CN111373052A - 非编码RNA(ncRNA)用于认知障碍的诊断 - Google Patents
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Abstract
本发明描述用于在有风险罹患或发展认知障碍的受试者中诊断认知障碍，包括但不限于阿尔茨海默病的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月5日提交的美国临时申请62/554,427的权益和优先权。
技术领域
本发明涉及人类医学领域，尤其涉及包括阿尔茨海默氏病的认知障碍的诊断。本发明涉及认知障碍(特别是阿尔茨海默氏病)的生物标志物，其由外周体液中的循环非编码RNA(ncRNA)，例如微RNA(miRNA)和长非编码RNA(lncRNA)、或其组合组成，是一种非侵入性的方法，所述方法可以使用此生物标志物用于诊断认知障碍(特别是阿尔茨海默氏病)或用于监测其发展或进程。本发明还涉及使用该生物标志物和患者的外周体液用于诊断目的和/或用于其他人类医学应用的相关试剂盒，方法，方案和信息的可传递形式，所述应用包括临床试验中的患者分层和/或监测治疗策略的有效性。因此，本发明将对患者的生活质量产生重大影响，并对医疗保健系统和经济产生显著影响。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是一种慢性神经退行性疾病，其特征在于认知功能的进行性丧失、以及病理学上脑内淀粉样β肽(Aβ)的细胞外沉积和神经原纤维缠结中超磷酸化tau蛋白的细胞内沉积，与进行性神经元退化有关(Marcus et al.J Neurogenet.2011；25(4):127-33；Gotz et al,Br J Pharmacol.2012；165(5):1246-59)。
AD是痴呆的最常见形式。目前，全球约有4680万人患有AD或其他类型的痴呆症。随着人口老龄化，这一数字到2050年估计将增加到1.315亿(《世界阿尔茨海默病报告》，2015年：http://www.alz.co.uk/research/WorldAlzheimerReport2015.pdf)。因此，在发达国家和新兴国家中，AD正在对受累个人及其家庭造成日益严重的负担以及对医疗和卫生保健资源造成日益显著的经济和社会成本。
目前，尚无治愈AD的方法。现有针对这种疾病的对症治疗，所有都在试图抵消神经递质的紊乱。尽管许多新的潜在的疾病缓解治疗候选物目前正在临床试验中，但尚无一获得批准。从2002年到2012年，有99.6％的AD临床试验失败，其中有289项为对症药物(36.6％)，疾病缓解小分子(35.1％)和疾病改善免疫疗法(18％)的2期和3期临床试验(Cummings et al.,Expert Rev Clin Pharmacol.2014；7(2):161-5)。在AD领域的全球专家和制药行业提出的提高AD药物开发成功率的策略中，包括：a)在神经变性开始之前早期干预疾病过程，b)识别和开发用于早期诊断、非侵入性的、适用于受试者群体分层以及在临床试验中纵向监测药物疗效的准确生物标志物。
在尸检组织病理学分析中定义了AD的病理特征。如美国神经病学会、美国精神病学协会(DSM-IV)以及CERAD和NIA-里根研究所的神经病理学标准所认可的，淀粉样斑块的存在仍然是AD确诊的绝对必要特征。
目前对该疾病的诊断尚无把握(Dubois et al Lancet Neurol.2014；13(6):614-29)，其基于一系列的临床和神经心理学检查以及神经影像的组合，例如使用磁共振成像(MRI)的结构成像和/或使用氟脱氧葡萄糖F18(18F-FDG)正电子发射断层扫描(PET)的葡萄糖代谢检查，取决于方法和疾病的严重阶段，准确度低于70％-85％，(Frisoniet al.,NatRev Neurol.2010；6(2):67–77；Tahmasian et al.,J Nucl Med.2016；57(3):410-5)。
有时，还需要另外检测脑脊液(CSF)中与AD相关的生物标志物Aβ42和tau或磷酸化tau(Sunderland et al.,JAMA.2003；289(16):2094-2103)，但CSF检查要求腰椎穿刺，这是一种侵入性手段，通常需要患者入院。此外，这些CSF检查的准确性仍然不足，因为多达30％的受试者可能会被误诊，并且不能纵向实施该检查以进行跟踪用于确认诊断目的。
纵向验证性诊断检查，对于早期检测AD的临床前阶段和轻度认知功能损害(MCI；定义为出现最初细微症状的早期阶段)以及由此及早检测并计算MCI转化为AD的风险，是必要的。由于CSF的局限性(侵入性)，在出现症状前的临床前AD阶段，很少将CSF检测用作早期诊断的生物标志物，它也不适合作为伙伴生物标志物对纵向临床试验中招募的同一受试者在多个时间点重复实施。
最近，正在开发与AD病理学相关的特异性神经影像学方法，特别是使用配体，用于体内淀粉样β(Aβ)配体-正电子发射断层扫描(PET)神经成像，包括F-18 florbetapir和F-18 flutemetamol，这些已获得FDA和/或EMA批准(Choi et al.,2009and Wong et al.,2010)。然而，这些方法的实践成本高昂且极为受限(仅在配备了PET技术的大城市的某些医院中可用，仍主要用于研究目的，无健康保险补偿)，并且其诊断准确性仍在研究中以供进一步理解。因此，这些AβPET神经成像方法的使用仍然非常有限，即使在富裕国家，绝大多数患者也无法从此类检查中受益。
对于纳入药物开发试验中的AD患者人群，需要更好的定义：使用Aβ配体的PET成像显示，多达30％的被诊断患有AD的受试者显示Aβ扫描阴性，以及多达35％具有正常认知状态的受试者显示Aβ扫描阳性(
Chételat等，Neuro Image Clinical 2013；2：356-65)。因此，在大型制药公司的某些临床试验中，PET Aβ扫描被用于指导所需队列中受试者的募集。抗Aβ抗体，例如Solanezumab在混合的轻度至中度AD患者中测试，未能显示明确的功效，但是在仅轻度AD患者的亚组中提供了一些令人鼓舞的数据。在根据CSF生物标志物谱选择的轻度AD患者中，结果显示出有希望的功效(Carlson et al.,Alzheimers Dement(Amst).2016；2:75-85；Siemers et al.,Alzheimers Dement.2016；12(2):110-20)。然而，CSF生物标志物的使用是侵入性的，极大地限制了其用作药物开发的生物标志物的应用。例如，它不适合于重复使用以监测疾病的稳定性和/或进展，也不适合于在临床纵向试验中监测疾病缓解治疗药物候选物或预防性策略的功效。
总体而言，现有的检测要么缺乏用于诊断大量AD人群的易得性和简便性，和/或缺乏准确性(灵敏度和特异性)。这是开发用于AD的可靠且快速的诊断检测的一个主要障碍和瓶颈。另一个障碍是无需侵入性样品搜集(例如腰椎穿刺)的生物标志物的鉴定。缺乏可以通过细胞、动物模型、临床前模型和人体试验验证的此类易得、灵敏且特异的生物标志物，阻碍了用于AD的疗法和药物的开发、或阻碍了对触发AD或参与AD进程的病理过程的研究。
如今，显然仍然需要准确且无创的外周生物标志物检测用于AD诊断，包括临床前和早期AD诊断，以及用于药物开发应用(患者分层以及在临床试验中监测药物疗效)。
ncRNA包括小microRNA(miRNA)和长的非编码RNA(lncRNA)。
-miRNA是小的非编码RNA分子(18-23个核苷酸)，在转录后水平上负调节基因表达。目前鉴定出的miRNA约有70％在脑中表达。miRNA在神经发育、分化和突触可塑性中起主要作用。一些特定的miRNA在AD脑、CSF和血液中异常表达(综述：Hu等人，2016,Front AgingNeurosci.9(8):13)，揭示了它们在AD诊断中的潜在价值。
-lncRNA通常定义为大于200个核苷酸并以组织特异性方式表达的转录物。在脑中，lncRNA可以在蛋白质的表观遗传、转录和转录后水平调节基因表达，具有多种功能，包括神经元传递和突触可塑性。最近的研究在AD死后脑组织中鉴定了lncRNA候选物；一些lncRNA候选物直接或间接调节神经毒性Aβ的形成、突触活性或神经元DNA修复(综述：Luo Kand Chen Y,ClinInterv Aging 2016；11:867–872)。
miRNA的表达水平可以具有作为诊断性生物标志物的潜力，因为已知它们在循环中，并且可以在多种体液(例如血浆，CSF和尿液)中鉴定组织特异性谱。深度测序技术的近来发展提出了一种可行的方法来开发生物标志物管线，以便分析特定于神经退行性疾病的外周miRNA标签。
我们先前证实，在心脏组织或脑组织等组织中表达或高度富集的lncRNA可以释放到外周循环中，并且可以容易地通过经典RT-PCR在不同的外周样品中定量(PCT/EP2018/065492)。除RT-PCR之外，我们还在外周样品上进行了总RNA测序，并在外周样品(例如血清，血浆和Paxgene-RNA-管采集的全血)中定量到有意义比例的lncRNA(PCT/EP2018/065492)。
根据本发明，使用最新技术结合以非侵入性方式收集的样品(包括Paxgene全血管，血清和血浆)的方法，已鉴定了特异于神经退行性疾病(尤其是AD)的新miRNA标签和lncRNA标签。
附图简述
图1显示，miR.99a.5p，MiR.1229.3p，miR.378d和miR.6880.5p在人血浆肝素锂样品中的表达水平，这些样品来自患有早期至中度阿尔茨海默病(AD)的患者和年龄匹配的健康对照。Y轴：miRNA浓度平均值(标化读数的log2值)的平均值+/-SD。X轴：AD：阿尔茨海默病患者组，HV：健康对照组。
图2显示，使用随机森林的预测模型用于诊断AD患者。在本结果示例中使用了三种miRNA，显示良好的AUC值0.839和准确度0.818。
图3显示，lncRNA候选物lnc-TPPP-1:2,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5和lnc-HECA-6:1在来自早期至中度阿尔茨海默病(AD)患者和年龄匹配健康对照的人血清样品中的表达水平。Y轴：lncRNA浓度平均值(CPM，每百万的计数)的平均值+/-标准差。X轴：AD：阿尔茨海默病患者组，HV：健康对照组。
图4显示比较的火山图。火山图显示，线上方1008种lncRNA在AD组与HV(健康对照)组中差异表达且具有统计学显著性(p<0.05)。33种lncRNAs的p值小于0.05，且倍数变化大于2或小于0.5。线下方显示了差异表达但未达到统计学意义的lncRNA。
图5显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从19867种lncRNA中选出的13种排序最前的lncRNA候选物的标签。
图6显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从p值<0.05且倍数变化≥2或≤0.5或AUC≥0.85或≤0.15的90种lncRNA中选出的7种排序最前的lncRNA候选者的标签。
图7显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从90种lncRNA(p值<0.05且倍数变化≥1,6或≤0.6且AUC≥0.85或≤0.15的)中选出的12种排序最前的lncRNA候选者的标签。
图8显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从(p值<0.05且与神经认知检测包括MMSE和/或MoCA的评分良好相关(Pearson)的)lncRNA中选出的3种排序最前的lncRNA候选者的标签。
图9显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从p值<0.05且与神经影像评分(在测量的120多个结构中与认知和记忆相关的脑结构，例如中颞区(mediotemporal area)、左和右海马、左和右杏仁核、内嗅皮层，的体积)良好相关(Pearson)的lncRNA中选出的7种排序最前的lncRNA候选者的标签。
图10显示基于随机森林算法的预测模型建模，其使得能够鉴定从p值<0.05且与CSF生物标志物Aβ42和tau(总tau或磷酸化tau)良好相关(Pearson)的lncRNA中选出的18种排序最前的lncRNA候选者的标签。
图11显示lncRNA水平与涉及认知的脑结构(诸如中颞区和海马)的神经影像体积得分之间的相关性结果的示例。
图12显示lncRNA与CSF生物标志物Aβ42或Tau之间的相关性结果的示例。
发明详述
本发明涉及一种在有风险罹患或发展轻度认知功能损害(mild cognitiveimpairment)或认知障碍(cognitive disorder)的受试者中诊断认知障碍，包括但不限于阿尔茨海默氏病，的方法，包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在所述受试者的生物样品中检测ncRNA(miRNA和/或lncRNA)标签(signature)的表达水平，所述ncRNA标签包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)或由其组成；
(c)将样品中miRNA和/或lncRNA的表达水平与参照中的表达水平进行比较，
其中与参照中的水平相比，样品中表达水平的增加或降低鉴定受试者患有认知障碍或有风险发展认知障碍。
在一些实施方案中，ncRNA标签包含或由选自以下的ncRNA组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种miRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lnc RNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNA；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列28种miRNA；
(xiii)表3所列74种miRNA；
(xiv)表6所列33种lncRNA；
(xv)表7所列60种lncRNA；
(xvi)表8所列32种lncRNA；
(xvii)表9所列84种lncRNA；和
(xviii)表10所列94种lncRNA。
本发明还涉及一种用于在患有认知功能丧失或损害或痴呆的受试者中监测认知障碍的发展(development)或进展(progression)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在所述生物样品中检测ncRNA标签的表达水平，所述ncRNA标签包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)或由其组成；
(c)将样品中miRNA和/或lncRNA的表达水平与参照中的表达水平进行比较，
其中与参照中的水平相比，样品中表达水平的增加或降低鉴定受试者患有认知障碍或有风险发展认知障碍，和
(d)根据所鉴定的认知障碍，设计治疗方法。
在一些实施方案中，ncRNA标签包含或由选自以下的ncRNA组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种mRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lnc RNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNA；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列28种miRNA；
(xiii)表3所列74种miRNA；
(xiv)表6所列33种lncRNA；
(xv)表7所列60种lncRNA；
(xvi)表8所列32种lncRNA；
(xvii)表9所列84种lncRNA；和
(xviii)表10所列94种lncRNA。
生物样品可以是从体液例如血液，血浆，血清，尿液或脑脊液获得的受试者的一小部分。合适地，生物样品是血浆或血清或Paxgene-RNA-tube。
认知障碍(cognitive disorder)是指，例如，认知功能的进行性损害或进行性丧失，例如AD。
对认知功能损害或痴呆的诊断：
“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有认知功能损害症状并且没有异常的神经影像学发现，并且年龄与要用本发明的方法诊断的患者相匹配。参照可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出认知功能损害或丧失或痴呆之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自几个健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有认知功能损害症状，也没有异常的神经影像学发现。
对特定痴呆类型或其轻度认知功能损害(MCI)相对于其他痴呆类型及其MCI的鉴 别性诊断：
痴呆的类型和亚型很多，包括例如
阿尔茨海默病(Alzheimer,AD)和AD型MCI
额颞痴呆(Frontotemporal dementia,FTD)和FTD型MCI
路易体痴呆(Dementia with Lewy body,DLB)和DLB型MCI
帕金森氏病痴呆(Parkinson’s disease dementia,PDD)和PDD型MCI
血管性痴呆(Vascular dementia)
进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy，PSP)，
皮质基底节变性(Corticobasal degeneration，CBD)
对于一种痴呆亚型的鉴别诊断(differential diagnosis)，参照样品可以是来自患有(一种或多种)其他类型痴呆的(一个或多个)患者的(一个或多个)样品。例如，对于AD或AD型MCI的鉴别诊断，该(一个或多个)样品应来自患有非AD型MCI/痴呆症的(一个或多个)患者(即，来自患有FTD和/或DLB和/或PDD和/或血管性痴呆和/或PSP和/或CBD和/或其他痴呆症的(一个或多个)受试者的(一个或多个)样品)，或来自可能患有另一种疾病但没有认知功能损害或痴呆症的(一个或多个)受试者。
本发明还涉及一种的方法，所述方法用于在患有认知功能的进行性损害或丧失或痴呆的受试者中诊断认知障碍，包括但不限于阿尔茨海默氏病，并监测其发展或进展，所述方法包括：
(a)使用本发明方法，使用所述受试者的生物样品，确定认知障碍的存在，和
(b)根据步骤(a)的结果，适应性地调整治疗方法。
本发明还涉及一种的方法，所述方法用于在受试者中诊断认知障碍，包括但不限于早期MCI和非常轻度的阿尔茨海默氏病，其中在使用现有方法例如MMSE,MoCA和其他神经认知检测时，所述受试者无明显和/或无可测量的症状，但在症状之前有本发明生物标志物的异常改变，其中所述方法包括：
(a)使用本发明方法，使用所述受试者的生物样品，确定发展认知障碍的风险，和
(b)根据步骤(a)的结果，适应性地调整治疗方法。
本发明还涉及一种方法，该方法用于在受试者中预测性诊断认知障碍，包括但不限于，早期MCI和非常轻度的阿尔茨海默氏病，其中所述受试者通过神经影像学方法如MRI和/或CT扫描，没有明显的和/或可测量的异常，其中所述方法包括：
(a)使用本发明方法，使用所述受试者的生物样品，确定发展认知障碍的风险，和
(b)根据步骤(a)的结果，适应性地调整治疗方法。
本发明还涉及用于治疗患有认知功能的进行性损害或丧失或痴呆的受试者的方法，所述方法包括：
(a)使用本发明方法，在所述患者中诊断与认知功能的进行性损害或丧失或痴呆有关的认知障碍，和
(b)根据步骤(a)的结果，适应性地调整治疗方法。
认知障碍的治疗方法的例子可以包括施用：
-已获准用于治疗认知障碍，尤其是阿尔茨海默氏病的药物，例如，胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐(donepezil)，卡巴拉汀(rivastigmine)或加兰他敏(galantamine)，或NMDA受体拮抗剂，例如美金刚(memantine)，或药物组合，例如多奈哌齐和美金刚，和/或
-正在临床开发中的新治疗候选物或组合，例如，目前在抗淀粉样蛋白领域中测试的，例如β-分泌酶抑制剂和抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体，以及抗tau蛋白方法，例如目前在抗-tau蛋白领域中测试的，例如调节tau磷酸化状态的激酶或磷酸酶的调节剂和抗tau抗体；以及调节本发明ncRNA所涉及的分子途径的药物候选物，所述途径例如神经变性，突触可塑性，氧化应激，自体吞噬，线粒体功能障碍和免疫-炎症途径。
此外，本发明包括用于诊断和/或监测认知障碍的试剂盒，所述认知障碍包括但不限于AD，该试剂盒包含至少一种用于在生物样品中测定ncRNA表达谱的试剂，所述ncRNA表达谱包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)或由其组成。
在一些实施方案中，ncRNA表达谱包含或由选自以下的ncRNA组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)7种miRNA,包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p；
(iii)3种miRNA,包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p；
(iv)11种miRNA,包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p；
(v)15种miRNA,包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p；
(vi)13种lncRNA,包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20；
(vii)7种lncRNA,包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4；
(viii)12种lnc RNA，包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2；
(ix)3种lncRNA,包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2；
(x)7种lncRNA,包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46；
(xi)18种lncRNA,包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1；
(xii)表2所列28种miRNA；
(xiii)表3所列74种miRNA；
(xiv)表6所列33种lncRNA；
(xv)表7所列60种lncRNA；
(xvi)表8所列32种lncRNA；
(xvii)表9所列84种lncRNA；和
(xviii)表10所列94种lncRNA。
本发明试剂盒允许实施本发明miRNA标签和/或lncRNA标签的测量，其中试剂盒包含用于测量如上所述至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)的至少一种试剂。
“试剂”是指，特异地允许确定miRNA/基因表达谱的试剂，即，特异地旨在用于特异确定miRNA/基因表达谱中存在的miRNA/基因的表达水平的试剂。例子包括例如，miRNA/基因表达谱中存在的miRNA/基因的特异性扩增引物对(正向和反向)和/或探针。该定义不包括可用于确定任何其他miRNA/基因的表达水平的通用试剂。
“试剂”也意指特异地允许确定lncRNA表达谱的试剂，即，特异地旨在用于特异确定lncRNA表达谱中存在的lncRNA的表达水平的试剂。例子包括，例如，lncRNA表达谱中存在的lncRNA的特异性扩增引物对(正向和反向)和/或探针。该定义不包括可用于确定任何其他lncRNA的表达水平的通用试剂。
在一些实施方案中，用于诊断和/或监测认知障碍的试剂盒包含一种或多种对目的ncRNA具有特异性的寡核苷酸探针和用于纯化探针-靶核酸复合物的试剂。寡核苷酸探针包含与目的ncRNA的区域互补的序列。寡核苷酸探针可以是DNA或RNA。寡核苷酸探针优选是DNA。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸探针被生物素化，并且用于纯化探针-靶标复合物的试剂是链霉亲和素包被的基质，例如链霉亲和素包被的磁性颗粒，例如T1链霉亲和素包被的磁珠。在一个优选的实施方案中，目的ncRNA是lncRNA。对lncRNAs特异的寡核苷酸探针的长度可以是30至80个核苷酸，例如40至70个核苷酸，40至60个核苷酸，或大约50个核苷酸。
本发明的另一个实施方案涉及用于下一代测序(next generation sequencing)的靶向测序组，其包含对生物样品中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)具有特异性的核酸，所述至少一种ncRNA选自表1中列出的406种miRNA和表5中列出的1008种lncRNA。
在一些实施方案中，所述至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)包含选自以下的ncRNA或由其组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种miRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lncRNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNA；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列28种miRNA；
(xiii)表3所列74种miRNA；
(xiv)表6所列33种lncRNA；
(xv)表7所列60种lncRNA；
(xvi)表8所列32种lncRNA；
(xvii)表9所列84种lncRNA；和
(xviii)表10所列94种lncRNA。
本发明还涉及应用本发明方法来开发在临床试验中测试的新治疗策略(候选药物)，其中所述治疗策略用于治疗认知障碍(包括但不限于阿尔茨海默氏病)，其中该方法可以用于：(a)在开始治疗之前，用于选择要入选临床试验的患者；由此，该测试将增加所治疗患者人群从测试的(一个或多个)治疗策略中受益的可能性，同时避免入选无法从该测试的新候选药物受益的患者亚群；和/或(b)在使用新的测试药物候选物开始治疗后，用于监测该测试的(一个或多个)治疗策略的(一个或多个)反应，包括功效。
在再一方面，本发明还涉及检测方法。例如，本发明考虑用于检测至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)的方法。在一方面，该方法包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在来自所述受试者的生物样品中检测ncRNA标签的表达水平，其中所述ncRNA标签包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种，或由其组成。
在一些实施方案中，ncRNA标签包含选自以下的ncRNA，或由其组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)7种miRNA，包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p；
(iii)3种miRNA，包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p；
(iv)11mRNA，包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p；
(v)15种miRNA，包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p；
(vi)13种lncRNA，包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20；
(vii)7种lncRNA，包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4；
(viii)12种lnc RNA，包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2；
(ix)3种lncRNA，包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2；
(x)7种lncRNA，包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46；
(xi)18种lncRNA，包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1；
(xii)表2所列28种miRNA；
(xiii)表3所列74种miRNA；
(xiv)表6所列33种lncRNA；
(xv)表7所列60种lncRNA；
(xvi)表8所列32种lncRNA；
(xvii)表9所列84种lncRNA；和
(xviii)表10所列94种lncRNA。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术，确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。尤其是，可以通过测量每种miRNA或lncRNA的核酸转录物的量，确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。可以使用本领域技术人员已知的任何技术，测量核酸转录物的量。测量可以直接在提取的RNA样品上进行，或在采用本领域熟知技术从提取的RNA制备的逆转录互补DNA(cDNA)上进行。从RNA或cDNA样品，可以使用本领域熟知的技术，包括核酸阵列、定量PCR、测序(例如下一代测序)、FIMAP定量和标记探针杂交，测量核酸转录物的量。
在一些实施方案中，使用测序例如下一代测序来确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。可以在使用逆转录酶将提取的RNA转换为cDNA后进行测序，也可以直接对RNA分子进行测序。在不应被认为限制本发明范围的一个特定实施方案中，使用下一代测序来测量表达水平可以如下进行。简要地说，从样品(例如血液样品)中提取RNA。除去rRNA后，将RNA样品逆转录为cDNA。为了确保链特异性，首先在放线菌素D存在的情况下，使用Super-Script II逆转录酶和随机引物合成单链cDNA，然后用第二链标记混合物将其转化为双链cDNA，该混合物掺入dUTP代替dTTP。使用AMPure XP磁珠纯化所得平末端cDNA。在3′末端腺苷酸化步骤之后，将衔接子连接到cDNA。这样获得的cDNA(测序文库)可以通过PCR扩增。该测序文库可以通过本领域技术人员已知的任何下一代测序技术来测序。
在一些实施方案中，通过在测量之前捕获和富集对应于目的ncRNA的核酸(RNA或cDNA)来促进，例如通过测序(例如，下一代测序)进行的，ncRNA表达水平的测量。如本文所用，富集是指，通过选择性地纯化目的核酸来相对于初始样品增加样品中目的核酸的百分比。对应于目的ncRNA的核酸的富集可以在提取的RNA样品上或在提取的RNA制备的cDNA样品上进行。在一些实施方案中，通过在允许探针与靶核酸杂交以形成探针-靶核酸复合物的条件下，将RNA或cDNA样品与特异于目的ncRNA的寡核苷酸探针(例如，包含与目的ncRNA的区域互补的序列的寡核苷酸探针)杂交，来捕获和富集与目的ncRNA相对应的核酸。探针可以是DNA或RNA，优选DNA。探针-靶核酸复合物可以通过本领域技术人员已知的任何技术来纯化。在一个优选的实施方案中，探针被生物素化。可以通过使用链霉亲和素包被的基质，例如链霉亲和素包被的磁性颗粒，例如T1链霉亲和素包被的磁珠，来纯化生物素化的探针-靶核酸复合物。在一个优选的实施方案中，通过该方法测量的ncRNA是lncRNA。针对lncRNA的特异性探针的长度可以是30至80个核苷酸，例如40至70个核苷酸，40至60个核苷酸或大约50个核苷酸。
在一些实施方案中，可以使用定量PCR确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。定量或实时PCR是本领域技术人员公知的并且容易获得的技术，不需要精确的描述。在不应被认为限制本发明范围的一个特定实施方案中，使用定量PCR确定表达谱可以如下进行。简而言之，实时PCR反应可以使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行。将6μl cDNA添加到9μl PCR混合物中，所述混合物中包含7.5μl TaqMan Universal PCRMaster Mix，0.75μl探针和引物的20X混合物以及0.75μl水。该反应包括：在50℃下2分钟的一个引发步骤，然后在95℃下10分钟；40个扩增循环，每个循环包括在95℃下15秒和60℃下1分钟。反应和数据采集可使用ABI 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行。通过在指数期记录可以检测到背景荧光以上的荧光信号时的扩增循环(循环阈值或CQ或CT)，可以确定样品中模板转录物分子的数量。因此，模板转录物分子的起始数目与CT反向相关。
在一些实施方案中，miRNA和/或lncRNA的表达水平可以通过使用核酸微阵列来确定。核酸微阵列由附着在基质上的不同核酸探针组成，基质可以是微芯片，载玻片或微球大小的珠子。微芯片可以由聚合物，塑料，树脂，多糖，二氧化硅或二氧化硅基材料，碳，金属，无机玻璃或硝化纤维素组成。探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA微阵列”)或寡核苷酸(“寡核苷酸微阵列”)。为了确定靶核酸样品的表达谱，标记所述样品，使其在杂交条件下与微阵列接触，导致在靶核酸与附着于微阵列表面的互补探针序列之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在。微阵列杂交技术的许多变型形式是本领域技术人员可得的。
在一些实施方案中，可以通过FIMAP定量来确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。简而言之，使用具有与qPCR相同序列的化学修饰引物，通过PCR扩增lncRNA和miRNA。正向引物在5′被磷酸化，反向引物在5′被生物素化。PCR产物用核酸外切酶消化，以消除磷酸化链并仅保留生物素化链。将生物素化的PCR产物与编码的二氧化硅微盘孵育，该微盘用与目的RNA互补的寡核苷酸包被(每个靶寡核苷酸一个代码)，并通过添加荧光链霉亲和素偶联物显示杂交产物。通过测量荧光信号确定miRNA和/或lncRNA的表达水平。
在另一方面，本发明检测方法考虑使用试剂来测量或检测一种或多种miRNA和/或一种或多种lncRNA。“试剂”是指特异地允许确定miRNA/基因或lncRNA表达谱的试剂，即特异地用于特异确定miRNA/基因表达谱中存在的miRNA/基因或lncRNA表达谱中存在的lncRNA的表达水平的试剂。例子包括例如，对存在于miRNA/基因表达谱中的miRNA/基因和/或存在于lncRNA表达谱中的lncRNA特异的扩增引物对(正向和反向)和/或探针。该定义不包括可用于确定任何其他miRNA/基因的表达水平的通用试剂和可用于确定任何其他lncRNA的表达水平的通用试剂。
在另一方面，本发明检测方法包括从生物样品中检测一种或多种miRNA和/或lncRNA，其中所述生物样品选自血液，血浆，血清，尿液，脑脊液，泪液，唾液。在一些实施方案中，生物样品是血液。
“治疗”有风险发展认知障碍或罹患认知障碍的受试者，尤其是认知功能进行性损害或丧失或痴呆的受试者，例如AD，是指，向有此需要的受试者施用或给予方案，以使该病症或疾病的至少一种症状得以治愈，减轻，补救或改善。根据本发明，取决于诊断结果，对受试者采用适应化的治疗方法，并对其进行进一步监测。基于本发明的miRNA标签和/或lncRNA标签对受试者的监测允许进一步适应性调整或改变治疗方法，例如增加药物用量，施用药物组合以获得协同效应，或以有效量的另一种药物代替该药物。
本发明还涉及对患有认知障碍的受试者的治疗策略进行修改，其中所述受试者已经使用用于(体外)诊断或监测认知功能进行性损害或丧失或痴呆的本发明方法进行了诊断和/或监测。
根据本发明，本发明的miRNA和/或lncRNA可以与用于诊断认知障碍(包括但不限于AD)的一种或多种生物标志物组合使用。此类生物标志物的实例包括但不限于USP9,377,472，USP 7,897,786和USP 6,703,212中公开的生物标志物，其内容通过引用并入本文。本发明的方法将本发明的miRNA和/或lncRNA与一种或多种已知的生物标志物组合，可以允许提高诊断的准确性；或鉴别诊断；以及更高效，更成功的药物开发，例如在临床试验中在募集之前提高患者分层的准确性、和监测批准的疗法或正在开发的新药的功效。
根据本发明，本发明的miRNA和/或lncRNA可以与目前用于诊断认知障碍(包括但不限于AD)和/或用于鉴别诊断目的的一种或多种测试结合使用。这种测试的例子包括但不限于，神经心理学测试，例如MMSE，MoCA和神经影像学方法，特别是体积MRI。本发明的方法将本发明的miRNA和/或lncRNA与一种或多种已知的生物标志物组合，可以允许提高诊断的准确性；或鉴别诊断；以及更高效，更成功的药物开发，例如在临床试验中在募集之前提高患者分层的准确性和监测批准的疗法或正在开发的新药的疗效。
为了鉴定特异地参与AD发病机制和AD型轻度认知功能损害(MCI)的miRNA标签，在来自不同组的样品中已经筛选了总共2083种miRNA，所述组包括具有AD或AD型MCI的患者组以及没有脑影像学异常的认知完好的健康对照组。随后在所有样品中进行miRNA分析，检测到高于阈值的406种miRNA。通过比较在不同组样品中测得的miRNA表达水平，与(在临床部门的神经科，基于神经认知和神经心理学测试以及神经影像学测试以及基于脑脊髓液生物标志物：β-淀粉样肽1-42(Aβ42)和(总的和/或磷酸化的)tau)诊断为患有AD或AD型认知功能损害的患者组样品中的表达水平相比，对照组样品中差异表达的miRNA被鉴定为miRNA生物标志物候选物。
为了鉴定特异地参与AD发病机制和AD型轻度认知功能损害(MCI)的lncRNA标签，在来自不同组的样品中已经筛选了总共127802种lncRNA，所述组包括具有AD或AD型MCI的患者组以及没有脑影像学异常的认知完好的健康对照组。随后在所有样品中进行lncRNA分析，检测到高于阈值的19867种lncRNA。通过比较在不同组样品中测得的lncRNA表达水平，与(在临床部门的神经科，基于神经认知和神经心理学测试以及神经影像学测试以及基于脑脊髓液生物标志物：β-淀粉样肽1-42(Aβ42)和(总的和/或磷酸化的)tau)诊断为患有AD或AD型认知功能损害的患者组样品中的表达水平相比，对照组样品中差异表达的lncRNA被鉴定为lncRNA生物标志物候选物。
在两组之间使用两尾Welch t检验和/或Wilcoxon Mann-Whitney检验，分析了表达水平。显著差异表达被鉴定为p<0.05。针对每种miRNA和lncRNA以及每种测试条件，计算倍数变化和AUC(曲线下面积)。
基于倍数变化≥1.49倍或≤0.75倍变化和/或AUC>0.6或<0.4来确定差异表达时，也选择了miRNA候选物，如表2、3和4所示。
基于倍数变化≥1.6(或≤0.6)和/或AUC≥0.80(或<0.20)来确定差异表达时，也选择了lncRNA候选物，如表6和表7所示。
随机森林算法(Breimann 2001，Breiman和Cutler 2001)用于构建模型，还用于选择最前的miRNA和/或最前的lncRNA。基于最前的2-20个mRiNA和/或lncRNA的组合的预测性模型，可以以≥80％的准确度预测疾病。
在测量的2083种miRNA中，有406种miRNA的表达水平显示高于阈值。此406种miRNA的序列显示在表1中。
表1:406种miRNA的序列
在分析的406种可检测的miRNA中，有28种miRNA显示出统计学上的显著差异(Welch T检验p值<0.05)，在这些候选物中，有7种候选物的p值<0.01。表2中显示了这28种miRNA。
表2：基于p值<0.05有用的28种miRNA的列表。SD：标准差
在此406种检测到的miRNA中，共有74种miRNA候选物也显示AUC值≥0.6或≤0.4；其中共有11种候选物表现出良好的AUC值≥0.65或≤0.35；1种候选物显示出非常好的AUC值≥0.7或≤0.30。表3中显示了该74种候选miRNA。
表3:还显示AUC值≥0.6或≤0.40的74种候选物的列表
| miRNA | AUC | miRNA | AUC | miRNA | AUC |
| miR.99a.5p | 0,268 | miR.145.5p | 0,383 | miR.4800.5p | 0,612 |
| miR.1229.3p | 0,301 | miR.139.5p | 0,384 | miR.6746.5p | 0,613 |
| miR.100.5p | 0,301 | miR.150.5p | 0,386 | miR.4667.5p | 0,614 |
| miR.378d | 0,303 | miR.193a.3p | 0,390 | miR.4656 | 0,614 |
| miR.193b.3p | 0,307 | miR.342.3p | 0,391 | miR.1914.3p | 0,616 |
| miR.1306.5p | 0,328 | miR.210.3p | 0,392 | miR.1275 | 0,618 |
| miR.195.5p | 0,333 | miR.144.5p | 0,392 | miR.8089 | 0,619 |
| miR.532.3p | 0,334 | miR.27b.3p | 0,394 | miR.5703 | 0,619 |
| miR.125b.5p | 0,341 | miR.664a.3p | 0,396 | miR.6124 | 0,621 |
| miR.34a.5p | 0,342 | miR.16.5p | 0,396 | miR.2392 | 0,621 |
| miR.378i | 0,351 | miR.877.3p | 0,397 | miR.7111.5p | 0,622 |
| miR.532.5p | 0,354 | miR.29a.3p | 0,400 | miR.8085 | 0,622 |
| miR.375 | 0,363 | miR.130a.3p | 0,400 | miR.6716.5p | 0,624 |
| miR.660.5p | 0,363 | miR.6794.5p | 0,601 | miR.6778.5p | 0,625 |
| miR.194.5p | 0,369 | miR.1908.5p | 0,601 | miR.6797.5p | 0,625 |
| miR.141.3p | 0,370 | miR.6799.5p | 0,602 | miR.4534 | 0,633 |
| miR.144.3p | 0,372 | miR.3141 | 0,604 | miR.6775.5p | 0,635 |
| miR.1234.3p | 0,373 | miR.6738.5p | 0,604 | miR.4270 | 0,636 |
| miR.378f | 0,375 | miR.6894.5p | 0,604 | miR.6812.5p | 0,638 |
| miR.181b.5p | 0,376 | miR.7851.3p | 0,605 | miR.6086 | 0,645 |
| miR.502.3p | 0,378 | miR.4695.5p | 0,608 | miR.765 | 0,645 |
| miR.192.5p | 0,378 | miR.23a.5p | 0,609 | miR.6769a.5p | 0,647 |
| miR.766.3p | 0,378 | miR.4463 | 0,610 | miR.5196.5p | 0,649 |
| miR.122.5p | 0,380 | miR.382.5p | 0,611 | miR.6880.5p | 0,655 |
| miR.378a.3p | 0,381 | miR.4655.5p | 0,611 |
在406种检测到的miRNA中，共有15种候选物显示AUC值≥0.6或≤0.4，且倍数变化值≥1.49或≤0.75。该15种miRNA的列表显示在表4中。
表4：15种候选物的列表，显示AUC值≥0.6或≤0.4且倍数变化值≥1.49或≤0.75
| miRNA | p值 | 倍数变化 | AUC |
| miR.23a.5p | 0,06528 | 0,630 | 0,609 |
| miR.6880.5p | 0,01316 | 0,717 | 0,655 |
| miR.7111.5p | 0,03968 | 0,733 | 0,622 |
| miR.6812.5p | 0,05632 | 0,735 | 0,638 |
| miR.6738.5p | 0,07930 | 0,741 | 0,604 |
| miR.5196.5p | 0,03121 | 0,741 | 0,649 |
| miR.6894.5p | 0,10422 | 0,746 | 0,604 |
| miR.8085 | 0,27457 | 0,747 | 0,622 |
| miR.4463 | 0,08930 | 0,748 | 0,610 |
| miR.2392 | 0,10513 | 0,748 | 0,621 |
| miR.144.3p | 0,03740 | 1,606 | 0,372 |
| miR.192.5p | 0,01449 | 1,666 | 0,378 |
| miR.193b.3p | 0,00242 | 1,716 | 0,307 |
| miR.194.5p | 0,01913 | 1,823 | 0,369 |
| miR.122.5p | 0,02053 | 2,225 | 0,380 |
从测序的127802种lncRNA中，根据其阈值表达水平，选择了19867种lncRNA进行统计分析。AD患者与健康对照人群的比较显示，1008种lncRNA差异表达具有统计学意义(p值<0.05，Wilcoxon检验)(表5)。这1008种lncRNA的序列显示在本申请的序列表中。
表5：AD组与健康对照组相比具有差异表达(p值<0.05，Wilcoxon检验)的1008种lncRNA的序列号，p值，平均值+/-SD，倍数变化和AUC
在具有统计学显著性(p值<0.05)表达差异的此1008种lncRNA中，33种lncRNA显示倍数变化>2或<0.5，如表6所示。
表6：差异表达具有统计学意义(p<0.05，Wilcoxon检验)且倍数变化>2或<0.5的33种lncRNA的平均值+/-SD
在具有统计学显著性(p值<0.05)表达差异的1008种lncRNA中，60种lncRNA显示了AUC≥0.85，如表7所示。
表7：p值<0.05且AUC值AUC≥0.85的60种lncRNA
当使用p值<0.05的选定miRNA(包含2种或更多种miRNA的标签)时，基于随机森林算法进行预测建模以区分AD患者和健康对照人群的结果，显示出了良好的准确性。例如，包含三种miRNA，miR1220.3p，miR378d和miR99a.5p，的标签允许了0.839的良好AUC和81.8％的准确度。
当使用所分析的总共19867种lncRNA时，通过基于随机森林算法进行预测建模以区分AD患者和健康对照人群，结果显示出：使用如下13种lncRNA，作为lncRNA数量的函数的AUC达到了平台。这13种lncRNA用于构建模型。结果表明，该lncRNA标签可以区分2个群体(轻度AD患者和健康对照人群)，AUC值＝0.993，准确度＝95.8％，灵敏度＝100％且特异性＝91.7％。
在具有统计学显著性(p值<0.05)差异表达的1008种lncRNA中，将倍数变化>2(或<0.5)或AUC≥0.85(或≤0.15)的90种lncRNA用于基于随机森林算法的预测建模。结果表明，使用以下7种排序最前的候选物，可以完全区分AD和HV组，其AUC值为100％，准确度为100％，灵敏度为100％，特异性为100％。
| lncRNA | 排序 |
| LINC02345:11 | 1 |
| lnc-EBLN1-1:4 | 2 |
| lnc-TPPP-1:2 | 3 |
| lnc-TENM3-3:3 | 4 |
| lnc-FAT1-7:2 | 5 |
| lnc-DKK1-5:3 | 6 |
| lnc-TACSTD2-2:4 | 7 |
当应用另一个过滤器时，考虑倍数≥1.6且AUC≤0.85的lncRNA的列表，使用随机森林算法，选择了排序最前的以下12种lncRNA来构建模型，这使得可以区分AD和HV群体，仍具有良好AUC＝0.979，优良的准确度95.8％，灵敏度91.7％，和特异性100％。
| lncRNA | 排序 |
| lnc-TPPP-1:2 | 1 |
| ARRDC3-AS1:7 | 2 |
| lnc-TENM3-3:5 | 3 |
| lnc-TENM3-3:4 | 4 |
| lnc-QRFP-5:1 | 5 |
| lnc-CRYBB1-1:1 | 6 |
| lnc-MGST3-1:3 | 7 |
| lnc-FAM49B-8:1 | 8 |
| HAND2-AS1:70 | 9 |
| lnc-TMEM185B-12:7 | 10 |
| lnc-CNDP1-7:1 | 11 |
| lnc-C21orf58-1:2 | 12 |
为了选择最佳的lncRNA候选物，使用随机森林算法，对特定一组lncRNA候选物应用了建模，这些候选物在AD患者相对于健康对照人群中具有统计学显著的差异表达，并且与神经认知测试(在进行的7种神经心理学测试中，包括MMSE和/或MOCA)的得分具有良好的相关性(Pearson R系数)(表8)：结果表明，以下3种排序最前的lncRNA的标签可以良好地区分AD患者和健康对照人群，AUC＝0.953，准确度、灵敏度和特异性分别为91.7％，91.7％和91.7％。
| lncRNA | 排序 |
| lnc-TENM3-3:3 | 1 |
| lnc-MARCH4-2:7 | 2 |
| lnc-LRRC1-5:2 | 3 |
表8：与神经认知测试，MoCA，MMSE相关的本发明lncRNA。R：相关系数(Pearson).。HV：健康对照组，AD：轻度至中度AD组
使用随机森林算法的建模也应用于表9中的lncRNA候选物的特定集合，这些候选物在AD患者与健康对照人群中具有统计显著的差异表达，并且与神经影像学评分(在测试的120种以上结构中，与认知和记忆有关的脑结构，例如中颞区，左右海马，左右杏仁核，内嗅皮层，的体积)具有良好的相关性(Pearson)：结果显示，以下7种排序最前的lncRNA的标签可实现在AD患者和健康对照组之间的出色区分，AUC＝0.993，准确度＝95.8％，灵敏度＝91.7％，特异性＝100％。
| lncRNA | 排序 |
| lnc-TPPP-1:2 | 1 |
| lnc-TENM3-3:3 | 2 |
| lnc-TMEM185B-12:7 | 3 |
| lnc-NAXD-6:5 | 4 |
| lnc-HECA-6:1 | 5 |
| lnc-COMMD6-10:1 | 6 |
| MIR29B2CHG:46 | 7 |
表9：与MRI(脑结构的体积)相关的本发明lncRNA。R：相关系数(Pearson)。HV：健康对照组，AD：轻度至中度AD组。
使用随机森林算法的建模还应用于表10中的lncRNA候选物的特定集合，这些候选物在AD患者与健康对照人群中具有统计显著的差异表达，并且与AD病理学高度相关的CSF生物标志物(Aβ42，tau或磷酸化tau)的水平具有良好的相关性(Pearson)：结果显示，以下18种排序最前的lncRNA的标签可以在AD患者和健康对照人群之间进行出色的区分，AUC＝0.972，准确度＝0,917，灵敏度＝0.83，特异性＝1。
| lncRNA | 排序 | lncRNA | 排序 |
| lnc-TPPP-1:2 | 1 | lnc-DNALI1-5:4 | 10 |
| LINC02345:11 | 2 | RORB-AS1:6 | 11 |
| lnc-ZNF273-4:4 | 3 | lnc-TPPP-1:3 | 12 |
| lnc-TACC2-8:6 | 4 | lnc-BMS1-2:1 | 13 |
| LINC01206:20 | 5 | lnc-ADRB1-4:1 | 14 |
| lnc-C5orf67-3:1 | 6 | lnc-XXYLT1-5:1 | 15 |
| HAND2-AS1:58 | 7 | MIR99AHG:104 | 16 |
| lnc-PRDM9-20:1 | 8 | LINC01748:17 | 17 |
| lnc-CLK1-1:7 | 9 | lnc-AKR1E2-15:1 | 18 |
表10：与CSF生物标志物相关的本发明lncRNA
材料和方法
为了鉴定人受试者血浆或血清或全血样品中的miRNA，使用HTG EdgeSeq miRNA全转录组V2靶向测序测定法(HTG WTA V2，HTG Molecular，Tuscon，美国)，对2083种miRNA进行miRNA谱分析。该技术基于核酸酶保护的靶向RNA测序测定法，该测定法采用无萃取裂解过程，然后进行核酸酶保护测定(NPA)，以制备用于测量的核酸酶保护探针(NPP)的化学计量文库。
为了鉴定人受试者的血清，血浆或全血样品中的lncRNA，首先提取循环总RNA，并通过去除核糖体RNA，制备测序文库(RiboZero TruSeq文库制备试剂盒，Illumina Inc.SanDiego，USA)，并在Illumina NextSeq500上进行测序，2x75 bp读长。
ncRNA(miRNA和lncRNA)也通过使用特异性引物的qPCR进行了测量。为此，首先提取循环总RNA，使用特异性引物进行逆转录和实时PCR。使用FiMAP，这是一个具有专利权的平台，它基于PCR产物在包被的微盘上与偶联检测探针的互补寡核苷酸的杂交。提取总RNA，然后进行逆转录和PCR步骤，其中使用多个ncRNA的特异性引物，允许几个靶标的多重扩增。因此，使用对每种ncRNA特异的编码微盘，在FiMAP平台上进行了定量。
患者群体和样品
从肝素锂试管中收集的血液样品中制备血清或血浆样品，并在Paxgene RNA管中收集全血样品。样品来自健康志愿者(HV)，法国牟罗兹“
Sang”(EFS)的捐献者，和来自认知完好的健康对照受试者和具有轻度认知功能损害或不同阶段的阿尔茨海默氏病(AD)的患者，所述患者根据Amoneta Diagnostics赞助的前瞻性研究的方案招募，该研究注册到AgenceNationale de Sécuritédu Médicament et des Produitsde Santé(ANSM)，包括在ID RCB下的ADKIT研究：2015年1月22日2015-A00118-41，在IDCRCB下的时间生物学研究：2016年2月4日2016-A200227-44。
用于miRNAs的方法
HTG EdgeSeq run
使用了HTG全转录物组miRNA(WTA)试剂盒(HTG WTA V2，HTG Molecular，Tuscon，美国)。按照以下方案制备了样品：将15μl血浆裂解缓冲液和15μl血浆样品与3μl蛋白酶K混合，并在50℃下伴随轨道振荡孵育60分钟。将25μl的该混合物转移到HTG样品板上，并加载到HTG处理器中，以进行核酸酶保护测定并制备化学计量的NPP。
分子条形码和衔接子添加
对于血浆样品，使用Hemo KlenTaq(MO332S，NEB，Evry，France)酶进行条形码编码。对于每个样品，混合2.4μl Hemo KlenTaq,0.6μl dNTPs(10nM)(NEB,N0447S),6μlOneTaq PCR GC缓冲液5X(B9023S,NEB,Evry,France),3μl正向和反向引物(HTG WTA,HTGMolecular,Tuscon,United States),3μl样品制备物和12μl H2O。PCR步骤在ABI2720Thermocycler上进行，使用如下循环：95℃ 4分钟，然后进行16个循环，每个循环分别为95℃ 15秒，55℃ 45秒和68℃ 45秒。方案在68℃ 10分钟终止。
PCR纯化
为了从文库中除去过量的引物，使用了Agentcour AMPure XP珠子(A63880,Beckmancoulter,Villepinte,France)。对于每个样品，将37.5μl AMPure XP微珠与15μlPCR产物组合使用。用移液器混合10次后，将溶液在室温下孵育5分钟，然后放在磁力架上。2分钟分离珠子后，小心地取出澄清的溶液，而不干扰珠子。用200μl的80％乙醇将小珠清洗2次。用25μl H2O洗脱与珠子相连的PCR产物。将纯化的PCR产物溶液置于新试管中，同时将板放在磁力架上，以分离PCR产物和珠子。
确定文库浓度：
为了确定每个样品的文库浓度，使用了Kapa Biosystems qPCR试剂盒(KK4824，Cliniscience，Nanterre，法国)。对于每个反应，混合物由12μl的Mastermix，0.4μl的ROX染料，3.6μl的H2O和4μl的模板(标准品或文库以1/10000稀释)组成。样品在ABI PRISM7900HT(High ROX)上运行，进行以下循环：95℃持续5分钟，35个循环，每个循环为95℃持续30秒，65℃持续45℃，并进行数据收集和解离曲线。标准品对应于452bp的扩增子，而带有条形码的NPP的扩增子对应于115bp。该比率用于确定每个文库的浓度。
样品合并和测序
合并每个样品，以生成4nM的合并库。从该合并的文库中，将5μl与新鲜制备的0.2NNaOH混合并孵育2分钟。将溶液短暂涡旋并在280g离心1分钟，然后与990μl预冷器HT1缓冲液(Illumina NextSeq Reagent v2 kit,Illumina,Paris,France)混合。制备了20pM的15％PhiX(PhiX control v3,Illumina,Paris,France)。将260μl制备的变性文库以20pM与39μl 20 pM PhiX混合，并将1001μl HT1缓冲液加载入Illumina NextSeq500 Mid OutputV2 150循环试剂盒中并进行测序。
序列分析
直接使用来自Illumina Sequencer的FASTQ文件进行数据重建和分析，并由HTGParser软件进行处理。
统计学
使用供应商推荐的方法对数据进行标化。在过滤掉所有低于70(供应商建议的阈值)的值后，基于序列总计数进行所述标化。标化后，具有该阈值第75个百分位的所有miRNA均被视为噪音，已被删除。
为了确定区分阿尔茨海默氏病患者和健康对照受试者的miRNA，将以下统计学方法应用于标化后的数据：对标化数据进行了两尾Welch t检验和计算倍数变化。对样品中检测到的每种miRNA制作了单独的ROC曲线。使用在AUROC方面最佳的miRNA，进行了随机森林算法，以建立诊断阿尔茨海默氏病的预测模型。
选择目的miRNA的最终列表，这些miRNA基于p值<0.05或倍数变化≥1.49或≤0.75(以Log2值)和/或各自的AUC而选择，选择的所有miRNA均至少在三个所选生物标志物列表(表1、2和3)之一中。
用于lncRNA的方法
样品测序
核糖核酸(RNA)提取，根据制造商的说明，使用Norgen血清/血浆提取以及RNA纯化和浓缩微洗脱试剂盒，从1.5ml血清开始进行。
使用Illumina TruSeq链式总RNA文库制备试剂盒与人/小鼠/大鼠RiboZero rRNA提取试剂盒(Illumina Inc.San Diego，USA，美国)组合，从提取的总RNA中制备了测序文库。所有步骤均按照低通量方案并根据制造商的说明执行，没有片段化步骤。简而言之，将细胞质核糖体RNA(rRNA)与生物素化的靶标特异性寡核苷酸杂交，并使用链霉亲和素包被的磁珠去除。然后将耗尽rRNA的RNA样品逆转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)。为了确保链特异性，首先在放线菌素D存在的情况下，使用Super-Script II逆转录酶(Invitrogen)和随机引物合成单链cDNA，然后用第二链标记混合物将其转化为双链cDNA，所述混合物掺入dUTP代替dTTP。使用AMPure XP磁珠纯化所得的平末端cDNA。在3′末端腺苷酸化步骤之后，进行Illumina的衔接子连接。因此，使用AMPure XP珠子将获得的带单索引的文库洗涤两次，以去除过量的衔接子，并通过PCR富集(15个循环)。通过最终的AMPure XP珠洗涤，纯化PCR产物，并在30μl重悬缓冲液中洗脱准备测序的文库。
为了进行质量控制，根据制造商的建议，使用DNA 1000芯片在AgilentTechnologies2100生物分析仪上运行每个文库1μl。检查衔接子二聚体的缺失，平均文库大小由区域表决定。使用Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒(Invitrogen)在Qubit 2.0上对文库进行定量。先前在Bioanalyzer上确定的文库大小用于从质量浓度计算摩尔浓度。
所有文库均使用Illumina NextSeq500(2x75bp)进行测序。
生物信息分析
使用Partek Flow(Partek Inc.,St Louis,MO,USA build 6)进行RNA-seq数据分析。Partek Flow的预对齐QA/QC模块用于可视化FASTQ文件的读段质量。检查所有读段。FASTQ原始文件根据其质量得分(Phred得分)在3′末端进行修整。所使用的参数是末端最低质量水平30和最小的经修整读长50。未对齐的读段使用智人hg19基因组进行映射。使用软件STAR版本2.5.3(Dobin,A.,Davis,C.A.,Schlesinger,F.,Drenkow,J.,Zaleski,C.,Jha,S.,Batut,P.,Chaisson,M.,and Gingeras,T.R.(2013).STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.Bioinforma.Oxf.Engl.29,15–21)，进行映射。使用默认参数。Partek Flow的对齐后QC模块用于可视化每个位置的平均碱基质量得分以及每个对齐的映射质量。使用具有专利的lncRNA注释的GTF文件，对映射的读段进行定量，其中使用Partek Expectation/Maximization(E/M)算法用于定量(Xing,Y.,Yu,T.,Wu,Y.N.,Roy,M.,Kim,J.,and Lee,C.(2006).An expectation-maximization algorithm for probabilisticreconstructions of full-length isoforms from splice graphs.Nucleic AcidsRes.34,3150–3160)。使用默认参数。中位值低于基因间区域的中位值读段密度的转录物被丢弃，以进行下一步分析。转录物计数通过CPM(每百万的计数)进行标准化。仅考虑在一组的至少一半样品中显示高表达(CPM≥10)的转录物。
统计学分析和预测建模
为了确定差异表达的lncRNA，使用Wilcoxon Mann-Whitney参数检验，进行统计分析。p值≤0.05的lncRNA被认为是差异表达的。为了建立分类模型用于2个分类，使用了R的微阵列分类(CMA)包(Slawski M,Daumer M,Boulesteix AL.CMA:a comprehensiveBioconductor package for supervised classification with high dimensionaldata.BMC Bioinformatics 2008,9:439)以及留一交叉验证。用于这种预测建模的算法是(a)随机森林，(b)线性判别分析和(c)朴素贝叶斯(Breiman L.Random forests.MachineLearning,45(1):5–32,2001)。
通过10种候选物选择的平均排序(每CV-折)，计算模型中RNA候选物的排序。根据模型(和RNA选择方法)，将AUC绘制为模型中RNA数量的函数。通过图形确定每个模型的最佳RNA数量。生成了ROC曲线和混淆矩阵，以评估我们模型的预测性能。报告AUC值，准确度，灵敏度，特异性，阳性和阴性预测值。
用于定量miRNA和lncRNA的其他方法
总RNA提取
根据制造商的说明，分别使用Paxgene Blood RNA试剂盒(法国Qiagen)和Serum/Plasma mini试剂盒(加拿大NorgenBiotek)提取总RNA。
使用RNA 6000Nano试剂盒(法国安捷伦)，在Agilent 2100生物分析仪上检查了RNA质量。RNA量使用RNA高灵敏度试剂盒(Fisher Scientific，法国)在Qubit 3.0荧光计上测量。
cDNA合成
如下将总RNA用于miRNA和lncRNA cDNA合成。对于miRNA，在10μl的最终体积中逆转录100ng RNA，所述最终体积包括1μl 10x poly(A)聚合酶缓冲液，0.1mM ATP，1μM通用miRNA RT引物，脱氧核苷酸各0.1mM(dATP,dCTP,dGTP和dTTP)，100单位的MuLV逆转录酶(美国New England Biolabs)和1单位的poly(A)聚合酶(美国New England Biolabs)，在42℃孵育1小时，然后在95℃ 5分钟进行酶灭活。RT引物的序列是5’-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V是A、C和G，且N是A、C、G和T。引物购自IDT(Integrated DNATechnologies,Belgium).。
对于lncRNA，根据生产商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Fisherscience，法国)进行逆转录。
qPCR定量
对于lncRNA，使用Applied Biosystems的预扩增预混液与对应于lncRNA的引物对各0.1X(100nM)，进行预扩增反应。如供应商公开发布的，执行16个预扩增循环(50℃ 2分钟，96℃ 10分钟，在95℃ 15秒和60℃ 1分钟的40个循环)。对于miRNA扩增，使用miRprimer工具(PMID：24472427)设计引物。在总体积10μl中进行生物样品的定量PCR，所述总体积中具有1μl cDNA或以1/20稀释在TE缓冲液中的预扩增产物(分别用于miRNA和lncRNA)，5μl2x Soadvanced SYBR green PCR Master Mix(Biorad，USA)和每个引物各250nM。循环条件为95℃ 5-10分钟，然后40个循环，每个循环为95℃ 10-30秒和60℃30-60秒。热分析后进行熔解曲线分析(60℃至99℃)，以确保扩增的特异性。使用CFX maestro软件(Biorad，USA)，相对于在5log标度上实现的标准曲线，确定了相对表达水平。
FIMAP定量
还使用Quantamatrix(韩国)开发的FIMAP/QMAP平台，对目的lncRNA和miRNA进行了定量。简而言之，使用具有与qPCR相同序列的化学修饰引物，通过PCR扩增lncRNA和miRNA。正向引物在5′磷酸化，反向引物在5′生物素化。在Biorad T100热循环仪上在20μl反应中进行多重PCR反应，其中所述反应包含2μl miRNA或lncRNA cDNA，每种引物各250nM和10μl 2X One Taq Hot Start 2X预混液(New England Biolabs,USA)，条件如下：94℃ 30秒；25个循环，每个循环为94℃ 30s，60℃ 1分钟和68℃ 1分钟；然后在68℃最后延伸5分钟。然后，将PCR产物用25U的λ核酸外切酶在37℃消化30分钟，以消除磷酸化的链，仅保留生物素化的链。因此，使用编码的二氧化硅微盘在QMAP上对消化的产物进行定量，该微盘上包被了与目的RNA互补的寡核苷酸(每个靶寡核苷酸一个代码)。简而言之，将生物素化的PCR产物与包被的微盘在96孔板中温育，并且在洗涤步骤之后通过添加荧光链霉亲和素缀合物SAPE(Prozyme，丹麦)来揭示杂交产物。将板在QMAP上成像，每个点拍摄2张图像：一张暗图像可量化荧光，一张明图像可读取微盘代码。然后，通过QMAP软件，根据关联的微盘代码，将荧光信号分配给每个靶标，从而计算每个靶标的相对表达。
结果
对来自轻度损害或中度阿尔茨海默病的患者和认知完好健康受试者的血浆样品进行了基于miRbase v20的2083种miRNA分析。将HTG EdgeSeq技术产生的结果标化后，阳性鉴定了每样品平均406种miRNA。从鉴定的这406种miRNA中进行了统计分析，以鉴定具有阿尔茨海默病预测价值的miRNA。
分类模型使用随机森林算法。由此，鉴定了具有高预测价值的2至20种miRNA的几个组，它们提供的AUC范围为0.839至0.793，准确度高于0.77，特异性高于0.77，灵敏度高于0.74。图2显示了结合具有AUC 0.839的3种miRNA的预测模型。
产生了可用于诊断阿尔茨海默氏病的miRNA列表。该列表是通过多种统计分析确定的：各自的AUC，倍数变化和t检验p值(表2、3和4)。从p值低于0.05的数据集，从血浆肝素锂样品中选择了74种miRNA。根据倍数变化≥1.49或≤0.75和单独AUC>0.6或<0.4，进行进一步分析。参见表2、3和4。
使用总-RNAseq技术，对来自阿尔茨海默氏病患者和认知完好健康受试者的血清样品，进行了基于LNCipedia v5.2的127,802种转录物分析。在127,802种转录物上，鉴定了在一组的至少一半样品中具有超过10CPM表达水平的19867种lncRNA。
根据统计学意义(p值<0.05，Wilcoxon检验)，从19867种lncRNA中选择了可用于诊断阿尔茨海默氏病的1008种lncRNA。分类模型使用随机森林算法。由此，鉴定出具有高预测价值的2-20种lncRNA的几组。选定的2-20种lncRNA的集合提供了从0.7到1的AUC，准确度、灵敏度和特异性在0.7到1范围内。
图3至图12显示了以下结果的示例：a)单独lncRNA的表达水平(图3)；b)区分2个群体的统计学显著性(p值)，图示为火山图(图4)；c)使用随机森林算法进行预测建模以鉴定几组用于诊断阿尔茨海默病的lncRNA标签(图5-10)；和d)lncRNA水平与神经影像或CSF生物标志物的相关性(图11、12)。
Claims (13)
1.一种在有风险罹患或发展认知障碍的受试者中诊断认知障碍，包括但不限于阿尔茨海默氏病，的方法，所述方法包括：
(a)从受试者分离生物样品；
(b)在所述受试者的生物样品中检测ncRNA(miRNA和/或lncRNA)标签的表达水平，所述ncRNA标签包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)或由其组成；
(c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较，
其中与参照中的水平相比，样品中表达水平的增加或降低鉴定受试者患有认知障碍或有风险发展认知障碍。
2.权利要求1的方法，其中ncRNA标签包含选自以下的ncRNA或由选自以下的ncRNA组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种mRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lnc RNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNAs；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列的28种miRNA；
(xiii)表3所列的74种miRNA；
(xiv)表6所列的33种lncRNA；
(xv)表7所列的60种lncRNA；
(xvi)表8所列的32种lncRNA；
(xvii)表9所列的84种lncRNA；和
(xviii)表10所列的94种lncRNA。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)中，组合检测ncRNA的表达水平与适于检测认知障碍的其它生物标志物，例如神经认知测试、神经影像学方法和/或CSF生物标志物。
4.前述权利要求任一项的方法，用于在患有认知功能的丧失或损害或痴呆的受试者中监测认知障碍的发展或进展，所述方法包括步骤(a),(b)和(c),以及
(d)根据所述鉴定的认知障碍，设计治疗方法。
5.用于治疗患有认知功能的进行性损害或丧失或痴呆的受试者的方法，所述方法包括：
(a)使用权利要求1-3任一项的方法，在所述患者中诊断与认知功能的进行性损害或丧失或痴呆相关的认知障碍，和
(b)根据步骤(a)获得的结果，适应性调整治疗方法。
6.调整治疗策略以适应患有认知功能的进行性损害或丧失或痴呆的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用权利要求1-4任一项的方法，在所述患者中诊断或监测认知功能的进行性损害或丧失或痴呆，和
(b)相应地修改该患者的治疗策略。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中生物样品选自血液、血浆、血清、唾液、泪液、尿液、或脑脊液。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中诊断认知障碍或任何类型的痴呆(区别于健康对照)，或其中相对于其他类型的痴呆，诊断特定类型的痴呆，所述其他类型的痴呆包括但不限于阿尔茨海默病(AD)和AD型轻度认知功能损害(MCI)、额颞痴呆(FTD)和FTD型MCI、路易体痴呆(DLB)和DLB型MCI、帕金森病痴呆(PDD)和PDD型MCI、血管性痴呆、进行性核上性麻痹(PSP)、和皮质基底节变性(CBD)。
9.用于诊断和/或监测认知障碍，包括但不限于AD的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定ncRNA表达谱的至少一种试剂，所述nc表达谱包含选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)、或由其组成。
10.权利要求9的试剂盒，其中ncRNA表达谱包含选自以下的ncRNA或由选自以下的ncRNA组成：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种mRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lnc RNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNAs；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列的28种miRNA；
(xiii)表3所列的74种miRNA；
(xiv)表6所列的33种lncRNA；
(xv)表7所列的60种lncRNA；
(xvi)表8所列的32种lncRNA；
(xvii)表9所列的84种lncRNA；和
(xviii)表10所列的94种lncRNA。
11.权利要求9或10的试剂盒，其中至少一种试剂包含与目的ncRNA互补的特异性寡核苷酸。
12.用于下一代测序的靶向测序组，其包含特异于选自表1所列406种miRNA和表5所列1008种lncRNA中的至少一种ncRNA(miRNA和/或lncRNA)的核酸。
13.权利要求12的测序组，其中所述至少一种ncRNA包含选自以下的ncRNA：
(i)miR.99a.5p；
(ii)包括miR.99a.5p,miR.378d,miR.100.5p,miR.193b.3p,miR.34a.5p,miR.1306.5p,和miR.1229.3p的7种miRNA；
(iii)包括miR1220.3p,miR378d和miR99a.5p的3种miRNA；
(iv)包括miR.99a.5p,miR.1229.3p,miR.100.5p,miR.378d,miR.193b.3p,miR.1306.5p,miR.195.5p,miR.532.3p,miR.125b.5p,miR.34a.5p,和miR.6880.5p的11种mRNA；
(v)包括miR.23a.5p,miR.6880.5p,miR.7111.5p,miR.6812.5p,miR.6738.5p,miR.5196.5p,miR.6894.5p,miR.8085,miR.4463,miR.2392,miR.144.3p,miR.192.5p,miR.193b.3p,miR.194.5p,和miR.122.5p的15种miRNA；
(vi)包括lnc-DLG5-1:1,lnc-EBLN1-1:4,lnc-FAT1-7:2,lnc-PRR5-5:1,lnc-RBKS-6:1,lnc-FOXD4L5-35:1,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAM133B-2:1,lnc-ZNF726-1:3,lnc-AP3M1-1:1,lnc-DUSP10-6:1,lnc-TPPP-1:2,和LINC01206:20的13种lncRNA；
(vii)包括LINC02345:11,lnc-EBLN1-1:4,lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-FAT1-7:2,lnc-DKK1-5:3,和lnc-TACSTD2-2:4的7种lncRNA；
(viii)包括lnc-TPPP-1:2,ARRDC3-AS1:7,lnc-TENM3-3:5,lnc-TENM3-3:4,lnc-QRFP-5:1,lnc-CRYBB1-1:1,lnc-MGST3-1:3,lnc-FAM49B-8:1,HAND2-AS1:70,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-CNDP1-7:1,和lnc-C21orf58-1:2的12种lnc RNA；
(ix)包括lnc-TENM3-3:3,lnc-MARCH4-2:7,和lnc-LRRC1-5:2的3种lncRNAs；
(x)包括lnc-TPPP-1:2,lnc-TENM3-3:3,lnc-TMEM185B-12:7,lnc-NAXD-6:5,lnc-HECA-6:1,lnc-COMMD6-10:1,和MIR29B2CHG:46的7种lncRNA；
(xi)包括lnc-TPPP-1:2,LINC02345:11,lnc-ZNF273-4:4,lnc-TACC2-8:6,LINC01206:20,lnc-C5orf67-3:1,HAND2-AS1:58,lnc-PRDM9-20:1,lnc-CLK1-1:7,lnc-DNALI1-5:4,RORB-AS1:6,lnc-TPPP-1:3,lnc-BMS1-2:1,lnc-ADRB1-4:1,lnc-XXYLT1-5:1,MIR99AHG:104,LINC01748:17,和lnc-AKR1E2-15:1的18种lncRNA；
(xii)表2所列的28种miRNA；
(xiii)表3所列的74种miRNA；
(xiv)表6所列的33种lncRNA；
(xv)表7所列的60种lncRNA；
(xvi)表8所列的32种lncRNA；
(xvii)表9所列的84种lncRNA；和
(xviii)表10所列的94种lncRNA。
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