JP2022519159A - 循環細胞の分析方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、循環細胞を特徴解析および分析するための方法を提供する。特に本発明は、個々の細胞の固有性を確認する方法、および取得されたサンプルが、既定された固有性の一つの細胞に由来することを確認する方法を提供する。循環胎児細胞、微小欠失、癌に関連する一塩基変動、または癌の早期再発と転移の状況において、コピー数変動および異数性を決定するために一つの細胞のサンプルを分析する追加の方法が提供される。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７８０，７２４号明細書および２０１９年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７９７，５１８号明細書の利益を主張するものであり、それら出願はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。
現在、出生前診断、疾患および状態の診断、ならびに疾患の発生と治療応答の検査とモニタリングに関して、侵襲性の高い組織生検法の代わりとして液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）を使用することに大きな関心が寄せられている。例えば、妊娠中の母親の液体生検は、非侵襲的な胎児の診断法と検査を提供するものであり、胎児または羊水に対する侵襲的な生検を実施することで発生するリスクが回避される。癌の発生および治療応答の診断ならびにモニタリングを行う場合でも、液体生検は、転移または外科手術合併症の原因となる可能性があるリスクを伴う侵襲的な腫瘍組織生検の実施を回避し得る。また液体生検を基にした方法は、早期ステージでの再発または転移を検出するには感受性が不充分な画像系の検出法よりも感度が高い場合がある。
液体生検は、患者から血液または尿のサンプルを採取すること、および胎児、腫瘍、または他の対象となる器官から剥がれ落ちるセルフリーＤＮＡや循環細胞を単離することに基づいている。セルフリーＤＮＡや循環細胞の分析を行うことによって、強力で非侵襲的な診断方法が提供されてきた。しかしセルフリーＤＮＡは断片化されており、全ゲノムは網羅されないため、セルフリーＤＮＡの分析では、細胞および／または組織から全ゲノムＤＮＡを直接分析する場合と同量の情報は得られない。一方で循環細胞の分析は、非常に少量の細胞サンプルを特徴解析および分析するという困難さにより、課題を抱えている。したがって、液体生検を基にした方法を最大限に活用するために、少数の細胞または一つの細胞のみを含有するサンプルを単離および分析する方法が求められている。
本明細書において、少数の循環細胞または一つの循環細胞のみを含有する場合がある循環細胞サンプルを分析および特徴解析するための方法が開示される。本明細書に例証される態様によれば、一つの実施形態において、胎児を妊娠している母親の血液サンプルに由来する、または細胞株に由来する胎児起源であると推測される循環細胞を分析および特徴解析する方法であって、当該方法は、ａ）当該血液サンプルまたは細胞株から取得された胎児起源であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡの第一のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）セットと、当該血液サンプルの血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡ、または子供の細胞株と母親の細胞株の混合ＤＮＡの第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）座位の多重化増幅反応を実施することによって取得される工程、ｂ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットを、次世代シーケンスにより遺伝子型解析する工程、およびｃ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットの遺伝子型に基づき、当該一つ以上の循環細胞が、一つ以上の母細胞である、一つ以上の胎児細胞である、または母細胞と胎児細胞の混合であると決定する工程、を含む。
一つの実施形態において、本明細書に開示される方法は、血液サンプルのバフィーコート画分から取得された一つ以上の母細胞から単離された母細胞ＤＮＡの第三のアンプリコンセットを生成すること、および当該第三のアンプリコンセットを次世代シーケンスにより遺伝子型解析して、母親の遺伝子型を決定すること、をさらに含む。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、血液サンプルから、胎児起源であると推測される循環細胞、セルフリーＤＮＡを含む血漿画分、および母細胞を含むバフィーコート画分を取得することをさらに含む。
一つの実施形態では、当該一つ以上の循環細胞が、一つ以上の母細胞である、一つ以上の胎児細胞である、または母細胞と胎児細胞の混合であると決定することは、血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡ（または子供と母親のＤＮＡ混合であることが判明しているセルフリーＤＮＡ）と、胎児起源であることが推測される循環細胞（または子供の細胞株）から取得された細胞ＤＮＡの間の母体一致と胎児一致を計算すること、および胎児混合割合（または子供割合）の計算を含む。
一つの実施形態では、第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、少なくとも１，０００個のＳＮＰ座位の多重化増幅反応を実施することにより取得される。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＳＮＰ座位の量を測定することにより、母細胞と胎児細胞の混合物（または母親と子供の細胞株の混合物）のうちの胎児割合を推定することをさらに含む。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＳＮＰでのアレル比を決定することをさらに含む。
一つの実施形態では、胎児割合の推定は、アレル比を使用する。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の循環細胞を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む。
一つの実施形態では、細胞ＤＮＡは、胎児細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される。
一つの実施形態では、当該方法はさらに、一つ以上の循環細胞が一つ以上の胎児細胞であると決定された遺伝子型を使用して、非侵襲的な出生前検査を実施することを含む。
一つの実施形態では、当該方法はさらに、一つ以上の胎児細胞であると決定された一つ以上の循環細胞における対象となる標的染色体または標的染色体セグメントのコピー数変動または異数性を検出することを含む。
一つの実施形態では、対象となる標的染色体または標的染色体セグメントは、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、性染色体、および／またはそれらの染色体セグメントである。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法はさらに、一つ以上の純粋な胎児細胞であると決定された一つ以上の循環細胞における微小欠失を検出することを含む。
一つの実施形態では、微小欠失は、ディジョージ症候群に関連する２２ｑ１１．２欠失、プラダーウィリ症候群に関連する微小欠失、アンジェルマン症候群に関連する微小欠失、１ｐ３６欠失、および／または猫鳴き症候群に関連する微小欠失である。
別の例示的態様において、一つの態様では、本開示は、腫瘍に由来すると決定された一つ以上の循環細胞を取得することにより、癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出するための方法を提供し、当該方法は、
ａ）癌と診断された患者の腫瘍サンプルにおいて特定された変異に基づいて、一つ以上の患者特異的変異を選択する工程、
ｂ）当該患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、当該患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
ｃ）当該癌患者から取得された当該血液サンプルから取得された、循環腫瘍細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡから第一のアンプリコンセット、およびセルフリーＤＮＡから第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該腫瘍細胞および正常細胞は、当該癌患者の血液サンプルまたはその画分の各々から取得され、当該第一のアンプリコンセットおよび当該第二のアンプリコンセットは、癌に関連する患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される工程、
ｄ）次世代シーケンスにより当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットをシーケンスする工程、
ｅ）当該第一のアンプリコンセットの配列に基づき、一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、当該第二のアンプリコンセットの配列は参照として使用され、腫瘍が起源であると決定された循環細胞から生成された第一のアンプリコンセットからの一つ以上の患者特異的変異の検出は、癌の早期再発または転移を示唆する工程、を含む。
別の態様では、本明細書における開示は、癌患者を治療するための方法を提供し、当該方法は、
ａ）外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で癌患者を治療する工程、
ｂ）当該患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、当該患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
ｃ）当該癌患者から取得された当該血液サンプルから取得された、循環腫瘍細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡから第一のアンプリコンセット、およびセルフリーＤＮＡから第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該腫瘍細胞および正常細胞は、当該癌患者の血液サンプルまたはその画分の各々から取得され、当該第一のアンプリコンセットおよび当該第二のアンプリコンセットは、癌に関連する患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される工程、
ｄ）次世代シーケンスにより当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットをシーケンスする工程、
ｅ）当該第一のアンプリコンセットの配列に基づき、一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、当該第二のアンプリコンセットの配列は参照として使用され、腫瘍が起源であると決定された循環細胞から生成された第一のアンプリコンセットからの一つ以上の患者特異的変異の検出は、癌の早期再発または転移を示唆する工程、
ｆ）当該患者に化合物を投与する工程であって、当該化合物は、血液サンプルから検出された当該一つ以上の患者特異的変異を有する癌の治療に有効であることが判明している工程、を含む方法。
本明細書に提供される改善方法によって、非常に少数のＣＴＣを含有するサンプルの正確な分析と特徴解析が可能となる。本発明方法により分析されるサンプル中のＣＴＣの数は、１００細胞未満、７５細胞未満、５０細胞未満、２５細胞未満、２０細胞未満、１５細胞未満、１０細胞未満、５細胞未満、または一つの細胞であり得る。本明細書に提供される方法を使用することにより、一つの循環腫瘍細胞、２ＣＴＣ、３ＣＴＣ、４ＣＴＣ、５ＣＴＣ、６ＣＴＣ、７ＣＴＣ、８ＣＴＣ、９ＣＴＣ、または１０ＣＴＣから正確なゲノム情報が取得され得る。
一部の実施形態では、方法は、予め決定された患者特異的変異に基づいて循環腫瘍細胞であると推測される循環細胞の固有性を決定することにより、癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出することを含む。一部の実施形態では、患者特異的変異は、癌に関連した一塩基バリアント（ＳＮＶ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ：ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｎｔ）、インデル、欠失、または遺伝子融合を含む。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも２個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも８個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１６個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５０個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個～約１０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個～約１０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。
一つの態様では、多重化増幅が実施されて、癌に関連する患者特異的変異を包含するアンプリコンが取得される。一部の実施形態では、第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、５０～１０００個の癌関連患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される。
一つの態様では、癌患者における腫瘍の早期再発と転移のモニタリングおよび検出のための方法は、複数の循環細胞を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む。一部の実施形態では、細胞ＤＮＡは、腫瘍細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される。
一部の実施形態では、当該方法はさらに、一つ以上の循環細胞が一つ以上の腫瘍細胞であると決定された遺伝子型を使用して、非侵襲的な癌検査を実施することを含む。
別の例証的態様において、一つの実施形態では、移植レシピエントの血液サンプルに由来する、ドナー細胞であると推測される循環細胞を分析および特徴解析する方法であって、当該方法は、ａ）当該血液サンプルから取得されたドナー細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡの第一のアンプリコンセットと、当該血液サンプルの血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡの第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）座位の多重化増幅反応を実施することによって取得される工程、ｂ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットを、次世代シーケンスにより遺伝子型解析する工程、ｃ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットの遺伝子型解析に基づき、当該一つ以上の循環細胞が、一つ以上のドナー細胞である、一つ以上のレシピエント細胞である、またはドナー細胞とレシピエント細胞の混合であると決定する工程、を含む。
図１は、循環細胞を取得および分析するための例示的な方法のワークフローを示す。
図２は、個々の循環細胞の固有性を確認するための例示的な方法のワークフローを示す。
図３は、実施例２で得られた遺伝的データのヘトレート（ｈｅｔｒａｔｅ）プロットを示す。図３Ａは、１個の胎児細胞を含有するサンプル１Ｆのヘトレートプロットである。図３Ｂは、２個の胎児細胞を含有するサンプル２Ｆのヘトレートプロットである。図３Ｃは、４個の胎児細胞を含有するサンプル４Ｆのヘトレートプロットである。図３Ｄは、１０個の胎児細胞を含有するサンプル１０Ｆのヘトレートプロットである。図３Ｅは、２０個の胎児細胞を含有するサンプル２０Ｆのヘトレートプロットである。
図４は、実施例３で取得された遺伝的データのヘトレートプロットを示す。図４Ａは、１０個の胎児細胞を含有するサンプル１０Ｆのヘトレートプロットである。図４Ｂは、９個の胎児細胞と１個の母細胞を含有するサンプル９Ｆ１Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｃは、７個の胎児細胞と３個の母細胞を含有するサンプル７Ｆ３Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｄは、５個の胎児細胞と５個の母細胞を含有するサンプル５Ｆ５Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｅは、３個の胎児細胞と７個の母細胞を含有するサンプル３Ｆ７Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｆは、１個の胎児細胞と４個の母細胞を含有するサンプル１Ｆ４Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｇは、１個の胎児細胞と９個の母細胞を含有するサンプル１Ｆ９Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｈは、１個の胎児細胞と１９個の母細胞を含有するサンプル１Ｆ１９Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｉは、１０個の母細胞を含有するサンプル１０Ｍのヘトレートプロットである。図４Ｊは、１０％の胎児ＤＮＡと９０％の母体ＤＮＡを含有するサンプル１０％ ＣＦ混合物のヘトレートプロットである。 同上。
図５は、実施例１によるマルチプレックスＰＣＲ増幅反応の例示的なワークフローと条件を示す。
ここに開示する実施形態は、添付の図面を参照しながらさらに説明されるものであり、同じ構造は、複数の図面にわたって同じ符合で表される。示される図面は必ずしも縮尺通りではなく、ここに開示する実施形態の原則の説明について、通常の配置をする代わりに強調して示される。
上記に特定した図は、提示するために提供されるのであって限定するためではない。
１．概要
本開示は、循環細胞の特徴解析およびゲノム解析のための方法および組成物を提供する。特に本開示は、単離された一つの循環細胞の固有性の確認方法、および一つの細胞からのゲノムデータを分析する方法を提供するものであり、それらは文献上、前例がない方法である。
一つの細胞の単離とゲノム解析は、臨床研究者や企業研究者の多くの関心を引いている。シングルセルゲノミクスは、細胞レベルでの遺伝情報を提供する。単離された一つの細胞から取得された遺伝子型解析プロファイルとゲノム情報は、臨床診断、リスク予測、薬剤開発および疾患治療において多くのアプリケーションの可能性を秘めている。しかし一つの細胞からゲノム情報を取得する方法の開発は、一つの細胞のサンプルはもちろん、少数の細胞を含むサンプルからデータを分析するという大きな試練により妨げられてきた。本明細書の開示は、一つの細胞サンプルからゲノム情報を正確に取得および分析するための生化学的方法および分析方法の両方を提供する。
特に一つの細胞からゲノム情報を正確に取得および分析する方法は、液体生検に基づく診断に大きな影響を及ぼすであろう。液体生検とは、固形ではない生物学的組織のサンプル採取を指し、最も多いのは血液であるが、唾液、尿、脳脊髄液や他の体液もある。例えば、妊娠中の母親の液体生検を使用して、胎児を起源とするセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）と胎児循環細胞の両方を含有するサンプルを取得することにより、胎児の非侵襲的な診断が可能となる。インタクトな循環胎児細胞（ＣＦＣ）は、母体の血液循環に入ることができる。そのため、胎児の遺伝物質の解析を行うことによって、非侵襲的出生前遺伝子診断（ＮＩＰＧＤまたはＮＰＤ：Ｎｏｎ－Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）を提供することが可能となる。しかしＣＦＣは、何十億もの母体血液細胞の中で、高度に希釈されてしまう。もう一つの例は癌患者の液体生検の使用であり、腫瘍自体の生検を行うことなく腫瘍を診断またはモニタリングする。癌患者の液体生検により、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が単離され、腫瘍の診断およびモニタリング、ならびに治療に対する腫瘍の応答性を検査することが可能となる。ＣＴＣは、原発病変および転移病変から癌患者の血流中に剥落するが、進行性転移疾患を有する患者であっても、患者の血液細胞の中ではＣＴＣは相対的に稀である。したがって液体生検に基づく腫瘍の正確な診断は、少数の細胞または一つの細胞のみを含有する細胞サンプルの正確な単離と分析に依存する。さらに液体生検を使用して、移植された器官を起源とする循環細胞の単離および分析を行い、移植臓器をモニタリングしてもよい。
したがって液体生検を基にした診断の最大限の活用は、例えば循環胎児細胞（ＣＦＣ）や循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などのＣＲＣを正確に単離および分析する診断方法の能力に依存する。例えば、ＣＦＣを使用して妊娠した母親の胎児を診断する場合、妊娠した母親の血液サンプルに由来する一つの循環細胞の分析は、単離された当該一つの循環細胞が胎児を起源とすることが確認され、有用な情報を提供することに依存する。同様に、癌患者からの一つの循環細胞の分析は、単離された当該一つの循環細胞が腫瘍を起源とすることが確認され、有用な情報を提供することに依存する。それに加えて循環希少細胞（ＣＲＣ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｒｅ ｃｅｌｌ）を基にした診断は、少数の細胞のみ、または一つの細胞のみを含むサンプルを分析する能力にも依存する。
本開示は、単離された一つの循環細胞を正確に分析し、それらを定性的および定量的に特徴解析することができる方法を提供することによって、このニーズを満たすものである。本明細書の開示は、単離された一つの循環細胞サンプルを分析するためのＳＮＰを基にした次世代シーケンス（ＮＧＳ）法を提供するものであり、当該方法は、細胞のタイプを特定し、そのＤＮＡの純度を推定し、そしてサンプルの品質を測定することができる。例えば本開示方法を使用して、胎児細胞であると推測される単離細胞が、純粋な一つの単離胎児細胞、純粋な母細胞、または胎児細胞と母細胞の混合であることを確認してもよい。別の実施形態では、本開示方法を使用して、循環腫瘍細胞であると推測される単離細胞サンプルが、単離された一つの循環腫瘍細胞であるか、または患者の血液に由来する正常細胞であるかを確認してもよい。
図１は、母体の血液サンプルから単離された循環胎児細胞の分析のための、本開示の例示的実施形態のワークフローの概要である。したがって図１に概要されるワークフローを適合させて、循環腫瘍細胞または対象から単離された任意の他の循環希少細胞の分析を実現してもよい。一つの例示的な実施形態では、図１に概要され、以下でさらに詳細に説明される本開示の方法は、
１．胎児を妊娠している母親から血液サンプルを収集する工程、
２．当該血液サンプルから血漿画分および／またはバフィーコート画分を単離する工程、
３．当該血液サンプルから胎児細胞と母細胞を単離する工程、
４．（ａ）当該血漿画分からセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、および任意で、（ｂ）当該バフィーコート画分からゲノムＤＮＡ、を抽出する工程、
５．単離された（ａ）胎児細胞、および（ｂ）母細胞を溶解させる工程、
６．シーケンス用のｃｆＤＮＡライブラリーを調製する工程、
７．（ａ）細胞溶解物に対して直接、（ｂ）母ＤＮＡに対して、および（ｃ）ｃｆＤＮＡライブラリーに対して、大規模多重化ＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ：ｍａｓｓｉｖｅｌｙ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＰＣＲ）を実施する工程、
８．ＤＮＡバーコードを増幅されたＤＮＡサンプルに付加し、各サンプルをラベリングする工程、
９．シーケンス用のＤＮＡサンプルプールを調製する工程、
１０．次世代シーケンス（ＮＧＳ）プロトコールを介してサンプルをランする工程、
１１．（ａ）ＮＧＳデータの前処理、および（ｂ）ＮＧＳデータの分析、を実施する工程、ならびに
１２．当該ＮＧＳデータの処理および分析の結果を解釈する工程、を含む。
上述の方法の結果によって、ｃｆＤＮＡおよび胎児ＤＮＡ（細胞溶解物）および母体ＤＮＡとの間の一致に関する情報が提供され、細胞サンプルの純度決定が可能となり得る。本明細書の図２および実施例に示されるように、本開示方法を使用して、分析されたＤＮＡサンプルが一つの循環細胞に由来したことが確認され得る。本明細書に提供される実施例は、図１および２に概要されるワークフローに従い、参照としてｃｆＤＮＡを使用することで、当該方法が、未知のサンプルからの細胞ＤＮＡの起源、およびサンプルの組成を決定することができることを示した。例えば、妊娠中の女性の血液から単離された胎児／母細胞の場合、当該方法は、当該サンプルが純粋な胎児細胞、または純粋な母細胞であるかを決定することができる（図２および実施例）。
さらにデータからは、循環細胞中の染色体異常を明らかにすることができる。サンプルが母細胞と胎児細胞の混合であると決定された場合、胎児割合を決定することができる。別の態様では、本明細書に提供される方法を使用して、循環腫瘍細胞サンプルの純度を決定してもよく、循環腫瘍細胞のゲノム情報を分析してもよい。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法によって、移植された器官に由来すると推測される循環細胞が、移植臓器を起源とする純粋な単離細胞であるとの決定が可能となる。
２．一つの細胞を分析してその固有性を確認する方法
本明細書の開示は、非常に少数の細胞、さらには一つの細胞のサンプルからもゲノム情報の分析が可能なデータ分析方法を提供する。特に本開示は、血液サンプルから単離された一つの循環細胞の固有性を決定し、当該一つの循環細胞のゲノム情報を分析することができる方法を提供する。例えば、以下および本明細書の実施例においてさらに説明されるように、本開示は、妊娠した母親の血液サンプルに由来する循環胎児細胞の固有性をどのように確認し、次いで当該確認された純粋な胎児細胞サンプルのゲノム情報をどのように分析するかを示している。以下の記載の方法は、参照として対応するセルフリーＤＮＡを使用することによって、任意の細胞サンプルの固有性の確認に適合されることができる。
本明細書に例証される態様によれば、一つの実施形態において、胎児を妊娠している母親の血液サンプルからの胎児起源であると推測される循環細胞を分析および特徴解析する方法は、ａ）当該血液サンプルから取得された胎児起源であると推測される一つ以上の細胞株または一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡの第一のアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）セットと、当該血液サンプルの血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡ、または子供のＤＮＡと母親のＤＮＡから取得されたＤＮＡ混合物の第二のアンプリコンセットを生成することであって、当該第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）座位の多重増幅反応を実施することによって取得される、生成すること、ｂ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットを、次世代シーケンスにより遺伝子型解析すること、およびｃ）当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットの遺伝子型解析に基づき、当該一つ以上の循環細胞が、一つ以上の母細胞である、一つ以上の胎児細胞である、または母細胞と胎児細胞の混合であると決定すること、を含む。一つの実施形態において、本明細書に開示される方法は、血液サンプルのバフィーコート画分から取得された一つ以上の母細胞から単離された、または母親の細胞株から単離された母細胞ＤＮＡの第三のアンプリコンセットを生成すること、および当該第三のアンプリコンセットを次世代シーケンスにより遺伝子型解析して、母親の遺伝子型を決定すること、をさらに含む。
一つの実施形態では、当該一つ以上の循環細胞が、一つ以上の母細胞である、一つ以上の胎児細胞である、または母細胞と胎児細胞の混合であると決定することは、血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡ、または子供と母親のＤＮＡ混合物と、胎児起源であることが推測される循環細胞から取得された細胞ＤＮＡの間の母体一致と胎児一致を計算すること、および胎児混合割合の計算を含む。
以下の指標すべてを計算するための最初の工程は、ｃｆＤＮＡサンプルのアレル比（ＡＲ：ａｌｌｅｌｅ ｒａｔｉｏ）を分析し、それらを母体遺伝子型／胎児遺伝子型＝ＲＲ／ＲＲ、ＲＲ／ＲＭ、ＲＭ／＊、ＭＭ／ＭＭ、またはＭＭ／ＭＲとして分類することである。アレル比は、以下の方法により計算される：所与のＳＮＰに対する参照カウント数／総カウント数。一部の実施形態において、ｃｆＤＮＡに対する基礎的な遺伝子型決定装置（ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）は、ＡＲによりＳＮＰを分類する。この計算のアルゴリズムは、様々なアプリケーションに調整可能である。例示的であるが、非限定的な実施形態において、ｃｆＤＮＡに対する基礎的な遺伝子型決定装置は、以下の様式で、ＡＲによりＳＮＰを分類する：
Figure 2022519159000002
あるいは一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡの遺伝子型は、ＰＡＮＯＲＡＭＡ（登録商標）遺伝子型決定装置を使用することによって分類され得る。
二番目の工程として、未知のサンプル中のＳＮＰは、アレル比（ＡＲ）に基づき、ホモ接合性－Ｒ（ＨｏＲ）、ホモ接合性－Ｍ（ＨｏＭ）、またはヘテロ接合性（Ｈｅｔ）に分類される。この計算のアルゴリズムは、様々なアプリケーションに調整可能である。例示的であるが、非限定的な実施形態では、未知のサンプル中のＳＮＰは、以下の様式で、アレル比率（ＡＲ）に基づきホモ接合性－Ｒ（ＨｏＲ）、ホモ接合性－Ｍ（ＨｏＭ）、またはヘテロ接合性（Ｈｅｔ）に分類される：
Figure 2022519159000003
三番目の工程として、これらＳＮＰの遺伝子型決定／分類を使用することにより、未知のサンプルを分類するために使用され得る以下の指標が計算された：
母体一致＝未知のサンプルにおいて、予測範囲内にあるアレル比（それぞれＨｏＲおよびＨｏＭ）を有するｃｆＤＮＡサンプル中のホモ接合性ＳＮＰ（ＲＲ／ＲＲまたはＭＭ／ＭＭ）の割合。
Figure 2022519159000004
母体一致が高い場合（約８５％超）、当該未知のサンプルは、ｃｆＤＮＡサンプルと同じ母親に由来する可能性が高い。
胎児一致＝未知のサンプルにおいて、予測範囲内にあるアレル比（Ｈｅｔ）を有するｃｆＤＮＡサンプル中の胎児バンド（ｂａｎｄ）ＳＮＰ（ＲＲ／ＲＭまたはＭＭ／ＭＲ）の割合。
Figure 2022519159000005
胎児一致が高い場合（約８５％超）、当該未知のサンプルは、少なくともいくつかの胎児ＤＮＡを含む可能性が高い。
胎児混合割合＝未知のサンプルにおける、胎児ＤＮＡによる寄与の推定である。これは、未知のサンプル中の胎児バンドのＲＲ／ＲＭおよびＭＭ／ＭＲの分離を１から引いたものである。サンプルが純粋な母細胞である場合、分離は１に近く、胎児混合割合は０である。サンプルが純粋な胎児細胞である場合、分離は０に近く、胎児割合は１に近い。混合は、これら二つの値の間の数値である。
Figure 2022519159000006
一つの例証的実施形態では、未知のサンプルは、計算された母体一致、胎児一致、および胎児混合割合を使用することによって、以下の表１に従って分類される。表１に示される例証的実施形態によれば、純粋な胎児サンプルは、９５％を超える胎児混合割合、ならびに８５％を超える胎児一致および母体一致を有すると定義される。一部の実施形態では、サンプルは、胎児混合割合が、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超え、母体一致および胎児一致が、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える場合に、純粋な胎児サンプルである。一つの特定の実施形態では、サンプルは、胎児混合割合が９５％を超え、胎児一致が８５％を超える場合に、純粋な胎児サンプルである。サンプルは、母体一致が、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超え、胎児混合割合が１５％、１０％、５％、または２％未満である場合に、純粋な母サンプルであり得る。一つの特定の実施形態では、母体一致が８５％を超え、胎児混合割合が５％未満であるとき、サンプルは純粋な母細胞である。特定の組み合わせ（例えば、１００％の胎児一致と０％の胎児混合割合）は不可能であるか、または非常に可能性が低く（例えば、高い胎児一致と低い母体一致）、そのため分類表から除外されることに留意されたい。
Figure 2022519159000007
この方法は、１３番染色体、１８番染色体、および２１番染色体に関し、Ｐａｎｏ（登録商標）Ｖ２標的セットに対して本明細書の実施例で検証されており、任意のＳＮＰ標的セット（ただし充分なサイズとマイナーアレル頻度とする）に有用であることが予期される。例えば、ＳＰＥＣＴＲＵＭ（登録商標）標的セットは、本開示方法に対して有用な遺伝子型決定装置であり得る。
３．循環細胞の単離
循環胎児細胞（ＣＦＣ）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、および移植臓器からの循環細胞は、液体生検サンプルにおいて相対的に稀である。例えば、母体血液中の胎児細胞濃度は、妊娠の段階および胎児の状態に依存するが、推定値としては、母体血液１ミリリットル当たり１～４０個の胎児細胞、または１００，０００個の母体有核細胞当たり１個未満の胎児細胞の範囲である。現在の技術でも少量の胎児細胞を母親の血液から分離することができるが、胎児細胞を任意の量で純粋になるまで濃縮することは困難である。
循環希少細胞を濃縮するための方法が多数開発されており、それら方法は、循環腫瘍細胞に関しては周囲の正常細胞から循環腫瘍細胞を識別する特性、または循環胎児細胞に関しては母細胞から循環胎児細胞を識別する特性に基づいている。
こうした識別特性は、例えばサイズ、密度、電荷、および変形能などの物理的特性であってもよく、特殊フィルターを通した濾過、マイクロピペッティングと組み合わせた顕微鏡、マイクロ流体システム、遠心分離、電気泳動、またはフローサイトメトリーなどの方法の使用に基づいた濃縮が可能である。
あるいは識別特性は、例えば細胞表面タンパク質の発現または生存能力などの生物学的特性であってもよく、循環細胞を標識して正常細胞または母細胞から識別することが可能である。例えば抗体を使用して、周囲の細胞ではなく循環細胞によって発現される特定の細胞表面マーカーを検出してもよく、その後、当該循環細胞は、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、抗体を結合する剤でコーティングされた固形支持体に置いて、結合抗体とともにある細胞を単離することにより単離されてもよい。例えば、循環腫瘍細胞は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に対する抗体を使用して単離されている。Ａｌｉｘ－Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ ａｎｄ Ｐａｎｔｅｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５９（１）：１１０－１１８（２０１３）を参照のこと。あるいは循環細胞は、循環細胞上にはなく正常細胞上にある抗原を認識する抗体を使用して、その後、抗体標識細胞を除去することによるネガティブ選択によって濃縮されてもよい。別のネガティブ選択方法は、赤血球の選択溶解である。
４．患者集団
本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、または「個体」とは、任意の対象、患者、または個人を指し、当該用語は本明細書において相互交換可能に使用される。これに関して、「対象」、「患者」、および「個体」は、哺乳動物、および特にヒトを含む。「その必要のある」と併せて使用される場合、「対象」、「患者」または「個体」という用語は、特定の症状または障害を有する、またはそのリスクがある任意の対象、患者、または個体を意図する。
本開示の方法および組成物を使用して、哺乳動物を含むヒトおよび非ヒト動物、ならびに様々な症状または障害に罹患しているヒトの子供および成人を含む未成熟動物および成熟動物を含む、様々な対象を診断、モニタリングまたは治療することができる。診断または治療されるヒト対象は、胚、胎児、幼児、小児、学齢期の子供、１０代、青年、成人、または高齢者の患者であり得る。
一部の実施形態では、母親の血液サンプルから取得された循環胎児細胞を単離および分析することにより診断またはモニタリングされる対象は、胎児である。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、胎児の父子鑑定に使用されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、妊娠した母親の胎児中の対象となる染色体または染色体セグメントにおけるコピー数変動を決定してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、性染色体、および／またはそれら染色体セグメントのコピー数変動を決定してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、胎児の染色体における微小欠失を検出してもよい。一部の実施形態では、胎児で検出される微小欠失は、ディジョージ症候群に関連する２２ｑ１１．２欠失、プラダーウィリ症候群に関連する微小欠失、アンジェルマン症候群に関連する微小欠失、１ｐ３６欠失、および猫鳴き症候群に関連する微小欠失である。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、妊娠した母親の胎児における一塩基変動（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を検出してもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、癌患者を診断またはモニタリングしてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、患者の血液サンプルから循環腫瘍細胞を単離および検出することにより、腫瘍組織におけるコピー数変動を検出してもよい。一部の実施形態では、本明細書の方法を使用して、癌患者中の癌に関連する患者特異的変異を一つ以上検出してもよい。一部の実施形態では、本明細書の方法を使用して、癌患者の腫瘍中の癌に関連する患者特異的変異を少なくとも２個検出してもよい。一部の実施形態では、本明細書の方法を使用して、癌患者の腫瘍の早期再発または転移に関連する変異を検出してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、治療に対する癌患者の反応をモニタリングしてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、移植臓器を起源とする循環細胞の単離および分析を行うことにより、移植臓器のレシピエントをモニタリングしてもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、移植臓器のレシピエントにおける移植片宿主病を診断してもよい。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、免疫抑制治療に対する臓器移植患者の反応をモニタリングしてもよい。
５．遺伝子型データの取得
５．１ 遺伝子データのソース
任意の関連する個体遺伝子データは、以下から取得できる：個体のバルク二倍体組織、個体由来の一つ以上の二倍体細胞、個体由来の一つ以上の一倍体細胞、標的個体由来の一つ以上の割球、個体に存在する細胞外遺伝物質、母親の血液または癌患者の血液中に存在する個体由来の細胞外遺伝物質、母親の血液に存在する個体由来の細胞、関連個体の配偶子から生成された一つ以上の胚、当該胚から採取された一つ以上の割球、関連個体に存在する細胞外遺伝物質、関連個体を起源とすることが判明している遺伝物質、およびそれらの組み合わせ。例示的な実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して、例えば胎児細胞または腫瘍細胞などの標的細胞からの標的サンプルのゲノムを起源とする遊離ＤＮＡが分析される。一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、血液サンプルから、胎児起源であると推測される循環細胞、セルフリーＤＮＡを含む血漿画分、および母細胞を含むバフィーコート画分を取得することをさらに含む。一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、腫瘍細胞であると推測される循環細胞、セルフリーＤＮＡを含む血漿画分、および正常細胞を含むバフィーコート画分を血液サンプルから取得することをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「セルフリーＤＮＡ」という用語は、細胞を溶解する工程を必要とせずに分析に利用可能なＤＮＡを指す。セルフリーＤＮＡは、血液または他の体液中に見出され得る。セルフリーＤＮＡは、様々な組織から取得されてもよい。そうした組織は、例えば血液、リンパ、腹水、脳脊髄液などの液状形態の組織であってもよい。セルフリーＤＮＡは、様々な細胞源由来であってもよい。一部の例では、セルフリーＤＮＡは、胎児細胞から誘導されたＤＮＡから構成される。セルフリーＤＮＡは、標的細胞および非標的細胞から誘導されたＤＮＡの混合物であってもよい。胎児の異数性に関するＤＮＡの分析の場合、一部の実施形態では、セルフリーＤＮＡは、妊娠女性の血液から取得されてもよく、この場合においてセルフリーＤＮＡは、母親由来のセルフリーＤＮＡと胎児由来のセルフリーＤＮＡの混合物を含む。他の実施形態では、セルフリーＤＮＡは、癌性腫瘍細胞から誘導されてもよい。セルフリーＤＮＡは、腫瘍細胞から誘導されたセルフリーＤＮＡと、身体の別の箇所の腫瘍ではない細胞から誘導されたセルフリーＤＮＡの混合物を含んでもよい。
或る説明的な実施形態においては、本発明の方法で解析されるサンプルは、血液サンプル又はそのフラクションである。或る実施形態においては、本明細書で提供する方法は、ＤＮＡ断片の、特に血液循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）中で発見した腫瘍のＤＮＡ断片の増幅に特に適している。こうした断片は、典型的には、長さを約１６０ヌクレオチドとする。
例えばｃｆＮＡである無細胞核酸（ｃｆＮＡ）は、アポトーシス、壊死、自家融解及びネクロプトーシス等である種々の細胞死の形態を介して循環系に放出され得るということがこの技術分野で知られている。ｃｆＤＮＡは断片化され、断片のサイズ分布は１５０～３５０ｂｐから、１００００ｂｐ超まで変化する（Ｋａｌｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ ７；２１（４１）：１１６３６－１１６５３を参照のこと）。例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の血漿ＤＮＡ断片のサイズ分布は、カウント数（ｃｏｕｎｔ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）のピークが約１６６ｂｐである長さ１００～２２０ｂｐの範囲に及ぶものであって、また長さ１５０～１８０ｂｐの断片において腫瘍ＤＮＡ濃度が最も高かった（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１３１７－Ｅ１３２５を参照）。
説明的な実施形態においては、血液循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、細胞片及び血小板を遠心分離で除去後、ＥＤＴＡ－２Ｎａチューブを用いて血液から単離した。血漿サンプルは、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、独国ヒルデン）を用いてＤＮＡを抽出するまで、－８０℃で保存することが可能である（例えばＨａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；１１２：３５２－３５６）。Ｈａｍａｋａｖａらは、全サンプルのうち抽出したセルフリーＤＮＡの濃度の中央値が血漿１ｍｌ当たり４３．１ｎｇ（９．５～１３３８ｎｇ／ｍｌの範囲に及ぶ）であり、変異断片は０．００１～７７．８％の範囲に及び、中央値は０．９０％であると報告した。
例えばＤＮＡ配列データなどの遺伝データは、一つ以上の標的細胞から誘導されたＤＮＡと、一つ以上の非標的細胞から誘導されたＤＮＡを含むＤＮＡの混合物から取得することができる。標的細胞および非標的細胞は、他の基準に基づき、ゲノムレベルで互いに異なっている。「誘導された」という用語は、細胞が、ＤＮＡの最終的な源であることを示すために使用される。したがって、例えば、妊娠女性の母体血液から得られたセルフリーＤＮＡは、胎児の胎盤由来の細胞から誘導されており、これらは典型的には胎児自身および母親の細胞と遺伝的に同一である。当該方法は、患者の組み合わせを採用する。
５．２ 増幅（例えばＰＣＲ）反応混合物：
一部の実施形態では、遺伝子型データの取得は、シーケンス（例えば、ショットガンシーケンス、単一分子シーケンス、または他の次世代シーケンス技術など）、多型座位を検出するためのＳＮＰアレイ、またはマルチプレックスＰＣＲを含む。一部の実施形態において、遺伝子型解析は、例えば少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個の異なる多型座位といった多型座位を検出するＳＮＰアレイの使用を伴う。一部の実施形態では、遺伝子型解析は、マルチプレックスＰＣＲの使用を伴う。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１３，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個の異なる多形座位（例えば、ＳＮＰ）に同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリーと、画分中のサンプルを接触させて、反応混合物を生成すること、当該反応混合物をプライマー伸長反応条件下に置いて増幅産物を生成させ、ハイスループットシーケンサーで測定して、シーケンスデータを生成することを伴う。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）がシーケンスされる。ｍＲＮＡはエクソンのみを含んでいるため、ｍＲＮＡをシーケンスすることで、例えば数メガベースなどゲノム中の長距離にわたり多型座位（例えばＳＮＰなど）についてアレルを決定することができる。
一つの実施形態では、多重化標的ＰＣＲは、溶解細胞サンプルに直接実施される。一部の実施形態では、細胞は、プロテアーゼＫ消化により溶解される。一部の実施形態では、細胞は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、およびトリス－塩酸塩を含む生理食塩水中でのプロテアーゼＫ消化によって溶解される。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅用の細胞を調製するために、細胞は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、およびトリス－塩酸塩を含まない生理食塩水中でのプロテアーゼＫ消化によって溶解される。さらなる詳細については、実施例の項を参照のこと。
一部の実施形態では、サンプルバーコードは、アンプリコンの生成工程の間にＤＮＡに付加される。
或る実施形態においては、本発明の方法は、増幅反応混合物を形成することを含む。この反応混合物は典型的に、ポリメラーゼと、ヌクレオチド三リン酸塩と、サンプルから生成した核酸ライブラリーからの核酸断片と、一連の標的特異的な順方向アウタープライマーと、単鎖（ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ）逆方向アウターユニバーサルプライマーとを組み合わせることによって形成する。他の説明的な実施形態では、反応混合物は、標的特異的な順方向アウタープライマーの代わりである標的特異的な順方向インナープライマーと、核酸ライブラリーからの核酸断片の代わりである、アウタープライマーを用いた第一のＰＣＲ反応からのアンプリコンとを含む。本明細書で提供するこの反応混合物は、説明的な実施形態においては、この発明の独立した態様でそれぞれが形成される。説明的な実施形態においては、この反応混合物はＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は典型的に、マグネシウムを含む。
一部の実施形態においては、この反応混合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マグネシウム、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態においては、ＴＭＡＣの濃度を、２０から７０ｍＭの間（両端の値を含める）とする。いずれの特定の理論と結びつける意図はないが、ＴＭＡＣが、ＤＮＡに結合し、二本鎖を安定させ、プライマー特異性を増加させ及び／又は様々なプライマーの融点を均一化させるということがわかっている。一部の実施形態においては、ＴＭＡＣが、様々な標的に対する増幅産物の量の均一性を増加させる。一部の実施形態においては、マグネシウム（塩化マグネシウムからのマグネシウム等）の濃度を１から８ｍＭの間とする。
大量の標的のマルチプレックスＰＣＲ用の大量のプライマーが、多量のマグネシウムをキレート化し得る（プライマー中の２つのリン酸塩が１つのマグネシウムをキレート化する）。例えば、プライマーからのリン酸塩濃度が約９ｍＭであるように十分なプライマーを用いると、該プライマーは、有効なマグネシウム濃度を約４．５ｍＭだけ減少させ得る。一部の実施形態においては、高濃度のマグネシウムが、非標的遺伝子座の増幅等であるＰＣＲエラーを引き起こすことがあるため、ポリメラーゼに対する補助因子として利用可能なマグネシウムの量を減少させるためにＥＤＴＡを用いる。一部の実施形態においては、ＥＤＴＡの濃度が、利用可能なマグネシウムの量を１から５ｍＭの間（例えば３から５ｍＭの間）まで減少させる。
一部の実施形態においては、ｐＨが７．５から８．５の間とし、例えば７．５から８、８から８．３、又は８．３から８．５の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、Ｔｒｉｓバッファーを、例えば１０から１００ｍＭの間の濃度で、例えば１０から２５ｍＭ、２５から５０ｍＭ、５０から７５ｍＭ又は２５から７５ｍＭの間（両端の値を含める）等の濃度で用いる。一部の実施形態においては、これら濃度のＴｒｉｓバッファーはいずれも、７．５から８．５の間のｐＨで用いる。一部の実施形態においては、ＫＣｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４の組み合わせを用いるものであり、例えば５０から１５０ｍＭの間のＫＣｌ及び１０から９０ｍＭの間の（ＮＨ４）２ＳＯ４等（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、ＫＣｌの濃度は、０から３０ｍＭの間、５０から１００ｍＭの間又は１００から１５０ｍＭの間（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は、１０から５０ｍＭ、５０から９０ｍＭ、１０から２０ｍＭ、２０から４０ｍＭ、４０から６０ｍＭ、又は６０から８０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４の間（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、アンモニウム［ＮＨ４＋］の濃度は、０から１６０ｍＭの間であり、例えば０から５０、５０から１００、又は１００から１６０ｍＭの間等（両端の値を含める）である。一部の実施形態においては、カリウムとアンモニウムとの濃度の合計（［Ｋ＋］＋［ＮＨ４＋］）は、０から１６０ｍＭの間であり、例えば０から２５、２５から５０の間、５０から１５０、５０から７５、７５から１００、１００から１２５、又は１２５から１６０ｍＭの間等（両端の値を含める）である。［Ｋ＋］＋［ＮＨ４＋］が１２０ｍＭである例示的なバッファーは、ＫＣｌが２０ｍＭ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４が５０ｍＭである。一部の実施形態においては、該バッファーは、ｐＨが７．２から８のＴｒｉｓバッファーを２５から７５ｍＭ、ＫＣｌを０から５０ｍＭ、硫酸アンモニウムを１０から８０ｍＭ及びマグネシウムを３から６ｍＭを含む（両端の値を含める）。一部の実施形態においては、該バッファーは、ｐＨが７から８．５のＴｒｉｓバッファーを２５から７５ｍＭ、ＭｇＣｌ２を３から６ｍＭ、ＫＣｌを１０から５０ｍＭ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を２０から８０ｍＭを含む（両端の値を含める）。一部の実施形態においては、１００から２００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのポリメラーゼを用いる。一部の実施形態においては、ｐＨ８．１の最終体積２０μｌ中、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＣｌ２、ライブラリー中の各プライマー７．５ｎＭ、５０ｍＭのＴＭＡＣ、および７μｌのＤＮＡ鋳型が使用される。
一部の実施形態においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ８，０００）又はグリセロール等のクラウディング試薬（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いる。一部の実施形態においては、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ８，０００）の量は、０．１から２０％であり、０．５から１５％、１から１０％、２から８％又は４から８％の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、グリセロールの量は、０．１から２０％の間であり、０．５から１５％、１から１０％、２から８％又は４から８％の間（両端の値を含める）等である。一部の実施形態においては、クラウディング試薬により、用いられるポリメラーゼ濃度の低濃度化及び／又はアニーリング時間の短縮化が可能となる。一部の実施形態においては、クラウディング試薬が、ＤＯＲの均一性を改善し及び／又は脱落（未検出のアレル）を低減する。一部の実施形態では、プルーフリーディング活性をもつポリメラーゼ、プルーフリーディング活性のない（又はごくわずかな）ポリメラーゼ、又は、プルーフリーディング活性をもつポリメラーゼとプルーフリーディング活性のない（又はごくわずかな）ポリメラーゼとの混合物を用いる。一部の実施形態においては、ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）ポリメラーゼ、非ホットスタート（ｎｏｎ－ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）ポリメラーゼ、又は、ホットスタートポリメラーゼと非ホットスタートポリメラーゼとの混合物を用いる。一部の実施形態においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる（例えば、キアゲン社のカタログＮｏ．２０３２０３を参照）。一部の実施形態においては、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いる。一部の実施形態においては、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼであって、反応混合物中に過剰なテンプレートが存在する場合に、及び、長い産物を増幅する場合に有効なＰＣＲ増幅を提供するハイフィデリティポリメラーゼを用いる（カリフォルニア州マウンテンビュー、タカラクロンテック社（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））。一部の実施形態においては、ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ又はＫＡＰＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、これらはシングルサブユニットの、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼである好熱性バクテリア、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）に基づく。ＫＡＰＡ Ｔａｑ及びＫＡＰＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’ポリメラーゼと５’－３’エキソヌクレアーゼ活性とを有するが、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性は有さない（例えば、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社カタログＮｏ．ＢＫ１０００を参照）。一部の実施形態においては、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いるものであり、それは超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）からの高度に熱安定なＤＮＡポリメラーゼである。酵素が、５’→３’の向きで、二重鎖ＤＮＡにヌクレオチドのテンプレート依存性重合を触媒する。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼもまた、ポリメラーゼに対してヌクレオチド取り込みエラーを修正可能にさせる３’→５’のエキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を示す。当該ポリメラーゼは、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）カタログＮｏ．ＥＰ０５０１を参照）。一部の実施形態においては、Ｋｌｅｎｔａｑ１を用いるものであり、それはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ－ｆｒａｇｍｅｎｔ）アナログであるであり、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有さない（例えば、ミズーリ州セントルイス、ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社カタログＮｏ．１００を参照）。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼであり、例えばＰＨＵＳＩＯＮハイフィデリティ（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．））又はＰＨＵＳＩＯＮホットスタートフレックス（Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）等である。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｍ０４９１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＱ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０２０３Ｓ、ニュー・イングランド・バイオラボ社）である。
一部の実施形態においては、５から６００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ（反応ボリューム１ｍＬ当たりのユニット数）の間のポリメラーゼであり、５から１００、１００から２００、２００から３００、３００から４００、４００から５００又は５００から６００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬの間（両端の値を含める）等であるポリメラーゼを用いる。
５．３ ＰＣＲ法
一部の実施形態においては、ホットスタートＰＣＲを用いて、ＰＣＲサーモサイクルを行う前に重合を軽減又は防止する。例示的なホットスタートＰＣＲ法は、反応混合物が高温に達するまで、最初のＤＮＡポリメラーゼを抑制すること、又は、反応成分の反応を物理的に分離することを含む。一部の実施形態においては、マグネシウムの緩やかな放出を利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、活性のためにマグネシウムイオンを要するため、マグネシウム は、化学物質と結合させておくことで反応から化学的に分離し、高温でのみ溶液中に放出させる。一部の実施形態においては、抑制剤の非共有結合性の結合を利用する。この方法においては、ペプチド、抗体又はアプタマーが、低温で酵素に非共有結合的に結合し、その活性を抑制する。上昇した温度でのインキュベーション後、抑制剤が放出されて、反応が開始する。一部の実施形態においては、低温ではほとんど活性をもたない改変ＤＮＡポリメラーゼ等の、低温感受性のＴａｑポリメラーゼを利用する。一部の実施形態においては、化学的な改変を利用する。この方法においては、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位内のアミノ酸の側鎖に、ある分子が共有結合している。この分子は、上昇した温度で反応混合物をインキュベーションすることによって、酵素から放出される。分子が放出されると、酵素が活性化する。
一部の実施形態においては、テンプレートの核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡのサンプル等）に対する量は、２０から５，０００ｎｇの間であり、２０から２００、２００から４００、４００から６００、６００から１，０００、１，０００から１，５００又は２，０００から３，０００ｎｇの間等（両端の値を含める）である。
一部の実施形態においては、キアゲン社のマルチプレックスＰＣＲキットを利用する（キアゲン社カタログＮｏ．２０６１４３）。１００×５０μＬのマルチプレックスＰＣＲ反応に関しては、キットには、２×ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（最終濃度が３ｍＭのＭｇＣｌ２を与える、３×０．８５ｍｌ）、５×Ｑ－Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×２．０ｍｌ）及びＲＮａｓｅフリー水（２×１．７ｍｌ）が含まれる。ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＭＭ）は、ＫＣｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４の組み合わせのみならず、ＰＣＲ添加剤、テンプレートにおけるプライマーの局所濃度を増加させるＦａｃｔｏｒ ＭＰを含有する。Ｆａｃｔｏｒ ＭＰは、特に結合したプライマー同士を安定化させ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって有効なプライマー伸長が可能になる。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの改変型であり、室温ではポリメラーゼ活性を有さない。一部の実施形態においては、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、任意の既存のサーモサイクルプログラムに組み込むことが可能な９５℃での１５分間のインキュベーションにより活性化される。
一部の実施形態においては、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度）、ライブラリー中の各プライマーを７．５ｎＭ、ＴＭＡＣを５０ｍＭ、および２０μｌ最終体積中でＤＮＡ鋳型７μｌが使用される。一部の実施形態においては、ＰＣＲサーモサイクル条件は、９５℃で１０分（ホットスタート）、９６℃で３０分間を２０サイクル、６５℃で１５分間及び７２℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間（最終伸長）、その後４℃での保持を含む。
一部の実施形態においては、総体積２０μｌ中、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度（推奨濃度の２倍）、ライブラリー中の各プライマーを２ｎＭ、ＴＭＡＣを７０ｍＭ、およびＤＮＡ鋳型７μｌが使用される。一部の実施形態においては、４ｍＭまでのＥＤＴＡも含む。一部の実施形態においては、ＰＣＲサーモサイクル条件は、９５℃で１０分間（ホットスタート）、９６℃で３０秒間を２５サイクル、６５℃で２０、２５、３０、４５、６０、１２０又は１８０分間及び任意に７２℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間（最終伸長）、その後４℃での保持を含む。
他の例示的な条件のセットは、セミネスト（ｓｅｍｉ－ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲのアプローチを含む。第一のＰＣＲ反応では、２×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、ライブラリー中の各プライマーを１．８７５ｎＭ（順方向及び逆方向のアウタープライマー）、及び、ＤＮＡテンプレートを含む、２０μｌの反応ボリュームを用いる。
サーモサイクル用パラメータには、９５℃で１０分間と、９６℃で３０秒間、６５℃で１分間、５８℃で６分間、６０℃で８分間、６５℃で４分間及び７２℃で３０秒間を２５サイクルと、その後７２℃で２分間とを含み、その後４℃で保持する。次に、１：２００で希釈された、得られた産物２μｌを、第二のＰＣＲ反応の入力として用いる。この反応では、１×ＱＩＡＧＥＮ ＭＭ最終濃度、順方向インナープライマーをそれぞれ２０ｎＭ、および１μＭの逆方向プライマータグを含む、１０μｌの反応ボリュームを用いる。サーモサイクル用パラメータは、９５℃で１０分間と、９５℃で３０秒間、６５℃で１分間、６０℃で５分間、６５℃で５分間及び７２℃で３０秒間を１５サイクルと、その後７２℃で２分間とを含み、その後４℃で保持する。アニーリング温度は、本明細書で述べているように、任意に、プライマーの一部又はプライマーの全ての融点より高くすることが可能である（その全体を参照することによって本明細書に組み入れるものとする２０１５年１０月２０日出願の米国特許出願第１４／９１８，５４４号を参照）。
融点（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）のＤＮＡ二本鎖の半分（５０％）と、その完全な相補鎖が解離して、一本鎖ＤＮＡになる温度である。アニーリング温度（ＴＡ）は、ＰＣＲプロトコールが実行される温度である。従来の方法では、用いるプライマーの最低Ｔｍよりも通常５℃低いものであり、これにより可能性のある全ての二重鎖がほとんど形成される（本質的に全てのプライマー分子がテンプレート核酸と結合するように）。これは高効率であるが、低温では、より非特異的な反応となることが必至である。ＴＡが低過ぎることによるひとつの結果として、内部での一塩基の不一致又は部分的なアニーリングが許容されることがあるため、プライマーが、真の標的以外の配列に対してアニールされ得ることがある。本発明の一部の実施形態においては、ＴＡはＴｍよりも高く、ある瞬間で標的のごく一部のみが、プライマーをアニーリングする（例えば、約１～５％のみ）。これらが伸長すれば、それらがプライマー及び標的のアニーリング及び解離の平衡状態から脱し（伸長でＴｍが直ぐに７０℃を超えるまでに上昇するため）、標的のうち新たな約１～５％がプライマーを有する。これにより、反応を長時間のアニーリングとすることにより、１サイクル当たり約１００％のコピーされた標的を得ることが可能である。
種々の実施形態においては、アニーリング温度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３℃から、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１５℃の間であり、少なくとも２５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９５又は１００％の不一致のプライマーの融点（経験的に測定又は計算したＴｍ等）よりも高いものである。様々な実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以下、１℃以上～５℃以下、１℃以上～３℃以下、３℃以上～５℃以下、５℃以上～１０℃以下、５℃以上～８℃以下、８℃以上～１０℃以下、１０℃以上～１２℃以下、または１２℃以上～１５℃以下）高い。種々の実施形態においては、アニーリング温度は、１から１５℃の間（１から１０、１から５、１から３、３から５、３から８、５から１０、５から８、８から１０、１０から１２又は１２から１５℃の間等（両端の値を含める））であり、不一致のプライマーのうち少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％の融点（経験的に測定又は計算したＴｍ等）か又は不一致のプライマーの全ての融点（経験的に測定又は計算したＴｍ等）よりも高いものであり、アニーリングステップの長さ（１ＰＣＲサイクル当たり）は、５から１８０分の間であり、１５から１２０分、１５から６０分、１５から４５分又は２０から６０分の間等（両端の値を含める）である。
例示的なマルチプレックスＰＣＲ法
種々の実施形態においては、長いアニーリング時間（本明細書で述べるとおりであり実施例１２に例示する）及び／又は低プライマー濃度を用いる。実際には、或る実施形態においては、制限したプライマーの濃度及び／又は条件を用いる。種々の実施形態においては、アニーリングステップの長さは、範囲の下限で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は６０分から、範囲の上限で２０、２５、３０、３５、４０、４５、６０、１２０又は１８０分の間である。種々の実施形態においては、アニーリングステップの長さ（１ＰＣＲサイクル当たり）は３０から１８０分の間である。例えば、アニーリングステップを３０から６０分の間とすることが可能であり、各プライマーの濃度を２０、１５、１０又は５ｎＭ未満とすることが可能である。他の実施形態においては、プライマー濃度は、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５ｎＭから、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５及び５０である。
高濃度の多重化においては、溶液中の大量のプライマーが原因で、溶液が粘稠となり得る。溶液が粘稠過ぎる場合は、プライマーがテンプレートＤＮＡに結合するのにそれでも十分な量までプライマー濃度を減少させることが可能である。種々の実施形態においては、１，０００から１００，０００の様々なプライマーを用いて、各プライマーの濃度を２０ｎＭ未満とし、例えば１０ｎＭ未満、又は１から１０ｎＭの間（両端の値を含める）等とする。
５．４ 例示的なマルチプレックスＰＣＲ法
一つの態様では、本発明は、（ｉ）核酸サンプルを、少なくとも１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；１５，０００；１９，０００；２０，０００；２５，０００；２７，０００；２８，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；７５，０００；または１００，０００個の様々な標的座位に同時にハイブリダイズするプライマーライブラリーと接触させ、反応混合物を生成すること、および（ｉｉ）当該反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件など）におき、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成すること、を含む、核酸サンプル中の標的座位を増幅させ宇方法を特徴とする。一部の実施形態において、本方法はまた、少なくとも一つの標的アンプリコン（例えば、標的アンプリコンの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％）の有無を決定することを含む。一部の実施形態において、本方法はまた、少なくとも一つの標的アンプリコン（例えば、標的アンプリコンの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％）の配列を決定することを含む。一部の実施形態では、標的座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％が増幅される。一部の実施形態では、少なくとも２５；５０；７５；１００；３００；５００；７５０；１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；１５，０００；１９，０００；２０，０００；２５，０００；２７，０００；２８，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；７５，０００；または１００，０００個の異なる標的座位が、少なくとも５、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、または４００倍に増幅される。一部の実施形態では、標的座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、または１００％が、少なくとも５、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１５０、２００、３００、または４００倍に増幅される。様々な実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、または０．０５％未満が、プライマー二量体である。一部の実施形態では、方法は、マルチプレックスＰＣＲとシーケンス（例えば、ハイスループットシーケンス）を伴う。
種々の実施形態では、長時間のアニーリングおよび／または低濃度のプライマーが使用される。様々な実施形態では、アニーリング工程の長さは、３分、５分、８分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１２０分、１５０分、または１８０分よりも長い。種々の実施形態では、（１ＰＣＲサイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、例えば、５分以上～６０分以下、１０分以上～６０分以下、５分以上～３０分以下、または１０分以上～３０分以下など、５分以上～１８０分以下である。様々な実施形態では、アニーリング工程の長さは、５分より長く（例えば、１０分または１５分より長い）、各プライマーの濃度は、２０ｎＭ未満である。様々な実施形態では、アニーリング工程の長さは、５分より長く（例えば、１０分または１５分より長い）、各プライマーの濃度は、１ｎＭ以上～２０ｎＭ以下、または１ｎＭ以上～１０ｎＭ以下である。様々な実施形態では、アニーリング工程の長さは、２０分より長く（例えば、３０分、４５分、６０分または９０分より長い）、各プライマーの濃度は、１ｎＭ未満である。
高濃度の多重化においては、溶液中の大量のプライマーが原因で、溶液が粘稠となり得る。溶液が粘稠過ぎる場合は、プライマーがテンプレートＤＮＡに結合するのにそれでも十分な量までプライマー濃度を減少させることが可能である。様々な実施形態では、６０，０００個未満の様々なプライマーが使用され、各プライマーの濃度は、例えば１０ｎＭ未満、または１ｎＭ以上～１０ｎＭ以下など、２０ｎＭ未満である。様々な実施形態では、６０，０００個超の様々なプライマー（例えば、６０，０００～１２０，０００個の様々なプライマー）が使用され、各プライマーの濃度は、例えば５ｎＭ未満、または１ｎＭ以上～１０ｎＭ以下など、１０ｎＭ未満である。
アニーリング温度は、任意でプライマーの一部または全ての融点よりも高くなり得ることが見出された（対照的に、他の方法はプライマーの融点よりも低いアニーリング温度を使用する）。融点（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）のＤＮＡ二本鎖の半分（５０％）と、その完全な相補鎖が解離して、一本鎖ＤＮＡになる温度である。アニーリング温度（ＴＡ）は、ＰＣＲプロトコールが実行される温度である。従来の方法では使用されるプライマーの最も低いＴｍよりも通常、５℃低い温度であり、そのため可能性のあるほぼ全ての二本鎖が形成されていた（本質的に全てのプライマー分子が鋳型核酸に結合するため）。これは高効率であるが、低温では、より非特異的な反応となることが必至である。ＴＡが低過ぎることによるひとつの結果として、内部での一塩基の不一致又は部分的なアニーリングが許容されることがあるため、プライマーが、真の標的以外の配列に対してアニールされ得ることがある。本発明の一部の実施形態では、ＴＡは（Ｔｍ）よりも 高く、ある瞬間で標的のごく一部のみがプライマーをアニーリングする（例えば、約１～５％のみ）。これらが伸長すれば、それらがプライマーと標的のアニーリングおよび解離の平衡状態から脱し（伸長でＴｍが直ぐに７０℃を超えるまでに上昇するため）、標的のうち新たな約１～５％がプライマーを有する。これにより、反応を長時間のアニーリングとすることにより、１サイクル当たり約１００％のコピーされた標的を得ることが可能である。したがって最も安定した分子対（プライマーと鋳型ＤＮＡの完全なＤＮＡ対を伴う分子対）が優先的に伸長され、正しい標的アンプリコンが生成される。例えば、６３℃未満の融点を有するプライマーを用いて、アニーリング温度として５７℃、およびアニーリング温度として６３℃で同じ実験が行われた。アニーリング温度が５７℃であったとき、増幅されたＰＣＲ産物のマッピングされたリードの割合は５０％と低かった（増幅された産物の約５０％がプライマー二量体であった）。アニーリング温度が６３℃であったとき、増幅産物のプライマー二量体の割合は約２％に低下した。
様々な実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高い。一部の実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、そして（ＰＣＲサイクル１回あたりの）アニーリング工程の長さは、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、または１８０分よりも長い。
様々な実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以下、１℃以上～５℃以下、１℃以上～３℃以下、３℃以上～５℃以下、５℃以上～１０℃以下、５℃以上～８℃以下、８℃以上～１０℃以下、１０℃以上～１２℃以下、または１２℃以上～１５℃以下）高い。様々な実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての融点（例えば、実験的に測定された、または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以下、１℃以上～５℃以下、１℃以上～３℃以下、３℃以上～５℃以下、５℃以上～１０℃以下、５℃以上～８℃以下、８℃以上～１０℃以下、１０℃以上～１２℃以下、または１２℃以上～１５℃以下）高く、（ＰＣＲ１サイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、例えば、５分以上～６０分以内、１０分以上～６０分以内、５分以上～３０分以内、または１０分以上～３０分以内など、５分以上～１８０分以内である。
一部の実施形態では、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、実験的に測定または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１５℃高い。一部の実施形態において、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、実験的に測定された、または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、そして（ＰＣＲサイクル１回あたりの）アニーリング工程の長さは、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、または１８０分よりも長い。
一部の実施形態では、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、実験的に測定または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以内、１℃以上～５℃以内、１℃以上～３℃以内、３℃以上～５℃以内、５℃以上～１０℃以内、５℃以上～８℃以内、８℃以上～１０℃以内、１０℃以上～１２℃以内または１２℃以上～１５℃以内）高い。一部の実施形態では、アニーリング温度は、プライマーの最も高い融点（例えば、実験的に測定または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以内、１℃以上～５℃以内、１℃以上～３℃以内、３℃以上～５℃以内、５℃以上～１０℃以内、５℃以上～８℃以内、８℃以上～１０℃以内、１０℃以上～１２℃以内または１２℃以上～１５℃以内）高く、（ＰＣＲ１サイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、例えば、５分以上～６０分以内、１０分以上～６０分以内、５分以上～３０分以内、または１０分以上～３０分以内など、５分以上～１８０分以内である。
一部の実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての平均融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高い。一部の実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての平均融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１５℃高く、そして（ＰＣＲサイクル１回あたりの）アニーリング工程の長さは、１、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、または１８０分よりも長い。
一部の実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての平均融点（例えば、実験により測定された、または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以下、１℃以上～５℃以下、１℃以上～３℃以下、３℃以上～５℃以下、５℃以上～１０℃以下、５℃以上～８℃以下、８℃以上～１０℃以下、１０℃以上～１２℃以下、または１２℃以上～１５℃以下）高い。一部の実施形態において、アニーリング温度は、同一ではないプライマーのうちの少なくとも２５、５０、７５、１００、３００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、２７，０００、２８，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００個、またはすべての平均融点（例えば、実験的に測定された、または計算されたＴｍ）よりも１～１５℃（例えば、１℃以上～１０℃以下、１℃以上～５℃以下、１℃以上～３℃以下、３℃以上～５℃以下、５℃以上～１０℃以下、５℃以上～８℃以下、８℃以上～１０℃以下、１０℃以上～１２℃以下、または１２℃以上～１５℃以下）高く、（ＰＣＲ１サイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、例えば、５分以上～６０分以内、１０分以上～６０分以内、５分以上～３０分以内、または１０分以上～３０分以内など、５分以上～１８０分以内である。
一部の実施形態において、アニーリング温度は、５０℃以上～７０℃以内、例えば５５℃以上～６０℃以内、６０℃以上～６５℃以内、または６５℃以上～７０℃以内である。一部の実施形態では、アニーリング温度は、５０℃以上～７０℃以内、例えば５５℃以上～６０℃以内、６０℃以上～６５℃以内、または６５℃以上～７０℃以内であり、そして（ｉ）（ＰＣＲ１サイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０または１８０分よりも長いか、または（ｉｉ）（ＰＣＲ１サイクル当たりの）アニーリング工程の長さは、例えば、５分以上～６０分以内、１０分以上～６０分以内、５分以上～３０分以内、または１０分以上～３０分以内など、５分以上～１８０分以内であるかのいずれかである。
一部の実施形態では、以下の条件のうちの一つ以上が、Ｔｍの実験的測定に使用されるか、または仮定されてＴｍが計算される：温度は６０．０℃、プライマー濃度は１００ｎＭ、および／または塩濃度は１００ｍＭ。一部の実施形態では、ライブラリーを用いたマルチプレックスＰＣＲに使用される条件など、他の条件が使用される。一部の実施形態では、１００ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、格プライマーが７．５ｎＭ、および５０ｍＭ ＴＭＡＣ、ｐＨ８．１が使用される。一部の実施形態では、Ｔｍは、内臓ＳａｎｔａＬｕｃｉａパラメータ（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔのワールドワイドウェブ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３、リリース２．２．３）を使用して計算される。一部の実施形態では、計算されたプライマー融点は、プライマー分子の半分がアニーリングされると予想される温度である。上述のように、計算された融点よりも高い温度であっても、一定の割合のプライマーがアニーリングされ、それに従いＰＣＲ伸長も可能となる。一部の実施形態では、実験的に測定されたＴｍ（実際のＴｍ）は、ＵＶ分光光度計においてサーモスタット制御されたセルを使用することにより決定される。一部の実施形態では、温度を吸光度に対してプロットすることにより、２つのプラトーを伴うＳ字型曲線が生成される。プラトー間の中間の吸光度の値が、Ｔｍに相当する。
一部の実施形態では、ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ２１００ ｐｒ ＵＶ／可視光分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）での２６０ｎｍでの吸光度が、温度の関数として測定される（例えば、Ｔａｋｉｙａ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（Ｔｍ）ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＮＡ／ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ（Ｏｘｆ）；（４８）：１３１－２，２００４を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に援用される）。一部の実施形態では、２６０ｎｍでの吸光度は、毎分２℃のペースで９５℃から２０℃まで温度を低下させることにより測定される。一部の実施形態では、プライマーおよびその完全な相補鎖（例えば、２μＭの各ペアのオリゴマー）が混合され、次いで３０分の間にサンプルを９５℃に加熱して５分間その温度を維持し、その後室温まで冷却して、９５℃で少なくとも６０分間サンプルを維持することによりアニーリングが行われる。一部の実施形態では、融点は、ＳＷＩＦＴ Ｔｍソフトウェアを使用してデータを分析することによって決定される。本発明方法のいずれかの一部の実施形態では、当該方法は、プライマーが標的座位のＰＣＲ増幅に使用される前または後のいずれかに、ライブラリー中のプライマーの少なくとも５０、８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９、または１００％の融点を実験的に測定または計算（コンピューターで計算）することを含む。
一部の実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイを含まない。
一部の実施形態では、プライマーの大部分または全てが伸長されて、増幅産物を形成する。ＰＣＲ反応において全てのプライマーが消費された場合、同数またはほぼ同数のプライマー分子が各標的座位の標的アンプリコンへと転換されるため、様々な標的座位の増幅の均一性が増加する。一部の実施形態では、プライマー分子の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９、または１００％が伸長されて、増幅産物を形成する。一部の実施形態では、標的座位の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９、または１００％に関し、その標的座位に対するプライマー分子の少なくとも８０、９０、９２、９４、９６、９８、９９、または１００％が伸長されて、増幅産物を形成する。一部の実施形態では、当該割合のプライマーが消費されるまで、複数のサイクルが実施される。一部の実施形態では、全て、または実質的に全てのプライマーが消費されるまで、複数のサイクルが実施される。所望の場合、初期プライマー濃度を低下させる、および／または実施されるＰＣＲサイクル数を増加させることにより、高割合のプライマーが消費され得る。
一部の実施形態では、ＰＣＲ法は、マイクロリットル単位の反応ボリュームで実施されてもよいが、マイクロ流体アプリケーションで使用されるナノリットル単位またはピコリットル単位の反応ボリュームと比較して、（鋳型核酸の局所濃度が低いため）特異的なＰＣＲ増幅の実施が困難となる可能性がある。一部の実施形態では、反応ボリュームは、１Ｌ以上～６０Ｌ以下、例えば、５Ｌ以上～５０Ｌ以下、１０Ｌ以上～５０Ｌ以下、１０Ｌ以上～２０Ｌ以下、２０Ｌ以上～３０Ｌ以下、３０Ｌ以上～４０Ｌ以下、または４０Ｌ以上～５０Ｌ以下である。
一つの実施形態では、本明細書に開示される方法は、高効率の高度に多重化された標的化ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅し、続いてハイスループットシーケンスを行って各標的座位におけるアレル頻度が決定される。得られたシーケンスリードの大部分が標的座位にマッピングされるように、一つの反応ボリュームにおいて約５０または１００個を超えるＰＣＲプライマーを多重化する能力は新規であり、自明ではない。高度に多重化された標的ＰＣＲを非常に効率的な様式で実施することが可能な技術の一つは、互いにハイブリダイズする可能性が低いプライマーを設計することである。典型的にはプライマーと呼称されるＰＣＲプローブは、少なくとも３００個；少なくとも５００個；少なくとも７５０個；少なくとも１，０００個；少なくとも２，０００個；少なくとも５，０００個；少なくとも７，５００個；少なくとも１０，０００個；少なくとも２０，０００個；少なくとも２５，０００個；少なくとも３０，０００個；少なくとも４０，０００個；少なくとも５０，０００個；少なくとも７５，０００；または少なくとも１００，０００個の可能性のあるプライマー対の間の有害な可能性のある相互作用、またはプライマーとサンプルＤＮＡの間の意図されない相互作用に関する熱力学的モデルを生成し、次いで当該モデルを使用して、プール中の他の設計との適合性がない設計を除外することにより選択される。高度に多重化された標的化ＰＣＲを非常に効率的な様式で実施することが可能な別の方法は、標的化ＰＣＲに対する部分的または完全な入れ子型法を使用することである。これら方法のうちの一つまたは組み合わせを使用することで、一つのプール中の少なくとも３００個、少なくとも８００、少なくとも１，２００、少なくとも４，０００、または少なくとも１０，０００個のプライマーの多重化が可能となり、得られる増幅ＤＮＡは、シーケンスされたときに標的座位にマッピングされるＤＮＡ分子が大部分である。これら方法のうちの一つまたは組み合わせを使用することで、一つのプール中の大多数のプライマーの多重化が可能となり、得られる増幅ＤＮＡは、標的座位にマッピングされるＤＮＡ分子が、５０％超、６０％超、６７％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、または９９．５％超である。
一部の実施形態では、標的遺伝物質の検出は、多重化された様式で行われてもよい。並行して行われ得る標的遺伝子配列の数は、１～１０個、１０～１００個、１００～１０００個、１０００～１万個、１万～１０万個、１０万～１００万個、または１００万～１０００万個の範囲であり得る。１プール当たり１００個を超えるプライマーを多重化しようする試みた結果、例えばプライマー二量体が形成されるなどの望ましくない副反応といった重大な問題が生じた。
５．５ 標的化ＰＣＲ
一部の実施形態では、ＰＣＲを使用して、ゲノムの特定の位置を標的とすることができる。血漿サンプルでは、オリジナルのＤＮＡは高度に断片化されている（典型的には５００ｂｐ未満、平均の長さは２００ｂｐ未満）。ＰＣＲでは、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方が同じ断片にアニーリングして増幅することが可能である。したがって断片が短い場合、ＰＣＲアッセイは比較的短い領域でも増幅するはずである。ＭＩＰＳのように、多型の位置がポリメラーゼ結合部位に近すぎる場合、様々なアレルからの増幅においてバイアスが生じる可能性がある。現在、例えばＳＮＰを含有するなどの多型領域を標的とするＰＣＲプライマーは、典型的にはプライマーの３’末端が多型塩基に直接隣接する塩基にハイブリダイズするように設計される。本開示の実施形態では、フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの両方の３’末端が、標的アレルのバリアント位置（多型部位）から一つまたはいくつか離れた位置の塩基にハイブリダイズするように設計される。多型部位（ＳＮＰまたは別の多型）とプライマーの３’末端がハイブリダイズするように設計される塩基の間の塩基数は、１塩基であってもよく、２塩基であってもよく、３塩基であってもよく、４塩基であってもよく、５塩基であってもよく、６塩基であってもよく、７～１０塩基であってもよく、１１～１５塩基であってもよく、または１６～２０塩基であってもよい。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、多型部位から様々な塩基数で離れてハイブリダイズするよう設計されてもよい。
ＰＣＲアッセイは多数行うことができるが、異なるＰＣＲアッセイの間の相互作用により、アッセイは約１００個を超えて多重化することは困難である。様々な複雑な分子的アプローチを使用して、多重化のレベルを増加させることができるが、それでも１反応当たり１００個、おそらくは２００個、または場合により５００個未満のアッセイ数に限定されている。大量のＤＮＡを含むサンプルは、複数のサブ反応に分割され、次いでシーケンス前に再度混合される。サンプル全体またはＤＮＡ分子の一部の亜集団のいずれかが限定されているサンプルについては、サンプルを分割することで統計的なノイズを生じさせることになる。一つの実施形態では、少数または限定された量のＤＮＡとは、１０ｐｇ未満、１０～１００ｐｇ、１００ｐｇ～１ｎｇ、１～１０ｎｇ、または１０～１００ｎｇの量を指す場合がある。他の方法が複数プールへの分割を含み、それにより生じた確率的ノイズに関連して重大な問題が生じる可能性がある少量のＤＮＡの場合には当該方法は特に有用であり、さらに当該方法は任意のＤＮＡ量のサンプルに対して実行された場合にバイアスを最小化するという利点も提供することに留意されたい。これらの状況下では、全般的な前増幅工程を使用して、全体的なサンプル量を増加させてもよい。理想的には、この前増幅工程は、アレル分布を大きく変化させるべきではない。
一つの実施形態では、本開示方法は、多数の標的座位、具体的には１，０００～５，０００個の座位、５，０００～１０，０００個の座位、または１０，０００個を超える座位に特異的なＰＣＲ産物を生成させ、例えば一つの細胞または体液由来ＤＮＡなどの限定的なサンプルからシーケンス法または何らかの他の遺伝子型解析法により遺伝子型解析を行うことができる。現在、５～１０個を超える標的のマルチプレックスＰＣＲ反応の実施は大きな挑戦であり、例えばプライマー二量体や他のアーチファクトといったプライマーの副産物により妨げられることが多い。ハイブリダイゼーションプローブを用いたマイクロアレイを使用して標的配列を検出する場合、プライマー二量体や他のアーチファクトは検出されないため、無視してもよい。しかし検出方法としてシーケンスを使用する場合、シーケンスリードの大部分はサンプル中の所望の標的配列ではなく、そうしたアーチファクトをシーケンスしてしまう。一つの反応ボリュームにおいて、５０または１００を超える反応を多重化し、その後にシーケンスを行うために使用される先行技術の方法は多くの場合、２０％超、さらには５０％超、多くの場合には８０％超、および場合によっては９０％超のオフターゲットのシーケンスリードが生じる。
概してサンプルの複数（ｎ個）の標的（５０個超、１００個超、５００個超、または１，０００個超）の標的化シーケンスを実施するためには、サンプルを多数の並行反応へと分割し、個々の一つの標的を増幅してもよい。この方法はＰＣＲマルチウェルプレートで実施されており、または例えばＦＬＵＩＤＩＧＭ ＡＣＣＥＳＳ ＡＲＲＡＹ（マイクロ流体チップ中、１サンプル当たり４８反応）またはＲＡＩＮ ＤＡＮＣＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社によるＤＲＯＰＬＥＴ ＰＣＲ（数百～数千個の標的）などの市販プラットフォームで行うことができる。残念なことに、これらの分割およびプール法は、ＤＮＡの量が限定的なサンプルでは問題があり、各ウェルに１コピーの各ゲノム領域が確実に存在するようにするには、ゲノムコピー数が充分ではないことが多い。分割とプール化によって生じる確率的ノイズにより、元のＤＮＡサンプル中に存在したアレル割合に関して非常に不正確な測定結果が生じてしまうため、多型座位が標的とされる場合、および多型座位でのアレルの相対的割合が必要とされる場合には特に重大な問題である。本明細書において、限定的な量のＤＮＡのみが利用可能である場合に適用可能な、多数のＰＣＲ反応を効果的および効率的に増幅する方法が記載される。一つの実施形態では、方法は、一つの細胞、体液、例えば血漿、生検、環境および／または法医学サンプルに存在する遊離した浮遊ＤＮＡなどＤＮＡ混合物の分析に適用されてもよい。
一つの実施形態では、標的化シーケンスは、以下の工程のうちの一つ、複数、またはすべてを伴い得る：ａ）ＤＮＡ断片の両端にアダプター配列を有するライブラリーを生成および増幅する工程。ｂ）ライブラリー増幅後に複数の反応に分割する工程。ｃ）ＤＮＡ断片の両端にアダプター配列を有するライブラリーを生成し、任意で増幅する工程。ｄ）１標的当たり、一つの標的特異的な「フォワード」プライマーと、一つのタグ特異的プライマーを使用して、選択標的の１０００～１０，０００－多重化増幅回行う工程。ｅ）「リバース」の標的特異的プライマーと、第一ラウンドで標的特異的フォワードプライマーの一部として導入されたユニバーサルタグに特異的な一つ（または一つ以上）のプライマーを使用して、当該産物の２回目の増幅を行う工程。ｆ）選択標的の１０００－多重化前増幅を、限定された回数のサイクルで行う工程。ｇ）産物を複数のアリコートに分け、個々の反応（例えば、５０～５００－多重化であるが、一重化でも使用することができる）において標的のサブプールを増幅する工程。ｈ）並行サブプール反応の産物をプールする工程。ｉ）これら増幅の間、プライマーはシーケンス適合タグ（部分的または全長）を担持し、それにより産物がシーケンスされ得る工程。
５．６ 高度多重化ＰＣＲ
本明細書において、例えば血漿から得られたゲノムＤＮＡなどの核酸サンプルから数百～数万の標的配列（例えば、ＳＮＰ座位）の標的化増幅を可能とする方法が開示される。増幅されたサンプルは、プライマー二量体産物を比較的含み得ず、標的座位でのアレルバイアスが低い。増幅中または増幅後に産物にシーケンス適合アダプターが付加される場合、これらの産物の分析はシーケンスにより実施されることができる。
当分野で公知の方法を使用して高度に多重化されたＰＣＲ増幅を行っても、望みの増幅産物を上回る、シーケンスに適さないプライマー二量体産物が生成される。当該産物は、当該産物を形成するプライマーを除去することによって、またはプライマーのインシリコ選択を実施することによって、実験的に減少させることができる。しかしアッセイ数が多いほど、この問題はより困難になる。
一つの解決策は、５０００－多重化反応を、例えば、１００個の５０－多重化反応または５０個の１００－多重化反応といった、いくつかの低多重化増幅へと分けることであり、またはサンプルを個々のＰＣＲ反応に分けてしまうことである。しかし例えば妊娠血漿からの非侵襲的な出生前診断など、サンプルＤＮＡが限定的である場合には、複数反応にサンプルを分割することはボトルネックを生じさせ、避けるべきである。
本明細書において、最初にサンプルの血漿ＤＮＡを広範に増幅させ、その後、サンプルを、１反応あたりより中程度の数の標的配列を有する複数の多重化標的濃縮反応に分割する方法を記載する。一つの実施形態では、本開示方法は、複数の座位でＤＮＡ混合物を優先的に濃縮するために使用することができる。当該方法は、以下の工程のうちの一つ以上を含む：ＤＮＡ混合物からライブラリーを生成および増幅させる工程であって、ライブラリー中の分子はＤＮＡ断片の両末端にライゲートされたアダプター配列を有する工程、当該増幅されたライブラリーを複数の反応に分割する工程、一つの標的当たり一つ以上の標的特異的「フォワード」プライマーと、一つ以上のアダプター特異的ユニバーサル「リバース」プライマーを使用して、選択標的の多重化増幅の第一ラウンドを実施する工程。一つの実施形態では、本開示の方法は、「リバース」の標的特異的プライマーと、当該第一ラウンドにおける標的特異的フォワードプライマーの一部として導入されたユニバーサルタグに特異的な一つ以上のプライマーを使用して、第二の増幅を実施することをさらに含む。一つの実施形態では、当該方法は、完全入れ子型、ヘミ入れ子型、セミ入れ子型、片側完全入れ子型、片側ヘミ入れ子型、または片側セミ入れ子型のＰＣＲ法を伴ってもよい。一つの実施形態では、本開示の方法は、複数の座位でＤＮＡ混合物を優先的に濃縮するために使用され、当該方法は、選択された標的の多重化前増幅を限定された回数のサイクルで増幅すること、産物を複数のアリコートに分割すること、および個々の反応中の標的のサブプールを増幅すること、および並行サブプール反応の産物をプールすることを含む。この方法を使用して、５０～５００座位、５００～５，０００座位、５，０００～５０，０００座位、またはさらには５０，０００～５００，０００座位に対して、低レベルのアレルバイアスとなるよう標的化増幅が実施され得ることに留意されたい。一つの実施形態では、プライマーは、部分的または全長のシーケンス適合タグを担持する。
ワークフローは、（１）例えば、血漿ＤＮＡなどのＤＮＡを抽出すること、（２）断片の両末端にユニバーサルアダプターを有する断片ライブラリーを調製すること、（３）当該アダプターに特異的なユニバーサルプライマーを使用してライブラリーを増幅させること、（４）増幅されたサンプル「ライブラリー」と複数のアリコートに分割すること、（５）アリコートに対して、多重化（例えば、標的一つ当たり一つの標的特異的プライマー、およびタグ特異的プライマーで、約１００－多重化、１，０００または１０，０００－多重化）を実施すること、（６）１サンプルのアリコートをプールすること、（７）サンプルをバーコード化すること、（８）サンプルを混合し、濃度を調整すること、（９）サンプルをシーケンスすること、を伴ってもよい。ワークフローは、複数のサブ工程を含んでもよく、サブ工程は、列記される工程のうちの一つを含む（例えば、ライブラリー調製の工程（２）は、三つの酵素工程（平滑末端、ｄＡテーリング、およびアダプターライゲーション）と三つの精製工程を伴い得る）。ワークフローの工程はまとめられてもよく、分割されてもよく、または異なる順序で実施されてもよい（例えば、サンプルのバーコード化およびプール化）。
ライブラリー増幅は、短い断片がより効率的に増幅されるよう、偏りが生じるような方法で実施され得ることに留意されたい。このようにして、例えば妊娠女性の循環中に存在するセルフリー胎児ＤＮＡ（胎盤起源）のようなモノヌクレオソームＤＮＡ断片などの短い配列を優先的に増幅させることが可能となる。ＰＣＲアッセイは、例えばシーケンスタグ（通常、１５～２５塩基の短縮型）などのタグを有し得ることに留意されたい。多重化を行った後、サンプルのＰＣＲ多重化物をプールし、次いでタグ化は、タグ特異的ＰＣＲ（ライゲーションによって行うこともできる）によって完了する（バーコード化を含む）。さらに全長シーケンスタグを、多重化と同じ反応で加えることもできる。最初のサイクルで標的特異的プライマーを用いて標的を増幅してもよく、次いでタグ特異的プライマーに継続してＳＱアダプターシーケンスが完了する。ＰＣＲプライマーはタグを担持しなくてもよい。シーケンスタグは、ライゲーションによって増幅産物に付加されてもよい。
一つの実施形態では、高度なマルチプレックスＰＣＲに続いてクローナルシーケンスを行って増幅産物を評価することにより、例えば胎児異数性の検出などの様々なアプリケーションが行われてもよい。従来的なマルチプレックスＰＣＲは同時に最大で５０個の座位を評価する。一方で本明細書に記載される方法を使用することで、同時に５０個を超える座位、同時に１００個を超える座位、同時に５００個を超える座位、同時に１，０００個を超える座位、同時に５，０００個を超える座位、同時に１０，０００個を超える座位、同時に５０，０００個を超える座位、同時に１００，０００個を超える座位の同時評価が可能となり得る。実験により最大で１０，０００個、および１０，０００個以上の別個の座位を一つの反応で同時に評価し得ること、高い正確性で非侵襲的な出生前異数性診断および／またはコピー数判定を行うために充分に良好な効率および特異性であり得ることが示されている。アッセイは、例えば血漿から単離されたｃｆＤＮＡサンプルなどのサンプル全体、その画分、またはさらに処理されたｃｆＤＮＡの派生物を用いて一つの反応で組み合わされてもよい。サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたは派生物）は、複数の並行多重化反応に分割されてもよい。最適なサンプル分割および多重化は、様々な性能仕様をトレードオフすることにより決定される。物質の量が限られているため、サンプルを複数の画分に分割すると、サンプリングノイズが生じ、処理のための時間が必要となり、誤差の可能性が増大する可能性がある。反対に高度な多重化であるほど、偽増幅の量が多くなり、増幅の不均衡も大きくなる。それら両方ともが検査性能を低下させる可能性がある。
本明細書に記載される方法のアプリケーションにおいて、元のサンプル（例えば血漿）の量が限定的であること、およびアレル頻度または他の測定項目を取得する物質中の元の分子数が限定的であること、の二つの重要な関連懸念事項がある。元の分子の数が特定のレベルを下回ると、ランダムサンプリングノイズが顕著となり、試験の精度に影響を与える可能性がある。典型的には、標的座位一つ当たり５００－１０００個に相当する元の分子を含むサンプルに対して測定が行われる場合には、非侵襲的な出生前異数性診断を行うために充分な品質のデータを取得することができる。例えば、サンプル量を増加させるなど、別個の測定回数を増加させる方法も多く存在する。サンプルに行われる各操作も、物質の喪失をもたらす可能性がある。様々な操作によって生じた喪失を特徴解析して回避するか、または必要に応じて特定の操作の収率を改善して、検査性能を低下させる可能性のある喪失を回避することが不可欠である。
一つの実施形態では、元のサンプル（例えば、ｃｆＤＮＡサンプル）のすべて、または画分を増幅させることにより、その後の工程における喪失の可能性を軽減させることが可能である。サンプル中の遺伝物質の全てを増幅させ、下流の手順で利用可能な量を増加させるための様々な方法が利用可能である。一つの実施形態では、ライゲーション介在性ＰＣＲ（ＬＭ－ＰＣＲ：ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ）のＤＮＡ断片は、一つの別個のアダプター、二つの別個のアダプター、または多くの別個のアダプターのいずれかのライゲーションを行った後にＰＣＲによって増幅される。一つの実施形態では、多重置換増幅（ＭＤＡ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のｐｈｉ－２９ポリメラーゼを使用して、全てのＤＮＡが等温で増幅される。ＤＯＰ－ＰＣＲおよびその変形版では、ランダムプライミングを使用して、元の材料ＤＮＡを増幅する。各方法は、例えば、ゲノムのすべての表出領域にわたる増幅の均一性、元のＤＮＡの捕捉と増幅の効率、および断片長の関数としての増幅性能などの特徴を有する。
一つの実施形態では、ＬＭ－ＰＣＲは、３－プライムチロシンを有する一つのヘテロ二本鎖アダプターと共に使用されてもよい。ヘテロ二本鎖アダプターは、一つのアダプター分子の使用を可能とし、当該分子は、ＰＣＲの第一ラウンド中に元のＤＮＡ断片の５プライム末端と３プライム末端上の二つの異なる配列へと変換され得る。一つの実施形態では、増幅されたライブラリーを、サイズ分離、またはＡＭＰＵＲＥ、ＴＡＳＳなどの産物により、または他の類似の方法によって分割することが可能である。ライゲーションの前に、サンプルＤＮＡは平滑末端化されてもよく、次いで一つのアデノシン塩基が３－プライム末端に付加される。ライゲーションの前に、制限酵素または何らかの他の切断方法を使用してＤＮＡが切断されてもよい。ライゲーションの間に、サンプル断片の３－プライムアデノシンと、アダプターの相補的３－プライムチロシンオーバーハングによって、ライゲーション効率が高められる。ＰＣＲ増幅の伸長工程は、時間的見地から、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、または約１，０００ｂｐより長い断片からの増幅を減少させるよう、制限されてもよい。市販のキットによって指定される条件を使用して多数の反応を実行した。その結果、サンプルＤＮＡ分子の１０％未満が、ライゲーションに成功した。これに対する反応条件の一連の最適化によって、ライゲーションはおよそ７０％まで改善された。
一つの実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも１０００個の標的座位の高効率で高度に多重化された標的化ＰＣＲを行い、次いで次世代シーケンスを行って遺伝子型データを取得する。一部の実施形態では、多重化された標的化ＰＣＲは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、または５００００個の標的座位に実施される。一つの実施形態では、多重化された標的化ＰＣＲは、１３０００個の標的座位に実施される。一部の実施形態では、標的座位は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。
５．７ ミニＰＣＲ
以下のミニＰＣＲ法は、例えばｃｆＤＮＡなど、短い核酸、消化核酸、または断片化核酸を含有するサンプルに望ましい。従来のＰＣＲアッセイの設計は、明確な胎児分子の著しい喪失を生じさせるが、ミニＰＣＲアッセイと呼ばれる非常に短いＰＣＲアッセイを設計することにより喪失を大幅に低下させることができる。母体血清中の胎児ｃｆＤＮＡは高度に断片化され、断片サイズは、平均１６０ｂｐ、標準偏差１５ｂｐ、最小サイズは約１００ｂｐ、および最大サイズは約２２０ｂｐで、およそガウス型で分布する。標的とされる多型に関し、断片の開始位置および終了位置の分布は必ずしもランダムではないが、個々の標的の間で、およびすべての標的の間で集合的に大きく異なっており、一つの特定の標的座位の多型部位は、その座位に由来する様々な断片の間で、開始位置から終了位置までの任意の位置を占め得る。ミニＰＣＲという用語は、追加の制限または限定なく、通常のＰＣＲを等しく指す場合もあることに留意されたい。
ＰＣＲを行う間、増幅は、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位の両方を含む鋳型ＤＮＡ断片からのみ発生する。胎児ｃｆＤＮＡ断片は短いため、両方のプライマー部位が存在する尤度は、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位の両方を含む長さＬの胎児断片の尤度であり、アンプリコンの長さと断片の長さの比である。理想的な条件下では、アンプリコンが、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｂｐであるアッセイは、利用可能な鋳型断片分子のそれぞれ７２％、６９％、６６％、６３％、５９％、または５６％からの増幅に成功する。アンプリコンの長さは、フォワードのプライミング部位とリバースのプライミング部位の５－プライム末端の間の距離である。当業者により典型的に使用されるよりも短いアンプリコン長は、短いシーケンスリードのみを必要とすることによって、より効率的な所望の多型座位の測定をもたらし得る。一つの実施形態では、アンプリコンのかなりの割合が、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、または４５ｂｐ未満であるものとする。
先行技術の方法において、例えば本明細書に記載のものなどの短いアッセイは通常回避される。その理由は、必要ではないこと、ならびにプライマーの長さ、アニーリング特性、およびフォワードプライマーとリバースプライマーの間の距離が限定されることにより、プライマー設計にかなりの制約が課されるためである。
また、いずれかのプライマーの３－プライム末端が多型部位のおよそ１～６塩基内にある場合、偏って増幅される可能性があることにも留意されたい。初期ポリメラーゼ結合部位におけるこの一塩基の差は、一つのアレルの優先的な増幅を生じさせる可能性があり、そのためアレル頻度の実測値が変化し、性能が低下される可能性がある。これらの制約の全てが、特定の座位の増幅に成功するプライマーの特定を非常に困難にし、さらには同じ多重化反応での適合性を有する巨大プライマーセットの設計も困難にする。一つの実施形態では、内側フォワードプライマーおよびリバースプライマーの３’末端は、多型部位から上流のＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数の塩基によって多型部位から分離される。理想的には、塩基の数は、６～１０塩基であってもよいが、４～１５塩基、３～２０塩基、２～３０塩基、または１～６０塩基であってもよく、実質的に同じ結果を達成し得る。
マルチプレックスＰＣＲは、すべての標的が増幅される一ラウンドのＰＣＲを伴う場合もあれば、一ラウンドのＰＣＲを行い、続いて一ラウンド以上の入れ子型ＰＣＲまたは何らかの変形版の入れ子型ＰＣＲが伴う場合もある。入れ子型ＰＣＲは、前のラウンドで使用されたプライマーに対して少なくとも１塩基対、内側に結合する一つ以上の新たなプライマーを使用した後続ラウンドのＰＣＲ増幅からなる。入れ子型ＰＣＲは、後続反応において正しい内部配列を有する従前の増幅からの増幅産物のみを増幅することによって、偽増幅標的の数を減少させる。偽増幅標的の減少は、特にシーケンスにおいて、取得可能な有用測定数を改善する。入れ子型ＰＣＲは典型的には、前のプライマー結合部位に対して完全に内部でプライマーを設計することを伴い、増幅に必要な最小ＤＮＡセグメントサイズを必然的に増加させる。ＤＮＡが高度に断片化されている例えば血漿ｃｆＤＮＡなどのサンプルについては、アッセイサイズが大きくなるにつれ、測定値を取得することができる個別のｃｆＤＮＡ分子の数が減少する。一つの実施形態では、この効果を相殺するために、第二ラウンドのプライマーの一方または両方が第一の結合部位と重複して数塩基、内側に伸長され、さらに特異的となる一方で、アッセイの合計サイズは最小限に増加する部分的入れ子型法を使用してもよい。
一つの実施形態では、ＰＣＲアッセイの多重化プールは、一つ以上の染色体の潜在的なヘテロ接合性のＳＮＰまたは他の多型座位もしくは非多型座位を増幅するように設計され、これらアッセイは一つの反応で使用されて、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイの数は、５０～２００ＰＣＲアッセイ、２００～１，０００ＰＣＲアッセイ、１，０００～５，０００ＰＣＲアッセイ、または５，０００～２０，０００ＰＣＲアッセイ（それぞれ５０～２００－多重化、２００～１，０００－多重化、１，０００～５，０００－多重化、５，０００～２０，０００－多重化、２０，０００超－多重化）であってもよい。一つの実施形態では、約１０，０００ＰＣＲアッセイ（１０，０００－多重化）の多重化プールは、Ｘ染色体、Ｙ染色体、第１３染色体、第１８染色体、および第２１染色体、および第１または第２染色体の潜在的なヘテロ接合性ＳＮＰ座位を増幅するように設計され、これらのアッセイは一つの反応で使用され、母体血漿、絨毛膜の絨毛サンプル、羊水穿刺サンプル、一つもしくは少数の細胞、他の体液もしくは組織、癌、または他の遺伝物質から取得されたｃｆＤＮＡを増幅する。各座位のＳＮＰ頻度は、クローナル法またはアンプリコンのシーケンスの何らかの他の方法により決定されてもよい。アレル頻度分布の統計解析、またはすべてのアッセイの比率を使用して、サンプルが、検査に含まれる染色体の一つ以上のトリソミーを含有するかが決定されてもよい。別の実施形態では、元のｃｆＤＮＡサンプルは二つのサンプルに分割され、並行的な５，０００－多重化アッセイが実施される。別の実施形態では、元のｃｆＤＮＡサンプルは、ｎ個のサンプルに分割され、並行的（約１０，０００／ｎ）多重化アッセイが実施される。この場合においてｎは、２～１２、または１２～２４、または２４～４８、または４８～９６である。データは、既に説明されている方法と似た方法で収集および分析される。この方法は、転座、欠失、重複、および他の染色体異常の検出にも同様に良好に適用可能であることに留意されたい。
一つの実施形態では、標的ゲノムに対する相同性のないテールが、プライマーのいずれかの３－プライム末端または５－プライム末端に添加されてもよい。これらのテールは、その後の操作、手順、または測定を容易にする。一つの実施形態では、テール配列は、フォワードまたはリバースの標的特異的プライマーと同じであってもよい。一つの実施形態では、異なるテール配列が、フォワードまたはリバースの標的特異的プライマーに使用されてもよい。一つの実施形態では、複数の異なるテールが、異なる座位、または座位セットに使用されてもよい。特定のテールは、すべての座位で共通してもよく、または座位のサブセットに共通してもよい。例えば、現行の任意のシーケンスプラットフォームにより必要とされるフォワードプライマーおよびリバースプライマーに対応するフォワードテールおよびリバーステールを使用することによって、増幅後の直接的なシーケンスが可能となる。一つの実施形態では、テールは、すべての増幅された標的に共通のプライミング部位として使用することができ、他の有用な配列を加えるために使用され得る。一部の実施形態では、内側のプライマーは、標的座位（例えば、多型座位）の上流または下流のいずれかにハイブリダイズするよう設計された領域を含有してもよい。一部の実施形態では、プライマーは、分子バーコードを含有してもよい。一部の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲ増幅が可能となるよう設計されたユニバーサルプライミング配列を含有してもよい。
一つの実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーが、例えばＩＬＬＵＭＩＮＡから入手可能なＨＩＳＥＱ、ＧＡＩＩＸ、またはＭＹＳＥＱなどのハイスループットシーケンス装置（しばしば大規模並行的シーケンス装置とも呼称される）に必要とされる必須のフォワード配列およびリバース配列に対応するテールを有するように、１０，０００－多重化ＰＣＲアッセイプールが作製される。さらに、シーケンステールに対して含有される５－プライムは、アンプリコンにヌクレオチドバーコード配列を加えるための後続のＰＣＲにおいてプライミング部位として使用され得る追加配列であり、ハイスループットシーケンス装置の一つのレーンで複数のサンプルの多重化シーケンスが可能となる。
一つの実施形態では、１０，０００－多重化ＰＣＲアッセイプールは、リバースプライマーが、ハイスループットシーケンス装置に必要とされる必須のリバース配列に対応するテールを有するように作製される。第一の１０，０００－多重化アッセイで増幅した後、後続のＰＣＲ増幅は、すべての標的に対して部分的に入れ子型となったフォワードプライマー（例えば、６塩基の入れ子）、および最初のラウンドに含まれたリバースシーケンステールに対応するリバースプライマーを有する別の１０，０００－多重化プールを使用して実施されてもよい。ただ一つの標的特異的プライマーとユニバーサルプライマーを用いた部分的入れ子型増幅の後続ラウンドを行うことで、必要とされるアッセイサイズが限定され、サンプルノイズが減少するが、偽アンプリコンの数も大幅に減少する。シーケンスタグは、添付されたライゲーションアダプターに付加されてもよく、および／またはＰＣＲプローブの一部として付加されてもよく、その結果として当該タグは最終的なアンプリコンの一部となる。
腫瘍の割合は、検査性能に影響を及ぼす。患者血漿中に存在するＤＮＡの腫瘍割合を高めるための方法は多数存在する。腫瘍割合は、すでに検討されている前述のＬＭ－ＰＣＲ方法によって、ならびに長い断片の標的化除去によって増加させることができる。一つの実施形態では、標的座位のマルチプレックスＰＣＲ増幅を行う前に、追加のマルチプレックスＰＣＲ反応を実施して、後続のマルチプレックスＰＣＲで標的とされる座位に対応する長大な母体断片を選択的に除去してもよい。追加のプライマーは、セルフリー胎児ＤＮＡ断片中に存在すると予想される多型からの距離よりも長い距離の部位でアニーリングするように設計される。これらのプライマーは、１サイクルのマルチプレックスＰＣＲ反応において使用され、その後、標的多型座位のマルチプレックスＰＣＲが実施されてもよい。これらの遠位プライマーは、ＤＮＡのタグ付けされた断片の選択的な認識が可能となる分子または部分にタグ付けされる。一つの実施形態では、これらのＤＮＡ分子は、１サイクルのＰＣＲの後に、ビオチン分子で共有結合的に修飾されてもよく、それによりこれらのプライマーを含む新たに形成された二本鎖ＤＮＡの除去が可能となる。第一ラウンド中に形成された二本鎖ＤＮＡは、母親が起源である可能性が高い。ハイブリッドな物質の除去は、磁気ストレプトアビジンビーズを使用することによって達成されてもよい。同様に機能する他のタグ化方法も存在する。一つの実施形態では、サイズ選択方法を使用して、より短いＤＮＡ鎖、例えば、約８００ｂｐ未満、約５００ｂｐ未満、または約３００ｂｐ未満の鎖のサンプルを濃縮してもよい。その後、短い断片の増幅を通常通り進行させることができる。
本開示に記載されるミニＰＣＲ法は、一つのサンプルから、一つの反応において、数百～数千、さらには数百万の座位について、高度に多重化された増幅と分析を可能にする。それと同時に、増幅されたＤＮＡの検出を多重化することができる。数十～数百個のサンプルを、バーコード化ＰＣＲを使用して一つのシーケンスレーンで多重化することができる。この多重化検出は、最大で４９－多重化まで試験に成功しており、それより多い多重化も可能である。事実上、これにより、１回のシーケンス実行において、数千個のＳＮＰで、数百個のサンプルが遺伝子型解析されることが可能となる。これらのサンプルについて、当該方法により遺伝子型とヘテロ接合率の決定、同時にコピー数の決定も可能となり、それらの両方ともが異数性検出の目的で使用されてもよい。突然変異量に関する方法の一部として使用されてもよい。当該方法は、任意の量のＤＮＡまたはＲＮＡに使用されてもよく、標的領域は、ＳＮＰ、他の多型領域、非多型領域、およびそれらの組み合わせであってもよい。
一部の実施形態では、断片化ＤＮＡのライゲーション介在性ユニバーサルＰＣＲ増幅が使用されてもよい。ライゲーション介在性ユニバーサルＰＣＲ増幅を使用して血漿ＤＮＡを増幅することができ、次いでそれを複数の並行反応に分割することができる。さらにこれを使用して短い断片を優先的に増幅することができ、その結果、腫瘍割合が高められる。一部の実施形態では、ライゲーションにより断片へのタグを付加することにより、より短い断片の検出、より短い標的配列特異的プライマー部分の使用、および／または非特異的反応を減少させる高温でのアニーリングが可能になる。
本明細書に記載される方法は、ある量の混入ＤＮＡと混合されている標的ＤＮＡセットである場合の多数の目的に対し、使用されてもよい。一部の実施形態では、標的ＤＮＡおよび混入ＤＮＡは、遺伝的に関連する個体由来のものであってもよい。例えば、胎児（標的）の遺伝子異常は、胎児（標的）ＤＮＡと母体（混入）ＤＮＡも含有する母体血漿から検出される場合がある。当該異常には、全染色体異常（例えば、異数性）、部分染色体異常（例えば、欠失、重複、逆位、転座）、ポリヌクレオチド多型（例えば、ＳＴＲ）、一塩基多型、および／または他の遺伝的な異常もしくは差異が含まれる。一部の実施形態において、標的ＤＮＡと混入ＤＮＡは、同じ個体由来であってもよいが、標的ＤＮＡと混入ＤＮＡは、例えば癌の場合などには一つ以上の変異によって異なっている。（例えば、Ｈ．Ｍａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｏｒ ＤＮＡ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４：９（２００８）を参照のこと）。一部の実施形態において、ＤＮＡは、細胞培養（アポトーシス）上清中に見出され得る。一部の実施形態において、生物学的サンプル（例えば、血液）にアポトーシスを誘導することが可能であり、その後にライブラリー調製、増幅および／またはシーケンスが実施される。この目的を達成するための多数のワークフローおよびプロトコールが、本開示の別段に提示されている。
一部の実施形態において、標的ＤＮＡは一つの細胞に由来してもよく、１コピー未満の標的ゲノムからなるＤＮＡサンプルに由来してもよく、少量のＤＮＡに由来してもよく、混合起源（例えば、癌患者の血漿と腫瘍、健常ＤＮＡと癌性ＤＮＡの混合、移植など）からのＤＮＡに由来してもよく、他の体液に由来してもよく、細胞培養物に由来してもよく、培養上清に由来してもよく、法医学ＤＮＡサンプルに由来してもよく、古代のＤＮＡサンプル（例えばコハクに閉じ込められた昆虫）に由来してもよく、他のＤＮＡサンプルに由来してもよく、そしてそれらの組み合わせであってもよい。
一部の実施形態において、短いアンプリコンサイズを使用してもよい。短いアンプリコンサイズは、断片化されたＤＮＡに特に好適である（例えば、Ａ．Ｓｉｋｏｒａ，ｅｔ ｓｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ｊａｎ；５６（１）：１３６－８を参照のこと）。
短いアンプリコンサイズを使用することで、いくつかの顕著な利益がもたらされ得る。短いアンプリコンサイズは、最適化された増幅効率がもたらされ得る。短いアンプリコンサイズは通常、短い産物を生じさせる。ゆえに非特異的プライミングが発生する可能性は低い。クラスターが小さくなるため、短い産物は、シーケンスフローセル上でより高密度にクラスター化することができる。本明細書に記載される方法は、より長いＰＣＲアンプリコンと同等に良好に機能し得ることに留意されたい。アンプリコンの長さは、例えばより長い配列をシーケンスする場合など、必要に応じて増加させてもよい。入れ子型ＰＣＲプロトコールの第一工程として１００ｂｐから２００ｂｐの長さのアッセイを用いた１４６－多重化標的増幅を用いた実験を、一つの細胞に対して、およびゲノムＤＮＡに対して実施し、陽性の結果が得られた。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、ＳＮＰ、コピー数、ヌクレオチドのメチル化、ｍＲＮＡレベル、他のタイプのＲＮＡ発現レベル、他の遺伝的特性、および／もしくはエピジェネティックな特性を増幅ならびに／または検出してもよい。本明細書に記載されるミニＰＣＲ法は、次世代シーケンスと共に使用されてもよく、例えばマイクロアレイ、デジタルＰＣＲによる計数、リアルタイムＰＣＲ、質量分析法などの他の下流方法と共に使用されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるミニＰＣＲ増幅法は、少数集団の正確な定量のための方法の一部として使用されてもよい。スパイクキャリブレーターを使用した絶対的定量に使用されてもよい。ベリーディープシーケンス（ｖｅｒｙ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を介した変異／マイナーアレルの定量に使用されてもよく、および高度に多重化された様式で実行されてもよい。標準的な父子鑑定に使用されてもよく、およびヒト、動物、植物、または他の生物における親族または祖先のアイデンティティ検査に使用されてもよい。法医学的検査に使用されてもよい。例えば羊水およびＣＶＳ、精子、受精産物（ＰＯＣ）などの任意の種類の材料に対する迅速遺伝子型解析およびコピー数分析（ＣＮ）に使用されてもよい。例えば胚から生検されたサンプルに対する遺伝子型解析など、単一細胞解析に使用されてもよい。ミニＰＣＲを使用した標的シーケンスにより、迅速な胚解析（生検から１日以内、１日、または２日以内）に使用されてもよい。
一部の実施形態では、ミニＰＣＲ増幅法は、腫瘍分析に使用することができる。腫瘍生検は多くの場合、健康な細胞と腫瘍細胞との混合物である。標的化ＰＣＲによって、バックグラウンド配列をほぼ有さない、ＳＮＰおよび座位のディープシーケンスが可能となる。腫瘍ＤＮＡに対するコピー数分析およびヘテロ接合性消失の分析に使用されてもよい。当該腫瘍ＤＮＡは、腫瘍患者の多くの様々な体液または組織に存在し得る。腫瘍再発の検出、および／または腫瘍スクリーニングに使用されてもよい。種子の品質管理試験に使用されてもよい。交配目的または漁業目的に使用されてもよい。これらの方法のいずれかも、倍数性分類の目的のために、非多型座位を標的としても同様に好適に使用され得ることに留意されたい。
本明細書に開示される方法の根底にある基礎的な方法の一部を説明するいくつかの文献としては、以下が挙げられる：（１）Ｗａｎｇ ＨＹ，Ｌｕｏ Ｍ，Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ＩＶ，Ｆｒｉｋｋｅｒ ＤＭ，Ｃｕｉ Ｘ，Ｌｉ ＪＹ，Ｈｕ Ｇ，Ｃｈｕ Ｙ，Ａｚａｒｏ ＭＡ，Ｌｉｎ Ｙ，Ｓｈｅｎ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｑ，Ｋａｍｂｏｕｒｉｓ ＭＥ，Ｇａｏ Ｒ，Ｓｈｉｈ Ｗ，Ｌｉ Ｈ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５ Ｆｅｂ；１５（２）：２７６－８３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｗｏｏｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８９０３，ＵＳＡ．（２）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｌｉ Ｈ，Ｗａｎｇ ＨＹ，Ｃｕｉ Ｘ，Ｌｕｏ Ｍ，Ｈｕ Ｇ，Ｇｒｅｅｎａｗａｌｔ ＤＭ，Ｔｅｒｅｓｈｃｈｅｎｋｏ ＩＶ，Ｌｉ ＪＹ，Ｃｈｕ Ｙ，Ｇａｏ Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７；３９６ － ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８０２５６９９．（３）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ９ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ：Ｎｅｓｔｅｄ Ｐａｔｃｈ ＰＣＲ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ．Ｖａｒｌｅｙ ＫＥ，Ｍｉｔｒａ ＲＤ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００８ Ｎｏｖ；１８（１１）：１８４４－５０．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ １０．本明細書に開示される方法によって、上記の参考文献よりも高度な多重化が可能となることに留意されたい。
６．非侵襲的出生前検査のための、循環胎児細胞からのゲノム情報の分析方法。
一つの態様では、当該方法はさらに、一つ以上の循環細胞が一つ以上の胎児細胞であると決定された遺伝子型を使用して、非侵襲的な出生前検査を実施することを含む。
一つの実施形態では、当該方法はさらに、一つ以上の胎児細胞であると決定された一つ以上の循環細胞における対象となる標的染色体または標的染色体セグメントのコピー数変動または異数性を検出することを含む。
倍数性分類は、「染色体コピー数分類」または「コピー数分類」（ＣＮＣ：Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｃａｌｌｉｎｇ）とも呼ばれ、細胞中に存在する一つ以上の染色体の量および染色体の固有性の判定を指す。異数性とは、細胞中に誤った数の染色体が存在する状態を指す。ヒト体細胞の場合、細胞が２２対の常染色体と１対の性染色体を含有しない場合を指す。ヒト配偶子の場合、細胞が２３個の各染色体のうちの一つを含有しない場合を指す。一つの染色体の場合、２よりも多い、または２よりも少ない、相同であるが同一ではない染色体が存在する場合を指し、当該二つの各染色体は異なる親を起源とする。倍数性の状態とは、細胞中の一つ以上の染色体の量および染色体の固有性を指す。
ＣＮＶは、影響を受ける配列の長さに基づいて、二つの主要カテゴリーのうちの一つに割り当てられることが多い。第一のカテゴリーにはコピー数多形（ＣＮＰ）が含まれ、これは一般的な集団に共通し、１％よりも高い全体的頻度で発生する。典型的にはＣＮＰは小さく（ほとんどが長さ１０キロ塩基未満）、薬物の解毒と免疫に重要なタンパク質をコードする遺伝子に関して濃縮されることが多い。これらのＣＮＰのサブセットは、コピー数に関して非常に変化に富んでいる。結果として、異なるヒトの染色体は、特定の遺伝子セットに関して、広範なコピー数（例えば、２、３、４、５など）を有し得る。最近になって、免疫反応遺伝子に関連するＣＮＰが、乾癬、クローン病、および糸球体腎炎を含む複雑な遺伝性疾患に対する感受性と関連していた。
第二のＣＮＶには、数十万塩基対から１００万塩基対を超える長さのサイズに及ぶ、ＣＮＰよりもはるかに長い、比較的希少なバリアントが含まれる。一部の例では、これらのＣＮＶは、特定の個体を誕生させた精子または卵子の産生中に生じたか、または家族内の数世代の間でのみ受け継がれていた可能性がある。これらの巨大で希少な構造的バリアントは、精神遅滞、発達遅滞、分裂症、および自閉症の対象において不均衡に観察されている。そのような対象における当該出現は、巨大で希少なＣＮＶが、一塩基置換を含む他の遺伝性変異型よりも神経認知性疾患においてより重要である可能性があるという推測を導いた。
遺伝子コピー数は、癌細胞において変化し得る。例えば、Ｃｈｒｌｐの重複は乳癌に普遍的であり、ＥＧＦＲのコピー数は非小細胞肺癌において正常状態よりも高くなり得る。癌診断のためのさらなる標的遺伝子については、本明細書のセクション９に提供される。癌は主要な死亡原因の一つである。したがって癌の早期診断と治療が重要であり、患者の転帰を改善することができる（例えば、寛解の確率および寛解の持続期間を増加させる）。また早期診断によって、患者は、少数の抜本的な治療選択肢を受けることもできる。癌性細胞を破壊する現行治療の多くは正常細胞にも影響を与え、その結果、例えば悪心、嘔吐、血球数の減少、感染リスクの上昇、脱毛、および粘膜の潰瘍など、様々な副作用の可能性が生じる。したがって癌の早期検出が望ましく、それにより癌を除去するために必要な治療（例えば化学療法剤または放射線など）の量および／または回数を減少させることができる。
コピー数変動は、重度の精神的および肉体的な障害、ならびに特発性学習障害とも関連している。セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用した非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）を使用して、例えば胎児のトリソミー１３、１８、および２１、三倍体性、ならびに性染色体の異数性などの異常を検出することができる。したがって一つの実施形態では、対象となる標的染色体または標的染色体セグメントは、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、性染色体、および／またはそれらの染色体セグメントである。
また、重度の精神的および肉体的な障害を生じさせる可能性がある亜染色体の微小欠失は、そのサイズの小ささによって検出がより困難である。微小欠失症候群のうちの８つは、１０００分の１より高い総発生率であり、胎児常染色体トリソミーとほぼ同じ頻度である。したがって一つの実施形態では、本明細書に開示される方法はさらに、一つ以上の純粋な胎児細胞であると決定された一つ以上の循環細胞における微小欠失を検出することを含む。一つの実施形態では、微小欠失は、ディジョージ症候群に関連する２２ｑ１１．２欠失、プラダーウィリ症候群に関連する微小欠失、アンジェルマン症候群に関連する微小欠失、１ｐ３６欠失、および／または猫鳴き症候群に関連する微小欠失である。
さらに、ＣＣＬ３Ｌ１のコピー数の多さは、ＨＩＶ感染に対する感受性の低さと関連しており、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＣＤ１６細胞表面免疫グロブリン受容体）のコピー数の少なさは、全身性エリテマトーデスおよび類似の炎症性自己免疫障害に対する感受性を増大させる可能性がある。
所与の染色体または染色体セグメントにマッピングされるＤＮＡ配列を基にしたリード数の計数に基づき、胎児細胞における染色体コピー数を測定する方法は、染色体コピー数または染色体セグメントコピー数を分析するための「計数方法」または「定量方法」と簡便に呼称される。そうした方法の例は、特に、公開特許出願ＵＳ２０１３／０１７２２１１Ａ１、米国特許第８，００８，０１８号、米国特許第８，４６７，９７６Ｂ２号、米国公開特許出願ＵＳ２０１２／０００３６３７Ａ１に見出すことができる。多くの場合、そうした方法には、特定の染色体にマッピングされるＤＮＡ配列のリード数に対する参照値（カットオフ値）の生成を伴い、値を超えるリード数である場合、特定の遺伝子異常を示している。
したがって、胎児起源であると推測される細胞サンプルを分析および特徴解析する方法は、コピー数を決定するための方法およびシステム、または胎児細胞であることが確認された対象となる細胞における対象となる染色体または染色体セグメントの異数性を検出するための方法およびシステムと組み合わされてもよい。コピー数を決定、または異数性を検出するためのこれらの方法は、対象となる染色体または染色体セグメントを使用して実施され、バイアスモデルを設定する。すなわち、検査パラメータを設定するために、同一の並行分析において、高い信頼性で二倍体サンプルと特定されているサンプルを分析に使用して、試験サンプルのセット中の他のサンプルの対象となる同一染色体または染色体セグメントの異数性の分析が行われる。信頼とは、分類されたＳＮＰ、アレル、アレルのセット、倍数性の分類、または決定された染色体セグメントのコピー数が、個体の実際の遺伝的状態を正しく表している統計的な可能性を指す。そうした胎児ＤＮＡからのコピー数変動および異数性を決定する方法は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６に記載されている。
標的細胞および非標的細胞から得られたＤＮＡ調製物のシーケンスにより検出された各座位の量は、例えばＰＣＲなどの増幅工程を行う前など、シーケンス用の調製前の初期サンプル材料中の座位の開始量以外の理由によって、座位ごとに異なる可能性がある。例えばＰＣＲプライマーの結合効率、アンプリコン長さ、ＧＣ含量などの変数は、シーケンス用の調製またはシーケンス中の個々の座位の出現における変動原因となり得る。このような因子は、座位に特異的なバイアスを生じさせ、座位ごとに過剰に出現または過小に出現させ得る。さらにバイアスは、サンプル特異的な不一致から生じることがある。例えば、サンプルの物理的処理中のピペッティングのエラーまたは他の測定エラーに起因して、一つのサンプルが、サンプルセット中の別のサンプルよりも多くのＤＮＡを有する場合がある。例示的な実施形態では、これらのサンプル特異的なバイアスは、サンプル特異的パラメータによって考慮される。サンプル特異的パラメータに関するこれら特定の実施形態は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６に開示されている。
遺伝情報の生成に使用される特定の方法とは無関係に、各座位からの遺伝配列情報の量は、元のサンプル中の座位のコピー数の相対的な量に依存する。同じ染色体セグメント上にあると考えられる座位、または一部の実施形態では、同じ染色体上にあると考えられる座位は、同じ開始量を有すると推定される。したがって、例えば、標的細胞のゲノム（または非標的細胞のゲノム）の２１番染色体上に存在する複数の座位は、ゲノムＤＮＡ中でほぼ等しい量で存在すると推定される。したがって、同じ染色体上の座位間で実測される遺伝情報の量における差異は、座位特異的バイアスの結果である。例えば、ＳＮＰ１とＳＮＰ２が同じ染色体上に位置し、同じ染色体上で同じコピー数を有すると仮定され、ＳＮＰ１が０．１％のリード深度を有することが判明し、ＳＮＰ２が０．４％のリード深度を有することが判明した場合、ＳＮＰ１よりもＳＮＰ２からのＤＮＡ配列の産生に有利な定量的な座位特異的バイアスによりこれが説明され得る。このバイアスは、二つの異なるＳＮＰについて、可能性のあるサンプリング結果の分布を考慮することによって、さらに正規化され得る。したがって、本発明の方法は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６においてより詳細に論じられるように、バイアスを分析し、バイアスモデルを提供するものである。
本発明の特定の実施形態では、一つまたは二つの最尤法が使用される。上述のように、第一の最尤法を使用して、サンプルセット中の二倍体サンプルを特定し、サンプルセット中の他のサンプルが異数性である第一の確率を決定することができる。したがって、特定の実施形態では、対象となる染色体または染色体セグメントのうちの一つ以上またはすべてが、第一の最尤法を使用して二染色体性であることが決定される。当該方法は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６においてさらに記述および図示される。
別の実施形態では、対象となる染色体または染色体セグメントのコピー数は、複数の第二の倍数仮説または第二の倍数仮説セットを生成することにより決定され、この場合において第二の倍数仮説の各々は、標的細胞中の対象となる染色体または染色体セグメントの特定のコピー数に関連付けられる。次いでモデルを使用して、各患者からの遺伝データが、第二の仮説の各々にどの程度適合するかを試験する。第二の仮説の各々に対する適合度が決定される。第二の確率値は、第二の仮説ごとに計算され、この場合において当該第二の確率値は、標的細胞のゲノムが、第二の仮説によって指定される染色体または染色体セグメントの数を有する可能性を示す。したがって、最大尤度を有する第二の仮説を選択することによって、標的細胞のゲノム中の染色体または染色体セグメントのコピー数を決定し得る。そうした第一および第二の仮説を組み合わせて検討し、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６で詳細に検討されるように、異数性決定の信頼度を高めることができる。
胎児の倍数性の状態を決定するために使用される方法に関する本開示の一つの実施形態では、サンプル中の胎児ＤＮＡの割合を考慮に入れることをさらに含む。本開示の一つの実施形態では、方法は、胎児起源または胎盤起源であるサンプル中のＤＮＡのパーセントを計算することを伴う。本開示の一つの実施形態では、異数性分類の閾値は、計算された胎児ＤＮＡパーセントに基づいて適応的に正規化される。一部の実施形態では、ＤＮＡ混合物において胎児起源であるＤＮＡのパーセントを推定する方法は、母親の遺伝物質と胎児の遺伝物質を含有する混合サンプルを取得すること、胎児の父親から遺伝子サンプルを取得すること、混合サンプル中のＤＮＡを測定すること、父親のサンプル中のＤＮＡを測定すること、および混合サンプルと父親サンプルのＤＮＡ測定結果を使用して混合サンプル中の胎児起源のＤＮＡのパーセントを計算すること、を含む。
一つの態様では、本明細書に記載の方法は、細胞サンプルが真の胎児細胞と真の母細胞の両方を含有する場合、サンプルが胎児細胞と母細胞の混合物であることの確認が可能となり、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を参照として使用することにより、胎児割合を推定し得る。本明細書にその全体で組み込まれる米国特許出願第２０１８／０２９８４３９号に記載されるように、母体ＤＮＡの遺伝子型データ、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの混合物、および胎児ＤＮＡの推定割合によって、胎児の父性の決定が可能となる。母親と子のｃｆＤＮＡの混合物、および胎児と母親のＤＮＡの混合物から得られた遺伝子型データを使用して、サンプルの胎児割合が決定され、父子鑑定が可能となり得る。
一部の実施形態は、ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）（ＰＳ）法と組み合わせて使用されてもよく、当該方法は、米国特許出願１１／６０３，４０６（米国公開２００７０１８４４６７）、米国特許出願１２／０７６，３４８（米国公開２００８０２４３３９８）、米国特許出願１３／１１０，６８５、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／５２７３０（ＰＣＴ公開：ＷＯ／２０１０／０１７２１４）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／０５０８２４（ＰＣＴ公開：ＷＯ／２０１１／０４１４８５）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７０１８（ＰＣＴ公開：ＷＯ／２０１１／１４６６３２）、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／６１５０６に記載されており、それら出願はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）は、遺伝子データを解析するために使用され得る情報科学ベースの方法である。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）法の一部として検討されてもよい。一部の実施形態では、ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）法は、高い精度で標的個体、当該個体由来の一つの細胞もしくは少数の細胞、または標的個体のＤＮＡからなるＤＮＡ混合物、または一つもしくは複数の他の個体のＤＮＡの遺伝子データを決定するため、特に疾患関連アレルを決定する、対象となるアレルを決定する、標的個体中の一つもしくは複数の染色体の倍数性の状態を決定する、および／または別の個体と標的個体の関連性の程度を決定するために使用され得る方法の集合である。ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）は、これらの方法のいずれかを指す場合がある。ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）は、情報科学に基づく方法の一例である。
本発明の一部の実施形態では、異数性決定に関する信頼性の改善は、定量的な非アレル性閾値またはカットオフ法を使用してサンプルの異数性を決定することにより得ることができ、そして同じサンプルに対し、尤度を決定する方法を使用して異数性を決定することにより得ることができる。サンプルが、閾値法により対象となる染色体または染色体セグメント中に異数性を有すると特定され、当該サンプルが、仮説セットに対する尤度決定を使用して高い信頼度で異数性を有すると特定される場合、当該サンプルは、当該サンプルの供給源である対象中の一つ以上の標的細胞に関し、対象となる染色体または染色体セグメントに異数性を有するサンプルと特定される。当該方法は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２０１８／０１７３８４６においてさらに説明および図示される。
特にＮＩＰＴなど、非アレル性閾値分析を実施する方法が当分野に公知である。例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 ７，８８８，０１７号および第８，３１８，４３０号は、推定される染色体にマッピングされるリード数を計数し、これを参照染色体にマッピングされるリード数と比較して、推定される染色体上に過剰なリードがある場合には、当該染色体での胎児の三倍体性に相当するという仮定を使用して、胎児異数性を決定する方法を提供する。シーケンスリードの深度と参照値を含む当該文献中の教示は、本発明の実施形態の実施に有用であり得る。
７．循環腫瘍細胞からゲノム情報を分析する方法。
本明細書に提供される方法および組成物は、液体生検を使用して循環腫瘍細胞を含有する試料を取得することにより、癌（例えば、乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌）の検出、診断、病期分類、スクリーニング、治療、および管理を改善する。本明細書で提供する方法は、解説的な実施形態において、循環流体中、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）中の癌に関連する変異を分析する。当該方法は、必要とされていた複数回試験ではなく、全てが有効であれば腫瘍サンプルを利用する一回の試験で、腫瘍中で発見される大部分の変異体、クローン性変異のみならずサブクローン性変異を特定するという利点を提供する。
したがって一つの態様において、本開示は、腫瘍に由来すると決定された一つ以上の循環細胞を取得することにより、癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出するための方法を提供し、当該方法は、
ａ）癌と診断された患者の腫瘍サンプルにおいて特定された変異に基づいて、一つ以上の患者特異的変異を選択する工程、
ｂ）当該患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、当該患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
ｃ）当該癌患者から取得された当該血液サンプルから取得された、循環腫瘍細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡから第一のアンプリコンセット、およびセルフリーＤＮＡから第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該腫瘍細胞および正常細胞は、当該癌患者の血液サンプルまたはその画分の各々から取得され、当該第一のアンプリコンセットおよび当該第二のアンプリコンセットは、癌に関連する患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される工程、
ｄ）次世代シーケンスにより当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットをシーケンスする工程、
ｅ）当該第一のアンプリコンセットの配列に基づき、一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、当該第二のアンプリコンセットの配列は参照として使用され、腫瘍が起源であると決定された循環細胞から生成された第一のアンプリコンセットからの一つ以上の患者特異的変異の検出は、癌の早期再発または転移を示唆する工程、を含む。
別の態様では、本明細書における開示は、癌患者を治療するための方法を提供し、当該方法は、
ａ）外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で癌患者を治療する工程、
ｂ）当該患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、当該患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
ｃ）当該癌患者から取得された当該血液サンプルから取得された、循環腫瘍細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡから第一のアンプリコンセット、およびセルフリーＤＮＡから第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、当該腫瘍細胞および正常細胞は、当該癌患者の血液サンプルまたはその画分の各々から取得され、当該第一のアンプリコンセットおよび当該第二のアンプリコンセットは、癌に関連する患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される工程、
ｄ）次世代シーケンスにより当該第一のアンプリコンセットと当該第二のアンプリコンセットをシーケンスする工程、
ｅ）当該第一のアンプリコンセットの配列に基づき、一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、当該第二のアンプリコンセットの配列は参照として使用され、腫瘍が起源であると決定された循環細胞から生成された第一のアンプリコンセットからの一つ以上の患者特異的変異の検出は、癌の早期再発または転移を示唆する工程、
ｆ）当該患者に化合物を投与する工程であって、当該化合物は、血液サンプルから検出された当該一つ以上の患者特異的変異を有する癌の治療に有効であることが判明している工程、を含む方法。
本明細書に提供される改善方法によって、非常に少数のＣＴＣを含有するサンプルの正確な分析と特徴解析が可能となる。本発明方法により分析されるサンプル中のＣＴＣの数は、１００細胞未満、７５細胞未満、５０細胞未満、２５細胞未満、２０細胞未満、１５細胞未満、１０細胞未満、５細胞未満、または一つの細胞であり得る。本明細書に提供される方法を使用することにより、一つの循環腫瘍細胞、２ＣＴＣ、３ＣＴＣ、４ＣＴＣ、５ＣＴＣ、６ＣＴＣ、７ＣＴＣ、８ＣＴＣ、９ＣＴＣ、または１０ＣＴＣから正確なゲノム情報が取得され得る。
一部の実施形態では、方法は、予め決定された患者特異的変異に基づいて循環腫瘍細胞であると推測される循環細胞の固有性を決定することにより、癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出することを含む。一部の実施形態では、患者特異的変異は、癌に関連した一塩基バリアント（ＳＮＶ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、インデル、欠失、または遺伝子融合を含む。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも２個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも８個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１６個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５０個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。
一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個～約１０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００個～約１０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１０００個～約５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５０００個～約１００００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００００個～約１５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１５０００個～約２００００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも２００００個～約２５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５００００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。
一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１００００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも１５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。一部の実施形態では、癌に関連する患者特異的変異が少なくとも２５０００個存在する場合、当該一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示唆する。
一つの態様では、多重化増幅が実施されて、癌に関連する患者特異的変異を包含するアンプリコンが取得される。一部の実施形態では、第一のアンプリコンセットと第二のアンプリコンセットは、５０～１０００個の癌関連患者特異的変異の多重化増幅反応を実施することにより取得される。
一つの態様では、癌患者における腫瘍の早期再発と転移のモニタリングおよび検出のための方法は、複数の循環細胞を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む。一部の実施形態では、細胞ＤＮＡは、腫瘍細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される。
一部の実施形態では、当該方法はさらに、一つ以上の循環細胞が一つ以上の腫瘍細胞であると決定された遺伝子型を使用して、非侵襲的な癌検査を実施することを含む。
当該方法および組成物は、それ自体のみでも有用であり得、または癌（例えば、乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）の検出、診断、病期分類、スクリーニング、治療および管理のための他の方法とともに使用される場合でも有用であり得、例えばこれら他の方法の結果を補助して、信頼性の高い結果および／または最終的な結果を提供する。
「癌」および「癌性」という用語は、典型的には非制御状態の細胞増殖を特徴とする、動物における生理学的状態を指す、または記載する。「腫瘍」は、一つ以上の癌性細胞を含む。癌にはいくつかの主な種類がある。癌腫は、皮膚で始まる癌、または内臓を縁取る、もしくは覆う組織で始まる癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織で始まる癌である。白血病は、例えば骨髄などの血液形成組織で始まり、大量の異常な血液細胞が産生されて血中に入る癌である。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞で始まる癌である。中枢神経系の癌は、脳および脊髄の組織で始まる癌である。
一部の実施形態では、癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、膀胱癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系の非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系の胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、松果体実質腫瘍の中間分化型、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽細胞腫）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、原発部位不明の癌腫、中枢神経系の非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系の胚芽腫、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣細胞腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部癌、心臓癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球増加症、喉頭癌、口唇癌、肝癌、悪性線維性組織球腫、骨癌、髄芽細胞腫、髄様上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、メルケル細胞皮膚癌、中皮種、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性黒色腫、多発性黒色腫／形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、他の脳腫瘍および脊髄腫瘍、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、乳頭腫症、副鼻腔癌、副甲状腺癌、骨盤内癌、陰茎癌、咽頭癌、松果体実質腫瘍の中間分化型、松果体芽細胞腫、下垂体部腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞癌、気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、移行上皮細胞癌、腎盂および尿管の移行上皮細胞癌、絨毛性腫瘍、尿管癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍を含む。
他の実施形態においては、本明細書において、例えば癌を有すると推測される個体などの個体からの血液サンプルまたはその画分中の癌（例えば、乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）を検出するための方法が提供され、当該方法は、本明細書に提供されるｃｔＤＮＡ ＳＮＶ増幅／シーケンスワークフローを使用して、循環腫瘍細胞を含有するサンプルおよびｃｔＤＮＡサンプル中に存在する一塩基バリアントを決定することにより、サンプル中に存在する一塩基バリアントを決定することを含む。複数の一塩基座位で、サンプル中に、範囲の下限で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のＳＮＶ、範囲の上限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、または５０個のＳＮＶの存在は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌）の存在を示す。
当該実施形態の特定の例では、癌は、ステージ１ａ、１ｂ、もしくは２ａの乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌である。当該実施形態の特定の例では、癌は、ステージ１ａもしくは１ｂの乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌である。当該実施形態の特定の例では、個体は外科手術を受けていない。当該実施形態の特定の例では、個体は生検を受けていない。本明細書で提供する方法の実施形態のいずれについての或る実施例においては、ある個体からのＣＴＣに標的増幅を実行する前に、当該個体に由来する腫瘍に存在するＳＮＶに関してデータが提供される。したがってこれら実施形態においては、ＳＮＶの増幅／シークエンシング反応を、個体からの一つ又は複数の腫瘍サンプルに対して実行する。この方法では、本明細書で提供するＣＴＣのＳＮＶの増幅／シークエンシング反応は、それがクローン性及びサブクローン性の変異の液体生検を提供することを理由に、やはり有利である。また、本明細書で提供するように、癌（例えば、乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌）を有する個体において、あるＳＮＶに関して、該個体からのｃｔＤＮＡサンプル中で例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０％ＶＡＦ以上である高い割合のＶＡＦが確定するものであれば、クローン性変異であることがより明確に特定可能である。
説明的な実施形態においては、本明細書の方法のうちいずれかの、一組の一塩基バリアント遺伝子座が、癌（例えば、乳癌、膀胱癌、または結腸直腸癌）に関するＴＣＧＡおよびＣＯＳＭＩＣのデータセットにおいて特定された一塩基バリアント遺伝子座の全てを含む。
本明細書の方法のうちのいずれかの或る実施形態において、一組の一塩基バリアント遺伝子座は、癌（例えば、乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）に関連することが判明している一塩基バリアント遺伝子座を、範囲の下限で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００又は１０，０００個含み、範囲の上限で５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００及び２５，０００個含む。
他の実施形態においては、個体からの血液またはその画分のサンプルから、癌（例えば乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）を有すると推測される個体などの個体に対して癌（例えば乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）の診断を裏付ける方法を本明細書で提供するものであって、当該方法は、本明細書で提供されるＣＴＣ ＳＮＶ増幅／シーケンスワークフローを実行して、一つ又は複数の一塩基バリアントが複数の一塩基バリアント遺伝子座中に存在するか否かを決定することを含む。当該実施形態では、以下の要素、意見、ガイドライン、または規則が適用される：一塩基バリアントの非存在は、ステージ１ａ、１ｂまたは２ａの腺癌の診断を裏付けるものであり、一塩基バリアントの存在は、扁平上皮細胞癌またはステージ２ｂもしくは３ａの腺癌の診断を裏付けるものであり、および／または１０個以上の一塩基バリアントの存在は、扁平上皮細胞癌またはステージ２ｂもしくは３の腺癌の診断を裏付けるものである。
或る実施形態においては、この方法は、治療計画、治療法を決定することと、及び／又は、一つ又は複数のクローン性一塩基バリアントを標的とする化合物を個体に投与することとをさらに含む。或る実施例においては、サブクローン性ＳＮＶ及び／又は他のクローン性ＳＮＶは治療法で標的とされない。或る治療法及び関連する変異が、この明細書の他の部分で提供されるが、この分野で公知である。したがって、ある実施例においては、当該方法は、個体に化合物を投与することをさらに含むものであって、当該化合物は、決定された一塩基バリアントのうちの一つ又は複数を有する癌（例えば乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）の治療に特に有効であることがわかっているものである。
或る実施形態においては、本明細書のＳＮＶを検出する方法を用いて治療レジメンを行うことが可能である。ＡＤＣ及びＳＣＣに関連する特定の変異を標的とする治療法が、利用可能であり、開発中である（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃａｎｃｅｒ．１４：５３５－５５１（２０１４））。例えば、治療の選択には、Ｌ８５８Ｒ又はＴ７９０ＭにおけるＥＧＦＲ変異の検出が有益であり得る。エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＺＫ９２９１、ＣＯ－１６８６及びＨＭ６１７１３は、米国又は治験で現在承認されている治療であり、これらは特定のＥＧＦＲ変異を標的としている。他の例では、ＫＲＡＳ中のＧ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ又はＧ１２Ｖの変異を利用して、個体に対してセルメチニブとドセタキセルとを組み合わせた治療を行うことが可能である。他の例として、ＢＲＡＦにおけるＶ６００Ｅ変異を利用して、対象に対してベムラフェニブ、ダブラフェニブ及びトラメチニブによる治療を行うことが可能である。
本発明の標的遺伝子は、例示的な実施形態においては癌関連遺伝子であり、多くの説明的な実施形態においては癌関連遺伝子である。癌関連遺伝子（例えば、癌関連遺伝子または膀胱癌関連遺伝子または結腸直腸癌関連遺伝子）とは、癌（例えば乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌）のリスク変化に関連する遺伝子、または癌の予後変化に関連する遺伝子を指す。癌を促進する例示的な癌関連の遺伝子には、癌遺伝子、細胞の増殖や湿潤又は転移を高める遺伝子、アポトーシスを抑制する遺伝子、及び、血管新生促進（ｐｒｏ－ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子が含まれる。癌を抑制する癌関連遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子、細胞の増殖や湿潤又は転移を抑制する遺伝子、アポトーシスを促進する遺伝子、及び、抗血管新生（ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子が含まれるが、これに限定されない。
変異検出方法の一実施形態では、標的となる遺伝子の領域を選択することから開始する。公知の変異を含む領域を用いて、ｍＰＣＲ－ＮＧＳのためのプライマーを増殖させて、増幅して変異を検出する。
本明細書で提供する方法を使用して、事実上あらゆるタイプの変異、特に癌に関連することが判明している変異を検出することができ、特に本明細書に提供される方法は、癌、特に乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌に関連する特にＳＮＶなどの変異を目的とする。例示的なＳＮＶは、以下の遺伝子のうちの一つ又は複数中に存在し得る：種々の肺癌サンプル中において、変異している、コピー数が増加している又は他の遺伝子と融合している、及びその組み合わせであるものとして特定された、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＲＯＳ１、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、ＨＥＲ２、ＤＤＲ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＫＲＡＳ、ＮＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＫ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＬＬ２、ＥＺＨ２、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＳＯＸ２、ＭＹＣ、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＲＧ１、ＴＰ５３、ＬＫＢ１及びＰＴＥＮ（Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ：ａ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｅｔ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１４ Ａｕｇ １４（８）：５３５－５５１）。他の実施例においては、遺伝子の一覧は上記に列記したものであって、ＳＮＶは引用したＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．の参照文献等で報告されている。
８．分析方法の例示的な実施形態
８．１ 癌を検出するための例示的な実施形態
特定の実施形態では、循環腫瘍核酸が存在するか否かを決定する方法における分析工程は、癌において異数性を呈することが判明している染色体セグメントのセットを分析することを含む。特定の実施形態では、循環腫瘍核酸が存在するか否かを決定する方法における分析工程は、１，０００～５０，０００個、または１００～１０００個の倍数性に関する多形座位を分析することを含む。特定の実施形態では、循環腫瘍核酸が存在するか否かを決定する方法における分析工程は、１００～１０００個の一塩基バリアント部位を分析することを含む。例えば、これらの実施形態では、分析工程は、マルチプレックスＰＣＲを実施して、１０００～５０，０００個のポリマー座位および１００～１０００個の一塩基バリアント部位にわたってアンプリコンを増幅することを含む。この多重化反応は、１回の反応として、または異なるサブセットの多重化反応のプールとして設定することができる。本明細書に開示される大規模マルチプレックスＰＣＲなど、本明細書に提供される多重化反応は、多重化を改善し、それに伴い感度レベル改善の実現を補助する増幅反応を実施するための例示的プロセスを提供する。
特定の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ反応は、限定的プライマー条件下で、反応の少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％に対して実施される。本明細書に提供される大規模な多重化反応を実施するための改善条件を使用することができる。
特定の態様では、循環腫瘍核酸が個体中のサンプルに存在するか否かを決定するための上記の方法、およびその全ての実施形態は、システムを用いて実施することができる。本開示は、当該方法を実施するための特定の機能的および構造的な特性に関する教示を提供する。非限定的な例として、システムは以下を含む：
サンプルからのデータを分析して、個体中の染色体セグメント上の多型座位セットでの倍数性を決定するように構成された入力プロセッサ；および
多型座位に存在するアレル不均衡のレベルを、倍数性の決定に基づき決定するよう構成されたモデラ―であって、この場合において０．５％以上のアレル不均衡は、循環の存在を示す。
８．２ 一塩基バリアントを検出するための例示的な実施形態
特定の態様では、本明細書において、一塩基バリアントを検出するための方法が提供される。本明細書に提供される改善方法は、サンプル中の０．０１５、０．０１７、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５パーセントのＳＮＶの検出限界を実現することができる。ＳＮＶを検出するための全ての実施形態が、システムを用いて実施することができる。本開示は、当該方法を実施するための特定の機能的および構造的な特性に関する教示を提供する。さらに本明細書において、処理デバイスにより実行されたとき、当該処理デバイスに、本明細書に提供されるＳＮＶの検出方法を実行させるコンピューター可読コードを含む非一時的コンピューター可読媒体を含む実施形態が提供される。
したがって、一つの実施形態において、一塩基バリアントが個体由来のサンプル中のゲノム位置セットに存在に存在するか否かを決定するための方法が本明細書において提供され、当該方法は、各ゲノム位置に対し、当該ゲノム位置に及ぶアンプリコンの効率および１サイクル当たりのエラー率の推定を生成すること、トレーニングデータセットを使用すること、サンプル中の各ゲノム位置に対し実測されたヌクレオチド固有性情報を受信すること、各ゲノム位置で一つ以上の真の変異から生じた一塩基バリアントのパーセントの確率セットを、各ゲノム位置で実測されたヌクレオチド固有性情報と、様々なバリアントのパーセントのモデルとを、各ゲノム位置に対して独立して推定された増幅効率と１サイクル当たりのエラー率を使用して決定すること、および各ゲノム位置に対する確率セットから最も可能性の高い真のバリアントのパーセントと信頼度を決定すること、を含む。
一塩基バリアントが存在するか否かを決定する方法の例示的実施形態において、効率および１サイクル当たりのエラー率の推定は、ゲノム位置に及ぶアンプリコンセットに対して生成される。例えば、ゲノム位置に及ぶ２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、またはそれ以上のアンプリコンが含有され得る。
一塩基バリアントが存在するか否かを決定する方法の例示的な実施形態において、実測されたヌクレオチド固有性情報には、各ゲノム位置に対し実測された総リード数、および各ゲノム位置に対し実測されたバリアントアレルのリード数が含まれる。
一塩基バリアントが存在するか否かを決定する方法の例示的な実施形態において、サンプルは血漿サンプルであり、一塩基バリアントは、サンプルの循環腫瘍ＤＮＡ中に存在する。一塩基バリアントが存在するか否かを決定する方法の例示的な実施形態において、サンプルは血漿サンプルであり、一塩基バリアントは、サンプルの循環胎児ＤＮＡ中に存在する。
別の実施形態では、本明細書において、個体由来のサンプル中に存在する一塩基バリアントのパーセントを推定する方法が提供される。当該方法は、以下の工程を含む：ゲノム位置セットで、当該ゲノム位置に及ぶ一つ以上のアンプリコンに対する効率と１サイクル当たりのエラー率の推定を生成する工程、トレーニングデータセットを使用する工程、サンプル中の各ゲノム位置に対し実測されたヌクレオチド固有性情報を受信する工程、当該アンプリコンの増幅効率と１サイクル当たりのエラー率を使用して、真の変異分子の初期パーセントを含む検索スペースに対し、分子の総数、バックグラウンドのエラー分子、および真の変異分子の推定される平均と分散を生成する工程、および推定される平均と分散を使用した分布を、サンプル中の実測ヌクレオチド固有性情報に適合させることにより最も可能性の高い真の一塩基バリアントのパーセントを決定する工程により、真の変異から生じたサンプル中に存在する一塩基バリアントのパーセントを決定する工程、を含む。
本発明の当該実施形態に関するトレーニングデータセットには、好ましくは健常な個体群からのサンプルが含まれる。特定の例示的な実施形態では、トレーニングデータセットは、一つ以上の試験中サンプルと同じ日に、さらには同じ実行で分析される。例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３６、４８、９６、１００、１９２、２００、２５０、５００、１０００またはそれ以上の健康な個体群からのサンプルを使用して、トレーニングデータセットが生成され得る。より多くの健康な個体、例えば、９６以上のデータが利用可能である場合、試験中サンプルに当該方法を実施する前にランが実行されたとしても、増幅効率の推定に対する信頼度は増加する。ＰＣＲエラー率は、アンプリコン当たりのエラー率であるため、ＳＮＶ塩基の位置だけでなく、ＳＮＶ周囲の全体的な増幅領域に対しても生成される核酸配列情報を使用することができる。例えば、５０の個体由来のサンプルを使用し、ＳＮＶ周囲の２０塩基対のアンプリコンをシーケンスすることで、１０００塩基リードからのエラー頻度データを使用して、エラー頻度率を決定することができる。
典型的には、増幅効率は、増幅されたセグメントに対する増幅効率の平均および標準偏差を推定し、その後、それを例えば二項分布またはベータ二項分布などの分布モデルに適合させることにより推定する。サイクル数が判明しているＰＣＲ反応に対してエラー率が決定され、その後、１サイクル当たりのエラー率が推定される。
特定の例示的な実施形態では、試験データセットの開始分子の推定は、実測リード数が推定リード数と大幅に異なる場合に、工程（ｂ）で推定された開始分子数を使用して、試験データセットに対する効率の推定値を更新することをさらに含む。その後、新しい効率および／または開始分子に対して推定が更新され得る。
分子、バックグラウンドエラー分子、および真の変異分子の総数を推定するために使用される検索スペースは、ＳＮＶ塩基であるＳＮＶ位置の塩基のコピー数の下限に対し、０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％、および上限に対し、１％、２％、２．５％、５％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％からの検索スペースを含み得る。低域である下限に対する０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、または１％、および高域である上限の１％、２％、２．５％、５％、１０％、１２．５％、または１５％は、当該方法が循環腫瘍ＤＮＡを検出している血漿試料の例示的実施例に使用され得る。高域は、腫瘍サンプルに使用される。
分布は、総分子中の総エラー分子数（バックグラウンドエラーと真の変異）に対して適合され、検索スペース中の可能性のある真の変異の各々に対する尤度または確率が計算される。この分布は、二項分布またはベータ二項分布であり得る。
最も可能性の高い真の変異は、最も可能性の高い真の変異のパーセントを決定し、分布適合からのデータを使用して信頼度を計算することにより決定される。例示的な例として、および本明細書に提供される方法の臨床的な解釈の限定ではなく、平均変異率が高い場合、ＳＮＶの陽性判定を行うために必要な信頼度は低くなる。例えば、最も可能性の高い仮説を使用したサンプル中のＳＮＶの平均変異率が５％であり、信頼度が９９％である場合、陽性ＳＮＶ分類が行われる。他方で、この例示的な例に関し、最も可能性の高い仮説を使用したサンプル中のＳＮＶの平均変異率が１％であり、信頼度が５０％である場合、特定の状況では、陽性ＳＮＶ分類は行われない。データの臨床的解釈は、感度、特異性、有病率、および代替品の利用可用性の関数であることを理解されたい。
別の実施形態では、本明細書において、個体由来の試験サンプル中の一つ以上の一塩基バリアントを検出する方法が提供される。当該実施形態による方法は、以下の工程を含む：
複数の各正常個体からの複数の対照サンプルのバリアントアレル頻度の中央値を、シーケンスランで生成された結果に基づき一塩基バリアントの位置セット中の各位置塩基バリアントの位置に対して決定し、閾値を下回る正常サンプル中のアレルバリアント頻度の中央値を有する選択された一塩基バリアントを特定し、一塩基バリアント位置の各々に対する外れサンプルを除去した後、一塩基バリアント位置の各々に対するバックグラウンドエラーを決定する工程、試験サンプルのシーケンスランで生成されたデータに基づき、試験サンプルに関して、選択された一塩基バリアント位置に対する実測リード深度で加重された平均および分散を決定する工程、およびコンピューターを使用して、当該位置のバックグラウンドエラーと比較して統計的に有意なリード深度加重平均を伴う一塩基バリアント位置を一つ以上特定し、それにより一つ以上の一塩基バリアントを検出する工程。
一つ以上のＳＮＶを検出するための当該方法の特定の実施形態では、複数の対照サンプルは、少なくとも２５個のサンプルを含む。特定の例示的な実施形態では、複数の対照サンプルは、下限に対しては少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、または２５０個のサンプル、および上限に対しては１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、２５０、５００、および１０００個のサンプルである。
一つ以上のＳＮＶを検出するための当該方法の特定の実施形態では、ハイスループットシーケンスで生成されたデータから外れ値を削除し、実測リード深度で加重された平均、および実測分散が決定される。一つ以上のＳＮＶを検出するための当該方法の特定の実施形態では、試験サンプルの一塩基バリアント位置の各々に対するリード深度は、少なくとも１００リードである。
一つ以上のＳＮＶを検出するための当該方法の特定の実施形態では、シーケンスランは、限定されたプライマー反応条件下で実施される多重化増幅反応を含む。本明細書に提供される多重化増幅反応を実施するための改善方法を使用して、例示的実施形態におけるこれら実施形態を実施する。
理論により制限されるものではないが、本発明方法は、正常血漿サンプルを使用したバックグラウンドエラーモデルを利用するものであり、当該正常血漿サンプルは、試験サンプルと同じシーケンスランでシーケンスされ、ラン特異的なアーチファクトを説明するものである。例えば、＞０．１％、０．２％、０．２５％、０．５％、０．７５％、および１．０％などの閾値を超える正常バリアントアレル頻度の中央値を有するノイズ位置が除去される。
外れ値のサンプルは、ノイズおよび混入を説明するモデルから繰り返し取り除かれる。全てのゲノム座位の塩基置換毎に、リード深度で加重された平均およびエラー標準偏差が計算される。特定の例示的実施形態では、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、または１０００個のバリアントリードなどの少なくとも閾値のリード数、および特定の実施形態ではバックグラウンドエラーモデルに対して２．５、５、７．５、または１０よりも高いａ１ Ｚスコアを有する一塩基バリアント位置を含む、例えば循環胎児細胞、循環腫瘍細胞またはセルフリー血漿サンプルなどのサンプルは、候補変異として計数される。
特定の実施形態では、範囲の下限に対して、１００、２５０、５００、１，０００、２０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，００００、５０，０００、または１００，０００よりも高いリード深度、および範囲の上限に対して、２０００、２５００、５，０００、７，５００、１０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、または５００，０００よりも高いリード深度が、一塩基バリアント位置セット中の各一塩基バリアント位置に対するシーケンスランにおいて獲得される。典型的には、シーケンスランは、ハイスループットシーケンスのランである。例示的な実施形態では、試験サンプルに対して生成された平均値または中央値は、リード深度により加重される。したがって、１０００リードで検出された一つのバリアントアレルを有するサンプルにおいて、バリアントアレルの決定は真である尤度は、１０，０００リードで検出された一つのバリアントアレルを有するサンプルよりも高く重み付けされる。１００％の信頼度を伴ってバリアントアレル（すなわち、変異）の決定が為されるわけではないため、特定された一塩基バリアントは、候補バリアントまたは候補変異とみなされ得る。
８．３ 相決定されたデータの分析のための例示的な検定統計量
遺伝的に同一ではない二つ以上の細胞を起源とするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する混合サンプルであると判明している、または推測されるサンプルの相決定されたデータの分析に関する例示的な検定統計量を、以下に記載する。ｆは、例えば対象となるＣＮＶを伴うＤＮＡもしくはＲＮＡの割合、または例えば癌細胞などの対象となる細胞からのＤＮＡもしくはＲＮＡの割合といった、対象となるＤＮＡまたはＲＮＡの割合を示す。癌検査の一部の実施形態において、ｆは、癌細胞と正常細胞の混合物中の癌細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡの割合を示し、またはｆは、癌細胞と正常細胞の混合物中の癌細胞の割合を示す。これは対象となる細胞に由来するＤＮＡの割合を指し、２コピーのＤＮＡが対象となる細胞の各々から与えられると仮定していることに留意されたい。これは、欠失または重複したセグメントでの対象となる細胞に由来するＤＮＡ割合とは異なる。
各ＳＮＰの可能性のあるアレルは、ＡおよびＢと示される。ＡＡ、ＡＢ、ＢＡ、およびＢＢを使用して、全ての可能性のある順序でのアレル対が示される。一部の実施形態において、ＡＢまたはＢＡの順序のアレルを有するＳＮＰが分析される。Ｎｉは、ｉ番目のＳＮＰのシーケンスリードの数を示し、ＡｉおよびＢｉは、それぞれ、アレルＡおよびＢを示す、ｉ番目のＳＮＰのリード数を示す。以下が仮定される：
Ｎｉ＝Ａｉ＋Ｂｉ。
アレル比率Ｒｉが規定される：
Figure 2022519159000008
Ｔは、標的とされるＳＮＰの数を示す。
普遍性を失うことなく、一部の実施形態は、一つの染色体セグメントに焦点を当てる。さらなる明確性の問題として、明細書において「第二の相同染色体セグメントと比較された第一の相同染色体セグメント」という文言は、染色体セグメントの第一のホモログと、染色体セグメントの第二のホモログを意味する。一部の実施形態では、標的ＳＮＰのすべてが、対象となる染色体セグメントに含有される。他の実施形態では、複数の染色体セグメントが、コピー数変動の可能性について分析される。
ＭＡＰ推定
この方法は、標的セグメントの欠失または重複を検出するために、順序付けられたアレルを介した相決定の知識を活用する。各ＳＮＰ ｉについて、定義する
Figure 2022519159000009
次いで、定義する
Figure 2022519159000010
様々なコピー数仮説（例えば二染色体、第一もしくは第二のホモログの欠失、または第一もしくは第二のホモログの重複に関する仮説）の下でのＸｉおよびＳの分布が以下に記載される。
二染色体仮説
標的セグメントが欠失または重複していない仮説の下、
Figure 2022519159000011
式中、
Figure 2022519159000012
リードＮの深度が一定であると仮定すると、以下のパラメータを伴う二項分布Ｓが与えられる
Figure 2022519159000013
欠失仮説
第一のホモログが欠失している（すなわち、ＡＢ ＳＮＰが、Ｂとなり、ＢＡ ＳＮＰがＡとなる）仮説の下、Ｒｉは、ＡＢ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000014
 ならびにＢＡ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000015
 を伴い、二項分布を有する。したがって、
Figure 2022519159000016
リードＮの深度が一定であると仮定すると、以下のパラメータを伴う二項分布Ｓが与えられる
Figure 2022519159000017
第二のホモログが欠失している（すなわち、ＡＢ ＳＮＰが、Ａとなり、ＢＡ ＳＮＰがＢとなる）仮説の下、Ｒｉは、ＡＢ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000018
 ならびにＢＡ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000019
 を伴い、二項分布を有する。したがって、
Figure 2022519159000020
リードＮの深度が一定であると仮定すると、以下のパラメータを伴う二項分布Ｓが与えられる
Figure 2022519159000021
重複仮説
第一のホモログが重複している（すなわち、ＡＢ ＳＮＰが、ＡＡＢとなり、ＢＡ ＳＮＰがＢＢＡとなる）仮説の下、Ｒｉは、ＡＢ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000022
 ならびにＢＡ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000023
 を伴い、二項分布を有する。したがって、
Figure 2022519159000024
リードＮの深度が一定であると仮定すると、以下のパラメータを伴う二項分布Ｓが与えられる
Figure 2022519159000025
第二のホモログが重複している（すなわち、ＡＢ ＳＮＰが、ＡＢＢとなり、ＢＡ ＳＮＰがＢＡＡとなる）仮説の下、Ｒｉは、ＡＢ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000026
 ならびにＢＡ ＳＮＰに対してパラメータ
Figure 2022519159000027
 を伴い、二項分布を有する。したがって、
Figure 2022519159000028
リードＮの深度が一定であると仮定すると、以下のパラメータを伴う二項分布Ｓが与えられる
Figure 2022519159000029
分類
上記のセクションで示されたように、Ｘｉは、バイナリ確率変数である。
Figure 2022519159000030
これにより、各仮説下での検定統計量Ｓの確率を計算することができる。測定データを与えられた各仮説の確率を計算することができる。一部の実施形態において、最も高い確率の仮説が選択される。望ましい場合、Ｓの分布は、各Ｎｉを一定のリード深度Ｎで概算するか、またはリード深度を定数Ｎまで切り捨てることにより、単純化することができる。この単純化により、与えられる。
Figure 2022519159000031
ｆの値は、測定データを与えられたｆの最も可能性の高い値、例えば、最尤推定、最大事後確率推定またはベイズ推定など、アルゴリズム（例えば、検索アルゴリズム）を使用して最良データ適合を生じさせるｆの値を選択することにより推定することができる。一部の実施形態では、複数の染色体セグメントが分析され、ｆの値は各セグメントのデータに基づき推定される。すべての標的細胞がこれらの重複または欠失を有する場合、これら様々なセグメントのデータに基づくｆの推定値は類似する。一部の実施形態では、ｆは、例えば、癌性と非癌性のＤＮＡまたはＲＮＡの間のメチル化の差異（低メチル化または高メチル化）に基づいて、癌細胞からＤＮＡまたはＲＮＡの割合を決定することにより、実験的に測定される。
単一仮説の棄却
二染色体仮説に対するＳの分布は、ｆに依存しない。ゆえに測定されたデータの確率は、ｆを計算することなく、二染色体仮説に対して計算することができる。単一仮説棄却の検定を、二染色体のヌル仮説に使用することができる。一部の実施形態において、二染色体仮説下のＳの確率が計算され、当該確率が所与の閾値（例えば、１，０００分の１未満）を下回る場合、当該二染色体仮説は棄却される。これは、染色体セグメントの重複または欠失が存在することを示す。望ましい場合、閾値を調整することにより偽陽性率を変えることができる。
８．４ 相決定されたデータの分析のための例示的方法
遺伝的に同一ではない二つ以上の細胞を起源とするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する混合サンプルであると判明している、または推測されるサンプルからのデータの分析に関する例示的な方法を、以下に記載する。一部の実施形態において、相決定されたデータが使用される。一部の実施形態では、当該方法は、計算された各アレル比率に関し、当該計算されたアレル比率が、予測されたアレル比率を上回るか、または下回るか、および特定の座位について差異の程度を決定することを伴う。一部の実施形態では、特定の仮説について、座位でのアレル比率の尤度分布が決定され、計算されたアレル比率が、尤度分布の中心に近いほど、仮説が正しい可能性が高くなる。一部の実施形態では、当該方法は、各座位に関し、仮説が正しい尤度を決定することを伴う。一部の実施形態では、当該方法は、各座位に関し、仮説が正しい尤度を決定すること、および各座位に対する仮説の確率を組み合わせることを含み、最も高い組み合わせ確率を有する仮説が選択される。一部の実施形態では、当該方法は、各座位に関し、仮説が正しい尤度を決定すること、および一つ以上の標的細胞のＤＮＡまたはＲＮＡと、サンプル中の総ＤＮＡまたは総ＲＮＡの可能性のある各比率を決定することを伴う。一部の実施形態では、各仮定に対する組み合わせ確率は、各座位に対する当該仮説の確率と、可能性のある各比率を組み合わせることにより決定され、最も高い組み合わせ確率を有する仮説が選択される。
一つの実施形態では、以下の仮説が検討される：Ｈ１１（すべての細胞が正常である）、Ｈ１０（ホモログ１のみを有し、ホモログ２を欠失する細胞の存在）、Ｈ０１（ホモログ２のみを有し、ホモログ１を欠失する細胞の存在）、Ｈ２１（ホモログ１の重複を有する細胞の存在）、Ｈ１２（ホモログ２の重複を有する細胞の存在）。例えば癌細胞またはモザイク細胞などの標的細胞の割合ｆ（または標的細胞からのＤＮＡまたはＲＮＡの割合）に対し、ヘテロ接合性（ＡＢまたはＢＡ）のＳＮＰの予測アレル比率は、以下のように見出すことができる：
式（１）：
Figure 2022519159000032
バイアス、混入およびシーケンスエラーの補正：
ＳＮＰでの実測ＤＳは、各アレルが存在する元のマッピングされたリードの数、ｎＡ ０およびｎＢ ０からなる。次に、ＡおよびＢのアレル増幅における予測バイアスを使用して、補正されたリードｎＡおよびｎＢを見出すことができる。
ｃａは、大気混入（例えば、空気中または環境中のＤＮＡからの混入）を示し、ｒ（ｃａ）は、大気混入に対するアレル比率（最初は０．５とされる）を示す。さらに、ｃｇは、遺伝子型決定時の混入率（例えば、別のサンプルからの混入など）を示し、ｒ（ｃｇ）は、混入物に対するアレル比率である。ｓｅ（Ａ，Ｂ）およびｓｅ（Ｂ，Ａ）は、一つのアレルを異なるアレルに分類するシーケンスエラーを示す（例えば、Ｂアレルが存在するときに、Ａアレルを間違って検出するなど）。
大気混入、遺伝子型決定時の混入、およびシーケンスエラーを補正することにより、所与の予測される比率にｒ対する実測アレル比率ｑ（ｒ、ｃａ、ｒ（ｃａ）、ｃｇ、ｒ（ｃｇ）、ｓｅ（Ａ，Ｂ）、ｓｅ（Ｂ，Ａ））を見出すことができる。
混入遺伝子型は不明であるため、集団頻度を使用してＰ（ｒ（ｃｇ））を見出すことができる。より具体的には、ｐを、アレルのうちの一つ（参照アレルと呼称される場合もある）の集団頻度とする。次に、Ｐ（ｒ（ｃｇ）＝０）＝（１－ｐ）２、Ｐ（ｒ（ｃｇ）＝０）＝２ｐ（１－ｐ）、およびＰ（ｒ（ｃｇ）＝０）＝ｐ２とする。ｒ（ｃｇ）に対する条件付き期待値を使用して、Ｅ［ｑ（ｒ、ｃａ、ｒ（ｃａ）、ｃｇ、ｒ（ｃｇ）、ｓｅ（Ａ，Ｂ）、ｓｅ（Ｂ，Ａ））］を決定することができる。大気混入および遺伝子型決定時の混入は、ホモ接合性のＳＮＰを使用して決定されるため、欠失または重複の存在の有無に影響を受けないことに留意されたい。さらに所望に応じて、参照染色体を使用して大気混入および遺伝子型決定時の混入を測定することも可能である。
各ＳＮＰの尤度：
以下の方程式は、アレル比率ｒとした場合のｎＡおよびｎＢを観察する確率を与える式である：
式（２）：
Figure 2022519159000033
Ｄｓは、ＳＮＰ ｓのデータを示す。各仮説のｈ ε｛Ｈ１１、Ｈ０１、Ｈ１０、Ｈ２１、Ｈ１２｝について、式（１）においてｒ＝ｒ（ＡＢ，ｈ）またはｒ＝ｒ（ＢＡ，ｈ）とすることができ、ｒ（ｃｇ）に対する条件付き期待値を見出して、実測アレル比率のＥ［ｑ（ｒ、ｃａ、ｒ（ｃａ）、ｃｇ、ｒ（ｃｇ））］を決定することができる。次いで、式（２）において、ｒ＝Ｅ［ｑ（ｒ、ｃａ、ｒ（ｃａ）、ｃｇ、ｒ（ｃｇ）、ｓｅ（Ａ，Ｂ）、ｓｅ（Ｂ，Ａ））］とすることで、Ｐ（Ｄｓ｜ｈ，ｆ）を決定することができる。
検索アルゴリズム：
一部の実施形態では、外れ値であるように見えるアレル比率を有するＳＮＰは、無視される（例えば、平均値よりも少なくとも２または３標準偏差上回る、または下回るアレル比率を有するＳＮＰを無視または除外する）。この方法で特定される利点は、モザイク化割合が高い場合に、アレル比率の変動性も高い場合があり、ゆえにモザイク化が原因でＳＮＰが除外されないことであることに留意されたい。
Ｆ＝｛ｆ１，…．，ｆＮ｝は、モザイク割合（例えば、腫瘍または胎児の割合）の検索スペースを示す。各ＳＮＰ ｓおよびｆ ε ＦでのＰ（Ｄｓ｜ｈ，ｆ）を決定することができ、およびすべてのＳＮＰの誘導を組み合わせることができる。
アルゴリズムは、各仮説の各ｆを探索する。検索方法を使用して、欠失仮説または重複仮説の信頼度が、無欠失仮説または無重複仮説の信頼度よりも高い、ｆの範囲Ｆ＊が存在する場合、モザイク化が存在すると結論付ける。一部の実施形態において、Ｆ＊におけるＰ（Ｄｓ｜ｈ，ｆ）に対する最大尤度推定値が決定される。望ましい場合、ｆ ε Ｆ＊に対する条件付き期待値が決定されてもよい。望ましい場合、各仮説の信頼度を決定することができる。
一部の実施形態において、ベータ二項分布が、二項分布の代わりに使用される。一部の実施形態では、参照染色体または参照染色体セグメントを使用して、ベータ二項分布のサンプル特異的パラメータが決定される。
８．５ 相決定されたデータを用いずに欠失および重複を検出するための例示的な方法
一部の実施形態では、相決定されていない遺伝子データを使用して、個体のゲノム（例えば、一つ以上の細胞中のゲノム、またはｃｆＤＮＡもしくはｃｆＲＮＡ）中の第二の相同染色体セグメントと比較して、第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現があるかを決定される。一部の実施形態において、相決定された遺伝子データが使用されるが、相は無視される。一部の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルは、二つ以上の遺伝的に異なる細胞に由来するｃｆＲＮＡまたはｃｆＲＮＡを含む、個体由来のｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡの混合サンプルである。一部の実施形態において、当該方法は、各座位に対する計算アレル比率と、予測アレル比率の間の差異の大きさを利用する。
一部の実施形態では、当該方法は、個体からの一つ以上の細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡのサンプル中の染色体または染色体セグメント上の多型座位のセットでの遺伝子データを、各座位の各アレルの量を測定することにより取得することを伴う。一部の実施形態では、アレル比率は、サンプルが誘導された少なくとも一つの細胞においてヘテロ接合性である座位に対して計算される。一部の実施形態では、特定の座位に対し計算されたアレル比率は、当該アレルのうちの一つの測定量を、当該座位のすべてのアレルに対して計算された合計量により割ったものである。一部の実施形態では、特定の座位に対する計算されたアレル比率は、当該アレルのうちの一つ（例えば、第一の相同染色体セグメント上のアレル）の測定量を、当該座位の一つ以上の他のアレル（例えば、第二の相同染色体セグメント上のアレル）の測定量により割ったものである。計算されたアレル比率および予測アレル比率は、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して、または任意の標準的な方法（例えば、本明細書に記載される計算アレル比率または予測アレル比率の任意の数学的変換など）を使用して計算されてもよい。
一部の実施形態において、検定統計量は、各座位に対する計算アレル比率と、予測アレル比率の間の差異の大きさに基づいて計算される。一部の実施形態において、検定統計量Δは、以下の式
Figure 2022519159000034
 を使用して計算される。
式中、δｉは、ｉ番目の座位に対する計算アレル比率と、予測アレル比率の間の差異の大きさであり；
式中、μｉは、δｉの平均値であり；および
式中、σｉ ２は、δｉ・の標準偏差である。
例えば、予測アレル比率が０．５である場合、以下のようにδｉを規定することができる。
Figure 2022519159000035
μｉおよびσｉの値は、Ｒｉが二項確率変数であるという事実を使用してコンピューター計算することができる。一部の実施形態では、標準偏差は、すべての座位に関して同じであると仮定される。一部の実施形態では、標準偏差の平均値もしくは加重平均値、または標準偏差の推定値は、σｉ ２の値に使用される。一部の実施形態では、検定統計量は、正規分布を有すると仮定される。例えば、中心極限定理とは、座位の数（例えば、ＳＮＰｓ Ｔの数など）が大きくなるにつれ、Δの分布が標準的正規に収束することを意味する。
一部の実施形態では、一つ以上の細胞のゲノム中の染色体または染色体セグメントのコピー数を指定する一つ以上の仮説のセットが列挙される。一部の実施形態では、検定統計量に基づき最も可能性が高い仮説が選択され、それに伴い一つ以上の細胞のゲノム中の染色体または染色体セグメントのコピー数が決定される。一部の実施形態では、検定統計量が、当該仮説に対する検定統計量の分布に属する確率が、上限閾値を上回る場合に仮説が選択される。検定統計量が、当該仮説に対する検定統計量の分布に属する確率が、下限閾値を下回る場合に当該仮説の一つ以上が棄却される。または検定統計量が、当該仮説に対する検定統計量に属する確率が、下限閾値と上限閾値の間にある場合、または当該確率が、充分に高い信頼度で決定されない場合、仮説は選択も棄却もされない。一部の実施形態では、上限および／または下限の閾値は、例えばトレーニングデータ（例えば、二倍体サンプルなどのコピー数が判明しているサンプル、または特定の欠失または重複を有することが判明しているサンプルなど）からの分布など、経験分布から決定される。そのような経験分布を使用して、単一仮説の棄却検定に対する閾値を選択することができる。検定統計量Δは、Ｓから独立しているため、必要に応じて両方を独立して使用できることに留意されたい。
８．６ アレルの分布またはパターンを使用した欠失および重複を検出するための例示的な方法
本項は、第二の相同染色体セグメントと比較して、第一の相同染色体セグメントのコピー数が過剰出現しているかを決定する方法を含む。一部の実施形態では、当該方法は、（ｉ）個体の一つ以上の細胞（例えば癌細胞）のゲノム中に存在する染色体または染色体セグメントのコピー数を指定する複数の仮説、または（ｉｉ）個体の一つ以上の細胞のゲノム中の第二の相同染色体セグメントと比較した場合の、第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の程度を指定する複数の仮説を列挙することを伴う。一部の実施形態では、当該方法は、染色体または染色体セグメント上の複数の多型座位（例えば、ＳＮＰ座位）の個体由来の遺伝子データを取得することを伴う。一部の実施形態では、各仮説について、予測される個体の遺伝子型の確率分布が生成される。一部の実施形態では、取得された個体の遺伝子データと、予測される個体の遺伝子型の確率分布との間のデータ適合が計算される。一部の実施形態では、一つ以上の仮説が、当該データ適合に従いランク付けされ、最高位にランク付けされた仮説が選択される。一部の実施形態では、例えば検索アルゴリズムなどの技術またはアルゴリズムが、以下の工程のうちの一つ以上に使用される：データ適合の計算、仮説のランク付け、または最高位にランク付けされた仮説の選択。一部の実施形態では、データ適合は、ベータ二項分布に対する適合であるか、または二項分布に対する適合である。一部の実施形態では、最尤推定、最大事後確率の推定、ベイズ推定、動的推定（例えば動的ベイズ推定）、および期待値最大化推定からなる群から技術またはアルゴリズムが選択される。一部の実施形態では、当該方法は、当該技術またはアルゴリズムを、取得された遺伝子データまたは予測される遺伝子データに適用することを含む。
一部の実施形態では、当該方法は、（ｉ）個体の一つ以上の細胞（例えば癌細胞）のゲノム中に存在する染色体または染色体セグメントのコピー数を指定する複数の仮説、または（ｉｉ）個体の一つ以上の細胞のゲノム中の第二の相同染色体セグメントと比較した場合の、第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現の程度を指定する複数の仮説を列挙することを伴う。一部の実施形態では、当該方法は、染色体または染色体セグメント上の複数の多型座位（例えば、ＳＮＰ座位）の個体由来の遺伝子データを取得することを伴う。一部の実施形態では、遺伝子データは、複数の多型座位のアレル計数を含む。一部の実施形態では、各仮説について、染色体または染色体セグメント上の複数の多型座位で予測されるアレル計数に対する同時分布モデルが生成される。一部の実施形態では、一つ以上の仮説に対する相対的確率は、同時分布モデル、およびサンプルで測定されたアレル計数を使用して決定され、最も高い確率の仮説が選択される。
一部の実施形態では、アレルの分布またはパターン（例えば計算されたアレル比率のパターン）を使用して、例えば欠失または重複など、ＣＮＶの存在の有無が決定される。必要に応じて、ＣＮＶの親起源を、当該パターンに基づき決定することができる。
８．７ 例示的な計数方法／定量的方法
一部の実施形態では、例えば染色体セグメントもしくは染色体全体の欠失または重複など、一つ以上のＣＮＳを検出するために、一つ以上の計数方法（定量方法とも呼称される）が使用される。一部の実施形態では、一つ以上の計数方法を使用して、第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が、第一の相同染色体セグメントの重複によるものか、または第二の相同染色体セグメントの欠失によるものかが決定される。一部の実施形態では、一つ以上の計数方法を使用して、重複している染色体セグメントまたは染色体の余剰なコピーの数が決定される（例えば、１、２、３、４またはそれ以上の余剰なコピーが存在するか否か）。一部の実施形態では、一つ以上の計数方法を使用して、多数の重複と少量の腫瘍割合を有するサンプルと、少数の重複と多量の腫瘍割合を有するサンプルを識別する。例えば、一つ以上の計数方法を使用して、四つの余剰な染色体コピーと１０％の腫瘍割合を有するサンプルと、二つの余剰な染色体コピーと２０％の腫瘍割合を有するサンプルを識別する。例示的な方法は、例えば、米国特許公開２００７／０１８４４６７、２０１３／０１７２２１１、および２０１２／０００３６３７、米国特許第８，４６７，９７６号、第７，８８８，０１７号、第８，００８，０１８号、第８，２９６，０７６号、および第８，１９５，４１５号、２０１４年６月５日に出願された米国特許出願６２／００８，２３５、２０１４年８月４日に出願された米国出願６２／０３２，７８５に開示されており、それら文献は各々その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ｆ値（例えば、腫瘍割合または胎児割合）がＣＮＶ決定において使用されて、例えば、二つの染色体または染色体セグメントの量の間の実測された差異と、ｆの値が与えられた特定のタイプのＣＮＶに対して予測される差異が比較される（例えば、米国特許公開２０１２／０１９００２０、米国特許公開２０１２／０１９００２１、米国特許公開２０１２／０１９０５５７、米国特許公開２０１２／０１９１３５８を参照のこと。当該文献は各々その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、腫瘍割合が増加するにつれ、二染色体性の参照染色体セグメントと比較して、腫瘍中で重複される染色体セグメントの量における差異も増加する。一部の実施形態では、当該方法は、ｆ値に対して、対象となる染色体または染色体セグメントの相対頻度を、参照染色体または参照染色体セグメント（例えば、二染色体性であることが予測または判明している染色体または染色体セグメント）と比較して、ＣＮＶの尤度を決定することを含む。例えば、様々な可能性のあるＣＮＶ（例えば、対象となる染色体セグメントの一つまたは二つの余剰コピーなど）について、第一の染色体または染色体セグメントと、参照染色体または参照染色体セグメントとの間の量の差異は、ｆ値を考慮して予測される差異と比較することができる。
８．８ 参照サンプルを使用した例示的な計数方法／定量的方法
一つ以上の参照サンプルを使用する例示的な定量的方法は、２０１４年６月５日に出願された米国特許出願６２／００８，２３５、および２０１４年８月４日に出願された米国特許出願６２／０３２，７８５に記載されており、当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、一つ以上の染色体または対象となる染色体で、ＣＮＶをなにも有さない可能性が最も高い一つ以上の参照サンプルは、腫瘍ＤＮＡ割合が最も高いサンプルを選択すること、ゼロに最も近いｚ－スコアを有するサンプルを選択すること、最も高い信頼度または尤度を有するＣＮＶに対応しない仮説にデータが適合するサンプルを選択すること、正常であることが判明しているサンプルを選択すること、癌を有する尤度が最も低い個体（例えば、低年齢、乳癌スクリーニングの場合には男性、家族歴が無い、など）由来のサンプルを選択すること、ＤＮＡのインプット量が最も高いサンプルを選択すること、最も高いシグナルとノイズの比を有するサンプルを選択すること、癌を有する尤度と相関すると考えられている他の基準に基づきサンプルを選択すること、またはいくつかの基準の組み合わせを使用してサンプルを選択することにより、特定される。参照セットが選択された時点で、これらの事例が二染色体性であると仮定し、次いでＳＮＰあたりのバイアス、すなわち各座位に対する実験特異的な増幅と他の処理バイアスを推定することができる。次いで、この実験特異的バイアスの推定を使用して、例えば第２１番染色体の座位などの対象となる染色体および必要に応じて他の染色体の座位の測定におけるバイアスを、第２１番染色体に関して二染色体性と仮定されている、サブセットの一部ではないサンプルに対して補正する。倍数性が不明なこれらサンプルにおいて、バイアスが補正されたら、次いでこれらサンプルのデータを、個体がトリソミー２１に罹患しているかを決定する同一の方法または別の方法を使用して、２回分析することができる。例えば、定量的方法は、倍数性が不明の残りのサンプルに対して使用することができ、ｚ－スコアは、第２１番染色体の補正された測定遺伝子データを使用して計算することができる。あるいは、第２１番染色体の倍数性の状態に関する予備的な推定の一部として、癌を有すると推測される個体に由来するサンプルの腫瘍割合を計算することができる。当該腫瘍割合を有する場合について、二染色体性の場合に予測される補正リードの割合（二染色体性仮説）、およびトリソミーの場合に予測される補正リードの割合（トリソミー仮説）を計算することができる。あるいは、過去に腫瘍割合が測定されなかった場合、異なる腫瘍割合について、二染色体仮説およびトリソミー仮説のセットを生成することができる。各例について、様々なＤＮＡ座位の選択と測定において予測される統計的変動を考慮し、補正リードの割合に関する予測分布を計算することができる。実測された補正リード割合は、予測補正リード割合の分布と比較することができ、倍数性が不明な各サンプルについて、二染色体仮説とトリソミー仮説に対して尤度比を計算することができる。最も高い計算尤度を有する仮説に関連付けられる倍数性の状態が、正しい倍数性の状態として選択され得る。
８．９ 例示的な参照染色体または参照染色体セグメント
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちの任意の方法が、一つ以上の参照染色体または参照染色体セグメントに対して実施され、その結果は、対象となる一つ以上の染色体または染色体セグメントと比較される。
一部の実施形態では、参照染色体または参照染色体セグメントは、ＣＮＶが存在しないと予測されるものに対する対照として使用される。一部の実施形態では、参照は、当該染色体または染色体セグメントにおいて欠失または重複を有さないと判明している、または予測される一つ以上の様々なサンプルと同じ染色体または染色体セグメントである。一部の実施形態では、参照は、二染色体性であると予測される検査サンプルとは異なる染色体または染色体セグメントである。一部の実施形態では、参照は、検査される同一サンプル中の対象となる染色体のうちの一つに由来する異なるセグメントである。例えば、参照は、潜在的な欠失領域または重複領域の外側の一つ以上のセグメントであってもよい。検査される同一染色体上に参照があることによって、例えば代謝、アポトーシス、ヒストン、不活化および／または増幅における染色体間の差異など、異なる染色体間の変動が回避される。検査される染色体と同一の染色体上にＣＮＶを有さないセグメントの分析を行い、代謝、アポトーシス、ヒストン、不活化、および／または増幅におけるホモログ間の差異を決定することができ、その結果、ＣＮＶの非存在下でのホモログ間の変動レベルが決定され、潜在的なＣＮＶからの結果と比較することができる。一部の実施形態では、潜在的なＣＮＶに関し、計算アレル比率と予測アレル比率の間の差異の程度は、参照に対して相当する程度よりも大きく、それによりＣＮＶの存在が確認される。
一部の実施形態では、参照染色体または参照染色体セグメントは、例えば特に対象となる欠失または重複などのＣＮＶが存在すると予測されるものに対する対照として使用される。一部の実施形態では、参照は、当該染色体または染色体セグメントにおいて欠失または重複を有すると判明している、または予測される一つ以上の様々なサンプルと同じ染色体または染色体セグメントである。一部の実施形態では、参照は、ＣＮＶを有すると判明または予測される検査サンプルとは異なる染色体または染色体セグメントである。一部の実施形態では、潜在的なＣＮＶに関し、計算アレル比率と予測アレル比率の間の差異の程度は、ＣＮＶの参照に対して相当する程度よりも少なく（例えば、有意に違わない）、それによりＣＮＶの存在が確認される。一部の実施形態では、潜在的なＣＮＶに関し、計算アレル比率と予測アレル比率の間の差異の程度は、ＣＮＶの参照に対して相当する程度よりも小さく（例えば、有意に小さい）、それによりＣＮＶの非存在が確認される。一部の実施形態では、癌細胞（またはｃｆＤＮＡもしくはｃｆＲＮＡなどの癌細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ）の遺伝子型が、非癌性細胞（またはｃｆＤＮＡもしくはｃｆＲＮＡなどの非癌性細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ）の遺伝子型とは異なる一つ以上の座位が使用されて、腫瘍割合が決定される。腫瘍割合を使用して、第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現が、第一の相同染色体セグメントの重複によるものか、または第二の相同染色体セグメントの欠失によるものかが決定され得る。さらに腫瘍割合を使用して、重複する染色体セグメントまたは染色体の余剰コピー数を決定して（例えば、１、２、３、４またはそれ以上の余剰コピーが存在するかを決定して）、例えば四つの余剰染色体コピーと１０％の腫瘍割合を有するサンプルを、二つの余剰染色体コピーと２０％の腫瘍割合を有するサンプルを識別することもできる。さらに腫瘍割合を使用して、可能性のあるＣＮＶについて、実測データが、予測データにどの程度適合するかを決定することができる。一部の実施形態では、ＣＮＶの過剰出現の程度を使用して、個体に特定の治療法または治療レジメンが選択される。例えば一部の治療薬は、少なくとも四つ、六つ、またはそれ以上のコピー数の染色体セグメントに対してのみ有効である。
一部の実施形態では、腫瘍割合を決定するために使用される一つ以上の座位は、参照染色体または参照染色体セグメント、例えば二染色体性であることが判明もしくは予測される染色体または染色体セグメント、一般的に癌細胞で、または個体が有することが判明もしくは有するリスクが増している特定のタイプの癌で、稀に重複または欠失する染色体もしくは染色体セグメント、または異数性である可能性が低い染色体もしくは染色体セグメント（欠失または重複した場合、細胞死が生じると予測されるセグメント）にある。一部の実施形態では、本発明の方法のいずれかを使用して、参照染色体または染色体セグメントが、癌細胞および非癌性細胞の両方において二染色体性であることが確認される。一部の実施形態では、二染色体分類の信頼度が高い一つ以上の染色体または染色体セグメントが使用される。
腫瘍割合を決定するために使用され得る座位の例としては、個体の非癌性細胞（または非癌性細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在しない、癌細胞（または癌細胞に由来するｃｆＤＮＡもしくはｃｆＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ）中の多型または変異（例えば、ＳＮＰ）が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍割合は、個体からのサンプル（例えば、血漿サンプルまたは腫瘍生検）中の非癌性細胞（または非癌性細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ）中には存在しないアレルを癌細胞（または癌細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ）が有する多型座位を特定すること、および当該特定された多型座位のうちの一つ以上で癌細胞に固有のアレルの量を使用して、サンプル中の腫瘍割合を決定することにより決定される。一部の実施形態では、非癌性細胞は、多型座位で第一のアレルに関してホモ接合性であり、癌細胞は、多型座位で（ｉ）第一のアレルと第二のアレルに関してヘテロ接合性であるか、または（ｉｉ）第二のアレルに関してホモ接合性である。一部の実施形態では、非癌性細胞は、多型座位で第一のアレルと第二のアレルに関してヘテロ接合性であり、癌細胞は、多型座位で（ｉ）１コピーまたは２コピーの第三のアレルを有する。一部の実施形態では、癌細胞は、非癌性細胞には存在しないアレルを１コピーのみ有すると仮定され、または判明している。例えば、非癌性細胞の遺伝子型がＡＡであり、癌細胞がＡＢであり、サンプル中の当該座位でのシグナルの５％がＢアレル由来であり、９５％がＡアレル由来である場合、サンプルの腫瘍割合は、１０％である。一部の実施形態では、癌細胞は、非癌性細胞には存在しないアレルを２コピー有すると仮定され、または判明している。例えば、非癌性細胞の遺伝子型がＡＡであり、癌細胞がＢＢであり、サンプル中の当該座位でのシグナルの５％がＢアレル由来であり、９５％がＡアレル由来である場合、サンプルの腫瘍割合は、５％である。一部の実施形態では、非癌性細胞にはないアレルを癌細胞が有する複数の座位を分析して、癌細胞中の座位のいずれがヘテロ接合性であり、いずれがホモ接合性であるかが決定される。例えば、非癌性細胞がＡＡである座位について、Ｂアレルからのシグナルが、一部の座位では約５％、そして一部の座位では約１０％である場合、癌細胞は、約５％のＢアレルを有する座位でヘテロ接合性、約１０％のＢアレルを有する座位ではホモ接合性であると仮定される（腫瘍割合が約１０％であることを示す）。
腫瘍割合の決定に使用され得る座位の例としては、癌細胞と非癌性細胞が共通して一つのアレルを有し得る座位（例えば、癌細胞がＡＢであり、非癌性細胞がＢＢであるか、または癌細胞がＢＢであり、非癌性細胞がＡＢである座位）が挙げられる。Ａシグナルの量、Ｂシグナルの量、または混合サンプル（癌細胞と非癌性細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含有する）中のＡシグナルとＢシグナルの比率は、（ｉ）癌細胞のみに由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含有するサンプル、または（ｉｉ）非癌性細胞のみに由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含有するサンプル、に対応する値と比較される。値の差を使用して、混合サンプルの腫瘍割合が決定される。
一部の実施形態では、腫瘍割合の決定に使用され得る座位は、（ｉ）癌細胞のみに由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含有するサンプル、および／または（ｉｉ）非癌性細胞のみに由来するＤＮＡまたはＲＮＡを含有するサンプル、の遺伝子型に基づいて選択される。一部の実施形態では、座位は、混合サンプルの分析に基づいて選択され、例えば、各アレルの絶対量または相対量が、癌細胞と非癌性細胞の両方が特定の座位で同じ遺伝子型を有する場合に予測される量とは異なっている座位である。例えば、癌細胞と非癌性細胞が同じ遺伝子型を有する場合、座位は、全ての細胞がＡＡである場合に０％のＢシグナル、全ての細胞がＡＢである場合に５０％のＢシグナル、または全ての細胞がＢＢである場合に１００％のＢシグナルを生じさせると予測される。Ｂシグナルが他の値であれば、癌細胞と非癌性細胞の遺伝子型は、当該座位で異なっており、当該座位を使用して腫瘍割合を決定できることが示される。
一部の実施形態では、一つ以上の座位でのアレルに基づき計算された腫瘍割合は、本明細書に開示される計数方法のうちの一つ以上を使用して計算された腫瘍割合と比較される。
８．１０ 表現型の検出方法の例または多重変異分析方法の例
一部の実施形態では、当該方法は、疾患もしくは障害（例えば、癌）に関連する、または疾患もしくは障害のリスク増大に関連する変異のセットに関し、サンプルを分析することを含む。方法のシグナルとノイズの比を改善し、腫瘍を別個の臨床サブセットに分類するために使用され得るクラス（例えば、ＭまたはＣの癌クラス）内での事象間には強い相関が存在する。例えば、一緒に検討される一つ以上の染色体または染色体セグメント上のいくつかの変異（例えば、いくつかのＣＮＶ）に対する不明確な結果は、非常に強いシグナルである場合がある。一部の実施形態では、対象となる複数の多型または変異（例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、またはそれ以上）の有無を決定することにより、例えば癌などの疾患もしくは障害の有無、または例えば癌などの疾患もしくは障害を有するリスク増大の有無の決定の感度および／または特異度が増す。一部の実施形態では、複数の染色体にわたる事象間の相関を使用して、個々に各シグナルを検討するよりも強力にシグナルが検討される。方法自体の設計は、腫瘍を最もよくカテゴライズするよう最適化され得る。これは、一つの特定の変異／ＣＮＶに対する感受性が最も重要であり得る、再発の早期検出およびスクリーニングに非常に有用であり得る。一部の実施形態では、事象は必ずしも相関しているわけではなく、相関する確率を有している。一部の実施形態では、非対角線上の条件を有するノイズ共分散行列を伴う行列推定式が使用される。
一部の実施形態では、本発明は、個体の表現型（例えば、癌の表現型）を検出するための方法を特徴とし、当該表現型は、変異セットのうちの少なくとも一つの存在により規定される。一部の実施形態では、当該方法は、個体からの一つ以上の細胞に由来するＤＮＡまたはＲＮＡのサンプルに対し、ＤＮＡまたはＲＮＡの測定値を取得することであって、当該細胞のうちの一つ以上が、表現型を有すると推測される、取得すること、および当該ＤＮＡまたは当該ＲＮＡの測定値を分析して、当該変異のセット中の各変異について、当該細胞の少なくとも一つが当該変異を有する尤度を決定することを含む。一部の実施形態では、当該方法は、（ｉ）当該変異の少なくとも一つについて、当該細胞の少なくとも一つが当該変異を含有する尤度が、閾値よりも高く、または（ｉｉ）当該変異の少なくとも一つについて、当該細胞の少なくとも一つが当該変異を有する尤度が、閾値よりも低く、および当該変異の複数について、当該細胞の少なくとも一つが当該変異の少なくとも一つを有する組み合わせ尤度が、閾値よりも高い、のいずれかの場合に、当該個体が表現型を有すると決定することを含む。一部の実施形態では、一つ以上の細胞は、変異セット中のサブセットまたは全の変異を有する。一部の実施形態では、変異のサブセットは、癌に関連し、または癌のリスク増加に関連する。一部の実施形態では、変異セットは、癌変異のＭクラスにおける変異のサブセットまたはすべてを含む（Ｃｉｒｉｅｌｌｏ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４５（１０）：１１２７－１１３３，２０１３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．２７６２、当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、変異セットは、癌変異のＣクラスにおける変異のサブセットまたはすべてを含む（Ｃｉｒｉｅｌｌｏ、上記）。一部の実施形態では、サンプルは、セルフリーのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡの測定値は、対象となる一つ以上の染色体または染色体セグメント上の多型座位のセットでの測定値（各座位での各アレルの量など）を含む。
８．１１ 方法の組み合わせの例
結果の精度を高めるために、ＣＮＶの有無を検出するための二つ以上の方法（例えば、本発明の方法のいずれかまたは任意の公知の方法）が実施される。一部の実施形態では、疾患もしくは障害の有無、または疾患もしくは障害のリスク増大を示す因子を分析する一つ以上の方法（例えば、本明細書に記載される方法または任意の公知の方法）が実施される。
一部の実施形態では、標準的な数学的技術を使用して、二つ以上の方法間の共分散および／または相関が計算される。さらに標準的な数学的手法を使用して、二つ以上の検定に基づく特定の仮説の複合確率を決定してもよい。例示的な技術としては、メタ分析、ナリシス、独立検定に対するフィッシャーの複合確率検定、既知の共分散と従属ｐ値を組み合わせるブラウン法、および未知の共分散と従属ｐ値を組み合わせるコスト（Ｋｏｓｔ）法が挙げられる。第二の方法に対して尤度が決定される場合に対して、ある意味で直交または非関連となる第一の方法により尤度が決定される場合、尤度を組み合わせることは単純であり、乗算または正規化により行うことができ、または例えば以下の式を使用して行うことができる：
Ｒｃｏｍｂ＝Ｒ１Ｒ２／［Ｒ１Ｒ２＋（１－Ｒ１）（１－Ｒ２）］
Ｒｃｏｍｂは、組み合わされた尤度であり、Ｒ１およびＲ２は、個々の尤度である。例えば、方法１からのトリソミーの尤度が９０％であり、方法２からのトリソミーの尤度が９５％である場合、二つの方法からの結果を組み合わせることにより、臨床医は、（０．９０）（０．９５）／［（０．９０）（０．９５）＋（１－０．９０）（１－０．９５）］
＝９９．４２％の尤度で胎児がトリソミーであると結論づけることができる。第一および第二の方法が直交しない場合、すなわち、二つの方法の間に相関がある場合でも、尤度を組み合わせることができる。
複数の因子または変数を分析する方法の例は、２０１１年９月２０日に発行された米国特許第８，０２４，１２８号、２００６年７月３１日に出願された米国公開第２００７／００２７６３６号、および２００６年１２月６日に出願された米国公開第２００７／０１７８５０１号に開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
様々な実施形態では、特定の仮説または診断の複合確率は、８０、８５、９０、９２、９４、９６、９８、９９、または９９．９％よりも大きいか、または何らかの他の閾値よりも大きい。
８．１２ 遺伝子データを相決定するための例示的方法
一部の実施形態では、遺伝子データは、本明細書に記載される方法、または遺伝子データを相決定するための任意の公知の方法を使用して相決定される（例えば、２００９年２月９日に出願されたＰＣＴ公開ＷＯ２００９／１０５５３１、２００９年８月４日に出願されたＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０１７２１４、２０１２年１１月２１日に出願された米国特許公開２０１３／０１２３１２０、２０１０年１０月７日に出願された米国特許公開２０１１／００３３８６２、２０１０年８月１９日に出願された米国特許公開２０１１／００３３８６２、２０１１年２月３日に出願された米国特許公開２０１１／０１７８７１９、２００８年３月１７日に出願された米国特許第８，５１５，６７９号、２００６年１１月２２日に出願された米国特許公開２００７／０１８４４６７、２００８年３月１７日に出願された米国特許公開２００８／０２４３３９８、および２０１４年５月１６日に出願された米国出願６１／９９４，７９１を参照のこと。当該文献は各々参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、ハプロタイプ頻度に基づく集団を使用して、例えばＨａｐＭａｐベースの相決定など、最も可能性の高い相を推定するコンピュータープログラムを使用して相決定される。例えば、一倍体のデータセットは、一般集団（例えば、公開されたＨａｐＭａｐ ＰｒｏｊｅｃｔおよびＰｅｒｌｅｇｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｐｒｏｊｅｃｔのために生成された集団）における公知のハプロタイプブロックを利用して、統計的方法を使用し二倍体データから直接推測されることができる。ハプロタイプブロックは本質的に様々な集団において繰り返し発生する一連の相関アレルである。これらハプロタイプブロックはしばしば古代から共通しているため、これらを使用して二倍体の遺伝子型からハプロタイプを予測する場合がある。このタスクを実現する、公開されて利用可能なアルゴリズムとしては、不完全系統法、共役事前確率分布に基づくベイズ法、および母集団の遺伝学的特徴からの事前確率分布に基づくベイズ法が挙げられる。これらのアルゴリズムの一部は、隠れマルコフモデルを使用する。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、局在化ハプロタイプクラスタリング（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ、例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｐｈａｓｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｓｓｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｗｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｂｙ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ” Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｏｖ ２００７；８１（５）：１０８４－１０９７を参照のこと。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）を使用して相決定される。例示的なプログラムは、Ｂｅａｇｌｅのバージョン：３．３．２またはバージョン４である（ｈｆａｃｕｌｔｙ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｂｒｏｗｎｉｎｇ／ｂｅａｇｌｅ／ｂｅａｇｌｅ．ｈｔｍｌで、ワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、距離、遺伝子型マーカーの順序と間隔、欠損データの補完、組み換え率の推定、またはそれらの組み合わせを伴う連鎖不平衡の減衰を使用するアルゴリズム（例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ａｎｄ Ｓｃｈｅｅｔ，“Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｅｃａｙ ｏｆ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｉｎ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｉｓｓｉｎｇ－Ｄａｔａ Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ” Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７６：４４９－４６２，２００５を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＰＨＡＳＥのｖ．２．１またはｖ２．１．１である（ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、隠れマルコフモデルに従って、クラスター構成物質を染色体に沿って連続的に変化させるアルゴリズムを使用して相決定される。この方法は柔軟性があり、連鎖不平衡の「ブロック様」パターンと、距離がある連鎖不平衡の段階的な低下の両方に可能である（例えば、Ｓｃｈｅｅｔ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，“Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄａｔａ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ ｍｉｓｓｉｎｇ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｃ ｐｈａｓｅ．”Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，７８：６２９－６４４，２００６を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ｆａｓｔＰＨＡＳＥである（ｓｔｅｐｈｅｎｓｌａｂ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、例えば以下の参照データセットのうちの一つ以上を使用する方法など、遺伝子型補完方法を使用して相決定される：ＨａｐＭａｐデータセット、複数のＳＮＰチップ上で遺伝子型判定された対照データセット、および１，０００ゲノムプロジェクトからの高密度型判定されたサンプル。例示的な方法は、正確性を高め、複数の参照パネルにわたって情報を組み合わせる柔軟なモデリングフレームワークである（例えば、Ｈｏｗｉｅ，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ａｎｄ Ｍａｒｃｈｉｎｉ（２００９）“Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．”ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５（６）：ｅ１０００５２９，２００９を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＩＭＰＵＴＥまたはＩＭＰＵＴＥバージョン２（ＩＭＰＵＴＥ２としても知られる）である（ｍａｔｈｇｅｎ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｐｕｔｅ／ｉｍｐｕｔｅ＿ｖ２．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、例えばＰＨＡＳＥ ｖ２．１においてＳｔｅｐｈｅｎｓによって開発されたアルゴリズムなど、組み換えとの合体遺伝的モデルの下でハプロタイプを推測するアルゴリズムなどのハプロタイプを推測するアルゴリズムを使用して相決定される。主要なアルゴリズムの改善は、各個体の候補ハプロセットのセットを表す二分木の使用に依存する。これらの二分木の表現は、（１）ＰＨＡＳＥ ｖ２．１で作成された冗長な動作を回避することによって、ハプロタイプの事後確率の計算速度を速める、および（２）二分木において最もらしい経路（すなわちハプロタイプ）のスマートな探索を行うことにより、ハプロタイプ推測問題に関する指数関数的な態様を克服する（例えば、Ｄｅｌａｎｅａｕ，Ｃｏｕｌｏｎｇｅｓ ａｎｄ Ｚａｇｕｒｙ，“Ｓｈａｐｅ－ＩＴ：ｎｅｗ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ９：５４０，２００８ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－９－５４０を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＳＨＡＰＥＩＴである（ｍａｔｈｇｅｎ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｈａｐｅｉｔ／ｓｈａｐｅｉｔ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、ハプロタイプ－断片頻度を使用して、より長いハプロタイプに対する実験ベースの確率を取得するアルゴリズムを使用して相決定される。一部の実施形態では、アルゴリズムはハプロタイプを再構築する。それによって、ハプロタイプは最大の局所的一貫性を有するようになる（例えば、Ｅｒｏｎｅｎ，Ｇｅｅｒｔｓ，ａｎｄ Ｔｏｉｖｏｎｅｎ，“ＨａｐｌｏＲｅｃ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ，”ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：５４２，２００６を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＨａｐｌｏＲｅｃ、例えばＨａｐｌｏＲｅｃのバージョン２．３である（ｃｓ．ｈｅｌｓｉｎｋｉ．ｆｉ／ｇｒｏｕｐ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えばパーティション－ライゲーション戦略を使用するアルゴリズム、および期待値最大化ベースのアルゴリズムなどのアルゴリズムを使用して相決定される（例えば、Ｑｉｎ，Ｎｉｕ，ａｎｄ Ｌｉｕ，“Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ－Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ－Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，”Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７１（５）：１２４２－１２４７，２００２を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＰＬ－ＥＭである（ｐｅｏｐｌｅ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／～ｊｕｎｌｉｕ／ｐｌｅｍ／ｃｌｉｃｋ．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、遺伝子型をハプロタイプとブロック分割に同時に相決定するアルゴリズムなどのアルゴリズムを使用して相決定される。一部の実施形態では、期待値最大化アルゴリズムが使用される（例えば、Ｋｉｍｍｅｌ ａｎｄ Ｓｈａｍｉｒ，“ＧＥＲＢＩＬ：Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｌｏｃｋ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ，” Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＰＮＡＳ）１０２：１５８－１６２，２００５を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＧＥＶＡＬＴバージョン２プログラムの一部として入手可能なＧＥＲＢＩＬである（ａｔ ａｃｇｔ．ｃｓ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／ｇｅｖａｌｔ／でワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、ＥＭアルゴリズムを使用して、相を指定しない遺伝子型測定値を与えられたハプロタイプ頻度のＭＬ推定値を計算するアルゴリズムなどを使用して相決定される。当該アルゴリズムはさらに、一部の遺伝子型の測定値を（例えば、ＰＣＲの失敗を原因として）欠落させる。また当該アルゴリズムは、個々のハプロタイプの多重補完も可能である（例えば、Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．（２００２），“ＳＮＰＨＡＰ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ＳＮＰｓ”を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、ＳＮＰＨＡＰである。
一つの実施形態では、個体の遺伝子データは、集団の遺伝子型データからハプロタイプを推定するアルゴリズム、例えば、ＳＮＰペア形成のために収集された遺伝子型の統計値に基づくハプロタイプ推定のためのアルゴリズムを使用して相決定される。このソフトウェアを使用して、例えばＤＮＡアレイから取得された多数の長いゲノム配列の比較的正確な相決定を行うことができる。例示的なプログラムは、遺伝子型マトリックスを入力として取り込み、対応するハプロタイプマトリックスを出力する（例えば、Ｂｒｉｎｚａ ａｎｄ Ｚｅｌｉｋｏｖｓｋｙ，“２ＳＮＰ：ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｈａｓｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２－ＳＮＰ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ，” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２２（３）：３７１－３，２００６を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例示的なプログラムは、２ＳＮＰである（ａｌｌａ．ｃｓ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／～ｓｏｆｔｗａｒｅ／２ＳＮＰでワールドワイドウェブで利用可能である。当該プログラムはその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
様々な実施形態では、個体の遺伝子データは、染色体または染色体セグメントの異なる位置で染色体が交差する確率に関するデータを使用して（例えば、任意の間隔について組み換えリスクスコアを生成する、ＨａｐＭａｐデータベースで見出され得る組み換えデータを使用して）、相決定され、染色体または染色体セグメント上の多型アレル間の依存度をモデル化する。一部の実施形態では、多型座位でのアレル数は、シーケンスデータまたはＳＮＰアレイデータに基づいてコンピューター上で計算される。一部の実施形態では、多数の仮説の各々が、染色体または染色体セグメントの様々な可能性のある状態（例えば、個体からの一つ以上の細胞のゲノム中の第二の相同染色体セグメントと比較した場合の第一の相同染色体セグメントのコピー数の過剰出現、第一の相同染色体セグメントの重複、第二の相同染色体セグメントの重複、または第一と第二の相同染色体セグメントの均等な出願）に関連し、生成される（例えば、コンピューター上で生成される）。染色体上の多型座位での予測アレル数に対するモデル（例えば、同時分布モデル）が各仮説に対して構築される（例えば、コンピューター上で構築される）。各仮説の相対的な確率が、当該同時分布モデルおよびアレル数を使用して決定される（例えば、コンピューター上で決定される）。そして最も高い確率の仮説が選択される。一部の実施形態では、アレル数に関する同時分布モデルの構築、および各仮説の相対的な確率を決定する工程は、参照染色体を使用する必要がない方法を使用して為される。
一部の実施形態では、個体由来のサンプル（例えば、腫瘍生検、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、または対象となるＣＮＶを有する主たる、もしくは唯一の細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する可能性が高い別のサンプル）が分析されて、対象となるＣＮＶ（例えば、欠失または重複）を含有することが判明している、または推測される一つ以上の領域の相が決定される。一部の実施形態では、サンプルは、高い腫瘍割合（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または１００％など）を有する。一部の実施形態では、サンプルは、胎児を妊娠している母親からの血液サンプルである。一部の実施形態では、胎児を妊娠している母親からの血液サンプルは、循環胎児細胞、および／または胎児ＤＮＡを含有する。
一部の実施形態では、サンプルは、ハプロタイプの不均衡または任意の異数性を有する。一部の実施形態では、サンプルは、２種類のＤＮＡの任意の混合を含み、当該２種類のＤＮＡは、異なる比率の二つのハプロタイプを有し、少なくとも一つのハプロタイプを共有する。一部の実施形態では、少なくとも１０個、１００個、５００個、１，０００個、２，０００個、３，０００個、５，０００個、８，０００個、または１０，０００個の多型座位が分析され、座位の一部またはすべてのアレルの相が決定される。一部の実施形態では、サンプルは、たとえば長期の細胞培養により誘導された異数性など、処理されて異数性となった細胞または組織に由来する。
一部の実施形態では、サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの大部分またはすべてが、対象となるＣＮＶを有する。一部の実施形態では、総ＤＮＡまたは総ＲＮＡに対する、対象となるＣＮＶを含有する一つ以上の標的細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡのサンプル中の比率は、少なくとも８０、８５、９０、９５、または１００％である。欠失を有するサンプルについては、欠失を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）について、一つのハプロタイプのみが存在する。この第一のハプロタイプは、欠失領域中に存在するアレルの固有性を決定する標準的な方法を使用して決定され得る。欠失を含む細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）のみを含有するサンプルでは、それら細胞に存在する第一のハプロタイプからのシグナルのみが存在する。欠失を伴わない少量の細胞（またはＤＮＡまたはＲＮＡ）（少量の非癌性細胞など）も含有するサンプルでは、これらの細胞（またはＤＮＡまたはＲＮＡ）中の第二のハプロタイプからの弱いシグナルは無視することができる。欠失がない個体由来の他の細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する第二のハプロタイプは、推定により決定することができる。例えば、欠失がない個体由来の細胞の遺伝子型が（ＡＢ、ＡＢ）であり、当該個体の相決定データが、第一のハプロタイプが（Ａ、Ａ）であると示す場合、他方のハプロタイプが（Ｂ、Ｂ）であると推測され得る。
欠失を伴う細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）と欠失を伴わない細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）の両方が存在するサンプルについては、相をさらに決定することができる。例えば、ｘ軸は染色体に沿った個々の座位の直線的な位置を表し、ｙ軸は、総（Ａ＋Ｂ）アレルのリードの割合としてＡアレルのリード数を表すプロットを作成することができる。欠失に関する一部の実施形態では、パターンは、個体がヘテロ接合性であるＳＮＰを表す二つの中心バンドを含む（上のバンドは、欠失がない細胞からのＡＢ、および欠失のある細胞からのＡを表し、下のバンドは、欠失の無い細胞からのＡＢ、および欠失のある細胞からのＢを表す）。一部の実施形態では、欠失を伴う細胞、ＤＮＡ、またはＲＮＡの割合が増加するにつれ、これら二つのバンドの分離も増加する。したがって、Ａアレルの固有性を使用して第一のハプロタイプを決定し、Ｂアレルの固有性を使用して、第二のハプロタイプを決定することができる。
重複を有するサンプルについては、重複を有する細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）について、当該ハプロタイプの余剰コピーが存在する。重複領域の当該ハプロタイプは、重複領域中に増加した量で存在するアレルの固有性を決定する標準的な方法を使用して決定することができ、または重複していない領域のハプロタイプは、減少した量で存在するアレルの固有性を決定する標準的な方法を使用して決定することができる。一つのハプロタイプが決定された時点で、他のハプロタイプは推定により決定することができる。
重複を伴う細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）と重複を伴わない細胞（またはＤＮＡもしくはＲＮＡ）の両方が存在するサンプルについては、欠失に関し上述される方法と似た方法を使用して、相をさらに決定することができる。例えば、ｘ軸は染色体に沿った個々の座位の直線的な位置を表し、ｙ軸は、総（Ａ＋Ｂ）アレルのリードの割合としてＡアレルのリード数を表すプロットを作成することができる。欠失に関する一部の実施形態では、パターンは、個体がヘテロ接合性であるＳＮＰを表す二つの中心バンドを含む（上のバンドは、重複がない細胞からのＡＢ、および重複のある細胞からのＡＡＢを表し、下のバンドは、重複の無い細胞からのＡＢ、および重複のある細胞からのＡＢＢを表す）。一部の実施形態では、重複を伴う細胞、ＤＮＡ、またはＲＮＡの割合が増加するにつれ、これら二つのバンドの分離も増加する。したがって、Ａアレルの固有性を使用して第一のハプロタイプを決定し、Ｂアレルの固有性を使用して、第二のハプロタイプを決定することができる。一部の実施形態では、癌があることが判明している個体に由来するサンプル（例えば、腫瘍生検または血漿サンプル）について、一つ以上のＣＮＶ領域の相（例えば、測定された領域中の多型座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％の相）が決定され、同個体に由来するその後のサンプルを分析して、癌の進行がモニタリングされる（例えば、癌の寛解または再発がモニタリングされる）。一部の実施形態では、腫瘍割合が多いサンプル（例えば、腫瘍担持量が多い個体に由来する腫瘍生検または血漿サンプル）を使用して、相決定データが取得され、当該データを使用して、腫瘍割合が少ないその後のサンプル（例えば、癌治療を受けた個体または寛解中の個体の血漿サンプル）の分析が行われる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちの二つ以上を使用して、個体の遺伝子データが相決定される。一部の実施形態では、バイオインフォマティクス法（例えば、母集団ベースのハプロタイプ頻度を使用して最も可能性の高い相を推定する方法）および分子生物学的方法（例えば、バイオインフォマティクスをベースとして推定された相決定データではなく、実際の相決定データを取得するための、本明細書に記載される分子相決定法のいずれか）が使用される。一部の実施形態において、他の対象（例えば、過去の対象）からの相決定データを使用して、母集団データが改善される。例えば、他の対象からの相決定データを母集団データに追加して、別の対象に対して可能性のあるハプロタイプの事前確率分布を計算することができる。一部の実施形態では、他の対象（例えば、過去の対象）からの相決定データを使用して、別の対象に対する可能性のあるハプロタイプの事前確率分布が計算される。
一部の実施形態では、確率的データを使用してもよい。例えば、サンプル中のＤＮＡ分子の出現に関する確率的な性質、ならびに様々な増幅バイアスおよび測定バイアスが原因で、二つの異なる座位から測定された、または所与の座位の異なるアレルから測定されたＤＮＡ分子の相対数は、混合物中の分子の相対数、または個体中の分子の相対数を常に表すとは限らない。個体の血漿からＤＮＡをシーケンスすることにより、常染色体上の所与の座位で正常な二倍体個体の遺伝子型を決定しようと試みる場合、一つのアレルのみが観察されるか（ホモ接合性）、またはおよそ等しい数の二つのアレルが観察される（ヘテロ接合性）ことが予測される。もし当該アレルで、１０分子のＡアレルが観察され、２分子のＢアレルが観察された場合、当該個体が当該座位でホモ接合性であり、２分子のＢアレルはノイズまたは混入が原因であるか、または当該個体はヘテロ接合性であり、Ｂアレルの分子の数が少ないのは、血漿中のＤＮＡ分子数における無作為で統計的な変動、増幅バイアス、混入または他の様々な原因によるものかは、明白ではない。この場合、個体がホモ接合性である確率、および個体がヘテロ接合性である対応する確率は計算することができ、およびこれらの確率的な遺伝子型をさらなる計算に使用することができる。
所与のアレル比率について、当該比率が、個体中のＤＮＡ分子の比率を密接に表している尤度は、観察される分子数が多いほど高くなることに留意されたい。例えば、１００分子のＡと、１００分子のＢが測定された場合、実際の比率が５０％であった尤度は、１０分子のＡと１０分子のＢが測定された場合よりもかなり高い。一つの実施形態では、ベイズ理論をデータの詳細モデルと組み合わせて、実測が行われることで特定の仮説が正しい尤度が決定される。例えば、二つの仮説、すなわちトリソミー個体に相当する仮説と、二染色体個体に相当する仮説を検討する場合、二染色体仮説が正しい確率は、１０分子の各２アレルが観察された場合と比較して、１００分子の各２アレルが観察された場合の方がかなり高い。バイアス、混入、またはその他のノイズ源によってデータのノイズが大きくなるにつれ、または所与の座位での実測数が少なくなるにつれて、実測データを与えられた最大尤度の仮説が真である確率は低下する。実際には、多くの座位での確率を集約して、最大尤度仮説が正しい仮説であると決定され得る信頼度を増加させることが可能である。一部の実施形態では、確率は、組み換えを考慮せずに単純に集約される。一部の実施形態では、計算は、交差が考慮される。
一つの実施形態では、確率的に相決定されたデータが、コピー数変動の決定に使用される。一部の実施形態では、確率的に相決定されたデータは、例えば、ＨａｐＭａｐデータベースなどのデータソースからの母集団ベースのハプロタイプブロック頻度のデータである。一部の実施形態では、確率的に相決定されたデータは、分子学的方法により取得されたハプロタイプデータであり、例えば、染色体の個々のセグメントが、１反応当たり一つの分子に希釈されるが、確率的なノイズが原因で、当該ハプロタイプの固有性は完全には判明しない希釈により相決定される。一部の実施形態では、確率的に相決定されたデータは、分子学的方法により取得されたハプロタイプデータであり、当該ハプロタイプの固有性は、高い確実性で判明している場合がある。
医師が、個体からの血漿ＤＮＡを測定することにより、特定の染色体セグメントで欠失を有する何らかの細胞が体内にあるかを判定したいと望む仮定上のケースを想定する。医師は、血漿ＤＮＡの起源である細胞のすべてが二倍体であり、同じ遺伝子型である場合、ヘテロ接合性の座位について、二つのアレルのそれぞれについて観察されるＤＮＡ分子の相対数は、５０％のＡアレルと５０％のＢアレルを集約する一つの分布に入るという知識を利用し得る。しかし 当該血漿ＤＮＡの起源である細胞の画分が特定の染色体セグメントで欠失を有していた場合、ヘテロ接合性の座位について、当該二つのアレルの各々で観察されるＤＮＡ分子の相対数は、二つの分布に入ると予測され、一つはＢアレルを含有する染色体セグメントに欠失がある座位について、５０％を超えてＡアレルが集約され、一つは、Ａアレルを含有する染色体セグメントに欠失がある座位については、５０％を下回り集約される。血漿ＤＮＡの起源である細胞の比率が高くなると、これら二つの分布は５０％からさらに離れる。
この仮定の例では、個体の体内の細胞の一部において、個体が染色体領域の欠失を有するかを判定したい医師を想定する。医師は、個体から血液をバキュテナーまたは他のタイプの血液チューブに採血し、血液を遠心分離して、血漿層を分離してもよい。医師は、血漿からＤＮＡを単離し、場合により標的化増幅もしくは他の増幅、座位捕捉技術、サイズ濃縮または他の濃縮技術によって標的化とされる座位のＤＮＡを濃縮する。医師は、例えばＳＮＰセットでのアレル数を測定することにより、言い換えれば、アレル頻度データを生成、例えばｑＰＣＲ、シーケンス、マイクロアレイ、またはサンプル中のＤＮＡの量を測定する他の技術といったアッセイを使用して濃縮および／または増幅されたＤＮＡを生成することにより、分析を行ってもよい。本発明者らは、医師が標的化増幅技術を使用してセルフリー血漿ＤＮＡを増幅させ、次いで増幅されたＤＮＡをシーケンスして、癌の指標である染色体セグメント上に存在する６個のＳＮＰで、以下の可能性のある例示的データを得る事例について、データ分析を検討する。この場合において、個体は、当該ＳＮＰでヘテロ接合性であった：
ＳＮＰ１：４６０リードのＡアレル、５４０リードのＢアレル（４６％Ａ）
ＳＮＰ２：５３０リードのＡアレル、４７０リードのＢアレル（５３％Ａ）
ＳＮＰ３：４０リードのＡアレル、６０リードのＢアレル（４０％Ａ）
ＳＮＰ４：４６リードのＡアレル、５４リードのＢアレル（４６％Ａ）
ＳＮＰ５：５２０リードのＡアレル、４８０リードのＢアレル（５２％Ａ）
ＳＮＰ６：２００リードのＡアレル、２００リードのＢアレル（５０％Ａ）
この一連のデータからは、個体が正常であり、全ての細胞が二染色体性である事例と、または個体が癌を有する可能性があり、細胞の一部は、そのＤＮＡが血漿中に存在するセルフリーＤＮＡとなり、染色体で欠失または重複を有する事例とを識別することは困難である場合がある。例えば、最大尤度の二つの仮説は、個体がこの染色体セグメントで欠失を有し、６％の腫瘍割合を伴い、そして染色体の欠失セグメントは、六つのＳＮＰに関して、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ、Ｂ）または（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）の遺伝子型を有する、とする。ＳＮＰセットに関する当該個体の遺伝子型の表現において、括弧内の最初の文字はＳＮＰ１のハプロタイプの遺伝子型に相当し、二番目の文字はＳＮＰ２に相当する。
染色体セグメントでの個体のハプロタイプを決定する方法を使用し、二つの染色体のうちの一つについて、ハプロタイプが（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ、Ｂ）であったことを見出した場合、最大尤度仮説に合致し、個体が当該セグメントで欠失を有し、ゆえに癌性細胞または前癌細胞を有する可能性があるという計算尤度はかなり増加する。一方で、個体がハプロタイプ（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）を有することが見出された場合、個体が当該染色体セグメントにおいて欠失を有する尤度は大きく減少し、おそらく非欠失仮説の尤度が高くなる（実際の尤度値は、例えば特にシステムでの測定ノイズなどの他のパラメータに依存する）。
個体のハプロタイプを決定する方法は多く存在し、その多くが、本明細書において別段に記載される。部分的なリストはここに示されており、網羅的であることは意図されていない。一つの方法は生物学的な方法であり、個々のＤＮＡ分子は、任意の所与の反応ボリューム中に各染色体領域からおよそ一つの分子となるまで希釈され、次いでシーケンスなどの方法を使用して遺伝子型が測定される。別の方法は、情報科学ベースの方法であり、頻度と結び付けられた様々なハプロタイプに関する母集団データを確率的に使用することができる。別の方法は、一つまたは複数の関連個体とともに個体の二倍体データを測定する方法であり、当該関連個体は、個体とハプロタイプブロックを共有し、ハプロタイプブロックを示唆すると予測される。別の方法は、高濃度の欠失セグメントまたは重複セグメントを含む組織サンプルを採取し、アレル不均衡に基づきハプロタイプを測定する方法であり、例えば、欠失を伴う腫瘍組織サンプルからの遺伝子型測定値を使用して、当該領域に対する相決定データを判定することができ、次いでこのデータを使用して、癌が切除後に再増殖していたかを判定することができる。
実際には、典型的には２０個を超えるＳＮＰ、５０個を超えるＳＮＰ、１００個を超えるＳＮＰ、５００個を超えるＳＮＰ、１，０００個を超えるＳＮＰ、または５，０００個を超えるＳＮＰが、所与の染色体セグメントで測定される。
９．変異の例
例えば癌などの疾患または障害、または例えば癌などの疾患または障害のリスク増加（例えば正常レベルを超えるリスク）に関連する変異の例としては、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、多重ヌクレオチド変異、欠失（例えば、２００万～３，０００万塩基対領域の欠失）、重複、またはタンデムリピートが挙げられる。一部の実施形態では、変異は、例えばｃｆＤＮＡ、セルフリーミトコンドリアＤＮＡ（ｃｆ ｍＤＮＡ）、核ＤＮＡ（ｃｆ ｎＤＮＡ）、細胞ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡを起源とするセルフリーＤＮＡなどのＤＮＡ中にある。一部の実施形態では、変異は、例えばｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡなどのＲＮＡ中にある。一部の実施形態では、変異は、疾患または障害（例えば、癌）を有さない対象よりも、疾患または障害（例えば、癌）を有する対象において高頻度に存在する。一部の実施形態では、変異は、例えば原因変異など、癌の指標である。一部の実施形態では、変異は、疾患または障害において原因となる役割を有するドライバー変異である。一部の実施形態では、変異は、原因変異ではない。例えば、一部の癌では複数の変異が蓄積するが、それらのうちのいくつかは原因変異ではない。原因ではない変異（例えば、疾患または障害を有さない対象よりも、疾患または障害を有する対象において高頻度に存在する変異）であっても、疾患または障害の診断に有用であり得る。一部の実施形態では、変異は、一つ以上のマイクロサテライトでのヘテロ接合性の喪失性（ＬＯＨ）である。
一部の実施形態では、対象は、対象が有することが判明している一つ以上の多型または変異についてスクリーニングされる（例えば、その存在、これら多形または変異を有する細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡの量における変化、または癌の寛解もしくは再発の検査のため）。一部の実施形態では、対象は、対象がリスクがあると判明している一つ以上の多型または変異についてスクリーニングされる（例えば、当該多型または当該変異を有する親族がいる対象など）。一部の実施形態では、対象は、例えば癌などの疾患または障害に関連する多形または変異のパネルに関してスクリーニングされる（例えば、少なくとも５個、１０個、５０個、１００個、２００個、３００個、５００個、７５０個、１，０００個、１，５００個、２，０００個、または５，０００個の多型または変異）。
癌に関連する多くのコードバリアントが、Ａｂａａｎらの“Ｔｈｅ Ｅｘｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ－６０ Ｐａｎｅｌ：Ａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｕｌｙ １５，２０１３に記載され、およびｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＮＣＩ６０．ｈｔｍｌでワールドワイドウェブで利用可能である。当該文献等は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。ＮＣＩ－６０ヒト癌細胞株パネルは、肺、結腸、脳、卵巣、乳房、前立腺、および腎臓、ならびに白血病および黒色腫の癌を表す６０個の様々な細胞株からなる。これらの細胞株で特定された遺伝的バリエーションは、以下の二つのタイプからなる：正常集団に存在するＩ型バリアント、および癌特異的なＩＩ型バリアント。
例示的な多型または変異（例えば、欠失または重複）は、以下の遺伝子のうちの一つ以上にある：ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＥＧＦＲ、ＮＲＡＳ、ＮＦ２、ＦＢＸＷ７、ＥＲＢＢｓ、ＡＴＡＤ５、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＡＬＫ、ｐ５３、ＢＲＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＳＥＴＤ２、ＬＲＰ１Ｂ、ＰＢＲＭ、ＳＰＴＡ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＴＲＲＡＰ、ＳＴＡＧ２、ＥＰＨＡ３／５／７、ＰＯＬＥ、ＳＹＮＥ１、Ｃ２０ｏｒｆ８０、ＣＳＭＤ１、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ２．ＦＢＸＷ７、ＫＩＴ、ＭＵＣ４、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＤＤＸ１１、ＤＤＸ１２、ＤＳＰＰ、ＥＰＰＫ１、ＦＡＭ１８６Ａ、ＧＮＡＳ、ＨＲＮＲ、ＫＲＴＡＰ４－１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＬＬ３、ＮＲＡＳ、ＲＢ１、ＳＭＡＤ４、ＴＴＮ、ＡＢＣＣ９、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＧＡＰ１０、ＡＫＴ１、ＡＭＢＮ、ＡＭＰＤ２、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＡＮＫＲＤ４０、ＡＰＯＢＲ、ＡＲ、ＢＩＲＣ６、ＢＭＰ２、ＢＲＡＴ１、ＢＴＮＬ８、Ｃ１２ｏｒｆ４、Ｃ１ＱＴＮＦ７、Ｃ２０ｏｒｆ１８６、ＣＡＰＲＩＮ２、ＣＢＷＤ１、ＣＣＤＣ３０、ＣＣＤＣ９３、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２７、ＣＤＣ４２ＢＰＡ、ＣＤＨ９、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ８、ＣＨＥＫ２、ＣＨＲＮＡ９、ＣＩＺ１、ＣＬＳＰＮ、ＣＮＴＮ６、ＣＯＬ１４Ａ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＯＣＣ、ＣＴＳＦ、ＣＹＰ１Ａ２、ＤＣＬＫ１、ＤＨＤＤＳ、ＤＨＸ３２、ＤＫＫ２、ＤＬＥＣ１、ＤＮＡＨ１４、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ９、ＤＮＡＳＥ１Ｌ３、ＤＵＳＰ１６、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＥＣＴ２、ＥＦＨＢ、ＲＲＮ３Ｐ２、ＴＲＩＭ４９Ｂ、ＴＵＢＢ８Ｐ５、ＥＰＨＡ７、ＥＲＢＢ３、ＥＲＣＣ６、ＦＡＭ２１Ａ、ＦＡＭ２１Ｃ、ＦＣＧＢＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＬＧ２、ＦＬＴ１、ＦＯＬＲ２、ＦＲＹＬ、ＦＳＣＢ、ＧＡＢ１、ＧＡＢＲＡ４、ＧＡＢＲＰ、ＧＨ２、ＧＯＬＧＡ６Ｌ１、ＧＰＨＢ５、ＧＰＲ３２、ＧＰＸ５、ＧＴＦ３Ｃ３、ＨＥＣＷ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＲＡＳ、ＨＳ３ＳＴ１、ＨＳ６ＳＴ１、ＨＳＰＤ１、ＩＤＨ１、ＪＡＫ２、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＩＡＡ０５２８、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ３８、ＫＲＴＡＰ２１－１、ＫＲＴＡＰ４－５、ＫＲＴＡＰ４－７、ＫＲＴＡＰ５－４、ＫＲＴＡＰ５－５、ＬＡＭＡ４、ＬＡＴＳ１、ＬＭＦ１、ＬＰＡＲ４、ＬＰＰＲ４、ＬＲＲＦＩＰ１、ＬＵＭ、ＬＹＳＴ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＯ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＥＧＦ１０、ＭＭＰ１６、ＭＯＲＣ１、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＴＭＲ３、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２、ＭＵＣ２０、ＮＢＰＦ１０、ＮＢＰＦ２０、ＮＥＫ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＬＲＰ４、ＮＯＴＣＨ２、ＮＲＫ、ＮＵＰ９３、ＯＢＳＣＮ、ＯＲ１１Ｈ１、ＯＲ２Ｂ１１、ＯＲ２Ｍ４、ＯＲ４Ｑ３、ＯＲ５Ｄ１３、ＯＲ８Ｉ２、ＯＸＳＭ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＦ１、ＰＲＧ４、ＰＲＰＦ１９、ＰＴＨ２、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＪ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５０、ＲＢＭ１２、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ２２、ＲＯＲ１、ＲＰ１１－６７１Ｍ２２．１、ＲＰ１３－９９６Ｆ３．４、ＲＰ１Ｌ１、ＲＳＢＮ１Ｌ、ＲＹＲ３、ＳＡＭＤ３、ＳＣＮ３Ａ、ＳＥＣ３１Ａ、ＳＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＬＣ２５Ａ２、ＳＬＣ４４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＭＡＤ２、ＳＰＴＡ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴＫ１１、ＳＺＴ２、ＴＡＦ１Ｌ、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＴＢＰ、ＴＧＦＢＩ、ＴＩＦ１、ＴＭＥＭ１４Ｂ、ＴＭＥＭ７４、ＴＰＴＥ、ＴＲＡＰＰＣ８、ＴＲＰＳ１、ＴＸＮＤＣ６、ＵＳＰ３２、ＵＴＰ２０、ＶＡＳＮ、ＶＰＳ７２、ＷＡＳＨ３Ｐ、ＷＷＴＲ１、ＸＰＯ１、ＺＦＨＸ４、ＺＭＩＺ１、ＺＮＦ１６７、ＺＮＦ４３６、ＺＮＦ４９２、ＺＮＦ５９８、ＺＲＳＲ２、ＡＢＬ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＡＸＬ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＬＭ、ＢＲＩＰ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＩＣ、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ１、ＤＡＸＸ、ＤＤＲ２、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＭＳＹ（Ｃ１１ｏｒｆ３０）、ＥＰ３００、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＭ１２３Ｂ（ＷＴＸ）、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＬ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＩＤ４（Ｃ１７ｏｒｆ３９）、ＧＮＡ１１、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＫ３Ｂ、ＨＧＦ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ７Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ（ＭＹＳＴ３）、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＬＨＬ６、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＤ１２、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＦ１、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＤＫ１、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＤ５１、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＮＦ４３、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＴＡＴ４、ＳＵＦＵ、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＶＨＬ、ＷＩＳＰ３、ＷＴ１、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ７０３、およびそれらの組み合わせ（Ｓｕら、Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ２０１１、１３：７４－８４；ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｏｌｄｘ．２０１０．１１．０１０；およびＡｂａａｎら、“Ｔｈｅ Ｅｘｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＩ－６０ Ｐａｎｅｌ：Ａ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ”、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｕｌｙ １５、２０１３、当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、重複は、乳癌に関連する染色体１ｐ（Ｃｈｒ１ｐ）重複である。一部の実施形態では、一つ以上の多型または変異は、例えばＶ６００Ｅ変異など、ＢＲＡＦ中にある。一部の実施形態では、一つ以上の多型または変異は、Ｋ－ｒａｓにある。一部の実施形態では、Ｋ－ｒａｓおよびＡＰＣにおける一つ以上の多型または変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、Ｋ－ｒａｓおよびｐ５３における一つ以上の多型または変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、ＡＰＣおよびｐ５３における一つ以上の多型または変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、Ｋ－ｒａｓ、ＡＰＣおよびｐ５３における一つ以上の多型または変異の組み合わせが存在する。一部の実施形態では、Ｋ－ｒａｓおよびＥＧＦＲにおける一つ以上の多型または変異の組み合わせが存在する。例示的な多型または変異は、以下のマイクロＲＮＡのうちの一つ以上にある：ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２３ｂ、ｍｉＲ－２４－１、ｍｉＲ－２４－２、ｍｉＲ－２７ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－２９ｂ－２、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、およびｍｉＲ－２２３（Ｃａｌｉｎら、Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：１７９３－８０１，２００５。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、欠失は、少なくとも０．０１ｋｂ、０．１ｋｂ、１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１ｍｂ、２ｍｂ、３ｍｂ、５ｍｂ、１０ｍｂ、１５ｍｂ、２０ｍｂ、３０ｍｂ、または４０ｍｂの欠失である。一部の実施形態では、欠失は、１ｋｂ以上～４０ｍｂ以下、例えば、１ｋｂ以上～１００ｋｂ以下、１００ｋｂ以上～１ｍｂ以下、１以上～５ｍｂ以下、５以上～１０ｍｂ以下、１０以上～１５ｍｂ以下、１５以上～２０ｍｂ以下、２０以上～２５ｍｂ以下、２５以上～３０ｍｂ以下、または３０以上～４０ｍｂ以下の欠失である。
一部の実施形態では、重複は、少なくとも０．０１ｋｂ、０．１ｋｂ、１ｋｂ、１０ｋｂ、１００ｋｂ、１ｍｂ、２ｍｂ、３ｍｂ、５ｍｂ、１０ｍｂ、１５ｍｂ、２０ｍｂ、３０ｍｂ、または４０ｍｂの重複である。一部の実施形態では、重複は、１ｋｂ以上～４０ｍｂ以下、例えば、１ｋｂ以上～１００ｋｂ以下、１００ｋｂ以上～１ｍｂ以下、１以上～５ｍｂ以下、５以上～１０ｍｂ以下、１０以上～１５ｍｂ以下、１５以上～２０ｍｂ以下、２０以上～２５ｍｂ以下、２５以上～３０ｍｂ以下、または３０以上～４０ｍｂ以下の重複である。
一部の実施形態では、タンデムリピートは、例えば２以上～６以下、７以上～１０以下、１０以上～２０以下、２０以上～３０以下、３０以上～４０以下、４０以上～５０以下、または５０以上～６０以下のヌクレオチドなどの２以上～６０以下のヌクレオチドのリピートである。一部の実施形態では、タンデムリピートは、２ヌクレオチドのリピート（ジヌクレオチドリピート）である。一部の実施形態では、タンデムリピートは、３ヌクレオチドのリピート（トリヌクレオチドリピート）である。
一部の実施形態では、多型または変異は、予測的である。例示的な予測的変異としては、例えば、結腸直腸癌における術後の疾患再発の指標であるＫ－ｒａｓ変異などのＫ－ｒａｓ変異が挙げられる（Ｒｙａｎら、”Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ，”Ｇｕｔ ５２：１０１－１０８，２００３；およびＬｅｃｏｍｔｅ Ｔら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ－ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，”Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：５４２－５４８，２００２。当該文献は各々その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、多型または変異は、特定の治療に対する反応の変化に関連する（例えば、有効性もしくは副作用の増加または減少）。例としては、非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲ系治療に対する反応性の低下と関連するＫ－ｒａｓ変異が挙げられる（Ｗａｎｇら、”Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ－ｂａｓｅｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，” Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ１６：１３２４－１３３０，２０１０。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
Ｋ－ｒａｓは、癌遺伝子であり、多くの癌で活性化される。例示的なＫ－ｒａｓ変異は、コドン１２、１３、および６１における変異である。Ｋ－ｒａｓ ｃｆＤＮＡ変異は、膵臓癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、および胃癌において特定されている（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ ＆ Ｓｃｈｍｉｄｔ “Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＣＮＡｓ）ａｎｄ ｃａｎｅｒ － ａ ｓｕｒｖｅｙ，” Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７５：１８１－２３２，２００７。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
ｐ５３は腫瘍抑制因子であり、多くの癌で変異し、腫瘍の進行の原因となっている（Ｌｅｖｉｎｅ ＆ Ｏｒｅｎ“Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｐ５３：ｇｒｏｗｉｎｇ ｅｖｅｒ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，”９：７４９－７５８，２００９。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｓｅｒ２４９ など、多くの様々なコドンが変異する場合がある。ｐ５３ ｃｆＤＮＡ変異は、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、大腸癌および肝細胞癌において特定されている（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ ＆ Ｓｃｈｍｉｄｔ “Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ（ＣＮＡｓ）ａｎｄ ｃａｎｅｒ － ａ ｓｕｒｖｅｙ，”Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７７５：１８１－２３２，２００７。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
ＢＲＡＦは、Ｒａｓの下流の癌遺伝子である。 ＢＲＡＦ変異は、膠細胞性新生物、黒色腫、甲状腺癌、および肺癌において特定されている（Ｄｉａｓ－Ｓａｎｔａｇａｔａら、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ｘａｎｔｈｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ：ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１１；６：ｅ１７９４８，２０１１；Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｂ－ＲＡＦ ＤＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｂｉｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １３：２０６８－２０７４，２００７；およびＢｏａｒｄら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ－１４２８８６）ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃ ２００９；１０１：１７２４－１７３０。これら文献は各々参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異は、例えば黒色腫で発生し、進行した段階でより普遍的にみられる。Ｖ６００Ｅ変異は、ｃｆＤＮＡにおいて検出されている。
ＥＧＦＲは細胞増殖に寄与し、多くの癌において誤制御されている（Ｄｏｗｎｗａｒｄ Ｊ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＡＳ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：１１－２２，２００３；およびＬｅｖｉｎｅ ＆ Ｏｒｅｎ“Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ３０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｐ５３：ｇｒｏｗｉｎｇ ｅｖｅｒ ｍｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，”９：７４９－７５８，２００９。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例示的なＥＧＦＲ変異としては、エクソン１８～２１における変異が挙げられ、肺癌患者において特定されている。ＥＧＦＲ ｃｆＤＮＡ変異は、肺がん患者において特定されている（Ｊｉａら、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ／ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，”Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０；１３６：１３４１－１３４７，２０１０。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
乳癌に関連する例示的な多型または変異としては、マイクロサテライトでのＬＯＨ（Ｋｏｈｌｅｒら、”Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ，” Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ８：ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６－４５９８－８－１０５，２００９。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）、ｐ５３変異（例えば、エクソン５～８の変異）（Ｇａｒｃｉａら、“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ４５：６９２－７０１，２００６。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＥＲ２（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＨＥＲ２ ＤＮＡ ａｆｔｅｒ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ３０：２４６３－２４６８，２０１０。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＥＤ１、およびＧＡＳ６の多型または変異が挙げられる（Ｍｕｒｔａｚａら、”Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，”Ｎａｔｕｒｅ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２０６５，２０１３。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
ｃｆＤＮＡレベルの増加およびＬＯＨは、全生存期間および無病生存期間の減少と関連する。ｐ５３変異（エクソン５～８）は、全生存期間の減少と関連する。 循環ＨＥＲ２ ｃｆＤＮＡレベルの減少は ＨＥＲ２－ポジティブの乳癌対象における ＨＥＲ２－標的化治療に対する良好な反応性と関連している。ＰＩＫ３ＣＡにおける活性化変異、ＭＥＤ１の短縮化、およびＧＡＳ６におけるスプライシング変異は、治療耐性を生じさせる。
結腸直腸癌に関連する多型または変異の例としては、ｐ５３、ＡＰＣ、Ｋ－ｒａｓ、およびチミジル酸合成酵素の変異、ならびにｐ１６遺伝子のメチル化が挙げられる（Ｗａｎｇら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰＣ，Ｋ－ｒａｓ，ａｎｄ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，” Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｕｒｇ ２８：７２１－７２６，２００４；Ｒｙａｎら、”Ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ：ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｆｏｌｌｏｗ ｕｐ，” Ｇｕｔ ５２：１０１－１０８，２００３；Ｌｅｃｏｍｔｅら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ－ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，” Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １００：５４２－５４８，２００２；Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，” Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２７：８８１－８８８，２００９。当該文献は各々その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。血清Ｋ－ｒａｓ変異の術後検出は、疾患再発の強力な予測因子である。Ｋ－ｒａｓ変異およびｐ１６遺伝子メチル化の検出は、生存率の低下および疾患再発の増加と関連する。Ｋ－ｒａｓ、ＡＰＣ、および／またはｐ５３の変異の検出は、再発および／または転移と関連する。ｃｆＤＮＡを使用したチミジル酸合成酵素（フルオロピリミジン系化学療法剤の標的）遺伝子の多型（ＬＯＨ、ＳＮＰ、変動的な数のタンデムリピート、および欠失を含む）は、治療反応性と関連する場合がある。
肺癌（例えば、非小細胞肺癌）に関連する多型または変異の例としては、Ｋ－ｒａｓ（例えば、コドン１２の変異）およびＥＧＦＲ変異が挙げられる。例示的な予測的変異としては、全生存期間および無増悪生存期間の増加に関連するＥＧＦＲ変異（エクソン１９の欠失またはエクソン２１の変異）が挙げられ、Ｋ－ｒａｓ変異（コドン１２および１３の変異）が無増悪生存期間の減少と関連している（Ｊｉａｎら、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ／ｐｌｅｕｒａｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，” Ｊ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １３６：１３４１－１３４７，２０１０；Ｗａｎｇら、“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ－ｂａｓｅｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ，” Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １６：１３２４－１３３０，２０１０。当該文献は各々その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。治療に対する反応性の指標となる多型または変異の例としては、治療に対する反応性を改善するＥＧＦＲ変異（エクソン１９の欠失またはエクソン２１の変異）、および治療に対する反応性を減少させるＫ－ｒａｓ変異（コドン１２および１３）が挙げられる。ＥＦＧＲにおいて耐性寄与変異が特定されている（Ｍｕｒｔａｚａら、“Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ，”Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２０６５，２０１３。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
黒色腫（例えば、ブドウ膜黒色腫）に関連する多型または変異の例としては、ＧＮＡＱ、ＧＮＡ１１、ＢＲＡＦ、およびｐ５３の多型または変異が挙げられる。例示的なＧＮＡＱおよびＧＮＡ１１の変異としては、Ｒ１８３およびＱ２０９の変異が挙げられる。ＧＮＡＱまたはＧＮＡ１１におけるＱ２０９変異は、骨への転移と関連している。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ 変異は、転移性／進行期の黒色腫を有する患者において検出され得る。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅは、浸潤性黒色腫の指標である。化学療法剤後のＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異の存在は、治療に対する非反応性と関連している
膵臓癌に関連する多型または変異の例としては、Ｋ－ｒａｓおよびｐ５３（例えば、ｐ５３ Ｓｅｒ２４９）の多型または変異が挙げられる。ｐ５３ Ｓｅｒ２４９は、Ｂ型肝炎感染および肝細胞癌、ならびに卵巣癌、および非ホジキンリンパ腫とも関連している。
サンプル中に低頻度で存在している多型または変異であっても、本発明方法を用いて検出することができる。例えば、１００万個中、１個の頻度で存在する多型または変異は、１，０００万回のシーケンスリードを実行することにより、１０回実測することができる。望ましい場合には、シーケンスリードの数を、所望の感度レベルに応じて変更することができる。一部の実施形態では、サンプルを再分析するか、または対象からの別のサンプルをより多くの数のシーケンスリードを使用して分析し、感度を改善する。例えば、癌に関連する、または癌のリスク増大に関連する多型または変異が全くない、または少数（例えば、１、２、３、４、または５）しか検出されない場合、サンプルを再分析するか、または別のサンプルを検査する。
一部の実施形態では、複数の多型または変異が、癌または転移性癌に必要である。そのような場合、複数の多型または変異をスクリーニングすることにより、癌または転移性癌を正確に診断する能力が改善される。対象が、癌または転移性癌に必要な複数の多型または変異のサブセットを有する一部の実施形態において、後に対象を再スクリーニングして、対象が追加の変異を獲得したかを判定することができる。
癌または転移性癌に対して、複数の多型または変異が必要とされる一部の実施形態では、多型または変異の各々の頻度を比較して、それらが似た頻度で起こるかを判定することができる。例えば、二つの変異（「Ａ」および「Ｂ」と記載される）が癌に必要な場合、一部の細胞はなにも有さず、一部の細胞はＡを有し、一部の細胞はＢを有し、一部の細胞はＡとＢを有する。ＡおよびＢが似た頻度で実測される場合、対象は、ＡおよびＢの両方を有する細胞をいくつか有する可能性がさらに高くなる。ＡおよびＢが異なる頻度で観察される場合、対象は、異なる細胞集団を有する可能性がさらに高くなる。
癌または転移性癌に対して、複数の多型または変異が必要とされる一部の実施形態では、対象に存在するそのような多型または変異の数または固有性を使用して、対象が疾患または障害を有する可能性、またはいつ有するかを予測することができる。多型または変異が特定の順序で生じる傾向がある一部の実施形態では、対象は定期的に検査され、対象が他の多型または変異を獲得したかを判定してもよい。
一部の実施形態では、複数の多型または変異（例えば、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、またはそれ以上）の有無を決定することにより、例えば癌などの疾患もしくは障害の有無、または例えば癌などの疾患もしくは障害を有するリスク増大の有無の決定の感度および／または特異度が増す。
一部の実施形態では、多型または変異は、直接検出される。一部の実施形態では、多型または変異は、当該多型または当該変異に連鎖した一つ以上の配列（例えば、ＳＮＰなどの多型座位）の検出により間接的に検出される。
９．１ 例示的な核酸改変
一部の実施形態では、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増加と関連するＲＮＡまたはＤＮＡの完全性の変化（例えば、断片化したｃｆＲＮＡもしくはｃｆＤＮＡのサイズ変化、またはヌクレオソーム組成物の変化）が存在する。一部の実施形態では、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増加と関連するＲＮＡまたはＤＮＡのメチル化パターンの変化（例えば、腫瘍抑制性遺伝子の超メチル化）が存在する。例えば、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドのメチル化は、局所的な遺伝子サイレンシングを誘発することが示唆されている。ｐ１６腫瘍抑制遺伝子の異常なメチル化は、肝癌、肺癌、および乳癌の対象に生じる。ＡＰＣ、Ｒａｓ関連ドメインファミリータンパク質１Ａ（ＲＡＳＳＦ１Ａ：Ｒａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ａ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｐ１）、およびＤＡＰＫをはじめとする、頻繁にメチル化される他の腫瘍抑制遺伝子は、例えば上咽頭癌、結腸直腸癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、黒色腫、および急性白血病など、様々なタイプの癌で検出されている。例えばｐ１６などの特定の腫瘍抑制遺伝子のメチル化は、癌形成の早期事象として報告されており、早期の癌スクリーニングに有用である。
一部の実施形態では、メチル化感受性制限酵素消化を使用した亜硫酸水素塩変換法または非亜硫酸水素塩系の方法を使用して、メチル化パターンが決定される（Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６２：３０８－３１３，２００９。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。亜硫酸水素塩変換法では、メチル化シトシンはシトシンとして残り、非メチル化シトシンがウラシルに変換される。メチル化感受性制限酵素（例えば、ＢｓｔＵＩ）は、メチル化されていないＤＮＡ配列を特定の認識部位（例えば、ＢｓｔＵＩについては５’－ＣＧ ｖ ＣＧ－３）で切断するか、メチル化された配列はそのままである。一部の実施形態では、損なわれていないメチル化配列が検出される。一部の実施形態では、ステムループプライマーが使用されて、酵素消化されていないメチル化ＤＮＡを共増幅することなく、制限酵素消化された非メチル化断片が選択的に増幅される。
９．２ ｍＲＮＡスプライシングにおける変化の例
一部の実施形態では、ｍＲＮＡスプライシングの変化が、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増加と関連している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡスプライシングの変化は、癌または癌のリスク増加に関連する以下の核酸のうちの一つ以上に存在する：ＤＮＭＴ３Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＫＬＦ６、Ｒｏｎ、またはＧｅｍｉｎ５。一部の実施形態では、検出されたｍＲＮＡスプライスバリアントは、例えば癌などの疾患または障害と関連している。一部の実施形態では、複数のｍＲＮＡスプライスバリアントが健康な細胞（例えば非癌性細胞など）により産生されるが、ｍＲＮＡスプライスバリアントの相対量の変化が、例えば癌などの疾患または障害と関連している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡスプライシングの変化は、ｍＲＮＡ配列の変化（例えば、スプライス部位の変異）、スプライシング因子のレベルの変化、利用可能なスプライシング因子の量の変化（例えば、スプライシング因子がリピートに結合することが原因の利用可能なスプライシング因子の量の減少）、スプライシング制御の変化、または腫瘍微小環境が原因である。
スプライシング反応は、スプライソソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）と呼ばれる複数タンパク質／ｍＲＮＡ複合体により実施される（Ｆａｃｋｅｎｔｈａｌ１ ａｎｄ Ｇｏｄｌｅｙ，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ １：３７－４２，２００８，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０００３３１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。スプライソソームは、イントロン－エクソンの境界を認識し、２回のエステル交換反応を介して介在イントロンを除去し、二つの隣接エクソンのライゲーションを生じさせる。ライゲーションが誤って発生すると、正常なタンパク質をコードする可能性が低くなる場合があるため、この反応の忠実度は最高でなければならない。例えば、エクソンスキッピングにより翻訳中のアミノ酸の固有性および順序を特定する三つ組みコドンのリーディングフレームが保持される場合、代替的スプライシングが為されたｍＲＮＡは、重要なアミノ酸残基を欠いたタンパク質を指定しまう場合がある。より一般的には、エクソンスキッピングは、翻訳リーディングフレームを破壊し、未成熟な終止コドンを生じさせる。これらのｍＲＮＡは多くの場合、ナンセンス介在性ｍＲＮＡ分解として知られるプロセスを通して少なくとも９０％まで分解され、これにより、このような欠陥のあるメッセージが蓄積して短縮型タンパク質産物が生成されてしまう尤度が低下する。ミススプライシングされたｍＲＮＡがこの経路を回避した場合、短縮型、変異型、または不安定なタンパク質が産生される。
代替的スプライシングは、同じゲノムＤＮＡから複数または多くの異なる転写物を発現させる手段であり、特定のタンパク質に対して利用可能なエクソンのサブセットの統合から生じる。一つ以上のエクソンを除外することによって、特定のタンパク質のドメインがコードタンパク質から失われ、その結果ｍタンパク質の機能喪失または機能獲得が生じる可能性がある。以下のいくつかのタイプの代替的スプライシングが報告されている：エクソンスキッピング、代替５’または３’スプライス部位、相互排他的エクソン、および非常に稀であるが、イントロン保持。バイオインフォマティクス的方法を使用して、癌と正常細胞における代替的スプライシングの量を比較し、癌は、正常細胞よりも低レベルの代替的スプライシングを呈すると判定した研究者もいる。さらに代替的スプライシング事象のタイプの分布は、癌と正常細胞では異なっていた。癌細胞は、正常な細胞よりもエクソンスキッピングが少ないが、代替的５’および３’スプライス部位選択、およびイントロン保持は多く示していた、エクソン化現象（他の組織では主にイントロンとして使用される配列のエクソンとしての使用）が検証されたとき、癌細胞でエクソン化に関連する遺伝子は、ｍＲＮＡのプロセッシングと優先的に関連していた。このことから、癌細胞と異常なｍＲＮＡスプライス型の生成との間の直接的な関連性が示唆される。
９．３ ＤＮＡまたはＲＮＡのレベル変化の例
一部の実施形態では、一つ以上のタイプのＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡ）、またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ）の総量または濃度の変化がある。一部の実施形態では、一つ以上の特定のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡ）分子、またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ）分子の量または濃度の変化がある。一部の実施形態では、一つのアレルは、対象となる座位の別のアレルよりも多く発現される。例示的なｍｉＲＮＡは、遺伝子の発現を制御する短い２０～２２ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、一つ以上のＲＮＡ分子の固有性または量の変化など、トランスクリプトームの変化がある。
一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡもしくはｃｆＲＮＡの量または濃度の増加が、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増加と関連している。一部の実施形態では、あるタイプのＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡなど）またはＲＮＡ（例えば、ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ）の総濃度は、健常（例えば、非癌性の）対象における当該タイプのＤＮＡまたはＲＮＡの総濃度と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、またはそれ以上まで増加する。一部の実施形態では、７５以上～１００ｎｇ／ｍＬ以下、１００以上～１５０ｎｇ／ｍＬ以下、１５０以上～２００ｎｇ／ｍＬ以下、２００以上～３００ｎｇ／ｍＬ以下、３００以上～４００ｎｇ／ｍＬ以下、４００以上～６００ｎｇ／ｍＬ以下、６００以上～８００ｎｇ／ｍＬ以下、８００以上～１，０００ｎｇ／ｍＬ以下の総濃度のｃｆＤＮＡ、または１００ｎｇを超える、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｎｇ／ｍＬを超える総濃度のｃｆＤＮＡは、癌を示し、癌リスクの増加を示し、良性より悪性である腫瘍のリスク増加を示し、おそらく寛解に至っている癌の減少を示し、または当該癌の予後の悪化を示す。一部の実施形態では、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増大に関連した多形／変異（例えば、欠失または重複）を一つ以上有する、あるタイプのＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡ）、またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ）の量は、当該タイプのＤＮＡまたはＲＮＡの総量の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０または２５％である。一部の実施形態では、あるタイプのＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆ ｍＤＮＡ、ｃｆ ｎＤＮＡ、細胞ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡ）、またはＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡ）の総量のうち、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０または２５％は、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増大に関連する特定の多形または変異（例えば欠失または重複）を有する。
一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、封入されている。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、封入されていない。
一部の実施形態では、総ＤＮＡ中の腫瘍ＤＮＡの割合（例えば、総ｃｆＤＮＡ中、腫瘍ｃｆＤＮＡの割合、または総ｃｆＤＮＡ中、特定の変異を有する腫瘍ｃｆＤＮＡの割合）が決定される。一部の実施形態では、腫瘍ＤＮＡの割合は、複数の変異について決定されてもよく、この場合において当該変異は、一塩基バリアント、コピー数バリアント、区別的なメチル化、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の実施形態では、最も高く計算された腫瘍割合を有する変異の一つまたはセットについて計算された平均腫瘍割合は、サンプル中の実際の腫瘍割合としてみなされる。一部の実施形態では、変異のすべてについて計算された平均腫瘍割合が、サンプル中の実際の腫瘍割合としてみなされる。一部の実施形態では、この腫瘍割合を使用して、癌が病期分類される（腫瘍割合が高くなると、癌のステージはより進行したものとなり得るため）。一部の実施形態では、血漿中の腫瘍ＤＮＡの割合と、腫瘍の大きさは相関し得るため、腫瘍割合は、癌のサイズ決定に使用される。一部の実施形態では、血漿サンプル中の実測腫瘍割合と、所与の変異遺伝子型を有する組織のサイズとの間に相関性がある場合があるため、腫瘍割合を使用して、一つまたは複数の変異がある腫瘍比率の大きさが決定される。例えば、所与の変異遺伝子型を有する組織の大きさは、腫瘍ＤＮＡの割合と相関する場合があり、当該腫瘍ＤＮＡの割合は、当該特定の変異に焦点を当てることによって計算され得る。
１０．例示的な生化学的方法および組成物
１０．１ サンプル例
本発明の態様のいずれか一部の実施形態において、サンプルは、欠失または重複を有すると推測される細胞、例えば癌性であると推測される細胞または胎児起源であると推測される循環細胞に由来する細胞性遺伝物質および／または細胞外遺伝物質を含む。一部の実施形態では、サンプルは、欠失または重複を有する細胞、ＤＮＡ、またはＲＮＡを含有すると推測される任意の組織または体液を含む。これら方法の一部として使用される遺伝的測定は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む任意のサンプルに行われてもよく、例えば、限定されないが、組織、血液、血清、血漿、尿、毛髪、涙、唾液、皮膚、爪、便、胆汁、リンパ、子宮頸部粘液、精液、腫瘍、胎児、または核酸を含む他の細胞もしくは材料などのサンプルに行われてもよい。サンプルには、任意の細胞型、または任意の細胞型に由来するＤＮＡもしくはＲＮＡが含まれてもよく、使用されてもよい（例えば、癌性またはニューロンであると推測される任意の器官または組織からの細胞など）。一部の実施形態では、サンプルは、核ＤＮＡおよび／またはミトコンドリアＤＮＡを含む。一部の実施形態では、サンプルは、本明細書に開示される標的個体のいずれか由来である。一部の実施形態では、標的個体は、癌患者である。
例示的なサンプルとしては、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡを含有するサンプルが挙げられる。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、細胞を溶解する工程を必要とせずに、分析に利用可能である。セルフリーＤＮＡは、例えば液状の組織、例えば血液、血漿、リンパ、腹水、または脳脊髄液など様々な組織から取得されてもよい。一部の例では、ｃｆＤＮＡは、胎児細胞から誘導されたＤＮＡから構成される。一部の例では、ｃｆＤＮＡは、遠心分離されて細胞物質が除去された全血から単離された血漿から単離される。ｃｆＤＮＡは、標的細胞（例えば、癌細胞）および非標的細胞（例えば、非癌性細胞）から誘導されたＤＮＡの混合物であってもよい。
一部の実施形態では、サンプルは、癌細胞を起源とするＤＮＡ（またはＲＮＡ）と、非癌性（すなわち正常）細胞を起源とするＤＮＡ（またはＲＮＡ）の混合物など、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の混合物を含有するか、または含有することが推測される。一部の実施形態では、サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９、または１００％が、癌細胞である。一部の実施形態では、サンプル中のＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｃｆＲＮＡ）の少なくとも０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９、または１００％が、癌細胞に由来する。様々な実施形態では、サンプル中の癌性細胞である細胞のパーセントは、０．５％以上～９９％以下、例えば１％以上～９５％以下、５％以上～９５％以下、１０％以上～９０％以下、５％以上～７０％以下、１０％以上～７０％以下、２０％以上～９０％以下または２０％以上～７０％以下である。一部の実施形態では、サンプルは、癌細胞に対して濃縮され、または癌細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡに対して濃縮される。サンプルが癌細胞に対して濃縮される一部の実施形態では、濃縮サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９、または１００％が、癌細胞である。サンプルが癌細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡに対して濃縮される一部の実施形態では、濃縮サンプル中のＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９２、９４、９５、９６、９８、９９、または１００％が、癌細胞由来である。一部の実施形態では、細胞ソーティング（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）など）を使用して、癌細胞が濃縮される（Ｂａｒｔｅｎｅｖａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．，１８３６（１）：１０５－２２，Ａｕｇ ２０１３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２０１３．０２．００４．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｆｅｂ ２４、およびＩｂｒａｈｉｍら、Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０６：１９－３９，２００７を参照のこと。これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、サンプルは、胎児細胞に対して濃縮される。サンプルが胎児細胞に対して濃縮される一部の実施形態では、濃縮サンプル中の細胞の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７％またはそれ以上が、胎児細胞である。一部の実施形態では、サンプル中の胎児細胞である細胞のパーセントは、０．５％以上～１００％以下、例えば１％以上～９９％以下、５％以上～９５％以下、１０％以上～９５％以下、１０％以上～９５％以下、２０％以上～９０％以下、または３０％以上～７０％以下である。一部の実施形態では、サンプルは、胎児ＤＮＡに対して濃縮される。サンプルが胎児ＤＮＡに対して濃縮される一部の実施形態では、濃縮サンプル中のＤＮＡの少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７％またはそれ以上が、胎児ＤＮＡである。一部の実施形態では、サンプル中の胎児ＤＮＡであるＤＮＡのパーセントは、０．５％以上～１００％以下、例えば１％以上～９９％以下、５％以上～９５％以下、１０％以上～９５％以下、１０％以上～９５％以下、２０％以上～９０％以下、または３０％以上～７０％以下である。
一部の実施形態では、サンプルは、一つの細胞を含むか、または一つの細胞に由来するＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複数の個々の細胞（例えば、同じ対象または異なる対象に由来する、少なくとも５個、１０個、２０個、３０個、４０個、または５０個の細胞）が並行して分析される。一部の実施形態では、同じ個体に由来する複数のサンプルからの細胞が組み合わされ、これにより、サンプルを別々に分析する場合と比較して、作業量が減少する。複数のサンプルを組み合わせることにより、癌について同時に複数の組織を検査することも可能となる（これを使用して、癌に対するさらに徹底的なスクリーニングを提供することができる、または癌が他の組織に転移しているか否かが判定され得る）。
一部の実施形態では、サンプルは、一つの細胞または少数の細胞、例えば、２、３、５、６、７、８、９、または１０個の細胞を含有する。一部の実施形態では、サンプルは、１～１００、１００～５００、または５００～１，０００個の細胞を有する。一部の実施形態では、サンプルは、１ピコグラム以上～１０ピコグラム以下、１０ピコグラム以上～１００ピコグラム以下、１００ピコグラム以上～１ナノグラム以下、１ナノグラム以上～１０ナノグラム以下、１０ナノグラム以上～１００ナノグラム以下、または１００ナノグラム以上～１マイクログラム以下のＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、サンプルは、パラフィン包埋される。一部の実施形態では、サンプルは、例えばホルムアルデヒドなどの保存剤を用いて保存され、任意でパラフィン包埋され、これによってＤＮＡが架橋されて、より少ない量のＤＮＡがＰＣＲに利用可能になり得る。一部の実施形態では、サンプルは、ホルムアルデヒド固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、新鮮なサンプルである（例えば、１日または２日間の分析で取得されたサンプル）。一部の実施形態では、サンプルは、分析前に凍結される。一部の実施形態では、サンプルは、病歴サンプルである。
これらのサンプルは、本発明の方法のいずれかで使用することができる。
１０．２ サンプル調製方法の例
一部の実施形態では、方法は、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを単離または精製することを含む。当該目的を達成するための、当分野に公知の多くの標準的な方法がある。一部の実施形態では、サンプルは遠心分離され、様々な層が分離されてもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ろ過を使用して単離されてもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡの調製は、増幅、分離、クロマトグラフィーによる精製、液体分離、単離、優先的濃縮、優先的増幅、標的化増幅、または当分野に公知であるか、もしくは本明細書に記載される他の多くの技術のいずれかを含んでもよい。ＤＮＡ単離に関する一部の実施形態では、ＲＮａｓｅを使用して、ＲＮＡが分解される。ＲＮＡ単離に関する一部の実施形態では、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッドのＤＮａｓｅなど）を使用してＤＮＡが分解される。一部の実施形態では、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）をメーカーのプロトコールに従い使用して、ＲＮＡが単離される。一部の実施形態では、低ＲＮＡ分子は、メーカーのプロトコールに従い、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、米国テキサス州オースティン）を使用して単離される（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１－６４９，２０１２。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡの濃度および純度は任意で、Ｎａｎｏｖｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して決定されてもよく、およびＲＮＡの完全性は任意で、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州サンタクララ）を使用して測定されてもよい（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１－６４９，２０１２。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ＴＲＩＺＯＬまたはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して、保管中のＲＮＡが安定化される。
一部の実施形態では、ユニバーサルタグ付きアダプターが付加されてライブラリーが作製される。ライゲーションの前に、サンプルＤＮＡは平滑末端化されてもよく、次いで一つのアデノシン塩基が３－プライム末端に付加される。ライゲーションの前に、制限酵素または何らかの他の切断方法を使用してＤＮＡが切断されてもよい。ライゲーションの間に、サンプル断片の３－プライムアデノシンと、アダプターの相補的３－プライムチロシンオーバーハングによって、ライゲーション効率が高められる。一部の実施形態では、アダプターライゲーションは、ＡＧＩＬＥＮＴ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ ｋｉｔにあるライゲーションキットを使用して実施される。一部の実施形態では、ライブラリーは、ユニバーサルプライマーを使用して増幅される。一つの実施形態では、増幅されたライブラリーは、サイズ分離により、または例えばＡＧＥＮＣＯＵＲＴ ＡＭＰＵＲＥ ビーズもしくは他の類似方法などの製品を使用することにより、分割される。一部の実施形態では、ＰＣＲ増幅を使用して標的座位が増幅される。一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡはシーケンスされる（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＩＩＧＡＸまたはＨｉＳｅｑシーケンサーを使用したシーケンス）。一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡは、シーケンスエラーを減少させるために、増幅されたＤＮＡの各末端からシーケンスされる。増幅されたＤＮＡの一方の末端からシーケンスされたとき、特定の塩基に配列エラーがある場合、（増幅されたＤＮＡの同じ末端から複数回シーケンスを行うことと比較して）増幅されたＤＮＡの反対側からシーケンスされたとき、相補的な塩基にシーケンスエラーがある可能性は低い。
一部の実施形態では、全ゲノムアプリケーション（ＷＧＡ：ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を使用して、核酸サンプルを増幅する。多数の方法がＷＧＡに利用可能である：ライゲーション介在ＰＣＲ（ＬＭ－ＰＣＲ：ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（ＤＯＰ－ＰＣＲ：ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）、および多重置換増幅（ＭＤＡ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。ＬＭ－ＰＣＲでは、アダプターと呼ばれる短いＤＮＡ配列がＤＮＡの平滑末端にライゲーションされる。これらのアダプターは、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅に使用されるユニバーサル増幅配列を含有する。ＤＯＰ－ＰＣＲでは、ユニバーサル増幅配列をさらに含有するランダムプライマーが、アニーリングおよびＰＣＲの最初のラウンドで使用される。次いで、第二のＰＣＲラウンドで、当該配列がユニバーサルプライマー配列でさらに増幅される。ＭＤＡは、ｐｈｉ－２９ポリメラーゼを使用する。このポリメラーゼは、ＤＮＡを複製し、単一細胞解析に使用されている、処理能力が高く、非特異的な酵素である。一部の実施形態では、ＷＧＡは実施されない。
一部の実施形態では、選択的な増幅または濃縮は、標的座位を増幅または濃縮するために使用される。一部の実施形態では、増幅技術および／または選択的濃縮技術は、例えばライゲーション介在ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションによる断片捕捉、分子反転プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ）、または他の環状化プローブ（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ）などのＰＣＲを伴いうる。一部の実施形態では、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、またはエマルジョンＰＣＲ、単一アレル塩基伸長反応とその後の質量分析法が使用される（Ｈｕｎｇら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６２：３０８－３１３，２００９。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ハイブリッド捕捉プローブを用いたハイブリダイゼーションによる捕捉を使用して、ＤＮＡを優先的に濃縮する。一部の実施形態では、増幅または選択的濃縮の方法はプローブの使用を伴い、この場合において標的配列に正しくハイブリダイゼーションした際に、ヌクレオチドプローブの３－プライム末端または５－プライム末端が、少数のヌクレオチドにより多型アレルの多型部位から分離される。この分離によって、アレルバイアスと呼ばれる一つのアレルの優先的増幅が減少する。これは、正しくハイブリダイズされたプローブの３－プライム末端または５－プライム末端が、アレルの多型部位に直接隣接する、または非常に近くにあるプローブの使用を伴う方法を超える改善である。一つの実施形態では、ハイブリダイズ領域が多型部位を包含する可能性がある、または確実に包含するプローブは除外される。ハイブリダイゼーション部位での多型部位は不均一なハイブリダイゼーションの原因となる可能性があり、一部のアレルではハイブリダイゼーションを完全に阻害し得る。これにより特定アレルの優先的増幅が生じてしまう。これらの実施形態は、サンプルが一つの個体由来の純粋なゲノムサンプルであるか、または個体混合物由来であるかに関わらず、各多型座位でのサンプルの元々のアレル頻度をより良好に保持するという点で、標的増幅および／または選択的濃縮を伴う他の方法を超える改善である。
一部の実施形態では、ＰＣＲ（ミニＰＣＲと称される）を使用して、非常に短いアンプリコンが生成される（２０１２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１３／６８３，６０４号、米国特許出願公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国特許出願第１３／３００，２３５号、２０１１年１１月１８日に出願された米国特許出願公開第２０１２／０２７０２１２号、および２０１４年５月１６日に出願された米国特許出願第６１／９９４，７９１号。当該特許出願はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。ｃｆＤＮＡ（例えば、ネクローシス的に、またはアポトーシス的に放出された癌性ｃｆＤＮＡ）は高度に断片化されている。胎児ｃｆＤＮＡについては、断片サイズは、平均１６０ｂｐ、標準偏差１５ｂｐ、最小サイズは約１００ｂｐ、および最大サイズは約２２０ｂｐで、およそガウス型で分布する。一つの特定の標的座位の多型部位は、当該座位を起源とする様々な断片の中の開始位置から終了位置までの任意の位置を占め得る。ｃｆＤＮＡ断片は短いため、両方のプライマー部位が存在する尤度は、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位の両方を含む長さＬの断片の尤度であり、アンプリコンの長さと断片の長さの比である。理想的な条件下では、アンプリコンが、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｂｐであるアッセイは、利用可能な鋳型断片分子のそれぞれ７２％、６９％、６６％、６３％、５９％、または５６％からの増幅に成功する。癌を有すると推測される個体のサンプルからのｃｆＤＮＡに最も好ましい、関連する特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡは、８５、８０、７５または７０ｂｐ、特定の好ましい実施形態では７５ｂｐの最大アンプリコン長を生じさせ、５０～６５℃の融点、特に好ましい実施形態では５４～６０．５℃の融点を有するプライマーを使用して増幅される。アンプリコンの長さは、フォワードのプライミング部位とリバースのプライミング部位の５－プライム末端の間の距離である。当業者により典型的に使用されるよりも短いアンプリコン長は、短いシーケンスリードのみを必要とすることによって、より効率的な所望の多型座位の測定をもたらし得る。一つの実施形態では、アンプリコンのかなりの割合が、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、または４５ｂｐ未満である。
一部の実施形態では、増幅は、直接多重化ＰＣＲ、連続ＰＣＲ、入れ子型ＰＣＲ、二重入れ子型ＰＣＲ、１．５辺入れ子型ＰＣＲ（ｏｎｅ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ｓｉｄｅｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）、完全入れ子型ＰＣＲ、片側完全入れ子型ＰＣＲ、片側入れ子型ＰＣＲ、ヘミ入れ子型ＰＣＲ、ヘミ入れ子型ＰＣＲ、三重ヘミ入れ子型ＰＣＲ、セミ入れ子型ＰＣＲ、片側セミ入れ子型ＰＣＲ、リバースセミ入れ子型ＰＣＲ法、または片側ＰＣＲを使用して実施される。これらは２０１２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１３／６８３，６０４号、米国特許出願公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国特許出願第１３／３００，２３５号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０２１２号、および２０１４年５月１６日に出願された米国特許出願第６１／９９４，７９１号に記載されており、これら特許出願はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。望ましい場合、これら方法のいずれかをミニＰＣＲに使用することができる。
望ましい場合、ＰＣＲ増幅の伸長工程は、時間的な観点から制限され、２００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、または１，０００ヌクレオチドよりも長い断片の増幅が減少する場合がある。これにより、断片化されたＤＮＡまたは短いＤＮＡ（例えば、胎児ＤＮＡ、またはアポトーシスもしくは壊死を経た癌細胞由来のＤＮＡなど）の濃縮が生じ、および試験性能の改善がもたらされ得る。
一部の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲが使用される。一つの実施形態では、核酸サンプル中の標的座位の増幅方法は、（ｉ）核酸サンプルを、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個の様々な標的座位に同時にハイブリダイズするプライマーライブラリーと接触させ、反応混合物を生成すること、および（ｉｉ）当該反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件など）におき、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成すること、を含む。一部の実施形態では、標的座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％が増幅される。様々な実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、または０．０５％未満が、プライマー二量体である。一部の実施形態では、プライマーは、溶液中にある（例えば、固相ではなく、液相に溶解される）。一部の実施形態では、プライマーは溶液中にあり、固形支持体上に固定されていない。一部の実施形態では、プライマーは、マイクロアレイの一部ではない。一部の実施形態では、プライマーは、分子反転プローブ（ＭＩＰ）を含まない。
一部の実施形態では、二つ以上の（例えば３または４）標的アンプリコン（本明細書に開示されるミニＰＣＲ方法からのアンプリコン）が一緒にライゲーションされ、次いでライゲーション産物がシーケンスされる。複数のアンプリコンを一つのライゲーション産物にまとめることで、その後のシーケンス工程の効率が上がる。一部の実施形態では、標的アンプリコンは、ライゲーションされる前は１５０、１００、９０、７５、または５０塩基対よりも短い。選択的濃縮および／または増幅は、異なるタグ、分子バーコード、増幅用タグ、および／またはシーケンス用タグを用いて、個々の各分子をタグ付けすることを伴いうる。一部の実施形態では、増幅された産物はシーケンス（例えばハイスループットシーケンス）により分析され、または例えばＳＮＰアレイ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＩＮＦＩＮＩＵＭアレイ、またはＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップなどのアレイへのハイブリダイゼーションにより分析される。一部の実施形態では、例えば、Ｇｅｎｉａ社により開発されたナノポアシーケンス技術などのナノポアシーケンスが使用される（例えば、ｇｅｎｉａｃｈｉｐ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙでのワールドワイドウェブを参照のこと。当該内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態において、二本鎖シーケンスが使用される（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｒａｒｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０９（３６）：１４５０８－１４５１３，２０１２。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。この方法は、ＤＮＡ二本鎖の日本の鎖の各々を個々にタグ付けおよびシーケンスすることによりエラーを大幅に減少させる。二本の鎖は相補的であるため、真の変異は両方の鎖の同じ位置で見出される。対照的にＰＣＲエラーまたはシーケンスエラーは一本の鎖のみで変異を生じさせるため、技術的エラーとして差し引くことができる。一部の実施形態では、当該方法は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を、二本鎖タグ（Ｄｕｐｌｅｘ Ｔａｇ）と呼称される無作為だが相補的な二本鎖ヌクレオチド配列でタグ付けすることを伴う。二本鎖タグ配列は、まず一本鎖の無作為化ヌクレオチド配列を一つのアダプター鎖に導入し、次いでＤＮＡポリメラーゼを用いて反対側の鎖を伸長し、相補的な二本鎖タグを生成することにより、標準的なシーケンスアダプターへと組み込まれる。タグ付けされたアダプターをせん断化ＤＮＡにライゲーションした後、個別に標識された鎖は、アダプター尾部上の非対称プライマー部位からＰＣＲ増幅され、ペア末端シーケンスが行われる。一部の実施形態では、サンプル（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡサンプル）は、例えば、異なるウェル（例えば、ＷａｆｅｒＧｅｎ ＳｍａｒｔＣｈｉｐのウェル）などの複数の画分へと分割される。一部のウェルにおいて、全サンプルよりも変異を有する分子の割合が高くなるため、異なる画分（例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、７５、１００、１５０、２００または３００個の画分）にサンプルを分割することで、分析感度を上昇させることができる。一部の実施形態では、各画分は、５００、４００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２もしくは１個未満のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を有する。一部の実施形態では、各画分中の分子は、別々にシーケンスされる。一部の実施形態では、同じ画分中の全ての分子に同じバーコード（例えば、無作為配列または非ヒト配列）が（例えば、バーコードを含有するプライマーを用いた増幅またはバーコードのライゲーションにより）付けられ、異なるバーコードは、異なる画分の分子に付けられる。バーコード化された分子をプールし、一緒にシーケンスすることができる。一部の実施形態では、分子が増幅され、その後に例えば入れ子型ＰＣＲによりプールされ、シーケンスされる。一部の実施形態では、一つのフォワードプライマーと二つのリバースプライマー、または二つのフォワードプライマーと一つのリバースプライマーが使用される。
一部の実施形態では、サンプル（例えば、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中の１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１もしくは０．００５％未満のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子に存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が、検出される（または検出可能である）。一部の実施形態では、サンプル（例えば、血液サンプルなどに由来するｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中の１，０００、５００、１００、５０、２０、１０、５、４、３もしくは２個未満の元々のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（増幅前）に存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が、検出される（または検出可能である）。一部の実施形態では、サンプル（例えば、血液サンプルなどに由来するｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡのサンプル）中のわずか１個の元々のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（増幅前）に存在する変異（例えば、ＳＮＶまたはＣＮＶ）が、検出される（または検出可能である）。
例えば、変異（例えば、一塩基バリアント（ＳＮＶ））の検出限界が０．１％である場合、０．０１％で存在する変異は、画分を、例えば１００ウェルなどの複数の画分に分割することにより検出することができる。ウェルのほとんどは、変異のコピーを有していない。変異を有する数個のウェルについて、変異は、非常に高いリードパーセントとなる。一つの例では、標的座位に由来する２０，０００個の初期ＤＮＡコピーが存在し、それらのコピーのうちの２個が、対象となるＳＮＶを含む。サンプルが１００ウェルに分割される場合、９８ウェルはＳＮＶを有し、２ウェルは０．５％でＳＮＶを有する。各ウェル内のＤＮＡはバーコード化され、増幅され、他のウェルからのＤＮＡとともにプールされ、シーケンスされる。ＳＮＶのないウェルを使用して、バックグラウンド増幅／シーケンスエラー率を測定し、外れ値ウェルからの信号が、バックグラウンドのノイズレベルを超えているかを決定することができる。
一部の実施形態では、増幅産物は、例えば、一つ以上の対象となる染色体（例えば、第１３、第１８、第２１、Ｘ、Ｙ染色体またはそれらの任意の組み合わせ）に対するプローブを含むマイクロアレイなどのアレイを使用して検出される。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（カリフォルニア州サンディエゴ）、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ社，ＤＡＳＬ社，Ｉｎｆｉｎｉｕｍ社またはＣｙｔｏＳＮＰ－１２社の遺伝子型解析アッセイなど、市販のＳＮＰ検出マイクロアレイを使用してもよいこと、または例えばＯｎｃｏＳｃａｎのマイクロアレイなどのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＳＮＰ検出マイクロアレイ製品を使用してもよいことを理解されたい。
シーケンスを伴う一部の実施形態では、リード深度は、所与の座位にマッピングされるシーケンスリードの数である。リード深度は、リードの総数に対して正規化されてもよい。サンプルのリード深度に関する一部の実施形態では、リード深度は、標的座位に対するリードの平均深度である。座位のリード深度に関する一部の実施形態では、リード深度は、当該座位へのシーケンサーマッピングにより測定されたリードの数である。概して、座位のリード深度が大きいほど、当該座位におけるアレル比率は、元のＤＮＡサンプルにおけるアレル比率に近くなる傾向がある。リード深度は、限定されないが、パーセンテージまたは割合を含む、様々な異なる方法で表現され得る。したがって、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱなどの高度並行化ＤＮＡシーケンサーでは、例えば１００万個のクローンのシーケンスが行われ、一つの座位でのシーケンスが３，０００回行われることにより、当該座位で３，０００のリード深度が生じる。当該座位でのリードの割合は、３，０００を１００万の総リードで割ったもの、または総リードの０．３％である。
一部の実施形態では、アレルデータが取得され、この場合において当該アレルデータは、多型座位の特定アレルのコピー数を示す、定量的な測定値を含む。一部の実施形態では、当該アレルデータは、多型座位で実測された各アレルのコピー数を示す、定量的な測定値を含む。典型的には、対象となる多型座位の全ての可能性のあるアレルについて、定量的な測定値が取得される。例えば、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ、ハイスループットＤＮＡシーケンスなどのＤＮＡシーケンスといったＳＮＰ座位またはＳＮＶ座位のアレルを決定する、前段落で検討された方法のいずれかを使用して、多型座位の特定のアレルのコピー数の定量的な測定値を生成することができる。この定量的な測定値は、本明細書においてアレル頻度データまたは実測遺伝的アレルデータと呼ばれる。アレルデータを使用する方法は、定量的アレル法と呼ばれることもある。この方法は、アレル固有性に関係なく非多型座位または多型座位からの定量的データのみを使用する定量的方法とは対照的である。アレルデータがハイスループットシーケンスを使用して測定される場合、アレルデータは典型的には、対象となる座位にマッピングされた各アレルのリード数を含む。
一部の実施形態では、非アレルデータが取得され、この場合において当該非アレルデータは、特定座位のコピー数を示す、定量的な測定値を含む。座位は、多型または非多型であり得る。座位が非多型である一部の実施形態では、非アレルデータは、当該座位に存在する可能性がある個々のアレルの相対量または絶対量についての情報を含まない。非アレルデータ（すなわち、非多型座位からの定量的データ、または各断片のアレル固有性に関係ない多型座位からの定量的データ）のみを使用する方法は、定量的方法と呼ばれる。典型的には、対象となる多型座位の全ての可能性のあるアレルについて定量的測定値が取得され、一つの値は、合計で当該座位での全アレルについて測定された量と関連付けられる。多型座位の非アレルデータは、当該座位の各アレルについて、定量的アレルを合計することによって取得され得る。アレルデータがハイスループットシーケンスを使用して測定される場合、非アレルデータは典型的には、対象となる座位にマッピングされたリード数を含む。シーケンス測定値は、座位に存在する各アレルの相対数および／または絶対数を示す場合があり、非アレルデータは、アレル固有性に関係なく、当該座位にマッピングされたリードの合計を含む。一部の実施形態では、同じシーケンス測定値セットを使用して、アレルデータと非アレルデータの両方を生成することができる。一部の実施形態では、アレルデータは、対象となる染色体でのコピー数を決定する方法の一部として使用され、生成された非アレルデータは、対象となる染色体でのコピー数を決定するための異なる方法の一部として使用することができる。一部の実施形態では、二つの方法は統計的に直交しており、これらを組み合わせて対象となる染色体でのコピー数に関するより正確な決定が為される。
一部の実施形態では、遺伝子データの取得には、（ｉ）例えば、自動化ハイスループットＤＮＡシーケンサーの使用によるなど、実験技術によりＤＮＡの配列情報を取得すること、または（ｉｉ）実験技術により従前に取得された情報を獲得することであって、当該情報は、例えばインターネット上のコンピューターにより、またはシーケンスデバイスからの電子的転送により、電子的に送信される、獲得すること、を含む。
追加的なサンプルの調製、増幅、および定量法の例は、２０１２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１３／６８３，６０４号（米国特許出願公開第２０１３／０１２３１２０号、および２０１４年５月１６日に出願された米国特許出願第６１／９９４，７９１号）に記載されており、当該出願は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。これらの方法は、本明細書に開示されるサンプルのいずれかの分析に使用することができる。
１０．３ セルフリーＤＮＡの定量方法の例
望ましい場合、ｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡの量または濃度は、標準的な方法を使用して測定することができる。一部の実施形態では、セルフリーミトコンドリアＤＮＡ（ｃｆ ｍＤＮＡ）の量または濃度が決定される。一部の実施形態では、核ＤＮＡ（ｃｆ ｎＤＮＡ）を起源とするセルフリーＤＮＡの量または濃度が決定される。一部の実施形態では、ｃｆ ｍＤＮＡとｃｆ ｎＤＮＡの量または濃度は、同時に決定される。
一部の実施形態では、ｑＰＣＲを使用して、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｃｆｍ ＤＮＡが測定される（Ｋｏｈｌｅｒら、“Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ．”Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ８：１０５，２００９，８：ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７６－４５９８－８－１０５。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃｆ ｎＤＮＡ由来の一つ以上の座位（例えば、グリセロアルデヒド－３－ホスファデヒドロゲナーゼ、ＧＡＰＤＨ）、およびｃｆ ｍＤＮＡ由来の一つ以上の座位（ＡＴＰａｓｅ ８、ＭＴＡＴＰ ８）を、マルチプレックスｑＰＣＲを使用して測定することができる。一部の実施形態では、蛍光標識ＰＣＲを使用して、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｃｆ ｍＤＮＡが測定される（Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂａｃｈら、“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｂｅｎｉｇｎ ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓ ７：２８４８－２８５４，２０１１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。望ましい場合、データの正規分布は、例えばシャピロ－ウィルク検定などの標準的な方法を使用して決定することができる。望ましい場合、例えばマン・ホイットニーのＵ検定などの標準的な方法を使用して、ｃｆ ｎＤＮＡとｍＤＮＡのレベルを比較することができる。一部の実施形態では、ｃｆ ｎＤＮＡおよび／またはｍＤＮＡのレベルは、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定またはクラスカル・ウォリス検定などの標準的な方法を使用して、他の確立された予後因子と比較される。
１０．４ ＲＮＡの増幅、定量、および分析方法の例
以下の例示的な方法のいずれかを使用して、例えば、ｃｆＲＮＡ、細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、コード細胞質ＲＮＡ、非コード細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはｔＲＮＡなどのＲＮＡを増幅および任意で定量してもよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇでワールドワイドウェブで利用可能なｍｉＲＢａｓｅデータベースに列挙されたｍｉＲＮＡ分子のいずれかであり、当該内容は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。例示的なｍｉＲＮＡ分子としては、ｍｉＲ－５０９、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－１４６ａが挙げられる。
一部の実施形態では、逆転写酵素多重化ライゲーション依存プローブ増幅（ＲＴ－ＭＬＰＡ：ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して、ＲＮＡを増幅する。一部の実施形態では、ハイブリダイズプローブの各セットは、ＳＮＰに及ぶ二つの短い合成オリゴヌクレオチドと、一つの長いオリゴヌクレオチドからなる（Ｌｉら、Ａｒｃｈ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ＲＴ－ＭＬＰＡ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒｓ，”Ｊｕｌｙ ５，２０１３，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００４０４－０１３－２９２６－５；Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、“Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ４０ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ５７，２００２；Ｄｅｎｇら、（２０１１）“Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ Ｍｅｄ．４９：６４１－６４６，２０１１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ＲＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲで増幅される。一部の実施形態では、ＲＮＡは、前述のＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを用いた一工程のリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲなどのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲで増幅される（Ｌｉら、Ａｒｃｈ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓｏｍｙ ２１ ｂｙ ＲＴ－ＭＬＰＡ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｓｅｔ ｏｆ ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒｓ，” Ｊｕｌｙ ５，２０１３，ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００４０４－０１３－２９２６－５；Ｌｏら、“Ｐｌａｓｍａ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ＲＮＡ ａｌｌｅｌｉｃ ｒａｔｉｏ ｐｅｒｍｉｔｓ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，” Ｎａｔ Ｍｅｄ １３：２１８－２２３，２００７；Ｔｓｕｉら、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｉｃｒｏ－ａｒｒａｙ ｂａｓｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ：ｔｏｗａｒｄｓ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：４６１－４６７，２００４；Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１－６４９，２０１２。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、マイクロアレイを使用してＲＮＡを検出する。例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のヒトｍｉＲＮＡマイクロアレイを、メーカーのプロトコールに従って使用することができる。簡潔に述べると、単離されたＲＮＡは脱リン酸化され、ｐＣｐ－Ｃｙ３でライゲーションされる。標識されたＲＮＡを精製し、Ｓａｎｇｅｒ ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ １４．０に基づくヒト成熟ｍｉＲＮＡ用のプローブを含有するｍｉＲＮＡアレイにハイブリダイズする。アレイを洗浄し、マイクロアレイスキャナー（Ｇ２５６５ＢＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してスキャンする。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．５．３により評価される。標識化、ハイブリダイゼーション、およびスキャンは、Ａｇｉｌｅｎｔ ｍｉＲＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｙｓｔｅｍのプロトコールに従って実施されてもよい（Ｇｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１２２：６４１－６４９，２０１２。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、ＴａｑＭａｎアッセイを使用してＲＮＡを検出する。例示的なアッセイは、ＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐａｎｅｌ ｖ１．０（Ｅａｒｌｙ Ａｃｃｅｓｓ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）であり、当該アッセイは、１５７個のＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓを含有し、各逆転写プライマー、ＰＣＲプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを含む（Ｃｈｉｍら、“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ，” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．５４（３）：４８２－９０，２００８。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
望ましい場合、一つ以上のｍＲＮＡのｍＲＮＡスプライシングパターンは、標準的な方法を使用して決定することができる（ＦＦａｃｋｅｎｔｈａｌ１ ａｎｄ Ｇｏｄｌｅｙ，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ １：３７－４２，２００８，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｍｍ．０００３３１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、高密度マイクロアレイおよび／またはハイスループットＤＮＡシーケンスを使用して、ｍＲＮＡスプライスバリアントを検出することができる。
一部の実施形態では、全トランスクリプトームのショットガンシーケンスまたはアレイを使用して、トランスクリプトームが測定される。
１０．５ 増幅方法の例
また、同じ反応ボリューム（例えば、全ての標的座位を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ反応サンプルの一部）において近傍する、または隣接する標的座位を増幅することが原因の干渉を最小化または防止する改善ＰＣＲ増幅法が開発されている。これらの方法を使用して、近傍する、または隣接する標的座位を同時に増幅することができ、これにより、異なる反応ボリュームに近傍標的座位を分離させて別々に増幅させて干渉を回避するよりも早く、そして安価になる。
一部の実施形態では、標的座位の増幅は、５’→３’の低エキソヌクレアーゼ活性および／または低鎖置換活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）を使用して実施される。一部の実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が低レベルであることにより、近傍プライマー（例えば、非伸長プライマー、またはプライマー伸長中に一つ以上のヌクレオチドが付加されたプライマー）の分解を減少または防止する。一部の実施形態では、鎖置換活性が低レベルであることにより、近傍プライマー（例えば、非伸長プライマー、またはプライマー伸長中に一つ以上のヌクレオチドが付加されたプライマー）の置換を減少または防止する。一部の実施形態では、互いに隣接する標的座位（例えば、標的座位の間に塩基が無い）または隣接する標的座位（例えば、座位が、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１塩基内にある）が増幅される。一部の実施形態では、一つの座位の３’末端は、次の下流座位の５’末端の５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１塩基以内にある。
一部の実施形態では、例えば一つの反応ボリュームにおいて同時増幅することにより、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個の異なる標的座位が増幅される。一部の実施形態では、増幅産物の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が、標的アンプリコンである。様々な実施形態において、標的アンプリコンである増幅産物の量は、５０以上～９９．５％以下、例えば６０以上～９９％以下、７０以上～９８％以下、８０以上～９８％以下、９０以上～９９．５％以下、または９５以上～９９．５％以下である。一部の実施形態では、標的座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が、例えば一つの反応ボリュームにおける同時増幅により、増幅される（例えば、増幅前の量と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍増幅される）。様々な実施形態において、増幅される（例えば、増幅前の量と比較して少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍増幅される）標的座位の量は、５０以上～９９．５％以下、例えば、６０以上～９９％以下、７０以上～９８％以下、８０以上～９９％以下、９０以上～９９．５％以下、９５以上～９９．９％以下、または９８以上～９９．９９以下である。一部の実施形態では、より少ない非標的アンプリコンが産生される。例えば、第一のプライマー対からのフォワードプライマーと第二のプライマー対からのリバースプライマーから形成されるアンプリコンは少ない。そうした望ましくない非標的アンプリコンは、過去の増幅方法を使用して、例えば第一のプライマー対からのリバースプライマー、および／または第二のプライマー対からのフォワードプライマーが、分解および／または置換された場合などに、産生される可能性がある。
一部の実施形態では、伸長されるプライマーに結合するポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が低い、および／または鎖置換活性が低いポリメラーゼであった場合に、近傍プライマー（例えば、次の下流プライマー）を分解および／または置換する可能性が低いため、これらの方法によって、より長時間の伸長時間を用いることが可能となる。様々な実施形態において、ポリメラーゼの伸長速度によって、伸長するプライマーに付加されるヌクレオチドの数が、プライマー結合部位の３’末端と同鎖上の次の下流プライマー結合部位の５’末端の間のヌクレオチド数の８０、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００％以上になる反応条件（例えば伸長時間と温度など）が使用される。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型として使用したＤＮＡアンプリコンが産生される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型として使用したＲＮＡアンプリコンが産生される。一部の実施形態では、逆転写酵素を使用して、ＲＮＡを鋳型として使用したｃＤＮＡアンプリコンが産生される。
一部の実施形態では、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性レベルの低さは、同条件下での同量のＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ポリメラーゼ（“Ｔａｑ”ポリメラーゼであり、好熱細菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来する、普遍的に使用されるＤＮＡポリメラーゼである。ＰＤＢ １ＢＧＸ、ＥＣ ２．７．７．７。Ｍｕｒａｌｉら、“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｂ：ｔｈｅ Ｆａｂ ｉｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ａｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｌｉｘ－ｃｏｉｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２５６２－１２５６７，１９９８。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）の活性の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、または０．１％未満である。一部の実施形態では、ポリメラーゼの鎖置換活性レベルの低さは、同条件下での同量のＴａｑポリメラーゼの活性の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１または０．１％未満である。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＰＵＳＨＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｍ０５３０Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０５３５Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｆｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｐｐｍａｎ ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａ．２：３４－３５，１９９５；Ｃｈｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｋ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０９：２８４－２９０，１９９３。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）である。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、処理能力強化ドメインと融合されたパイロコッカス様酵素である。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’ポリメラーゼ活性と、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端産物を生成する。ＰＨＵＳＩＯＮ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と、鎖置換活性を欠く。
一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｑ５（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｍ０４９１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）またはＱ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ０４９３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼは、処理能力強化Ｓｓｏ７ｄドメインに融合された、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する高忠実性、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼである。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性と、鎖置換活性を欠く。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼである（Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．；Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｈ．（１９８９）．“ＤＮＡ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，” Ｉｎ Ａｕｓｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．３．５．１０－３．５．１２．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（２ｎｄ ｅｄ．），５．４４－５．４７．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’方向にＤＮＡ合成を触媒し、鋳型およびプライマーの存在を必要とする。この酵素は３’→５’のエキソヌクレアーゼ活性を有し、この活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩの活性よりもはるかに高い。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶである（（Ｍ０３２７Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．；（Ｂｏｕｄｓｏｃｑ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：４６０７－４６１６，２００１；ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４：１１０２－１１１１，２００６。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶは、様々なＤＮＡ鋳型損傷部位にわたり効率的にＤＮＡを合成する、熱安定性のＹファミリー損害部位バイパスＤＮＡポリメラーゼである（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｐ．ら、（２００６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４，１１０２－１１１１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶは、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性と鎖置換活性を欠く。
一部の実施形態では、プライマーがＳＮＰを有する領域に結合する場合、当該プライマーは、異なる効率で様々なアレルに結合し、増幅するか、または一つのアレルのみに結合し、増幅し得る。ヘテロ接合性の対象については、アレルのうちの一つがプライマーにより増幅されない場合がある。一部の実施形態では、プライマーは、各アレルに対して設計される。例えば、二つのアレル（例えば、バイアレル性ＳＮＰ）が存在する場合、標的座位の同じ位置に結合するために二つのプライマーを使用することができる（例えば、Ａアレルに結合するフォワードプライマーと、Ｂアレルに結合するフォワードプライマー）。例えば、ｄｂＳＮＰデータベースなどの標準的な方法を使用して、ヘテロ接合率が高いＳＮＰホットスポットなどの、公知のＳＮＰの位置を決定することができる。
一部の実施形態では、アンプリコンのサイズは類似している。一部の実施形態では、標的アンプリコンの長さの範囲は、１００、７５、５０、２５、１５、１０、または５ヌクレオチド未満である。一部の実施形態（例えば、断片化されたＤＮＡまたはＲＮＡ中の標的座位の増幅など）では、標的アンプリコンの長さは、例えば、６０以上～８０ヌクレオチド以下、または６０以上～７５ヌクレオチド以下など、５０以上～１００ヌクレオチド以下である。一部の実施形態（例えば、エクソンまたは遺伝子全体にわたる、複数の標的座位の増幅など）では、標的アンプリコンの長さは、１００以上～５００ヌクレオチド以下、例えば１５０以上～４５０ヌクレオチド以下、２００以上～４００ヌクレオチド以下、２００以上～３００ヌクレオチド以下、または３００以上～４００ヌクレオチド以下である。
一部の実施形態では、複数の標的座位は、プライマー対を使用して同時に増幅され、当該ペアは、当該反応ボリューム中の増幅される各標的座位に対するフォワードプライマーとリバースプライマーを含む。一部の実施形態では、１ラウンドのＰＣＲは、標的座位あたり一つのプライマーを用いて行われ、その後の第二ラウンドのＰＣＲは、標的座位あたり一つのプライマー対を用いて行われる。例えば、第一ラウンドのＰＣＲは、標的座位あたり一つのプライマーを用いて実施されてもよく、それにより、（例えば、各座位に対するフォワードプライマーを使用して）全てのプライマーが同じ鎖に結合する。その結果、ＰＣＲは直線的に増幅することができ、配列の差異または長さの差異を原因とするアンプリコン間の増幅バイアスは減少または消滅する。一部の実施形態では、次いでアンプリコンは、各標的座位に対するフォワードプライマーとリバースプライマーを使用して増幅される。
１０．６ プライマー設計方法の例
望ましい場合、マルチプレックスＰＣＲは、プライマー二量体を形成する尤度が低いプライマーを使用して実施されてもよい。特に、高度に多重化されたＰＣＲはしばしば、例えばプライマー二量体の形成など、非生産的な副反応から生じるＤＮＡ産物を非常に高割合で生じさせる場合がある。一つの実施形態では、非生産的な副反応を引き起こす可能性が最も高い特定のプライマーをプライマーライブラリーから取り除き、ゲノムにマッピングされる増幅ＤＮＡの割合が高くなるプライマーライブラリーを得てもよい。問題のあるプライマー、すなわち、特に二量体を形成する可能性が高いプライマーを取り除く工程によって、予想外なことに、その後のシーケンスによる分析に対し、非常に高レベルのＰＣＲ多重化が可能となった。
マッピングされないプライマー二量体、または他のプライマー損害産物の量が最小化されるライブラリーのためにプライマーを選択する方法は多く存在する。実験データは、少数の「不良」プライマーが、大量の非マッピングプライマー二量体の副反応の原因であることを示している。これらの「不良」プライマーを除去することにより、標的座位にマッピングする配列リードの割合を増加させることができる。標的増幅によって増幅されたＤＮＡのシーケンスデータを調べることが、「不良」プライマーを特定する一つの方法である。最大頻度で見られるプライマー二量体を除去して、ゲノムにマッピングされない副産物ＤＮＡをもたらす可能性が有意に低いプライマーライブラリーを得ることができる。また、様々なプライマーの組み合わせの結合エネルギーを計算することができるプログラムも公的に利用可能であり、最も高い結合エネルギーを有する組み合わせを除去することによっても、ゲノムにマッピングされない副産物ＤＮＡをもたらす可能性が有意に低いプライマーライブラリーが得られる。
プライマー選択に関する一部の実施形態では、候補標的座位に対して一つ以上のプライマーまたはプライマー対を設計することによって、候補プライマーの初期ライブラリーが作製される。候補標的座位（例えばＳＮＰ）のセットは、例えば、標的集団内のＳＮＰ頻度またはＳＮＰのヘテロ接合性率など、標的座位の望ましいパラメータに関する、公的に利用可能な情報に基づき選択することができる。一つの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔのワールドワイドウェブ、ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３ ｒｅｌｅａｓｅ２．２．３、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して設計されてもよい。望ましい場合、プライマーは、特定のアニーリング温度範囲内でアニーリングするように設計されてもよく、特定のＧＣ含量範囲を有するよう設計されてもよく、特定のサイズ範囲を有するよう設計されてもよく、特定のサイズ範囲の標的アンプリコンを産生するよう設計されてもよく、および／または他のパラメータ特性を有するように設計されてもよい。候補標的座位あたり、複数のプライマーまたはプライマー対から始めると、標的座位の大部分またはすべてに対するプライマーまたはプライマー対がライブラリー中に残る尤度が高くなる。一つの実施形態では、選択基準は、標的座位あたり少なくとも一つのプライマー対がライブラリーに残ることを必要とする場合がある。そのほうが、標的座位のほとんどまたは全てが、最終プライマーライブラリーを使用することで増幅される。これは、例えばゲノム内の多数の場所での欠失または重複のスクリーニング、または疾患もしくは疾患のリスク増加に関連する多数の配列（例えば、多型または他の変異）のスクリーニングなどの用途に望ましい。ライブラリーからのプライマー対が、別のプライマー対によって生成された標的アンプリコンと重複する標的アンプリコンを生成する場合、当該プライマー対のうちの一つをライブラリーから除去して、干渉を防止してもよい。
一部の実施形態では、候補プライマーのライブラリーからの二つのプライマーの可能性のある組み合わせのほとんどまたはすべてについて、「望ましくないスコア」（スコアが高いと、望ましさは最も少なくなる）が計算される（例えば、コンピューター上の計算など）。様々な実施形態において、望ましくないスコアは、ライブラリー中の候補プライマーの可能性のある組み合わせの少なくとも８０、９０、９５、９８、９９、または９９．５％について計算される。望ましくないスコアはそれぞれ、当該二つの候補プライマー間の二量体形成の尤度に少なくとも部分的に基づいている。必要に応じて、望ましくないスコアは、当該標的座位のヘテロ接合性の比率、標的座位での配列（例えば、多型）と関連する罹患率、当該標的座位での配列（例えば、多型）と関連する疾患浸透率（ｄｉｓｅａｓｅ ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ）、標的座位に対する候補プライマーの特異度、候補プライマーのサイズ、標的アンプリコンの融点、標的アンプリコンのＧＣ含量、標的アンプリコンの増幅効率、標的アンプリコンのサイズ、および組み換えホットスポットの中心からの距離、からなる群から選択される一つ以上の他のパラメータに依存してもよい。一部の実施形態では、標的座位に対する候補プライマーの特異度は、当該候補プライマーが、増幅するよう設計された標的座位以外の座位に結合および増幅することによりミスプライムする尤度を含む。一部の実施形態では、ミスプライムする一つ以上またはすべての候補プライマーが、ライブラリーから除去される。一部の実施形態では、選択する候補プライマーの数を増やすために、ミスプライムの可能性がある候補プライマーは、ライブラリーから除去されない。複数の因子が検討される場合、望ましくないスコアは、様々なパラメータの加重平均に基づいて計算されてもよい。パラメータは、プライマーが使用される特定の用途に対するその重要性に基づいて様々な重みに割り当てられ得る。一部の実施形態では、望ましくないスコアが最も高いプライマーが、ライブラリーから除去される。除去されたプライマーが、一つの標的座位にハイブリダイズするプライマー対のメンバーである場合、当該プライマー対の他方のメンバーも、ライブラリーから除去されてもよい。プライマーを除去するプロセスは、必要に応じて繰り返されてもよい。一部の実施形態では、ライブラリーに残っている候補プライマーの組み合わせに対し、望ましくないスコアがすべて最小閾値以下になるまで、選択方法が実施される。一部の実施形態では、選択方法は、ライブラリーに残っている候補プライマーの数が所望の数に減少するまで実施される。
様々な実施形態において、望ましくないスコアが計算された後、第一の最小閾値を超える望ましくないスコアを有する二つの候補プライマーの組み合わせの最大数の一部である候補プライマーが、ライブラリーから除去される。この工程では、第一の最小閾値以下の相互作用はあまり重要ではないため、無視される。除去されたプライマーが、一つの標的座位にハイブリダイズするプライマー対のメンバーである場合、当該プライマー対の他方のメンバーも、ライブラリーから除去されてもよい。プライマーを除去するプロセスは、必要に応じて繰り返されてもよい。一部の実施形態では、ライブラリーに残っている候補プライマーの組み合わせに対し、望ましくないスコアがすべて第一の最小閾値以下になるまで、選択方法が実施される。ライブラリーに残っている候補プライマーの数が所望よりも多い場合、第一の最小閾値を、さらに低い第二の最小閾値にまで低下させ、プライマーを取り除くプロセスを繰り返すことによって、プライマーの数を減少させてもよい。ライブラリーに残っている候補プライマーの数が所望よりも少ない場合、第一の最小閾値を、さらに高い第二の最小閾値にまで上昇させて、元々の候補プライマーライブラリーを使用してプライマーを取り除くプロセスを繰り返し、より多くの候補プライマーがライブラリーに残れるようにすることにより、当該方法を継続させることができる。一部の実施形態では、ライブラリーに残っている候補プライマーの組み合わせに対し、望ましくないスコアがすべて第二の最小閾値以下になるまで、またはライブラリーに残っている候補プライマーの数が所望の数に減少するまで、選択方法が実施される。
必要に応じて、別のプライマー対によって生成された標的アンプリコンと重複する、標的アンプリコンを生成するプライマー対を、別の増幅反応に分割することができる。候補標的座位の全てを分析することが望ましいアプリケーションに対しては、（重複標的アンプリコンが原因で分析から候補標的座位を省く代わりに）複数回のＰＣＲ増幅反応が望ましい場合がある。
これらの選択方法は、ライブラリーから除去する必要のある候補プライマーの数を最小化し、プライマー二量体の望ましい現象を実現する。ライブラリーから少数の候補プライマーを除去することによって、得られたプライマーライブラリーを使用し、より多くの（または全ての）標的座位を増幅することができる。
多数のプライマーを多重化することにより、含有され得るアッセイにかなりの制限が課される。意図せずに相互作用するアッセイは、偽の増幅産物を生じさせる。ミニＰＣＲのサイズ制約は、さらなる制約をもたらす場合がある。一つの実施形態では、非常に多数の潜在的ＳＮＰ標的（約５００～１００万個超）から開始することが可能であり、各ＳＮＰを増幅するプライマーを設計しようと試みることが可能である。プライマーを設計することが可能な場合、ＤＮＡ二本鎖形成に関して公開されている熱力学的なパラメータを使用して、全ての可能性のあるプライマー対の間の偽プライマー二本鎖形成の尤度を評価することにより、偽生成物が形成される可能性の高いプライマー対を特定する試みが可能となる。プライマー相互作用は、当該相互作用に関連するスコア化関数によってランク付けされてもよく、最も悪い相互作用スコアを有するプライマーは、所望のプライマー数が満たされるまで取り除かれる。ヘテロ接合性である可能性が高いＳＮＰが最も有用である場合、アッセイのリストをランク付けし、最もヘテロ接合性に適合するアッセイを選択することも可能である。実験により、高い相互作用スコアを有するプライマーが、プライマー二量体を形成する可能性が最も高いことが実証された。高度に多重化された場合、すべての偽相互作用を取り除くことは不可能であるが、インシリコで最も高い相互作用スコアを有するプライマーまたはプライマー対は反応全体で優位に働き、意図される標的からの増幅が大幅に制限されてしまうため、それらを取り除くことは不可欠である。この手順を実施して、最大で１０，０００個、場合によっては１０，０００個を超えるプライマーの多重プライマーセットを生成した。この手順による改善は大きく、すべてのＰＣＲ産物のシーケンスによって決定したところ、最も不良なプライマーが取り除かれなかった場合の反応からの１０％と比較して、標的産物の８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、さらには９９％超の増幅を可能にする。前述の部分的セミ入れ子型法と組み合わせた場合、９０％超、さらには９５％超のアンプリコンが標的配列にマッピングされ得る。
どのＰＣＲプローブが二量体を形成する可能性が高いかを決定する方法が他にもあることに留意されたい。一つの実施形態では、最適化されていないプライマーセットを使用して増幅されたＤＮＡのプールを分析することで、充分に問題のあるプライマーを決定し得る。例えば、シーケンスを使用して分析が行われてもよく、最大数で存在する二量体は、二量体を形成する可能性が最も高いものと判定され、除去され得る。一つの実施形態では、プライマーの設計方法は、本明細書に記載されるミニＰＣＲ方法と組み合わせて使用されてもよい。
プライマー上のタグの使用は、プライマー二量体産物の増幅およびシーケンスを低減し得る。一部の実施形態では、プライマーは、タグとともにループ構造を形成する内部領域を含有する。特定の実施形態では、プライマーは、標的座位に特異的な５’領域、標的座位に特異的ではなく、ループ構造を形成する内部領域、および標的遺伝子座に特異的な３’領域を含む。一部の実施形態では、ループ領域は、二つの結合領域の間にある場合もあり、当該二つの結合領域は、鋳型ＤＮＡの連続領域または隣接領域に結合するよう設計されている。様々な実施形態では、３’領域の長さは、少なくとも７ヌクレオチドである。一部の実施形態では、３’領域の長さは、７以上～２０ヌクレオチド以下、例えば、７以上～１５ヌクレオチド以下、または７以上～１０ヌクレオチド以下である。様々な実施形態では、プライマーは、標的座位に特異的ではない５’領域（例えば、タグまたはユニバーサルプライマー結合部位）、次いで標的座位に特異的な領域、標的座位に特異的ではなく、ループ構造を形成する内部領域、および標的遺伝子座に特異的な３’領域を含む。タグプライマーを使用して、必要な標的特異的配列を２０塩基対未満、１５塩基対未満、１２塩基対未満、さらには１０塩基対未満にまで短縮することができる。これは、標的配列がプライマー結合部位内で断片化されているときの標準的なプライマー設計で予期せぬ出来事であり得、またはプライマー設計内に策定され得る。この方法の利点としては、特定の最大アンプリコン長について設計可能なアッセイの数を増加させること、およびプライマー配列の「非情報的」なシーケンスを短縮すること、が挙げられる。また、内部タグ付けと組み合わせて使用されてもよい。
一つの実施形態では、多重化標的ＰＣＲ増幅中の非生産的な産物の相対量は、アニーリング温度を上昇させることによって減少させることができる。標的特異的プライマーと同じタグを用いてライブラリーを増幅する場合、タグがプライマー結合に寄与するため、ゲノムＤＮＡと比較してアニーリング温度を上昇させることができる。一部の実施形態では、任意でアニーリング時間を長くしながら、プライマー濃度を低下させる。一部の実施形態では、アニーリング時間は、３分より長く、５分より長く、８分より長く、１０分より長く、１５分より長く、２０分より長く、３０分より長く、６０分より長く、１２０分より長く、２４０分より長く、４８０分より長く、さらには９６０分より長くてもよい。特定の例示的な実施形態では、プライマー濃度を低下させながら、長いアニーリング時間が用いられる。様々な実施形態において、例えば３分、５分、８分、１０分、または１５分超など、通常よりも長い伸長時間が用いられる。一部の実施形態では、プライマー濃度は、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭの低さ、さらには１ｎＭよりも低い。これにより驚くべきことに、例えば、１，０００－多重化反応、２，０００－多重化反応、５，０００－多重化反応、１０，０００－多重化反応、２０，０００－多重化反応、５０，０００－多重化反応、さらには１００，０００－多重化反応など、高度に多重化された反応に対して安定的な性能がもたらされる。一つの実施形態では、増幅は、長いアニーリング時間での１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、または５サイクルのランを用いて、次いでタグ付けされたプライマーを用いた通常のアニーリング時間でのＰＣＲサイクルで行われる。
標的位置を選択するために、候補プライマー対のプールの設計から開始し、プライマー対の間での潜在的に有害な相互作用に関する熱力学的モデルを作成し、次いで当該モデルを使用して、プール内の他の設計との適合性が無い設計を排除してもよい。
一つの実施形態では、本発明は、標的座位（例えば、疾患もしくは障害に関連する多型または変異、または例えば癌などの疾患もしくは障害に対するリスク増加に関連する多型または変異を含みうる座位）の数を減少させる方法、および／または検出された疾患負荷を増加させる（例えば、検出された多型または変異の数を増加させる）方法を特徴とする。一部の実施形態では、当該方法は、例えば癌などの疾患または障害を有する対象の中での各座位の多型または変異（例えば、一塩基変動、挿入、または欠失、または本明細書に記載される他の変動のいずれかなど）の頻度または再発率により、座位をランク付け（例えば、最高位から最低位までのランク付け）することを含む。一部の実施形態では、ＰＣＲプライマーは、座位の一部または全てに対して設計される。プライマーライブラリーに関してＰＣＲプライマーを選択する間は、より高い頻度または再発率の座位（より高くランク付けされた座位）に対するプライマーが、より低い頻度または再発率の座位（より低くランク付けされた座位）でのプライマーよりも好ましい。一部の実施形態では、当該パラメータは、本明細書に記載される望ましくないスコアの計算におけるパラメータの一つとして含まれる。必要に応じて、ライブラリー中の他の設計との適合性のないプライマー（例えば、高くランク付けされた座位に対するプライマー）を、異なるＰＣＲライブラリー／プールに含めることができる。一部の実施形態では、すべてのライブラリー／プールにより現れる座位のすべて（または大部分）の増幅を行うために、複数のライブラリー／プール（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）は、別個のＰＣＲ反応で使用される。一部の実施形態では、当該方法は、充分なプライマーが一つ以上のライブラリー／プールに含有され、当該プライマーにより、疾患または障害に関して全体として望ましい疾患負荷が（例えば、疾患負荷の少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％の検出により）捕捉され得るまで継続される。
１０．７ プライマーライブラリーの例
一つの態様では、本発明は、本発明方法のいずれかを使用して候補プライマーのライブラリーから選択されたプライマーなど、プライマーのライブラリーを特徴とする。一部の実施形態では、ライブラリーは、一つの反応ボリュームにおいて、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００個の異なる標的座位に同時にハイブリダイズする（または同時にハイブリダイズする能力を有する）、または同時に増幅する（または同時に増幅する能力を有する）プライマーを含む。様々な実施形態において、ライブラリーは、一つの反応ボリュームにおいて、１００以上～５００以下、５００以上～１，０００以下、１，０００以上～２，０００以下、２，０００以上～５，０００以下、５，０００以上～７，５００以下、７，５００以上～１０，０００以下、１０，０００以上～２０，０００以下、２０，０００以上～２５，０００以下、２５，０００以上～３０，０００以下、３０，０００以上～４０，０００以下、４０，０００以上～５０，０００以下、５０，０００以上～７５，０００以下、または７５，０００以上～１００，０００以下の異なる標的座位を同時に増幅する（または同時に増幅する能力を有する）プライマーを含む。様々な実施形態において、ライブラリーは、一つの反応ボリュームにおいて、１，０００以上～１００，０００以下の異なる標的座位、例えば、１，０００以上～５０，０００以下、１，０００以上～３０，０００以下、１，０００以上～２０，０００以下、１，０００以上～１０，０００以下、２，０００以上～３０，０００以下、２，０００以上～２０，０００以下、２，０００以上～１０，０００以下、５，０００以上～３０，０００以下、５，０００以上～２０，０００以下、ｏｒ ５，０００以上～１０，０００以下の異なる標的座位を同時に増幅する（または同時に増幅する能力を有する）プライマーを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、一つの反応ボリュームにおいて標的座位を同時に増幅する（または同時に増幅する能力を有する）プライマーを含み、増幅産物の６０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、または０．５％未満がプライマー二量体である。様々な実施形態で、プライマー二量体である増幅産物の量は、０．５以上～６０％以下、例えば、０．１以上～４０％以下、０．１以上～２０％以下、０．２５以上～２０％以下、０．２５以上～１０％以下、０．５以上～２０％以下、０．５以上～１０％以下、１以上～２０％以下または１以上～１０％以下である。一部の実施形態では、プライマーは、一つの反応ボリュームにおいて標的座位を同時に増幅し（または同時に増幅する能力を有し）、それにより増幅産物の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が、標的アンプリコンである。様々な実施形態において、標的アンプリコンである増幅産物の量は、５０以上～９９．５％以下、例えば６０以上～９９％以下、７０以上～９８％以下、８０以上～９８％以下、９０以上～９９．５％以下、または９５以上～９９．５％以下である。一部の実施形態では、プライマーは一つの反応ボリュームにおいて標的座位を同時に増幅し（または同時に増幅する能力を有し）、それにより標的座位の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％が増幅される（例えば、増幅前の量と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍増幅される）。様々な実施形態において、増幅される（例えば、増幅前の量と比較して少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍または１００倍増幅される）標的座位の量は、５０以上～９９．５％以下、例えば、６０以上～９９％以下、７０以上～９８％以下、８０以上～９９％以下、９０以上～９９．５％以下、９５以上～９９．９％以下、または９８以上～９９．９９以下である。一部の実施形態では、プライマーのライブラリーは、少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個のプライマー対を含み、この場合においてプライマーの各対は、フォワード試験プライマーとリバース試験プライマーを含み、各試験プライマーの対が、標的座位にハイブリダイズする。一部の実施形態では、プライマーのライブラリーは、異なる標的座位に各々ハイブリダイズする少なくとも１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個の個々のプライマーを含み、この場合において個々のプライマーはプライマー対の一部ではない。
様々な実施形態において、各プライマーの濃度は、１００、７５、５０、２５、２０、１０、５、２、もしくは１ｎＭ未満、または５００、１００、１０、もしくは１μｍ未満である。様々な実施形態において、各プライマーの濃度は、１μＭ以上～１００ｎＭ以下、例えば、１μＭ以上～１ｎＭ以下、１ｎＭ以上～７５ｎＭ以下、２ｎＭ以上～５０ｎＭ以下、または５ｎＭ以上～５０ｎＭ以下である。様々な実施形態において、プライマーのＧＣ含量は、３０以上～８０％以下、例えば、４０以上～７０％以下、または５０以上～６０％以下である。一部の実施形態では、プライマーのＧＣ含量の範囲は、３０、２０、１０、または５％未満である。一部の実施形態では、プライマーのＧＣ含量の範囲は、５以上～３０％以下、例えば、５以上～２０％以下または５以上～１０％以下である。一部の実施形態では、試験プライマーの融点（Ｔｍ）は、４０以上～８０℃以下、例えば５０以上～７０℃以下、５５以上～６５℃以下、または５７以上～６０．５℃以下である。一部の実施形態では、Ｔｍは、内臓ＳａｎｔａＬｕｃｉａパラメータ（ｐｒｉｍｅｒ３．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔのワールドワイドウェブ）を使用して、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｌｉｂｐｒｉｍｅｒ３、リリース２．２．３）を使用して計算される。一部の実施形態では、プライマーの融点の範囲は、１５、１０、５、３、または１℃未満である。一部の実施形態では、プライマーの融点の範囲は、１以上～１５℃以下、例えば１以上～１０℃以下、１以上～５℃以下、または１以上～３℃以下である。一部の実施形態では、プライマーの長さは、１５以上～１００ヌクレオチド以下、例えば１５以上～７５ヌクレオチド以下、１５以上～４０ヌクレオチド以下、１７以上～３５ヌクレオチド以下、１８以上～３０ヌクレオチド以下、または２０以上～６５ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、プライマーの長さの範囲は、５０、４０、３０、２０、１０、または５ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、プライマーの長さの範囲は、５以上～５０ヌクレオチド以下、例えば、５以上～４０ヌクレオチド以下、５以上～２０ヌクレオチド以下、または５以上～１０ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、標的アンプリコンの長さは、例えば、６０以上～８０ヌクレオチド以下、または６０以上～７５ヌクレオチド以下など、５０以上～１００ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、標的アンプリコンの長さの範囲は、５０、２５、１５、１０、または５ヌクレオチド未満である。一部の実施形態では、標的アンプリコンの長さの範囲は、５以上～５０ヌクレオチド以下、例えば、５以上～２５ヌクレオチド以下、５以上～１５ヌクレオチド以下、または５以上～１０ヌクレオチド以下である。一部の実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイを含まない。一部の実施形態では、ライブラリーは、マイクロアレイを含む。
一部の実施形態では、アダプターもしくはプライマーの一部（例えば少なくとも８０、９０、または９５％）またはすべては、隣接ヌクレオチド間に、天然に存在するホスホジエステル結合以外の結合を一つ以上含む。そうした結合の例としては、ホスホラミド、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート結合が挙げられる。一部の実施形態では、アダプターもしくはプライマーの一部（例えば少なくとも８０、９０、または９５％）またはすべては、最後の３’ヌクレオチドと、最後の３’ヌクレオチドの一つ前の間にチオリン酸塩（例えばモノチオリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、アダプターもしくはプライマーの一部（例えば少なくとも８０、９０、または９５％）またはすべては、３’末端の最後の２、３、４、または５ヌクレオチドの間にチオリン酸塩（例えばモノチオリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、アダプターもしくはプライマーの一部（例えば少なくとも８０、９０、または９５％）またはすべては、３’末端の最後の１０ヌクレオチドの外側の少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチドの間にチオリン酸塩（例えばモノチオリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、そうしたプライマーは、切断または分解される可能性が低い。一部の実施形態では、プライマーは、酵素切断部位（例えば、プロテアーゼ切断部位）を含有しない。
追加的なマルチプレックスＰＣＲ法およびライブラリーの例は、２０１２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１３／６８３，６０４号（米国特許出願公開第２０１３／０１２３１２０号）および２０１４年５月１６日に出願された米国特許出願第６１／９９４，７９１号に記載されており、これらは各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの方法およびライブラリーは、本明細書に開示されるサンプルのいずれかの分析に使用することができ、および本発明方法のいずれかに使用することができる。
１０．８ 組み換え検出用のプライマリーライブラリーの例
一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーは、一つ以上の公知の組み換えホットスポット（例えば相同なヒト染色体間の交差など）で組み換えが生じたかを判定するように設計される。染色体間でどのような交差が発生したかを知ることで、個体に対し、より正確に相決定された遺伝子データを判定することができる。組み換えホットスポットは、組み換え事象が集中する傾向がある染色体の局所的領域である。多くの場合、ホットスポットは、平均組み換え頻度よりも低い領域である“コールドスポット”に隣接される。組み換えホットスポットは、似た形態を共有する傾向があり、およそ１～２キロ塩基対（ｋｂｐ）の長さである。ホットスポット分布は、ＧＣ含量および反復因子の分布と正に相関する。部分的に変性した１３ｍｅｒのモチーフであるＣＣＮＣＣＮＴＮＮＣＣＮＣは、いくつかのホットスポットの活性において役割を果たしている。ＰＲＤＭ９と呼ばれるジンクフィンガータンパク質がこのモチーフに結合し、その位置で組み換えを開始することが示されている。組み換えホットスポットの中心間の平均距離は、約８０ｋｂｐであると報告されている。一部の実施形態では、組み換えホットスポットの中心間の距離は、約３ｋｂ～約１００ｋｂの範囲である。公開データベースには、多数の公知のヒト組み換えホットスポットが含まれており、例えば、ＨＵＭＨＯＴおよび国際ＨａｐＭａｐプロジェクトデータベースがある（例えば、Ｎｉｓｈａｎｔら、“ＨＵＭＨＯＴ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｉｏｔｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｈｏｔ ｓｐｏｔｓ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４：Ｄ２５－Ｄ２８，２００６，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ；Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚら、“Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ － Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｒｅａｌ Ｄａｔａ” ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（６）：ｅ６５２７２，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６５２７２；、およびｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．ｅｎのワールドワイドウェブを参照のこと。当該資料は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーは、組み換えホットスポット（例えば、公知のヒト組み換えホットスポット）でクラスター化され、またはその近傍でクラスター化される。一部の実施形態では、対応するアンプリコンを使用して、組み換えホットスポット内またはその近傍の配列を決定し、その特定のホットスポットで組み換えが発生したか否かを決定する（例えば、当該アンプリコンの配列が、組み換えが発生した場合に予想される配列であるか、または組み換えが発生しなかった場合に予想される配列であるか）。一部の実施形態では、プライマーは、組み換えホットスポット（および任意で組み換えホットスポットに隣接する配列）の一部またはすべてを増幅するように設計される。一部の実施形態では、長リードシーケンス（例えば、最大で約１０ｋｂまでのシーケンスに対しＩｌｌｕｍｉｎａ社が開発したＭｏｌｅｃｕｌｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用したシーケンス）、または対形成末端シーケンスを使用して、組み換えホットスポットの一部またはすべてをシーケンスする。組み換え事象が発生したか否かに関する知識を使用して、どのハプロタイプブロックがホットスポットに隣接するかを決定することができる。必要に応じて、特定のハプロタイプブロックの存在を、当該ハプロタイプブロック内の領域に特異的なプライマーを使用して確認することができる。一部の実施形態では、公知の組み換えホットスポット間には交差は存在しないと仮定される。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーは、染色体の末端で、またはその近傍でクラスター化される。例えば、そのようなプライマーを使用して、染色体の末端で特定のアームまたはセクションが存在するか否かを決定することができる。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーは、組み換えホットスポットで、またその近傍で、および染色体の末端で、またはその近傍でクラスター化される。
一部の実施形態では、プライマーライブラリーは、組み換えホットスポット（例えば、公知のヒト組み換えホットスポット）に特異的であり、および／または組み換えホットスポットの近傍の領域（例えば、組み換えホットスポットの５’末端または３’末端の１０、８、５、３、２、１または０．５ｋｂ以内）に特異的である一つ以上のプライマー（例えば少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、２，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、もしくは５０，０００個の異なるプライマーまたは異なるプライマー対）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、または１５０個の異なるプライマー（またはプライマー対）は、同じ組み換えホットスポットに対して特異的であるか、または同じ組み換えホットスポットに対して特異的であるか、もしくは組み換えホットスポットの近傍の領域に対して特異的である。一部の実施形態では、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、または１５０種類の異なるプライマー（またはプライマー対）は、組み換えホットスポット間の領域（例えば、組み換えを受けている可能性が低い領域）に対して特異的であり、これらのプライマーを使用して、ハプロタイプブロック（例えば、組み換えが発生したか否かに応じて予想されるもの）の存在を確認することができる。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％のプライマーは、組み換えホットスポットに特異的であり、および／または組み換えホットスポットの近傍の領域（例えば、組み換えホットスポットの５’末端または３’末端の１０、８、５、３、２、１、または０．５ｋｂ以内）に特異的である。一部の実施形態では、プライマーライブラリーを使用して、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、７５０個以上、１，０００個以上、２，０００個以上、５，０００個以上、７，５００個以上、１０，０００個以上、２０，０００個以上、２５，０００個以上、３０，０００個以上、４０，０００個以上または５０，０００個以上の異なる組み換えホットスポット（例えば、公知のヒト組み換えホットスポット）で発生したか否かが決定される。一部の実施形態では、組み換えホットスポットまたはその近傍領域に対するプライマーの標的となる領域は、ゲノムの当該部分に沿ってほぼ均等に広がっている。一部の実施形態では、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、または１５０個の異なるプライマー（またはプライマー対）は、染色体の末端領域、またはその近傍領域（例えば、染色体の末端から２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０１、または０．００１ｍｂ以内の領域）に特異的である。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％は、染色体の末端領域またはその近傍領域（例えば、染色体の末端から２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０１、または０．００１ｍｂ以内の領域）に特異的である。一部の実施形態では、少なくとも１、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００、または１５０個の異なるプライマー（またはプライマー対）は、染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％は、染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。一部の実施形態では、プライマーライブラリー中のプライマーの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％は、組み換えホットスポット、組み換えホットスポットの近傍領域、染色体の末端領域もしくはその近傍領域、または染色体中の潜在的な微小欠失内の領域に特異的である。
１０．９ キットの例
一つの態様では、本発明は、例えば本明細書に記載される方法のいずれかを使用して、核酸サンプル中の標的座位を増幅し、染色体セグメントもしくは染色体全体の欠失および／または重複を検出するキットなどのキットを特徴とする。一部の実施形態では、キットは、本発明のプライマーライブラリーのいずれかを含み得る。一つの実施形態では、キットは、複数の内側フォワードプライマーおよび任意で複数の内側リバースプライマー、ならびに任意で外側フォワードプライマーおよび外側リバースプライマーを含み、各プライマーは、標的の染色体または染色体セグメント、および任意で追加の染色体または染色体セグメントの標的部位（例えば、多型部位）のうちの一つからすぐ上流および／またはすぐ下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、キットは、例えば、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して、一つ以上の染色体セグメントまたは染色体全体の一つ以上の欠失および／または重複を検出することを目的とする、標的座位を増幅するためのプライマーライブラリーの使用に関する説明書を含む。
ある実施形態では、本発明のキットは、染色体異数性の検出およびＣＮＶ決定のためのプライマー対、例えばＣＮＶ（ＣｏＮＶＥＲＧｅ）（遺伝子型により明らかにされたコピー数バリアント事象：Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｎｔ Ｅｖｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）および／またはＳＮＶなどの染色体異数性を検出するための大規模な多重化反応のためのプライマー対などを提供する。これらの実施形態では、キットは、少なくとも１００、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、２８，０００、５０，０００または７５，０００個、および最大で２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００、２５００、３０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５，０００、２８，０００、５０，０００、７５，０００または１００，０００個のプライマー対を含み、それらは一緒に輸送される。プライマー対は、一つの管、例えば一つのチューブもしくはボックス、または複数のチューブもしくはボックスに含有され得る。ある実施形態では、プライマー対は、商業的提供者によって事前に認定されて、一緒に販売され、他の実施形態では、顧客は、カスタムな遺伝子標的および／またはプライマーを選択し、商業的提供者は、当該顧客に対して、一つのチューブでも複数のチューブでもなく、プライマープールを作製および輸送する。ある例示的な実施形態では、キットは、ＣＮＶとＳＮＶの両方、特に、少なくとも一つのタイプの癌と相関することが知られているＣＮＶとＳＮＶを検出するためのプライマーを含む。
本発明の一部の実施形態による循環ＤＮＡ検出用キットは、循環ＤＮＡ検出のための標準および／または対照を含む。例えばある実施形態では、標準および／または対照は、本明細書に提供される増幅反応を実施するために使用されるプライマー、例えば、ＣｏＮＶＥＲＧｅを実施するためのプライマーとともに販売され、ならびに任意で輸送および包装される。ある実施形態では、対照は、例えばＣＮＶなどの一つ以上の染色体異数性を呈し、および／または一つ以上のＳＮＶを含む単離ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡといったポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、標準および／または対照は、ＰｌａｓｍＡｒｔ標準と呼ばれ、特に特定の遺伝性疾患、ならびに癌などの特定の疾患状態においてＣＮＶを呈することが知られているゲノム領域に対する配列同一性、ならびに血漿中に天然に存在するｃｆＤＮＡ断片のサイズ分布を反映するサイズ分布を含む。ＰｌａｓｍＡｒｔ標準を作製するための方法の例は、本明細書の実施例に提供される。概して、染色体異数性を含むことが知られている源に由来するゲノムＤＮＡを単離し、断片化し、精製して、サイズ選択する。
したがって、人工ｃｆＤＮＡポリヌクレオチドの標準および／または対照は、上述のように調製された単離ポリヌクレオチドサンプルを、染色体異数性および／またはＳＮＶを呈さないことが判明しているＤＮＡサンプルに、例えば当該流体中のＤＮＡの０．０１％～２０％、０．１～１５％、または０．４～１０％など、インビボでｃｆＤＮＡについて実測される濃度と似た濃度で入れることによって作製することができる。これらの標準／対照は、アッセイ設計、特徴解析、開発、および／または検証のための対照として、ならびに、例えば、ＣＬＩＡラボで実施される癌検査などの検査中の品質管理標準として、ならびに／または研究用途のキットもしくは診断検査キットに含まれる標準として使用することができる。
１１．追加的な例示的実施形態
１１．１ データベースの例
本発明はまた、本発明方法からの一つ以上の結果を含むデータベースも特徴とする。例えば データベースは、一つ以上の対象について、以下の情報のいずれかを有する記録を含んでもよい：特定された任意の多型／変異（ＣＮＶなど）、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害のリスク増加と多形／変異の任意の公知の関連性、コードされるｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルまたは活性レベルに対する多型／変異の影響、サンプル中の総ＤＮＡ、総ＲＮＡまたは総細胞のうちの疾患または障害に関連するＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞（例えば疾患または障害に関連する多型／変異を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞）の割合、多形／変異を特定するために使用されるサンプルの供給源（例えば、血液サンプルまたは特定組織由来のサンプル）、疾患細胞の数、その後に検査を繰り返して得られた結果（例えば、疾患もしくは障害の進行または寛解をモニタリングするための検査の繰り返しなど）、疾患または障害の他の検査結果、対象が診断された疾患または障害のタイプ、与えられた治療、当該治療に対する反応、当該治療の副作用、症状（例えば、疾患または障害に関連する症状）、寛解の長さと回数、生存期間の長さ（例えば、初回検査から死亡までの期間の長さ、または診断から死亡までの期間の長さ）、死亡原因、およびそれらの組み合わせ。
一部の実施形態では、データベースは、一つ以上の対象について、以下の情報のいずれかを有する記録を含む：特定された任意の多型／変異、癌または癌のリスク増加と多形／変異の任意の公知の関連性、コードされるｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルまたは活性レベルに対する多型／変異の影響、サンプル中の総ＤＮＡ、総ＲＮＡまたは総細胞のうちの癌性のＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞の画分、多形／変異を特定するために使用されるサンプルの供給源（例えば、血液サンプルまたは特定組織由来のサンプル）、癌性細胞の数、腫瘍のサイズ、その後に検査を繰り返して得られた結果（例えば、癌の進行または寛解をモニタリングするための検査の繰り返しなど）、他の癌検査結果、対象が診断された癌のタイプ、与えられた治療、当該治療に対する反応、当該治療の副作用、症状（例えば、癌に関連する症状）、寛解の長さと回数、生存期間の長さ（例えば、初回検査から死亡までの期間の長さ、または癌診断から死亡までの期間の長さ）、死亡原因、およびそれらの組み合わせ。一部の実施形態では、当該治療に対する応答は、以下のいずれかを含む：腫瘍（例えば、良性腫瘍または癌性腫瘍）のサイズの減少または安定化、腫瘍サイズの増加の遅延または防止、腫瘍細胞数を減少または安定化、腫瘍消失とその再発の間の無病生存期間の延長、腫瘍の初回発生とその後の発生の防止、腫瘍に関連する有害な症状の低減または安定化、またはそれらの組み合わせ。一部の実施形態では、例えば癌などの疾患または障害に対する一つ以上の他の検査結果、例えば組織サンプルのスクリーニング検査、医学的撮像、または顕微鏡的検査からの結果が含まれる。
そのような一つの態様において、本発明は、少なくとも５、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８またはそれ以上の記録を含む電子データベースを特徴とする。一部の実施形態では、データベースは、少なくとも５、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８またはそれ以上の異なる対象についての記録を有する。
別の態様では、本発明は、本発明のデータベースとユーザーインターフェースを含むコンピューターを特徴とする。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、一つ以上の記録に含まれる情報の一部またはすべてを表示させる能力を有する。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、（ｉ）多型または変異を含有するとして特定される、その記録がコンピューターに保存されている一つ以上のタイプの癌、（ｉｉ）特定のタイプの癌で特定される、その記録がコンピューターに保存されている一つ以上の多型または変異、（ｉｉｉ）その記録がコンピューターに保存されている、特定のタイプの癌、または特定の多型もしくは変異に関する予後情報、（ｉｖ）その記録がコンピューターに保存されている、多型または変異を有する癌に有用な一つ以上の化合物または他の治療、（ｖ）その記録がコンピューターに保存されている、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の発現または活性を調節する一つ以上の化合物、および（ｖｉ）その記録がコンピューターに保存されている、化合物によりその発現または活性が調節される一つ以上のｍＲＮＡ分子またはタンパク質、を表示させる能力を有する。コンピューターの内部構成要素は、典型的には、メモリに結合されたプロセッサを含む。外部構成要素は通常、大容量デバイス、例えばハードディスクドライブ；ユーザー入力デバイス、例えばキーボードおよびマウス；ディスプレイ、例えばモニター；および任意でコンピューターシステムを他のコンピューターに接続させて、データと処理タスクを共有させる能力を有するネットワークリンクを含む。プログラムは、動作中に当該システムのメモリにロードされてもよい。
別の態様では、本発明は、本発明方法のいずれかの一つ以上の工程を含む、コンピューター実装プロセスを特徴とする。
１１．２ リスク要因の例
一部の実施形態では、対象は、例えば癌などの疾患または障害に対する一つ以上のリスク因子に関しても評価される。リスク因子の例としては、疾患または障害の家族歴、ライフスタイル（例えば、喫煙および発癌物質への曝露）、および一つ以上のホルモンまたは血清タンパク質のレベル（例えば、肝癌におけるアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、結腸直腸癌における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、または前立腺癌における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ））が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍のサイズおよび／または数が測定され、対象の予後決定、または対象の治療選択の際に使用される。
１１．３ スクリーニング方法の例
必要に応じて、例えば癌などの疾患または障害の有無を確認してもよく、または例えば癌などの疾患または障害を、任意の標準的な方法を使用して分類してもよい。例えば、例えば癌などの疾患または障害は多くの方法で検出することができ、特定の兆候および症状の存在、腫瘍生検、スクリーニング検査、または医学的撮像（例えば、マンモグラムまたは超音波）が挙げられる。癌の可能性が検出された時点で、組織サンプルの顕微鏡検査により診断を行ってもよい。一部の実施形態では、診断された対象は、複数の時点で、本発明の方法を使用した反復検査、または疾患もしくは障害に対する公知の検査を使用した反復検査を受けて、当該疾患もしくは障害の進行または当該疾患もしくは障害の寛解または再発をモニタリングされる。
１１．４ 癌の例
本発明方法のいずれかを使用して治療に対する反応性を予測またはモニタリングされ得る、診断、予後予測、安定化、治療、予防され得る癌の例としては、固形腫瘍、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、または芽腫が挙げられる。様々な実施形態では、癌は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫（例えば、小児の小脳または大脳の星状細胞腫）、基底細胞癌、胆管癌（例えば、肝外胆管癌）、膀胱癌、骨癌（例えば、骨肉腫または悪性線維性組織球腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（例えば、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、または視覚伝導路および視床下部の神経膠腫）、膠芽細胞腫、乳癌、気管支腺腫またはカルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（例えば、小児または消化管のカルチノイド腫瘍）、癌性中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫もしくは悪性神経膠腫（例えば、小児の小脳星状細胞腫または悪性神経膠腫）、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、ユーイング肉腫、ユーイングファミリー腫瘍における腫瘍、頭蓋外胚葉細胞腫瘍（例えば、小児の頭蓋外胚葉細胞腫瘍）、性腺外胚葉細胞腫瘍、眼癌（例えば、眼内黒色腫または網膜芽細胞腫の眼癌）、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外または卵巣の胚細胞腫瘍）、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫（例えば、脳幹、小児の大脳星状細胞腫、または小児の視覚伝導路および視床下部の神経膠腫）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚伝導路の神経膠腫（例えば、小児の視覚伝導路の神経膠腫）、島細胞癌（例えば、内分泌細胞癌または膵島細胞癌）、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性、または有毛細胞性の白血病）、口唇癌もしくは口腔癌、脂肪肉腫、肝癌（例えば、非小細胞癌または小細胞癌）、肺癌、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または中枢神経系リンパ腫）、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫または骨肉腫）、髄芽細胞腫（例えば、小児の髄芽細胞腫）、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（例えば、成人または小児の中皮腫）、肉眼で発見できない転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、多発性内分泌性新生組織形成性症候群（例えば、小児の多発性内分泌性新生組織形成性症候群）、多発性骨髄腫もしくは形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成疾患または骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病）、骨髄白血病（例えば、成人急性または小児急性の骨髄白血病）、骨髄増殖性障害（例えば、慢性骨髄増殖性障害）、鼻腔癌もしくは副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫もしくは骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌（例えば、膵島膵臓癌）、副鼻腔癌もしくは鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫もしくはテント上原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、小児の松果体芽細胞腫またはテント上原始神経外胚葉性腫瘍）、下垂体腺腫、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌もしくは尿路癌（例えば、腎盂または尿路の移行細胞癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（例えば、小児の横紋筋肉腫）、唾液腺癌、肉腫（例えば、ユーイングファミリー腫瘍における肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、または子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（例えば、非黒色腫、黒色腫、またはメルケル細胞皮膚癌）、小腸癌、扁平上皮細胞癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（例えば、小児のテント上原始神経外胚葉性腫瘍）、Ｔ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫など）、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫（例えば、小児胸腺腫）、胸腺腫もしくは胸腺癌、甲状腺癌（例えば、小児甲状腺癌）、絨毛性腫瘍（例えば、妊娠性絨毛性腫瘍）、原発部位不明の癌（例えば、成人または小児の原発部位不明癌）、尿道癌（例えば、子宮内膜子宮癌など）、子宮肉腫、膣癌、視覚伝導路もしくは視床下部の神経膠腫（例えば、小児の視覚伝導路または視床下部の神経膠腫）、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍（例えば、小児のウィルム腫瘍）である。様々な実施形態において、癌は、転移した、または転移していない。
癌は、ホルモンに関連する癌またはホルモン依存性の癌（例えば、エストロゲンまたはアンドロゲンに関連する癌）であっても、なくてもよい。良性腫瘍または悪性腫瘍は、本発明の方法および／または組成物を使用して、診断、予後判定、安定化、治療、または予防されてもよい。
一部の実施形態では、対象は、癌症候群を有する。癌症候群は、一つ以上の遺伝子内の遺伝子変異によって、影響を受ける個体が癌を発症しやすくなる遺伝的障害であり、これら癌の早期発症の原因となる場合もある。癌症候群はしばしば、生涯にわたる高い癌発症リスクだけでなく、複数の独立した原発性腫瘍発症のリスクも示す。これらの症候群の多くは、細胞の癌化防止に関与する腫瘍抑制遺伝子中の変異が原因である。影響を受ける可能性がある他の遺伝子は、ＤＮＡ修復遺伝子、癌遺伝子、および血管生成（血管新生）に関与する遺伝子である。遺伝性癌症候群の一般的な例は、遺伝性乳癌－卵巣癌症候群、および遺伝性非ポリープ型結腸癌（リンチ症候群）である。
一部の実施形態では、Ｋ－ｒａｓ、ｐ５３、ＢＲＡ、ＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２に一つ以上の多型または変異を有する対象に、それぞれＫ－ｒａｓ、ｐ５３、ＢＲＡ、ＥＧＦＲ、またはＨＥＲ２を標的とする治療が与えられる。
本発明方法は概して、任意の細胞、組織もしくは臓器型の悪性腫瘍または良性腫瘍の治療に適用することができる。
１１．５ 治療例
必要に応じて、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増大を安定化、治療、または予防するための任意の治療を、対象（例えば、本発明方法のいずれかを使用して、癌を有する、または癌のリスクが高いとして特定された対象）に与えることができる。様々な実施形態では、治療は、例えば癌などの疾患または障害に対する公知の治療または併用治療であり、限定されないが、細胞障害剤、標的化療法、免疫療法、ホルモン療法、放射線治療、癌性細胞もしくは癌となる可能性が高い細胞の外科的除去、幹細胞移植、骨髄移植、光力学的療法、緩和治療、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、治療（例えば、予防薬）を使用して、例えば癌などの疾患または障害のリスクが高い対象における、例えば癌などの疾患または障害を予防、遅延、または重症度を低下させる。一部の実施形態では、治療は、外科手術、第一選択の化学療法剤、アジュバント療法、またはネオアジュバント療法である。
一部の実施形態では、標的化療法は、癌の増殖と生存に寄与する癌の特定の遺伝子、タンパク質、または組織環境を標的とする治療である。このタイプの治療は、正常な細胞へのダメージを制限しながら、癌細胞の増殖と拡散を防止するものであり、通常、他の癌治療薬よりも副作用が少ない。
大きく成功した方法の一つは、腫瘍周辺の新しい血管増殖である血管新生を標的とする方法である。例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）などの標的化療法が、血管新生に干渉する。別の例は、ＨＥＲ２を過剰発現する癌（例えば、一部の乳癌など）に対する、例えばトラスツズマブまたはラパチニブなどのＨＥＲ２を標的とする治療の使用である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を使用して、癌細胞の外側の特定の標的をブロックする。例としては、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ）、ベバシズマブ、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、およびトラスツズマブが挙げられる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体のトシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）を使用して、腫瘍に放射線が送達される。一部の実施形態では、経口低分子が、癌細胞内部の癌プロセスを阻害する。例としては、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）、ソラフェニブ、スニチニブ、およびテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）が挙げられる。一部の実施形態では、プロテアソーム阻害剤（例えば、多発性骨髄腫の治療薬であるボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ））が、細胞内の他のタンパク質を分解する酵素である特殊化タンパク質に干渉する。
一部の実施形態では、免疫療法は、身体の自然防御を強化して癌と戦わせるよう設計される。免疫療法の例示的なタイプは、免疫系機能を増強、標的、または回復させるために、身体または実験室のいずれかによって作製される材料を使用する。
一部の実施形態では、ホルモン療法は、体内のホルモンの量を減少させることにより癌を治療する。一部の乳癌および前立腺癌を含む数種の癌は、ホルモンと呼ばれる体内の天然の化学物質の存在下でのみ増殖し、拡散する。様々な実施形態では、ホルモン療法を使用して、前立腺癌、乳癌、甲状腺癌、および生殖系の癌が治療される。
一部の実施形態では、治療は、造血幹細胞と呼ばれる高度に専門化された細胞によって罹患骨髄が置換される幹細胞移植を含む。造血幹細胞は、血流と骨髄の両方に存在する。
一部の実施形態では、治療は、光増感剤と呼ばれる特殊な薬剤を光とともに使用して癌細胞を殺す光力学的療法を含む。薬剤は、特定の種類の光によって活性化された後で機能する。
一部の実施形態では、治療は、癌性細胞、または癌になる可能性が高い細胞の外科的な切除（例えば、腫瘍摘出手術または乳腺切除術）を含む。例えば、乳癌感受性遺伝子変異（ＢＲＣＡ１遺伝子変異、またはＢＲＣＡ２遺伝子変異）を有する女性は、リスク軽減卵管卵巣摘出術（卵管および卵巣の除去）、および／またはリスク軽減両側乳房切除術（両乳房の除去）を用いて乳癌と卵巣癌のリスクを減少させてもよい。一部の癌の治療を含む、非常に慎重な外科的作業に対しては、非常に強力で精密な光のビームであるレーザーを、刃物（外科用メス）の代わりに使用することができる。
癌を減速、停止、または除去するための治療（疾患指向性治療とも呼ばれる）に加えて、癌ケアの重要な部分は、対象の症状と、例えば疼痛および悪心などの副作用を緩和することである。これには、緩和的または支持的なケアと呼ばれるアプローチである、身体的、感情的、および社会的なニーズで、対象を支援することが含まれる。ヒトはしばしば、疾患指向性治療と、症状緩和のための治療を同時に受けることがある。
例示的な治療としては、アクチノマイシンＤ、アドセトリス、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ、アムシジン（ａｍｓｉｄｉｎｅ）、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、アナストロゾール、アレディア、アリミデックス、アロマシン、アスパラギナーゼ、アバスチン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボンドロナット、ボネフォス（ｂｏｎｅｆｏｓ）、ボルテゾミブ、ブシルベクス（ｂｕｓｉｌｖｅｘ）、ブスルファン、カンプト、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス、セツキシマブ、キマックス（ｃｈｉｍａｘ）、クロラムブシル、シメチジン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、酢酸シプロテロン、シプロスタット（ｃｙｐｒｏｓｔａｔ）、シタラビン、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダカルボジン（ｄａｃａｒｂｏｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロゲニル（ｄｒｏｇｅｎｉｌ）、エムシット（ｅｍｃｙｔ）、エピルビシン、エポシン（ｅｐｏｓｉｎ）、アービタックス、エルロチニブ、エストラサイト（ｅｘｔｒａｃｙｔｅ）、エストラムスチン、エトポホス、エトポシド、エボルトラ、エキセメスタン、フェアストン、フェマーラ、フィルグラスチム、フルダラ、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、ジェムザール、グリーベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、グリベック、ゴナペプチルデポ（ｇｏｎａｐｅｐｔｙｌ ｄｅｐｏｔ）、ゴセレリン、ハラヴェン、ハーセプチン、ハイカムプチン（ｈｙｃａｍｐｔｉｎ）、ヒドロキシカルバミド、イバンドロン酸、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスホミド（ｉｆｏｓｆｏｍｉｄｅ）、インターフェロン、イマチニブメシル酸塩、イレッサ、イリノテカン、ジェブタナ、ランビス（ｌａｎｖｉｓ）、ラパチニブ、レトロゾール、リューケラン、リュープロレリン、リュースタット（ｌｅｕｓｔａｔ）、ロムスチン、マブキャンパシュ（ｍａｂｃａｍｐａｔｈ）、マブセラ、メガセ（ｍｅｇａｃｅ）、メゲストロール、メトトレキサート、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）、マイトマイシン、ムツラン（ｍｕｔｕｌａｎｅ）、マイレラン、ナベルビン、ニューラスタ（ｎｅｕｌａｓｔａ）、ニューポジェン、ネクサバール、ニペント（ｎｉｐｅｎｔ）、ノルバデックスＤ、ノバントロン、オンコビン、パクリタキセル、パミドロネート、ＰＣＶ、ペメトレキセド、ペントスタチン、パージェタ（ｐｅｒｊｅｔａ）、プロカルバジン、プロベンジ（ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、プレドニゾロン、プロストラップ（ｐｒｏｓｔｒａｐ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、リツキシマブ、スプリセル、ソラフェニブ、ソルタモックス（ｓｏｌｔａｍｏｘ）、ストレプトゾシン、スチルボエストロール（ｓｔｉｌｂｏｅｓｔｒｏｌ）、スチムバックス（ｓｔｉｍｕｖａｘ）、スニチニブ、スーテント、タブロイド（ｔａｂｌｏｉｄ）、タガメット、タモフェン（ｔａｍｏｆｅｎ）、タモキシフェン、タルセバ、タキソール、タキソテレ、ウラシルを用いたテガフール、テモダール、テモゾロミド、サリドマイド、チオプレックス（ｔｈｉｏｐｌｅｘ）、チオテパ、チオグアニン、トムデックス、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トレオスルファン、トリエチレンチオホルホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｒｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリプトレリン、タイバーブ（ｔｙｖｅｒｂ）、ウフトラル（ｕｆｔｏｒａｌ）、ベルケイド、ベプシド（ｖｅｐｅｓｉｄ）、ベサノイド、ビンクリスチン、ビノレルビン、ザーコリ（ｘａｌｋｏｒｉ）、ゼローダ、ヤーボイ、ザクチマ（ｚａｃｔｉｍａ）、ザノサー（ｚａｎｏｓａｒ）、ザベデス（ｚａｖｅｄｏｓ）、ゼベリン（ｚｅｖｅｌｉｎ）、ゾラデックス、ゾレドロネート、ゾメタゾレドロン酸、およびザイティガが挙げられる。
一部の実施形態では、癌は、乳癌であり、個体に投与される治療または化合物は、以下のうちの一つ以上である：Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセル・アルブミン安定化ナノ粒子製剤）、Ａｄｏ－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｅｍｔａｎｓｉｎｅ、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（エベロリムス：Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ、Ａｒｅｄｉａ（パミドロン酸二ナトリウム）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール：Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エキセメスタン：Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩：Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｅｒｉｂｕｌｉｎ Ｍｅｓｙｌａｔｅ、Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ、Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射剤）、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン：Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント：Ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ）、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール：Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｆｕｌｖｅｓｔｒａｎｔ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ Ａｃｅｔａｔｅ、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ：Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、Ｉｂｒａｎｃｅ（パルボシクリブ：Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）、Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ、Ｉｘｅｍｐｒａ（イクサベピロン：Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、Ｋａｄｃｙｌａ（Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン：Ａｄｏ－Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ：Ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ）、Ｌａｐａｔｉｎｉｂ Ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ、Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ、Ｌｙｎｐａｒｚａ（オラパリブ：Ｏｌａｐａｒｉｂ）、Ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ Ａｃｅｔａｔｅ、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｎｅｒａｔｉｎｉｂ Ｍａｌｅａｔｅ、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩：Ｎｅｒａｔｉｎｉｂ Ｍａｌｅａｔｅ）、Ｏｌａｐａｒｉｂ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ａｌｂｕｍｉｎ－ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ、Ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ Ｄｉｓｏｄｉｕｍ、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ：Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ Ｃｉｔｒａｔｅ、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル：Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル：Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、Ｔｈｉｏｔｅｐａ、Ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｔｒｅｘａｌｌ（メトトレキサート：Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブトシル酸塩：Ｌａｐａｔｉｎｉｂ Ｄｉｔｏｓｙｌａｔｅ）、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ：Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ）、Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ、Ｘｅｌｏｄａ（カペシタビン：Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリン酢酸塩：Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ Ａｃｅｔａｔｅ）、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン塩酸塩：Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ Ｃｉｔｒａｔｅ。一部の実施形態では、癌は、乳癌であり、個体に投与される治療または化合物は、以下から選択される組み合わせである：ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）とシクロホスファミド；ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミド、およびパクリタキセル（タキソール）；ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミド、およびフルオロウラシル；メトトレキサート、シクロホスファミド、およびフルオロウラシル；エピルビシン塩酸塩、シクロホスファミド、およびフルオロウラシル；ならびにドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン）、シクロホスファミド、およびドセタキセル（タキソテレ）。
ｍＲＮＡまたはタンパク質の変異型（例えば、癌関連型）および野生型（例えば、癌に関連しない型）の両方を発現する対象について、療法は、野生型の発現または活性を阻害するよりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、または２０倍多く、変異型の発現または活性を阻害することが好ましい。複数の治療剤の同時に使用または連続して使用することで、癌の発生率を大幅に減少させ、治療に抵抗性となる治療済の癌の数を減少させる場合がある。さらに、併用療法の一部として使用される治療剤は、癌を治療するために当該治療剤が個別に使用されるときに必要とされる対応用量よりも低い用量で済む場合がある。併用療法における各化合物の用量の低さは、当該化合物からの潜在的な有害副作用の重症度を減少させる。
一部の実施形態では、癌のリスクが高いと特定された対象（本発明または任意の標準的方法により）は、特定のリスク要因を回避し、またはライフスタイルを変えて、任意の癌のさらなるリスクを減少させてもよい。
一部の実施形態では、多型、変異、リスク因子、またはそれらの任意の組み合わせを使用して、対象に対する治療レジメンを選択する。一部の実施形態では、癌のリスクが高い対象、または予後不良である対象に対して、高い用量または多くの治療回数が選択される。
１１．５．１ 個別療法または併用療法に含有される他の化合物
必要に応じて、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスク増加を安定化、治療、または予防するための追加の化合物は、当分野に公知の方法に従って、天然産物または合成（または半合成）抽出物の両方の巨大ライブラリー、または化学物質ライブラリーから特定されてもよい。薬剤開発分野の当業者であれば、被験抽出物または被験化合物の正確な供給源が本発明方法にとって重要ではないことを理解するであろう。したがって、事実上、任意の数の化学抽出物または化合物を、特定のタイプの癌または特定の対象由来の細胞に対するその効果についてスクリーニングすることができ、または癌関連分子（例えば、特定のタイプの癌において活性または発現が変化していることが判明している癌関連分子）の活性または発現に対するその効果についてスクリーニングすることができる。粗抽出物が癌関連分子の活性または発現を調節することが見出された場合、当分野で公知の方法を使用して、ポジティブリード抽出物のさらなる分画化を行い、実測された効果に関与する化学成分を単離してもよい。
１１．５．２ 治療法の試験のためのアッセイおよび動物モデルの例
必要に応じて、本明細書に開示される治療法のうちの一つ以上が、細胞株（例えば、本発明方法を使用して癌と診断された、または癌リスクが増加したと診断された対象において特定された変異のうちの一つ以上を有する細胞株）、または例えばＳＣＩＤマウスモデル（Ｊａｉｎら、Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅｄ．Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．６４７－６７１，２００１。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）などの疾患または障害の動物モデルを使用して、例えば癌などの疾患または障害に対するその効果を検証されることができる。さらに、例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害に対するリスクの増大を安定化、治療、または予防するための特定の療法の有効性を決定するために使用され得る標準的アッセイ、および動物モデルが多数存在する。治療法は、標準的なヒト臨床試験でも試験することができる。
特定の対象に対して好ましい治療法を選択するために、化合物は、当該対象において変異している一つ以上の遺伝子の発現または活性に対するその効果について試験されることができる。例えば、特定のｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現を調節する化合物の能力は、標準的なノーザン分析、ウェスタン分析、またはマイクロアレイ分析を使用して検出することができる。一部の実施形態では、（ｉ）当該対象において（例えば、当該対象由来のサンプルにおいて）、正常レベルよりも高いレベルで発現されるか、または正常活性レベルよりも高い活性レベルを有する癌を促進するｍＲＮＡ分子もしくはタンパク質の発現または活性を阻害する、または（ｉｉ）当該対象において正常レベルより低いレベルで発現されるか、または正常活性レベルより低い活性を有する癌を阻害するｍＲＮＡ分子もしくはタンパク質の発現または活性を促進する、一つ以上の化合物が選択される。（ｉ）対象において、癌に関連する変異を有するｍＲＮＡ分子またはタンパク質の最大数を調節する、および（ｉｉ）対象において、癌に関連する変異を有さないｍＲＮＡ分子またはタンパク質の最小数を調節する、個別療法または併用療法。一部の実施形態では、選択された個別療法または併用療法は、高い薬剤有効性を有し、存在する場合でも、有害な副作用をほとんどもたらさない。
上述の対象特異的分析法の代替法として、ＤＮＡチップを使用して、特定のタイプの早期癌または後期癌（例えば、乳癌細胞）におけるｍＲＮＡ分子の発現と、正常組織における発現とを比較することができる（Ｍａｒｒａｃｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２，２０６－２０９，２０００；Ｈａｒｋｉｎ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．５：５０１－５０７，２０００；Ｐｅｌｉｚｚａｒｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２２）：４５７７－４５８１，２０００。当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。この分析に基づいて、当該タイプの癌を有する対象に対する個別療法または併用療法を選択し、当該タイプの癌において発現が変化したｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を調節することができる。
特定の対象または対象群に対する治療法を選択するために使用されることに加えて、発現プロファイリングを使用して、治療中に発生するｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の変化をモニタリングすることができる。例えば、発現プロファイリングを使用して、癌関連遺伝子の発現が、正常レベルに戻ったか否かを決定することができる。戻っていない場合、当該治療法の一つ以上の化合物の用量を変えて、対応する癌関連遺伝子の発現レベルに対する当該治療法の効果を増加または減少させることができる。さらにこの分析を使用して、治療法が他の遺伝子（例えば、有害な副作用と関連する遺伝子）の発現に影響を及ぼすか否かを決定することができる。必要に応じて、当該治療法の用量または組成を変えて、望ましくない副作用を予防または低減することができる。
１１．５．３ 製剤および投与方法の例
例えば癌などの疾患もしくは障害、または例えば癌などの疾患もしくは障害のリスクの増大を安定化、治療、または予防するために、組成物は、当業者に公知の任意の方法を使用して製剤化され、投与されてもよい（例えば、米国特許第８，３８９，５７８号および第８，３８９，５５７号を参照のこと。当該特許は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。製剤化および投与に関する一般的な技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｄａｖｉｄ Ｔｒｏｙ，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．に見出すことができ、当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。液体、スラリー、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、ゲル、軟膏、座薬、注射液、吸入剤、およびエアロゾルは、そうした製剤の例である。例として、調節放出経口製剤または徐放経口製剤は、当分野で公知の追加的な方法を使用して調製することができる。例えば、活性成分の好適な徐放形態は、マトリックス錠剤またはカプセル組成物であり得る。好適なマトリクス形成材料としては、例えば、ワックス（例えば、カルナバ、蜜蝋、パラフィンワックス、セレシン、シェラックワックス、脂肪酸、および脂肪アルコール）、油、硬化オイルまたは脂肪（例えば、硬化した菜種油、ヒマシ油、牛脂、パーム油、および大豆油）、およびポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリエチレングリコール）が挙げられる。他の適切なマトリクス打錠材料は、他の担体とともに、微結晶セルロース、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、および充填剤である。錠剤はまた、顆粒状物質、コーティングされた粉末、またはペレットを含有してもよい。錠剤はまた、多層型であってもよい。任意選択で、完成した錠剤は、コーティングされていても、コーティングされていなくてもよい。
そうした組成物の典型的な投与経路としては、限定されないが、経口、舌下、口腔、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内の注射、または点滴法）、直腸、膣、および鼻内が挙げられる。好ましい実施形態では、治療法は、徐放デバイスを使用して投与される。
本発明の組成物は、その中に含まれる活性成分が、組成物の投与時に生体利用可能となるように製剤化される。組成物は、一つ以上の投与単位の形態を取ってもよい。組成物は、１、２、３、４、またはそれ以上の活性成分を含有してもよく、および任意で１、２、３、４、またはそれ以上の不活性成分を含有してもよい。
１２．定義
以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
本明細書で使用される技術用語および科学用語は、別段の定義が無い限り、当分野の当業者により普遍的に理解される意味を有する。当業者に公知の任意の好適な材料および／または方法論を、本明細書に記載の方法の実施において利用することができる。
本発明の記載および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から別段であることが明白に示されない限り、相互交換可能に使用され、複数形も同様に含むこと、および各意味の範囲内に含まれることが意図される。また本明細書において使用される場合、「および／または」とは、列記された項目のうちの一つ以上の任意の、およびすべての可能性のある組み合わせを指し、および包含し、ならびに選択的に解釈されるとき（「または」）の組み合わせの欠落を指し、および包含する。
本明細書で使用される場合、「約」は当業者によって理解され、使用される文脈に対してある程度まで変化する。使用される文脈を考慮しても当業者に明白ではない用語の使用がある場合、「約」は特定の用語の最大プラスマイナス１０％を意味する。
「一塩基多型（ＳＮＰ）」は、同じ種の二つのメンバーのゲノム間で異なり場合がある一塩基を指す。用語の使用は、各バリアントが発生する頻度に対するいかなる制限も暗示するものではない。
「配列」とは、ＤＮＡ配列または遺伝子配列を指す。これは、個体におけるＤＮＡ分子またはＤＮＡ鎖の一次的で物理的な構造を指す場合がある。これは、当該ＤＮＡ分子に存在するヌクレオチドの配列、または当該ＤＮＡ分子に対する相補鎖を指す場合がある。これは、インシリコでのその表現としての当該ＤＮＡ分子中に含まれる情報を指す場合がある。
「座位」とは、個体のＤＮＡ上の特定の対象となる領域を指し、ＳＮＰ、挿入または欠失の可能性のある部位、または他の何らかの関連する遺伝的変動の部位を指す場合がある。疾患に連鎖したＳＮＰは、疾患連鎖座位を指す場合もある。
「多型アレル」、さらに「多型座位」とは、遺伝子型が所与の種内の個体間で変化するアレルまたは座位を指す。多型アレルのいくつかの例としては、一塩基多型、短タンデムリピート、欠失、重複、および逆位が挙げられる。
「多型部位」とは、個体間で変化する多型領域に存在する特定のヌクレオチドを指す。
「アレル」とは、特定の座位を占有する遺伝子を指す。
「遺伝子データ」さらには「遺伝的データ」とは、一つ以上の個体のゲノムの態様を記述するデータを指す。これは、座位、部分配列もしくは全配列、部分染色体もしくは全染色体、または全ゲノムの一つまたはセットを指す場合がある。これは、一つまたは複数のヌクレオチドの固有性を指す場合もある。これは、連続するヌクレオチド、またはゲノム中の異なる位置に由来するヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを指す場合もある。遺伝子型データは典型的にはインシリコであるが、配列中の物質的なヌクレオチドを化学的にコードされた遺伝的データとみなすことも可能である。遺伝子型データは、個体「に対する」、個体「の」、個体「での」、個体「に由来する」、または個体「にある」と言われる場合がある。遺伝子型データとは、遺伝子型解析プラットフォームからの出力測定値を指す場合もあり、当該測定値は遺伝物質に対して生成される。
「遺伝物質」さらには「遺伝子サンプル」とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含む一つ以上の個体に由来する組織または血液などの物質を指す。
「信頼度」とは、分類されたＳＮＰ、アレル、アレルのセット、倍数性分類、または父性分類が正確である統計的尤度を指す。
「異数性」とは、細胞中に誤った数の染色体が存在する状態を指す。ヒト体細胞の場合、細胞が２２対の常染色体と１対の性染色体を含有しない場合を指すこともある。ヒト配偶子の場合、細胞が２３個の各染色体のうちの一つを含有しない場合を指すこともある。一つの染色体型の場合、２よりも多い、または２よりも少ない、相同であるが同一ではない染色体コピーが存在する場合を指すこともあり、または同じ親を起源とする二つの染色体コピーが存在する場合を指すこともある。
「染色体」とは、一つの染色体コピーを指すこともあり、これは正常な体細胞中に４６個存在する一つのＤＮＡ分子を意味し、一例は、母体に由来する１８番染色体である。染色体とは、正常なヒト体細胞中に２３個存在する染色体型を指す場合もあり、一例は、１８番染色体である。
「モノソミー」とは、細胞が染色体型のうちの一つのみを含む状態を指す。
「二染色体性（ダイソミー）」とは、細胞が染色体型のうちの二つを含む状態を指す。
「単為生殖性ダイソミー」とは、細胞が染色体型のうちの二つを含有し、そして両方の染色体が一つの親を起源とする状態を指す。
「トリソミー」とは、細胞が染色体型のうちの三つを含む状態を指す。
遺伝物質の状態またはシンプルに「遺伝子状態」とは、ＤＮＡ上のＳＮＰのセットの固有性、相決定された遺伝物質のハプロタイプ、または挿入、欠失、リピートおよび変異を含むＤＮＡ配列を指す場合がある。また、一つ以上の染色体、染色体セグメント、または染色体セグメントセットの倍数性の状態を指す場合もある。
「父性の確立」または「父性の決定」とは、疑惑のある父親が、妊娠中の胎児の生物学的父親であるか、父親ではないかを確立または決定すること、または疑惑のある父親が、胎児の生物学的父親である尤度を決定または確立することを指す。
「アレル比」とは、サンプル中または個体中に存在する多型座位での各アレルの量の間の比率を指す。サンプルがシーケンスにより測定される場合、アレル比とは、座位の各アレルにマッピングされるシーケンスリードの比率を指す場合がある。サンプルが強度を基にした測定法により測定される場合、アレル比とは、当該測定法により推定される、座位に存在する各アレルの量の比率を指す場合がある。
「アレル分布」またはアレルカウント分布とは、座位セット中の各座位に存在する各アレルの相対量を指す。アレル分布とは、個体、サンプル、またはサンプルに行われた一連の測定値を指し得る。シーケンスの場合、アレル分布とは、多型座位セット中の各アレルに関し、特定のアレルにマッピングされるリードの数または推定数を指す。アレル測定値は確率的に処理されてもよい。すなわち、所与のアレルが、所与のシーケンスリードに現れる尤度は、０～１の割合である。またはアレル測定値はバイナリ様式で処理されてもよい。すなわち、任意の所与のリードは、正確にゼロコピーまたは１コピーの特定のアレルであるとみなされる。
「アレルバイアス」とは、ヘテロ接合性座位の実測アレル比が、元のＤＮＡサンプルにあった比率とは異なる度合を指す。特定の座位のアレルバイアスの度合は、測定時に当該座位の元のＤＮＡサンプルでのアレル比により割られた当該座位の実測アレル比に等しい。アレルバイアスは、１よりも大きいと規定されてもよく、そのため、アレルバイアスの度合の計算値が１未満である値ｘとなる場合、アレルバイアスの度合は１／ｘとして書き換えられてもよい。アレルバイアスは、増幅バイアス、精製バイアス、または異なるアレルに異なる影響を及ぼす何らかの他の現象に起因する可能性がある。
「プライマー」さらには「ＰＣＲプローブ」とは、一つのＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）またはＤＮＡ分子の集団（複数のＤＮＡオリゴマー）を指し、当該ＤＮＡ分子は同一であるか、またはほぼ同一であり、当該プライマーは、標的の多型座位にハイブリダイズするよう設計された領域を含有し、およびＰＣＲ増幅を可能にするよう設計されたプライミング配列を含有してもよい。プライマーは、分子バーコードをさらに含んでもよい。プライマーは、個々の分子ごとに異なるランダム領域を含有してもよい。
「ハイブリッド捕捉プローブ」とは、例えばＰＣＲまたは直接合成などの様々な方法によって生成され、サンプル中の特定の標的ＤＮＡ配列のうちの一方の鎖に対して相補的であることが意図される、修飾を受けている可能性のある任意の核酸配列を指す。外来性ハイブリッド捕捉プローブは調製サンプルに加えられ、変性－再アニーリングプロセスを介してハイブリダイズされて、外来性－内在性断片の二本鎖を形成してもよい。次いでこれらの二本鎖は、様々な手段によってサンプルから物理的に分離されてもよい。
「シーケンスリード」とは、クローナルシーケンス法を使用して測定されたヌクレオチド塩基の配列を表すデータを指す。クローナルシーケンス法により、一つのオリジナルＤＮＡ分子の単一またはクローンまたはクラスターを表すシーケンスデータが生成され得る。シーケンスリードは、ヌクレオチドが正確に分類された確率を示す、配列の各塩基位置での関連品質スコアを有し得る。
シーケンスリードのマッピングは、特定生物のゲノム配列中のシーケンスリードの起源の位置を決定するプロセスである。シーケンスリードの起源の位置は、当該リードのヌクレオチド配列とゲノム配列の類似性に基づく。
「ホモ接合性」とは、対応する染色体座位に類似のアレルを有することを指す。
「ヘテロ接合性」とは、対応する染色体座位に類似していないアレルを有することを指す。
「ヘテロ接合性率」とは、所与の座位でヘテロ接合性アレルを有する個体の集団中の比率を指す。ヘテロ接合性率とはさらに、個体中、またはＤＮＡサンプル中の所与の座位で予測される、または実測されたアレル比を指す場合もある。
「ハプロタイプ」とは、同一染色体上で一緒に遺伝することが多い、複数座位でのアレルの組み合わせを指す。ハプロタイプとは、所与の座位のセット間に発生した組み換え事象の数に応じて、わずか二つの座位、または染色体全体を指す場合がある。ハプロタイプとは、統計的に関連づけられた一つの染色分体上の一塩基多型（ＳＮＰ）のセットを指す場合もある。
「ハプロタイプデータ」さらには「相決定データ」または「順序付けられた遺伝子データ」とは、二倍体ゲノム中または多倍数体ゲノム中の一つの染色体、すなわち二倍体ゲノム中の染色体から分離された母系コピーまたは父系コピーからのデータを指す。
「相決定」とは、順序付けられていない二倍体（または多倍数体）遺伝子データを与えられた個体のハプロタイプ遺伝子データを決定する行為を指す。これは、一つの染色体上に存在するアレルセットに関し、アレルの二つの遺伝子のうちいずれが、個体の二つの相同染色体の各々に関連付けられているかを決定する行為を指す場合もある。
「相決定データ」とは、一つ以上のハプロタイプが決定されている遺伝子データを指す。
「胎児」とは、胎児、または胎児と遺伝子的に類似した胎盤の領域を指す。妊娠中の女性において、胎盤の一部は胎児と遺伝学的に類似しており、母体の血液中に存在する遊離浮遊性胎児ＤＮＡは、胎児と合致する遺伝子型を有する胎盤の一部を起源とする場合がある。
「胎児起源のＤＮＡ」とは、その遺伝子型が本質的に胎児の遺伝子型と同等であった細胞の一部であったＤＮＡを指す。胎児の染色体の半分の遺伝情報は、胎児の母親から遺伝していることに留意されたい。一部の実施形態では、胎児細胞に由来する、これら母系遺伝染色体からのＤＮＡは、「胎児起源のもの」であり、「母体起源のもの」ではないとみなされる。
「母体起源のＤＮＡ」とは、その遺伝子型が本質的に母親の遺伝子型と同等であった細胞の一部であったＤＮＡを指す。
「胎児起源の細胞」とは、元々は胎児の一部であったことが確認された循環細胞を指す。
「母体起源の細胞」とは、元々胎児の一部ではなかった、母細胞であることが確認された循環細胞を指す。
「子供」とは、胚、分割球、または胎児を指す場合がある。本開示の実施形態において、記載される概念は、誕生した子供である個体、胎児、胚、またはそれら由来の細胞セットに等しくよく適用されることに留意されたい。「子供」という用語の使用はシンプルに、子供と称される個体が、親の遺伝的子孫であることを示唆することが意図される場合がある。「親」とは、個体の遺伝的な母親または父親を指す。個体は、典型的には２人の親、母親および父親を有するが、遺伝的または染色体的なキメラ現象など、必ずしもそうではない場合がある。「母親」とは、個体の生物学的母親を指す場合があり、および／または、当該個体を妊娠した際にその個体を担持している女性を指す場合もある。
「親の状況」とは、標的の二人の親のうちの一人または両方に関する、二つの関連染色体のうちの各々に関する、所与のＳＮＰの遺伝的状態を指す。
「母体血漿」とは、妊娠している女性からの血液の血漿部分を指す。
「臨床的決定」とは、個体の健康または生存に影響を及ぼす結果をもたらす行為を行うか否かに関する任意の決定を指す。出生前父子鑑定の状況において、臨床的決定とは、胎児を中絶するか否かの決定を指す場合がある。また臨床的決定とは、さらなる検査を実施する決定、または子供の出生に備えるための措置を講じる決定を指す場合もある。
「診断ボックス」とは、本明細書に開示される方法の一つまたは複数の態様を実施するように設計された一つ、または組み合わせの機械を指す。一つの実施形態では、診断ボックスは、患者ケア地点に配置されてもよい。一つの実施形態では、診断ボックスは、標的化増幅、続いてシーケンスを行ってもよい。一つの実施形態では、診断ボックスは、単独で、または技術者の助けを借りて機能してもよい。
「情報科学を基にした方法」または「情報科学を基にしたアプローチ」とは、大量のデータの意味を理解するために統計に大きく依存する方法を指す。出生前診断の状況において、これは、例えば分子アレイまたはシーケンスからの大量の遺伝子データを与えられて、直接物理的に状態を測定するのではなく、最も可能性の高い状態を統計学的に推測することにより、一つ以上の染色体での倍数性の状態、または一つ以上のアレルでのアレルの状態を決定するよう設計された方法を指す。本開示の一つの実施形態では、情報科学を基にした技術は、本特許で開示される技術であってもよい。本開示の一つの実施形態では、当該技術は、ＰＡＲＥＮＴＡＬ ＳＵＰＰＯＲＴ（商標）であってもよい。
一つもしくは複数の座位に対応するＤＮＡの選択的濃縮、または一つもしくは複数の座位でのＤＮＡの選択的濃縮とは、当該座位に対応する濃縮前のＤＮＡ混合物中のＤＮＡ分子の割合よりも、当該座位に対応する濃縮後のＤＮＡ混合物中のＤＮＡ分子の割合を高くする、任意の方法を指す。当該方法は、座位に対応するＤＮＡ分子の選択的な増幅を伴ってもよい。当該方法は、座位に対応しないＤＮＡ分子の除去を伴ってもよい。
「増幅」とは、ＤＮＡ分子のコピー数を増加させる方法を指す。
「選択的増幅」とは、特定のＤＮＡ分子のコピー数、またはＤＮＡの特定の領域に対応するＤＮＡ分子のコピー数を増加させる方法を指す場合がある。また、特定の標的ＤＮＡ分子のコピー数を増加させる方法、または非標的ＤＮＡ分子もしくは非標的ＤＮＡ領域を増加させるよりも標的ＤＮＡ領域を増加させる方法を指す場合もある。選択的増幅は、優先的濃縮方法であってもよい。
「ユニバーサルプライミング配列」とは、例えばライゲーション、ＰＣＲ、またはライゲーション介在ＰＣＲにより標的ＤＮＡ分子集団に付加され得るＤＮＡ配列を指す。標的分子の集団に付加されると、ユニバーサルプライミング配列に特異的なプライマーを使用して、１対の増幅プライマーを使用した標的集団の増幅が可能となる。ユニバーサルプライミング配列は、典型的には、標的配列とは関連しない。
「ユニバーサルアダプター」または「ライゲーションアダプター」または「ライブラリータグ」は、標的二本鎖ＤＮＡ分子集団の５－プライム末端と３－プライム末端に共有結合することができるユニバーサルプライミング配列を含有するＤＮＡ分子である。アダプターを付加することによって、標的集団の５－プライム末端および３－プライム末端に対するユニバーサルプライミング配列が提供され、ＰＣＲ増幅は、１対の増幅プライマーを使用して標的集団から全分子を増幅することが可能となる。
標的化とは、ＤＮＡ混合物中の座位セットに対応するＤＮＡ分子を選択的に増幅する、または別手段により選択的に濃縮するために使用される方法を指す。
決定、確立、および計算は、相互交換可能に使用され得る。
＊ ＊ ＊ ＊
以下の実施例は、本明細書で提供する実施形態の使用方法の完全な開示及び説明を当業者にもたらすように定期するものであり、開示の範囲を限定するものでもなく、また以下の実施例が全てであったり又は行った実験のみであるということを示すことを意図しているものでもない。使用する数字（例えば量、温度等）に関して精度を保証するような努力しているが、一部の実験的な誤差や偏差を考慮に入れるべきである。別に示さない限り、部分は容量部であり、温度は摂氏℃である。実施例を説明することを意図した本質的な態様を変更することなく、説明した方法において変形させることが可能であるということを理解されたい。
実施例１．
本実施例の目的は、少数の細胞からＤＮＡを濃縮するための戦略を開発することであった。特に本実施例は、一つの単一単離胎児細胞からのＤＮＡの濃縮を実証した。
本実施例に示されるモデルシステムは、血液からの希少細胞の濃縮効率、特に胎児細胞の濃縮と単離を評価するために設計した。細胞株ＡＧ１６７７７を胎児起源の細胞（女性）に使用し、細胞株ＡＧ１６７７８を母体起源の細胞に使用した。それらからのＤＮＡ混合物をｃｆＤＮＡ様の参照物として使用した。
胎児細胞濃縮プロセスの結果は、濃縮プラットフォームに応じて、１、１０、または数百個の細胞レベルの細胞混合物であった。胎児細胞濃縮効率を評価する方法は、わずか数個の細胞、さらには一つの細胞を使用して、胎児細胞を識別し、胎児割合を正確に推定できるようになるために必要であった。
細胞混合物は、ＡＧ１６７７７細胞およびＡＧ１６７７８細胞（トリソミー２１の娘／母のペア）を個々に手でマイクロピペッティングを行って、様々な比率（例えば、１００：０、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、５９：４１、５８：４２、５７：４３、５６：４４、５５：４５、５４：４６、５３：４７、５２：４８、５１：４９、５０：５０、４９：５１、４８：５２、４７：５３、４６：５４、４５：５５、４４：５６、４３：５７、４２：５８、４１：５９、４０：６０、３９：６１、３８：６２、３７：６３、３６：６４、３５：６５、３４：６６、３３：６７、３２：６８、３１：６９、３０：７０、２９：７１、２８：７２、２７：７３、２６：７４、２５：７５、２４：７６、２３：７７、２２：７８、２１：７９、２０：８０、１９：８１、１８：８２、１７：８３、１６：８４、１５：８５、１４：８６、１３：８７、１２：８８、１１：８９、１０：９０、９：９１、８：９２、７：９３、６：９４、５：９５、４：９６、３：９７、２：９８、１：９９または０：１００）で細胞を混合することにより生成された。
ＰＣＲ増幅用に細胞を調製するために、細胞は、プロテイナーゼＫ消化を使用して溶解された。
標的座位として選択された１３，０００個超の一塩基多型（ＳＮＰ）の高度多重化ＰＣＲ増幅を使用して、標的細胞由来のＤＮＡを増幅した。図６において、マルチプレックスＰＣＲ増幅反応の例示的なワークフローと条件を示す。
当該方法は、１細胞サンプルの分析にも使用された。培養された細胞株（ＡＧ１６７７７、ＡＧ１６７７８）から単離された１細胞をサンプルインプットとして使用する場合、胎児細胞ワークフローは、標準的なサンプルインプットを使用した場合と同等のヘトレートプロットの生成に成功したことが示された。したがって、１細胞を使用して染色体全体の異数性を決定することが可能となった。
胎児細胞単離での使用以外に、ワークフローを使用して、腫瘍の場合のコピー数変動（ＣＮＶ：ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の決定（研究ワークフローおよびデータ２０１４）および臓器移植患者におけるドナー細胞の存在の決定にも使用できる可能性がある。
本発明者らのＳＮＰを基にしたＮＧＳ法は、ＷＧＡ（全ゲノム増幅）の前増幅を行わずに細胞サンプルのランを実施する。ＷＧＡを省略することで、本発明方法は、ＷＧＡ依存型の従来方法と比較してコスト効率が良く、時間を節約できる。最も重要なことは、ＷＧＡを省略することで、ＷＧＡ工程からのＰＣＲバイアスが回避され、エラーが減少し、より信頼性の高い遺伝子型解析のためのデータが生成されることである。
実施例２．
本実施例の目的は、本明細書に開示される方法および組成物を使用して一つの細胞を分析できることを示すことであった。
細胞株ＡＧ１６７７７を胎児細胞として使用した。顕微鏡下でマイクロキャピラリーピペットを使用して、５μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中、０．１％ ウシ血清アルブミン）を入れたＰＣＲチューブに個々の細胞それぞれを採取した。以下の表２は、本実施例で使用された様々な数の細胞を含むサンプルを示す。
Figure 2022519159000036
表２に示す各サンプルに、６μＬの溶解緩衝液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ再構成緩衝液中、プロテイナーゼＫ）を添加した。反応混合物を、５６℃で６０分間インキュベートし、続いて９５℃で１０分間インキュベートした。（注：この手順はサーモサイクラーで実施することができる）サンプル混合物（細胞溶解物）は冷却され、その後、実施例１に記載される胎児細胞に対する増幅ワークフローを通して実行された。特に、ＳＴＡＲ１段階については、７．７６μｇのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ１ プライマー混合物、２０μＬの４ｘマスター混合物、および０．２４μＬの５Ｍ ＴＭＡＣがサンプルに加えられた。次いで、反応混合物を、以下の表３に概説されるＰＣＲプロトコールを使用して増幅した。
Figure 2022519159000037
ＰＣＲワークフローのＳＴＡＲ２段階のために、ＳＴＡＲ１ ＰＣＲ産物を水で１：２００に希釈した。この段階の増幅混合物を作製するために、希釈されたＳＴＡＲ１産物２ｕＬを、２．９４μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ２ プライマー混合物、２．５μＬの４ｘマスター混合物、２．５μＬの水、および０．０６μＬの５Ｍ 塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）と混合した。ＳＴＡＲ２反応混合物を、以下の表４に概説されるＰＣＲプロトコールを使用して増幅した。
Figure 2022519159000038
ＰＣＲワークフローのバーコード化段階のために、ＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を水で１：４０に希釈した。バーコード化用に増幅混合物を作製するために、希釈されたＳＴＡＲ２産物２μＬを、１μＬの１０μＭ Ｆ－ＢＣと混合し、２μＬのＮＳ２ バーコード（５μＭ）、２．５μＬの４ｘマスターミックス、および２．５μＬの水を一緒に混合した。バーコード化ＰＣＲのＰＣＲプロトコールを、以下の表５に示す。
Figure 2022519159000039
次いで、バーコード化産物をプールし、精製し、定量した。次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を使用して、プールされたサンプルをシーケンスした。
次いでシーケンスデータを、本明細書に記載のデータ解析方法を使用して解析し、図３に示すように、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ／Ｙ染色体のＳＮＰのヘトレートプロットを作成した。コピー数変動のデータ解析から、トリソミー２１（ダウン症候群）が、分析された細胞株に存在したことが示された。２１トリソミーの存在は、わずか一つの単一細胞のみを含有することが確認されているサンプルにおいてさえも明白に認められた（図３Ａ）。したがってこの方法は、現在使用されている、ｃｆＤＮＡの使用に基づく検査と比較して、優れた感度を示す。
実施例３．
本実施例の目的は、細胞混合物に対し、本明細書に開示される循環細胞を分析および特徴解析する方法を試験することであった。
細胞混合物サンプルは、顕微鏡下でマイクロキャピラリーピペットを用いて、個々の胎児細胞（ＡＧ１６７７７）および個々の母細胞（ＡＧ１６７７８）を採取することにより調製した。次いで個々に採取された胎児細胞と母細胞を、以下の表６に示すように特定の比率で混合した。
Figure 2022519159000040
各サンプルチューブにおいて、５μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中、０．１％ウシ血清アルブミン）中に細胞を懸濁した。細胞を溶解するために、６μＬの溶解緩衝液（Ａｒｃｔｕｒｕｓ再構成緩衝液中のプロテイナーゼＫ）を各サンプルに添加した。次いで反応混合物を、５６℃で６０分間インキュベートし、続いて９５℃で１０分間インキュベートした。（注：この手順はサーモサイクラーで実施することができる）混合物（細胞溶解物）は冷却され、その後、実施例１に記載される胎児細胞に対するＰＣＲ増幅ワークフローへと進んだ。
ＰＣＲワークフローの ＳＴＡＲ１段階については、７．７６μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ１プライマー混合物、２０μＬの４ｘマスター混合物、および０．２４μＬの５Ｍ ＴＭＡＣを各サンプルに加えた。ＰＣＲワークフローのＳＴＡＲ１段階のＰＣＲプロトコールを、以下の表７に示す。
Figure 2022519159000041
ＰＣＲワークフローのＳＴＡＲ２段階のために、ＳＴＡＲ１ ＰＣＲ産物を１：２００に水で希釈した。ＳＴＡＲ２増幅用の増幅混合物を作製するために、希釈されたＳＴＡＲ１産物２ｕＬを、２．９４μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ２ プライマー混合物、２．５μＬの４ｘマスター混合物、２．５μＬの水、および０．０６μＬの５Ｍ ＴＭＡＣと混合した。ＳＴＡＲ２反応のＰＣＲプロトコールを、以下の表８に示す。
Figure 2022519159000042
ＰＣＲワークフローのバーコード化段階のために、ＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を１：４０に水で希釈した。バーコード化用に増幅混合物を作製するために、希釈されたＳＴＡＲ２産物２μＬを、１μＬの１０μＭ Ｆ－ＢＣと混合し、２μＬのＮＳ２ バーコード（５μＭ）、２．５μＬの４ｘマスターミックス、および２．５μＬの水を一緒に混合した。バーコード化反応のＰＣＲプロトコールを、以下の表９に示す。
Figure 2022519159000043
次いで、バーコード化産物をプールし、精製し、定量した。次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を使用して、プールされたサンプルをシーケンスした。
次いでシーケンスデータを、本明細書に記載のデータ解析方法を使用して解析し、図４に示すように、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ／Ｙ染色体のＳＮＰのヘトレートプロットを作成した。本実施例で分析された胎児細胞にトリソミー２１が存在していることは知られており、胎児細胞のトリソミー２１は、５Ｆ５Ｍ（５個の胎児細胞と５個の母細胞、図４Ｄ）サンプル、７Ｆ３Ｍ（７個の胎児細胞と３個の母細胞、図４Ｃ）サンプル、９Ｆ１Ｍ（９個の胎児細胞と１個の母細胞、図４Ｂ）サンプル、および１０Ｆ（１０個の胎児細胞、図４Ａ）サンプルで確認された。したがって、本明細書に開示される方法は、わずか５個の標的細胞を含有する混合サンプルを解析することができる。
ｃｆＤＮＡサンプルと細胞サンプルとの間の胎児一致と母体一致、ならびに胎児純度の計算は、選択された細胞の固有性の決定に成功した。
Figure 2022519159000044
実施例４．
本実施例の目的は、妊娠している女性の血液サンプルから単離された循環細胞を分析することである。本実施例は、開示された方法が、例えば母体血液サンプル中の胎児細胞など、個々の循環細胞の固有性を解析および確認できることを実証する。
複数の血液サンプル（各３０ｍＬ）を、妊娠女性から採取する。５～１０ｍＬの血漿画分を、各血液サンプルから単離する。セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、血漿画分から抽出される。胎児細胞および母細胞は各血液サンプルから単離され、溶解される。同じ血液サンプルから４～６個の細胞を溶解して、１０μＬの細胞溶解物を得る。サンプルに、実施例１に記載される胎児細胞のＰＣＲ増幅ワークフローを行う。
ｃｆＤＮＡライブラリーの調製 ｃｆＤＮＡライブラリーは、ライブラリー調製キット（Ｎａｔｅｒａ、ＲＥＦ １３１１００）を使用して、ＮａｔｅｒａのＩＦＵ １３１１００．１ 改訂０２（ＩＦＵ－１０００２）に記載されるプロトコールに従って調製される。
次に、ｃｆＤＮＡライブラリーの６．７μＬを、３μＬのｃｆＤＮＡ ＯｎｅＳｔａｒプライマー混合物、１０μＬの４ｘマスター混合物、および０．３μＬの ５Ｍ ＴＭＡＣと混合することによって、ｃｆＤＮＡのＳＴＡＲ１増幅を行う。ＳＴＡＲ１ ＰＣＲプロトコールを、以下の表１１に示す。
Figure 2022519159000045
ｃｆＤＮＡ ＳＴＡＲ１産物をバーコード化するために、ＳＴＡＲ１ ｃｆＤＮＡ ＰＣＲ産物を水で１：４００に希釈し、２μＬの希釈 ＳＴＡＲ１ ｃｆＤＮＡ ＰＣＲ産物を、１μＬの１０μＭ Ｆ－ＢＣ、２μＬのＮＳ２ バーコード（５μＭ）、および５μＬの４ｘマスター混合物と混合する。ｃｆＤＮＡ ＳＴＡＲ１産物をバーコード化するための反応混合物を、以下の表１２に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000046
細胞溶解物のＳＴＡＲ１増幅については、５．８２μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ１ プライマー混合物、１５μＬの４ｘマスター混合物、および０．１８μＬの５Ｍ ＴＭＡＣを各サンプルに加える。ＳＴＡＲ１反応混合物を、以下の表１３に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000047
ＳＴＡＲ１細胞溶解物のＰＣＲ産物のＳＴＡＲ２増幅については、細胞溶解物のＳＴＡＲ１ ＰＣＲ産物を水で１：２００に希釈し、２μＬの希釈ＳＴＡＲ１産物を、２．９４μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ２ プライマー混合物、２．５μＬの４ｘマスター混合物、２．５μＬの水、および０．０６μＬの ５Ｍ ＴＭＡＣと混合する。ＳＴＡＲ２反応混合物を、以下の表１４に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000048
細胞溶解物サンプルのバーコード化については、細胞溶解物のＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を水で１：４０に希釈し、２μＬの希釈ＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を、１μＬの１０μＭ Ｆ－ＢＣ、２μＬのＮＳ２ バーコード（５ｕＭ）、２．５μＬの４ｘマスター混合物、および２．５μＬの水と混合する。バーコード化反応混合物を、以下の表１５に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000049
次いで、バーコード化産物をプールし、精製し、定量する。次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を使用して、プールされたサンプルをシーケンスする。サンプルごとに異なるバーコードを使用する。サンプルの総数に応じて、バーコード化ｃｆＤＮＡと、バーコード化細胞溶解物を一つのチューブまたは二つのチューブにプールしてシーケンスを行う。
シーケンスデータは、本明細書に記載されるデータ解析方法を使用して解析され、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ／Ｙ染色体のＳＮＰのヘトレートプロットが生成される。ｃｆＤＮＡサンプルと細胞サンプルとの間の胎児一致と母体一致は、本明細書のセクション２に記載されるように計算される。ｃｆＤＮＡサンプルと細胞サンプルとの間の胎児一致と母体一致、ならびに胎児純度の計算は、選択された細胞の固有性の決定に成功し得る。
実施例５．
本実施例の目的は、血液からの盲検化細胞サンプルの分析を行うことによって、開示される方法の感度および特異性をさらに試験し、個々の細胞の固有性を確認することである。
妊娠中の女性から複数の血液サンプルが採取され、そこから一つの胎児細胞と一つの母細胞が単離され、ｃｆＤＮＡが抽出される。細胞サンプルは、２個の胎児細胞または２個の母細胞を同じ起源から単離することによって調製される。次いで、単離された細胞を溶解して、複数の細胞溶解物サンプルを得る。ｃｆＤＮＡおよび細胞溶解物サンプルは、改変を伴う最適化Ｐａｎｏｒａｍａ ｖ２ ｇＤＮＡプロトコールで実行される。
ｃｆＤＮＡライブラリーの調製 ｃｆＤＮＡライブラリーは、ライブラリー調製キット（Ｎａｔｅｒａ、ＲＥＦ １３１１００）を使用して、ＮａｔｅｒａのＩＦＵ １３１１００．１ 改訂０２（ＩＦＵ－１０００２）に記載されるプロトコールに従って調製される。
ｃｆＤＮＡのＳＴＡＲ１調製については、６．７μＬのｃｆＤＮＡライブラリーを、３μＬのｃｆＤＮＡ ＯｎｅＳｔａｒプライマー混合物、１０μＬの４ｘマスター混合物、および０．３μＬの５Ｍ ＴＭＡＣと混合する。ＳＴＡＲ１反応混合物を、以下の表１６に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000050
ｃｆＤＮＡをバーコード化するために、ＯｎｅＳｔａｒ ＰＣＲ産物を水で１：４００に希釈し、２μＬの希釈ＳＴＡＲ１産物を、１μＬの１０ｕＭ Ｆ－ＢＣ、２μＬのＮＳ２ バーコード（５μＭ）、および５μＬの４ｘマスター混合物と混合する。バーコード化反応混合物を、以下の表１７に示すＰＣＲプロトコールを用いて実行する。
Figure 2022519159000051
細胞溶解物サンプルＤＮＡのＳＴＡＲ１増幅については、５．８２μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ１ プライマー混合物、１５μＬの４ｘマスター混合物、および０．１８μＬの５Ｍ ＴＭＡＣをサンプルに加える。細胞溶解物サンプルの ＳＴＡＲ１ ＰＣＲ増幅プロトコールを以下の表１８に示す。
Figure 2022519159000052
細胞溶解物サンプルのＳＴＡＲ２増幅については、細胞溶解物のＳＴＡＲ１ ＰＣＲ産物を水で１：２００に希釈し、２μＬの希釈ＳＴＡＲ１産物を、２．９４μＬのｇＤＮＡ ＳＴＡＲ２ プライマー混合物、２．５μＬの４ｘマスター混合物、２．５μＬの水、および０．０６μＬの ５Ｍ ＴＭＡＣと混合する。細胞溶解物サンプルの ＳＴＡＲ２ ＰＣＲ増幅プロトコールを以下の表１９に示す。
Figure 2022519159000053
細胞溶解物サンプルのバーコード化については、細胞溶解物のＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を水で１：４０に希釈し、２μＬの希釈ＳＴＡＲ２ ＰＣＲ産物を、１μＬの１０μＭ Ｆ－ＢＣ、２μＬのＮＳ２ バーコード（５μＭ）、２．５μＬの４ｘマスター混合物、および２．５μＬの水と混合する。細胞溶解物サンプルのバーコード化ＰＣＲ増幅プロトコールを以下の表２０に示す。
Figure 2022519159000054
次いで、バーコード化産物をプールし、精製し、定量する。次世代シーケンス（ＮＧＳ）技術を使用して、プールされたサンプルをシーケンスする。シーケンス完了後、本明細書に記載される方法を使用してデータが解析される。１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ／Ｙ染色体のＳＮＰは、ヘトレートプロットで視覚化することができる。ｃｆＤＮＡを参照として使用して、未知の細胞溶解物サンプルからのシーケンスデータを特徴解析することができる。ｃｆＤＮＡサンプルと細胞溶解物サンプルとの間の胎児一致と母体一致は、本明細書に記載されるアルゴリズムを使用して計算され、細胞の細胞固有性を決定するために使用される。

＊＊＊＊

Claims (40)

  1. 胎児起源であると推測される循環細胞の起源を決定する方法であって、
    ａ）小児細胞株、または胎児を妊娠している母親の血液サンプルから取得された胎児起源であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡからの第一のアンプリコンセット、および子供と母親のＤＮＡ混合物、または前記血液サンプルの血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡからの第二のアンプリコンセットを生成することであって、前記第一のアンプリコンセットと前記第二のアンプリコンセットは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）座位の多重化増幅反応を実行することによって取得される、生成すること、
    ｂ）次世代シーケンスにより前記第一のアンプリコンセットと前記第二のアンプリコンセットをシーケンスすること、および
    ｃ）前記第一のアンプリコンセットの配列に基づいて前記一つ以上の循環細胞の起源を決定することであって、前記第二のアンプリコンセットの配列は、参照として使用される、決定すること、を含む方法。
  2. 母親の細胞株から、または前記血液サンプルのバフィーコート画分から取得された一つ以上の母細胞から単離された母細胞ＤＮＡからの第三のアンプリコンセットを生成すること、および前記第三のアンプリコンセットを次世代シーケンスにより遺伝子型解析し、母親の遺伝子型を決定すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記血液サンプルから、胎児起源であると推測される前記循環細胞、前記セルフリーＤＮＡを含む前記血漿画分、および前記母細胞を含む前記バフィーコート画分を取得することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 工程（ｃ）が、子供と母親のＤＮＡの混合物または前記血漿画分から取得された前記セルフリーＤＮＡと、胎児起源であると推測される前記循環細胞から取得された前記細胞ＤＮＡとの間の母体一致と胎児一致の計算、および胎児混合物割合の計算を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第一のアンプリコンセットと前記第二のアンプリコンセットは、少なくとも１，０００個のＳＮＰ座位の多重化増幅反応を実施することにより取得される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＳＮＰ座位の量を測定することによって、前記母細胞と胎児細胞の混合物の前記胎児割合を推定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記方法が、前記ＳＮＰでのアレル比を決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記胎児割合の推定は、前記アレル比を使用する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記方法が、複数の循環細胞または細胞株を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された前記細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記細胞ＤＮＡは、胎児細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される、請求項１に記載の方法。
  11. 前記方法がさらに、一つ以上の循環細胞が一つ以上の胎児細胞であると決定された遺伝子型を使用して、非侵襲的な出生前検査を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記方法がさらに、一つ以上の胎児細胞であると決定された前記一つ以上の循環細胞における対象となる標的染色体または標的染色体セグメントのコピー数変動または異数性を検出することを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 対象となる前記標的染色体または標的染色体セグメントは、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、性染色体、および／またはそれらの染色体セグメントである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記方法がさらに、一つ以上の純粋な胎児細胞であると決定された前記一つ以上の循環細胞における微小欠失を検出することを含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記微小欠失は、ディジョージ症候群に関連する２２ｑ１１．２欠失、プラダーウィリ症候群に関連する微小欠失、アンジェルマン症候群に関連する微小欠失、１ｐ３６欠失、および／または猫鳴き症候群に関連する微小欠失である、請求項１４に記載の方法。
  16. 癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出するための方法であって、前記方法が、
    ａ）癌と診断された患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて、一つ以上の患者特異的変異を選択する工程、
    ｂ）前記患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、前記患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
    ｃ）循環腫瘍細胞であると推測され、前記患者の血液サンプルから取得される、一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡからアンプリコンセットを生成する工程であって、前記アンプリコンセットは、癌に関連する前記患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅によって生成される工程、
    ｄ）次世代シーケンスにより前記アンプリコンセットをシーケンスする工程、および前記アンプリコンセット中の前記一つ以上の患者特異的変異の存在に基づいて、前記一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、前記一つ以上の患者特異的変異を含む一つ以上の循環腫瘍細胞の検出が、前記癌の早期再発または転移を示す工程、を含む方法。
  17. 前記患者特異的変異が、癌に関連した一塩基バリアント（ＳＮＶ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、インデル、および／または遺伝子融合を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記アンプリコンセットが、癌に関連する少なくとも８個の患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅により生成される、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記アンプリコンセットが、癌に関連する少なくとも１６個の患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅により生成される、請求項１６に記載の方法。
  20. 癌に関連する少なくとも２個の患者特異的変異の前記存在が、前記一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示す、請求項１６に記載の方法。
  21. 癌に関連する少なくとも５個の患者特異的変異の前記存在が、前記一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示す、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記一つ以上の患者特異的変異を含む少なくとも２個の循環腫瘍細胞の検出が、前記癌の早期再発または転移を示す、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記方法が、複数の循環細胞を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された前記細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む、請求項１６に記載の方法。
  24. 前記細胞ＤＮＡは、腫瘍細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される、請求項１６に記載の方法。
  25. 前記方法がさらに、腫瘍細胞であると決定された一つ以上の循環細胞の遺伝子型から、癌に関連する追加の患者特異的変異を特定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  26. 前記患者は、肺癌に罹患している、請求項１６に記載の方法。
  27. 前記患者は、乳癌に罹患している、請求項１６に記載の方法。
  28. 前記患者は、膀胱癌に罹患している、請求項１６に記載の方法。
  29. 前記患者は、結腸直腸癌に罹患している、請求項１６に記載の方法。
  30. ドナー細胞であると推測される循環細胞の起源を決定する方法であって、
    ａ）移植レシピエントの血液サンプルから取得されたドナー細胞であると推測される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡからの第一のアンプリコンセット、および前記血液サンプルの血漿画分から取得されたセルフリーＤＮＡからの第二のアンプリコンセットを生成することであって、前記第一のアンプリコンセットと前記第二のアンプリコンセットは、複数の一塩基多型（ＳＮＰ）座位の多重化増幅反応を実行することによって取得される、生成すること、
    ｂ）次世代シーケンスにより前記第一のアンプリコンセットと前記第二のアンプリコンセットをシーケンスすること、および
    ｃ）前記第一のアンプリコンセットの配列に基づいて前記一つ以上の循環細胞の起源を決定することであって、前記第二のアンプリコンセットの配列は、参照として使用される、決定すること、を含む方法。
  31. 癌患者における腫瘍の早期再発または転移をモニタリングおよび検出するための方法であって、前記方法が、
    ａ）癌と診断された患者の腫瘍サンプルにおいて特定された体細胞変異に基づいて、一つ以上の患者特異的変異を選択する工程、
    ｂ）前記患者が外科手術、第一選択化学療法、および／またはアジュバント療法で治療された後、前記患者から一つ以上の血液サンプルを長期的に採取する工程、
    ｃ）前記患者の血液サンプルから単離されるセルフリーＤＮＡからの第一のアンプリコンセットを生成する工程であって、前記第一のアンプリコンセットは、癌に関連する前記患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅によって生成される工程、
    ｄ）次世代シーケンスにより前記第一のアンプリコンセットをシーケンスする工程、および前記アンプリコンセット中の一つ以上の患者特異的変異の存在を検出する工程であって、前記一つ以上の患者特異的変異の存在は、癌の早期再発または転移を示す工程、
    ｅ）前記患者の血液サンプルから取得される一つ以上の循環細胞から単離された細胞ＤＮＡから第二のアンプリコンセットを生成する工程であって、前記第二のアンプリコンセットは、癌に関連する前記患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅によって生成される工程、
    ｆ）次世代シーケンスにより前記第二のアンプリコンセットをシーケンスする工程、および前記アンプリコンセット中の一つ以上の患者特異的変異の存在に基づいて、前記一つ以上の循環細胞の起源を決定する工程であって、前記一つ以上の患者特異的変異の存在は、前記一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示す工程、および
    ｇ）腫瘍細胞であると決定された前記一つ以上の循環細胞の配列から、癌に関連する一つ以上の追加の変異を特定する工程、を含む方法。
  32. 前記患者特異的変異が、癌に関連した一塩基バリアント（ＳＮＶ）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、インデル、および／または遺伝子融合を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第一および／または第二のアンプリコンセットが、癌に関連する少なくとも８個の患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅により生成される、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記第一および／または第二のアンプリコンセットが、癌に関連する少なくとも１６個の患者特異的変異を包含するゲノム座位の多重化増幅により生成される、請求項３１に記載の方法。
  35. 工程（ｄ）において、癌に関連する少なくとも２個または少なくとも５個の患者特異的変異の前記存在が、癌の早期再発または転移を示す、請求項３１に記載の方法。
  36. 工程（ｆ）において、癌に関連する少なくとも２個または少なくとも５個の患者特異的変異の前記存在が、前記一つ以上の循環細胞が腫瘍細胞であることを示す、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記方法が、複数の循環細胞を個々の反応ボリュームに分けること、各反応ボリューム中の細胞ＤＮＡを単離すること、および各反応ボリュームにおいて単離された前記細胞ＤＮＡにサンプルバーコードを取り付けることを含む、請求項３１に記載の方法。
  38. 前記細胞ＤＮＡは、腫瘍細胞であると推測される一つの循環細胞から単離される、請求項３１に記載の方法。
  39. 前記患者は、肺癌、乳癌、膀胱癌または結腸直腸癌に罹患している、請求項３１に記載の方法。
  40. 癌に関連する前記一つ以上の追加の変異に基づいて前記患者を治療することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
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