CN102884206A - 用于确定心血管疾病的风险的手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学，具体涉及内科医学和/或心脏病学。本发明通过测量存在于患者的样品中的miRNA，提供用于给样品分型及鉴别和/或治疗患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的患者的手段和方法。本发明还提供用于鉴别新的心血管疾病治疗的手段和方法。

Description

用于确定心血管疾病的风险的手段和方法
本发明涉及医学，具体涉及内科医学和/或心脏病学。
心血管疾病技术上包括影响心血管系统的任何疾病。然而，其通常用于指与动脉粥样硬化相关的那些疾病。
在美国和大多数的欧洲国家中，心血管疾病是死亡和残疾的第一起因。检测到心脏问题的时候，潜在的起因(动脉粥样硬化)通常是相当晚期了，已经进展了数十年。因此，不断增强的重点在于通过改进风险因素诸如健康饮食、运动和避免吸烟来预防动脉粥样硬化。
冠心病(或冠状动脉疾病(CAD))是指冠状循环不能为心肌和周围组织提供充足的循环。CAD是复杂的疾病，其被认为是由很多遗传因素、环境因素及这些因素中的相互作用引起的。事实上，已经鉴定了CAD的很多风险因素，包括吸烟、高龄、男性性别、糖尿病、高收缩压、心绞痛的个人史、高脂肪饮食、传染原(infectious agent)、肥胖、增加的血浆总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、增加的血浆甘油三酯及降低的血浆高密度脂蛋白(HDL)胆固醇。然而，家族史是CAD最重要的独立风险因素之一，且孪生子研究还表明遗传因素有助于CAD的发展。CAD的高死亡率、迟发性及家族中的拟表型造成的复杂化也在这个重要疾病的遗传解剖中呈现出大的挑战。
CAD的主要起因由缓慢发展的动脉粥样硬化斑块的形成和急性血栓性闭塞事件组成，导致了缺血性的并发症。
由于CAD代表了人的发病率和死亡率的主要起因，存在对创新的诊断策略和治疗策略的需要。目前，很难准确地预测受试者在将来是否会发展成CAD。现在，这是通过风险计算器来完成的，其并非非常准确。而且，本领域已知的风险计算器不能预测受试者是否已经缓慢地发展成斑块形成，或是否处于急性闭塞性事件的风险中。一些临床测试可用来评估个体是否患有心血管疾病，比如冠状动脉或外周动脉的变窄。例如，心电图、压力测试(运动心电图)、超声心动图、验血(用于测试某些脂肪、胆固醇、糖和蛋白质的反常水平)被用于诊断的目的。然而，这些测试中没有一个能可靠地预测个体患心血管疾病诸如冠状或外周动脉疾病的风险。因此，存在对新的生物标志物(biomarker)的需要，所述生物标志物能够更可靠地预测心血管疾病的风险。
本发明的目的是提供用于给处于患心血管疾病的风险中的受试者的样品分型及用于鉴别和/或治疗患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者的手段和方法。本发明的又一目的是提供用于鉴别在心血管疾病治疗中有用的药物及用于监测这样的治疗的方法。
本发明通过测量存在于所述患者的样品中的miRNA，提供用于给样品分型及鉴别和/或治疗患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的患者的手段和方法。本发明还提供用于鉴别新的心血管疾病治疗的手段和方法。
本发明首次显示出miRNA在血小板中的表达水平的改变与心血管疾病相关。很多人寻找心血管疾病的遗传生物标志物，但是从未有人用血小板来完成。例如，已经显示，循环的miRNA是对于AMI的诊断有用的生物标志物2-4。据报道，心肌损伤后，miR-1和miR-208两者在血浆中是升高的。然而，可能的是，这些miRNA是自受损的心肌细胞释放到血流中，例如因为在出院的AMI患者中，miR-1的水平恢复正常。与在心血管疾病的急性期中考察循环的miRNA的这些研究相反，本发明人是在心血管疾病的稳定期中考察存在于血小板中的miRNA，其中释放自例如受损的心肌细胞的miRNA不再起作用。而且，由本发明人所发现的miRNA在之前的研究中并未被发现，因为在本发明之前，寻找与心血管疾病相关的miRNA的其它人并未寻求miRNA在血小板纯化样品(例如，富含血小板的血浆)中的水平。相反是在急性心血管疾病过程中测定例如血浆样品中的miRNA水平。然而，在急性心血管疾病的过程中，几种miRNA在全血或血浆样品中是被上调和/或下调的(即，异常调节的)。这些异常调节的miRNA包括释放自受损的心脏细胞的miRNA，而且包括例如释放自对心脏损伤起作用的活化白细胞的miRNA。同时，通常伴随急性心血管疾病的缺血性损伤已经对血或血浆中的几种miRNA的表达水平产生影响。之前的任何研究没有鉴别在本发明中被鉴别为心血管疾病的预测性风险因素的miRNA，因为这些miRNA没有以允许通过由发明人所使用的筛选法(微阵列)来测定CAD患者和健康对照之间的1.5-2倍的差异的高水平存在于心血管疾病的急性期的全血中微阵列，这种筛选方法是测试大量的总miRNA所需要的。
通过使用在血小板方面相对纯的样品即富含血小板的血浆样品，发明人能够鉴别存在于血小板中且在处于风险中但还未患有急性心血管疾病的受试者中被异常调节的miRNA。这些miRNA充当处于患心血管疾病的风险中的受试者的生物标志物，且因此可以用作预测性的生物标志物。
miRNA是通过抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解来抑制蛋白质合成的小的核酸分子。继成为正常发育和生理学的重要调节器之后，已经将miRNA的异常调节的表达与许多人类疾病相关联。结果，认为人的miRNA作为生物标志物是非常有用的。最近，已经发现了微RNA通路在无核血小板中的存在1。现在，本发明提供这样的见解：血小板miRNA的表达特征(expression profile)在确定受试者是否患有心血管疾病或是否处于患心血管疾病的风险中是有用的。例如，本发明表明，在与健康对照的血小板相比时，特定的miRNA在患有CAD的患者的血小板中被差异表达。
在第一个实施方式中，本发明提供用于测定受试者是否处于患心血管疾病的风险中的方法，该方法包括用所述受试者的样品来测定至少一种miRNA的(相对)表达水平，所述miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物(orthologue)组成的组，且将所述至少一种miRNA的表达水平与参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中。优选地，所述方法为体外方法。所述参考值优选地是通过使用参考样品来测定所述至少一种miRNA的表达水平而得到的，参考样品优选地来自未患有心血管疾病或未处于患心血管疾病的风险中的受试者。在优选的实施方式中，所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。在另一个更优选的实施方式中，所述miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物。
没有必要同时测定参考值和测试值两者。例如，可能的是，优选地使用来自未患有心血管疾病或未处于患心血管疾病的风险中的受试者的样品来测定参考值且反复使用所述参考值以测定测试样品中的所述至少一种miRNA的相对表达是否是患心血管疾病的个体风险的指示。可能的是，将已经表明是患心血管疾病的低风险的指示的表达水平用作参考值，例如来自健康个体的许多样品中的miRNA的平均水平。另一方面，还可能能够的是，将已经表明是心血管疾病或患心血管疾病的高风险的指示表达水平用作参考值。例如，这样的参考值是用患有心血管疾病的个体的样品而得到的。因此，通过将所述受试者的样品中的任何上述miRNA的表达水平与健康个体的样品中的表达水平或与患有心血管疾病的个体的样品中的表达水平进行比较，测定受试者是否处于患心血管疾病的风险中是可能的。与健康个体的表达水平相当的表达水平是所述受试者未处于心血管疾病的风险中的指示。与患有心血管疾病的个体的表达水平相当的表达水平表明所述受试者处于患心血管疾病的风险中。关于相当是指表达水平优选地小于1.8倍的差异，更优选地小于1.5倍的差异，更优选地小于1.3倍的差异，最优选地小于1.2倍的差异。
优选的是，在根据本发明的方法中测定选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少两种miRNA的表达水平。优选的是，所述至少两种miRNA中的至少一种为hsa-miR-340*或miR-624*，或hsa-miR-340*或miR-624*的同源物或直系同源物。更优选地，所述至少两种miRNA中的至少一种为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。在优选的实施方式中，所述至少两种miRNA中的第一种为hsa-miR-340或hsa-miR-340的同源物或直系同源物，且所述至少两种miRNA中的第二种为miR-454或miR-454的同源物或直系同源物。更优选地，在根据本发明的方法中测定选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少三种，更优选地至少四种，更优选地至少五种，更优选地至少六种，更优选地至少七种，最优选地至少八种miRNA的表达水平。在受试者的样品中测定几种上文所述的miRNA优选地导致了受试者患心血管疾病的风险的更为准确的评估。
例如，本发明表明，如果测定了hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合本发明的至少一种其它miRNA的表达水平，优选地为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平和/或miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的表达水平，与如果测量了这些miRNA中的仅仅一种的表达水平相比，可以更为准确地测量受试者患心血管疾病的风险。同样也适用于测定miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平联合本发明的至少一种其它miRNA的表达水平，优选地为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平和/或miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的表达水平。
因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中测定至少两种miRNA的(相对)表达水平，其中所述至少两种miRNA中的第一种为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且其中所述至少两种miRNA中的第二种选自由miR-624*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组，该方法还包括将所述至少两种miRNA的表达水平和参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于患心血管疾病的风险中。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述第二种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在甚至更优选的实施方式中，所述第二种miRNA为miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物。
在最优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述第二种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的(相对)表达水平，且将所述第一种miRNA、第二种miRNA及又一种miRNA的表达水平与参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于患心血管疾病的风险中。
在另一优选实施方式中，提供根据本发明的方法，其中测定至少两种miRNA的(相对)表达水平，其中所述至少两种miRNA中的第一种为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，且所述至少两种miRNA中的第二种选自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组，该方法还包括将所述至少两种miRNA的表达水平和参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于患心血管疾病的风险中。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述第二种miRNA选自由miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
关于“健康受试者”或“未患有心血管疾病或未处于患心血管疾病的风险中的受试者”是指不具有相对于正常人群的增加的风险的受试者。优选地，这样的受试者不具有超重或高胆固醇，是不吸烟者、非糖尿病患者，且不具有心血管疾病的历史或家族史。
关于“患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者”是指已经被诊断有心血管疾病和/或具有相对于正常人群的患心血管疾病的增加的风险的受试者。
优选地，用包括血小板的样品来测定存在于所述血小板中的至少一种miRNA的表达水平。然而，对于测定其表达水平，样品中的血小板仍然完整和/或miRNA仍然存在于血小板之内是没有必要的。例如，在测定本发明的miRNA的水平之前，血小板可以是，且优选地是裂解的。然后，用在所述样品中测量的miRNA的量来计算存在于所述血小板中的所述miRNA的(相对)水平。使用词语“相对”，因为没有必要测定绝对值(例如，以pg/1×106血小板计算)，但水平优选地是相对于持家基因来测定的，持家基因比如RNU6B，RNU6B是在很多miRNA定量研究中广泛使用的内源性参考RNA。
注意，用血小板相对纯的样品，即富含血小板的血浆样品，本发明已经鉴别了几种miRNA，与在健康个体的血小板中的表达相比，所述几种miRNA在处于心血管疾病的风险中的个体的血小板中被差异表达。由于本发明已经鉴别了在血小板中差异表达的几种miRNA，在根据本发明的方法中，没有必要使用富含血小板的样品。例如，全血样品可用于本发明的方法中以确定个体是否处于患心血管疾病的风险中。
然而，优选避免的是，用于根据本发明的方法的样品的制备诱导了所述血小板和/或所述样品中的miRNA水平的改变。例如，这是假设血样品是在没有抗凝剂下抽取的情况。这样的血样品的处理诱导了血小板的活化和随后的凝血。凝血将导致样品中的miRNA水平的改变。
本文将miRNA的同源物定义成由于共同的祖先而相似的miRNA。DNA序列通常是相似的，不相同的。
本文将miRNA的直系同源物定义成通过物种形成事件而分开的同源核酸分子。例如，直系同源基因是在因为起源于共同的祖先而彼此相似的不同物种中的基因。当然，优选的是，使用来自特定物种的miRNA直系同源物来诊断和/或治疗所述特定物种中的心血管疾病。因此，在人中，当在人的样品中测定miRNA时，优选地测定人的miRNA。
在优选的实施方式中，同源物和/或直系同源物与本发明的miRNA具有至少50％的序列同一性。在更优选的实施方式中，序列同一性为至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，最优选地至少95％。
本文将术语“％序列同一性”定义成在比对序列且任选地引入空位(如果需要)以实现最大的百分比序列同一性后，核酸序列中与感兴趣的核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分数。用于比对的方法和计算机程序是本领域所熟知的。
由于测定了血小板中的miRNA的表达水平，优选使用包括血小板的样品，例如血样品或富含血小板的血浆样品。因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中使用全血样品，优选地富含血小板的血样品。关于全血样品是指静脉或动脉血样品，优选地在开放系统(即，没有真空)中抽取的且优选地具有抗凝剂。已知真空对血细胞加压且可导致血小板的活化和随后miRNA水平在样品中的改变。抗凝剂的使用防止和/或减少了血的凝固，且因此防止和/或减少了凝血引起的miRNA水平在样品中的变化。在甚至更优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述样品是富含血小板的血浆样品。
因此，本文将富含血小板的血浆定义成具有基线(即正常血浆中的血小板浓度)以上的血小板浓度的血浆。通过离心来制备富含血小板的血浆的方法是技术人员已知的。富含血小板的血浆还可以包含增加的白细胞浓度或可以不包含增加的白细胞浓度。然而，在根据本发明的方法中，优选使用具有低数目的白细胞的富含血小板的血浆样品。优选地，相对于所述样品中的血小板的量，所述样品包括5％以下，更优选地2.5％以下，更优选地1％以下，甚至更优选地0.5％以下，最优选地0.4％以下的白细胞。
根据本发明，从在CAD患者与对照中差异表达的miRNA中，在CAD患者中，hsa-miR-1280是下调的，且hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545：9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*和hsa-miR-624*是上调的。由于测试结果的可变性和个体之间的差异，本文定义的是，认为1.5倍的下调或上调是显著的且预测个体是否处于患心血管疾病的风险中。
因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，包括测定所述样品中的所述至少一种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述至少一种miRNA的表达水平为至少1.5倍的增加，其中所述至少一种miRNA包括选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的miRNA。在更优选的实施方式中，测定所述表达水平是否为至少1.55，优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加。
在另一个优选实施方式中，提供根据本发明的方法，包括测定所述样品中的所述至少一种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述至少一种miRNA的表达水平为至少1.5倍的减少，其中所述miRNA为hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物。在更优选的实施方式中，测定所述表达水平是否为至少1.55，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的减少。
在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，包括测定所述样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，且测定所述样品中的第二种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述第二种miRNA的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，其中所述第二种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述第二种miRNA选自由miR-624*和miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述第二种miRNA为miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，包括测定所述样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，测定所述样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，且测定所述样品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加。
在另一优选实施方式中，提供根据本发明的方法，包括测定所述样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，且测定所述样品中的第二种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述第二种miRNA的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的增加，其中所述第二种miRNA选自由miR-545：9.1、hsa-miR-340*和miR-454*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述第二种miRNA选自由hsa-miR-340*和miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
在优选的实施方式中，本发明还提供根据本发明的方法，还包括测定所述样品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表达水平为至少1.15倍，优选地至少1.2，更优选地至少1.25，更优选地至少1.3，更优选地至少1.4，更优选地至少1.5，更优选地至少1.60，更优选地至少1.65，更优选地至少1.75，最优选地至少1.85倍的减少。
miRNA不仅仅是个体是否处于患心血管疾病的风险中的指示物。如前所述的，miRNA能够通过抑制mRNA的翻译或通过促进mRNA的降解来抑制蛋白质合成。因此，miRNA是正常发育和生理学的有效调节物。miRNA表达的增加将导致其靶的蛋白质合成的抑制。在处于患心血管疾病的风险中的受试者中，观察到hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545：9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*和/或hsa-miR-624*的表达的增加。因此，对于治疗、减弱和或预防心血管疾病，例如通过增加这些miRNA中的任一个的靶的量、表达和/或活性抵消这些增加的miRNA的作用是有用的，。例如，增加miRNA靶的量、表达和/或活性可以通过抑制所述miRNA的量、活性和/或表达，或通过提供靶本身来完成。
因此，在一个实施方式中，本发明提供用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少一种miRNA的靶的量、表达和/或活性。优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。更优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或miR-624*，或hsa-miR-340*或miR-624*的同源物或直系同源物。在甚至更优选的实施方式中，所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。
本发明提供了这样的见解：增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少两种，更优选地至少三种，更优选地至少四种，或更多种miRNA的一种或多种靶的量、表达和/或活性在治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病中是有用的。特别地，对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病，选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少两种miRNA的组合是特别有用的。根据本发明，增加hsa-miR-340*、miR-624*和miR-454*，或这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物的一种或多种靶的量、表达和/或活性在治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病上是最有效的。
因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，该方法还包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由miR-624*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的靶的量、表达和/或活性。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述又一种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在甚至更优选的实施方式中，所述又一种miRNA为miR-454*或miR-454的同源物或直系同源物。
在最优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述又一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的miR-454的靶或miR-454的同源物或直系同源物的靶的量、表达和/或活性。
在另一个优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的靶的量、表达和/或活性。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述又一种miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
在优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中所述miRNA的靶的量、表达和/或活性的所述增加是通过所述血小板和/或所述巨核细胞中的所述miRNA的表达或活性的抑制而介导的。
还提供了用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少三种miRNA的一个靶或多个靶的量、表达和/或活性。优选地，所述至少三种miRNA选自由miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。最优选地，所述至少三种miRNA的第一种为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述至少三种miRNA的第二种为miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物，且所述至少三种miRNA的第三种为hsa-miR-340*或miR-340*的同源物或直系同源物。
在优选的实施方式中，所述miRNA的靶的量、表达和/或活性的所述增加是通过抑制选自由所述血小板中和/或所述巨核细胞中的miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少一种miRNA的表达或活性而介导的。优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。更优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
优选地，所述miRNA的表达和/或活性的所述抑制是通过miRNA反义分子。miRNA反义分子是与miRNA具有高百分数的互补序列同一性的核酸分子。高互补序列同一性允许与所述miRNA的特异性结合。关于互补是指miRNA和miRNA反义分子之间的嘌呤和嘧啶的特异性配对。优选地，所述miRNA反义分子与本发明的miRNA的所述互补序列同一性为至少50％。在更优选的实施方式中，该序列同一性为至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，最优选地至少95％。
miRNA表达减少，比如例如在患有CAD的受试者中观察到的hsa-miR-1280的减少，将导致miRNA靶的表达增加。因此，miRNA表达减少的作用可以通过miRNA靶的量、表达和/或活性的减少来抵消。例如，这可通过增加所述miRNA的量、表达和/或活性来完成。
因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，还包括减少患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板中和/或巨核细胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的靶的量、表达和/或活性。优选地，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表达和/或活性的所述减少是通过增加所述血小板中和/或所述巨核细胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的量、表达和/或活性而介导的。在更优选的实施方式中，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表达和/或活性的所述减少是通过向所述受试者提供hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物而介导的。
因此，在另一个优选的实施方式中，提供用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，包括减少患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板中和/或巨核细胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的靶的量、表达和/或活性。优选地，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表达和/或活性的所述减少是通过增加所述血小板中和/或所述巨核细胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的量、表达和/或活性而介导的。在更优选的实施方式中，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表达和/或活性的所述减少是通过向所述受试者提供hsa-miR-1280和/或同源物和/或直系同源物和/或类似物而介导的。
在优选的实施方式中，提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，其中miRNA的所述同源物、直系同源物和/或类似物与所述miRNA具有至少50％的序列同一性。在更优选的实施方式中，序列同一性为至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％。
本文将miRNA的类似物定义成包括被修饰以例如增加核酸酶抵抗力，和/或增加反义核甘酸对靶序列的亲和力的的一个或多个残基的人工修饰的miRNA。
在优选的实施方式中，类似物包括修饰的骨架。这样的骨架的实例由吗啉代骨架；氨基甲酸酯骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；及酰胺骨架来提供。
还优选的是，骨架中的残基之间的连接不包括磷原子，比如通过短链烷基或环烷基的核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基的核苷间连接，或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间连接所形成的连接。
优选的类似物包括具有修饰的聚酰胺骨架的肽核酸(PNA)。根据碱基对识别，基于PNA的分子为DNA分子的真实模拟物。PNA的骨架由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。可选择的骨架包括一碳延伸的吡咯烷PNA单体。由于PNA分子的骨架包括不带电的磷酸根基团，PNA-RNA杂交体通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂交体更加稳定。
另外优选的骨架包括吗啉代类似物，其中核糖或脱氧核糖被6-元的吗啉环代替。最优选的miRNA类似物或等同物包括磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligomer)(PMO)，其中核糖或脱氧核糖被6-元吗啉环取代，且相邻的吗啉环之间的阴离子磷酸二酯连接被非离子磷酰二胺吗啉代连接代替。
在又另一实施方式中，本发明的miRNA类似物包括磷酸二酯连接中的非桥接氧之一的取代。这种修饰使碱基配对稍微不稳定，但显著增加了对核酸酶降解的抵抗力。优选的核苷酸类似物或等同物包括：硫代磷酸酯；手性的硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；H-磷酸酯；包括3′-亚烷基磷酸酯、5′-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其它烷基磷酸酯；次磷酸酯；包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯(phosphoramidate)；硫羰基磷酰胺酯(thionophosphoramidate)；硫羰基烷基磷酸酯；硫羰基烷基磷酸三酯；硒代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。
本发明另一优选的miRNA类似物包括在2′、3′和/或5′位置处被单取代或双取代的一个或多个糖部分，比如-OH；-F；可以被一个或多个杂原子中断的取代或未取代的线性或支链低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基，-甲氧基，-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧代乙氧基；及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以为吡喃糖或其衍生物，或脱氧吡喃糖或其衍生物，优选地核糖或其衍生物，或脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LockedNucleic Acid)(LNA)，其中2′-碳原子连接到糖环的3′或4′碳原子上，从而形成二环糖部分。优选的LNA包括2′-O，4′-C-亚乙基-桥接的核酸。这些取代使得核苷酸类似物或等同物对抗核糖核酸酶H和核酸酶且增加了对靶RNA的亲和力。
在另一实施方式中，本发明的miRNA类似物包括一种或多种碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成碱基和天然碱基，比如本领域已知的或将已知的肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤及嘧啶碱基和嘌呤碱基的其它氮杂、脱氮、羟基、卤素、硫代、硫醇、烷基、烯基、炔基、硫代烷基衍生物。
技术人员理解的是，没有必要对反义寡核苷酸中的所有位置进行统一的修饰。此外，多于一种的上述类似物可以被合并到单一的miRNA中或甚至在miRNA内的单一位置中。
因此，本发明提供了这样的见解：存在于血小板中的miRNA的抑制剂在例如治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病中是有用的，所述miRNA在患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者中被过表达。
因此，本发明还提供用作药物的miRNA的抑制剂，所述miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。另一实施方式提供用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的miRNA的抑制剂，所述miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在优选的实施方式中，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在另一更优选的实施方式中，所述miRNA为hsa-miR-340*或miR-624*，或hsa-miR-340*或miR-624*的同源物或直系同源物。
在患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者的血小板中，hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-545：9.1、hsa-miR-451、hsa-miR-454*、hsa-miR-624*都是过表达的。相反，在患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者的血小板中，hsa-miR-1280的表达是较低的。因此，对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病，必须增加hsa-miR-1280的表达或活性。
因此，本发明还提供用作药物的miRNA hsa-miR-1280和/或其同源物、直系同源物和/或类似物，和/或hsa-miR-1280的活化剂。在另外的实施方式中，本发明提供用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的miRNAhsa-miR-1280和/或其同源物、直系同源物和/或类似物，和/或hsa-miR-1280的活化剂。
还提供了包括根据本发明的至少一种抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在更优选的实施方式中，药物组合物包括至少一种miRNA的抑制剂，所述miRNA为hsa-miR-340*或其同源物或直系同源物。在更优选的实施方式中，药物组合物包括至少一种另外的miRNA的抑制剂，所述miRNA为miR-624*或miR-454*，或miR-624*或miR-454*的同源物或直系同源物。在最优选的实施方式中，药物组合物包括至少一种miR-624*的抑制剂或miR-624*的同源物或直系同源物的抑制剂；至少一种hsa-miR-340*的抑制剂或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的抑制剂；及至少一种miR-454*的抑制剂或miR-454*的同源物或直系同源物的抑制剂。
在另一个更优选的实施方式中，药物组合物包括至少一种miRNA的抑制剂，所述miRNA为miR-624*或其同源物或直系同源物。在更优选的实施方式中，药物组合物包括至少一种另外的miRNA的抑制剂，所述miRNA为hsa-miR-340*或其同源物或直系同源物。
根据本发明的这样的药物组合物对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病是特别有用的。因此，本发明提供根据本发明用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的药物组合物。
术语“心血管疾病”包括影响心脏、动脉和静脉的种类广泛的疾病。根据本发明，心血管疾病优选地伴有动脉变窄或是动脉变窄的结果。这种变窄可以但不一定严重到使得动脉完全被堵塞。动脉的类型可以是外周动脉(例如，臂或腿的外周动脉疾病、中风、肾衰竭或血管性痴呆)，还可以是冠状动脉(例如，导致短暂性脑缺血发作、急性冠脉综合征或稳定性心绞痛)。
因此，在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法、根据本发明的抑制剂、药物组合物和/或根据本发明的miRNA，其中所述心血管疾病选自由动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、短暂性脑缺血发作、中风、周围性血管疾病、急性冠脉综合征、稳定性心绞痛、血管性痴呆和肾衰竭组成的组。
由于本发明已经提供了如下见解：选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451和hsa-miR-1280组成的组的miRNA的血小板表达预测受试者是否处于患心血管疾病的风险中，本发明还提供用于测定血小板miRNA的表达的试剂盒。
因此，在一个实施方式中，本发明提供多个部件的试剂盒(kit of parts)，包括能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少一种miRNA的至少一种分子，及在根据本发明的方法中使用所述试剂盒的说明书页。所述试剂盒可以任选地包括一种或多种对照，和/或一个或多个标准品。在优选的实施方式中，所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或miR-624*，或hsa-miR-340*或miR-624*的同源物、直系同源物或类似物。
在优选的实施方式中，所述试剂盒包括能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少两种miRNA的至少两种分子。在更优选的实施方式中，所述试剂盒包括能够特异性地结合3种miRNA的至少3种分子，更优选地能够特异性地结合4种miRNA的至少4种分子，更优选地能够特异性地结合5种miRNA的至少5种分子，更优选地能够特异性地结合6种miRNA的至少6种分子，最优选地能够特异性地结合7种miRNA的至少7种分子，所述miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组。当然，理解的是，至少两种分子一起结合本发明的两种miRNA，且每一种分子优选地仅结合一种miRNA。这对于至少3种，至少4种，至少5种，至少6种及至少7种分子也同样适用。
在优选的实施方式中，提供根据本发明的多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合至少两种miRNA的至少两种分子，其中所述至少两种分子中的第一种为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且所述至少两种分子中的第二种为miR-624*、miR-454*，或miR-624*或miR-454*的同源物或直系同源物。
在最优选的实施方式中，提供根据本发明的多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子，能够特异性地结合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子，及能够特异性地结合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子。
在另一个实施方式中，提供多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少两种miRNA的至少两种分子。甚至更优选的是，所述试剂盒包括能够特异性地结合选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少三种miRNA的至少三种分子。
在仍另一个实施方式中，提供试多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少四种miRNA的至少四种分子。在更优选的实施方式中，所述试剂盒包括能够特异性地结合5种miRNA的至少5种分子，更优选地能够特异性地结合6种miRNA的至少6种分子，最优选地能够特异性地结合7种miRNA的至少7种分子，所述miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组。
因此，对于测定个体是否患有心血管疾病或是否处于患心血管疾病的风险中，上述试剂盒是有用的。因此，在一个实施方式中，提供根据本发明的试剂盒用于测定个体是否患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的用途。
可以使用特异性地结合到本发明的miRNA上的各种分子。优选地，所述至少一种分子为核酸分子或人造的核酸分子。核酸分子由单体核苷酸的链组成。为了增加例如稳定性，人工修饰核酸分子。按照定义，这样人工修饰的核酸分子是类似物。类似物包括例如肽核酸，及包括至少一种修饰的核苷酸和/或非天然核苷酸诸如例如肌苷、LNA、吗啉代和2′-O-甲基RNA的核酸序列。
技术人员易于鉴别用于根据本发明的试剂盒的能够特异性地结合本发明的miRNA的核酸分子。能够特异性地结合本发明的至少一种miRNA的核酸分子优选地包括与所述至少一种miRNA具有至少85％的互补序列同一性的至少7个核苷酸的序列。在更优选的实施方式中，所述核酸分子包括至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或至少24个核苷酸，且与所述至少一种miRNA具有至少85％的互补序列同一性。在更优选的实施方式中，所述互补序列同一性为至少90％，至少95％，或100％。如上所述的，互补是指miRNA和miRNA反义分子之间的嘌呤和嘧啶的特异性配对。因此，关于互补序列同一性是指miRNA的核酸分子和反义核酸分子之间的百分比序列同一性。
这样的试剂盒可以以阵列的形式提供。阵列对于高通量筛选是特别有用的。因此，在仍另一个实施方式中，本发明提供包括固定在平台上的分子的阵列，其中所述分子中的至少一种或几种能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少四种miRNA上。在另一个实施方式中，本发明提供包括固定在平台上的分子的阵列，其中所述分子中的至少一种或几种能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少三种，优选地至少四种，更优选地至少五种，更优选地至少六种miRNA上。
在优选的实施方式中，提供根据本发明的阵列，其中至少部分的所述分子能够特异性地结合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物上，至少部分的所述分子能够特异性地结合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物上，且至少部分的所述分子能够特异性地结合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物上。
在另一个实施方式中，本发明提供包括固定在平台上的分子的阵列，其中所述分子中的至少一种或几种能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-454*、miR-624*及其同源物和直系同源物组成的组的至少两种，优选地至少三种miRNA上。在仍另一个实施方式中，本发明提供包括固定在平台上的分子的阵列，其中所述分子中的至少一种或几种能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-454*、miR-624*及其同源物和直系同源物组成的组的至少两种miRNA，优选地至少三种miRNA上。在优选的实施方式中，所述至少两种miRNA中的第一种为。例如，合成能够结合所述miRNA中的几种，优选地至少四种的一种分子是可能的。例如，这可以通过合成包括与至少一种miRNA具有至少85％的互补序列同一性的至少7个核苷酸的序列，还包括与至少一种其它miRNA具有至少85％的互补序列同一性的至少7个核苷酸的序列等等的核酸分子来实现。合成各自包括与至少一个miRNA具有至少85％的互补序列同一性的至少7个核苷酸的序列的几种分子也是可能的。优选地，不同的分子与本发明的又一种miRNA具有至少85％的互补序列同一性。在更优选的实施方式中，所述核酸分子包括至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或至少24个核苷酸，且与所述至少一种miRNA或所述至少至少一种其它miRNA具有至少85％的互补序列同一性。在更优选的实施方式中，所述互补序列同一性为至少90％，至少95％，或100％。
根据本发明的阵列优选地包括其中每一个选择性结合miRNA的分子。阵列优选地附有在根据本发明的方法中使用所述阵列的说明书页。如前所述的，可以使用特异性结合到本发明的不同miRNA的各种分子。优选地，核酸分子或类似物被用于根据本发明的阵列中。
在另一优选的实施方式中，存在于所述阵列上的多个分子能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少5种，更优选地至少6种，更优选地至少7种miRNA上。在另一个优选的实施方式中，存在于所述阵列上的多个分子能够特异性地结合到选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少4种，更优选地至少5种，更优选地至少6种miRNA上。
在一个实施方式中，本发明提供根据本发明的阵列在根据本发明的方法中优选地用于测定个体是否患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的用途。
在本发明之前，用几个其它风险因素来测定个体是否患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中。这些因素包括但不限于血压、血胆固醇水平、血糖水平、吸烟习惯、年龄、在所述受试者中的血清C-反应蛋白水平、家族史、BMI和/或腰围。除了根据本发明的方法外，这些风险因素仍然是有用的。
因此，本发明提供根据本发明的方法，还包括将血压、血胆固醇水平、血糖水平、吸烟习惯、年龄、在所述受试者中的血清C-反应蛋白水平、家族史、BMI和/或腰围考虑进来，用于测定心血管疾病的风险。技术人员知道这些参数的参考值及与异常值相关的风险。
可以通过本领域已知的任何方法来测定miRNA水平。技术人员能够选择最适合特定情况的方法。在优选的实施方式中，提供根据本发明的方法，其中用PCR比如定量实时PCR、微阵列、核糖核酸酶保护测定、免疫学方法、原位杂交和/或测序来测定miRNA的水平。这些方法是本领域所熟知的且被公布在试验手册中比如例如Sambrook的“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第三版，2001，冷泉港实验室出版社)中。
由于本发明已经提供了在血小板中的本发明的miRNA的水平指示个体是否患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的见解，本发明还提供用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法。本发明利用本发明的miRNA的表达在患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者中被改变的见解，来测定候选化合物是否能够使所述表达正常化。在本文中，关于“正常化”是指，如果这种表达在患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者中增加，那么候选化合物能够使所述表达减少。反之亦然，如果化合物能够使患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者中减少的miRNA的表达增加，该化合物就能够使miRNA的表达正常化。
因此，本发明提供用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，包括使患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者的第一样品的血小板与候选化合物接触，测定相对于未接触所述候选化合物的所述受试者的第二样品的血小板的至少一种miRNA的表达，所述第一样品的所述血小板的至少一种miRNA的表达水平，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组，其中相对于所述第二样品中的所述至少一种miRNA的表达，所述第一样品中的所述至少一种miRNA的表达指示所述化合物对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病是否有用。优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。更优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。还优选的是所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或miR-340*的同源物或直系同源物。
在优选的实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，所述方法还包括选择和/或分离被鉴别为对治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物。
在优选的实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，该方法还包括测定选自由miR-624*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达水平，所述第二样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达水平是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或或预防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述又一种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述又一种miRNA为miR-454*。
在最优选的实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述又一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达，所述第二样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在另一优选实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-624*，或has-miR-624*的同源物或直系同源物，该方法还包括测定选自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达，所述第二样品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在更优选的实施方式中，提供根据本发明用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述又一种miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
用本发明的方法来监测抗血小板治疗的效果也是可能的。抗血小板治疗利用了与血小板相互作用以阻止血小板聚集成有害的血块的药物。抗血小板药物包括阿司匹林、噻氯匹定
Figure BDA00002277879900261
氯吡格雷
Figure BDA00002277879900262
替罗非班和埃替非巴肽
Figure BDA00002277879900264
如前所述的，处于患心血管疾病的风险中的个人中的高百分比对阿司匹林治疗的响应不是很好。用根据本发明的方法，识别这样的不响应者且可以转换到其它的药物。
因此，在一个实施方式中，本发明提供用于监测受试者中的抗血小板治疗效果的方法，该方法包括测定相对于受试者的第二样品的至少一种miRNA的表达水平，所述受试者的第一样品的所述至少一种miRNA的表达水平，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组，其中相对于所述第一样品的所述至少一种miRNA的表达水平，所述第二样品的所述至少一种miRNA的表达水平是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在采集所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。更优选地，所述至少一种miRNA选自由miR-545：9.1、miR-624*、miR-454*及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在优选的实施方式中，提供根据本发明用于监测抗血小板治疗的效果的方法，其中所述受试者患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中。
用于根据本发明的监测抗血小板治疗的效果的方法的样品优选地包含血小板。然而，对于测定其表达水平，样品中的血小板仍然完整和/或miRNA仍然存在于血小板之内是没有必要的。例如，在根据本发明的方法中，可以使用全血样品或富含血小板的血浆样品。
在优选的实施方式中，提供用于监测受试者中的抗血小板治疗的效果的方法，其中所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，该方法还包括测定选自由miR-624*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达，所述第二样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在更优选的实施方式中，提供用于监测受试者中的抗血小板治疗的效果的方法，其中所述又一种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。在更优选的实施方式中，所述又一种miRNA为miR-454*或其同源物或直系同源物。
在最优选的实施方式中，提供用于监测受试者中的抗血小板治疗的效果的方法，其中所述又一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达水平，其中相对于所述第一样品中的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达，所述第二样品中的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在另外的优选实施方式中，提供用于监测受试者中的抗血小板治疗的效果的方法，其中所述至少一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，该方法还包括测定选自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545：9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达，所述第二样品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
在更优选的实施方式中，提供用于监测受试者中的抗血小板治疗的效果的方法，其中所述又一种miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中的任一个的同源物和直系同源物组成的组。
本发明还通过以下非限制性实例来阐述。实例不以任何的方式限制本发明的范围。
附图说明
图1.24位受试者的表达特征的监督分层聚类分析(supervisedhierarchical clustering analysis)的热图(heat map)(在x-轴上标明样品)。在图的上方将受试者标记成对照(灰色)或病例(黑色)。以相同的顺序将所描述的214个差异表达的miRNA(调整的P＜0.05)的名称列出在表II中。色标灰色等级条(colour key grey-scale bar)表示标准化的miRNA表达水平(深灰色表示相对较低的表达；浅灰色表示相对较高的表达)。
图2.CAD患者和对照受试者的血小板中7种候选miRNA的表达特征。每一个图的左边两个条表示12位健康对照和12位CAD患者的平均miRNA表达，如通过miRNA阵列所测定的。通过实时PCR对相同的数据集进行确认(右边的两个条)。数据以平均值±SEM来表示且*表示与健康对照相比p＜0.05。
图3.CAD患者和对照受试者的血小板中6种候选miRNA的表达特征。每一个图的左边的两个条表示miRNA阵列群组(cohort)的平均miRNA表达(12位对照和12位患者)。通过实时PCR对两个独立的群组进行确认(右边的四个条)。数据以平均值±SEM来表示且*表示与健康对照相比p＜0.05。
实施例
实施例1
设计和方法
研究群体
为了产生具有CAD遗传易感性的研究群体5，我们选择了一组在年轻时患有CAD(早发CAD)且具有早发心血管疾病(CVD)的阳性家族史的12位白人男性患者。这些患者具有CAD持续风险的“极端(extreme-end)”的表型。因此，这个组对于考察血小板特异性的miRNA在CAD中的作用是理想的。患者选自我们的阿姆斯特丹的学术医疗中心(AMC)的门诊诊所，所述门诊诊所专注于早发CAD。对照组由12位健康的白人男性志愿者组成，所述志愿者是通过广告招募的。这个对照组不具有CVD的历史或阳性家族史且不允许使用任何药物。该研究遵守赫尔辛基宣言，研究方案得到了阿姆斯特丹的AMC的医学伦理委员会的批准，并得到了所有受试者的书面知情同意。
定义
早发CAD被定义成在51岁年龄之前的心脏事件。早发CVD的阳性家族史被定义成一个或多个1级家族成员或两个或多个2级家族成员患有早发CVD(男性＜51岁且女性＜56岁)。CAD被定义成极性心肌梗塞(AMI)或稳定性心绞痛(SAP)。AMI是通过症状或心电图变化被临床诊断的，且通过心肌坏死的标志物的升高的血浆水平来证实。SAP是通过症状被临床诊断的且通过显著的冠状动脉狭窄来证实，如通过冠状造影所显示的。以如下的方式定义风险因素：高血压，已知采取高血压治疗；糖尿病，已知采取糖尿病治疗；肥胖，体重指数(BMI)＞30kg/m2；高胆固醇血症，已知采取高胆固醇血症治疗。
外周血收集与血小板分离
用规格19(19-gauge)的针，从肘前静脉中无血瘀地抽取非空腹静脉血样品。将血收集在5个柠檬酸三钠管(每一个5mL，包含0.5mL 0.105M柠檬酸三钠，BD Vacutainer)中，丢弃第一个。在刚刚取血之后，使样品离心(180g，15分钟，室温，不制动)，以得到富含血小板的血浆(PRP)。用聚丙烯移液管将PRP小心地转移到塑料管中，留下至少25％的PRP，以避免白细胞污染。将一份酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)缓冲液(0.085M柠檬酸三钠，0.11M葡萄糖，0.071M柠檬酸)添加到5份的PRP中，且然后使PRP离心(800g，20分钟，室温，不制动)。丢弃含血小板较少的血浆，且将血小板沉淀(pellet)小心地重新悬浮在台氏缓冲液(Tyrode buffer)(136.9mM NaCl，2.61mM KCl，11.9mM NaHCO3，5.55mM葡萄糖，2mM EDTA，pH 6.5)中。使血小板悬浮液离心(800g，20分钟，室温，不制动)。丢弃上清液且将血小板沉淀重新悬浮在50μl的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中且在分离RNA之前在-80℃下存储。通过荧光激活细胞分选术(FACS)来考察分离的血小板的污染，使用抗CD45-APC(BDBiosciences)、CD235a-FITC(DAKO)和CD61-PE(BD Biosciences)的单克隆抗体以分别鉴别白细胞、红细胞和血小板。分离的血小板的纯度为99.72％。
RNA提取及miRNA表达分析
基本上根据生产商用于液体样品的方案，用mirVana PARIS试剂盒(Ambion，Inc)来从血小板中提取总RNA。改进该方案，以用等体积的酸-苯酚氯仿来提取样品两次，且在最后的洗涤步骤后和洗脱之前，使柱子干燥3分钟。将样品从50μl浓缩到12μl，其中5μl被用于阵列中。
在ServiceXS(Leiden，The Netherlands)，用Illumina Human v2MicroRNA BeadArray根据生产商的建议(Illumina，Inc.，San Diego，CA)来获得MiRNA的表达特征。使用统计软件包R(版本2.9.0)中的微球阵列包(beadarray package)(版本1.12.1)，预处理、概括、log转换及分位数标准化(quantile normalized)原始数据。使用limma包(版本2.18.3)，用调节的(moderated)t检验来评估差异表达。如果通过用Benjamini和Hochberg的方法对于多重检验调整的P值小于0.05，认为MiRNA显著地差异表达。通过样品的分层聚类(欧几里得距离，全联(complete linkage))使差异表达的miRNA(调整的p＜0.05)可视化。对于详细信息，参见网上的补充资料。
通过定量实时聚合酶链反应的表达分析
为了验证微阵列分析，选择在患者和对照之间差异表达的miRNA用于实时PCR。将来自RNA分离的洗脱液的8μl的固定体积用作逆转录反应中的输入。用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)来使输入RNA逆转录。在LightCycler480系统II(Roche)上，用High Resolution Melting Master(Roche)来进行实时PCR。用LinRegPCR定量PCR数据分析软件(版本11.3.3)来分析数据6。计算N0值后，将数据标准化成内源性对照RNU6B(Applied Biosystems)。对于详细信息，参见网上的补充资料。
结果
临床特征
所考察的受试者的临床特征显示在表1中。我们知道没有受试者患有糖尿病和肥胖症。
外周血小板的MiRNA特征(signature)
微阵列分析鉴别在血小板中检测到的893个成熟的人的miRNA中的214个在具有CAD的患者和健康对照之间被差异表达(调整的p＜0.05)。这214个miRNA被用于监督分层聚类分析中，所述分析基于受试者的miRNA表达特征的相似性将受试者聚类(参见图1)。这种聚类分析显示，一小组(a subset of)血小板衍生的miRNA能够区分CAD患者和健康对照。在这214个差异表达的miRNA中，与对照相比，9个miRNA在患者中被上调至少1.5倍。而且，与对照相比，4个miRNA在患者中被被下调至少1.5倍。为了确认我们的数据的稳健性，我们还在没有上述的异常样品的情况下分析了我们的数据。不管我们省略了异常值的哪一种组合，6种miRNA保持显著上调且1种miRNA保持显著下调。上调的miRNA为miR-340*、miR-615-5p、miR-545：9.1、miR-451、miR-454*和miR-624*，且下调的miRNA为miR-1280(参见图2)。
通过实时PCR确认miRNA阵列数据
在同一群体中，用实时PCR来确认6个上调miRNA和1个下调miRNA的阵列数据。由于与其它样品相比RNU6B(我们的内源性对照)的表达水平始终在范围之外，从分析中排除两位对照受试者。所有的6个上调的miRNA也被实时PCR证明为上调的，尽管通过PCR，只有三个是统计学显著的(miR-545：9.1，miR-624*和miR-454*；p＜0.05)。未能证实单一下调的miRNA(参见图2)。现在使PCR的条件和样品大小最佳化，以证实其它3个上调的miRNA和miR-1280。
实施例2
设计和方法
研究群体
确议群组
为了证实微阵列数据的发现，在两个独立的确认群组中，通过qRT-PCR在分离的血小板中测量选定的miRNA的表达水平。
确认群组I
确认群组I由40位早发男性CAD受试者和40位年龄相一致的男性对照组成。这些对照也是通过广告招募的。用相同的入选和排除及匹配标准，以与用于miRNA阵列分析的群体同样的方式选择参与者。在CAD诊断后的多年来完成数据收集。入选发生在2009年12月到2010年6月。两次邀请27位对照受试者参与本研究，以能够在药物使用前和药物使用后评估miRNA表达。就此而言，要求他们服用乙酰水杨酸100mg每日一次且服用辛伐他汀40mg每日一次，持续8周。
确认群组II
确认群组II由具有早发CAD的高患病率的4个家族的成员；27位动脉粥样硬化患者和40位健康家族成员组成。这4个家族在门诊诊所筛查。没有CAD症状或抱怨的家族成员经历冠状CT扫描，以评估亚临床CAD。病例被定义为具有CAD的历史或冠状动脉钙化(coronary calcium)得分＞80的百位分数。对照被定义成没有任何CAD症状或抱怨且冠状动脉钙化得分＜80的百位分数。
定义
早发CAD被定义成男性在51岁年龄之前及女性在56岁之前的心脏事件。早发心血管疾病(CVD)的阳性家族史被定义成一个或多个1级家族成员或两个或多个2级家族成员患有早发CVD。CAD被定义成急性心肌梗塞(AMI)或稳定性心绞痛。通过症状或心电图变化临床诊断出AMI且通过心肌坏死的标志物的增加的血浆水平来证实，并通过如根据冠状造影单一血管疾病所显示的冠状动脉阻塞来证实。通过症状临床诊断出稳定性心绞痛且通过如根据冠状造影所显示的在至少2个血管中的显著的冠状动脉狭窄(＞70％)来证实。以如下的方式定义风险因素：高血压：采取高血压治疗或在半小时的Dinamap测量中3次独立测量的未治疗的收缩压＞140mmHg或舒张压＞90mmHg；超重：BMI＞25kg/m2；高胆固醇血症：总的未治疗的胆固醇水平＞8mmol/l或在事件之前采取高胆固醇血症治疗；吸烟：目前吸烟；糖尿病：2次独立测量的空腹葡萄糖＞6.9mmol/l或非空腹＞11.1mmol/l或已知采取糖尿病治疗。
所有上述群组遵守赫尔辛基宣言。研究方案得到了阿姆斯特丹的AMC的医学伦理委员会的批准，且得到了所有受试者的书面知情同意。
外周血收集与血小板分离
用规格19的针，从肘前静脉中无血瘀地抽取非空腹静脉血样品。将血收集在5个柠檬酸三钠管中(每一个5ml，含有0.5ml 0.105M柠檬酸三钠，BD Vacutainer)。未用第一个样品来分析。在刚刚取血之后，使样品离心(180g，15分钟，在室温下，不制动)，以得到富含血小板的血浆(PRP)。用聚丙烯移液管，将PRP的上层小心地转移到塑料管中，以避免白细胞污染。将一份酸-柠檬酸盐-葡萄糖(ACD)缓冲液(0.085M柠檬酸三钠，0.11M葡萄糖，0.071M柠檬酸)添加到5份PRP中，且然后使PRP离心(800g，20分钟，在室温下，不制动)。丢弃含血小板较少的血浆，且将血小板沉淀小心地重新悬浮在台氏缓冲液(136.9mM NaCl，2.61mM KCl，11.9mMNaHCO3，5.55mM葡萄糖，2mM EDTA，pH 6.5)中。使血小板悬浮液离心(800g，20分钟，在室温下，不制动)。丢弃上清液且将血小板沉淀重新悬浮在50μl的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中且在分离RNA之前在-80℃下存储。通过荧光激活细胞分选术(FACS)来考察分离的血小板，使用抗CD45(BD Biosciences)、CD235a(DAKO)和CD61(BD Biosciences)的单克隆抗体以鉴别白细胞、红细胞和血小板。通过FACS分析，分离的血小板的纯度为99.72％。
RNA分离
根据生产商用于液体样品的方案，用mirVana PARIS试剂盒(Ambion.Inc.)来分离血小板RNA。改进方案，以用等体积的酸-苯酚氯仿来提取样品两次，且在最后的洗涤步骤后和洗脱之前，使柱子干燥3分钟。将样品从50μl浓缩到12μl，其中5μl被用于如下所述的Illumina阵列中。
通过定量实时PCR的表达分析
为了确认微阵列分析，选择在患者和对照之间差异表达的miRNA以用于实时PCR。将来自RNA分离的洗脱液的8μl的固定体积用作逆转录反应中的输入。用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)或TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)来使输入RNA逆转录。用HighResolution Melting Master(Roche)来进行miR340*、miR451和miR624*的实时PCR。通过TaqMan MicroRNA测定(Applied Biosystem)和LightCycler480probe master(Roche)来进行miR454*、miR545：9.1和miR615-5p的实时PCR。两个实时PCR均在LightCycler480系统II(Roche)上进行。用LinRegPCR定量PCR数据分析软件版本12.3来分析MiR340*、miR451和miR624*。用LinRegPCR定量PCR数据分析软件版本12.5来分析MiR454*和miR545：9.1。至今，还没有确立标准化的方案以标准化且确认miRNA的含量。出于该目的，在计算N0值后，将数据对于血小板计数和miRNA223两者标准化，miRNA 223在所有的受试者中的表达是类似的。使用用于Windows的社会科学统计包(Statistical Package for the Social Sciences，SPSS)版本11.0(SPSS.Chicago IL)，将结果表示成平均值±SEM。由于分布不是正态的，miRNA被log转换。对于所有的分析，认为p值＜0.05表示在统计学上有显著性差异。
结果
候选miRNA的确议
确认群组I
在确认群组I中，通过实时PCR，首先确认通过微阵列分析鉴别的7个差异表达的miRNA。该群组由40位患有早发CAD的选定患者和40位健康匹配对照组成。在阵列分析中观察到的7个miRNA中，与对照相比，2个miRNA(miR340*和miR624*)在患者中被显著上调(图3)。
确认群组II
在首次确认后，我们在第二个，我们的早发CAD门诊诊所的患者的更为通常的组中确认我们的结果。这个群组由4个家族组成，包括27位患者和40位家族成员。在阵列分析中观察到的7个miRNA中，与对照相比，2个miRNA(miR340*和miR624*)在患者中被显著上调(图3)。
药物使用和血小板miRNA表达
为了考察使用药物是否会影响两个候选miRNA(miR340*和miR624*)的miRNA表达水平，在我们服用药物和不服用药物的对照个体中测定这些miRNA的表达，如方法部分所描述的。有趣的是，药物并没有使结果改变。
表1：临床特征
临床特征 患者(n＝12) 对照(n＝12)
收集数据时的年龄(岁，(SD)) 46(6.5) 45(7.0)
CAD开始的年龄(岁，(SD)) 42(7.6) 不适用
目前吸烟(数目；(％)) 1(8) 1(8)
高胆固醇血症 2(17) 0
高血压 2(17) 0
表2：图1中所描述的214个差异表达的miRNA的名称(调整的P＜0.05)1     hsa-miR-659
2     HS_60
3     HS_262.1
4     hsa-miR-299-3p
5     hsa-miR-525-5p
6     hsa-miR-875-5p
7     hsa-miR-578
8     hsa-miR-1248
9     hsa-miR-943
10    solexa-539-2056
11    hsa-miR-181d
12    hsa-miR-665
13    hsa-miR-206
14    hsa-miR-1206
15    hsa-miR-1205
16    hsa-miR-646
17    hsa-miR-367*
18    HS_268
19    HS_177
20    hsa-miR-455-3p
21    hsa-miR-1243
22    HS_265.1
23    hsa-miR-491-3p
24    HS_23
25    HS_106
26    hsa-miR-214*
27    HS_25
28    HS_168
29    hsa-miR-548i
30    hsa-miR-20b*
31    HS_182.1
32    hsa-miR-572
33    hsa-miR-106a：9.1
34    hsa-miR-663
35    hsa-miR-596
36    solexa-15-44487
37    hsa-miR-581
38    HS_141
39    hsa-miR-138-2*
表2，续
40    hsa-miR-583
41    hsa-miR-641
42    hsa-miR-516a-3p，hsa-miR-516b*
43    hsa-miR-647
44    HS_284.1
45    hsa-miR-518d-3p
46    hsa-miR-560：9.1
47    solexa-9578-86
48    hsa-miR-614
49    hsa-miR-548m
50    hsa-miR-1231
51    HS_40
52    hsa-miR-507
53    HS_71.1
54    hsa-miR-146a*
55    hsa-miR-520b，hsa-miR-520c-3p，hsa-miR-520f
56    HS_304_b
57    IIS_267
58    hsa-miR-570
59    hsa-miR-144
60    HS_49
61    hsa-miR-648
62    hsa-miR-526b
63    hsa-miR-634
64    HS_170
65    hsa-miR-1200
66    hsa-miR-147
67    hsa-miR-1269
68    hsa-miR-346
69    hsa-miR-1255b
70    hsa-miR-548c-3p
71    HS_90
72    hsa-miR-1258
73    HS_95
74    hsa-miR-569
75    HS_147
76    hsa-miR-100*
77    hsa-miR-1261
78    hsa-miR-195*
79    HS_79.1
80    hsa-miR-298
81    hsa-miR-488*
表2，续
82     hsa-miR-661
83     HS_273
84     hsa-miR-636
85     hsa-miR-744*
86     HS_15.1
87     hsa-miR-302c
88     hsa-miR-934
89     HS_89
90     HS_9
91     hsa-miR-1207-3p
92     hsa-miR-155*
93     hsa-miR-509-5p
94     hsa-miR-34c-3p
95     hsa-miR-455-5p
96     hsa-miR-551b*
97     hsa-miR-1283
98     solexa-7764-108
99     hsa-miR-429
100    hsa-miR-920
101    hsa-miR-657
102    hsa-miR-34a*
103    hsa-miR-325
104    hsa-miR-211
105    hsa-miR-31*
106    hsa-miR-579
107    hsa-miR-541
108    hsa-miR-1236
109    hsa-miR-1278
110    hsa-miR-1247
111    solexa-3464-254
112    hsa-miR-1298
113    HS_14.1
114    hsa-let-7c*
115    hsa-miR-1245
116    hsa-miR-548g
117    hsa-miR-1300
118    hsa-miR-302c*
119    hsa-let-7f-2*
120    hsa-miR-876-5p
121    hsa-miR-137
122    hsa-miR-1299
123    hsa-miR-300
表2，续
124    HS_99.1
125    hsa-miR-30b*
126    hsa-miR-922
127    HS_176
128    hsa-miR-563
129    hsa-miR-504
130    hsa-miR-9*
131    HS_122.1
132    hsa-miR-1289
133    hsa-miR-571
134    HS_184
135    hsa-miR-1267
136    HS_19
137    hsa-miR-513a-5p
138    hsa-miR-591
139    HS_110
140    hsa-miR-1204
141    IIS_22.1
142    HS_68
143    hsa-miR-25*
144    hsa-miR-516a-5p
145    hsa-miR-218-1*
146    solexa-7534-111
147    hsa-miR-376a*：9.1
148    hsa-miR-376a*
149    hsa-miR-299-5p
150    HS_303_b
151    HS_157
152    hsa-miR-1237
153    hsa-miR-550
154    hsa-miR-187
155    hsa-miR-886-3p
156    HS_194
157    hsa-miR-519b-3p
158    HS_139
159    hsa-miR-1224-3p
160    hsa-miR-551a
161    hsa-miR-371-5p
162    solexa-3022-299
163    HS_113
164    HS_150
165    HS_152
表2，续
166    hsa-miR-10b*
167    HS_86
168    hsa-miR-190
169    solexa-3277-272
170    hsa-miR-557
171    hsa-miR-632
172    hsa-miR-1257
173    solexa-8926-93
174    hsa-miR-1305
175    hsa-miR-193a-3p
176    hsa-miR-362-3p
177    HS_94
178    hsa-miR-374a*
179    hsa-miR-10a*
180    hsa-miR-651
181    hsa-miR-182*
182    HS_65
183    hsa-miR-615-5p
184    HS_275
185    hsa-miR-181a*
186    HS_188
187    hsa-miR-517a
188    hsa-miR-615-3p
189    hsa-miR-17*
190    hsa-miR-505
191    hsa-miR-154
192    hsa-miR-454*
193    HS_303_a
194    hsa-miR-450b-5p
195    hsa-miR-624*
196    hsa-miR-451
197    hsa-miR-576-5p
198    hsa-miR-340*
199    hsa-miR-335*
200    hsa-miR-132
201    hsa-miR-10a
202    hsa-miR-585
203    hsa-miR-545：9.1
204    hsa-miR-199a-5p
205    hsa-miR-106b
206    hsa-miR-1280
207    hsa-miR-328
表2，续
208    hsa-miR-151-5p
209    hsa-miR-23b
210    hsa-miR-20a
211    hsa-miR-126*
212    hsa-miR-374a
213    hsa-miR-151-3p
214    hsa-miR-21
表3：miRNA及miRNA的组合的AUC和p值
Figure BDA00002277879900431
参考文献
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Claims (32)

1.用于确定受试者是否处于患心血管疾病的风险中的方法，所述方法包括用所述受试者的样品来测定至少一种miRNA的(相对)表达水平，所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组，且将所述至少一种miRNA的表达水平和参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于患心血管疾病的风险中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中测定至少两种miRNA的(相对)表达水平，其中所述至少两种miRNA中的第一种为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且所述至少两种miRNA中的第二种选自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组，所述方法还包括将所述至少两种miRNA的表达水平和参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于患心血管疾病的风险中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的(相对)表达水平，且将所述第一种miRNA、第二种miRNA及又一种miRNA的表达水平与参考值进行比较，其中所述比较的结果指示所述个体是否处于心血管疾病的风险中。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用全血样品。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，包括测定所述样品中的所述至少一种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述至少一种miRNA的所述表达水平为至少1.50倍的增加，其中所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，包括测定所述样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.50倍的增加，且测定所述样品中的所述第二种miRNA的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的所述第二种miRNA的表达水平为至少1.50倍的增加。
8.根据权利要求4或5所述的方法，包括测定所述样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.50倍的增加；测定所述样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.50倍的增加；且测定所述样品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表达水平为至少1.50倍的增加。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，还包括测定所述样品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表达水平是否相对于未处于心血管疾病的风险中的健康个体的样品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表达水平为至少1.50倍的减少。
10.用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少一种miRNA的靶的量、表达和/或活性。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，所述方法还包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的选自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的靶的量、表达和/或活性。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述又一种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述又一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括增加患有所述疾病或处于患所述疾病的风险中的受试者的血小板和/或巨核细胞中的miR-454的靶或miR-454的同源物或直系同源物的靶的量、表达和/或活性。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述miRNA的靶的量、表达和/或活性的所述增加是通过抑制所述血小板和/或所述巨核细胞中的所述miRNA的表达或活性而介导的。
15.用作药物的miRNA的抑制剂，所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
16.用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病的miRNA的抑制剂，所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
17.一种药物组合物，包括至少一种根据权利要求15所述的抑制剂和药学上可接受的赋形剂。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述组合物包括至少一种miRNA的抑制剂，其中所述miRNA为hsa-miR-340或hsa-miR-340的同源物或直系同源物。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物还包括至少一种miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的抑制剂。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述组合物还包括至少一种miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的抑制剂。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的药物组合物，用于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病。
22.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，或根据权利要求16所述的抑制剂，或根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述心血管疾病选自由动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、短暂性脑缺血发作、中风、周围性血管疾病、急性冠脉综合征、稳定性心绞痛、血管性痴呆和肾衰竭组成的组。
23.多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合到选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组的至少一种miRNA上的至少一种分子，在根据权利要求1-9中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的说明书页，及任选地一个或多个对照和/或一个或多个标准品。
24.根据权利要求23所述的多个部件的试剂盒，包括能够特异性地结合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子，能够特异性地结合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子，及能够特异性地结合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物的至少一种分子。
25.核酸分子的阵列，包括固定在平台上的分子，其中至少部分的所述分子能够特异性地结合到选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物组成的组的至少四种miRNA上。
26.根据权利要求25所述的阵列，其中至少部分的所述分子能够特异性地结合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物上，至少部分的所述分子能够特异性地结合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物上，且至少部分的所述分子能够特异性地结合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物上。
27.用于鉴别对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病有用的化合物的方法，包括使患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的受试者的第一样品的血小板与候选化合物接触，测定相对于未接触所述候选化合物的所述受试者的第二样品的血小板的至少一种miRNA的表达，所述第一样品的所述血小板的至少一种miRNA的表达水平，所述miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组，其中相对于所述第二样品中的所述至少一种miRNA的表达，所述第一样品中的所述至少一种miRNA的表达指示所述化合物对于治疗、减弱、延迟和/或预防心血管疾病是否有用。
28.用于监测受试者中的抗血小板治疗效果的方法，所述方法包括测定相对于受试者的第二样品的至少一种miRNA的表达水平，所述受试者的第一样品的所述至少一种miRNA的表达水平，所述至少一种miRNA选自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组，其中相对于所述第一样品的所述至少一种miRNA的表达水平，所述第二样品的所述至少一种miRNA的表达水平是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述至少一种miRNA为hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定选自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9.1、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组的又一种miRNA的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达，所述第二样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合所述又一种miRNA的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述又一种miRNA选自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及这些miRNA中任一个的同源物和直系同源物组成的组。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述又一种miRNA为miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法还包括测定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达水平，其中相对于所述第一样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平联合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达，所述第二样品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表达水平和miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表达且联合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表达是所述抗血小板治疗的效果的指示，且其中所述受试者在所述第一样品和所述第二样品之间已经接受了抗血小板的治疗。
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