KR20180088690A

KR20180088690A - 골수종의 치료 또는 진행의 모니터링

Info

Publication number: KR20180088690A
Application number: KR1020187018220A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 스펜서; 스리두르가 미트라프라부
Original assignee: 알프레드 헬스
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2018-08-06
Also published as: CA3007426A1; CN108603232A; WO2017091865A1; JP2022000059A; EP3384050A1; JP2018537128A; AU2016363113A1; US20180282820A1; EP3384050A4

Abstract

본 발명은 골수종을 진단하고, 골수종을 앓고 있는 개체에서 질병 진행 또는 치료 효능을 모니터링하기 위한 방법들 및 키트들에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응의 모니터링 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리(cell-free) 핵산을 제공하는 단계; 및 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계를 포함하며; 여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리킨다.

Description

골수종의 치료 또는 진행의 모니터링

본 출원은 호주 가출원 AU 2015905013 및 AU 2016903019로부터 우선권을 주장하며, 그 전체 개시내용은 이들 전체가 본원에 포함된다.

본 발명은 개체가 골수종을 앓고 있는지의 여부를 확인하며, 골수종의 진행 또는 골수종 치료의 효능을 모니터링하기 위한 방법들 및 키트들에 관한 것이다.

다발성 골수종(MM)은 골수(BM) 전반에 걸친 다병소성 종양 침착물을 특징으로 하는 불치성 혈액 악성 종양(haematological malignancy)이다. 핵형 불안정성(kryotypic instability) 및 염색체 수 이상(numeric chromosome abnormality)은 사실상 모든 MM에 존재한다. 면역글로빈(IgH) 유전자 및 FGFR3/MMSET, CCND1, CCND3 또는 MAF를 수반하는 1차 전좌(primary translocation)는 질병 발병 동안 발생하고, MYC 유전자를 수반하는 2차 전좌는 질병 진행 동안 발생한다. MM의 치료가 프로테아좀 저해제 및 면역조정제의 사용에 의해 유의한 진전을 이루긴 하였지만, 이러한 질병은, 종종 이러한 질병의 초기 단계 동안에 존재하지 않는 돌연변이의 축적을 통해 세포가 전신 요법에 대해 내성이 생겨 불치성으로 남는다. 치료에 대한 내성은 종종 MM 세포의 유전적 진화를 통해 매개되어, 더 저항성인 클론이 성장 및 생존 이점을 갖게 된다. 진단 및 예후의 예측에 대한 현재의 관행은 순차적인 BM 생검을 수행하는 것이지만, 생검으로부터 수득된 유전자 정보(GI; genetic information)는 종양(들)의 공지된 클론간(inter-clonal) 및 클론내(intra-clonal) 이종성(heterogeneity)에 의해 혼동된다(confounded).

다발성 골수종의 진단 및 예후의 예측을 확인하고/거나 치료 효능을 모니터링하기 위한 향상되거나 대안적인 방법이 요망되고 있다.

명세서 내의 임의의 선행 기술에 대한 참조문헌은, 이러한 선행 기술이 임의의 사법권 내에서 보편적인 일반 지식의 일부를 형성하거나, 이러한 선행 기술이 당업자에 의해 선행 기술의 다른 조각인 것으로 이해되며, 관련이 있는 것으로 간주되고/거나 조합되는 것으로 타당하게 예상될 수 있을 것임을 인정하거나 제시하는 것이 아니다.

본 발명은 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응의 모니터링 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리(cell-free) 핵산을 제공하는 단계; 및

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리키거나; KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 존재 또는 그 수의 증가는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 무반응을 가리킨다.

- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계;

- 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 제공하는 단계;

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계; 및

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, 세포-프리 핵산 또는 골수 단핵 세포 유래의 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리키거나; 세포-프리 핵산 또는 골수 단핵 세포 유래의 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 존재 또는 그 수의 증가는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 무반응을 가리킨다.

- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 핵산 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별(identify)하는 단계로서, 대조군 프로파일은 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 핵산의 수준에 대한 데이터를 함유하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 핵산 수준이 대조군 프로파일과 동일한 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 있음을 확인하는 단계

를 포함한다.

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 핵산 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계로서, 대조군 프로파일은 치료 시작 전 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 핵산의 수준에 대한 데이터를 함유하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 핵산 수준이 대조군 프로파일보다 낮은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 있음을 확인하는 단계

를 포함한다.

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 핵산 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계로서, 대조군 프로파일은 치료 시작 전 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 핵산의 수준에 대한 데이터를 함유하는 단계;

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 핵산 수준이 대조군 프로파일보다 낮은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 있음을 확인하는 단계; 또는

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 핵산 수준이 대조군 프로파일과 동일하거나 높은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 없었음을 확인하는 단계

를 포함한다.

- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시험 시료를 제공하는 단계;

- 세포-프리 핵산의 수준에 대해 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 핵산의 수준에 대한 데이터를 함유하는 대조군 프로파일을 제공하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 핵산 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일 내 세포-프리 핵산의 수준이 대조군 프로파일과 동일한 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 있음을 확인하는 단계

를 포함한다.

- 다발성 골수종을 앓고 있는 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 핵산의 수준에 대한 데이터를 함유하는 대조군 프로파일을 제공하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 핵산 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계;

- 시험 시료 프로파일 내 세포-프리 핵산의 수준이 대조군 프로파일보다 낮은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 있음을 확인하는 단계; 또는

- 시험 시료 프로파일 내 세포-프리 핵산의 수준이 대조군 프로파일과 동일하거나 높은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응이 없음을 확인하는 단계

를 포함한다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에서, 세포-프리 핵산은 세포-프리 DNA이다. 본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에서, 세포-프리 핵산은 세포-프리 종양-유래 DNA이다.

본 발명은 또한, 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응의 모니터링 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및

를 포함하며,

여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리킨다.

- 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 제공하는 단계;

를 포함하며,

여기서, 세포-프리 핵산 또는 골수 단핵 세포 유래의 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리킨다.

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액의 세포-프리 핵산을 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서, 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 세포-프리 핵산의 돌연변이 수 또는 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계로서, 대조군 프로파일은 치료 시작 전 개체의 말초 혈액 내 세포-프리 DNA의 수준에 대한 데이터를 함유하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 세포-프리 핵산의 돌연변이 수 또는 수준이 대조군 프로파일보다 낮은 경우, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응하였음을 확인하는 단계

를 포함한다. 대안적으로, 개체가 다발성 골수종 치료에 반응하지 않았다는 확인 단계는, 시험 시료 프로파일에서 적어도 하나의 돌연변이를 함유하는 세포-프리 핵산의 돌연변이 수 또는 수준이 대조군 프로파일과 동일하거나 높은 경우이다.

- 다발성 골수종을 앓고 있는 것으로 진단받았거나 진행형 질병(advanced disease)을 앓고 있는 것으로 식별된(identified) 다발성 골수종 치료를 받은 개체를 본원에 기재된 본 발명의 방법에 따라 제공하는 단계; 및

를 포함하며,

여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리킨다.

본 발명의 임의의 양태에서, 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계는 진단되거나 모니터링되는 개체로부터 말초 혈액 시료를 직접적으로 수득하는 단계를 수반할 수 있다.

본 발명의 임의의 양태에서, 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계는 돌연변이를 갖는 전사체의 수 또는 분포 분율(fractional abundance)을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 세포-프리 핵산의 수준 또는 세포-프리 핵산, 전형적으로 DNA 내 돌연변이 수에 대해 시험 시료를 평가하는 단계는, 말초 혈액으로부터 세포-프리 핵산을 추출하고, 세포-프리 핵산을 제외한 말초 혈액의 모든 구성성분들을 폐기하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명의 임의의 양태에서, 개체를 치료하기 위해 하나 이상의 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 치료는, 다발성 골수종에 대한 개체의 전반적인 치료가 변형되도록, 환자에게 이전에 투여된 것과 상이한 약물 또는 약물들을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자에게 이전에 투여된 약물 또는 약물들에 하나 이상의 부가적인 약물이 보충된다. 대안적인 실시형태에서, 이전에 투여된 약물 또는 약물들은 하나 이상의 대안적인 약물로 대체된다.

바람직하게는, 투여되는 약물은, 덱사메타손(Dexamethasone), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리노마이드(Lenalinomide), 에토포사이드(Etopside), 시스플라틴(Cisplatin), 익사조밉(Ixazomib), 보르테조밉(Bortezomib), 베무라피닙(Vemurafinib), 리고세르팁(Rigosertib), 트라메티닙(Trametinib), 파노비노스타트(Panobinostat), 아자시티딘(Azacytidine), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루무맙(Nivolumumab), 두발루맙(Durvalumab) 또는 자가 줄기세포 이식물(ASCT; autologous stem cell transplant)을 포함하여 당업자에게 공지된 요법이다. 치료는 하나 이상의 약물, 또는 하기 조합들을 포함하여 2개 이상의 약물들의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 시스플라틴(DCEP); 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시스플라틴 및 탈리도마이드(T-DCEP); 레날리도마이드 및 덱사메타손(Rd), 익사조밉-사이클로포스파미드-덱사메타손(ICd); 또는 보르테조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(VCD). 치료는 부가적인 약물과 조합된 DCEP, T-DCEP, Rd, Icd 또는 VCD의 조합을 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 임의의 양태에서, 개체를 치료하기 위해 약물을 투여하는 단계가 발생하며, 여기서, 확인 단계는 환자가 치료에 반응하는 데 실패한 것으로 식별하거나, 환자가 상응하는 골수-유래 핵산에서보다 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산 또는 순환하는 종양-프리 핵산에서 더 높은 돌연변이 로드(load)를 가진 것으로 식별한다.

본 발명은 다발성 골수종을 앓고 있는 개체에 대해 치료 계획(regimen)의 확인 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 다발성 골수종 치료를 받고 있거나 받았거나, 진행형 질병을 앓고 있는 것으로 식별된 개체를 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 제공하는 단계;

- 개체로부터, 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및

를 포함하며,

여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 돌연변이 중 임의의 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 검출하는 단계는, 치료 계획이 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 경로를 특이적으로 표적화하는 약물의 투여를 포함하는 것을 확인한다.

개체가 1개 초과의 돌연변이를 갖고 있는 것으로 확인되는 경우, 치료는, 각각의 돌연변이가 특이적으로 표적화되도록 1개 초과의 약물을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 또한, 개체의 돌연변이가 현재의 치료 프로토콜에 반응성이지 않은 것으로 확인된 경우, 특정 약물의 투여를 중단하고 대안적인 치료를 시작할지 확인하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 특정 돌연변이를 표적화하는 약물의 투여를 유지할지 확인하고, 개체에서 상이한 돌연변이들을 표적화하는 하나 이상의 약물의 첨가에 의해 치료 프로토콜을 보충하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다발성 골수종을 앓고 있는 개체의 질병 진행의 모니터링 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 다발성 골수종의 진행이 확인되어야 하는 개체로부터 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계;

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자에서, 순환하는 종양-프리 핵산의 수준 또는 종양-프리 핵산에서 돌연변이 수에 대해 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 이전의 시점에서 동일한 개체의 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자에서, 순환하는 종양-프리 핵산의 수준 또는 종양-프리 핵산에서 돌연변이 수에 대해 데이터를 함유하는 비교 프로파일을 제공하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 비교 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 비교 프로파일 사이에서 순환하는 종양-프리 핵산의 수준 또는 종양-프리 핵산에서 돌연변이 수의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 순환하는 종양-프리 핵산의 수준 또는 종양-프리 핵산에서 돌연변이 수가 비교 프로파일보다 더 높은 경우 개체에서 질병이 진행된 것으로 확인하는 단계

를 포함한다. 대안적으로, 시험 시료 프로파일에서 순환하는 종양-프리 핵산의 수준 또는 종양-프리 핵산에서 돌연변이 수가 비교 프로파일과 동일하거나 더 낮은 경우 개체에서 질병이 진행되지 않은 것으로 확인한다.

바람직하게는, 이전의 시점에서 동일한 개체로부터의 비교 프로파일은 본 발명의 방법을 수행하기 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 24개월 전부터이다.

바람직하게는, 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계는 진단되는 개체로부터 말초 혈액 시료를 직접적으로 수득하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 순환하는 종양-프리 핵산에서 돌연변이의 존재, 수준 또는 수에 대해 시험 시료를 평가하는 단계는, 말초 혈액으로부터 세포-프리 DNA를 추출하고, 세포-프리 DNA를 제외한 말초 혈액의 모든 구성성분들을 폐기하는 단계를 포함한다.

본 발명은 다발성 골수종을 앓고 있는 개체에서 질병 진행의 모니터링 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 질병 진행이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및

- TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, TP53에서 하나 이상의 돌연변이의 검출은, 개체를 진행형 질병으로 진행된 것으로 진단한다. 바람직하게는, TP53에서 돌연변이는 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 인코딩한다.

본 발명은 다발성 골수종을 앓고 있는 개체에서 질병의 진행의 모니터링 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산 및 골수 단핵 세포를 제공하는 단계; 및

- KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이에 대해 세포-프리 핵산 및 골수-유래 핵산을 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, 3개 초과의 TP53 돌연변이의 검출은 진행형 질병으로 진전된 개체를 진단한다. 바람직하게는, TP53에서 돌연변이는 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 인코딩한다.

본 발명은 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 개체의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 순환하는 종양-프리 핵산에 대해, 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액의 시험 시료를 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, 순환하는 종양-프리 핵산의 존재의 확인은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 것으로 진단한다. 바람직하게는, 순환하는 종양-프리 핵산은, 적어도 하나의 돌연변이가 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 세포-프리 핵산이다. 바람직하게는, 돌연변이는 도 10에 열거된 돌연변이를 인코딩하는 임의의 하나 이상의 돌연변이이다.

- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계; 및

- 순환하는 종양-프리 핵산에 대해 시험 시료를 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, 순환하는 종양-프리 핵산의 검출은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 것으로 진단한다. 바람직하게는, 순환하는 종양-프리 핵산은, 적어도 하나의 돌연변이가 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 세포-프리 핵산이다. 바람직하게는, 돌연변이는 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 인코딩한다.

- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및

를 포함하며,

여기서, KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이의 검출은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 것으로 진단한다. 바람직하게는, 이러한 방법은 세포-프리 핵산이 추출되는 개체로부터 말초 혈액 시료를 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 임의의 양태에서, 핵산에서 검출되는 돌연변이는 도 10에 나타낸 돌연변이들로 이루어진 군 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩한다. 보다 바람직하게는, 돌연변이는 KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G12V, KRAS G12S, KRAS G12R, KRAS G12A, KRAS G13C, NRAS Q61K, NRAS Q61H_1, NRAS G13D, NRAS Q61H, NRAS Q61L, NRAS G13R, BRAF V600E 및 TP53 R273H 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 돌연변이는 KRAS G12S, KRAS G12R 및 NRAS Q61L로부터 선택된다.

- 다발성 골수종과 연관된 것으로 공지된 돌연변이를 검출하도록 디자인된 복수의 프로브들을 제공하는 단계;

- 프로브가 세포-프리 핵산에 결합하기에 적합한 조건 하에, 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 복수의 프로브들과 접촉시키는 단계; 및

- 프로브와 세포-프리 핵산의 결합을 검출하는 단계

를 포함한다.

- 도 10에 나타낸 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩하는 핵산에서 하나 이상의 돌연변이를 검출하도록 디자인된 복수의 프로브들을 제공하는 단계;

- 프로브와 세포-프리 핵산의 결합을 검출하는 단계

를 포함한다.

- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계;

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계;

- 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 제공하는 단계; 및

- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 평가하는 단계

를 포함하며,

여기서, 세포-프리 핵산 및 골수 유래의 핵산 둘 다에서 돌연변이의 검출은 개체가 다발성 골수종을 앓고 있는 것으로 진단한다.

- 세포-프리 DNA 수준에 대해, 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액의 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 DNA 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계로서, 대조군 프로파일은 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 개체의 말초 혈액에서 세포-프리 DNA 수준에 대한 데이터를 함유하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 DNA 수준이 대조군 프로파일보다 더 높은 경우, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있음을 확인하는 단계

를 포함한다.

- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계;

- 세포-프리 DNA 수준에 대해 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;

- 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 개체의 말초 혈액에서 세포-프리 DNA 수준에 대한 데이터를 함유하는 대조군 프로파일을 제공하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 DNA 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계; 및

를 포함한다.

- 이전의 시점에서 동일한 개체의 말초 혈액에서 세포-프리 DNA 수준에 대한 데이터를 함유하는 비교 프로파일을 제공하는 단계;

- 시험 시료 프로파일을 비교 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 비교 프로파일 사이에서 세포-프리 DNA 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별하는 단계; 및

- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 DNA 수준이 비교 프로파일보다 더 높은 경우, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있음을 확인하는 단계

를 포함한다.

상기 기재된 본 발명의 임의의 양태는 Ras-MAPK 경로를 표적화하는 양식(modality)에 의한 치료를 받을 개체를 식별하는 데 사용될 수 있으며, 바람직하게는 이러한 양식은 Ras-MAPK 경로의 저해제이다. 예를 들어, Ras-MAPK 경로에 관여하는 생성물을 인코딩하는 유전자에서의 돌연변이의 식별은, 개체가 Ras-MAPK 경로의 저해제에 의한 치료로부터 이득을 얻을 것으로 식별한다.

본 발명의 임의의 양태에서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서의 돌연변이는 도 10에 열거된 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에서의 돌연변이를 인코딩한다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에서, 다발성 골수종, 활성 질병(active disease) 또는 진행형 질병을 앓고 있는 것으로 진단된 개체를 치료하기 위해 약물을 투여하는 단계가 추가로 포함된다. 다발성 골수종을 치료하기 위한 약물은 본원에 기재된 약물들을 포함하여 치료에 전형적으로 사용되는 임의의 하나일 수 있다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 양태에서, 돌연변이의 평가는, 개체의 KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 유전자의 모두 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을, 대조군 개체 또는 개체들의 KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 유전자의 모두 또는 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 하나 이상의 개체로부터 유래되거나, 새로 진단된, 비-진행형 질병의 경우일 수 있음)과 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한, 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 개체의 진단에 사용하거나, 질병의 진행 또는 단계를 모니터링하거나 치료 효능을 모니터링하는 데 사용하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는

- 도 10에 열거된 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩하는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 임의의 하나 이상의 돌연변이를 검출하기 위한 수단; 및

- 개체의 말초 혈액 시료로부터 세포-프리 핵산을 단리하거나 추출하기 위한 시약

을 포함한다.

바람직하게는, 키트는 또한, 다발성 골수종을 앓고 있지 않는 개체로부터 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 키트는 또한, 다발성 골수종을 가진 환자에서 식별된 돌연변이가 검출된 위치에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 야생형 서열을 포함한다. 전형적으로, 이러한 위치는, 다발성 골수종을 가진 환자에서 식별된 돌연변이가 도 10에 열거되어 있는 위치이다.

바람직하게는, 키트는 또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에서 키트의 사용에 대한 작성된 설명서를 포함한다.

바람직하게는, 하나 이상의 돌연변이를 검출하기 위한 수단은, 돌연변이를 포함하는 서열과 혼성화하거나 돌연변이를 포함하는 서열을 증폭시키기 위한 하나 이상의 핵산 프로브 또는 프라이머이다. 프로브들은, 상보적인 염기 짝짓기(base-paring)에 의해 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 서열 내의 이들 프로브의 표적 부위들에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브인 것이 바람직하다. 의심을 피하기 위해, 본 발명의 맥락에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브의 정의는 전장(full length) KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자(또는 이의 보체)를 포함하지 않는다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 사용하기 위한 또는 사용되는 경우 고체 지지체에 고정된 복수의 프로브들을 포함하는 다발성 골수종 검출 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 프로브는 도 10에 열거된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 검출하도록 디자인된다.

본원에서 임의의 양태에서, 골수 단핵 세포는 골수 생검 유래일 수 있다.

본 발명은 또한, 다발성 골수종을 앓고 있는 개체를 치료하기 위해 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 골수종을 앓고 있는 개체의 치료 방법을 제공하며, 여기서, 개체는 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에 의해 다발성 골수종을 앓고 있는 것으로 진단된다. 바람직하게는, 투여되는 약물은 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 탈리도마이드, 레날리노마이드, 에토포사이드, 시스플라틴, 익사조밉, 보르테조밉, 베무라피닙, 리고세르팁, 트라메티닙, 파노비노스타트, 아자시티딘, 펨브롤리주맙, 니볼루무맙, 두발루맙 또는 자가 줄기세포 이식물(ASCT)을 포함하여 당업자에게 공지된 요법이다. 치료는 하나 이상의 약물, 또는 하기 조합들을 포함하여 2개 이상의 약물들의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 시스플라틴(DCEP); 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시스플라틴 및 탈리도마이드(T-DCEP); 레날리도마이드 및 덱사메타손(Rd), 익사조밉-사이클로포스파미드-덱사메타손(ICd); 또는 보르테조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(VCD). 치료는 부가적인 약물과 조합된 DCEP, T-DCEP, Rd, Icd 또는 VCD의 조합을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 다른 것을 필요로 하는 경우를 제외하고는, 용어 "포함하다" 및 용어의 변화형, 예컨대 "포함하는", "포함한다" 및 "포함되는"은 추가의 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계를 배제하려는 것이 아니다.

본 발명의 추가의 양태들, 및 이전의 단락들에서 기재된 양태들의 추가의 실시형태들은 실시예 및 첨부된 도면을 참조로 하여 하기 상세한 설명을 통해 명확해질 것이다.

도 1: 세포-프리 DNA(cfDNA)의 양은 다발성 골수종(MM) 환자의 혈장에서 유의하게 더 높다. 컬럼 그래프는 MM 환자(n=37) 및 정상 지원자(NV)(n=21)의 혈장(PL) 1 ml로부터 회수된 cfDNA의 양을 ng으로 나타낸다. MM에서 그 양은 통계학적 분석을 위해 GraphPad Prism V6를 이용하는 만-휘트니 t-테스트(Mann-Whitney t-test)에 의해 평가된 바와 같이 유의하게 더 높고, p=0.0085의 유의성을 가리킨다.
도 2: cfDNA 양은 질병 단계와 상관관계가 있다. 컬럼 그래프는 NV, 및 활성 질병 및 안정한 질병을 가진 MM 환자의 PL 1 ml로부터 회수된 cfDNA의 양을 ng으로 나타낸다. 활성 질병을 가진 환자에서 cfDNA의 수준은 만-휘트니 t-테스트를 사용하여 비교한 경우 NV(p=0.0067)보다 유의하게 더 높다.
도 3: cfDNA 양은 파라단백질(paraprotein), 혈청-프리 경쇄(SFLC) 또는 골수(BM) MM 세포 비율과 상관관계가 있지 않다. 상관관계 플롯은, cfDNA의 양이 파라단백질, SFLC 및 BM MM 세포 비율과 상관관계가 있지 않음을 가리킨다. 피어슨 상관관계 계수 분석은 GraphPad Prism V6f를 이용하여 상관관계에 대한 r-값을 확인하기 위해 수행되었다.
도 4: MM 환자의 짝지어진(paired) BM 및 PL 시료에서 돌연변이의 분포이다. 컬럼 그래프는 BM 및 PL 시료에 존재하는 KRAS, NRAS, TP53 및 BRAF의 돌연변이 수 및 비율을 나타낸다.
도 5: 재발성/불응성(RR) 및 새로운 진단(ND) 환자에서 돌연변이의 분포이다. 컬럼 그래프는 각각의 환자에서 BM 및 PL에서 확인된 돌연변이 수를 가리킨다. 18 48RR 환자 중 10명은, BM 생검 부위로부터 이격된 곳에서 돌연변이적으로 이질적인(disparate) 질병과 일치하는 PL에서만 검출 가능한 돌연변이를 나타내었다(RR1RR2, 4, 10, 12, 13, 14, 15, 28, 35 및 8 및 11, 및 ND 13에서 컬럼의 상부 구획).
도 6: BM 및 PL 시료에서의 돌연변이 분포율(MA; mutational abundance)이다. 도트-플롯은 BM, PL, 또는 BM과 PL 둘 다에 존재하는 돌연변이의 MA의 대표도이다. MA의 중앙 수준이 도시되어 있다. BM에서 MA의 중앙 수준은, 두 구획(compartment) 모두에서 검출되는 돌연변이에 대해 PL(p=0.014)에서보다 유의하게 더 높다. BM 및 PL 둘 다에서 확인되는 돌연변이에서, BM에서 중앙 MA는 BM에서만 확인되는 돌연변이에서의 중앙 MA보다 유의하게 더 높았다(p<0.0001). PL 단독 돌연변이의 MA는 BM 및 PL 둘 다에서 검출되는 PL 돌연변이의 MA보다 유의하게 더 낮았다(p=0.003). 모든 분석들은 만-휘트니 t-테스트를 사용하여 수행되었다.
도 7: 돌연변이 유형의 분포로서, (a) 모든 돌연변이들은 48명 환자의 BM 및/또는 PL에서 검출되었다. NRAS Q61K가 가장 우세하였다. (b) KRAS 돌연변이가 검출되었으며, (c) NRAS 돌연변이가 검출되었으며, (d) TP53 돌연변이가 검출되었고, (e) BRAF 돌연변이가 검출되었다.
도 8: MM은 주로 KRAS 돌연변이를 가진다. (a) BM 단독, (b) PL 단독, (c) BM과 PL 둘 다에서 검출된 KRAS, NRAS, BRAF 및 TP53 돌연변이의 비율이다.
도 9: ND 및 RR 환자에서 돌연변이의 분포이다. 컬럼 그래프는 각각의 RR 및 ND 환자 내에 존재하는 돌연변이의 수 및 유형을 나타낸다. 하나 이상의 RAS 돌연변이는 69% 초과의 환자에 존재하였다.
도 10: OMD 패널에서 KRAS, NRAS, BRAF 및 TP53 돌연변이의 리스트이다.
도 11: 환자에서 골수(BM), 말초 혈액(PB) 시료 또는 둘 다에서 검출되는 돌연변이의 요약이다.
도 12: 환자 #1 내지 #3의 PL에서 돌연변이체 클론의 순차적인 추적(tracking)이다.
(a): 선 그래프는 환자 #1에서 ddPCR에 의한 돌연변이체 클론의 FA를 나타낸다. PL을, 진단-후 1, 2, 3, 5, 8 및 10개월째에 수집하였다. 혈청 카파 프리-경쇄(카파 LC) 수준을 우측 Y-축에 나타내고, 명시적인 질병 진행 증거는 10개월째에 나타난다. 경구 아자시티딘, 레블리미드(revlimid) 및 덱사메타손(Rd) 요법 동안, 좌측 Y-축 상에 도시된, TP53 R273H가 아니라 돌연변이체 클론 KRAS G12D FA의 뚜렷한 증가는 혈청학적 진행과 일치하였다.
(b): 선 그래프는 레블리미드 및 덱사메타손을 이용한 요법 동안 1, 2, 6, 12, 15 및 17개월째에 수집된 순차적인 PL에서 돌연변이체 클론 KRAS G12V 및 KRAS G12S의 FA(좌측 Y-축)를 나타낸다. 람다 경쇄(LC) 및 파라단백질(우측 Y-축)은 12개월째에 하락하였으며, 후속해서 15개월 및 17개월째에 증가하였다. KRAS G12V의 수준은 요법 동안 람다 LC 증가와 일치하였다.
(c): 선 그래프는 동종 이식-후(post - allograft)(Allo) 1, 4 및 13개월째에 수집된 순차적인 PL에서 돌연변이체 KRAS G12C의 FA를 나타낸다(좌측 Y-축). FA 수준은 카파 경쇄(LC)와 일치하였고, 우측 Y-축에서 도시된 동종 이식-후(post-allo) 4개월 및 13개월째에 안정한 질병과 일치하는 검출 가능한 수준으로 존재하였다.
환자 PL에서 돌연변이체 클론의 순차적인 추적이다. 선 그래프는 환자 #3에서 ddPCR에 의한 돌연변이체 클론의 FA를 나타낸다. PL을 진단-후 1, 2, 3, 5, 8 및 10개월째에 수집하였다(적색 별표로 나타냄). 혈청 카파 프리-경쇄(카파 LC) 수준은 10개월째에 명시적인 질병 진행 증거와 함께 나타난다. 경구 아자시티딘, 레블리미드 및 덱사메타손(Rd) 요법 동안, TP53 R273H가 아니라 돌연변이체 클론 KRAS G12D FA의 뚜렷한 증가는 혈청학적 진행과 일치하였다.
도 13: 환자 #4, #5, #6 및 #7의 PL에서 돌연변이체 클론의 순차적인 추적.
(a) 선 그래프는 파노비노스타트 요법 시 새로 진단된 환자에서 1, 4 및 7개월째에 수집된 PL에서 환자 #4에서 PL-단독 돌연변이 KRAS G13C의 FA를 나타낸다. 4개월째 내지 7개월째 사이에 람다 경쇄(LC) 및 파라단백질 수준 둘 다에서 유의한 변화가 검출되지 않았으나; KRAS G13C 수준은 4개월째 내지 7개월째 사이에 가파른 증가를 가졌으며, 이는 질병 재발과 일치하였다(좌측 Y-축).
(b) 환자 #5에 대한 요법 동안 PL 돌연변이의 검출이다. 선 그래프는 경구 아자시티딘, 레블리미드 및 덱사메타손(Rd)을 이용한 요법 동안 1, 10, 20 및 90일째에 수집된 환자#5 PL에서 돌연변이체 클론 NRAS Q61K, KRAS Q61H_1 및 BRAF V600E의 FA를 나타낸다. FA 수준은 치료 10일째에 감소하였으며, 한편 카파 경쇄(LC) 감소는 불과 20일째부터 검출되었다.
(c) 선 그래프는 요법 동안 1, 13 및 24개월째에 수집된 재발성 환자의 순차적인 PL에서 4개의 돌연변이체 클론(좌측 Y-축) 및 람다 LC(우측 Y-축)의 FA를 나타낸다. 환자 #6에서 레블리미드 및 덱사메타손을 이용한 요법 시 재발되었으며, 13개월째에 2개의 돌연변이체 클론 KRAS G12V 및 KRAS G12A의 수준의 증가는 람다 LC와 일치하였으나, TP53 R273H 및 NRAS G13R FA는 감소하는 것으로 확인되었다. 13개월째에 익사조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(Cd)으로 전환하면, KRAS G12A 및 KRAS G12V의 수준이 감소하였고 NRAS G13R의 수준은 증가하였으며, 이는, 치료에 대한 돌연변이체 클론의 차별적인 반응을 제시한다.
(d) 선 그래프는 비-분비성(non-secretory) 환자인 환자 #7에서 ddPCR에 의한 돌연변이체 클론의 FA를 나타낸다. PL을 진단-후 1, 3, 13, 17 및 19개월째에 수집하였다. BM MM 세포의 비율이 나타나 있으며, 4개의 클론들의 증가하는 FA는 13개월째에 BM 재발과 일치하며, 불과 자가 줄기세포 이식-후(ASCT) 9개월째에서이다. 19개월째에, VCD에 대한 BM 반응은 명백하였으나, NRAS G13D 클론의 FA는 증가하였다. 환자는 이후 곧 불응성의 진행형 질병에 굴복하였다.
도 14: ddPCR를 사용한 OnTargetTM 돌연변이 검출 플랫폼(OMD) 결과의 입증(validation)이다. 표는, ddPCR을 사용하여 특정 돌연변이에 대해 체크된 BM 및 PL 시료에 대해 돌연변이의 존재(√) 또는 부재(X)에 대해 요약한 것이다.

이제, 본 발명의 소정의 실시형태를 참조로 하여 상세히 기재될 것이다. 본 발명이 실시형태와 함께 기재될 것이긴 하지만, 본 발명은 본 발명을 이들 실시형태로 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다. 그와는 대조적으로, 본 발명은 모든 대안, 변형 및 등가물을 망라하고자 하며, 이들은 청구항에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.

당업자는 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 많은 방법들 및 물질들을 인지할 것이며, 이들은 본 발명의 실시에 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 기재된 방법 및 물질로 어떠한 식으로도 제한되지 않는다.

본 명세서에서 개시되고 정의된 본 발명은 문맥 또는 도면으로부터 언급되거나 명백한 개별 특징들 중 2개 이상의 모든 대안적인 조합들까지 확장되는 것으로 이해될 것이다. 이들 상이한 조합들은 모두 본 발명의 다양한 대안적인 양태들을 구성한다.

본 발명자들은, 말초 혈액 내에서 세포-프리 DNA를 검출함으로써, 다발성 골수종 및 다발성 골수종 질병 진행의 다양한 단계들의 진단 방법을 확인하였다. 따라서, 본 발명은, 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 비-침습적인 방법(혈액 시료화 대(vs) 골수 생검)을 통해 모니터링하는 것이 가능하고, 세포-프리 DNA를 통한 돌연변이 상태의 검출이 단일 부위의 조직 생검보다 종양의 유전적 시그너처의 보다 포괄적인 그림을 제공한다는 점을 포함하여 유의한 이점을 제공한다. 이들 이점에 의해, 보다 확고한 진단이 가능하고, 질병에 존재하는 유전적 변경과 일치하는 특정 치료가 가능하다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은, 종래의 질병 진행 모니터링 방법으로도 치료가 성공적이었음을 알 수 있는 경우, 본 발명의 방법은 질병 카이네틱스(kinetics)의 보다 정밀한 모니터링을 포함하여 질병 진행의 보다 정확한 평가를 가능하게 한다고 나타내었다. 이러한 유형의 통찰(insight)은 임상의로 하여금 보다 개인화된 치료를 제공할 수 있게 하며, 여기서, 특이적인 분자적 경로는, 개체의 돌연변이 상태가 질병 경과에 따라 변한다는 것을 포함하여 개체에 대해 확인되는 돌연변이 상태에 반응하는 치료 프로토콜을 조정함으로써 표적화될 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 하나의 치료 접근법이 더 이상 효과적이지 않은 상황에서 조기(earlier) 개입을 가능하게 하여, 질병이 진행됨에 따라 개체의 돌연변이 상태의 변화를 반영하기 위해 치료 프로토콜의 조정을 용이하게 한다.

핵산은 다른 공급원들 중에서도 세포자멸사, 괴사 및 DNA/RNA-지질단백질 복합체의 자발적 방출을 통해 혈장 및 혈청 내로 방출된다. 순환하는 세포-프리 종양-유래 DNA(ctDNA)는 다수의 독립적인 종양들로부터 공급되는 DNA와 함께 대표적인 전체 종양 게놈을 함유한다. 이러한 ctDNA의 전체 게놈 또는 엑솜(exome) 시퀀싱은, 종양의 순차적인 생검을 수행할 필요 없이, 암 치료법에 대해 획득된 내성과 연관된 돌연변이를 식별하는 데 이용될 수 있다. 또한, 이차적인 돌연변이가, 원발성 종양의 재-생검의 높은 위음성율(false-negative rate)로 인해 이러한 재-생검을 통해서보다 혈장 내에서 보다 용이하게 검출될 수 있으며, 이는 표적 종양유전자의 특징화 및 질병 진행 동안 획득되는 돌연변이의 식별을 위한 혈장-기반 분석의 유용성을 입증한다는 것이 명백해졌다. 따라서, 입수 가능한 데이터는, 순환하는 핵산의 분석이 단일 부위의 조직 생검보다 종양(들)의 유전적 장소(landscape)의 잠재적으로 보다 포괄적인 그림을 제공한다는 것을 제시할 것이다. 본 발명자들은, 개별 MM 환자의 유전적 장소의 보다 포괄적인 그림이 말초 혈액(PB)으로부터 유래되는 순환하는 세포-프리 핵산, 즉, 세포 프리-DNA 및 RNA(각각 cfDNA 및 cfRNA)를 분석하는 것임을 보여주는 본원에 기재된 결과를 수득하였으며, 이것이 다수의 독립적인 종양들로부터 발생할 수 있는 대표적인 전체 종양 게놈 및 트랜스크립톰(transcriptome)을 함유하기 때문이다.

본원에 사용되는 바와 같이, '세포-프리 핵산' 또는 "cfDNA"는, 세포로부터 상기 세포가 거주하는 혈액 또는 다른 체액 내로 방출되거나 그렇지 않으면 탈출한 핵산, 바람직하게는 (게놈 또는 미토콘드리아) DNA이다. 체액, 예컨대 말초 혈액으로부터 세포-프리 핵산(예를 들어 DNA)의 추출 또는 단리는 체액에 존재하는 임의의 세포의 파열(rupture)을 수반하지 않는다. 세포-프리 DNA는, 유체 내의 모든 또는 실질적으로 모든 미립자 물질들, 예컨대 세포 또는 세포 찌꺼기가 제거된 체액으로부터 단리된 DNA일 수 있다.

세포-프리 핵산이 종양으로부터 유래되는 경우(즉, 종양으로부터 기원하고 혈액 또는 다른 체액 내로 방출된 핵산), 세포-프리 종양-유래 DNA 또는 ctDNA라는 용어가 사용될 수 있다.

세포-프리 핵산, 예컨대 DNA는 예를 들어 Lo 등의 미국 특허 6,258,540; 문헌[Huang et al, Methods Mol. Biol, 444: 203-208 (2008)] 등을 포함하는 기술들을 사용하여 말초 혈액 시료로부터 추출될 수 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 비제한적인 예로서, 말초 혈액은 EDTA 튜브에 수집될 수 있으며, 수집 후 상기 혈액은 원심분리에 의해 혈장, 백혈구 세포 및 적혈구 세포 구성성분들로 분획화될 수 있다. 세포-프리 혈장 분획(예를 들어 0.5 내지 2.0 mL)에 존재하는 DNA는 QIAamp DNA 혈액 미니 키트(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 또는 유사한 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 추출될 수 있다.

문맥상 다르게 언급하지 않는 한, 순환하는 세포-프리 종양-유래 핵산 및 순환하는 종양-프리 핵산은 상호호환적으로 사용되고, 세포-프리 종양-유래 DNA 및 순환하는 종양-프리 DNA도 마찬가지이다.

본 발명은 개체에서 질병 진행 또는 치료 효능을 진단하고, 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 개체에서 질병 경과에 따른 돌연변이 상태 및/또는 다양한 치료 접근법들에 대한 반응에서의 변화를 특징화하는 것을 포함하여, 골수종을 앓고 있는 개체의 돌연변이 상태 또는 장소를 특징화하는 데 사용될 수 있다.

질병 진행 또는 치료 효능의 모니터링은, 무증상(smouldering) 또는 무통성(indolent) 다발성 골수종, 활성 다발성 골수종, 다발성 고립 형질세포종, 골수외 형질세포종, 분비성, 비-분비성, IgG 람다 또는 카파 경쇄(LC) 유형을 포함하여 임의의 유형의 다발성 골수종을 가진 개체에서 수행될 수 있다. 다발성 골수종에서 골수종 세포에 의해 생성되는 가장 흔한 면역글로불린(Ig)은 IgG, IgA 및 IgM이고, 덜 흔하게는 IgD 또는 IgE가 수반된다.

본 발명의 양태들, 예컨대 질병 진행 또는 치료 효능의 모니터링은, 종래의 말초 혈액 바이오마커가 검출 가능하지 않은(예를 들어 실시예를 포함하여 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 파라단백질 또는 다른 마커가 검출 가능하지 않은) 개체에서 특히 유용할 수 있다.

본 발명의 방법은 전형적으로, 개체 유래의 핵산(이따금 "시험 시료"로 지칭됨)을 대조군 프로파일 내의 핵산과 비교하는 것을 포함한다.

일부 경우, '대조군 프로파일'은 임의의 임상적으로 또는 생화학적으로 검출 가능한 다발성 골수종을 갖고 있지 않은 개체 또는 개체들의 말초 혈액 시료 유래의 세포-프리 핵산, 바람직하게는 세포-프리 DNA의 수준을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 임의의 임상적으로 또는 생화학적으로 검출 가능한 다발성 골수종을 갖고 있지 않은 개체 또는 개체들의 말초 혈액 시료는 본원에서 '대조군 시료'로 지칭된다. '대조군 프로파일'은, 다발성 골수종의 부재를 제외하고는, 일반적으로 개체가 다발성 골수종을 갖고 있는지의 여부를 확인하기 위해 선택된 개체와 동일하거나 매우 유사한 개체로부터 유래될 수 있다. 대조군 프로파일을 유래하기 위해 개체 또는 개체들의 말초 혈액 유래의 대조군 시료 내 세포-프리 DNA 수준의 측정은 일반적으로, 시험 시료 내 세포-프리 DNA의 측정에 사용되는 것과 동일한 검정법 포맷을 사용하여 수행된다.

대조군 프로파일은 또한, 시험 시료가 취해진 개체와 동일한 개체로부터 유래될 수 있으나, 상이한 시점, 예를 들어 1년 또는 수년 더 일찍 유래될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이와 같이, 대조군 프로파일은 또한, 개체가 다발성 골수종 치료를 받기 이전에, 또는 다발성 골수종 치료 동안 보다 이른 단계에서 개체로부터 유래된 세포-프리 핵산의 수준을 포함할 수 있다. 이로써, 이러한 대조군 프로파일은 개체에서 세포-프리 DNA 수준의 기준선 또는 기저 수준(basal level) 프로파일을 형성하며, 이러한 프로파일에 대해 시험 시료가 비교될 수 있다.

세포-프리 핵산 수준의 측정값을 제공하는 것 외에도, 대조군 프로파일은 또한, 본원에 기재된 바와 같이 특정 돌연변이의 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 이들 돌연변이는 개체 유래의 세포-프리 핵산에서 검출된다.

질병 진행을 측정하거나 치료 효능을 모니터링하기 위한 대조군 프로파일은, 시험 시료가 취해진 개체와 동일한 개체로부터 생성될 수 있으나, 상이한 시점, 예를 들어 1년 또는 수년 더 일찍 생성될 수 있다. 이로써, 이러한 대조군 프로파일은 개체에서 (a) 순환하는 종양-프리 핵산의 수준, (b) 순환하는 종양-프리 핵산 내 돌연변이의 수, 또는 (c) 적어도 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 함유하는 순환하는 종양-프리 핵산의 비율에 대한 기준선 또는 기저 수준 프로파일을 형성한다.

본 명세서에서, 치료의 실패는, 치료(예를 들어 화학요법) 계획을 받고 있긴 하지만 임의의 일시적인 향상을 경험하지 못한 채 질병의 진행, 치료 계획의 하나 이상의 사이클을 받은 후 어떠한 객관적인 반응도 없음, 또는 치료 계획을 받고 있긴 하지만 한정된 반응과 더불어 후속적인 진행을 포함한다. 요법에 비-반응성인 골수종은 '불응성 다발성 골수종'으로도 명명될 수 있다. 불응성 골수종은 치료 요법에 대한 반응을 전혀 나타내지 않는 환자에서 발생할 수 있거나, 처음에는 치료에 반응하지만 재발 후에는 치료에 반응하지 않는 환자에서 발생할 수 있다.

본 명세서에서 '재발'은 다르게 명시되지 않는 한, 향상 기간 후 암의 징후 및 증상의 복귀를 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, '진행형 질병'은 재발성 다발성 골수종을 가지고/거나 불응성 다발성 골수종을 가진 개체를 포함한다.

단어 '치료하다', '치료' 또는 '치료에 대한 반응'은, 그 목적이 요망되지 않는 생리학적 변화 또는 장애를 늦추는(줄이는) 것인 치유적 치료를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 요망되는 임상 결과로는, 검출 가능하거나 검출 불가능하든지 간에, 증상의 경감, 질병 규모의 축소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 늦춰짐, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(remission)(부분적이거나 전체적이든지 간에) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 치료는 또한, 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존율과 비교하여, 생존율의 연장을 의미할 수 있다. 치료는 본질적으로, 질병 또는 장애를 완전히 없애는 것이 아니라, 감염 및 질병 또는 장애의 진행의 합병증 및 부작용을 감소시키거나 최소화할 수 있다.

본 발명이 인간에 적용될 수 있긴 하지만, 본 발명은 수의학에서의 치유적 목적에도 유용하다. 본 발명은 가축 또는 농경용 동물, 예컨대 소, 양, 말 및 가금류; 반려 동물, 예컨대 고양이 및 개; 및 동물원 동물에도 유용하다.

본 발명은 또한, 개체에서 RAS/MAPK 경로의 돌연변이 상태를 제공하며, 이는 이후에, RAS/MAPK 경로를 표적화하는 치유적 양식, 트라메티닙(trametinib), 리고세르팁(rigosertib), 코비메티닙(cobimetinib), 셀루메티닙(selumetinib), 소라페닙(sorafenib) 또는 베무라페닙(vemurafenib)에 의해 치료될 수 있는 개체를 식별하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 다발성 골수종 치료의 효능을 모니터링하는 단계를 포함하며, 여기서, 이러한 치료로는, 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 탈리도마이드, 레날리노마이드, 에토포사이드, 시스플라틴, 익사조밉, 보르테조밉, 베무라피닙, 리고세르팁, 트라메티닙, 파노비노스타트, 아자시티딘, 펨브롤리주맙, 니볼루무맙, 두발루맙 또는 자가 줄기세포 이식물(ASCT) 중 임의의 하나 이상의 투여 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

치료는 하나 이상의 약물, 또는 하기 조합들을 포함하여 2개 이상의 약물들의 임의의 조합을 포함할 수 있다: 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 시스플라틴(DCEP); 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시스플라틴 및 탈리도마이드(T-DCEP); 아자시티딘 및 레날리도마이드(Rd), 익사조밉-사이클로포스파미드-덱사메타손(ICd); 또는 보르테조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(VCD). 치료는 부가적인 약물과 조합된 DCEP, T-DCEP, Rd, Icd 또는 VCD의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 다발성 골수종 치료를 받는 개체의 돌연변이 상태를 확인하거나 모니터링한 결과를 기반으로, 다발성 골수종 치료를 조정하거나 변형시키는 단계를 포함한다. 조정 또는 변형은 치료 프로토콜로부터 특정 약물 또는 약물들을 제거하고, 해당 약물을 하나 이상의 대안적인 약물로 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조정 또는 변형은 기존의 약물에 부가적인 약물을 보충하는 단계를 포함할 수 있다.

임의의 실시형태에서, 대체 또는 보충적인 치료는 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 탈리도마이드, 레날리노마이드, 에토포사이드, 시스플라틴, 보르테조밉, 코비메티닙, 익사조밉, 리고세르팁, 셀루메티닙, 소라페닙, 트라메티닙, 베무라피닙, 파노비노스타트, 아자시티딘, 펨브롤리주맙, 니볼루무맙, 두발루맙 또는 자가 줄기세포 이식물(ASCT) 중 임의의 하나 이상을 투여하는 단계를 포함한다. 대체 또는 보충적인 치료는 또한, 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 시스플라틴(DCEP); 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시스플라틴 및 탈리도마이드(T-DCEP); 레날리도마이드 및 덱사메타나손(Rd), 익사조밉-사이클로포스파미드-덱사메타손(ICd); 또는 보르테조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(VCD)의 조합들 중 임의의 하나 이상의 조합을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료는 부가적인 약물과 조합된 DCEP, T-DCEP, Rd, Icd 또는 VCD의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 개체의 돌연변이 상태의 진행 및 변화를 모니터링함으로써, 임상의 또는 의사는 임의의 하나 개체에 대해 채택된 치료 접근법에 관하여 고지에 입각한 결정(informed decision)을 할 수 있다. 예를 들어 소정의 실시형태에서, MM 환자에서 식별된 특정 돌연변이체 클론이 제1 치료에는 반응하지 않으나 제2 치료에는 반응하며, 한편 개체에서 식별된 다른 클론은 제1 치료에는 반응하지만 제2 치료에는 반응하지 않는 것으로 확인될 수 있다. 따라서, 다양한 치료 접근법들에 대한 돌연변이체 클론의 반응을 본 발명의 방법을 사용하여 모니터링함으로써, 2개 이상의 치료들을 조합하는 접근법을 조정하는 것이 또한 가능하며, 각각의 치료는 개체에서 클론의 상이한 하위세트들을 표적화한다.

하기는 질병의 경과 동안 MM에 대한 치료를 조정하는 데 있어서 본 발명의 유용성을 예시하는 일부 시나리오들이다:

- 개체는 레날리노마이드(레블리미드)와 덱사메타손의 조합을 이용한 치료를 몇 개월 동안 받는다. 치료 과정 동안, 파라단백질 및 람다 LC의 수준은 점차 감소하고, KRAS G12S 돌연변이를 가진 혈장 내 클론의 분포율도 마찬가지이다. 치료를 한 지 15개월 후, 혈장 내 KRAS G12V 클론의 분포 분율은, 파라단백질 및 람다 LC의 양의 중간 정도의 증가만 초과하는 속도로 급격하게 증가한다. 그 결과는, KRAS G12V 클론을 특이적으로 표적화하기 위해서는 치료 프로토콜의 변화가 필요함을 가리킨다. KRAS G21S 클론을 표적화하는 데 있어서 레날리노마이드-덱사메타손의 효능을 고려하면, RAS 경로를 표적화하는 부가적인 약물을 기존의 치료 프로토콜에 보충하는 것이 권고되며;

- 개체는 아자시티딘과 Rd(레날리노마이드 및 덱사메타손)의 조합을 이용한 치료를 받는다. 치료를 한 지 몇 개월 후, 혈장 내 KRAS G12D 클론의 분포 분율은 급격하게 증가하고, 이러한 증가는, RAS/MAPK 경로를 표적화하기 위해 치료 프로토콜의 변형이 필요함을 가리키며;

- 개체는 MM을 진단받은 후 2개월째에 ASCT를 이용한 치료를 받는다. 치료 후 몇 개월 이내에, KRAS G31C 클론의 분포율은 감소한다. 치료를 파나비노스타트(Panabinostat)로 전환한 후, KRAS G13C 클론의 분포 분율은 증가하고, 이러한 증가는, 이 약물이 이들 클론을 성공적으로 표적화하지 않고 대안적이거나 보충적인 치료가 필요함을 가리키며;

- 개체는 Rd(레날리노마이드 및 덱사메타손) 조합을 이용한 치료를 받는다. 치료 과정 동안, TP53 R273H 및 RNAS G13R 클론의 분포 분율을 감소하였으며, 이러한 감소는, 이들 클론이 Rd를 이용한 치료에 반응하였음을 가리킨다. 그러나, KRAS G12V 및 G12A 클론의 분포율은 증가하였으며, 이러한 증가는, 이들 클론이 초기 치료에 비-반응성이었음을 가리킨다. Rd 치료를 익사조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(Icd)으로 대체하면, KRAS G12V 및 G12A 클론이 치료에 반응하였으나 RNAS G13R 클론의 분포 분율이 증가한 것으로 나타났다. 그런 다음, ICd 치료에 Rd 치료를 보충하여, KRAS G12V 및 G12A 클론 및 RNAS G13R 클론을 표적화하였고;

- 개체는 보르테조밉, 사이클로포스파미드 및 덱사메타손(VCD)을 이용한 치료, 및 후속해서 ASCT를 이용한 치료를 받는다. 혈장 내 다양한 클론들의 분포 분율은 초기 치료 후 감소하고, 이후의 개월 동안 약간만 증가한다. 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시스플라틴 및 탈리도마이드(T-DCEP) 치료는 골수 MM의 증가에 반응하여 시작된다. T-DCEP 치료는 아무런 효과가 없으며, G13D 클론 및 NRAS Q61K 클론의 분포 분율이 후속적으로 증가한다. VCD 치료로의 후속적인 전환은 골수 MM 및 NRAS Q61K 클론을 성공적으로 표적화하지만, NRAS G13D 클론은 표적화하지 않으며, 이는 이러한 클론을 표적화하는 약물을 이용한 보충적인 치료가 필요함을 가리킨다.

각각의 상기 시나리오는, 질병 진행을 본 발명의 방법에 따라 모니터링하면, 질병이 진행됨에 따라 혈장에서 기능적인 분포율을 증가시킨 클론을 특이적으로 표적화하기 위해 기존의 치료를 대체 또는 보충할 수 있음을 가리킨다.

본 발명에서 유용한 것으로 도 10 및 도 11에서 기재되고 본원에서 지칭된 돌연변이는 특정 단백질에서의 아미노산 돌연변이로 나타나 있다. 예를 들어, KRAS G12D는, 야생형의 정상적인 단백질에서 위치 12에서 보이는 글리신(G)으로부터 아스파테이트(D)로의 변화를 유발하는, KRAS를 인코딩하는 유전자에서의 돌연변이를 지칭한다. 도 10에서 아미노산 돌연변이를 유발하는 핵산 내 임의의 돌연변이가 본원에서 고려된다. 모든 아미노산 돌연변이들의 넘버링은 주어진 단백질 유래의 인간 야생형 아미노산 서열에서의 위치에 상응한다. 그러나, 아미노산 잔기 수는 또 다른 동물에서는 상이할 수 있으며, 따라서 본 발명은 본원에 기재된 인간 또는 다른 동물 유래의 오르토로그(ortholog) 또는 파라로그(paralog)에서 도 10에 나타낸 것과 동등한 돌연변이를 고려한다. KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있으며, 임의의 공지된 데이터베이스, 예컨대 GenBank 데이터베이스, 예를 들어 등록 번호 NM_004985.3에 의해 인간 KRAS, 등록 번호 NM_002524.4에 의해 인간 NRAS, 등록 번호 NM_004333.4에 의해 인간 BRAF 및 등록 번호 NM_000546.5에 의해 인간 TP53로서 접근될 수 있다.

V-Ki-ras2 Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 호모로그 및 KRAS로도 공지된 GTPase KRAS는 인간에서 KRAS 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. KRAS는 KRAS; C-K-RAS; CFC2; K-RAS2A; K-RAS2B; K-RAS4A; K-RAS4B; KI-RAS; KRAS1; KRAS2; NS; NS3; RASK2로 지칭될 수 있다.

NRAS는 인간에서 NRAS 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. NRAS는 NRAS ; ALPS4; CMNS; N-ras; NCMS; NRAS1; NS6으로 지칭될 수 있다.

BRAF는 B-Raf로 명명되는 단백질을 제조하는 인간 유전자이다. 이 유전자는 또한, 원-종양유전자(proto-oncogene) B-Raf 및 v-Raf 뮤린 육종 바이러스 종양유전자 호모로그 B로 지칭되어 있는 한편, 이 단백질은 보다 형식적으로는 세린/트레오닌-단백질 키나제 B-Raf로 공지되어 있다. BRAF는 BRAF; B-RAF1; BRAF1; NS7; RAFB1로 지칭될 수 있다.

p53으로도 공지된 종양 단백질 p53, 세포성 종양 항원 p53(UniProt 명칭), 인단백질 p53, 종양 억제자 p53, 항원 NY-CO-13 또는 형질변환-관련 단백질 53(TRP53)은 다양한 유기체들에서 상동성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 임의의 이소폼(isoform), 예컨대 TP53(인간) 및 Trp53(마우스)이다. TP53은 TP53; BCC7; LFS1; P53; TRP53으로 지칭될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 '핵산'은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이의 유사체의 단위를 혼입하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 단일-가닥 핵산은 변성된 이중-가닥 DNA의 하나의 가닥 핵산일 수 있다. 대안적으로, 이는 임의의 이중-가닥 DNA로부터 유래되지 않는 단일-가닥 핵산일 수 있다. 적합한 핵산 분자는 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함하는 DNA이다. 다른 적합한 핵산 분자는 mRNA를 포함하는 RNA이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 '단리된' 또는 '부분적으로 정제된'은 핵산의 경우, 천연 공급원에서 발견되는 바와 같이 핵산과 함께 존재하고/거나 세포에 의해 발현된 경우 핵산과 함께 존재할 적어도 하나의 다른 구성성분(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩타이드)으로부터 분리되는 핵산을 지칭한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 시험관내 전사/번역을 사용하여 합성된 핵산은 '단리된' 것으로 간주된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 핵산 분자의 '부분(portion)'은 해당 분자에 의해 포함된 뉴클레오타이드들의 인접한(contiguous) 세트를 지칭한다. 부분은 분자에 의해 포함된 뉴클레오타이드들의 모든 또는 오로지 하나의 하위세트를 포함할 수 있다. 부분은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, '증폭된 생성물', '증폭 생성물' 또는 '앰플리콘(amplicon)'은, 뉴클레오타이드 서열이 주형 핵산 서열 및/또는 이의 상보적인 서열에 상응하는 특정 표적 핵산 주형 가닥 및/또는 이의 상보적인 서열의 일부의 복사체인 증폭 반응으로 인한 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 증폭 생성물은, 표적 핵산 및/또는 이의 보체의 일부인 서열의 측면에 존재하는 프라이머에 특이적인 서열을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 증폭된 생성물은 일반적으로 이중-가닥 DNA일 것이지만, 이의 개별 가닥을 참조로 할 수 있다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법에서, (a) 순환하는 세포-프리 종양-유래 핵산 또는 순환하는 종양-프리 핵산, 또는 (b) 세포-프리 핵산에서 양, 수준, 존재 또는 돌연변이를 시료에서 평가하거나 확인하는 단계는 본원에 기재된 바와 같이 임의의 방법, 예를 들어 PCR, 마이크로어레이, 시퀀싱 형태 등에 의한 것일 수 있다.

핵산의 양은 본원에 기재된 임의의 방법, 또는 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 또는 구체적으로 정량적 중합효소 연쇄 반응(QPCR) 또는 미세방울 디지털 중합효소 연쇄 반응(DDPCR; droplet digital polymerase chain reaction)을 사용하여 정량화될 수 있다. QPCR은 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 한 기술이고, 표적화된 핵산 분자를 증폭시키고 동시에 정량화하는 데 사용된다. QPCR은 DNA 시료에서 특정 서열의 검출 및 정량화(DNA 투입 또는 부가적인 정규화 유전자에 대해 정규화된 경우 복사체의 절대수 또는 상대량)를 둘 다 가능하게 한다. 절차는 중합효소 연쇄 반응의 일반적인 원리를 따르며, 각각의 증폭 사이클 후 증폭된 DNA가 반응에서 축적됨에 따라 실시간으로 정량화되는 것이 부가적인 특징이다. QPCR은 예를 들어, Kurnit 등(미국 특허 6,033,854), Wang 등(미국 특허 5,567,583 및 5,348,853), Ma 등(문헌[The Journal of American Science, 2(3), 2006]), Heid 등(문헌[Genome Research 986-994, 1996]), Sambrook and Russell(문헌[Quantitative PCR, Cold Spring Harbor Protocols, 2006]) 및 Higuchi(미국 특허 6,171,785 및 5,994,056)에 기재되어 있다. 이들의 내용은 그들 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.

일례는 실시예에 기재된 OnTarget™ 돌연변이 검출(OMD) 플랫폼(보레알 게노믹스(Boreal Genomics))이다.

임의의 고-처리량 시퀀싱 핵산 기술은 세포-프리 핵산 또는 세포-프리 종양 핵산에서 양, 수준 또는 돌연변이를 확인하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 용량을 가진 여러 가지 시퀀싱 기술들이 입수 가능하고, 이들 기술은 상업적으로 입수 가능하며, Illumina, Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재); Life Technologies, Inc.(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)이다. 일부 실시형태에서, 개별 분자들이 동시에(in parallel) 시퀀싱되는 고형 표면 상에서 이들 분자를 공간적으로 단리하는 단계를 포함하는 고-처리량 시퀀싱 방법이 이용된다. 이러한 고형 표면은 비다공성 표면(예컨대 솔렉사 시퀀싱, 예를 들어 문헌[Bentley et al, Nature,456: 53-59(2008)] 또는 컴플리트 게노믹스(Complete Genomics) 시퀀싱, 예를 들어 문헌[Drmanac et al, Science, 327: 78-81(2010)]에서와 같이), 비드-결합된 또는 입자-결합된 주형을 포함할 수 있는 웰 어레이(arrays of well)(예컨대 454, 예를 들어 문헌[Margulies et al, Nature, 437: 376-380(2005)] 또는 이온 토렌트(Ion Torrent) 시퀀싱, 미국 특허 공개 2010/0137143 또는 2010/0304982), 마이크로머신드 막(micromachined membrane)(예컨대 SMRT 시퀀싱, 예를 들어 문헌[Eid et al, Science, 323: 133-138(2009)]) 또는 비드 어레이(고형 시퀀싱 또는 폴로니 시퀀싱, 예를 들어 문헌[Kim et al, Science, 316: 1481-1414(2007)])를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이러한 방법은, 단리된 분자들이 고형 표면 상에서 공간적으로 단리되기 전 또는 후에 단리된 분자들을 증폭시키는 단계를 포함한다. 선행(prior) 증폭은 에멀젼-기반 증폭, 예컨대 에멀젼 PCR, 또는 롤링 서클(rolling circle) 증폭을 포함할 수 있다. Bentley 등(상기 인용됨) 및 제조업체의 설명서(예를 들어 TruSeq™ 시료 제조 키트 및 데이터 시트, Illumina, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재, 2010); 및 추가로 하기 참조문헌들: 미국 특허 6,090,592; 6,300,070; 7,115,400; 및 EP0972081B1에 기재된 바와 같이, 개별 주형 분자들이 고형 표면 상에서 공간적으로 분리되고, 이후 이들 분자가 브릿지 PCR에 의해 동시에 증폭되어 별개의 클론 집단 또는 클러스터를 형성하고, 그런 다음 시퀀싱되는 솔렉사-기반 시퀀싱이 특히 관심 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 포함된다. 전체 엑솜 시퀀싱은 실시예에 기재되어 있다.

본원에 기재된 바와 같은 돌연변이는 프로브, 바람직하게는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 검출될 수 있다. 프로브는 종래의 소프트웨어를 사용하여, 요망되는 파라미터의 선택을 기반으로 표적 유전자 서열에 결합하도록 디자인된다. 결합 조건은, 높은 수준의 특이성이 제공되게 하는 - 즉, 결합이 "엄격한 조건" 하에 발생하게 하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 열적 용융점보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.

한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 (Tm). Tm은, 50%의 표적 서열이 (한정된 이온 강도 및 pH 하에) 완벽하게 매칭된 프로브에 결합하는 온도이다. 이러한 측면에서, pH 7에서 약 0.02 M 이하의 염 농도에서 본 발명의 프로브의 Tm은 바람직하게는 40℃ 초과, 바람직하게는 70℃ 미만, 보다 바람직하게는 약 53℃이다. 예비혼합된 결합 용액은 입수 가능하고(예를 들어 CLONTECH Laboratories, Inc.사의 EXPRESSHYB 혼성화 용액), 결합은 제조업체의 설명서에 따라 수행될 수 있다. 대안적으로, 당업자는 이들 결합 조건들의 변화를 고안할 수 있다.

결합 후, 엄격한(바람직하게는 고도로 엄격한) 조건 하에서의 세척은 비결합된 핵산 분자를 제거한다. 전형적인 엄격한 세척 조건은 55-65℃에서 0.1% SDS가 포함된 0.5-2x SSC 용액에서의 세척을 포함한다. 전형적인 고도로 엄격한 세척 조건은 55-65℃에서 0.1% SDS가 포함된 0.1-0.2x SSC 용액에서의 세척을 포함한다. 당업자는 예를 들어 세척 용액에서 SSC를 SSPE로 치환함으로써 동등한 조건을 쉽게 고안할 수 있다.

혼성화 조건의 엄격성과는 달리, 혼성화 특이성은 전반적인 서열 유사성, 미스매칭 염기의 분포 및 위치, 및 프로브 및 표적 서열에 의해 형성되는 DNA 듀플렉스의 자유 에너지의 양을 포함하여 여러 가지 프로브 디자인 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다.

핵산 서열의 '보체'는 상보적인 염기 짝짓기를 통해 상기 핵산 서열에 결합한다. 비-코딩(안티-센스) 핵산 가닥은 또한, 이러한 핵산 가닥이 상보적인 염기 짝짓기를 통해 코딩(센스) 가닥에 결합하기 때문에, "상보적인 가닥"으로 공지된다.

따라서, 일 양태에서, 프로브는 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 코딩(센스) 가닥 내의 표적 서열에 결합한다. 대안적으로 또 다른 양태에서, 프로브는 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 비-코딩(안티-센스) 가닥 내의 표적 서열에 결합한다.

일 양태에서, 프로브는 지지체 또는 플랫폼 상으로 고정될 수 있다. 프로브의 고정화는 프로브에 대한 물리적 위치를 제공하고, 프로브를 요망되는 위치에 고착시키고/거나 프로브의 회수 또는 분리를 용이하게 하는 역할을 할 수 있다.

지지체는 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 제조되는 강성(rigid) 고형 지지체일 수 있거나, 심지어 지지체는 막, 예컨대 나일론 또는 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 3D 매트릭스는 본 발명에 사용하기에 적합한 지지체 - 예를 들어 폴리아크릴아미드 또는 PEG 겔이다.

일 실시형태에서, 지지체는 하나 이상의 비드 또는 마이크로스피어 형태, 예를 들어 액체 비드 마이크로어레이 형태일 수 있다. 적합한 비드 또는 마이크로스피어는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어 Luminex Corp., 미국 텍사스주 오스틴 소재). 비드의 표면은 DNA의 부착을 위해 카르복실화될 수 있다. 비드 또는 마이크로스피어는 독특하게 식별될 수 있으며, 이로써 이들의 독특한 특징들(예를 들어 비드 크기 또는 색상, 또는 독특한 표지)에 따라 소팅을 가능하게 할 수 있다, 일 양태에서, 비드/ 마이크로스피어는 형광단(예를 들어 적색 및/또는 적외선 형광단)들을 이용하여 내부적으로 염색되고, 이들의 상이한 형광 강도에 의해 서로 구별될 수 있다.

일 양태에서, 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키기 전에, 본 방법은 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자 또는 이의 보체의 일부를 증폭시킴으로써, 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

시료가 작고/거나 DNA 서열의 이종성 수집물(collection)을 포함하는 경우, 표적 핵산을 증폭시키는 것이 바람직할 수 있다.

증폭은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있고, 바람직하게는 PCR에 의해 수행된다. 당업자는 핵산 서열의 증폭을 촉진하는 데 적합한 조건을 확인할 수 있을 것이다.

따라서, 일 양태에서, 증폭은 서열 특이적인 프라이머들의 쌍을 사용하여 수행되며, 여기서, 상기 프라이머들은 상보적인 염기 짝짓기에 의해 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자 또는 이의 보체의 표적 부위에 결합한다. 적합한 DNA 중합효소 및 DNA 전구체(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)의 존재 시, 프라이머들은 연장됨으로써, 표적 핵산의 개별 가닥에 상보적인 새로운 핵산 가닥의 합성이 개시된다. 이로써, 프라이머는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자 또는 이의 보체의 일부의 증폭을 구동함으로써, 앰플리콘을 생성한다. 이러한 앰플리콘은, 프로브가 결합하거나 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이의 존재를 식별하기 위해 직접적으로 시퀀싱될 수 있는 표적 서열을 포함한다.

명확히 하기 위해, 본 발명의 맥락에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 정의는 전장 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자(또는 이의 보체)를 포함하지 않는다.

프라이머 쌍은 포워드 및 리버스 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함한다. 포워드 프라이머는 표적 핵산의 상보적인, 비-코딩(안티센스) 가닥에 결합하는 프라이머이고, 리버스 프라이머는 표적 핵산의 상응하는 코딩(센스) 가닥에 결합하는 프라이머이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 표적 핵산은, 돌연변이, 바람직하게는 도 10에 열거된 돌연변이의 존재가 확인되어야 하는 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다.

본 발명의 프라이머는 종래의 소프트웨어, 예컨대 프라이머 익스프레스(Applied Biosystems사)를 사용하여, 요망되는 파라미터의 선택을 기반으로 표적 유전자 서열에 결합하도록 디자인된다. 이러한 측면에서, 결합 조건은, 높은 수준의 특이성이 제공되는 조건인 것이 바람직하다. 프라이머의 용융점(Tm)은 바람직하게는 50℃를 초과하고, 가장 바람직하게는 약 60℃이다. 본 발명의 프라이머는 바람직하게는 표적 핵산에 결합하지만, 바람직하게는 자가-상보성 및 이량체 형성(프라이머-투-프라이머 결합)을 최소화하기 위해 스크리닝된다.

포워드 및 리버스 올리고뉴클레오타이드 프라이머들은 전형적으로 1 내지 40개 뉴클레오타이드 길이이다. 더 짧은 프라이머는 표적 핵산에의 어닐링을 더 신속하게 하기 때문에, 이러한 더 짧은 프라이머를 사용하는 것은 이점이다.

바람직하게는, 포워드 프라이머는 적어도 10개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 18개 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오타이드 길이이고, 포워드 프라이머는 바람직하게는 35개 이하 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 30개 이하 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 28개 이하 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 25개 이하 뉴클레오타이드 길이이다. 일 실시형태에서, 포워드 프라이머는 약 20-21개 뉴클레오타이드 길이이다.

바람직하게는, 리버스 프라이머는 적어도 10개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 15개 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오타이드 길이이고, 리버스 프라이머는 바람직하게는 35개 이하 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 30개 이하 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 28개 이하 뉴클레오타이드 길이이다. 일 실시형태에서, 리버스 프라이머는 약 26개 뉴클레오타이드 길이이다.

"중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 DNA의 상보적인 가닥들의 동시적인 프라이머 연장에 의한, 특정 DNA 서열의 시험관내 증폭 반응을 의미한다. 즉, PCR은 프라이머 결합 부위의 측면에 존재하는 표적 핵산의 다수의 복사체들 또는 복제물들을 제조하는 반응이고, 이러한 반응은 하기 단계들을 1회 이상 반복하여 포함한다: (i) 표적 핵산을 변성시키는 단계, (ii) 프라이머를 프라이머 결합 부위에 어닐링하는 단계, 및 (iii) 프라이머를 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에 핵산 중합효소에 의해 연장시키는 단계. 통상, 이러한 반응은 서멀 사이클러(thermal cycler) 장비에서 각각의 단계에 대해 최적화된 상이한 온도들을 통해 사이클링된다. 특정 온도, 각각의 단계에서의 기간, 및 단계들 사이의 변화율은 당업자에게 잘 공지된, 예를 들어 참조문헌들: 문헌[McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach(각각 IRL Press, Oxford, 1991 and 1995)]에 의해 예시된 많은 인자들에 따라 다르다. 예를 들어, Taq DNA 중합효소를 사용하는 종래의 PCR에서, 이중 가닥 표적 핵산은 90℃ 초과의 온도에서 변성될 수 있으며, 프라이머는 50-75℃ 범위의 온도에서 어닐링되고, 프라이머는 72-78℃ 범위의 온도에서 연장된다. 용어 "PCR"은 비제한적으로 RT-PCR, 실시간 PCR, 네스티드(nested) PCR, 정량적 PCR, 멀티플렉스드(multiplexed) PCR 등을 포함하여 반응의 유도체 형태들을 포함한다. 반응 부피는 수백 나노리터, 예를 들어 200 nl 내지 수백 ㎕, 예를 들어 200 ㎕의 범위이다. "리버스 전사 PCR" 또는 "RT-PCR"은, 예를 들어 Tecott 등의 미국 특허 5,168,038에서와 같이, 표적 RNA를 상보적인 단일 가닥 DNA로 전환시킨 다음, 이러한 DNA를 증폭시키는 리버스 전사 반응에 선행되는 PCR을 의미하며, 이러한 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. "실시간 PCR"은, 반응이 진행됨에 따라 반응 생성물, 즉 앰플리콘의 양이 모니터링되는 PCR을 의미한다. 반응 생성물의 모니터링에 사용되는 검출 화학이 예를 들어 Gelfand 등의 미국 특허 5,210,015("택맨(taqman)"); Wittwer 등의 미국 특허 6,174,670 및 6,569,627(인터칼레이팅 다이(intercalating dye)); Tyagi 등의 미국 특허 5,925,517(멀레큘러 비콘(molecular beacon))에서와 같이 주로 상이한, 많은 형태의 실시간 PCR들이 존재하며, 이들 특허는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 실시간 PCR을 위한 검출 화학은 문헌[Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305(2002)]에 리뷰되어 있으며, 이 또한 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. "네스티드 PCR"은, 제1 PCR의 앰플리콘이 새로운 프라이머 세트를 사용하는 제2 PCR용 시료가 되고, 이러한 프라이머들 중 적어도 하나가 제1 앰플리콘의 내부 위치에 결합하는 2-단계 PCR을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 네스티드 증폭 반응을 참조로 하여 "초기 프라이머"는 제1 앰플리콘을 생성하는 데 사용되는 프라이머를 의미하고, "이차적인 프라이머"는 제2 또는 네스티드 앰플리콘을 생성하는 데 사용되는 하나 이상의 프라이머를 의미한다. "멀티플렉스드 PCR"은, 다수의 표적 서열들(또는 단일 표적 서열 및 하나 이상의 참조 서열)이 동일한 반응 혼합물 내에서 동시적으로 수행되는 PCR을 의미하며, 예를 들어 문헌[Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228(1999)](2-색상 실시간 PCR)을 참조로 한다. 통상, 별개의 프라이머 세트들이, 증폭되고 있는 각각의 서열에 이용된다. 전형적으로, 멀티플렉스 PCR에서 표적 서열의 수는 2 내지 50, 또는 2 내지 40, 또는 2 내지 30의 범위이다. "정량적 PCR"은, 시료 또는 표본 내에서의 하나 이상의 특정 표적 서열의 분포율을 측정하도록 디자인된 PCR을 의미한다. 정량적 PCR은 이러한 표적 서열의 절대적인 정량화 및 상대적인 정량화를 둘 다 포함한다.

정량적 측정은, 개별적으로 검정되거나 표적 서열과 함께 검정될 수 있는 하나 이상의 참조 서열 또는 내부 표준을 사용하여 수행된다. 참조 서열은 시료 또는 표본에 대하여 내인성 또는 외인성일 수 있고, 외인성인 경우, 하나 이상의 경쟁자(competitor) 주형을 포함할 수 있다. 전형적인 내인성 참조 서열은 하기 유전자들의 전사체의 절편을 포함한다: β-액틴, GAPDH, p2-마이크로글로불린, 리보좀 RNA 등. 원용에 의해 포함된 하기 참조문헌들에서 예시된 바와 같이, 정량적 PCR 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다: 문헌[Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126(1999); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447(1989); Zimmerman et al, Biotechniques, 21 : 268-279(1996); Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020(1992); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446(1989)] 등.

실시예

실시예 1

말초 혈액(PB) 수집 및 가공:

PB 시료(30 ml)를, 알프레드 인간 윤리 위원회에 따라 고지에 입각한 동의를 받은 후 정상 지원자(NV) 또는 MM 환자로부터 10 ml Streck 세포-프리 DNA BCT 튜브 또는 10 ml EDTA 튜브를 사용하여 수득하였다. 시료의 수집 직후, 튜브를 뒤집어서, 혈액을 수집 튜브 내의 보존제와 함께 혼합하여, 시료 가공 및 저장 동안 혈액 세포로부터 DNA의 방출을 방지하였다(문헌[Das K, 등(2014) Molecular diagnosis & therapy 18(6):647-653; Qin J, Williams TL, & Fernando MR (2013) BMC research notes 6:380]). 혈장(PL)을 820 x g에서 10분(min) 동안 원심분리를 통해 PB로부터 분리하였다. 세포층을 어지럽히지 않으면서 상층액을 수집하고, 16,000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리하여, 임의의 잔여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 상층액을 수집하고, 혈장으로부터 cfDNA를 단리할 때까지 장기간 저장을 위해 -80℃에서 1 ml 분취물 내에서 저장하였다.

세포-프리 DNA 추출:

냉동된 혈장 시료를 QIAamp 순환하는 핵산 키트(Qiagen, 독일 소재)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 cfDNA 추출에 사용하였다. 평균적으로 6 ml의 혈장을 cfDNA 추출에 사용하였다. 후속해서, 혈장 ctDNA를 QUBIT 형광측정계 및 고 민감성 DNA 검출 키트(Life Technologies, 오스트레일리아 소재)를 이용하여 정량화하였다. DNA 수율을 Qubit 2.0 형광측정계(Life Technologies)를 사용하여 측정하였다. QUBIT 검정법에 이용된 최대 투입 부피는 5 ml이었다. 추출된 DNA를 추가의 가공때까지 -80℃에 저장하였다.

골수 단핵 세포의 피콜(Ficoll) 단리, MM 세포 비율의 확인 및 CD138+ MM 세포의 단리

PB와 일치하여, 알프레드 병원 인간 윤리 위원회로부터 승인을 받은 프로토콜에 따라 작성된 고지에 입각한 동의서를 받은 후, MM 환자 또는 NV로부터 시료용 BM을 수득하였다. 피콜 파크 플러스(GE Healthcare, 오스트레일리아 뉴 사우스 웨일주 라이댈미어 소재)를 이용하여, 골수 단핵 세포를 함유하는 버피(buffy) 층(BMMNC)을 제조업체의 가이드라인에 따라 단리하였다. 적혈구 세포를, 적혈구 세포 용해 완충제(10 mmol/L KHCO₃, 150 mmol/L NH₄Cl 및 0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)를 37℃에서 5분 동안 사용하여 제거한 후, 멸균 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 이용한 세척에 의해 임의의 용해 완충제를 제거하였다. 그런 다음, 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI-1640 배지 내에서 밤새 배양하였다. 각각의 환자로부터 단리된 BMMNC 내 MM 또는 정상 혈장 세포(PC)의 비율을, CD138, CD38 및 CD45 염색의 유세포 분석을 통해 확인하였다. 간략하게는, 세포를 CD45-FITC(Becton Dickinson(BD) Biosciences, 오스트레일리아 뉴 사우스 웨일즈 노스 라이드 소재), CD38-PerCP(BD Biosciences) 및 CD138-PE(Miltenyi Biotec, 오스트레일리아 뉴 사우스 웨일즈 매쿠아리 파크 소재)를 이용하여 실온에서 20분 동안 염색하고, 세척한 다음, 300 ㎕의 완충제(0.5% FCS/PBS) 내에 재현탁하였다. 시료를 BD FACSCalibur 유세포분석기 상에서 획득하고, MM BM 유래의 CD38+/CD45-/CD138+ 세포의 비율을 확인하였다. MM 세포를 단리하기 위해, CD138 마이크로비드를 제조업체(Miltenyi Biotec)의 가이드라인을 사용하여 이용하였다. 세포를 비드 완충제(PBS/ 2mM EDTA / 0.5% BSA) 내에서 세척하고, 마이크로비드를 이용하여 20분 동안 염색하였다. CD138+ 세포를 MS-컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 자기(magnetic) 단리를 통해 선별하였다. DNA 추출을, QIAGEN 혈액 DNeasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 수행하고, QUBIT 형광측정계 2.0을 이용하여 정량화하였다.

OnTarget™ 돌연변이 검출(OMD) 플랫폼

환자의 CD138 MM 세포 및 짝지어진 혈장(2 ml) 유래의 게놈 DNA를, KRAS, NRAS, CTNNB1, EGFR, PIK3CA, TP53, FOXL2, GNAS 및 BRAF 유전자에 96-돌연변이를 포함하는 OnTarget™ 돌연변이 검출(OMD) 플랫폼(Boreal Genomics사)을 이용한 돌연변이 특징화에 이용하였으며, 43개의 돌연변이(BRAF n=6; KRAS n=18; NRAS n=10 및 TP53 n=9)가 잠재적으로 MM과 관련이 있다(도 10 및 11). OMD 시료 추출, 정량화, 가공, 돌연변이 농화(enrichment), MiSeq 라이브러리 제조 및 시퀀싱, 데이터 분석을 위한 방법은 하기에 제공되어 있고, 이전에 기재된 바와 같다(문헌[Kidess E, Heirich K, Wiggin M, Vysotskaia V, Visser BC, Marziali A, et al. Mutation profiling of tumor DNA from plasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with a novel, high-sensitivity multiplexed mutation detection platform. Oncotarget. 2015;6:2549-61]).

OnTarget™ 돌연변이 검출(OMD) 플랫폼 시료 추출, 정량화 및 가공

혈장 시료의 DNA를, 변형된 버전의 QIAamp 순환하는 핵산 키트(Qiagen, 파트 번호 55114)를 사용하여 추출하였다. 시료를 최종 부피 60 ㎕ 0.1X TE로 용리하였다. 골수 유래의 DNA 시료를 0.1X TE에서 60 μ까지 희석시켰다. 품질 관리를 위해 5 ㎕ 분취물을 제거하였다. 잔여물을 OnTarget 검정법에 사용하기 위해 보관하였다. 각각의 시료에 존재하는 게놈 복사체의 수를 qPCR을 사용하여 검정하였다. 5 ㎕ 시료 분취물을 15배 및 60배로 단계 희석하고, COG5 및 ALB 유전자 내에 함유된 앰플리콘을 사용하여 qPCR에 의해 2벌 중복으로 검정하였다. 검정법을 진행하기 위해, 검정을 위한 투입 질량 한계인 300 ng 미만을 함유하는 것으로 확인된 시료를 소모한 한편, 300 ng을 초과하여 함유하는 시료를 dH₂O로 희석시키면, 50 ㎕의 분취물이 qPCR에 의해 측정되는 바와 같이 300 ng을 제공할 것이다. 30 내지 300 ng 야생형 DNA(Roche Human Genomic DNA, 파트 번호 11691112001)를 함유하는 여섯(6)개의 음성 대조군 시료들을, 수령한 시료와 동시에 진행하였다. 그런 다음, 각각의 돌연변이에 대한 공정 수율을 개별적으로 계산하고 각각의 돌연변이에 대한 검정법 성공을 입증하기 위해 사용된 내부 양성 대조군을 각각의 시료에 첨가하였다. 내부 양성 대조군은 PCR 프라이머 및 OnTarget 호모로그 부위에서 돌연변이체 대립유전자와 동일한 서열을 가지지만, 개별 투입 분자에 대한 수율 계산을 용이하게 하고 시퀀싱 후 대조군이 진정한 돌연변이체로부터 쉽게 구별될 수 있게 하는 무작위 식별자(RID; random identifier), 무작위 DNA 바코드를 부가적으로 함유한다. 대략 100개의 내부 양성 대조군 분자들을 96-돌연변이 패널에서 각각의 돌연변이에 대해 첨가하였다. 그런 다음, 멀티플렉스 12V사이클 바코딩 PCR 반응(PCR1)에서 각각의 시료에 독특한 시료 DNA 바코드를 지정하였다. 99%의 각각의 시료를 바코딩 반응에서 주형으로서 사용하여, 패널에 96개의 돌연변이를 함유하는 유전자좌를 증폭시켰다. 돌연변이 패널 유전자좌 및 2개의 부가적인 대조군 유전자좌들(정량화에 사용되는 COG5 및 ALB)을 증폭시키는 별도의 반응에서 잔여 1%에 바코딩하였다. 2개의 바코딩 PCR 반응 둘 다에서, 모든 프라이머들은 유니버셜 프라이머로서 사용되는 5' 태그를 함유하여, 이후의 단계에서 단일 프라이머 세트를 이용하여 모든 유전자좌들을 증폭시킬 수 있다. 그런 다음, 바코딩된 증폭된 생성물 및 정량화 반응 생성물을 풀링하여, 해당 시료에 대한 모든 PCR 생성물들을 함유하는 각각의 시료에 대한 단일 분취물을 수득하였다. 각각의 시료에 대한 PCR 생성물 중 15%를 풀링하고, 후속적으로 Zymo DNA 클린 및 컨센트레이터 컬럼을 제조업체의 설명서에 따라 정제하였다. 각각의 시료 중 잔여물은 보유되었다.

OnTarget 돌연변이 농화

시료 세트를 OnTarget 상에 로딩하고, 96개의 돌연변이들, 뿐만 아니라 야생형 COG5 및 ALB 서열을 농화시켰다. 그런 다음, 농화된 OnTarget 산출물을 BioRad 마이크로 BioVSpin 6 컬럼을 제조업체의 설명서에 따라 정제하였다.

MiSeq 라이브러리 제조 및 시퀀싱

그런 다음, 농화되고 정제된 OnTarget 산출물을 Illumina MiSeq 라이브러리 제조에 사용하였다. 세트-특이적인 바코드 및 5' MiSeq 어댑터 태그를 함유하는, 유니버셜 프라이머(PCR2)를 사용하는 35개 사이클의 PCR에 의해 생성물을 증폭시키고 MiSeq 어댑터에 의해 태깅하였다. 그런 다음, PCR 산출물을 Agencourt AMPure XP 키트를 사용하여 정제하였다. 그런 다음, 시퀀싱 라이브러리를, KAPA 라이브러리 Quant 키트를 사용하여 qPCR에 의해 정량화하고, 5 nM 농도까지 정규화하고, 그런 다음 라이브러리를 Illumina MiSeq 상에서 시퀀싱하였다.

데이터 분석 서열 정렬

시퀀싱 데이터를, OnTarget 96-플렉스 돌연변이화 패널 내로부터의 서열로 제조된 커스텀 참조 라이브러리에 대한 정렬을 위해 BWA를 사용하여 작성된 커스텀 분석 스크립트, 및 정렬 후 추가의 데이터 조작을 위한 SAM 툴을 사용하여 완전히 자동화된 방식으로 분석하였다. 돌연변이 정량화, 품질 관리 및 시각화를, Perl, Python 및 MySql에 작성된 스크립트를 사용하고 그래프비즈(graphviz)와 같은 툴을 이용하여 수행하였다. 알고리즘에 대한 간략한 설명은 하기와 같다. 우선, MiSeq로부터의 미가공(raw) FastQ 파일을 시료 및 세트 바코드(각각 제1 및 제2 PCR 반응에 첨가됨)에 의해 디-멀티플렉스드(de-multiplexed)하고, 바코딩 PCR 프라이머들 사이에 놓인 각각의 분자의 내인성 영역만 보유하도록 트리밍한 다음, 하기 기준에 따라 필터링하였다:

a) 포워드 및 리버스 판독물(read)을 동일한 참조 서열에 정렬시켜야 하며, b) 2개의 판독물 모두는 동일한 돌연변이를 운반하고, c) 식별된 돌연변이는 OnTarget 96-플렉스 패널 내에 함유되어야 한다.

상기 조건을 충족하는 판독물을 시료 바코드 및 돌연변이에 따라 폐기하였다(binned). 그런 다음, 잔여 판독물을 재분석하여, 이들 판독물이 하기와 같이 내부 양성 대조군 분자들에 대한 별도의 참조 라이브러리에 정렬되었는지 확인하였다:

1. 각각의 판독물의 내인성 섹션의 처음 15개 염기들을, OnTarget 96-플렉스 패널 내에서 유전자좌에 대한 참조 서열의 감소된 세트에 정렬하였다.

2. RID 바코드를, 유전자좌에 특이적인 측면 서열을 검색함으로써 확인하였다.

3. 그런 다음, RID 서열을 내인성 서열로부터 제거하였으며; 그런 다음, 잔여 내인성 서열은 상기 시험 (a) 내지 (c)를 통과하였다.

필터를 통과한 내부 양성 대조군 판독물을 RID 내에서 시퀀싱 에러에 대해 보정하고, 시료 바코드, 돌연변이 및 독특한 RID 서열에 따라 폐기하였다. 그런 다음, 각각의 시료 바코드 / 돌연변이 조합에 대한 전체 워크플로우를 통한 평균 단일 분자 수율을, 해당 바코드 및 돌연변이에 대한 모든 RID들에 대한 평균 판독수로서 계산하였다.

품질 관리 체크

품질 관리 체크를, 시퀀서가 모든 IPC 분자를 검출하고, 연장에 의해, 모든 게놈 돌연변이체 분자가 워크플로우에 들어가는 것을 보장하기 위해 수행하였다. 각각의 시료에서 각각의 돌연변이에 대해, 2개의 체크를 수행하였다:

(a) 검출된 내부 양성 대조군 분자의 수는 투입 내부 양성 대조군 분자의 예상된 수의 적어도 50%이어야 한다.

(b) 각각의 투입 분자에 대해 관찰된 평균 판독수는 10을 초과해야 한다. 상기 조건들을 둘 다 따르지 않는 돌연변이는 저하된 민감성을 갖는 것으로 플래깅되었다(flagged).

검출 계산 및 돌연변이 콜링의 한계

그런 다음, 각각의 시료 내의 각각의 돌연변이에 대한 투입 돌연변이체 분자의 수를, 주어진 바코드에 대한 돌연변이체 판독물의 수를 해당 돌연변이 및 바코드에 대한 평균 단일 분자 수율로 나누어서 계산하였다. 유사한 과정을 WT COG5 및 ALB 서열에 대해서도 수행하였으며, 워크플로우에 들어간 게놈의 총 수를 측정하는 데 사용하였다: 이들 유전자좌 중 오로지 1%만 바코딩 PCR 반응에서 증폭되었음을 고려한다. 돌연변이 분포율을, 총 투입 게놈 복사체에 대한 투입 돌연변이체 복사체의 비율로서 계산하였다. 2개의 시료들에 대해, 어떠한 내부 양성 대조군도 시료에 첨가하지 않았으며, 이는 단일 분자 수율을 직접적으로 측정할 수 없었음을 의미하였다. 이들 2개의 시료들에 대한 단일 분자 수율을, 동시에 가공된 9개의 다른 시료들에 대한 단일 분자 수율을 평균화함으로써 근사치를 내었다. 그런 다음, 이러한 단일 분자 수율 근사치를 사용하여, 돌연변이체 판독물의 수로부터 돌연변이체 복사체 수를 확인하였다. 이러한 분석의 타당성을 체크하기 위해, 이러한 계산 방법을, 내부 양성 대조군을 함유한 세트 내에서 모든 다른 시료들에 대해 수행하였고, 표준 계산에 대해 체크하였다: 결과는 모든 시료들 내의 모든 돌연변이들에 대해 20% 미만만큼 상이하였다. 돌연변이체 복사체의 검출된 수가 검출 한계를 초과하는 경우에만, 돌연변이를 양성이라고 명명하였으며, 이러한 검출 한계는 하기와 같이 정의된다:

여기서, 합계 내의 용어들은 하기와 같다:

·2개의 투입 돌연변이체 복사체

·투입 게놈(Ngenomes)의 수로 나눔으로써 복사체로 전환된, 히스토리컬 보레알 게노믹스(historical Boreal Genomics) 야생형 시료에서 검출된 평균 돌연변이 분포율 + 3 표준 편차로서 계산된, WT 시료에서 최대 예상된 돌연변이 백그라운드(99.9% 신뢰 구간, 1 테일드(tailed))

·앰플리콘 내의 다른 서열 상에서 시퀀싱 에러로 인한 최대 예상된 크로스토크(crosstalk). 이는, 앰플리콘 내의 돌연변이에 매칭하지 않는 모든 검출된 투입 복사체들(cp _in )의 합계의 1%로서 계산되고, 96-플렉스 패널에 WT 및 돌연변이를 둘 다 포함한다. 하나의 돌연변이가 높은 분포율로 존재하는 경우, 이는 밀접하게 관련된 돌연변이에 대한 검출 한계에 유의한 영향을 미칠 수 있다.

전체 엑솜 시퀀싱

WES를 위해, 짝지어진 환자로부터의 게놈 DNA 및 ctDNA, 라이브러리 제조 및 엑솜 포착을, 각각 NEBNext 울트라 라이브러리 프렙 키트(Genesearch) 및 SureSelect XT2 인간 엑솜 V5.0 키트(Agilent)를 이용하여 수행하였다. 그런 다음, 시퀀싱을 Illumina HiSeq 2500 상에서 수행하고, APF 인간 엑솜 파이프라인을 통해 가공하였다.

미세방울 디지털 PCR(ddPCR): OMD의 입증 및 환자 ctDNA 추적

OMD 확인 사항들을, 돌연변이 특이적인 ddPCR을 이용하여 입증하고, 환자로부터의 연속 PL 시료들을 또한, ddPCR을 이용하여 정량적으로 추적하였다(Biorad QX200 미세방울 디지털 PCR 시스템). PCR을, QX200 ddPCR(Biorad)을 사용하여 수행하였다.

비말(droplet)을, 비말 생성기를 사용하여 생성하였으며, 이러한 생성기에서 20 ul 반응물을 20,000개 이하의 안정한 나노리터 비말들의 에멀젼으로 분할한다. 그런 다음, 비말들을 Prime PCR 검정법 조건(Biorad)을 사용하여 수행되는 PCR 증폭 처리하였다. 모든 ddPCR 세트 업은 주형-프리 대조군을 가졌다. PCR 후, 비말들을 2-형광 검출기를 이용하여 판독하여, 관심 돌연변이에 대해 양성인 비말들을 확인하였다. Quantasoft^TM 소프트웨어 버전 1.7에 의해, 시료의 돌연변이체 복사체 및 분포 분율(FA)의 확인이 가능하였다.

실시예 2

MM 환자에서 세포-프리 DNA 양은 정상 지원자에서보다 유의하게 더 높다

MM 환자(n=37) 및 NV(n=21)에서 CfDNA 양을 확인하였다. 더 많은 cfDNA 양을 NV보다 MM 환자로부터 수득하였다(각각 중앙값 23 ng/ml[범위 5-195 ng/ml] 대 15 ng/ml[범위 6-32 ng/ml], p = 0.0085, 도 1). cfDNA의 양이 질병 단계와 상관 관계가 있는 경우, 활성 질병(ND 및 재발성 질병)을 앓고 있는 환자는 NV와 비교하여 유의하게 더 많은 양의 cfDNA를 가졌음이 분명하였다(p=0.0067; 도 2). cfDNA의 양이 활성 질병을 앓고 있는 환자에서 유의하게 더 높은 한편, 그 수준은 파라단백질, 혈청-프리 경쇄 및 BM MM 세포 비율의 양과 상관관계가 없었다(도 3, 스피어만 순위 상관관계 계수).

실시예 3

BM MM 세포 및 ctDNA 둘 다의 프로파일링은 MM 환자의 돌연변이 장소의 포괄적인 그림을 제공한다

48명의 MM 환자들(15명은 새로 진단되고[ND], 33명은 재발성/불응성[RR]임)은 동시-발생적인(contemporaneous) CD138-농화된 MM 종양 세포 집단 수집물을 갖고 있었으며, 6개의 야생형(WT) DNA 대조군과 함께 모든 짝지어진 BM MM DNA 및 ctDNA 표본은 OMD를 수행하였다. 총 128개의 돌연변이들(KRAS n=65 [50.7%], NRAS n=37 [28.9%], BRAF n=10 [7.8%], TP53 n=16 [12.5%])이 MM 환자(BM 및/또는 ctDNA)에서 검출되었으며, WT 대조군에서는 어떠한 돌연변이도 검출되지 않았다(도 4). 128개의 돌연변이들 중에서, n=38개의 돌연변이들은 BM 및 PL 둘 다에서 확인되었으며, BM에서 n=59이고, PL에서 n=31이었다. 더욱이, 총 53.9%의 돌연변이들이 PL에서 확인되었으며, 이는 MM에서 ctDNA의 존재를 의미한다. 48명의 환자 중 10명은 BM에 존재하지 않는 31개의 돌연변이들을 PL에 갖고 있었으며, 따라서 BM 생검 부위로부터 이격된 곳에서 총 24.2%가 독점적으로 또는 주로 검출되었다(도 10).

48명의 환자 중에서, 12명의 환자는 BM 또는 PL 중 어느 곳에서도 임의의 검출 가능한 돌연변이를 갖지 않았으며(25%), 16명(33.3%)은 PL에 돌연변이를 갖지 않았고, 3명(6%)은 PL에서만 돌연변이를 가졌다.

RR 코호트 내에서, ND 코호트(1개의 돌연변이)와 비교하여 PL(30개의 돌연변이)에서만 더 많은 돌연변이들이 확인되었으며, 이는 BM 생검 부위에서 이격된 곳에서 독점적으로 존재하는 RR 환자에서 유전적으로 이종성 지배적인 하위-클론의 존재 가능성이 더 크다는 것과 일치한다(도 5). 또한, PL-단독 돌연변이의 보다 높은 빈도는 ND보다 RR 환자에서 검출되었다(27.2% vs 6.6%, p=0.25 치-스퀘어드(Chi-squared) 시험). 존재/돌연변이 수는 고위험 세포유전학의 존재와 임의의 상관관계가 있지 않았다.

BM 또는 PL에서 검출된 돌연변이를 갖지 않는 환자(12명의 환자)를 입증 분석으로부터 배제하였다. BM 및 PL과 매칭된 초기 코호트 유래의 잔여 36명의 환자들을, ddPCR을 사용하여 선별된 돌연변이들에 대해 입증하였다. BM 및 Pl 시료를 ddPCR에 의해 123개의 돌연변이들에 대해 시험하였으며, OMD와 ddPCR 사이에 92.6%의 일치율(concordance)이 존재하였다.

미세방울 디지털 PCR(ddPCR)을, OMD에서 검출된 돌연변이의 후속적인 입증에 이용하였다. 매칭된 BM 및 PL을 가진 초기 코호트로부터의 총 12명의 환자들을 선별된 돌연변이(KRAS G13D, G12D, G12V, G12A 및 G12R)에 대해 ddPCR을 사용하여 입증하였다. OMD에 의해 존재한 10/11(90.9% 일치율) 돌연변이를 ddPCR에 의해 검출하였고, OMD에서 음성인 4/13(30.7%) 돌연변이를 ddPCR에 의해 검출하였으며, 이는 ddPCR에 대한 더 높은 민감성을 가리켰다(도 14).

돌연변이 분포율은 MM 환자의 유전적으로 이종성인 장소를 반영한다

BM에서 돌연변이의 돌연변이 분포율(MA)은 0.0059% - 32%(중앙값 0.14%)의 범위였고, PL에 대해서는 0.0090% - 14%(중앙값 0.11%)의 범위였다(도 6). BM 단독에서 확인된 돌연변이에 대한 것보다 BM 및 PL 둘 다에서 확인된 돌연변이에 대해 BM에서 중앙값 MA는 PL의 중앙값 MA보다 유의하게 더 높았으며(도 6; p<0.0001), 이는, BM에서 더 많은 지배적인 클론들이 또한, PL에서 검출 가능함을 가리킨다(도 6, p=0.014). 이는, OMD에서 나타나는 돌연변이 프로파일은 검정법의 검출 수준보다 낮게 더 작은 BM 클론을 포함하지 않았다는 것과 일치한다. 마찬가지로, PL 단독 돌연변이의 MA는 BM 및 PL 둘 다에서 검출된 PL 돌연변이의 MA보다 유의하게 더 낮았다(도 6; p=0.003).

돌연변이는 주로 RAS-MAPK 경로와 연관 있었다

BM 및 PL 둘 다에서 확인된 상부(top) 4개의 돌연변이들은 NRAS Q61K(8.6%), KRAS Q61H_1(7.0%), KRAS G13D(6.3%) 및 KRAS G12D(6.3%)이었다(도 7A). KRAS 돌연변이 내에서, KRAS Q61H_1(13.9%)이 가장 주요하였으며, 후속해서 KRAS G13D(12.3%) 및 KRAS G12D(12.3%)(도 7B)이었고, 한편 NRAS 돌연변이에서, NRAS Q61K(29.7%)가 최고의 발생율을 가졌으며, 후속해서 NRAS G12D(13.5%) 및 NRAS G13D(10.8%)이었다(도 7C). TP53 중에서, TP53 G245D, R273H 및 R248W는 동일한 발생율을 가졌으며(18.8%; 도 7D), 한편 BRAF V600E(50%; 도 7E)는 시험된 모든 4개의 BRAF 돌연변이들의 최고 발생율을 가졌다.

시험된 48명의 환자들 중에서, 33명(69%)은 적어도 하나의 RAS 활성화 돌연변이를 가졌다. KRAS 돌연변이는 PL-단독, BM-단독 및 둘 다에서 최고 발생율을 가졌다(도 8a 내지 도 8c), (도 8c). RAS 돌연변이는 ND 및 RR 환자 둘 다에 분포되었으며, 73%의 ND 및 67%의 RR 환자가 적어도 하나의 RAS 활성화 돌연변이를 가졌다(도 9). 그러나, 진행형 질병을 앓고 있는 개별 환자는 더 높은 수의 RAS 돌연변이를 갖고 있었으며, 35명 중 15명(43%)은 ND와 비교하여 ≥2개의 활성화 돌연변이를 갖고 있었고, 4/15(27%)를 갖고 있었다(도 9, p=0.35 치-스퀘어드 시험). RR 코호트 내에서, 3명의 환자들(RR24, RR12 및 RR13, 도 9)은 10개 초과의 활성화 RAS 돌연변이를 가졌다. RAS-MAPK 경로 돌연변이 중에서, KRAS는 RR 환자에서 최고 발생율(56개의 돌연변이)을 가졌으며, 후속해서 NRAS 돌연변이이었다(27개의 돌연변이). 그러나, ND 환자에서, NRAS(10개의 돌연변이)는 KRAS 9개의 돌연변이)보다 더 높았다. 이들 결과는, KRAS 및 NRAS 돌연변이는 MM에 우세함을 가리킨다. RAS-MAPK 경로 돌연변이가 높은 발생율을 가진 한편, TP53 돌연변이는 RR 환자에서 독점적으로 확인되었다(도 9).

표 1: 시료 정보. 표는 시료, 및 시료의 돌연변이 프로파일에 대한 정보를 가진다.

[표 1]

실시예 4

진행형 질병을 앓고 있는 MM 환자는 ctDNA에 더 많은 돌연변이들을 가진다

ND 환자와 비교하여 RR 환자에 더 많은 MTS가 존재하였다 - 각각 중앙값 2.5개의 돌연변이/환자(범위, 0-11) 대 1개의 돌연변이/환자(범위, 0-3), p=0.03. RAS-MAPK 경로(KRAS/NRAS/BRAF)의 활성화 MTS를, 90%의 ND 환자(중앙값 MTS 1, 범위 0-3) 및 72%의 RR 환자(중앙값 MTS 1, 범위 0-11)를 포함하는 28명의 환자 중 22명(79%)에서 검출하였으며(BM 및/또는 ctDNA), 더욱이, 18명 중 8명(44%)의 RR 환자는 ≥2의 활성화 MTS를 갖고 있었다(각각 2, 2, 3, 4, 4, 8, 8, 11). 또한, 모든 13의 TP53 MTS가 RR 환자에서 독점적으로 확인되었다.

실시예 5

전체 엑솜 시퀀싱은 ctDNA 돌연변이 검출에 이용될 수 있다

탐구용 WES를 4개의 ctDNA 시료 상에서 수행하였으며, 주로 108, 152, 101 및 98개의 별개의 유전자의 엑손 변이체를 나타내었으며, 중앙값 판독 깊이(read depth)는 각각 115, 79, 78 및 65이었다. 변이체들을 C>T 전이(각각 모든 변이체들의 51%, 45%, 51% 및 44%)에 대해 농화시켰으며, 이는 MM BM의 WES와 함께 기재된 바와 같이 메틸화된 시토신으로부터 티민으로의 자발적인 탈아민화를 반영한다.

본원의 데이터는 MM의 돌연변이 특징화에 대한 부속(adjunct)으로서 ctDNA 평가의 유용성을 확인시켜 준다. 더욱이, 고도로 민감한 표적화된 접근법들을 사용하여, 이는 이전에 BM WES에서 보여진 것보다 MM에서 더 복잡한 돌연변이 장소를 나타내었다. 본원의 코호트에서, RAS-MAPK 경로의 활성화 MTS가 고도로 우세하였으며, 이러한 확인은, 이러한 경로에 대한 놀라운 서브클로날 수렴(convergence)을 제시한다. 작용 가능한 MTS를 식별하는 것을 목적으로 한 혈장 ctDNA 평가를 수반하는 고-민감성 접근법들은, 향후 MM 치료 전략들을 개인화하는 데 있어서 상당한 진전을 나타낼 수 있고, MM에 대한 RAS-MAPK 경로 표적화된 접근법들을 수반하는 향후 연구들이 필수적임을 나타낼 수 있다.

실시예 6

하기 실시예에서 돌연변이 전사체에 대해 모니터링된 7명의 환자들에 대한 방법

오스트레일리아 멜버른 소재의 알프레드 병원 인간 연구 윤리 위원회에 의해 승인을 받은 연구를 위해 혈액을 수집하는 데 있어서 작성된 고지에 입각한 동의서를 환자에게 제공하였다.

임상 요건을 기반으로 환자로부터 혈액 시료를 수득하였다. 모든 혈액 시료들을 스트렉(Streck) DNA 튜브에서 수집하였으며, 수집 후 48시간 이내에 가공하였다. 800 g에서 10분 동안 원심분리한 후 혈장을 단리하고, 후속해서 1600 g에서 10분 더 원심분리한 후, 혈장을 1.8 ml 튜브 내에 분취하고, 필요할 때까지 -80℃에 저장하였다. QIAamp 순환하는 핵산 키트(Qiagen)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하여 혈장 DNA를 추출하였다. DNA를 100 ㎕의 완충제 AVE를 사용하여 용리하고, NanoDrop 1000 분광 광도계(ThermoScientific)를 사용하여 정량화하였다.

각각의 환자에서 돌연변이를 Boreal Genomics(Boreal Genomics)에 의해 식별하고, 미세방울 디지털 중합효소 연쇄 반응(DDPCR)(BioRad)을 사용하여 돌연변이를 정량화하였다. 본 발명자들은 BioRad QX200 DDPCR 시스템 및 DDPCR 프로브 마스터믹스[프로브에 대한 DDPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음)] 및 특이적인 돌연변이체 클론을 표적화하는 프라이머를 사용하였다. 이들 돌연변이체 및 야생형 프라이머를 BioRad사로부터 구매하였으며, 이들 프라이머 서열은 상기 회사의 소유이다.

DNA 시료를 제한효소 분해에 의해 단편화시켰으며, 이는, DDPCR 반응물 20 ㎕ 당 MSE1 5개 단위의 농도로 DDPCR 반응물에 MSE1를 직접적으로 첨가하고, 96-딥 웰 반응 모듈이 있는 C1000 터치 서멀 사이클러 상에서 진행시킴으로써 달성된다. 돌연변이의 증폭을 위한 서멀 사이클링 프로토콜은 효소를 활성화시키기 위해 95℃에서 10분, 및 후속해서 변성을 위해 94℃에서 30초이다. 어닐링은 55℃에서 60초이었고, 변성 및 어닐링 단계를 39회 반복하였으며, 후속해서 효소 열화를 98℃에서 10분 동안 수행하였고, 시료를 기계로부터 제거할 때까지 반응물을 12℃에서 유지시켰다. 모든 단계들에 대한 램핑 속도(ramping rate)는 2℃/초(second)로 설정되었다. PCR 단계의 완료 후, 시료를 QX200 미세 방울 판독기 상으로 로딩하고, QuantaSoft Ver 1.7을 사용하여 분석하였다.

실시예 7

레블리미드 및 덱사메타손(Rd)과 조합된 경구 아자시티딘의 1b상 시험으로 치료를 받는 동안, 진행형 재발성 질병을 앓고 있는 환자 #1에서 순차적인 PL 시료 수집을 수행하였다. ctDNA를, 이전에 식별된 TP53 R273H 및 KRAS G12D 돌연변이에 대해 ddPCR에 의해 시험하였다. 지배적인 클론인 것으로 보인 KRAS G12D의 FA는 질병의 재발과 일치하여 급속하게 증가하였으며, 한편 TP53 273H의 FA는 시간이 경과하여도 유의하게 변하지 않았다(도 12a).

다발성 골수종을 앓고 있는 인간 환자에서 이러한 임상 실시예(구체적으로 IgG 람다 형태)는, 상이한 질병 단계들에서 검출 가능한 돌연변이들의 이종성을 보여준다.

실시예 8

레블리미드 및 덱사메타손(Rd)으로 치료를 받는 동안, 환자 #2는 재발성 MM을 갖고 있었고 순차적인 PL 시료 수집을 받았다. 2개의 돌연변이인 KRAS G12S 및 KRAS G12V에 대한 ctDNA 분석은, KRAS G12S 돌연변이가 시간이 경과하여도 미미한 변화를 나타낸 한편, KRAS G12V 클론의 FA는 람다 경쇄(LC) 수준의 변화와 동시에 변하였으며, 이는 둘 다 치료법에 대한 신생 불응성과 함께 증가하였음을 가리켰다(도 12b).

실시예 9

환자 #3은 재발성 MM을 갖고 있었으며, 재발 및 동종 이식-후 시점에서 순차적인 PL 수집을 받았다. 카파 LC의 수준은 동종 이식-후 12개월의 기간에 걸쳐 점차적으로 감소하였으며; 돌연변이체 클론 KRAS G12C의 FA와는 대조적으로, 동종 이식-후 가파르게 하락하였으며, 안정한 질병과 일치하는 PL에는 낮은 검출 가능한 수준으로만 잔존하였다(도 12c).

다발성 골수종을 앓고 있는 인간 환자에서 이러한 임상 실시예(구체적으로 IgG 카파 형태)는, 순환하는 종양 DNA에서 하락 후, 혈청 마커의 하락을 보여준다.

실시예 10

환자 #4는, 고용량의 화학요법 조건화된 자가 줄기세포 이식(ASCT) 후, 완전한 반응을 달성하는 데 실패하고 있는 MM 환자에 대해 파노비노스타트의 II상 연구에 등록된 새로 진단된 MM이었다. ASCT-전 및 ASCT-후 및 3개월의 파노비노스타트 치료 후, 순차적인 PL 시료들을, BM에서 식별되지 않은 PL-단독 돌연변이인 KRAS G13C의 존재에 대해 분석하였다. KRAS G13C의 FA는 증가한 한편, 치료법에서 후속적인 재발 및 시험 치료법의 중단을 알리는 PP 또는 람다 LC에서는 미미한 변화가 존재하였다(도 13a).

이는, 치료법 전환을 혈청 마커에 의해 예측되는 것보다 더 일찍 가능하게 하는 종양 부담(burden)의 표준 측정에서 관찰 가능한 변화와의 불일치(discordance)를 선행하거나 보여주는 FA에서의 변화와 함께 질병 상태의 더 양호한 바이오마커로서 ctDNA의 임상 실시예이다.

실시예 11

환자 #5는 진행형 재발성 MM을 갖고 있었으며, Rd와 조합된 경구 아자시티딘의 1b상 시험으로 치료를 받는 동안 90일의 기간에 걸쳐 순차적인 PL 수집을 받았다. 치료 후 10일 이내에 관찰된 3개의 모든 돌연변이체 클론들의 FA에서의 가파른 하락을 이용하여 3개의 돌연변이체 클론, NRAS Q61K, KRAS Q61H_1 및 BRAF V600E를 추적하였다. 이와는 대조적으로, 카파 LC는 20일째까지 계속해서 상승하였다. 최고 FA를 가진 KRAS Q61H_1의 수준은 90일째까지 계속 하락하였으며, 이러한 하락은 카파 LC 수준과 일치하였다(도 13b).

이는, 질병 반응의 예측을 혈청 마커보다 더 일찍 가능하게 하는 종양 부담의 표준 측정에서 관찰 가능한 변화와의 불일치를 선행하거나 보여주는 FA에서의 변화와 함께 질병 상태의 더 양호한 바이오마커로서 ctDNA의 임상 실시예이다.

실시예 12

환자 #6은 재발성 질병을 갖고 있었으며, Rd에 의해 TP53 R273H 및 NRAS G13R 클론 둘 다가 감소하였다. 경쇄 탈출과 일치하는 람다 LC의 급속한 증가는, 이전에 검출되지 않은 PL에서 2개의 새로운 KRAS 클론들인 G12A 및 G12V의 출현과 일치하였다. 2개의 KRAS 클론 모두의 FA는 익사조밉-사이클로포스파미드-덱사메타손(ICd) 요법으로의 전환에 의해 감소하였으며, 혈청학적 반응과 일치하였다. 그러나, Rd에 반응성이었던 NRAS G13R 클론의 FA는, 계속 반응한 TP53 R273H 클론과는 대조적으로 ICd 상에서 상승하였으며, 이는, 2개의 상이한 치료법들에 대한 4개의 돌연변이체 클론들의 차별적인 반응을 강조한다(도 13c).

이는, 질병 반응의 예측을 혈청 마커보다 더 일찍 가능하게 하고 가능하게는 치료법 전환을 가능하게 하는 종양 부담의 표준 측정에서 관찰 가능한 변화와의 불일치를 선행하거나 보여주는 FA에서의 변화와 함께 질병 상태의 더 양호한 바이오마커로서 ctDNA의 임상 실시예이다. 이는 또한, 기존의 돌연변이가 동일한 수준으로 남아 있는 반면, 불응성 질병과 상관관계가 있는 새로운 돌연변이의 상승을 보여준다.

실시예 13

환자 #7은 새로 진단된 비-분비성 MM을 갖고 있었으며, 종래의 말초 혈액 마커가 없었다. 순차적인 PL ctDNA 분석은, 재발성 질병이, BM에서 진단 시 존재하였던 돌연변이체 KRAS G12V 및 KRAS G12D 클론의 재출현, 및 2개의 새로운 클론인 NRAS G13D 및 NRAS Q61K의 출현과 연관이 있음을 보여주었으며, 전자(former)는 탈리도마이드 - 덱사메타손, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 시스플라틴(T-DCEP) 및 보르테조밉(벨카데(velcade)) - 사이클로포스파미드 - 덱사메타손(VCD) 재치료 둘 다에 대한 불응성을 보여주고, 진행형 질병 직후 환자가 사망할 때까지 지속되었다(도 13d). 흥미롭게는, 19개월째에 BM 생검은 질병 부담의 뚜렷한 감소를 보여주었으며 이는 VCD의 재도입과 일치하였으나, PL ctDNA의 ddPCR은 NRAS G13D 클론의 FA 증가를 보여주었으며 이는 VCD-불응성 질병과 일치하였다.

다발성 골수종을 앓고 있는 인간 환자에서 이러한 임상 실시예는 질병 상태 및 치료 효능의 마커로서 순환하는 세포-프리 DNA에서 돌연변이의 검출에 대한 임상적 유용성을 강조한다. 이러한 실시예는, 종래의 말초 혈액 바이오마커를 갖고 있지 않은(즉 파라단백질을 갖고 있지 않은) 환자가 특히, 순환하는 세포-프리 DNA 수준 또는 돌연변이의 검출로부터 이득을 얻을 것임을 분명하게 보여준다.

본원에 기재된 실시예에서의 임상 결과는, 다양한 형태의 다발성 골수종들을 앓고 있는 환자에서, 질병 단계 및 치료 효능을 식별하는 데 사용될 수 있는 순환하는 세포-프리 핵산을 비-침습적으로 시험할 때의 이득을 분명하게 보여준다. 이를 통해, 의사 및 임상의는 질병의 전반적인 돌연변이 상태를 보다 철저하게 이해할 수 있으며, 이로써 암 진행을 구동하는 신호전달 경로에 관한 보다 최적화된 치료를 할 수 있다.

MM 환자에서 다병소성 종양 침착물 및 클론내 이종성은 단일 BM 부위에서 WGS 또는 WES를 사용하는 포괄적인 돌연변이 특징화를 위한 어려운 세팅을 제공하는데, 이의 공간적인 및 시간적인 제한 때문이다. RAS, FGFR3, TRAF3 및 TP53에서의 다수의 이차적인 활성화 돌연변이들은 질병 재발 시 우세한 것으로 공지되어 있으며, 이는, 포괄적인 특징화가 치료 결정을 알려줄 수 있을 것임을 가리킨다. 개별 MM 환자의 유전적 장소의 보다 포괄적인 그림을 제공할 수 있을 대안적인 접근법은 PL 유래의 ctDNA를 분석하는 것이며, 이는 이론적으로, 다수의 독립적인 종양들로 인해 발생하는 전체 종양 게놈의 대표를 함유하기 때문이다. MM에서 본원에 기재된 연구는, 돌연변이 특징화 및 환자 치료 동안 돌연변이체 클론의 실시간 모니터링을 위해, BM 생검에 대한 부속으로서 PL-유래 ctDNA의 유용성을 평가하고자 하였다.

이러한 연구에서, ND 및 RR MM 환자로부터 짝지어진 BM 시료 및 PL에서 ctDNA의 평가를 OMD 플랫폼을 사용하여 수행하여, MM과 관련된 4개의 유전자들, 즉 KRAS, NRAS, BRAF 및 TP53에 초점을 맞춘 MM 환자의 돌연변이 프로파일을 특징화하였다. 돌연변이를 BM 및 PL 시료 둘 다에서 검출하였으며, 이는 MM의 포괄적인 돌연변이 특징화를 위해 BM 생검에 대한 접근법으로서 ctDNA의 유용성을 가리킨다. 다수의 독립적인 종양들로부터 기원하는 ctDNA의 개념은 PL에서만 확인되는 돌연변이의 31%에 의해 보강되었다. BM 및 ctDNA 둘 다에서 확인된 돌연변이와 함께 하위세트의 환자(23%)에서, 돌연변이 로드는 ctDNA 내에서 비율적으로 더 컸으며, 이러한 언급을 더욱 강조하였다. 부가적으로, RR 환자는 PL 단독 돌연변이를 더 높은 발생율로 가졌으며, 이는, 유전적 양식(architecture)이 질병 진행 동안 다수의 종양 부위들에 걸쳐 진화한다는 개념을 지지하였다. 마찬가지로, PL의 순차적인 ddPCR을 수행하였을 때, 환자 #1은 BM 부위와 이격된 곳에 신생 NRAS G13D 클론을 가졌으며, 이는 불응성 질병 재발과 상응하였다(도 12). 이와 더불어, 이들 결과는, 단일-부위 BM 생검이, 특히 종양 다이내믹스의 실시간 모니터링 및 치료에 대한 내성의 예측이 요망되는 경우, 진화하는 종양 게놈을 포괄적으로 포착하기 위해 그 용량이 제한된다는 확인을 제공한다.

본원에 기재된 코호트에서, RAS-MAPK 경로의 활성화 돌연변이가 고도로 우세하였으며, 적어도 1개의 활성화 돌연변이가 BM 및/또는 PL에서 79%의 환자에 존재하였으며, 따라서 이러한 경로에서 놀라운 서브클로날 수렴을 나타낸다. 이들 데이터는 또한, 일부 환자들에서 서브클로날 양식이 선행 NGS 연구에 의해 제시된 것보다 더 복잡하고, RAS 돌연변이가 이전에 기재된 것보다 더 우세하고, RAS-MAPK 경로를 표적화하는 적절하게 디자인된 유망한 임상 시험에 대한 필요성을 강조한다는 것을 확인시켜 준다. 부가적으로, 특이적인 돌연변이체 서브클론의 정량적 추적을 위한 ctDNA의 ddPCR의 사용은 치료 결정을 더 양호하게 알려 주어야 한다. 더욱이, (WES BM 분석과 비교하여) 이러한 접근법에서 검출된 돌연변이 수의 증가는 과돌연변이된 그림을 가진 환자, 예를 들어 RR 환자 1 내지 4의 인지를 가능하게 하며(도 9), 치유적으로 관련이 잇다. 최근의 관찰들은, 체크 포인트 저해가 최고 돌연변이 로드를 가진 고형 종양 환자에서 보다 효과적임을 제시한다. 이러한 치유적 전략은 환자의 보다 포괄적인 돌연변이 특징화의 개념에서 보다 지향적인 방식으로 발휘될 수 있다.

유사하게는, ddPCR을 사용한 이전에 식별된 돌연변이의 순차적인 ctDNA 분석은, 이전의 재발과 일치하는 특이적인 돌연변이체 클론의 FA의 증가를 보여주었다(도 12 및 도 13). 이를 기반으로, 잠재적으로 작용 가능한 돌연변이의 존재에 대한 표적화된 ctDNA 평가가 종양 부담의 비-침습적인 실시간 측정뿐만 아니라 치유적 선택에 대한 결정적인 정보를 제공할 수 있음이 제시된다. 더욱이, ctDNA 평가로부터 유래된 정량적 데이터는, 단일 부위 BM 생검 검사로부터 유래된 것보다 전신의 종양 부담의 더욱 전체론적인(holistic) 측정, 및 표적화된 치료법에 대한 반응의 후속적인 평가를 나타낼 수 있다. 이는, MM의 돌연변이 특징화에 대한 부속으로서 ctDNA의 유용성을 평가한 MM에서 최초의 개념 증명 연구이다. 고도로 민감한 표적화된 접근법들을 사용하여, 본 발명자들은 BM WES에서 이전에 나타난 것보다 MM에서 보다 복잡한 돌연변이 장소를 나타내었으며, 중요하게는 환자 치료 동안 추적될 수 있는, BM 생검 부위에 이격한 곳에서 주로 또는 독점적으로 존재하는 돌연변이체 클론의 존재를 나타내었다. 본 발명자들은, 작용 가능한 돌연변이를 식별하는 것을 목적으로 하는 PL ctDNA 평가를 포함하는 고-민감성 접근법들이 향후 MM 치료 전략들을 개인화하는 데 있어서 상당한 진전을 나타내고, MM에 대한 RAS-MAPK 경로 표적화된 접근법들을 포함하는 향후 연구들이 필수적이라고 결론 내린다.

Claims

다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응의 모니터링 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리(cell-free) 핵산을 제공하는 단계; 및
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리키거나;
KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 존재 또는 그 수의 증가는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 무반응을 가리키는, 방법.
다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응의 모니터링 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종 치료를 받은 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계;
- 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 제공하는 단계;
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계; 및
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, 세포-프리 핵산 또는 골수 단핵 세포 유래의 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 부재 또는 그 수의 감소는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 반응을 가리키거나;
세포-프리 핵산 또는 골수 단핵 세포 유래의 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다에서 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이의 존재 또는 그 수의 증가는 다발성 골수종 치료에 대한 개체의 무반응을 가리키는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
검출되는 돌연변이가 도 10에 나타낸 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이, 개체의 세포-프리 핵산을, 다발성 골수종 치료 전 개체로부터 수득된 세포-프리 핵산과 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법이, 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을, 다발성 골수종 치료 전 개체로부터 수득된 골수 단핵 세포 유래의 핵산과 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
검출된 돌연변이가 KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G12V, KRAS G12S, KRAS G12R, KRAS G12A, KRAS G13C, NRAS Q61K, NRAS Q61H_1, NRAS G13D, NRAS Q61H, NRAS Q61L, NRAS G13R, BRAF V600E 및 TP53 R273H로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩하는, 방법.
개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는지의 여부의 확인 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체로부터 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계;
- 세포-프리 DNA 수준에 대해 시험 시료를 평가함으로써, 시험 시료 프로파일을 형성하는 단계;
- 다발성 골수종이 없는 개체의 말초 혈액에서 세포-프리 DNA 수준에 대한 데이터를 함유하는 대조군 프로파일을 제공하는 단계;
- 시험 시료 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하여, 시험 시료 프로파일과 대조군 프로파일 사이에서 세포-프리 DNA 수준의 차이가 존재하는지의 여부를 식별(identify)하는 단계; 및
- 시험 시료 프로파일에서 세포-프리 DNA 수준이 대조군 프로파일보다 높은 경우, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있음을 확인하는 단계
를 포함하는, 방법.
제7항에 있어서,
말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계가, 진단되는 개체로부터 말초 혈액 시료를 직접적으로 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
세포-프리 DNA 수준에 대해 시험 시료를 평가하는 단계가, 말초 혈액으로부터 세포-프리 DNA를 추출하고, 세포-프리 DNA를 제외한 말초 혈액의 모든 구성성분들을 폐기하는 단계를 포함하는, 방법.
다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 개체의 진단 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체로부터 말초 혈액의 시험 시료를 제공하는 단계; 및
- 순환하는 종양-프리 핵산에 대해 시험 시료를 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, 순환하는 종양-프리 핵산의 검출은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 것으로 진단하는, 방법.
제10항에 있어서,
순환하는 종양-프리 핵산이, 적어도 하나의 돌연변이가 KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 세포-프리 핵산인, 방법.
제11항에 있어서,
돌연변이가, 도 10에 열거된 임의의 하나 이상의 돌연변이인, 방법.
다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 개체의 진단 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이의 검출은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 것으로 진단하는, 방법.
제13항에 있어서,
세포-프리 핵산이 추출되는 개체로부터 말초 혈액 시료를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
검출되는 돌연변이가 도 10에 나타낸 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 인코딩하는, 방법.
제15항에 있어서,
돌연변이가 KRAS G12D, KRAS G12C, KRAS G12V, KRAS G12S, KRAS G12R, KRAS G12A, KRAS G13C, NRAS Q61K, NRAS Q61H_1, NRAS G13D, NRAS Q61H, NRAS Q61L, NRAS G13R, BRAF V600E 및 TP53 R273H로부터 선택되는, 방법.
다발성 골수종을 앓고 있거나 발병할 위험에 있는 개체의 진단 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계;
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 서열에서 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계;
- 개체의 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 제공하는 단계; 및
- KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 임의의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이에 대해, 골수 단핵 세포 유래의 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, 세포-프리 핵산 및 골수 유래의 핵산 둘 다에서 돌연변이의 검출은, 개체가 다발성 골수종을 앓고 있는 것으로 진단하는, 방법.
제17항에 있어서,
KRAS, NRAS, BRAF 및/또는 TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이가 도 10에 열거된 돌연변이들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
다발성 골수종을 앓고 있는 개체에서 진행형 질병(advanced disease)의 진단 방법으로서, 상기 방법은
- 진행형 질병의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산을 제공하는 단계; 및
- TP53 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 돌연변이에 대해, 세포-프리 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, TP53에서 하나 이상의 돌연변이의 검출은, 개체가 진행형 질병을 앓고 있는 것으로 진단하는, 방법.
제19항에 있어서,
TP53에서 돌연변이가 도 10에 열거된 돌연변이들 중 임의의 하나 이상인, 방법.
다발성 골수종을 앓고 있는 개체에서 진행형 질병의 진단 방법으로서, 상기 방법은
- 다발성 골수종의 진단이 확인되어야 하는 개체의 말초 혈액 시료로부터 유래된 세포-프리 핵산 및 골수 단핵 세포를 제공하는 단계; 및
- KRAS, NRAS, BRAF 또는 TP53 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이에 대해 세포-프리 핵산 및 골수-유래 핵산을 평가하는 단계
를 포함하며,
여기서, 3개 초과의 TP53 돌연변이의 검출은, 개체가 진행형 질병을 앓고 있는 것으로 진단하는, 방법.
제21항에 있어서,
TP53에서 돌연변이가 도 10에 열거된 돌연변이들 중 임의의 하나 이상인, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
다발성 골수종, 활성 질병(active disease) 또는 진행형 질병을 앓고 있으며, 치료에 반응하지 않는 것으로 진단되는 개체를 치료하기 위해 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서,
약물이 RAS/MAPK 경로를 표적화하는, 방법.
제24항에 있어서,
약물이 트라메티닙(trametinib), 리고세르팁(rigosertib), 코비메티닙(cobimetinib), 셀루메티닙(selumetinib), 소라페닙(sorafenib) 및 베무라페닙(vemurafenib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
개체가 치료에 반응하지 않는 것으로 평가되는 경우, 상기 방법이 기존의 치료를 부가적인 약물로 대체하거나 부가적인 약물을 보충하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제26항에 있어서,
부가적인 약물이 덱사메타손(Dexamethasone), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리노마이드(Lenalinomide), 에토포사이드(Etopside), 시스플라틴(Cisplatin), 보르테조밉(Bortezomib), 코비메티닙, 익사조밉(Ixazomib), 리고세르팁, 셀루메티닙, 소라페닙, 트라메티닙, 베무라피닙, 파노비노스타트(Panobinostat), 아자시티딘(Azacytidine), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루무맙(Nivolumumab), 두발루맙(Durvalumab) 또는 자가 줄기세포 이식물(ASCT; autologous stem cell transplant)로부터 선택되는, 방법.