WO2015035480A1

WO2015035480A1 - USOS DE PELO MENOS UM miRNA, KIT, MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DE MAMA E MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE METÁSTASE

Info

Publication number: WO2015035480A1
Application number: PCT/BR2013/000357
Authority: WO
Inventors: Márcia Maria Chiquitelli MARQUES SILVEIRA; René Aloisio da Costa VIEIRA; Adhemar LONGATTO FILHO; Augusto Ludvik Filip MARINO; Adriane Feijo EVANGELISTA; Henrique Cesar Santejo SILVEIRA; Taciane MACEDO; Ligia Maria KERR
Original assignee: Fundação Pio Xii - Hospital De Câncer De Barretos
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2015-03-19
Also published as: BR112016005413A2; BR112016005413A8

Abstract

A presente invenção refere-se a novos usos de pelo menos um microRNAs, como biomarcadores de câncer de mama e como biomarcadores de potencial metastático em câncer de mama. Ainda, a presente invenção refere-se a kits que compreendem ditos biomarcadores e aos métodos de diagnóstico de câncer de mama e para avaliação de risco de metástase.

Description

"USOS DE PELO MENOS UM miRNA, KIT, MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DE MAMA E MÉTODOS PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE

METÁSTASE"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos usos de pelo menos um microRNA (miRNA), como biomarcadores de câncer de mama e como biomarcadores de potencial metastático em câncer de mama.

Ainda, a presente invenção refere-se a kits que compreendem pelo menos um de ditos biomarcadores e a métodos de diagnóstico de câncer de mama e para avaliação de risco de metástase em câncer de mama.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Segundo tipo mais frequente no mundo, o câncer de mama é o mais comum entre as mulheres, respondendo por 22% dos casos novos a cada ano. O câncer de mama se desenvolve a partir de alterações genético- moleculares nas células do tecido mamário não sendo considerado como uma única doença, dado ao seu alto padrão de heterogeneidade clínica e molecular.

Tal heterogeneidade gera diversos subtipos de câncer de mama, que notoriamente apresentam diferenças significativas na predição de sobrevida e sobrevida livre de doença, sendo o tipo basal de pior prognóstico seguido do tipo Her2 superexpresso.

Tais diferenças trazem grandes dificuldades para o diagnóstico e prognóstico de câncer de mama, principalmente quando envolvem potencial metastático.

Um problema frequente no diagnóstico de tumores de mama é a falta de marcadores biológicos associados à invasão e metástase tumoral. Sabemos que o processo de formação de novos vasos, denominado angiogênese, constitui um importante mecanismo no desenvolvimento tumoral, sendo responsável pelo aporte nutricional às células neoplásicas em proliferação, e estabelecendo condições favoráveis para a disseminação metastática.

Juntamente com sua habilidade em induzir a angiogênese, as neoplasias malignas também podem induzir a formação de novos vasos linfáticos, um processo referido como linfangiogênese.

O estudo do processo de linfangiogênese, ou seja, crescimento e produção de novos vasos linfáticos, sob vários aspectos fisiológicos e patológicos, ganhou um maior interesse nos últimos anos. Atualmente, não há um consenso se a principal via de disseminação linfática é através do desenvolvimento de vasos intratumorais ou peritumorais. Assim, a elucidação dos mecanismos que governam o processo de linfangiogênese é essencial para se entender como ocorre o desenvolvimento dos vasos linfáticos, bem como para encontrar marcadores específicos para eles.

O processo de metástase por sua vez é um passo crucial para disseminação das neoplasias, sendo responsável por mais de 90% das mortes associadas ao câncer. Considerando que a maioria dos pacientes portadores de câncer morrem devido a presença de metástases e não por causa do tumor primário, é imprescindível, portanto, que os estudos avancem na elucidação dos mecanismos moleculares deste evento, de maneira a encontrar alvos terapêuticos e prevenir a disseminação do câncer.

Dentro do contexto de progressão tumoral, os miRNAs têm surgido como importantes reguladores da expressão gênica e assim estariam associados ao estabelecimento e progressão de várias doenças incluindo a tumorigênese (vide Sassen S, Miska EA, Caldas C. MicroRNA— implications for câncer. Virchows Arch. janeiro de 2008;452(1):1-10).

Recentemente foi proposto que a patogênese do câncer envolve, entre outras macromoléculas, os miRNAs, cujos perfis de expressão estão associados com o prognóstico e os resultados terapêuticos em vários cânceres humanos.

MicroRNAs, ou miRNAs, são pequenos RNAs (19 a 24 nucleotídeos) não codificadores de proteínas originados de RNAs precursores em grampo com cerca de 60 a 1 10 nucleotídeos envolvidos na regulação pós- transcricional de genes codificantes (vide Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Câncer, novembro de 2006;6(1 1 ):857- 66).

A regulação pós-transcricional exercida pelos miRNAs ocorre por interação (pareamento de bases) na região 3' não traduzida dos RNAm (3'UTR) e depende do grau de complementaridade com o RNAm alvo. O resultado dessa interação pode levar a inibição da tradução ou a degradação do RNAm.

O fato dos miRNAs serem sequências pequenas e agirem sem a necessidade de pareamento completo, faz com que um único miRNA possa regular muitos RNAm alvos, além de cooperarem no controle de um único RNAm (vide Sevignani C, Calin GA, Siracusa LD, Croce CM. Mammalian microRNAs: a small world for fine-tuning gene expression. Mamm. Genome. março de 2006; 17(3): 189-202). As ferramentas atuais e de bioinformática utilizadas para estudo dos miRNAs ainda sofrem atualizações e melhoramentos constantes, dado ao fato de que novas funções moleculares e mecanismos de ação continuam surgindo destas pequenas moléculas.

Embora estejamos no início do entendimento da biologia dos miRNAs e seu modo de ação, o crescente número de estudos vem revelando a importância desses pequenos RNAs nos diversos processos biológicos, a os miRNAs tornaram-se muito importantes no entendimento molecular do câncer humano. Diante deste panorama o processo de metástase tumoral encaixa- se perfeitamente como modelo de estudo para a identificação de miRNAs que possam estar relacionados tanto com a angiogênese/linfangiogênese quanto com a invasão e metástase tumoral.

Isto porque embora a função dos miRNAs como oncogenes ou como supressores tumorais já tenha sido caracterizada, os mecanismos de mediação da metástase exercido pelos miRNAs foram pouco estudados até o presente momento.

Um crescente número de estudos demonstram que os miRNAs desempenham importante papel no início, progressão, invasão e metástase tumoral entre os diferentes tipos de cânceres (vide, por exemplo, Calin GA, Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat. Rev. Câncer, novembro de 2006;6(11):857-66; e Almeida Ml, Reis RM, Calin GA. MicroRNAs and metastases-the neuroblastoma link. Câncer Biol. Ther. março de 2010;9(6):453-4).

A busca por biomarcadores específicos e funcionais capazes de diferenciar uma condição patológica de um estado normal, ou de auxiliar de maneira acurada no prognóstico do paciente é uma luta travada diariamente em muitos países. O interesse por estas moléculas promissoras e sua possível aplicação clínica é crescente na literatura, uma vez que a medicina atual e a genômica estão cada vez mais entrelaçadas.

No entanto, pouco tem se avançado na aplicação da tecnologia de microRNA na identificação de biomarcadores para o câncer de mama, particularmente biomarcadores relacionados ao pior prognóstico da doença, qual seja, o câncer de mama metastático.

Apesar do carcinoma mamário ser amplamente estudado no mundo todo, ainda há muito o que se investigar. Neste sentido, necessário apontar a importância destas pesquisas para a saúde publica, já que os números mostram alto índice de mulheres acometidas com esta doença, e os altos índices de mortalidade oriundos direta ou indiretamente do câncer de mama.

Assim, a presente invenção visa contribuir com a expansão do conhecimento em direção a este problema, tendo como objetivo principal a identificação de miRNAs e sua aplicação como biomarcadores em câncer de mama e, particularmente, ao potencial metastático em câncer de mama.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de pelo menos um miRNA, selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , como biomarcador de câncer de mama é como biomarcador para o potencial metastático em câncer de mama.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um kit que compreende pelo menos um de ditos biomarcadores e instruções para o uso.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico in vitro de câncer de mama, em que dito método compreende as etapas de: (a) colocar em contato pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , com uma amostra alvo; e (b) avaliar o reconhecimento dos miRNAs pela amostra alvo.

Ainda, a presente invenção refere-se a um método in vitro para avaliação de risco de metástase em câncer de mama, em que dito método compreende as etapas de: (a) colocar em contato pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , com uma amostra alvo; e (b) avaliar o reconhecimento dos miRNAs pela amostra alvo. Outra realização da presente invenção refere-se a um método de diagnóstico in vitro de câncer de mama, e a um método in vitro para avaliação de risco de metástase, em que ditos métodos utilizam o kit da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 representa uma imagem típica de um eletroferograma obtido a partir da análise da integridade de uma das amostras de RNA total deste projeto.

A Figura 2 representa uma matriz de expressão de 12 microRNAs diferencialmente expressos no tecido tumoral de pacientes com câncer de mama sem metástase e com metástase no ECI. O dendrograma superior horizontal mostra o agrupamento das amostras e o vertical o agrupamento dos genes. O vermelho indica indução da expressão, a verde repressão, e o preto, sem modulação.

A Figura 3 representa uma matriz de expressão de 43 microRNAs diferencialmente expressos no tecido tumoral de pacientes com câncer de mama sem metástase e com metástase no ECU. O dendrograma superior horizontal mostra o agrupamento das amostras e o vertical o agrupamento dos genes. O vermelho indica indução da expressão, a verde repressão, e o preto, sem modulação.

A Figura 4 representa uma matriz de expressão de 67 microRNAs diferencialmente expressos no tecido tumoral de pacientes com câncer de mama sem metástase e com metástase no ECIII. O dendrograma superior horizontal mostra o agrupamento das amostras e o vertical o agrupamento dos genes. O vermelho indica indução da expressão, a verde repressão, e o preto, sem modulação. A Figura 5 representa um Diagrama de Venn mostrando a sobreposição de miRNAs apontados como diferencialmente expressos nas análises de microarrays. Podemos identificar os 7 miRNAs comuns aos três estadiamentos e os demais representam os miRNAs específicos de cada estádio e comuns a mais de um estádio (p < 0,05).

A Figura 6 representa uma comparação dos perfis de expressão de três miRNAs apontados como potenciais biomarcadores para o processo de metástase tumoral em pacientes com câncer de mama estadiamento clínico I (P≤ 0,05).

A Figura 7 representa uma comparação dos perfis de expressão de seis miRNAs apontados como potenciais biomarcadores para o processo de metástase tumoral em pacientes com câncer de mama estadiamento clínico II (p≤0,05).

A Figura 8 representa uma comparação dos perfis de expressão de doze miRNAs apontados como potenciais biomarcadores para o processo de metástase tumoral em pacientes com câncer de mama estadiamento clínico III (p < 0,05).

A Figura 9 representa uma confirmação da superexpressão de miR-183 e miR-494 nas amostras de tumores de mama metastáticos (M) em relação ao não metastáticos (NM) no estadiamento clínico II e I, respectivamente (A e B).

A Figura 10 representa as curvas ROC obtidas a partir dos dados de expressão dos miRNAs miR-21 , miR-183 e miR-494 diferencialmente expressos nas amostras de tumor metastático de pacientes com câncer de mama em estadiamento clínico II.

A Figura 11 representa a curva ROC obtida a partir da combinação dos dados de expressão dos miRNAs miR-21 , miR-183 e miR-494 diferencialmente expressos nas amostras de tumor metastático de pacientes com câncer de mama em estadiamento clínico II.

A Figura 12 representa as curvas de risco relativo associando o padrão de expressão (t/p = linha tracejada/doi/w = linha continua) do miR-21 , miR-183 e do miR-494 com a presença de metástase em pacientes com carcinoma mamário invasor estádio II (p < 0,05).

A Figura 13 representa a curva de risco relativo associando o padrão de expressão (i/p = linha tracejada/do w/7 = linha continua) combinado dos três miRNAs (miR-21 , miR-183 miR-494) com a presença de metástase em pacientes com carcinoma mamário invasor estádio II (p < 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com uma realização, a presente invenção refere-se ao uso de pelo menos um miRNA, selecionado do grupo que consiste em miRNA- 183, miRNA-494 e miRNA-21 , como biomarcador de câncer de mama e como biomarcador para o potencial metastático em câncer de mama.

Em uma realização preferida, a presente invenção utiliza uma combinação dos miRNAs selecionados dentre miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21. Particularmente, a presente invenção utiliza os três miRNAs em conjunto.

Ainda, a presente invenção refere-se a um kit que compreende:

(a) pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA- 83, miRNA-494 e miRNA-21 ; e (b) instruções para o uso.

O kit da presente invenção pode ser utilizado para o diagnóstico ou prognóstico de câncer de mama. Particularmente, o kit da presente invenção é aplicado no prognóstico ou diagnóstico de metástase de câncer de mama.

Em uma realização preferencial, o kit da presente invenção compreende uma combinação dos biomarcadores selecionados dentre miRNA- 183, miRNA-494 e miRNA-21. Particularmente, o kit da presente invenção compreende os três miRNAs em conjunto.

Ainda, a presente invenção refere-se a um método de diagnóstico in vitro de câncer de mama e a um método in vitro para avaliação de risco de metástase, que compreendem as etapas de: (a) colocar em contato pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em mi^'RNA-183, miRNA- 494 e miRNA-21 , com uma amostra alvo; e (b) avaliar o reconhecimento dos miRNAs pela amostra alvo.

Para a realização do diagnóstico ou da avaliação de que tratam os métodos da presente invenção, o nível de reconhecimento ou nível de expressão dos miRNAs pela amostra alvo deverá ser analisado. Uma alta expressão ou reconhecimento está associada ao pior prognóstico da doença.

De modo preferencial, os métodos da presente invenção empregam uma combinação dos miRNAs selecionados dentre miRNA- 83, miRNA-494 e miRNA-21. Mais particularmente, os três miRNAs são utilizados em conjunto.

A presente invenção refere-se ainda a um método de diagnóstico in vitro de câncer de mama e a um método in vitro para avaliação de risco de metástase, que utilizam o kit da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, os termos "potencial metastático", "prognóstico de metástase" e "avaliação de risco de metástase" são utilizados de forma intercambiai.

O potencial metastático ou diagnóstico de metástase de que trata a presente invenção refere-se a qualquer tipo de metástase. Particularmente, a metástase de que trata a invenção refere-se a metástase à distância ou metástase linfonodal. De acordo com uma realização preferida, a presente invenção refere-se a metástase à distância. Adicionalmente, conforme definição dada pela presente invenção, uma "amostra alvo" inclui qualquer amostra a ser avaliada pelo método da presente invenção.

Em particular, a amostra alvo da presente invenção inclui uma amostra de tecido tumoral ou linhagens celulares. Preferencialmente, o tecido tumoral é tecido de câncer de mama.

Os miRNAs da presente invenção são miRNAs disponíveis comercialmente, identificados abaixo:

microRNA Número de Sequência

acesso

hsa-miRNA-183 002269 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU hsa-miRNA-494 002365 UGAAACAUACACGGGAAAGCUC hsa-miRNA-21 000397 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

A presente invenção pode ser compreendida de forma mais clara e precisa através da leitura dos exemplos a seguir, que ilustram a presente invenção sem apresentar qualquer caráter limitativo.

EXEMPLOS DELINEAMENTO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo observacional de coorte retrospectivo.

ASPECTO ÉTICO

Esse estudo foi submetido ao Comité de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos / Fundação Pio XII, SP, Brasil (CEP) e encontra-se aprovado (processo: 362/2010). O estudo foi realizado a partir de casos selecionados obtidos do arquivo de anatomia patológica do Departamento de Patologia e no Banco de Tumores do Hospital de Câncer de Barretos, não envolvendo experimentação ou entrevista com as pacientes. Os pesquisadores garantem sigilo de todas as pacientes, não divulgando publicamente o nome ou qualquer outra informação que possa identificar as mulheres envolvidas neste estudo.

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

- Carcinoma mamário nas formas ductal e lobular;

- Estádio clínico I, II e III;

- Ausência de tratamento prévio;

- Tratamento no Hospital de Câncer de Barretos.

CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

- Seguimento inadequado, ou óbito precoce por outra patologia;

- Presença de outro sítio tumoral primário;

- Ausência de material parafinado suficiente para análise;

- Ausência de boa qualidade do RNA após extração.

CASUÍSTICA E ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE PACIENTES

A casuística global corresponde a uma coorte retrospectiva de 956 mulheres portadoras de câncer de mama, não submetidas a tratamento prévio, atendidas no período de 1998 a 2001 no Departamento de Mastologia do Hospital de Câncer de Barretos. Desta população foram excluídas pacientes nos estádios clínicos (EC) 0 e IV, sendo as pacientes avaliadas a partir de um banco de dados com informações relativas ao tratamento, recorrência e óbito destas pacientes. Neste período o seguimento mediano foi de 86.5 meses (variação de 1 a 141 meses), com taxas de perda de seguimento de 3,7%. Ao final do período, 32.7% tiveram óbito por neoplasia, 6.4% tiveram óbito por outra causa, 8.8% encontram-se vivas com neoplasia e 51 % encontram-se vivas sem evidência de neoplasia. Das 832 pacientes com estádio 0 a III, a taxa de recorrência foi de 31.6%. A taxa de recorrência encontra-se na Tabela- TABELA 1

RECORRÊNCIA/ METÁSTASE EM FUNÇÃO DO ESTÁDIO CLÍNICO AO INÍCIO DO TRATAMENTO. HOSPITAL DE CÂNCER DE BARRETOS. PERÍODO DE 1998 A 2001 EC-TNM Recorrência/ Metástase Total

Ausente Presente

I 102 (87.2%) 15 (12.8%) 117 lia 183 (80.6%) 44 (19.4%) 227

Mb 81 (64.8%) 44 (35.2%) 125

Illa 50 (56.8%) 38 (43.2%) 88 lllb 51 (63.0%) 30 (37.0%) 81

Mc 52 (36.1%) 92 (63.9%) 144

Total 569 (68.4%) 263 (31.6%) 832

pacientes foram selecionadas em função do desfecho conhecido, isto é, pacientes com metástase a distância, que foram comparadas com pacientes que não desenvolveram metástase à distância no mesmo estadiamento clínico. Foram inicialmente previstas 30 pacientes em cada subgrupo de estadiamento, sendo estas selecionadas a partir do banco de dados e pareadas frente ao estádio TNM, subclassificadas pelo EC global, EC- T e EC-N, separando-se em dois grupos, isto é, pacientes com recorrência metastática e sem recorrência metastática. Os casos foram selecionados de forma sequencial em função do registro hospitalar utilizando o TNM, sétima edição (61). Na ausência de correspondente com metástase avaliava-se o caso com o estadiamento que apresenta características mais próximas, sendo a escolha de maneira sequencial do banco de dados.

Posteriormente os prontuários foram avaliados, obtendo-se informações frente ao número do anatomopatológico. Na presença de material tumoral presente sob a forma de blocos de parafina, a paciente era incluída. Na ausência de material parafinado, a paciente era excluída, sendo avaliado quando possível, um novo caso no banco de dados, escolhido também de maneira sequencial.

Após a coleta do material, realizou-se análise estatística visando avaliar a adequação do pareamento entre os grupos, conforme dados apresentados nas tabelas 2 e 3 para a amostragem utilizada no rastreamento de microRNAs por microarrays. Nas variáveis categóricas utilizou-se o teste do qui-quadrado e o teste de Fisher. Nas variáveis contínuas, devido ao fato da distribuição do grupo não ser normal, utilizou-se o método de Mann-Whitney. Observou-se que a variável de interesse (metástase) se mostrou distribuída de maneira homogénea entre os grupos, frente à variável escolhida para o pareamento (p valor sem significância estatística).

TABELA 2

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS ENTRE OS GRUPOS COM PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE METÁSTASE À DISTÂNCIA.

Metástase Ausente Presente Total p (x²)

Variáveis selecionadas no pareamento

EC-TNM EC I 9 4 13 0.385

EC II 13 10 23

EC III 13 15 28

EC-T (TNM) T1 15 12 27 0.742

T2 10 8 18

T3 6 3 9

T4 4 6 10

EC-N (TNM) NO 17 8 25 0.378

N1 9 10 19

N2 5 5 10

N3 4 6 10 TABELA 3

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS VARIÁVEIS CONTÍNUAS ENTRE OS GRUPOS COM PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE METÁSTASE À DISTÂNCIA.

Ausente Presente

Mediana Max-Min Mediana Max-Min P

Tamanho 3.0 1-6.5 2.1 1-8.5 0.442

Idade 56.0 30-95 51.5 29-83 0.217

Foram elegíveis para as análises de expressão global de microRNAs, 09 pacientes no EC I, 13 pacientes no EC II e 13 pacientes no ECIII que não desenvolveram doença metastática e 4 pacientes do EC I, 10 do ECU e 15 do ECIII que desenvolveram metástase a distância, correspondendo a 13 pacientes no Estádio I, 23 pacientes no Estádio II e 28 pacientes no Estádio III. Os microRNAs que se mostraram diferencialmente expressos na etapa inicial de rastreamento tiveram sua expressão diferencial confirmada por PCR em Tempo Real nesta mesma coorte de rastreamento.

VARIÁVEIS CLÍNICAS E PATOLÓGICAS

As variáveis clínicas, anatomopatológicas, relacionadas ao estadiamento clínico TNM e ao tratamento e seguimento foram obtidas a partir de levantamento de dados de prontuários, por meio de ficha padronizada e encontram-se na forma de banco de dados, no programa SPSS statistics 19 for Windows®. Neste banco também encontram-se dados relacionados à metástase, seguimento, óbito e sobrevida.

Dos casos avaliados, realizou-se uma revisão histológica procurando mensurar o impacto de variáveis patológicas na metástase, e possível impacto dos microRNA identificados, como fatores prognósticos na análise univariada e multivariada. Em todas as pacientes, além da avaliação do estádio clínico específico (EC-T-TNM e EC-N-TNM), e da histologia (ductal ou lobular), realizou-se nova reação para avaliação da expressão dos receptores de estrogênio, progesterona, Ki-67, p-53. Her2 e citoqueratina 5/6. A tabela 4 mostra os marcadores que foram utilizados nas reações de imunohistoquímica.

Na análise microscópica das reações de IHQ os cortes foram analisados em microscópio óptico, com varredura das lâminas em aumento de 40X, aplicando-se o método semi-quantitativo. A análise semi-quantitativa foi feita quanto à positividade ou negatividade do marcador. Os RE e RP foram considerados positivos quando houve marcação nuclear em mais de 1 % das células tumorais. As citoqueratinas 5/6 foram consideradas positivas quando a marcação citoplasmática (fraca ou forte) foi observada nas células tumorais. O Ki-67 foi considerado em porcentagem de células marcadas. Para a análise estatística, foi considerado um ponto de corte de 14%. Quanto aos marcadores de membrana como HER2 (Herceptest), foram avaliados com um score semi- quantitativo e definidos como negativas a marcação de 0 - 1 + (zero a uma cruz), e como positivas, as marcações moderada 2+ (duas cruzes) e marcação intensa 3+ (três cruzes). O HER2 foi avaliado pela IHQ e os casos foram confirmados com DISH, sendo o kit de sondas para análise do HER2 da Ventana.

TABELA 4

RELAÇÃO DOS MARCADORES UTILIZADOS PARA USO NA TÉCNICA DE

IMUNOHISTOQUÍMICA.

Tecido

Proteína Anticorpo Anticorpo controle

Fabricantes Diluição

tecidual primário Secundário positivo da reaçao

Proteína Rabbit Carcinoma de

Ultraview

p53 monoclonal Dako 1 :1200 células

Universal

318-6-11 escamosas Receptor Rabbit Pronto

Ultraview

estrogênio monoclonal Ventana pra Mama

Universal

clone SP1 uso

Receptor de Rabbit Pronto

Ultraview

progesterona monoclonal Ventana pra Mama

Universal

clone IE2 uso

Mouse

Ki-67 monoclonal Ultraview

Dako 1 :600 Amígdala

MIB-5 Universal

Rabbit Pronto Ultraview

Her2

monoclonal Ventana pra Universal Mama 4B5 uso

Mouse Pronto

Citoqueratina Dako

monoclonal pra Dako Flex Próstata 5/6

D5/16B4 uso

Procurou-se realizar uma classificação do subtipo molecular através da imunohistoquímica (Luminal A ou B; basal-like e Her2 superexpresso), utilizando a classificação proposta por Carey (2006) (62) e Cheang et al (2009) (8), apresentadas na tabela 5. Todo o material foi analisado por uma única patologista, Dra. Ligia Maria Kerr, com larga experiência em patologia mamária.

TABELA 5

CLASSIFICAÇÃO MOLECULAR BASEADA NA EXPRESSÃO DE MARCADORES PELA

IMUNOHISTOQUÍMICA.

Subtipo RE/RP Her2 Ki67 C5/6

Luminal A Positivo Negativo <13%

Luminal B Positivo Negativo >1 % Positivo Positivo

Her2 Negativo Positivo

Basal Negativo Negativo Positivo

*Adaptada a partir de Carey (2006)(62) e Cheang et al (2009).

EXEMPLO 1

EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE RNA TOTAL

EXTRAÇÃO DE RNA DAS AMOSTRAS PARAFINADAS

Logo após a obtenção das peças cirúrgicas, fragmentos tumorais foram coletados e fixados em formaldeído tamponado 10%. Todo material foi previamente avaliado pela patologista responsável e colaboradora neste projeto Dra. Ligia Maria Kerr, que avaliou os cortes histológicos provenientes dos blocos de parafina disponíveis no Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos, corados por Hematoxilina/Eosina. Este procedimento foi utilizado como critério de seleção de blocos com áreas tumorais mais representativas para a extração de RNA, evitando assim a contaminação por excesso de células não tumorais e necrose.

Após a confirmação da área tumoral foram confeccionadas 5 lâminas com 1 corte de 10μιη cada e a área tumoral foi removida, por meio da raspagem, com agulha BD Precision Glide (1 ,20 x 40mm) e armazenada em microtubo de 1.5ml_ estéril para extração do RNA. A extração do RNA total foi realizada a partir de 40μιτι (4 lâminas com 10μιη cada) seguindo o protocolo do kit Recover AH Total Nucleic Acid Isolation {Ambion by Life Technologies, Austin, TX, USA). Este protocolo é iniciado pela imersão dos cortes em xilol para remoção da parafina, seguida de uma incubação por 3 minutos em termobloco a 50°C, e posterior centrifugação a 10.000 rpm por 2 minutos para formação de pellet de células. Na sequência, removeu-se o xilol deixando o pellet no fundo do tubo. Realizou-se então, duas lavagens com 1ml_ de etanol absoluto à temperatura ambiente a fim de remover todo o xilol residual, seguindo de centrifugação a 10.000 rpm, por 2 minutos à temperatura ambiente, deixando-se o pellet e removendo o sobrenadante.

O pellet de células resultante foi seco em centrífuga a vácuo Savant ISS110 Speedvac Concentrator {Thermo Scientific, Asheville, NC, USA) por 15 minutos na velocidade padrão e temperatura de 45°C. Em seguida, adicionou-se 4pL de protease seguido por 100μΙ_ de tampão de digestão fornecidos pelo kit e as amostras foram então incubadas por 3 horas a 50° C a fim de permitir a completa lise do tecido e liberação do RNA. Realizou-se então uma etapa de inativação da protease por aquecimento a 80° C durante 15 minutos. Decorrido este tempo adicionou-se a cada amostra 275μΙ_ de álcool absoluto e 120μΙ_ do reagente Isolation additive (fornecido pelo kit) somando um total de 395μΙ_ por amostra com a finalidade de ajudar na separação dos ácidos nucleicos do resto dos componentes celulares.

Em seguida realizou-se a purificação do material em colunas com filtros de sílica fornecidas pelo kit que retém o RNA total e o material filtrado é descartado. Na sequência, foram realizadas duas etapas de lavagem, a saber: inicialmente adicionou-se 700pL da solução Wash 1 (fornecida pelo kit) e então fez-se a centrifugação das amostras por 30 segundos a 10.000 rpm e temperatura ambiente. Desprezou-se o filtrado e na mesma coluna de purificação e adicionou-se 500μΙ_ da solução Wash 2 (também fornecida pelo kit). As amostras foram então novamente submetidas à centrifugação por 30 segundos a 10.000 rpm à temperatura ambiente.

Para eliminar soluções de lavagem residuais nos filtros das colunas de purificação realizamos nova centrifugação por 30 segundos a 10.000 x g e à temperatura ambiente. Na sequência, fizemos um tratamento com DNAse em que foi preparado um mix contendo: 4μΙ_ da enzima DNAse, 6μ!_ de 10X DNA buffer e 50μΙ_ de água nuclease free, todos estes reagentes fornecidos pelo kit. Foram então adicionados a cada amostra, 60μΙ_ deste mix no centro da coluna, seguida de incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. Após este tempo, repetiu-se o processo de lavagem em que foram realizados novamente duas etapas de lavagem, a saber: inicialmente adicionou-se 700μΙ_ da solução Wash 1 (fornecida pelo kit) e então fez-se a centrifugação das amostras por 30 segundos a 10.000 rpm à temperatura ambiente. Desprezou-se o filtrado e em seguida na mesma coluna de purificação, adicionou-se 500μί. da solução Wash 2 (também fornecida pelo kit).

As amostras foram então novamente submetidas a centrifugação por 30 segundos, a 10.000 rpm em temperatura ambiente. Com o intuito de eliminar soluções de lavagem residuais nos filtros das colunas de purificação, realizamos nova centrifugação por 30 segundos a 10.000 x g em temperatura ambiente. O filtro foi então transferido para um novo tubo coletor fornecido pelo kit e 30μί de água RNAse free foram adicionados no centro do filtro. Após 1 minuto de incubação à temperatura ambiente as amostras foram novamente submetidas à centrifugação durante 1 minuto a 13.400 rpm em temperatura ambiente a fim de obter o RNA total eluído em água RNAse free. O RNA total obtido foi então armazenado em freezer -80°C até sua utilização.

AVALIAÇÃO DA QUANTIDADE E QUALIDADE DO RNA

As quantificações das amostras de RNA total foram feitas utilizando o aparelho NanoDrop ND-2000 espectrofotômetro (NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA) sendo que 1 U A260 corresponde a 40ug de RNA/mL. Foram utilizadas apenas amostras livre de contaminantes (A260 A230 -1 ,8) e de proteínas (A₂6o/A₂8o = 1 ,8-2,0).

A qualidade das amostras de RNA total foi determinada por meio de eletroforese microfluidica (On-Chip electrophoresis) utilizando o aparelho Bioanalyzer 2λ 00 Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) e com os RNA Small Chips (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) (Figura 5). Este chip foi escolhido pois permite a quantificação de pequenos RNAs como os microRNAs em amostras obtidas de material parafinado.

Antes de iniciar o preparo do gel para eletroforese, todos os reagentes, que até o momento estavam a 4°C, foram mantidos por 30 minutos em temperatura ambiente. Para limpeza dos eletrodos, aplicou-se 40ΌμΙ_ de água no cartucho de lavagem e o mesmo foi inserido no aparelho com a tampa abaixada por 1 minuto. Em seguida o cartucho foi retirado e a tampa aberta para secagem dos eletrodos durante a preparação do chip.

Decorrido o tempo de 30 minutos de descongelamento dos reagentes, iniciou-se o preparo do gel, em que adicionou-se 650 L do RNA Small gel numa coluna com filtro fornecida pelo próprio kit e centrifugou-se por 10.000g, durante 15 minutos em temperatura ambiente, o gel foi aliquotado em tubos de 0,2mL com 45pL cada e armazenados a -30 ° C até o momento de uso. Em uma alíquota de 45μΙ_ em um tubo 0,2μΙ_ livre de nuclease, foi adicionado 2μΙ_ de RNA 6000 Small Dye, levou-se ao vórtex por 10 segundos e depois centrifugou-se a 13.000g por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida iniciou-se o preparo do RNA 6000 Small chip que foi colocado no priming station com os ajustes corretos para leitura de RNAs. Primeiramente adicionou-se 9μΙ_ da mistura do gel/dye na região G indicada no chip e com o auxílio de uma seringa acoplada ao priming station distribuiu-se o gel por todo o chip. Em seguida, adicionou-se outros 9μΙ_ da mistura nos demais pontos indicados com a letra G. Adicionou-se 9μΙ_ da Small RNA conditioning solution na posição marcada como CS e ainda 1 μΙ_ de marcador na posição indicada como ladder e 5μΙ_ de RNA Small Marker em cada uma das 1 1 amostras, bem como na posição do marcador. Por último, as amostras foram denaturadas a 70°C por 2 minutos, para evitar formação de estruturas secundárias e adicionou-se 1 μΙ_ de cada amostra nos respectivos poços marcados de 1 a 1 1. Com a ajuda do vórtex IKA MS3 (Manca, Hong Kong, CHIN), agitou-se o chip horizontalmente a 2.200 rpm por 1 minuto e em seguida, colocou-se o chip no bioanalizador. Com a ajuda do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma e densitometria dos géis) em 30 minutos de corrida eletroforética.

EXEMPLO 2

OLIGO MICROARRAYS MLCRORNAS MICROARRAYS

Para avaliação do perfil de microRNAs nas amostras de tecido tumoral de pacientes com carcinoma mamário foram utilizadas lâminas de microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) contendo cada uma quatro regiões com 15.000 oligos (60 mer) representando 723 miRNAs humanos e 76 controles internos preparados pelo processo de SurePrint (sistema de impressão), formato denominado de 8x15k oligo-a/rays. Este processo de síntese in situ possibilita a deposição de oligonucleotídeos, base a base, de 40-60-mer de comprimento (o que inclui a sequência de microRNA e uma cauda extra), com extrema precisão resultando em alta pureza e alta fidelidade das sondas de microRNAs.

A marcação das amostras foi feita com a utilização do miRNA Complete Labeling and Hyb Kit {Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a partir de 100ng de RNA total. O primeiro passo envolveu a diluição do RNA total para 50ng/pL em água livre de nucleases. Posteriormente, adicionou-se 2μΙ_ (100ng) dessa diluição em um tubo de 0,6mL e conservou-se no gelo enquanto foi preparado o CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) Master Mix, que foi feito sem a marcação do Spike-in. A reação por amostra do CIP Master Mix continha: 0,4μΙ_ de 10X Calf Intestinal Phosphatase Buffer, 1 ,1 pL de água livre de nucleases e 0,5μΙ_ de Calf Intestinal Phosphatase, sendo o volume final em cada amostra de 4pL . O passo seguinte envolveu a defosforilação das amostras. Todos os tubos foram colocados a 37°C em um termobloco por 30 minutos. Em seguida, denaturaram-se as amostras adicionando, em cada uma delas, 2,8μΙ_ de DMSO 100% em um termobloco, por 8 minutos. Após esse tempo, os tubos foram colocados imediatamente em um banho frio feito de uma mistura de água e gelo.

Após a denaturação, partiu-se para o processo de ligação preparando-se o Ligation Master Mix. Nesse mix utilizou-se por amostra: 1 μΙ_ de 10X T4 RNA Ligase Buffer (aquecido previamente a 37°C para dissolução do precipitado); 3μΙ_ de Cyanine3-pCp e 0,5μΙ_ de T4 RNA Ligase (mantida a temperatura ambiente durante o preparo da reação). Após a adição do mix, misturou-se gentilmente, resultando num volume final de 1 1 ,3μΙ_, e uma baixa e rápida centrifugação foi feita antes que os tubos fossem levados para incubação a 16°C em um termociclador por 2 horas.

Decorrido o tempo da incubação, as amostras foram submetidas a secagem a vácuo à temperatura de 45°C num aparelho Savant ISS1 10 Speedvac Concentrator (Thermo Scientific, Asheville, NC, USA) por aproximadamente 60 minutos observando-se que estivessem totalmente secas e sem resíduos de DMSO.

Na etapa que antecede a hibridação, as amostras foram resuspensas em 18μΙ. de água livre de nucleases e em seguida, pipetou-se 4,5μΙ_ de 10X Blocking Agent (preparado com a adição de 125μ1_ de água livre de nucleases e aquecido a 37°C por 4 minutos) e 22,5μΙ_ de 2X Hi-RPM Hybridization Buffer, resultando num volume de 45μΙ_. Após serem misturadas gentilmente, as amostras foram incubadas a 100°C, por 5 minutos e imediatamente transferidas para o gelo, por 5 minutos.

Enquanto ocorria a incubação, as câmaras de hibridação contendo as lâminas da Agilent foram preparadas para receber as amostras. Tudo deve ocorrer num período máximo de 15 minutos. O processo de hibridação com os microarrays aconteceu num forno a 55°C com 20rpm durante 20 horas.

Após a hibridação, as lâminas foram submetidas a imersão em GE Wash Buffer 1 (com 0,005% Triton X-102), à temperatura ambiente, para a liberação da lâmina em meio líquido, evitando o ressecamento e exposição ao ozônio do ar capaz de degradar a cianina (Cyanine3-pCp).

Em seguida, foram realizadas duas lavagens: a primeira no tampão 1 (GE Wash Buffer 1-0,005% Triton X-102) à temperatura ambiente por 5 minutos e a segunda no tampão 2 (GE Wash Buffer 2-0,005% Triton X-102) por 5 minutos, a 37°C. A adição do Triton reduz a possibilidade de surgimento de artefatos nos arrays.

Após serem retiradas da solução, as lâminas foram varridas imediatamente (scanning) evitando o impacto dos oxidantes ambientais na intensidade dos sinais utilizando o DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies).

ANÁLISE DOS DADOS DE MICROARRAYS QUANTIFICAÇÃO E PRÉ-PROCESSA ENTO DOS DADOS DE MICROARRAYS DE MIRNAS

Após o escaneamento das lâminas os dados brutos foram quantificados com o auxílio do software Feature Extraction versão.11.0 e os arquivos gerados no programa foram submetidos ao ambiente matemático- estatístico R versão 2.11.0 (http://www.r-proiect.org) para as etapas de pré- processamento e análises subsequentes. O ambiente R funciona através de pacotes, que são instalados para realização de cálculos e funções matemáticas, a fim de realizar ou combinar testes estatísticos.

Na primeira etapa foi feito o ajuste de background pela subtração dos valores de background de cada microRNA (gBGMedianSignaí) pelos valores de expressão (gMedianSignal), e transformados em escala logarítmica (log2). Finalmente, todas as distribuições foram normalizadas pelo método quantile, utilizando o pacote Aroma light (63). Foi também calculado o valor da mediana de todas as sequências de miRNAs depositadas na lâmina de microarray.

ANÁLISE ESTATÍSTICA POR RANK PRODUCTS

Os microRNAs diferencialmente expressos foram identificados pelo teste Rank Products, com uso do pacote RankProd em R (64). Rank Products é um método estatístico não-paramétrico que fornece uma lista ranqueada por fold change em que é calculada a taxa de falsos positivos. Em um estudo recente, comparando diversos métodos de análise de microarrays, esse teste foi considerado como um dos mais robustos, mesmo com baixo número de amostras (65).

Foram considerados como miRNAs diferencialmente expressos em cada estadiamento comparando o perfil de expressão no tumor primário e na metástase de acordo com os parâmetros de p-value e pfp (porcentagem de falsos positivos), ambos abaixo de 0.05. Dessa forma, foram realizadas análises pareadas entre ECI (sem metástase) e ECIM (com metástase), ECU (sem metástase) e ECIIM (com metástase) e ECIII (sem metástase) e ECIIIM (com metástase).

EXEMPLO 3

BUSCA DE MICRORNAS BIOMARCADORES DE METÁSTASE PELO MÉTODO DA CURVA

ROC

A fim de selecionarmos quais miRNAs apontados como diferencialmente expressos pelos microarrays, seriam bons candidatos a biomarcadores de metástase para os diferentes estadiamentos, utilizamos o método da curva ROC (receiver operator characteristic curve). O método da área sob a curva ROC tem sido amplamente utilizado para identificação de biomarcadores (66,67). O princípio é conceitualmente simples, no qual valores de sensibilidade são piotados em relação aos valores de especificidade. A área sob a curva (AUC) fornece um valor entre 0.5-1.0, por isso é também conhecido como estatística-c (68). Em geral, valores de AUC acima de 0.75 possuem significância clínica (69), sendo que no presente projeto selecionamos microRNAs com AUC acima de 0.8. Foi utilizada a função gim (General Logistic Models) e o pacote ROCR (70).

Os miRNAs de alta sensibilidade e especificidade (ROC ≥ 0,8) foram agrupados pela distância métrica de Pearson e Average Linkage usando o pacote gplots.

EXEMPLO 4

REAÇÃO DE PCR EM TEMPO REAL PARA CONFIRMAÇÃO DOS DADOS DE MICROARRAYS A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foi utilizada para a confirmação dos dados de microarray para quatro miRNAs, que se apresentaram diferencialmente expressos entre as amostras de paciente com carcinoma de mama metastáticos e não metastáticos nos diferentes estádios clínicos. Para o estadiamento clínico I foram selecionados o miR-2 ; para o estadiamento II o miRNA miR-183; já para o estadiamento III o miR-140-3p. Selecionamos ainda o miR-494 que se apresentou como diferencialmente expresso em pacientes com tumores metastáticos independente do estadiamento clínico. Para normalização dos dados utilizamos o RNU 48 como miRNA endógeno (cuja expressão se mantém com o mesmo padrão em todas as amostras biológicas) (tabela 6).

A reação de qRT-PCR foi feita utilizando-se o kit Taqman microRNA Assays (Life Technologies, Foster City, CA, USA), conforme orientação do fabricante. A quantificação da expressão dos microRNAs diferencialmente expressos, segue um protocolo simples, de dois passos, que requer a transcrição reversa com um primer microRNA específico seguido por PCR tempo real com sondas TaqMan. As reações de transcrição reversa foram realizadas com 10ng de RNA total, 0.15μΙ_ de dNTP; 1 μ1_ de enzima Multiscribe; 1 ,5μΙ_ de 10x RT buffer, 0, 19μΙ_ de Rnase inhibitor, 3μΙ_ do primer do microRNA de interesse; 4, 16 L de água RNAse free, segundo as instruções do fabricante. As amostras permaneceram a 16°C, durante 30 minutos (1 ciclo), depois a 42°C (1 ciclo), durante mais 30 minutos e então a 85°C, durante 5 minutos (1 ciclo). As reações foram realizadas no termociclador MasterCycle- Eppendorf. Finalizada esta etapa, as amostras foram imediatamente colocadas no gelo e armazenadas a -20°C. A segunda etapa consiste na reação de amplificação dos cDNAs. Para tal, adicionou-se a cada amostra de 5μ1_ de master mix RT; 2,5pL de água RNAse free; e 0,5μΙ_ da sonda do mesmo microRNA que se utilizou o primer no processo de transcrição reversa da etapa 1. A quantidade do mix é determinada a partir da multiplicação pelo número de amostras, geralmente uma placa de 96 poços; adiciona-se 8 iL do mix em cada poço; e 2μΙ_ do cDNA de cada amostra. As reações de qPCR foram realizadas com o auxílio do aparelho 7900 HT Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems USA). A reação tem volume final de 10μ1_, sendo que cada amostra foi feita em triplicata, com amplificação no 7900HT Fast Real-time PCR System {Applied Biosystems USA) numa corrida de cerca de 2 horas e 30 minutos com os seguintes ciclos: Estágio 1 , 10 minutos a 95°C; Estágio 2, 40 repetições de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C.

TABELA 6

SONDAS UTILIZADAS NAS REAÇÕES DE QRT-PCR E SUAS RESPECTIVAS SEQUÊNCIAS. microRNA Número de Sequência

acesso

RNU 8 001006 GATGACCCCAGGTAACTCTGAGTGTGTCG

CTGATGCCATCACCGCAGCGCTCTGACC

hsa-miRNA-183 002269 UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU

hsa-miRNA-494 002365 UGAAACAUACACGGGAAACCUC hsa-miRNA-140-3p 002234 U ACCACAG G G U AG AAC C AC G G hsa-miRNA-21 000397 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA

EXEMPLO 5

ANÁLISE DOS DADOS DE PCR QUANTITATIVA EM TEMPO REAL (QPCR)

A expressão relativa de cada microRNA foi calculada pela análise comparativa do gene alvo com o do controle interno (RNU 48 Control miRNA Assay, Applied Biosystems, USA), utilizando o método comparativo de ΔΔΟΤ, usando o programa R para determinação das respectivas quantificações relativas. Como normalizador, utilizamos o valor mínimo de expressão do grupo não metastático em relação ao metastático de cada estadiamento clínico.

A diferença estatística dos miRNAs entre os grupos de pacientes foi calculada usando o teste não paramétrico Mean-Whitney-U-test. Utilizamos como valor de corte o p valor < 0,05. Em seguida, estes miRNAs foram submetidos a uma análise da curva ROC que estabelece um valor de corte (threshold), baseado na expressão diferencial a fim de identificar miRNAs induzidos e reprimidos.

A associação dos padrões de expressão dos miRNAs (induzidos ou reprimidos) com a data de aparecimento da metástase dos pacientes nos diferentes estádios, foram considerados para obtenção da curva de risco relativo, usando o pacote Survival do ambiente estatístico-matemático R. Foram utilizados o test-log-rank e a análise multivariada pelo método de Cox. Nesta última, foram avaliadas a influência do T, N, M, histologia (ductal e lobular), assim como os subtipos moleculares. Ambas as análises consideraram p< 0,05.

EXEMPLO 6

RESULTADOS - DADOS CLÍNICOS

Neste trabalho, foram incluídas 64 pacientes portadoras de câncer de mama para rastreamento global de microRNAs, sendo: 35 que não apresentaram metástase à distância ao longo do tempo e 29 que apresentaram recorrência metastática à distância ao longo do tempo. Os grupos foram estratificados de acordo com o estádio clínico em ECI, ECU e ECIII na intenção de encontrar miRNAs comuns ou específicos a cada estádio, que estariam relacionados ao processo de metástase. Observou-se que a variável de interesse (metástase) se mostrou distribuída de maneira homogénea entre os grupos, frente as variáveis escolhidas para o pareamento, com exceção da variável receptor de progesterona (p=0.018), como é possível observar na Tabela 7. Ainda nesta tabela, tem-se os dados numéricos da distribuição dos subtipos moleculares, onde os tumores luminais A e B foram agrupados.

TABELA 7

ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS ENTRE OS GRUPOS EM RELAÇÃO AOS SUBTIPOS MOLECULARES.

Metástase Ausente Presente Total p (x²)

Variáveis categóricas observadas após o pareamento

Histologia Ductal 30 19 49 0.078

Lobular 5 10 15

Receptor RE + 21 13 34 0.226

Estrogênio RE - 14 16 30

Receptor RP + 16 5 21 0.018

Progesterona RP - 19 24 43

Her2 Her2 + 5 8 13 0.158

Her2 - 30 21 51

Subtipo Luminal 23 13 36 0.265

Molecular Basal like 9 11 20

Her2 3 5 8 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE E INTEGRIDADE DAS AMOSTRAS DE RNA

Após extração do RNA total das amostras de tumor emblocadas em parafina e fixadas em formalina, realizamos a avaliação das mesmas quanto à contaminação por proteína (razão 260/280) e fenol/reagentes razão (260/230), em que todas as amostras apresentaram razões entre 1 ,8 e 2,0, indicando desta forma, ausência de contaminação.

Posteriormente as amostras de RNA foram submetidas a análise de integridade por meio de eletroforese microfluidica utilizando o aparelho Agilent 2100 Bioanalyzer. A integridade das amostras evidenciando a preservação dos miRNAs pode ser observada pela densitometria, nas quais podemos checar a porcentagem de miRNAs na população de RNA total.

Somente as amostras que apresentaram picos correspondentes a 18-24 nt e que apresentaram concentração de miRNA superior a 40% (Figura 1) foram utilizadas pois correspondem população de microRNAs obtida dentro da população do RNA total.

ASSINATURAS DE EXPRESSÃO DOS MIRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS DURANTE A PROGRESSÃO DO CÂNCER DE MAMA

A fim de se obter as assinaturas moleculares do miRNAs durante a progressão do câncer de mama, foram realizadas hibridações com Agilent Human miRNA Microarray (8X15K - G4471A, Agilent Technologies). Amostras de RNA total (100 ng) foram marcadas utilizando o Kit miRNA complete labeling and Hyb Kit (Agilent Technologies) segundo as instruções do fabricante.

Os microRNAs foram considerados como diferencialmente expressos em cada estadiamento clínico, comparando o perfil de expressão no tumor primário de pacientes que ao longo do tempo desenvolveram ou não metástase à distância, de acordo com os parâmetros de p-value e pfp (porcentagem de falsos positivos), ambos abaixo de 0.05. Dessa forma, foram realizadas análises pareadas entre ECI (sem metástase) e ECIM (com metástase), ECU (sem metástase) e ECIIM (com metástase) e ECIII (sem metástase) e ECIIIM (com metástase). As figuras 2, 3 e 4 mostram a matriz de expressão com o dendrograma dos microRNAs e das amostras obtidas na comparação entre ECI x ECIM, ECU x ECIIM e ECIII x ECIIIM, respectivamente

Podemos observar que no ECI 9 microRNAs se apresentaram induzidos (up) e 3 reprimidos (down). Já no ECU, 28 miRNAs estavam up e 15 miRNAs estavam down. Finalmente no ECIII, 20 miRNAs foram observados como up e 46 como down, sendo que o miR-1236 não mostrou alteração de expressão. A tabela 8, apresenta a lista de miRNAs diferencialmente expressos com significância estatística divididos por estádio clínico, juntamente com suas respectivas modulações de expressão.

TABELA 8

MODULAÇÃO DOS MIRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS EM CADA ESTÁDIO

microRNA P.valor pfp modulação hsa-let-7a 0.00001 0.0045 up hsa-let-7b 0.00001 0.0011 up hsa-let-7c 0.00001 0.0212 up hsa-miR-1225-3p 1.00E-04 0.0496 up hsa-miR-1231 0.00001 0.005 up hsa-miR-1308 0.00001 0.0133 down hsa-miR- 914 0.00001 0.00001 up hsa-miR-21 0.00001 0.0174 up hsa-miR-328 0.00001 0.0233 up hsa-miR-494 5.00E-05 0.0274 up hsa-miR-553 1.00E-04 0.033

ebv-miR-BART17-5p 1.OOE-04 0.0212 down hcmv-miR-UL70-3p 0.00001 0.0024 up hsa-let-7a 1.00E-04 0.0093 down hsa-let-7b 5.00E-05 0.0131 down hsa-let-7c 0.00035 0.03415 up hsa-miR-1202 4.00E-04 0.03895 up hsa-miR-1207-5p 0.00001 0.0039 up hsa-miR-1225-5p 2.00E-04 0.02215 up hsa-miR-1246 0.00001 0.00001 up hsa-miR-125b 1. OOE-04 0.0122 up hsa-miR-1260 0.00001 0.00195 down hsa-miR-1268 0.00001 8.00E-04 up hsa-miR-1274a 0.00001 0.0059 down hsa-miR-1274b 0.00001 0.00001 down hsa-miR-1288 1. OOE-04 0.0149 up hsa-miR-1290 5.00E-05 0.0075 up hsa-miR-1308 0.00001 0.00695 up hsa-miR-150^* 4.00E-04 0.0358 up hsa-miR-16 0.00015 0.02465 down hsa-miR-1826 2.00E-04 0.0305 down hsa-miR-183 1. OOE-04 0.0125 up hsa-miR-186* 2.00E-04 0.0339 down hsa-miR-1914* 0.00001 0.0021 up hsa-miR-1915 0.00001 0.0015 up hsa-miR-200c 2. OOE-04 0.022 up hsa-miR-205 1.00E-04 0.0243 down

microRNA P.valor pfp modulação hsa-miR-23a 0.00001 0.0043 up hsa-miR-27a 1.00E-04 0.0123 up hsa-miR-29c 1.00E-04 0.0121 down hsa-miR-301a 2.00E-04 0.0419 down hsa-miR-424 1.00E-04 0.0155 up hsa-miR-494 0.00001 0.0103 down hsa-miR-572 3.00E-04 0.03065 up hsa-miR-575 3.00E-04 0.0308 up hsa-miR-630 5.00E-04 0.0425 up hsa-miR-638 0.00001 0.0054 up hsa-miR-663 2.00E-04 0.02005 up hsa-miR-720 0.00001 0.00001 down hsa-miR-923_v12.0 0.00001 0.00435 up hsa-miR-940 0.00001 0.0037 up jcv-miR-J1-3p 3.00E-04 0.0296 up

ebv-miR-BART12 0.00001 0.0058 up ebv-miR-BART13 2.00E-04 0.02065 down ebv-miR-BART19-3p 4.00E-04 0.0297 down hsa-let-7a 0.00001 0.0017 down hsa-let-7b 0.00001 0.00375 up hsa-let-7c 0.00015 0.025 up hsa-let-7f 1.00E-04 0.0148 down hsa-let-7g* 6.00E-04 0.0438 down hsa-miR-103 3.00E-04 0.0245 down hsa-miR-106b 4.00E-04 0.0317 down hsa-miR-107 3.00E-04 0.0233 down hsa-miR-1202 2.00E-04 0.0291 up hsa-miR-1207-5p 0.00001 0.00435 up hsa-miR-1225-5p 4.00E-04 0.03915 down hsa-miR-1236 6.00E-04 0.0427 NA hsa-miR-1246 0.00001 0.00001 down hsa-miR-1260 0.00035 0.0302 down hsa-miR-1268 1.00E-04 0.01215 down hsa-miR-1290 2.00E-04 0.0207 down hsa-miR-1303 3.00E-04 0.0276 down hsa-miR-1305 0.00025 0.0305 up hsa-miR-1308 0.00001 0.001 15 down

microRNA P.valor pfp modulação hsa-miR-140-3p 4.00E-04 0.029 down hsa-miR-1470 7.00E-04 0.0489 down hsa-miR-155 7.00E-04 0.0483 down hsa-miR-15b 1.00E-04 0.0079 down hsa-miR-16 0.00001 0.00245 down sa-miR-1826 0.00001 0.00015 down hsa-miR-188-5p 0.00045 0.0446 up hsa-miR-1915 1 0Ε-04 0.01355 down hsa-miR-196a 2.00E-04 0.0251 up hsa-miR-199a-3p 3.00E-04 0.03115 up hsa-miR-200a 7.00E-04 0.0493 down hsa-miR-205 0.00001 0.02755 down hsa-miR-21 0.00001 0.0013 down hsa-miR-217 4.00E-04 0.0432 up hsa-miR-26a .00E-04 0.0152 down hsa-miR-26b 3.00E-04 0.0248 down hsa-miR-27a 8.00E-04 0.0498 down hsa-miR-29a 2.00E-04 0.016 down hsa-miR-302d^* 5.00E-04 0.0403 down hsa-miR-30b 0.00025 0.02305 down hsa-miR-324-3p 6.00E-04 0.0453 down hsa-miR-328 0.00015 0.0165 down hsa-miR-342-3p 3.00E-04 0.0272 down hsa-miR-375 6.00E-04 0.0415 down hsa-miR-424^* 5.00E-04 0.0351 down hsa-miR-494 0.00001 9.00E-04 down hsa-miR-512-5p 0.00001 0.0076 up hsa-miR-513a-5p 1.00E-04 0.0151 down hsa-miR-513b 3.00E-04 0.0245 down hsa-miR-539 0.00001 0.0064 up hsa-miR-548f 5.00E-04 0.0488 up hsa-miR-559 2.00E-04 0.0265 up hsa-miR-575 1.00E-04 0.0103 up hsa-miR-590-3p 4.00E-04 0.0427 up hsa-miR-630 4.00E-04 0.0449 up hsa-miR-638 2.00E-04 0.027 up hsa-miR-657 8.00E-04 0.0499 down hsa-miR-663 1.00E-04 0.0148 down hsa-miR-720 0.00001 0.00001 up

microRNA P.valor pfp modulação hsa-miR-874 8.00E-04 0.0498 down hsa-miR-923_v12.0 1.00E-04 0.0129 up

hsa-miR-92b 5.00E-04 0.0366 down hsa-miR-93 2.00E-04 0.0193 down hsa-miR-939 3.00E-04 0.0279 down kshv-miR-K12-3 3.00E-04 0.0279 down

INTERPOLAÇÃO DOS MIRNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS DURANTE A PROGRESSÃO TUMORAL POR MEIO DA CONSTRUÇÃO DE UM DIAGRAMA DE VENN

A fim de avaliarmos a existência de relações entre o conjunto de microRNAs diferencialmente expressos em cada comparação (com e sem metástase) e os estadiamentos clínicos (ECI x ECIM; ECU x ECIIM; ECIII x ECIIIM), fizemos o diagrama de Venn, que compara os microRNAs obtidos em cada estadiamento utilizando o pacote gplots em R (http://cran.r- proiect.orq/web/packages/gplots/index.html). A figura 5 mostra o diagrama de Venn, apontando sete miRNAs que são diferencialmente expressos e comuns ao processo de metástase. São eles: hsa-let7a, hsa-let7b, hsa-let7c, hsa-miR- 1308, hsa-miR-21 , hsa-miR494, hsa-miR-923 V12.0.

Destes sete miRNAs encontrados como comuns a tumores metastáticos durante a progressão tumoral, destacamos que quatro deles (hsa- let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c e miR-21 ) já estão sabidamente relacionados ao processo de metástase, por terem como alvos alguns supressores tumorais (PTEN) e proto-oncogenes (genes Ras), o que valida nossos resultados com outros estudos previamente analisados.

Dentre estes sete miRNAs selecionamos o miR-21 (já sabidamente envolvido na carcinogênese) e o miR-494 (pois não existem evidências concretas do seu papel no processo de metástase em câncer de mama), para confirmação dos dados por PCR em Tempo Real.

BUSCA DE MICRORNAS BIOMARCADORES DE METÁSTASE NA PROGRESSÃO DO

CÂNCER DE MAMA, PELO MÉTODO DA CURVA ROC

A partir dos miRNAs apontados como diferencialmente expressos pelos microarrays utilizamos o método da curva ROC a fim de avaliar quais destes miRNAs seriam bons candidatos a biomarcadores de metástase. Utilizamos miRNAs que apresentaram a área sob a curva (AUC) acima de 0.8 como miRNAs com potencial significância clínica para biomarcadores de metástase.

Foram então gerados gráficos de cores ou heatmaps dos microRNAs diferencialmente expressos e que também foram também considerados significativos pelo método da área sob a curva ROC. Foi utilizada a distância métrica de Pearson para construção dos agrupamentos. As figuras 12, 13 e 14 ilustram os perfis de expressão dos microRNAs apontados como candidatos a biomarcadores de metástase identificados nas amostras de pacientes nos estadiamentos clínicos I, II e III que apresentaram metástase (ECIM, ECIIM e ECIIIM) em relação aos pacientes que não apresentaram metástase respectivamente (ECI, ECU, ECIM).

A figura 6 nos mostra três miRNAs cujos padrões de expressão são mais sensíveis e específicos ao processo de metástase para tumores classificados no estadiamento clínico I. São eles: miR-21 , miR1914 e miR-553.

Destes o miR-21 (o primeiro miRNA descrito em mamíferos) já vem sendo amplamente discutido na literatura como um oncomir, pois seus principais alvos já validados são supressores tumorais como PTEN e Bcl2 (entre outros alvos) (71 ). Alterações na expressão de miR-21 (superexpressão) vem sendo associada ao desenvolvimento de diversos tipos de tumores humanos dentre eles o câncer de mama (72). Para o estadiamento clínico II a figura 7 evidencia seis miRNAs cujos padrões de expressão são mais sensíveis e específicos ao processo de metástase para tumores de pacientes com câncer de mama neste estádio. São eles: jcv-miR-J1-3p, miR27a, miR183, miR-301a, miR-186 e miR-16.

Destes chamamos atenção para o miR-183, que se mostra superexpresso no tumor da maioria dos pacientes com câncer de mama ECU metastático. Este miRNA apresenta como principais alvos validados metaloproteinases de matriz e desempenha importante papel na regulação de supressores tumorais como EGR1 e PTEN. Além disso, a expressão deste miRNA está diretamente relacionada a tumores de mama que expressam o antígeno Her2/neu (73).

Finalmente, a figura 8 nos mostra doze miRNAs, cujos padrões de expressão são mais sensíveis e específicos ao processo de metástase para tumores classificados no estadiamento clínico III. São eles: miR-30b, miR-107, miR-93, miR-106b, miR-16, miR15b, miR-140-3p, miR-513b, miR-512-5p, ebv- miR-BART 12, miR-590-3p e miR-559.

O miR-15b e miR-16 pertencem a um cluster de miRNAs que ao que parece, exercem função de supressor tumoral, regulando negativamente a expressão do fator de transcrição E2F, que é uma molécula chave, tanto na indução da proliferação, quanto da morte celular (74).

CONFIRMAÇÃO DOS MIRNAS APONTADOS COMO DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS POR

QPCR EM TEMPO REAL

Utilizamos o método de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para a confirmação dos dados de microarray para cinco microRNAs, que se apresentaram diferencialmente expressos entre as amostras de paciente com carcinoma de mama metastáticos e não metastáticos, nos diferentes estádios clínicos. São eles: miR-21 e miR-494 (diferencialmente expressos nos casos ECI, ECII e ECIII), miR-183 (diferencialmente expresso apenas nos casos ECU) e miR-140-3p (diferencialmente expresso apenas nos casos ECI II).

Antes de realizarmos as reações de PCR em Tempo Real, fez-se necessário uma etapa de padronização das reações e seleção do melhor miRNA endógeno a ser usado como calibrador. Após vários testes para escolha do melhor endógeno selecionamos o RNU48 para normalização dos dados pois apresentava o mesmo padrão de expressão em todas as amostras biológicas analisadas.

Por meio das reação de PCR em Tempo Real conseguimos confirmar a expressão diferencial de dois miRNAs, o miR-183 para as amostras de pacientes do estadiamento clínico II e o miR-494 apenas para as amostras de pacientes do estadiamento I. Estes dois miRNAs se apresentaram superexpressos nas amostras de tecido tumoral metastático, quando comparados às amostras de tecido tumoral não metastático, com significância estatística (p < 0.05) (Figura 9).

Um fato curioso que nossos resultados mostraram é que na análise inicial utilizando a tecnologia dos microarrays e também por meio da construção do diagrama de Venn o miR-494 foi identificado como comumente superexpresso nos tumores metastáticos dos três estadiamentos clínicos. No entanto, quando realizamos o PCR em Tempo Real, foi possível identificar este miRNA com significância estatística alta (p < 0,002) apenas no estadiamento clínico mais inicial, ou seja, o EC I.

Este é um resultado totalmente original e muito interessante pois sabemos que este miRNA tem ¹ como alvos supressores tumorais, especialmente PTEN e que, portanto, a superexpressão de miR-494 pode ser um mecanismo de regulação pós-transcricional associado a eventos de iniciação da carcinogênese. Existem ainda poucos trabalhos na literatura que mostram a associação da expressão deste miRNA com o surgimento e progressão de alguns tipos de tumores. Sendo assim, talvez este miRNA seja um bom candidato a investigações futuras por meio de ensaios funcionais a fim de melhor elucidar o real papel deste miRNA no câncer de mama.

ASSOCIAÇÃO DOS PADRÕES DE EXPRESSÃO DOS IRNAS COM O PROGNÓSTICO DOS PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA DURANTE A PROGRESSÃO TUMORAL

Tendo em vista que a expressão do miR-183 foi confirmada apenas nas amostras do estádio II pelo PCR em Tempo Real, decidimos inicialmente avaliar se havia correlação da expressão deste miRNA com os dados clínicos dos pacientes nestes estadiamento. Nossos resultados mostraram que a superexpressão do miR-183 apresenta uma área sob a curva de 0,769, ou seja, este miRNA parece ser um bom marcador com alta especificidade e sensibilidade para o processo de metástase em pacientes com câncer de mama em estadiamento clínico II (Figura 10).

Considerando o potencial deste miRNA como biomarcador para o processo de metástase em tumores de mama de pacientes no estadiamento clínico II, decidimos avaliar se a combinação deste potencial biomarcador com o miR-21 e miR-494, nas amostras de estádio II, apresentava correlação da expressão com os dados clínicos com significância estatística. Fizemos então, uma regressão logística usando o modelo gim {general logistic model) em ambiente R, a fim de unir a expressão dos três marcadores (miR-183 específico do EC II, miR-21 e miR-494), e as combinações de dois a dois. Os valores resultantes desta regressão logística foram submetidos a análise da curva ROC, para determinação do ponto de corte, que caracteriza o valor predito pela regressão para a superexpressão (up) ou diminuição da expressão (down) destes miRNAs em cada paciente.

Com este valor de corte, finalmente foi possível fazer a associação do padrão de expressão dos três miRNAs e em combinações de dois a dois, comparados com a data de surgimento da metástase por meio da construção da curva de risco relativo usando o pacote Sun/ival do ambiente estatístico-matemático R. A probabilidade de recorrência foi avaliada pelo teste log-rank. Ambas as análises consideraram p < 0,05.

Observamos pelas curvas ROC, que a combinação do miR-183 com o miR-21 e o miR-494 aumenta o valor da área sob a curva, consequentemente aumentando o valor preditivo do miR-21 e miR-494 quando vistos separadamente, sugerindo um potencial destas combinações como biomarcadores de metástase para o estadiamento clínico II (Figura 10).

Realizamos também uma análise da curva ROC, combinando os valores de expressão dos três miRNAs (miR-21 , miR-183 e mir-494) a fim de avaliarmos o valor preditivo de metástase nas amostras de tumor de pacientes em estadiamento clínico II (Figura 1 1 ).

Podemos observar que a combinação destes três potenciais marcadores de metástase apresentou um resultado melhor, no qual houve um significativo aumento da área sob a curva (AUC=0,838), evidenciando o potencial destes marcadores para o câncer de mama metastático em estadiamento clínico II. No entanto, a sensibilidade especificidade da combinação não foi superior aos valores do miR-183 analisado separadamente. A tabela 9 mostra os miRNAs, bem como suas combinações e os valores da área sob a curva; sensibilidade e especificidade, destes potenciais biomarcadores de metástase em amostras do estadiamento clínico II.

TABELA 9

TABELA DOS MIRNAS COM POTENCIAL BIOMARCADOR APRESENTANDO OS VALORES DE CORTE OBTIDOS POR MEIO DAS ANÁLISES DE CURVAS ROC. microRNAs Valor de corte AUC Sensibilidade (%) Especificidade (%) miR21 1 ,89 0,438 30 75 miR183 4,708 0,769 75 80 miR494 1 ,688 0,400 30 75 miR21 + miR494 0,497 0,600 50 75 miR21 + miR183 0,431 0,823 90 70 miR183 + miR494 0,354 0,830 70 75 miR183 + miR21 +

miR494 0,567 0,838 75 80

Nossos resultados mostraram que não foi possível observar significância estatística entre os grupos de pacientes (metástase versus não metástase) quando associamos os padrões de expressão do miR-21 (p = 0,88 ) e do miR-494 (p = 0,86), após o teste estatístico de log Rank neste grupo de pacientes (ECU). Por outro lado, observamos que a superexpressão do miR- 183 foi associada a um pior prognóstico, com significância estatística (p=0,03), nos pacientes do estadiamento clínico II (Figura 12).

Na figura 12 também podemos observar que a combinação da expressão do miR-21 com miR-494 não foi significativa após o teste de log- rank (p=0,123). As outras combinações de marcadores foram significativas: miR-21 com miR-183 (p=0,004) e miR- 83 com miR-494 (p=0,001 ). Nos casos de estadiamento clínico III não foram encontrados resultados significativos para associação destes marcadores com o prognóstico.

Considerando que estes três marcadores são potencias marcadores de risco para o desenvolvimento de metástase nos casos de pacientes com câncer de mama em estadiamento clínico II, avaliamos a combinação da expressão destes três marcadores nos casos deste grupo. Nossos resultados mostraram que a superexpressão destes três miRNAs (miR21 + miR183 + miR494) foi associada a um maior risco relativo de desenvolvimento de metástase nos casos metastáticos do grupo de pacientes em ECU com alta significância estatística (p=0,002). O risco relativo para metástase de acordo com o padrão de expressão (up ou down) dos miRNAs é apresentado na figura 13.

Portanto nossas análises mostraram que quando fazemos a associação da expressão do miR-183 com qualquer um dos miRNAs (miR-21 e miR-494) observamos valores maiores de risco (Figura 13). Tal resultado nos mostra que provavelmente, miR-183 seja um potencial biomarcador de risco capaz de discriminar com maior acurácia tumores metastáticos de tumores não metastáticos de carcinoma de mama em estadiamento clínico II.

Considerando o potencial destes miRNAs (miR-183, miR-21 e miR494) como marcadores de risco para desenvolvimento do câncer de mama, realizamos ainda um análise multivariada utilizando a regressão de Cox. Esta análise tem o objetivo de avaliar a capacidade prognóstica em discriminar os pacientes independente das variáveis clínico-patológicas como: histologia; tamanho; envolvimento nodal e subtipo molecular (Tabela 10).

TABELA 10

ANÁLISE MULTIVARIADA PARA RISCO RELATIVO UTILIZANDO REGRESSÃO DE COX PARA COMBINAR VARIÁVEIS CLÍNICAS COM A MODULAÇÃO DE TRÊS MLRNAS DE INTERESSE (HSA-MIR21 , HSA-MIR494 E HSA-MLR-183).

Covariável p valor RR (95% IC)

Ductal 0.2964 (0.06656-1.32)

Histologia 0.1105

Outro 1

regulação Up 5.8382 (1.44192-23.64)

0.0134

miRNA Down 1

Lobular 3.374 (0.7577-15.02)

Histologia 0.1105

Outro 1

regulação Up 5.8382 (1.44:192-23.64)

0.0134

miRNA Down 1

T2 1.7449 (0.4589-6.635)

T2 0.41401

Outro 1 regulação Up 7.584 (1.7856-32.207)

0.00604

regulação Up 6.3045 (1.5768-25.208)

0.00921

miRNA Down 1 :

IpIlieSá ll

Subtipo Basal 0.3512 (0.06617-1.864)

0.21919

Molecular Outro 1

regulação Up 8.3112 (1.91848-36.006)

0.00464

Subtipo Her2 3.766 (0.8233-17.23)

0.08739

Molecular Outro 1 regulação Up 8.332 (1.8785-36.95)

0.00528

miRNA Down

Podemos observar pela tabela 10 que a superexpressão dos miRNAs miR-21 , miR-183 e miR-494 foi associada a um pior prognóstico apresentando risco relativo para o desenvolvimento de metástase com significância estatística (p < 0,05) e intervalo de confiança de 95%, independente das variáveis clínicas e patológicas avaliadas. Estes resultados são bastante promissores considerando que a combinação da superexpressão é bastante nova dentro do contexto de miRNAs como marcadores de risco para o desenvolvimento de metástase no câncer de mama.

CONCLUSÕES

Conseguimos identificar miRNAs diferencialmente expressos e comuns aos casos metastáticos de todos os estádios clínicos, o que evidencia sua importância no processo de progressão e metástase do câncer de mama.

Por meio de uma análise com curvas ROC, foi possível identificar perfis de expressão de miRNAs candidatos a biomarcadores de metástase para os diferentes estadiamentos clínicos estudados (ECI, ECU, ECIII) em pacientes com câncer de mama.

Conseguimos correlacionar os achados moleculares com os dados clínico-patológicos. Por meio da associação do padrão de expressão de miR-183 com miR-494 e miR-21 , foi possível associar o aumento da expressão destes marcadores a um pior prognóstico em pacientes com câncer de mama no estadiamento clínico II.

Como bem compreendem os técnicos no assunto, são possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção à luz dos ensinamentos acima, sem se afastar do seu escopo de proteção, conforme delimitado pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

I . USO DE PELO MENOS UM miRNA, selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , caracterizado pelo fato de que é como biomarcador de câncer de mama.

2. USO DE PELO MENOS UM miRNA, selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , caracterizado pelo fato de que é como biomarcador de potencial metastático em câncer de mama.

3. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que emprega uma combinação de miRNAs.

4. USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os três miRNAs são utilizados em conjunto.

5. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia ou metástase linfonodal.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia.

7. KIT, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA- 494 e miRNA-21 ; e (b) instruções para o uso.

8. KIT, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de miRNAs.

9. KIT, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende os três miRNAs em conjunto.

10. KIT, de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que se aplica no diagnóstico ou prognóstico de câncer de mama.

I I . KIT, de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que se aplica no diagnóstico ou prognóstico de metástase de câncer de mama.

12. KIT, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia ou metástase linfonodal.

13. KIT, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia.

14. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE CÂNCER DE

MAMA, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) colocar em contato pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , com uma amostra alvo; e (b) avaliar o reconhecimento dos miRNAs pela amostra alvo.

15. MÉTODO IN VITRO PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE

METÁSTASE, em câncer de mama, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) colocar em contato pelo menos um miRNA selecionado do grupo que consiste em miRNA-183, miRNA-494 e miRNA-21 , com uma amostra alvo; e (b) avaliar o reconhecimento dos miRNAs pela amostra alvo.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que uma alta expressão ou reconhecimento está associada ao pior prognóstico.

17. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que emprega uma combinação de miRNAs.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os três miRNAs são utilizados em conjunto.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia ou metástase linfonodal.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a metástase é metástase à distancia.

21. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE CÂNCER DE MAMA, caracterizado pelo fato de que utiliza um kit conforme descrito em uma das reivindicações 7 a 13.

22. MÉTODO IN VITRO PARA AVALIAÇÃO DE RISCO DE METÁSTASE, em câncer de mama, caracterizado pelo fato de que utiliza um kit conforme descrito em uma das reivindicações 7 a 13.