JP2020536503A - 認知障害の診断用のノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ） - Google Patents
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Abstract
本発明は、認知障害を有するかまたは発症するリスクがある対象におけるアルツハイマー病を含むがこれに限定されない認知障害の診断のための方法を記載する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮出願第６２／５５４，４２７号の利益および優先権を主張する。
本出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮出願第６２／５５４，４２７号の利益および優先権を主張する。
本発明は、ヒト薬剤の分野、および特に、アルツハイマー病を含む認知障害の診断に関する。本発明は、認知障害、特にアルツハイマー病のためのバイオマーカーであって、末梢体液中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、またはその組合せなどの循環性ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）からなり、このバイオマーカーを使用して認知障害、特にアルツハイマー病を診断するためまたはその発症もしくは進行をモニターするための非侵襲的方法を表す、バイオマーカーに関する。それは、診断目的のためならびに／またはこのバイオマーカーおよび患者からの末梢体液を使用する臨床試験における患者の層化および／もしくは治療戦略の有効性のモニタリングを含む他のヒト薬剤応用のための関連するキット、方法、プロトコールおよび伝達可能な情報形態にさらに関する。本発明は、したがって、患者の生活の質に対する強い影響力ならびに健康管理システムおよび経済に対する大きな影響力を有する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の進行性喪失により特徴付けられ、病理学的に、進行性のニューロン変性と関連付けられる、脳の神経原線維変化におけるアミロイド−ベータペプチド（Ａβ）の細胞外沈着および高リン酸化タウタンパク質の細胞内沈着により特徴付けられる、慢性の神経変性疾患である［Marcus et al. J Neurogenet. 2011; 25(4):127-33；Gotz et al, Br J Pharmacol. 2012; 165(5):1246-59］。
ＡＤは、最も一般的な形態の認知症である。世界中で約４６８０万人の人々が、現在、ＡＤまたは他の種類の認知症と共に生きている。人口の加齢と共に、この数は２０５０年までに１億３１５０万にまで増加すると推定されている（World Alzheimer Report, 2015: http://www.alz.co.uk/research/WorldAlzheimerReport2015.pdf）。そのため、ＡＤは、罹患した個体およびその家族に対してますます重要な負担となるだけでなく、先進国および新興国の両方における医療およびヘルスケア資源に対する経済的および社会的コストとなりつつある。
現在、ＡＤに対する治癒法はない。症候性治療がこの疾患に対して存在し、全てが、神経伝達物質の障害を打ち消すことを試みている。多数の新たな潜在的な疾患修飾治療剤候補が臨床試験において現在研究されているが、いずれもまだ承認されていない。２００２年から２０１２年までに、症候性剤（３６．６％）、疾患修飾小分子（３５．１％）および疾患修飾免疫療法（１８％）に関する２８９の第２相および第３相試験である９９．６％のＡＤ臨床試験は失敗した［Cummings et al., Expert Rev Clin Pharmacol. 2014;7(2):161-5］。ＡＤ分野の世界中の専門家および製薬産業によりＡＤ薬物開発の成功率を向上させることが提案されている戦略の中には、ａ）神経変性が始まる前に疾患プロセスに早期に介入すること、ｂ）非侵襲的であり、対象集団の層化および臨床試験における薬物有効性の縦断的モニタリングのために好適な早期診断用の正確なバイオマーカーを同定および開発することがある。
ＡＤの病理学的特徴は、検死組織病理学分析において定義される。ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＳＭ−ＩＶ）ならびにＣＥＲＡＤおよびＮＩＡ−Ｒｅａｇａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの両方の神経病理学的基準により認められるように、アミロイドプラークの存在は、ＡＤの確定診断のために絶対的に必要とされる特徴のままである。
疾患の現行の診断は不確実なままであり［Dubois et al Lancet Neurol. 2014;13(6):614-29］、それは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用する構造イメージングおよび／またはフルオロデオキシグルコースＦ１８（１８Ｆ−ＦＤＧ）の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用するグルコース代謝などの、一連の臨床的および神経心理学的試験ならびに神経イメージングの組合せに基づいており、方法および疾患の重篤度段階に応じて７０％〜８５％未満の精度を有する［Frisoni et al., Nat Rev Neurol. 2010; 6(2): 67-77；Tahmasian et al., J Nucl Med. 2016 ;57(3):410-5］。
場合により、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＤ関連バイオマーカーＡβ４２およびタウまたはリン酸化タウの検出が追加的に行われるが［Sunderland et al., JAMA. 2003;289(16):2094-2103］、ＣＳＦ試験は腰椎穿刺を要求し、腰椎穿刺は、侵襲的な手順であり、多くの場合に対象の入院を必要とする。加えて、これらのＣＳＦ試験の精度は不充分なままであり、最大３０％の対象は誤診断されることがあり、試験を縦断的に実施して、診断目的の確認のためにフォローアップすることができない。
縦断的な確認診断試験は、ＡＤの発症前段階および軽度認知障害（ＭＣＩ；最初のわずかな症状が現れる早期段階として定義される）の早期検出への応用のため、したがって、ＭＣＩのＡＤへの変換を早期に検出してそのリスクを算出するために必須である。その限界（侵襲的）に起因して、ＣＳＦ試験は、症状が現れる前の発症前ＡＤ段階における早期診断用のバイオマーカーとしてほとんど使用されず、縦断的臨床試験に登録された同じ対象においていくつかの時点において繰り返し実施されるコンパニオンバイオマーカーとして好適でない。
最近、ＡＤ病理学のために特定の神経イメージング方法が開発されており、これらは顕著には、ＦＤＡおよび／またはＥＭＡにより承認されたＦ−１８フロルベタピルおよびＦ−１８フルテメタモルを含む陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）神経イメージング用のインビボアミロイド−ベータ（Ａβ）リガンド用のリガンドを用いる（Choi et al., 2009およびWong et al., 2010）。しかしながら、それらの実施はコスト的に非常に限られており（ＰＥＴ技術を備えた大都市の一部の病院においてのみ利用可能であり、健康保険により還付されないので依然として主に研究目的である）、それらの診断精度は、さらなる理解のために依然として研究中である。したがって、これらのＡβ ＰＥＴ神経イメージング方法の使用は非常に限られたままであり、患者の大部分は、裕福な国においてさえそのような試験から利益を受けていない。
薬物開発試験のために含めるべきＡＤ患者集団のより良好な定義が必要とされており、Ａβリガンドを使用するＰＥＴイメージングは、ＡＤを有すると診断された対象の最大３０％は陰性Ａβスキャンを示すこと、および正常な認知状態を有する対象の最大３５％は陽性Ａβスキャンを示すことを示した（Gael Chetelat et al, NeuroImage Clinical 2013; 2:356-65）。したがって、ＰＥＴ Ａβスキャンは、大きい製薬企業による一部の臨床試験において所望のコホートに対象を登録するためのガイドとして使用されている。混合された軽度から中等度のＡＤを有する患者において試験された抗Ａβ抗体、例えばソラネズマブは、明確な有効性を示さなかったが、軽度ＡＤ患者亜群においてのみある程度の希望的なデータを伴った。ＣＳＦバイオマーカープロファイルに基づいて選択された軽度ＡＤ患者において、結果は有望な有効性を示した［Carlson et al., Alzheimers Dement (Amst). 2016; 2:75-85；Siemers et al., Alzheimers Dement. 2016;12(2):110-20］。しかしながら、ＣＳＦバイオマーカーの使用は侵襲的であり、薬物開発用のバイオマーカーとしてのその使用を劇的に制限する。例えば、それは、安定性および／または疾患の進行をモニターするための繰り返しの使用のために好適でなく、疾患修飾治療薬物候補または予防戦略の有効性を臨床的な縦断的試験においてモニターするために好適でない。
全体的に、既存の試験は、大きいＡＤ集団の診断用の使用のための容易なアクセス可能性および簡便性を欠いており、かつ／または精度（感度および特異度）を欠いている。これは、ＡＤ用の信頼できる迅速な診断試験を開発するための主要な障害およびボトルネックを表す。別の障害は、脊椎穿刺などの侵襲的な試料回収を必要としないバイオマーカーの同定である。細胞モデル、動物モデル、前臨床モデル、およびヒト試験により検証され得るそのようなアクセス可能な、高感度かつ高特異度のバイオマーカーの欠如は、ＡＤ用またはＡＤを誘発するもしくはＡＤの進行に関与する病理学的プロセスに関する研究用の療法および薬物の開発を妨害する。
今日、発症前および早期ＡＤを含むＡＤの診断用および薬物開発における応用（臨床試験における患者の層化および薬物有効性のモニタリング）用の正確かつ非侵襲的な末梢バイオマーカー試験についての満たされていない必要性が明確に存在する。
ｎｃＲＮＡは、短鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む。
ｍｉＲＮＡは、転写後レベルにおいて遺伝子発現を負にモジュレートする短鎖ノンコーディングＲＮＡ分子（１８〜２３ヌクレオチド）である。現在同定されているｍｉＲＮＡの約７０％は脳において発現される。ｍｉＲＮＡは、神経の発生、分化およびシナプス可塑性において大きな役割を果たす。一部の特定のｍｉＲＮＡは、ＡＤの脳、ＣＳＦおよび血液において異常に発現され［総説について、Hu et al., 2016, Front Aging Neurosci. 9(8):13］、ＡＤの診断におけるそれらの潜在的な価値を明らかにする。
ｌｎｃＲＮＡは、典型的に、２００ヌクレオチドより長い、組織特異的な方式で発現される転写物として定義される。脳において、ｌｎｃＲＮＡは、神経伝達およびシナプス可塑性を含む多様な機能を有するタンパク質のエピジェネティック、転写、および転写後レベルにおける遺伝子発現を調節することができる。最近の研究は、ＡＤ検死脳組織においてｌｎｃＲＮＡ候補を同定し、一部のｌｎｃＲＮＡ候補は、神経毒性Ａβの形成、シナプス活性またはニューロンＤＮＡ修復を直接的または間接的に調節する（総説について、Luo K and Chen Y, Clin Interv Aging 2016; 11: 867-872）。
ｍｉＲＮＡは、転写後レベルにおいて遺伝子発現を負にモジュレートする短鎖ノンコーディングＲＮＡ分子（１８〜２３ヌクレオチド）である。現在同定されているｍｉＲＮＡの約７０％は脳において発現される。ｍｉＲＮＡは、神経の発生、分化およびシナプス可塑性において大きな役割を果たす。一部の特定のｍｉＲＮＡは、ＡＤの脳、ＣＳＦおよび血液において異常に発現され［総説について、Hu et al., 2016, Front Aging Neurosci. 9(8):13］、ＡＤの診断におけるそれらの潜在的な価値を明らかにする。
ｌｎｃＲＮＡは、典型的に、２００ヌクレオチドより長い、組織特異的な方式で発現される転写物として定義される。脳において、ｌｎｃＲＮＡは、神経伝達およびシナプス可塑性を含む多様な機能を有するタンパク質のエピジェネティック、転写、および転写後レベルにおける遺伝子発現を調節することができる。最近の研究は、ＡＤ検死脳組織においてｌｎｃＲＮＡ候補を同定し、一部のｌｎｃＲＮＡ候補は、神経毒性Ａβの形成、シナプス活性またはニューロンＤＮＡ修復を直接的または間接的に調節する（総説について、Luo K and Chen Y, Clin Interv Aging 2016; 11: 867-872）。
ｍｉＲＮＡは循環することが公知であり、組織特異的なプロファイルが、血漿、ＣＳＦおよび尿などの多数の体液において同定され得るので、その発現レベルは診断バイオマーカーとしての可能性を有し得る。ディープシークエンシング技術における最近の発展は、神経変性疾患に特異的な末梢ｍｉＲＮＡシグネチャーをプロファイルするためにバイオマーカーパイプラインを開発するための実行可能なアプローチを提示する。
本発明者らは以前に、心臓組織または脳組織などの組織中で発現または高度に濃縮されたｌｎｃＲＮＡは、末梢循環に放出されて、異なる末梢試料において古典的なＲＴ−ＰＣＲにより容易に定量化可能であり得ることを示した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６５４９２）。ＲＴ−ＰＣＲに加えて、本発明者らは末梢試料に対するトータルＲＮＡシークエンシングも行い、血清、血漿およびＰａｘｇｅｎｅ−ＲＮＡチューブにより回収した全血などの末梢試料において大きな割合のｌｎｃＲＮＡを定量化した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６５４９２）。
本発明によれば、ほとんどの最近の技術ならびにＰａｘｇｅｎｅ全血チューブ、血清および血漿を含む非侵襲的な方式で回収された試料を組み合わせた方法的構成を使用して、神経変性疾患、特にＡＤに特異的な新たなｍｉＲＮＡシグネチャーおよびｌｎｃＲＮＡシグネチャーが同定された。
本発明は、軽度認知障害または認知障害を有するかまたは発症するリスクがある対象におけるアルツハイマー病を含むがこれに限定されない認知障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）シグネチャーにおける発現のレベルを検出することであって、ｎｃＲＮＡシグネチャーが、前記対象からの生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなる、前記検出すること；
（ｃ）試料中のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現のレベルを参照中の発現のレベルと比較すること
を含み、
参照中のレベルと比較された試料中の発現のレベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、
方法に関する。
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）シグネチャーにおける発現のレベルを検出することであって、ｎｃＲＮＡシグネチャーが、前記対象からの生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなる、前記検出すること；
（ｃ）試料中のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現のレベルを参照中の発現のレベルと比較すること
を含み、
参照中のレベルと比較された試料中の発現のレベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、
方法に関する。
一部の実施形態では、ｎｃＲＮＡシグネチャーは、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
本発明はまた、認知機能の喪失もしくは障害または認知症を患う対象において認知障害の発症または進行をモニターする方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡシグネチャーにおける発現のレベルを検出すること、ここでｎｃＲＮＡシグネチャーは、生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなる；
（ｃ）試料中のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現のレベルを参照中の発現のレベルと比較すること、
ここで、参照中のレベルと比較された試料中の発現のレベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、および
（ｄ）同定された前記認知障害に従って治療処置を設計すること
を含む方法に関する。
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡシグネチャーにおける発現のレベルを検出すること、ここでｎｃＲＮＡシグネチャーは、生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなる；
（ｃ）試料中のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現のレベルを参照中の発現のレベルと比較すること、
ここで、参照中のレベルと比較された試料中の発現のレベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、および
（ｄ）同定された前記認知障害に従って治療処置を設計すること
を含む方法に関する。
一部の実施形態では、ｎｃＲＮＡシグネチャーは、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
生物学的試料は、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿または脳脊髄液から得られた対象の小部分であってもよい。好適には、生物学的試料は、血漿または血清またはＰａｘｇｅｎｅ−ＲＮＡチューブである。
認知障害は、例えば、認知機能の進行性障害または進行性喪失、例えばＡＤを意味する。
認知障害または認知症の診断について：
「参照」は、例えば、認知障害症状を有さず、異常な神経イメージング所見を有さず、本発明の方法を用いて診断される患者に年齢をマッチさせた正常な健常対象からの試料などの好適な対照試料であってもよい。参照は、障害もしくは疾患症状の実証前または認知機能の障害もしくは喪失もしくは認知症の診断の前の同じ対象からの試料であってもよい。参照は、標準化された試料、例えば、認知障害症状を有さず、異常な神経イメージング所見を有さない健常対象のいくつかの試料からの材料またはデータを含む試料であってもよい。
「参照」は、例えば、認知障害症状を有さず、異常な神経イメージング所見を有さず、本発明の方法を用いて診断される患者に年齢をマッチさせた正常な健常対象からの試料などの好適な対照試料であってもよい。参照は、障害もしくは疾患症状の実証前または認知機能の障害もしくは喪失もしくは認知症の診断の前の同じ対象からの試料であってもよい。参照は、標準化された試料、例えば、認知障害症状を有さず、異常な神経イメージング所見を有さない健常対象のいくつかの試料からの材料またはデータを含む試料であってもよい。
他の認知症の種類およびそれらの軽度認知障害（ＭＣＩ）に対する特定の認知症の種類またはそのＭＣＩの鑑別診断について：
認知症の種類およびサブタイプは多数であり、例えば、以下を含む：
アルツハイマー（ＡＤ）およびＡＤ型のＭＣＩ
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ
レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ
パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ
血管性認知症
進行性核上麻痺（ＰＳＰ）
大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）
認知症の種類およびサブタイプは多数であり、例えば、以下を含む：
アルツハイマー（ＡＤ）およびＡＤ型のＭＣＩ
前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ
レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ
パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ
血管性認知症
進行性核上麻痺（ＰＳＰ）
大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）
１つの認知症サブタイプの鑑別診断のために、参照試料は、他の種類の認知症を患う患者からの試料であってもよい。例えば、ＡＤまたはＡＤ型のＭＣＩの鑑別診断のために、試料は、非ＡＤ型のＭＣＩ／認知症を有する患者からのもの（すなわち、ＦＴＤおよび／またはＤＬＢおよび／またはＰＤＤおよび／または血管性認知症および／またはＰＳＰおよび／またはＣＢＤおよび／または他の認知症を有する対象からの試料）、または別の疾患を患っていてもよいが認知障害および認知症のいずれも有しない対象からのものである。
本発明はまた、アルツハイマー病を含むがこれに限定されない認知障害を診断し、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を患う対象におけるその発症または進行をモニターする方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害の存在を決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害の存在を決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
本発明はまた、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡおよび他の神経認知試験などの利用可能な方法を使用した場合に見掛けのおよび／または測定可能な症状を有しないが、症状に先立って本発明のバイオマーカーの異常な変化を伴う対象において早期ＭＣＩおよび非常に軽度のアルツハイマー病を含むがこれらに限定されない認知障害を診断する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
本発明はさらに、ＭＲＩおよび／またはＣＴスキャンのような神経イメージング方法により見掛けのおよび／または測定可能な異常を有しない対象において早期ＭＣＩおよび非常に軽度のアルツハイマー病を含むがこれらに限定されない認知障害を予測診断する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
（ａ）本発明による方法を使用して前記対象の生物学的試料を使用して認知障害を発症するリスクを決定すること、および
（ｂ）工程（ａ）の結果の機能に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
本発明はまた、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を患う対象を処置する方法であって、
（ａ）本発明による方法を使用して前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に関連付けられる認知障害を診断すること、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた結果に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
（ａ）本発明による方法を使用して前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に関連付けられる認知障害を診断すること、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた結果に治療処置を適合させること
を含む方法に関する。
認知障害の治療処置の例は、以下の投与を含んでもよい：
認知障害、特にアルツハイマー病の処置のために既に承認された薬物、例えば、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネネペジル（ｄｏｎｅｎｅｐｅｚｉｌ）、リバスチグミンもしくはガランタミン）、もしくはＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、もしくは薬物の組合せ（例えば、ドネペジルおよびメマンチン）、ならびに／または
臨床開発されている新規の治療剤候補もしくは組合せ、例えば、抗アミロイド分野において現在試験されているもの（例えば、ベータ−セクレターゼ阻害剤および抗ベータ−アミロイドモノクローナル抗体）、および抗タウアプローチ、例えば、抗タウ分野において現在試験されているもの（例えば、タウリン酸化状態を調節するキナーゼもしくはホスファターゼのモジュレーターおよび抗タウ抗体）；および本発明のｎｃＲＮＡが関与する神経変性、シナプス可塑性、酸化ストレス、オートファジー、ミトコンドリア機能障害および免疫炎症経路などの分子経路をモジュレートする薬物候補。
認知障害、特にアルツハイマー病の処置のために既に承認された薬物、例えば、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネネペジル（ｄｏｎｅｎｅｐｅｚｉｌ）、リバスチグミンもしくはガランタミン）、もしくはＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチン）、もしくは薬物の組合せ（例えば、ドネペジルおよびメマンチン）、ならびに／または
臨床開発されている新規の治療剤候補もしくは組合せ、例えば、抗アミロイド分野において現在試験されているもの（例えば、ベータ−セクレターゼ阻害剤および抗ベータ−アミロイドモノクローナル抗体）、および抗タウアプローチ、例えば、抗タウ分野において現在試験されているもの（例えば、タウリン酸化状態を調節するキナーゼもしくはホスファターゼのモジュレーターおよび抗タウ抗体）；および本発明のｎｃＲＮＡが関与する神経変性、シナプス可塑性、酸化ストレス、オートファジー、ミトコンドリア機能障害および免疫炎症経路などの分子経路をモジュレートする薬物候補。
さらには、本発明は、ＡＤを含むがこれに限定されない認知障害を診断および／またはモニターするためのキットであって、生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなるｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定用の少なくとも１つの試薬を含む、キットを含む。
一部の実施形態では、ｎｃＲＮＡ発現プロファイルは、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
本発明のキットは、本発明のｍｉＲＮＡシグネチャーおよび／またはｌｎｃＲＮＡシグネチャーの測定を行うことを可能とし、キットは、上記に指し示されるような少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を測定するための少なくとも１つの試薬を含む。
「試薬」は、ｍｉＲＮＡ／遺伝子発現プロファイルの決定を特異的に可能とする試薬、すなわち、ｍｉＲＮＡ／遺伝子発現プロファイル中に存在するｍｉＲＮＡ／遺伝子の発現レベルの特異的な決定を特異的に目的とする試薬を意味する。例としては、例えば、ｍｉＲＮＡ／遺伝子発現プロファイル中に存在するｍｉＲＮＡ／遺伝子に特異的な増幅プライマーペア（フォワードおよびリワード（ｒｅｗａｒｄ））ならびに／またはプローブが含まれる。この定義は、任意の他のｍｉＲＮＡ／遺伝子の発現レベルの決定のために有用な汎用試薬を除外する。
「試薬」はまた、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定を特異的に可能とする試薬、すなわち、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡの発現レベルの特異的な決定を特異的に目的とする試薬を意味する。例としては、例えば、ｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡに特異的な増幅プライマーペア（フォワードおよびリワード）ならびに／またはプローブが含まれる。この定義は、任意の他のｌｎｃＲＮＡの発現レベルの決定のために有用な汎用試薬を除外する。
一部の実施形態では、認知障害を診断および／またはモニターするためのキットは、目的のｎｃＲＮＡに特異的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブおよびプローブ−標的核酸複合体を精製するための試薬を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、目的のｎｃＲＮＡの領域に相補的な配列を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、ＤＮＡである。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはビオチン化されており、プローブ−標的複合体を精製するための試薬は、ストレプトアビジンでコーティングされた基材、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子、例えば、Ｔ１ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズである。好ましい実施形態では、目的のｎｃＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。ｌｎｃＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブの長さは、３０〜８０ヌクレオチド、例えば、４０〜７０、４０〜６０、または約５０ヌクレオチドであってもよい。
本発明のさらなる実施形態は、生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）に特異的な核酸を含む、次世代シークエンシング用の標的化シークエンシングパネルに関する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）は、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
本発明はまた、アルツハイマー病を含むがこれに限定されない認知障害の処置のために臨床試験において試験される新たな治療戦略（薬物候補）の開発のための方法の応用に関し、方法は、（ａ）次に臨床試験に登録される患者の選択のための処置を開始する前に使用することができ、したがって、試験は、試験される治療戦略から利益を受ける患者集団を処置する可能性を増進させると同時にこの試験される新たな薬物候補から利益を受けない患者亜集団の患者の登録を回避し、かつ／または、（ｂ）新たな試験される薬物候補を用いる処置が開始されたら、試験される治療戦略の有効性を含む応答をモニターするために使用することができる。
さらなる態様では、本発明はまた、検出方法に関する。例えば、本発明は、少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）の検出方法を想定する。一態様では、本方法は、以下を含む：
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡシグネチャーにおける発現のレベルを検出すること、ここでｎｃＲＮＡシグネチャーは、前記対象からの生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡシグネチャーにおける発現のレベルを検出すること、ここでｎｃＲＮＡシグネチャーは、前記対象からの生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
一部の実施形態では、ｎｃＲＮＡシグネチャーは、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含むかまたはからなる。
ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、当業者により公知の任意の技術により決定されてもよい。特に、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、各ｍｉＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡの核酸転写物の量を測定することにより決定される。核酸転写物の量は、当業者により公知の任意の技術により測定され得る。測定は、抽出されたＲＮＡ試料に対して直接的に実行されてもよく、または当該技術分野において周知の技術により抽出されたＲＮＡから調製された逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して実行されてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料から、核酸転写物の量は、核酸マイクロアレイ、定量ＰＣＲ、シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、ＦＩＭＡＰ定量化、および標識プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む、当業者により公知の任意の技術を使用して測定されてもよい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、シークエンシング、例えば、次世代シークエンシングを使用して決定される。シークエンシングは、逆転写酵素を使用して抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後に実行されてもよく、またはＲＮＡ分子は直接的にシークエンシングされてもよい。本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない特定の実施形態では、次世代シークエンシングを使用する発現レベルの測定は、以下の通りに行われてもよい。簡潔に述べれば、ＲＮＡが試料（例えば、血液試料）から抽出される。ｒＲＮＡを除去した後、ＲＮＡ試料はｃＤＮＡに逆転写される。鎖特異性を確実にするために、一本鎖ｃＤＮＡが最初に、アクチノマイシンＤの存在下でＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素およびランダムプライマーを使用して合成された後、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを組み込んだ第２鎖マーキングミックス（ｓｅｃｏｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｍａｒｋｉｎｇ ｍｉｘ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換される。結果として得られた平滑末端化ｃＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズを使用して精製される。３’末端アデニル化工程の後、アダプターがｃＤＮＡに取り付けられる。そのようにして得られたｃＤＮＡ（シークエンシングライブラリー）は、ＰＣＲにより増幅されてもよい。シークエンシングライブラリーは、当業者により公知の任意の次世代シークエンシング技術によりシークエンシングされ得る。
一部の実施形態では、例えばシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）による、ｎｃＲＮＡの発現レベルの測定は、測定前に目的のｎｃＲＮＡに対応する核酸（ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を捕捉および濃縮することにより促進される。本明細書において使用される場合、濃縮は、目的の核酸を選択的に精製することにより初期試料と比べて試料中の目的の核酸のパーセンテージを増加させることを指す。目的のｎｃＲＮＡに対応する核酸の濃縮は、抽出されたＲＮＡ試料または抽出されたＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ試料に対して実行され得る。一部の実施形態では、目的のｎｃＲＮＡに対応する核酸は、プローブおよび標的核酸のハイブリダイゼーションによりプローブ−標的核酸複合体を形成させることを可能とする条件下でＲＮＡまたはｃＤＮＡ試料を目的のｎｃＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、目的のｎｃＲＮＡの領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ）にハイブリダイズさせることにより捕捉および濃縮される。プローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、好ましくはＤＮＡである。プローブ−標的核酸複合体は、当業者により公知の任意の技術により精製され得る。好ましい実施形態では、プローブはビオチン化されている。ビオチン化プローブ−標的核酸複合体は、ストレプトアビジンでコーティングされた基材、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性粒子、例えば、Ｔ１ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用することにより精製され得る。好ましい実施形態では、この方法により測定されるｎｃＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。ｌｎｃＲＮＡに特異的なプローブの長さは、３０〜８０ヌクレオチド、例えば、４０〜７０、４０〜６０、または約５０ヌクレオチドであってもよい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、定量ＰＣＲを使用して決定されてもよい。定量ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲは、当業者にとって周知かつ容易に利用可能な技術であり、詳細な記載は必要ない。本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない特定の実施形態では、定量ＰＣＲを使用する発現プロファイルの決定は、以下の通りに行われてもよい。簡潔に述べれば、リアルタイムＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実行される。６μｌのｃＤＮＡが、７．５μｌのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．７５μｌのプローブおよびプライマーの２０Ｘ混合物ならびに０．７５μｌの水を含有する９μｌのＰＣＲ混合物に加えられる。反応は、５０℃で２分の１回の開始工程の後、９５℃で１０分、ならびに９５℃で１５秒および６０℃で１分を含む増幅の４０サイクルからなる。反応およびデータ取得は、ＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われ得る。試料中の鋳型転写物分子の数は、蛍光シグナルがバックグラウンド蛍光より高く検出され得る指数期中の増幅サイクル（サイクル閾値またはＣＱまたはＣＴ）を記録することにより決定される。したがって、鋳型転写物分子の出発数は、ＣＴに逆相関する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、核酸マイクロアレイの使用により決定されてもよい。核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライドまたはマイクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に取り付けられた種々の核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカもしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、またはニトロセルロースから構成されていてもよい。プローブは、ｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡマイクロアレイ」）またはオリゴヌクレオチド（「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」）などの核酸であり得る。標的核酸試料の発現プロファイルを決定するために、前記試料は標識され、ハイブリダイゼーション条件においてマイクロアレイと接触させられて、マイクロアレイ表面に取り付けられたプローブ配列に相補的な標的核酸との間の複合体の形成に繋がる。標識化されたハイブリダイズした複合体の存在が次に検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、ＦＩＭＡＰ定量化により決定されてもよい。簡潔に述べれば、ｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、化学的に修飾されたｑＰＣＲ用と同じ配列を有するプライマーを使用するＰＣＲにより増幅される。フォワードプライマーは５’においてリン酸化されており、リバースプライマーは５’においてビオチン化されている。ＰＣＲ生成物はエキソヌクレアーゼにより消化されて、リン酸化された鎖が取り除かれ、ビオチン化されたもののみが保たれる。ビオチン化されたＰＣＲ生成物は、目的のＲＮＡに相補的なオリゴでコーティングされたコーディングシリカマイクロディスク（ｃｏｄｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｍｉｃｒｏｄｉｓｋｓ）（標的オリゴ当たり１コード）とインキュベートされ、ハイブリダイズした生成物は、蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートの添加により明らかにされる。ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、蛍光シグナルを測定することにより決定される。
またさらなる態様では、検出方法は、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡおよび／または１つもしくは複数のｌｎｃＲＮＡを測定または検出するための試薬の使用を想定する。「試薬」は、ｍｉＲＮＡ／遺伝子またはｌｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定を特異的に可能とする試薬、すなわち、ｍｉＲＮＡ／遺伝子発現プロファイル中に存在するｍｉＲＮＡ／遺伝子またはｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡの発現レベルの特異的な決定を特異的に目的とする試薬を意味する。例としては、例えば、ｍｉＲＮＡ／遺伝子発現プロファイル中に存在するｍｉＲＮＡ／遺伝子および／またはｌｎｃＲＮＡ発現プロファイル中に存在するｌｎｃＲＮＡに特異的な増幅プライマーペア（フォワードおよびリワード）ならびに／またはプローブが挙げられる。この定義は、任意の他のｍｉＲＮＡ／遺伝子の発現レベルの決定のために有用な汎用試薬および任意の他のｌｎｃＲＮＡの発現レベルの決定のために有用な汎用試薬を除外する。
いっそうさらなる態様では、検出方法は、生物学的試料からの１つまたは複数のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡを検出することを含み、生物学的試料は、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液から選択される。一部の実施形態では、生物学的試料は血液である。
認知障害、特に、認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症、例えば、ＡＤを発症するリスクがあるかまたはそれを有する対象を「処置する」または該対象の「処置」は、障害または疾患の少なくとも１つの症状が、治癒され、軽減され、治りまたは改善されるようにそれを必要とする対象にレジメンを投与することまたは該投与を意味する。本発明によれば、診断結果に応じて、対象は、適合された治療処置に付され、かつさらにモニターされる。本発明のｍｉＲＮＡシグネチャーおよび／またはｌｎｃＲＮＡシグネチャーに基づく対象のモニタリングは、治療処置のさらなる適合または改変、例えば、薬物量の増加、相乗効果を得るための薬物の組合せの投与、または有効量の別の薬物による薬物の置換を可能とする。
本発明はまた、本発明による認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症の（インビトロ）診断またはモニタリングの方法を使用して診断および／またはモニターされた認知障害を患う対象における治療戦略の改変に関する。
本発明によれば、本発明のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡは、ＡＤを含むがこれに限定されない認知障害を診断するために現在使用されている１つまたは複数のバイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。そのようなバイオマーカーの例は、米国特許第９，３７７，４７２号明細書、米国特許第７，８９７，７８６号明細書および米国特許第６，７０３，２１２号明細書（これらの内容は参照することにより本明細書に含まれる）に開示されるようなバイオマーカーを含むがこれらに何ら限定されない。本発明のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡを１つまたは複数の公知のバイオマーカーと組み合わせた本発明の方法は、診断の精度の増進、または鑑別診断、およびより効率的かつ成功裡の薬物開発、例えば、承認された療法または開発中の新規の薬物の有効性の臨床試験およびモニタリングにおける登録前の患者の層化についての精度の増進を可能とし得る。
本発明によれば、本発明のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡは、ＡＤを含むがこれに限定されない認知障害を診断するためおよび／または鑑別診断目的のために現在使用されている１つまたは複数の試験と組み合わせて使用されてもよい。そのような試験の例は、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡなどの神経心理学的試験、および神経イメージング方法、特に体積測定ＭＲＩを含むがこれらに何ら限定されない。本発明のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡを１つまたは複数の公知のバイオマーカーと組み合わせた本発明の方法は、診断の精度の増進、または鑑別診断、およびより効率的かつ成功裡の薬物開発、例えば、承認された療法または開発中の新規の薬物の有効性の臨床試験およびモニタリングにおける登録前の患者の層化についての精度の増進を可能とし得る。
ＡＤおよびＡＤ型の軽度認知障害（ＭＣＩ）の病理発生に特異的に関与するｍｉＲＮＡシグネチャーを同定するために、ＡＤまたはＡＤ型のＭＣＩを有する患者の群および脳イメージング異常を有しない認知に問題のない健常対照の群を含む種々の群からの試料中の計２０８３のｍｉＲＮＡをスクリーニングした。その後に全ての試料中のｍｉＲＮＡプロファイリングを行い、４０６のｍｉＲＮＡが閾値より高く検出された。種々の群の試料において測定されたｍｉＲＮＡ発現レベルの比較により、ＡＤまたはＡＤ型の認知障害を有すると診断（臨床現場の神経学部門において、神経認知および神経心理学的試験ならびに神経イメージング試験ならびに脳脊髄液バイオマーカー：ベータ−アミロイドペプチド１−４２（Ａβ４２）およびタウ（全体および／またはリン酸化）に基づく）された患者群の試料中の発現レベルと比較して対照群の試料中で差次的に発現されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡバイオマーカー候補として同定した。
ＡＤおよびＡＤ型の軽度認知障害（ＭＣＩ）の病理発生に特異的に関与するｌｎｃＲＮＡシグネチャーを同定するために、ＡＤまたはＡＤ型のＭＣＩを有する患者の群および脳イメージング異常を有しない認知に問題のない健常対照の群を含む種々の群からの試料中の計１２７８０２のｌｎｃＲＮＡをスクリーニングした。その後に全ての試料中のｌｎｃＲＮＡプロファイリングを行い、１９８６７のｌｎｃＲＮＡが閾値より高く検出された。種々の群の試料において測定されたｌｎｃＲＮＡ発現レベルの比較により、ＡＤまたはＡＤ型の認知障害を有すると診断（臨床現場の神経学部門において、神経認知および神経心理学的試験ならびに神経イメージング試験ならびに脳脊髄液バイオマーカー：ベータ−アミロイドペプチド１−４２（Ａβ４２）およびタウ（全体および／またはリン酸化）に基づく）された患者群の試料中の発現レベルと比較して対照群の試料中で差次的に発現されたｌｎｃＲＮＡをｌｎｃＲＮＡバイオマーカー候補として同定した。
２群間の両側ウェルチｔ検定および／またはウィルコクソン−マン−ホイットニー検定を使用して発現レベルを解析した。有意な差次的発現は、ｐ＜０．０５として同定した。倍数変化およびＡＵＣ（曲線下面積）を各ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡならびに各試験条件について算出する。倍数変化≧１．４９倍もしくは≦０．７５倍の変化および／またはＡＵＣ＞０．６もしくは＜０．４に基づいて差次的発現が決定された場合にｍｉＲＮＡ候補も選択し、それを表２、表３および表４に指し示す。
倍数変化≧１．６（もしくは≦０．６）および／またはＡＵＣ≧０．８０（もしくは＜０．２０）に基づいて差次的発現が決定された場合にｌｎｃＲＮＡ候補も選択し、それを表６および表７に指し示す。
ランダムフォレストアルゴリズム（Breimann 2001、Breiman and Cutler 2001）を使用してモデルを構築し、かつランダムフォレストアルゴリズムを使用して、上位ｍｉＲＮＡおよび／または上位ｌｎｃＲＮＡを選択した。上位２〜２０のｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡの組合せに基づく予測モデルは、８０％以上の精度で疾患を予測することを可能とする。
測定した２０８３のｍｉＲＮＡのうち、４０６のｍｉＲＮＡは閾値より高い発現レベルを示した。４０６のｍｉＲＮＡの配列を表１に示す。
分析した４０６の検出可能なｍｉＲＮＡのうち、２８のｍｉＲＮＡは統計的に有意な差（ウェルチＴ検定ｐ値＜０．０５）を示し、これらの候補のうち、７つの候補はｐ値＜０．０１を示した。２８のｍｉＲＮＡを表２に示す。
４０６の検出されたｍｉＲＮＡのうち、計７４のｍｉＲＮＡ候補はまた、ＡＵＣ値≧０．６または≦０．４を示し、これらのうちの計１１の候補は良好なＡＵＣ値≧０．６５または≦０．３５を示し、１つの候補は非常に良好なＡＵＣ値≧０．７または≦０．３０を示した。７４の候補ｍｉＲＮＡを表３に示す。
４０６の検出されたｍｉＲＮＡのうち、計１５の候補は、ＡＵＣ値≧０．６または≦０．４および倍数変化値≧１．４９または≦０．７５の両方を示した。１５のｍｉＲＮＡのリストを表４に示す。
シークエンシングした１２７８０２のｌｎｃＲＮＡのうち、統計解析用の閾値発現レベルに基づいて１９８６７のｌｎｃＲＮＡを選択した。健常対照集団とのＡＤ患者の比較は、１００８のｌｎｃＲＮＡは統計的有意性（ｐ値＜０．０５、ウィルコクソン検定）を有して差次的に発現されることを示した（表５）。これらの１００８のｌｎｃＲＮＡの配列を本出願に含まれる配列表に示す。
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）を有して差次的に発現される１００８のｌｎｃＲＮＡのうち、３３のｌｎｃＲＮＡは倍数変化＞２または＜０．５を示し、それを表６に示す。
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）を有して差次的に発現される１００８のｌｎｃＲＮＡのうち、６０のｌｎｃＲＮＡはＡＵＣ≧０．８５を示し、それを表７に示す。
２つ以上のｍｉＲＮＡのシグネチャーを含むｐ値＜０．０５を有する選択されたｍｉＲＮＡを使用した場合のＡＤ患者集団と健常対照集団とを鑑別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測的モデリングからの結果は、良好な精度を示した。例えば、３つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐを含むシグネチャーは、０．８３９の良好なＡＵＣおよび８１．８％の精度を可能とした。
解析した計１９８６７のｌｎｃＲＮＡを使用した場合のＡＤ患者集団と健常対照集団とを鑑別するためのランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測的モデリングは、ｌｎｃＲＮＡの数の関数としてＡＵＣが以下の１３のｌｎｃＲＮＡでプラトーに達したことを示すことを可能とした。これらの１３のｌｎｃＲＮＡを使用してモデルを構築した。結果は、このｌｎｃＲＮＡシグネチャーは、ＡＵＣ値＝０．９９３、精度＝９５．８％、感度＝１００％および特異度＝９１．７％で２つの集団（軽度ＡＤ患者および健常対照集団）の鑑別を可能としたことを示す。
統計的有意性（ｐ値＜０．０５）を有して差次的に発現された１００８のｌｎｃＲＮＡのうち、倍数変化＞２（もしくは＜０．５）またはＡＵＣ≧０．８５（もしくは≦０．１５）を有する９０のｌｎｃＲＮＡをランダムフォレストアルゴリズムに基づく予測的モデリングのために使用した。結果は、以下の上位７の順位の候補を用いて、１００％のＡＵＣ値の他に、１００％の精度、１００％の感度および１００％の特異度で、ＡＤ群とＨＶ群との完全な鑑別が可能となったことを示す。
倍数変化≧１．６およびＡＵＣ≧０．８５を有するｌｎｃＲＮＡのリストを考慮して別のフィルターを適用した場合、ランダムフォレストアルゴリズムの使用は、モデルを構築するために以下の上位１２の順位のｌｎｃＲＮＡを選択することを可能とし、これは、いっそう優れたＡＵＣ＝０．９７９、９５．８％の優れた精度、９１．７％の感度および１００％の特異度でＡＤ集団とＨＶ集団とを鑑別することを可能とした。
最良のｌｎｃＲＮＡ候補をさらに選択するために、ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健常対照集団における統計的に有意な差次的発現ならびに行った７つの神経心理学的試験のうちＭＭＳＥおよび／またはＭＯＣＡを含む神経認知試験のスコアとの良好な相関（ピアソンＲ係数）の両方を有するｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットに適用した（表８）。結果は、以下の上位３の順位のｌｎｃＲＮＡのシグネチャーは、ＡＵＣ＝０．９５３、９１．７％、９１．７％および９１．７％の精度、感度および特異度でＡＤ患者集団と健常対照集団との優れた鑑別を可能としたことを示す。
ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健常対照集団における統計的に有意な差次的発現ならびに神経イメージングスコア（測定した１２０より多くの構造のうちの中側区画、左および右海馬、左および右扁桃体、嗅内皮質などの認知および記憶に関連する脳構造の体積）との良好な相関（ピアソン）の両方を有する表９からのｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットにも適用した。結果は、以下の上位７の順位のｌｎｃＲＮＡのシグネチャーは、ＡＵＣ＝０．９９３、精度＝９５．８％、感度＝９１．７％および特異度＝１００％でＡＤ患者集団と健常対照集団との優れた鑑別を可能としたことを示す。
ランダムフォレストアルゴリズムを使用するモデリングを、ＡＤ患者対健常対照集団における統計的に有意な差次的発現およびＡＤ病理学に高い関連性を有するＣＳＦバイオマーカー：Ａβ４２、タウまたはリン酸化タウのレベルとの良好な相関（ピアソン）の両方を有する表１０からのｌｎｃＲＮＡ候補の特定のセットにも適用した。結果は、以下の上位１８の順位のｌｎｃＲＮＡのシグネチャーは、ＡＵＣ＝０．９７２、精度＝０．９１７、感度＝０．８３および特異度＝１でＡＤ患者集団と健常対照集団との優れた鑑別を可能としたことを示す。
材料および方法
ヒト対象の血漿または血清または全血試料中のｍｉＲＮＡを同定するために、ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｖ２ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＨＴＧ ＷＴＡ Ｖ２、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して２０８３のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。この技術は、抽出フリー溶解プロセスの後にヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）を使用して測定用のヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の化学量論ライブラリーを調製するヌクレアーゼ保護標的化ＲＮＡシークエンシングアッセイに基づく。
ヒト対象の血漿または血清または全血試料中のｍｉＲＮＡを同定するために、ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｖ２ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＨＴＧ ＷＴＡ Ｖ２、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）を使用して２０８３のｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。この技術は、抽出フリー溶解プロセスの後にヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）を使用して測定用のヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の化学量論ライブラリーを調製するヌクレアーゼ保護標的化ＲＮＡシークエンシングアッセイに基づく。
ヒト対象の血清、血漿または全血試料中のｌｎｃＲＮＡを同定するために、循環性トータルＲＮＡを最初に抽出し、シークエンシングライブラリーをリボソームＲＮＡの除去により調製し（ＲｉｂｏＺｅｒｏ ＴｒｕＳｅｑ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）、２×７５ｂｐのリード長さを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００によりシークエンシングした。
また、特異的プライマーを使用するｑＰＣＲによりｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡ）を測定した。このために、循環性トータルＲＮＡを最初に抽出し、特異的プライマーを使用する逆転写およびリアルタイムＰＣＲを行った。ＦｉＭＡＰを使用する自社開発のプラットフォームは、検出プローブに連結された相補的なオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロディスク上でのＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーションに基づいた。トータルＲＮＡを抽出した後、ｎｃＲＮＡに対する特異的プライマーを使用していくつかの標的のマルチプレックスを可能とする逆転写およびＰＣＲ工程を行った。定量化は、したがって、各ｎｃＲＮＡに特異的なコーディングマイクロディスクを使用してＦｉＭＡＰプラットフォーム上で行った。
患者集団および試料
血清または血漿試料を、リチウム−ヘパリンチューブ中に回収された血液試料から調製し、全血試料をＰａｘｇｅｎｅ ＲＮＡチューブに回収した。試料は、健常ボランティア（ＨＶ）、フランス国ミュルーズの「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ」（ＥＦＳ）のドナーから、ならびに２０１５年１月２２日のＩＤ ＲＣＢ：２０１５−Ａ００１１８−４１の下でのＡＤＫＩＴ研究、２０１６年２月４日のＩＤ ＲＣＢ：２０１６−Ａ２００２２７−４４の下での時間生物学的研究を含むｔｈｅ Ａｇｅｎｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ Ｓａｎｔｅ（ＡＮＳＭ）に登録されたＡｍｏｎｅｔａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓをスポンサーとする前向き研究のプロトコールに従って登録された認知に問題のない健常対照対象および軽度認知障害または異なる段階のアルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者からのものであった。
血清または血漿試料を、リチウム−ヘパリンチューブ中に回収された血液試料から調製し、全血試料をＰａｘｇｅｎｅ ＲＮＡチューブに回収した。試料は、健常ボランティア（ＨＶ）、フランス国ミュルーズの「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ」（ＥＦＳ）のドナーから、ならびに２０１５年１月２２日のＩＤ ＲＣＢ：２０１５−Ａ００１１８−４１の下でのＡＤＫＩＴ研究、２０１６年２月４日のＩＤ ＲＣＢ：２０１６−Ａ２００２２７−４４の下での時間生物学的研究を含むｔｈｅ Ａｇｅｎｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｓｅｃｕｒｉｔｅ ｄｕ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｉｔｓ ｄｅ Ｓａｎｔｅ（ＡＮＳＭ）に登録されたＡｍｏｎｅｔａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓをスポンサーとする前向き研究のプロトコールに従って登録された認知に問題のない健常対照対象および軽度認知障害または異なる段階のアルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者からのものであった。
ｍｉＲＮＡについての方法
ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑラン
ＨＴＧ ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｉＲＮＡ（ＷＴＡ） ｋｉｔを使用した（ＨＴＧ ＷＴＡ Ｖ２、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）。試料を以下のプロトコールに従って調製した：１５μｌの血漿溶解緩衝液および１５μｌの血漿試料および３μｌのプロテイナーゼＫを混合し、オービタル振盪と共に５０℃で６０分間インキュベートした。２５μｌの混合液をＨＴＧサンプルプレートに移し、ＨＴＧプロセッサーにロードしてヌクレアーゼ保護アッセイを行い、化学量論のＮＰＰを調製した。
ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑラン
ＨＴＧ ｗｈｏｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｉＲＮＡ（ＷＴＡ） ｋｉｔを使用した（ＨＴＧ ＷＴＡ Ｖ２、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）。試料を以下のプロトコールに従って調製した：１５μｌの血漿溶解緩衝液および１５μｌの血漿試料および３μｌのプロテイナーゼＫを混合し、オービタル振盪と共に５０℃で６０分間インキュベートした。２５μｌの混合液をＨＴＧサンプルプレートに移し、ＨＴＧプロセッサーにロードしてヌクレアーゼ保護アッセイを行い、化学量論のＮＰＰを調製した。
分子バーコード化およびアダプター付加
血漿試料について、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（ＭＯ３３２Ｓ、ＮＥＢ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）酵素を使用してバーコード化を行った。各試料について、２．４μｌのＨｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、０．６μｌのｄＮＴＰ（１０ｎＭ）（ＮＥＢ、Ｎ０４４７Ｓ）、６μｌのＯｎｅＴａｑ ＰＣＲ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘ（Ｂ９０２３Ｓ、ＮＥＢ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、３μｌのフォワードおよびリバースプライマー（ＨＴＧ ＷＴＡ、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、３μｌの試料調製物および１２μｌのＨ２０を混合する。ＰＣＲ工程は、以下のサイクリングプロファイル：９５℃で４分間の後、９５℃で１５秒間、５５℃で４５秒間および６８℃で４５秒間の１６サイクルを使用してＡＢＩ ２７２０ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにより行った。プロトコールは、６８℃での１０分間により終了した。
血漿試料について、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（ＭＯ３３２Ｓ、ＮＥＢ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）酵素を使用してバーコード化を行った。各試料について、２．４μｌのＨｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、０．６μｌのｄＮＴＰ（１０ｎＭ）（ＮＥＢ、Ｎ０４４７Ｓ）、６μｌのＯｎｅＴａｑ ＰＣＲ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘ（Ｂ９０２３Ｓ、ＮＥＢ、Ｅｖｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）、３μｌのフォワードおよびリバースプライマー（ＨＴＧ ＷＴＡ、ＨＴＧ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｔｕｓｃｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、３μｌの試料調製物および１２μｌのＨ２０を混合する。ＰＣＲ工程は、以下のサイクリングプロファイル：９５℃で４分間の後、９５℃で１５秒間、５５℃で４５秒間および６８℃で４５秒間の１６サイクルを使用してＡＢＩ ２７２０ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにより行った。プロトコールは、６８℃での１０分間により終了した。
ＰＣＲクリーンアップ
ライブラリーから過剰なプライマーを除去するために、Ａｇｅｎｔｃｏｕｒ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。各試料について、３７．５μｌのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを１５μｌのＰＣＲ生成物と組み合わせて使用する。ピペットを用いて１０回混合した後に、溶液を室温で５分間インキュベートした後、マグネットスタンド上に置く。２分のビーズの分離の後、ビーズを乱すことなく、清澄溶液を慎重に除去する。ビーズを２００μｌのエタノール（８０％）で２回洗浄する。ビーズに連結（ｌｉｎｋ）されたＰＣＲ生成物の溶出を２５μｌのＨ２０を用いて行う。ＰＣＲ生成物の精製溶液を新たなチューブに入れ、プレートをマグネットスタンド上に置いてＰＣＲ生成物およびビーズを分離する。
ライブラリーから過剰なプライマーを除去するために、Ａｇｅｎｔｃｏｕｒ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。各試料について、３７．５μｌのＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを１５μｌのＰＣＲ生成物と組み合わせて使用する。ピペットを用いて１０回混合した後に、溶液を室温で５分間インキュベートした後、マグネットスタンド上に置く。２分のビーズの分離の後、ビーズを乱すことなく、清澄溶液を慎重に除去する。ビーズを２００μｌのエタノール（８０％）で２回洗浄する。ビーズに連結（ｌｉｎｋ）されたＰＣＲ生成物の溶出を２５μｌのＨ２０を用いて行う。ＰＣＲ生成物の精製溶液を新たなチューブに入れ、プレートをマグネットスタンド上に置いてＰＣＲ生成物およびビーズを分離する。
ライブラリー濃度の決定：
各試料についてライブラリーの濃度を決定するために、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＫ４８２４、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｔｅｒｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する。各反応について、混合液は、１２μｌのＭａｓｔｅｒｍｉｘ、０．４μｌのＲＯＸ染料、３．６μｌのＨ２０および４μｌの鋳型（１／１００００に希釈された標準物質またはライブラリー）から構成される。試料を、以下のサイクル：９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒および６５℃で４５℃の３５サイクルを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（Ｈｉｇｈ ＲＯＸ）に投入し、データ収集の後に解離曲線を行った。標準物質は４５２ｂｐのアンプリコンに対応している一方、バーコードを有するＮＰＰのアンプリコンは１１５ｂｐに対応する。比を適用して各ライブラリーの濃度を決定する。
各試料についてライブラリーの濃度を決定するために、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＫ４８２４、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｎｔｅｒｒｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する。各反応について、混合液は、１２μｌのＭａｓｔｅｒｍｉｘ、０．４μｌのＲＯＸ染料、３．６μｌのＨ２０および４μｌの鋳型（１／１００００に希釈された標準物質またはライブラリー）から構成される。試料を、以下のサイクル：９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒および６５℃で４５℃の３５サイクルを用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ（Ｈｉｇｈ ＲＯＸ）に投入し、データ収集の後に解離曲線を行った。標準物質は４５２ｂｐのアンプリコンに対応している一方、バーコードを有するＮＰＰのアンプリコンは１１５ｂｐに対応する。比を適用して各ライブラリーの濃度を決定する。
試料のプールおよびシークエンシング
４ｎＭのプールされたライブラリーを生成するために各試料をプールする。このプールされたライブラリーから５μｌを、新たに調製した０．２ＮのＮａＯＨと混合し、２分間インキュベートした。溶液を短くボルテックスし、２８０ｇで１分間遠心分離し、９９０μｌの予め冷却した（ｐｒｅ−ｃｈｉｌｌｅｒ）ＨＴ１ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ ｖ２ ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）と混合した。２０ｐＭの１５％ ＰｈｉＸ（ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を調製した。２６０μｌの２０ｐＭで調製した変性ライブラリーを３９μｌの２０ｐＭのＰｈｉＸと混合し、１００１μｌのＨＴ１ ＢｕｆｆｅｒをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｖ２ １５０ ｃｙｃｌｅｓ ｋｉｔにロードし、シークエンシングした。
４ｎＭのプールされたライブラリーを生成するために各試料をプールする。このプールされたライブラリーから５μｌを、新たに調製した０．２ＮのＮａＯＨと混合し、２分間インキュベートした。溶液を短くボルテックスし、２８０ｇで１分間遠心分離し、９９０μｌの予め冷却した（ｐｒｅ−ｃｈｉｌｌｅｒ）ＨＴ１ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ ｖ２ ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）と混合した。２０ｐＭの１５％ ＰｈｉＸ（ＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を調製した。２６０μｌの２０ｐＭで調製した変性ライブラリーを３９μｌの２０ｐＭのＰｈｉＸと混合し、１００１μｌのＨＴ１ ＢｕｆｆｅｒをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｖ２ １５０ ｃｙｃｌｅｓ ｋｉｔにロードし、シークエンシングした。
配列解析
データの再構築および解析をＩｌｌｕｍｉｎａ ＳｅｑｕｅｎｃｅｒからのＦＡＳＴＱファイルを直接的に使用して行い、ＨＴＧ Ｐａｒｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅにより処理した。
データの再構築および解析をＩｌｌｕｍｉｎａ ＳｅｑｕｅｎｃｅｒからのＦＡＳＴＱファイルを直接的に使用して行い、ＨＴＧ Ｐａｒｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅにより処理した。
統計
供給業者により推奨される方法を使用してデータを正規化する。この正規化は、７０（供給業者により推奨される閾値）より低い全ての値をフィルター除去した後の配列の総数に基づく。正規化後、この閾値の７５パーセンタイルを有する全てのｍｉＲＮＡをノイズとみなし、除去した。
供給業者により推奨される方法を使用してデータを正規化する。この正規化は、７０（供給業者により推奨される閾値）より低い全ての値をフィルター除去した後の配列の総数に基づく。正規化後、この閾値の７５パーセンタイルを有する全てのｍｉＲＮＡをノイズとみなし、除去した。
アルツハイマー病患者を健常対照対象から鑑別するｍｉＲＮＡを決定するために、以下の統計的方法を正規化データに適用する：両側ウェルチｔ検定および倍数変化の計算（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を正規化データに対して行った。試料中に検出された各ｍｉＲＮＡについて個々のＲＯＣ曲線を行った。ＡＵＲＯＣに関して最良のｍｉＲＮＡを用いるランダムフォレストアルゴリズムを行って、アルツハイマー病の診断用の予測モデルを確立した。
目的のｍｉＲＮＡの最終リストを、ｐ値＜０．０５またはＬｏｇ２において倍数変化≧１．４９もしくは≦０．７５および／または選択されたバイオマーカーの３つのリスト（表１、表２および表３）の少なくとも１つにある全てのｍｉＲＮＡの選択により決定された個々のＡＵＣを用いて選択した。
ｌｎｃＲＮＡについての方法
試料のシークエンシング
Ｎｏｒｇｅｎ Ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＲＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ＫｉｔおよびＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｕｔｅ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して、１．５ｍｌの血清から開始してリボ核酸（ＲＮＡ）の抽出を行う。
試料のシークエンシング
Ｎｏｒｇｅｎ Ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ＫｉｔおよびＲＮＡ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ＫｉｔおよびＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｕｔｅ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って使用して、１．５ｍｌの血清から開始してリボ核酸（ＲＮＡ）の抽出を行う。
ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＲｉｂｏＺｅｒｏ ｒＲＮＡ ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ、Ｃ）と組み合わせてＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用して、抽出されたＲＮＡの総量からシークエンシングライブラリーを調製する。全ての工程は低スループットプロトコールを用いて製造業者の説明書に従って行い、フラグメンテーション工程は行わない。簡潔に述べれば、細胞質リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をビオチン化標的特異的オリゴにハイブリダイズさせ、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用して除去する。ｒＲＮＡ枯渇ＲＮＡ試料を次に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に逆転写する。鎖特異性を確実にするために、一本鎖ｃＤＮＡを最初に、アクチノマイシンＤの存在下でＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびランダムプライマーを使用して合成した後、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを組み込んだ第２鎖マーキングミックスを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換する。結果として得られた平滑末端化ｃＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズを使用して精製する。３’末端アデニル化工程の後、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアダプターライゲーションを行う。そのようにして得られた一本鎖のインデックス付けされたライブラリーを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを使用して２回洗浄して過剰なアダプターを除去し、ＰＣＲ（１５サイクル）により濃縮する。ＰＣＲ生成物を最終のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ洗浄液を用いて精製し、シークエンシング準備済みライブラリーを３０μｌの再懸濁緩衝液中に溶出させる。
品質管理のために、１μｌの各ライブラリーを、製造業者の推奨に従ってＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐを使用してＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに投入する。アダプター二量体の非存在をチェックし、平均ライブラリーサイズをリージョンテーブルにより決定する。ライブラリーをＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＱｕｂｉｔ ２．０により定量化する。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより以前に決定されたライブラリーサイズを使用して質量濃度からモル濃度を算出する。
全てのライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００（２×７５ｂｐ）を用いてシークエンシングする。
バイオインフォマティクス解析
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ解析をＰａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ ｂｕｉｌｄ ６）を使用して行う。Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗのｐｒｅ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＱＡ／ＱＣ ｍｏｄｕｌｅを使用してＦＡＳＴＱファイルのリードクオリティを可視化する。全てのリードを調べる。未加工ＦＡＳＴＱファイルをクオリティスコア（Ｐｈｒｅｄスコア）の関数として３’末端においてトリミングする。使用するパラメーターは、３０の末端最小クオリティレベルおよび５０の最小トリミングリード長である。非アライメントリードをホモサピエンスｈｇ１９ゲノムを使用してマッピングする。このマッピングは、ソフトウェアＳＴＡＲのバージョン２．５．３［Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. (2013). STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 15-21］を使用して行う。デフォルトのパラメーターを使用する。Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗのｐｏｓｔ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＱＣ ｍｏｄｕｌｅを使用して、位置当たりの平均塩基クオリティスコアの他に、アライメント当たりのマッピングクオリティを可視化した。マッピングされたリードを、Ｐａｒｔｅｋ Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ／Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（Ｅ／Ｍ）アルゴリズム［Xing, Y., Yu, T., Wu, Y.N., Roy, M., Kim, J., and Lee, C. (2006). An expectation-maximization algorithm for probabilistic reconstructions of full-length isoforms from splice graphs. Nucleic Acids Res. 34, 3150-3160］を使用する定量化用の特許付与されたｌｎｃＲＮＡアノテーションを有するＧＴＦファイルを使用して定量化した。デフォルトのパラメーターを使用する。中央値が遺伝子間領域中のリード密度の中央値下にある転写物を解析の次の工程のために廃棄する。転写物数をＣＰＭ（１００万当たりの数）により正規化した。１つの群の少なくとも半分の試料において高発現（ＣＰＭ≧１０）を示す転写物のみを考慮する。
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ解析をＰａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ Ｉｎｃ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ ｂｕｉｌｄ ６）を使用して行う。Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗのｐｒｅ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＱＡ／ＱＣ ｍｏｄｕｌｅを使用してＦＡＳＴＱファイルのリードクオリティを可視化する。全てのリードを調べる。未加工ＦＡＳＴＱファイルをクオリティスコア（Ｐｈｒｅｄスコア）の関数として３’末端においてトリミングする。使用するパラメーターは、３０の末端最小クオリティレベルおよび５０の最小トリミングリード長である。非アライメントリードをホモサピエンスｈｇ１９ゲノムを使用してマッピングする。このマッピングは、ソフトウェアＳＴＡＲのバージョン２．５．３［Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. (2013). STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinforma. Oxf. Engl. 29, 15-21］を使用して行う。デフォルトのパラメーターを使用する。Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗのｐｏｓｔ−ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＱＣ ｍｏｄｕｌｅを使用して、位置当たりの平均塩基クオリティスコアの他に、アライメント当たりのマッピングクオリティを可視化した。マッピングされたリードを、Ｐａｒｔｅｋ Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ／Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（Ｅ／Ｍ）アルゴリズム［Xing, Y., Yu, T., Wu, Y.N., Roy, M., Kim, J., and Lee, C. (2006). An expectation-maximization algorithm for probabilistic reconstructions of full-length isoforms from splice graphs. Nucleic Acids Res. 34, 3150-3160］を使用する定量化用の特許付与されたｌｎｃＲＮＡアノテーションを有するＧＴＦファイルを使用して定量化した。デフォルトのパラメーターを使用する。中央値が遺伝子間領域中のリード密度の中央値下にある転写物を解析の次の工程のために廃棄する。転写物数をＣＰＭ（１００万当たりの数）により正規化した。１つの群の少なくとも半分の試料において高発現（ＣＰＭ≧１０）を示す転写物のみを考慮する。
統計解析および予測的モデリング
差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡを決定するために、統計解析をウィルコクソン−マン−ホイットニーのパラメトリック検定を使用して行う。ｐ値≦０．０５を有するｌｎｃＲＮＡを差次的に発現されると考える。２つの分類のための分類モデルを構築するために、一個抜き交差検証を用いるＲのＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙｓ（ＣＭＡ）パッケージ［Slawski M, Daumer M, Boulesteix AL. CMA: a comprehensive Bioconductor package for supervised classification with high dimensional data. BMC Bioinformatics 2008, 9:439］を使用した。この予測的モデリングのために使用されるアルゴリズムは、（ａ）ランダムフォレスト、（ｂ）線形判別分析および（ｃ）ナイーブベイズである［Breiman L. Random forests. Machine Learning, 45(1): 5-32, 2001］。
差次的に発現されるｌｎｃＲＮＡを決定するために、統計解析をウィルコクソン−マン−ホイットニーのパラメトリック検定を使用して行う。ｐ値≦０．０５を有するｌｎｃＲＮＡを差次的に発現されると考える。２つの分類のための分類モデルを構築するために、一個抜き交差検証を用いるＲのＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙｓ（ＣＭＡ）パッケージ［Slawski M, Daumer M, Boulesteix AL. CMA: a comprehensive Bioconductor package for supervised classification with high dimensional data. BMC Bioinformatics 2008, 9:439］を使用した。この予測的モデリングのために使用されるアルゴリズムは、（ａ）ランダムフォレスト、（ｂ）線形判別分析および（ｃ）ナイーブベイズである［Breiman L. Random forests. Machine Learning, 45(1): 5-32, 2001］。
モデル中のＲＮＡ候補の順位を１０候補選択の平均順位により算出した（ＣＶ−ｆｏｌｄ当たり）。モデル（およびＲＮＡ選択方法）毎にＡＵＣをモデル中のＲＮＡの数の関数としてプロットした。モデル当たりのＲＮＡの最適な数を図式により決定した。ＲＯＣ曲線および混同行列を生成して、本発明者らのモデルの予測性能を評価した。ＡＵＣの値、精度、感度、特異度、正および負の予測値を報告する。
ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡの定量化のための追加の方法
トータルＲＮＡ抽出
製造業者の説明書に従ってそれぞれＰａｘｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、Ｃａｎａｄａ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。
トータルＲＮＡ抽出
製造業者の説明書に従ってそれぞれＰａｘｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ、Ｃａｎａｄａ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｋｉｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによりＲＮＡ品質を調べた。ＲＮＡ Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＱｕｂｉｔ ３．０ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによりＲＮＡ量を測定した。
ｃＤＮＡ合成
トータルＲＮＡを以下の通りにｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのｃＤＮＡ合成のために使用した。ｍｉＲＮＡについて、１００ｎｇのＲＮＡを、１μｌの１０ｘポリ（Ａ）ポリメラーゼ緩衝液、０．１ｍＭのＡＴＰ、１μＭのユニバーサルｍｉＲＮＡ ＲＴ−プライマー、０．１ｍＭの各デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１００単位のＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）および１単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含む１０μｌの最終容量中で逆転写し、４２℃で１時間インキュベートした後、９５℃で５分間酵素不活性化を行った。ＲＴ−プライマーの配列は、５’−ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（Ｖは、Ａ、ＣおよびＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴである）であった。プライマーは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。
トータルＲＮＡを以下の通りにｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡのｃＤＮＡ合成のために使用した。ｍｉＲＮＡについて、１００ｎｇのＲＮＡを、１μｌの１０ｘポリ（Ａ）ポリメラーゼ緩衝液、０．１ｍＭのＡＴＰ、１μＭのユニバーサルｍｉＲＮＡ ＲＴ−プライマー、０．１ｍＭの各デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、１００単位のＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）および１単位のポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含む１０μｌの最終容量中で逆転写し、４２℃で１時間インキュベートした後、９５℃で５分間酵素不活性化を行った。ＲＴ−プライマーの配列は、５’−ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ（Ｖは、Ａ、ＣおよびＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴである）であった。プライマーは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。
ｌｎｃＲＮＡについて、製造業者の説明書に従ってｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して逆転写を行った。
ｑＰＣＲの定量化
ｌｎｃＲＮＡについて、ｌｎｃＲＮＡに対応する０．１Ｘ（１００ｎＭ）の各プライマーペアと共にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用して前増幅反応物を調製した。１６の前増幅サイクルを供給業者により公表されるように行った（５０℃で２分、９６℃で１０分の後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル）。ｍｉＲＮＡの増幅のために、プライマーをｍｉＲｐｒｉｍｅｒ ｔｏｏｌ（ＰＭＩＤ：２４４７２４２７）を使用して設計した。ＴＥ緩衝液中に１／２０に希釈された１μｌのｃＤＮＡまたは前増幅生成物（それぞれｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡについて）、５μｌの２ｘ Ｓｏａｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）および２５０ｎＭの各プライマーを含む１０μｌの総容量で生物学的試料の定量ＰＣＲを行った。サイクリング条件は、９５℃で５〜１０分の後、９５℃で１０〜３０秒および６０℃で３０〜６０秒の４０サイクルであった。融解曲線解析（６０℃〜９９℃）を熱的プロファイルの後に行って、増幅における特異性を確実にした。ＣＦＸ ｍａｅｓｔｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）を使用して５ｌｏｇスケールで実現された標準曲線に対して相対発現レベルを決定した。
ｌｎｃＲＮＡについて、ｌｎｃＲＮＡに対応する０．１Ｘ（１００ｎＭ）の各プライマーペアと共にＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用して前増幅反応物を調製した。１６の前増幅サイクルを供給業者により公表されるように行った（５０℃で２分、９６℃で１０分の後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクル）。ｍｉＲＮＡの増幅のために、プライマーをｍｉＲｐｒｉｍｅｒ ｔｏｏｌ（ＰＭＩＤ：２４４７２４２７）を使用して設計した。ＴＥ緩衝液中に１／２０に希釈された１μｌのｃＤＮＡまたは前増幅生成物（それぞれｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡについて）、５μｌの２ｘ Ｓｏａｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＵＳＡ）および２５０ｎＭの各プライマーを含む１０μｌの総容量で生物学的試料の定量ＰＣＲを行った。サイクリング条件は、９５℃で５〜１０分の後、９５℃で１０〜３０秒および６０℃で３０〜６０秒の４０サイクルであった。融解曲線解析（６０℃〜９９℃）を熱的プロファイルの後に行って、増幅における特異性を確実にした。ＣＦＸ ｍａｅｓｔｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）を使用して５ｌｏｇスケールで実現された標準曲線に対して相対発現レベルを決定した。
ＦＩＭＡＰ定量化
目的のｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをまた、Ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ（Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）により開発されたＦＩＭＡＰ／ＱＭＡＰプラットフォームを使用して定量化した。簡潔に述べれば、化学的に修飾されたｑＰＣＲ用と同じ配列を有するプライマーを使用するＰＣＲによりｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを増幅した。フォワードプライマーは５’においてリン酸化されており、リバースプライマーは５’においてビオチン化されていた。マルチプレックスＰＣＲ反応を、以下の条件：９４℃で３０秒の後、９４℃で３０秒、６０℃で１分および６８℃で１分の２５サイクル、その後６８℃で５分間の最終の伸長を用いて２μｌのｍｉＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ ｃＤＮＡ、２５０ｎＭの各プライマーおよび１０μｌの２Ｘ Ｏｎｅ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２Ｘ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有する２０μｌの反応液中でＢｉｏｒａｄ Ｔ１００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにより行った。ＰＣＲ生成物を次に２５Ｕのラムダエキソヌクレアーゼを３７℃で３０分間用いて消化して、リン酸化された鎖を取り除き、ビオチン化されたもののみを保った。そのように消化した生成物を、目的のＲＮＡに相補的なオリゴでコーティングされたコーディングシリカマイクロディスク（標的オリゴ当たり１コード）を使用してＱＭＡＰにより定量化した。簡潔に述べれば、ビオチン化されたＰＣＲ生成物を９６ウェルプレート中でコーティングマイクロディスクとインキュベートし、ハイブリダイズした生成物を、洗浄工程後に蛍光ストレプトアビジンコンジュゲート、ＳＡＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により明らかにした。プレートをスポット当たり２つの画像を撮影するＱＭＡＰによりイメージングし、１つは蛍光を定量化するための暗い画像、１つはマイクロディスクコードを読むための白色光画像であった。各標的の相対発現を次に、関連付けられるマイクロディスクコードに従って蛍光シグナルを各標的に割り当てることによりＱＭＡＰ ｓｏｆｔｗａｒｅにより算出する。
目的のｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをまた、Ｑｕａｎｔａｍａｔｒｉｘ（Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）により開発されたＦＩＭＡＰ／ＱＭＡＰプラットフォームを使用して定量化した。簡潔に述べれば、化学的に修飾されたｑＰＣＲ用と同じ配列を有するプライマーを使用するＰＣＲによりｌｎｃＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを増幅した。フォワードプライマーは５’においてリン酸化されており、リバースプライマーは５’においてビオチン化されていた。マルチプレックスＰＣＲ反応を、以下の条件：９４℃で３０秒の後、９４℃で３０秒、６０℃で１分および６８℃で１分の２５サイクル、その後６８℃で５分間の最終の伸長を用いて２μｌのｍｉＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ ｃＤＮＡ、２５０ｎＭの各プライマーおよび１０μｌの２Ｘ Ｏｎｅ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２Ｘ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有する２０μｌの反応液中でＢｉｏｒａｄ Ｔ１００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにより行った。ＰＣＲ生成物を次に２５Ｕのラムダエキソヌクレアーゼを３７℃で３０分間用いて消化して、リン酸化された鎖を取り除き、ビオチン化されたもののみを保った。そのように消化した生成物を、目的のＲＮＡに相補的なオリゴでコーティングされたコーディングシリカマイクロディスク（標的オリゴ当たり１コード）を使用してＱＭＡＰにより定量化した。簡潔に述べれば、ビオチン化されたＰＣＲ生成物を９６ウェルプレート中でコーティングマイクロディスクとインキュベートし、ハイブリダイズした生成物を、洗浄工程後に蛍光ストレプトアビジンコンジュゲート、ＳＡＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の添加により明らかにした。プレートをスポット当たり２つの画像を撮影するＱＭＡＰによりイメージングし、１つは蛍光を定量化するための暗い画像、１つはマイクロディスクコードを読むための白色光画像であった。各標的の相対発現を次に、関連付けられるマイクロディスクコードに従って蛍光シグナルを各標的に割り当てることによりＱＭＡＰ ｓｏｆｔｗａｒｅにより算出する。
結果
ｍｉＲｂａｓｅ ｖ２０に基づく２０８３のｍｉＲＮＡのプロファイリングを軽度障害または中等度アルツハイマー病を患う患者および認知に問題のない健常対象からの血漿試料に対して行った。ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ技術を用いて生成された結果の正規化後、試料当たり４０６のｍｉＲＮＡの平均は正に同定された。同定されたこれらの４０６のｍｉＲＮＡから、アルツハイマー病の予測値を有するｍｉＲＮＡを同定するために統計解析を行った。
ｍｉＲｂａｓｅ ｖ２０に基づく２０８３のｍｉＲＮＡのプロファイリングを軽度障害または中等度アルツハイマー病を患う患者および認知に問題のない健常対象からの血漿試料に対して行った。ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ技術を用いて生成された結果の正規化後、試料当たり４０６のｍｉＲＮＡの平均は正に同定された。同定されたこれらの４０６のｍｉＲＮＡから、アルツハイマー病の予測値を有するｍｉＲＮＡを同定するために統計解析を行った。
ランダムフォレストアルゴリズムを分類モデルのために使用した。これから、高い予測値を有する２〜２０のｍｉＲＮＡのいくつかのセットが同定され、これらのセットは、０．７７を上回る精度、０．７７を上回る特異度および０．７４より優れた感度と共に０．８３９〜０．７９３の範囲内のＡＵＣを提供する。図２は、０．８３９のＡＵＣを有する３つのｍｉＲＮＡを組み合わせた予測モデルを示す。
アルツハイマー病の診断のために有用なｍｉＲＮＡのリストを生成した。このリストは、複数の統計解析：個々のＡＵＣ、倍数変化およびｐ値についてのｔ検定（表２、表３および表４）を使用して決定された。０．０５より低いｐ値を有するデータセットから、７４のｍｉＲＮＡを血漿リチウムヘパリン試料から選択した。それらを倍数変化≧１．４９または≦０．７５および個々のＡＵＣ＞０．６または＜０．４に基づいてさらに解析した。表２、表３および表４を参照。
ＬＮＣｉｐｅｄｉａ ｖ５．２に基づく１２７，８０２の転写物のプロファイリングをアルツハイマー病を患う患者および認知に問題のない健常対象からの血清試料に対してｔｏｔａｌ−ＲＮＡｓｅｑ技術を使用して行った。１２７，８０２の転写物の中で、１つの群の少なくとも半分の試料において１０を上回るＣＰＭの発現レベルを有する１９８６７のｌｎｃＲＮＡが同定された。
１９８６７のｌｎｃＲＮＡのうち、アルツハイマー病の診断のために有用な１００８のｌｎｃＲＮＡを統計的有意性（ｐ値＜０．０５、ウィルコクソン検定）に基づいて選択した。ランダムフォレストアルゴリズムを分類モデルのために使用した。これから、高い予測値を有する２〜２０のｌｎｃＲＮＡのいくつかのセットが同定された。選択された２〜２０のｌｎｃＲＮＡのセットは、０．７から最大１の範囲内のＡＵＣを０．７〜１の範囲内の精度、感度および特異度と共に提供する。
図３〜１２は、ａ）個々のｌｎｃＲＮＡの発現のレベル（図３）、ｂ）ボルカノプロットとして図式化される、２つの集団を区別するための統計的有意性（ｐ値）（図４）、ｃ）アルツハイマーの診断用のｌｎｃＲＮＡシグネチャーのいくつかのセットの同定を可能とするランダムフォレストアルゴリズムを使用する予測的モデリング（図５〜１０）およびｄ）神経イメージングまたはＣＳＦバイオマーカーとのｌｎｃＲＮＡレベルの相関（図１１、１２）に関する結果の例を示す。
Claims (13)
- 認知障害を有するかまたは発症するリスクがある対象における（アルツハイマー病を含むがこれに限定されない）認知障害の診断のための方法であって、
（ａ）対象から生物学的試料を単離すること；
（ｂ）ｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）シグネチャーにおける発現のレベルを検出すること、ここでｎｃＲＮＡシグネチャーは、前記対象からの生物学的試料中の表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなる；
（ｃ）試料中の発現のレベルを参照中の発現のレベルと比較する
ことを含み、
ここで、参照中のレベルと比較した試料中の発現のレベルの増加または減少が、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクがある対象を同定する、方法。 - ｎｃＲＮＡシグネチャーが、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。 - 工程（ｂ）においてｎｃＲＮＡの発現レベルが、（神経認知試験、神経イメージング方法および／またはＣＳＦバイオマーカーなどの）認知障害の検出のために好適な別のバイオマーカーと組み合わせて検出される、請求項１または２に記載の方法。
- 工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、ならびに
（ｄ）同定された前記認知障害に従って治療処置を設計すること
を含む、認知機能の喪失もしくは障害または認知症を患う対象において認知障害の発症または進行をモニターするための、先行請求項のいずれかに記載の方法。 - 認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を患う対象を処置する方法であって、
（ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の方法を使用して前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症に関連する認知障害を診断すること、および
（ｂ）工程（ａ）において得られた結果に治療処置を適合させること
を含む、方法。 - 認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を患う対象に治療戦略を適合させる方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の方法を使用して前記患者における認知機能の進行性障害もしくは喪失または認知症を診断またはモニターすること、および
（ｂ）それに従って患者の治療戦略を改変すること
を含む、方法。 - 生物学的試料が、血液、血漿、血清、唾液、涙液、尿または脳脊髄液から選択される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- 認知障害または任意の認知症型が診断される（健常対照に対する差異）か、または特定の種類の認知症が、（アルツハイマー（ＡＤ）、ＡＤ型の軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＦＴＤ型のＭＣＩ、レビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）およびＤＬＢ型のＭＣＩ、パーキンソン病型認知症（ＰＤＤ）およびＰＤＤ型のＭＣＩ、血管性認知症、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含むがこれらに限定されない）他の種類の認知症に対して診断される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
- （ＡＤを含むがこれに限定されない）認知障害を診断および／またはモニターするためのキットであって、表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）を含むかまたはからなるｎｃＲＮＡ発現プロファイルの決定のための少なくとも１つの試薬を含む、キット。
- ｎｃＲＮＡ発現プロファイルが、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含む、請求項９に記載のキット。 - 少なくとも１つの試薬が、目的のｎｃＲＮＡに相補的な特定のオリゴヌクレオチドを含む、請求項９または１０に記載のキット。
- 表１に列記される４０６のｍｉＲＮＡおよび表５に列記される１００８のｌｎｃＲＮＡから選択される少なくとも１つのｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡおよび／またはｌｎｃＲＮＡ）に特異的な核酸を含む、次世代シークエンシング用の標的化シークエンシングパネル。
- 少なくとも１つのｎｃＲＮＡが、
（ｉ） ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ；
（ｉｉ） ７つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２９．３ｐ；
（ｉｉｉ） ３つのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ１２２０．３ｐ、ｍｉＲ３７８ｄおよびｍｉＲ９９ａ．５ｐ；
（ｉｖ） １１のｍＲＮＡ：ｍｉＲ．９９ａ．５ｐ、ｍｉＲ．１２２９．３ｐ、ｍｉＲ．１００．５ｐ、ｍｉＲ．３７８ｄ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１３０６．５ｐ、ｍｉＲ．１９５．５ｐ、ｍｉＲ．５３２．３ｐ、ｍｉＲ．１２５ｂ．５ｐ、ｍｉＲ．３４ａ．５ｐ、およびｍｉＲ．６８８０．５ｐ；
（ｖ） １５のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ．２３ａ．５ｐ、ｍｉＲ．６８８０．５ｐ、ｍｉＲ．７１１１．５ｐ、ｍｉＲ．６８１２．５ｐ、ｍｉＲ．６７３８．５ｐ、ｍｉＲ．５１９６．５ｐ、ｍｉＲ．６８９４．５ｐ、ｍｉＲ．８０８５、ｍｉＲ．４４６３、ｍｉＲ．２３９２、ｍｉＲ．１４４．３ｐ、ｍｉＲ．１９２．５ｐ、ｍｉＲ．１９３ｂ．３ｐ、ｍｉＲ．１９４．５ｐ、およびｍｉＲ．１２２．５ｐ；
（ｖｉ） １３のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＤＬＧ５−１：１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＰＲＲ５−５：１、ｌｎｃ−ＲＢＫＳ−６：１、ｌｎｃ−ＦＯＸＤ４Ｌ５−３５：１、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ１３３Ｂ−２：１、ｌｎｃ−ＺＮＦ７２６−１：３、ｌｎｃ−ＡＰ３Ｍ１−１：１、ｌｎｃ−ＤＵＳＰ１０−６：１、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、およびＬＩＮＣ０１２０６：２０；
（ｖｉｉ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＥＢＬＮ１−１：４、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＦＡＴ１−７：２、ｌｎｃ−ＤＫＫ１−５：３、およびｌｎｃ−ＴＡＣＳＴＤ２−２：４；
（ｖｉｉｉ） １２のｌｎｃ ＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＡＲＲＤＣ３−ＡＳ１：７、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：５、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：４、ｌｎｃ−ＱＲＦＰ−５：１、ｌｎｃ−ＣＲＹＢＢ１−１：１、ｌｎｃ−ＭＧＳＴ３−１：３、ｌｎｃ−ＦＡＭ４９Ｂ−８：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：７０、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＣＮＤＰ１−７：１、およびｌｎｃ−Ｃ２１ｏｒｆ５８−１：２；
（ｉｘ） ３つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＭＡＲＣＨ４−２：７、およびｌｎｃ−ＬＲＲＣ１−５：２；
（ｘ） ７つのｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ｌｎｃ−ＴＥＮＭ３−３：３、ｌｎｃ−ＴＭＥＭ１８５Ｂ−１２：７、ｌｎｃ−ＮＡＸＤ−６：５、ｌｎｃ−ＨＥＣＡ−６：１、ｌｎｃ−ＣＯＭＭＤ６−１０：１、およびＭＩＲ２９Ｂ２ＣＨＧ：４６；
（ｘｉ） １８のｌｎｃＲＮＡ：ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：２、ＬＩＮＣ０２３４５：１１、ｌｎｃ−ＺＮＦ２７３−４：４、ｌｎｃ−ＴＡＣＣ２−８：６、ＬＩＮＣ０１２０６：２０、ｌｎｃ−Ｃ５ｏｒｆ６７−３：１、ＨＡＮＤ２−ＡＳ１：５８、ｌｎｃ−ＰＲＤＭ９−２０：１、ｌｎｃ−ＣＬＫ１−１：７、ｌｎｃ−ＤＮＡＬＩ１−５：４、ＲＯＲＢ−ＡＳ１：６、ｌｎｃ−ＴＰＰＰ−１：３、ｌｎｃ−ＢＭＳ１−２：１、ｌｎｃ−ＡＤＲＢ１−４：１、ｌｎｃ−ＸＸＹＬＴ１−５：１、ＭＩＲ９９ＡＨＧ：１０４、ＬＩＮＣ０１７４８：１７、およびｌｎｃ−ＡＫＲ１Ｅ２−１５：１；
（ｘｉｉ） 表２に列記される２８のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｉｉ） 表３に列記される７４のｍｉＲＮＡ；
（ｘｉｖ） 表６に列記される３３のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖ） 表７に列記される６０のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉ） 表８に列記される３２のｌｎｃＲＮＡ；
（ｘｖｉｉ） 表９に列記される８４のｌｎｃＲＮＡ；および
（ｘｖｉｉｉ） 表１０に列記される９４のｌｎｃＲＮＡ
からなる群から選択されるｎｃＲＮＡを含む、請求項１２に記載のシークエンシングパネル。
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