ES2481819B1 - Método de evaluación para evaluar una posibilidad de cáncer de mama - Google Patents

Abstract

Método de evaluación para evaluar una posibilidad de cáncer de mama.#La presente invención se refiere a un método para evaluar una posibilidad de cáncer de mama en un sujeto, donde el método incluye detectar y cuantificar en suero o plasma micro-RNA específicos cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de mama. Igualmente, la invención se refiere al uso de micro-RNA específicos cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de mama.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de evaluación para evaluar una posibilidad de cáncer de mama.

imagen1

imagen2

La presente invención se refiere a un método para evaluar una posibilidad de cáncer de mama en un sujeto, donde el método incluye detectar y cuantificar en suero o plasma micro-RNA específicos cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de mama. Igualmente, 5 la invención se refiere al uso de micro-RNA específicos cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de mama.

La presente invención se enmarca en el campo del desarrollo de métodos no invasivos de diagnóstico precoz de transformaciones neoplásicas mamarias, por ejemplo como complemento a los habituales diagnósticos por imagen. 10

El cáncer de mama es uno de los cinco tipos de cáncer más comunes, siendo su elevada incidencia la causa principal de intensas investigaciones enfocadas principalmente a una detección precoz y un rápido diagnóstico. En este contexto, las ciencias ómicas han permitido grandes avances en la búsqueda de marcadores moleculares específicos para la detección precoz y el diagnóstico de este de tipo de cáncer (Kim BMC Bioinformatics 2010). De entre los 15 marcadores moleculares estudiados, ciertos micro-RNA se están valorando en cuanto a su uso potencial como marcadores de diagnóstico y pronóstico (Shi, Cancer TRat Rev 2009).

Los micro-RNA (miRNA) son pequeñas moléculas de RNA no codificante de cadena simple que modulan la expresión génica y cuyo tamaño es de dieciocho a veinticinco nucleótidos (Aoife L. Clin Can Res, 2008; Bartels, Clin Chem 2009; Zoon, Exp. REv. Mol. Diagn. 2009). Los 20 mi-RNA actúan como reguladores post-transcripcionales y controlan procesos celulares muy diversos, como desarrollo y diferenciación, ciclo celular y apoptosis. Así, se expresan en el núcleo celular de eucariotas, tanto en regiones intragénicas como intergénicas, y pueden regular la expresión de genes a nivel post-transcripcional bloqueando la traducción y/o induciendo la degradación del RNA mensajero (mRNA) uniéndose a su región 3’ no traducida 25 (UTR) complementaria. Diversos estudios recientes indican que los microRNA están implicados en la patogénesis de todos los tipos de cáncer en humanos (MICRO-RNAS: NUEVOS MARCADORES DE INTERÉS EN ONCOLOGÍA, Ginés Luengo Gil, Servicio de Hematología y Oncología Médica, Hospital Universitario Morales Meseguer, Centro Regional de Hemodonación y Departamento de Medicina Interna, Universidad de Murcia, REVISTA 30 EUBACTERIA (ABRIL 2012) Nº28 / ISSN-1697-0071).

Hasta el momento se han identificado aproximadamente unos 1.000 miRNA en humanos, de los cuales aproximadamente 200 están relacionados con procesos tumorales, aunque se sugiere que existen decenas de miles. La aparición y el continuo desarrollo de técnicas de secuenciación masiva ha sido clave para el descubrimiento y la identificación de este tipo de 35 moléculas, ya que su pequeño tamaño y la baja concentración en la que están presentes en las células eucarióticas dificulta su detección mediante técnicas moleculares tradicionales (Nygaard, BMC Med Gen, 2009). Además, un aspecto clave en la biogénesis de estas pequeñas moléculas de RNA que las hace atractivas como biomarcadores moleculares es el hecho de que se mantienen estables en suero y plasma, permitiendo su detección tanto en 40 tejidos específicos como en este tipo de fluidos (Lodes, PLoS one, 2009).

En el sistema de nomenclatura estándar, los microRNA (miRBase) se nombran con un nombre compuesto de 4 partes, del tipo mmu-miR-375-5p. Las tres primeras letras indican la especie, por ejemplo hsa (homo sapiens) para humano. Un nombre de microRNA en minúscula (por ejemplo hsa-mir-22) hace referencia al gen de microRNA o al pre-microRNA, mientras que al 45 microRNA maduro se le asocia el término miR (como en hsa-miR-22-5p). La referencia numérica asociada al nombre se asigna de forma secuencial, mientras que la última referencia alfanumérica se refiere al brazo (5p o 3p, respectivamente 5’ o 3’).

Se han caracterizado aproximadamente unos 20-30 miRNA específicos diferencialmente expresados en cáncer de mama. Algunos de los ejemplos mejor caracterizados son miR-21, que tiene un carácter oncogénico; miR-29A, miR-17-5p, miR-26A, miR-181A, miR-22, miR196A-2, etc. (Maillot, Cancer Res 2009; Bourguignon JBC 2009; Wu, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011). Actualmente, los patrones de expresión de estos 5 miRNA específicos se están utilizando para diferenciar el tejido sano mamario adyacente al tejido tumoral con el fin de clasificar los distintos tipos de tumores y avanzar en el pronóstico (Lowery, Clin Can Res 2008; Enerly, PLoS One 2011, Rothe, PLoS One 2011).

Los cánceres de mama se pueden clasificar en subtipos moleculares en función de diferentes perfiles de expresión genética. Perou y col. (Perou, C.M., Sorlie, T., Eisen, M.B., van de Rijn, 10 M., Jeffrey, S.S., Rees, C.A., Pollack, J. R., Ross, D.T., Johnsen, H., Akslen, L A., y col. (2000), Molecular portraits of human breast tumours, Nature 406, 747-752) revelaron la estratificación molecular de los tumores mamarios en subtipos moleculares reproducibles de cáncer de mama con diferentes características biológicas, resultados clínicos y respuestas a la terapia. La clasificación incluye dos grupos basados en la expresión génica del receptor estrógeno (ER): 15 ER+ (luminal A, luminal B, luminal C) y ER- (Her-2, tipo basal o triple negativo, tipo normal). Estos subgrupos se han relacionado con diferentes evoluciones de la enfermedad, lo que indica la existencia de una base biológica como causa de la heterogeneidad clínica del cáncer de mama.

Así, la identificación de microRNA específicos para los distintos tumores de mama podría 20 contribuir de manera efectiva y probablemente más precisa al diagnóstico y pronóstico de la enfermedad.

Por tanto, dado el potencial de este tipo de marcadores, se ha investigado activamente cómo se produce se liberación de los miRNA específicos expresados en las células malignas tumorales al torrente sanguíneo. Para algunos MiRNA como miR-451 y miR-1246 se ha 25 demostrado que son expresados en células epiteliales mamarias malignas y liberados selectivamente a la circulación, mientras que son retenidos intracelularmente en células epiteliales sanas (Pigati, PLoS One, 2010). Estudios recientes demuestran que estos miRNA específicos pueden ser detectables mediante reacciones de amplificación a partir de sangre periférica, ya que estas moléculas son de pequeño tamaño y muy estables (Zhao, Cancer 30 PLoS One 2010).

Por ejemplo, del documento WO2014023797 se conoce un método ex vivo para determinar si las células tumorales de un paciente son o podrían ser resistentes a un medicamento que modula la unión de una hormona esteroidea a su receptor. El método descrito en este documento permite seleccionar qué tipo de tratamiento hormonal sería más adecuado en cada 35 caso para ciertos tipos de cáncer de mama.

La US 20120214864 se refiere a un método para identificar un tumor triple negativo en una muestra procedente de un sujeto, en particular tejido tumoral, donde un nivel disminuido de determinados miRNA comparados con los correspondientes a un tumor luminal indican que el sujeto padece un cáncer triple negativo. 40

La presente invención proporciona un método para evaluar una posibilidad de cáncer de mama en un sujeto, donde el método incluye detectar y cuantificar en una muestra de suero o plasma del sujeto en cuestión la expresión de al menos un micro-RNA específico seleccionado de entre hsa-miR-142-3p (UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA, SEQ ID NO: 1, Nº de acceso MIMAT0000434), hsa-miR-505-5p (GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU, SEQ ID NO: 2, Nº de 45 acceso
MIMAT0004776), hsa-miR-21-5p (UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA, SEQ ID NO: 3, Nº de acceso MIMAT0000076), hsa-miR-125b-5p (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA, SEQ ID NO: 4, Nº de acceso MIMAT0000423) y hsa-miR-3656 (GGCGGGUGCGGGGGUGG, SEQ ID NO: 5, Nº de acceso MIMAT0018076) y/o combinaciones de los mismos, específicos de la

población española, cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de mama; comparar la expresión mediante análisis estadístico con un valor de referencia obtenido de un sujeto sano para determinar si existe sobreexpresión; y evaluar la posibilidad de cáncer de mama en base a una posible presencia tumoral cuando el al menos un miRNa está sobreexpresado en la muestra en un valor superior a un valor de corte óptimo. 5

Preferentemente, en el método anteriormente descrito se utiliza una combinación de hsa-miR-125b-5p (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA, SEQ ID NO: 4, Nº de acceso MIMAT0000423) y hsa-miR-3656 (GGCGGGUGCGGGGGUGG, SEQ ID NO: 5, Nº de acceso MIMAT0018076).

Igualmente, la invención se refiere al uso de los micro-RNA específicos citados o de combinaciones de los mismos cuya expresión está relacionada con la presencia de tumor de 10 mama, incluyendo cualquier subtipo de tumor (Her2+, Luminal A y B y Triple negativo), en un método tal como el descrito.

Las figuras y ejemplos siguientes de la invención se aportan a modo meramente ilustrativo y no limitativo de la misma.

En las figuras: 15

Fig. 1: Esquema metodológico de extracción de RNA a partir de tejido mamario e identificación de miRNA diferencialmente expresados mediante plataforma de microarrays;

Fig. 2: muestra los resultados estadísticos de diferencia de expresión de los miRNA diferencialmente expresados obtenidos en el grupo de estudio y el grupo de 20 control;

Fig. 3: muestra los resultados estadísticos de la diferencia de expresión de los miRNA en cada uno de los subtipos de tumores estudiados;

Fig. 4: Estudio estadístico de expresión diferencial en plasma, donde miRNA1 se corresponde con la SEQ ID NO: 1, miRNA2 se corresponde con la SEQ ID NO: 25 2, miRNA3 se corresponde con la SEQ ID NO: 3, miRNA4 se corresponde con la SEQ ID NO: 4 y miRNA5 se corresponde con la SEQ ID NO: 5.

1. Metodología aplicada

Selección muestral

Se recopilaron muestras de tejido parafinado de pacientes diagnosticados de tumores Triple 30 negativo, luminal A, luminal B y Her2 para el grupo de estudio y de tejido mamario sano para el grupo de control como se muestra en la tabla 1 siguiente:

Tabla 1

Grupo de estudio

Tipo de tumor

Número de pacientes

Triple negativo

22

Luminal A

19

Luminal B

15

Her2

15

Grupo de control

Número de muestras

Tejido mamario sano

14

.

Todas estas muestras se procesaron para identificar los miRNA diferencialmente expresados tal como se muestra en la Fig. 1. En el caso de las muestras de tejido parafinado, se aplicó una técnica de microdisección en los cortes parafinados para extraer RNA específicamente del tejido embebido con el fin de evitar interferencias y ruido de fondo en los resultados del estudio 5 de expresión.

Análisis de resultados y selección de miRNA candidatos

Los resultados de los distintos perfiles de expresión de las muestras hibridadas en la plataforma de arrays se filtraron y analizaron estadísticamente. Este análisis estadístico consiste esencialmente en procesar los datos brutos obtenidos a partir de la plataforma de 10 arrays para obtener un listado de miRNA diferencialmente expresados, en mayor o menor proporción, de un modo estadísticamente significativo respecto al grupo de control. El objetivo de este análisis es estudiar la expresión de los miRNA que detecta la plataforma de microarrays empleada, en este caso 1.926 (miRCURY LNA microRNA Array, 7th gen), para analizar los distintos patrones de expresión de cada uno de los tipos de tumor, identificándose 15 el valor de expresión de los miRNA subregulados y sobreexpresados en cada uno de ellos mediante análisis “pipeline” y algoritmos estadísticos. Con el fin de filtrar y normalizar los datos obtenidos, se eliminan los miRNA con una expresión inferior a un valor umbral V < 0,07. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente Tabla 2 (véanse las Fig. 2 y 3):

Tabla 2 20

Grupo

miRNA diferencialmente expresados Subregulados Sobreexpresados

Estudio

191 104 87

Control

169 103 66

La selección de los miRNA diferencialmente en cada subtipo permite disponer de una firma genética específica para cada tipo de tumor.

Con la selección de miRNA obtenida se trabajó sobre el grupo completo de tumores para obtener una firma que indique la presencia de cualquier tumor de mama. Como resultado de 25 este análisis, se obtuvo un grupo de 27 miRNA que presentan unos parámetros de precisión, sensibilidad y especificidad muy apropiados, del 98%, 100% y 83% respectivamente.

2. Metodología aplicada

Se obtuvieron muestras de sangre completa (en tubos específicos para estudios de expresión en sangre), plasma y suero y se procesaron para obtener fracciones de RNA en las que 30 estuvieran presentes los miRNA de interés. Se escogieron las muestras de plasma ya que permitieron extraer la fracción con los miRNA con un kit adecuado de purificación. Se procedió entonces a analizar la expresión de los miRNA seleccionados a partir de los procesos anteriormente descritos con el fin de obtener un grupo de miRNA potenciales estadísticamente robustos y significativos. 35

El conjunto de los 27 miRNA se sometió a una priorización el función de las sondas disponibles para su detección en el sistema de qRT-PCR miRCURY LNA (PCR reversa cuantitativa). Este primer grupo de lección se basó en 18 marcadores de los que se encontraron sondas prediseñadas y validadas para el estudio de expresión.

Para la detección de los miRNA se retrotranscribió el RNA a cDNA y se ajustaron los 5 parámetros de amplificación siguiendo las instrucciones del proveedor.

Se testó también la detección de diferencias de expresión de los miRNA en las muestras de tumores parafinados, ya que el cambio de metodología de la plataforma de arrays a la detección por qRT-PCR podría afectar a la detección de alguno de ellos. De las reacciones de amplificación en las muestras tumorales parafinadas se obtuvieron los siguientes resultados: de 10 los 18 miRNA seleccionados, 8 no pudieron amplificarse por qRT-PCR y de los 10 restantes 9 estaban diferencialmente expresados.

Estos 9 miRNA diferencialmente expresados se detectaron entonces en muestras de plasma mediante qRT-PCR, de los cuales se detectó la expresión para 8 de ellos, y de estos, cinco estaban diferencialmente expresados. 15

Con estos cinco miRNA se realizó un análisis estadístico para el análisis de significación estudiando los resultados de diferencia de expresión de los cinco miRNA en la serie completa de muestras, obteniéndose los resultados mostrados en la Fig. 4. Como puede observarse claramente en esta figura, el nivel relativo de sobreexpresión de los cinco miRNA seleccionados indica que éstos están significativamente expresados en las muestras obtenidas 20 de sujetos con tumores de mama (“Pre” en la figura 4). En todos los casos, el valor de significación considerado para asumir que la expresión del miRNA relevante es significativamente distinta era < 0,05.

En función de los resultados obtenidos se calculó el valor de corte (“cutoff”) para cada uno de los miRNA seleccionados, entendido como el valor límite que diferencia positivos y negativos, 25 esto es el valor óptimo para cada miRNA que divide los resultados de forma que se encuentran más miRNA sobreexpresados en las muestras tumorales por encima o por debajo de dicho valor y al contrario en caso de las muestras sanas.

Ejemplo

Para evaluar la posibilidad de cáncer de mama en plasma obtenido de un sujeto particular, se 30 cuantifica en cada muestra la expresión de los micro-RNA seleccionados, en este ejemplo cada uno de hsa-miR-142-3p, hsa-miR-505-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-125b-5p y hsa-miR-3656 y de la combinación hsa-miR-125b-5p + hsa-miR-3656, tal como se ha descrito anteriormente por qPCR, así como los escogidos como referencia para el sujeto, en este ejemplo hsa-miR103a-3p y hsa-miR-16-5p por tener un nivel de expresión muy constante en la población general. 35 Para cada miRNA se calcula el valor normalizado de la expresión restando el valor del miRNA de referencia al valor de miRNA de interés en cada muestra. A continuación se compara la expresión mediante análisis estadístico tal como se ha descrito anteriormente con un valor de referencia control de un sujeto sano para determinar si existe sobreexpresión. Por último, se evalúa la posibilidad de cáncer de mama en base a una posible presencia tumoral 40 considerando que la sobreexpresión del miRNA en cuestión indica la presencia del tumor si el valor resultante es superior al cutoff óptimo en cada caso.

miRNA

AUC (área bajo la curva) Error estándar 95% Intervalo de confianza Valor p Cutoff óptimo Sensibilidad (%) Especificidad (%)

miR-142-3p

0,6509 0,06607 0,5214-0,7805 0,03004 0,9171 64 69

miR-505-5p

0,7333 0,06323 0,6094-0,8573 0,001012 0,9599 73 72

miR-21-5p

0,7781 0,05417 0,6719-0,8843 < 0,0001 0,8896 67 81

miR-125b-5p

0,7956 0,04934 0,6988-0,8923 < 0,0001 0,8599 70 92

miR-3656

0,8938 0,03953 0,8163-0,9714 < 0,0001 0,6310 90 81

miR-3656 + miR125b-5p

0,9138 0,03353 0,8481-0,9796 < 0,0001 0,5856 84 92

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para evaluar una posibilidad de cáncer de mama en un sujeto, incluyendo el método

   i. detectar y cuantificar en una muestra de suero o plasma del sujeto la expresión de al menos un micro-RNA específico seleccionado de entre 5

   hsa-miR-142-3p (UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA, SEQ ID NO: 1),

   hsa-miR-505-5p (GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU, SEQ ID NO: 2),

   hsa-miR-21-5p (UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA, SEQ ID NO: 3),

   hsa-miR-125b-5p (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA, SEQ ID NO: 4) y

   hsa-miR-3656 (GGCGGGUGCGGGGGUGG, SEQ ID NO: 5) 10

   y/o de cualesquiera combinaciones de los mismos, específicos de la población española;

   ii. comparar la expresión mediante análisis estadístico con un valor de referencia obtenido de un sujeto sano para determinar si existe sobreexpresión; y

   iii. evaluar la posibilidad de cáncer de mama en base a una posible presencia 15 tumoral cuando el al menos un miRNa o una combinación de cualesquiera de ellos está sobreexpresado en la muestra en un valor superior a un valor de corte óptimo.
2. 2. Método para evaluar una posibilidad de cáncer de mama en un sujeto según la 20 reivindicación 1, caracterizado porque en el paso i. se selecciona la combinación de hsa-miR-125b-5p, SEQ ID NO: 4, y hsa-miR-3656, SEQ ID NO: 5.
3. 3. Utilización de al menos un micro-RNA específico seleccionado de entre

   hsa-miR-142-3p (UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA, SEQ ID NO: 1), 25

   hsa-miR-505-5p (GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU, SEQ ID NO: 2),

   hsa-miR-21-5p (UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA, SEQ ID NO: 3),

   hsa-miR-125b-5p (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA, SEQ ID NO: 4) y

   hsa-miR-3656 (GGCGGGUGCGGGGGUGG, SEQ ID NO: 5) y/o de combinaciones de cualesquiera de los mismos, 30

   específicos de la población española, en un método según la reivindicación 1.