KR101806511B1 - 췌장암 암줄기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

췌장암 암줄기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커, 마커 검출 방법 및 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 췌장암 세포주로부터 발굴된 마커로서, 췌장암 줄기세포 마커 검출을 통하여 췌장암, 특히 조기의 췌장암을 검출할 수 있는 마커이다. 또한, 본 발명의 마커를 이용하면 췌장암을 정확하게 진단 및 예후를 분석 할 수 있다.

Description

췌장암 암줄기세포 특성을 이용한 췌장암 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarkers Indicative of Pancreatic Cancer Using Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics and Using Their Uses}
본 발명은 췌장암 암줄기세포 특이 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포(cancer stem cells or tumor initiating cells)가 존재하며, 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다(BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery, 8:806-823(2009)). 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며, 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단을 위한 진단용 마커 개발에도 도움이 될 것이다.
췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 80-90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타민(gemcitabine), 타르세바(tarceva)를 포함한 몇 항암제의 치료 효과는 지극히 실망적이며, 항암치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 췌장암 암줄기세포 및/또는 췌장암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 췌장암 암줄기세포 생물학적 특성에 근거한 진단, 특히 췌장암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커 및 향후 치료표적에 사용할 수 있는 표지자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 췌장암 암줄기세포 특이 바이오마커 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 암줄기세포 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 췌장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 (ⅰ) 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer), 또는 (ⅱ) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 암줄기세포 마커 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 (ⅰ) 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer), 또는 (ⅱ) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 췌장암 암줄기세포 및/또는 췌장암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 췌장암 암줄기세포를 진단, 특히 췌장암을 조기에 진단할 수 있을 뿐 만 아니라 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명하였다.
본 발명은 췌장암 세포주로부터 분리된 췌장암 암줄기세포로부터 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하여 규명된 신규한 췌장암 암줄기세포 마커로서, 췌장암을 조기에 매우 정확하게 진단 및 예후를 분석할 수 있는 특징을 가진다.
본 명세서에서 표현 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 “췌장암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명에서 용어 “췌장암(pancreatic cancer)”이란 췌장 세포에서 기원하는 암을 의미한다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있는데 췌관세포에서 발생한 췌관 선암종이 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관 선암종을 의미한다. 그 외에 낭종성암(낭선암), 내분비종양 등이 있다. 췌장암 환자 중 약 5-10%는 유전 소인을 가지고 있는데, 췌장암 환자에서 췌장암의 가족력이 있는 경우는 약 7.8% 정도로 일반인에서의 췌장암 발생률 0.6%에 비해 빈도가 높다. 췌장암은 5년 생존율이 5% 이하로 예후가 매우 나쁜 암이다. 그 이유는 대부분 암이 진행된 후에 발견되기 때문에 발견 당시 수술 절제가 가능한 경우가 20% 이내이고, 육안으로 보기에 완전히 절제되었다 하더라도 미세 전이에 의해 생존율 향상이 적으며, 항암제 및 방사선 치료에 대한 반응이 낮기 때문이다. 따라서, 생존율을 향상시킬 수 있는 가장 중요한 방법은 증상이 없거나 비특이적일 때 조기 발견하여 수술하는 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 췌장암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어 “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 췌장암 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 췌장암을 가진 세포 또는 조직에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 췌장암 진단 마커는 Genbank 접근번호가 AAH14372.2인 단백질, Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로서, 췌장암 암줄기세포에서 발현이 증가하는 단백질이다. 이러한 마커들은 단백질 뿐 만 아니라 어느 하나의 단백질을 코딩하는 DNA 또는 mRNA을 포함하며, 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다.
본 발명에서 췌장암을 진단에 있어서 사용되는 표현 “단백질 발현수준 측정”은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 췌장암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 췌장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 췌장암 암줄기세포 및/또는 췌장암을 진단하기 위하여 상기 단백질군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과 각각 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)을 포함하며, 보다 바람직하게는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메릭 항체이고, 보다 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.
상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 단백질군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.
본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 췌장암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트(multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두 개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.
본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.
본 발명의 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 췌장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 췌장암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 췌장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 췌장암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 췌장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 췌장암 의심 환자의 실제 췌장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 췌장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 췌장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 췌장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 췌장 조직 및 췌장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 바람직하게는, 상기 췌장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 췌장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.
본 발명에서 췌장암을 진단하기 위하여 사용되는 표현 “폴리뉴클레오타이드 측정”은 생물학적 시료에서 본원 발명의 단백질 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 마커로 사용되는 상기 단백질군으로부터 선택되는 각각의 단백질 마커를 코딩하는 염기서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA의 단편을 의미한다.
본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 줄기세포 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 단백질군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던블롯팅(Nothern blotting), DNA 칩 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 본 발명의 방법은 인간의 췌장 세포 시료로부터 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준을 측정하고, 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 또는 뉴클레오타이드 발현 수준과 비교하는 방법으로 수행된다.
본 발명의 암줄기세포를 가지는 췌장암 진단 마커를 검출하는 방법을 췌장암 환자의 세포 시료를 가지고 수행하는 경우, 시료를 채취한 환자의 췌장암 예후를 판단할 수 있게 된다.
상기 정상 대조군 시료란, 암에 걸리지 않은 인간으로부터 채취한 췌장 세포, 암이 없는 정상 췌장 세포, 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 이미 확인된 시료로서, 예컨대 비 점착성 배양 조건 하에서 구를 형성하지 않는 등 암줄기세포를 포함하지 않는 것으로 확인된 췌장암 세포주 시료, 또는 악성이 아닌 것으로 확인된 췌장암 환자의 암 이외의 세포 시료 등을 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 정상 대조군 시료 내 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 발현 수준도 상술한 바와 동일한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현량과 암줄기세포 검출 대상인 췌장암 환자에서의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 췌장암 환자 시료 내 암줄기세포 포함여부를 진단할 수 있다.
구체적으로, 환자 시료의 상기 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현 수준이 정상 대조군 시료의 상기 단백질들로 이루어진 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 발현 수준의 150% 이상인 경우 췌장암 암줄기세포를 포함하는 것으로 판단한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001619.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH70129.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서의 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 하나 이상의 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 고발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 췌장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
본 발명자들은 상기 단백질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 경우, 일반 췌장 암세포와 달리 췌장암 암줄기세포 내에서 그 발현이 현저히 증가한다는 사실을 발견하였다. 일반 췌장 암세포와는 달리 췌장암 암줄기세포 내에서만 타겟 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 발현이 특이적으로 현저하게 증가한다는 것은 그것이 암줄기세포의 생존에 있어 필수적인 요소임을 지시하며, 이의 발현을 차단하는 물질은 암줄기세포의 성장 억제 및 사멸을 유도함으로써 췌장암의 근본적 치료에 도움이 되는 물질, 즉 췌장암 치료제로 판정된다.
상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 췌장암 치료제는 암 조직의 대부분을 차지하는 일반 암세포만를 타겟으로 하는 것이 아니라, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 췌장암 암줄기세포를 그 타겟으로 하므로, 췌장암의 근본적인 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.0001-10000 /kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 GLRX3 활성 억제제 또는 GLRX3발현 억제제는 암줄기세포 마커인 CD24, CD44 및 ESA를 발현하는 세포를 감소시키며, 암줄기세포의 특징인 증식율 및 이동능을 감소시킨다. 또한, 스피어 형성을 감소시켜, 결과적으로 암 발생의 초기 현상으로 인식되는 암줄기세포의 증식을 억제 할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제는 GLRX3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩타이드, 작은 분자량 화합물 또는 천연추출물이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 GLRX3 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. GLRX3 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 GLRX3 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
GLRX3에 특이적으로 결합하여 GLRX3의 활성을 억제할 수 있는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)).
GLRX3의 활성을 억제하는 작은 분자량의 화합물은 후술하는 스크리닝 방법을 통하여 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명에서 이용되는 GLRX3 발현 억제제는 GLRX3 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 shRNA 올리고뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 GLRX3 mRNA에 상보적이고 GLRX3 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, GLRX3 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 디자인은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다(Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, GLRX3의 발현억제제는 GLRX3 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA 또는 shRNA이다.
본 발명에서 용어 "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(p53 mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(p53 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.
siRNA 말단 구조는 p53 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열목록 제 1서열의 GLRX3유전자의 591 번째 내지 616 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열로, 서열목록 제2서열 및 제3 서열에 기재된 siRNA 이고, 상기 shRNA는 서열목록 제 1서열의 GLRX3유전자의 496 번째 내지 516 번째 뉴클레오타이드에 상보적인 서열로, 서열목록 제 4 서열에 기재된 shRNA이다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 억제제 또는 발현 억제제의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 바람직하게는, 상기 암은 암줄기세포에 의한 것이고, 보다 바람직하게는 상기 암은 췌장암이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GLRX3(Glutaredoxin-3)의 활성 또는 발현을 억제하는 단계를 포함하는 암 세포의 증식 억제 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 암 세포는 암줄기세포이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 췌장암 줄기세포 및 췌장암에 대한 신규한 분자 마커, 마커 검출 방법 및 스크리닝 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 췌장암 세포주로부터 발굴된 마커로서, 췌장암 줄기세포 마커 검출을 통하여 췌장암, 특히 조기의 췌장암을 검출할 수 있는 마커이다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 마커를 이용하면 췌장암을 정확하게 진단 및 예후를 분석 할 수 있다.
도 1은 인체 췌장암 세포주(Hpac, CAPAN1, CAPAN2, CFPAC, ASPC1, BXPC3, MIAPACA2 및 PANC1)들을 스피어 배양한 결과이다. Hpac, CAPAN1 및 CAPAN2에서 스피어가 형성되는 것을 결과를 나타내었다.
도 2a-2b는 스피어 세포에서 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석한 것이다. 도 2a는 Hpac 접착에 비해 스피어 세포에서 암 줄기세포 신호 체계로 알려진 Notch, Hedgehog 및 wnt 시그널링이 활성화된 결과이다. 도 2b는 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4, nanog 및 암 줄기세포 마커로 알려진 ABGC2가 증가하는 결과를 보여준다.
도 3은 스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커의 발현을 분석한 것이다. 암 줄기세포 마커로 보고된 CD44 및 PROM2 등이 스피어 세포에서 증가되어 있음을 확인할 수 있다.
도 4a-4c는 잘 알려진 줄기세포 신호 차단 약물에 의한 스피어 형성 억제를 확인한 결과이다. 도 4a는 약물에 의해 스피어 형성 억제를 보여주는 현미경 사진이다. 도 4b는 약물에 의한 스피어 형성 억제시 스피어 세포의 직경 차이를 그래프로 나타낸 것이다. 도 4c는 약물에 따른 스피어 형성 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 이와 같은 결과들을 토대로 줄기세포 신호 차단 약물에 의해 스피어 형성이 억제되었으며, 스피어의 직경 및 수도 줄어드는 것을 확인 할 수 있다.
도 5a-5c는 Hpac 부착 세포와 스피어 세포의 암화 능력 차이를 확인한 결과 이미지이다. 도 5a는 종양이 형성된 면역제어 마우스의 췌장과 폐전이를 보여주는 이미지이다. 도 5b는 마우스의 췌장 및 전이가 관찰된 기관을 떼어 내어 H&E 면역 염색한 이미지이다. 도 5c는 Hpac 의 부착 세포와 스피어 세포의 종양 크기 차이를 그래프로 나타낸 것이다. Hpac 부착 세포와 스피어 세포를 면역제어 마우스에 in situ 이식하여 종양 형성 능력을 비교하였을 때, 암 줄기세포의 특성을 지니는 Hpac-스피어를 이식한 그룹에서 암 형성능력이 높게 나타났고, 폐와 복막 등 기관 및 조직으로의 전이가 관찰되는 결과를 나타냈다.
도 6는 부착 세포와 스피어 세포의 배양액의 분비 단백질을 분석하기 위해 2D 젤 전기영동한 이미지이다. 접착 대비 스피어에서 2배 이상 증가한 스팟이 55개 검출되었다.
도 7은 동정된 분비 단백질들의 발현을 Hpac과 Capan1세포의 접착 및 스피어 배양액에서 웨스턴 블롯을 통하여 확인한 결과이다. AKR1B1, HSP90, ALDH, Vimentin및 GLRX3가 Hpac 스피어 또는 CAPAN1 스피어의 배양액에서 증가되어 있음을 알 수 있다.
도 8은 AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1, Miapaca-2 의 8종의 췌장암 세포주 및 HPDE에서의 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 암줄기세포 마커인 CD24, CD44 및ESA를 모두 발현하는 세포 (CD24+/CD44+/ESA+) 및 3 종류의 마커를 모두 발현하지 않는 세포(CD24-/CD44-/ESA-)로 췌장암 세포를 분획한 세포에서 GLRX3 발현을 확인한 결과이다.
도 10은 은 상기 결과는GLRX3 siRNA와 콘트롤 siRNA를 도입했을 때, 암줄기세포 마커 3종류(CD24+/CD44+/ESA+)의 발현 변화를 확인한 결과이다
도 11a 및 11b는 GLRX3 녹-다운(k/d) 세포주에서 GLRX3의 억제로 인한 변화를 확인한 결과로, 도 11a는 GLRX3에 대한 mRNA 및 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블럿 결과이며, 도 11b 및 도 11c는 세포 증식율을 확인한 결과이다.
도 12a 및 12b는 GLRX3 녹-다운에 따른 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인한 결과로, 도 12a는 GLRX3 k/d 세포주의 스피어 형성 능력을 확인한 결과이며, 도 12b는 생존율 및 증식율을 확인한 결과이다.
도 13은 인체 췌장암 조직 마이크로 어레이에서 면역조직 화학염색을 통하여 분비 단백질들을 확인한 이미지이다. AGPAT4및 GLRX3를 포함한 7개의 분비 단백질들이 췌장암 조직에서 증가되어 있는 결과이다.
도 14는 인체 정상 췌장 조직과 췌장암 조직에서 AGPAT4및 GLRX3 를 포함한 7개의 분비 단백질들의 발현을 확인한 이미지이다. 7개의 단백질 모두 정상 췌장조직에 비해 췌장암 조직에서 현저히 높은 발현을 보여주고 있다.
도 15a는 기존에 췌장암 마커로 사용되고 있는 CA 19-9를 췌장암 환자의 혈청에서 확인한 결과이다.
도 15b는 기존에 췌장암 마커로 사용되고 있는 CEA를 췌장암 환자의 혈청에서 확인한 결과이다. CA19-9와 CEA가 현재 사용되고 있는 췌장암 진단 마커이지만 환자마다 CA19-9 및 CEA의 발현이 확연히 차이가 나는 것을 확인할 수 있다.
도 16a-16b는 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS(Multiple affinity removal column system)를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 MSK2 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 16a는 MSK2 단백질의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 16b는 MSK2 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 17a-17b는 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 비멘틴(vimentin) 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 17a는 비멘틴 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 17b는 비멘틴 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인과 만성 췌장염 환자의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 18a-18b는 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 ALDH 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 18a는 ALDH 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 18b는 ALDH 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인과 만성 췌장염의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 19a-19b는 정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자들의 혈청을 MARS를 사용하여 검출한 후 웨스턴 블롯을 통하여 분비된 단백질 중 GLRX3 단백질의 발현을 확인한 결과이다. 도 19a는 GLRX3 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 19b는 GLRX3 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 덴시토메트리로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 정상인과 만성 췌장염의 혈청에 비해 췌장암 혈청에서 높게 발현되는 결과이다.
도 20a 및 20b는 췌장암 환자 혈청에서 GLRX3 발현을 ELISA를 통해 확인한 결과이다. 도 20a는 정상 대조군 환자, 만성 췌장염 환자 및 췌장암 환자의 혈액을 분리하여 GLRX3의 발현을 비교한 결과이고, 도 20b는 GLRX3의 발현 정도가 1800 ng/㎖ 이상인 환자와 1800 ng/㎖ 이하인 환자의 생존기간을 비교한 그래프이다.
실시예
다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.
실험 재료 및 방법
인체 췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양
인체 췌장암 세포주 8주 (Hpac, Capan1, Capan2, Cfpac1, Aspc1, Bxpc3, Miapaca2, Panc1)는 모두 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하였으며, ATCC에 의해 제시된 프로토콜에 의해 세포주들을 성장 배지에서 배양하였다. 즉, AsPC-1 및 BxPC-3 세포는 10% 우태아혈청(FBS; Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였고, Capan-1 및 CFPAC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 IMDM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Capan-2 세포는 10% FBS를 포함한 맥코이 5a(Invitrogen Gibco)에서, 그리고 MIA PaCa-2 세포는 10% FBS 및 2.5% 마혈청(Hyclone)을 포함하는 DMEM(Invitrogen Gibco)에서 배양하였다. Hpac 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM/햄 F12(D/F12; Invitrogen Gibco)에서, 그리고 PANC-1 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다.
스피어(Sphere) 배양을 위하여 췌장암 세포주들을 EGF(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), bFGF(10 ng/㎖, R&D Systems Inc.), 1ITS(insulin transferring selenium, Gibco) 및 0.5% FBS을 보충한 혈청 프리 DMEM/F12 배지에 1000 세포/㎖의 비율로 6-웰 울트라 로우 클러스터 플레이트(Corning Inc., Corning NY)에 접종 후 7일-10일 동안 배양하였다. 같은 배양액으로 배양 접시(Nalgene Nunc Int., Rochester, NY)에 부착시켜 접합(adherent) 상태에서 키운 세포를 대조군으로 하였다.
스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현 분석
RNAeasy Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 Hpac 접착과 스피어 세포의 총 RNA를 추출하였다. Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 42℃에서 한 시간 동안 추출된 각각의 RNA 2 ㎍를 역전사 반응시켰다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현을 분석하였고, 베타 액틴(Beta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 암 줄기세포 관련 유전자들의 프라이머 염기 서열, PCR 반응 온도 및 싸이클수는 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 정방향 프라이머 염기서열
(5’-3’)		 역방향 프라이머 염기서열
(5’-3’)		 Tm/사이클
Jagged 1 CTCAATTACTGTGGGACTCATCA GAACACTCACACTCAAAGCCC 52℃/30
Notch3 ATGGTGGGAACTAAACACAGCT ATGACCCTGGAGGAAGCACA 55℃/35
Hes1 GTGCTGTCTGGATGCGGAGT GAACACTCACACTCAAAGCCC 55℃/35
Ihh CCTGAACTCGCTGGCTATCT AATACACCCAGTCAAAGCCG 56℃/35
PTCH GCAGTGGTGAGAGAAAAGGA CTCGGATTGGTGACCATAAG 59℃/30
Gli1 AGAGTCCAGGGGGTTACATA AGAGTCCAGGGGGTTACATA 57℃/35
Wnt4 CTCCTCGTCTTCGCCGTCTT TACTGGCACTCCTCAATGGA 62℃/40
Dvl2 GGTTGGGGAGACGAAGGTGATT ATCTGAGGACACCAGCCAGGATAC 58℃/30
Lef1 CGAAGAGGAAGGCGATTTAG GGATGGGTGGAGAAAGAGAT 62℃/40
Oct4 GTGGAGGAAGCTGACAACAA AGCAGCCTCAAAATCCTCTC 62℃/27
Nanog ACTGTCTCTCCTCTTCCTTCCT AGAGTAAAGGCTGGGGTAGGTA 61℃/30
Stat3 GTCTGGCTGGACAATATCAT TTGGGAATGTCAGGATAGAG 56℃/30
ABCG2 TATGAGTGGCTTATCCTGCT CACTGATCCTTCCATCTTGT 56℃/30
PTEN GGACGAACTGGTGTAATGAT CAGACCACAAACTGAGGATT 56℃/30
Beta - actin GGCATCCTCACCCTGAAGTA GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA 55℃/25
스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커들의 발현 분석
Hpac 세포로부터 접착 및 스피어 배양을 한 후, 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, 접착 및 스피어 세포를 암 줄기세포 마커 항체로 염색하였으며, FITC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-PROM2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-EphA2(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD130(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD271(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), PE-CD133(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 PE-CD117(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)을 각각의 마커 항체로 이용하였다.
유세포 분석은 BD LSR II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.
줄기세포 신호 차단 약물에 의한 스피어 형성 억제
잘 알려진 줄기세포 신호 차단 약물인 DAPT(Calbiochem, San Diego, CA, USA), Cyclopamine-KAAD (Calbiochem, San Diego, CA, USA), LiCl (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), ATRA (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO), OV (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)를 배양액에 첨가하여 스피어 배양을 하였다. 7일 후 스피어 형성 억제여부를 확인하였다.
Hpac 스피어의 암화능력 확인
인체 췌장암 세포주 Hpac으로부터 배양된 접착과 스피어 세포를 0.25 % 트립신 EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 처리하여 동일한 수의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음, NOD-SCID 면역제어 마우스(Charles River, Japan)의 췌장에 직접 in situ 이식하여 접착 세포와 스피어 세포간의 종양 형성 능력을 관찰하였다.
스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 분비 단백질 분석
스피어를 형성하는 세포의 배양액에서 암 줄기세포와 관련된 분비 단백질을 분석하기 위하여, Hpac과 Capan 1 세포를 7-10일간 접착 또는 스피어를 배양하였다. 그 다음, 무혈청 DMEM/F12 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY)로 교환한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 접착 및 스피어의 배양 상층액을 원심분리와 필터를 이용하여 수집하였다.
다양한 분비 단백질들을 포함한 상층액을 3 kDa 분자-매스 컷오프(molecular-mass cut off: MWCO)를 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축시킨 후, 프로테오믹스 분석(2-D젤 분석과 MALDI-TOF)을 실시하였다. 염색된 젤 이미지 분석 후 차이를 보이는 스팟은 트립신으로 절단시킨 후 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight) 분석을 통하여 동정하였다. 데이타베이스 검색엔진은 MASCOT을 사용하였다.(Na K et al., Proteomics (9):3989-3999, 2009).
스피어 세포의 배양액에서 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석
프로테오믹스 분석에 의해 동정된 분비 단백질들의 발현을 Hpac과 Capan 1 의 접착 및 스피어 배양액에서 검증하기 위하여, 접착 및 스피어 배양 상층액을 원심분리 및 필터를 이용하여 수집하였다.
3 kDa 분자-매스 컷오프(molecular-mass cut off: MWCO)를 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축시킨 후, 단백질 정량에 의해 25 ㎍ 씩 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블록킹하였다. 그 다음, 각각의 멤브레인을 프로테오믹스 결과 동정된 분비 단백질들에 해당하는 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 1차 항체는 마우스 모노클로날 AKR1B1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 HSP90(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), 마우스 모노클로날 비멘틴(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei)을 사용하였다.
1차 항체와 반응한 각각의 멤브레인을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)-콘쥬게이티드 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 단백질을 Enhanced chemiluminescence system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다.
췌장암 세포주에서의 GLRX3 mRNA 및 단백질 발현 확인
AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1 및 Miapaca-2의 8종의 췌장암 세포주 및 HPDE(Human Pancreatic Ductal Epithelial cell)에서 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인하였다. RNAeasy 미니 키트(QIAGEN, Valencia, CA, 미국)를 사용하여 췌장암 세포주의 총 RNA를 추출하고, Superscript II(Gibco BRL, Grand Island, NY)의 반응을 통하여 각각의 RNA를 역전사 반응시켰다. GLRX3 프라이머와 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 췌장암 세포주에서의 GLRX3 유전자의 발현을 분석하였고, 베타 액틴(Beta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다. 췌장암 세포주에서의 GLRX3 단백질 발현 분석은 세포 총 단백질 및 분비단백질에서 실시하였다. 세포 총단백질은 세포 용해 버퍼(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM ßß-glycerophosphate, 25 mM NaF, 0.5 M EDTA, 1% NP-40, 0.1 mM PMSF, 1% 프로테아제 억제자 칵테일(Roche))를 이용하여 추출하였다. 분비단백질 준비를 위해, 혈청이 없는 조건에서 배양한 세포배양액을 원심분리하여 세포 부산물들을 제거하고, 최종 80% 부피의 아이스-콜드(ice-cold) 아세톤으로 침전시켰다. 침전된 분비단백질은 100% 아이스-콜드 아세톤으로 세척단계를 거친 후 원심진공건조기로 말린 후 다시 세포용해 버퍼로 용해하였다. 총단백질 및 분비단백질을 단백질 정량에 의해 25 ㎍ 씩 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩(loading)한 후 전기영동을 실시하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 막(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후, 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 탈지분유(non-fat milk)를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에 1시간 동안 블로킹하였다. 그 다음, PVDF 막을 GLRX3에 대한 1차 항체(Abnova corporation, Taipei, 중국)와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 1차 항체와 반응한 각각의 PVDF 막을 TBS-T 버퍼에 세척시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)-콘쥬게이티드 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA, 미국)와 1시간 동안 반응시켰다. 면역반응이 있는 단백질은 West Pico chemiluminescent Substrate system(PIERCE, Rockford, IL)을 이용하여 검출하였다.
췌장암 암줄기세포의 특성을 가진 세포 분획에서의 GLRX3 과발현 확인
암줄기세포 특성을 가진 세포를 분획하기 위해, 배양한 췌장암 세포주 HPAC과 CFPAC-1를 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 제조하였다. 그 다음 암줄기세포 마커로 알려진 PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), APC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 FITC-ESA(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)로 아이스에서 10분간 염색하였다. 항체의 아이소타입 컨드롤로는 정제된 마우스 IgG1,λ-FITC, IgG2a,κ-PE 및 IgG2b,κ-APC(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA, 미국)를 이용하여 염색하였다. 세포 분류는 FACSAria II(BD Immunocytochemistry system, Franklin Lakes, NJ, 미국)를 이용하였다. 3 종류의 마커를 모두 발현하는 세포(CD24+/CD44+/ESA+)와 상기 마커를 모두 발현하지 않는 세포(CD24-/CD44-/ESA-)의 분획 세포에서 RNAeasy 미니 키트(QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 췌장암 세포주의 총 RNA를 추출하였다. Superscript II(Gibco BRL, Grand Island, NY, 미국)의 반응을 통하여 각각의 RNA를 역전사 반응시킨 후, GLRX3 프라이머 및 Taq 폴리머라아제에 의한 PCR을 통하여 GLRX3 유전자의 발현을 분석하였고, 베타 액틴(Beta actin) 유전자의 발현을 대조군으로 하였다.
GLRX3를 저해하기 위해 GLRX3에 대한 siRNA(invitrogen stealthTM siRNA duplex oligoribonucleotides)를 이용하였다. 센스 siRNA는 UGA GGG AGU UCU UUA GCU AAC UCU G 이고, 안티센스 siRNA는 CAG AGU UAG CUA AAG AAC UCC CUC A이다. 대조군 siRNA는 Invitrogen 사의 음성 대조군 Med GC를 사용하였다. CFAPC-1 세포에 RNAiMAX(invtirogen, Carlsbad, CA, 미국)를 이용하여 GLRX3 또는 음성대조군 siRNA를 이입한 후, 72시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 아큐타아제(Accutase; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 처리하여 동일한 수의 단일세포 현탁액을 만든 후 PE-CD24(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), APC-CD44(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 FITC-ESA(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)로 염색하였다. 유세포 분석은 BD LSR II(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 실시하였으며, BD FACSDiva 소프트웨어를 통하여 분석하였다.
GLRX3 발현 저해 세포주 구축 및 특성 분석
GLRX3 발현 저해로 인한 효과를 보기 위해, GLRX3에 대한 shRNA(SABiosciences SureSilencingTM shRNA 플라스미드) 및 대조군 shRNA를 제작하여 HPAC 세포주에 영구 이입하여 GLRX3 녹-다운 (k/d) 세포주를 수립하여, GLRX3 mRNA 및 단백질 발현을 조사하였다. GLRX3에 대한 shRNA의 서열은 GTG GAA ATT CTT CAC AAA CAT 이고, 대조군 shRNA의 서열은 GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC 이며, 선별 마커는 퓨로마이신(puromycin, 2.0 /)이다. 동일한 수의 세포를 유전자이입 하루 전날 플레이트에 부착시킨 후, 유전자 이입 당일에는 GLRX3에 대한 shRNA 및 대조군 shRNA 를 Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)과 혼합하여 세포에 이입하였다. 유전자 이입 후 24시간이 지난 후, 배양액을 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신이 포함된 배양액으로바꾸어 준 후, 3일 이상 지속배양 하였다. 퓨로마이신 배양액에서 살아남은 세포는 다시 96웰 플레이트에1세포/웰의 비율로 부착시킨 후 배양하였다. 각 웰에서 살아남아 증식된 세포에서mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현 변화를 PCR과 웨스턴블럿으로 확인하여 최종적으로 GLRX3 k/d 세포주 클론 2개와 대조군 클론 두개를 확보하였다. 확보된 GLRX3 k/d의 암 관련 특성 변화를 확인하기 위해, 세포증식 속도와 세포증식이동분석(wound-healing assay)를 수행하였다. 세포증식 속도는 각 클론의 세포를 1.25×104개씩 24웰-플레이트에 부착시킨 후, 5일간 매일 일정시간에 세포를 0.25% trypsin-EDTA로 떼에서 세포계수기(hematocytometer)에서 세포수를 측정하였다. 세포중식이동분석은 세포배양 시 세포의 수가 웰에 100% 가까이 채워지고 난 후 스크래치를 주고, 시간에 따른 스크래치 회복능력을 현미경하에서 관찰하면서 사진을 찍었다(Olympus DP50).
GLRX3 발현 저해 세포주의 암줄기세포 관련 특성 변화 분석
췌장암 암줄기세포 관련 단백질로 도출된 GLRX3 단백질이었으므로, GLRX3 k/d로 인해 유발되는 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인하였다. 이를 위해 GLRX3 k/d 세포주 2클론과 대조군 세포주 2클론을 7일간 스피어 배양하였다. 집락형성 분석법(clonogenic assay)은 세포배양액에 넣고 끓인 0.6% 아가(Agar)를 24웰-플레이트에 굳힌 후(하층배지), 그 위에 1000개/웰의 세포를 0.3% 아가-세포배양액(상층배지)과 혼합하여 응고시킨다. 0.3% 상층 배지가 굳으면 그 위에 500 ㎕/웰씩 배양액을 첨가하였다. 배양액을 3일에 한번씩 첨가해주면서 3-4주 동안 배양 후, 아가 상의 배양액을 제거하고 크리스탈바이올렛으로 염색한 다음 콜로니 수를 측정하였다.
면역조직 화학염색을 통한 인체 췌장암 조직에서의 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현 분석
췌장 조직 슬라이드를 자일렌 내에서 탈파라핀화시키고 등급별 알코올 내에서 재수화시켰다. 내생성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 20분 동안 0.3%의 과산화수소 포함 메탄올 용액으로 블록킹하였다. 마이크로웨이브 항원 검색을 시트레이트 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 4분 동안 실시하였다. 그 다음, 슬라이드를 10% 노말 당나귀 혈청 용액으로 1시간 동안 배양시켜서 비-특이적인 배경 염색을 감소시켰다. 1: 200으로 희석하여 반응시킨 1차 항체는 마우스 모노클로날 AGPAT4 (Abnova corporation, Taipei), 마우스 모노클로날 AKR1B1(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 래빗 폴리클로날 HSP90(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA), 래빗 폴리클로날 MSK2(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 Vimentin(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei)이다.
블록화된 섹션을 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 그 이후의 반응은 Envision 키트(DakoCytomation, Carpineteria, CA, USA)에 포함된 권장 과정을 이용하여 실시하였다.
마지막으로, 슬라이드를 3,3’-디아미노벤지딘(3,3’-diaminobenzidine; DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA)로 배양시키고, 변형된 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO)용액으로 대조 염색하였다.
염색의 강도는 각각 음성, 약한, 중간 및 강한 갈색 염색의 존재에 해당하는 -, +, ++ 및 +++로 평가하였다.
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서 웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 분석을 실시하였다.
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자의 혈청에서 발굴된 분비 단백질의 발현을 확인하기 위하여 정상 혈청(normal) 5예, 만성 췌장염 혈청(chronic pancreatits) 5예, 췌장암 환자 혈청(pancreatic cancer) 20예를 선정하였다.
선정된 총 30예의 혈청들은 MARS(Multiple affinity removal column system)를 사용하여 혈청내의 6개의 주요 단백질인 알부민, 트란스페린, IgG, IgA, 햅토그로빈(haptoglobin), 항-트립신(anti-trypsin)을 제거시킨 후, 3 kDa MWCO(molecular-mass cut off)을 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축하였고, 각 예의 단백질을 농도 40 ㎍씩 동일한 농도로 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 로딩한 후 전기영동하였다. 전기영동에 의해 크기별로 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인(Millipore corporation, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후 비특이적 반응을 감소시키기 위하여 5% 논-팻 밀크를 첨가한 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)에서 한시간 동안 블록킹 하였다. 그 다음, 각각의 1차 항체와 각각의 멤브레인들을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다.
1:500의 희석으로 사용된 각각의 1차 항체는 래빗 폴리클로날 MSK2(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 비멘틴(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA), 마우스 모노클로날 ALDH(BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) 및 마우스 모노클로날 GLRX3(Abnova corporation, Taipei) 이다.
1차 항체와 반응한 멤브레인을 TBS-T 버퍼로 세척한 후 HRP-콘쥬게이티드 2차 항체(santa cruz biotechnology Inc, santa cruz, CA)와 1시간 동안 반응시켰다. 단백질은 Enhanced chemiluminescence system (PIERCE, Rockford, IL)에 의해 검출되었다.
췌장암 환자 혈액에서의 GLRX3 발현 확인
실제 임상환자(정상 대조군 환자 28명, 만성 췌장염 환자 9명 및 췌장암 환자 57명)에 대해 의 혈액에서 GLRX3 발현을 확인하기 위해 ELISA(USCN GLRX3 ELISA kit)를 수행하였다. ELISA 방법은 ELISA kit 제작회사의 프로토콜대로 수행하였다. 환자의 혈청은 PBS에 1:10으로 희석 후 사용하였다. 표준농도 는 10 nM/㎖부터 1/2씩 희석하여 준비하였다. 희석한 환자 혈청과 표준농도 를GLRX3 ELISA 키트 96웰에 각각 넣고 2시간 동안 37도에서 반응하였다. 검출시약 A를 100 ㎕씩 넣고 다시 1시간 동안37도에서 반응하였다. 모든 용액을 제거한 후 세척용액으로 3회 세척하였다. 검출시약 B를 100 ㎕씩 넣고 37도에서 30분간 반응하였다. 용액을 제거하고 5회 세척 후 90 ㎕씩의 기질용액을 넣고 37도에서 15-20분 동안 반응한 후 50 ㎕씩의 종료용액을 넣고 450 ㎚에서 발색을 측정한다.
실험 결과
췌장암 세포주로부터 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 분리 및 배양
암 줄기세포의 특성을 나타내는 스피어 형성 유무를 확인한 결과, 총 8종의 췌장암 세포주 중 Hpac, Capan1 및 Capan2의 세포주에서 스피어가 형성됨을 확인하였고, 그 중 Hpac과 Capan1을 선택하여 후속 실험을 진행하였다(도 1).
스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 유전자들의 발현 분석
RT-PCR을 수행한 결과 췌장암 세포주 Hpac의 접착에 비해 스피어에서 Notch, Hedgehog 및 Wnt등 줄기세포 관련 신호전달 체계가 활성화되어 있는 것을 확인하였다. 발생 초기에 증가하는 것으로 알려진 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4, nanog 및 stat3 등의 유전자 발현도 증가하였으며, 이 외에도 ABCG2, PTEN 등 암 줄기세포 마커들의 발현도 증가함을 확인할 수 있었다(도 2a-2b).
스피어 세포에서 유세포 분석을 통한 암 줄기세포 마커들의 발현 분석
유세포 분석을 통하여 기존에 알려진 암 줄기세포 마커들의 발현을 Hapc 과 Hpac-sphere에서 확인한 결과 CD44, PROM2, EphA2, CD130 및 CD271이 증가되어 있음을 확인하였다(도 3).
줄기세포 신호 차단 약물에 의한 스피어 형성 억제
Hpac-스피어의 형성 능력이 잘 알려진 줄기세포 신호를 차단하는 약물에 의해서 완전히 억제되거나 감소되는 것을 확인하였다(도 4a-4c; DAPT는 Notch 억제제이고; KAAD는 HH 억제제이며; Licl는 GSK3b 억제제이고; ATRA는 Oct4 억제제이며; OV는 Nanog 억제제임.).
Hpac 스피어의 암화능력 확인
인체 췌장암 세포주 Hpac으로부터 스피어 배양을 통해 형성한 Hpac-스피어를 NOD/SCID 마우스의 췌장에 in situ 이식하여 종양형성 능력을 비교하였을 때, Hpac에 비해 암 줄기세포의 특성을 지니는 Hpac-스피어를 이식한 그룹에서 암 형성능력이 높게 나타났고, 폐와 복막 등 기관 및 조직으로의 전이가 관찰 되었다(도 5a-5c).
Hpac 스피어 세포가 암 줄기세포와 관련된 유전자 및 마커들을 발현하고 있으며, 암화능력이 증가되어 있는 결과들(도 1-5c)을 토대로, 스피어에서 분비되는 단백질 프로파일을 조사함으로써 췌장암 줄기세포 특이 표지자를 예측할 수 있을 것으로 판단되었다.
스피어 세포에서의 암 줄기세포 관련 분비 단백질 분석
Hpac과 Capan1의 접착과 스피어에서 587개의 패어드 스팟(paired spots)이 검출되었고, 이 중 접착 대비 스피어에서 2배 이상 증가한 스팟은 55개가 검출되었다(도 6).
스피어 젤에서 2배 이상 증가한 스팟 55개 중 41개의 스팟에 대해 MALDI-TOF를 수행하여 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질을 동정하였다(표 2).
스팟 번호 폴드 체인지
(Fold change)		 GI번호 접근번호
(Accession number)		 단백질 명
15378 4.1 GI:30268237 CAD89908.1 hypothetical protein
15386 2.5 GI:41352061 NP_055704.2 metalloprotease 1 precursor
15391 2.7 GI:20149594 NP_031381.2 heat shock 90kDa protein 1, beta
15413 2.7 GI:16507237 NP_005338.1 heat shock 70kDa protein 5
15429 4.3 GI:145701028 NP_001077415.1 hypothetical protein LOC55471 isoform 3
15436 9.2 GI:56203587 CAI21475.1 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 4 (AGPAT4)
15470 2.3 GI:4504025 NP_002055.1 glutaredoxin
15602 5.2 GI:39644662 AAH09206.2 HSP90AB1 protein
15619 2.8 GI:21396487 NP_653337.1 hypothetical protein LOC55471 isoform 1
15665 2.3 GI:31543 CAA27309.1 unnamed protein product
15680 2.2 GI:38014278 AAH01678.2 TUBB3 protein
15687 2.3 GI:62414289 NP_003371.2 vimentin
15737 4.3 GI:24308169 NP_060009.1 dynein, axonemal, heavy chain 3
15792 2.3 GI:4504025 NP_002055.1 glutaredoxin
15805 2.0 GI:119586807 EAW66403.1 hCG2042304
15821 3.3 GI:34304594 AAQ63403.1 hypothetical protein FLJ10808 isoform
15871 3.3 GI:998688 AAB34148.1 erythrocyte 26 S protease subunit 12
15882 6.2 GI:28839796 AAH47896.1 RPS6KA4 protein (MSK2)
15890 2.1 GI:48257132 AAH14372.2 GLRX3 protein
15977 3.8 GI:4502049 NP_001619.1 aldo-keto reductase family 1, member B1
15978 3.4 GI:4502049 NP_001619.1 aldo-keto reductase family 1 (AKR1)
16000 2.3 GI:171848760 2PD5_A Chain A, Human Aldose Reductase Mutant V47i
16026 2.5 GI:8118090 AAF72885.1 formin 2-like protein
16051 17.0 GI:21389577 NP_653280.1 hypothetical protein LOC146705
16087 4.4 GI:157168362 NP_000261.2 nucleoside phosphorylase
16095 3.7 GI:4503143 NP_001900.1 cathepsin D preproprotein
16139 2.1 GI:158261815 BAF83085.1 unnamed protein product
16159 2.6 GI:47682755 AAH70129.1 TPI1 protein
16193 2.5 GI:662841 AAA62175.1 heat shock protein 27
16246 2.2 GI:60593959 1X71_A Chain A, Crystal Structure Of Siderocalin
16268 2.1 GI:544759 AAB29537.1 biliverdin-IX beta reductase isozyme I
16288 2.0 GI:14042653 BAB55338.1 unnamed protein product
16337 2.0 GI:119588464 EAW68058.1 tetraspanin 18, isoform CRA_a
16432 2.2 GI:158259341 BAF85629.1 unnamed protein product
16528 2.5 GI:16549206 BAB70777.1 unnamed protein product
16610 2.9 GI:178375 AAB46377.1 aldehyde dehydrogenase (ALDH)
16625 5.6 GI:13489087 NP_109591.1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B
16629 9.4 GI:4558862 AAD22767.1 A-kinase anchoring protein AKAP350
16640 2.4 GI:21752882 BAC04252.1 unnamed protein product
16643 5.3 GI:119568120 EAW47735.1 spectrin repeat containing, nuclear envelope 1
16650 2.3 GI:119617987 EAW97581.1 hCG2015069
암 줄기 세포와 관련이 있는 것으로 보고된 바 있는 HSP90AB1, ALDH와 비메틴(vimentin) 등의 단백질들이 함께 동정됨으로써, 표1에 제시된 분비 단백질들이 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 가능성이 있음을 시사한다.
웨스턴 블롯(Western blot)을 통한 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질의 발현 검증
MALDI-TOF 분석에 의해 발굴된 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질의 검증을 위해, 상용화된 항체를 사용하여 Hpac과 Capan1세포의 접착 및 스피어 배양액에서 웨스턴 블롯을 실시하였다. GLRX3을 포함한 5개의 분비 단백질이 췌장암 세포주 Hpac 또는 Capan1의 스피어 배양액에서 증가되어 있음을 검증하였다(도 7).
췌장암 세포주에서의 GLRX3 mRNA 및 단백질 발현 확인
AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, Cfpac-1, HPAC, Panc-1 및 Miapaca-2의 8종의 췌장암 세포주 및 HPDE(Human Pancreatic Ductal Epithelial cell)에서의 mRNA 및 단백질을 추출하여 GLRX3 발현을 확인하였다. 그 결과, 정상 HPDE에 비해 8종의 췌장암 세포주에서 모두 GLRX3 mRNA이 고발현하는 것을 확인하였다. 또한, 8종의 췌장암 세포주에서 GLRX3 단백질을 발현하고 있으며, 배양액에서의 웨스턴 블럿을 통해 HPAC을 제외한 나머지 췌장암 세포주에서 GLRX3 단백을 세포 외로 분비함을 확인하였다(도 8).
췌장암 암줄기세포의 특성을 가진 세포 분획에서의 GLRX3 과발현 확인
암줄기세포 마커로 알려진 CD24, CD44 및 ESA로 췌장암 세포주 HPAC을 형광염색 후 3 종류의 마커를 모두 발현하는 세포(CD24+/CD44+/ESA+)와 상기 마커를 모두 발현하지 않는 세포(CD24-/CD44-/ESA-)로 췌장암 세포를 분획하였을 때, CD24+/CD44+/ESA+ 분획의 세포가 CD24-/CD44-/ESA- 분획의 세포보다 GLRX3를 과발현하고 있음을 확인하였다. 이는 다른 췌장암 세포주인 CFPAC-1에서도 동일한 결과를 확인하였다(도 9).
또한 상기 암줄기세포 분획은 GLRX3 발현 저해로 인해 변화되는데, 대조군 siRNA에 비해 GLRX3에 대한 siRNA를 처리했을 때 CD24+/CD44+/ESA+ 분획이 70.4%에서 29.3%로 감소하는 것을 확인하였다(도 10).
GLRX3 발현 저해 세포주 구축 및 특성 분석
GLRX3 발현 저해로 인한 효과를 보기 위해, GLRX3에 대한 shRNA 및 대조군 shRNA를 제작하여 HPAC 세포주에 영구 이입하여 GLRX3 녹-다운 (k/d) 세포주를 수립하였다. 수립된 GLRX3 k/d 세포주는 대조군에 비해 GLRX3의 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 감소해 있음을 확인하였다(도 11 a). 대조군 및 GLRX3 shRNA에 대한 각각의 세포주에서 두 개 이상의 양성 클론을 선별하여 그 특성을 규명하였다. 대조군에 비해 GLRX3 k/d 세포(sh3-G10 및 sh3-H10)에서 증식율이 감소되었음을 확인하였고(도 11b), 세포의 증식 이동 능력을 동시에 볼 수 있는 세포증식이동 분석(wound-healing assay) 결과 GLRX3 k/d 세포에서 세포증식이동 능력이 대조군에 비해 저하되어 있음을 확인하였다(도 11c).
GLRX3 발현 저해 세포주의 암줄기세포 관련 특성 변화 분석
췌장암 암줄기세포 관련 단백질로 도출된 GLRX3 단백질이었으므로, GLRX3 k/d 으로 인해 유발되는 암줄기세포 관련 특성 변화를 확인하였다. 우선 GLRX3 k/d 세포주 및 대조군 세포주의 스피어 형성 능력을 확인하였다(도 12a). 그 결과 GLRX3 k/d 세포들은 모두 스피어를 형성하지 못하였다. 반면, 대조군 세포주는 모두 스피어를 잘 형성함을 보여주었다. 이는 스피어 배양 시 GLRX3 발현이 증가했던 결과와 동일 선상의 결과를 보여주는 것이다. 또한, 생존능 및 증식 능력을 보는 클론원성 분석(clonogenic assay) 결과, GLRX3 k/d 세포들이 대조군 세포들에 비해 적은 수의 콜로니를 형성하였다(도 12b).
이상의 결과는, GLRX3 이 췌장암 암줄기세포와 관련된 발암관련 마커로서의 가능성뿐 아니라, GLRX3 저해로 유발되는 여러 암관련 특성 저해로 보아 췌장암 치료제 타겟으로서의 가능성을 보여주고 있다.
인체 췌장암 조직에서의 췌장암 암줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현 검증
AGPAT4의 경우 관찰 가능한 총 29명의 TMA 슬라이드에서 “++” 15예와 “+++” 14예로 췌장암 환자 100%의 췌장암 조직에서 발현되었다(도 13에서 패널 (A)).
AKR1B1의 경우 관찰 가능한 총 27 명의 TMA 슬라이드에서 “-” 10예, “+” 15예 및 “++” 2예로 췌장암 환자 62.9%의 췌장암 조직에서 발현되었다(도 13에서 패널 (B)).
HSP90의 경우 관찰 가능한 총 28 명의 TMA 슬라이드에서 “+” 1예, “++” 19예 및 “+++” 8예로 췌장암 환자 100%의 췌장암 조직에서 발현되었다 (도 13에서 패널 (C)).
ALDH의 경우 관찰 가능한 총 26 명의 TMA 슬라이드에서 “-” 4예, “+” 8예, “++” 7예 및 “+++” 7예로 췌장암 환자 84.6%의 췌장암 조직에서 발현되었다(도 13에서 패널 (D)).
MSK2의 경우 관찰 가능한 총 27 명의 TMA 슬라이드에서 “-” 1예, “+” 5예, “++” 8예 및 “+++” 13예로 췌장암 환자 96.2%의 췌장암 조직에서 발현되었다(도 13에서 패널 (E)).
비멘틴의 경우 세포 외부 인터스티움(interstitium)에 주로 염색되었다. 염색된 세포들은 관상구조를 이루고 있는 것들이 많았으나, 암세포는 아닌 것으로 추정되었다. 암의 사이토플라즘에는 거의 염색되지 않았다. 28예의 췌장암 조직 중 1예에서 포컬(focal)염색되었다(도 13에서 패널 (F)).
GLRX3의 경우 관찰 가능한 총 25 명의 TMA 슬라이드에서 “-” 11예, “+” 11예 및 “++” 4예로 췌장암 환자 57.6%의 췌장암 조직에서 발현되었다(도 13에서 패널 (G)).
췌장암 환자의 수술을 통한 절제조직의 파라핀 절편에서도 면역조직 화학염색을 통하여 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들의 발현을 검증하였다. 이미 암줄기 세포와 연관이 있는 것으로 보고된 HSP90과 ALDH, 그리고 본 연구에서 발굴한 GLRX3를 포함한 7개의 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들 모두 정상 췌장 조직에 비해 췌장암 조직에서 강하게 발현되고 있음을 확인할 수 있다(도 14에서 패널 (A)-(G)).
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자 혈청에서의 발굴된 분비 단백질들의 발현 검증
발굴된 분비 단백질에 대한 상용화된 ELISA 키트의 부재로, 일부 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 통하여 발현 검증을 수행하였다.
정상, 만성 췌장염 및 췌장암 환자의 혈청에서 발굴된 분비 단백질의 발현을 확인하기 위하여 정상 혈청(normal) 5예, 만성 췌장염 혈청(chronic pancreatits) 5예, 췌장암 환자 혈청(pancreatic cancer) 20예를 선정하였다. 본 연구에서 발굴된 췌장암 줄기세포 관련 분비 단백질들과 기존의 췌장암 마커로 사용되고 있는 CA 19-9와 CEA를 비교하기 위하여 선정된 췌장암 환자들(PC2-PC10)의 혈청 내 CA19-9 및 CEA의 농도를 도 15a-15b에 나타내었다.
발굴한 분비 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 검증하기에 앞서, 선정된 총 30예의 혈청들은 MARS(Multiple affinity removal column system)를 사용하여 혈청내의 6개의 주요 단백질인 알부민, 트란스페린, IgG, IgA, 햅토그로빈(haptoglobin), 항-트립신(anti-trypsin)을 제거한 후, 3 kDa MWCO(molecular-mass cut off)을 가진 아미콘 울트라 센트리퓨갈 필터 디바이스를 사용하여 농축하였고, 각 예의 단백질을 동일한 농도로 웨스턴 블롯에 사용하였다.
분비 단백질 중 암 줄기세포와의 연관성이 잘 알려진 비멘틴과 ALDH의 경우, 정상과 만성 췌장염 환자의 혈청에 비해 췌장암 환자의 혈청에서 많이 발현하는 결과를 보여 주었다. 췌장암 암줄기세포 분비 단백질로 발굴된 GLRX3 역시 정상 혈청에서는 매우 낮게 발현되는 반면, 췌장암 환자 혈청 50% 이상에서 정상 및 만성 췌장염보다 높은 발현을 나타내었다(도 16a 내지 도 19b).
췌장암 환자 혈액에서의 GLRX3 발현 확인
실제 임상환자의 혈액에서 GLRX3 발현을 확인하기 위해 ELISA(USCN GLRX3 ELISA kit)를 수행하였다. 정상 대조군 환자 28명, 만성 췌장염 환자 9명 및 췌장암 환자 57명에 대해 수행한 결과, 췌장암 환자의 혈액에서 GLRX3 발현이 높게 나타나는 것으로 확인 되었다(도 20a). 특히 수술하지 않고 방사선 치료 혹은 약물치료만 받은 환자 29명 중 GLRX3 레벨이 1800 ng/ 이상인 환자는 생존기간이 155일인 반면, 1800 ng/ 이하 환자의 경우 생존기간이 463일로 GLRX3 발현 정도에 따라 생존기간의 차이를 나타내었다(도 20b).
검토
암 조직에는 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포가 존재하며, 이것이 암의 발생은 물론 기존의 암 치료법이 적용된 후 줄어든 암세포를 재생하는데 관여함으로써 암의 재발이나 전이에 핵심적인 역할을 한다고 보고된바 있다(BB Zhou et al. Nat Rev Drug Discov., 8:806-823(2009)). 그리고 암세포는 이종접합(heterogenous)하며, 이중 일부 세포만이 암 형성 능력을 가지는 종양 개시세포(tumor initiating cell)로 암 줄기세포라고 알려져 있다. 이들 세포들은 in vitro에서 부유 배양시 스피어를 형성하게 되고, 스피어 배양으로 얻은 세포는 원 세포주에 비해 강력한 암 형성 능력을 가진다고 보고된 바 있으며(A. Dubrovska et al. Proc Natl Acad Sci USA ., 106:268-273(2009)), 또한 이들 세포에서는 원 세포주에 비해서 일부 암 및 암 줄기세포 관련 유전자 및 단백질들이 강하게 발현된다고 알려져 있다.
본 연구에서는 췌장암 세포주로부터 형성된 스피어들은 서브-스피어(sub-sphere)를 형성하여 줄기세포의 자가 재생(self renewal)한 특성을 지님을 확인하였고, 암 발생 및 줄기세포 특성 유지에 관여하는 Notch, Hedgehog 및 wnt 시그널등 잘 알려진 줄기세포 관련 신호체계(T. Reya et al. Nature, 414:105-111(2001))가 활성화되어 있었으며, 발생 초기에 증가하는 것으로 알려져 있으며 줄기세포의 다분화 능력을 나타내는 oct4 및 nanog 유전자의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그 외에도 암 줄기세포의 생존 및 유지에 중요한 역할을 하는 PTEN의 발현도 증가되어 있어 줄기세포 관련 이전의 보고들과 일치되는 결과를 보여주었다(J. Zhou et al. Proc Natl Acad Sci USA ., 104:16158-16163(2007)). 유세포 분석을 통하여 Hapc과 Hpac-스피어의 줄기세포 표지자를 비교한 결과, 스피어에서 CD44, PROM2, EphA2, CD130 및 CD271등 잘 알려진 줄기세포 표지자들과 또는 암의 악성도와 연관된 단백질들을 발현하는 세포수가 증가되어 있음을 알 수 있었다.
위의 결과들을 토대로 암 발생과정의 초기 현상으로 인식되는 암 줄기세포의 역할을 연계하고 암 줄기세포의 특성을 갖는 스피어 세포 배양시 분비되는 단백질을 동정 및 검증하기 위하여 프로테오믹스 분석을 수행하였으며, 이를 통하여 췌장암 환자에서 특이적으로 분비되는 단백질에 대한 검증을 하였다.
프로테오믹스 결과 HSP90, 비멘틴, HSP27 및 ALDH를 비롯한 AGPAT4, AKR1B1, MSK2 및 GLRX3 등의 분비 단백질들이 동정되었다. 췌장암 조직에서 이들 분비 단백질들의 발현을 확인한 결과 정상 조직에 비해 췌장암 조직에서 현저히 증가되어 있음을 확인하였고, 분비 단백질들의 발현이 췌장암 환자의 혈청에서 정상에 비해 높게 나타나는 결과를 나타내었다. 비록 ELISA 키트의 부재로 웨스턴 블롯에 의해 혈청에서의 발현을 확인하였으나, 본 연구에서 발굴한 분비 단백질의 발현이 췌장암 환자의 혈청에서 증가해 있음을 검증할 수 있었다.
특히 GLRX3는 췌장암 환자의 혈청에서 증가해 있을 뿐 아니라 GLRX3 발현이 높은 췌장암 환자의 생존기간이 GLRX3 발현이 상대적으로 적은 췌장암 환자의 생존기간보다 낮게 나타나는 현상으로 보아 GLRX3는 췌장암 진단 뿐 아니라 예후마커로 활용될 수 있음을 검증하였다.
또한, 여러 암의 치료학적 타겟(therapeutic target)으로 보고된 HSP90 (L. Whitesell and S.L. Lindquist, Nat Rev Cancer, 5: 761-772(2005)), 암 줄기세포와 관련된 중간엽의 전이에 대한 상피(Epithelial to Mesenchymal transition) 마커인 비멘틴(JM. Lee et al. J Cell Biol ., 172:973-981(2006); PB. Gupta et al. Cell., 138:645-659(2009)), 암 줄기세포의 특성인 항암제 내성에 관련된 단백질인 HSP27(S. Oesterreich et al. Cancer Res ., 53:4443-4448(1993)), 최근에 암 줄기세포 마커로 대두되고 있는 ALDH(C. Jauffret et al. Clin Cancer Res ., 16:45-55(2010)) 등이 함께 동정됨은 본 연구에서 발굴한 분비 단백질들이 암 줄기세포 관련 분비 단백질의 가능성을 시사한다고 보여진다.
췌장암은 5년 생존율이 1-4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고, 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로 그 어떤 인체암보다도 조기 진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
현재까지 췌장암에 효과가 있다고 알려진 5-플루오로유라실, 젬시타빈, 및 타르세바를 포함한 항암제 치료에 대한 반응율은 15% 내외에 불과하고, 이러한 사실은 췌장암 환자의 예후를 향상시키기 위해서는 보다 효과적인 조기 진단법의 개발이 절실히 요구되고 있음을 시사한다.
따라서 본 연구에서 발굴한 췌장암 줄기세포 연관 분비 단백질에 대한 연구를 지속하여 이를 이용한 새로운 암 조기 진단법의 개발 및 기존의 마커와의 조합을 통하여 보다 더 의미 있는 암 줄기세포를 이용한 진단법의 개발이 가능할 것으로 보여진다. 더 나아가서 새로운 암치료의 표적을 제공하여 암 줄기세포를 이용한 새로운 진단법 및 치료 개발의 근간을 수립하는 것이 가능할 것으로 사료된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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  2. Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 (ⅰ) 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer), 또는 (ⅱ) 상기 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 췌장암 진단 또는 예후 분석용 키트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 통해 췌장암 암줄기세포 마커를 검출하는 방법.
  6. 췌장암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 Genbank 접근번호가 CAD89908.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_001077415.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAI21475.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653337.1인 단백질, Genbank 접근번호가 CAA27309.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW66403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAQ63403.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAB34148.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAH47896.1인 단백질, Genbank 접근번호가 2PD5_A인 단백질, Genbank 접근번호가 AAF72885.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_653280.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF83085.1인 단백질, Genbank 접근번호가 1X71_A인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB55338.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW68058.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAF85629.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAB70777.1인 단백질, Genbank 접근번호가 NP_109591.1인 단백질, Genbank 접근번호가 AAD22767.1인 단백질, Genbank 접근번호가 BAC04252.1인 단백질, Genbank 접근번호가 EAW47735.1인 단백질 및 Genbank 접근번호가 EAW97581.1인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 단백질을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오타이드을 검출하는 단계를 통해 췌장암 마커를 검출하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
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