CN112779331A

CN112779331A - 一种血管痴呆血清外泌体microRNAs标志物及其应用

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Publication number: CN112779331A
Application number: CN202110160750.5A
Authority: CN
Inventors: 蒋国军; 韩雪; 汤磊磊; 邓亚萍; 张玲娣; 任国飞
Original assignee: Zhejiang Xiaoshan Hospital
Current assignee: Zhejiang Xiaoshan Hospital
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2021-02-05
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-02-05
Also published as: CN112779331B

Abstract

本发明涉及一种血管痴呆血清外泌体microRNAs标志物及其应用。本发明研究表明血清外泌体miR‑154‑5p和miR‑1294在血管痴呆患者血清外泌体中异常表达，用于单独或联合诊断血管性痴呆具有很强的特异性和灵敏性。本发明为血管性痴呆的临床诊断提供了一种新的手段，而且具有检测方法简便、快速实用、便于临床开展等优点。

Description

一种血管痴呆血清外泌体microRNAs标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种血管痴呆外泌体标志物及其应用。

背景技术

血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是由于脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征，临床缺乏特异性的诊断分子标志物[1,2]。最新研究表明，血管病变引发认知功能障碍比阿尔兹海默症(AD)更为常见，而且多发于伴有大脑退行性改变的老年患者[3]。血管性痴呆患者在全世界老年人中比例急剧增加，这已然成为一个世界性健康难题，严重影响民众健康，甚至影响到国家经济发展。由于未来人口老龄化问题日益显著，因此加快解析痴呆发生病理机制，发展预防和治疗血管性痴呆的新方法十分必要。

近年来随着免疫学、分子生物学和基因组学技术的发展，寻找和发现可靠的早期诊断生物标记物(biomarker)已经成为目前的一个研究热点。作为解析血管性痴呆发病机制的重要环节，分子标志物的发现将对推进动物、细胞和分子三个层面的功能机制研究快速向临床转化提供了桥梁[4,5]。长期以来，组织活检是很多疾病诊断的金标准[6]。但随着在血管性痴呆的深入研究中，组织活检存在极大的局限性，可行性不强。脑功能成像也由于其特异性等原因，仅能提供非常有限的葡萄糖代谢关联指标，例如无法将诊断明确的血管病变诱发的脑损伤与临床相关性结合，相同程度的脑损伤患者或许临床认知水平表现不同[7]。当深入剖析寻找疾病多种标志物时，研究者们通常会对血清进行分析，血清中包含有丰富的蛋白质、激素、RNA和炎性标志物等[8]。某些参与炎性反应及疾病进程分子事件的基因、蛋白质，都可以被鉴定作为疾病的潜在诊断标志物。因此，采用便于采集的血液临床样本，结合基础医学的最新科研成果，为临床诊疗血管性痴呆提供适合于体外快速、精确诊断和检测的分子标志物是亟待解决的重要科学问题[9-11]。

近年来，外泌液体活检技术受到广泛关注。外泌体是直径为40-100nm的脂质双分子层结构囊泡，它可由不同类型细胞脱落释放，在大多数生物体液如脑脊液、乳汁、尿液和血液中检测到[12]。其特性如下：1.外泌体内包含多种不同分子，包括核酸(如DNA,mRNA,miRNA,非编码RNA)，蛋白质(如细胞骨架蛋白，跨膜蛋白，热休克蛋白)和酶(GAPDH,ATPase,pgk1)，信息量丰富，外泌体miRNA可作为血液分子标志物的实验依据不断增加[13-15]；2.外泌体膜结构可防止内容物被酶类物质降解，具有稳定性[16]；3.外泌体体积小，易通过血脑屏障[17]。如此非入侵性取样可以降低活检的危险，而且鉴于其高灵敏度和准确性，利于疾病的早期发现。

期刊文献(张宣,吴红彦,李海龙,等.microRNA表达对血管性痴呆的影响[J].中国实验方剂学杂志,2016(14期):227-230.)综述了VaD相关microRNA的研究进展，同时对microRNA用于血管性痴呆患者早期诊断与治疗进行了展望。然而目前未见血清外泌体microRNA miR-154-5p和miR-1294诊断VaD的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血管痴呆血清外泌体microRNAs标志物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂在制备血管性痴呆诊断产品中的应用。

作为本发明的一个优选例，检测样品为血清外泌体。

作为本发明的另一优选例，所述检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂为特异性识别或扩增miR-154-5p和/或miR-1294的试剂。

作为本发明的另一优选例，所述检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂为miR-154-5p和/或miR-1294的特异性探针或引物。

作为本发明的另一优选例，所述产品为试剂盒或生物芯片。

作为本发明的另一优选例，所述试剂盒还包括：特异性检测内参基因的检测试剂。

更优选地，所述特异性检测内参基因的检测试剂是针对人U6 SnRNA的逆转录引物、扩增引物和探针。

作为本发明的另一优选例，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书。

本文中，所述miR-154-5p参见HGNC ID：31541，所述miR-1294参见HGNC ID：35287。

本发明优点在于：

1、本发明提供了血管痴呆血清外泌体标志物miR-154-5p和miR-1294，miR-154-5p诊断准确度为0.906，灵敏度1.00，特异度0.846，miR-1294诊断准确度为0.871，灵敏度1.00，特异度0.846，二者联合诊断的准确度为0.872，灵敏度1.00，特异度0.846。目前临床缺乏特异性的VaD诊断分子标志物，本发明为VaD诊断提供了准确可靠、简单可行的诊断策略。

2、本发明的标志物为血清外泌体标志物，具有检测方法简便、快速实用、便于临床开展等优点。

附图说明

图1：外泌体的透射电镜图。

图2：外泌体粒径分布图谱。

图3：差异表达miRNA饼图。

图4：KEGG分析差异表达miRNA的靶点。

图5：差异表达miRNA热图。

图6：差异表达miRNA进行RT-PCR验证。

图7：miRNA-154-5p和miRNA-1294单独或联合诊断VaD的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件。

实施例1

一、实验方法

1.血液样本收集及处理

受试者为浙江萧山医院收治的血管痴呆患者，并招募年龄匹配、无脑损伤、无精神及神经系统疾病的健康志愿者作为对照。所有参与诊断工作的医师具有执业医师资格并有10年以上神经内科从业经验，熟练掌握美国精神医学会诊断标准DSM-IV关于血管痴呆的诊断标准，熟练使用缺血指数量表(Hachinski)，采用痴呆评定表(CDR)评定患者痴呆程度，采用简易精神量表(MMSE)评估患者精神状态。严重心、肝、肾、内分泌疾病作为排除标准。所有患者在纳入之前都给出了书面知情同意书，并且研究方案已由浙江萧山医院伦理委员会批准。

从每位受试者收集5ml外周血，样本在室温下静置1h，然后在3000g离心10min获得血清，将血清冻存于-80℃冰箱用于后续检测分析。

2.血清外泌体分离

将2ml血清用18ml PBS进行稀释，充分混合后，用0.22μm的滤膜进行过滤，低温超速离心10，0000g，12h，然后弃去上清；沉淀物用25ml PBS进行稀释，再次超速离心10，0000g，2h，弃去上清，得到沉淀物即为外泌体。

3.透射电镜观察外泌体的形态

将外泌体重悬于20-30μl PBS中，吸取10μl样本滴加于铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，吸取2％的醋酸双氧铀10μl再次滴于铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，20-25℃环境下自然晾干；使用TECNAI透射电镜在80KV下观察外泌体形态。

4.外泌体粒径检测

将外泌体重悬于20-30μl PBS中，使用Zataview马尔文粒径检测仪检测外泌体的粒径。

5.外泌体中RNA提取及测序

使用荷兰QIAGEN公司的试剂盒对外泌体中片段长度小于200nt RNA进行抽提，提取步骤严格按照试剂盒说明书进行。提取好的RNA样本干冰运送深圳华大基因有限公司武汉实验中心，进行质检，在保证提取的RNA浓度和纯度合格的情况下，使用BGISEQ-500平台进行测序。

6.外泌体中miRNA定量分析

6.1外泌体中RNA定量及逆转录

提取到的外泌体使用荷兰QIAGEN公司的miRNeasy Mini Kit进行RNA抽提，操作按照说明书执行，RNA定量使用Qubit微量核酸定量仪。外泌体RNA按照QIAGEN加尾法逆转录试剂盒操作步骤进行逆转录得到cDNA。其中，逆转录反应体系为：5×miScript HiFlex/HiSpec Buffer 4μl,10×miScript Nucleics Mix 2μl,ddH₂O 2μl,miScript ReverseTranscriptase Mix 2μl,RNA 10μl。PCR反应程序为37℃60min，95℃5min，cDNA产物存放于-80℃。

6.2 RT-PCR荧光定量分析

使用SYBR Green法进行RT-PCR定量RNA的表达水平，RNA的表达量采用2^-ΔΔCt法计算，其中反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master 5μl,引物(10μM)1μl,ddH₂O 3μl,逆转录产物(稀释20倍)1μl。PCR反应程序为95℃5min，95℃10s和60℃30s 40个循环，扩增产物存放于-20℃备用。引物从浙江天科生物有限公司采购，外泌体内参为U6，序列(5’-3’)：

U6：GCAGCACATATACTAAAA(SEQ ID NO:1)；

miRNA-155-5p：GTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGG(SEQ ID NO:2)；

miRNA-154-5p：CCAGCGTGTAGGTTATCCGTG(SEQ ID NO:3)；

miR-132-5p：CCGTGGCTTTCGATTGTTACT(SEQ ID NO:4)；

miR-1294：AGCGTGTGTGAGGTTGGCAT(SEQ ID NO:5)。

二、实验结果

1.外泌体的鉴定

本研究通过参照权威文献结合前期实验条件摸索，构建了以过夜超速离心法提取血清外泌体的方法。采用透射电镜观察外泌体形态，如图1所示，从血清中分离的外泌体为形态均一的经典杯状结构，粒径在30-150nm范围内；纳米粒径跟踪分析进一步验证细胞外囊泡的粒径在100nm左右，大小符合外泌体典型特征(图2)。以上结果表明该纯化法从血清中纯化得到的细胞外囊泡是外泌体。

2.血管痴呆患者血清外泌体microRNAs表达谱生物信息学分析

本研究中所有入组受试者信息见表1(包括验证时使用的样本)。本研究遴选符合纳入、排除标准的7例正常受试者和7例血管痴呆患者的血清样本，纯化外泌体，进行microRNA建库测序。microRNA转录组学分析结果显示：检测到成熟的miRNA共计598种，其中相较于对照组上调的有33％，下调的占19％(图3)。KEGG分析结果表明，这些差异表达的miRNAs靶向的基因主要富集在参与神经元分化的细胞形态发生、有机羟基化合物代谢过程、小GTP酶介导的信号转导等生物过程相关，这提示我们后续可以从此类生物学调控的角度研究差异表达miRNA功能(图4)。严格筛选转录组学中相较于对照组上调或下调两倍以上，且表达量大于等于1000个拷贝的miRNA作为关注对象，其中筛选出四种miRNAs，分别为miRNA-155-5p，miRNA-154-5p，miR-132-5p，miR-1294(图5)，其转录组学中相较于对照组上调，具体上调倍数见表2。扩大临床样本量对这4个miRNA进一步验证，RT-qPCR结果显示，与对照组比较，血管痴呆组血清外泌体中miRNA-154-5p，miR-1294显著上调，而miRNA-155-5p，miR-132-5p变化无统计学意义(图6)。当我们选择logistic回归模型作为我们的二分类数据的预测模型，利用测序的数据作为训练集，然后把我们的验证数据作为测试集(对照组13例，模型组23例)，我们可以看到单独miR-154-5p作为预测因子，ROC曲线下面积为0.906，而miR-1294和miR-1284+miR-154-5p ROC曲线下面积分别为0.871和0.872(图7)，所以我们可以选择miR-154-5p、miR-1294或两者联合作为预测因子。其中miR-154-5p的灵敏度和特异性分别是1.00和0.846，具有很高的诊断价值，可作为血管性痴呆诊断的标志物。

表1入组受试者信息表

表2血管痴呆患者血清外泌体miRNA上调倍数

参考文献：

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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江萧山医院

<120> 一种血管痴呆血清外泌体microRNAs标志物及其应用

<130> /

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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ccgtggcttt cgattgttac t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcgtgtgtg aggttggcat 20

Claims

1.检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂在制备血管性痴呆诊断产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测样品为血清外泌体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂为特异性识别或扩增miR-154-5p和/或miR-1294的试剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测miR-154-5p和/或miR-1294含量的试剂为miR-154-5p和/或miR-1294的特异性探针或引物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或生物芯片。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：特异性检测内参基因的检测试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特异性检测内参基因的检测试剂是针对人U6 SnRNA的逆转录引物、扩增引物和探针。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书。