265, PBI-4283 e PBI-4299.

[0219] - Hormônio do crescimento

[0220] - Inibidores de via de sinalização de célula de Hedgehog como Vismodegib, TAK-441, IPI-926, Saridegib, Sonidegib/Erismodegib, BMS-833923/XL139, PF-04449913, Taladegib/lY2940680, ETS-2400, SHR-1539, e CUR61414.

[0221] - Inibidores de cotransportador de ácido bilial de sódio Ileal como A-4250, GSK-2330672, volixibat, CJ-15 14199, e elobixibat.

[0222] - Imunomodulares como PBI-4050, PBI-4265, PBI- 4283, PBI-4299 e AIC-649.

[0223] - Sensibilizadores de insulina e antagonista de receptor 1 de MCH como MSDC-0602k, MSDC-0602, CSTI-100 e AMRI.

[0224] - Inibidores de integrina; inibidores de integrina de Agente Terapêutico Dobrável, inibidores de integrina de Agente Terapêutico Indalo, inibidores de integrina de St Louis University, ProAgio, e GSK-3008348.

[0225] - Inibidores de cetoohexoquinase como JNJ- 28165722, JNJ-42065426; JNJ-42152981, JNJ-42740815, JNJ-

42740828, e PF-06835919.

[0226] - Inibidores de Leucotriena (LT)/Fosfodiesterase (PDE)/lipoxigenase (LO) como tipelukast (anteriormente MN- 001), tomelukast, sulukast, masilukast, zafirlukast, pranlukast, montelukast, gemilukast, verlukast, aklukast, pobilikast, cinalukast, e iralukast.

[0227] - Inibidores homólogos a lisil-oxidase 2 como Rappaport, InterMune, Pharmaxis, AB-0023, Simtuzumab, PXS- 5382A e PXS-5338.

[0228] - Macrolídeos: solitromicina, azitromicina, e eritromicina.

[0229] - Moduladores de receptor de manone se macrófago como AB-0023, MT-1001, [18F]FB18mHSA, Xemys, technetium Tc 99m tilmanocept, e CDX-1307.

[0230] - Modulador de proteína 2 de ligação a metil-CpG e os inibidores de transglutaminase incluem, porém sem limitação, cisteamina, EC Cisteamina, bitartarato de cisteamina com revestimento entérico, bitartarato de cisteamina (com revestimento entérico), Bennu, bitartarato de cisteamina (com revestimento entérico), Raptor, bitartarato de cisteamina, DR Cisteamina, bitartarato de cisteamina com revestimento entérico de liberação atrasada, mercaptamina, mercaptamina (com revestimento entérico), Bennu, mercaptaminA (com revestimento entérico), Raptor, RP-103, RP-104, PROCYSBI e mercaptamina (com revestimento entérico).

[0231] - Antagonistas de miRNA como RG-125 anteriormente AZD4076, RGLS-5040, RG-101, MGN-5804, e MRG-201.

[0232] - Estimulador de Metaloproteinase 9 (MMP9) como estimulador de MMP9 de Elastomic Ab.

[0233] - Inibidor da família mitocondrial de carreador e inibidor de proteína de carreador de fosfato mitocondrial incluem, porém sem limitação, TRO-19622, Trophos, olesoxime, RG-6083 ou RO-7090919.

[0234] - Inibidores de mieloperoxidase incluem, porém sem limitação, PF-06667272

[0235] - Anticorpos monoclonais: bertilimumab, NGM- 313, mAbs de alvejamento de IL-20, fresolimumab (antiTGFβ) anteriormente GC1008, timolumab anteriormente BTT-1023, namacizumab, omalizumab, ranibizumab, bevacizumab, lebrikizumab, epratuzumab, felvizumab, matuzumab, monalizumab, reslizumab, e inebilizumab.

[0236] - Anticorpos monoclonais como mAbs anti-IL20, anticorpos anti-TGFβ, anticorpos anti-CD3, anticorpos anti- LOXL2 e anticorpos anti-TNF.

[0237] - Moduladores de mTOR como MSDC-0602, terapia de gene AAV coadministrado com SVP-sirolimus.

[0238] - Estimulador de sirtuína de deacetilase dependente de NAD; inibidor de PDE 5 como NS-0200.

[0239] - Inibidores de NF-kappa B como LC-280126.

[0240] - Ácido nicotínico como Niacina ou Vitamina B3

[0241] - Agonistas de Receptor de Ácido Nicotínico (GPR109) como ARI-3037MO, MMF, LUF 6283, Acifran, IBC 293, MK-1903, GSK256073, MK-6892, MK-0354, SLx-4090, lomitapida, lexibulina, apabetalona, acifran, laropiprant, daporinad, anacetrapib, INCB-19602, ST-07-02, lomefloxacina, Niacina e liberação controlada/laropiprant, - nitazoxanide (NTZ), seu tizoxanide (TZ) de metabólito ativo ou outros pró-fármacos de TZ como RM-5061,

[0242] - Fármacos anti-inflamatórios não esteroide

(NSAIDs) incluem, porém sem limitação, F-351, salicilatos (aspirina), acetaminofeno, derivados de ácido propiônico (ibuprofeno, naproxeno), derivados de ácido acético (indometacina, diclofenac), derivados de ácido enólico (piroxicam, fenilbutazona), derivados de ácido antranílico (ácido meclofenálmico, ácido flufenâmico), inibidores de 25 COX-2 seletivo (celecoxib, parecoxib) e sulfonanilidas (nimesulida).

[0243] - Ligantes de receptor nuclear como DUR-928 anteriormente DV 928.

[0244] - Agonistas de proteína P2Y13 como CER-209

[0245] - Moduladores de PDGFR como BOT-501 e BOT-191.

[0246] - Estimuladores de Fenilalanina hidroxilase como Pegvaliase, sapropterina, AAV-PAH, CDX-6114,

[0247] sepiapterina, RMN-168, ALTU-236, ETX-101, HepaStem, rolipram, e alprostadil

[0248] - Antagonistas de receptor ativado por protease (PAR)-2; PZ-235 e NP-003.

[0249] - Moduladores de proteína quinase como CNX-014, MB-11055, ALF-1, mangiferina, amlexanox, GS-444217, REG- 101, e valina.

[0250] - Agonistas de PPAR-alfa como fenofibrato, ciprofibrato, pemafibrato, gemfibrozila, clofibrato, binifibrato, clinofibrato, ácido clofíbrico, nicofibrato, pirifibrato, plafibrida, ronifibrato, teofibrato, tocofibrato e SR10171;

[0251] - agonistas de gama PPAR como Pioglitazona, pioglitazona deuterada, Rosiglitazona, efatutazona, ATx08- 001, OMS-405, CHS-131, THR-0921, SER-150-DN, KDT-501, GED- 0507-34-Levo, CLC-3001, e ALL-4.

[0252] - Agonista delta de PPAR como GW501516 (Endurabol ou ácido ({4-[({4-metil-2-[4-(trifluorometil)fenil]-1,3- tiazol-5-il}metil)sulfanil]-2-metilfenoxi}acético)), ou MBX8025 (Seladelpar ou ácido {2-metil-4-[5-metil-2-(4- trifluorometil-fenil)-2H-[1,2,3]triazol-4-ilmetilsilfanil]- fenoxi}-acético), ou GW0742 (ácido [4-[[[2-[3-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]-4-metil-5-tiazolil]metil]tio]-2- metil fenoxi]acético) ou L165041 ou HPP-593 ou NCP-1046.

[0253] - agonistas PPARalpha/gama (também chamados glitazars), como Saroglitazar, Aleglitazar, Muraglitazar, Tesaglitazar, e DSP-8658.

[0254] - agonistas PPARalpha/delta como Elafibranor, e T913659.

[0255] - PPAR gama/delta como ácido linoleico conjugado (CLA), T3D-959.

[0256] - agonistas de PPAR alfa/gama/delta ou agonistas de PPARpan: IVA337 ou TTA (ácido tetradeciltioacético) ou Bavachinin ou GW4148 ou GW9135, ou Bezafibrato ou Lobeglitazona, ou CS038.

[0257] - fibras pré-bióticas, probióticos

[0258] - Receptores de pregnano X como Rifampicina.

[0259] - Inibidores de proteína quinase 2 associada por Rho (ROCK2): KD-025, TRX-101, BA-1049, LYC-53976, INS- 117548, e RKI-1447.

[0260] - Inibidores de quinase 1 de regulação de sinal (ASK1); GS-4997

[0261] - Inibidores de transporte de sódio-glicose (SGLT) 2: remogliflozina, dapagliflozina, empagliflozina, ertugliflozina, sotagliflozina, ipragliflozina, tianagliflozina, canagliflozina, tofogliflozina,

janagliflozina, bexagliflozina, luseogliflozina, sergliflozina, HEC-44616, AST-1935, e PLD-101.

[0262] - Inibidores de estearoil CoA desaturase- 1/conjugados de ácido biliar de ácido graxo: aramchol, GRC- 9332, steamchol, TSN-2998, GSK-1940029, e XEN-801.

[0263] - Agonista de receptor β de Tiroide (THR β): VK-2809, MGL-3196, MGL-3745, SKL-14763, sobetirome, BCT- 304, ZYT-1, MB-07811, e eprotirome.

[0264] - antagonistas de Receptor 4 do tipo Toll (TLR-4) como naltrexona, JKB-121, M-62812, resatorvid, dendrofilina, CS-4771, AyuV-1, AyuV-25, NI-0101, EDA-HPVE7, e eritoran.

[0265] - Moduladores de receptor de tirosina quinase (RTK); CNX-025; KBP-7018

[0266] - Inibidores de trocador de ânion urato 1 e inibidores de xantina oxidase como lesinurad, RLBN-1001, verinurad, KUX-1151 e lesinurad + alopurinol.

[0267] - inibidores de proteína-1 de adesão vascular (VAP-1) como PXS-4728A, CP-664511, PRX-167700, ASP-8232, RTU-1096, RTU-007, e BTT-1023.

[0268] - agonistas de receptor de Vitamina D (VDR) como calciferol, alfacalcidol, 1,25-di-hidroxivitamina D3, Vitamina D2, Vitamina D3, calcitriol, Vitamina D4, Vitamina D5, di-hidrotacisterol, calcipotriol; tacalcitol 1,24- di- hidroxivitamina D3, e paricalcitol.

[0269] - Vitamina E e isoformas, vitamina E combinada com vitamina C e atorvastatina.

[0270] Outros agentes anti-NASH incluem KB-GE-001 e NGM- 386 e NGM-395 e NC-10 e TCM-606F. Os agentes anti-NASH adicionais incluem icosabutato, NC-101, NAIA-101,

colesevelam e PRC-4016. Outros agentes antifibróticos incluem HEC-585, INV-240, agente terapêutico de RNAi (Silence Therapeutics) e programa de SAMiRNA (Bioneer Corp).

[0271] Outros agentes antifibróticos ilustrativos incluem inibidores de receptor de tirosina quinase ou pirfenidona (RTKIs), como Nintedanib, Sorafenib e outros RTKIs ou bloqueadores de receptor de angiotensina II (AT1) ou inibidor de CTGF ou qualquer composto antifibrótico suscetível à interferência com as vias ativadas por TGFβ e BMP incluindo ativadores do complexo de TGFβ latente, como MMP2, MMP9, THBS1 ou integrinas de superfície celular, receptores de TGFβ tipo I (TGFBRI) ou tipo II (TGFBRII) e seus ligantes, como TGFβ, Activina, inibina, Nodal, hormônio anti-Müllerian, GDFs ou BMPs, correceptores auxiliares (também conhecido como receptores do tipo III) ou componentes das vias canônicas dependentes de SMAD incluindo membros ou proteínas de SMAD reguladoras ou inibidoras das vias não canônicas ou independentes de SMAD incluindo várias ramificações de sinalização de MAPK, TAK1, vias de sinalização de GTPase similar a Rho, vias de fosfatidilinositol-3 quinase/AKT, processo de EMT induzido por TGFβ ou vias de sinalização de Hedgehog canônicas e não canônicas incluindo ligantes de Hh ou genes-alvo ou quaisquer membros das vias de WNT ou Notch que são suscetíveis de influenciar TGFβ.

[0272] Em uma modalidade particular, o tratamento de NASH ou fibrose de fígado compreende administrar um composto de fórmula (I) selecionado no grupo que consiste em 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-

carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4- metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-isopropiloxi carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4- metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-terc- butiloxicarbonildimetilmetiloxifenil] prop-2-en-1-ona, 1- [4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-terc- butiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1- [4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4- trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4-terc- butiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil] prop-2-en-1-ona, 1- [4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetil oxifenil]prop-2-en-1-ona, ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil] fenoxi]-2- metilpropanoico e éster isopropílico de ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2- metil-propanoico; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em uma modalidade particular adicional da invenção, o composto de fórmula (I) é 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5- dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[0273] Em particular, a invenção se refere a um produto de combinação que compreende pelo menos um agente anti- NAFLD, e/ou um agente anti-NASH, e/ou um agente anti- fibrótico para uso em um método para tratar NAFLD, NASH, NASH ativa, e/ou fibrose de fígado em um indivíduo que necessita do mesmo, em que o indivíduo foi classificado como um receptor do dito tratamento graças a um método de acordo com a invenção.

[0274] Em uma modalidade mais particular, a invenção se refere ao tratamento de NAFLD, NASH, NASH Ativa, e/ou fibrose de fígado com um produto de combinação que compreende pelo menos um agente selecionado a partir do grupo de compostos anti-NAFLD, anti-NASH e/ou anti- fibrótico, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0275] Em uma modalidade mais particular, a invenção se refere ao tratamento de NAFLD, NASH, NASH Ativa, e/ou fibrose de fígado com Elafibranor.

[0276] Em uma modalidade adicional, o tratamento de NASH ou fibrose de fígado compreende administrar NTZ, TZ, vitamina E ou pioglitazona, ácido obeticólico, elafibranor, selonsertib, saroglitazar e/ou cenicrivoc.

[0277] Em uma modalidade adicional, o tratamento de NASH ou fibrose de fígado compreende administrar NTZ ou TZ, em particular NTZ.

[0278] Em uma modalidade particular adicional, um tratamento de combinação é conduzido. Em outra modalidade particular, o tratamento de NAFLD, NAFL, NASH, NASH Ativa, ou fibrose de fígado compreende administrar Elafibranor combinado com um ou mais outros compostos anti-NAFLD, anti- NAFL, anti-NASH ou anti-fibrose de fígado. Em ainda outra modalidade, o tratamento de NAFLD, NAFL, NASH, NASH Ativa, ou fibrose de fígado compreende administrar Elafibranor combinado com pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em NTZ, TZ, vitamina E ou pioglitazona, ácido obeticólico, elafibranor, selonsertib, saroglitazar e cenicrivoc. Em ainda outra modalidade, o tratamento de NAFLD, NAFL, NASH, NASH Ativa, ou fibrose de fígado compreende administrar Elafibranor combinado com NTZ.

[0279] Considerando o papel de micro-RNA na modulação de gene expressão, os resultados obtidos pelos inventores também suportam papéis fatofisiológicos de miR-452 no desenvolvimento e evolução de NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado.

[0280] Considerando o papel de micro-RNA na modulação de gene expressão, os resultados obtidos pelos inventores também suportam papéis fatofisiológicos de miR-452 no desenvolvimento e evolução de NAFL.

[0281] Os métodos da invenção, desse modo, podem ser usados para identificar subpopulações específicas de indivíduos com NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado com base em níveis de circulação de miR-452. Essas subpopulações podem ter uma doença dependente de miR-452 que tornaria esses pacientes responsivos a fármacos específicos que atuam diretamente (miR-452 mimético ou simulado, desregulador de miRNA como RNA circular (CircRNA) ou anti- miR-452) ou indiretamente em vias dependentes de miR- 452.

[0282] Os métodos da invenção, desse modo, podem ser usados para identificar subpopulações específicas de indivíduos com NAFL com base em níveis de circulação de miR-452. Essas subpopulações podem ter uma doença dependente de miR-452 que tornaria esses pacientes responsivos a fármacos específicos que atuam diretamente (miR-452 mimético, desregulador de miRNA como RNA circular (CircRNA) ou anti-miR-452) ou indiretamente em vias dependentes de miR- 452.

[0283] Além disso, a partir dessa observação, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um composto inibidor de miR-452 para uso no tratamento de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado em um indivíduo que necessita do mesmo.

[0284] Além de, a partir dessa observação, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um composto inibidor de miR-452 para uso no tratamento de NAFL em um indivíduo que necessita do mesmo.

[0285] Como usado no presente documento, o termo "composto inibidor de miR-452“ e declinações do mesmo se referem a qualquer composto, como um composto de ácido nucleico, com capacidade de impedir a ação de miR-452 e particularmente de hsa-miR-452-5p e hsa-miR-452-3p. Em uma modalidade particular, o composto inibidor de miR-452 da presente invenção é um composto que inibe ou reduz a atividade de miR-452, por exemplo, ligando-se a miR-452 ou que inibe expressão de miR-452. O termo “expressão inibidora de miR-452" significa que a produção de miR-452 no fígado ou hepatócitos após o tratamento com o dito composto inibidor é menor que a quantidade produzida antes do tratamento. Um indivíduo versado na técnica pode determinar prontamente se expressão de miR-452 foi inibida no fígado ou hepatócitos, com o uso de, por exemplo, técnicas para determinar nível de transcrição de miRNA.

[0286] Compostos inibidores de miR-452 adeqados incluem RNA de fita simples ou dupla (como RNA ou "siRNA” de interferência pequena ou grande), antagonistas, ácidos nucleicos antissenso, RNA circular, esponjas de miRNA artificiais e moléculas enzimáticas de RNA como ribozimas. Cada um desses compostos pode ser alvejado para um determinado miRNA e destruir ou induzir a destruição do miRNA alvo. Por exemplo, a expressão de um determinado miRNA pode ser inibida induzindo-se interferência de RNA do miRNA com uma molécula de RNA de fita dupla isolada ("dsRNA") que tem pelo menos 90 %, por exemplo, 95 %, 98 %, 99 % ou 100 %, de homologia de sequência com pelo menos uma porção ou, de preferência, com a totalidade, do miRNA. Em uma modalidade preferencial, a molécula de dsRNA é um siRNA. siRNAs útil nos presente métodos compreende RNA de fita dupla curto de cerca de 17 nucleotídeos a cerca de 29 nucleotídeos em comprimento, de preferência, de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos em comprimento. O siRNA compreende uma fita de RNA senso e uma fita de RNA antissenso complementar anelados juntos por interações de pareamento de base Watson-Crick padrão (doravante "pareado com base"). A fita senso compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é substancialmente idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos contida dentro do miRNA alvo. Kits

[0287] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção também se refere a um kit que compreende meios para determinar o nível de: (i) miR-452 em uma amostra de fluido corporal, e, opcionalmente (ii) pelo menos um outro marcador de circulação de danos ao fígado.

[0288] De acordo com outro aspecto, a presente invenção também se refere a um kit que compreende meios para determinar o nível de: (i) miR-452 em uma amostra de fluido corporal, e, opcionalmente (ii) pelo menos um outro marcador de NAFLD, NASH, ou

Fibrose de fígado.

[0289] O kit da invenção é útil para implantar os métodos descritos acima. O mesmo pode ainda incluir opcionalmente instruções para implantar os ditos métodos. O kit pode compreender reagentes e tampões apropriados para conduzir medições dos níveis de miR-452 e qualquer outro marcador de circulação de danos ao fígado como fornecido acima. Em particular, o kit pode compreender anticorpos específicos para uma proteína a ser quantificada, e/ou iniciadores úteis para quantificar níveis de micro-RNA, como bem conhecido na técnica.

[0290] O kit pode compreender reagentes e tampões apropriados para conduzir medições dos níveis de miR-452 e qualquer outro marcador de NAFLD e/ou NASH.

[0291] Em uma modalidade preferencial, o kit compreende meios para determinar o nível de miR-452-5p.

[0292] Deve ser entendido que a descrição acima, bem como os exemplos a seguir se destinam a ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo das invenções serão evidentes para aqueles versados na técnica aos quais a invenção pertence.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS A. Amostras clínicas

[0293] As amostras de sangue usadas nesse estudo de biomarcador foram retiradas de pacientes do estudo GOLDEN- DIAG, coorte OBESO e RESOLVE-It.

[0294] O teste clínico de fase 2 GOLDEN-505 (NCT01694849) foi um estudo controlado por placebo, cedo duplo, randomizado, de múltiplos centros para avaliar a eficácia e segurança de Elafibranor (1-[4-metiltiofenil]-3- [3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1- ona) uma vez ao dia em esteato-hepatite em pacientes com Esteato-Hepatite Não Alcoólica (NASH). A biópsia de fígado foi realizada para confirmar o diagnóstico de NASH após exclusão apropriada de fígado doença de outra etiologia. NASH foi diagnosticado como esteato-hepatite avaliada por biópsia de fígado dentro de 6 meses antes da randomização. A confirmação de esteato-hepatite teve como base leitura central de biópsia de fígado. Os pacientes com NASH foram definidos com uma NAS ≥ 3 que inclui pontuação de esteatose ≥ 1 e balonamento de hepatócito ≥ 1 e inflamação lobular ≥

1. O estudo foi aprovado por corpos reguladores apropriados, em que todos os pacientes foram informados do consentimento para participação.

[0295] Uma biópsia de fígado de inclusão foi usada para examinação e pontuação de lesões histológicas. As amostras de sangue foram coletadas em varredura e no final do período de tratamento de 1 ano para hematologia, e análise bioquímica clínica que inclui uma lista compreensiva de parâmetros relacionados a NAFLD/NASH. Em pacientes que assinaram um consentimento informado dedicado, amostras de sangue adicionais foram coletadas para pesquisa de novo diagnóstico de biomarcadores de NASH.

[0296] As amostras de sangue usadas nesse estudo de biomarcador foram retiradas de pacientes do estudo GOLDEN- DIAG na inclusão (270 amostras) e um ano após (223 amostras).

[0297] Os inventores também tiveram acesso a amostras de sangue de ser humano de indivíduos com uma biópsia de fígado e dados biológicos e clínicos associados do UZA Biobank, a coorte OBESO. Essa coorta, que é composta por pacientes com obesidade mórbida, também compreende pacientes com NAFLD/não NASH, pacientes com NASH, pacientes cirróticos e controles saudáveis. O soro de 253 pacientes foi processado para a validação de miRNA de circulação candidato identificado no estudo GOLDEN-DIAG com tecnologia de sequenciamento de próxima geração (NGS) (HTG EdheSeq) e RT-qPCR, respectivamente. Consentimento informado, escrito para coleta, armazenamento e uso de amostras adicionais foi obtido de cada paciente.

[0298] Os inventores também tiveram acesso a amostras de sangue de ser humano de indivíduos com uma biópsia de fígado e dados biológicos e clínicos associados do estudo RESOLVE-IT. RESOLVE-IT é uma Estudo de Fase III Controlado por Placebo, Cego Duplo, Randomizado, de Múltiplos Centros (NCT02704403) para Avaliar a Eficácia e Segurança de Elafibranor em Pacientes com Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH) e fibrose. O estudo foi aprovado por corpos reguladores apropriados, em que todos os pacientes forneceram consentimento informado para participação. Uma biópsia de fígado de inclusão foi usada para examinação e pontuação de lesões histológicas. As amostras de sangue foram coletadas em varredura. Em pacientes que assinaram um consentimento informado dedicado, amostras de sangue adicionais foram coletadas para pesquisa de novo diagnóstico de biomarcadores de NASH.

[0299] O soro de 370 pacientes do estudo RESOLVE-IT em varredura com 263 que corresponde a biópsia de fígado foi processado para a validação de miRNA de circulação candidato identificado no estudo GOLDEN-DIAG com análise de sequência de Borda HTG e análise de RTqPCR.

[0300] O soro de 100 indivíduos de EFS (Etablissement Français du Sang) foi processado para a avaliação em indivíduos saudáveis de miRNA de circulação candidato identificados no estudo GOLDEN-DIAG com análise de sequência de Borda HTG. As amostras de soro foram usadas para a análise de sequência de Borda HTG.

[0301] As amostras de soro das três coortes (GOLDEN- DIAG, OBESO e RESOLVE-IT) foram usadas para a análise de sequência de Borda HTG e análise de RTqPCR. B. Amostragem de sangue e Teste laboratorial

[0302] As amostras de sangue foram coletadas de acordo com o Protocolo Laboratorial Central e Manual-Genfit - GFT505-212-7.

[0303] De acordo com o protocolo de estudo, após análises serem realizadas.

[0304] HEMATOLOGIA inclui hemoglobina, hematócrito, contagem de RBC, leucócitos, contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, monócitos, basófilos -abs. e % de valores), contagem de plaqueta e reticulócitos.

[0305] BIOQUÍMICA Painel I inclui glicose no plasma, triglicerídeos (TG), creatinina, liberação de creatinina, gama-glutamiltransferase (GGT), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), creatina fosfoquinase (CPK), fosfatase alcalina, hormônio de estimulação da tireoide (TSH) e HbA1c.

[0306] BIOQUÍMICA Painel II inclui glicose no plasma,

creatinina, liberação de creatinina, proteína total, albumina, sódio, potássio, cloreto, cálcio, ácido úrico, ureia expressada como nitrogênio de ureia no sangue (BUN), aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama-glutamiltransferase (GGT), fosfatase alcalina, creatina fosfoquinase (CPK), bilirubina total, bilirubina conjugada, proteína reativa a C (hsCRP), Razão AST/ALT e HbA1c. ANÁLISE DE URINA inclui:

[0307] - Análise por sonda (gravidade específica, pH, RBC, leucócitos, glicose, proteína, cetonas, bilirubina, urobilinogênio e nitrito)

[0308] - Análise por microscópio inclui RBC, WBC, moldes, cristais, bactérias, células epiteliais e leveduras.

[0309] - Análise química (albumina e creatinina)

[0310] SOROLOGIA inclui HIV ab I/ II, HCV ab, HCV RNA (apenas testado mediante recebimento de amostras de Visita de RNA de HCV e no caso de resultado “reativo” ou “indeterminado” para HCV Ab) e HbsAg.

[0311] PAINEL DE LIPÍDIO inclui triglicerídeos (TG), colesterol total, não HDL-C (cálculo), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C), lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) (cálculo), colesterol de lipoproteína de muito baixa densidade calculado (VLDL-C) (cálculo), apolipoproteína AI (ApoAI) e apolipoproteína B (ApoB).

[0312] QUÍMICA DE URINA inclui alfa-1-microglobulina, beta-N-acetilglicoseaminidase(beta-NAG) e neutrofil- gelatinase associada a lipocalina (N-Gal)

[0313] MARCADORES DE SEGURANÇA incluem homocisteína, NT- ProBNP, Troponina T, Cistatina C, e Beta2-microglobulina.

[0314] PARÂMETROS GLICÊMICOS E OUTROS PARÂMETROS LIPÍDICOS incluem leptina, insulina, avaliação de modelo homeostático (HOMA-IR), glicose no soro (para cálculo de HOMA-IR), frutosamina, peptídeo C e ácidos graxos livres (FFA).

[0315] MARCADORES INFLAMATÓRIOS incluem haptoglobina, fibrinogênio, fator alfa de necrose por tumor (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e inibidor ativador de plasminogênio 1 (PAI-1) Ag (citrato).

[0316] MARCADORES DE FÍGADO incluem citoqueratina-18 (CK18)(M65 & M30), adinopectina, ferritina, alfa2 macroglobulina, FGF19 & FGF21, ácido hialurônico (Advia centaur, reagência adquirida por Siemens Belgium e carregada para Genfit em passagem), pró-peptídeo de terminal N de colágeno tipo III (PIIINP) (Advia centaur, reagência adquirida por Siemens Belgium) e inibidor de tecido de matriz de metaloprotease-1 (TIMP-1) (Advia centaur, reagência adquirida por Siemens).

[0317] A lista de métodos, instrumentos e fabricante para cada ensaio bioquímico é relatada nessa tabela: Parâmetro Método Instrumento Fabricante leptina ELISA manualmente Sistemas R&D insulina CLIA Immulite Siemens 2000

Parâmetro Método Instrumento Fabricante HOMA-IR Cálculo com Glicose e Insulina frutosamina Colorimétrico Modular Roche P800 Diagnostics c-Peptídeo CLIA Immulite Siemens 2000 haptoglobulina imunoturbidimetria Modular Roche P800 Diagnostics fibrinogênio Método Clauss STAR- Stago evolução TNF alfa perfilagem de Luminex Millipore múltiplas análises de fluorocina IL-6 perfilagem de Luminex Millipore múltiplas análises de fluorocina PAI-1 Ag ELISA manualmente Stago FFA ACS-ACOD Modular Roche P800 Diagnostics CK18 M30 ELISA manualmente Peviva CK18 M65 ELISA manualmente Peviva adiponectina ELISA manualmente Millipore ferritina ECLIA Modular Roche E170 Diagnostics alfa2 nefelometria BN II Siemens macroglobulina ácido imunoensaio Advia Siemens hialurônico centaur PIIINP imunoensaio Advia Siemens centaur TIMP-1 imunoensaio Advia Siemens centaur FGF-19 ELISA manualmente Sistemas R&D

Parâmetro Método Instrumento Fabricante FGF-21 ELISA manualmente Sistemas R&D visfatina ELISA manualmente Imunoensaios Alpco resistina ELISA manualmente Sistemas R&D YKL-40, CHI3L1 Imunoensaio de proteína 1 semelhante à Quitinase 3 Humana Quantikine ® ELISA Número de Catálogo DC3L10 Para a determinação quantitativa de concentrações de proteína 1 semelhante à Quitinase 3 Humana (CHI3L1) em sobrenadantes de cultura de célula, soro, plasma e urina.

Coleta de Amostra & Armazenamento

[0318] As amostras de sangue usadas nesse estudo de biomarcador foram retiradas de pacientes do estudo

505.212.7 antes do período de tratamento. Consentimento informado, escrito para coleta, armazenamento e uso de amostras adicionais foi obtido de cada paciente.

[0319] Sangue coletado em tubos contendo citrato 2,7 ml foi processado separando-se plasma livre de célula de células de sangue dentro de 15 minutos de coleta por centrifugação a 1.500 xg por 15 minutos. O plasma de sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Os tubos foram mantidos a -70 °C.

[0320] Para prosseguir com a extração de RNA, tubos de plasma foram, então, centrifugados a 13.000 xg por 2 min para peletizar e remover as plaquetas. O plasma de sobrenadante livre de plaquetas foi transferido para um novo tubo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a - 80 °C.

[0321] O sangue coletado em tubo de separação de soro (SST) de 8,5 ml foi processado uma hora após 15 amostragens separando-se soro livre de célula das células de sangue por centrifugação entre 1.300 xg e 2.000 xg por 10 minutos. O soro foi,, então, transferido para um novo tubo. Os tubos foram mantidos a -70 °C. A extração de RNA foi realizada sem centrifugação adicional. C. Sequenciamento de Próxima Geração

[0322] O Sistema de Sequenciamento de Borda HTG foi usado para sequenciar os miRNAs contidos em amostras de soro.

[0323] Os níveis de soro de 2.083 miRNAs (miRBase) foram medidos com o uso de tecnologia de HTG-EdgeSeq-NGS. Kit de miRNA de transcriptoma completo de HTG (WTA) foi usado.

[0324] Amostras foram preparadas com o uso de 15 µl de tampão de lise de plasma e 15 µl de amostra de plasma e 3 µl de Proteinase K são misturados e incubados a 50 °C por 60 min com agitação orbital. 25 µl da mistura são transferidos para a placa de amostra de HTG e carregados no processador de HTG para realizar o ensaio de proteção de nuclease e preparar o NPP estequiométrico.

Sequenciamento e preparação de biblioteca

[0325] Tecnologia de código de barras é realizada com o uso de enzima Hemo KlenTaq. Para cada amostra, foram misturados 2,4 µl de Hemo KlenTaq, 0,6 µl de dNTPs (10 nM), 6 µl de Tampão OneTaq PCR GC 5X, 3 µl de Iniciadores Progressivo e Reverso , 3 µl de preparação de amostra e 12 µl de H20. A fim de remover excesso de iniciador da biblioteca, esferas de Agentcour AMPure XP foram usadas. A concentração de biblioteca para cada amostra foi realizada com o uso de Kit Kapa Biosystems qPCR. Cada amostra é agrupada a fim de gerar uma biblioteca agrupada e sequenciada em um Illumina NextSeq500. Para cada amostra, pelo menos 250.000 leituras são geradas. Reconstrução de dados e análise foram realizados com o uso de arquivos de FASTQ e processados pelo software HTG Parser.

[0326] Os níveis de miRNAs (número de leituras) em amostras de soro de pacientes com NASH em risco de fibrose progressão (A Serem Tratados; TBT=NAS≥4, F≥2 em exame histológico, n=109) foram comparados a níveis obtidos no soro de pacientes A Não Sere, Tratados (NTBT), n=161. Alteração de dobra (TBT vs NTBT) e significância estatística foram calculadas. Análise de Bioinformática

[0327] O objetivo da análise é constatar biomarcadores que podem estar relacionados à identificação de pacientes com NASH a serem tratados. Pacientes a serem tratado (TBT) são definidos de modo diferente de acordo com as partes diferentes do estudo.

[0328] TBT2 são definidos como: - pontuação de esteatose ≥ 1

- pontuação de balonamento de hepatócito ≥ 1 - pontuação de inflamação lobular≥ 1 - NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 (NAS é definida como a soma da pontuação de esteatose, pontuação de balonamento de hepatócito e classificação de inflamação lobular) - estágio de fibrose ≥ 2 (como uma fibrose igual a 2, 3 ou 4, em particular, 2 ou 3).

[0329] As verificações de controle de qualidade (FastQC) buscam fornecer uma maneira simples de realizar algumas verificações de controle de qualidade em dados de sequência bruta que advêm de tubulações de sequenciamento de alto rendimento.

[0330] As mesmas fornecem um conjunto modular de análises que podem ser usadas para fornecer uma impressão rápida de se os dados têm quaisquer problemas dos quais deve-se estar ciente antes de realizar qualquer análise adicional.

[0331] Kit de miRNA de transcriptoma completo de HTG (WTA) foi usado. Sequenciamento e preparação de biblioteca foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante. Para cada amostra, uma média de 931.000 leituras por amostra foi gerada. Os dados foram normalizados mediante a recomendação do fabricante para permitir comparação direta entre as diferentes amostras pelos ajustes de número de leituras. Limma, um pacote de software R/Bioconductor, desenvolveu análises diferenciais para análises de sequenciamento de HTG Edge. D. RTqPCR Quantitativa de miRNA em Soro

[0332] RNA total de soro com miRNAs preservados foi extraído de 100 µl de soro por kit de extração de miRVana Paris (AM1556, Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. miR-39-3p de C. elegans perfurado sintético foi adicionado às amostras [3.125 fmols] (cel-miR-39-3p, número de acessão de miRBase MIMAT = 0000010, 5'Phos- UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' (SEQ ID NO:4), HPLC purificado, Integrated DNA Technologies) antes da extração de RNA como controle interno de processo de extração de RNA. A eluição foi realizada em 100 µl de tampão de eluição.

[0333] Expressão de miRNAs maduros foi detectada de acordo com as instruções do fabricante com o uso do Ensaio Taqman miRNA qRT-PCR: Kit de transcrição reversa de TaqMan MicroRNA (Ref: 4366597, Applied Biosystems, Carlsbad, CA), Ensaio de MicroRNA Taqman 20X (Ref: 4440888, Applied Biosystems) e TaqMan Universal Master Mix II (Ref: 4440040, Applied Biosystems).

[0334] Transcrições reversas foram realizadas com o uso de um ciclador térmico GeneAmp® PCR System 9700 (Ref: 200005, Applied Biosystems).

[0335] PCRs quantitativas foram realizadas com o uso de um Sistema de Detecção em Tempo Real de CFX96 Touch™ - C1000 - IVD certificado, (185-5095 IVD, BioRad).

[0336] A sequência de miRNA de interesse e ID de Ensaio de Taq Man é relatada na seguinte tabela: miRNA ID Sequência Número de ID de miRbase Ensaio hsa-miR-452- AACUGUUUGCAGAGGAAACU MIMAT0001635 001032 5p GA (SEQ ID NO:1)

[0337] hsa-miRNA sintético (Integrated DNA Technologies)

foi diluído em 3,125 fmol/ml e 5 µl foram usados para transcrição reversa concomitante com RNA extraído de amostras de soro. O produto foi diluído em série e PCR foi realizado em todas as amostras (RNA padrão ou derivado de soro). Curva padrão foi realizada e usada para converter dados de Cq em cópias/µl. O modo de determinação de Cq foi Regressão. Quantificação é expressa em cópias/µl de formato de soro.

[0338] O fornecedor é IDT para o hsa-miRNA sintético.

RESULTADOS

[0339] Primeiro, níveis de circulação de 2.083 espécies de miRNA foram medidos simultaneamente em 1.216 amostras de soro de GOLDEN-DIAG, (270 em Inclusão, 223 Um Ano Após), OBESO (253 amostras na inclusão), RESOLVE-IT (370 amostras de visita de varredura) e HEALTHY (100 indivíduos EFS) através de Sequenciamento de Borda de HTG para uma seleção imparcial de miRNAs que os níveis de circulação poderiam discriminar pacientes TBT2 (TBT2 definição = NAS ≥ 4 e F ≥ 2, e pelo menos um ponto em esteatose, inflamação lobular e pontuações de balonamento de hepatócito) e indivíduos com NTBT2 (indivíduo NTBT2 difere de um indivíduo TBT2 em classificação de pelo menos um ponto menor em esteatose, balonamento de hepatócito, pontuações de inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose). Os pacientes TBT2 devem ser tratados para seu risco aumentado de evolução para resultados de fígado grave como cirrose, HCC, insuficiência hepática, transplante de fígado e morte do fígado.

[0340] A partir dessa análise, os inventores identificaram mir-452, que foi comumente sobre-expresso em amostras de soro de pacientes TBT2 em comparação com pacientes NTBT2 em coortes GOLDEN-DIAG, OBESO e RESOLVE-IT na inclusão.

[0341] Como mostrado na tabela 1, a saber e surpreendentemente, em coortes GOLDEN-DIAG, OBESO e RESOLVE, o número de leituras por milhão para hsa-miR-452- 5p foi significativamente maior em pacientes TBT2 que em pacientes NTBT2.

[0342] Por exemplo, 36 RPM (Leituras por milhão) foram obtidas em pacientes TBT2 versus 21 RPM para pacientes NTBT2 para hsa-miR-452-5p em GOLDEN-DIAG na inclusão.

[0343] Os inventores também usaram biópsia de fígado e amostras de soro coletadas no final do período de um ano de tratamento de teste GOLDEN como um terceiro conjunto de dados independentes e, novamente, foi confirmado que o número de leituras por milhão para hsa-miR-452-5p foi significativamente maior em pacientes TBT2 do que em pacientes NTBT2.

[0344] Esses resultados foram confirmados nas coortes independentes OBESO e RESOLVE-IT entre pacientes TBT2 e NTBT2.

[0345] Em coortes GOLDEN-DIAG, OBESO e RESOLVE-IT, concentrações de soro de hsa-miR-452-5p foram significativamente maiores em NTBT2 (pacientes com NAFLD com mínimas lesões histológicas) que no soro de indivíduos SAUDÁVEIS (Tabela 1).

GOLDEN-DIAG - Em inclusão RPM em RPM em Alteração de hsa_miRNA valor p NTBT2 TBT2 Dobra hsa-miR-452- 21 36 1,61 1,24E-05 5p GOLDEN-DIAG- Um Ano Após RPM em RPM em Alteração de hsa_miRNA valor p NTBT2 TBT2 Dobra hsa-miR-452- 21 40 1,97 1,83E-08 5p

OBESO RPM em RPM em Alteração de hsa_miRNA valor p NTBT2 TBT2 Dobra hsa-miR-452- 10 17 1,60 5,50E-04 5p RESOLVE-IT em inclusão RPM em RPM em Alteração de hsa_miRNA valor p NTBT2 TBT2 Dobra hsa-miR-452- 23 32 1,53 1,14E-04 5p

SAUDÁVEL hsa_miRNA RPM hsa-miR-452- 6 5p

[0346] Tabela 1: Experimento de sequenciamento de borda de HGT e número de leituras por milhão (RPM) obtidos para hsa-miR-452-5p em pacientes A Serem Tratados (TBT2) versus A Não Serem Tratados (NTBT2). Leituras por milhão (RPM) foram expressas como média de grupos de paciente NTBT2 e TBT2 (Estudo GOLDEN-DIAG - Em inclusão (109 TBT2 e 161 pacientes NTBT2) e Golden Diag - Um Ano Após (76 TBT2 e 147 NTBT2); OBESO (50 TBT2 e 202 pacientes NTBT2); RESOLVE-IT (87 TBT2 e 90 NTBT2) respectivamente; TBT2 se refere a pacientes com NAS ≥ 4 com pelo menos 1 ponto em Esteatose, Balonamento de Hepatócito e pontuações de Inflamação Lobular e estágio de fibrose ≥ 2 em examinação histológica de uma biópsia de fígado. Um indivíduo NTBT2 difere de um indivíduo TBT2 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose. Indivíduos SAUDÁVEIS são 100 EFS indivíduos sem medicamento, RPM foram expressos como média dos 100 indivíduos. Indivíduos EFS (Etablissement Français du Sang) são indivíduos saudáveis sem medicamento.

[0347] Para confirmação, níveis de hsa-mir-452-5p foram, então, medidos com o uso do método padrão gold para quantificação de oligonucleotídeos em fluidos corporais, RT-qPCR, com o uso de ensaios de miRNA de Taq Man específicos. Resultado pode ser resumido como a seguir:

[0348] - Como mostrado na tabela 2 e figuras 1-2-3-4, nas três coortes na inclusão e em GOLDEN-DIAG na semana-52, hsa-mir-452-5p concentração de soro foi significativamente maior em pacientes TBT2 do que em pacientes NTBT2. GOLDEN-DIAG - Em inclusão RT-PCR Cópias.µl-1 Cópias.µl-1 TBT2/NTBT2 quantitativo em NTBT2 em TBT2 Soro de Níveis Níveis Alteração SD SEM SD SEM valor p AUC Cópias.µl-1 médios médios de Dobra hsa-miR-452- < 12 11 1 23 17 2 1,84 0,72 5p 0,0001

GOLDEN-DIAG - Um Ano Após RT-PCR Cópias.µl-1 Cópias.µl-1 TBT2/NTBT2 quantitativo em NTBT2 em TBT2 Soro de Níveis Níveis Alteração SD SEM SD SEM valor p AUC Cópias.µl-1 médios médios de Dobra hsa-miR-452- < 13 10 1 23 18 2 1,77 0,71 5p 0,0001

OBESO RT-PCR Cópias.µl-1 Cópias.µl-1 TBT2/NTBT2 quantitativo em NTBT2 em TBT2 Soro de Níveis Níveis Alteração SD SEM SD SEM valor p AUC Cópias.µl-1 médios médios de Dobra hsa-miR-452- < 13 8 1 24 19 3 1,83 0,72 5p 0,0001

SOLUCINAR RT-PCR Cópias.µl-1 Cópias.µl-1 TBT2/NTBT2 quantitativo em NTBT2 em TBT2 Soro de Níveis Níveis Alteração SD SEM SD SEM valor p AUC Cópias.µl-1 médios médios de Dobra hsa-miR-452- 14 12 1 27 25 2 1,93 <0,0001 0,73 5p

[0349] Tabela 2: Experimentos de RT-qPCR para confirmação/validação de super-expressão de hsa-miR-452-5p em Pacientes A Serem Tratados (TBT2) versus Pacientes A Não Serem Tratados (NTBT2). Significância estatística TBT2 vs NTBT2 foi calculada com o uso do teste de Mann Whitney não paramétrico. TBT2 se refere a pacientes com NAS ≥ 4 com esteatose, balonamento de hepatócito e pontuações de inflamação lobular ≥ 1 e estágio de fibrose ≥ 2 em examinação histológica de uma biópsia de fígado. AUC = Área sob a curva de Característica de Operação de Receptor foi obtida para identificação de TBT2 vs NTBT2.

[0350] - Conforme mostrado nas figuras 1 ao aplicar uma segunda definição de pacientes TBT e pacientes com NTBT (TBT1 vs. NTNT1) na coorte GOLDEN-DIAG na inclusão, análises mostraram que concentração de soro de hsa-miR-452- 5p foi significativamente maior em pacientes TBT1 do que em pacientes NTBT1. Nessas análises, TBT1 se refere a pacientes com NAS ≥ 4 com pelo menos 1 ponto em esteatose, Balonamento de hepatócito e pontuações de Inflamação Lobular e estágio de fibrose ≥ 1 em examinação histológica de uma biópsia de fígado. Um indivíduo NTBT1 difere de um indivíduo TBT1 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose.

[0351] - Conforme mostrado nas figuras 1 ao aplicar uma terceira definição de pacientes TBT e pacientes com NTBT (TBT7 vs. NTBT7) na coorte GOLDEN-DIAG na inclusão, análises mostraram que concentração de soro de hsa-miR-452- 5p foi significativamente maior em pacientes TBT7 do que em pacientes NTBT7. Nessas análises, TBT7 se refere a pacientes com NAS ≥ 4 com pelo menos 1 ponto em esteatose, balonamento de hepatócito e pontuações de Inflamação Lobular e estágio de fibrose ≥ 1 em examinação histológica de uma biópsia de fígado. Um indivíduo NTBT1 difere de um indivíduo TBT1 na classificação de pelo menos um ponto menor em pontuações de esteatose, balonamento de hepatócito, inflamação lobular, NAS e/ou estágio de fibrose.

[0352] - Conforme mostrado nas Figuras 2, 3 e 4, nas três coortes, concentrações de soro de hsa-miR-452-5p foram significativamente maiores em pacientes com NASH Ativa (NAS ≥ 4 com pelo menos um ponto em esteatose, inflamação lobular e balonamento de hepatócito) do que em pacientes não NASH e pacientes com NASH amena (NAS < 4).

[0353] - Conforme mostrado nas figuras 2, 3 e 4, nas três coortes, concentrações de soro de hsa-mir-452-5p foram significativamente maiores em pacientes com fibrose significativa ou maior estágio de fibrose (F ≥ 2) do que em pacientes com nenhuma fibrose ou fibrose mínima (F < 2). Análises adicionais de experimentos de RT-qPCR realizados em amostras de soro de GOLDEN-DIAG na inclusão que mostram fortes correlações entre níveis de circulação de espécies de miR-452 e pontuações histológicas e estágio de fibrose são fornecidas (resultados similares foram obtidos com o uso de amostras de OBESO e RESOLVE-IT):

[0354] - Conforme mostrado na figura 5, nível de circulação de hsa-miR-452-5p correlacionado positivamente com pontuação de esteatose, pontuação de inflamação lobular, pontuação de balonamento de hepatócito. Consequentemente, nível de circulação de miR-452-5p correlacionado significativa e positivamente com NAS e índice de atividade. Finalmente, houve uma forte correlação entre nível de circulação de miR-452-5p e estágio de fibrose.

[0355] Os resultados apresentados na tabela 3 a seguir ilustram correlações significativas entre alterações em níveis de circulação de hsa-miR-452-5p e evolução de NAS, NASH Índice de Atividade e Fibrose após 52 semanas em pacientes GOLDEN.

GOLDEN-DIAG (Semana 52 - Inclusão) Alteração em concentração de soro de miR (ΔmiR) vs Evolução de Índice de Atividade (ΔAI) Valor P Aprimoramento Estável Piora (teste de (ΔAI<0) (ΔAI=0) (ΔAI>0) Kruskal Wallis) ΔmiR-452- 5p 1,237 ± 0,56 ± - -1,81 ± 1,54 0,2124 (cópias.µl 1,61 2,26 1) GOLDEN-DIAG (Semana 52 - Inclusão) Alteração em concentração de soro de miR (ΔmiR) vs Evolução de NAS (ΔNAS) Valor P Aprimoramento Estável Piora (teste de (ΔNAS<0) (ΔNAS=0) (ΔNAS>0) Kruskal Wallis) ΔmiR-452- 5p 2.069 ± 0,8237 ± - -2,39 ± 1,60 0,055 (cópias.µl 1,64 1,95 1) GOLDEN-DIAG (Semana 52 - Inclusão) Alteração em concentração de soro de miR (ΔmiR) vs Evolução de Fibrose (ΔF) Valor P Aprimoramento Estável Piora (teste de (ΔF<0) (ΔF=0) (ΔF>0) Kruskal Wallis) ΔmiR-452- 5p -0,23 ± 1,01 ± -1.491 ± 1,45 0,7550 (cópias.µl- 1,32 3,15 1)

[0356] Tabela 3: A correlação de alterações em níveis de soro de hsa-miR-452-5p e as evoluções de Índice de Atividade (AI), NAS e Fibrose durante o teste GOLDEN de um ano. Conclusão: i) esses resultados, com base em medição de níveis de miRNA em amostras de soro e plasma com o uso de duas metodologias diferentes (HTG Edge-Seq e RTqPCR) suportam o uso de hsa-mir-452-5p e, mais geralmente, oligonucleotídeos relacionados a hsa-miR-452 como biomarcadores de diagnóstico de circulação para identificação de pacientes com NAFLD (NAS ≥ 1), NASH (NAS ≥ 3 com pelo menos 1 ponto em esteatose, pelo menos 1 ponto em inflamação lobular e pelo menos 1 ponto em pontuações de balonamento de hepatócito), NASH Ativa (NAS ≥ 4 com pelo menos 1 ponto em esteatose, pelo menos 1 ponto em inflamação lobular e pelo menos 1 ponto em pontuações de balonamento de hepatócito), fibrose significativa (F ≥ 2), e/ou NASH Ativa e fibrose (TBT1, TBT2, TBT7). ii) esses resultados, com base em medição de níveis de miRNA em amostras de soro suportam o uso de espécies de hsa-miR-452 como biomarcadores de diagnóstico de circulação para classificação não invasiva de lesões histológicas (esteatose, inflamação lobular, balonamento de hepatócito), avaliação de atividade de NASH (NAS ou Índice de Atividade) e avaliação de doença gravidade (estágio de fibrose) em um indivíduo. iii) esses resultados, com base em medição de níveis de miRNA em amostras de soro e plasma suportam o uso de espécies de hsa-miR-452 como biomarcadores de diagnóstico de circulação para classificação não invasiva de lesões histológicas (esteatose, inflamação lobular, balonamento de hepatócito), avaliação de atividade de NASH (NAS ou Índice de Atividade) e avaliação de doença gravidade (estágio de fibrose) em um indivíduo. iv) esses resultados, com base em medição de níveis de miRNA em amostras de soro e plasma suportam o uso de espécies de hsa-miR-452 como biomarcadores de circulação para monitorar evolução de atividade de NAFLD, atividade de NASH ou estágio de fibrose em um mesmo paciente ou o paciente é tratado ou não com u fármaco anti-NAFLD, um fármaco anti-NASH ou um fármaco anti-fibrótico. v) Finalmente, o estado da técnica que liga o nível de atividade de NASH ao risco de evolução de fibrose e que liga o estágio de fibrose ao risco de resultados de fígado a longo prazo (cirrose, transplante de fígado, HCC ou morte do fígado), suporta espécies de miR-452 como biomarcadores de prognóstico para avaliar o risco de evolução de fibrose para cirrose e para estimar o risco de complicações severas a longo prazo. Referências

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Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para diagnosticar ou monitorar uma doença de fígado gorduroso não alcoólico (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e/ou fibrose de fígado, e/ou para determinar a eficácia de um tratamento de uma NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado, caracterizado por compreender determinar o nível de miR-452 em uma amostra de fluido corporal do dito indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que miR-452 é hsa-miR-452, em particular, hsa-miR-452-5p, hsa-miR-452-3p.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender determinar o nível de hsa- miR-452-5p.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue, plasma ou soro.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o nível de miR-452 é comparado a níveis de referência de miR-

452.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um nível de miR-452 que é maior que níveis de referência obtidos em amostras de indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose-hepática indica a presença de NAFLD.

7. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que um nível do dito pelo menos um microRNA, que é maior que um nível de referência obtido em amostras de indivíduos saudáveis com nenhuma esteatose- hepática, indica a presença de NAFL.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um nível de miR-452 que é maior que níveis de faixa de referência obtidos em amostras de um indivíduo não NASH indica a presença de NASH definida como pelo menos um ponto em esteatose, inflamação lobular e pontuação de balonamento de hepatócito.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um nível de miR-452 que é maior que um nível de faixa de referência obtido em amostras de indivíduos sem NASH Ativa indica a presença de NASH Ativa definida como NAS ≥ 4 com pelo menos um ponto em esteatose, um ponto em inflamação lobular e um ponto nas pontuações de balonamento de hepatócito.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um nível de miR-452 que é maior que níveis de referência obtidos em amostras de indivíduos com nenhuma fibrose ou fibrose mínima de fígado (F = 0 ou 1) indica a presença de uma fibrose de fígado significativa (F = 2), moderada (F = 3) ou severa (F = 4).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender a classificação de um indivíduo como sendo receptor potencial (TBT) ou não receptor (NTBT) de um tratamento para NASH e/ou fibrose de fígado, com base na detecção de um nível aumentado de miR-452 em relação a um nível de referência de miR-452 medido em indivíduos com NTBT.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,

caracterizado pelo fato de que indivíduos com NTBT e TBT têm as seguintes classificações derivadas de biópsia de fígado: a) TBT1: pontuação de esteatose ≥ 1 pontuação de balonamento de hepatócito ≥ 1 pontuação de inflamação lobular ≥ 1 NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 estágio de fibrose ≥ 1 (como um estágio de fibrose igual a 1, 2, 3 ou 4 3) NTBT1: difere de TBT1 em uma classificação de pelo menos um ponto menor em qualquer um dentre pontuação de esteatose, pontuação de balonamento de hepatócito, pontuação de inflamação lobular, NAS ou estágio de fibrose; ou b) TBT2: pontuação de esteatose ≥ 1 pontuação de balonamento de hepatócito ≥ 1 pontuação de inflamação lobular ≥ 1 NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 estágio de fibrose ≥ 2 (como um estágio de fibrose igual a 2, 3 ou 4, em particular, 2 ou 3) NTBT2: difere de TBT em uma classificação de pelo menos um ponto menor em qualquer um dentre pontuação de esteatose, pontuação de balonamento de hepatócito, pontuação de inflamação lobular, NAS ou estágio de fibrose;

ou c) TBT7: pontuação de esteatose ≥ 1 pontuação de balonamento de hepatócito ≥ 1 pontuação de inflamação lobular ≥ 1 NAS (Pontuação de Atividade de NAFLD) ≥ 4 estágio de fibrose = 1b, 1c, 2, 3 ou 4 NTBT7: difere de TBT em uma classificação de pelo menos um ponto menor em qualquer um dentre pontuação de esteatose, pontuação de balonamento de hepatócito, pontuação de inflamação lobular, NAS ou estágio de fibrose.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender monitorar a evolução de atividade de NAFLD, atividade de NASH ou fibrose de fígado no indivíduo com base na evolução do nível de miR-452 em amostras coletadas duas ou mais vezes separadas do mesmo indivíduo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser para avaliar a eficácia de um tratamento de NAFLD, NASH ou fibrose de fígado, com base na evolução do nível de miR-452 em amostras coletadas duas ou mais vezes separadas do mesmo indivíduo tratado.

15. Composto anti-NAFLD, anti-NASH ou anti-fibrose caracterizado por ser para uso em um método para tratar um indivíduo que tem NAFLD, NASH ou fibrose de fígado, respectivamente, em que o indivíduo é diagnosticado ou classificado como um paciente a ser tratado devido a NAFLD,

NASH ou fibrose de fígado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e administrar o dito composto ao dito indivíduo diagnosticado.

16. Composto inibidor de miR-452 caracterizado por ser para uso em um método para tratar um indivíduo que tem NAFLD, NASH e/ou fibrose de fígado.

17. Composto inibidor de miR-452 para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado ou classificado a ser tratado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

18. Método para o diagnóstico de esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e/ou para determinar a atividade, o estágio, ou a gravidade de NASH em um indivíduo, e/ou para a classificação de um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para NASH, e/ou para a avaliação da eficácia de um tratamento médico, e/ou para a determinação da progressão ou da regressão da patologia em pacientes com NASH, e/ou para a classificação de um paciente como um respondedor potencial ou não respondedor a um tratamento médico, e/ou para a predição de resultado de doença para um paciente, e/ou para a identificação de marcadores substitutos de resultados de relevância clínica, caracterizado por compreender a medição do nível de sangue, soro ou plasma em que circula hsa-miR-452 e pelo menos um outro marcador de circulação de sangue, soro ou plasma de danos ao fígado.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por ser para o diagnóstico de NASH ou para a classificação de um indivíduo como um receptor ou não receptor de um tratamento para NASH.

20. kit caracterizado por compreender meios para determinar o nível de: (i) hsa-miR-452 (em particular, hsa-miR-452-5p), e (ii) pelo menos um marcador de circulação de sangue, soro ou plasma de danos ao fígado.

21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por ser para uso no método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

22. Molécula anti-NASH caracterizada por ser para uso em um método para o tratamento de NASH, em que a dita molécula anti-NASH é administrada a um paciente que necessita do mesmo diagnosticado com NASH ou classificado de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

23. Molécula anti-NASH para uso, de acordo com a reivindicação 22, sendo a dita molécula caracterizada por ser da fórmula (I): X1 A R4

O X2 R5 em que: X1 representa um halogênio, um grupo R1, ou G1-R1; A representa um grupo CH=CH ou um grupo CH2-CH2; X2 representa um grupo G2-R2; G1 e G2, idênticos ou diferentes, representam um átomo de oxigênio ou enxofre; R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila não substituído, um grupo arila ou um grupo alquila que é substituído por um ou mais átomos de halogênio, um grupo alcóxi ou alquiltio, grupos cicloalquila, grupos cicloalquiltio ou grupos heterocíclicos; R2 representa um grupo alquila substituída por pelo menos um grupo -COOR3, em que R3 representa um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, ou grupos heterocíclicos R4 e R5, idênticos ou diferentes, que representam um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, grupos heterocíclicos; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

24. Molécula anti-NASH para uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em 1- [4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil- 4-isopropilox carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonildimetilmetiloxifenil] prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4- trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil] prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetil oxifenil]prop-2-en-1-ona, ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil] fenoxi]-2-

metilpropanoico, e éster isopropílico de ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2- metil-propanoico; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em particular, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que a molécula anti-NASH é Elafibranor, opcionalmente combinado com outra molécula anti-NASH, como nitazoxanida, vitamina E ou pioglitazona, ácido obeticólico, elafibranor, selonsertib, saroglitazar e cenicrivoc.

26. Molécula anti-fibrótica caracterizada por ser para uso em um método para o tratamento de fibrose de fígado, em que a dita molécula anti-fibrótica é administrada a um paciente que necessita da mesma diagnosticado com fibrose de fígado ou classificado como um paciente a ser tratado ou classificado como um receptor de um tratamento de fibrose de fígado de acordo com o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

27. Molécula anti-fibrótica para uso, de acordo com a reivindicação 26, sendo a dita molécula caracterizada por ser da fórmula (I): X1 A R4

O X2 R5 em que: X1 representa um halogênio, um grupo R1, ou G1-R1;

A representa um grupo CH=CH ou um grupo CH2-CH2; X2 representa um grupo G2-R2; G1 e G2, idênticos ou diferentes, representam um átomo de oxigênio ou enxofre; R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila não substituído, um grupo arila ou um grupo alquila que é substituído por um ou mais átomos de halogênio, um grupo alcóxi ou alquiltio, grupos cicloalquila, grupos cicloalquiltio ou grupos heterocíclicos; R2 representa um grupo alquila substituída por pelo menos um grupo -COOR3, em que R3 representa um átomo de hidrogênio, ou um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, ou grupos heterocíclicos. R4 e R5, idênticos ou diferentes, que representam um grupo alquila que é substituído ou não por um ou mais átomos de halogênio, grupos cicloalquila, grupos heterocíclicos; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

28. Molécula anti-fibrótica para uso, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizada pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em 1- [4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4-carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil- 4-isopropilox carbonildimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonildimetilmetiloxifenil] prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonil dimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometilfenil]-3-[3,5-dimetil-4-

carboxidimetilmetiloxifenil]prop-2-en-1-ona, 1-[4- trifluorometil oxifenil]-3-[3,5-dimetil-4- tercbutiloxicarbonildimetilmetiloxi fenil] prop-2-en-1-ona, 1-[4-trifluorometiloxifenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetil oxifenil]prop-2-en-1-ona, ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio)fenil]-3-oxo-propil] fenoxi]-2- metilpropanoico, e éster isopropílico de ácido 2-[2,6- dimetil-4-[3-[4-(metiltio) fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2- metil-propanoico; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em particular, 1-[4-metiltiofenil]-3-[3,5-dimetil-4- carboxidimetilmetiloxi fenil]prop-2-en-1-ona ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a molécula anti-fibrótica é Elafibranor, opcionalmente combinado com outra molécula anti-fibrótica, como nitazoxanida, vitamina E ou pioglitazona, ácido obeticólico, elafibranor, selonsertib, saroglitazar e cenicrivoc.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a molécula anti-fibrótica é nitazoxanida, opcionalmente combinada com outra molécula anti-fibrótica, como vitamina E ou pioglitazona, ácido obeticólico, elafibranor, selonsertib, saroglitazar e cenicrivoc.