CN103773764A - 一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用 - Google Patents
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Abstract
发明的目的是提供一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用，所述的miRNA为miR-204-5p，其RNA序列为SEQ ID NO:1。该miRNA基因产物能够调节SMAD4基因的表达，阻断TGF-β／Smads信号通路，抑制上皮-间质转化(EMT)，具有制备用于后发性白内障PCO诊疗制品的潜力。
Description
本发明要求申请日为2012年12月27日，申请号为201210579895x，发明名称为：用于白内障相关miRNA的筛选的发明申请的优先权。
技术领域
本发明属于基因诊断与治疗的相关技术领域，具体涉及miR-204-5p在制备检测后发性白内障诊疗制品中的应用。
发明背景
后发性白内障（PCO）又称后囊膜混浊，是指白内障囊外摘除术后，或外伤性白内障部分皮质吸收后所形成的晶状体后囊膜混浊。它是白内障摘除术后最常见的并发症，在成人，术后发生率为30％～50％，在儿童则为100％。随着白内障超声乳化术的开展，后发性白内障已成为影响白内障术后视力恢复的主要因素。白内障术后的创伤修复、残留的晶状体上皮细胞(1ens epithelial cells，LECs)增生、迁移、上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、胶原沉积、残留LECs的晶状体纤维再生是白内障术后形成后发障的主要原因。目前针对后发性白内障的发病机理的研究较多，但在临床和药物干预方面仍缺乏安全、有效的手段减少PCO的发生。PCO一旦发生，通常采用Nd：YAG激光后囊膜切开术治疗，不仅费用昂贵，而且有视网膜脱离、黄斑水肿、虹膜出血等并发症的发生。药物治疗方面，目前眼内植入药物缓释装置是防治后发性白内障较为理想的给药方式，但是药物缓释装置中，药物浓度效应控制、作用范围、靶向性依然有待提高。已有研究表明，TGF-B可诱导a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)、波形蛋白（Vimentin）、上皮型E-钙粘蛋白(E-Cadherin)等与EMT相关目的基因的表达，诱导LECs发生EMT。而TGFβ／Smads信号传导系统在角膜的形成发育、角膜和晶状体创伤后的修复、后发性白内障中均起着至关重要的作用。通过调节Smad蛋白可以影响眼部组织的创伤愈合和纤维化程度。因此阻断TGF-β／Smads信号通路可能成为PCO新的治疗方法。这就需要获得能够调节Smad蛋白的有效的miRNAs。
发明内容
本发明的目的是提供一种miRNA及在制备后发性白内障诊疗制品中的应用，所述的miRNA为miR-204-5p，从而弥补现有技术的不足。
申请人通过对后发性白内障的囊膜芯片进行分析，发现miR-204-5p的表达量显著下调，且miR-204-5p参与后发性白内障PCO病程中靶基因SMAD4的调节，从而促成了本发明。
本发明的miRNA，为has-miR-204-5p，其核酸序列为SEQ ID NO:1；
本发明的miRNA，能够调节Smad基因的表达；
本发明还提供miR-204-5p或其模拟物（miR-204-5p mimic）的新的用途，是用于制备后发性白内障PCO的诊疗制品；
所述的制品为药物，该药物包含有药理有效含量的has-miR-204-5p或其模拟物。
本发明提供了一种能用于治疗后发性白内障的miRNA。has-miR-204-5p能够调节Smad的表达，通过阻断TGF-β／Smads信号通路，影响白内障术后的创伤修复、抑制上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)和残留LECs的晶状体纤维再生等，可能成为治疗PCO的新方法，具有制备用于后发性白内障PCO诊疗制品的潜力。
附图说明
图1：qRT-PCR分析正常人和后发性白内障患者LECs miR-31，miR-182，miR-204-5p的相对表达量的变化图；显示后发性白内障患者(PCO)LECs中miR-31，miR-182，miR-204-5p的表达显著下调(P<0.05)；
图2：miR-204-5p靶基因为SMAD4且显著下调SMAD4的表达图，其中A为miR-204-5p结合在SMAD4的3-UTR2880-2887bp区域；B为体外培养人晶体囊袋模型LECs转染pGL3-SMAD4、pGL3-control、miR-204-5pmimic+Mut-pGL3-SMAD4-3’-UTR、miR-204-5p mimic+pGL3-SMAD4-3’-UTR和miR-204-5p mimic+pGL3-SMAD4-3’-UTR后，海肾荧光素酶报告酶基因表达情况；C为miR-204-5p下调SMAD4蛋白的表达(上图为western blotting结果图,下图为GAPDH标准化后的结果)。泳道1：正常培养3天的囊袋LECs；泳道2：转染miR-204-5p mimic control的囊袋LECs；泳道3：转染miR-204-5p mimic的囊袋LECs；泳道4：转染miR-204-5p inhibitor的囊袋LECs；
图3：EMT标记物E-cadherin，a-SMA，Vimentin在后发性白内障PCO组织中的表达；Normal为正常人囊袋材料；PCO为后发型白内障患者囊袋材料；
图4：体外培养正常人囊袋LECs过量表达miR-204-5p mimic和miR-204-5p inhibitor后EMT marker基因的表达。
具体实施方式
申请人通过对后发性白内障手术患者和正常供体晶体囊膜材料芯片分析发现，miR-204-5p（等同于has-miR-204-5p）在后发性白内障手术患者晶体囊膜中显著下调，并通过qRT-PCR验证这一结果。同时发现miR-204-5p的靶基因为SMAD4，且在体外培养的PCO模型中，上调miR-204-5p的表达可抑制EMT的形成及其相关基因的表达，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：has-miR-204-5p的筛选及靶基因SMAD4的确定
1、样品RNA提取与检测
生物材料来源：正常人和后发性白内障患者晶体囊膜
根据TRIzol(Invitrogen)and miRNeasy mini kit(QIAGEN)说明书，提取miRNA在内的总RNA。
1)收集晶体囊膜加入1mL TRIzol(10μLβ-巯基乙醇)试剂，裂解后室温放
置5min。
2)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s后室温静置2-3min，12,000×g4℃离心15min。
3)去上清，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀。
4)将步骤3中得到的溶液和沉淀转移到2mL RNeasy Mini spin column中，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5)向吸附柱中加入700uL Buffer RWT，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6)向吸附柱中加入500uL Buffer RPE，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7)重复6。
8)将吸附柱放入一个新的RNeasy Mini spin column中，≥8000xg室温离心1min，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液
9)将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入20uL RNase-free ddH2O，轻轻盖上管盖，≥8000xg室温离心1min，得到RNA溶液。
使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以此计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变形凝胶琼脂糖电泳，检测RNA纯度和完整性。
2、制备荧光标记探针
采用miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower标记试剂盒(Exiqon,Vedbaek,Denmark)，用T4RNA连接酶将Hy3TM基团标记miRNA3’末端。反应体系如下:
CIP reaction:
混匀，37℃，30min，95℃，5min终止反应，至于冰上。
充分混匀，16℃避光孵育1h，65℃，15min终止反应。
3、芯片杂交
Hy3TM基团标记miRNA加入杂交缓冲液，95℃变性2min，冰上放置2min，与miRCURYTM LNA Array(v.16.0)(Exiqon)56℃杂交16–20h。杂交在Nimblegen Systems中进行，杂交完成后用Wash buffer kit(Exiqon)洗数次，400rpm，5min干燥。
4、图像采集数据分析
用Axon GenePix4000B芯片扫描仪扫描芯片荧光强度，并用GenePixPro6.0software(Axon)进行数据分析，比较正常人和后发性白内障患者晶体囊膜miRNA的差异。筛选出具有统计学意义，表达量差异的变化>=1.5倍、p值<0.05的miRNA。
5、qRT-PCR验证miRNA的表达
为了进一步验证miRNA芯片结果的准确性，在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，选取后发性白内障PCO患者和正常人的囊袋材料，采用qRT-PCR进一步验证。RNA提取方法与miRNA芯片一致，cDNA合成采用MMLV Reverse transcriptase1st-Stand cDNA SynthesisKit(Epicenter Biotechnologies，Madison,WI)，特异引物合成由广州RiboBio公司完成。qRT-PCR反应采用SYBR Green方法在ABI7500系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA)进行。三次实验重复后，结果表明，与正常晶体囊膜相比，后发性白内障患者晶体囊膜中hsa-miR-204（RNA序列为SEQ IDNO:1）显著下调，并且qRT-PCR结果也与芯片结果一致，如图1所示。
实施例2：has-miR-204靶基因SMAD4的确定
根据生物信息学分析，发现has-miR-204结合于SMAD4基因的3’-UTR区域第2880-2887bp处，如图2A所示。
扩增SMAD4基因的3’-UTR区域及Mut-SMAD4-3’-UTR区域，序列359bp，分别在上游添加BglII，下游添加MluI酶切位点，序列如表1所示，以pGL3-Basic Vector(Promega)为载体骨架，构建pGL3-SMAD4、pGL3-SMAD4-3’-UTR和Mut-pGL3-SMAD4-3’-UTR载体。
miRNA mimic作为一种化学合成的成熟miRNA模拟物，转染至细胞后可以模拟内源性miRNA发挥作用。miRNA inhibitor作为一种化学合成的成熟miRNA抑制剂，转染至细胞后可以特异性抑制miRNA的功能。因此，在体外培养条件下，采用miRNA mimic和miRNA inhibitor来模拟体内环境，研究miRNA的功能。
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，选取正常人的囊袋材料进行体外培养，发现与单独转染pGL3-control相比，LECs共转染pGL3-SMAD4-3’-UTR和miR-204-5p mimic(miR-204-5p的模拟物)(锐博生物，广州)共转染体外培养人晶体囊袋模型时，海肾荧光素酶报告酶基因表达下调2.5倍，如图2B所示。
采用miR-204-5p mimic和miR-204-5p inhibitor(miR-204-5p的抑制剂)(锐博生物，广州)转染囊袋LECs发现，转录水平上SMAD4mRNA的表达并无明显差异，而翻译水平上检测发现，miR-204-5p mimic转染的囊袋LECs中SMAD4的表达显著下调，而转染miR-204-5p inhibitor的囊袋LECs中SMAD4的表达与正常培养的囊袋LECs无差异，如图2C所示。综上说明，SMAD4是miR-204-5p的靶基因。
实施例3：has-miR-204-5p抑制体外培养PCO模型EMT发生
1、从PCO患者材料中检测EMT marker基因的表达
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，选取后发性白内障PCO患者和正常人的囊袋材料，进行western blotting检测EMTmarker基因E-cadherin，a-SMA，Vimentin的表达，发现与正常人相比E-cadherin表达显著下调，a-SMA，Vimentin表达上调，如图3所示。
2、上调has-miR-204-5p表达抑制EMT
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，选取PCO患者和正常人的囊袋材料，在含有10%胎牛血清的DMEM/F12（LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)培养基中TGF-β2处理24h后，分成两组分别转染miR-204-5p mimic control、miR-204-5p mimic和miR-204-5p inhibitorcontrol、miR-204-5p inhibitor，每组进行3次重复。形态学观察发现，第3-7天，正常培养的囊袋材料LECs开始由最初的排列整齐呈铺路石状晶体上皮细胞向间充质细胞转化，且出现褶皱。转染miR-204-5p mimic囊袋材料LECs，晶体上皮细胞向间充质细胞转化减缓，且褶皱较少。Western blotting检测发现，LECs转染miR-204-5p mimic时，E-cadherin表达上调，a-SMA，Vimentin表达下调；而转染miR-204-5p inhibitor时E-cadherin表达下调；a-SMA，Vimentin表达上调，如图4所示。说明miR-204-5p在维持LECs细胞形态以及抑制LECs细胞向成纤维细胞转化具有明显作用，能够抑制体外囊袋培养模型中EMT的发生。
体外培养的囊袋材料中，miR-204-5p mimic的总浓度为50nM，作为miR-204-5p及其稳定存在基因产物治疗后发性白内障药物计量的参考，给药方式可通过滴眼液局部用药、前房注射、植入缓释装置等途径在术后1到2周时间内进行给药，临床应用可根据受试者体重、年龄、健康状况、给药途径等方式确定给药量。
Claims (5)
1.一种miRNA，其特征在于，所述的miRNA为has-miR-204-5p，其RNA序列为SEQ ID NO:1。
2.has-miR-204-5p或其模拟物的应用，其特征在于，所述的应用是调节Smad基因的表达。
3.权利要求2所述的has-miR-204-5p或其模拟物的应用，其特征在于，所述的应用是用于制备用于治疗后发性白内障PCO的制品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的制品为药物。
5.一种用于治疗后发性白内障的药物，其特征在于，所述的药物包含有药理有效剂量的has-miR-204-5p和/或其模拟物。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104825249A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-08-12 | 温州医科大学 | 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533966A (zh) * | 2005-08-01 | 2012-07-04 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533966A (zh) * | 2005-08-01 | 2012-07-04 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YE WANG,ET AL: "MicroRNA-204-5p Regulates Epithelial-to-Mesenchymal Transition during Human Posterior Capsule Opacification by Targeting SMAD4", 《IOVS》 * |
| 秦宇 等: "miR一204调控Bcl一2家族在年龄相关性白内障发病过程中机制研究", 《中国实用眼科杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104825249A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-08-12 | 温州医科大学 | 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法 |
| CN104825249B (zh) * | 2015-04-28 | 2017-11-07 | 温州医科大学 | 一种表面介导基因治疗型人工晶状体及其制备方法 |
| CN114939125A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-08-26 | 江苏省中医院 | 巨噬细胞源外泌体在制备抗腹膜纤维化药物中的应用 |
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