WO2023085307A1 - 診断マーカー検出方法、及び診断キット - Google Patents

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WO2023085307A1
WO2023085307A1 PCT/JP2022/041683 JP2022041683W WO2023085307A1 WO 2023085307 A1 WO2023085307 A1 WO 2023085307A1 JP 2022041683 W JP2022041683 W JP 2022041683W WO 2023085307 A1 WO2023085307 A1 WO 2023085307A1
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gene
disease
site
numb
detection method
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PCT/JP2022/041683
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滋樹 光永
逸朗 井ノ上
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大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to diagnostic marker detection methods and diagnostic kits.
  • SAD Sporadic Alzheimer's disease
  • a ⁇ amyloid- ⁇
  • a ⁇ positron emission tomography reports that A ⁇ accumulation begins approximately 20 years before the onset of dementia. This potential accumulation over time makes early clinical diagnosis of dementia and the predementia stage, mild cognitive impairment (MCI), difficult.
  • a ⁇ accumulation is tested by amyloid PET, which is radioactive, invasive, expensive, and available in limited facilities.
  • the major components of A ⁇ , A ⁇ 42, phosphorylated tau, and total tau are also measured in cerebrospinal fluid (CSF) as biomarkers for SAD, but CSF collection remains invasive. Therefore, research and development of blood biomarkers for early diagnosis and screening tests are ongoing.
  • CSF-measured proteins/peptides miRNAs, long non-coding RNAs (lncRNAs), mRNAs, and circular RNAs have also been studied. Attempts to use these various blood RNAs as biomarkers generally involve combining many types of RNA and are somewhat complicated.
  • VSRAD analyzes regions of interest (ROI) of medial temporal structures such as the entorhinal cortex, hippocampus and amygdala, but atrophy is more common in patients with SAD.
  • ROI regions of interest
  • genomic mosaicism due to somatic mutations is present in the brain and is observed in both SAD and NCI.
  • Somatic mutations include single nucleotide variants (SNVs), copy number variants (CNVs), aneuploidies, and activation of retrotransposons.
  • SNVs single nucleotide variants
  • CNVs copy number variants
  • aneuploidies aneuploidies
  • retrotransposons activation of retrotransposons.
  • APP gen cDNA is present in a form integrated into genomic DNA, is characterized by the absence of introns and the presence of intra-exon junctions.
  • the APP gen cDNA is neuron-specific and the number of Foci in DNA in situ hybridization (DISH) analysis is higher in SAD than in NCI.
  • DISH DNA in situ hybridization
  • An increase in the DISH foci of APP gen cDNA with age has also been reported using mouse models of SAD.
  • plasma nucleic acid levels have been reported to be increased in SAD compared to NCI. Since brain atrophy is driven by necrosis/apoptosis, these reports suggest that APP gen cDNA and its transcripts, like other cfDNA and cfRNA, are released into the plasma from injured neurons. (For example, see Non-Patent Document 1.).
  • NUMB gene the NUMB endocytic adaptor protein gene
  • PROK2 gene the prokineticin 2 gene
  • these NUMB gene and PROK2 gene are also expected to leak out from injured neurons in the same way as APPgen cDNA.
  • APP gen cDNA is formed by recombination in somatic cells rather than germline cells, its abundance is low, and it is thought that plasma APP gen cDNA is also very low.
  • nucleic acids are easily amplified, so if they can be amplified, it may be possible to detect APP gen cDNA even in plasma.
  • neuronal damage and associated nucleic acid release can be detected even before the onset of dementia.
  • it is suggested that early diagnosis of SAD is possible if APP gen cDNA in plasma can be detected.
  • nucleic acids released from damaged neurons or glial cells can be detected, it is suggested that early diagnosis of SAD is possible.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a diagnostic marker detection method and a diagnostic kit that can diagnose Alzheimer's disease simply, highly sensitively, rapidly, and non-invasively.
  • a diagnostic marker detection method for detecting a disease-related gene from circulating nucleic acids (CNA) in peripheral blood isolated from a subject [2] The diagnostic marker detection method according to [1], wherein the disease is Alzheimer's disease. [3] The diagnostic marker detection method according to [1] or [2], wherein the disease-related gene is an amyloid precursor protein (APP) gene. [4] The method for detecting a diagnostic marker according to any one of [1] to [3], wherein the junction between exons of the disease-related gene is detected. [5] The diagnostic marker detection method according to [4], wherein the junction between exons of the disease-related gene is the junction of exons 7 and 9 of the APP gene.
  • CNA circulating nucleic acids
  • [6] The method for detecting a diagnostic marker according to [4], wherein the junction between exons of the disease-related gene is the junction of exons 14 and 16 of the APP gene.
  • [7] The method for detecting a diagnostic marker according to any one of [1] to [3], wherein homologous recombination sites between exons of the disease-related gene are detected.
  • [8] The method for detecting a diagnostic marker according to [1] or [2], wherein the disease-related gene is NUMB endocytic adapter protein gene (NUMB gene) or prokineticin2 gene (PROK2 gene).
  • the exon junction site or homologous recombination site, or the region containing the NUMB gene or PROK2 gene is amplified by singleplex PCR or multiplex PCR, and the next generation Quantify by analyzing the base sequence of the amplified product with a sequencer (NGS) and counting the number of reads in the region containing the junction site or homologous recombination site, or the NUMB gene or PROK2 gene, [4] to [10]
  • NGS sequencer
  • the region containing the junction site or homologous recombination site between exons, or the NUMB gene or PROK2 gene is quantified by a singleplex or multiplex one-step real-time PCR (RT-PCR) method including a reverse transcription step, [ 4] The diagnostic marker detection method according to any one of [9]. [13] During PCR of the region containing the junction site or homologous recombination site between the exons, during PCR of the NUMB gene, or during PCR of the PROK2 gene, the internal standard is amplified in the same PCR tube, and the internal standard is read.
  • RT-PCR real-time PCR
  • a diagnostic kit for detecting disease-related genes from circulating nucleic acids (CNA) in peripheral blood isolated from a subject A diagnostic kit comprising a primer set for amplifying the disease-related gene and/or a probe that binds to the disease-related gene or its amplification product.
  • CNA circulating nucleic acids
  • the disease-related gene is at least one selected from the group consisting of an amyloid precursor protein (APP) gene, a NUMB endocytic adapter protein gene (NUMB gene), and a PRPK2 gene, [16] or [17] diagnostic kit as described in . [19] The diagnostic kit according to any one of [16] to [18], which detects exon junctions, homologous recombination sites, or exons of the disease-related gene.
  • APP amyloid precursor protein
  • NUMB gene NUMB endocytic adapter protein gene
  • the present invention it is possible to provide a diagnostic marker detection method and a diagnostic kit for diagnosing Alzheimer's disease in a simple, highly sensitive, rapid and non-invasive manner.
  • FIG. 2 shows the structure of APP gene and mRNA.
  • 1 is a schematic diagram of the present invention;
  • FIG. 4 publicly available NGS data (Sequence Read Archives, SRA) were computationally analyzed using the generated probe sequences. In the present invention, four SRAs were analyzed using probe sequences. Additionally, circulating nucleic acids extracted from 1-1.2 mL plasma samples were analyzed by Illumina sequencing.
  • FIG. 2 shows a method of constructing probe sequences for Computational APP gencDNA screening. The same sequence of 3'-terminal 2 bases and 5'-terminal 2 bases was searched.
  • a 30 base probe sequence was created by combining 16 bases containing two homologous bases at the 3′ end and 16 bases containing two homologous bases at the 5′ end and removing one pair of the two homologous bases. .
  • the construction region of the probe sequence was the coding region of the APP gene, and homologous regions separated by at least 10 bases were selected. Probe sequences that themselves could be mapped directly to the APP cDNA were removed, yielding a final set of 184,506 probe sequences.
  • Fig. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis results for A ⁇ -producing APP gen cDNA. The p-value is 0.0000318.
  • Fig. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis results for delex8. The p-value is 0.0127.
  • Fig. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis of A ⁇ -producing APP gen cDNA excluding reads using proseqff178928. p-value: 0.00207.
  • Fig. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis of A ⁇ -producing APP gen cDNA excluding reads using proseqf
  • FIG. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis of reads using proseqff178928 only. p-value: 0.0000153.
  • Fig. 3 is a graph comparing APP gen cDNA between SAD and NCI in PRJNA574438 constructed from cf-mRNA. Mann-Whitney U test analysis of reads using DRA-normalized proseqff178928 only. p-value: 0.00000148. Representative lead sequences with inter-exon junctions detected in plasma.
  • FIG. 4 is a table showing probe sequences detected from PRJNA493258 to SRR7905478 and SRR7905479.
  • Table for detection of APP gen cDNA in publicly available NGS data (SRA). Table showing the top 10 probe sequences by read count in PRJNA574438.
  • 1 is a table of probe sequences detected by Illumina sequencing of APP gene DNA in plasma CNA of Example 1.
  • FIG. 4 is a table showing the results of Example 2.
  • FIG. 4 is an amplification curve showing the results of Example 3; 4 is a graph showing the results of Example 4.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Example 5.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Example 6.
  • the diagnostic marker detection method of the present invention is a method for detecting disease-related genes from circulating nucleic acids (CNA) in peripheral blood isolated from a subject.
  • CNA circulating nucleic acids
  • genomic cDNA Somatic APP
  • Somatic APP gene recombination in Alzheimer's disease and normal neurons.
  • fragmented DNA derived from APP gencDNA from cell-free circulating nucleic acids in the peripheral blood of Alzheimer's disease patients.
  • APP detection was exclusively performed in the brain or using cerebrospinal fluid, which was difficult from an invasive point of view.
  • Diagnosis of Alzheimer's disease using peripheral blood discovered by the present inventor is simple and non-invasive. Based on this concept, the present invention can also be applied to other diseases. Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, prion disease, cerebral edema, cerebral ischemia, cerebral infarction, brain tumor, demyelinating disease, epilepsy, neuropathic pain , migraine, manic depression, major depressive disorder, schizophrenia, and other neurological disorders. It can also be applied to any disease that occurs tissue-specifically. Examples include tissue-specific cancers such as brain tumor, bladder cancer, lung cancer, colon cancer, stomach cancer, breast cancer, prostate cancer, and thyroid cancer.
  • Neurological disease-related genes include APP, Snca, Uchl1, Apoe, Park7, Apbb1, Bcl2, Ube2l1, Ubqln1, Bax, Cdk5, Ubb, Als2, Gtf2a1, Bace1, Psen1, Ide, Ccs, Sod1, Gpx1, Hsp90AA1, Hsp9 0AB1 , Hsp4 (Hsp70), DNAJB1 (Hsp40), Stip1, Hsf1, Mapt (tau) and the like.
  • Oncogenes include a group of genes encoding growth factors such as sis; a group of genes encoding receptor tyrosine kinases such as erbB, fms, and ret; a group of genes encoding non-receptor tyrosine kinases such as fes; Genes encoding GTP / GDP binding proteins of; Genes encoding serine / threonine kinases such as src, mos, raf; Genes encoding nuclear proteins such as myc, myb, fos, jun, erbA; crk genes encoding signaling adapter molecules such as Bcr-Abl; and fusion genes such as Bcr-Abl.
  • growth factors such as sis
  • receptor tyrosine kinases such as erbB, fms, and ret
  • non-receptor tyrosine kinases such as fes
  • Ras-MAP kinase pathway related genes such as Shc, Grb2, Sos, MEK, Rho and Rac genes
  • Phospholipase C gamma-protein kinase C pathway related genes such as PLC ⁇ and PKC
  • PI3K, Akt and Bad JAK-STAT pathway-related genes such as JAK and STAT
  • GAP pathway-related genes such as GAP, p180 and p62.
  • the present invention provides a diagnostic marker detection method for detecting an amyloid precursor protein (APP) gene from cell-free circulating nucleic acids in peripheral blood isolated from a subject.
  • APP amyloid precursor protein
  • the method for obtaining peripheral blood follows the standard method, and the method for extracting cell-free circulating nucleic acids from peripheral blood also follows the standard method.
  • the APP gene has 18 exons, and pre-mRNA obtained by transcription undergoes splicing to become mRNA. Multiple splicing variants have been reported, and APP695 mRNA without exon 7 and exon 8 is specifically expressed in brain neurons (Neuronal ELAVL proteins utilize AUF-1 as a co-partner to induce neuron-specific alternative splicing of APP. Fragkouli A, Koukouraki P, Vlachos IS, Paraskevopoulou MD, Hatzigeorgiou AG, Doxakis E. Sci Rep. 2017 Mar 14;7:44507.).
  • gencDNA a gene that has been reconstituted by a cell.
  • mRNA of these splicing variants is reverse transcribed into cDNA, undergoes intramolecular recombination, and is randomly inserted into genomic DNA. This inserted cDNA is called gencDNA.
  • the present inventors have found that Alzheimer's disease can be diagnosed by detecting gencDNA or transcription products from gencDNA released into peripheral blood by cell death.
  • a forward primer that anneals to a specific exon and a reverse primer that anneals to other exons are used to amplify exon junctions by PCR, and/or exon junctions or homologous recombination sites.
  • junction site labeling the junction site with a probe that hybridizes to the region containing
  • a combination of different primers that anneal to each of exons 1-18 may be used so that intramolecular recombination of fragments between any exons can be detected. Among them, it is preferable to detect the exon 7-exon 9 joining site. Alternatively, it is preferable to detect the exon 14-exon 16 joining site.
  • This junction site is common to L-APP mRNA expressed in leukocytes and glial cells in APP mRNA lacking exon 15.
  • the detection method it is also preferable to detect homologous recombination sites between exons of disease-related genes.
  • the mRNA of genes associated with Alzheimer's disease such as the NUMB gene and the PROK2 gene, is also released from damaged brain cells and may be detected.
  • Specific quantification methods include the next-generation sequencer (NGS) method and the real-time PCR (RT-PCR) method.
  • next-generation sequencers In next-generation sequencers, analyzed DNA fragments are called reads, and output data is the product of the number of reads and the number of bases determined per read (read length).
  • a region containing a junction site between exons is amplified by singleplex PCR or multiplex PCR, the nucleotide sequence of the amplified product is analyzed with a next-generation sequencer (NGS), a region containing a junction site, a homologous recombination region, Alternatively, it is preferable to quantify by counting the number of reads of Alzheimer's disease-related genes, such as the NUMB gene and the PROK2 gene.
  • Multiplex PCR is a method of simultaneously amplifying multiple gene regions by simultaneously using multiple primer pairs in one PCR reaction system. Specifically, using reverse transcribed CNA purified from plasma, the region containing the exon junction or homologous recombination site is amplified by singleplex PCR or multiplex PCR, and the next-generation sequencer (NGS) is used to amplify the region. It is preferable to quantify by analyzing the base sequence of the amplification product and counting the number of reads in the region containing the ligation site or the homologous recombination site.
  • NGS next-generation sequencer
  • the internal standard is amplified in the same PCR tube during PCR of the region containing the junction site between exons, and the number of reads of the internal standard and the exon junction site, homologous recombination site, or Alzheimer's disease Normalization is preferably performed by comparing the number of reads from related genes.
  • the internal standard includes exon 8 of the APP gene.
  • the internal standard may contain the exon regions of the HLA-DRA gene.
  • the cut-off value may be determined by the mean value and standard deviation of the non-disease group standardized using an internal standard.
  • RT-PCR Real-time PCR
  • an intercalator method, a probe method, a cycling probe method, or the like can be used to monitor the amount of amplification product produced by detecting fluorescence intensity.
  • RT-PCR real-time PCR
  • multiplex PCR at least part of the combination of various primers that anneal to each of the junction sites or homologous recombination sites described above may be used in one PCR reaction system.
  • RT-PCR real-time PCR
  • an internal standard-specific fluorescent dye labeled with a fluorescent dye different from the fluorescent dye-labeled probe specific to the junction site between exons and the fluorescent dye labeled probe specific to the junction site between exons are used and normalized by comparison of fluorescence intensities of these probes.
  • Quantitative methods include an absolute quantification method for determining the actual copy number of the target and a comparative quantification method for determining relative values between samples, which are used depending on the quality of the data to be obtained.
  • the internal standard includes exon 8 of the APP gene.
  • the internal standard may contain the exon regions of the HLA-DRA gene.
  • the cut-off value may be determined by the mean value and standard deviation of the non-disease group standardized using an internal standard.
  • the internal standard is amplified in the same PCR tube, and the number of reads of the internal standard and the exon junction site or homologous recombination site, or the Alzheimer's disease-related gene read
  • An internal standard-specific fluorescent dye-labeled probe labeled with a fluorescent dye different from the fluorescent dye of the homologous recombination site-specific or Alzheimer's disease-related gene-specific fluorescent dye-labeled probe can be used, and standardization can be performed by comparing the fluorescence intensities of these probes.
  • the diagnostic marker detection method of the present embodiment is a technique for detecting fragmented DNA or mRNA released into the blood due to cell death, and can be performed via a nucleic acid amplification reaction by the PCR method, so that it is highly sensitive. Can detect diagnostic markers.
  • the diagnostic kit of the present invention is a diagnostic kit for detecting a disease-related gene from CNA in peripheral blood isolated from a subject, and comprises a primer set for amplifying the disease-related gene or a transcription product therefrom. , and/or a probe that binds to the disease-associated gene or its amplification product.
  • the diagnostic kit of the present invention is suitable for use in the above ⁇ method for detecting a diagnostic marker>> and includes the configuration described in the ⁇ method for detecting a diagnostic marker>>.
  • the disease-related gene to be targeted is preferably the APP gene, the NUMB gene or the PROK2 gene, and the primer set and/or probe is a junction site between exons of the APP gene or It is more preferable to detect homologous recombination sites, or to detect NUMB gene-derived mRNA or PROK2 gene-derived mRNA.
  • Specific primer sets and probes include those substantially identical to those represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1-6 and 15-52.
  • Substantially identical means that each of the primer set and probe can anneal or hybridize to the nucleic acid of interest, with respect to the base sequence represented by each SEQ ID, It means having at least 80% (eg, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, and 100%) identity.
  • kits for separating peripheral blood from blood and/or a kit for extracting CNA from peripheral blood may be provided.
  • the number of positive reads for the probe sequence of SRR7905479 in SAD cases was 190,934 out of 254,351 total reads.
  • NCI case SRR79054708 there were 82,346 of a total of 360,290 reads. Since these SRAs were constructed after nested PCR of APP amplifying between exons 1 and 18, general normalization using housekeeping genes was not possible and these reads were normalized by total read number. was done. The results were 0.751 for AD cases and 0.229 for NCI cases. These results indicate that APP intra-exon recombination occurs more frequently in SAD cases than in NCI cases.
  • FIG. 11 shows over 200 reads in SAD.
  • Four of the 38 probe sequences had no frameshift at the ligation site and were considered potentially capable of producing A ⁇ .
  • the proseqff37467 sequence which has the largest number of A ⁇ -producing reads, was also positive in the NCI group, but the read count was low compared to the SAD group (NCI: 264, SAD: 16,636).
  • APP mRNA lacking exon 8 on the other hand, is neuron-specific, and SRR7905478 and SRR7905479 were constructed from genomic DNA without reverse transcription. Therefore, the junction sequence between exons 7 and 9 of postmortem brain genomic DNA (delex8) is believed to be derived from the APP gen cDNA.
  • the number of reads for this concatenated sequence was 816 (163 per case) for SRR7905478 (NCI) and 385 (77 per case) for SRR7905479 (SAD).
  • the indices were 0.32 for NCI and 43.2 for SAD, respectively.
  • three additional A ⁇ -producing probe sequences were observed in the SAD group but not in the NCI group.
  • PRJNA574438 constructed from cf-mRNA (cell-free mRNA) rather than postmortem brain, had 331 positive probe sequences, two of which were identical to those detected in BioProject SRR7905480 and PRJNA558504. . However, there were no common positive probe sequences in common for SRR7905478 and SRR7905479 where many probe sequence reads were detected. The number of positive probe sequences for PRJNA574438 was 125 out of 127 for SAD and 96 out of 116 for NCI.
  • the average number of positive probe sequences was 4.5 for SAD and 2.4 for NCI, and was significantly different (p-value 1.74E-4 by Welch Two Sample t-test).
  • the average total number of APP gen cDNA reads was 54/case for SAD and 29/case for NCI. There was a significant difference in the number of APP gen cDNA reads between SAD and NCI when normalized by the number of midex8 reads.
  • the p-value by the Mann-Whitney U test was 1.88E-5.
  • the most frequent probe sequence was proseqff178928, which accounted for about 89% of the probe sequence positive reads, and the sequence was named L-APP mRNA, the ligation of exons 14 and 16 of APP mRNA lacking exon 15. It was identical to the site sequence. L-APP mRNA is expressed in leukocytes and astrocytes. Therefore, considering the possibility that L-APP mRNA was released from them, only proseqff178928 was examined for reads. When proseqff178928 was excluded from the Mann-Whitney U test, the p-value was 2.07E-2 (see Figure 7), and the p-value for proseqff178928 alone was 1.53E-5 (see Figure 8). . That is, the p-value for probe sequence proseqff178928 positive reads only was more significant than the p-value for all probe sequence positive reads (p-value: 3.18E-5).
  • Example 1 [Nucleotide sequence analysis of circulating nucleic acids] To confirm the presence of transcripts from APP gen cDNA in plasma, NGS analysis was performed on plasma samples. Circulating nucleic acids were extracted from 1-1.5 mL plasma and eluted at 17 ⁇ L using the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN). Double-stranded cDNA was synthesized using 15 ⁇ L of eluate, ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit, and NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second Strand Synthesis Module (NEB). This cDNA solution also contains cfDNA since no steps have been taken to remove it.
  • QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit QIAGEN
  • Double-stranded cDNA was synthesized using 15 ⁇ L of eluate, ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit, and NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second Strand Synthesis Module (NEB). This cDNA solution also contains cf
  • the cDNA solution was purified using 1.2 volumes of AMPure XP beads (Beckman Coulter) and dA tailed using the NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (NEB) followed by NEBNext Ultra II Adapter ligations were performed using the DNA Library Prep Kit for Illumina.
  • the reaction mixture was purified using 1.2 volumes of AMPure XP beads and eluted with 32 ⁇ L of 0.1 ⁇ TE.
  • the cfDNA and cDNA were enriched by capture hybridization using xGen capture probes (Integrated DNA Technologies), followed by PCR amplification using KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems).
  • Illumina sequencing was then performed using the MiSeq reagent kit v2 (300 cycles) and a MiSeq sequencer (Illumina).
  • probe sequences were detected in plasma samples (see Figure 14), detected in 7 of 10 SAD patients and 2 of 3 controls.
  • the lead sequence containing probes detected in two sequencing runs is shown in FIG.
  • eight probe sequences were common to those detected with SRA PRJNA574438 constructed from plasma cf-mRNA.
  • the probe sequence with the highest number of reads was also the same between plasma samples and PRJNA574438.
  • delex8 is neuron-specific rather than APP gen cDNA-specific, since the cDNA synthesized from neuron-derived APP mRNA also has the same junctions as delex8.
  • FIG. A box blot of delex8 normalized by midex8 of PRJNA574438 constructed from cf-mRNA is shown in FIG. A significant difference was observed between SAD and NCI in the Mann-Whitney U test with a p-value of 0.0127.
  • CNA was extracted from 1 mL of each plasma of a control group (Control) without cognitive impairment and Alzheimer's disease patients (AD) using QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN).
  • the APP gene has 18 exons, and pre-mRNA obtained by transcription undergoes splicing to become mRNA.
  • PCR was performed using the extracted CNA and the following primers. Forward primer: exon 1 and exon 2 joining site GGCACTGCTCCTGCTGG (SEQ ID NO: 1)
  • Reverse primer exon 17 and exon 18 joining site CAGGTGGCGCTCCCTG (SEQ ID NO: 2)
  • the cycle of PCR is as follows. 98°C 30 sec: 1 cycle 95°C 15 sec, 60°C 30 sec, 72°C 30 sec: 40 cycles 4°C: hold
  • Example 3 One-step RT-PCR was performed using CNA prepared in the same manner as in Example 1. ThermoFisher's TaqMan one-step RT-PCR reagents were used. Also, the following primers and probes were used.
  • the cycle of PCR is as follows. 50°C 5 min: 1 cycle 95°C 20 sec: 1 cycle 95°C 15 sec, 60°C 60 sec: 40 cycles
  • the probe for the internal standard was labeled with a fluorescent dye, HEX, and the exon junction-specific probe was labeled with FAM. The results are shown in FIG. It was shown that neuron-derived delex8 and internal standard midex8 could be clearly detected even by one-step RT-PCR.
  • Example 4 Using the NUMB exon base sequence AATCCTCAGACGCCTTCACTTAGGACAAGCT (SEQ ID NO: 53) of the published SRA of PRJNA574438, the number of reads containing this sequence was examined and compared between SAD and NCI. For standardization, the nucleotide sequence GGCAAAGAAGGAGACGGTCTGGCGGCTTGA of the HLA-DRA gene was used (SEQ ID NO: 54). The Mann-Whitney U test gave a P value of 0.000000305. The results are shown in FIG.
  • Example 5 A similar comparison of HLA-DRA normalized APP gen cDNA and NUMB read counts in combination yielded a P-value of 0.000000165 with the Mann-Whitney U test, a smaller P-value than either alone. . The results are shown in FIG.
  • Example 6 Using the exon sequence AATGGAAGGCAGGAAAGAAGAAAGAGGAAG (SEQ ID NO: 55) of the variant exon of the PROK2 gene, the published SRA of PRJNA574438 was examined, and the number of reads containing this sequence was examined and compared between SAD and NCI. For standardization, the nucleotide sequence GGCAAAGAAGGAGACGGTCTGGCGGCTTGA of the HLA-DRA gene was used (SEQ ID NO: 54). The Mann-Whitney U test gave a P value of 0.000000000012. The results are shown in FIG.
  • the present invention it is possible to provide a diagnostic marker detection method and a diagnostic kit for diagnosing Alzheimer's disease in a simple, highly sensitive, rapid and non-invasive manner.

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Abstract

被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出する、診断マーカー検出方法。

Description

診断マーカー検出方法、及び診断キット
　本発明は、診断マーカー検出方法、及び診断キットに関する。
　孤発性アルツハイマー病 （ＳＡＤ）は、認知症の主な原因である。これは、アミロイドβ（以下、Ａβともいう。）のプラークへの蓄積と、神経原線維変化における異常にリン酸化されたタウの蓄積によって特徴付けられる。それらの蓄積はニューロンの損傷を引き起こすが、病因のメカニズムは完全には理解されていない。
　さらに、Ａβ陽電子放出断層撮影法 (アミロイドＰＥＴ) は、Ａβの蓄積が認知症の発症の２０年ほど前に始まることを報告している。この長期にわたる潜在的な蓄積により、認知症及び認知症の前段階である軽度認知障害 （ＭＣＩ）の早期臨床診断が困難となっている。
　Ａβの蓄積はアミロイドＰＥＴによって検査されるが、これは、放射性、侵襲性、高価であり、限られた施設でしか利用できない。Ａβの主成分、Ａβ４２、リン酸化タウ、及び総タウも、ＳＡＤのバイオマーカーとして脳脊髄液（ＣＳＦ）で測定されるが、ＣＳＦの採取は依然として侵襲的である。
 そのため、早期診断及びスクリーニング検査のための血液バイオマーカーの研究開発が進行中である。ＣＳＦで測定されたタンパク質／ペプチドに加えて、ｍｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、及び環状ＲＮＡも研究されている。これらの様々な血液ＲＮＡをバイオマーカーとして使用する試みは、一般に多くの種類のＲＮＡを組み合わせることを伴い、やや複雑である。
　脳の萎縮は年齢とともに観察されるが、ＳＡＤではその程度が著しい。扁桃体、海馬、嗅内皮質、及び海馬傍皮質の萎縮は、早期発症から観察される。ＳＡＤと非認知障害 （ＮＣＩ）における萎縮の程度の違いに基づいて、ＭＲＩ画像を使用したＮＣＩからＳＡＤへの進行の予測も研究されている。例えば、ＶＳＲＡＤ は、内嗅皮質、海馬、扁桃体などの内側側頭構造の関心領域（ＲＯＩ） を分析するが、ＳＡＤ患者では萎縮がより一般的である。
　一方、体細胞変異によるゲノムモザイク現象は脳に存在し、ＳＡＤとＮＣＩの両方で観察される。体細胞変異には、一塩基変異体 （ＳＮＶ）、コピー数変異体（ＣＮＶ）、異数性 、及びレトロトランスポゾンの活性化が含まれる。これらのゲノムモザイクは死後の脳で観察されており、バイオマーカーとして使用することは困難であった.
 最近、脳モザイク現象の１つであるアミロイド前駆体タンパク質（以下、ＡＰＰともいう。）のゲノムｃＤＮＡ（ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡ）とその転写物が死後脳で報告されている。
　ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに組み込まれた形で存在し、イントロンが存在せず、エクソン内ジャンクションが存在することを特徴とする。ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡはニューロン特異的であり、ＤＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＤＩＳＨ）分析におけるＦｏｃｉの数は、ＮＣＩよりもＳＡＤの方が高くなっている。年齢とともに、ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの ＤＩＳＨ ｆｏｃｉが増加することも、ＳＡＤのマウスモデルを使用して報告されている。さらに、血漿核酸レベルは、ＮＣＩと比較してＳＡＤで増加することが報告されている。脳の萎縮は、ネクローシス／アポトーシスによって引き起こされるため、これらの報告は、ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡとその転写産物が、他のｃｆＤＮＡや ｃｆＲＮＡと同様に、損傷したニューロンから血漿中に放出されることを示唆している（例えば、非特許文献１参照。）。
　さらに最近、マウスの網膜神経節細胞を使ってNUMB endocytic adaptor protein遺伝子（以下ＮＵＭＢ遺伝子）が、アルツハイマー病の発症に関与しているタウ蛋白質レベルの調節に関与していることが報告された（例えば、非特許文献２参照。）。また、prokineticin 2 遺伝子(以下ＰＲＯＫ２遺伝子)もアルツハイマー病に関連していることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。これらのＮＵＭＢ遺伝子やＰＲＯＫ２遺伝子もＡＰＰｇｅｎｃＤＮＡと同様に、傷害されたニューロンから漏出してくることが予想される。
Lee, M. H. et al. Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons. Nature 563, 639-645 (2018). Lacomme, M. et al. Numb regulates Tau levels and prevents neurodegeneration in tauopathy mouse models. Sci Adv. 2022 Oct 21;8(42):eabm4295. doi: 10.1126/sciadv.abm4295. Epub 2022 Oct 19 Zuena, A.R. et al. Chemokines in Alzheimer's Disease: New Insights Into Prokineticins, Chemokine-Like Proteins. Front Pharmacol. 10,622 (2019).
　ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡは、生殖系列細胞ではなく体細胞で組換えにより形成されるため存在量は少なく、血漿中のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡも非常に少ないと考えられる。しかし、タンパク質と異なり、核酸は増幅しやすいため、増幅できれば血漿中でもＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡを検出できる可能性がある。また、ペプチドよりも検出が容易であることに加えて、ニューロンの損傷及び関連する核酸の放出は、認知症の発症前であっても検出することができる。つまり、血漿中のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡを検出できれば、ＳＡＤの早期診断が可能であることが示唆される。或いは傷害されたニューロンやグリア細胞から放出される核酸を検出できれば、ＳＡＤの早期診断が可能であることが示唆される。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便・高感度・迅速かつ非侵襲的にアルツハイマー病を診断できる診断マーカー検出方法、及び診断キットを提供する。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出する、診断マーカー検出方法。
［２］前記疾患は、アルツハイマー病である、［１］に記載の診断マーカー検出方法。
［３］前記疾患関連遺伝子が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子である、［１］又は［２］に記載の診断マーカー検出方法。
［４］前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位を検出する、［１］～［３］のいずれか一つに記載の診断マーカー検出方法。
［５］前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位がＡＰＰ遺伝子のエクソン７とエクソン９の連結部位である、［４］に記載の診断マーカー検出方法。
［６］前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位がＡＰＰ遺伝子のエクソン１４とエクソン１６の連結部位である、［４］に記載の診断マーカー検出方法。
［７］前記疾患関連遺伝子のエクソン間の相同組み換え部位を検出する、［１］～［３］のいずれか一つに記載の診断マーカー検出方法。
［８］前記疾患関連遺伝子が、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、又はｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ２遺伝子(ＰＲＯＫ２遺伝子）である、［１］又は［２］に記載の診断マーカー検出方法。
［９］前記疾患関連遺伝子は、ＡＰＰ遺伝子、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、及びｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ ２ 遺伝子(ＰＲＯＫ２遺伝子)からなる群から選ばれる組み合わせである、［１］又は［２］に記載の診断マーカー検出方法。
［１０］更に検出した疾患関連遺伝子のコピー数を定量する、［１］～［９］のいずれか一つに記載の診断マーカー検出方法。
［１１］血漿から精製したＣＮＡを逆転写したものを用いて、前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ　ＰＣＲ又はｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで増幅し、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）でその増幅産物の塩基配列を解析し、連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域のリード数を計数することにより定量する、［４］～［１０］のいずれか一つに記載の診断マーカー検出方法。
［１２］前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域を、逆転写工程を含むｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘのワンステップリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により定量する、［４］～［９］のいずれか一つに記載の診断マーカー検出方法。
［１３］前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位を含む領域のＰＣＲ時に、或いはＮＵＭＢ遺伝子のＰＣＲ時に、又はＰＲＯＫ２遺伝子のＰＣＲ時に、内部標準を同一のＰＣＲチューブ内で増幅し、内部標準のリード数とエクソンの連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子のリード数を比較することにより標準化するか、ＲＴ－ｑＰＣＲ時に、エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的、或いはＮＵＭＢ遺伝子特異的、又はＰＲＯＫ２遺伝子特異的蛍光色素標識プローブと、前記エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的、或いはＮＵＭＢ遺伝子特異的、又はＰＲＯＫ２遺伝子特異的蛍光色素標識プローブの蛍光色素とは異なる蛍光色素で標識した内部標準特異的蛍光色素標識プローブを用い、これらプローブの蛍光強度の比較により標準化する、［１１］又は［１２］に記載の診断マーカー検出方法。
［１４］内部標準がＡＰＰ遺伝子のエクソン８を含む、［１３］に記載の診断マーカー検出方法。
［１５］内部標準がＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子のエクソン領域を含む、［１４］に記載の診断マーカー検出方法。
［１６］被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出するための診断キットであって、
前記疾患関連遺伝子を増幅するためのプライマーセット、及び／又は前記疾患関連遺伝子若しくはその増幅産物に結合するプローブを含む、診断キット。
［１７］前記疾患は、アルツハイマー病である、［１６］に記載の診断キット。
［１８］前記疾患関連遺伝子が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、及びＰＲＰＫ２遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つである、［１６］又は［１７］に記載の診断キット。
［１９］前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位、相同組み換え部位又はエクソンを検出する、［１６］～［１８］のいずれか一つに記載の診断キット。
　本発明によれば、簡便・高感度・迅速かつ非侵襲的にアルツハイマー病を診断できる診断マーカー検出方法、及び診断キットを提供できる。
ＡＰＰ遺伝子及びｍＲＮＡの構造を示す図である。 本発明の模式図である。公開されている４つのＮＧＳデータ (シークエンス リード アーカイブ、ＳＲＡ) を、作成したプローブシークエンスを使用してコンピューターで分析した。本発明では、プローブ配列を使用して４ つのＳＲＡを分析した。さらに、１～１．２ｍＬの血漿サンプルから抽出した循環核酸をイルミナシークエンスで分析した。 Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇのためのプローブ配列の構築方法を示す図である。３'末端２塩基と５'末端２塩基の同じ配列を検索した。３’末端の２つの相同塩基を含む１６塩基と５’末端の２つの相同塩基を含む１６塩基を結合し、２つの相同塩基の１対を除去することにより、３０塩基のプローブ配列を作成した。プローブ配列の構築領域は、ＡＰＰ遺伝子のコード領域であり、少なくとも１０塩基離れた相同領域が選択された。それ自体がＡＰＰ ｃＤＮＡに直接マッピングできるプローブ配列が除去され、１８４，５０６個のプローブ配列の最終セットが得られた。 ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるＳＡＤとＮＣＩ間のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの比較グラフである。Ａβ産生可能なＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡに関するＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定分析結果である。ｐ値は、０．００００３１８である。 ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるＳＡＤとＮＣＩ間のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの比較グラフである。ｄｅｌｅｘ８に関するＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定分析結果である。ｐ値は、０．０１２７である。 正規化されたＡβ産生可能リード数とｄｅｌｅｘ８の間の相関を調べたグラフである。Ｒ２＝０．２０８５。 ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるＳＡＤとＮＣＩ間のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの比較グラフである。ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８を使用したリードを除くＡβ産生可能なＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定分析結果である。ｐ値:０．００２０７。 ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるＳＡＤとＮＣＩ間のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの比較グラフである。ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８のみを使用したリードのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定分析結果である。ｐ値:０．００００１５３。 ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるＳＡＤとＮＣＩ間のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの比較グラフである。ＤＲＡで正規化されたｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８のみを使用したリードのＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定分析結果である。ｐ値:０．０００００１４８。 血漿中で検出されたエクソン内連結部位を有する代表的なリード配列である。 ＰＲＪＮＡ４９３２５８からＳＲＲ７９０５４７８及びＳＲＲ７９０５４７９ で検出されたプローブ配列を示す表である。 公開されているＮＧＳデータ（ＳＲＡ）でのＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの検出に関する表である。 ＰＲＪＮＡ５７４４３８におけるリード カウントによる上位１０のプローブ配列を示す表である。 実施例１の血漿ＣＮＡ中のＡＰＰ遺伝子ＤＮＡのイルミナシークエンスで検出されたプローブ配列に関する表である。 実施例２の結果を示す表である。 実施例３の結果を示す増幅曲線の図である。 実施例４の結果を示すグラフである。 実施例５の結果を示すグラフである。 実施例６の結果を示すグラフである。
≪診断マーカー検出方法≫
　本発明の診断マーカー検出方法は、被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出する方法である。
　アルツハイマー病患者の死後、脳のニューロンで、ＡＰＰ ｍＲＮＡが逆転写され分子内組み換えをおこし、ゲノムＤＮＡにランダムに挿入されたもの (ｇｅｎｏｍｉｃ ｃＤＮＡ又は“ｇｅｎｃＤＮＡ”という。)が報告されている (Somatic APP gene recombination in Alzheimer's disease and normal neurons. Lee MH, Siddoway B, Kaeser GE, Segota I, Rivera R, Romanow WJ, Liu CS, Park C, Kennedy G, Long T, Chun J. Nature. 2018 Nov;563(7733):639-645.参照。)。
　上記知見に基づき、本発明者は、アルツハイマー病患者の末梢血中のセルフリー循環核酸から、ＡＰＰのｇｅｎｃＤＮＡ由来の断片化したＤＮＡを見出した。
　従来、ＡＰＰの検出は脳内で、又は脳脊髄液を用いて行われるのが専らであり、侵襲性の観点から難があった。本発明者が見出した末梢血を用いたアルツハイマー病の診断は、簡便で非侵襲である。このコンセプトに基づけば、本発明は、他の疾患にも適用し得る。疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病、プリオン病、脳浮腫、脳虚血、脳梗塞、脳腫瘍、脱髄疾患、てんかん、神経因性疼痛、片頭痛、躁鬱病、大鬱病性障害、統合失調症、等の神経疾患が挙げられる。また、組織特異的に生じるあらゆる疾患にも適用できる。例えば、脳腫瘍や膀胱がん、肺がん、大腸がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、甲状腺がん等、組織特異的ながんが挙げられる。
　疾患関連遺伝子としては、疾患特異的に発現する遺伝子なら特に限定されず、神経疾患関連遺伝子、がん遺伝子等が挙げられる。
　神経疾患関連遺伝子としては、ＡＰＰ、Ｓｎｃａ、Ｕｃｈｌ１、Ａｐｏｅ、Ｐａｒｋ７、Ａｐｂｂ１、Ｂｃｌ２、Ｕｂｅ２ｌ１、Ｕｂｑｌｎ１、Ｂａｘ、Ｃｄｋ５、Ｕｂｂ、Ａｌｓ２、Ｇｔｆ２ａ１、Ｂａｃｅ１、Ｐｓｅｎ１、Ｉｄｅ、Ｃｃｓ、Ｓｏｄ１、Ｇｐｘ１、Ｈｓｐ９０ＡＡ１、Ｈｓｐ９０ＡＢ１、Ｈｓｐ４（Ｈｓｐ７０）、ＤＮＡＪＢ１（Ｈｓｐ４０）、Ｓｔｉｐ１、Ｈｓｆ１、Ｍａｐｔ（ｔａｕ）等が挙げられる。
　がん遺伝子としては、ｓｉｓ等の増殖因子をコードする遺伝子群；ｅｒｂＢ、ｆｍｓ、ｒｅｔ等のレセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｆｅｓ等の非レセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｒａｓ等のＧＴＰ／ＧＤＰ結合タンパク質をコードする遺伝子群；ｓｒｃ、ｍｏｓ、ｒａｆ等のセリン／スレオニンキナーゼをコードする遺伝子群；ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｅｒｂＡ等の核内タンパク質をコードする遺伝子群；ｃｒｋ等のシグナル伝達アダプター分子をコードする遺伝子群；Ｂｃｒ－Ａｂｌ等の融合遺伝子が挙げられる。
　更に、がん遺伝子として、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、ＭＥＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ遺伝子等のＲａｓ－ＭＡＰキナーゼ経路関連遺伝子；ＰＬＣγ、ＰＫＣ等のホスホリパーゼＣガンマ-プロテインキナーゼＣ経路関連遺伝子；ＰＩ３Ｋ、Ａｋt、Ｂａｄ等のＰＩ３Ｋ－Ａｋt経路関連遺伝子；ＪＡＫ、ＳＴＡＴ等のＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路関連遺伝子；ＧＡＰ、ｐ１８０、ｐ６２等のＧＡＰ系経路関連遺伝子が挙げられる。
　以下、一例として、アルツハイマー病診断マーカー検出方法について説明する。
＜アルツハイマー病診断マーカー検出方法＞
　一実施形態として本発明は、被験者から単離された末梢血中のセルフリー循環核酸から、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子を検出する、診断マーカー検出方法を提供する。
　末梢血の取得方法としては、定法に従い、また、末梢血からセルフリー循環核酸を抽出する方法についても定法に従う。
　図１に示す様に、ＡＰＰ遺伝子は、１８個のエクソンを有し、転写により得られたｍＲＮＡ前駆体は、スプライシングを受けてｍＲＮＡとなる。複数のスプライシングバリアントが報告されており、脳のニューロンではｅｘｏｎ ７, ｅｘｏｎ ８を含まないＡＰＰ６９５ ｍＲＮＡが特異的に発現している(Neuronal ELAVL proteins utilize AUF-1 as a co-partner to induce neuron-specific alternative splicing of APP. Fragkouli A, Koukouraki P, Vlachos IS, Paraskevopoulou MD, Hatzigeorgiou AG, Doxakis E. Sci Rep. 2017 Mar 14;7:44507.参照。)。ｇｅｎｃＤＮＡの生成機構は未だ解明されていないが、これらスプライシングバリアントのｍＲＮＡが逆転写され、ｃＤＮＡとなり、分子内組み換えをおこし、ゲノムＤＮＡにランダムに挿入されると考えられる。この挿入されたｃＤＮＡをｇｅｎｃＤＮＡという。
　本発明者は、細胞死によって末梢血中に放出されたｇｅｎｃＤＮＡあるいはｇｅｎｃＤＮＡからの転写産物を検出することでアルツハイマー病の診断ができることを見出した。検出方法としては、スプライシングバリアントが逆転写され、分子内組み換えを起してなるｇｅｎｃＤＮＡあるいはその転写物を検出すべく、疾患関連遺伝子であるＡＰＰ遺伝子のエクソン間の連結部位あるいは相同組み換え部位を検出することが好ましい。
　具体的には、特定のエクソンにアニールするフォワードプライマーと他のエクソンにアニールするリバースプライマーを用いてエクソン間の連結部位をＰＣＲにて増幅すること、及び／又はエクソン間の連結部位あるいは相同組み換え部位を含む領域にハイブリダイズするプローブを用いて当該連結部位を標識することが挙げられる。どのエクソン間の断片が分子内組換えされても検出できるように、エクソン１～１８のそれぞれにアニールする様々なプライマーの組み合わせを用いてもよい。中でも、エクソン７とエクソン９の連結部位を検出することが好ましい。または、エクソン１４とエクソン１６の連結部位を検出することが好ましい。なお、この連結部位はエクソン１５が欠落したＡＰＰのｍＲＮＡで白血球とグリア細胞に発現しているＬ－ＡＰＰ ｍＲＮＡと共通している。
　また、検出方法としては、疾患関連遺伝子のエクソン間の相同組み換え部位を検出することも好ましい。
　あるいは、アルツハイマー病に関連している遺伝子、例えばＮＵＭＢ遺伝子やＰＲＯＫ２遺伝子、のｍＲＮＡも傷害された脳の細胞から放出されるので、それを検出しても良い。
　更に、アルツハイマー病の進行度、重篤度を診断する観点から、検出した疾患関連遺伝子のコピー数を定量することが好ましい。具体的な定量方法としては、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）法とリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法の２点が挙げられる。
［次世代シークエンサー（ＮＧＳ）］
　次世代シークエンサーでは、解析されたＤＮＡ断片をリードと呼び、リード数と１リード当たりに決定される塩基数（リード長）の積が出力データとなる。
　本実施形態において、エクソン間の連結部位を含む領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ　ＰＣＲまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで増幅し、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）でその増幅産物の塩基配列を解析し、連結部位を含む領域、相同組み換え領域、或いはアルツハイマー病関連遺伝子、例えばＮＵＭＢ遺伝子やＰＲＯＫ２遺伝子のリード数を計数することにより定量することが好ましい。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲは、一つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。具体的には、血漿から精製したＣＮＡを逆転写したものを用いて、前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位を含む領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ　ＰＣＲ又はｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで増幅し、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）でその増幅産物の塩基配列を解析し、連結部位又は相同組み換え部位を含む領域のリード数を計数することにより定量することが好ましい。
　また、定量化の観点から、エクソン間の連結部位を含む領域のＰＣＲ時に、内部標準を同一のＰＣＲチューブ内で増幅し、内部標準のリード数とエクソンの連結部位、相同組み換え部位、或いはアルツハイマー病関連遺伝子由来のリード数を比較することにより標準化することが好ましい。
　アルツハイマー病の診断においては、内部標準がＡＰＰ遺伝子のエクソン８を含むことが好ましい。また、内部標準がＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子のエクソン領域を含んでいてもよい。
　更に、内部標準を用いて標準化した非疾患群の平均値と標準偏差によりカットオフ値を決定してもよい。
［リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）］
　リアルタイムＰＣＲでは、インターカレータ－法、プローブ法、サイクリングプローブ法等を用いて、蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
　本実施形態において、エクソン間の連結部位を含む領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により定量することが好ましい。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲにおいては、上述した連結部位又は相同組み換え部位のそれぞれにアニールする様々なプライマーの組み合わせの少なくとも一部を、一つのＰＣＲ反応系で使用してもよい。
　詳細には、エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位、或いはアルツハイマー病関連遺伝子を含む領域を、逆転写工程を含むｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘのワンステップリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により定量することが好ましい。
　また、定量化の観点から、エクソン間の連結部位特異的蛍光色素標識プローブと、前記エクソン間の連結部位特異的蛍光色素標識プローブの蛍光色素とは異なる蛍光色素で標識した内部標準特異的蛍光色素標識プローブを用い、これらプローブの蛍光強度の比較により標準化することが好ましい。
　定量方法としては、ターゲットの実際のコピー数を決定する絶対定量法とサンプル間の相対値を決定する比較定量法が挙げられ、取得したいデータの質に応じて使い分けられる。
　アルツハイマー病の診断においては、内部標準がＡＰＰ遺伝子のエクソン８を含むことが好ましい。また、内部標準がＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子のエクソン領域を含んでいてもよい。更に、内部標準を用いて標準化した非疾患群の平均値と標準偏差によりカットオフ値を決定してもよい。
　詳細には、エクソン間の連結部位を含む領域のＰＣＲ時に、内部標準を同一のＰＣＲチューブ内で増幅し、内部標準のリード数とエクソンの連結部位又は相同組み換え部位、或いはアルツハイマー病関連遺伝子のリード数を比較することにより標準化するか、ＲＴ－ｑＰＣＲ時に、エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的或いはアルツハイマー病関連遺伝子特異的蛍光色素標識プローブと、前記エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的或いはアルツハイマー病関連遺伝子特異的蛍光色素標識プローブの蛍光色素とは異なる蛍光色素で標識した内部標準特異的蛍光色素標識プローブを用い、これらプローブの蛍光強度の比較により標準化することが好ましい。
　本実施形態の診断マーカー検出方法は、細胞死によって血中に放出された断片化されたＤＮＡ又はｍＲＮＡを検出しようとする技術で、ＰＣＲ法による核酸増幅反応を介することができるため、高感度で診断マーカーを検出できる。
≪診断キット≫
　本発明の診断キットは、被験者から単離された末梢血中のＣＮＡから、疾患関連遺伝子を検出するための診断キットであって、前記疾患関連遺伝子或いはそれからの転写産物を増幅するためのプライマーセット、及び／又は前記疾患関連遺伝子若しくはその増幅産物に結合するプローブを含むキットである。本発明の診断キットは、上述した≪診断マーカー検出方法≫に好適に用いられ、≪診断マーカー検出方法≫に記載された構成を含む。
　アルツハイマー病を対象とする診断キットの場合には、対象とする疾患関連遺伝子は、ＡＰＰ遺伝子又はＮＵＭＢ遺伝子又はＰＲＯＫ２遺伝子が好ましく、プライマーセット、及び／又はプローブが、ＡＰＰ遺伝子のエクソン間の連結部位又は相同組み換え部位を検出するものであること、或いはＮＵＭＢ遺伝子由来のｍRNA、或いはＰＲＯＫ２遺伝子由来のｍＲＮＡを検出するものであることがより好ましい。具体的なプライマーセット、及びプローブとしては、配列番号１～６、１５～５２で表される塩基配列で表されるものと実質的に同一であるものが挙げられる。
　「実質的に同一である」とは、プライマーセット及びプローブのそれぞれが、対象の核酸にアニール又はハイブリダイズできるように、各配列番号で表される塩基配列に対して、
少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％）同一性を有することを意味する。
　また、内部標準として、ＡＰＰ遺伝子のエクソン８、或いはＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子のエクソン部分を標的とすることが好ましい。
　更に、上記プライマーセット、及び／又はプローブに加えて、血液から末梢血を分離するためのキット、及び／又は、末梢血からＣＮＡを抽出するためのキットを備えていてもよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［公開されたＰａｃｂｉｏ配列データのプローブ配列によるＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ］
　ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡの存在を確認し、その全体像を把握するために、ＡＰＰ ｍＲＮＡ配列に基づいてプローブ配列を設計し、公開されている配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ ａｒｃｈｉｖｅ,ＳＲＡ）をコンピューターでスクリーニングした（図２参照。）。報告されているＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡは、２塩基以上の相同領域とのエクソン内相同組換えによって形成された。したがって、プローブ配列は、２塩基の相同領域の上流１４塩基、２塩基の相同配列、及び相同領域の下流１４塩基を組み合わせることによって作成された。合計１８４，５０６のプローブ配列が得られた (図３参照。)。次に、構築されたプローブ配列を、死後の人間の脳のＡＰＰのｎｅｓｔｅｄＰＣＲのアンプリコンのＰａｃｂｉｏ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによって得られたＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＰＲＪＮＡ４９３２５８のＳＲＲ７９０５４７８とＳＲＲ７９０５４７９のｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに使用した。
　ＳＡＤケースにおけるＳＲＲ７９０５４７９のプローブ配列のポジティブリード数は、２５４，３５１の合計リードのうち１９０，９３４であった。ＮＣＩケースのＳＲＲ７９０５４７８では、合計３６０，２９０のリードのうち８２，３４６であった。
 これらのＳＲＡは、エクソン１と１８の間で増幅するＡＰＰのｎｅｓｔｅｄＰＣＲの後に構築されたため、ハウスキーピング遺伝子を使用した一般的な正規化は不可能であり、これらのリードは総リード数によって正規化された。結果は、ＡＤケースで０．７５１、ＮＣＩケースで ０．２２９であった。これらの結果は、ＳＡＤケースにおけるＡＰＰエクソン内組換えがＮＣＩケースよりも頻繁に発生することを示している。
　ＳＡＤとＮＣＩのポジティブプローブ配列を比較すると、これら２つの実行で合計３８のプローブ配列について、それぞれ２６のプローブ配列がＳＲＲ７９０５４７９（ＳＡＤ）でポジティブであり、２５のプローブ配列が ＳＲＲ７９０５４７８（ＮＣＩ）でポジティブであった。図１１は、ＳＡＤにおける２００リード以上のものを示す。３８個のプローブ配列のうち４個は連結部位にフレームシフトがなく、Ａβを産生できる可能性があると考えられた。
　最大のＡβ産生リード数を有するｐｒｏｓｅｑｆｆ３７４６７配列もＮＣＩ群でポジティブであったが、リードカウントは ＳＡＤ群と比較してわずかであった（ＮＣＩ:２６４、ＳＡＤ:１６，６３６）。一方、エクソン８を欠くＡＰＰ ｍＲＮＡは、ニューロン特異的であり、ＳＲＲ７９０５４７８とＳＲＲ７９０５４７９は、逆転写なしでゲノムＤＮＡから構築された。したがって、死後脳のゲノムＤＮＡのエクソン７と９の間の連結配列（ｄｅｌｅｘ８）は、ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡに由来すると考えられる。この連結配列のリード数は、ＳＲＲ７９０５４７８（ＮＣＩ）では８１６ (症例当たり１６３)、ＳＲＲ７９０５４７９（ＳＡＤ）では３８５(症例当たり７７)であった。これらの連結配列のリード数を使用して正規化すると、指数はそれぞれＮＣＩで０．３２、ＳＡＤで４３．２であった。さらに、３つの追加のＡβ産生プローブ配列がＳＡＤ群で観察されたが、ＮＣＩ群では観察されなかった。これらの結果は、ＳＡＤ群のＡＰＰのエクソン内組換え体におけるＡβ産生リードの比率が、ＳＲＲ７９０５４７８及びＳＲＲ７９０５４７９を含むＳＲＡ ＰＲＪＮＡ４９３２５８のＮＣＩ群よりもはるかに高いことを示す。
［公開されたイルミナｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇデータのプローブ配列によるＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ］
　構築されたプローブ配列は、上記のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡスクリーニングに使用できるため、他のＳＲＡも分析した（図２参照。）。ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＰＲＪＮＡ４９３２５８のＳＲＲ７９０５４８０とＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔＰＲＪＮＡ５５８５０４のＳＲＲ９８９９１５２～３の２実行には、それぞれ１つと２つのポジティブプローブ配列があったが、リード数はそれぞれ ５（２/症例）と２９（１０/症例）とわずかであった（図１２参照。）。
　ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＰＲＪＮＡ５３２４６５では、ＳＡＤケースの海馬体（ＨＦ）で非常に少ないプローブ配列（１症例当たり０．１４リード) が観察されたが、ＳＡＤケースの血液又はＮＣＩケースのＨＦと血液ではポジティブなプローブ配列は見つからなかった。一方、ＡＰＰエクソン８ （ｍｉｄｅｘ８）の平均リード数は、１３４～１７８であった（図１２参照。）。
 これら３つのＳＲＡは、ＡＰＰのｎｅｓｔｅｄＰＣＲアンプリコンから得られたＳＲＲ７９０５４７８及び ＳＲＲ７９０５４７９とは異なり、キャプチャーハイブリダイゼーション及びイルミナシークエンスによって、死後の脳及び血液から構築された。
［血漿ｃｆ－ｍＲＮＡからのＳＲＡにおけるＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリード数の比較］
　対照的に、死後脳ではなくｃｆ－ｍＲＮＡ（セルフリーｍＲＮＡ）から構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８には、３３１のポジティブプローブ配列があり、そのうち２つはＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＳＲＲ７９０５４８０及びＰＲＪＮＡ５５８５０４で検出されたものと同一であった。ただし、多くのプローブ配列リードが検出されたＳＲＲ７９０５４７８及びＳＲＲ７９０５４７９に共通する共通のポジティブプローブ配列はなかった。ＰＲＪＮＡ５７４４３８のポジティブプローブ配列の数は、ＳＡＤで１２７例中１２５例、ＮＣＩで１１６例中９６例であった。ポジティブプローブ配列の平均数は、ＳＡＤで４．５、ＮＣＩで２．４であり、有意差があった(Ｗｅｌｃｈ Ｔｗｏ Ｓａｍｐｌｅ ｔ－ｔｅｓｔによるｐ値１．７４Ｅ－４)。ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリードの平均総数は、ＳＡＤで５４／症例、ＮＣＩで２９／症例であった。ｍｉｄｅｘ８のリード数で正規化すると、ＳＡＤとＮＣＩの間でＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリード数に有意差があった。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によるｐ値は、１．８８Ｅ－５であった。正規化されたＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリード数を有するＮＣＩケースには、６つの外れ値があった。これらのうち、ＭＭＳＥスコアは３例で３０、１例で２９であり、２例で利用不可であった。
　Ａβ生成については、３０１個のプローブ配列のうち、２０２個でフレームシフトが発生していない。これらのリードは、Ａβを生成できると見なされるが、ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８を除いて、リード数はわずかであった。図１３は、上位１０のＡβ生成可能なリード数を示す。Ａβ生成可能な読み取りに注目すると、平均リード数はＳＡＤで５２／症例、ＮＣＩで２９／症例であった。これらの値は、上記のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリード数と同様であった。ｍｉｄｅｘ８で正規化した場合でも、ＳＡＤとＮＣＩの間に有意差があり（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によるｐ値は、２．９Ｅ－５、図４参照。）、正規化された総リード数とＡβ産生リード数の間に高い相関があった（ｒ２＝０．９８２）。ＮＣＩケースには６つの外れ値があり、それらは上記の正規化された合計ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡリードカウントで観察された同じ外れ値のケースであった。
　最も頻度の高いプローブ配列は、ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８で、これはプローブ配列ポジティブリードの約８９％を占め、その配列は、Ｌ－ＡＰＰ ｍＲＮＡと名付けられた、エクソン１５を欠くＡＰＰ ｍＲＮＡのエクソン１４及び１６の連結部位配列と同一であった。Ｌ－ＡＰＰ ｍＲＮＡは、白血球と星状細胞で発現している。したがって、Ｌ－ＡＰＰ ｍＲＮＡがそれらから放出された可能性を考慮し、ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８のみでリードを調べた。ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８をＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定から除外した場合、p 値は２．０７Ｅ－２ であり（図７参照。）、ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８単独のp 値は、１．５３Ｅ－５であった（図８参照。）。つまり、プローブ配列ｐｒｏｓｅｑｆｆ１７８９２８ポジティブリードのみのp 値は、すべてのプローブ配列ポジティブ リードのp 値よりも有意であった (p 値:３．１８Ｅ－５)。
［実施例１］
［循環核酸の塩基配列解析］
　血漿中のＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡからの転写産物の存在を確認するために、血漿サンプルでＮＧＳ分析を実行した。循環核酸は、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、１～１．５ｍＬの血漿から抽出し、１７μＬで溶出した。 １５μＬの溶出液、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、及びＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｎｏｎ－Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ （ＮＥＢ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡ溶液には、ｃｆＤＮＡ を除去する手順が実行されていないため、ｃｆＤＮＡも含まれている。１．２倍容量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してｃＤＮＡ 溶液を精製し、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ/ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ)を使用してｄＡテーリングを行った後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ を使用してアダプターライゲーションを実行した。この反応混合物を１．２倍容量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、３２μＬの０．１×ＴＥで溶出した。このｃｆＤＮＡ及びｃＤＮＡは、ｘＧｅｎキャプチャープローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したキャプチャーハイブリダイゼーション、続いてＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＰＣＲ増幅によって濃縮された。次に、ＭｉＳｅｑ試薬キット ｖ２ （３００サイクル）とＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してイルミナシーケンスを実行した。
　合計１９のプローブ配列が血漿サンプル中で検出され（図１４参照。）、ＳＡＤ患者１０人中７人、及びコントロール３人中２人で検出された。２回のシークエンスランで検出されたプローブを含むリード配列を図１０に示す。興味深いことに、８つのプローブ配列は、血漿ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＳＲＡ ＰＲＪＮＡ５７４４３８で検出されたものと共通であった。さらに、リード数が最も多いプローブ配列も、血漿サンプルとＰＲＪＮＡ５７４４３８の間で同じであった。
［ＡＰＰエクソン７とエクソン９の接合部配列のリード数の比較］
　上記の２ヌクレオチド相同組換えを想定して構築されたプローブ配列は連結部を検出できない。ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写によって生成されると考えられているため、つまり、ニューロンで発現するＡＰＰ ｍＲＮＡにはエクソン８が欠けているため、ＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡには、ＡＰＰのエクソン７と９の重複しない接合配列を持つものが含まれる。それでエクソン７とエクソン９の連結部位の塩基配列である、ｄｅｌｅｘ８を使用してＳＲＡのＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇを実行した。ただし、ニューロン由来のＡＰＰ ｍＲＮＡから合成された ｃＤＮＡもまた、ｄｅｌｅｘ８と同じ連結部を持っているため、上記で作成したプローブ配列とは異なり、ｄｅｌｅｘ８はＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡ特異的ではなくニューロン特異的である。結果を図１２に示す。ｃｆ－ｍＲＮＡから構築されたＰＲＪＮＡ５７４４３８のｍｉｄｅｘ８によって正規化したｄｅｌｅｘ８のＢｏｘブロットを図５に示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定検定では、ＳＡＤとＮＣＩ の間に有意差が観察され、ｐ値は０．０１２７だった。
［実施例２］
　認知機能障害が無い対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びアルツハイマー病患者（ＡＤ）それぞれの血漿１ｍＬから、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＣＮＡを抽出した。
　図１に示す様に、ＡＰＰ遺伝子は、１８個のエクソンを有し、転写により得られたｍＲＮＡ前駆体は、スプライシングを受けてｍＲＮＡとなる。
　抽出したＣＮＡと、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ:エクソン１とエクソン２の連結部位ＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ:エクソン１７とエクソン１８の連結部位ＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧ（配列番号２）
　ＰＣＲのサイクルは以下の通りである。
９８℃３０ｓｅｃ：１ｃｙｃｌｅ 
９５℃１５ｓｅｃ, ６０℃３０ｓｅｃ,７２℃３０ｓｅｃ：４０ｃｙｃｌｅs
４℃:ｈｏｌｄ
　その後、ライブラリを調製して、ナノポアシークエンシングを行った。
　結果を図１５に示す。アルツハイマー病患者由来のサンプルで、プローブのポジティブリード数は、コントロールサンプルに対して、有意な差が確認された。
［実施例３］
　実施例１と同様の方法で調製したＣＮＡを用いて、Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴａｑＭａｎ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ試薬を使用した。
　また、以下のプライマー及びプローブを用いた。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：エクソン７ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：エクソン９ＧＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＧＧ（配列番号４）
Ｆａｍ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ：ＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧ（エクソン７とエクソン９の連結部位を検出（ｄｅｌｅｘ８）；配列番号５）
Ｈｅｘ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ：ＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＣ（エクソン８を検出（ｍｉｄｅｘ８）；配列番号６）
　ＰＣＲのサイクルは以下の通りである。
５０℃５ｍｉｎ：１ｃｙｃｌｅ
９５℃２０ｓｅｃ：１ｃｙｃｌｅ
９５℃１５ｓｅｃ,６０℃６０ｓｅｃ：４０ ｃｙｃｌｅｓ　
　内部標準に対するプローブは蛍光色素のＨＥＸで標識したもの、エクソン間の連結部位特異的プローブはＦＡＭで標識したものを用いた。
　結果を図１６に示す。ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲでもニューロン由来のｄｅｌｅｘ８、及び内部標準のｍｉｄｅｘ８を明確に検出できていることが示された。
［実施例４］
　公開されたＰＲＪＮＡ５７４４３８のＳＲＡを対象に、ＮＵＭＢのエクソンの塩基配列ＡＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＴＣＡＣＴＴＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴ（配列番号５３）を用いて、この配列が含まれるリード数を調べＳＡＤとＮＣＩで比較した。標準化はＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子の塩基配列ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡを用いた（配列番号５４）。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでＰ値０．００００００３０５が得られた。その結果を図１７に示した。
［実施例５］
　ＨＬＡ－ＤＲＡで標準化したＡＰＰ ｇｅｎｃＤＮＡとＮＵＭＢのリード数を組み合わせて同様な比較を行ったところ、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでＰ値０．００００００１６５が得られ、単独の場合よりも小さなP値となった。その結果を図１８に示した。
［実施例６］
　公開されたＰＲＪＮＡ５７４４３８のＳＲＡを対象に、ＰＲＯＫ２遺伝子のヴァリアントのエクソンの塩基配列ＡＡＴＧＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧ（配列番号５５）を用いて、この配列が含まれるリード数を調べＳＡＤとＮＣＩで比較した。標準化はＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子の塩基配列ＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡを用いた（配列番号５４）。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでＰ値０．００００００００００１２が得られた。その結果を図１９に示した。
　本発明によれば、簡便・高感度・迅速かつ非侵襲的にアルツハイマー病を診断できる診断マーカー検出方法、及び診断キットを提供できる。

Claims (19)

  1. 　被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出する、診断マーカー検出方法。
  2. 　前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項１に記載の診断マーカー検出方法。
  3. 　前記疾患関連遺伝子が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子である、請求項１又は２に記載の診断マーカー検出方法。
  4. 　前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位を検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載の診断マーカー検出方法。
  5. 　前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位がＡＰＰ遺伝子のエクソン７とエクソン９の連結部位である請求項４に記載の診断マーカー検出方法。
  6. 　前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位がＡＰＰ遺伝子のエクソン１４とエクソン１６の連結部位である請求項４に記載の診断マーカー検出方法。
  7. 　前記疾患関連遺伝子のエクソン間の相同組み換え部位を検出する、請求項１～３のいずれか一項に記載の診断マーカー検出方法。
  8. 　前記疾患関連遺伝子が、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、又はｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ２遺伝子(ＰＲＯＫ２遺伝子）である、請求項１又は２に記載の診断マーカー検出方法。
  9. 　前記疾患関連遺伝子は、ＡＰＰ遺伝子、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、及びｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ２遺伝子(ＰＲＯＫ２遺伝子からなる群から選ばれる組み合わせである、請求項１又は２に記載の診断マーカー検出方法。
  10. 　更に検出した疾患関連遺伝子のコピー数を定量する、請求項１～９のいずれか一項に記載の診断マーカー検出方法。
  11. 　血漿から精製したＣＮＡを逆転写したものを用いて、前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ　ＰＣＲ又はｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで増幅し、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）でその増幅産物の塩基配列を解析し、連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域のリード数を計数することにより定量する、請求項４～１０のいずれか一項に記載の診断マーカー検出方法。
  12. 　前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子を含む領域を、逆転写工程を含むｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘのワンステップリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法により定量する、請求項４～９のいずれか一項に記載の診断マーカー検出方法。
  13. 　前記エクソン間の連結部位又は相同組み換え部位を含む領域のＰＣＲ時に、或いはＮＵＭＢ遺伝子のＰＣＲ時に、又はＰＲＯＫ２遺伝子のＰＣＲ時に、内部標準を同一のＰＣＲチューブ内で増幅し、内部標準のリード数とエクソンの連結部位又は相同組み換え部位、或いはＮＵＭＢ遺伝子、又はＰＲＯＫ２遺伝子のリード数を比較することにより標準化するか、ＲＴ－ｑＰＣＲ時に、エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的、或いはＮＵＭＢ遺伝子特異的、又はＰＲＯＫ２遺伝子特異的蛍光色素標識プローブと、前記エクソン間の連結部位特異的又は相同組み換え部位特異的、或いはＮＵＭＢ遺伝子特異的、又はＰＲＯＫ２遺伝子特異的蛍光色素標識プローブの蛍光色素とは異なる蛍光色素で標識した内部標準特異的蛍光色素標識プローブを用い、これらプローブの蛍光強度の比較により標準化する、請求項１１又は１２に記載の診断マーカー検出方法。
  14. 　内部標準がＡＰＰ遺伝子のエクソン８を含む、請求項１３に記載の診断マーカー検出方法。
  15. 　内部標準がＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子のエクソン領域を含む、請求項１４に記載の診断マーカー検出方法。
  16. 　被験者から単離された末梢血中の循環核酸（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ, ＣＮＡ）から、疾患関連遺伝子を検出するための診断キットであって、
    　前記疾患関連遺伝子を増幅するためのプライマーセット、及び／又は前記疾患関連遺伝子若しくはその増幅産物に結合するプローブを含む、診断キット。
  17. 　前記疾患は、アルツハイマー病である、請求項１６に記載の診断キット。
  18. 　前記疾患関連遺伝子が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、ＮＵＭＢ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＮＵＭＢ遺伝子）、及びＰＲＰＫ２遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項１６又は１７に記載の診断キット。
  19. 　前記疾患関連遺伝子のエクソン間の連結部位、相同組み換え部位又はエクソンを検出する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の診断キット。
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