KR20130069633A - 심혈관 질환의 위험도를 측정하기 위한 수단 및 방법 - Google Patents

심혈관 질환의 위험도를 측정하기 위한 수단 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의학, 특히 내과 및/또는 심장학에 관한 것이다. 본 발명은 환자의 샘플에 존재하는 miRNA를 측정함으로써 샘플을 타입핑하여, 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 환자를 동정 및/또는 치료하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 심혈관 질환에 대한 새로운 치료법을 동정하기 위한 수단과 방법을 제공한다.

Description

심혈관 질환의 위험도를 측정하기 위한 수단 및 방법 {MEANS AND METHODS FOR DETERMINING RISK OF CARDIOVASCULAR DISEASE}
본 발명은 의학, 특히, 내과 및/또는 심장학에 관한 것이다.
심혈관 질환은 기술적으로 심혈관계에서 발병하는 모든 질환을 포괄한다. 그러나, 통상적으로는 죽상경화증과 관련된 질환을 지칭하는데 사용된다.
심혈관 질환은 미국과 대부분의 유럽 국가들에서 사망과 신체적 장애의 가장 큰 원인이다. 심장에서 문제가 발견될 때까지 기저 원인 (죽상경화증)은 통상 현저히 진전되어 수십년간 진행된 상태이다. 따라서, 건강한 식습관, 운동 및 금연과 같은 위험 인자들에 변화를 가하여 죽상경화증을 예방하는 것이 중요해지고 있다.
관상동맥 질환 (또는 CAD: coronary artery disease)은 관상 동맥 순환이 심근과 주변 조직으로 적절한 순환을 제공하지 못하는 것을 의미한다. CAD는 복합적인 질환으로, 많은 유전적 요인, 환경적 요인 그리고 이들 요인들 간의 상호작용에 의해 야기되는 것으로 생각되고 있다. 실제, 흡연, 노령, 남성, 당뇨병, 높은 수축기 혈압, 협심증 병력, 고지방식이, 감염원, 비만, 총 혈장 및 저밀도 지단백질 (LDL) 콜레스테롤 증가, 혈장 트리글리세라이드 증가 및 혈장 고밀도 지단백질 (HDL) 콜레스테롤 감소를 비롯하여, CAD에 대한 다수의 위험 요인들이 밝혀졌다. 그러나, 가족력은 CAD에서 가장 중요한 독립 위험 인자로서, 쌍둥이 연구에 따르면 유전적 요인이 CAD 발생에 기여하는 것으로 제안되었다. 높은 사망율, CAD의 후발성 특징 및 가족에서의 표현형모사(phenocopy)에 의한 합병증 역시 이러한 중대 질환을 유전적으로 분석하는데 주요한 도전이 된다.
CAD의 주요 요인은 서서히 진행되는 죽상경화성 플라그 형성 및 급성 혈전성 폐색 장애이며, 이로 인해 허혈증 합병증이 발생한다.
CAD는 인간 이환과 사망의 주된 요인이기 때문에, 혁신적인 진단 전략과 치료학적 전략이 요구되고 있다. 현재, 개체에서 향후 CAD의 발병 여부를 정확하게 예측하기 어렵다. 오늘날에는 이러한 예측은 그다지 정확하지 않은 위험도 계산법으로 행해진다. 아울러, 당해 기술 분야에 공지된 위험도 계산법은 개체에서 서서히 진행되는 플라그의 형성 여부나 급성 폐색성 장애 위험성 유무를 예측하지 못한다. 몇가지 임상적인 실험을 적용하여, 개체가 관상 동맥 또는 말초 동맥이 좁아지는 현상 등의 심혈관 질환을 앓고 있는지를 평가할 수 있다. 예를 들어, 진단 목적으로 심전도, 스트레스 검사 (운동 심전도), 초음파 심장 검사, 혈액 검사 (특정 지방, 콜레스테롤, 당 및 단백질의 수치가 비정상적인지에 대한 검사)를 사용한다. 그러나, 이러한 검사들은 관상 동맥 또는 말초 동맥 질환과 같은 심혈관 질환을 앓고 있는 개체에서 위험성을 신뢰성있게 예측하기 어렵다. 따라서, 심혈관 질환의 위험성을 보다 신뢰성있게 예측할 수 있는 새로운 바이오마커가 요구되고 있다.
Landry P, Plante I, Ouellet DL, Perron MP, Rousseau G, Provost P. Existence of a microRNA pathway in anucleate platelets. Nat Struct Mol Biol 2009;16:961-6. Ji X, Takahashi R, Hiura Y, Hirokawa G, Fukushima Y, Iwai N. Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury. Clin Chem 2009;55:1944-9. Ai J, Zhang R, Li Y, Pu J, Lu Y, Jiao J, Li K, Yu B, Li Z, Wang R, Wang L, Li Q, Wang N, Shan H, Li Z, Yang B. Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2010;391:73-7. Wang GK, Zhu JQ, Zhang JT, Li Q, Li Y, He J, Qin YW, Jing Q. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans. Eur Heart J. 2010 Feb 16. [Epub ahead of print] Scheuner MT. Genetic predisposition to coronary artery disease. Curr Opin Cardiol 2001;16:251-60. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, Karlen Y, Bakker O, van den Hoff MJ, Moorman AF. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res 2009;37:e45.
본 발명의 목적은 심혈관 질환을 앓을 위험성이 있는 개체의 샘플에 대해 유형을 분석하기 위한 수단 및 방법, 및 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 개체를 동정 및/또는 치료하기 위한, 수단 및 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 심혈관 치료법에 유용한 약제를 동정하고 이러한 요법을 모니터링하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 샘플의 유형을 분석하기 위한 수단 및 방법, 환자의 샘플에 존재하는 miRNA를 측정함으로써, 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 환자를 동정 및/또는 치료하기 위한 수단 및 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명은 새로운 심혈관 질환의 치료법들을 동정하기 위한 수단과 방법을 제공한다.
본 발명에서는 최초로 혈소판의 miRNA의 발현 수준의 변화가 심혈관 질환과 연관 있음을 확인하였다. 심혈관 질환에 대한 유전자 바이오마커에 대해 많은 연구들이 진행되었지만, 혈소판을 이용한 연구는 행해지지 않았다. 예를 들어, 순환성 miRNA가 AMI를 진단하는데 유용한 바이오마커인 것으로 확인되었다2-4. miR-1과 miR-208은 심근 손상 후 혈장에서 증가되는 것으로 보고되었다. 그러나, 예를 들어 퇴원한 AMI 환자들의 경우 miR-1 수준이 정상으로 회복되므로, 이들 miRNA는 손상된 심장 세포에 의해 혈류로 분비되는 것으로 보인다. 심혈관 질환의 급성기(acute phase)에 순환성 miRNA를 조사한 이러한 연구들과는 반대로, 본 발명자들은 예컨대 손상된 심장 세포에 의해 분비된 miRNA가 제 역할을 하지 못하는 심혈관 질환의 안정기에 혈소판에 존재하는 miRNA를 조사하였다. 아울러, 본 발명의 이전에는, 심혈관 질환과 관련있는 miRNA를 연구하는 그룹들에서는 혈소판-정제 샘플 (예, 혈소판이 풍부한 혈장)에서의 miRNA 수준은 확인하지 않았으므로, 본 발명자들이 발굴한 miRNA들은 이전 연구들에서 인지되지 못하였다. 대신 miRNA 수준은 예컨대 급성 심혈관 질환기의 혈장 샘플에서 측정되었다. 급성 심혈관 질환기에는 수종의 miRNA가 전혈 샘플 또는 혈장 샘플에서 상향- 및/또는 하향-조절 (즉, 탈규제)된다. 이러한 비정상적인 miRNA는, 손상된 심장 세포에서 방출되는 것과, 또한 심장 손상에 작용하는 활성화된 백혈구 세포로부터 방출되는 miRNA를 포괄한다. 또한, 급성 심혈관 질환을 정상적으로 수반하는 허혈성 외상도 혈액 또는 혈장에서 수종의 miRNA의 발현 수준에 상당한 영향을 미친다. 본 발명에서 심혈관 질환의 예측 위험 인자로서 동정한 miRNA는, 급성 심혈관 질환기의 전혈에서는, 본 발명자가 사용한 다수의 전체 miRNA를 검사하기 위한 스크리닝 방법 (마이크로어레이)을 통해 CAD 환자와 건강한 대조군 간에 1.5 - 2배의 차이가 검출될만큼 높은 수준으로 존재하지는 않기 때문에, 기존의 어떠한 연구들에서도 동정되지 않았다.
상대적으로 정제된 혈소판 샘플을 이용함으로써, 즉, 혈소판이 풍부한 혈장 샘플을 이용함으로써, 본 발명자들은 혈소판에 존재하며, 급성 심혈관 질환의 발병 위험성은 있으나 아직 발병하지 않은 개체에서 비정상적인 miRNA를 동정할 수 있었다. 이들 miRNA는 심혈관 질환을 앓을 위험성이 있는 개체에 대한 바이오마커로 작용하며, 따라서, 예측 바이오마커로서 사용할 수 있다.
miRNA는 mRNA 번역을 저해하거나 또는 mRNA 분해를 촉진시킴으로써 단백질 합성을 억제하는 소형 핵산 분자이다. 정상적인 발생과 생리 기능의 주요 조절자일 뿐만 아니라, miRNA의 비정상적인 발현은 다수의 인간 질환과 관련되어 있다. 그래서, 인간 miRNA는 바이오마커로서 매우 유용한 것으로 보인다. 최근, 탈핵된 혈소판(anucleate platelet)에 microRNA 경로가 존재하는 것으로 발견되었다1. 이에, 본 발명은, 혈소판 miRNA의 발현 프로파일이 개체가 심혈관 질환을 앓고 있는지 앓을 위험성이 있는지를 판단하는데 유용하다는 식견을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어, 특정 miRNA가 건강한 대조군의 혈소판에 비해 CAD 환자의 혈소판에서 차별적으로 발현됨을 입증한다.
제1 구현예에 있어서, 본 발명은, 개체의 샘플을 이용하여, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그(orthologue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단계, 및 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 비교 결과가 개체가 심혈관 질환을 앓고 있는지 앓을 위험성이 있는지를 표시하는 것을 특징으로 하는, 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성을 결정하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 상기 기준값은, 바람직하게는, 기준 샘플, 바람직하게는 심혈관 질환을 앓고 있거나 심혈관 질환을 앓을 위험성이 없는 개체로부터 수득한 기준 샘플을 이용하여, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써, 구한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 miRNA는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이다. 다른 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 miRNA는 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이다.
기준값과 검사값을 동시에 측정할 필요는 없다. 예를 들어, 바람직하게는 심혈관 질환을 앓고 있지 않거나 또는 앓을 위험성이 있는 개체로부터 샘플을 이용하여 기준값을 측정하며, 검사 샘플에서 상기 하나 이상의 miRNA의 상대적인 발현이 심혈관 질환을 앓을 개체 위험성을 나타내는지의 유무를 판단하기 위해 상기 기준값을 반복해서 사용할 수 있다. 심혈관 질환에 대한 발병 위험성이 낮은 것으로 나타내는 발현 수준은 기준값으로 사용할 수 있으며, 예컨대 건강한 개체 유래의 여러가지 샘플에서의 miRNA 평균 수준을 기준값으로 사용할 수 있다. 한편, 심혈관 질환 또는 심혈관 질환에 대한 발병 고위험성을 표시하는 것으로 확인된 발현 수준이 기준값으로 이용될 수도 있다. 이와 같은 기준값은 예를 들어 심혈관 질환을 앓고 있는 개체의 샘플을 이용하여 구한다. 따라서, 개체의 샘플에서 상기 언급된 임의 miRNA의 발현 수준을, 건강한 개체의 샘플에서의 발현 수준 또는 심혈관 질환을 앓고 있는 개체의 샘플에서의 발현 수준과 비교함으로써, 개체가 심혈관 질환 발병 위험성이 있는지를 판단할 수 있다. 건강한 개체와 발현 수준이 비슷하다는 것은, 개체에 심혈관 질환 위험성이 없다는 것을 의미한다. 심혈관 질환을 앓고 있는 개체와 발현 수준이 비슷하다는 것은 개체가 심혈관 발병 위험성이 있다는 것을 의미한다. 비슷하다는 것은, 발현 수준의 차이가 바람직하게는 1.8배 이하, 더 바람직하게는 1.5배 이하, 더 바람직하게는 1.3배 이하, 가장 바람직하게는 1.2배 이하인 것을 의미한다.
miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA의 발현 수준을, 본 발명에 따른 방법으로 측정하는 것이 바람직하다. 상기 2종 이상의 miRNA 중 하나 이상의 miRNA는 miR-340*, miR-624*, 또는 hsa-miR-340* 또는 miR-624*의 상동체 또는 오르소로그인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 2종 이상의 miRNA 중 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이다. 바람직한 구현예에서, 상기 2종 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA는 hsa-miR-340, hsa-miR-340의 상동체 또는 hsa-miR-340의 오르소로그이고, 상기 2종 이상의 miRNA 중 제2의 miRNA는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그이다. miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 보다 바람직하게는 3종 이상, 보다 바람직하게는 4종 이상, 보다 바람직하게는 5종 이상, 보다 바람직하게는 6종 이상, 보다 바람직하게는 7종 이상, 가장 바람직하게는 8종 이상의 miRNA의 발현 수준을, 본 발명에 따른 방법으로 측정한다. 개체의 샘플에서 전술한 miRNA들 중 몇 종의 miRNA를 측정함으로써, 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체를 바람직하게는 보다 정확하게 판단할 수 있다.
본 발명은, 예컨대, hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준을, 본 발명의 하나 이상의 다른 miRNA의 발현 수준과 함께 측정하는 경우, 바람직하게는, miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그 및/또는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준과 함께 측정하는 경우, 이들 miRNA 중 한가지의 발현 수준을 측정하는 경우에 비해 개체의 심혈관 질환 발병 위험성을 더 정확하게 측정할 수 있는 것으로 확인된다. miR-624*, 또는 miR-624*의 상동체 또는 오르소로그의 발현 수준을, 본 발명의 하나 이상의 다른 miRNA의 발현 수준, 바람직하게는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그 및/또는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준과 조합하여 측정하는 경우에도 마찬가지이다.
이에, 바람직한 일 구현예에서, 2종 이상의 miRNA의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 2종 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고 상기 2종 이상의 miRNA 중 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 2종 이상의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하며, 상기 비교 결과는 개체가 심혈관 질환 발병 위험성이 있는지를 나타낸다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 더 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그이다.
가장 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이며, miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 제1 및 제2의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 비교의 결과는 상기 개체의 심혈관 질환 발병 위험성 여부를 표시하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서, 2종 이상의 miRNA의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단꼐를 포함하며, 상기 2종 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, 상기 2종 이상의 miRNA 중 제2의 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 2종 이상의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 비교의 결과가 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성 여부를 표시하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
"건강한 개체" 또는 "심혈관 질환을 앓고 있지 않거나 발병 위험성이 없는 개체"는, 정상 집단에 비해 위험성이 증가되지 않은 개체를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 개체는 과체중 또는 고콜레스테롤 개체가 아니며, 비-흡연자이고, 당뇨병 환자가 아니며, 심혈관 질환의 병력 또는 가족력을 가지지 않는다.
"심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체"는 이미 심혈관 질환으로 진단받은 개체 및/또는 정상 집단에 비해 심혈관 질환을 앓을 위험성이 높은 개체를 의미한다.
혈소판에 존재하는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준은, 바람직하게는, 상기 혈소판을 포함하는 샘플을 이용하여 측정한다. 그러나, miRNA의 발현 수준을 측정하기 위해, 샘플내 혈소판이 여전히 온전한 상태이거나 및/또는 miRNA가 여전히 혈소판내에 존재할 필요는 없다. 예컨대, 혈소판은 본 발명의 miRNA의 수준을 측정하기 전에 세포 용해시킬 수 있거나 세포 용해시키는 것이 바람직하다. 상기 샘플에서 측정되는 miRNA의 양을 이용하여 상기 혈소판에 존재하는 상기 miRNA의 (상대적인) 양을 계산한다. 용어 "상대적인"은, 절대값 (예, pg/1x106 혈소판)의 측정이 반드시 필요한 것은 아니기 때문에 사용되며, 수준은 바람직하게는 다수의 miRNA 정량 실험에서 널리 사용되는 내부 기준 RNA인 RNU6B 등의 하우스키핑 유전자에 대해 상대적으로 측정한다.
본 발명에서 주목할 점은, 상대적인 혈소판 정제 샘플, 즉 혈소판이 풍부한 혈장 샘플을 이용하여, 건강한 개체의 혈소판에서의 발현과 비교하여, 심혈관 질환 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판에서 차별적으로 발현되는 수종의 miRNA를 동정했다는 것이다. 이제, 본 발명은 혈소판에서 차별적으로 발현되는 수종의 miRNA를 동정했으며, 본 발명에 따른 방법에서 반드시 혈소판 농화된 샘플을 사용할 필요는 없다. 예를 들어, 개체가 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는지를 판단함에 있어, 본 발명의 방법에 전혈 샘플을 사용할 수 있다.
그러나, 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 샘플의 제조시, 상기 혈소판 및/또는 상기 샘플의 miRNA의 수준에 변화를 야기하는 것은 피하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 혈액 샘플을 항응고제를 사용하지 않고 채혈하는 경우가 그러하다. 이렇게 혈액 샘플을 취급하면, 혈소판의 활성화와 이에 따른 응고가 야기된다. 응고는 샘플내 miRNA의 수준에 변화를 야기할 것이다.
miRNA의 상동체는 본원에서 공통 조상으로부터 유래되는 비슷한 miRNA로서 정의된다. DNA 서열은 일반적으로 비슷하지만 동일하진 않다.
본원에서 miRNA의 오르소로그는 종 분화 현상에 의해 분리된 상동적인 핵산 분자로서 정의된다. 오르소로그 유전자는, 예컨대, 종들이 공통 조상으로부터 기원하였기 때문에 서로 비슷한 여러가지 종들에서의 유전자이다. 물론, 특정 종에서 심혈관 질환을 진단 및/또는 치료하기 위해서는 상기 특정 종의 miRNA 오르소로그를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 인간의 경우, 인간 샘플에서 miRNA를 측정할 경우, 인간 miRNA를 측정하는 것이 바람직하다.
바람직한 일 구현예에서, 상동체 및/또는 오르소로그는 본 발명의 miRNA와 50% 이상의 서열 동일성을 가진다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 서열 동일성은 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
용어 "서열 동일성%"는, 본원에서, 서열들을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요에 따라 갭을 선택적으로 도입한 다음, 대상 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열내 뉴클레오티드의 퍼센트로서 정의된다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
혈소판에서 miRNA의 발현 수준을 측정하기 때문에, 혈소판을 포함하는 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 혈소판 풍부 혈장 샘플을 이용하는 것이 바람직하다. 바람직한 일 구현예에서, 따라서, 전혈 샘플, 바람직하게는 혈소판이 농화된 혈액 샘플을 사용하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 전혈 샘플은 바람직하게는 오픈 시스템에서 (즉, 진공없이) 바람직하게는 항-응고제를 이용하여 채혈한 정맥 혈액 샘플 또는 동맥 혈액 샘플을 의미한다. 진공은 혈액 세포에 스트레스를 주는 것으로 알려져 있으며, 혈소판의 활성화와 이에 따른 샘플내 miRNA의 수준의 변화를 초래할 수 있다. 항-응고제를 사용하면 혈액의 응고가 방지 및/또는 감소되어, 따라서, 응고로 인해 샘플내 miRNA의 수준에 변화가 발생되는 것을 방지하거나 및/또는 낮출 수 있다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 샘플이 혈소판 풍부 혈장 샘플인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
혈소판 풍부 혈장은, 상기 베이스라인 (즉, 정상 혈장에서의 혈소판 농도) 보다 혈소판 농도가 높은 혈장으로서 정의된다. 원심분리에 의해 혈소판 풍부 혈장을 제조하는 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 혈소판 풍부 혈장은 증가된 농도의 백혈구 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 방법에 있어서, 백혈구 세포의 수가 적은 혈소판 풍부 혈장 샘플을 이용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 샘플은 혈소판의 양에 비해 백혈구 세포를 5% 미만, 보다 바람직하게는 2.5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 0.4% 미만으로 포함한다.
본 발명에서, CAD 환자와 대조군 간에 차별적으로 발현되는 miRNA들에서, CAD 환자에서는 hsa-miR-1280이 하향-조절되고, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-545:9.1, hsa-miR-451, hsa-miR-454* 및 hsa-miR-624*가 상향-조절된다. 검사 결과의 편차와 개체간 차이를 고려하여, 본 발명에서는, 1.5배 하향-조절 또는 상향-조절은 개체의 심혈관 질환 발병 위험성 여부에 대한 유의한 예측인자로 간주한다.
따라서, 바람직한 일 구현예에서, 상기 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준과 비교하여, 1.50배 이상으로 증가되는지를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA를 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 발현 수준이 1.55배 이상, 바람직하게는, 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 더 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정한다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비교하여, 1.50배 이상 감소되는지를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 miRNA가 hsa-miR-1280 또는 이의 상동체 또는 오르소로그인 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 발현 수준이 1.55배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 낮은지를 측정한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준에 비해, 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 증가되는지는 측정하는 단계, 및 상기 샘플에서 제2의 miRNA의 발현 수준이 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 상기 제2의 miRNA의 발현 수준에 비해 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 제2의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA는 miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그이다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준에 비해, 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계, 상기 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준이 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준에 비하여 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계, 및 샘플에서의 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준이 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준에 비하여 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계, 및 상기 샘플에서의 제2의 miRNA의 발현 수준이 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 제2의 miRNA의 발현 수준에 비해 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 제2의 miRNA가 miR-545:9.1, hsa-miR-340*, miR-454*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 제2의 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 일 구현예에서, 또한, 본 발명은, 상기 샘플에서의 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 또는 hsa-miR-1280의 오르소로그의 발현 수준이 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 또는 hsa-miR-1280의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.15배 이상, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.25배 이상, 보다 바람직하게는 1.3배 이상, 보다 바람직하게는 1.4배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 1.60배 이상, 보다 바람직하게는 1.65배 이상, 보다 바람직하게는 1.75배 이상, 가장 바람직하게는 1.85배 이상 낮은지를 측정하는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
miRNA는 개체가 심혈관 질환을 앓을 위험성이 있는지를 나타내는 단순한 지표가 아니다. 앞서 설명한 바와 같이, miRNA는 mRNA 번역을 저해하거나 또는 mRNA 분해를 촉진시킴으로써 단백질 합성을 억제할 수 있다. 따라서, miRNA는 정상적인 발생과 생리 기능의 강력한 조절자이다. miRNA의 발현 증가는 이의 타겟의 단백질 발현 억제로 이어질 것이다. hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-545:9.1, hsa-miR-451, hsa-miR-454*, 및/또는 hsa-miR-624*의 발현 증가는, 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체에서 관찰되었다. 심혈관 질환을 치료, 경감 또는 예방하기 위해, 예컨대, 이들 miRNA 중 임의의 miRNA의 타겟의 활성, 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써, 이들 증가된 miRNA의 작용을 상쇄시키는 것이 유용하다. miRNA 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 증가는, 예컨대 상기 miRNA의 양, 활성 및/또는 발현을 저해함으로써 또는 타겟 자체를 제공함으로써, 행할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은, 심혈관 질환 환자 및/또는 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, 또는 hsa-miR-340* 또는 miR-624*의 상동체 또는 오르소로그이다. 보다 더 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이다.
본 발명은, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 4개 이상의 miRNA에 대한 하나 이상의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성 증가가, 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방에 유용하다는 식견을 제공한다. 특히, hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA의 조합이, 특히, 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명에서, hsa-miR-340*, miR-624*, 및 miR-454*, 또는 이들 miRNA의 상동체 및 오르소로그에 대한 하나 이상의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성 증가가, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 가장 유효하다.
따라서, 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서의 miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 다른 miRNA는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그이다.
가장 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서 miR-454*의 타겟, miR-454*의 상동체의 타겟 또는 miR-454*의 오르소로그의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서 hsa-miR-340*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 miRNA의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을, 상기 혈소판 및/또는 상기 거핵구에서의 상기 miRNA의 발현 또는 활성의 저해를 통해 매개하는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다.
또한, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 miRNA에 대한 하나 이상의 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 3개 이상의 miRNA는 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 상기 3개 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA는 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, 상기 3개 이상의 miRNA 중 제2의 miRNA는 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그이고, 상기 3개 이상의 miRNA 중 제3 miRNA는 hsa-miR-340* 또는 miR-340*의 상동체 또는 오르소로그이다.
바람직한 일 구현예에서, miRNA에 대한 상기 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 증가는, 상기 혈소판 및/또는 상기 거핵구에서 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 또는 활성의 저해를 통해 매개된다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 miRNA의 발현 및/또는 활성의 저해는, miRNA 안티센스 분자를 통해 이루어진다. miRNA 안티센스 분자는, miRNA와 상보적인 서열 동일성 %가 높은 핵산 분자이다. 높은 상보적인 서열 동일성은 상기 miRNA에 대한 특이적인 결합을 허용한다. 상보적인은 miRNA와 miRNA 안티센스 분자 간에 퓨린과 피리미딘의 특이적인 쌍 형성을 의미한다. 바람직하게는, 상기 miRNA 안티센스 분자와 본 발명의 miRNA의 상기 상보적인 서열 동일성은 50% 이상이다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 서열 동일성은 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이다.
CAD를 앓고 있는 개체에서, 예로 hsa-miR-1280에 대해서 관찰되는 바와 같이, miRNA의 발현 감소는, miRNA 타겟의 발현을 증가시킬 것이다. 따라서, miRNA의 발현 감소 효과는, miRNA 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 상쇄시킬 수 있다. 이는 예컨대 상기 miRNA의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 행해질 수 있다.
따라서, 바람직한 일 구현예에서, 심혈관 질환을 앓고 있거나 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다. 바람직하게는, hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 상기 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 감소는, 상기 혈소판 및/또는 상기 거핵구에서 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체, hsa-miR-1280의 오르소로그 및/또는 hsa-miR-1280의 유사체의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 매개된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 감소는, 상기 개체에게, hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체, hsa-miR-1280의 오르소로그 및/또는 hsa-miR-1280의 유사체를 제공함으로써 매개된다.
이에, 다른 구현예에서, 심혈관 질환을 앓고 있거나 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 상기 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 감소는, 상기 혈소판 및/또는 상기 거핵구에서의 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체, hsa-miR-1280의 오르소로그 및/또는 hsa-miR-1280의 유사체의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시킴으로써 매개된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 및/또는 hsa-miR-1280의 오르소로그에 대한 상기 타겟의 양, 발현 및/또는 활성의 감소는, 상기 개hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체, hsa-miR-1280의 오르소로그 및/또는 hsa-miR-1280의 유사체를 제공함으로써 매개된다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 miRNA의 상동체, 오르소로그 및/또는 유사체가 상기 miRNA와 50% 이상의 서열 동일성을 가지는, 본 발명에 따른 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 서열 동일성은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상이다.
miRNA의 유사체는, 예컨대 뉴클레아제 내성을 높이기 위해 및/또는 타겟 서열에 대한 안티센스 뉴클레오티드의 친화성을 높이기 위해, 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는, 인위적으로 변형된 miRNA로서 정의된다.
바람직한 일 구현예에서, 유사체는 변형된 벡본을 포함한다. 이러한 벡본의 예는, 모르폴리노 벡본, 카르바메이트 벡본, 실록산 벡본, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 벡번, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본, 메틸렌포름아세틸 벡본, 리보아세틸 벡본, 알켄 함유 벡본, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 벡본, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 벡본 및 아미드 벡본으로 제시된다.
벡본에서 잔기들 간의 결합은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 혼성 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자성 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 간의 결합 등의 인 원자를 포함하지 않는 것이 더 바람직한다.
바람직한 유사체는 변형된 폴리아미드 벡본을 구비한 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다. PNA-계 분자는 염기-쌍 인지 측면에서 DNA 분자의 진성 모방체이다. PNA의 벡본은 펩타이드 결합에 의해 연결되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위들로 구성되며, 이때 뉴클레오베이스는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 벡본에 결합된다. 다른 벡본은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다. PNA 분자의 벡본은 하전된 포스페이트기를 포함하지 않기 때문에, PNA-RNA 하이브리드는 통상 각각 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드 보다 더 안정적이다.
다른 바람직한 벡본은, 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6원 모르폴리노 고리로 치환된 모르폴리노 유사체를 포함한다. 가장 바람직한 miRNA 유사체 또는 등가체는, 리보스 또는 데옥시리보스 당이 6원 모르폴리노 고리로 치환되고 인접한 모르폴리노 고리 간의 음이온성 포스포다이에스테르 결합이 비-이온성 포스포로다이아미데이트 결합으로 치환된, 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 miRNA 유사체는 포스포다이에스테르 결합에서 비-분지형 산소들 중 하나의 치환을 포함한다. 이러한 변형은 염기-쌍을 약간 불안정하게 만들지만, 뉴클레아제 분해에 대한 상당한 내성을 부여한다. 바람직한 뉴클레오티드 유사체 또는 등가체는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, H-포스포네이트, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포로트리에스테르, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 miRNA 유사체는, -OH; -F; 하나 이상의 이종원자가 개재될 수 있는, 치환 또는 비치환된, 선형 또는 분지형의 저급 (C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 알릴 또는 아르알킬; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; -디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시옥시에톡시와 같이, 2', 3', 및/또는 5' 위치에서 1번 치환 또는 2번 치환된, 하나 이상의 당 모이어티를 포함한다. 당 모이어티는 피라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시피라노스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 이의 유도체일 수 있다. 바람직한 유도체화된 당 모이어티는, 2'-탄소가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소에 연결되어 이환식 당 모이어티를 형성하는, LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O,4'-C-에틸렌-분지 형성된 핵산을 포함한다. 이러한 치환은 뉴클레오티드 유사체 또는 등가체에게 RNase H 및 뉴클레아제 내성을 부여하며, 타겟 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다.
다른 구현예에서, 본 발명의 miRNA 유사체는 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다. 변형된 염기는 이노신, 크잔틴, 하이폭산틴 및 당해 기술 분야에 공지되거나 널리 공지될 피리미딘 및 퓨린 염기의 기타 아자, 데아자, 하이드록시, 할로, 티오, 티올, 알킬, 알케닐, 알키닐, 티오알킬 유도체 등의 합성 및 천연 염기를 포함한다.
당업자는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 모든 위치를 균일하게 변형시킬 필요가 없음을 알 것이다. 또한, 전술한 유사체들 중 2종 이상이 하나의 miRNA에 또는 심지어 miRNA내 한 위치에 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체에서 과다 발현되는, 혈소판에 존재하는 miRNA에 대한 저해제가, 예컨대 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용하다는 식견을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 약제로서 사용하기 위한, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 저해제를, 추가로 제공한다. 다른 구현예는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하기 위한, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 대한 저해제를 제공한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 보다 바람직한 구현예에서, 상기 miRNA는 hsa-miR-340* miR-624*, 또는 hsa-miR-340* 또는 miR-624*의 상동체 또는 오르소로그이다.
hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-545:9.1, hsa-miR-451, hsa-miR-454*, hsa-miR-624*는 모두 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판에서 과다 발현된다. 대조적으로, hsa-miR-1280은 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판에서 발현 수준이 낮다. 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하기 위해, hsa-miR-1280 발현 또는 활성은 따라서 증가시켜야 한다.
또한, 본 발명은 약제로 사용하기 위한, miRNA hsa-miR-1280, 및/또는 이의 상동체, 오르소로그 및/또는 유사체, 및/또는 miRNA hsa-miR-1280에 대한 활성제를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하기 위한, miRNA hsa-miR-1280, 및/또는 이의 상동체, 오르소로그 및/또는 유사체, 및/또는 miRNA hsa-miR-1280에 대한 활성제를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 저해제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 약학 조성물은 hsa-miR-340* 또는 이의 상동체 또는 오르소로그인 miRNA에 대한 하나 이상의 저해제를 포함한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 약학 조성물은 miR-624*, miR-454* 또는 miR-624* 또는 miR-454*의 상동체 또는 오르소로그인 miRNA에 대한 하나 이상의 다른 저해제를 포함한다. 가장 바람직한 일 구현예에서, 약학 조성물은, miR-624*에 대한 하나 이상의 저해제, 또는 miR-624*의 상동체 또는 오르소로그에 대한 저해제; miR-340*에 대한 하나 이상의 저해제, 또는 miR-340*의 상동체 또는 오르소로그에 대한 저해제; 및 miR-454*에 대한 하나 이상의 저해제, 또는 miR-454*의 상동체 또는 오르소로그에 대한 저해제를 포함한다.
다른 보다 바람직한 구현예에서, 약학 조성물은, miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그인 miRNA에 대한 하나 이상의 저해제를 포함한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 약학 조성물은 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오스소로그인 miRNA에 대한 하나 이상의 저해제를 포함한다.
본 발명에 따른 상기한 약학 조성물은, 특히 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 약학 조성물을 제공한다.
용어 "심혈관 질환"은 심장, 동맥 및 정맥에 발병하는 매우 다양한 질환을 포괄한다. 본 발명에서, 심혈관 질환은 바람직하게는 동맥 혈관의 좁아짐을 동반하거나 그 결과이다. 이러한 좁아짐은, 필수적인 것은 아니나, 동맥이 폐쇄될 만큼 중증일 수 있다. 동맥의 유형은 말초 동맥 (예, 팔 또는 다리의 말초 동맥 질환, 뇌졸증, 신부전, 또는 혈관성 치매가 나타남) 또는 관상 동맥 (예, 일과성 허혈성 발작, 급성 관상 동맥 증후군 또는 안정형 협심증 발생)일 수 있다.
따라서, 바람직한 일 구현예에서, 상기 심혈관 질환이 죽상경화증, 관상 동맥 질환, 일과성 허혈성 발작, 뇌졸증, 말초 혈관 질환, 급성 관상 동맥 증후군, 안정형 협심증, 혈관성 치매 및 신부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 저해제, 약학 조성물 및/또는 본 발명에 따른 miRNA를 제공한다.
이제, 본 발명은 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 hsa-miR-1280으로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA의 혈소판 발현이, 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성 유무의 예측인자라는 식견을 제공하므로, 본 발명은 또한 혈소판 miRNA의 발현을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 따라서, 본 발명은, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자와, 본 발명에 따른 방법으로 키트를 사용하기 위한 설명서(instruction leaflet)를 포함하는, 성분 키트(kit of parts)를 제공한다. 상기 키트는, 선택적으로 하나 이상의 대조군 및/또는 하나 이상의 표준 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, 또는 이들의 상동체, 오르소로그 또는 상동체이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 키트는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 2 이상의 분자를 포함한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 키트는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 3종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 3 이상의 분자, 보다 바람직하게는 4종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 4 이상의 분자, 보다 바람직하게는 5종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 5 이상의 분자, 보다 바람직하게는 6종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 6 이상의 분자, 가장 바람직하게는 7종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 7 이상의 분자를 포함한다. 물론, 상기 2 이상의 분자는 본 발명의 2개의 miRNA에 결합하며, 각 분자는 바람직하게는 단 하나의 miRNA에 결합하는 것으로 이해된다. 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 및 7개 이상의 분자들에게도 동일하게 적용된다.
바람직한 일 구현예에서, 2 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 2 이상의 분자를 포함하며, 상기 2 이상의 분자 중 제1 분자가 hsa-miR-340* 또는 이의 상동체 또는 오르소로그이고, 상기 2 이상의 분자 중 제2 분자가 miR-624*, miR-454* 또는 이들의 상동체 또는 오르소로그인, 성분 키트를 제공한다.
가장 바람직한 일 구현예에서, hsa-miR-340* 및/또는 이의 상동체 및/또는 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자, miR-624* 및/또는 이의 상동체 및/또는 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자, 및 miR-454* 및/또는 이의 상동체 및/또는 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자를 포함하는, 본 발명에 따른 키트를 제공한다.
다른 구현예에서, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 2 이상의 분자를 포함하는, 성분 키트를 제공한다. 보다 더 바람직한 상기 키트는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 3 이상의 분자를 포함하는, 성분 키트를 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서, miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 4개 이상의 분자를 포함하는 성분 키트를 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 키트는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 5개 이상의 분자, 보다 바람직하게는, 6개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 6개 이상의 분자, 가장 바람직하게는 7개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 7개 이상의 분자를 포함한다.
전술한 키트는 개체가 심혈관 질환을 앓고 있는지 심혈관 발병 위험성이 있는지를 측정하는데 유용하다. 따라서, 일 구현예에서, 개체가 심혈관 질환을 앓고 있는지 심혈관 발병 위험성이 있는지를 측정하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 키트의 용도를 제공한다.
본 발명의 miRNA에 특이적으로 결합하는 다양한 분자들을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 분자는 핵산 분자 또는 인공 핵산 분자이다. 핵산 분자는 뉴클레오티드 단량체의 체인으로 구성된다. 예로, 안정성을 향상시키기 위해, 핵산 분자를 인위적으로 변형시킨다. 이러한 인위적으로 변형된 핵산 분자는 정의에 따라 유사체이다. 예로, 유사체는 펩타이드 핵산 뿐만 아니라 이노신, LNA,모르폴리노 및 2'-메틸-RNA와 같이 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 키트에 사용하기 위한 본 발명의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 분자는 당업자에 의해 쉽게 동정된다. 본 발명의 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 분자는, 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA와의 상보적인 서열 동일성이 85% 이상인 7개의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 핵산 분자는 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가진다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 상보적인 서열 동일성은 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%이다. 앞서 기술한 바와 같이, 상보적인은 miRNA와 miRNA 안티센스 분자 상의 퓨린 및 피리미딘의 특이적인 쌍 형성을 의미한다. 따라서 상보적인 서열 상동성은, 핵산 분자와 miRNA의 안티센스 사이의 서열 동일성 %를 의미한다.
상기한 키트는 어레이 형태로 제공될 수 있다. 어레이는 특히 고성능 스크리닝(high throughput screening)에 이용가능하다. 또 다른 구현예에서, 따라서, 본 발명은 플랫폼 상에 고정된 분자를 포함하는 어레이를 제공하며, 상기 분자의 하나 이상 또는 수개가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 플랫폼 상에 고정된 분자를 포함하는 어레이를 제공하며, 상기 분자의 하나 이상 또는 수개가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 분자의 적어도 일부가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있으며, 분자의 적어도 일부가 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있으며, 분자의 적어도 일부가 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는, 본 발명에 따른 어레이를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 분자의 하나 이상 또는 수개가 hsa-miR-545:9.1, hsa-miR-454*, hsa-miR-624*, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는, 플랫폼 상에 고정된 분자를 포함하는 어레이를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은, 분자의 하나 이상 또는 수개가 hsa-miR-545:9.1, hsa-miR-454*, hsa-miR-624*, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는, 플랫폼 상에 고정된 분자를 포함하는 어레이를 제공한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 2개 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA는. 예컨대, 상기 miRNA들 중 수개, 바람직하게는 4개 이상에 결합할 수 있는 하나의 분자를 합성할 수 있다. 이는, 예를 들어, 하나 이상의 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가진 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하며, 추가적으로 하나 이상의 다른 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가지는 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 서열 등을 포함하는, 핵산 분자를 합성함으로써, 달성된다. 또한, 각각 하나 이상의 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가지는 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 서열을 포함하는, 수개의 분자들을 합성하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 상이한 분자들은 본 발명의 다른 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가진다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 핵산 분자(들)는 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상 또는 24개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA 및/또는 상기 하나 이상의 다른 miRNA와 85% 이상의 상보적인 서열 동일성을 가진다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 상보적인 서열 동일성은 90% 이상, 95% 이상 또는 100%이다.
본 발명에 따른 어레이는, 바람직하게는, 각각이 miRNA에 선택적으로 결합하는 분자들을 포함한다. 어레이는, 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법으로 상기 어레이를 사용하기 위한 설명서가 첨부된다. 앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 여러가지 miRNA에 특이적으로 결합하는 다양한 분자들을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자 또는 유사체가 본 발명에 따른 어레이에 사용된다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 어레이에 존재하는 복수개의 분자들은 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상, 보다 바람직하게는 7개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 어레이에 존재하는 복수개의 분자들은 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상, 보다 바람직하게는 6개 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 개체가 심혈관 질환을 앓고 있는지 심혈관 발병 위험성이 있는지를 확인하기 위한 본 발명에 따른 어레이의 용도를 제공한다.
본 발명의 이전에는, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는지를 확인하기 위해 몇가지 다른 위험 인자들을 사용하여 왔다. 이러한 인자들로는 혈압, 혈중 콜레스테롤 수치, 혈당 수치, 흡연 습관, 연령, 개체의 혈청 C-반응성 단백질 수치, 가족력, BMI 및/또는 허리둘레가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 위험 인자들은 본 발명에 따른 방법 외에도 여전히 유용하다.
따라서, 본 발명은, 심혈관 질환에 대한 위험성을 결정하기 위해 혈압, 혈중 콜레스테롤 수치, 혈당 수치, 흡연 습관, 연령, 개체의 혈청 C-반응성 단백질 수치, 가족력, BMI 및/또는 허리둘레를 고려하는 단계를 더 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 당업자는 이들 파라미터의 기준 수준과 비정상적인 수준과 관련된 위험도를 인지하고 있다.
miRNA 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 당업자는 특정 상황에 가장 적합한 방법을 선정할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, miRNA의 수준을 정량적인 실시간 PCR 등의 PCR, 마이크로어레이, RNase 보호 분석, 면역학적 방법, 인 시츄 혼성화 및/또는 서열분석을 이용하여 검출하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예로 Sambrook's "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Third Edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press)와 같은 실험 교재에 공개되어 있다.
이제 본 발명은 혈소판내 본 발명의 miRNA의 수준이 개체가 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는지에 대한 지표라는 식견을 제공하여 주어, 또한, 본 발명은 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 후보 화합물이 상기 발현을 정상화시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 본 발명의 miRNA의 발현이 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체에서 변이된다는 점을 활용한다. 이 문장에서 "정상화"는, 발현이 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체에게 증가된다면, 후보 화합물이 이러한 발현을 감소시킬 수 있다는 의미이다. 반대로, 화합물이 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체에서 감소되는 miRNA의 발현을 증가시킬 수 있다면, 이 화합물은 miRNA의 발현을 정상화할 수 있는 것이다.
이에, 본 발명은, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 제1 샘플의 혈소판을 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 상기 후보 화합물과 접촉되지 않은 상기 개체의 제2 샘플의 혈소판에서의 하나 이상의 miRNA의 발현에 대하여 상기 제1 샘플의 상기 혈소판에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제2 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현에 대한 상기 제1 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현이 상기 화합물이 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 지의 여부를 표시하는 것을 특징으로 하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물의 동정 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340* 또는 miR-340*의 상동체 또는 오르소로그인 것이 바람직하다.
바람직한 일 구현예에서, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 것으로 동정된 화합물을 선별 및/또는 분리하는 단계를 더 포함하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 샘플에서의 상기 miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 상대적인 조합 수준이, 상기 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 상기 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA는 miR-454*이다.
가장 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 상대적인 조합 수준이, 상기 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 상기 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-624* 또는 hsa-miR-624*의 상동체 또는 오르소로그이고, hsa-miR-340*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현과 상기 제1 샘플의 상기 다른 miRNA의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 상대적인 조합 수준이, 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 상기 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 유용한 화합물을 동정하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 방법으로 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 것도 가능하다. 항-혈소판 요법은, 혈소판이 유해한 덩어리로 응집되는 것을 차단하기 위해 혈소판과 상호작용하는 약물을 사용한다. 항-혈소판 약물로는 아스피린, 티클로피딘(Ticlid®), 글로피도그렐 (Plavix®), 티로피반 (Aggrastat®), 및 에티피바티드 (Integrilin®)를 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 있는 개체들은 대부분 아스피린 요법에 매우 잘 반응하지 않는다. 본 발명에 따른 방법으로 이용하여, 이러한 무반응자를 동정하고, 다른 약물 요법으로 바꿀 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은, 개체의 제2 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 대한 상기 개체의 제1 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 상대적인 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 제1 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 대한 상기 제2 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 상대적인 발현 수준이 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, hsa-miR-340*, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 하나 이상의 miRNA는 miR-545:9.1, miR-624*, miR-454*, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 개체가 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 것을 특징으로 하는 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하기 위한 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하기 위한 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 샘플은 혈소판을 포함한다. 그러나, 발현 수준을 측정하기 위해, 샘플내 혈소판이 여전히 무손상 상태이거나 및/또는 miRNA가 혈소판내에 여전히 존재할 필요는 없다. 예를 들어, 전혈 샘플 또는 혈소판 농화된 혈장 샘플을 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 상대적인 조합 수준이, 항-혈소판 요법에 대한 효과 여부를 표시하며, 상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
더 바람직한 일 구현예에서, 다른 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로부터 선택되는, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 보다 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA는 miR-454* 또는 이의 상동체 또는 오르소로그이다.
가장 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 조합 수준이, 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
다른 바람직한 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고, hsa-miR-340*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제1 샘플에서의 상기 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 상대적인 조합 수준이, 항-혈소판 요법의 효과를 나타내며, 상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
더 바람직한 일 구현예에서, 상기 다른 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는, 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아래 비제한적인 실시예를 들어 더욱 상세하게 설명된다. 본 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
도 1. 개체 24명의 발현 프로파일에 대한 지도 계층적 군집 분석의 히트 맵(heat map) (샘플을 x축에 표시). 개체는 도의 상단에 대조군 (회색) 또는 사례 (검정)으로 표시된다. 나타낸 214개의 차별적으로 발현되는 miRNA(P<0.05로 조정됨)의 명칭은 동일한 순서로 표 2에 열거한다. 색상 수단인 회색-스케일 바는 표준화된 miRNA 발현 수준을 표시한다 (진회색은 상대적인 저발현성을 표시하고; 연회색은 상대적인 고발현성을 표시한다).
도 2. CAD 환자와 대조군 개체의 혈소판에 대한 7개의 후보 miRNA의 발현 프로파일들. 각 도에서 좌측 2개의 막대는 12명의 건강한 대조군과 12명의 CAD 환자의 miRNA 어레이로 분석한 평균 miRNA 발현을 나타낸 것이다. 동일한 데이타세트를 실시간 PCR로 검증하였다 (우측 2개의 막대). 데이타는 평균 ± SEM으로 표시하고, *: 건강한 대조군 대비 p<0.05이다.
도 3. CAD 환자와 대조군 개체의 혈소판에 대한 6개의 후보 miRNA의 발현 프로파일들. 각 도에서 좌측 2개의 막대는 miRNA 어레이 코호트의 평균 miRNA 발현(12명의 대조군과 12명의 환자)을 나타낸 것이다. 2개의 독립적인 코호트를 실시간 PCR로 검증하였다 (우측 4개의 막대). 데이타는 평균 ± SEM으로 표시하고, *: 건강한 대조군 대비 p<0.05이다.
실시예
실시예 I
설계 및 방법
실험 집단
유전적 CAD 소인을 가진 실험 집단5을 구축하기 위해, 나이가 어리고 조기 심혈관 질환 (CVD) 가족력이 있는, CAD (조기(premature) CAD) 백인 남성 환자 12명으로 이루어진 그룹을 선정하였다. 이들 환자는 CAD에 대해 지속적인 위험이 있는 '최극단(extreme-end)' 표현형을 가지고 있다. 이에, 이 그룹이 CAD에서의 혈소판 특이적인 miRNA의 기능을 조사하는데 이상적이다. 환자들은 조기 CAD 전문인 암스테르담의 아카데믹 메디컬 센터 (AMC)의 외래환자 클리닉에서 선정하였다. 대조군은 광고를 통해 모집한 12명의 건강한 백인 남성 지원자로 구성하였다. 이들 대조군은 CVD 병력이나 가족력이 없으며, 어떠한 약물도 사용하지 못하게 하였다. 실험은 헬싱키의 선언에 따라 수행하였고, 실험 프로토콜은 암스테르담에 위치한 AMC의 의료 윤리 위원회로부터 승인받았으며, 모든 개체들로부터 서면 동의서를 받았다.
정의
조기 CAD는 51세 이전에 발병하는 심장 장애로 정의하였다. 조기 CVD 양성 가족력은 1 등급 이상의 가족 구성원 또는 조기 CVD를 가진 2 등급 이상의 가족 구성원 (남성 < 51세, 여성 < 56세)으로 정의하였다. CAD는 급성 심근 경색 (AMI) 또는 안정형 협심증 (SAP) 중 하나로 정의하였다. AMI는 증상 또는 심전도 변화에 의해 임상적으로 진단하고, 심근 괴사 마커의 혈장 수준 증가로 검증하였다. SAP는 증상으로 임상적으로 진단하며, 관상 동맥 혈관 촬영술로 확인되는 유의한 관상 동맥 협착증으로 검증하였다. 위험 인자는 다음과 같은 방식으로 정해진다: 고혈압, 고혈압에 대해 공지된 치료법: 당뇨병, 당뇨병에 대해 공지된 치료법; 비만, 체질량 지수 (BMI) > 30 kg/m2, 고콜레스테롤혈증, 고콜레스테롤혈증에 대한 공지된 치료법.
말초 혈액 채혈 및 혈소판 분리
비-금식 정맥혈 샘플을 안와 정맥으로부터 혈류 정지 없이 19게이지 바늘을 이용하여 채혈하였다. 혈액을 5개의 트리소듐 시트레이트 시험관 (각각에 0.105 M 트리소듐 시트레이트 0.5 mL이 들어 있는 5 mL, BD Vacutainer)으로 채혈하고, 처음 것은 버렸다. 혈액 채혈 직후, 샘플을 원심 분리(180g, 15분, 실온, 정지 없이 실행)하여, 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)을 수득하였다. 폴리프로필렌 파이펫을 이용하여 PRP를 조심스럽게 25% 이상을 남겨두고 플라스틱 시험관으로 옮겨 백혈구 오염을 방지하였다. 산-시트레이트-덱스트로스 (ACD) 완충액 (0.085 M 트리소듐 시트레이트, 0.11 M 글루코스, 0.071 M 시트르산)을 PRP에 1:5의 비율로 첨가하고, PRP를 원심분리하였다 (800g, 20분, 실온, 정지 없이 진행). 혈소판-결핍 혈장은 버리고, 혈소판 펠렛을 조심스럽게 티로드 완충액 (136.9 mM NaCl, 2.61 mM KCl, 11.9 mM NaHCO3, 5.55 mM 글루코스, 2 mM EDTA, pH 6.5)에 재현탁하였다. 펠렛 현탁물을 원심분리 (800g, 20분, 실온, 정지 없이 진행)하였다. 상층액은 버리고, 펠렛을 50 ㎕의 멸균 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)에 재현탁하고, RNA를 분리하기 전에 -80℃에 보관하였다. 분리된 혈소판은, 각각 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 동정하기 위해, CD45-APC (BD Biosciences), CD235a-FITC (DAKO) 및 CD61-PE (BD Biosciences)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)로 오염 여부를 확인하였다. 분리된 혈소판의 순도는 99.72% 였다.
RNA 추출 및 miRNA 발현 프로파일링
mirVana PARIS 키트 (Ambion, Inc.)를 기본적으로 액체 샘플에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 혈소판으로부터 총 RNA를 추출하였다. 샘플을 동일 부피의 산-페놀 클로로포름으로 2번 추출하고, 마지막 세척 단계 후와 용출 단계 전에 3분간 건조하는 것으로 프로토콜을 변형하였다. 샘플을 50 ㎕에서 12 ㎕로 농축하고, 이중 5 ㎕을 어레이에 사용하였다.
miRNA 발현 프로파일은 Illumina Human v2 MicroRNA BeadArrays를 제조사의 권고안 (Illumina, Inc., San Diego, CA) at ServiceXS (Leiden, The Netherlands)에 따라 이용하여 수득하였다. 원 데이타를 사전-가공하고, 요약하여, log로 변환한 다음, 비드어레이 팩키지를 이용하여 통계 소프트웨어 패키지 R (version 2.9.0)로 분위 정규화(quantile normalization)하였다. 차별적인 발현은 리마 패키지 (version 2.18.3)를 이용하여 온건 조건의 t-테스트를 이용하여 평가하였다. 벤자미니 및 호크베그 방법을 이용함으로써 다중 테스트에 대해 조정한 P-값이 0.05 미만인 경우, miRNA는 유의하게 차별적으로 발현되는 것으로 간주하였다. 차별적으로 발현된 miRNA (p<0.05로 조정)를 샘플의 계층 클러스터링 (Euclidean distance, complete linkage)에 의해 가시화하였다. 상세한 정보는 부룩의 데이타를 온라인으로 참조한다.
정량적인 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의한 발현 분석
마이크로어레이 분석을 검증하기 위해, 환자와 대조군 간에 차별적으로 발현되는 miRNA를 실시간 PCR용 선별하였다. RNA 분리를 통한 용출물 8 ㎕ 고정 부피를 역전사 반응에 투입물로 사용하였다. 투입 RNA를 miScript 역전사 키트 (Qiagen)를 이용하여 역전사하였다. 실시간 PCR을 고해상도 멜팅 마스터 (Roche)를 이용하여 LightCycler480 system II (Roche)에서 수행하였다. 데이타를 LinRegPCR 정량 PCR 데이타 분석 소프트웨어, 버전 11.3.36을 이용하여 분석하였다. NO-값을 계산한 후, 데이타를 내부 대조군 RNU6B (Applied Biosystems)에 대해 정규화하였다. 상세한 정보는 부록의 데이타를 온라인으로 참조한다.
결과
임상적인 특징들
조사한 개체들의 임상 특징들을 표 1에 나타낸다. 어떤 개체도 본 발명자가 인지하는 한 비만 및 당뇨병을 가지고 있지 않았다.
말초 혈소판의 MiRNA 시그니처
마이크로어레이 프로파일링을 통해, 혈소판에서 검출한 893개의 성숙한 인간 miRNA들 중 214개가 CAD 환자와 건강한 대조군 간에 차별적으로 발현되는 것으로 동정되었다 (p<0.05로 조정됨). 이들 214개의 miRNA를 이의 miRNA 발현 프로파일들의 유사성을 기초로 개체들을 클러스터링 하는 지도 계층적 클러스터링 분석에 사용하였다 (도 1 참조). 이러한 쿨러스터링 분석을 통해, 혈소판-유래 miRNA의 서브세트가 CAD 환자와 건강한 대조군에서 구별될 수 있다는 것이 확인되었다. 이들 214개의 차별적으로 발현되는 miRNA들 중에서, 9개의 miRNA가 대조군과 비교하여 환자에서 1.5배 이상으로 상향 조절되었다. 또한, 4개의 miRNA가 대조군과 비교하여 환자에서 1.5배 이상으로 하향 조절되었다. 본 데이타의 견고성(robustness)을 검증하기 위해, 본 데이타를 전술한 범위외 샘플은 제외하고, 분석하였다. 범위 외의 결과들의 조합을 생략하는 것과는 무관하게, 6개의 miRNA가 유의하게 상향 조절되는 것으로 잔류하였고, 1개의 miRNA가 유의하게 하향 조절되는 것으로 남겨졌다. 상향 조절되는 miRNA는 miR-340*, miR-615-5p, miR-545:9.1, miR-451, miR-454* 및 miR-624*이고, 하향 조절되는 miRNA는 miR-1280이었다 (도 2 참조).
실시간 PCR에 의한 miRNA 어레이 데이타 검증
6개의 상향 조절된 miRNA와 1개의 하향 조절된 miRNA의 어레이 데이타를 동일 집단에서의 실시간 PCR로 검증하였다. RNU6B (내부 대조군)의 발현 수준은 다른 샘플과 비교하여 항상 범위 외이었기 때문에, 2명의 대조군 개체는 분석에서 제외시켰다. 6개의 상향 조절된 miRNA 모두 실시간 PCR에 의해 충분히 상향 조절되는 것으로 확인되었고, 단 3개는 PCR에서 통계적으로 유의하였다 (miR-545:9.1, miR-624* 및 miR-454*; p < 0.05). 하나의 하향 조절된 miRNA는 검증할 수 없었다 (도 2 참조). PCR 조건과 샘플 크기를, 다른 3개의 상향 조절된 miRNA들과 miR-1280을 검증하기 위해, 이제 최적화한다.
실시예 2
설계 및 방법
실험 집단
검증 코호트(validation cohort)
마이크로어레이 데이타의 결과를 검증하기 위해, 선별된 miRNA의 발현 수준을 분리한 혈소판에서 2번의 독립적인 검증 코호트로 qRT-PCR로 측정하였다.
검증 코호트 I
검증 코호트 I은 40명의 남성 조기 CAD 개체와 40세의 매칭되는 남성 대조군으로 이루어진다. 또한, 이들 대조군은 광고를 통해 모집하였다. 참가자들은 동일한 가입 및 제외, 그리고 매칭 기준을 이용하여 miRNA 어레이 분석에 사용된 집단과 동일한 방식으로 선택하였다. 데이타 수집은 CAD 진단 후 수년간 행하였다. 가입은 2009년 12월에서 2010년 6월까지 실시하였다. 27명의 대조군 개체들에게, 약물 사용 전과 후에 miRNA 발현을 측정할 수 있도록, 본 실험에 2번 참가하도록 요청하였다. 이와 관련하여, 매일 아세틸 살리실산 100 mg과 매일 심바스타틴 40 mg을 8주간 복용하도록 요청하였다.
검증 코호트 II
검증 코호트 II는 조기 CAD 유병률이 높은 4 가구의 구성원들로 구성된다; 27명의 죽상경화증 환자와 40명의 건강한 가족 구성원. 이들 4 가구는 외래 환자 클리닉에서 스크리닝하였다. CAD 증상 또는 신체적 이상이 없는 가족 구성원들을 관상 동맥 CT-스크리닝을 수행하여, 잠복기 CAD를 검사하였다. 사례들은 CAD 병력을 가지고 있거나 또는 관상 칼슘 수치 > 80번째 백분위수인 것으로 제한하였다. 대조군은 어떠한 CAD 증상이나 신체적 이상 소견이 없고, 관상 칼슘 수치가 < 80번째 백분위수인 개체로 제한하였다.
정의
조기 CAD는 남성의 경우 51세 이전, 여성의 경우 56세 이전에 발병하는 심장 장애로 정의하였다. 조기 CVD 양성 가족력은 1 등급 이상의 가족 구성원 또는 조기 CVD를 가진 2 등급 이상의 가족 구성원으로 정의하였다. CAD는 급성 심근 경색 (AMI) 또는 안정형 협심증 중 하나로 정의하였다. AMI는 증상 또는 심전도 변화에 의해 임상적으로 진단하고, 심근 괴사 마커의 혈장 수준 증가로 검증하고, 관상 동맥 혈관 촬영에서 단일 혈관 질환(single vessel disease)에 의해 확인되는 관상 동맥 폐색으로 검증하였다. 안정형 협심증은 증상으로 임상적으로 진단하고, 관상 동맥 혈관 촬영에 의해 확인되는 바와 같이 2개 이상의 혈관에서 유의한 관상 동맥 협착증 (<70%)으로 검증하였다. 위험 인자는 다음과 같은 방식으로 정해진다: 고혈압, 고혈압 치료 또는 30분 Dinamap 측정에서, 무처리시 수축기 혈압 >140 mmHg 또는 이완기 혈압 >90 mmHg으로 3회 독립적으로 측정됨; 과체중; BMI >25 kg/m2; 고콜레스테롤혈증; 무처리시 총 콜레스테롤 수치 >8 mmol/l 또는 발병 전에 고콜레스테롤혈증에 대한 치료; 흡연; 현재 흡연; 당뇨병; 금식시 혈당이 >6.9 mmol/l로 또는 비-금식시 >11.1 mmol/l로 2번 독립적으로 측정됨, 또는 당뇨병에 대해 공지된 치료법.
상기에서 언급한 모든 코호트는 헬싱키 선언에 따라 행한다. 실험 프로토콜은 암스테르담에 위치한 AMC의 의료 윤리 위원회로부터 승인받았으며, 모든 개체들로부터 서면 동의서를 받았다.
말초 혈액 채집 및 혈소판 분리
비-금식 정맥혈 샘플을 안와 정맥으로부터 혈류 정지 없이 19게이지 바늘을 이용하여 채혈하였다. 혈액을 5개의 트리소듐 시트레이트 시험관 (각각에 0.105 M 트리소듐 시트레이트 0.5 mL이 들어 있는 5 mL, BD Vacutainer)으로 채혈하였다. 처음 샘플은 분석에 사용하지 않았다. 혈액 채혈 직후, 샘플을 원심 분리(180g, 15분, 실온, 정지 없이 실행)하여, 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)을 수득하였다. 폴리프로필렌 파이펫을 이용하여 PRP의 상층을 조심스럽게 플라스틱 시험관으로 옮겨 백혈구 오염을 방지하였다. 산-시트레이트-덱스트로스 (ACD) 완충액 (0.085 M 트리소듐 시트레이트, 0.11 M 글루코스, 0.071 M 시트르산)을 PRP에 1:5의 비율로 첨가하고, PRP를 원심분리하였다 (800g, 20분, 실온, 정지 없이 진행). 혈소판-결핍 혈장은 버리고, 혈소판 펠렛을 조심스럽게 티로드 완충액 (136.9 mM NaCl, 2.61 mM KCl, 11.9 mM NaHCO3, 5.55 mM 글루코스, 2 mM EDTA, pH 6.5)에 재현탁하였다. 펠렛 현탁물을 원심분리 (800g, 20분, 실온, 정지 없이 진행)하였다. 상층액은 버리고, 펠렛을 50 ㎕의 멸균 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)에 재현탁하고, RNA를 분리하기 전에 -80℃에 보관하였다. 분리된 혈소판은, 각각 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 동정하기 위해,CD45 (BD Biosciences), CD235a (DAKO) 및 CD61 (BD Biosciences)에 대한 단일클론 항체를 이용하여 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)로 검사하였다. 분리된 혈소판의 순도는 FACS 분석에 따르면 99.72% 였다.
RNA 분리
mirVana PARIS 키트 (Ambion, Inc.)를 액체 샘플에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 혈소판으로부터 총 RNA를 추출하였다. 샘플을 동일 부피의 산-페놀 클로로포름으로 2번 추출하고, 마지막 세척 단계 후와 용출 단계 전에 3분간 건조하는 것으로 프로토콜을 변형하였다. 샘플을 50 ㎕에서 12 ㎕로 농축하고, 이중 5 ㎕을 Illumina 어레이에 아래와 같이 사용하였다.
정량적인 실시간 PCR에 의한 발현 분석
마이크로어레이 분석을 검증하기 위해, 환자와 대조군에서 차별적으로 발현되는 miRNA를 실시간 PCR을 위해 선택하였다. RNA 분리를 통한 용출물 8 ㎕ 고정 부피를 역전사 반응에 투입물로 사용하였다. 투입 RNA를 miScript 역전사 키트 (Qiagen) 또는 TaqMan MicroRNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 역전사하였다. miR340*, miR451 및 miR624*의 실시간 PCR을 고해상도 멜팅 마스터 (Roche)를 이용하여 수행하였다. miR454*, miR545:9.1 및 miR615-5p의 실시간 PCR을 TaqMan MicroRNA 분석 (Applied Biosystem)과 LightCycler 480 프로브 마스터 (Roche)로 수행하였다. 양쪽 실시간 PCR은 LightCycler480 system II (Roche)에서 수행하였다. MiR340*, miR451 및 miR624*를 LinRegPCR 정량 PCR 데이타 분석 소프트웨어, 버전 12.3을 이용하여 분석하였다. MiR454*와 miR545:9.1은 LinRegPCR 정량 PCR 데이타 분석 소프트웨어, 버전 12.5를 이용하여 분석하였다. 지금까지, miRNA 함량을 정규화하고 검증하기 위한 정규화 프로토콜은 확립되어 있지 않다. 이를 위해, NO-값을 계산한 후, 데이타를 혈소판과, 모든 개체들에서 유사하게 발현되는 miRNA 223에 대해 정규화하였다. 결과들은 Windows, version 11.0 (SPSS. Chicago IL)용 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences)를 이용하여 평균 ± SEM으로 나타낸다. 분포가 정상적이지 않아, miRNA를 로그-변환하였다. 모든 분석들에서, p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주되었다.
결과
후보 miRNA의 검증
검증 코호트 I
마이크로어레이 분석으로 동정한 7개의 차별적으로 발현된 miRNA를 먼저 검증 코호트 I에서 실시간 PCR에 의해 검증하였다. 이 코호트는 조기 CAD의 선정된 환자 40명과 건강한 매칭되는 대조군 40명으로 구성된다. 어레이 분석에서 관찰된 7개의 miRNA들 중, 2개 miR340*와 miR624*는 대조군에 비해 환자에서 유의하게 상향 조절되었다 (도 3).
검증 코호트 II
1차 검증 후, 조기 CDA 외래 환자 클리닉에서 2차로 보다 포괄적인 환자 코호트로 결과를 검증하였다. 이 코호트는 27명의 환자와 40명의 가족 구성원으로 이루어진 4가구로 구성된다. 어레이 분석에서 관찰된 7개의 miRNA들 중, 2개의 miRNA들, 즉 miR340* 및 miR624*는 대조군과 비교하여 환자에서 임상적으로 상향 조절되었다 (도 3).
약물 사용 및 혈소판 miRNA 발현
약물 사용이 2개의 후보 miRNA들 miR340* 및 miR624*의 miRNA 발현 수준에 대한 영향을 조사하기 위해, 이들 miRNA의 발현을 방법 단락에서 기술된 바와 같이 약물을 사용한 대조군 개체와 사용하지 않은 대조군 개체에서 측정하였다. 놀랍게도, 약물은 이러한 결과에 영향을 미치지 않았다.
표 1: 임상 특징들
임상 특징 환자 (n=12) 대조군 (n=12)
데이타 수집 연령(세, (SD)) 46 (6.5) 45 (7.0)
CAD 발병 연령 (세, (SD)) 42 (7.6) 적용 안됨
현재 흡연율 (명 수; (%)) 1 (8) 1 (8)
고콜레스테롤혈증 2 (17) 0
고혈압 2 (17) 0
표 2: 차별적으로 발현되는 214개의 miRNA가 도시된 도 1에서의 명칭 (P<0.05)
1 hsa-miR-659
2 HS_60
3 HS_262.1
4 hsa-miR-299-3p
5 hsa-miR-525-5p
6 hsa-miR-875-5p
7 hsa-miR-578
8 hsa-miR-1248
9 hsa-miR-943
10 solexa-539-2056
11 hsa-miR-181d
12 hsa-miR-665
13 hsa-miR-206
14 hsa-miR-1206
15 hsa-miR-1205
16 hsa-miR-646
17 hsa-miR-367*
18 HS_268
19 HS_177
20 hsa-miR-455-3p
21 hsa-miR-1243
22 HS_265.1
23 hsa-miR-491-3p
24 HS_23
25 HS_106
26 hsa-miR-214*
27 HS_25
28 HS_168
29 hsa-miR-548i
30 hsa-miR-20b*
31 HS_182.1
32 hsa-miR-572
33 hsa-miR-106a:9.1
34 hsa-miR-663
35 hsa-miR-596
36 solexa-15-44487
37 hsa-miR-581
38 HS_141
39 hsa-miR-138-2*
40 hsa-miR-583
41 hsa-miR-641
42 hsa-miR-516a-3p,hsa-miR-516b*
43 hsa-miR-647
44 HS_284.1
45 hsa-miR-518d-3p
46 hsa-miR-560:9.1
47 solexa-9578-86
48 hsa-miR-614
49 hsa-miR-548m
50 hsa-miR-1231
51 HS_40
52 hsa-miR-507
53 HS_71.1
54 hsa-miR-146a*
55 hsa-miR-520b,hsa-miR-520c-3p,hsa-miR-520f
56 HS_304_b
57 HS_267
58 hsa-miR-570
59 hsa-miR-144
60 HS_49
61 hsa-miR-648
62 hsa-miR-526b
63 hsa-miR-634
64 HS_170
65 hsa-miR-1200
66 hsa-miR-147
67 hsa-miR-1269
68 hsa-miR-346
69 hsa-miR-1255b
70 hsa-miR-548c-3p
71 HS_90
72 hsa-miR-1258
73 HS_95
74 hsa-miR-569
75 HS_147
76 hsa-miR-100*
77 hsa-miR-1261
78 hsa-miR-195*
79 HS_79.1
80 hsa-miR-298
81 hsa-miR-488*
82 hsa-miR-661
83 HS_273
84 hsa-miR-636
85 hsa-miR-744*
86 HS_15.1
87 hsa-miR-302c
88 hsa-miR-934
89 HS_89
90 HS_9
91 hsa-miR-1207-3p
92 hsa-miR-155*
93 hsa-miR-509-5p
94 hsa-miR-34c-3p
95 hsa-miR-455-5p
96 hsa-miR-551b*
97 hsa-miR-1283
98 solexa-7764-108
99 hsa-miR-429
100 hsa-miR-920
101 hsa-miR-657
102 hsa-miR-34a*
103 hsa-miR-325
104 hsa-miR-211
105 hsa-miR-31*
106 hsa-miR-579
107 hsa-miR-541
108 hsa-miR-1236
109 hsa-miR-1278
110 hsa-miR-1247
111 solexa-3464-254
112 hsa-miR-1298
113 HS_14.1
114 hsa-let-7c*
115 hsa-miR-1245
116 hsa-miR-548g
117 hsa-miR-1300
118 hsa-miR-302c*
119 hsa-let-7f-2*
120 hsa-miR-876-5p
121 hsa-miR-137
122 hsa-miR-1299
123 hsa-miR-300
124 HS_99.1
125 hsa-miR-30b*
126 hsa-miR-922
127 HS_176
128 hsa-miR-563
129 hsa-miR-504
130 hsa-miR-9*
131 HS_122.1
132 hsa-miR-1289
133 hsa-miR-571
134 HS_184
135 hsa-miR-1267
136 HS_19
137 hsa-miR-513a-5p
138 hsa-miR-591
139 HS_110
140 hsa-miR-1204
141 HS_22.1
142 HS_68
143 hsa-miR-25*
144 hsa-miR-516a-5p
145 hsa-miR-218-1*
146 solexa-7534-111
147 hsa-miR-376a*:9.1
148 hsa-miR-376a*
149 hsa-miR-299-5p
150 HS_303_b
151 HS_157
152 hsa-miR-1237
153 hsa-miR-550
154 hsa-miR-187
155 hsa-miR-886-3p
156 HS_194
157 hsa-miR-519b-3p
158 HS_139
159 hsa-miR-1224-3p
160 hsa-miR-551a
161 hsa-miR-371-5p
162 solexa-3022-299
163 HS_113
164 HS_150
165 HS_152
166 hsa-miR-10b*
167 HS_86
168 hsa-miR-190
169 solexa-3277-272
170 hsa-miR-557
171 hsa-miR-632
172 hsa-miR-1257
173 solexa-8926-93
174 hsa-miR-1305
175 hsa-miR-193a-3p
176 hsa-miR-362-3p
177 HS_94
178 hsa-miR-374a*
179 hsa-miR-10a*
180 hsa-miR-651
181 hsa-miR-182*
182 HS_65
183 hsa-miR-615-5p
184 HS_275
185 hsa-miR-181a*
186 HS_188
187 hsa-miR-517a
188 hsa-miR-615-3p
189 hsa-miR-17*
190 hsa-miR-505
191 hsa-miR-154
192 hsa-miR-454*
193 HS_303_a
194 hsa-miR-450b-5p
195 hsa-miR-624*
196 hsa-miR-451
197 hsa-miR-576-5p
198 hsa-miR-340*
199 hsa-miR-335*
200 hsa-miR-132
201 hsa-miR-10a
202 hsa-miR-585
203 hsa-miR-545:9.1
204 hsa-miR-199a-5p
205 hsa-miR-106b
206 hsa-miR-1280
207 hsa-miR-328
208 hsa-miR-151-5p
209 hsa-miR-23b
210 hsa-miR-20a
211 hsa-miR-126*
212 hsa-miR-374a
213 hsa-miR-151-3p
214 hsa-miR-21
표 3: miRNA 및 miRNA 조합의 AUC 및 p-값
MIR (조합) AUC p-값
miR-624* 0.631 0.038
hsa-miR-340* 0.687 0.007
miR-454* 0.592 0.224
hsa-miR-451 0.598 0.153
340*, 624* 0.696 0.003
340*, 454* 0.712 0.001
340*, 451 0.681 0.006
624*, 454* 0.639 0.038
624*. 451 0.618 0.077
451, 454* 0.618 0.076
624*, 340*, 454* 0.707 0.002
624*, 340*, 451 0.693 0.004
340*, 454*, 451 0.710 0.002
624*, 454*, 451 0.629 0.054
624*, 340*, 451, 454* 0.707 0.002

Claims (32)

  1. 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성을 결정하기 위한 방법으로서,
    상기 개체의 샘플을 이용하여, hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체(homologue) 및 오르소로그(orthologue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 포함하며,
    상기 비교 결과가 상기 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성 여부를 표시하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    2종 이상의 miRNA의 (상대적인) 발현 수준을 측정하며,
    상기 2종 이상의 miRNA 중 제1의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고,
    상기 2종 이상의 miRNA 중 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 방법은, 상기 2종 이상의 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하며, 상기 비교 결과가 상기 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성 여부를 표시하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2의 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고,
    상기 방법은 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 (상대적인) 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 제1의 miRNA, 제2의 miRNA 및 다른 miRNA의 발현 수준을 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하며,
    상기 비교 결과가 상기 개체의 심혈관 질환의 발병 위험성 여부를 표시하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
    전혈 샘플(whole blood sample)이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 샘플에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계, 및
    상기 샘플에서의 상기 제2의 miRNA의 발현 수준이 miRNA 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 상기 제2의 miRNA의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계,
    상기 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계, 및
    상기 샘플에서의 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 높은지를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 샘플에서의 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 또는 hsa-miR-1280의 오르소로그의 발현 수준이, 심혈관 질환의 발병 위험성이 없는 건강한 개체의 샘플에서의 hsa-miR-1280, hsa-miR-1280의 상동체 또는 hsa-miR-1280의 오르소로그의 발현 수준에 비해 1.50배 이상 낮은지를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하는, 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 miRNA가 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고,
    상기 방법은, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA에 대한 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 다른 miRNA가 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고,
    상기 방법은, 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 혈소판 및/또는 거핵구에서, miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그에 대한, 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 miRNA에 대한 상기 타겟의 양, 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계는, 상기 혈소판 및/또는 상기 거핵구에서의 상기 miRNA의 발현을 통해 또는 발현의 저해를 통해 매개되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 약제로 사용하기 위한 miRNA의 저해제로서,
    상기 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 저해제.
  16. 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하기 위한 miRNA의 저해제로서,
    상기 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 저해제.
  17. 제15항에 따른 하나 이상의 저해제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 hsa-miR-340, hsa-miR-340의 상동체 또는 hsa-miR-340의 오르소로그에 대한 하나 이상의 저해제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물은 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그에 대한 하나 이상의 저해제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그에 대한 하나 이상의 저해제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서,
    심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방에 사용하기 위한 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제14항, 제 16항, 또는 제21항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 심혈관 질환이 죽상경화증, 관상 동맥 질환, 일과성 허혈성 발작, 뇌졸증, 말초 혈관 질환, 급성 관상 동맥 증후군, 안정형 협심증, 혈관성 치매 및 신부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법, 저해제 또는 약학 조성물.
  23. 성분 키트(kit of parts)로서,
    hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자; 및
    제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 따른 방법으로 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함하며,
    선택적으로, 하나 이상의 대조군 및/또는 하나 이상의 표준 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 성분 키트.
  24. 제23항에 있어서,
    hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자,
    miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자, 및
    miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 성분 키트.
  25. 플랫폼 상에 고정된 분자들을 포함하는 핵산 분자 어레이로서,
    상기 분자들 중 적어도 일부는 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 4종 이상의 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 어레이.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 분자들 중 적어도 일부는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 및/또는 hsa-miR-340*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있으며,
    상기 분자들 중 적어도 일부는 miR-624*, miR-624*의 상동체 및/또는 miR-624*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있으며,
    상기 분자들 중 적어도 일부는 miR-454*, miR-454*의 상동체 및/또는 miR-454*의 오르소로그에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 어레이.
  27. 심혈관 질환의 치료, 경감, 지연 및/또는 예방에 유용한 화합물을 동정하는 방법으로서,
    심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 개체의 제1 샘플의 혈소판을 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 상기 후보 화합물과 접촉되지 않은 상기 개체의 제2 샘플에서 혈소판에 의한 하나 이상의 miRNA의 발현에 대한, 상기 제1 샘플에서 상기 혈소판에 의한 하나 이상의 miRNA의 발현의 상대적인 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 제2 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현에 대한 상기 제1 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현의 상대적인 수준이, 심혈관 질환을 치료, 경감, 지연 및/또는 예방하는데 있어 상기 화합물의 유용성을 표시하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 개체에서 항-혈소판 요법의 효과를 모니터링하는 방법으로서,
    개체의 제2 샘플에서의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 대한 상기 개체의 제1 샘플의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 이상의 miRNA가 hsa-miR-340*, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, hsa-miR-1280, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 제1 샘플에서의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준에 대한 상기 제2 샘플의 상기 하나 이상의 miRNA의 발현의 상대적인 수준이, 항-혈소판 요법에 대한 효과 여부를 표시하며,
    상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 개체는 심혈관 질환을 앓고 있거나 발병 위험성이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 하나 이상의 miRNA는 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그이고,
    상기 방법은, miR-624*, miR-454*, miR-545:9.1, hsa-miR-615-5p, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하며,
    상기 제1 샘플에서의, hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의, hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 상기 다른 miRNA의 발현의 상대적인 조합 수준이, 항-혈소판 요법에 대한 효과 여부를 표시하며,
    상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 다른 miRNA는 miR-624*, miR-454*, hsa-miR-451, 및 이들의 임의의 상동체 및 오르소로그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 다른 miRNA는 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그이고,
    상기 방법은, miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하며,
    상기 제1 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 조합 수준에 대한, 상기 제2 샘플에서의 상기 hsa-miR-340*, hsa-miR-340*의 상동체 또는 hsa-miR-340*의 오르소로그의 발현과 miR-624*, miR-624*의 상동체 또는 miR-624*의 오르소로그의 발현 및 miR-454*, miR-454*의 상동체 또는 miR-454*의 오르소로그의 발현의 상대적인 조합 수준이, 항-혈소판 요법에 대한 효과 여부를 표시하며,
    상기 개체는 제1 샘플 채취와 제2 샘플 채취 사이에 항-혈소판 요법을 시술받은 것을 특징으로 하는 방법.
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