CN104630216A - 一种放射性核素标记的microRNA-155靶向探针及其在肿瘤显像的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肿瘤显像的放射性核素标记的microRNA-155靶向探针。本发明提供了一种microRNA-155靶向探针A,为将microRNA-155靶向核酸的5’端与1个氨基通过己基连接,所述microRNA-155靶向核酸的核苷酸序列为序列表中序列2;所述序列2自5’末端第1-6位核苷酸和第18-23位核苷酸均经硫代修饰,且自5’末端第1-3位核苷酸和第21-23位核苷酸均经2’-甲氧基修饰。本发明的99mTc-AAM-155可有效的用于肿瘤的活体显像,而且能够在活体水平示踪miR-155的体内分布情况。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种放射性核素标记的microRNA-155靶向探针及其在肿瘤显像的应用。
背景技术
恶性肿瘤是一类严重危害人类身体健康的疾病。据统计,我国每年新增肿瘤患者约160万人,每年因肿瘤死亡的人数约130万人。肿瘤的早期诊断,可以使患者得到及时治疗,提高治愈率、改善预后、降低死亡率,因而早发现、早诊断、早治疗的“三早”原则在肿瘤诊治中受到广泛重视,一直是肿瘤研究的热点课题。在众多诊断手段中,核医学的放射性核素示踪技术以其高灵敏性、无创性、活体动态监测等优势独树一帜。特别是近年来分子核医学的不断发展,在细胞水平、甚至基因水平利用放射性核素示踪技术对特定分子进行探测,具有无创、早期、动态、定性/定量诊断等优势。研发具有高特异性、高灵敏度、强应用性的分子探针,实现疾病的早期诊断是分子核医学领域的前沿热点课题。
microRNA(miRNA)是一类小分子量的非编码RNA,一般为20~24个核苷酸,通过与靶基因的3’端非编码区域互补配对,使翻译受到抑制或引起特异性降解,从而在转录后水平进行调控。当某些miRNA由于基因扩增、缺失、变异等原因发生表达失调(增多或减少)时,可以导致恶性肿瘤的发生。这类miRNA已被证实扮演着原癌基因和抑癌基因的角色。原癌miRNA在大量的实体和血液恶性肿瘤中高表达,可以引起正常细胞发生恶变或增加肿瘤细胞的侵袭性和转移性。众多研究表明,miRNA可作为一种新的肿瘤标志物,在肿瘤组织的特异性变化可以帮助恶性肿瘤的早期诊断、进展评价、预后判断、以及治疗评估,甚至miRNA本身亦可作为治疗药物。
microRNA-155(miR-155)是第一个被发现具有癌基因功能的miRNA,定位于染色体21q23中的B细胞整合簇(B cell integration cluster,BIC)的非编码区,参与分化、造血、炎症、凋亡和免疫过程,特别是与多种恶性肿瘤、心血管疾病和病毒感染有关。miR-155的靶基因预计约991种,编码转录调控蛋白、蛋白受体、激酶、核和DNA结合蛋白,如C/EBPβ、E2F2、CyclinD、PIK3R1、SOSCl、K-ras及TGF,通过MAPK,ErbB,mTOR和VEGF等影响细胞增殖、分化和凋亡的细胞信号通路。众多研究证实,miR-155显著高表达于乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺导管癌、甲状腺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤,在肿瘤发生、发展、侵袭及转移中发挥重要的作用,且与患者预后息息相关。恶性肿瘤组织中的miR-155可达正常组织的10-14倍。体外细胞实验表明,miR-155在MDA-MB-453乳腺癌细胞中可以抑制caspase-3活性,阻止凋亡。高表达的miR-155常伴随tumor protein 53-induced nuclear protein 1(TP53INP1)降低,该因子可以阻滞细胞周期并激活caspase-3诱发凋亡。在胃癌研究中,过表达的miR-155靶向作用于信号传导蛋白SMAD2抑制细胞的迁移、侵袭和粘附。在肝癌研究中,能通过活化Wnt信号显著抑制凋亡,促进肝癌细胞增殖,还可直接靶向作用于SOX6,下调p21waf1/cip1通路,或靶向作用于C/EBPβ,增加细胞增殖和肿瘤形成。高表达的miR-155通过靶向下调凋亡诱导基因TP53INP1的表达促进PDAC的发生。miR-155在结肠癌细胞中的表达,继而下调靶点SOSCl的表达,促进小鼠肿瘤的生长。miR-155在TGF-β/Smad2信号通路中受到调控,与RhoA靶向作用后,在乳腺癌的发生发展中发挥作用。高度表达的miR-155,通过抑制RhoA的活性,干扰细胞的紧密结合的形成,进而促使细胞迁移和侵袭。由此可见,miR-155作为一种多种恶性肿瘤显著高表达的肿瘤相关生物标志物,可以作为肿瘤相关的作用靶点。检测恶性肿瘤中miR-155的表达水平对肿瘤的特异诊断、早期预警、预后评价、疗效评估与治疗指导等方面具有重要的临床应用价值。
然而,目前针对miR-155在体内水平的检测方法均为肿瘤活检组织的离体测定,如miRNA基因芯片技术、northern blotting检测、实时定量PCR(RT-PCR)分析、免疫组织化学方法等等。这些检测方法存在以下问题:有创性,需要穿刺活检组织或手术切除病变,且操作过程较为繁琐,结果有赖于病理组织的有效选取,存在一定的假阴性率。因此,miRNA的组织检测不能满足早期诊断的需要,不适于广泛的筛查和预防。有必要发展一种能活体检测miRNA表达的方法。
反义核苷酸能够与序列互补的miRNA发生特异性的结合,利用这一特点,设计和合成互补的反义寡核苷酸,进行适当的化学修饰,使之能在血清中保持良好的稳定性,进而在体内与互补的miRNA进行特异性的结合。将放射性标记方法与反义理论相结合,得到放射性核素反义示踪技术。肿瘤反义基因显像选择肿瘤特异的miRNA分子为靶向,对其特异性结合的探针进行放射性标记,利用单光子发射显像设备(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)等多种检测手段,显示反义探针的体内分布,定性或定量地评价在肿瘤的浓聚水平。反义显像方法相比体外活检方法,最大优势就是避免了检查的创伤性,实现了无创、活体、实时的肿瘤分子显像,不受活检标本取材的限制,对生物体进行整体全面的评价,避免了假阴性结果。
随着对miRNA在恶性血液病中的作用的深入研究,针对miRNA合成的反义寡核苷酸,有望成为肿瘤治疗的靶点。miR-155作为癌基因促进多种恶性疾病的发生、发展的潜在靶标,已被报道在体外细胞和组织中用于肿瘤靶向治疗研究。miR-155的反义寡核苷酸在治疗神经胶质瘤中,增加GABRAl蛋白的表达,抑制恶性细胞的增殖。在乳腺癌者中恢复SOCSl蛋白的表达,抑制肿瘤生长。在小鼠或猴子模型体内实验中,反义寡核苷酸靶向结合特异性miRNA可通过抑制miRNA发挥作用,证实反义探针具有结合的特异性和可靠性。
靶向核酸分子能否与靶基因特异性结合,是靶向显像技术成功与否的关键。反义核酸与靶点的结合,根本上取决于有效反义寡核苷酸序列的确定。未修饰的核酸分子在体内或血清环境下容易发生降解进而导致活性丧失,必须要使用一定的化学修饰方法来保证寡核苷酸的生物稳定性。目前关于核酸分子的化学修饰方式主要包括2’糖基修饰(包括2’-O-methyl,2’-OMe;2’-O-methoxyethyl,2’-MOE;2’-flouro,2’-F)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)和磷酸骨架修饰(phosphorothioate backbonemodification,PS)。合适的化学修饰不但能够提高核酸探针与靶向RNA的杂交亲和力,提高其抵抗核酸酶降解的能力,而且还可以减缓核酸探针的血浆清除速度并提高进入组织的能力。LNA修饰或肽核酸修饰的核酸探针通过抑制miR-155,用于治疗实体和血液系统恶性肿瘤,均取得了良好效果。以上研究为核酸标记探针的靶向显像研究提供了理论依据。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种microRNA-155靶向探针A。
本发明提供的microRNA-155靶向探针A,为单链DNA分子,其核苷酸序列为序列2,且序列2的第一位核苷酸通过己基连接伯胺,序列2第1-6位核苷酸和第18-23位核苷酸均经硫代修饰,第1-3位核苷酸和第21-23位核苷酸均经2’-甲氧基修饰。
本发明的另一个目的是提供一种microRNA-155靶向探针B。
本发明提供的microRNA-155靶向探针B,为用放射性核素标记所述靶向探针A,得到microRNA-155靶向探针B。
上述microRNA-155靶向探针B中,所述放射性核素为99mTc。
上述microRNA-155靶向探针B中,所述放射性核素是通过螯合剂NHS-MAG3标记到所述标记所述靶向探针A。
本发明的第三个目的是提供一种显像剂。
本发明提供的显像剂,其活性成分为上述的靶向探针A或上述的靶向探针B。
或本发明提供了microRNA-155作为肿瘤显像剂靶点中的应用。
上述的靶向探针B在制备显像剂中的应用也是本发明保护的范围。
上述显像剂为肿瘤影像显像剂。
本发明的第四个目的是提供一种制备靶向探针B的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
1)将上述的靶向探针A和NHS-MAG3溶液混匀,螯合反应,收集反应产物,即得到螯合后靶向探针A;
2)将所述螯合后靶向探针A和放射性核素在含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中反应,得到靶向探针B。
上述螯合反应在常温静置2h的条件下进行;
NHS-MAG3中的MAG3和靶向探针A(AAM-155)的摩尔比为15:1-20:1,具体为20:1。
上述含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系按照包括如下步骤的方法制备:
将SnCl2溶液、浓度为50mg/ml、pH值为9.2的酒石酸钠缓冲液混匀得到含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系,其中,SnCl2溶液与酒石酸钠缓冲液的体积比为1:5。
上述SnCl2溶液为将维生素C溶于10mM的HCl中,配制浓度为1.0mg/ml维生素CHCl溶液,将SnCl2与新鲜配制的维生素盐酸溶液混匀,得到SnCl2溶液,且SnCl2在SnCl2溶液中的终浓度为4mg/ml;
上述浓度为50mg/ml、pH值为9.2的酒石酸钠缓冲配方:将碳酸氢钠、乙酸铵、氢氧化铵和水混匀得到混合液,碳酸氢钠在混合液中的终浓度为0.5M、乙酸铵在混合液中的终浓度为0.25M、氢氧化铵在混合液中的终浓度为0.175M,得到浓度为50mg/ml、pH值为9.2的酒石酸钠缓冲液。充分混匀后沸水浴静置反应1h,得到反应产物。
上述步骤2)的反应为将MAG3-核酸溶液、酒酒石酸钠缓冲液、氯化亚锡溶液和99mTcO4 -淋洗液混匀后沸水浴静置反应1h,得到反应产物。
MAG3-核酸溶液:99mTcO4 -淋洗液:酒酒石酸钠缓冲液:氯化亚锡溶液的体积配比为15:5:5:1。
上述方法中,
步骤1)中,所述NHS-MAG3溶液中NHS-MAG3的浓度为7-8mg/ml,所述NHS-MAG3溶液中NHS-MAG3的浓度具体为7.25mg/ml;
步骤2)中,
所述含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中的氯化亚锡的浓度为3-5mg/ml,所述含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中的氯化亚锡的浓度具体为4mg/ml;
所述含有氯化亚锡和酒石酸钠反应体系中的酒石酸钠的浓度为6-8μg/μl;所述含有氯化亚锡和酒石酸钠反应体系中的酒石酸钠的浓度具体为7μg/μl。
上述的microRNA-155靶向探针A或上述靶向探针B在制备1)-6)至少一种产品中的应用:
1)促进肿瘤细胞中的C/EBPβ蛋白表达产品;
2)提高肿瘤细胞摄取率产品;
3)肿瘤影像显像剂;
4)用于肿瘤的活体显像产品;
5)在活体水平示踪microRNA-155的体内分布情况产品;
6)检测和/或定位肿瘤产品;
所述肿瘤具体为乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌、肝癌或黑色素瘤;
所述肿瘤细胞具体为乳腺癌MCF-7、胶质瘤U87、宫颈癌HeLa、肝癌HepG2或黑色素瘤A375。
上述99mTc为锝-99m,即99mTcO4 -淋洗液。
上述NHS-MAG3为巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimidyl-S-acetyl-mercaptoacetyltriglycline)。
本发明选择miR-155作为靶点,将放射性核素示踪技术与microRNA的分子生物学特征相结合,设计具备特定化学结构的核酸分子(amino-anti-miR-155,AAM-155),通过化学结构修饰如2’-甲氧基修饰和硫代修饰提高其血清稳定性及生物活性,使之能够与miR-155发生特异性靶向结合,并且通过与双功能螯合剂NHS-MAG3偶联可被放射性核素锝[99mTc]所标记,最终制得放射性核素锝[99mTc]标记的miR-155靶向探针(99mTc-AAM-155),为新型、无创性的肿瘤分子显像探针,并分别从放射性标记、血清稳定性、肿瘤细胞摄取、体外抑制活性以及荷瘤动物体内生物分布与活体显像等方面评价99mTc-AAM-155用于肿瘤显像的潜在应用价值。
综上所述,本发明的99mTc-AAM-155显像剂具有如下特点:
(1)miR-155在多种肿瘤中均具有高表达,是特异性较强的人体肿瘤生物标志之一,对临床肿瘤患者的诊断、治疗以及疗效监控具有重要意义。本研究证明以miR-155为靶点的99mTc-AAM-155显像剂可有效的用于肿瘤的活体显像,而且能够在活体水平示踪miR-155的体内分布情况;其有望在活体水平实现无创、早期、特异性的诊断肿瘤,以期将来在基因水平上为肿瘤患者的预后评价、疗效评估与治疗指导等方面提供有效的评价手段,克服体外检测miR-155所存在的缺点,具有重要的研究意义与潜在的临床应用价值;
(2)本研究基于与miR-155靶向结合的DNA序列AAM-155,分别对其5’和3’端的各6个核苷酸进行PS修饰,对两端各3个核苷酸进行2’-OMe修饰以提高探针的靶向结合能力和体内血清稳定性。此外,在探针的5’端连接6碳己基和氨基以偶联双功能螯合剂NHS-MAG3,达到标记99mTc的目的,得到99mTc-AAM-155。这些针对AAM-155的结构修饰具有首创性。本发明的99mTc-AAM-155显像剂通过磷硫酰修饰和2’-OMe修饰后,使其具有很好的稳定性;
(3)本发明的99mTc-AAM-155显像剂通过双功能螯合剂NHS-MAG3被放射同位素99mTc标记,获得了较高和稳定的标记率、放化纯和比活度。
(4)本研究利用放射性核素标记技术,制备特异性分子探针,应用靶向探针高专一性识别靶miRNA的原理,将其引入体内,实现在体内显示miRNA的生物分布情况。相较于其他常见标记DNA方法(如荧光素标记,生物素标记等),这种方法具有在活体水平上应用的优势,为miRNA体内应用机制和机理的研究提供辅助方法。
附图说明
图1为99mTc标记AAM的反应路线图。
图2为99mTc-AAM-155(A)和99mTc(B)的HPLC鉴定结果。
图3为凝胶电泳鉴定结果。
图4为2’-OMe及PS修饰及未行修饰探针的血清稳定性对比。
图5为放射性探针的标记稳定性结果。
图6为Western blotting鉴定AAM-155及对照探针对C/EBPβ蛋白结果。
图7为荧光标记的AAM-155和对照control探针的肿瘤细胞分布比较。
图8为99mTc-AAM-155及99mTc的MCF-7肿瘤细胞摄取率比较。
图9为99mTc-AAM-155在1、2、4、6、8、10h各时间点的荷U87裸鼠实验组体内生物分布T/NT比值。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)。
图10为99mTc-control在1、2、4、6、8h各时间点的荷U87裸鼠实验组体内生物分布T/NT比值。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)
图11为99mTc-AAM-155在2、4、6、8h各时间点的荷MCF-7裸鼠实验组体内生物分布T/NT比值。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)。
图12为实验组99mTc-AAM-155在多种荷瘤裸鼠肿瘤模型中的显像结果。箭头所指为肿瘤部位。
图13为对照组99mTc-control在乳腺癌MCF-7、胶质瘤U87及黑色素瘤A375荷瘤裸鼠的活体显像结果。箭头所指为肿瘤部位。
图14为2’-OMe及PS修饰(A)及未修饰(B)的AAM-155探针在荷U87裸鼠的活体显像对比。箭头所指为肿瘤部位。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的制备
miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的具体合成及反应路线见图1,是将miR-155的反义寡核苷酸序列进行化学修饰,这些化学修饰包括对探针两端各6个碱基进行磷酸骨架的磷脂酰(PS)修饰以及在探针两端各3个碱基进行2’-甲氧基(2’-OMe)修饰,通过双功能螯合剂S-乙酰基-NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl derivative ofS-Acetyl mercaptoacetyltriglycine)使之被放射性核素99mTc标记。
靶向探针99mTc-AAM-155的制备方法具体如下:
一、化学修饰后miR-155靶向核酸的获得
1、miR-155靶向核酸序列的确定
确定miR-155的反义寡核苷酸序列作为实验组,人类无关基因序列作为对照组。miR-155的原始序列为5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’(序列1)(23nt)。
根据特异性靶向的设计原则,合成如下miR-155的反义寡核苷酸作为实验组miR-155靶向核酸(为序列2所示的单链DNA分子):
实验组miR-155靶向寡核苷酸:5’-ACCCCTATCACGATTAGCATTAA-3(序列2)(23nt,单链);
对照组寡核苷酸control:5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3(序列3)(22nt,单链)。
2、化学修饰后miR-155靶向核酸的获得
由生工生物工程(上海)有限公司合成化学修饰后miR-155靶向核酸和化学修饰后对照寡核苷酸。
1)化学修饰后miR-155靶向核酸
化学修饰后miR-155靶向核酸(命名为AAM-155)为5’-NH2-(CH2)6-ACCCCTATCACGATTAG CATTAA-3’,其为在miR-155靶向核酸5’端连接6碳己基及伯胺,作为与MAG3螯合的基团;其AAM-155结构式如图1中所示。
miR-155靶向核酸序列为ACCCCT ATCACGATTAG CATTAA(序列2),且其核苷酸序列前6个核苷酸和后6个核苷酸均为硫代修饰(斜体表示),且其核苷酸序列前3个核苷酸和后3个核苷酸均为2’-甲氧基修饰(下划线部分)。
2)化学修饰后对照寡核苷酸
化学修饰后对照寡核苷酸(命名为control)为:5’-NH2-(CH2)6-CATTAATGTCGGACAA CTCAAT-3’,其连接方式和修饰方式均与化学修饰后miR-155靶向核酸相同。
AAM-155和control探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成,经HPLC纯化及分子量鉴定后,以冻干形态保存于-80℃。
3、FAM标记AAM-155探针和FAM标记control探针
合成FAM标记修饰后miR-155靶向核酸和FAM标记修饰后对照寡核苷酸,用于细胞水平的探针分布鉴定,具体如下:
1)FAM标记修饰后miR-155靶向核酸
FAM标记修饰后miR-155靶向核酸(命名为FAM-155)为5’-FAM-ACCCCTATCACGATTAG CATTAA-3’,其为在miR-155靶向核酸的5’端连接FAM基团,
miR-155靶向核酸的序列为ACCCCT ATCACGATTAG CATTAA(序列2),且其核苷酸序列前6个核苷酸和后6个核苷酸均为硫代修饰(斜体表示),且其核苷酸序列前3个核苷酸和后3个核苷酸均为2’-甲氧基修饰(下划线部分)。
2)FAM标记修饰后对照寡核苷酸
FAM标记修饰后对照寡核苷酸(命名为FAM-control)为:5’-FAM-CATTAATGTCGGACAA CTCAAT-3’,其连接方式和修饰方式均与化学修饰后miR-155靶向核酸相同。
二、miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的获得
1、螯合后探针MAG3-AAM-155的获得
螯合后探针MAG3-AAM-155的制备方法:将双功能螯合剂巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimidyl-S-acetyl-mercaptoacetyltriglycline,NHS-MAG3)的丁二酰亚胺酯键断裂成羰基与上述制备的化学修饰后miR-155靶向核酸的伯胺形成酰胺键,得到螯合后探针MAG3-AAM-155;具体方法如下:
1)NHS-MAG3溶液的制备
分别配制0.3M HEPES水溶液(C8H18N2O4S)和0.3M HEPES钠盐水溶液(C8H17N2NaO4S),将二者等体积混匀,调pH值至7.6,得到核酸溶解液HEPES缓冲液;称取适量的NHS-MAG3粉末,将其加入HEPES缓冲液中,得到NHS-MAG3溶液,使NHS-MAG3的终浓度为7.25mg/ml;
2)螯合
取适量体积1)得到的NHS-MAG3溶液和上述一制备的AAM-155混匀,使得AAM-155浓度达到10μg/μl,其中,MAG3:AAM-155的最终摩尔比为15:1-20:1(在本实施例中一般使用20:1)。混匀后常温静置2h进行充分反应。反应结束后,向反应液中加入5μl醋酸铵溶液(2.0M),随即加入适量含SnCl2·2H2O(20mg/ml)的酒酒石酸钠缓冲液(含0.5M碳酸氢钠、0.25M醋酸铵和0.175M的氢氧化铵,浓度为100mg/ml)用于终止反应,得到混合液(含有螯合后探针MAG3-AAM-155)。
将混合液沸水浴20min后低转速(7000g)离心5min收取上清液,将上清液进行HPLC鉴定、纯化、分离。流动相A为乙腈,流动相B为0.1M的TEAB,pH 8.0,洗脱梯度为A从0min时20%到35min时40%,洗脱流速为1.5ml/min),填充物为Sephadex G25(柱体积为25mm×9mm、上样量为30nmol),根据洗脱产物在260nm波长处的吸光度峰值,收集28-30min左右洗脱液并冻干,保存于-80℃备用,得到螯合后探针MAG3-AAM-155。
NHS-MAG3作为一种双功能螯合剂,与核酸的5'末端连接的氨基而结合,去除保护巯基的乙酰基基团,通过转螯合作用而与99mTc螯合被标记。其优点是可以在室温和中性条件下进行标记反应,这种温和的反应环境对保护反应中的核酸分子起到重要作用,且该螯合剂具有稳定性高、标记率高、脱靶少的优势,对后续标记其中支持作用。
采用同样的方法制备连接螯合剂的control探针:将双功能螯合剂巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimidyl-S-acetyl-mercaptoacetyltriglycline,NHS-MAG3)的丁二酰亚胺酯键断裂成羰基与上述一制备的化学修饰后control靶向核酸的伯胺形成酰胺键,得到连接螯合剂的control探针。
2、99mTc标记获得miR-155靶向探针99mTc-AAM-155
miR-155靶向探针99mTc-AAM-155:将99mTc标记与上述1制备的螯合后探针MAG3-AAM-155反应,得到miR-155靶向探针99mTc-AAM-155,具体如下:
1)配制新鲜的SnCl2溶液
将维生素C溶于10mM的HCl中,配制浓度为1.0mg/ml维生素C HCl溶液,将SnCl2与新鲜配制的维生素盐酸溶液混匀,得到SnCl2溶液,且SnCl2在SnCl2溶液中的终浓度为4mg/ml;
2)配制浓度为50mg/ml、pH值为9.2的酒酒石酸钠缓冲液
将碳酸氢钠、乙酸铵、氢氧化铵和水混匀得到混合液,碳酸氢钠在混合液中的终浓度为0.5M、乙酸铵在混合液中的终浓度为0.25M、氢氧化铵在混合液中的终浓度为0.175M,得到浓度为50mg/ml、pH值为9.2的酒石酸钠酒石酸钠缓冲液;
3)MAG3-核酸溶液
取上述1获得的螯合后探针MAG3-AAM-155溶于乙酸铵溶液(0.25M,pH=5.2),使其终浓度为500μg/ml,得到MAG3-核酸溶液。
4)miR-155靶向探针99mTc-AAM-155
向3)45ul得到的MAG3-核酸溶液中加入15ul 2)得到的酒酒石酸钠缓冲液(使酒石酸钠在反应体系的终浓度达到7μg/μL),再加入3μl 1)中新鲜配制的氯化亚锡溶液,随即再加入15ul新鲜放射性活度99mTcO4 -淋洗液(中国原子能科学研究院同位素研究所),充分混匀后沸水浴静置反应1h,得到反应产物。
MAG3-核酸溶液:99mTcO4 -淋洗液:酒酒石酸钠缓冲液:氯化亚锡溶液的体积配比为15:5:5:1;
上述不同条件的反应产物经HPLC柱层析分离、纯化。流动相A为乙腈,流动相B为0.1M的TEAB,pH 8.0,洗脱梯度为A从0min时20%到35min时40%,洗脱流速为1.5ml/min),填充物为Sephadex G25(柱体积为25mm×9mm、上样量为30nmol),收集A260nm值与放射性活度高峰的产物,一般为5-6min左右所出峰,即为miR-155靶向探针99mTc-AAM-155。
采用同样的方法制备对照靶向探针99mTc-control:将99mTc标记与上述1制备的连接螯合剂的control探针反应,得到对照靶向探针99mTc-control。
3、标记产物的标记结果
通过测定HPLC柱层析时放射性活度峰下面积测定上述2获得的miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的标记率(99mTc-AAM-155的放射性活度/总放射性活度)。
结果如图2所示,表明,当反应体系中加入少量SnCl2·2H2O(4mg/ml)(如1μl-3μl),而且保证99mTc液新鲜且体积不超过25μl(如15μl),在室温下反应60min或加热30min,标记率可达97%~99%(n=5),放化纯接近100%,比活度达3.75MBq/ng。标记产物的放射性活度高峰出现单一,仅在约6-7min左右出现明显峰值,与A260的紫外吸光度峰值出现的保留时间一致。而单独99mTc的保留时间为3.5min。此结果证明经过MAG3偶联后的核酸探针能够被99mTc所标记,且标记率高。
4、标记产物的鉴定
使用琼脂糖凝胶电泳结果鉴定上述2获得的miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的探针完整性及标记效果,排除标记反应后的寡核苷酸发生降解或脱标现象。于琼脂糖凝胶(2%)上分别依次加样未螯合探针AAM-155、标记探针99mTc-AAM-155、99mTcO4 -淋洗液。120V电压下电泳40min后,紫外光下观察核酸条带的位置,并等份切开凝胶测定相应放射性计数。
凝胶电泳结果如图3,显示未螯合探针AAM-155(AAM)、标记探针99mTc-AAM-155(99mTc-AAM)的条带唯一,位于同一位置,未见拖尾及降解现象,99mTcO4-淋洗液(99mTc)泳道无条带出现。测量凝胶放射性分布结果显示,标记探针的放射性分布与条带位置完全一致,纯化前的标记样品可见2个放射性峰,左峰与纯化后样品一致,为标记探针所在位置;右峰与99mTc液位置一致,提示为多余99mTc液。纯化后标记样品仅见单独的标记探针峰,未见脱标现象。未标记探针无放射性计数峰值分布。由此可见,寡核苷酸探针在标记前后、纯化前后均具有良好的核酸完整性,为保持生物活性提供保障。
实施例2、miR-155靶向探针99mTc-AAM-155的功能验证
一、血清稳定性的评价
将实施例1制备的miR-155靶向探针99mTc-AAM-155置于人新鲜血清中,室温条件下放置12h,HPLC测定其放射化学纯度及凝胶电泳测定核酸稳定性。
1.核酸血清稳定性
测定探针在新鲜人血清中的12h内的稳定性(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)
(1)取人新鲜血清80μl-120μl,均分为8份;
(2)将99mTc-AAM-155(化学修饰AAM-155,总量为4nmol)用45μl缓冲液溶解,按照体积比1:2或1:3溶于血清,每样约440pmol,加样时按照倒序加样,最先加样12h点,临跑胶时加样0h。混匀,室温静置。
(3)配制2%的琼脂糖凝胶,200V,鉴定。
以未进行化学修饰的AAM-155为对照。
未进行化学修饰的AAM-155的制备方法:与99mTc-AAM-155方法基本一致,仅将化学修饰后miR-155靶向核酸替换为未进行化学修饰miR-155靶向核酸;
未进行化学修饰miR-155靶向核酸与化学修饰后miR-155靶向核酸的区别仅在于不进行硫代修饰和2’-甲氧基修饰,其余均相同。
结果如图4,与未进行化学修饰的AAM-155相比,99mTc-AAM-155在12h内,探针在凝胶中均表现为唯一条带,但随着时间延长,条带亮度未见明显降低,条带单一,未见拖尾及扩散征象。相比之下,未进行化学修饰的AAM-155可见条带亮度随时间延长明显减低,且向周围扩散,提示未化学修饰的探针在血清中降解明显。此结果证明2’-OMe及PS化学修饰方式能够显著提高探针在血清中的稳定性。
2.放射性探针的标记稳定性
将99mTc-AAM-155置于新鲜人血清中在37℃条件下孵育,探针浓度为0.01μg/μl。使用HPLC,流动相A为乙腈,流动相B为0.1M的TEAB,pH 8.0,洗脱梯度为A从0min时20%到35min时40%,洗脱流速为1.5ml/min),填充物为Sephadex G25(柱体积为25mm×9mm、上样量为30nmol),测定产物的放射性计数,分别测定探针4h、8h、12h的放化纯度。
分别测定99mTc-AAM-155探针在人新鲜血清中孵育4h、8h、12h时的放化纯度,HPLC结果如图5,显示各时间点下探针的260nm吸光度值和放射性值均显示为单峰,所得放化纯度均大于98%,说明标记探针在血清中没有受到多种酶成分的影响而降解,且无脱标现象,提示探针具有良好的血清稳定性。以上结果提示2’-OMe及PS化学修饰方式可以大大提高miRNA-155分子在多种理化条件下的稳定性,且通过MAG3螯合的99mTc标记的产物可在多种条件下保持标记的稳定性,都为将来miRNA反义探针在体内试验的研究奠定了研究基础。
二、99mTc-AAM-155细胞水平靶向调控C/EBPβ蛋白活性
C/EBPβ蛋白是miRNA-155的靶蛋白之一,miR-155抑制C/EBPβ的表达,而AAM-155能够通过抑制miR-155的活性从而增加细胞内C/EBPβ的表达。本研究通过评价AAM-155转染后的细胞中C/EBPβ蛋白的表达,进而对99mTc-AAM-155标记探针的活性评价。具体步骤如下:
1.细胞转染
1)6孔细胞培养板
MCF-7细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏编号为HB-8065)饲养于高糖培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)中。转染前一天,以合适的细胞密度(30%-40%)接种到6孔培养板上,得到6孔细胞培养板。转染时,细胞要达到60~70%。
2)混合液A
每孔准备240μl的无血清培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium)和10μl转染脂质体(Lipofectmine 2000)(总体积250μl)混合,温育5min,得到混合液A。
3)混合液B
每孔准备终浓度10nmol的核酸探针和无血清培养基(Opti-MEM I Reduced SerumMedium)混匀,得到的混合液B,体积为250μl。
4)转染
向1)的6孔细胞培养板中每孔均加入混合液A和混合液B,室温下静置20min;再将6孔板中的细胞用PBS冲洗细胞,加入2ml无血清培养基;再将孵育后的混合液A逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀,得到转染后细胞。
在37℃,5%的CO2中孵育6小时后,更换含有10%的胎牛血清(Gibco)的全培养基,在37℃,5%的CO2中48~72h检测蛋白表达水平。实验设置三个复孔。
上述核酸探针为未偶联AAM-155探针(实施例1的步骤一的2制备的MAG3-AAM-155)、未标记的MAG3-AAM-155探针(实施例1的步骤二的1制备的MAG3-AAM-155)、标记的99mTc-AAM-155探针(实施例1的步骤二的2制备的99mTc-AAM-155)、未偶联control探针(实施例1的步骤一的2制备的control)、未标记的MAG3-control探针(实施例1的步骤二的1制备的MAG3-control)、标记的99mTc-control探针(实施例1的步骤二的2制备的99mTc-control)。
通过导入不同的核酸分子上述实验分为6组:未偶联AAM-155探针组、偶联MAG3-AAM-155探针组、99mTc-AAM-155组、control对照组、偶联MAG3-control对照组及99mTc-control标记对照组。
2.蛋白印迹(Western-blotting)检测C/EBPβ蛋白的表达
转染后3d采用Western blotting法测定各组细胞中miR-155靶蛋白C/EBPβ的表达量,测定AAM-155对C/EBPβ蛋白的影响效果,具体如下:
分别收集转染后3天的上述1的6个组的2×106个细胞,加入0.5~1ml预冷细胞裂解液(50mmol/L HEPES,PH 7.0,500mmol/L NaCl,1%NP-40,100μg/ml PMSF,1μg/ml AEBSF),充分混匀,冰浴放置30分钟,期间漩涡振荡2~3次。10,000rpm,4℃离心10分钟,取上清,测定蛋白浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分离胶浓度为8%。上述提取的细胞总蛋白的上样量为150μg/孔道,恒压5V/cm电泳,电泳毕,置凝胶于转膜缓冲液中平衡5分钟。取聚偏氟乙烯膜(Hybond-polyvinylidene difluoride membranes,PVDF),先用甲醇浸润后再用纯水漂洗5分钟,置转膜缓冲液中平衡10分钟。采用干转系统(Bio-Rad),恒压15V,转膜1h。转膜毕,将PVDF膜置于含5%脱脂牛奶的1×TBS溶液中常温封闭1h。一抗分别用加入1:400稀释的C/EBPβ一抗和1:5000稀释的对照蛋白GAPDH抗体,4度孵育过夜。用0.05%Tween-20的TBST溶液洗涤三次,每次5分钟。一抗均购于Santa Cruz公司。二抗:1:5000稀释的HRP标记的二抗IgG(北京中衫生物科技公司),室温振荡孵育1h后,0.05%Tween-20的TBST溶液洗涤3次,每次10分钟。按试剂说明,加发光试剂Chemiluminescence Luminant Reagent孵育1分钟,X光胶片曝光成像。
Western blotting结果见图6左图,可见相比对照组,未偶联AAM-155探针、未标记的MAG3-AAM-155探针和标记的99mTc-AAM-155探针处理组的C/EBPβ蛋白表达均显著增高,而AAM-155探针之间无显著差异。
参照管家蛋白的表达量,如图6右图所示,未偶联AAM-155探针、未标记的MAG3-AAM-155探针和标记的99mTc-AAM-155探针处理组中C/EBPβ蛋白的上调率为68.7%、69.9%和69.4%,此结果说明本实验采用的MAG3螯合以及99mTc标记并未影响核酸探针的生物活性,保证了核酸仍然具有良好的肿瘤特异靶向性,miR-155靶向探针99mTc-AAM-155促进C/EBPβ蛋白表达。
三、99mTc-AAM-155的细胞分布及摄取
1.细胞转染
HepG2细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏编号为HB-8065)、HeLa细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏编号为CCL-2)、MCF7(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏编号为HTB-22)饲养于高糖培养基DMEM(Gibco)中。
转染方法同上述二99mTc-AAM-155细胞水平抑制活性的测定中的转染方法,核酸分子为实施例1制备的荧光探针FAM-AAM-155或FAM-Control。
2.细胞水平分布
HepG2细胞和HeLa细胞分别以合适的密度与转染前一天接种至欲置盖玻片的6孔板中。转染时,HepG2和HeLa细胞生长密度达到高倍镜视野下每视野5个左右。按照每孔共2ml混合新鲜培养基替换细胞孔内旧培养基。新鲜培养基配以无血清培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Gibco)200μl、转染脂质体Lipofectmine 2000(Invitrogen)10μl和荧光探针FAM-AAM-155(10nmol)或FAM-Control混合温育5min后加入1790μl无血清培养基(Opti-MEM I Reduced Serum Medium),室温下孵育20min。加入荧光探针的细胞37℃下孵育6小时和24小时。去除细胞孔内混合培养基,用PBS液清洗三次,每次5min,加入4%多聚甲醛200μl固定细胞30min,用PBS液清洗三次,每次5min,加入200μl TritonX-100透膜20min,用PBS液清洗三次,每次5min,加入150μl DAPI染核5min,后再用PBS清洗三次。准备载玻片,滴上封片液,将带有已完成荧光转染实验的载玻片细胞面覆盖其上并封片。
制备完成的细胞片置于共聚焦荧光显微镜下观察,HepG2及HeLa细胞的FAM-AAM-155和对照组FAM-Control细胞水平分布如图7。经过6小时孵育,FAM-AAM-155组细胞内的荧光水平高于对照组的荧光强度,孵育24小时后,FAM-AAM-155组荧光仍较强烈,而FAM-Control则明显减弱,二者差别增大。如结果所示,AAM-155和control对照组均能被转染至HepG2细胞和HeLa细胞内,但经过24小时的孵育后,AAM-155仍能保持足够的活性,和靶位点稳定结合而少有降解。
3.肿瘤细胞摄取率
当24孔板中的MCF-7细胞生长密度达到80%左右时,向每孔中分别加入等量的99mTc-AAM-155(1pmol)和99mTc,同时加入脂质体,进行常规转染操作。分别在加入后1h、2h、4h、6h、8h、10h时分别收集上清和细胞,分别测定其放射性计数。将培养液与3次的PBS洗液合并,并用井型计数器测定放射性计数,计做Cout;之后用含有0.5M氢氧化钠和1%的SDS细胞裂解液裂解细胞后,收集裂解液及3次PBS洗液,同样测定其合并的放射性计数,计做Cin,细胞摄取率计算按照如下公式计算Cin/(Cin+Cout)。
结果如图8所示,脂质体转染的探针的肿瘤摄取率均随着时间的延长而不断增加。99mTc-AAM-155组的肿瘤细胞摄取率,在10h时达到最大,为50.15±1.90%(n=4),99mTc液对照组在10h的细胞摄取率为2.11±0.15%(n=4),二者存在显著差异(P<0.01),99mTc-AAM-155组的肿瘤细胞摄取率明显高于99mTc对照组,表明99mTc-AAM-155提高肿瘤细胞摄取率,摄取率高,说明能特异性分布于肿瘤细胞的能力强。
四、荷瘤裸鼠活体评价
1、动物模型的构建
动物选择BALB/c nu/nu裸鼠(雌性,20±4g,4-6周龄),购买及饲养于北京大学第一医院实验动物中心。成瘤方式有两种,一种为细胞注射法,于每只裸鼠右上肢腋下注射1×107肿瘤细胞,将单层培养的细胞消化脱壁后稀释为一定浓度的细胞悬液,移植于动物皮下或其他部位。另一种为瘤块接种,将选取的瘤组织将瘤取出后,切开,选出生长良好而无变性坏死、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织,切成小块(约1-2mm);饲养1周左右即可在注射部位成瘤。当肿瘤成长至直径为1cm时,分别作生物学分布实验和体内显像实验。
2、荷瘤裸鼠的体内分布
当肿瘤达到合适大小的时候,分别通过尾静脉注射1μg(50μCi)的实施例1的99mTc-AAM-155和1μg(50μCi)99mTc-control探针,体积均为200μl。分别于注射后1h、2h、4h、6h、8h或10h,对每组3只裸鼠进行取血,并脊髓拖断处死。分别解剖取心、肝、脾、肺、肾脏、胃、小肠、膀胱、小腿长骨、肌肉和肿瘤,称重并利用NaI(Tl)计数仪测定放射性计数。分布结果分别记为每克组织的放射性计数的百分数(%ID/g)和肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值。
体内分布实验显示,在U87荷瘤裸鼠模型中,各脏器放射性计数随时间延长而下降(表1和表2)。放射性标记的核酸分子在肝脏的放射性计数在各时间点均为最高,其次为肾脏。血液的放射性在注射后开始较高,但是随着时间延长迅速下降,注射后10h达到最低。血运丰富的脏器例如心脏、肺脏、脾脏和骨髓的放射性分布情况与血液的分布情况类似,均随着时间延长不断降低。注射99mTc-AAM-155探针后,虽然肿瘤的放射性计数在注射后逐渐减少,由(8.51±1.51)%ID/g降低至(2.12±0.01)%ID/g,但是其它脏器的放射性计数降低得更快,特别是血液的放射性分布,血液的放射性分布由(8.82±2.01)%ID/g降至(0.36±0.04)%ID/g。可见,miR-155靶向的核酸在肿瘤部位其放射性摄取清除较慢。相比之下,99mTc-control对照探针的肿瘤的放射性摄取较低,注射后1h到8h的放射性摄取逐渐减低,由(0.96±0.27)%ID/g降至(0.49±0.05)%ID/g,显著低于实验组探针各时间点时的肿瘤摄取(P<0.01)。99mTc-AAM-155探针在血液和肌肉等多种器官的T/NT比值显著高于对照组(图9及图10)。此外,99mTc-AAM-155探针在荷MCF-7肿瘤裸鼠模型中,同样显示出较好的肿瘤摄取,其肿瘤部位的放射性分布及各部位的T/NT比值均显示99mTc-AAM-155探针的活体肿瘤靶向分布特性(表3及图11)。
表1 99mTc-AAM-155实验组探针在1、2、4、6、8、10h各时间点的荷U87裸鼠实验组体内生物分布结果(%ID/g)。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)
表2 99mTc-control对照组探针在1、2、4、6、8h各时间点U87荷瘤裸鼠体内生物分布结果(%ID/g)。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)
表3 99mTc-AAM-155实验组探针在2、4、6、8h各时间点的荷MCF-7裸鼠体内生物分布结果(%ID/g)。每个数值表示为平均值±标准差(n=3)
3、荷瘤裸鼠模型的活体显像
同样待裸鼠肿瘤长至1.5cm3时,尾静脉注射200μl的4μg(300~400μCi)的99mTc-AAM-155(实验组)和99mTc-control(对照组)。将裸鼠置于SPECT(GE Healthcare)的探头上,配以低能、高分辨平行孔准直器,分别在2、4、6、8h采集静态图像,采集计数为200,000个计数,图像储存为256×256像素,2.0倍。
显像结果可见,注射99mTc-AAM-155实验组探针后,在乳腺癌MCF-7、胶质瘤U87、宫颈癌HeLa、肝癌HepG2、黑色素瘤A375等多种肿瘤细胞荷瘤裸鼠模型中,可以在4h后清晰显示肿瘤,随时间延长肿瘤显像更为清晰(图12)。相比之下,注射99mTc-control对照组探针后8h,始终未能显示肿瘤影像(图13)。箭头所指为肿瘤部位。
4、2’-OMe及PS化学修饰显像剂与未修饰区别
为了验证本发明所用的2’-OMe及PS化学修饰方式能否提高AAM探针的活体靶向显像效果,进行如下实验:
将得到的99mTc-AAM-155和实施例2中一的未进行化学修饰的AAM-15按照上述3的方法分别尾静脉注入荷U87肿瘤裸鼠后2、4、6h进行活体显像。
显像结果如图14,结果显示,化学修饰探针(99mTc-AAM-155)能够清晰地显示肿瘤影像,相比之下,未进行化学修饰的AAM-15虽能显示肿瘤,但仅能隐约显示肿瘤影像,位于肿瘤部位的放射性浓聚显著少于化学修饰探针的肿瘤浓聚。
此结果证明本发明99mTc-AAM-155所用的2’-OMe及PS化学修饰方式能够显著提高探针的活体靶向效果。
Claims (10)
1.一种microRNA-155靶向探针A,其核苷酸序列为序列2,且序列2的第一位核苷酸通过己基连接伯胺,序列2第1-6位核苷酸和第18-23位核苷酸均经硫代修饰,第1-3位核苷酸和第21-23位核苷酸均经2’-甲氧基修饰。
2.一种microRNA-155靶向探针B,为用放射性核素标记所述靶向探针A,得到microRNA-155靶向探针B。
3.根据权利要求2所述的靶向探针B,其特征在于:所述放射性核素为99mTc。
4.根据权利要求3所述的靶向探针B,其特征在于:所述放射性核素是通过螯合剂NHS-MAG3标记到所述靶向探针A上。
5.一种显像剂,其活性成分为权利要求1所述的靶向探针A或权利要求2-4中任一所述的靶向探针B。
或microRNA-155作为肿瘤显像剂靶点中的应用。
6.权利要求2-4中任一所述的靶向探针B在制备显像剂中的应用。
7.根据权利要求5所述显像剂或权利要求6所述应用,其特征在于:所述显像剂为肿瘤影像显像剂。
8.一种制备靶向探针B的方法,包括如下步骤:
1)将权利要求1所述的靶向探针A和NHS-MAG3溶液混匀,螯合反应,收集反应产物,即得到螯合后靶向探针A;
2)将所述螯合后靶向探针A和放射性核素在含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中反应,收集反应产物,即得到靶向探针B。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:
所述放射性核素为99mTc;
步骤1)中,所述NHS-MAG3溶液中NHS-MAG3的浓度为7-8mg/ml,所述NHS-MAG3溶液中NHS-MAG3的浓度具体为7.25mg/ml;
步骤2)中,所述含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中的氯化亚锡的浓度为3-5mg/ml,所述含有氯化亚锡和酒石酸钠的反应体系中的氯化亚锡的浓度具体为4mg/ml;
所述含有氯化亚锡和酒石酸钠反应体系中的酒石酸钠的浓度为6-8μg/μl;所述含有氯化亚锡和酒石酸钠反应体系中的酒石酸钠的浓度具体为7μg/μl。
10.权利要求1所述的microRNA-155靶向探针A或权利要求2-4中任一所述靶向探针B在制备1)-6)至少一种产品中的应用:
1)促进肿瘤细胞中的C/EBPβ蛋白表达产品;
2)提高肿瘤细胞摄取率产品;
3)肿瘤影像显像剂;
4)用于肿瘤的活体显像产品;
5)在活体水平示踪microRNA-155的体内分布情况产品;
6)检测和/或定位肿瘤产品;
所述肿瘤具体为乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌、肝癌或黑色素瘤;
所述肿瘤细胞具体为乳腺癌细胞MCF-7、胶质瘤细胞U87、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2或黑色素瘤细胞A375。
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