JP2014519806A5 - - Google Patents

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JP2014519806A5
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Description

細胞内で自己会合し、ＲＮＡｉ活性を産生する組成物を使用した遺伝子発現を調節するための方法および成分
本願は、２０１１年４月２０日出願の米国仮特許出願第６１／４７７，２８３号および同第６１／４７７，２９１号、ならびに２０１１年４月２１日出願の同第６１／４７７，８７５号（前述の出願開示はすべて、それぞれ参照することによって完全に説明したかのように本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
本発明は、医薬、薬剤開発および遺伝子発現の調節の分野に関する。より具体的に述べると、本発明は、活動のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機序を産生する新規オリゴヌクレオチドベース薬剤を使用した遺伝子発現の調節を促進する組成物およびその使用方法を提供する。
本発明の属する技術状態を記載するために、公開出願と出願特許の両方を含む多数の刊行物および特許文書について本明細書を通して引用する。これらの引用は、それぞれ参照することによって完全に説明したかのように本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、ある二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造（ＲＮＡｉトリガー）が配列特異的な遺伝子阻害を引き起こす分子および機序を指す。ＲＮＡｉは２つの主要分類：短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に区別される。天然ｓｉＲＮＡの場合、ｄｓＲＮＡの元の供給源は、細胞に対して外来性であるかまたは細胞内転位因子に由来する。次いで、細胞は、ｄｓＲＮＡ供給源の活性を特異的に抑制することができるｓｉＲＮＡを産生するようにｄｓＲＮＡをプロセス化し得る。外来性供給源としては、生成したｓｉＲＮＡが、かかる侵入物に対して防御機序を提供するあるウイルスが挙げられる。
一方、天然ｍｉＲＮＡは、独立遺伝子からまたは一部の遺伝子をコードするタンパク質に見出される非常に短いイントロン配列から生成する前駆体分子から産生される。ｓｉＲＮＡ分子とは異なり、ｍｉＲＮＡ分子は特定の遺伝子に限定するのではなく、複数の異なる遺伝子を広く阻害する。したがって、天然ｓｉＲＮＡはｍｉＲＮＡより限定された活動阻害を特徴的に行う。
これらの差は、これら２つのＲＮＡｉクラスに関連する「標的コード」に部分的に反映される。標的コードは、標的配列の相補塩基対による認識に主にまたは完全に関与するアンチセンス鎖配列サブセットと簡単に定義することができる（Ａｍｂｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ， ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｍｏｒｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｗ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ｍｉＲＮＡ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｅｄ ９： ２７７−２７９， ２００３．に注釈を付けている。）
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ依存性活性遂行の根底にある一般的機序は実質的に重複するが、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ機能による遺伝子発現の詳細な抑制法は実質的に異なる。これらＲＮＡｉタイプのいずれにも適応可能である一般的機序の中心は、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）である。二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡはＲＩＳＣ内に積み込まれる。次のセンス鎖は廃棄され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣを標的（１つまたは複数）指向とするために使用される。
典型的およびｍｉＲＮＡサブセットのためのｓｉＲＮＡの場合、ＲＩＳＣ複合体は特異的なｍＲＮＡ標的を切断するアルゴノート２（ＡＧＯ２）と称する酵素を含む。他の酵素は分枝ｍＲＮＡを異常として認識し、さらに悪化させる。ＡＧＯ２によるｍＲＮＡ切断は、ガイド鎖と標的間で、特に、１０位と１１位のいずれか側のヌクレオシドのいくつかと共にガイド鎖５’末端から数えて１０および１１位に位置するＡＧＯ２切断側に隣接したヌクレオシドに関して、高配列相補性を必要とする。この位置（中央領域）で見出されるヌクレオシド配列は、この文脈において標的コードである。標的コードヌクレオシドと対応する標的ヌクレオシド間の完全相補性は典型的に、ＡＧＯ２ベース切断を必要とする。この標的コード外の追加ヌクレオシドもＲＩＳＣによって標的認識および機能的阻害の有効性に影響を及ぼし得、一部の不適合はこれらの側面領域で忍容し得る。
ｍｉＲＮＡ標的のゲノムワイド同一性および算出予想から、各哺乳動物ｍｉＲＮＡは平均して何百もの異なるｍＲＮＡの発現を阻害することが推定される。したがって、ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現調節パターンに関与し得る。しかしながら、特定のｍｉＲＮＡによる特定の細胞表現型を産生する能力は、１つ程度の少ない遺伝子の発現調節に基づくことができる。ほとんどの哺乳動物遺伝子は、ｍｉＲＮＡによって転写後に調節されると思われる。特定のｍｉＲＮＡ発現異常は、広範囲の医学的障害において病理的役割を有する。
標的コードは、ガイド鎖またはアンチセンス鎖５’末端から数えて２〜８位（または２〜７位）ヌクレオシドで構成されているいわゆる「シード配列」に存在するｍｉＲＮＡによって最も一般に使用される。この配列は、標的認識の主な決定因子であり、翻訳サイレンシングを引き起こす上で十分である。標的配列は、ｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に見出される。まれに、シード配列のヌクレオシド下流と標的間の相補性は、特にシード配列と標的の適合が弱い場合に標的認識に関与する。これらは３’補足または３’補整部位と称する。
別のｍｉＲＮＡ分類は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖５’末端から４位または５位下流で開始する１１または１２連続ヌクレオシドからなる「中心部位」に関与する標的コードを使用する。現在まで、標的コードによる標的認識を支持する３’補足または３’補整部位は覆われていない。
ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡ様阻害機序を有するいくつかを除き、ｍＲＮＡ値に影響を及ぼさず翻訳機序に干渉することによっておよび／または５’から３’方向の天然ｍＲＮＡ分解経路を活性化する必要がある状態を促進することによりｍＲＮＡ悪化を惹起することによって、特異的なｍＲＮＡ翻訳セットを抑制することができる。
ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの共通標的に加えて、一部のｍｉＲＮＡが５’ＵＴＲを標的とするかまたは一部のｍＲＮＡのコード領域に見出されている。これらの一部の場合では、ｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体は標的ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、他の場合では、翻訳を促進する。さらに、リボヌクレオタンパク質と複合体を形成し、したがってＲＩＳＣ独立形態でそれらのＲＮＡ結合機能に干渉する、あるｍｉＲＮＡの例がある。最後に、ＤＮＡへの結合によって特定の遺伝子転写に影響を及ぼし得るｍｉＲＮＡの証明された例もある。
過去数十年間に渡り、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関与するＲＮＡｉ関連機序は実質的に解明されており、植物と動物（すべてのヒト細胞タイプを含む）の両方において広範囲に発現することが見出されている。順に、これらの進歩は、ＲＮＡｉベース薬剤の治療候補としてならびに様々な研究および薬剤開発目的手段として使用するための設計および使用に適用されている。Ｔｕｓｃｈｌのグループは、細胞への合成ｓｉＲＮＡ投与について１０年以上前に最初に報告した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４１１： ４９４−４９８， ２００１）。従来のｓｉＲＮＡ治療は、ごく最近、霊長類ならびにヒトの肝臓において著しいＲＮＡｉ活性を達成可能な段階に到達した。現在までこれらの結果の至適化はｓｉＲＮＡを包括し、肝細胞へのその送達を促進する第２世代脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の使用に基づく。これらのデータは、ＰＣＳＫ９指向性のｓｉＲＮＡの第Ｉ相試験の暫定的な結果に由来する。
ｍｉＲＮＡは、比較的根本的にｓｉＲＮＡより複合体のＲＮＡｉ領域であり、結果的に治療用のｍｉＲＮＡベース薬剤候補を獲得することならびにｓｉＲＮＡに遅れを伴い様々な研究および薬剤開発目的手段として使用することが試みられている。潜在的ｍｉＲＮＡ治療としては、ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｍｉＲＮＡ模倣が挙げられる。最も進歩している点は、あるｍｉＲＮＡ機能を阻害するための立体障害機序を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の使用である。１例は、ｍｉＲ−１２２を阻害し、第ＩＩ相試験を完了して有望な結果を示した混合ＬＮＡ／ＤＮＡヌクレオシドホスホロチオエートオリゴである。ＭｉＲ−１２２は肝臓で高発現し、ＨＣＶ産生を必要とし、血漿中総コレステロール値を増大する。
ほとんど進歩していない点は、治療または研究または薬剤開発目的のｉｎ ｖｉｖｏ組織に対するｍｉＲＮＡ模倣送達である。部分的に、これは、分野が依然として治療的関連ｍｉＲＮＡの機能および同一性の解明の初期段階にあるためである。しかしながら、比較的少数のｍｉＲＮＡは、ある医学的状態における重要な役割を有する文献支持のための実質的な物体を有する。これらｍｉＲＮＡのいくつかは、発現下で病的である特定の癌タイプの抗癌遺伝子として機能する。重要なことに、欠損ｍｉＲＮＡ置換はしばしば実質的な抗癌活性、例えば、ｍｉＲ−３４およびｌｅｔ−７ファミリーメンバを有する。
薬剤としてのｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣開発における１つの最も重要な障壁は、体内組織でのこれらの化合物の非常に不良な吸収であることが当該技術分野において十分に認識されている（Ａｌｉａｂａｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３： ２５４６， ２０１２； Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ文書に先駆けオンラインで２０１２年１月１７日公開）。一般的使用において、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣を包括して生体利用可能な形態でそれらの組織内送達を促進する複合体担体が必要とされていることが広範囲に支持されている。現在まで成功しているこのアプローチは、かかる化合物の肝臓への送達に本質的に限定される。
一方、ｍｉＲＮＡを阻害するために使用されている立体障害アンチセンスオリゴは、担体を必要とせずに成功裏に組織に送達されている。さらに、臨床的重要な評価ポイントが達成されている。しかしながら、かかるオリゴは高用量を必要とし、潜在的に最も重要なことには標的ｍｉＲＮＡに対して非常に高い親和性を必要とする（Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４５２： ８９６， ２００８； Ｌａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７： １９８， ２０１０）。したがって、比較的高いＧ／Ｃ含量を有するｍｉＲＮＡは、この阻害形態に対して最も感受性であるべきである。高親和性を必要とするために、大多数またはこのアプローチを使用するｍｉＲＮＡおよび既存のアンチセンスオリゴ化学物質を効果的に標的とできない場合がある。
本明細書において使用されるｍｉＲＮＡ配列および命名法は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４： Ｄ１４０−Ｄ１４４， ２００６に記載されているｍｉＲＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）から取り込んでいる。簡単に述べると、ｍｉＲ−表示直後の番号、例えば、ｍｉＲ−２９は、特定のｍｉＲＮＡを示す。この表示は、様々な種に及ぶ対応するｍｉＲＮＡに適用される。例えば、ｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−３４ｂ中の文字は、成熟ｍｉＲＮＡ（アンチセンス鎖）における１つまたは２つの位置のみ異なる特定のｍｉＲＮＡを区別する。２番目のダッシュ記号に続く番号、例えば、ｍｉＲ−２４−１およびｍｉＲ−２４−２は、同一成熟ｍｉＲＮＡに生じる異なる遺伝子座を区別する。これらのｍｉＲＮＡは、異なるセンス鎖を有することができる。成熟ｍｉＲＮＡにおける他の一部のファミリーメンバ（１つまたは複数）と１つまたは２つのヌクレオシド位置のみ異なる複数のｍｉＲＮＡファミリーメンバおよび異なるヘアピン遺伝子座由来でもあるものは、文字と文字後の追加の番号の両方を有する、例えば、ｍｉＲ−２９ｂ−１およびｍｉＲ−２９ｂ−２はｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２９ｃである他のファミリーメンバを有する。最後に、一部の例では、２つの異なる成熟ｍｉＲＮＡ配列は、一方が５’腕由来であり他方が３’腕由来である同一ヘアピン前駆体から削除される。これらはそれぞれ−５ｐおよび−３ｐ、例えば、ｍｉＲ−１７−５ｐおよびｍｉＲ−１７−３ｐと表示される。
本発明に従い、ｉｎ ｖｉｖｏ組織内ＲＮＡｉ活性を提供する方法および組成物を開示する。本発明の組成物は、担体またはプロドラッグ設計を必要とせず対象にビヒクルまたは生理緩衝液内一本鎖オリゴとして送達することができ、最終的に多種多様の組織タイプにおいて意図された標的（１つまたは複数）を抑制可能である。驚くべきことに、本発明者は、投与に耐えさせる特徴を有し、相手鎖（１つまたは複数）と組み合わさって、意図されたアンチセンスオリゴのＲＩＳＣ内への効率的積み込みに至り、最小限の標的外効果を有する意図された確固たるサイレンシング活性を産生する二本鎖を形成する多種多様の組織において生体利用可能になる個々のオリゴ鎖を設計した。
本発明の組成物タイプは、（１）個々の遺伝子もしくは少数の遺伝子発現をＡＧＯ２ベース切断機序によって阻害する方法；（２）特定のｍｉＲＮＡ発現を阻害する方法；ならびに（３）新規シード配列を有するｍｉＲＮＡ様化合物生成の特定の内因性ｍｉＲＮＡ作用の部分的模倣を介してｍｉＲＮＡ様機能を提供する方法を含む３つの基本的な群に収まる。これら全３タイプの化合物は、連鎖ＲＮＡｉ（ｓｅｑＲＮＡｉ）と広く定義される。それらは、ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲおよびｓｅｑＭｉＲという用語によってそれぞれ個別に区別される。これら３タイプの活性、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲをそれぞれ有する一本鎖化合物も提供する。
例示的なｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲ、ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲ化合物は図８、１０、１２、１４、１６、２０〜２３および２６〜６７；図６８〜８１；図２、９、１１、１３、１５、１７、８６〜９７；ならびに図２、１８および１９にそれぞれ示す薬剤に基づく。例示的な方法は、遺伝子標的、ｍｉＲＮＡ標的を発現する、もしくはｍｉＲＮＡ欠損の細胞を、有効量の適切なｓｅｑＲＮＡｉ化合物と接触することを伴い、ｓｅｑＲＮＡｉは標的発現を阻害する上でまたはｍｉＲＮＡ活性を増強する上で効果的である。ｓｅｑＲＮＡｉは、本明細書において提供される特性を有する一本鎖または二本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはキメラオリゴを含むことができるが、これらに限定されない。
特に好ましい実施形態では、２工程投与方法について開示する。例示的な方法は、第１オリゴ鎖を対象へ投与し、適切な期間待機後に第２オリゴ鎖を前記対象へ投与することであり、前記第１鎖および第２鎖は、下記：（１）標的遺伝子ｍＲＮＡもしくは少数のｍＲＮＡ分解を触媒するかもしくは前記ｍＲＮＡ（１つまたは複数）翻訳を阻害すること；（２）特定のｍｉＲＮＡもしくは少数のｍｉＲＮＡ分解を触媒すること；または（３）ｍｉＲＮＡ活性を提供すること、の１つを達成する上で効果的であるｉｎ ｖｉｖｏ細胞内で細胞内二本鎖を形成する。オリゴ鎖は、担体またはプロドラッグ設計なしでビヒクルで投与することができるが、特定の組織タイプを標的とする等の特別な目的のために担体を使用し得る。
鎖修飾の鍵。 新規シード配列を有するｓｅｑＭｉＲ化合物設計の例証。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｉＲＮＡ化合物を含む非修飾鎖。 ヒト／マウスｌｅｔ−７ｉを含む非修飾鎖。 ウォッブル塩基対および不適合を除去したヒト／マウスｌｅｔ−７ｉを含む鎖。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計用の鎖に対するヌクレアーゼ耐性および本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則の適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計用の鎖に対するヌクレアーゼ耐性および本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則の適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計における好ましい工程を例証するヌクレアーゼ耐性鎖に対する熱力学規則の適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計における好ましい工程を例証するヌクレアーゼ耐性鎖に対する熱力学規則の適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計における工程を例証する鎖に対する基準アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計における工程を例証する鎖に対する基準アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計における工程を例証する鎖に対する非対称アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計における工程を例証する鎖に対する非対称アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計における工程を例証する基準アーキテクチャ鎖に対する分枝変異型アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計における工程を例証する基準アーキテクチャ鎖に対する分枝変異型アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ分子設計における工程を例証する小内的セグメント化アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｅｑＭｉＲ分子設計における工程を例証する小内的セグメント化アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 マウスＰＴＥＮ指向性のｓｓ−ｓｉＲＮＡ設計における工程を例証するアンチセンス鎖に対するｓｓ−ＲＮＡｉアーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ヒト／マウスＬｅｔ−７ｉに基づくｓｓ−ＭｉＲ設計における工程を例証するアンチセンス鎖に対するｓｓ−ＲＮＡｉアーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応。 ＲＮＡｉ活性の連続導入用マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ活性の連続導入用ヒト／マウスＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ活性の連続導入用マウスＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ活性の連続導入用マウスＳｔａｔ３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ボラノホスファート連結。 天然リボースを有するボラノホスファートモノマー。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＦａｓ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウス／ラット／非ヒト霊長類ＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウス／ラット／非ヒト霊長類ＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウス／ラット／非ヒト霊長類ＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＴＰ−１ｂ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／非ヒト霊長類ＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用マウスＰＴＥＮ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスＰＣＳＫ９指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用マウスＰＴＰ−１ｂ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスＰＴＰ−１ｂ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトｐ５３指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒト／マウスアポＢ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 ＲＮＡｉ連続導入用ヒトＰＴＰ−１ｂ指向性のｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−２４に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−２４に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−２９ａに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−２９ａに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−２９ｂに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−２９ｂに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−２９ｃに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−２９ｃに基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−３３に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−３３に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−１２２に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−１２２に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用マウスｍｉＲ−１５５に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 活動を阻害するための連続投与用ヒトｍｉＲ−１５５に基づくｓｅｑＩＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−２４に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−２４に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−２６ａに基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−２６ａに基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−２９に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−２９に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−１２２に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−１２２に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−１４６ａに基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−１４６ａに基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−２０３に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−２０３に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−２１４に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−２１４に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用マウスｍｉＲ−４９９に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。 本明細書に記載の連続投与方法における使用用ヒトｍｉＲ−４９９に基づくｓｅｑＭｉＲ化合物。
Ａ．先行技術の概要
現在、当該技術分野において、ｓｉＲＮＡベース化合物およびｍｉＲＮＡ模倣の広範の適応は、薬剤として、異なる細胞タイプのための異なる設計に関与する可能性が高い現在存在しない担体の開発が必要であるとみなされている。既存の担体は制限されるが、患者中を含む肝臓内で著しい値でｓｉＲＮＡ活性を得る上で有用な成功が主に示されている。一般に、従来のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣を薬剤プラットフォームとして確立する必要がある担体は、複合体構造となり、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ二本鎖を包括すると考えられている。担体の必要性の例外として潜在的組織は腎臓の近位細管細胞であり得る。
担体は、（１）細胞による取り込み不良；（２）ヌクレアーゼによる破壊；および（３）体内からのインタクト二本鎖の急速なクリアランス、を含む、裸体ｓｉＲＮＡを対象に注入時に生じることに基づき複数の理由から必要であると考えられる。さらに、一般的薬剤使用用に開発されている担体は、毒性、製剤の困難性、短い貯蔵半減期、大きなサイズ（ｓｉＲＮＡ／担体またはｍｉＲＮＡ／担体複合体は＞１００ｎＭサイズであるが、毛管核は、５〜６０ｎＭの範囲と推定される）が挙げられるが、これらに限定されない種々の関連問題を有する。さらに、多くの担体に関与する公開試験には共通の欠点があり、確実な結論を導くことが困難となっている；例えば、適切な用量反応曲線、特に、ｓｉＲＮＡ−対照／担体に対する試験ｓｉＲＮＡ／担体の比較を含むものは一般に見られない。
それゆえ、ｉｎ ｖｉｖｏ組織内広範のＲＮＡｉ依存性活性に至る新規アプローチの差し迫った必要性がある。本発明の背景の基本的な概念は、適切に設計されている相補性センス鎖およびアンチセンス鎖薬剤は、担体またはプロドラッグなしで対象に連続投与することができ、組み合わせて、広範囲の細胞タイプにおいてＲＮＡｉ活性を産生可能な二本鎖を形成することができる。したがって、１つの好ましい実施形態では、本発明の化合物は、（細胞取り込みを促進する）担体の不在下で投与することもできるが、ビヒクルまたは生理緩衝液（生理食塩水等）で送達される。したがって、本発明は、十分な固有のヌクレアーゼ安定性を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を、それらを個別にｉｎ ｖｉｖｏ連続投与することができ、多数の組織内でＲＮＡｉ活性産生を誘発するように生成する手段を提供する。この一般的アプローチは、ｓｅｑＲＮＡｉと称されている。
ｍｉＲＮＡ模倣分野において、所望されるｍＲＮＡタイプの抑制を避け、ｍＲＮＡタイプ発現を阻害する化合物の理論的設計の差し迫った必要性も、そのようにする商業的または医学的興味がある場に存在する。これは、目標が特定の内因性ｍｉＲＮＡを非常に模倣することであった場合に固有の問題である。（例えば、特定の市販目標により適合するように選択された）ｍＲＮＡ標的タイプ範囲が制限されるｍｉＲＮＡ様化合物を使用して、この問題を改善することができる。本発明のｓｅｑＭｉＲは、特に新規シード配列の使用およびそのｍＲＮＡ標的のシード配列親和性の操作を介してこの問題を改善するように設計することができる。
Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３１６： ６８０， ２００４）は、培養内で増殖させた細胞上の化学的修飾していない従来のｓｉＲＮＡ二本鎖を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖のトランスフェクションによる一本鎖の連続投与効果を研究した。彼らは、これらの条件下において細胞内でサイレンシングに基づくＲＮＡｉを引き起こすかかるアプローチ能力を示した。著者らは、一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）「は二本鎖ｓｉＲＮＡより再構成するＲＩＳＣの効果が顕著に低い」ことを観察した。これにより、彼らは次の考えを試験した：「（短い持続を意味する）細胞持続は、二本鎖ｓｉＲＮＡより効果が低いｓｓ−ｓｉＲＮＡの主な理由ではない可能性がある」。代わりに、二本鎖構造自体がＲＩＳＣ積み込みを促進し得る。彼らは、標的遺伝子を発現する細胞系内にウミシイタケルシフェラーゼまたは１つの標的ヒトＣＤ４６指向性の従来のｓｉＲＮＡの相補鎖を連続投与することによってこの概念を試験した。これらの治験担当医は、個々の鎖のｉｎ ｖｉｖｏ連続投与も二本鎖投与より取り込みを改善する連続鎖投与を使用する概念も開示しなかった。
ＷＯ２００９／１５２５００号は、短いおよび／または非基準ｓｉＲＮＡトリガーの使用に主に関与しており、データは、標準２１−ｍｅｒより短いものは実質的な活性を有することを示すために提供されている。該出願は、従来のｓｉＲＮＡを構成する２本の鎖は細胞に連続投与することができ、結果、親ｓｉＲＮＡ二本鎖のサイレンシングに基づくＲＮＡｉ効果は、細胞内に複製されることも主張している。このようにするために提供される本文の理論的根拠は、次のとおりである：「インターフェロン経路は、二本鎖核酸に曝露した細胞によって引き起こされるため、かかる薬剤を使用する先のＲＮＡｉ／遺伝子サイレンシングアプローチは同時に生じるこの経路の活性化を除外できなかった」。したがって、発明者らは、インターフェロン反応不在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で遺伝子サイレンシングを行う組成物と方法を提供することを請求している。鎖の連続投与はｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ取り込み問題を解決することができるという概念も本発明のこの実施形態における使用のための特異的な化合物も考慮されなかった。
細胞内の特異的なｍＲＮＡ標的に対してＲＮＡｉ依存性活性を達成する相補性センス鎖およびアンチセンス鎖の連続投与は、従来のｓｉＲＮＡ二本鎖をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ細胞に連続または共投与する実践と明確に区別可能である。薬剤に関して、一般に、複数の従来のｓｉＲＮＡ二本鎖を連続または同時形態のいずれかで動物または個体に投与する複数の理論的根拠がある。これらの理由としては、例えば、所定時点で所定標的をより深く抑制して経時的に所定標的に対する効果を伸ばし、連続してまたは同時に複数の標的を阻害することによって特定の商業目的を達すること、または意図された効果を無効にする標的遺伝子中の変異が生じる選択圧を低減することが所望されることが挙げられる。
米国特許第２００９／０１５６５２９号は、確立されたＲＮＡｉタイプの連続投与について開示している。当願において、「用語「共投与」とは、対象に２つ以上の試薬、特に２つ以上のｓｉＲＮＡ薬剤を投与することを指す。薬剤は、単一医薬組成物に含んで対象に同時投与することも、別々の製剤に含んで連続投与することもできる。２つの薬剤が対象内に同時に検出できる限り、２つの薬剤は共投与されると称される」。したがって、該発明者らは、当該技術分野において確立されていないが、明確にＲＮＡｉ依存性サイレンシング活性誘発剤を意味する用語「ｉＲＮＡ薬剤」（「干渉ＲＮＡ薬剤」の略語）の連続投与を提供している。実際、該発明者らは、ｉＲＮＡ薬剤を次のとおり定義した：「本明細書で使用するｉＲＮＡ薬剤は、標的遺伝子、例えばＥＮａＣ遺伝子ＳＣＮＮ１Ａ…の発現を下方制御することができるＲＮＡ薬剤である。ｉＲＮＡ薬剤は、当該技術分野においてＲＮＡｉ、または前転写もしくは前翻訳機序と称する場合がある転写後の標的ｍＲＮＡ切断を含むいくつかの機序の１つもしくは複数によって作用し得る」。したがって、ｉＲＮＡ薬剤という用語は、標的遺伝子の発現を下方制御することができる実体でなければならず、かかる薬剤の経時的連続共投与は、そのように共投与した薬剤が対象中に同時に存在する場合に行い得る。
ｓｉＲＮＡベースまたはｍｉＲＮＡ模倣薬剤開発プラットフォームを生成する試みに関連して、治験担当医らは、従来のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣を対象に送達する二本鎖を包括する複合体担体の開発に取り組んでいる。これらの化合物の二本鎖の性質は、存在する場合、化合物に起因する様々な所望される薬剤を促進するために、ヌクレアーゼ安定度を提供し、順に鎖に対する特定の化学修飾の選択に影響する。二本鎖構造は、パラメーター（細胞質と核間の相対的分布および電荷／電荷ベース上タンパク質の一般的粘性等）に関して化合物の細胞内分布上で有する重要性も有する。さらに、担体自体が追加のヌクレアーゼ耐性を誘発し、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞内で生体利用可能になる二本鎖の続く経路の詳細決定に対して主な影響を有する。したがって、従来のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣の所望される薬剤起因を促進するように開発されているアプローチは、複合体担体手段によって二本鎖として投与するこれらの薬剤の文脈において達成されている。
どの化学修飾を使用し、それらを鎖内のどこに置くかに関する問題は、従来のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣を含む鎖よりｓｅｑＲＮＡｉにおいて必然的に実質的に大きい。ｓｅｑＲＮＡｉのより大きな困難の基本は、次の事実である：（１）ｓｅｑＲＮＡｉ鎖は、従来のｓｉＲＮＡ二本鎖を構成する鎖よりヌクレアーゼ耐性の必要性が実質的に高い。結果、それらは、必然的に従来のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣より大量に修飾される；ならびに（２）一本鎖ヌクレアーゼ耐性を達成するために適応可能な本質的にすべての化学修飾タイプは、意図されたＲＮＡｉ依存性サイレンシング活性を実質的に阻害もしくは除去可能であることが知られている。これらのいくつかは従来のｓｉＲＮＡ活性と適合するが、それらは鎖内の適切な位置で対で使用されなければならない。これは、担体によって提供される二本鎖構造およびヌクレアーゼ保護のために可能である。したがって、ｓｅｑＲＮＡｉの使用におけるこれらの要因の欠如は新しい課題を示す。
本発明は、意図された標的に対するサイレンシング活性に過度に有害な影響を及ぼさないｉｎ ｖｉｖｏ細胞内で生体利用可能な二本鎖になるために十分に長く生存する各鎖の十分な固有のヌクレアーゼ耐性を提供することによってこれを達成する手段を提供する。これは、ＲＩＳＣによってｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成するセンス鎖の効率的除去手段の提供を含む。複数のｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖アーキテクチャも本出願における開示によって可能である。本明細書において提供されるアルゴリズムは驚くべきことに、これらの対象物を実験を取り消さず達成させ、任意のｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ標的に対してｓｅｑＲＮＡｉ活性を有する化合物ならびにｍｉＲＮＡ様特性を有する化合物の理論的設計を提供する。本発明のｍｉＲＮＡ模倣は２つの広範カテゴリー：（１）内因性ｍｉＲＮＡ化合物のシード配列に基づくもの；ならびに（２）新規シード配列に基づくもの、に収まる。したがって、この文脈において、用語「ｍｉＲＮＡ模倣」とは、任意の所定の内因性ｍｉＲＮＡ活性を正確に模倣する試みを必然的に示唆せずにｍｉＲＮＡ様活性を提供する化合物に使用される。本発明のｍｉＲＮＡ模倣は、種々の有用商業的または医学的必要性が満たされるように調節できる広範囲のｍｉＲＮＡ活性を提供する薬剤として役立つように設計される。
本発明のｓｅｑＲＮＡｉ設計は、担体またはプロドラッグ設計なしでビヒクルでの一本鎖ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために構成する。これは、多くの細胞タイプにおけるＲＮＡｉ活性に至る。これは頻繁に所望されるが、細胞標的特徴を有する担体の使用によって他のものを排除して、いくつかの細胞または組織タイプにｓｅｑＲＮＡｉ鎖を指向させる能力を有することもまた重要である。ｓｅｑＲＮＡｉ鎖は、小さなサイズおよび固有のヌクレアーゼ耐性のため、担体を用いた使用に従来のｓｉＲＮＡまたは従来のｍｉＲＮＡ模倣よりはるかに適している。それゆえ、担体は、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖に簡単にコンジュゲートすることができ、鎖を包む必要がないために比較的小さく単純であり得る。特定の組織に対してオリゴを標的可能なかかる比較的単純な担体は、当該技術分野において周知である。
選択アンチセンスｓｅｑＲＮＡｉ鎖もｓｓ−ｓｉＲＮＡまたはｓｓ−ｍｉＲＮＡとして使用することができる。ある修飾は、この活性を促進することができる。典型的には、活性は、相補性センス鎖（１つまたは複数）の連続投与により到達できるものより少ないが、一部の市販適応において、単回投与の平易さはセンス鎖が提供することができる増大した効力に勝る。これは、非常に急速な抑制効果が所望される状態を含む。
それは続いて、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖において、従来のｓｉＲＮＡ内鎖より大きな値の化学修飾を必要とし、従来のｍｉＲＮＡは潜在的競合目的が調和するように高度に組織化さればならない。本発明は驚くべきことに、実験を取り消さず対象中複数の細胞／組織タイプ内で選択標的に対して実質的なＲＮＡｉ依存性活性を広く達成する手段を提供する。ｓｅｑＲＮＡｉアンチセンス設計に基づきｓｅｑＲＮＡｉセットまたはｓｓ−ＲＮＡｉにより生成するＲＮＡｉ依存性活性は、ｓｉＲＮＡ様またはｍｉＲＮＡ様形態のいずれかに発現することができる。
Ｂ．定義
以下の定義および用語は、本発明の理解を促すために提供する。
「２’−フルオロ」とは、フッ素がリボース内ヒドロキシルと同一の立体化学配向であるヌクレオシド修飾を指す。フッ素が対向配向である例において、関連ヌクレオシドはＦＡＮＡまたは２’−デオキシ−２’フルオロ−アラビノ核酸と称する。
「３’補足または３’補整部位」とは、標的配列に相補性であり、特にシード配列と標的の適合が弱い場合に標的選択に関与する、シード配列部分のｍｉＲＮＡアンチセンス鎖下流部位を指す。
３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域の略語である。
「５’から３’方向のｍＲＮＡ分解経路」とは、デアデニレースによるポリ（Ａ）尾の除去によって開始するｍＲＮＡ分解のための天然経路を指す。これには、５’−キャップの除去、次いで残りのｍＲＮＡの５’から３’方向の分解が続く。
「アンチセンスオリゴまたは鎖」とは、センスオリゴ、前ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡに相補性のオリゴであり、これは、相補塩基対手段によってかかる核酸に結合する。アンチセンスオリゴは、標的中の全ヌクレオシドとの塩基対を必要としない。本明細書において別段の指定のない限り、必要であることは、サブマイクロモルオリゴ濃度の生理食塩条件下でＴｍ４０℃以上を提供するために十分な結合があることのみである。
「アルゴリズム」とは、ｓｅｑＲＮＡｉセットまたは対の生成における使用のためオリゴ鎖を設計するために使用される規則セットを指す。
「アンチセンス鎖ビヒクル」とは、特定のシード配列をｓｓ−ＭｉＲ化合物の設計開始点として挿入することができるアンチセンス鎖構造について記載するために使用される。これらのビヒクルは、標的外効果を最小限に抑え、効率的ＲＩＳＣ積み込みを促進するために設計および／または選択される。
「アーキテクチャ」とは、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖セットが相補塩基対をなした後に形成されたｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の可能なアーキテクチャ配置の１つを指すか、または、かかるアーキテクチャ群を指す。
「非対称規則」とは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖内の特定の鎖の可能性がアンチセンス鎖としてＲＩＳＣにより選択される天然機序を指す。従来のｓｉＲＮＡ化合物の設計に適用されており、ｓｅｑＲＮＡｉ化合物に適用することができる。簡単に述べると、４つの末端二本鎖ヌクレオシドの二本鎖の片端を二本鎖の対応ヌクレオシドの他端と比較した相対的Ｔｍは、各鎖がＲＩＳＣ内アンチセンス鎖として機能する相対度決定において重要な役割を果たす。鎖間Ｔｍの低い二本鎖末端に関与する５’末端を有する鎖は、アンチセンス鎖としてＲＩＳＣ内に積み込まれる可能性が高い。しかしながら、ほとんどの末端は、連続的ヌクレオシドにおいて最も重要であり、最も著しい末端４二本鎖ヌクレオシドにおいて進行的に重要度が低下するため、Ｔｍ効果は二本鎖末端ヌクレオシドに渡り均等に分配されていない。
「骨格」とは、正常な塩基またはそれらの置換が骨格付加物として生じるのに対し、交互のリンカー／糖またはオリゴの糖置換構造を指す。
「隆起構造または隆起」とは、一本鎖における複数の内連続的ヌクレオシドが、これらのヌクレオシドからなる二本鎖内隆起形成に至る形で相手鎖との塩基対を損なうｍｉＲＮＡ二本鎖またはｓｅｑＭｉＲベース二本鎖内領域を指す。隆起構造は、相手鎖との塩基対を損なうヌクレオシドが、両鎖内対向ヌクレオシドが塩基対のできない場合に生じる一本鎖および内ループ内のみである場合に生じる隆起ループを含む。
「アンチセンス鎖の中央領域」とは、全介在連結を含むこれらの各側の隣接３つのヌクレオシドと共に５’末端から９および１０位ヌクレオシドと規定される。
「化学修飾」とは、用語が、かかる化合物内および対応する天然ＲＮＡおよびＤＮＡ（Ｕ、Ｔ、Ａ、ＣおよびＧ塩基、リボースまたはデオキシリボース糖およびリン酸ジエステル連結）の標準天然成分に出現するものの間の任意の化学的相違を指す、従来のアンチセンスオリゴ、従来のｓｉＲＮＡ、従来のｍｉＲＮＡまたはｓｅｑＲＮＡｉ（ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＭｉＲ、またはｓｅｑＩＭｉＲ）として使用されるオリゴに適用される。製造中、この化学修飾タイプは、文字通り、天然ＤＮＡまたはＲＮＡ成分に行われる必要はない。この用語には、オーバーハング前駆体単位として使用することができる任意のヌクレオシド置換も包含される。
「キメラオリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオシドならびに２’−デオキシリボヌクレオシドを含むものである。
「化合物」とは、従来のｓｉＲＮＡ、従来のｍｉＲＮＡ、ならびに相補塩基対によって互いに形成することができるｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖に加えて特定のｓｅｑＲＮＡｉセットを構成するセンス、アンチセンス鎖を含む物質の組成物を指す。
「従来のアンチセンスオリゴ」とは、以下の機序の１つにより標的遺伝子の発現を阻害する一本鎖オリゴである：（１）立体障害−例えば、アンチセンスオリゴは、これらの工程の１つに直接干渉することによって、遺伝子発現および／もしくはコードしたタンパク質の産生に関与する一連の事象における一部の工程に干渉する。かかる工程は、遺伝子転写、前ｍＲＮＡスプライシングおよびｍＲＮＡ翻訳を含むことができる；（２）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素的消化の導入；（３）ＲＮａｓｅ Ｌによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素的消化の導入；（４）ＲＮａｓｅ Ｐによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素的消化の導入：（５）二本鎖ＲＮａｓｅによる標的遺伝子のＲＮＡ転写物の酵素的消化の導入；ならびに（６）同一アンチセンスオリゴ中併合立体的障害および酵素消化活性の導入。
「従来のｍｉＲＮＡ」とは、オリゴ二本鎖として細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与される化合物であり、用語は、一本鎖ｍｉＲＮＡ（ｓｓ−ｍｉＲＮＡ）として送達される−すなわちアンチセンス鎖がセンス鎖なしで投与されて実質的なＲＮＡｉサイレンシング効果を生成する異常な場合を除外する。従来のｍｉＲＮＡ投与はほぼ常に担体の使用（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）または活性形態で細胞内に化合物を得る流体送達（ｉｎ ｖｉｖｏ）等の他の手段を必要とする。
「従来のｓｉＲＮＡ」とは、オリゴ二本鎖として細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与される化合物であり、用語は、一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）として送達される−すなわちアンチセンス鎖がセンス鎖なしで投与されて実質的なＲＮＡｉサイレンシング効果を生成する異常な場合を除外する。従来のｓｉＲＮＡ投与はほぼ常に担体の使用（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）または活性形態で細胞内に化合物を得る流体送達（ｉｎ ｖｉｖｏ）等の他の手段を必要とする。
「二本鎖ビヒクル」とは、特定のシード配列およびそれらのセンス鎖相補体をｓｅｑＭｉＲ化合物の設計開始点として挿入することができるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖について記載するために使用される。これらのビヒクルは、標的外効果を最小限に抑え、効率的ＲＩＳＣ積み込みおよび意図されたアンチセンス鎖の保持を促進するために設計および／または選択される。
「エクソソーム」とは、分子種（ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ等）をある細胞から別の細胞へ輸送するエンドソーム由来小胞である。それらは起点細胞を反映する特定の組成を有し、典型的にはこれは、特定の細胞にペイロードを向かわせる。いったんこれら二次細胞がｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを取り込むと、それらはＲＮＡｉ機能を実行する。
「ＦＡＮＡ」とは、フッ素がリボース内ヒドロキシルと対向した立体化学配向であるヌクレオシド修飾を指す。これは、２’−デオキシ−２’フルオロ−アラビノ核酸とも称し得る。
「遺伝子標的」または「標的遺伝子」とは、その発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーによって標的とされる遺伝子のＤＮＡ配列またはそのＲＮＡ転写物（プロセス化したかまたはプロセス化していない）のいずれかを指す。
「ガイド鎖」とは、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ化合物の文脈において、アンチセンス鎖と同義的に使用される。
本明細書で使用し、当該技術分野において知られている「同一性」とは、２つ以上のオリゴ配列間の関係であり、配列比較によって決定される。同一性はまた、かかる配列ストリング間適合によって決定されるようにオリゴ配列間の配列関連度を意味する。同一性は、容易に算出することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）、およびＢｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）を参照されたい、いずれも、参照することによって本明細書に組み込まれる）。２つのポリヌクレオチド配列間で同一性を測定するいくつもの方法が利用可能であるが、用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖｍ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）を参照されたい）。方法は、一般に、オリゴ配列間の同一性を決定するために使用され、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， Ｓｉａｍ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． （１９８８） ４８：１０７３に開示のものが挙げられる。
「内連結部位」とは、オリゴ鎖５’または３’末端ではない連結部位を指す。これらの部位は、相手鎖と二本鎖形成時、潜在的に一本鎖エンドヌクレアーゼ攻撃および二本鎖エンドヌクレアーゼ攻撃を対象とする。かかる部位は、簡潔に連結部位とも称し得る。
ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣは、誘導多能性幹細胞の略語である。これらは、実験的操作により体細胞から作製される（誘導される）。かかる操作は、典型的には、体細胞内のある遺伝子発現の修飾（増大または低下）を引き起こすように発現ベクターの使用に関与している。「多能性」とは、かかる幹細胞はいくつもの可能である分化プログラムの１つに関与した娘細胞を産生することができるという事実を指す。
「連結部位」とは、連続的５’および３’ヌクレオシドまたはヌクレオシド置換の連結および同一性の性質によって定義されるオリゴ中の特定の連結部位または連結部位タイプを指す。連結部位は、「Ｘ−Ｙ」と表示され、式中、ＸおよびＹはそれぞれ正常な塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）の１つを有するヌクレオシドまたはヌクレオシド置換を示し、ダッシュ記号はそれらの間の連結を示す。
「不適合」とは、効果が対向ヌクレオシド塩基の相反設定によって鎖間または鎖内二本鎖形成を中和する、第２核酸内ヌクレオシドまたは同一オリゴ中の別のヌクレオシドとの相補塩基対をなさないオリゴ中のヌクレオシドを指す。
「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、片鎖をＲＩＳＣ内に積み込んだ後に遺伝子をコードするタンパク質の転写後抑制を典型的に引き起こす天然ｄｓＲＮＡ分類である。このアンチセンス鎖は、成熟ｍｉＲＮＡと称し得る。それは、ＲＩＳＣを成熟ｍｉＲＮＡのシード領域によって認識される特異的なｍＲＮＡ標的へと向かわせる。最も一般的に、シード配列は、複数の遺伝子から転写したｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内で完全な適合した配列を認識する。
「マイクロＲＮＡ模倣またはｍｉＲＮＡ模倣」とは、細胞に投与時に、特定の遺伝子セット発現における調節を産生するために天然ｍｉＲＮＡ活性を行うことに関与する細胞機序を使用する製造される化合物の分類である。本発明のマイクロＲＮＡ模倣は、特定の天然ｍｉＲＮＡによって調節した同一遺伝子の一部もしくはすべてを調節するように設計することも新規シード配列使用によって遺伝子セット発現を調節するように設計することもできる。本発明のｍｉＲＮＡ模倣は、１本鎖に関与するか２本鎖に関与するかに応じて、ｓｅｑＭｉＲまたはｓｓ−ＭｉＲと称する。
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」または「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」とは、特定のプロセス発現速度の変更、特定のプロセス阻害、特定のプロセス逆行、および／または特定のプロセス開始予防を指す。したがって、特定のプロセスが腫瘍増殖または転移である場合、用語「調節」とは、腫瘍増殖および／もしくは転移発現速度低減；腫瘍増殖および／もしくは転移阻害；腫瘍増殖および／もしくは転移逆行（腫瘍縮小および／または根絶等）ならびに／または腫瘍増殖および／もしくは転移予防を含むが、これらに限定されない。
「天然ＲＮＡ」とは、天然ＲＮＡ（すなわち、正常なＣ、Ｇ、ＵおよびＡ塩基、リボース糖およびリン酸ジエステル連結を有するＲＮＡ）である。
「ヌクレオシド」とは、本明細書において提供されるヌクレオシドアナログを含むものと解釈されるべきである。かかるアナログは、糖もしくは塩基または両方のいずれかで修飾できる。さらに、特定の実施形態では、オリゴ配列内ヌクレオチドまたはヌクレオシド脱塩基であり得る。ＲＮＡｉトリガー内オーバーハング前駆体およびオーバーハングにおいて、各ヌクレオシドおよびその５’連結は単位と称し得る。
「ヌクレオシド代替物」とは、ｓｅｑＲＮＡｉベースｓｉＲＮＡ二本鎖の３’末端オーバーハング前駆体またはオーバーハング内で発現し得る芳香族構造等の根本的に異なる化学的物質を有するが、典型的にはヌクレオシドによって取り込まれる少なくとも１つの役割を果たす構造を指す。３’末端オーバーハング前駆体に適用される規則の範囲は、相手鎖（１つまたは複数）と二本鎖を形成するｓｅｑＲＮＡｉ鎖の領域で発現する構造に適用される規則より広範であるものと理解されるべきである。オーバーハング前駆体およびオーバーハングにおいて、各ヌクレオシド置換およびその５’連結は単位と称し得る。
「オリゴ（１つまたは複数）」とは、オリゴヌクレオチド（１つまたは複数）の略語である。
「オーバーハング」とは、従来のｓｉＲＮＡおよび従来のｍｉＲＮＡの文脈において、これらの鎖によって形成された二本鎖を超えて伸びる、ヌクレオシドまたはヌクレオシド置換単位からなるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の任意の一部を指す。
「オーバーハング前駆体」とは、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖の存在する場合、相手のｓｅｑＲＮＡｉ鎖と組み合わせてｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時にオーバーハングを形成する一部を指す。用語はまた、意図された標的と相補塩基対をなさず、その鎖がｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖と二本鎖を形成するのであればオーバーハングを形成する鎖の３’末端に１つまたは複数の単位がある場合の、ｓｅｑＲＮＡｉアンチセンス設計に基づくｓｓ−ＲＮＡｉにも適用する。
「パッセンジャー鎖」とは、ｄｓＲＮＡ ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ化合物またはそれらの成分の文脈において「センス鎖」と同義的に使用される。これは、相手のガイド鎖またはアンチセンス鎖と複合体を形成してこれらの化合物の１つを形成する。
「医薬組成物」とは、薬理学的有効量の一本鎖もしくは二本鎖オリゴ（１つまたは複数）、任意に他剤（１つまたは複数）、ならびに医薬上許容担体を含む実体を指す。
「薬理学的有効量」、「治療的有効量」または単に「有効量」とは、商業的に実行可能な薬理的、治療的、予防的または他の市販結果を産生する上で効果的な薬剤量を指す。
「医薬上許容担体」とは、治療薬投与用の担体または希釈液を指す。治療的使用用の医薬上許容担体は、医薬分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄｉｔｏｒ）， １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｏｒ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （ｅｄｉｔｏｒ）， ２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００５， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（これらは、本明細書において参照することによって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
「プロドラッグ」とは、不活性であるが、典型的に代謝プロセスを介して化学修飾を施した後に体内で活性となる形態で投与される化合物を指す。ＲＮＡｉ依存性化合物の文脈において、プロドラッグ設計は、かかる化合物をヌクレアーゼから保護するおよび／またはそれらの細胞による取り込みを促進する手段として提案されている。プロドラッグに関して、一般に任意のＲＮＡｉ依存性プロドラッグは、ＲＩＳＣ積み込みおよび意図された標的（１つまたは複数）のサイレンシングを誘導するプロセシングが可能な化合物を産生する体内修飾を施さなければならない。アンチセンス鎖５’末端リン酸化なしのＲＮＡｉ依存性化合物投与は、プロドラッグ投与を構成するとはみなされない。
「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ媒介性干渉またはＲＮＡ干渉の略語である。これは、ＲＮＡｉトリガーを生成し、それらを使用してサイレンシング活性を行う細胞機序系を指す。複数のＲＮＡｉ活性タイプが認識されており、２つの最も顕著なものがｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡである。ほぼ常にこれらの活性に関連するＲＮＡｉトリガーは二本鎖ＲＮＡオリゴであり、最も一般的に２０〜２３−ｍｅｒサイズ範囲である。ＲＮＡｉ機序の共通の特徴は、これら二本鎖分子の１つをＲＩＳＣに積み込み、続いてセンスもしくはパッセンジャー鎖を捨て去り、アンチセンスもしくはガイド鎖を、サイレンシングすべき標的（１つまたは複数）にＲＩＳＣを向かわせるべく保ちおよび用いる。
「ＲＮＡｉ依存性」とは、遺伝子発現をサイレンスするためのＲＮＡｉベース機序の使用を指す。この機序を使用する化合物としては、従来のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ダイサー基質、ｍｉＲＮＡおよび３つのタイプのｓｅｑＲＮＡｉ（ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＭｉＲおよびｓｅｑＩＭｉＲ）ならびにｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲが挙げられる。
「ＲＮＡｉトリガー」とは、ＲＩＳＣ内に積み込む最も一般的に２０〜２３−ｍｅｒサイズ範囲である二本鎖ＲＮＡ化合物を指し、ＲＮＡｉ活性を指向とするために使用される標的実体（ガイド鎖またはアンチセンス鎖）を提供する。
「シード配列またはシード領域」とは、従来のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは従来のものではないｓｅｑＲＮＡｉもしくはｓｓ−ＲＮＡｉの事実上アンチセンス鎖５’末端から数えて２〜８位（または２〜７位）ヌクレオシドを含む。
「シード二本鎖」とは、事実上アンチセンス鎖であるシード配列とｍＲＮＡ３’ＵＴＲ内のその補体間で形成された二本鎖を指す。
「センスオリゴまたは鎖」とは、特定の遺伝子のアンチセンスオリゴまたはアンチセンス鎖に相補性のオリゴであり、これは、相補塩基対手段によってかかる核酸に結合する。アンチセンスオリゴへの結合時、センスオリゴは、アンチセンスオリゴ中の全ヌクレオシドとの塩基対を必要としない。本明細書において別段既定のない限り、必要であることは、サブマイクロモルオリゴ濃度の生理食塩条件下でＴｍ４０℃以上を提供するために十分な結合があることのみである。
「連続」とは、ｓｅｑＲＮＡｉ化合物投与の文脈において、細胞が相補性センス鎖およびアンチセンス鎖オリゴ対の一本鎖で処置され、この鎖の細胞取り込み後、細胞内取り込みも提供する方法で細胞を他鎖で処置する「２工程投与または方法」を指す。次いで、２本の鎖は細胞内機能的ＲＮＡｉトリガーを形成し、ＲＮＡｉトリガーを含む細胞内の標的遺伝子発現を阻害する。
「ｓｅｑＩＭｉＲ」とは、特定の内因性ｍｉＲＮＡの発現および／または機能を阻害するように設計されたサブタイプのｓｅｑＲＮＡｉ化合物である。
「ｓｅｑＭｉＲ」とは、ｍｉＲＮＡ機能を模倣するように設計されたサブタイプのｓｅｑＲＮＡｉ化合物である。かかる模倣は特定の内因性ｍｉＲＮＡシード配列に基づき得る。特定の内因性ｍｉＲＮＡに基づく場合、ｓｅｑＭｉＲは、典型的には、問題の内因性ｍｉＲＮＡによって阻害された特異的ｍＲＮＡサブセットのみ阻害するように設計される。ｓｅｑＭｉＲは新規シード配列で設計することもでき、したがって、いずれの所定の内因性ｍｉＲＮＡにも基づかない。
「ｓｅｑＲＮＡｉ」とは、二本鎖を構成する個々のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、担体またはプロドラッグ設計なしでｉｎ ｖｉｖｏ連続投与において十分な固有のヌクレアーゼ耐性を有し、同時に広範囲の細胞／組織タイプにおける意図された標的遺伝子（１つまたは複数）に対するＲＮＡｉ依存性サイレンシング効果を生むことができるように十分に修飾されている、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ送達に対する新規アプローチを指す。３つの異なるタイプのｓｅｑＲＮＡｉ（ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＭｉＲ、およびｓｅｑＩＭｉＲ）がある。
「ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖」とは、相補塩基対を介してｓｅｑＲＮＡｉセットまたは対内の鎖が互いに組み合わせる場合に形成された二本鎖を指す。
「ｓｅｑＲＮＡｉセット」または「ｓｅｑＲＮＡｉ対」とは、鎖が、相補塩基対に基づきｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成するために組み合わせることができる２つまたは３つの鎖群を指す。
「ｓｅｑｓｉＲＮＡ」とは、ＲＩＳＣによって遺伝子転写物の直接的切断を促進することにより個々の遺伝子または少数の遺伝子の発現を阻害するｓｅｑＲＮＡｉサブタイプである。標的コードは、主にアンチセンス鎖の中央領域からなる。従来のｓｉＲＮＡ化合物をｓｅｑｓｉＲＮＡ使用に変換することも、オリゴ結合のためのｍＲＮＡ内の接近可能な部位をｓｅｑｓｉＲＮＡ化合物設計用開始点として使用することもできる。
「サイレンシング」とは、ＲＮＡｉ活性の結果として生じる遺伝子発現阻害を指す。一般的に、至適時点で意図された標的の発現を５０％阻害するＲＮＡｉトリガー濃度として表す。
「ｓｓ−ＩＭｉＲ」とは、担体またはプロドラッグ設計なしで、かつ相補性センス鎖投与なしで対象に投与する本明細書において提供される規則に準じて設計されたアンチセンス鎖を指す。化合物を対象細胞内ＲＩＳＣ内に積み込み、続いてＲＩＳＣをサイレンシングのための特異的なｍｉＲＮＡに向かわせることが可能である。
「ｓｓ−ＭｉＲ」とは、担体またはプロドラッグ設計なしで、かつ相補性センス鎖なしで対象に投与可能な、本明細書において提供される規則に準じて設計されたアンチセンス鎖からなる一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣を指す。これは対象細胞内ＲＩＳＣ内に積み込まれ、続いて標的遺伝子発現サイレンシングのための一連の標的を指向とする、例えば、３’ＵＴＲにおける相補性結合配列を含む特定の一連のｍＲＮＡを阻害することが可能である。標的コードは、主にまたは排他的にシード配列によって提供される。
「ｓｓ−ｍｉＲＮＡ」とは、ＲＩＳＣ内に積み込まれ、続いて標的遺伝子発現サイレンシング、例えば、３’ＵＴＲにおける相補性結合配列を含む特定の一連のｍＲＮＡ阻害の標的セット指向とすることができるアンチセンスまたはガイド鎖からなる一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣を指す。標的コードは、排他的にシード配列によって提供されない場合、一次的である。
「ｓｓ−ＲＮＡｉ」とは、ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｓ−ｍｉＲＮＡおよび／またはｓｓ−ＭｉＲおよび／またはｓｓ−ＩＭｉＲ化合物を指す。
「ｓｓ−ｓｉＲＮＡ」とは、担体またはプロドラッグ設計なしで、かつ相補性センス鎖なしで対象に投与する本明細書において提供される規則に準じて設計されたアンチセンス鎖を指す。さらに、化合物は対象細胞内ＲＩＳＣ内に積み込まれ、続いてＲＩＳＣを標的遺伝子発現サイレンシングのための１つまたは最少のｍＲＮＡタイプの転写物（１つまたは複数）指向とすることができる。標的コードは主にまたは排他的に鎖の中央領域からなり、典型的にはＡＧＯ２をこの酵素によって切断するｍＲＮＡ標的（１つまたは複数）指向とする。
「幹細胞」とは、自己再生能を示す体内のまれな細胞タイプを指す。具体的には、幹細胞が分割する場合、得られた娘細胞は特定の分化プログラムを実行するかまたはそれらが親幹細胞の複製を産生する場合に自己再生を実行するかのいずれかである。自己再生を実行することによって、幹細胞は特定の組織または細胞タイプを維持および／または拡大する供給源材料として機能する。
「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物を指す。
「実質的に同一」とは、本明細書で使用する場合、２つの核酸配列間に非常に高い相同度、好ましくは＞９０％の配列同一性があることを意味する。
「合成の」とは、人工的な化学的製造を意味する。
「標的コード」とは、ＲＩＳＣを特異的な標的（１つまたは複数）指向とすることに主にまたは排除的に関与するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｅｑＲＮＡｉ化合物のガイド鎖またはアンチセンス鎖配列のサブセットである連続的ヌクレオシド配列を指す。標的コードは、典型的には、その５’末端と比較してガイド鎖またはアンチセンス鎖内のそれら特定の位置に基づき区別することができる。
「Ｔｍ」または融解温度は、相補性ヌクレオチド配列から分離するオリゴにおいて温度範囲の中間点である。この温度で、５０％らせん状（ハイブリダイズ化）および５０％コイル状（非ハイブリダイズ化）形成が存在する。ＵＶスペクトルを使用してＴｍを測定し、当該技術分野において周知である技術を使用してハイブリダイズ形成および分解（融解）を決定する。最も近い近隣考慮に基づきまたは相対的Ｇ：ＣおよびＵ：Ａ含有に従う非常に短い二本鎖の場合、Ｔｍを推定する利用可能な式もある。本発明の目的において、Ｔｍ測定は生理的ｐＨ（約７．４）および塩濃度（約１５０ｍＭ）に基づく。
「治療」とは、研究および開発目的のため標的遺伝子の発現を１つもしくは複数阻害する目的で、または疾患、疾患症状、もしくは疾患素因を治癒（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）、改変（ａｌｔｅｒ）、改善（ｒｅｍｅｄｙ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）するか、またはそれらに影響を及ぼす目的で、医学的状態、例えば、疾患もしくは障害、疾患症状、または疾患素因保因対象もしくは患者への一本鎖もしくは二本鎖オリゴ（１つまたは複数）または別の薬剤の適応もしくは投与、あるいは対象もしくは患者から単離された組織もしくは細胞系へのオリゴもしくは他剤の適応または投与を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖した組織または細胞または細胞系も、これらの目的のためにかかる化合物によって「処置」し得る。
「単位」とは、それらの５’末端連結とともにオーバーハング前駆体およびオーバーハングに現れるヌクレオシドまたはヌクレオシド置換を指す。ヌクレオシドは、５’末端または３’末端オーバーハングに現れてよいが、ヌクレオシド置換は３’末端オーバーハング前駆体およびオーバーハングにのみ現れることができる。
「非固定核酸」（ＵＮＡ）は、環が２’および３’炭素原子間に結合のないために非環式になるようにリボース糖に対する修飾を有するヌクレオシドを含む新規クラスのオリゴである。用語は、この修飾を有する個々のヌクレオシドに適用することもできる。
「上流」および「下流」とは、ヌクレオチド鎖に沿ったそれぞれ３’から５’方向または５’から３’方向の移動をそれぞれ指す。
「ビヒクル」とは、それを必要としている対象に投与するための活性医薬または化合物を伝達するために使用される治療価値のない物質について言及する。
Ｃ．実施形態
１つの実施形態では、新規相補性センス鎖およびアンチセンス鎖オリゴ化合物は、２工程連続手順で対象に連続投与し、一本鎖は担体またはプロドラッグ設計なしで投与し、ＲＮＡ標的（１つまたは複数）発現細胞によって取り込まれ、続いて担体またはプロドラッグ設計なしで第２相補鎖を投与し、これは同一細胞によって取り込まれ、ＲＮＡｉ依存性機序によって特異的なＲＮＡ標的（１つまたは複数）機能サイレンシングに至る。したがって、個々の鎖は、意図されたＲＮＡ標的（１つまたは複数）に対して商業的に有用なＲＮＡｉ依存性サイレンシング活性を生成させる生体利用可能な方法で十分な量で広範囲の様々なｉｎ ｖｉｖｏ細胞／組織タイプによってインタクトで取り込まれる。原則的に任意のＲＮＡタイプが標的とされ得るが、該当するＲＮＡ標的タイプとしては、例えば、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが挙げられる。
関連実施形態では、上記連続２工程連続投与方法における使用に適するように既知の従来のｓｉＲＮＡ化合物を修飾する方法およびアルゴリズムを提供する。特にこれらの方法およびアルゴリズムは、担体またはプロドラッグ設計なしで対象に連続投与することができ、次の特徴を示す相補性センス鎖およびアンチセンス鎖の作製を提供する：（１）それらの意図された薬剤機能を行うために十分長く実行可能な十分な固有のヌクレアーゼ耐性を示す；（２）それらを生体利用可能にする形態で多くの細胞／組織タイプによって広範囲に取り込まれる；および（３）関連ＲＮＡ標的（１つまたは複数）を発現する細胞／組織内の意図されたＲＮＡｉ依存性サイレンシング活性を産生する。このサイレンシング活性は、相手鎖なしで鎖を投与時に見られる効果と比較して、または本発明に従い修飾されておらず、担体なしで送達される配列同一的な従来のＲＮＡｉ依存性化合物と比較して高まっている。
別の実施形態では、既知の従来のｓｉＲＮＡ化合物ではない相補性センス鎖およびアンチセンス鎖に適用する方法およびアルゴリズムを提供する。これらの同一方法および設計アルゴリズムも特定のｍｉＲＮＡを阻害する新規化合物の生成に適している。このアプローチは、ＲＮＡｉが所望される対象中任意のＲＮＡ標的（１つまたは複数）の阻害剤生成に適用することができる。必要とするものは、標的の一部が相補性センス鎖と共にアンチセンス鎖によって相補塩基対に接近でき、本発明と共に提供するガイダンスに従う構成に適していることである。相補塩基対に接近できる意図されたＲＮＡ標的のそれらの部分を決定する手段は、当該技術分野において周知である。ＲＮＡ標的（１つまたは複数）に対して活性を有する従来のアンチセンスオリゴは、かかる相補塩基対に接近できるＲＮＡ標的上の特定の結合部位（１つまたは複数）の直接証拠を提供する。それは続いて、従来のアンチセンスオリゴは本発明の化合物としても構成できる。この実施形態の好ましいバージョンでは、本発明のアンチセンス鎖化合物は遺伝子標的ｍＲＮＡ転写物内ホットスポット指向であり、ホットスポットは米国特許第７，５１７，６４４号に規定されている。
さらに別の実施形態では、適切に設計されたセンス鎖およびアンチセンス鎖が連続送達方法を使用して、対象中細胞／組織内ｍｉＲＮＡ模倣活性を達成するアルゴリズム、方法および物質の組成物を提供する。このアプローチの１つのバージョンでは、特定の内因性ｍｉＲＮＡは、本発明の方法およびアルゴリズムを対象とする。この変異型では、内因性ｍｉＲＮＡの標的コード配列は、特定の市販目的の化合物のサイレンシングプロファイルを改善するために調節される。
関連実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖が特定の内因性ｍｉＲＮＡに基づかない連続送達方法を使用して、対象中細胞／組織内ｍｉＲＮＡ様活性を達成するアルゴリズム、方法および物質の組成物を提供する。それにも関わらず、これらの化合物は、本明細書においてｍｉＲＮＡ模倣とも称する。これらの化合物の開始点は、サイレンシングの市販興味のための１つまたは複数のｍＲＮＡタイプの３’ＵＴＲを標的とするように選択された新規シード配列である。この新規シード配列はそのセンス鎖相補体と共に、ＲＩＳＣ（二本鎖ビヒクル）内にそのアンチセンス鎖を効率的に積み込み可能な適切な二本鎖領域に挿入され、得られた二本鎖は本発明に従い修飾対象とする。
さらに別の実施形態では、アルゴリズムは、相手のセンス鎖の不在下で対象中意図されたＲＮＡｉ依存性活性を誘発することができるように本発明のアンチセンス鎖をさらに修飾するために使用される。
最終実施形態では、望ましくない副作用を産生し得る別の細胞／組織タイプと同一のサイレンシング効果がｉｎ ｖｉｖｏ対象中標的とされた細胞および／または組織タイプを限定することが所望される場合に担体は個々の鎖と使用される。この細胞／組織標的タイプを達成する理論的根拠および手段（一本鎖オリゴ薬剤（アンチセンスまたはアプタマー）へのその適応を含む）は、当該技術分野においてよく理解されている。特定の細胞／組織タイプの一本鎖オリゴでの使用および標的に適した担体の広範なレビューについては、ＰＣＴ／米国特許第２００９／００２３６５号に提供されている。かかる比較的小さく単純な確立された担体は、従来のｓｉＲＮＡおよび従来のｍｉＲＮＡ送達のための開発におけるものと対照的である。
Ｄ．発明の詳細の概要
１．用語に対するコメント：
用語「ヌクレオシド」とは、提供された正常なリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドならびにヌクレオシドアナログを網羅すると解釈されるべきである。称した立体化学配向の化合物は、一般に文献に見出されるものと同一推測を条件とするものと理解されるべきであり、短縮用語が使用される場合、例えば、リボースと称される場合はＤ−リボースであるものと理解されるべきであり、またはアラビノ核酸（ＡＮＡ）と称される場合はＤ−アラビノ核酸である。
「ヌクレオシド代替物」とは、根本的にヌクレオシドと異なる化学的物質を有するが、他の条件下でヌクレオシドによって取り込まれる少なくとも１つの役割を果たす構造を指す。さらに、３’末端オーバーハングに適用する修飾の範囲は、相手鎖（１つまたは複数）と二本鎖を形成するｓｅｑＲＮＡｉ鎖領域において発現する構造に適用するものより広範であるものと理解されるべきである。
「別段の定めがない限り」または「別段既定のない限り」等の言及は、ある条件下で、異なる修飾（１つまたは複数）を提供する本明細書に記載の他の特定修飾を指す。２つ以上の規則が同一実体の異なる修飾について指定するこれらおよび他の例では、狭く適応可能な規則（少ないｓｅｑＲＮＡｉ鎖に適用する）の方が支配する。例えば、特定のアーキテクチャに適応可能である規則がアーキテクチャ独立規則を支配する。
用語「好ましい」および「最も好ましい」とは、大部分の可能なｓｅｑＲＮＡｉセットの鎖の立体配置の至適範囲を示すために使用される。一部の例では、配列特異的相違から生じるもの等の要因のため、特定の本明細書における至適変異型は、一般に好ましいかまたは最も好ましいものではない。かかる例において、選択された変異型は、さらに本明細書において提供される変異型のより一般的範囲内に収まる。好ましいかまたは最も好ましいものではない変異型の使用に関する任意のかかる決定は、主に、このサイレンシングの所望期間と共に意図された標的におけるサイレンシング効力の所望値対標的外効果低下のバランスに基づく。標的外効果は、意図しない標的発現の抑制を最小限に抑え、先天性免疫性の意図しない調節を最小限に抑えることを含む。これらの望ましくない効果は、一般的に、従来のｓｉＲＮＡ二本鎖および／またはそれらの成分鎖に付随する。それらは、当該技術分野において周知である方法を使用して測定することができる。
「サイレンシング活性」とは、標的外効果を最小限に抑えつつ意図された標的に対して実質的に特異的であるサイレンシング活性値を指す。好ましくは、標的は、ｓｅｑｓｉＲＮＡ、およびｓｅｑＩＭｉＲが使用される場合、５０％、６０％、または７０％超でサイレンシングされる。ｓｅｑＭｉＲを使用する場合、１、２、３、４または５の標的配列発現の少なくとも２５％、３５％、４５％もしくは＞５０％抑制が好ましい。例えば、治療的ｓｅｑＲＮＡｉ化合物の場合、商業目的は、意図された標的を治療有益性を達成する点まで十分に抑制することである。例えば、機能的ゲノムの場合、この用語は、標的の生体的役割（１つまたは複数）をより良く理解させるように、著しい生体変化を測定できる点まで標的値を抑制する必要がある意図されたサイレンシング活性値を指す。
ｓｅｑＲＮＡｉ鎖（センス、アンチセンス、または両方）に適用するように明白に指定される規則は、対応する（センス、アンチセンス、または両方の）ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲおよびｓｅｑＭｉＲ鎖に適用する。かかる規則は、別段の指定のない限りｓｓ−ＲＮＡｉ鎖に適用するとはみなされない。一部のｓｓ−ＲＮＡｉ鎖修飾は、それらがｓｉＲＮＡタイプまたはｍｉＲＮＡタイプ活性を産生するように設計されるかどうかに基づき区別される。
別段の定めがない限り、本明細書に記載の天然リン酸ジエステル（キラル的に特異的なホスホロチオエート、ボラノホスファート）に代替的なある連結を簡素化するために、一般にホスホロチオエートと称する項に記載する１つまたは複数のホスホロチオエート連結と置換できるものと理解されるべきである。しかしながら、別段の定めがない限り、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖における使用のために独特に特定され、ｓｅｑＲＮＡｉベースｓｉＲＮＡ二本鎖内３’末端オーバーハングになる連結は、３’末端オーバーハング保護（ホスホノアセタート、チオホスホノアセタート、アミド、カルバメートおよび尿素）の文脈においてのみ適用する。連結は、特定されない場合、リン酸ジエステルであると推定される。
２．基本的設計考慮：
ヌクレアーゼ耐性を達成して他の本質的な特徴を提供するためにｓｅｑＲＮＡｉ鎖に使用される化学修飾タイプは機能に有害な影響を及ぼす可能性も有することは、当該技術分野において十分に確立されている。例えば、それらは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ二本鎖に見られるサイレンシング活性を低減し、さらに除去することができる。さらに、適切な修飾の使用は、鎖が考慮されている基本的配列（センスまたはアンチセンス）、特定の修飾の使用頻度、使用される他の化学修飾の性質、鎖内化学修飾の全体の位置、相手鎖上の一本鎖におけるかかる要因効果および二本鎖形成時に生成した局所ならびに全体の鎖間熱力学等の要因に依存する。サイレンシング活性に加えて、これらの考慮は、潜在的標的外効果が引き起こされるかまたは抑制される範囲等のｓｅｑＲＮＡｉ鎖およびｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の他の機能的特徴に対しても主な影響を及ぼしている。それは続いて、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖に必要とされる、従来のｓｉＲＮＡおよび従来のｍｉＲＮＡ内の鎖と比較して高い値の化学修飾は、潜在的競合対象物が調和するように高度に組織化しなければならない。この調和は、本明細書に提供するアルゴリズムの使用を介して到達できる。
ｓｅｑＲＮＡｉセットは、論理的順で、一連のアルゴリズムを適用することによって構築される。一部のアルゴリズム（ヌクレアーゼ耐性に対応するもの等）は常に適用されるが、他の適応は特定の嗜好に依存する。規則、特に、特定のｓｅｑＲＮＡｉセットの設計に適用するアルゴリズムの組み合わせを優先する一般的原理は、より限定的な規則があまり限定的ではない規則を支配するということである。規則は特定構造の修飾の選択肢が少ないという意味でより限定的であり得るおよび／または規則は適応においてより限定的であり得る。実践においていったん特定のｓｅｑＲＮＡｉセットのための配列が選択されると、最終ｓｅｑＲＮＡｉ鎖の設計を指向とする適切な一連のアルゴリズムが論理的順で最も効率的に適用される。例えば、特定アルゴリズムの適応順は次のとおりである可能性がある：（１）二本鎖エンドリボヌクレアーゼ耐性ではなくヌクレアーゼ耐性を提供する；（２）ある他の本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則を提供する；（３）選択された独立したアーキテクチャ（基準、平滑末端、非対称または小内セグメント化）を提供する；（４）小内的セグメント化以外、任意のこれらアーキテクチャに対する分枝変異型の任意の適応；（５）全体および局所鎖間熱力学至適化を提供する；（６）必要な場合に二本鎖エンドリボヌクレアーゼを保護する；ならびに（７）他の任意のアーキテクチャ独立規則を潜在的に選択する。
可能なｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖アーキテクチャのそれぞれは、他より有利および不利である。これら起因のいくつかを表１に示す。一般的な目的において、３’末端オーバーハングのみを有する非対称アーキテクチャ設計が最も好ましい。
Figure 2014519806
図１は、一部だがすべてではない図に適用する鎖に行うことができる修飾の鍵を提供する。図２は、他のｓｅｑＲＮＡｉタイプに適用しないｓｅｑＭｉＲセットの設計へのより高性能アプローチの一部を例証する。一般的設計プロセスを例証するため、マウスＰＴＥＮ指向性の従来のｓｉＲＮＡがマイクロＲＮＡｌｅｔ−７ｉと共に選択されている。前者化合物は、分子のｓｅｑｓｉＲＮＡまたはｓｅｑＩＭｉＲセットの設計を例証するために使用され、後者化合物は、分子のｓｅｑＭｉＲセットの設計を例証するために使用される。選択された例の非修飾鎖を図３および４に示す。任意の隆起構造の除去、不適合および／またはウォッブル塩基対は、ｓｅｑＭｉＲセットの構築における第１設計工程である。ｌｅｔ−７ｉの場合、隆起構造はないが、二本鎖内の５つのウォッブル塩基対および１つの不適合がある。これらの除去を図５に例証し、特異的なヌクレアーゼ耐性に対する効果およびある他の本質的／好ましい修飾を図７に示す。図６〜１９は、選択する実施例に基づき設計プロセスの異なる態様を例証する。図８および９は、それらが分子のｓｅｑＲＮＡｉセットとして適している最小限の必要条件を示す鎖の例を提供する点で特に注目に値する。
Ｅ．アルゴリズム：一般に適応可能なアーキテクチャ独立規則−ヌクレアーゼ耐性の達成
本発明のすべてのセンス鎖およびアンチセンス鎖（ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲ、ｓｅｑＭｉＲ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲ）は、ヌクレアーゼを保護するある化学修飾を必要としつつ、同時に追加の所望される特性を必要とする他の本質的および任意の修飾と適合するかまたは支持的である。ｓｅｑＲＮＡｉまたはｓｓ−ＲＮＡｉ鎖内のある連結部位に必要とされるヌクレアーゼ保護は、次のとおりである：
１）一本鎖エンドヌクレアーゼ攻撃からのある内連結部位の保護；
２）３’末端オーバーハング前駆体（１つまたは複数）が存在する場合、そのサイズおよび本質に応じて、鎖３’末端２つ以上のヌクレオシドまたはヌクレオシド置換間連結の、３’末端エキソヌクレアーゼ攻撃からの保護；
３）５’末端エキソヌクレアーゼ攻撃からの鎖５’末端での連結部位の保護；ならびに
４）二本鎖内鎖（１つまたは複数）を保護する必要な修飾が存在する場合、二本鎖エンドリボヌクレアーゼ攻撃からｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成するｓｅｑＲＮＡｉ鎖内のある連結部位の保護。
必要な場合、特定の内連結部位の保護は、ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよびｓｓ−ＩＭｉＲの中央領域ならびにｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲアンチセンス鎖のシード配列において残りのアンチセンス鎖より弛緩できる。これらのアンチセンス鎖領域は主に、排他的ではない場合、標的コードを示し、それらは、ヌクレアーゼ耐性を生成するために使用される化学修飾に対して残りのアンチセンスまたはセンス鎖より感受性であり得る。
ヌクレアーゼ耐性を確立するために保護される内連結部位は、所定の連結を括弧で括ったリボヌクレオシドによって定義される。したがって、保護的化学修飾の頻度および位置は、基本的鎖配列に影響を受ける。一般的使用において、一本鎖エンドリボヌクレアーゼから保護される連結部位（５’から３’方向に読む）は、以下のものである：
１）リボヌクレオシドを含むピリミジン（Ｕ、ＣまたはＴ）は、Ｃ−Ｇを除きプリン（ＧまたはＡ）に続く。
２）連結部位は、Ｃ−ＣおよびＵ−Ｃによって定義される。
３）連結部位は、Ｃ−Ｇ、Ａ−ＣおよびＡ−Ｕによって定義される。
それゆえ、規定されたヌクレアーゼ保護を達成するために保護する必要があるのは、ＲＮＡの正常に生じる４つの塩基（Ａ、Ｕ、ＣおよびＧ）の１つまたは２つを有するリボヌクレオシドに関与する１６の潜在的連結部位のうち半分のみである。一方、一本鎖エンドリボヌクレアーゼから保護する必要がない連結部位は、Ａ−Ａ、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｃ、Ｇ−Ｕ、Ｇ−Ａ、Ａ−ＧおよびＣ−Ｕである。本明細書に記載の一部の適応において、リボヌクレオシド内でＴはＵと置換し得、ヌクレアーゼ保護が行われる場合、ヌクレアーゼ保護規則はＴをウリジンとして扱う。
特定の連結部位を一本鎖エンドリボヌクレアーゼから保護するアプローチとしては、下記が挙げられる：
１）連結の５’ヌクレオシドメンバは、別段の定めがない限り、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボースからなる群から選択される糖を有する。
２）２つ以上の連続的ヌクレオシドがあり、１つは好ましくは２’−０−メチルであり、連続的ヌクレオシドがＣを含む場合、別段の定めがない限り、Ｃは２’−０−メチルであることが好ましい。
３）５’ヌクレオシド糖が２’−フルオロである場合、特に３’ヌクレオシドが２’−フルオロまたはリボースである場合、３’ヌクレオシドとの介在連結はホスホロチオエートであることが好ましい。
４）５’ヌクレオシドが、潜在的に添加した保護を提供するホスホロチオエートを有する２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース糖を有する場合、介在連結はホスホロチオエートであってもリン酸ジエステルであってもよい。
５）連結部位が１群（Ｕ−Ｇ、Ｕ−Ａ、Ｃ−Ａ）または２群（Ｃ−ＣおよびＵ−Ｃ）に規定される場合、ホスホロチオエートが好ましい。３群において、第１ヌクレオシドが２’−フルオロまたはリボース（Ｃ−Ｇ、Ａ−ＣおよびＡ−Ｕ）である場合、連結対内３’−ヌクレオシドがリボースまたは２’−フルオロであるホスホロチオエートが好ましい。
６）別段の定めがない限り、連結部位の３’ヌクレオシドメンバは、リボース、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボースからなる群から選択される糖を有することができる。
ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよびｓｓ−ＩＭｉＲアンチセンス鎖の中央領域の場合、すべての指定の修飾は、意図されたサイレンシング活性に対する悪影響を取り消さず頻繁に収容し得る。悪影響取り消しが見られる場合、より高いサイレンシング効果を達成するために連結部位保護が除去される順は、掲載順と逆である（すなわち３群、次いで２群、次いで１群）。したがって、例えば、Ｃ−Ｇ、Ａ−ＣおよびＡ−Ｕ連結部位（３群）の保護は、最も重要度が低い。
ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲアンチセンス鎖のシード配列の場合、ヌクレアーゼ耐性生成に関与する化学修飾は、内因的に生じるかまたは新規シード配列によって抑制されたｍＲＮＡタイプ範囲に影響を及ぼすことも、特定のｍｉＲＮＡタイプに起因するサイレンシング活性値に影響を及ぼすこともあり得る。これらの影響が意図された市販目的において不都合である場合、ヌクレアーゼ保護レベルを低減することによって避けることができる。他のｓｅｑＲＮＡｉおよびｓｓ−ＲＮＡｉタイプの中央領域に関して、エンドヌクレアーゼからのヌクレアーゼ保護レベルの低下は、重要度が最も低い第３群で示す順と逆順である。
本発明の鎖を任意の選択されたアーキテクチャの一本鎖３’末端エキソリボヌクレアーゼから独立して保護するための一般的手段は、最小末端２つのヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換（最大４である）ならびに最小末端２つの連結（最大４である）で、ヌクレアーゼ耐性を提供するものであることを必要とする。修飾は、２つのヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換ならびに２つの連結に限定することが好ましい。
必要な３’末端エキソヌクレアーゼ保護は、下記によって提供される：
１）３’末端オーバーハング前駆体の不在下、必要な３’末端保護は、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース基から個別に選択される２つの末端ヌクレオシドの使用によって提供できる。しかしながら、３’末端２’−フルオロ修飾を有する鎖の収率は、現行製造法では低減し得る。
２）３’末端オーバーハング前駆体の不在下、末端２つの連結はホスホロチオエートである。
３）３’末端エキソヌクレアーゼ保護も、その名によって項に記載のように、部分的または完全に３’末端オーバーハング前駆体の使用によって達成できる。オーバーハング前駆体は１〜４単位長を有し得、２単位が好ましい。１単位のみある場合、近接するヌクレオシドは、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース基から選択され、上流連結はホスホロチオエートである。
連結部位５’末端は、次のとおり完全にまたは部分的に保護される：
１）別段の定めがない限り、５’末端ヌクレオシドは、次の修飾：２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボースを有するヌクレオシドからなる群から選択される。
２）修飾する５’ヌクレオシドがシチジンである場合、別段の規定のない限り、２’−０−メチルが好ましい。
３）連結部位の３’メンバは、リボース、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボースからなる群から選択される糖を有することができる。
４）別段の定めがない限り、介在連結はリン酸ジエステルであってもホスホロチオエートであってもよいが、５’ヌクレオシドが２’−フルオロである場合、介在連結はホスホロチオエートであることが好ましい。
二本鎖エンドリボヌクレアーゼからの保護は、細胞内ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成と、ＲＩＳＣ結合およびプロセシング間の短期間において重要である。関連酵素は正常なＲＮＡ二本鎖の両鎖を消化する。ｓｅｑＲＮＡｉ鎖内セグメント（一本鎖セグメント）が正常なリボヌクレオシドに連続的な４つの連続リン酸ジエステル連結を保有し、相補性ＲＮＡ鎖と二本鎖を形成し、相補鎖内の同一サイズ以上のかかるセグメントと対をなす塩基である場合、得られた二本鎖セグメントはこれらの酵素によって低値消化を支持することができる。４つ未満の二本鎖セグメントは消化を支持しない。しかしながら、これらの酵素は、かかる二本鎖セグメントが二本鎖形成時に各鎖の対向正常リボヌクレオシドと連続した５〜６またはそれ以上のリン酸ジエステル連結を有する場合、著しく活性である。ホスホロチオエート連結がｓｅｑＲＮＡｉ相手鎖内相補性ＲＮＡセグメントを保護する場合、これらの酵素はまた、二本鎖内の単一の保護されていない一本鎖セグメントも消化することができる。
本明細書に記載のタイプの修飾ヌクレオシドおよび２’−デオキシヌクレオチドは、かかる二本鎖セグメントを形成するｓｅｑＲＮＡｉ対の少なくとも一本鎖の単鎖セグメントにおいて使用される場合、二本鎖エンドヌクレアーゼによって両鎖の一本鎖セグメントの消化を実質的に阻害する。したがって、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖は、次のとおり設計される：
１）それらが細胞内で相手鎖とｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時、両鎖内の正常なリボヌクレオシドに連続的な５以上の連続リン酸ジエステル連結を含む相補性二本鎖セグメントはなく、好ましくは４以上のセグメントがない。
２）二本鎖セグメン長が記載の長さに制限されるように、任意のかかる二本鎖セグメント（１つまたは複数）を相手鎖と共に形成可能でなければ、任意の一本鎖セグメント（１つまたは複数）をｓｅｑＲＮＡｉ鎖（１つまたは複数）に分割するために１つまたは複数の修飾ヌクレオシドが供給される。
３）かかる修飾は、得られたｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の２本の鎖の片方の一本鎖セグメントに限定されることも両方に出現することもできる。あるいまたはさらに、これらのサイズの二本鎖セグメントはホスホロチオエート連結を使用して分割できるが、これが唯一の保護方法である場合、両鎖の二本鎖セグメントに適用しなければならない。
ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を二本鎖エンドリボヌクレアーゼ攻撃から保護する規則は、所定のｓｅｑＲＮＡｉセットに適用するすべての関連規則に基づき修飾後に適用する点で他のヌクレアーゼからの保護規則と異なる。これは不必要な修飾の使用予防に役立つ。
Ｆ．アルゴリズム：一般に適応可能なアーキテクチャ独立規則−その他
１．本質的／好ましい修飾
ａ）ｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖およびアンチセンス鎖ならびにｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲに適応可能である：
ｉ）別段の定めがない限り、ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖内で一本鎖における任意の２’リボース修飾ヌクレオシドが相補鎖内ヌクレオシドと対向し、異なるリボース修飾を有するかまたは正常なリボヌクレオシドもしくは２’−デオキシリボヌクレオシドであることが好ましい。
ｉｉ）ウラシルは、同一ヌクレオシド内でリボースと対をなさないことが好ましい。ウラシルが２’−デオキシリボースと対をなす場合、いずれの連続的ヌクレオシドも２’−デオキシリボヌクレオシド（１つまたは複数）ではないことが好ましい。
ｉｉｉ）シトシンがメチル化されていない限り、２’−デオキシリボヌクレオシドを含むいずれのグアニンも２’−デオキシリボヌクレオシドを含む連続的シトシン３’側で使用されないことが好ましい。
ｉｖ）ヌクレアーゼ保護のためのホスホロチオエート使用が半分未満の連結をこのタイプとする場合、挿入する追加ホスホロチオエートはこの値を達成することが好ましい。
ｂ）ｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
ｉ）任意の所定のセンス鎖内に一列にヌクレオシドを含む３つ以下のグアニンがあることが好ましいが、４つが必要とされる場合、４つのうち１つは好ましくは７−デアザグアノシンである。
ｉｉ）不適合が規則により示され、標準塩基（Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣまたはＧ）を有する複数のヌクレオシドが役割を果たすことができる場合、好ましいヌクレオシド（１つまたは複数）は、ヌクレアーゼ攻撃に対してほとんどの安定した連結部位を生成するものである。例えば、Ｇ−ＧはＣ−Ｇより安定している。
ｉｉｉ）不適合の導入が規則により示され、不適合を生成する塩基変化のために選択されたヌクレオシドがＡである場合、ヌクレオシドは下記の１つに変化することが好ましい：
・Ｔが好ましく、糖が適応可能な規則によって許容される位置にある場合、糖は２’デオキシリボヌクレオシドであることがさらに好ましい。
・Ｃが好ましく、糖が適応可能な規則によって許容される位置にある場合、糖は２’−０−メチルであることがさらに好ましい
・Ｕは許容されるが好ましくなく、使用される場合、糖が適応可能な規則によって許容される位置にある場合、糖は２’−０−メチルであることが好ましい。
ｃ）ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖に適応可能である：
ｉ）アンチセンス鎖は、用いられてよい任意の３’末端オーバーハング前駆体単位（１つまたは複数）を除いて１６〜２３のヌクレオシド長である。
ｉｉ）連続４つ超のグアニン含有ヌクレオシドは許容されない。中央領域外に連続３つ以下のグアニン含有ヌクレオシドがあることが好ましいが、４つを必要とした場合、４つのうち１つは、好ましくは７−デアザグアノシンである。連続４つ以上のグアニン含有ヌクレオシドは、アンチセンス鎖の中央領域において許容されない。
ｄ）ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
ｉ）共通の正常ヌクレオシドからなる完全に相補性の中央領域と比較して、中央領域においてヌクレオシド位置の１つも意図された標的との結合親和性を低減する実体に占められていないことが好ましい。除外した修飾の例は、ＵＮＡおよび脱塩基実体ならびに標的ＲＮＡと適合しない塩基を有するヌクレオシドである。
ｉｉ）中央領域２つ以下の連続的ヌクレオシドが２’−０−メチル修飾を有することが好ましい。
ｉｉｉ）２’−デオキシリボヌクレオシドであり得るシード配列内ヌクレオシドの数または位置に対する制限はないが、いずれのオーバーハング前駆体も除いて、２’−デオキシリボヌクレオシドであり得るアンチセンス鎖の４０％以下の限度がある。加えて、中央領域２つのかかるヌクレオシドの限度があることが好ましく、２つある場合、それらは連続的ではない。残鎖において、任意のオーバーハング前駆体（１つまたは複数）を除いて、１つのかかるヌクレオシドの限度がある。
ｅ）ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
ｉ）必要に応じて、シード配列当たり最大３つを有するｍＲＮＡ３’ＵＴＲ標的配列（１つまたは複数）との結合親和性を増大するためにＬＮＡ（１つまたは複数）をシード配列において使用することができる。所定のシード配列内に複数のＬＮＡがある場合、それらはＬＮＡ修飾を有さないヌクレオシドの少なくとも１つによって分離されることが好ましい。ＬＮＡ中でＴはＵと置換できることに留意されたい。
ｉｉ）標的中の対応塩基がアデニンである場合、２−チオウラシル含有ＬＮＡをウリジンＬＮＡの代わりに使用して、シード配列のそのｍＲＮＡ標的との結合親和性をさらに亢進することができる。
ｉｉｉ）塩基が標的中の対応塩基：２，６−ジアミノプリン（アデニンとの対）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、２−チオチミンに相補性である場合、本明細書において提供される正常なリボースヌクレオシドタイプのＬＮＡまたは他のリボース修飾リボースヌクレオシドはシード配列において使用して以下の修飾塩基と対をなすことができる。
ｉｖ）シード配列および意図された標的配列（１つまたは複数）間にいずれのＧ：Ｕ塩基対もないことが好ましい。
ｖ）特にシード配列内にＬＮＡ修飾がない場合、シード配列内に２’−デオキシリボヌクレオシドがないことが好ましい。中央領域４つの２’−デオキシリボヌクレオシドの限度があり、２つ超ある場合、それらは連続的ではない。残鎖において、任意のオーバーハング前駆体（１つまたは複数）を除いて、１つの２’−デオキシリボヌクレオシドの限度がある。
ｖｉ）５’末端から２番目のヌクレオシドは、２’−０−メチルまたはＬＮＡではなく、２’−フルオロまたはリボースであることが好ましい。
例証的ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲ例に対するヌクレアーゼ耐性および本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則の適応をそれぞれ図６および７に提供する。
２． 非本質的／任意の修飾：
ｓｅｑＲＮＡｉ鎖およびｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖のヌクレアーゼ耐性値は、キラル的に特異的なホスホロチオエート連結の選択的使用を介して調節することができる。Ｓｐジアステレオ異性体ホスホロチオエート連結は、Ｒｐジアステレオ異性体よりはるかにヌクレアーゼ耐性である。標準ホスホロチオエート連結の混合したキラル性は、Ｒｐ連結が感受性連結部位において最初に切断された部位に至る。したがって、しばしば複数の感受性があることから、鎖または二本鎖の全体の安定性はＳｐキラル的に純粋な鎖より実質的に低下する。それゆえ、標準キラル的混合したホスホロチオエート連結によって提供されるものと比較して高いヌクレアーゼ耐性値が特定の市販目的に所望される場合、Ｓｐ連結は、好ましくは、それらの切断感受性の連結部位を保護するために使用される。
標準ホスホロチオエート連結の別の潜在的代替物はボラノホスファート連結であり、Ｓｐ立体異性体配置が好ましい。ボラノホスファート連結（図２４）は、ボラン（ＢＨ３ −）基が天然リン酸ジエステル連結中の非架橋酸素原子の１つを置換するという点で天然ＤＮＡおよびＲＮＡと異なる。かかる連結は、２つの一般的方法：（１）酵素重合指向性の鋳型；および（２）固体支持を使用する化学合成、を介してオリゴ中に挿入することができる。ボラノホスファートヌクレオシドモノマーを図２５に例証する。
ボラノホスファートオリゴ産生は、他の化学的物質間のリン酸ジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオリン酸の産生においてホスホラミダイトまたはＨ−ホスホン酸を使用する非常に一般に使用されるアプローチへの修飾に関与する方法を含む種々の固相化学合成スキームによって到達できる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７： ４７４６， ２００７）。より厳密にボラノホスファート指向性の他の固相合成技術も、ここ数年に開発されている。例えば、Ｗａｄａおよび同僚らは、Ｈ−ホスホネート中間体を利用することができる、彼らがボラノホスファートトリエステル方法と呼ぶものを開発している（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ７１： ４２６２， ２００６； Ｋａｗａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １８： ３７８３， ２００８）。この方法は、立体異性体的に純粋なボラノホスファート塩の合成にも適用することができる（Ｅｎｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １６： ９１５４， ２００８）。
混合した連結（ボラノホスファートおよびリン酸連結等）を有するオリゴの生成は、５’−０−保護基としてビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルの使用に関与するものを含むいくつもの固相方法によって成し遂げられている（Ｂｒｕｍｍｅｌ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ４３： ７４９， ２００２）。別の例では、５’−ヒドロキシルは、まずベンズヒドロキシビス（トリメチルシリルオキシ）シリル基で保護され、次いで、次の周期前にＥｔ３Ｎ：ＨＦによって脱ブロック化される（ＭｃＣｕｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２８： ８１３８， ２００６）。この方法により、９９％カップリング収率に至ることができ、純粋なボラノホスファート連結またはリン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ジチオリン酸またはメチルホスホネート連結と混合したボラノホスファートを有するオリゴの合成に適用することができる。
ボラノホスファートラミデートの２−（４−ニトロフェニル）エチルエステルのボラノホスファート化試薬はボラノホスファート結合したオリゴリボヌクレオシドを産生するために使用することができる（Ｌｉｎ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｗ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｂｏｒｏｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ， ＰｈＤ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ， Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ， ２００１）。この試薬は、触媒として１Ｈ−テトラゾールの存在下で、ヌクレオシド上ヒドロキシル基と容易に反応する。２−（４−ニトロフェニル）エチル基は、ベータ排泄を介して１，４−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）によって除去でき、対応ヌクレオシドボラノモノホスファート（ＮＭＰＢ）を良好な収率で産生する。
オリゴヌクレオチドボラノホスファートの立体制御合成は、ホスホロチオエートの立体制御合成のために当初開発されたオキサチアホスホレーンアプローチ適応を使用して到達できる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７： ４７４６， ２００７）。この方法はボラン基を導入させる三配位リン中間体に関与する。他のアプローチとしては、キラルインドール−オキサザホスホリンまたはキラルオキサザホスホリジンの立体制御合成手段が挙げられる。ホスホロチオエートの立体制御合成のために当初使用されたこれらのアプローチはいずれも、ボラノホスファート塩に成功裏に適応している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７： ４７４６， ２００７）。さらに、ボラノホスファートによって結合したオリゴの立体制御合成の産生に対する別のアプローチは、Ｈ−ホスホネート中間体の使用に関与する（Ｉｗａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍ Ｓｅｒ ５３： ９， ２００９）。
ｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖およびアンチセンス鎖ならびにｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲに適応可能である修飾：
ａ）別段既定のない限り、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖内３’末端ヌクレオシド修飾は、好ましくは２’−フルオロではない。これは製造であり、機能的問題ではない。３’末端で２’−フルオロを有する鎖の既存の標準合成方法の使用により、典型的には収率が低下する。
ｂ）ホスホロチオエート連結は、それらがヌクレアーゼ耐性を増大するために必要とされていない位置でリン酸ジエステルと置換するために使用することができる。これは、例えば、あるタンパク質（アルブミン等）に対するオリゴ粘性を増大するように行うことができる。
ｃ）Ｓｐジアステレオ異性体ホスホロチオエート連結は、高ヌクレアーゼ耐性値が所望される場合に標準キラル的混合したホスホロチオエート連結ではなく、本発明に従いヌクレアーゼ切断からの保護のため選択された連結部位において使用することができる。
ｄ）ボラノホスファート連結は、ホスホロチオエート連結の一部と置換してもすべてと置換してもよい。
ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内に適応可能である：
５’末端ヌクレオシドは、５’リボース位置でリン酸化し得る。
Ｇ．熱力学考慮
１．概要：
相補塩基対に関する熱力学考慮は、ｓｅｑＲＮＡｉ鎖の設計において重要性である。最も重要なことに、すべてのｓｅｑＲＮＡｉ化合物クラスの効率的サイレンシング活性は、熱力学パラメーター至適化に依存する。かかるパラメーターはまた、特定の市販目的においてｓｅｑＭｉＲシード配列設計の至適化において重要な役割を果たす。熱力学安定性は、二本鎖形成において融解温度（Ｔｍ）または標準フリーエネルギー変化（ΔＧ）に反映される。これらのパラメーターは互いに密接に相関し、十分に確立された最も近い近隣算出を使用して算出することも実験的に決定することもできる。
本発明における使用のため所望の熱力学特性を有する鎖の構築の開始点は、最も一般的な塩基（Ｕ、Ｃ、ＧおよびＡ）およびリン酸ジエステル連結を有する正常なリボヌクレオシドからなる鎖の基本的ＲＮＡ配列である。最も近い近隣算出は、生理的条件下で相手鎖を有する鎖の全体のＴｍ（１つまたは複数）ならびにヘアピンおよび二量体形成を介してそれ自体と相互作用する能力を算出することに使用することができる（Ｐａｎｊｋｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ｍｅｌｏ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１： ７１１， ２００５； Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３： ９３７３， １９８６； Ｄａｖｉｓ ＆ Ｚｎｏｓｋｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６： １３４２５， ２００７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ＆ Ｚｎｏｓｋｏ， Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００９年６月９日にオンライン公開）。最も近い近隣算出は、オリゴ分析のために容易に利用可能ないくつかのコンピュータプログラム使用を介して取り込むことができる。
局所鎖間Ｔｍは、ｓｅｑＲＮＡｉ化合物の設計において重要な役割を果たす。個別にこれらの領域は、最も近い近隣算出に確実に適用するには短すぎ得る。この場合、次式（式中、ｗ、ｘ、ｙおよびｚは指定タイプの塩基数である）：Ｔｍ＝２（ｗＡ＋ｘＵ）＋４（ｙＧ＋ｚＣ）を使用してＡ：ＵおよびＧ：Ｃ含量に基づく基本的Ｔｍ算出を適用することができる。
特定の化学修飾効果の説明をする表２に示す概算を使用してＴｍ算出を調節する。次いで、表は、それらを組み合わせて選択されたアーキテクチャと二本鎖形成時に所望の全体および局所Ｔｍに至る鎖に設計調節を行うガイドとして使用することができる。
Figure 2014519806
 ＊Ｔｍは、生理的条件下、摂氏で測定される。提供する数は概算であり、Ｔｍに対する実際の影響は、鎖長、二本鎖内修飾の位置および鎖内の他の修飾の存在が挙げられるが、これらに限定されないいくつかのパラメーターに影響される。指定ヌクレオシド修飾の親和性効果は、修飾が具体的に不適合と指定されない限り、オリゴヌクレオチド鎖内相補性ヌクレオシドに関するものとみなすべきである。
２．全体のおよび局所鎖間結合親和性：
特定のｓｅｑＲＮＡｉセットによって形成されたｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の全体のＴｍは重要である。Ｔｍが増大して摂氏約５５度を超えると、例えば、ＲＩＳＣ内にＡＧＯ２が他のアルゴノートと比較して選択的に積み込まれる可能性が増大する。ＡＧＯ２は、ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲ活性において重要である触媒活性を有する唯一のアルゴノートである。一方、大部分のｓｅｑＭｉＲは、アルゴノートがＲＩＳＣに組み込まれたものと比較的異なるが、その触媒活性が適切な設計考慮を使用してブロックされない場合、ＡＧＯ２積み込みはこれらの化合物によって標的外効果を生成する可能性を有する。したがって、ＡＧＯ２積み込みを至適化するために、ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲセットにおいて全体のＴｍ摂氏約６５度以上が好ましい。直接のＡＧＯ２触媒活性が阻害されない限り、ｓｅｑＭｉＲにおいて低Ｔｍが好ましい。後者は、アンチセンス鎖５’末端から１０および／または１１位ヌクレオシドが意図しない標的と効果的に塩基対することから予防することによって到達できる。
鎖間親和性、特にｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖領域（表３によって明白に規定される領域）におけるある相対差も小内的セグメント化よりすべてのｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖アーキテクチャ変異型において重要である。センス鎖に関して表３によって明白に定義される３つの領域は、全体の鎖間親和性より総括して比較的低い結合親和性がセンス鎖を除去するアンチセンス鎖の効率的ＲＩＳＣ積み込みおよび保持を促進することができる二本鎖内領域である。領域１および３内の低Ｔｍは、不適合によって産生し得るもの等の二本鎖の巻き戻しおよび領域２内の実質的に低いＴｍを促進し、ＵＮＡまたは脱塩基ヌクレオシドはパッセンジャー鎖の除去促進に役立ち得ると思われる。ＡＧＯ２がＲＩＳＣ内に積み込まれ、センス鎖内（アンチセンス鎖のヌクレオシド１０位と１１位間連結の向かい側）に適切な切断部位がある場合、領域２に対する不適合、ＵＮＡまたは脱塩基ヌクレオシドが存在しない場合、センス鎖の効率的除去を促進することができる。
好ましい範囲を超える際にｓｅｑＲＮＡｉ二本鎖の全体のＴｍを低減することが重要である場合、特にセンス鎖内において親和性を低減する修飾を確認するべき主要領域もある。しかしながら、ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の全体のＴｍは、直接測定するには高過ぎ得（生理的条件下で摂氏約９５度超）、これらの局所鎖間親和性が適切に調節される場合、化合物は所望のサイレンシング効果を依然として産生することができる。
表３によって明白に定義される併合された３つの領域において、両方が持続的配列とみなされ、いずれのサイズ差を補正時も、併合介入領域よりＴｍが低いことが好ましいことが一般規則である。これらの併合配列は、より正確な最も近い近隣算出を使用して評価するために十分大きい。明白に定義される全３つの領域は、併合した介在配列のＴｍよりサイズ補正された比較的低いＴｍを有することも好ましい。しかしながら、表３によって明白に定義される小サイズの個々の領域は、最も近い近隣効果を考慮しない基本的Ｔｍ算出の使用を必要とする。
競合する二本鎖の全体のＴｍが、低減する好ましい上値修飾を超える場合、表によって明白に定義される領域で選択的に行われるべきである。全体の二本鎖Ｔｍがアンチセンス鎖との不適合（１つまたは複数）の好ましい範囲内にある場合でも、１つまたは複数のこれらの領域の単一ＵＮＡまたは単一脱塩基ヌクレオシドは、意図されたサイレンシング活性を促進することができる。しかしながら、アンチセンス鎖５’末端から数えて１０および１１位と対向するセンス鎖がリン酸ジエステル連結を有し、センス鎖内のこの連結部位の５’側ヌクレオシドが２’−０−メチルではなく、好ましくはリボースまたは２’−フルオロである場合、ｓｅｑｓｉＲＮＡ／ｓｅｑＩＭｉＲセットにおいて領域２内Ｔｍが比較的低いことはあまり重要ではない場合がある。この配置はＡＧＯ２によるセンス鎖切断を促進し、順にこれはセンス鎖のＲＩＳＣからの除去を促進する。
Figure 2014519806
 ＊同定された領域は、アンチセンス鎖の対応する二本鎖部分を含むものと理解されるべきである。最も広範囲の潜在的化学修飾およびこれらの領域で鎖間親和性を低減するために使用することができる他の操作（不適合等）は、サイレンシング活性を低減せずにセンス鎖に適用することができるため、センス鎖を参照として使用する。指定のセンス鎖長は、オーバーハング前駆体を形成する任意の３’末端ヌクレオシドまたはヌクレオシド置換を除く。指定ヌクレオシド位置の範囲は、所定領域の指定されたものすべてを含む。したがって、例えば、４〜７は、４番目ヌクレオシドと７番目ヌクレオシドの両方を含むものとして解釈すべきである。
分子のｓｅｑＲＮＡｉセットを構成する鎖の設計は、ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖由来ＲＩＳＣによる所望のアンチセンス鎖の選択を促進する手段を含まなければならない。事実上アンチセンス鎖として意図されたアンチセンス鎖のＲＩＳＣ内積み込みを促進するために使用される手段の１つは、内因性ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ二本鎖由来のアンチセンス鎖選択の主要機序に基づく。この機序の背景にある原理は、非対称規則と称される場合がある。この規則に準じて、４つの末端二本鎖ヌクレオシドの二本鎖の片端を二本鎖の対応ヌクレオシドの他端と比較した相対的Ｔｍは、各鎖がＲＩＳＣ内アンチセンス鎖として機能する相対度決定において重要な役割を果たす。Ｔｍの低い二本鎖末端に関与する５’末端を有する鎖は、アンチセンス鎖としてＲＩＳＣ内に積み込まれる可能性が高い。しかしながら、ほとんどの末端ヌクレオシドは、連続的ヌクレオシドにおいて最も重要であり、進行的に重要度が低下するため、Ｔｍ効果は二本鎖末端ヌクレオシドに渡り均等に分配されていない。この規則侵害は必ずしも特定のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ二本鎖を非機能的にさせる必要はないが、事実上アンチセンス鎖として意図されたセンス鎖のＲＩＳＣ内積み込みがより多くあり、意図されたセンス鎖の積み込みは標的外効果の可能性を増大し得るため、それらは準最適活性を示す可能性が高い。
非対称規則は、ｓｅｑＲＮＡｉアーキテクチャタイプの大部分において重要である。特定の標的に対してｓｅｑＲＮＡｉセットのためにそれを確立する最も簡易な方法は、鎖に対する化学修飾のための必要な規則の適応後に単に非対称規則にてコンプライアンスに至る配列を選択することである。必要な場合、表２における情報を使用して鎖セットの非対称規則コンプライアンスを順守させることができる。鎖が例外的に非対称規則コンプライアンスから外れる状況では、分枝変異型をほとんどのアーキテクチャと使用することができる。
非対称規則コンプライアンス決定に関与した２つの４ヌクレオシド二本鎖は、Ｔｍ値決定信頼度が妥当である最も近い近隣算出に使用するには短すぎる。代わりにより基本的な算出を非修飾二本鎖Ｔｍ概算に使用することができる。非修飾二本鎖Ｔｍを決定後、表２に提供する修飾のＴｍの影響に基づき調節することができる。しかしながら、この決定は、あるものが末端から離れて移動時にヌクレオシドの重要性低下を考慮しない。これを簡単な方法で説明するため、４つのヌクレオシド二本鎖の全体のＴｍがアンチセンス鎖５’末端を含むものにおいて低く、この二本鎖の最も末端の２つのヌクレオシド対の親和性は、相手のヌクレオシドにおいて対応する対の他端の親和性より低いことが好ましい。
ＲＩＳＣは、鎖が選択されたアンチセンス鎖がサイレンシングにおいて活性である順で５’末端リボースまたはリボース置換物の５’ＣＨ２ＯＨ位置でリン酸化されることを必要とする。
したがって、アンチセンス鎖として所望のセンス鎖のＲＩＳＣ内積み込みの最も簡易な阻害方法は、この位置でセンス鎖を５’−メチル化することである。所望のアンチセンス鎖は５’−リン酸化されるように製造することができ、鎖が細胞に入った後、細胞内酵素はリン酸化提供に依存できる。これは、考慮して特定のアーキテクチャと設計された鎖内で非対称規則遂行に役立つように使用されるべきである。
サイレンシングするｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ二本鎖内各鎖の相対的関与を測定する方法は、当該技術分野において十分に確立されている。これらの技術は、意図されたアンチセンス鎖がＲＩＳＣによって効率的に使用されることを確実にするためにｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖にも適用できる。例えば、リードアウトタンパク質（ルシフェラーゼまたは向上した緑色蛍光タンパク質等）を有する発現ベクターは、ＲＩＳＣサイレンシングを指向とする任意の鎖のための標的コードによって認識可能な標的配列で構築することができる。同一細胞内で区別し得るリードアウトタンパク質を有する２つのかかるベクターは、それぞれがｓｅｑＲＮＡｉ対内の異なる鎖に反応する場所で構築することができる。次のこれらの発現ベクターは、試験鎖からなるｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖と共にまたはその投与直前に細胞系内にトランスフェクトすることができる。各リードアウトタンパク質のサイレンシングの相対値を測定することによって、各鎖がそれぞれの標的をサイレンスする相対的有効性を決定可能である。かかるアッセイは、意図されたセンス鎖がアンチセンス鎖としてＲＩＳＣ内に積み込まれる範囲の評価手段を提供する。
３．標的コードおよび標的：
従来のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡそれぞれのためのコードを標的とすることを除外しない場合、中央領域およびシード配列は主要である。したがって、これらのアンチセンス鎖領域への修飾は、意図された標的（１つまたは複数）のサイレンシングに対し影響を及ぼすそれらの能力に関して特に重要である。これらの基本的な概念はｓｅｑＲＮＡｉ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲアンチセンス鎖にも適用される。
このアルゴノートは、ＲＩＳＣ標的に対して触媒活性を有する点で独特であるため、ｓｉＲＮＡ、ｓｅｑｓｉＲＮＡ、ｓｅｑＩＭｉＲ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよびｓｓ−ＩＭｉＲアンチセンス鎖は、それらがＡＧＯ２でＲＩＳＣ内に積み込まれる場合に最も効果的である。ＡＧＯ２は、アンチセンス鎖５’末端から数えて１０および１１位の１つの結合するヌクレオシドと対向する連結で標的ｍＲＮＡを特異的に切断する。効果的であるため、いくつもの連続的ヌクレオシドに沿った１０および１１位のヌクレオシドはｍＲＮＡ標的と完全に相補性でなければならない。したがって、アンチセンス鎖の中央領域の不適合は、特に意図されたサイレンシング活性を弱らせる。しかしながら、ｍＲＮＡ標的の中央領域の結合親和性は、本発明によって許容される化学的物質タイプによって生成した親和性範囲内で、サイレンシング活性において比較的重要ではないと思われる。アンチセンス鎖の中央領域外および任意のオーバーハングを除き、配列とｍＲＮＡ標的の相補性度は高いことが好ましい。しかしながら、少数の不適合は典型的には忍容し得る。
ｍｉＲＮＡ、ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲ活性を支持する典型的な正常な内因性機序は、アンチセンス鎖積み込みＲＩＳＣが標的として特定のｍＲＮＡタイプを認識するように簡単に作用するｍＲＮＡ分解プロセスの導入に関与する。いったんこれが生じると、他の細胞因子はしばしばポリ−Ａ尾で開始するｍＲＮＡ分解に至るＲＩＳＣと複合体を形成する。この文脈において、ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ内シード配列および相補性配列間の相補塩基対に関与する熱力学相互作用の詳細は、他のＲＮＡｉタイプの中央領域およびそれらのｍＲＮＡ標的間の相補塩基対より注意を必要とする。
ｓｅｑＭｉＲを構築する１つの方法は、特定の内因性ｍｉＲＮＡまたは、隆起構造、そうでなければ相補鎖および／もしくはウォッブル塩基対間の他の不適合を削られたバージョンに重要なアーキテクチャ独立アルゴリズムおよび選択されたアーキテクチャ依存性アルゴリズムを単に適用することである。あるいは、特定の内因性ｍｉＲＮＡ由来のシード配列または新規シード配列は、センス鎖対応領域相補性配列と共に二本鎖ビヒクル中に置くことができる。二本鎖ビヒクルによって示された任意のＡＧＯ２ベース触媒活性は、例えば、アンチセンス鎖５’末端から数えて１０および／または１１位のヌクレオシドを脱塩基、ＵＮＡおよび／またはＦＡＮＡであるものと置換することによって阻害することができる。脱塩基ヌクレオシドは、本明細書において提供される、非固定変異型（ＵＮＡ中の糖）、２−デオキシリボースおよびＦＡＮＡを含む任意の糖修飾を有することができる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
新規シード配列は、サイレンシングを対象とする内因性ｍｉＲＮＡのシード配列およびｍＲＮＡ種内相補性配列の相互作用の詳細を研究するために使用されている最近開発されたコンピュータおよび分子生体技術との組み合わせを使用して特定の目的のため構築することができる（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９： ３２１， ２０１２は、一部の具体例を提供する）。潜在的新規シード配列は、サイレンシング目的のｍＲＮＡ収集における相補性配列のための３’ＵＴＲを調査することによって初めに同定することができる。これらの相補性配列は、下記のようにある熱力学基準を満たさなければならない。新規ｍｉＲＮＡの次のプロトタイプは、例えば、ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲ化合物の設計基準を満たす選択されたアンチセンス鎖内シード配列を置くことによって構築することができる。次いで、プロトタイプｓｅｑＭｉＲの目的のｍＲＮＡ収集を物理的に認識する能力を分析する。次いで、所望のｍＲＮＡ収集へ結合可能であるプロトタイプ化合物をサイレンシング試験において試験できる。最後に、シード配列のそのｍＲＮＡ標的配列に対する結合親和性の調節を必要に応じて行うことができる。
内因性ｍｉＲＮＡのシード配列とそのｍＲＮＡ標的の相互作用について記載する実質的な文献がある。従来のｓｉＲＮＡ内シード配列は、このＲＮＡｉクラスに見られる標的外効果への共通の主な関与であることが見出されている。したがって、ｓｉＲＮＡは、得られたサイレンシング活性は、通常、所望されないにもかかわらず、新規タイプのｍｉＲＮＡとして機能することもできることが明らかである。これから、シード配列外にある特定のｍｉＲＮＡアンチセンス鎖配列は、ｍｉＲＮＡタイプサイレンシング達成に必要としない。
Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６： ７１００， ２００８）は、ｍＲＮＡ標的に対してｍｉＲＮＡタイプ活性を引き起こす点でｓｉＲＮＡ内の特定のシード配列効果に影響を及ぼす一部の重要な熱力学考慮に注意を促している。彼らは、シード配列とｍＲＮＡ標的配列間で形成された二本鎖の熱力学安定性は、シード配列依存性サイレンシング度と強い正関関係を有することを示した。試験したシード領域／ｍＲＮＡ標的二本鎖の算出範囲は−１０℃〜３６℃であるが、対応するΔＧ値は−１６〜−７ｋｃａｌ／モルである。これは、ΔＧ−１ｋｃａｌ／モル変化当たりＴｍが約５℃増大することを示す。ΔＧ値は、確立された式ΔＧ＝−ＲＴｌｎ（１／Ｋｄ）（式中、Ｔは２９８．１５Ｋである）を使用して、シード二本鎖の解離定数に変換することができる。結果は、最高ΔＧ値と最低ΔＧ値のシード／標的二本鎖間の解離定数に１０６倍差あることを示した。
高濃度（５０ｎＭ）で使用時、試験した２６ｓｉＲＮＡ化合物のすべてがシード領域依存性標的外効果を有したが、低用量（０．５ｎＭ）で使用時に標的外効果を有したのは２６中５（３５％）のみであった。これらのｓｉＲＮＡ化合物は領域ベース標的抑制５０％超に至るか５０％未満に至るかに基づき２群に分割した。高Ｔｍを有する２群に区別されたシード二本鎖の算出したＴｍ摂氏２１．５度は高いサイレンシング活性と正の相関関係を有すること（サイレンシング活性対Ｔｍの線形回帰分析においてｒ＝−０．７２）が見出された。この高値の相関関係は、驚くべきことに、試験した各ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ内へのアンチセンス鎖積み込みの有効性等の要因に関して異なると予想できるはっきり異なる化合物であったという事実を与える。
ｍｉＲＢａｓｅデータベース中７３３ヒトｍｉＲＮＡにおいて完全に同一方法で算出したシード二本鎖Ｔｍにおいて、それらの７５％値は摂氏２１．５度超であったことが示された。２０パーセントは摂氏４０度超であり、５％は１０度未満であった。実際、７３３中１３（２％）ではシード二本鎖Ｔｍ摂氏５０度超と算出された。
ｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲの至適化におけるこれらの熱力学パラメーター補助は、特定の内因性ｍｉＲＮＡシード配列に基づくかまたは新規シード配列に基づくｍｉＲＮＡ活性を生成する。それらが内因性ｍＲＮＡ由来のシード配列に基づく場合、サイレンスするｍＲＮＡタイプに関してそれぞれ全体のシード二本鎖Ｔｍを増大または低減することによって全体のサイレンシング活性値を増大または低減することができる。ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ内シード配列に対する相補性配列が様々である場合、かかる標的配列のシード配列の比較的親和性は、一部において高い親和性を有し、サイレンシング活性の所望パターンに基づく他において低い親和性を有するように調節することができる。Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ． （２００８）データに基づき、ｓｅｑＭｉＲまたはｓｓ−ＭｉＲシード配列およびそのｍＲＮＡ標的配列間のシード二本鎖親和性は、好ましくはＴｍ摂氏２１．５度超および／またはサイレンスされるそれらのｍＲＮＡΔＧ−１２未満であることが明らかであり、好ましくはＴｍ１５度未満およびサイレンスされないΔＧ−１１超である。
特定シード配列およびそのｍＲＮＡ標的配列（１つまたは複数）への結合親和性を調節する基礎は、相補塩基対親和性に影響を及ぼす。化学的修飾および本明細書において提供される他の修飾であるこれらのいくつかの修飾アプローチを表２に提供する。これらの修飾の使用は、他の熱力学考慮を含むｓｅｑＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲに適用する他のすべての設計規則も考慮しなければならない。アンチセンス鎖のシード領域は５’末端から数えて２〜８位ヌクレオシドに関与し、非対称規則は、適用時、５’末端から１〜４位ヌクレオシドに関与し、分枝変異型の場合は５’末端から１〜６位ヌクレオシドに関与する。重複ヌクレオシド位置に対するいずれの修飾も適合するように行わなければならない。別の例では、表３によって定義される領域３において比較的低い鎖間親和性が好ましい。これはまた、シード配列のそのｍＲＮＡ３’ＵＴＲ標的に対する親和性を亢進する任意の所望と潜在的に矛盾するアンチセンス鎖のシード配列に関与するｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖上に親和性嗜好も加える。
これらの潜在的な矛盾に対する解決策は、ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ標的配列の結合親和性を増大するシード配列への任意の修飾がｓｅｑＭｉＲ相手のセンス鎖との全体または局所鎖間親和性を比例的に増大しないようにｓｅｑＭｉＲ鎖を設計することである。例えば、１つもしくは複数のＬＮＡ修飾を、不適合、ＵＮＡ、脱塩基ヌクレオシドまたは相手のセンス鎖の対応領域で他の許容される親和性低減修飾によって補償されるアンチセンス鎖シード配列内で使用することができる。この補償タイプにて、親和性低減修飾は、結合相手または親和性増大修飾を有する結合相手と連続的なヌクレオシドのいずれかに関与することが好ましい。
Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８）によって使用されるシード配列、ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ配列、算出および実験的設計は、新規シード配列に基づくもの（すなわち、内因性ｍｉＲＮＡに見出されないもの）を含むｓｅｑＭｉＲ化合物の設計および検査の態様の例証に役立つように使用することができる。実施例に使用される特定の方法は、限定することを意味しないが、実践用に低減するｓｅｑＭｉＲ設計概念の一部を低減する１アプローチを示す。Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．から取り込まれたシード配列は市販価値をほとんど有さないが、それらは実際の事実における例を基礎に置くリアルデータを生成するために使用されている点で、実施例と同様に貴重である。同一の基本的アプローチを、ｓｅｑＭｉＲ化合物によってサイレンスする実際のｍＲＮＡタイプの３’ＵＴＲ指向である新規または内因性ｍｉＲＮＡシード配列と使用することができる。
図２Ａは、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８）由来データの一部を要約する。第１欄には、２６の異なるｓｉＲＮＡ化合物名を列挙する。次の２つの欄には、これらの各化合物に由来するシード配列および発現ベクター内に挿入するために構築されたシード配列に対する相補性を含む配列を列挙する。第４欄にはシード二本鎖の算出したＴｍを提供し、最終欄には、それを発現する細胞内にトランスフェクト時にｓｉＲＮＡに産生された発現ベクター生成物抑制パーセントを提供する。先に述べたように、シード二本鎖の高Ｔｍと高い標的抑制値間には強い正関関係がある。
これらのデータに基づく重要な観察点としては、下記が挙げられる：（１）シード二本鎖の結合親和性は、残りのｓｉＲＮＡ化合物の性質より標的抑制値のはるかに重要な決定因子であると思われるという事実；および（２）内因性ｍｉＲＮＡアンチセンス鎖由来の特異的なシード配列は、ｍｉＲＮＡ様サイレンシング活性を得るために必要ではない。したがって、二本鎖に関して重要と思われるものは、単に所望のアンチセンス鎖のＲＩＳＣ内積み込みに至る必要な特性を有していることである。実際、二本鎖構造において、ｍｉＲＮＡ様サイレンシング活性を得るためにｓｉＲＮＡ化合物と異なる内因性ｍｉＲＮＡ二本鎖の任意の特定の特徴を模倣することも必要ではない。
図２Ａに示す抑制データに基づく実験的設計は、容易に定量化できる生成物で遺伝子の発現ベクター使用の関与を生成した。Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．， （２００８）は、市販ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に挿入したＲｅｎｉｌｌａ ｌｕｃ遺伝子を使用した。図２Ａ欄３に示す、ヌクレオシド５’末端に対する８つのヌクレオシドストレッチ相補性を含む２１のヌクレオシド配列および連続的シード配列を３つの直列反復としてプラスミド内ｌｕｃ遺伝子の３’ＵＴＲ内プラスミド内に挿入した。挿入した標的配列内に残っている１３のヌクレオシドにおいて残りのｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相同性はなかった。評価に関与した２６のｓｉＲＮＡ化合物のそれぞれにおいてこれを反復した。図の欄１に掲載する。次いで、これらのプラスミドはトランスフェクトしたプラスミド内標的配列と適合するシード配列を有するｓｉＲＮＡ化合物で続いて処置したＨｅＬａ細胞内にトランスフェクトした。各種用量でｓｉＲＮＡのｌｕｃ遺伝子生成物抑制能を決定し、５．０ｎＭ用量における結果を図２表Ａ第５欄に示す。
図２Ｂは、ｓｅｑＭｉＲまたはｓｓ−ＭｉＲ化合物における使用のためシード配列の修飾における２つの可能な工程を例証する表を提供する。商業的に有用な化合物を産生する実際の実践において、シード配列は内因性ｍｉＲＮＡアンチセンス鎖に由来することもでき、内因性ｍＲＮＡタイプの特定の群を標的とするように設計された新規シード配列であることもできる。ヌクレアーゼ耐性を達成するために提供された基本的規則および他の本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則は、第１欄に示すシード配列に適用し、結果を第２欄に示す。シード配列内のほとんどの５’ヌクレオシド中の糖は、鎖内の最初の２つの連結部位の固有のヌクレアーゼ安定性に応じて、リボースまたは２’−フルオロであり得る。これは鎖内５末端ヌクレオシドを知らずには完全に決定できないため、全実施例は第１シード位置に２’−フルオロ修飾を有する。存在する場合、シード配列内ほとんどの３’ヌクレオシドに対する修飾、およびシード配列部分ではない連続的ヌクレオシドへのその連結性質は、連続的非シードヌクレオシドの性質に明確に依存する。この例証のため、図２Ｄに示す陰性対照二本鎖のいずれかが二本鎖ビヒクルとして使用される場合にこれは状況に適合するため、連続的ヌクレオシドはＧであると推定される。この状況を示すため、Ｇを図２Ｂ欄２の丸括弧内に示す。別の二本鎖ビヒクルが使用された場合、シード配列３末端を有する連続的ヌクレオシドはＵ、ＣまたはＡであり得る。図２Ｄに示すｓｉＲＮＡベース二本鎖ビヒクルの場合、連続的ヌクレオシドはＵである。欄３は、標的を有するシード配列のＴｍを実質的に増大するために加えることができる表２から選択される潜在的修飾例である。非修飾配列より増大した推定Ｔｍを欄４に示す。商業的に有用なｓｅｑＭｉＲ化合物を産生する実際の実践において、特定のかかる修飾は、存在する場合、意図されたｍＲＮＡタイプ群のサイレンシングを至適化するように調節される。
図２Ｃは、相補鎖のシード配列と一致するｓｅｑＭｉＲ化合物における使用のためのセンス鎖部分の修飾における２つの可能な工程を例証する表を提供する。ここで主要な目標は、ｓｅｑＭｉＲ化合物のセンス鎖およびアンチセンス鎖成分の局所および全体の親和性上の図２Ｂにおけるシード配列に行われた修飾を高める親和性効果を低減することである。実践における好ましいＴｍ低下値は、ｓｅｑＭｉＲベース二本鎖の正確な構造による。潜在的修飾例を欄３に示し、修飾センス鎖およびアンチセンス鎖間Ｔｍの推定低下を欄４に示す。この状況において親和性を低減する好ましい方法は不適合を誘発することであるため、ヌクレアーゼ耐性修飾は変異を有し得る。さらに、修飾が存在する場合、欄２のセンス鎖配列内ほとんどの３’ヌクレオシドおよびこのセンス鎖配列切片部分ではない連続的３’ヌクレオシド（図示せず）に対するその連結の性質は、連続的３’ヌクレオシドの性質によることができる。これは、センス鎖内にオーバーハング前駆体がある場合に生じる。その場合、エンドヌクレアーゼを保護するために必要とする規則を欄２に示すセンス配列３’末端に適用する。オーバーハング前駆体の不在下、次いで、オーバーハング前駆体の不在下で鎖の３’末端保護規則を使用する。これは、鎖はオーバーハング前駆体を有さないため、図２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄにおける実施例の場合である。その結果、２Ｃに示すセンス鎖配列は修飾ヌクレオシドで終わり、ホスホロチオエート連結によって連続的３’ヌクレオシド（図示せず）に接続されていなければならない。最後に、商業的に有用なｓｅｑＭｉＲ化合物を産生する実際の実践において、このセンス鎖の一部に対するかかる修飾は、挿入した所望のシード配列を有する完全二本鎖ビヒクルに適用時に特定の二本鎖ビヒクルおよび本明細書に提供される設計必要条件の完全相補体にすべく調節される。
図２Ｄは、かかる構造を使用するｓｅｑＭｉＲ化合物の設計特徴を例証するために使用される二本鎖ビヒクルの３例を提供する。これらの実施例は、複数の種（マウスおよびヒト等）ならびにｓｉＲＮＡ標的ヒトおよびマウスアポＢのための２つの確立された陰性対照に基づく。図示するように、これらの親化合物は、本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則（ＥおよびＦ項から）に準じて修飾されている。疑問符は、特異的な挿入配列の不在下で前ヌクレオシドおよび／またはその３’連結修飾を決定できない箇所を示す。各二本鎖ビヒクルは、触媒的ＡＧＯ２ベースサイレンシング活性を阻害することを意図したアンチセンス鎖内修飾を伴いおよび伴わず示される。これらの例において、これは、アンチセンス鎖５’末端から数えて１１位の脱塩基２’デオキシリボヌクレオシド配置によって具体的に例証される。実践においてＡＧＯ２触媒活性を阻害する手段は、鎖に予防的に行ってもよく、必要性が生じた場合にのみ行ってもよい。
選択されたシード配列に置換されている鎖の部分および対応センス鎖配列は下線である。図示するように、本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則と共にヌクレアーゼ耐性生成のための規則は、下線部分を除いて、二本鎖ビヒクルの鎖に適用する。選択したシード配列およびセンス鎖内対応配列を挿入してアーキテクチャを選択後、特定のｓｅｑＭｉＲ化合物の設計を完成し得る。この例証の目的におけるシード配列および対応センス鎖配列の例を図２Ｂおよび２Ｃによってそれぞれ提供する。陰性対照内への新規シード配列挿入は、標的外ＡＧＯ２触媒活性を有する化合物を生成する可能性がある。これが生じる場合、本明細書において提供される方法によって阻害できる。
商業的に有用なｓｅｑＭｉＲ化合物を産生する実際の実践において、潜在的二本鎖ビヒクルプールは、二本鎖がＲＩＳＣによる二本鎖の効率的積み込みおよび所望のアンチセンス鎖保持に至る本明細書において提供される設計基準を満たすことが可能な任意の二本鎖を含むことができる。二本鎖ビヒクル供給源としては、内因性ｍｉＲＮＡ二本鎖、従来のｓｉＲＮＡ化合物、およびｓｅｑＭｉＲ化合物での治療のための目的の対象種にとってのｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ陰性対照になるべく確立されている二本鎖が挙げられる。陰性対照は、選択されたシード配列および対応センス鎖配列を挿入後、意図しないｓｉＲＮＡベースサイレンシング活性の導入の欠如について再確認する必要がある。二本鎖ビヒクルによって生成する任意のＡＧＯ２ベース触媒サイレンシング活性は、アンチセンス鎖５’末端から数えて１０および／または１１位のヌクレオシドを、鎖による二本鎖形成を妨げることなくこの触媒活性を阻害する修飾ヌクレオシドと置換することによって阻害できる。この目的のための適切な修飾としては、脱塩基、ＵＮＡおよびＦＡＮＡが挙げられる。脱塩基ヌクレオシドは、本明細書において提供される、非固定変異型（すなわち、ＵＮＡ中の糖）、２−デオキシリボースおよびＦＡＮＡを含む任意の糖修飾を有することができる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
図２Ｅは、二量体を形成するアンチセンス鎖の使用に基づき別のｓｅｑＭｉＲ設計変異型を提供する。この変異型が異常である方法の１つは、ｓｅｑＭｉＲとして機能するが一本鎖のみを必要とする。この設計は、シード配列と相補性配列を、同一鎖中センス鎖およびアンチセンス鎖間で分離せずに両方置くことに関与する。
図２Ｅに示す例証的実施例において、２Ｂの表におけるシード配列番号１２（ｓｉＲＮＡ ＩＴＧＡ１０〜２８０３由来）および図２Ｃに示す対応するセンス配列部分を図２Ｄに示す第１二本鎖ビヒクルアンチセンス鎖内に置いた。センス鎖とすでに関連した配列配置は、センス鎖内で同位置となるアンチセンス鎖内に置かれる。これらのシードおよび対応センス鎖配列は、図２Ｅにおける最初の例証の下線である。
２つのものが図２Ｅから迅速に消失する：（１）アンチセンス鎖は二量体、より具体的にはそれ自体で二本鎖を形成する：ならびに（２）アンチセンス鎖はそれ自体でヘアピンも形成する。これらの要因はまたこの形態で設計された他の任意のｓｅｑＭｉＲにも当てはまる。非修飾２本の鎖二本鎖の算出した全体のＴｍは、生理食塩条件下で摂氏５８度、および最も近い近隣算出を使用して５０ｎＭ化合物濃度である。ヘアピンを支持する鎖の一部を介在する非対ループと共に示す。
この設計の２つの潜在的利点は、次のとおりである：（１）治療に使用しなければならないのは一本鎖のみである；および（２）ヘアピンはシード配列のヌクレアーゼを保護できる。結果、シード配列は、ヌクレアーゼ攻撃から保護するために化学修飾する必要がない。これにより、例えば、内因性ｍｉＲＮＡ由来のシード配列を化学修飾なしで使用することができる。この設計の短所は、二本鎖形態と一本鎖形態が入れ替わる二本鎖の二本鎖部分は腎臓により迅速に消失されるため、血行に効率的に投与できない点である。このアプローチは、血行内ではなく脳髄液、関節液、腹水および膀胱等の比較的静止した環境内に化合物が挿入される状況で最も有用である可能性が高い。本明細書において、二本鎖種は事実上、より効率的に細胞によって取り込まれ得る一本鎖種のための貯蔵所としての役目を果たす。
このアプローチは、小内的セグメント化ではなくアーキテクチャおよび５’末端オーバーハングがある非対称変異型と使用することができる。しかしながら、それらは同一であるので、どの鎖を積み込んだかが問題となるため、これらのアーキテクチャに適用する非対称規則を修飾しなければならない。したがって、この状況において、二本鎖末端間差動Ｔｍを低減する必要がある。しかしながら、４つのほとんどの末端ヌクレオシドが段階的な親和性を有し、最低親和性は２つのほとんどの末端ヌクレオシドに委ねられるという概念は保持される。ヌクレオシド５’末端はシード領域部分ではないため、シード二本鎖Ｔｍに対して効果のないヌクレオシド３’末端との不適合として構成することができる。これは、２末端位置におけるヌクレオシドの片方または両方がＧおよび／またはＣである場合に好ましい。シード配列ヌクレオシドのほとんどの５’も３’末端上の対応ヌクレオシドと不適合であり得るが、標的配列と不適合ではない。これは、シード配列が５’末端から最初の２位におけるＧおよびＣで開始する場合に好ましい。
鎖は、標的外効果を生成し得るＡＧ０−２触媒活性支持から阻害されることも好ましい。これは、鎖による二本鎖形成を予防せずこの触媒活性を阻害する修飾ヌクレオシドと５’末端からヌクレオシド１０および／または１１位を置換することによって到達できる。この目的のための適切な修飾としては、脱塩基、ＵＮＡおよびＦＡＮＡが挙げられる。脱塩基ヌクレオシドは、本明細書において提供される、非固定変異型（すなわち、ＵＮＡ中の糖）、２−デオキシリボースおよびＦＡＮＡを含む任意の糖修飾を有することができる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。局所鎖間親和性に影響を及ぼす設計規則はこの段落で論じたばかりであり、前段落も表３によって定義される領域１、２および３内の低い局所親和性の嗜好性を満たす。
図２Ｅにおける例証において、１０位におけるＡおよび１１位におけるＵは、０Ｄサブスクリプト（図１）によって示すように２’−デオキシリボヌクレオチドを脱塩基にさせる。２つの位置に関与するかかる修飾は、全体のＴｍを１０〜摂氏２０度低減し得る。必要な場合、わずかに長い鎖を使用することによっておよび／またはＴｍを増大する修飾を１つもしくは複数添加することによって、かかる低下を補償することができる。これは、開始Ｔｍ５８および他の修飾ヌクレオチドによって提供されるＴｍ増大を考慮すると、本実施例において必要ではない。また、化合物がＡＧＯ２触媒活性のために受容不能な標的外効果を生まない場合は必要ではない。
ｓｅｑＭｉＲセットに関して、一般に、全体および局所鎖間親和性に関して重要な熱力学考慮を損なわずにシード二本鎖Ｔｍを増大する修飾をシード配列に行うことができる。これは、この場合、同一鎖中のｓｅｑＭｉＲ鎖セット内シード配列に相補性の配列に補整変化を行うことによって達成される。鎖間またはアンチセンス鎖／標的親和性を高めるかまたは低減する様々な手段を表２に掲載する。
１つの具体例または多数の可能性のうちシード二本鎖のＴｍ増大を、図２Ｅにおける最終例証に示す。ここでＬＮＡ修飾を５’末端から数えて５および８位に使用する。これらは１１位のＵＯＤによっておよび１５位の不適合の使用によって補償される。１１位のＵＯＤは８位のＬＮＡの結合相手と連続的であり、１５位の不適合は５位のＬＮＡの結合相手である。これは、この補償タイプは結合相手または結合相手と連続的であるヌクレオシドのいずれかに関与することができることを例証する。
図２Ｆは、薬剤開発における潜在的適合性を有する内因性ｍｉＲＮＡから取り込まれたシード配列へのこれらの設計原理の適応例を提供する。Ｌｅｔ−７ファミリーメンバは抗癌遺伝子として作用することができ、１つまたは複数ファミリーメンバ値がいくつかの癌タイプにおいて抑制される。抑制されたファミリーメンバ（１つまたは複数）の実験的に増大した値が種々の抗癌効果を生むことが示されている。
図２Ｆに例証するシード配列は、複数メンバのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーおよび複数の種（ヒトおよびマウス等）に共通である。二本鎖ビヒクル中にこの配列および対応センス鎖配列を挿入することによって、複数のｌｅｔ−７ファミリーメンバの特徴を模倣することができるｓｅｑＭｉＲを構築することができる。さらに、標的ｍＲＮＡに対するこのシード配列の親和性は、サイレンシング活性の生成した増大と共に増大することができる。この５例を、センス鎖の対応領域における結合親和性能力低下の補整の５例と共に示す。
図２Ｇにおいて、これらの配列は、ｓｉＲＮＡからアポＢに基づく２Ｄに示す二本鎖ビヒクル中の適切な場所に挿入される。アンチセンス鎖は、任意の意図しないｍＲＮＡ標的に対するＡＧＯ２触媒活性ブロッキング例と共におよび本例なしで示される。さらに、アンチセンス鎖は、２オーバーハング単位前駆体と共に示される。これらは、オーバーハング前駆体項に提供されるもの、例えば、〜Ｕ〜Ｕまたは〜ｄＴ〜ｄＴから選択できる。
２Ｇに示すアンチセンス鎖に基づき一本鎖を形成する二量体の例を２Ｈに例証する。２Ｅに関連する本明細書に記載のように、一本鎖を形成するかかる二量体は、二量体型が腎臓により数分で消失され得る血行以外の対象中の区画（ＣＮＳ等）における使用に最も適している。
４．ｓｅｑＲＮＡｉ化合物の最小限の本質的な規則の概要：
ＥおよびＦ項に提供される本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則に加えて、本発明に準じた使用に適した最も基本的なｓｅｑＲＮＡｉ化合物のための最小限の熱力学必要条件がある。提供される独立したアーキテクチャは、下記の点で異なる：（１）それらが鎖中のオーバーハング前駆体（１つまたは複数）を規定するかどうか、および規定する場合、何単位あり、どこにあるか；ならびに（２）それらが、１本のセンス鎖および１本のアンチセンス鎖、または２本のセンス鎖および１本のアンチセンス鎖、または２本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖を同一のｓｅｑＲＮＡｉセットメンバとして規定するかどうか。ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖において、アーキテクチャを有することが明らかに必要である。熱力学点観点から、平滑末端アーキテクチャは、最小限のセットまたはｓｅｑＲＮＡｉセットのための規則の記載に関して最も平易である。これは、同一ｓｅｑＲＮＡｉセット内二本鎖センスまたはアンチセンス鎖は追加の熱力学考慮を必要とし、１単位より長いオーバーハングは、ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の鎖間結合親和性に影響を及ぼす可能性を有するためである。これは、オーバーハングが二本鎖上で折り畳まれるほど十分長く、それと相互作用する場合に生じ得る。しかしながら、オーバーハング効果は、典型的には主な懸念はなく、通常、設計考慮において無視することができる。したがって、ほぼすべての状態において、基準および非対称アーキテクチャ（３’末端オーバーハング前駆体のみを有する）は、示される規則に関して平滑末端アーキテクチャ以上に熱力学的複合体ではない。
これらの規定を考慮し、ｓｅｑＲＮＡｉ化合物のための最小限の必要条件は、平滑末端アーキテクチャの本質的／好ましい規則と共にＥおよびＦ項に提供される本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則を必要とする。この最も簡易な場合において、この長さは任意のオーバーハングを除く最も多い割合の従来のｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ化合物の長さと一致するため、鎖長は１９−ｍｅｒと推定される。アーキテクチャ依存性アルゴリズムは、本明細書において最も簡易な場合としてみなされない追加の熱力学考慮を有する規則を含む。最も簡易な場合における熱力学規則では、ｓｅｑＲＮＡｉセットは以下のとおり要約することができる：
表３によって、３つの領域の併合関与は、少数の関与するヌクレオシドにおいて補正時に全体の二本鎖のＴｍより低いＴｍを有することが好ましいセンス鎖に基づきｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖内３つの領域が明白に定義される。３つの領域はすべて、比較的低いＴｍを有することが好ましいが、それらは個別に妥当に信頼できるＴｍ決定には短すぎる。親和性調節は、これら明白に定義される領域の１本のセンス鎖部分内の親和性低減修飾の使用によって、および／またはセンス鎖内の介在領域の親和性を増大することによって到達できる。ｓｅｑＲＮＡｉ二本鎖の全体のＴｍが好ましい範囲を超える場合、親和性を低減する修飾の使用は全体のＴｍを低減し、好ましくは、表３によって明白に規定される１つまたは複数の領域に行われる。これらの目標達成に関与する一般的工程は、次のとおりである：
ａ． 表３によって明白に定義される３領域のための総括的な鎖間二本鎖Ｔｍおよび全体の二本鎖Ｔｍを、最も近い近隣算出を使用して非修飾鎖において決定する。
ｂ．次に、局所および全体のＴｍに対する化学修飾効果を、表２における情報を使用してヌクレアーゼ耐性および本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則の適応後に行われた修飾において調節する。
ｃ．最後に、表２における情報を使用して、必要に応じて併合した局所Ｔｍを低減する、および／または介在するＴｍを増大する。これらの修飾は可能な限り均等に分配すべきである。修飾はセンス鎖に行われる。
２）非対称規則を次に適用する。
ａ． 非修飾ＲＮＡ配列に基づく二本鎖４つのヌクレオシド各末端間Ｔｍは、次の方程式：Ｔｍ＝２（ｗＡ＋ｘＵ）＋４（ｙＧ＋ｚＣ）（式中ｗ、ｘ、ｙおよびｚは、４つのヌクレオシド二本鎖内の指定ヌクレオシド数である）を使用して推定される。
ｂ．表２を使用して、（１）に提供したばかりのヌクレアーゼ耐性、本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則および熱力学規則適応後にこれらのヌクレオシドおよび介在連結に適用する修飾に基づき全体の４つのヌクレオシド二本鎖Ｔｍ調節を行う。
ｃ．しかしながら、（ａ）および（ｂ）における決定は、あるものが末端から離れて移動時にヌクレオシドの重要性低下を考慮しない。これを簡単な方法で説明するため、４つのヌクレオシド二本鎖の全体のＴｍがアンチセンス鎖５’末端を含むものにおいて低く、この二本鎖の最も末端の２つのヌクレオシド対の親和性は、相手のヌクレオシドにおいて対応する対の他端の親和性より低いことが好ましい。末端ヌクレオシド対の片方もしくは両方のいずれかまたは末端４つのヌクレオシドの全体のＴｍで調節を行う必要がある場合、必要な修飾情報は表２から得ることができる。通常、修飾等級は必要な調節等級とアライメントするべきである。
ｄ．このタイプの主な親和性調節が順にある場合、不適合がＵＮＡおよび脱塩基において好ましく、それらはセンス鎖に行われる。
本明細書において提供される許容される鎖修飾のすべてが、鎖間またはアンチセンス鎖／標的親和性に対する影響に関して十分に特性決定されているわけではなく、それらは表２に出現しない。特性決定されているものは、典型的には、鎖内の位置で効果が変わる（例えば、末端位置では典型的には効果が低下する）および隣接鎖／二本鎖文脈の他の詳細によって効果が変わる。
ｓｅｑＲＮＡｉセット設計に対する次の最も基本的な考慮は、標的コードの本質的／好ましい規則添加に関与する。これらはｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲのアンチセンス鎖の中央領域ならびにｓｅｑＭｉＲのシード配列である。これらの規則は、それぞれ対応するｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ＭｉＲアンチセンス鎖にも適用される。
標的がマウスＰＴＥＮである図８およびｓｅｑＭｉＲ例がｌｅｔ−７ｉに基づく図９におけるｓｅｑｓｉＲＮＡ例（ｓｅｑＩＭｉＲは、標的ＲＮＡタイプのみ異なる同一の設計プロセスに従う）へのこれらの本質的な規則の適応。これらの図は、ｓｅｑｓｉＲＮＡ／ｓｅｑＩＭｉＲおよびｓｅｑＭｉＲ化合物の本質的な基本設計を例証する。標準実践において、熱力学規則の一部またはすべてを後の設計プロセスに残すことができる。
図８は、図６から３鎖を開始点として引き継ぐ。表３によって定義される３つの領域はセンス鎖における下線である。次に、併合した３つの領域の配列を併合介在領域に続いて示す。表４は、鎖の修飾調節を行うかまたは行わない全体の二本鎖ならびに併合した局所および併合した介在配列結果のＴｍ算出を提供する。表２は、Ｔｍに対する様々な修飾の推定効果を提供する。併合領域１〜３配列は１０のヌクレオシド長であり、前者のＴｍが比例的に低下するように、併合した介在配列は９ヌクレオシド長である。
Figure 2014519806
 ＊併合介在領域より長い長さを補償するために１０％低下
２つの併合領域の差動Ｔｍと全体のＴｍは共にさらなる修飾なしで好ましいパラメーター内にあることを表４に見ることができる。さらに、二本鎖の２つの末端のＴｍ算出は、非対称規則の必要条件を満たす。センス鎖５’末端を有する末端の算出したＴｍは２８度であり、これは修飾で３２度に増大し、他端の算出したＴｍは２０度であり、これは修飾で２２度に増大する。通常実践において、５’末端オーバーハングを有する小内的セグメント化または非対称アーキテクチャが設計の一部として選択されている場合、この時点で非対称規則は適用されない。
実施例においては最も簡易な場合が考慮されているため、図９は、オーバーハング前駆体が除去されている点を除き図７から３鎖を開始点として引き継ぐ。表３によって定義される３つの領域は、ウォッブル塩基対および除去されたアンチセンス鎖との不適合を有するセンス鎖バージョンの下線である。次に、併合した３つの領域の配列を併合介在領域に続いて示す。表５は、鎖の修飾調節を行うかまたは行わない全体の二本鎖ならびに併合した局所および併合した介在配列結果のＴｍ算出を提供する。表２は、Ｔｍに対する様々な修飾の推定効果を提供するために使用する。
データは、ＡＧＯ２積み込みにおいて予想される嗜好性があるように、全体の二本鎖の推定Ｔｍは高い（８２度）ことを示す。これは、このｓｅｑＭｉＲ化合物がさらなる修飾なしで標的外ｓｉＲＮＡ様活性を有し得る可能性を増大することができる。これが意図された市販目的において問題である場合、二本鎖の全体のＴｍを好ましい範囲に低減してもよく、アンチセンス鎖５’末端から１０および／または１１位におけるヌクレオシドは意図しないｍＲＮＡ標的（１つまたは複数）の直接的切断の実行からＡＧＯ２を阻害するように修飾してもよい。
データは、表３によって定義される３つの領域の併合Ｔｍは併合介在領域のＴｍより低いということも示す。したがって、この二本鎖はさらなる修飾なしでこの熱力学嗜好を満たす。
Figure 2014519806
図９はまた、それらの非対称規則との適合性の考慮において、各末端由来の４−ヌクレオシド二本鎖も提供する。センス鎖５’末端の算出したＴｍは修飾なしで摂氏１４度および修飾ありで１６度であり、他端のＴｍは、それぞれ１２度および１４度であることが示される。したがって、末端は、より広い非対称規則の必要性の一般コンプライアンスにあるが、末端からヌクレオシドの第２対は、末端における対において副至適状態であり、アンチセンス鎖５’末端は他端における対応する対より比較的高い親和性を有する。センス鎖５’末端を有する末端はすでにＧ：Ｃである４つ中３つのヌクレオシド対と高Ｔｍを有することから、他端内の第２対は、Ｃを置換するＡまたはＧを等しく十分に有することができるが、この実施例においてＧが選択される。ＡまたはＧ置換差はいずれも、よりヌクレアーゼ耐性の連結対導入に関して他より利点を提供しない。
Ｈ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−基準
１．詳細：
基準は、天然ｓｉＲＮアーキテクチャである。基準は、従来のｓｉＲＮＡ製造において一般に使用されるアーキテクチャでもある。このアーキテクチャは、両鎖３’末端上に化合物の二本鎖部分を超えて伸びるオーバーハングを招く１〜４のヌクレオシドまたはヌクレオシド置換の存在によって定義される。一般に、オーバーハングのヌクレオシドまたはヌクレオシド置換物数は２〜３であることが好ましい。
ｓｅｑＲＮＡｉアプローチにて、対象に送達される化合物は二本鎖ではなく一本鎖であるため、オーバーハングを有するかかる鎖について述べるのは無意味である。代わりに、それらはオーバーハング前駆体を有し、基準アーキテクチャ型の場合、両ｓｅｑＲＮＡｉ鎖はオーバーハング前駆体を有する。オーバーハング前駆体を除き、所定のｓｅｑＲＮＡｉセットの２本の鎖長は同一である。オーバーハング前駆体は、その名によって項により詳細に論じられる。
非対称規則は、基準アーキテクチャにおいて重要である。このおよび基準アーキテクチャに関連する他の熱力学考慮は、熱力学の項にてより詳細に考慮される。
例証的ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲ例に対する基準アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応をそれぞれ図１０および１１に提供する。
図８からセンス鎖およびアンチセンス鎖を図１０に導入された修飾開始点として引き継ぐ。後者の図は、基準アーキテクチャと一致する７本のセンス鎖変異型および３本のアンチセンス鎖変異型を例証する。任意のこれらのセンス鎖を任意のアンチセンス鎖と使用することができる。基準アーキテクチャによって必要とされる場合、両鎖タイプはオーバーハング前駆体と共に示される。これらは、その名によって項に記載される任意のものであり得る。例証のため、実施例におけるそれらは〜ＵＦ〜ＵＭと称し得る。単にオーバーハング前駆体を失うことによって平滑末端アーキテクチャに準じて同一鎖を使用することができる。
図１１は、図９から調節されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を引き継ぐ。ウォッブル塩基および保持された不適合を有するセンス鎖を使用することができたが、例証を簡潔化するために継続しない。基準アーキテクチャは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方上で３’末端オーバーハング前駆体を必要とする。例証において、２オーバーハング単位が、これが好ましい数であるために示される。単位および介在連結は、オーバーハング前駆体項に提供される任意のものであり得る。例証のため、実施例におけるそれらは〜ＵＦ〜ＵＭと称し得る。
２つの二本鎖は、ｓｉＲＮＡ様活性による意図しない標的外効果をｓｅｑＭｉＲセットにおいて低減することができる２つの主要な方法を例証することが示される。二本鎖の１つにおいて、全体のＴｍは摂氏６０度未満に低減する。１つの追加的不適合および１つの脱塩基ヌクレオシドを、非対称規則に準じてセンス鎖内に挿入した不適合に添加する。新規修飾は、表３によって明白に定義される領域１および２内である。これらは、Ｔｍ８２度をＴｍ６０度未満に低減する効果を有する。第２二本鎖内で、アンチセンス鎖５’末端から１１位は脱塩基ヌクレオシドに変換される。
２．ｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
ａ）鎖は、３’末端にオーバーハング前駆体単位を少なくとも１つ有することを必要とする。
ｂ）別段既定のない限り、鎖は、表３によって明白に定義される３つの領域の１つまたは複数において１領域当たり１つの修飾を有することができ、修飾はアンチセンス鎖内の相手の（対向）ヌクレオシドと不適合のヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ＵＮＡおよびＡＮＡからなる群から選択される。ＵＮＡが領域１に使用される場合、表に許容される５’末端から最も下流位置にあることが好ましい。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
ｃ）（ｂ）に記載したばかりの修飾の１つが領域２に使用される場合を除き、以下が好ましい：鎖が二本鎖である場合にアンチセンス鎖５’末端から１０および１１位と対向する２つのヌクレオシド位置がリン酸ジエステル連結によって結合され、アンチセンス鎖１１位と対向するセンス鎖内ヌクレオシドはリボースおよび２’−フルオロからなる群から選択され、ヌクレオシド１１位はリボース、２’−フルオロまたは２−０−メチルからなる群から選択される。したがって、例えば、センス鎖がいずれのオーバーハング前駆体も除いて１９−ｍｅｒである場合、センス鎖５’末端から９位はアンチセンス鎖対向１１位である。さらに、アンチセンス鎖の連結部位対向１０および１１位がそのように構成される場合、鎖がアンチセンス鎖との不適合をいずれも有さない二本鎖である場合に、４本のセンス鎖ヌクレオシドはアンチセンス鎖５’末端から９〜１２位の対向ヌクレオシドに位置することが好ましい。
ｄ）鎖が、３’末端オーバーハング前駆体単位を１つのみ有する場合、３’末端ヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換物、ならびに末端２つの連結は、本明細書の３’末端オーバーハングの項において提供され、オーバーハング前駆体の次のヌクレオシドは、２’−フルオロ、２’−０−メチルもしくは２’−デオキシリボース群から選択される。
ｅ）鎖が、少なくとも２つのヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換単位長である３’末端オーバーハング前駆体を有する場合、必要な３’末端エキソヌクレアーゼ保護は、本明細書に記載の３’末端オーバーハング設計によって提供される。
Ｆ）ヌクレオシド５’末端は、好ましくは、その５’リボース位置を内因性酵素によるリン酸化から予防するために、例えば、メチル化によって化学修飾されている。
ｇ）それらが生じる場合、ｍｉＲＮＡ様活性を促進するシード配列による望ましくない標的外サイレンシングは、意図しないｍＲＮＡ標的（１つまたは複数）との相互作用を阻害することができる３つの代替物の１つもしくは複数を使用して阻害することができる：（ｉ）以下の規定の１つもしくは両方を満たす：５’末端から２番目のヌクレオシドは、リボースまたは２−フルオロではなく２’−０−メチルであることが好ましい、ならびに／または５’末端から３〜７位のヌクレオシドの１つはＵＮＡもしくは脱塩基である。しかしながら、不安定化修飾は、アンチセンス鎖の中央領域に収まらない；（ｉｉ）シード配列に相補性の意図しないｍＲＮＡ標的部位（１つまたは複数）内標的配列がＵおよび／もしくはＧ含有ヌクレオシドを１つもしくは複数有する場合、シード配列はそれと標的配列間にＧ：Ｕウォッブル塩基対を少なくとも１つ生成するように調節することができる；または（３）シード配列内の非常に多数のヌクレオシドは２’デオキシリボヌクレオシドであり得る。しかしながら、鎖に相補性の内因性ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈベース分解を促進する可能性を有するため、５以上の連続２’−デオキシリボヌクレオシドの存在は勢いをそがれる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
３．ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内に適応可能である：
ａ）鎖は、３’末端に少なくとも１つだが４つ以下のオーバーハング前駆体単位を有することを必要とし、２単位が好ましい。
ｂ）鎖が、３’末端オーバーハング前駆体単位を１つのみ有する場合、３’末端ヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換物、ならびに末端２つの連結は、本明細書の３’末端オーバーハングの項において提供され、オーバーハング前駆体の次のヌクレオシドは、２’−フルオロ、２’−０−メチルもしくは２’−デオキシリボース群から選択される。
ｃ）鎖が、少なくとも２つのヌクレオシドもしくはヌクレオシド置換単位長である３’末端オーバーハング前駆体を有する場合、必要な３’末端エキソヌクレアーゼ保護は、本明細書に記載の３’末端オーバーハング設計によって提供される。
４．ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
それらが生じる場合、ｍｉＲＮＡ様活性を促進するシード配列による望ましくない標的外サイレンシングは、意図しないｍＲＮＡ標的（１つまたは複数）との相互作用を阻害することができる２つの代替物の１つを使用して阻害することができる：（ｉ）以下の規定の１つもしくは両方を満たす：５’末端から２番目のヌクレオシドは、リボースまたは２−フルオロではなく２’−０−メチルであることが好ましい、ならびに／または５’末端から３〜７位のヌクレオシドの１つはＵＮＡもしくは脱塩基である；または（ｉｉ）シード配列に相補性の意図しないｍＲＮＡ標的部位（１つまたは複数）内標的配列がＵおよび／もしくはＧ含有ヌクレオシドを１つもしくは複数有する場合、シード配列はそれと標的配列間にＧ：Ｕウォッブル塩基対を少なくとも１つ生成するように調節することができる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
５．ｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
特に、それらの相手鎖と摂氏６０度超の全体のＴｍを生成する鎖において、アンチセンス鎖による内因性ＲＮＡ標的指向性の任意のＡＧＯ２触媒活性は阻害されることが好ましい。これは、アンチセンス鎖５’末端から１０および／または１１位ヌクレオシドにある修飾を行うことによって到達できる。既知の標的に対する標的外活性を避けるべきである場合、標的と不適合の指定ヌクレオシドの片方または両方を作製することによって到達できる。この状況において、単一のＡ：Ｃ不適合がないことが好ましい。任意のＡＧＯ２ベース触媒サイレンシング活性は、ヌクレオシド１０および／または１１位を、鎖による二本鎖形成を予防せずこの触媒活性を阻害する修飾ヌクレオシドと置換することによって阻害できる。この目的のための適切な修飾としては、脱塩基、ＵＮＡおよびＦＡＮＡが挙げられる。脱塩基ヌクレオシドは、本明細書において提供される、非固定変異型（すなわち、ＵＮＡ中の糖）、２−デオキシリボースおよびＦＡＮＡを含む任意の糖修飾を有することができる。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
６．ｓｅｑｓｉＲＮＡベースおよびｓｅｑＩＭｉＲベース二本鎖に適応可能である：
全体のＴｍは、生理的条件下で、少なくとも５５、好ましくは少なくとも６５度であるが、好ましくは摂氏約９５度未満である。全体のＴｍの調節手段を熱力学の項に示す。
７．ｓｅｑＭｉＲベース二本鎖に適応可能である：
アンチセンス鎖がＲＩＳＣ内等に積み込み時にｍＲＮＡに対してＡＧＯ２を直接的触媒活性を有することから予防するように修飾されていない限り、全体のＴｍは、生理的条件下で、少なくとも４５、好ましくは摂氏６０度未満である。後者の場合、全体のＴｍの６０度への制限が好ましいことは除外される。
Ｉ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−平滑末端
１．詳細： 所定ｓｅｑＲＮＡｉセットにおけるセンス鎖およびアンチセンス鎖長は同一であり、３’末端オーバーハング前駆体を有さない。非対称規則は、平滑末端アーキテクチャにおいて重要である。このおよび平滑アーキテクチャ関連の他の熱力学考慮は、熱力学の項にてより詳細に考慮される。オーバーハング前駆体のない場合を除き、例証的ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲに対する平滑末端アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応は、それぞれ図１０および１１に例証する基準と同一である。
２．ｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
ａ）エキソヌクレアーゼ攻撃からの必要な３’末端保護は、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース群から個別に選択される２つの末端ヌクレオシドの使用によって提供でき、末端２つの連結はホスホロチオエートである。しかしながら、３’末端２’−フルオロ修飾を有する鎖の収率は、現行製造法では低減する場合があるため、この位置におけるこの修飾は好ましくない。
ｂ）他の観点では、オーバーハング前駆体を有さない鎖を除き基準アーキテクチャ規則を本明細書に適用する。
３．ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である
ａ）エキソヌクレアーゼ攻撃からの必要な３’末端保護は、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース群から個別に選択される２つの末端ヌクレオシドの使用によって提供でき、末端２つの連結はホスホロチオエートである。しかしながら、３’末端２’−フルオロ修飾を有する鎖の収率は、現行製造法では低減する場合があるため、この位置におけるこの修飾は好ましくない。
ｂ）他の観点では、オーバーハング前駆体を有さない鎖を除き基準アーキテクチャ規則を本明細書に適用する。
４．ｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
ａ）エキソヌクレアーゼ攻撃からの必要な３’末端保護は、２’−フルオロ、２’−０−メチルまたは２’−デオキシリボース群から個別に選択される２つの末端ヌクレオシドの使用によって提供でき、末端２つの連結はホスホロチオエートである。しかしながら、３’末端２’−フルオロ修飾を有する鎖の収率は、現行製造法では低減する場合があるため、この位置におけるこの修飾は好ましくない。
ｂ）他の観点では、オーバーハング前駆体を有さない鎖を除き基準アーキテクチャ規則を本明細書に適用する。
Ｊ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−非対称
１．詳細：
ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内は、５’もしくは３末端または両端で１〜４単位オーバーハング前駆体を有するが、同一セット内センス鎖はオーバーハング前駆体を有さない。３’末端オーバーハング前駆体を有するアンチセンス鎖に関して、センス鎖５末端を有する末端ヌクレオシドは、好ましくはオーバーハング前駆体と連続的であるアンチセンス鎖内３’末端ヌクレオシドと対をなす。ほとんどの鎖配列において、オーバーハング前駆体はアンチセンス鎖３’末端のみで生じることが好ましい。３’末端オーバーハング前駆体のみがある場合、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド置換物数は２〜３であることが好ましい。５’末端オーバーハング前駆体も残鎖に適用する同一規則に準じ、他の規則に準じ得る３’末端オーバーハング前駆体を救う。オーバーハング前駆体は、その名によって項により詳細に論じられる。
アンチセンス鎖が５’末端オーバーハング前駆体を有さない場合、非対称規則を非対称アーキテクチャに準じて設計されたｓｅｑＲＮＡｉ鎖セットに適用する。非対称アーキテクチャが３’末端オーバーハング前駆体を伴うまたは伴わない５’末端オーバーハング前駆体を提供する場合、アンチセンス鎖選択のための非対称規則基礎の重要性は無効である。その結果、意図されたセンス鎖の除去およびＲＩＳＣによって意図されたアンチセンス鎖の保持における有効値に影響を及ぼす他の要因の重要性は、例えば、特に表３によって明白に定義される領域の鎖間親和性低下の誘発によって、特に領域２内の他の鎖間領域と比較して増す。これらおよび非対称アーキテクチャ関連の他の熱力学考慮は、熱力学の項にてより詳細に考慮される。
それゆえ、すべての非対称アーキテクチャの３つの形態は、３’末端オーバーハング前駆体を有するか有さないかという点のみ異なる本質的に同一アンチセンス鎖を有する。許容される基準または平滑末端アンチセンス鎖は、非対称アーキテクチャに簡単に置き換えられることができる。非対称アーキテクチャに使用されるセンス鎖は、二本鎖形成時に平滑末端アーキテクチャから簡単に置き換えられるかまたは３’末端で短縮されて相手のアンチセンス鎖内５’末端オーバーハング前駆体を生成するかのいずれかである。センス鎖がこのようにして切断される場合、表３に規定する領域１および２のＴｍは、結果が好ましい範囲未満にまで全体の鎖間Ｔｍを低減しない限り、残鎖より比較的低いことが特に好ましい。この場合、このセンス鎖が３’末端で切断されている場合でも、領域１および２の位置は、平滑末端センス鎖長に基づく。
したがって、センス鎖が３’末端で短縮される場合のみを例証する図１２および１３におけるｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲセットを示すことのみ必要である。使用される具体例において、３つのヌクレオシド分短縮される。３’末端オーバーハングのいずれかを有するものとしてまたはセンス鎖５’末端を有する平滑末端としてアンチセンス鎖相手を例証する。３’末端が修飾されている場合、適切な変更はヌクレアーゼ耐性および本質的／好ましいアーキテクチャ独立規則に準じるように行われている。
２．５’末端オーバーハング前駆体なしでアンチセンス鎖と対をなすｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
平滑末端アーキテクチャと同一の規則を使用する。
３．３’末端オーバーハング前駆体を伴うまたは伴わない５’末端オーバーハング前駆体と共にアンチセンス鎖と対をなすｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
ａ）は、セット内アンチセンス鎖より少なくとも１３のヌクレオシド長かつ６つ以下のヌクレオシド長短い。３’末端は３つ以下のヌクレオシド分短縮され、５’末端は短縮されないことが好ましい。
ｂ）別段既定のない限り、鎖は、表３によって明白に定義される３つの領域の１つまたは複数において１領域当たり１つの修飾を有することができ、修飾はアンチセンス鎖内の相手の（対向）ヌクレオシドと不適合のヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ＵＮＡおよびＡＮＡからなる群から選択される。ＵＮＡが領域１に使用される場合、表に許容される５’末端から最も下流位置にあることが好ましい。脱塩基ヌクレオシドは好ましくは、ホスホロチオエート連結によって隣接ヌクレオシドに結合している。
４．ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：３’末端オーバーハング前駆体があるかどうかに応じて、基準または平滑末端アーキテクチャと同一の規則を使用する。
５．ｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
３’末端オーバーハング前駆体があるかどうかに応じて、基準または平滑末端アーキテクチャと同一の規則を使用する。
Ｋ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−分枝変異型
１．詳細：
分枝変異型アルゴリズムは、重要であるそれらのｓｅｑＲＮＡｉアーキテクチャにおいて非対称規則を満たす最も根本的な解決策である。したがって、その使用は、これらのアーキテクチャの補助的な変異型であることに限定される。二本鎖末端間の非対称が非常に所望され、本発明に従いヌクレアーゼ耐性を達成するために使用される化学修飾タイプを使用することによって補正できないものと対向するｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成する鎖に適用する。代わりに、センス鎖内２〜６不適合間導入によって、そうでなければ相補性アンチセンス鎖５’末端を有するセンス鎖３’末端で末端６つのヌクレオシドの一部またはすべての間で相補塩基対を遮断することに関与する。したがって、分枝変異型は、表３によって規定される領域２および３間で不安定化修飾が好ましくない一般規則の例外である。具体的な熱力学考慮は、その名によって項により詳細に論じられる。
例証的ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲ例に対する分枝変異型アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応をそれぞれ図１４および１５に提供する。
図１４は、図１０から基準アーキテクチャセンス鎖およびアンチセンス鎖を引き継ぐ。図８の議論において、いずれの添加修飾もなく非対称規則に十分役立つｓｅｑｓｉＲＮＡマウスＰＴＥＮ化合物における末端二本鎖差動Ｔｍを指摘した。それにも関わらず、分枝変異型の中等度の適応はこのこれらの高度に関連した化合物の活性をさらに亢進することができることが考えられる。したがって、センス鎖の１４位におけるＡＲおよび１６位におけるＣＲは、それぞれＣＭおよびＧＲに変化する。
図１５は、非対称規則が適応可能であるアーキテクチャ例として基準アーキテクチャを使用する図１１から２つの二本鎖を引き継ぐ。これら二本鎖は、図９における非対称規則において調節済みであるが、２つの末端間差動がより大きいことよりさらに利点であり得ることが考えられる。したがって、第２不適合を５’末端から数えてセンス鎖１７位内に導入する。
２．特に所定の二本鎖があまり根本的ではない手段によって補正される規則を有するアライメントからずれ過ぎている場合に非対称規則が重要であるアーキテクチャを有する相手鎖とｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成するｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
アンチセンス相手鎖５’末端中対応ヌクレオシドを有するセンス鎖３’末端（いずれのオーバーハング前駆体も除く）で末端６つのヌクレオシドの一部またはすべての間の相補塩基対は、センス鎖内２〜６不適合間導入によって中断される。
Ｌ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−小内的セグメント化
１．詳細：
このアーキテクチャのより一般的形態は、単一アンチセンス鎖に相補性である２つの短いセンス鎖の使用を特徴とする。ｓｅｑＭｉＲの場合、この配置は逆であり得る、すなわち、単一センス鎖に相補性である２つの短いアンチセンス鎖があり得る。いずれかの場合において、これらの短鎖は、相手鎖とｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時に２つ以下のヌクレオシド位置により分離される。短鎖は、相手鎖と二本鎖形成時に迅速に連続することが好ましい。これは、そうでなければ単一のｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖である１連結を単に略すことによって到達できる。
さらに、短鎖の対向末端は相手鎖と二本鎖内に出現時、それらがｉｎ ｖｉｖｏで結紮される可能性を予防するように修飾できる。しかしながら、この発現の可能性は確立されていない。ＲＮＡ結紮の可能性を予防する１つの方法は、それらが相手鎖と二本鎖を形成時に逆脱塩基残基（３’−２’または３’−３’等）を対向末端の１つで使用するかまたは短鎖間に１つもしくは２つのヌクレオシド分離を有する。
ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲにおけるより一般的な使用において、このアーキテクチャは、所望のセンス鎖がアンチセンス鎖としてＲＩＳＣ内に積み込まれる可能性を本質的に除去する効果を有する。ｓｅｑＭｉＲの場合、２つの短いアンチセンス鎖の使用は、ｍＲＮＡ標的認識に対する３’補足部位の任意の関与を除去することができる。例えば、３’補足部位がそうでなければ使用される例において、認識された標的範囲を限定するために、特に限定が望ましくない標的数を減らす場合にこのアプローチを使用することができる。
短いサイズの２つのセンスまたはアンチセンス鎖は、得られた二本鎖が効率的に安定しない点まで相手鎖と親和性を低減することができる。しばしば、これは、それらと完全長相手鎖間で親和性を増大する上で特に有効であるセンス鎖（１つまたは複数）修飾を慎重に使用することによって補償することができる。熱力学考慮は、その名によって項により詳細に論じられる。
例証的ｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＭｉＲ例に対する小内的セグメント化アーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応をそれぞれ図１６および１７に提供する。
図１６に示す小内的セグメント化アーキテクチャの適応における開始２本のセンス鎖および３本のアンチセンス鎖は、図１０由来である。オーバーハング前駆体が存在するかしないかに関してのみ異なるセンス鎖をヌクレオシド９および１０位間連結を除去することによって２本の鎖に分割した。次に、ヌクレアーゼ耐性規則を２つの新規末端に適用した。最も近い近隣算出を使用し、続いて化学修飾を調節してこれら二本鎖センス鎖の各Ｔｍを決定した。アンチセンス鎖３’末端またはアンチセンス鎖５’末端と二本鎖を形成するセンス鎖の最終Ｔｍはそれぞれ５１度および３４度であった。第２センス鎖の下限を４０度超としてＴｍを同等にするため、第２センス鎖５’末端から数えて４および７位にＬＮＡ修飾を使用した。
図１７において、このアーキテクチャの適応における開始センス鎖は、図９において除去されたウォッブル塩基対および不適合を有するセンス鎖である。設計が隆起構造（１つまたは複数）を有する内因性ｍｉＲＮＡで開始した場合、この構造も小内的セグメント化アーキテクチャの適応開始時に除去される。２本のアンチセンス鎖は図１１由来である。これらの鎖の１つは、ＡＧＯ２触媒活性を阻害する修飾を有するが、他は有さない。
センス鎖を、＆で示すように１０位と１１位間で分離する。非修飾二本鎖センス鎖において算出したＴｍは、一本鎖５’末端および３’末端を有する鎖でそれぞれ３２または３９および４２度である。前者単一センス鎖５’末端を有するセンス鎖における代替的Ｔｍの基礎は、アンチセンス鎖内脱塩基ヌクレオシドの存在（二本鎖＃１）または不在（二本鎖＃２）である。各センス鎖内３’末端ヌクレオシドは修飾され、ホスホロチオエート連結はヌクレオシド８〜９位と９〜１０位間で添加される。これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性規則および二本鎖内で許容されない化学に基づくオーバーハング前駆体を有さない末端ヌクレオシド内２’−０−メチル修飾嗜好で保持される。アンチセンス鎖内５末端ヌクレオシドは、相補性ヌクレオシド対の両メンバにない２’−０−メチル嗜好を満たすように２’−フルオロへ変化する。化学修飾は、相手のアンチセンス鎖を有する各センス鎖のＴｍを約５度添加する。２本のセンス鎖のＴｍを増大するため、２つのＬＮＡ修飾を第１鎖に添加し、１つのＬＮＡ修飾を第２鎖に添加する。
図１７におけるアンチセンス鎖の１０〜１１連結での２本の鎖への分離は、それぞれの場合の欠失連結が他と対向するため、二本鎖センス鎖における基本的Ｔｍ算出を変えない。二本鎖３における単一センス鎖は同一のＬＮＡ修飾を有し、末端３’位でのＡＭのＡＦへの置換および１１位におけるＵＦのＵＭへの置換はアンチセンス鎖内相補性ヌクレオシドの変化を収容する。ヌクレアーゼ耐性規則保持において、１０位におけるＡは２’−０−メチルになり、１１位におけるＧは２’−フルオロになり、ホスホロチオエート連結は単一アンチセンス鎖数に基づく８〜９位と１１〜１２位間に挿入される。
２． ２本のセンス鎖が使用される場合にｓｅｑＲＮＡｉセンス鎖に適応可能である：
ａ）それらが相手のアンチセンス鎖とｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時に、それらは連続的であることが好ましい、２つ以下のヌクレオシド位置により分離される２本のセンス鎖があることを必要とする。ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時に対向する２つの末端の１つでヌクレオシドを置換するために逆脱塩基残基（３’−２’または３’−３’等）を使用することができる。
ｂ）鎖の配列およびそれらの化学修飾は、相手のアンチセンス鎖を有する各鎖のＴｍを決定する。これらの要因は、生理的条件下でアンチセンス鎖を有する各センス鎖の最小Ｔｍ摂氏４０度に至らなければならず、５０〜６５度を有することが好ましい。最大数度のみ離れている相手のアンチセンス鎖を有する各センス鎖Ｔｍも好ましい。
ｃ）必要に応じて、生理的条件下でｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を安定させるために、片方または両方のセンス鎖内でＬＮＡ（１つまたは複数）を１本鎖当たり最大３つ使用することができる。（１）所定鎖内に２つまたは３つのＬＮＡがある場合、ＬＮＡ修飾を有さないヌクレオシドの少なくとも１つによってそれらが分離すること；（２）ＬＮＡが鎖５’末端の第１位にないこと；（３）塩基がウラシルである場合にそれらが３’末端位にないこと；ならびに（４）２本のセンス鎖を、好ましくは表３によって明白に定義される３つの領域間に置かれる単一の単位ＬＮＡとして考慮すること、が好ましい。
ｄ）問題のヌクレオシドがウラシル塩基を有し、それがアンチセンス鎖内アデニン含有ヌクレオシドと相補塩基対を形成する場合、２−チオウリジン含有ヌクレオシドをＬＮＡの代わりに使用して鎖間結合親和性を亢進することができる。かかる場合において、このヌクレオシド中の糖に対する任意の修飾の性質は本明細書に提供する関連アーキテクチャ独立規則に準じる。
ｅ）アンチセンス鎖５’末端との相補塩基対をなすセンス鎖は、オーバーハング前駆体を有することができる。
３． ２本のセンス鎖が使用される場合にｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内に適応可能である：
５’および／または３’末端オーバーハング前駆体が存在するかしないかに応じて、基準の平滑末端または非対称アーキテクチャ関連規則に準じることができる。２〜３単位３’末端オーバーハング前駆体が好ましい。
４． ２本のセンス鎖が使用される場合にｓｅｑｓｉＲＮＡおよびｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
５’および／または３’末端オーバーハング前駆体が存在するかしないかに応じて、基準の平滑末端または非対称アーキテクチャ関連規則に準じることができる。
５． ２本のセンス鎖が使用される場合にｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
５’および／または３’末端オーバーハング前駆体が存在するかしないかに応じて、基準の平滑末端または非対称アーキテクチャ関連規則に準じることができる。
６． ２本のアンチセンス鎖が使用される場合にｓｅｑＭｉＲセンス鎖に適応可能である：
ａ）鎖の配列およびそれらの化学修飾は、相手のアンチセンス鎖を有する各鎖のＴｍを決定する。これらの要因は、生理的条件下でセンス鎖を有する各アンチセンス鎖の最小Ｔｍ摂氏４０度に至らなければならず、５０〜６５度を有することが好ましい。最大数度のみ離れている相手のセンス鎖を有する各アンチセンス鎖Ｔｍも好ましい。
ｂ）必要に応じて、生理的条件下でｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を安定させるために、片方または両方のセンス鎖内でＬＮＡ（１つまたは複数）を１本鎖当たり最大３つ使用することができる。（１）所定鎖内に２つまたは３つのＬＮＡがある場合、ＬＮＡ修飾を有さないヌクレオシドの少なくとも１つによってそれらが分離すること；（２）ＬＮＡが鎖５’末端の第１位にないこと；（３）塩基がウラシルである場合にそれらが３’末端位にないこと；ならびに（４）２本のセンス鎖を、好ましくは表３によって明白に定義される３つの領域間に置かれる単一の単位ＬＮＡとして考慮すること、が好ましい。
ｃ）問題のヌクレオシドがウラシル塩基を有し、それがアンチセンス鎖内アデニン含有ヌクレオシドと相補塩基対を形成する場合、２−チオウリジン含有ヌクレオシドをＬＮＡの代わりに使用して鎖間結合親和性を亢進することができる。かかる場合において、このヌクレオシド中の糖に対する任意の修飾の性質は本明細書に提供する関連アーキテクチャ独立規則に準じる。
ｄ）ヌクレオシド５’末端は、好ましくは、その５’リボース位置を内因性酵素によるリン酸化から予防するために、例えば、メチル化によって化学修飾されている。
ｅ）他の観点では、センス鎖は、オーバーハング前駆体を有するか有さないかに応じて、基準または平滑末端アーキテクチャの設計に従う。
７．２つが使用される場合にｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適応可能である：
ａ）それらが相手のセンス鎖とｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時に、２つ以下のヌクレオシド位置により分離される２本のアンチセンス鎖があることを必要とするそれらは連続的であることが好ましい。ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖形成時に対向する２つの末端の１つでヌクレオシドを置換するために逆脱塩基残基（３’−２’または３’−３’等）を使用することができる。
ｂ）そうでなければ、３’末端オーバーハング前駆体が存在するかしないかに応じて基準または平滑末端アーキテクチャ関連の規則に準じることができる。
Ｍ．アルゴリズム：アーキテクチャ依存性−ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内ベースｓｓ−ＲＮＡｉ
１．詳細：
ｓｅｑＲＮＡアンチセンス鎖内ベースｓｓ−ＲＮＡｉは、３つの一般的特徴を有する：（１）担体またはプロドラッグ設計なしで対象に投与することができる；（２）相補性相手のセンス鎖は、両鎖を対象の細胞内で組み合わせることができる時間枠を超えて同一対象に投与しない；および（３）それは、対象中細胞内の意図されたサイレンシング効果を生む。かかるアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がＲＩＳＣ内に積み込み時に、ｍｉＲＮＡ模倣、ｍｉＲＮＡ阻害剤またはｓｉＲＮＡとして機能するかどうかに応じて、３つの具体的なバージョン：ｓｓ−ＭｉＲ、ｓｓ−ＩＭｉＲおよびｓｓ−ｓｉＲＮＡに生じる。
例証的ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよびｓｓ−ＭｉＲ例に対するｓｓ−ＲＮＡｉアーキテクチャ依存性アルゴリズムの適応をそれぞれ図１８および１９に提供する。
図１８は、図１０に示すアンチセンス鎖がｓｓ−ｓｉＲＮＡ使用をいかに調節することができるかを示す。
図１９は、予防的に防止された潜在的ＡＧＯ２触媒活性を有するおよび有さない、標的に対するシード配列の結合親和性を増大する修飾を有するおよび有さないｌｅｔ−７ｉに基づくｓｓ−ＭｉＲのいくつもの変異型例を示す。開始鎖は、基準アーキテクチャの適応を例証する図１１におけるアンチセンス鎖に由来した。
３．ｓｓ−ＲＮＡｉに適応可能である
ａ）５’末端ヌクレオシドは、５’リボース位置でリン酸化されている。
ｂ）鎖は１６〜２０ヌクレオシド長であり、２〜３単位のオーバーハング前駆体を有し、全長１８〜２３であることが好ましい。ＲＩＳＣのＰＡＺドメインにおいて、比較的高い親和性を有するオーバーハング前駆体が最も好ましい。これらは、意図されたサイレンシング活性期間を延ばす能力によって区別することができる。
４．ｓｓ−ｓｉＲＮＡおよびｓｓ−ＩＭｉＲに適応可能である：
ヌクレアーゼ耐性規則、本質的／好ましいアーキテクチャ的独立規則ならびにｓｅｑｓｉＲＮＡ／ｓｅｑＩＭｉＲアンチセンス鎖に適した基準もしくは平滑末端規則を適用する。しかしながら、２’−フルオロ修飾が他の修飾より好ましく、リボースを保ち、存在する場合はオーバーハング前駆体を保つ。次の２つの例外がある：（１）必要な場合、任意の受容不能な先天性免疫反応の活性化を低減するために最少の２’−０−メチル修飾を使用すること；ならびに（２）シード領域におけるＵＮＡおよび／もしくは５’末端から２位における２’−０−メチルを使用してｍｉＲＮＡ様標的外効果を阻害すること。
５．ｓｓ−ＭｉＲに適応可能である：
ヌクレアーゼ耐性規則、本質的／好ましいアーキテクチャ的独立規則ならびにｓｅｑＭｉＲアンチセンス鎖に適した基準もしくは平滑末端規則を適用する。しかしながら、２’−フルオロ修飾が他の修飾より好ましく、リボースを保ち、存在する場合はオーバーハング前駆体を保つ。次の３つの例外がある：（１）必要な場合、最少の２’−０−メチル修飾を使用して、任意の受容不能な先天性免疫反応の活性化を低減すること；（２）シード配列内修飾（ＬＮＡ等）を使用してシード二本鎖Ｔｍを増大すること；および（３）意図しないＲＮＡ標的に対してＡＧＯ２触媒活性を阻害する本明細書において供給される修飾を使用すること。
Ｎ．オーバーハング前駆体
天然ｓｉＲＮＡ内オーバーハングは、典型的には標的ＲＮＡに相補性である。しかしながら、オーバーハングは、存在する場合、標的認識における役割をほとんど果たさないと思われる。合成化合物のための最も古く、最も使用された従来のｓｉＲＮＡアーキテクチャ（基準）は、両鎖上２つのデオキシチミジン３’末端オーバーハング（ｄＴｄＴ）を有する１９−ｍｅｒ二本鎖からなる。これらのオーバーハングは利便性および安価のために選択された。体液中３’末端エキソヌクレアーゼから保護するヌクレアーゼ耐性連結は、オーバーハング内ヌクレオシドを一般的に結合する。
当初、オーバーハングは全細胞タイプ内ｓｉＲＮＡ活性を必要とし、それらは活性に影響を及ぼさずに任意の天然リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドからなり得ると考えられた。それは続いて、平滑末端アーキテクチャを有するｓｉＲＮＡは、意図された標的に対して実質的なサイレンシング活性を産生可能であることが示された場合、３’末端オーバーハングは哺乳動物細胞内ｓｉＲＮＡ活性を必要としなかったことが見出された。
内因性ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体プロセシング中に生成した３’末端オーバーハングを有し、ＲＩＳＣ積み込みする準備ができている二本鎖ｍｉＲＮＡになる。ｓｉＲＮＡに関して、ｍｉＲＮＡ内オーバーハングは標的認識に関与しない。代わりに、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ内アンチセンス鎖３’末端オーバーハングは、標的転写物との相互作用を予防する形でＲＩＳＣのＲＮＡ結合ポケット内ＰＡＺドメインと相互作用することが示されている。この相互作用の結果、この３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣ積み込みおよびアンチセンス鎖保持に影響を及ぼすことができる。
オーバーハング設計および化学におけるバリエーション、ならびにオーバーハングを使用しない選択肢を商業的に有用な方法において、ｓｅｑＲＮＡｉ化合物の活性を調節するため使用することができる。例えば、癌を他の治療（典型的にはアポトーシスを阻害する標的分子）に対して感作するｓｅｑＲＮＡｉ治療は、かかる感作の産生に必要とされる比較的短期間に活性であることのみを必要とする。かかる効果持続期間を限定することによって、一部の潜在的副作用は低減し得るかまたは除去し得る。一方、慢性疾患（糖尿病等）または心疾患（アテローム性動脈硬化症等）処置時、それは比較的長いサイレンシング効果を生む構造ｓｅｑＲＮＡｉ鎖に一般に有利である。さらに、特定のオーバーハング前駆体および設計を使用して、ＲＩＳＣによって所望のアンチセンス鎖の選択を促進するおよび／またはアンチセンス鎖／ＲＩＳＣ複合体のサイレンシング活性ピークならびにその期間を亢進することができる。
ｓｅｑＲＮＡｉ内オーバーハング前駆体は１〜４のヌクレオシド長であり得、鎖対３’末端ならびにアンチセンス鎖５’末端のいずれにも関与していなくても、いずれかまたは両方に関与してもよい。３’末端オーバーハングは鎖の残りと実質的に異なる化学修飾を有することができるが、５’末端オーバーハングは相手鎖と二本鎖を形成する鎖の一部と同一ヌクレオシドおよび連結化学に基づく。
ｓｅｑＲＮＡｉ内３’末端オーバーハング前駆体は、任意の天然デオキシリボヌクレオシドを含むことができる。さらに、いくつものグループが、従来のｓｉＲＮＡサイレンシング効果持続期間に影響を及ぼすことができるオーバーハング設計／化学バリエーションについて記載している。これらの同一構造はｓｅｑＲＮＡｉ鎖内オーバーハング前駆体として使用することができる。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７： ２４４１， ２００９）は、モルホリン環を有する２つのヌクレオシド３’末端オーバーハングがセンス鎖とアンチセンス鎖の両鎖内リボースと置換されているかまたは単に従来のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のみが標準ｄＴｄＴオーバーハングを有する同一ｓｉＲＮＡより長く持続するサイレンシング効果に至る可能性があることを示した。別の例では、Ｓｔｒａｐｐｓ ｅｔ ａｌ．， （Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８： ４７８８， ２０１０）は、ｄＴｄＴオーバーハングはｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、試験した他のオーバーハングタイプよりサイレンシング期間を著しく短縮したことに関与したことを見出した。後者は次の：２つの２’−０−メチルウリジン；ＲＮＡ標的に相補性の２つの２’−０−メチル修飾ヌクレオシド；またはＲＮＡ標的に相補性の非修飾リボヌクレオシドからなる。効果持続期間差は、ＩＣ５０値差にも最大標的サイレンシング可変度にもよらないことが見出された。これらのデータにより、リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドより強いＰＡＺドメインへの結合を有し得ることが示唆される。
多数の他の３’末端オーバーハング前駆体化学的物質は、ｓｅｑＲＮＡｉ活性およびヌクレアーゼ耐性を促進することができる。これらとしては、指定ヌクレオシドアナログ化学的物質を任意の正常な塩基と使用することができる以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）２’−０−メチル；（２）２’−フルオロ；（３）ＦＡＮＡ；（４）２’−０−メトキシエチル（５）ＬＮＡ；（６）モルホリノ；（７）トリシクロ−ＤＮＡ（Ｉｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｉｆ ＤＮＡ， ＰＮＡ ＆ ＸＮＡ １： ９， ２０１０）；（８）リボ−ジフルオロトルイル（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １： １７６， ２００６）；（９）４’−チオリボヌクレオチド（Ｈｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ８： ２１３３， ２００７）；（１０）２’−０−メチル−４’−チオリボヌクレオチド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７： １３５３， ２００９； Ｍａｔｓｕｄａ， Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ １３１： ２８５， ２０１１）；（１１）アルトリトール−ヌクレオシド（ＡＮＡ）（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５： １０６４， ２００７）；（１２）シクロヘキセニル−ヌクレオシド（ＣｅＮＡ）（Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２９； ９３４０， ２００７；（１３）ピペラジン（米国特許第６，８４１，６７５号）；ならびに（１４）５−ビス（アミノエチル）アミノエチルカルバモイルメチル−２’−デオキシウリジンもしくは５−ビス（アミノエチル）アミノエチルカルバモイルメチル−チミジン（Ｍａｓｕｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ２１： ７１５， ２０１０）。
ｓｅｑＲＮＡｉ鎖内オーバーハング前駆体に使用されるヌクレオシドは、３’末端オーバーハング内様々な組み合わせにおいて使用することができ、好ましくはヌクレアーゼ耐性連結（ホスホロチオエート、ホスホノアセタート、チオホスホノアセタート、メチルボランホスフィン、アミド、カルバメートまたは尿素等）によって隣接非オーバーハングヌクレオシドに共に結合する（Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１： ４１０９， ２００３； Ｋｒｉｓｈｎａ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３： ９８４４， ２０１１； Ｉｗａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５０： １７５， ２００６； Ｉｗａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２６： １４５１， ２００７； Ｉｗａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５３： １１９， ２００９； Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３３０： １１６８， ２００５）。加えて、非修飾ヌクレオシドは、これらの連結を使用して、好ましくはリボヌクレオシドを有するホスホロチオエートは使用せず結合している場合に、オーバーハングに使用することができる。これらの連結は５’末端オーバーハングに使用することもできるが、ヌクレオシドは下記：（１）２’−０−メチル；（２）２’−フルオロ；（３）ＦＡＮＡ；および（４）ＲＮＡ（天然リボース）に限定されることが好ましい。しかしながら、ｓｅｑＭｉＲの場合、かかる５’末端修飾のｍＲＮＡがサイレンシング標的とされる効果を評価しなければならない。
さらに、３’末端オーバーハング前駆体は、ある疎水性芳香族部分を含むことができる。例えば、単位（１つまたは複数）が同一連結によってオリゴヌクレオチドに結合しており、複数単位が使用されるリン酸ジエステルまたは掲載したばかりの他の連結の１つによって結合した２つの６員環を含む１〜３単位からなるものは同一連結によっても結合する。２単位構造が好ましい。適切な環構造としては、ベンゼン、ピリジン、モルホリンおよびピペラジン（米国特許第６，８４１，６７５号）が挙げられる。ベンゼンおよびピリジン環に基づく構造は、従来のｓｉＲＮＡにおける３’末端オーバーハングの使用においてＵｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， （Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １８：１９４， ２００８； Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７： １９７４， ２００９）によってすでに記載されている。具体的には、これらの単位は、１，３−ビス（ヒドロキシメチル）ベンゼン、１，３−ビス（ヒドロキシメチル）ピリジンおよび１，２−ビス（ヒドロキシメチル）ベンゼンである。これらはオーバーハング前駆体としてｓｅｑＲＮＡｉ使用にも適する。
別の潜在的な非ヌクレオシドオーバーハング前駆体の例として、芳香族部分は、連結が単位を保持し、ベンゼン環がさらにベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、およびピレン基から選択される非架橋部分と共有結合するベンゼン環とオリゴが共有結合するビアリール単位であり得る。さらに、１つのかかるビアリール基は、相補性ｓｅｑＲＮＡｉ鎖が細胞内二本鎖を形成後、意図されたセンス鎖５’末端に結合し、ＲＩＳＣによってアンチセンス鎖として選択し得る可能性を実質的に低減し得る。（Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５３： ２７， ２００９； Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２２： ４２， ２０１１）。これらの単位がオーバーハング前駆体として使用される場合、１〜３単位が好ましく、２つが最も好ましい。
さらに、３’末端オーバーハング、またはその欠如は、細胞質と核間でｓｅｑＲＮＡｉベース二重微小染色体布に影響を及ぼすことができる。ｓｅｑＲＮＡｉ鎖対によって形成された細胞質および二本鎖内に放出された個々のｓｅｑＲＮＡｉ鎖は、核内に拡散することができる。いったん核内にあると、個々のｓｅｑＲＮＡｉ鎖はｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖を形成することができ、細胞質内で形成されて続いて核内に拡散された二本鎖はいずれも、エクスポーチン−５（Ｅｘｐ−５）によって核から排出できる。このＥｘｐ−５活性は、低用量二本鎖でサイレンシング活性速度を限定し得る。Ｅｘｐ−５は最初の２つのヌクレオシドまたは任意の３’末端オーバーハング（１つまたは複数）内のそれらのアナログに結合するが、二本鎖部分に対して潜在的により弱く結合する。したがって、それらは特に低濃度のｓｅｑＲＮＡｉで細胞質内の高い二本鎖存在を産生することができるため、ヌクレオシドを含む３’末端オーバーハング前駆体を有するように設計されたｓｅｑＲＮＡｉ鎖は、オーバーハング前駆体を有さないｓｅｑＲＮＡｉ鎖より潜在的に有利である。最後に、３’末端オーバーハング前駆体の性質は、存在する場合、ｓｅｑＲＮＡｉベース二本鎖の全体および局所鎖間親和性に影響する。この主題は、熱力学に対応する項において論じられる。
Ｏ．本発明の一本鎖オリゴ化合物の投与方法
ＲＮＡｉを生じる上で本発明の主な利点は、記載の多くの修飾が、化合物の薬理学および毒物学がすでに広く理解されており、文献に記載されている従来のアンチセンスオリゴに一般的に使用されている化学的物質を使用することである。異なるタイプのオリゴ治療範囲における多くの薬理学を要約する参考文献としては、次が挙げられる： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ （ｅｄ．） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｊｕｌｙ ２００７； Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， − ６ Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｅｔ， Ｊ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ （Ｅｄｉｔｏｒ） ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００６， Ｉｎｆｏｒｍａ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＲＩ Ｍａｈａｔｏ ａｎｄ ＳＷ Ｋｉｍ （Ｅｄｉｔｏｒａ） １ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００２， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ； Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， Ｐ Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ａｎｄ Ｃ Ｍａｌｖｙ （Ｅｄｉｔｏｒｓ） １ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９９， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ； Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （ＲＳＣ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） （ＲＳＣ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） （Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ） ｂｙ Ｊｅｎｓ Ｋｕｒｒｅｃｋ （Ｅｄｉｔｏｒ） Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； １ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００８， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ； Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｅ Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ （Ｅｄｉｔｏｒ） １ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９８， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ。
本発明の化合物が連続送達されるという事実は、さらに問題を加える。細胞への第１鎖投与と第２鎖投与の間隔は、第１鎖の大部分を取り込むために十分長くなければならない。関与する期間は、従来のアンチセンスオリゴのために作用し、本明細書において適用することができる。例えば、これらの化合物を血行中へ注入時、血漿から組織へのクリアランス時間半減期は約２０分である。したがって、１時間後、ほとんどの化合物は組織内にある。組織保持時間は用量に依存するが、対象を治療するために一般に使用される用量範囲内での組織保持は数日間または数週間以内に測定することができる。組織内化合物は生体利用可能な形態と利用不能形態の間で分別されるが、前者は、組織内標的の持続的な抑制に基づき数日間または数週間効果的値で存在することができることが明らかである。
したがって、続いて本発明のｓｅｑＲＮＡｉ化合物は、従来のアンチセンスオリゴのため確立された用量範囲で対象に投与し、静脈内または動脈内投与用の２本の鎖の間隔は鎖投与間で約１時間〜１週間の範囲であるが、４時間〜２４時間が好ましい。鎖のほとんどの全身性ｉｎ ｖｉｖｏ目的投与において、注入速度最大６ｍｇ／ｋｇ／時間で１時間超が適切である。
鎖の静脈内投与または動脈内投与のタイミングも化合物が標的組織と並列するいくつかの他の投与経路（腹腔内、髄腔内、眼内および膀胱腔内等）において役立ち得る。治療レジメンはｓｅｑＲＮＡｉ化合物用であり、従来のアンチセンスオリゴに使用されるもの鏡像にもなる。本発明の化合物のｓｓ−ＲＮＡｉにおいて、連続送達関連問題は該当せず、従来のアンチセンスオリゴのようにそれらを完全に処置できる。
ある実施形態では（例えば、肺線維症もしくは喘息等の肺障害の治療または局所もしくは全身性目的において自己投与を可能とするため）、本明細書に記載のオリゴをエアロゾル化形態で送達することが所望され得る。少なくとも１つのオリゴを含む医薬組成物は、推進剤または溶媒および推進剤の混合物中に溶解、懸濁または乳化形態でオリゴを含むエアロゾル製剤として投与することができる。次いで、エアロゾル化製剤は、呼吸系または鼻腔内経路を介して投与する。
鼻腔内投与に使用されるエアロゾル製剤は、一般に点滴薬またはスプレーとして鼻腔内経路に投与するように設計された水溶液である。鼻腔内溶液は、一般に鼻汁に類似するように調製され、一般に等張であり、ｐＨ約５．５〜約６．５を維持するよう弱緩衝であるがこの範囲外のｐＨ値も使用することができる。製剤に抗菌剤を含んでも保存剤を含んでもよい。
吸入および吸入抗原における使用用のエアロゾル製剤は、オリゴが患者の呼吸樹内に運搬されるように設計される。ＷＯ０１／８２８６８号；ＷＯ０１／８２８７３号；ＷＯ０１／８２９８０号；ＷＯ０２／０５７３０号；ＷＯ０２／０５７８５号を参照されたい。吸入溶液は、例えば、ネブライザーによって投与することができる。微細粉末または液体薬剤を含む吸入または吹送は、推進剤内薬物の溶液または懸濁液の医薬エアロゾルとして呼吸系に送達される。
エアロゾル製剤は、一般に、オリゴ支出に役立つ推進剤を含む。推進剤は、ハロカーボン、例えば、フルオロカーボン（フッ化塩素化炭化水素、ヒドロクロロフルオロカーボン、およびヒドロクロロカーボンならびに炭化水素および炭化水素エーテル等）を含む液化気体であり得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．Ｒ．， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ． （１９９０））。
本発明において有用なハロカーボン推進剤としては、すべての水素がフッ素、水素含有フルオロカーボン推進剤、および水素含有クロロフルオロカーボン推進剤と置換されるフルオロカーボン推進剤が挙げられる。ハロカーボン推進剤については、Ｊｏｈｎｓｏｎ、米国特許第５，３７６，３５９号、およびＰｕｒｅｗａｌ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７７６，４３４号に記載されている。
本発明において有用な炭化水素推進剤としては、例えば、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン、ペンタン、イソペンタンおよびネオペンタンが挙げられる。炭化水素混合物も推進剤として使用することができる。エーテル推進剤としては、例えば、ジメチルエーテルならびに多数の他のエーテルが挙げられる。
オリゴは圧縮気体で分配もできる。圧縮気体は、一般に不活性気体（二酸化炭素、亜酸化窒素または窒素等）である。
本発明のエアロゾル製剤は、複数の推進剤も含むことができる。例えば、エアロゾル製剤は、同一クラスから複数の推進剤（２つ以上のフルオロカーボン等）を含むことができる。エアロゾル製剤は、異なるクラスから複数の推進剤を含むこともできる。エアロゾル製剤は、異なるクラスから２つ以上の推進剤の任意との組み合わせ、例えば、フルオロ炭化水素および炭化水素を含むこともできる。
効果的エアロゾル製剤は、他の成分、例えば、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ならびに界面活性剤もしくは他の成分（油および洗剤等）を含むこともできる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９０； Ｐｕｒｅｗａｌ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，７７６，４３４号）。これらのエアロゾル成分は、製剤を安定させ、弁成分を円滑にする上で役立ち得る。
エアロゾル製剤は、圧力下でパッケージすることができ、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末剤および半固体調製を使用してエアロゾルとして製法することができる。溶液エアロゾルは、活性成分溶液（純粋な推進剤内オリゴまたは推進剤および溶媒の混合物等）からなる。溶媒は、活性成分を溶解するおよび／または推進剤の蒸発を遅らせるために使用される。本発明において有用な溶媒としては、例えば、水、エタノールおよびグリコールが挙げられる。エアロゾル溶液は活性成分ペプチドおよび推進剤を含み、溶媒および保存剤または酸化防止剤の任意の組み合わせを含むことができる。
エアロゾル製剤は分散液であっても懸濁液であってもよい。懸濁液エアロゾル製剤は一般に有効量のオリゴおよび分散剤の懸濁液を含む。本発明において有用な分散剤としては、例えば、ソルビタントリオレアート、オレイルアルコール、オレイン酸、レシチンおよびトウモロコシ油が挙げられる。懸濁液エアロゾル製剤は、潤滑剤および他のエアロゾル成分を含むこともできる。
エアロゾル製剤は、エマルションとして同様に製法することができる。エマルションは、例えば、アルコール（エタノール等）、界面活性剤、水および推進剤、ならびに活性成分、オリゴを含むことができる。界面活性剤は、非イオン性であっても、アニオンであっても、カチオンであってもよい。エマルションの１例としては、例えば、エタノール、界面活性剤、水および推進剤を挙げることができる。別のエマルションの例としては、例えば、植物性油、グリセリルモノステアレートおよびプロパンを挙げることができる。
オリゴは経口送達用に製法され得る（Ｔｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７： ２２５， ２００８； Ｒａｏｏｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９３： １４３１， ２００４； Ｒａｏｏｆ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １７： １３１， ２００２；米国特許第６，７４７，０１４号；米国特許第２００３／００４０４９７号；米国特許第２００３／００８３２８６号；米国特許第２００３／０１２４１９６号；米国特許第２００３／０１７６３７９号；米国特許第２００４／０２２９８３１号；米国特許第２００５／０１９６４４３号；米国特許第２００７／０００４６６８号；米国特許第２００７／０２４９５５１号；ＷＯ０２／０９２６１６号；ＷＯ０３／０１７９４０号；ＷＯ０３／０１８１３４号；ＷＯ９９／６００１２号）。かかる製剤は、オリゴと形成する腸溶コーテイングした投与量内に組み込まれ得るカプリン酸ナトリウム等の１つまたは複数の浸透性エンハンサーを組み込み得る。
体の特定部分（ＣＮＳ等）に適用することができる担体を伴うまたは伴わないオリゴに適応可能である送達機序もある。これらとしては、ＷＯ２００８／０３３２８５号に記載のようにＣＮＳ内の標的細胞に細胞浸透性担体／ＮＡＢＴ複合体を送達する上で役立つように、限定されないが脳内注液等の伝達向上送達方法の使用が挙げられる（脳内伝達向上マイクロ注入− Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ４６： ６８３， ２０００）。
いわゆるレバレッジ媒介性取り込み機序の利用に基づく薬剤送達機序も、本発明の実践に適している（Ｓｃｈｍｉｄｔ ａｎｄ Ｔｈｅｏｐｏｌｄ， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２６： １３４４， ２００４）。これらの機序は、細胞膜曲率の局所介入ならびに内エンドソーム、リソソームもしくは食胞の形成を引き起こすためにＭＡＲＭを利用する可溶性接着分子（ＳＡＭ）、例えば四量体レクチン、リポタンパク質もしくは大量ヒンジ分子周囲の架橋膜−アンカー分子（ＭＡＲＭ）の手段による標的に関与する。より具体的には、レバレッジ媒介性取り込みは、ＳＡＭによるＭＡＲＭの側面クラスタ化に関与し、したがって細胞によりオリゴ保因複合体の内在化に向かって反応を促進することができる立体配置的エネルギーを生成する。これらの組成物、方法、使用および産生手段はＷＯ２００５／０７４９６６号に提供されている。
多くの薬剤に関して、患者のオリゴ処置のための用量スケジュールは、動物試験から容易に推定し得る。２工程方法における使用のための高度に活性の従来のアンチセンスまたは相補性センス鎖およびアンチセンス鎖オリゴと共に一般に達さなければならない細胞外液濃度は、１〜２００ナノモル（ｎＭ）範囲である。より高い細胞外液値は最大１．５マイクロモルであり、これは組織内に促進されたオリゴの速度および量を増大し得るため、一部の適応においてより適し得る。かかる値は、血漿中で容易に達することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ適応において、使用されるオリゴ濃度は、生理的に均衡した塩溶液または処置する組織が浸っている他の溶媒の容積に基づき容易に算出される。新規組織と共に、１〜１０００ｎＭは中等度〜強活性のオリゴに必要な極度の濃度を示す。二百ナノモル（２００ｎＭ）が一般にほとんどの適応において実用的な値である。ほとんどの細胞系と共に、担体は典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏ投与に必要となる。雰囲気圧（環境圧）ではなく５％酸素値でオリゴを用いた組織インキュベーションは、結果を著しく改善し得る。
例えば、ホスホロチオエートオリゴの薬理／毒性試験により、ホスホロチオエートオリゴはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で適切に安定しており、全身投与後、中枢神経系等のいくつかの例外を伴いすべての体内組織によって容易に取り込まれることが示されている（Ｉｖｅｒｓｅｎ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３１， １９９１； Ｉｖｅｒｓｅｎ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐ． ４：４３， １９９４； Ｃｒｏｏｋｅ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２： ３２９， １９９２； Ｃｏｒｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｃｏｍｍ． ３： ２３９， １９９３； Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ７５９５， １９９１； Ｃｏｓｓｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６９： ８９， １９９４）。これらの化合物は、脳髄液内に大量注入後、中枢神経系内組織に容易に接近する（Ｏｓｅｎ−Ｓａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６４： ４４５， １９９３； Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６６： Ｒ１４１８， １９９４； Ｄｒａｇｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ５： ３０５， １９９３； Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ５： ２７７， １９９３； Ｈｅｉｌｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２３６： ３３９， １９９３； Ｃｈｉａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２２７： ４５１， １９９２）。ホスホロチオエート自体は比較的無毒性であることが見出されており、高用量および高速注入時に発現することが見られているクラス特異的副作用が十分に選択された配列で治療効果を得る上で必要とされる。ヌクレアーゼ耐性を提供するに加えて、ホスホロチオエートおよびボラノホスファート連結のリン酸ジエステル連結より潜在的に有利な点の１つは、血漿タンパク質およびアルブミンへの結合促進、特に得られた血漿半減期の増大効果を有する点である。血漿中オリゴを長期間保持することによって、腎臓による排出とは対照的に、組織に入る時間が長い。主にまたは排他的にリン酸ジエステル連結を有するオリゴの血漿半減期は数分のみである。したがって、それらは、担体なしで使用時、ｉｎ ｖｉｖｏ適応にほとんど使用されない。優勢または排他的にリン酸ジエステル連結を有するオリゴの場合、血漿タンパク質結合は、血清アルブミン等血漿タンパク質に結合するオリゴ分子に共有結合することによって改善できる。かかる分子としては、アリールプロピオン酸、例えば、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、プラノプロフェン、チアプロフェン酸、ナプロキセン、フルルビプロフェンおよびカルプロフェンが挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第６，６５６，７３０号）。本発明での使用に適したオリゴに連結し得る他の部分に関して、好ましい部位はオリゴ３’末端である。オリゴ静脈内投与は、特定のオリゴおよび医学的適応に応じて連続数日間または数分間投与し得る。ホスホロチオエート含有オリゴは、１８ヌクレオチド（例えば、オブリメルセン）〜２０ヌクレオチド（例えば、セネルセン、アリカホルセン、アプリノカルセン、ＩＳＩＳ１４８０３、ＩＳＩＳ５１３２およびＩＳＩＳ２５０３）長を含み試験された。そのように投与時、かかるオリゴは血漿からの排泄のαおよびβ相を示す。オリゴ各末端上少なくとも末端４つのヌクレオシドにホスホロチオエート連結と２’−０置換の両方を有するオリゴにおいて、α相オリゴ半減期は３０〜６０分であるが、β相は２週間超である。
ホスホロチオエート静脈内投与に関連する最も顕著な毒性とは、化学クラスに関連しており、一般にｍＲＮＡ標的配列と独立、したがって、ハイブリダイズと独立している。観察されて測定された毒性は、ある重要な毒性において最もヒトに類似した非ヒト霊長類を用いた前臨床的および臨床的に薬剤から薬剤で一貫している。
前臨床および臨床評価のための用量およびスケジュール選択において最も抑え難いクラス関連毒性は、特異的な血漿タンパク質への結合機能として発現し、凝固カスケードの一過性の阻害および相補性カスケードの活性化が挙げられる。これらの毒性はいずれも分子のポリアニオン性質に関し得る。
凝固カスケードに対するホスホロチオエート効果は、活性化部分トロンボプラスチン（ＰＰＴ）時間の血漿濃度関連延長に至る。ＰＴＴの最大延長は、最大血漿濃度と密接に相関するため、高ピーク濃度を避けてＰＴＴに対する著しい効果を避けるように用量およびスケジュールを選択できる。なぜなら、これらの薬剤の血漿半減期は短く（３０〜６０分）、凝固に対する効果は一過性であるためである。これらの薬剤のいくつもが、最大３週間持続する長期静脈内注入を用いた臨床において評価されている。より短いＩＶ注入（例えば、２時間）も研究されている。例えば、アプリノカルセン（ＩＳＩＳ３５２１）およびＩＳＩＳ５１３２は２時間と３週間の両持続的な注入スケジュールで研究された。用量３ｍｇ／ｋｇ／用量で２時間かけて、ＰＴＴの一過性延長が観察された。持続的注入で２１日間３ｍｇ／ｋｇを連日投与時、ＰＴＴに対して無効であった。この化学クラスのアンチセンス分子の凝固カスケードに対する効果は一致する。
同様に、補体活性化の観察は一貫している；しかしながら、血漿オリゴヌクレオチド濃度と補体活性化の関連性は、凝固に対する効果より複雑である。また、凝固に対する効果はラットならびにサルに見出されるが相補性カスケードに対する効果はサルおよびヒトにおいてのみ観察されている。
これらの薬剤をカニクイザルに２時間注入投与時、相補性分離生成物（すなわち、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＢｂ）増大は、血漿濃度が閾値４０〜５０μｇ／ｍＬを超えた場合のみ生じる。サルにおいて、これらのタンパク質中増大に関連する心血管虚脱発現は低い。ほとんどの部分において、ホスホロチオエートの臨床検査は、これらの高血漿濃度を避けるように設計されている。
ＩＳＩＳ３５２１を高用量２４ｍｇ／ｋｇで週１回２４時間注入投与時（１ｍｇ／ｋｇ／時間×２４時間）、安定状態の血漿濃度は高用量で約１２μｇ／ｍＬに到達した。しかしながら、このスケジュールでは、これらの血漿値がより短い注入時に見られるよりはるかに低かった場合でも、Ｃ３ａおよびＢｂ内で実質的に増大した。したがって、補体活性化は、血漿濃度が短期間（例えば２時間）で十分に許容され、血漿濃度が長く維持される場合に毒性を伴う用量とスケジュールの両方に関連し得る。これは、補体活性化が濃度１４〜１９μｇ／ｍＬで観察された赤毛猿におけるセネルセン知見を説明する可能性が高い。
ＩＳＩＳ３５２１を１．０および１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間投与時、平均ピーク血漿濃度は、それぞれ１１．１±０．９８および６．８２±１．３３μｇ／ｍＬであった。これらまたは他の高用量で補体活性化はなく、他の安全性問題もなかった。１．２ｍｇ／ｋｇ／時間で１時間投与した同様にサイズ化したホスホロチオエートの最大ピーク血漿濃度は、ＩＳＩＳ３５２１で観察されたものに類似すると予期される。
したがって、ホスホロチオエート注入速度を３．６ｍｇ／ｋｇ／時間以下に限定することが非常に好ましい。いくらか速い注入速度で補体活性化の効果が予想され得る。約２２ｍｇ／ｋｇの一定総用量を使用した１時間未満の注入の連続短縮に関して行った決定は、相補性分離生成物評価を含む安全性情報レビューに基づき容易に達成されるはずである。
以下の実施例は、本発明のある実施形態を例証するために提供される。それらは、本発明をいかなる形でも制限することを意図しない。
実施例１
ｓｅｑｓｉＲＮＡの適応
サイレンシングを標的とするｓｅｑｓｉＲＮＡ遺伝子を表６および実施例に示す。それらは、本明細書に示した設計をいかに通常または特に適用することができるかの消耗的な一連の例証を提供することを意味しない。当業者は、本明細書において提供される設計原理および実施例を容易に使用して、対象中、任意の所定の遺伝子標的を使用して本発明に従い生成することができる非常に制限された一連の化合物を達成することができる。
Figure 2014519806
Ａ．ｐ５３発現を下方制御するための化合物
ｐ５３は、幹細胞自己再生、細胞増殖および生存能（増殖、分化、アポトーシス、老化、分裂死および自食作用等）に関与するものを含む種々の細胞プログラムの調節に関与する。図２６〜３２、６３および６４は、本発明に従う使用に適した化合物を提供する。
かかるプログラムの病的発現もしくは発現不良、ならびに死プログラム、特にｐ５３機能をブロッキングする多種多様の医学的状態に関連する多くの罹患率の基礎は、かかる罹患率のすべてではなくとも多くを予防することができる。
例えば、癌において、野生型および変異ｐ５３はいずれも、癌細胞死に至る可能性があるプログラム誘発の閾値増大を含む腫瘍維持において重要な役割を果たす。典型的にはｐ５３阻害剤の使用（ｐ５３遺伝子標的指向性のｓｉＲＮＡ等）、細胞死プログラム誘発剤との併用（ＤＮＡ障害剤等）を使用して、癌細胞死を促進することができる。同時にｐ５３の阻害は多くの正常な組織を多くのかかる第２薬剤（化学療法および放射線等）の中毒作用から保護する。
さらに、本発明者は、癌治療方法として、（限定されないが、ＰＣＴ／米国特許第０９／０２３６５号に記載のもの等）ｐ５３を阻害するｓｓ−ｓｉＲＮＡ、二本鎖ｓｉＲＮＡまたは従来のアンチセンスオリゴと組み合わせてホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）を使用することができることを見出した（Ｂｒｏｗｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｂｏｒｏｎ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｈｅｒａｐｙ” Ｉｎ； “Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，” ＲＰ Ｓｐｅｎｃｅｒ （ｅｄ）， Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ， ＮＹ， １９７８； Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０： １０６１， １９９０； Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｈａｗ， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ８： １１４７， ２００１）。具体的には、１０Ｂ原子は、熱中性子捕捉後、分裂して７Ｌｉおよびエネルギー的α（ヘリウム）粒子を生成する。それらの１０〜１４ｍｍ経路内で、かかる粒子は、野生型または変異ｐ５３阻害時、癌細胞に対するアポトーシスおよび他の不活性化効果を高めるＤＮＡおよび他の損傷タイプを引き起こす。
機能が活動のＲＮａｓｅ Ｈ機序を使用し、ｐ５３遺伝子標的指向である従来のアンチセンスオリゴの使用がｉｎ ｖｉｔｒｏおよび患者において研究されている。これらのオリゴは、ある従来の治療の抗癌効果を促進し、正常な組織をゲノム障害剤から保護することが示されている。幹細胞を除く細胞の数タイプは、それらの活性のためのこの酵素に依存する従来のアンチセンスオリゴを支持する十分なＲＮａｓｅ Ｈ値を保有する。結果的に、機能のＲＮａｓｅ Ｈ活性に依存しないｐ５３遺伝子標的指向性のＲＮＡｉは、触媒のままでありつつ、より広範囲の細胞タイプにおいてｉｎ ｖｉｖｏ活性である潜在的利点を提供する。ＲＮＡｉに関して、一般にこの可能性は、ｉｎ ｖｉｖｏ従来のｓｉＲＮＡ取り込みの取り込み不良およびこの問題を広く対処できる担体がないことに関連する周知の問題によって厳重に限定される。
Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０： １７５４， ２００９）は、ｐ５３遺伝子標的指向性の従来のｓｉＲＮＡは、ラットにおけるシスプラチン誘発性腎損傷を軽減できるということを示すデータを示している。記載のｓｉＲＮＡは交互の２’−０−メチル／天然リボースヌクレオシドと平滑末端１９−ｍｅｒであった。腎中近位細管細胞は、シスプラチンに起因するもの等の虚血または腎毒性に関連する腎損傷の主要部位であり、かつ腎臓によって再吸収されるオリゴ部位であるため、担体は必要ではなかった。したがって、この担体のない従来のｓｉＲＮＡを用いたアプローチは、細胞を殺傷するかそうでなければ細胞能をなくすが、この医学的適応においてｐ５３阻害のための潜在的有用性を例証するｐ５３依存性プログラムの病的作用予防における使用は非常に限定される。
Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． （Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３： ４７５， ２００８）は、ｓｉＲＮＡでのｐ５３発現阻害はｉＰＳＣ産生を高めるために使用することができるということを示した。例えば、ヒト線維芽細胞は、それらの細胞内発現を獲得するために、いくつもの遺伝子用発現ベクターを使用することによってｉＰＳＣに変換した。ｉＰＳＣ産生の有効性は非常に低かったが、ｐ５３遺伝子標的指向性のｓｈＲＮＡがレンチウイルスベクターを使用して細胞内に導入された場合、約２ログ増大した。本明細書に記載のアプローチは、一過性に抑制する手段を提供するｐ５３より、長期抑制はｓｈＲＮＡによって提供される。これは、組織修復適応において必要となる等、特定の細胞タイプに区別するためにｉＰＳＣが誘発される場合に重要である。本明細書に記載のように短い細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）の各鎖への連結と組み合わせた２工程投与アプローチは、毒性に関連する最小の担体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ幹細胞におけるＲＮＡｉ活性を得る効率的方法を提供する。
本発明によって提供される２工程方法における使用のため構成することができるヒトｐ５３遺伝子標的指向性のＲＮＡｉ化合物は、ＷＯ２００６／０３５４３４号、米国特許第２００９／０１０５１７３号および米国特許第２００４／００１４９５６号に見出される。
表６に、本明細書に記載のｐ５３指向性の化合物の処置が有益である種々の障害を列挙する。例えば、心不全は、様々な心疾患に起因する重篤な状態である。ｐ５３は、心不全の発現において著しい役割を果たす。心血管形成は、心機能維持ならびに圧負荷により誘発される心肥大の発現に直接関連する。上方制御したｐ５３は、肥大した心臓内で血管形成を調節する低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）の抑制を介して、心肥大から心不全への転移を誘発する。さらに、ｐ５３はアポトーシスを促進することが知られており、アポトーシスは心不全に関与すると考えられる。したがって、ｐ５３は、複数の機序を介して心不全の発現を引き起こす重要な分子である。
したがって、本発明のｐ５３指向性の化合物は、心細胞アポトーシスによる心細胞死に合併する病的症状を減少または軽減するために使用することができる。初めに、化合物（１つまたは複数）は心細胞とインキュベートし、オリゴのｐ５３遺伝子機能の調節能（例えば、ｐ５３産生低下、アポトーシス、改善された心細胞シグナル伝達、Ｃａ＋＋輸送、または形態学等）を評価することができる。例えば、Ｈ９Ｃ２心筋細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ＵＳＡ）から経路１４で得ることができ、ＤＭＥＭ完全培養培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭα−グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌファンギゾンおよび５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２）において培養できる。この細胞系は、ｐ５３指向性の本発明の化合物の阻害機能の特徴化およびその修飾バージョンの特性化に適している。Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＰＮＡＳ ９５：２９７９−２９８４によって記載されているＨＬ−１細胞は、反復経路し得、さらに心臓特異性表現型を維持する。これらの細胞は、本明細書に記載のオリゴ効果をさらに特徴化するためにも使用することができる。
アポトーシス調節因子ｐ５３発現は、マウスにおいてマウス二重微小染色体２（ＭＤＭ２）と称され、またはヒトにおいてヒト二重微小染色体２（ＨＤＭ２）と称される分子、ユビキチン化およびプロテアソームプロセシングのためにｐ５３を標的とするＥ３酵素によって、ならびに脱ユビキチン化酵素、ユビキチン鎖をそれから除去することによってｐ５３を救うヘルペスウイルス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＨＡＵＳＰ）によって、部分的に支配されると思われる。Ｂｉｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ． ２００８ Ａｕｇ １；７９ （３）：４７２−８０）は、ｐ５３発現上昇がユビキチン−プロテアソーム系（ＵＰＳ）成分の異常調節およびヒト拡張型心筋症（ＤＣＭ）におけるアポトーシスの下流エフェクター活性化に関連したかどうかを検討した。これらの試験において、ＤＣＭ患者（ｎ＝１２）から、または呈していない（ドナー）心臓（ｎ＝１７）から左心室心筋試料を得た。ウエスタンブロッティング法および免疫組織化学により、ＤＣＭ組織にはＤＣＭを呈していない心臓より上昇したｐ５３およびその調節物質ＨＤＭ２、ＭＤＭ２もしくは他種に見出されるそのホモログ、ならびにＨＡＵＳＰ値（全Ｐ＜０．０１）が含まれるということが示された。ＤＣＭ組織にはまた、フルオロジェニック基質を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ測定した上昇ポリユビキチン化タンパク質値も含み、向上した２０Ｓ−プロテアソームキモトリプシン様活性（Ｐ＜０．０４）も保有した。ＤＣＭ組織には、活性化カスパーゼ９および３（Ｐ＜０．００１）が含まれ、カスパーゼ基質ＰＡＲＰ−１発現を低減した（Ｐ＜０．０５）。ウエスタンブロッティング法および免疫組織化学により、ＤＣＭ組織にはアポトーシスにおけるＤＮＡ断片化の重要なエフェクターである上昇したカスパーゼ−３活性化ＤＮＡｓｅ発現値（ＣＡＤ；Ｐ＜０．００１）が含まれ、上昇した強力なＣＡＤ阻害剤発現（ＩＣＡＤ−Ｓ；Ｐ＜０．０１）も含まれるということが示された。これらの治験担当医は、ヒトＤＣＭ内ｐ５３発現は、ｐ５３安定性を調節することが知られているＵＰＳ成分の異常調節に関連すると結論した。ＤＣＭ溶液中上昇したｐ５３発現およびカスパーゼ活性化は、ＣＡＤとその阻害剤ＩＣＡＤ−Ｓのいずれの活性化も伴わなかった。これらの知見は、アポトーシスは中断し得、したがって、ヒトＨＦ中潜在的可逆的であるという概念と一致する。
前述を考慮して、ｐ５３指向性の本明細書において提供される化合物は心不全の治療効果を示すはずであることが明らかである。したがって、本発明の１つの実施形態では、ｐ５３指向性の化合物を患者に投与して心細胞アポトーシスを阻害し、したがって、心不全発現を低減する。
癌の発現中の細胞形質転換は、正常パターンの細胞増殖調節および異常調節した転写対照の複数の改変に関与する。発癌プロセスにおける主要事象は、一部の手段による発癌機能の活性化（例えば、増幅、変異、染色体の再配列）または転写調節機能の改変もしくは異常発現、多くの場合において、抗癌遺伝子機能の除去に関与することができる。一部の腫瘍の向上した増殖および侵襲性特性の１つの理由は、発癌および抗癌遺伝子における累積効果を有する変異数増大獲得であり得る（Ｂｅａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：７４９５−７４９９， １９８９）。あるいは、その程度において生物的増殖および細胞機能に必要な正常な細胞シグナル伝達経路を介した発癌機能として（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：１５−１６， １９９３における概説）、発癌性シグナル伝達経路中の変異または脱調節に対応する追加の事象は、シグナル伝達経路単独における変異が癌を引き起こし得ない場合でも、腫瘍悪性腫瘍にも関与し得る（Ｇｉｌｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３：１７５９−１７６８， １９９３）。
ｐ５３は、有効な抗癌剤のための強力な標的を提供する。ｐ５３指向性の化合物とアポトーシスを促進する１つまたは複数の治療薬との組み合わせは、癌細胞中の細胞死を効果的に誘発する。かかる薬剤としては、従来の化学療法、放射線および生体薬剤（モノクローナル抗体およびホルモン経路を操作する薬剤等）が挙げられるが、これらに限定されない。
ｐ５３タンパク質は、細胞周期調節機序および細胞増殖対照の中心的役割を果たす重要な転写因子である。Ｂａｒａｎ ｅｔ ａｌ．は、乾癬患者から取り込まれた損傷性および非損傷性皮膚試料内のｐ５３タンパク質の発現および局所化を健常対照と比較して同定する試験を実施した（Ａｃｔａ Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ Ａｌｐ Ｐａｎｏｎｉｃａ Ａｄｒｉａｔ． （ ２００５） １４：７９−８３）。乾癬性損傷性および非損傷性皮膚（ｎ＝１８）切片を検討した。乾癬の個人歴および家族歴のない健常志願者対照群（ｎ＝１０）も検討した。ｐ５３発現は、アビジン−ビオチン複合体免疫ペルオキシダーゼ方法およびモノクローナル抗体ＤＯ７の使用を示した。すべての皮膚生検の１０分野における光顕微鏡を使用して染色核を有する細胞の数および局所化を検討した。損傷性乾癬性皮膚において、ｐ５３正細胞数は健常個体から取り込まれた皮膚試料（ｐ＜０．０１）および乾癬患者から取り込まれた非損傷性皮膚（ｐ＝０．０２）より有意に高かった。非損傷性乾癬性皮膚と正常皮膚間に有意差は観察されなかった（ｐ＝０．１）。ｐ５３正細胞の平均数と平均パーセント間で強い正関関係が見出された（ｐ＜０．０００１）。ｐ５３正細胞は最も一般的に健常皮膚と非損傷性乾癬性皮膚の両表皮基底層に位置した。損傷性乾癬性皮膚において、ｐ５３正細胞は全表皮層に発現した。これらのデータを考慮して、ｐ５３タンパク質は乾癬の発病において重要な要因と思われることが明らかである。したがって、皮膚内ｐ５３発現を効果的に下方制御する化合物は単独または乾癬を治療するために使用される他剤と併用使用してこの有痛性症状および見苦しい障害を軽減するはずである。
Ｂ．Ｆａｓ（アポ−１またはＣＤ９５）発現を下方制御するための化合物
Ｆａｓ（アポ−１またはＣＤ９５）は、アポトーシスを介して細胞死に至る経路を制御する細胞表面受容体である。この経路は、Ｆａｓ機能ブロッキングが臨床便益を提供できるいくつかの医学的状態に関与する。表６を参照されたい。例えば、Ｆａｓ媒介性アポトーシスは、肝細胞死を阻害することで命を救い得る肝疾患の広範のスペクトルに見られる病状の重要な原因である。図２２および３３〜３７は、細胞取り込み増大および／または標的細胞内Ｆａｓ発現の下方調節の安定性増大についてこれまで説明された多くの特徴を含む新規組成物物質を提供する。
Ｌｉｅｂｅｒｍａｎおよび同僚らは、劇症肝炎および腎虚血再灌流損傷マウスモデルにおけるマウスＦａｓ受容体遺伝子標的指向性のｓｉＲＮＡ効果を研究した（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ９： ３４７， ２００３； Ｈａｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１： １４８８３， ２００４）。流体トランスフェクション方法によって送達されたｓｉＲＮＡは、肝線維症低下またはより肝毒性のＦａｓ特異的抗体の注入関連死に示されるように、かかるｓｉＲＮＡがマウスを肝細胞アポトーシスから生成したコンカナバリンＡから保護するということを示した。第２試験において、ｓｉＲＮＡはマウスを腎動脈クランプ後の急性腎不全から保護することが示された。
ヒトＦａｓ（アポ−１またはＣＤ９５）受容体またはリガンド遺伝子標的指向性のＲＮＡｉ化合物はＷＯ２００９／０３５４３４３号、米国特許第２００５／０１１９２１２号、ＷＯ２００５／０４２７１９号および米国特許第２００８／０２２７７３３号に提供されている。
最近、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、心筋細胞は、心筋虚血中にアポトーシスまたは肥大補整を行い得ることを報告した（Ｃｏｒｏｎ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ． ２００８ Ｎｏｖ；１９（７）：５２７−３４）。Ｆａｓ発現は心筋虚血において上方制御され、心筋細胞のアポトーシスと肥大の両方に連結する。一部の報告によって、Ｆａｓは心筋肥大を誘発し得ることが示唆された。虚血性心筋細胞のアポトーシスおよび非虚血性心筋細胞におけるＦａｓ発現は虚血性心不全の初期段階中に発現する。肥大型心筋細胞は虚血反応に対してアポトーシスを容易に行い、その後、アポトーシス心筋細胞は線維組織に置換される。虚血性心不全後期において、肥大、アポトーシス、および線維症が互いに加速すると考えられるため悪循環を形成し得、最終的に心不全に至り得る。これらの観察に基づき、Ｆａｓ指向性の化合物は、心筋虚血および肥大に関連する病的作用の改善に有用な治療薬を提供することが明らかである。したがって、Ｆａｓ指向オリゴを心細胞に投与し、それらのアポトーシスに対する効果を評価する。上に論じられるように、Ｆａｓ指向性の化合物のある修飾も評価する。これらとしては、ＣＰＰを含む心臓ホーミングペプチドならびに適切な場合、リポソームまたはナノ粒子中カプセル封入への接合が挙げられる。
Ｇｉｌｈａｒ ｅｔ ａｌ．は題名「Ｆａｓ Ｐｕｌｌｓ ｔｈｅ Ｔｒｉｇｇｅｒ ｏｎ Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ」において乾癬動物モデルおよびＦａｓ媒介性シグナル形質導入によって果たした役割について記載している（２００６） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １６８：１７０−１７５）。Ｆａｓ／ＦａｓＬシグナル伝達は、アポトーシス導入において最も知られている。しかしながら、炎症サイトカイン、特に腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）を誘発するＦａｓシグナル伝達の代替経路がある。この経路は、高値の抗アポトーシス分子（Ｂｃｌ−ｘＬ等）を発現する細胞内で顕著である。ＴＮＦ−αは乾癬の中心であり、乾癬性表皮発病はＢｃｌ−ｘＬ発現が高いアポトーシス指標が低いため、これらの著者らは、炎症Ｆａｓシグナル伝達は、活性化リンパ球による乾癬誘発を介在すると仮説を立てた。乾癬患者由来の無関与皮膚をベージュ色の重度の併合免疫不全マウスに移植し、乾癬をＩＬ−２によって活性化したＦａｓＬ−正自己の天然キラー細胞注入によって誘発した。乾癬誘発は、天然キラー細胞注入後３および１０日目、抗Ｆａｓ（ＺＢ４）または抗ＦａｓＬ（４Ａ５）抗体のブロッキング注入によって阻害された。抗Ｆａｓモノクローナル抗体は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１５、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＩＣＡＭ−１の表皮性発現を阻害して、細胞増殖（Ｋｉ−６７）および表皮厚を著しく減らした。Ｆａｓ／ＦａｓＬシグナル伝達は、活性化リンパ球による乾癬誘発における本質的な初期事象であり、重要な炎症サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１５等）の導入が必要である。
かかるデータは、Ｆａｓ指向性の化合物の局所的投与を伴う治療レジメンおよび／もしくは乾癬関連症状の治療および軽減のためのＢＣＬ−ｘＬ指向性の化合物の理論的根拠を提供する。
Ｃ．アポＢ発現を下方制御するための化合物
アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）形成のための必須タンパク質であり、ＬＤＬ受容体リガンドである。ＬＤＬは、組織へのコレステロール運搬に関与する。高アポＢ値は、アテローム性動脈硬化症を引き起こすプラークに至る可能性がある。したがって、アポＢ発現ブロッキングは、表６に掲載するもの等、種々の医学的障害において有用な治療様式である。図２０、３８〜４６、６５および６６は、アポＢ発現をサイレンスする本発明に従う使用に適した化合物を提供する。
Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ ４３２： １７３， ２００４）は、本発明での使用に適したマウスとヒトの両アポＢ遺伝子標的を同時に指向とする２つのｓｉＲＮＡ化合物について記載している。これらの化合物は、パッセンジャー鎖３’末端に抱合体化したコレステロールを有する２１−ｍｅｒパッセンジャー鎖および２３−ｍｅｒガイド鎖を有する。コレステロールはヌクレアーゼ耐性と標的組織内への細胞取り込みの両方を促進した。肝臓および空腸内アポＢ発現低下は、血漿アポＢ−１００タンパク質およびＬＤＬ値低下を伴った。著者らは、非抱合型化合物（コレステロールなし）は不活性であることを示し、抱合した化合物は臨床的に許容される用量および用量レジメンで改善されたｉｎ ｖｉｖｏ効力を達成するためにさらなる至適化を必要とすると結論した。
治験担当医の同グループは、ヒトとマウスの両アポＢ遺伝子発現の下方調節に適したｓｉＲＮＡ化合物も提供する米国特許第２００６０１０５９７６号、ＷＯ０６０３６９１６号および米国特許第７，５２８，１１８号を出願した。アポＢを発現するヒトＨｅｐＧ２および／またはマウス肝細胞系ＮｍｕＬｉに示された活性を有する８１の異なるＲＮＡｉ化合物について記載された。２７のこれら二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物はＨｅｐＧ２細胞内アポＢタンパク質発現を対照３５％未満に低減することが見出された。これらｓｉＲＮＡの１つをヒトアポＢ−１００トランスジェニックマウスにおいて試験し、連日３日の尾静脈注入後、ｓｉＲＮＡはマウス肝アポＢ ｍＲＮＡ値を４３±１０％および空腸内５８±１２％に低下し、ヒト肝アポＢ ｍＲＮＡも４０±１０％に低下した。本発明での使用に適したアポＢ指向性の他のｓｉＲＮＡ化合物は、米国特許第２００６／０１３４１８９号に開示されている。これらは、ＳＮＡＬＰ（安定した核酸脂質粒子）送達技術と組み合わせた使用において記載されている。
遺伝子標的（アポＢ等）指向性の従来のアンチセンスオリゴは、本発明のＲＮＡｉ化合物に変換することができ、本明細書に記載のように使用することができる。アポＢ指向であり本発明での使用に適している一連の従来のアンチセンスオリゴについては、Ｍｅｒｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１８： ７４３， ２００８； Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６： ８７２， ２００５； Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１４： １７２９， ２００６；米国特許第７，４０７，９４３号、米国特許第２００６／００３５８５８号およびＷＯ２００７／１４３３１５号に記載されている。
出願ＷＯ２００７／１４３３１５号に記載されている従来のアンチセンスオリゴは、８〜１６−ｍｅｒである。１５−ｍｅｒより短いガイド鎖は活性ではないことが知られている。さらに１６−ｍｅｒガイド鎖は、本発明での使用に示唆された最短である。したがって、本実施例における使用に適したこの出願に掲載される化合物は１６−ｍｅｒに限定されるかまたはヒトアポＢ配列を使用して１６−ｍｅｒに伸びる１５〜１２−ｍｅｒに限定される。かかる１６−ｍｅｒは、本明細書に記載のように必ずしも遺伝子標的との塩基対の必要はないオーバーハングの使用によって延長できる。
かかる従来のアンチセンスオリゴとの使用または本発明によって記載されている２工程投与との使用に適したいくつかの治療レジメンについては、ＷＯ２００８／１１８８８３号に提供されている。ヒトアポＢに使用される配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、寄託番号Ｘ０４７１４．１に提供されている。
アテローム性動脈硬化症は、血管平滑筋細胞が病的に再プログラム化された状態である。脂質物質は動脈壁において収集され、典型的には慢性炎症がある。これは、血管壁が肥大、硬化し、プラークを形成する状況に至り、動脈をブロックし得、最終的に凝固を促進することによって動脈ブロックも促進し得る。プラーク破裂がある場合、後者ははるかに蔓延する。
プラーク形成効果のために冠状動脈が狭くなる場合、心臓への血流は、低下するかまたは停止し得、胸痛（安定アンギナ）、呼吸困難、心臓発作（症状等）を惹起する。プラーク部分は部分に分かれて血流中を移動し得る。これは、心臓発作および脳卒中の共通の起因である。凝固が心臓、肺、または脳内に移動する場合、脳卒中、心臓発作、または肺の塞栓症を引き起こし得る。
アテローム性動脈硬化症のリスク要因としては、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、高脂肪食、肥満症、心臓疾患および喫煙の個人的または家族歴が挙げられる。次の状態：脳血管疾患、透析を伴う腎疾患および末梢血疾患もアテローム性動脈硬化症に関連している。アポＢの下方調節は、アテローム性動脈硬化症および関連した病理学治療における有益な治療効果を有し得る。ＷＯ／２００７／０３０５５６号は、アポＢ指向性の化合物のアテローム病巣形成に対する効果を評価するために動物モデルを提供している。
Ｄ．ＰＣＳＫ９発現を下方制御するための化合物
タンパク質転換酵素サブチリシン様ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）は、肝臓中ＬＤＬ受容体を破壊し、結果的に血漿中ＬＤＬ値となるセリンプロテイナーゼである。ＰＣＳＫ９変異は、血漿脂質割合における改変に関連するある医学的障害を促進する機能獲得型起因を有し得る。ＰＣＳＫ９機能を阻害する薬剤は、表６に掲載するもの等、かかる医学的障害治療において役割を果たす。図２１および４７〜５３は、ＰＣＳＫ９発現をサイレンスする本発明に従う使用に適した化合物を提供する。
Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５： １１９１５， ２００８）は、ヒト、マウス、ラット、および非ヒト霊長類のＰＣＳＫ９遺伝子標的指向であり、モデル系においてそれらの活性が特性決定されている３つの異なる配列と本発明での使用に適した４つのｓｉＲＮＡ化合物を記載した。これらのｓｉＲＮＡはＨｅｐＧ２細胞を使用した活性スクリーニングによって１５０群から選択された。これらの化合物はｉｎ ｖｉｖｏ検査用脂質ナノ粒子で製法された。これらの化合物はラットおよびマウス肝ＰＣＳＫ９発現を５０〜７０％低減し、これは血漿コレステロール値の最大６０％低下を伴った。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子保因トランスジェニックマウスにおいて、ｓｉＲＮＡ化合物は肝臓内のこの遺伝子転写物値を＞７０％低減することが示された。ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの単一ボーラス注入後の非ヒト霊長類において、ＰＣＳＫ９発現に対する悪影響は３週間継続した。この時間中にアポＢおよびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬｃ）値は低減した。ＨＤＬコレステロールまたはトリグリセリドに対する検出可能な効果はなかった。米国特許第２００８／０１１３９３０号およびＷＯ２００７／１３４１６１号は本明細書に開示されたように修飾できる追加のＰＣＳＫ９ＲＮＡｉ化合物について開示している。
ＰＣＳＫ９遺伝子標的指向性の従来のアンチセンスオリゴは、いかに従来のアンチセンスオリゴが構成して本発明での使用に適した新規組成物物質を提供することができるかを示す別の例を提供する。かかる再配置は、ｓｉＲＮＡが本明細書に記載のように従来のアンチセンスオリゴより有利である状態において有用である。ヒトＰＣＳＫ９指向であり、本発明での使用に適している一連の従来のアンチセンスオリゴは、ＷＯ２００７／１４３３１５号に記載されている。これらの配列は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＣＳＫ９阻害活性をスクリーニングした中で最も活性のものであった。この出願に記載されている従来のアンチセンスオリゴは、８〜１６−ｍｅｒである。１５−ｍｅｒより短いガイド鎖は活性ではないことが知られている。さらに１６−ｍｅｒガイド鎖は、本発明での使用に示唆された最短である。かかる１６−ｍｅｒは、ガイド鎖の場合は本明細書に記載のように必ずしも遺伝子標的との塩基対の必要はないオーバーハングの使用によって延長できる。
かかる従来のアンチセンスオリゴでの使用またはガイド鎖がＰＣＳＫ９指向である細胞内ｓｉＲＮＡを形成可能な鎖の２工程投与での使用に適したいくつかの治療レジメンについては、ＷＯ２００８／１１８８８３号に記載されている。この出願における従来のアンチセンスオリゴはアポＢを標的とするが、関連組織およびＰＣＳＫ９に関連する治療目的は同一であり、したがって本質的に同一の治療レジメンを使用することができる。
このタンパク質は、コレステロール恒常性において主な調節役割を果たす。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の上皮成長因子様反復Ａ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合し、ＬＤＬＲ分解を誘発する。ＬＤＬＲ値低下により低密度リポタンパク質代謝低下に至り、これは、高コレステロール血症に至り得る。ＰＳＣＫ９機能の阻害は、コレステロール値を低減する手段を提供する。ＰＣＳＫ９は、皮質ニューロン分化においても役割を有し得る。
さらに、高コレステロール血症治療におけるマウスＰＣＳＫ９遺伝子標的指向性の従来のアンチセンスオリゴの有用性については、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （Ｊ ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４８： ７６３， ２００７）によって示されている。一連のアンチセンスオリゴの活性がスクリーニングされ、最も活性のもの（ＩＳＩＳ３９４８１４）がｉｎ ｖｉｖｏ試験用に選択された。高脂肪摂食マウスへのＩＳＩＳ３９４８１４の６週間投与によって、総血漿コレステロールは５３％低下し、血漿ＬＤＬは３８％低下した。これは肝臓ＰＣＳＫ９発現の９２％低下を伴った。
Ｅ．ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）発現を下方制御するための化合物
ＰＴＥＮは、効果または変異がその酵素活性を阻害する野生型ｐ５３を有する癌中で頻繁に変異しているホスファターゼ（ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸３−ホスファターゼ）である。この文脈において、ＰＴＥＮは腫瘍抑制剤として機能すると考えられる。しかしながら、変異ｐ５３を有する癌において、ＰＴＥＮは、部分的に機能獲得型ｐ５３変異値を増大することによって生存能および腫瘍増殖を支持する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８： １７２３， ２００８）。ＰＴＥＮは細胞周期調節タンパク質も調節し、細胞増殖阻害効果も有する。したがって、ＰＴＥＮ阻害剤は、一部の癌治療において、および移植等の目的のための細胞集団拡大等の細胞増殖促進において役割を有する。図８、１０、１２、１４、１６、１８、５４、５５および５７〜５９は、ＰＴＥＮ発現をサイレンスする本発明に従う使用に適した化合物を提供する。
末梢ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏ再生は律則されてめったに完了せず、残念ながら主な神経離断を呈する患者の経験する回復は限定される。ニューロン増殖シグナルの細胞内阻害はこれらの律則間であり得る。Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．は、成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット末梢ニューロンの再生中にＰＴＥＮの役割（染色体１０上で欠失したホスファターゼおよびテンシンホモログ）について調査した（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３０：９３０６−９３１５ （２０１０）。ＰＴＥＮは、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）／Ａｋｔシグナル伝達、共通のおよび中心的突起伸長ならびにニューロン成長因子の生存経路下流を阻害する。ＰＩ３−ＫおよびＡｋｔ突起伸長シグナルは発現し、再生中に成体末梢ニューロン内に活性化したが、ＰＴＥＮも同様に発現し、平衡状態になって、それらの支持を阻害した。ＰＴＥＮはニューロン核周部の細胞質、核、軸索再生成、およびシュワン細胞において発現した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ成体感覚ニューロンは、ｓｉＲＮＡを使用したＰＴＥＮの段階的な薬理的阻害とそのｍＲＮＡノックダウンの両方に反応した。両アプローチは独立したｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）経路であった神経突起伸長の可塑性において確固たる上昇を伴った。重要なことに、この加速した突起伸長は増大した突起伸長と共に前状態病巣を被ったニューロン内で生成した。さらに、重度の神経離断損傷に続き、損傷部位でのＰＴＥＮの局所薬理的阻害またはＰＴＥＮのｓｉＲＮＡノックダウンはｉｎ ｖｉｖｏ軸索突起伸長を加速した。本知見は、ＰＴＥＮ阻害を介して複合体再生環境内でさえ末梢ニューロン可塑性に顕著な影響を及ぼすことを示した。総括して、これらの知見は、神経修復に便益のある軸索内の固有の再生経路を広める新規経路を同定する。これらの知見を考慮して、ＰＴＥＮ指向性の本発明の化合物は、神経損傷および障害の治療に有用であり得ることが明らかである。１つの好ましい実施形態では、かかる薬剤はＴｏｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００６） １３９：４２９−４９にインスリンについて記載されているように髄腔内投与される。Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１： ２７０５， ２００３）は、本明細書に記載の本発明に従う使用に適しているヒトＰＴＥＮ遺伝子標的指向性の活動的ｓｉＲＮＡ化合物について記載した。Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８： ９０１， ２００５）は、ヒトＰＴＥＮを標的とする本発明における使用に適した２つのｓｉＲＮＡ化合物について記載した。
Ｆ．ＰＴＰ１Ｂ発現を下方制御するための化合物
インスリンの負の調節およびレプチンシグナル伝達として長く研究されている非膜貫通型タンパク質チロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｂは、腫瘍形成における予期せぬ正因子として新たな注目を集めている。これら二本鎖特徴は、ＰＴＰ１Ｂを糖尿病、肥満症、および潜在的に乳癌のための特に魅力的な治療標的とする。図５６、６１、６２および６７は、ＰＴＰ１Ｂ発現をサイレンスする本発明に従う使用に適した化合物を提供する。
インスリンシグナル伝達、ＰＴＰ１Ｂ脱リン酸化の場合、インスリン受容体（ＩＲ）ならびにその主要基質、ＩＲＳタンパク質、下流要素のレプチンシグナル伝達と対照的に、チロシンキナーゼＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ２）は脱リン酸化の主要標的である。しかしながら、ＰＴＰ１Ｂは細胞増殖において正シグナル伝達役割も果たし得るという暗示が、ＰＴＰ１ＢはＳｒｃ内阻害性Ｙ５２９部位を脱リン酸化し、したがってこのキナーゼを活性化するといういくつかの群による知見と共に数年前に出現し始めた。他のＰＴＰ１Ｂ基質も増殖促進効果に関与し得る。実際、ＰＴＰ１Ｂは一部の場合においてシグナル伝達刺激物として役立ち得るという概念は、ＰＴＰ１ＢはＥｒｂＢ２誘発性乳癌マウスモデルにおける積極的な役割を果たすことを示した先行作用における重要な確認を受けた。Ｙｉｐ ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３５：４４２−４４９ （２０１０）を参照されたい。これらの理由から、ＰＴＰ１Ｂは、肥満症、糖尿病、および現在では癌における潜在的治療標的として特定の注目を集めている。したがって、ＰＴＰ１Ｂ指向性の化合物をかかる障害の治療に有利に使用することができる。
実施例２
ｓｅｑＩＭｉＲ適応
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現に対して広範囲の効果を有することが示されている。ある例では、これらの効果は有害であり、ある病理学に関する。したがって、分解のためのかかるｍｉＲＮＡを標的とする特異的なｍｉＲＮＡ阻害剤が強く所望される。本発明者は、向上した安定性、細胞内の活性二本鎖形成能を示し、順に疾患関連内因性ｍｉＲＮＡ活性を阻害するように作用するｉｎ ｖｉｖｏ送達に適したｍｉＲＮＡ阻害剤の合成戦略を発明した。これらの設計パラダイムおよび得られたｍｉＲＮＡ阻害剤を本明細書の以下に記載する。
表７は、指定のｍｉＲＮＡ指向性のｓｅｑＩＭｉＲの医学的使用の一部の一覧を提供する。図６８〜８１は、これらのｍｉＲＮＡ標的活動を阻害する上で効果的であるｓｅｑＩＭｉＲ鎖の対を提供する。しかしながら、本発明の方法は、任意のｍｉＲＮＡに対してｓｅｑＩＭｉＲを生成するために使用することができる。本発明のオリゴ投与方法を上に詳細に提供する。
Figure 2014519806
異なるタイプの従来のアンチセンスオリゴは、研究、開発および治療目的において、特定の内因性ｍｉＲＮＡの競合阻害剤として潜在的使用のために開発中である。かかるオリゴは、活動が阻害されるｍｉＲＮＡの一本鎖に特に強く結合するように設計される。これらのオリゴは立体障害機序によって作用する。
例えば、上昇ｍｉＲ−２１値は、少なくとも部分的にＰＤＣＤ４翻訳および蓄積を予防することによって発癌を促進する多数の癌において発現する。別の例は、Ｃ型肝炎ウイルス複製を促進するｍｉＲ−１２２肝臓特異的ｍｉＲＮＡである。これらのｍｉＲＮＡを阻害する従来のアンチセンスオリゴは、潜在的治療薬として開発中である。
ＲＮａｓｅ Ｈ依存性であるもの等、標的に対して触媒活性を引き起こすアンチセンスオリゴと比較し、競合阻害剤として機能するアンチセンスオリゴは実質的に高濃度で使用されなければならない。Ｉｎ ｖｉｖｏ各種組織はオリゴを広範囲量で取り込む。例えば、肝臓および腎臓は比較的大量に取り込むが、静止リンパ球、精巣、骨格筋、ＣＮＳ、および他の組織ははるかに少量を取り込む。さらに、競合阻害剤機能を有するアンチセンスオリゴは、熱心にオリゴを取り込まない組織内でほとんど実施しないことが示されている。したがって、広範囲の組織タイプが効率的ｍｉＲＮＡ阻害を対象とし得るように、それらに対して触媒活性を有するオリゴヌクレオチドベースｍｉＲＮＡ阻害剤を有することが強く所望される。本発明は、この差し迫った必要性に対して解決策を提供する。
実施例３
ｓｅｑＭｉＲのための適応例
下表８に、特異的なｓｅｑＭｉＲ化合物の例が本明細書に提供されているｍｉＲＮＡ列挙を提供する。本発明の方法は、市販目的において任意の内因性ｍｉＲＮＡを模倣して、内因性ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡタイプサイレンシングパターンを改善するために使用することができ、設計的新規ｍｉＲＮＡ様化合物を生成するために使用することができる。
Figure 2014519806
現在、ｍｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）および他のＲＮＡｉ関連経路は、遺伝子調節が複合体の必須層を示すことが十分に確立されている。ＲＮＡｉを使用した遺伝子サイレンシングは、いくつかの異なる病理学基礎障害に関連する遺伝子発現除去のための治療戦略としてさらに大きな可能性を示す。
内因性ｍｉＲＮＡカウンターパートに密接に基づくいくつかの従来のｍｉＲＮＡ化合物は、潜在的治療薬として開発中である。いくつもの異なるｍｉＲＮＡが癌細胞中で正常なカウンターパートより非常に低値で発現することが見出されているため、癌は病巣の１領域である。さらに、これらのｍｉＲＮＡ置換は、深い抗癌効果を有し得ることが示される。いくつかの具体例を表に提供する。図２、９、１１、１３、１５、１７、１９および８２〜９７は、指定状態の治療に有用であるべきである表８に示す内因性ｍｉＲＮＡに基づく潜在的抗癌剤を含む種々の異なるｓｅｑＭｉＲ化合物を提供する。
提供されたｍｉＲＮＡ模倣はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養においても効果的であるべきである。このアプローチでは、第１鎖を標的細胞内にトランスフェクトし、続いて、ある時間枠が経過後に第２鎖を後続トランスフェクションできる。この方法は、創薬努力、標的検証を促進すべきであり、任意の望ましくない標的外効果を低減するかまたは除去する手段も提供する。
本発明のある好ましい実施形態が記載され、上に具体的に例示されているが、本発明がかかる実施形態に限定されることは意図されない。以下の特許請求の範囲に説明するように、本発明の範囲および真意から逸脱することなく様々な修正を行い得る。

本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］ 哺乳動物細胞内標的配列の発現を阻害する核酸ベース化合物であり、前記核酸ベース化合物が
ｉ）ヌクレアーゼ耐性；
ｉｉ）生物学的利用能、ならびに
ｉｉｉ）前記細胞内の阻害活性
を増大するように修飾された一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含み；前記化合物はビヒクル中一本鎖形態でｉｎ ｖｉｖｏ送達可能であり、前記化合物は、
ａ）図に示す化合物または
ｂ）ａ）の二本鎖化合物からなる群から選択され、
前記二本鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ連続投与後に細胞内で形成され、前記二本鎖は細胞内二本鎖形成時に前記遺伝子生成物発現のＲＮＡｉ依存性サイレンシングを効果的に引き起こし；
前記化合物は前記ｉｎ ｖｉｖｏ標的細胞内で前記修飾のない核酸化合物と比較して向上したサイレンシング活性を示す、
哺乳動物細胞内標的配列の発現を阻害する核酸ベース化合物。
［２］ 前記標的配列が、ｍＲＮＡ、複数のｍＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ分子からなる群から選択される、上記［１］の化合物。
［３］ 前記化合物が、標的ｍＲＮＡ配列のＡＧＯ２切断トリガーである、上記［１］の化合物。
［４］ 前記化合物が、少なくとも１つの治療的関連ｍｉＲＮＡ分解トリガーである、上記［１］の化合物。
［５］ 内因性治療的関連ｍｉＲＮＡ活性を模倣する、上記［１］の化合物。
［６］ 一本鎖の連続投与後、センス鎖およびアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド鎖の細胞内二本鎖を形成し、前記センス鎖が１０〜２５ヌクレオシド長であり、アンチセンス鎖が１６〜２５ヌクレオシド長である、上記［１］の化合物。
［７］ 前記オリゴヌクレオチドが、２’フルオロ、２’フルオロ置換リボース、２’−フルオロ−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルデオキシリボース、２’−Ｏ−メチル置換リボース、モルホリノ、ピペラジン、および固定核酸（ＬＮＡ）等からなる群から選択される修飾糖を少なくとも１つ含む、上記［１］の化合物。
［８］ 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、エチルホスホネート連結、ボラノホスファート連結、スルホンアミド、カルボニルアミド、ホスホロジアミデート、正電荷側基を含むホスホロジアミデート連結、ジチオリン酸、アミノエチルグリシン、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル；３’−アルキレンホスホネート；５’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイト、アミノアルキルホスホラミダイト、チオノホスホラミダイト；チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスファート、２’−５’連結ボラノホスファートネートアナログ、逆極性を有する連結、脱塩基連結、短鎖アルキル連結、シクロアルキルインターヌクレオシド連結、混合したヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド連結、短鎖ヘテロ原子またはシロキサン骨格を有する複素環インターヌクレオシド連結、硫化物、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル連結、チオホルムアセチル連結、メチレンホルムアセチル連結、チオホルムアセチル連結、リボアセチル連結、アルケン連結、スルファメート骨格、メチレンイミノ連結、メチレンヒドラジノ連結、スルホン酸連結、およびアミド連結からなる群から選択される修飾骨格連結を少なくとも１つ含み、前記連結は任意にオーバーハング前駆体に出現する、上記［１］の化合物。
［９］ 前記オリゴが、ボラノホスファート連結を少なくとも１つ含む、上記［１］の化合物。
［１０］ 前記オリゴが、２’−フルオロまたは２’−Ｏ−メチル置換リボースを少なくとも１つ含む、上記［１］の化合物。
［１１］ 基準、平滑末端、非対称、分枝変異型、または小内的セグメント化配置からなる群から選択されるアーキテクチャ配置である、上記［１］の化合物。
［１２］ 基準配置である、上記［１１］の化合物。
［１３］ 平滑末端配置である、上記［１１］の化合物。
［１４］ 非対称配置である、上記［１１］の化合物。
［１５］ 小内的セグメント化配置である、上記［１１］の化合物。
［１６］ センス鎖およびアンチセンス鎖が片端もしくは両端に１〜４単位からなるオーバーハング前駆体を少なくとも１つ含み、前記前駆体が修飾連結を少なくとも１つ含む、上記［６］の化合物。
［１７］ 前記アンチセンス鎖が、１〜４単位からなる３’末端オーバーハング前駆体を有し、前記前駆体が修飾連結を少なくとも１つ有する、上記［１６］に請求する化合物。
［１８］ アンチセンス鎖５’末端から１０および１１位、ならびにこれらのいずれか側の隣接３つのヌクレオシドにヌクレオシド標的コードを含み、介在連結および表２に説明するヌクレアーゼ耐性修飾をさらに少なくとも１つ含む、上記［１］の化合物。
［１９］ 標的コードがヘアピン二本鎖内に標的コードを含む鎖内でヘアピンを形成し、したがって、標的コードを分解から保護する、上記［１８］に請求する化合物。
［２０］ 標的コードが相補性二本鎖を形成する正確な部位での切断のための伝令ＲＮＡを標的とする、上記［１８］に請求する化合物。
［２１］ 前記化合物が、アンチセンス鎖５’末端から２〜８位ヌクレオシドに基づき標的コードを有し、前記化合物の３末端で十分な相補性を有する伝令ＲＮＡ群の発現を阻害する、上記［６］に請求する化合物。
［２２］ 標的コードが、ヘアピン二本鎖内に標的コードを含む鎖内でヘアピンを形成することによってさらに保護されている、上記［２１］に請求する化合物。
［２３］ 前記化合物内の前記標的コードが、表２に掲載される修飾からなる群から選択される修飾を少なくとも１つ含み、その存在が前記少なくとも１つの標的ｍＲＮＡの３’末端非翻訳領域で標的配列の標的コード配列の親和性を増大し、センス鎖内の対応配列が、アンチセンス鎖配列の標的コードの不適合を含み、さらに一本鎖内の親和性改変修飾が他鎖と比較して２つ以下である、上記［２１］に請求する化合物。
［２４］ 前記標的コードおよび対応センス鎖配列が二本鎖ビヒクルの対応領域に挿入され、前記二本鎖ビヒクルが、ダイサープロセシング後の特定の内因性ｍｉＲＮＡ二本鎖、活性ｉＲＮＡ二本鎖、ＲＩＳＣ積み込み可能なｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ陰性対照二本鎖からなる群から選択される、上記［２１］に請求する化合物。
［２５］ ｐ５３を標的とする、上記［１］の化合物。
［２６］ 医療手当方法における標的遺伝子の発現阻害における使用のための第１および第２オリゴヌクレオチドを含み、前記方法が、第１オリゴヌクレオチドが第２オリゴヌクレオチドより先に標的遺伝子発現細胞によって取り込まれ、第１および第２オリゴヌクレオチドが細胞内二本鎖を形成し、したがって遺伝子標的発現阻害を惹起するように第１および第２オリゴヌクレオチドの連続投与を含む；前記第１および／または前記第２オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性を増大するように適合している、上記［１］に請求する化合物。
［２７］ 前記第１オリゴヌクレオチドが第２オリゴヌクレオチドに関して切断されている、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［２８］ 前記第１オリゴヌクレオチドが５’末端と３’末端間Ｔｍが低い、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［２９］ 前記第１オリゴヌクレオチドがアルゴノート２切断部位を含む、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３０］ 二本鎖が細胞内で会合時に３’および／または５’末端でオーバーハングを形成する、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３１］ ２つ以上の第１オリゴヌクレオチドが連続的配列として提供される、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３２］ 前記第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、ヘアピン形成可能である、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３３］ 前記第１オリゴヌクレオチドがセンス鎖であり、第２オリゴヌクレオチドがアンチセンス鎖である、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３４］ 前記第１オリゴヌクレオチドがアンチセンス鎖であり、第２オリゴヌクレオチドがセンス鎖である、上記［２６］に記載の第１および第２オリゴヌクレオチド。
［３５］ 製剤が、経口、口腔内、肺内、髄腔内、経腸、子宮内、腫瘍内、頭蓋内、鼻腔内、筋肉内、皮下、血管内、髄腔内、吸入、経皮、皮内、腔内、移植、イオントフォレーシス、眼内、膣内、関節内、眼局所、静脈内、筋肉内、腺内、臓器内、リンパ内、移植、遅い放出、および腸溶コーテイング製剤からなる群から選択される、上記［１］乃至上記［３４］の化合物を含む製剤。
［３６］ 哺乳動物内の目的の細胞または組織内における核酸配列標的発現の下方調節方法であり、前記方法は
ａ）有効量の上記［１］乃至上記［３４］の化合物を投与する方法、ならびに
ｂ）酸化防止剤、ポリ不飽和脂肪酸、化学治療薬、ゲノム障害剤、およびイオン化放射線からなる群から選択される増強剤を任意に投与する方法
を含み、前記化合物は
前記ｉｎ ｖｉｖｏ細胞もしくは組織内にＲＮＡｉ依存形態で
ｉ）標的ｍＲＮＡ核酸配列の分解を誘発すること；または
ｉｉ）前記核酸配列により産生されたタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害すること；または
ｉｉｉ）標的ｍｉＲＮＡ核酸配列の分解を誘発すること；または
ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ標的核酸配列の活性を模倣すること
に効果的である、哺乳動物の目的の細胞もしくは組織内における核酸配列標的発現の下方調節方法。
［３７］ 前記化合物が２つの相補鎖を含み、前記方法が
ａ）第１鎖を前記哺乳動物内細胞に投与し、前記第１鎖の細胞取り込みが生じる適切な期間を提供する方法、
ｂ）第２鎖をａ）の細胞に投与する方法であり、前記第１鎖および前記第２鎖が前記標的核酸配列発現を下方調節する上で効果的である細胞内二本鎖を形成する方法、
を含む、上記［３６］の方法。
［３８］ 工程ｂ）が、工程ａ）後約４〜約２４時間に行われる、上記［３７］の方法。
［３９］ 前記疾患が、癌、エイズ、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、小脳変性症、癌、真性糖尿病、糸球体腎炎、心不全、黄斑変性、多発性硬化症、骨髄異形成症候群、パーキンソン病、前立腺過形成、乾癬、喘息、網膜変性、網膜色素変性症、関節リウマチ、アテロームプラーク破裂、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ウイルス感染、虚血再灌流損傷、脊髄損傷、神経損傷、心肥大、およびダイアモンドブラックファン貧血から選択される、疾患治療のための上記［３７］の方法。
［４０］ 前記疾患が癌である、上記［３９］の方法。
［４１］ 前記疾患がエイズである、上記［３９］の方法。
［４２］ 標的遺伝子に対してｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡｉ効果を改善するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であり、前記方法が
（ｉ）細胞内で二本鎖を形成可能な第１および第２オリゴヌクレオチド配列を得る方法；
（ｉｉ）ヌクレアーゼ耐性を増大するように前記第１および／もしくは前記第２オリゴヌクレオチド配列を修飾する方法；
（ｉｉｉ）前記第１オリゴヌクレオチド配列を標的遺伝子発現細胞と接触させる方法；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）後に前記第２オリゴヌクレオチド配列を前記細胞と接触させる方法ならびに；
（ｖ）工程（ｉｉ）なしの標的遺伝子の発現と比較して標的遺伝子発現を決定する方法、を含む方法。
［４３］ 前記第１オリゴヌクレオチドが、第２オリゴヌクレオチドに関して切断されている、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４４］ 前記第１オリゴヌクレオチドが、５’末端と３’末端間Ｔｍが低い、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４５］ 前記第１オリゴヌクレオチドがアルゴノート２切断部位を含む、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４６］ 二本鎖が細胞内で形成時に３’および／または５’末端でオーバーハングを構成するように設計される、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４７］ ２つ以上の第１オリゴヌクレオチドが連続的配列として提供される、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４８］ 前記第１オリゴヌクレオチドがセンス鎖であり、第２オリゴヌクレオチドがアンチセンス鎖である、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［４９］ 前記オリゴヌクレオチドが、図に示すオリゴヌクレオチド群から選択される、上記［４２］に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
［５０］ 図に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴヌクレオチド投与を少なくとも１つ含む表６、７または８に掲載される、障害の治療方法。
［５１］ 図に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも２つのオリゴの連続投与を含む表６、７または８に掲載される遺伝子標的によって媒介される障害の治療方法であり、前記オリゴが標的細胞内で二本鎖を形成し、前記二本鎖は前記標的遺伝子発現を下方調節する上で効果的であり、それによって、症状を改善するかもしくは前記障害を処置する、障害の治療方法。

Claims (15)

  1. 対象内の細胞における目的の少なくとも１つの標的リボ核酸の発現をサイレンシングする２つのオリゴリボヌクレオチド鎖を含むｓｅｑｓｉＲＮＡであって、
    前記ｓｅｑｓｉＲＮＡが、
    ａ）第１の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第１のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、ヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、前記細胞での前記第１の鎖の標的外効果を低減しながら確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第１のオリゴリボヌクレオチド鎖；および
    ｂ）第２の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第２のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、連結部位のヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、前記細胞での前記第２の鎖の標的外効果を低減しながら確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第２のオリゴリボヌクレオチド鎖
    を含み、
    前記医薬的に許容可能なビヒクルにおける前記オリゴリボヌクレオチド鎖は、対象における細胞内取り込みを促進することができるプロドラッグも担体もなく、
    ｉ）前記第１および第２のａ）およびｂ）の鎖は、相補的であり、かつ、いずれのオーバーハング前駆体も除いて１６〜２３塩基長の２本鎖を形成することができ；
    ｉｉ）１〜４単位長のオーバーハング前駆体が一方の鎖の３’末端に存在してよく；
    ｉｉｉ）第１または第２の鎖がＲＮＡｉパッセンジャー鎖として機能するセンス鎖であり、
    ｉｖ）前記相補的なアンチセンス鎖はＲＮＡｉガイド鎖として機能し、
    ｖ）前記第１および第２の鎖の２本鎖は、前記標的リボ核酸をサイレンシングする細胞でのｓｉＲＮＡ活性を生じることができ、
    前記第１および第２のオリゴリボヌクレオチド鎖の続く対象への投与後に、前記鎖が、前記パートナー鎖も、担体なしで送達される配列同一的な従来のＲＮＡｉ依存性化合物もなく投与された時に見られる効果と比較して、前記鎖は、対象における前記細胞内での前記標的リボ核酸の増強したサイレンシングを示す、前記ｓｅｑｓｉＲＮＡ。
  2. アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、癌、糖尿病およびエイズから選択される疾患を治療する対象内の目的の細胞での標的リボ核酸（ＲＮＡ）の発現または機能を下方調節するための薬剤を調製するための、請求項１に記載のｓｅｑｓｉＲＮＡの使用であって、
    ａ）対象に前記第１の鎖を投与すること、
    ｂ）前記第１の鎖の細胞内取り込みが生じるために少なくとも１時間を与えること、
    ｃ）前記対象に前記第２の鎖を投与すること、
    を含み、
    前記第１の鎖および前記第２の鎖は、
    ｉ）前記標的リボ核酸の発現を下方調節するのに効果的であり、および／または
    ｉｉ）ＲＮＡｉ依存性機序によって特異的なＲＮＡ標的機能をサイレンシングするのに効果的である、
    前記使用。
  3. 前記標的遺伝子の阻害が、表６に記載された医学的状態を治療するのに効果的である、請求項２に記載の使用。
  4. 前記標的遺伝子の阻害が、機能的ゲノムアッセイにおいて標的の生物学的活性を評価するために使用される、請求項２に記載の使用。
  5. 前記標的を少なくとも５０％下方制御する、請求項１に記載のｓｅｑｓｉＲＮＡ。
  6. 対象内の細胞における目的のｍｉＲＮＡの発現を阻害する２つの核酸の鎖を含むｓｅｑＩＭｉＲであって、
    ａ）第１の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第１のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、ヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第１のオリゴリボヌクレオチド鎖；
    ｂ）第２の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第２のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、ヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第２のオリゴリボヌクレオチド鎖
    を含み、
    前記医薬的に許容可能なビヒクルにおける前記オリゴリボヌクレオチド鎖は、対象における細胞内取り込みを促進することができるプロドラッグも担体もなく、
    ｉ）前記第１および第２のａ）およびｂ）の鎖は、相補的であり、かつ、いずれのオーバーハング前駆体も除いて１６〜２３塩基長の２本鎖を形成することができ；
    ｉｉ）１〜４単位長のオーバーハング前駆体が一方の鎖の３’末端に存在してよく；
    ｉｉｉ）前記第１または第２の鎖がＲＮＡｉパッセンジャー鎖として機能するセンス鎖であり、
    ｉｖ）前記相補的なアンチセンス鎖はＲＮＡｉガイド鎖として機能し、
    ｖ）前記第１および第２の鎖の２本鎖は、前記ｍｉＲＮＡ標的をサイレンシングする細胞でのｓｉＲＮＡ活性を生じることができ、
    前記第１および第２の鎖の続く対象への投与後に、前記鎖が、前記パートナー鎖も、担体なしで送達される配列同一的な従来のＲＮＡｉ依存性化合物もなく投与された時に見られる効果と比較して、前記鎖は、対象における前記細胞内の前記ｍｉＲＮＡの増強したサイレンシングを示す、前記ｓｅｑＩＭｉＲ。
  7. 癌、病的アポトーシス、ＨＤＬレベルの上昇、Ｃ型肝炎、自己免疫炎症および慢性心不全から選択される疾患を治療する対象内の目的の細胞でのｍｉＲＮＡの発現を下方調節するための薬剤を調製するための、請求項６に記載のｓｅｑＩＭｉＲの使用であって、
    ａ）対象に前記第１の鎖を投与すること、
    ｂ）前記第１の鎖の細胞内取り込みが生じるために少なくとも１時間を与えること、
    ｃ）前記対象に前記第２の鎖を投与すること、
    を含み、
    前記第１の鎖および前記第２の鎖は、前記標的ｍｉＲＮＡの発現および／または機能を下方調節するのに効果的であり、前記標的は、少なくとも５０％サイレンシングされてよい、
    前記使用。
  8. 治療されるべき前記医学的状態が、表７に記載されるものである、請求項７に記載の使用。
  9. 前記ｍｉＲＮＡの阻害が、機能的ゲノムアッセイにおいて標的の生物学的活性を評価するために使用される、請求項８に記載の使用。
  10. ｍｉＲＮＡ機能を模倣するｓｅｑＭｉＲであって、
    ａ）第１の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第１のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、ヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第１のオリゴリボヌクレオチド鎖；
    ｂ）第２の医薬的に許容可能なビヒクルにおける第２のオリゴリボヌクレオチド鎖であって、ヌクレアーゼ安定性を促進し、かつ、確固たるサイレンシング活性を促進するのに有効な修飾を含む、前記第２のオリゴリボヌクレオチド鎖
    を含み、
    前記医薬的に許容可能なビヒクルにおける前記オリゴリボヌクレオチド鎖は、対象における細胞内取り込みを促進することができるプロドラッグも担体も含まず、
    ｉ）前記第１および第２のａ）およびｂ）の鎖は、相補的であり、かつ、いずれのオーバーハング前駆体も除いて１６〜２３塩基長の２本鎖を形成することができ；
    ｉｉ）１〜４単位長のオーバーハング前駆体がアンチセンス鎖の３’末端に存在してよく；
    ｉｉｉ）前記第１または第２の鎖がＲＮＡｉパッセンジャー鎖として機能するセンス鎖であり、
    ｉｖ）前記相補的なアンチセンス鎖はＲＮＡｉガイド鎖として機能し、
    ｖ）前記第１および第２の鎖の２本鎖は、ｍｉＲＮＡの機能を模倣することができ、
    前記第１および第２のオリゴリボヌクレオチド鎖の続く対象への投与後に、前記鎖は、細胞および組織に広く取り込まれ、これにより、前記鎖が、ｍｉＲＮＡ２本鎖として投与された時に見られる効果に対して、生物学的利用能を増強し、かつ、確固たるサイレンシング活性を生じ、
    前記標的を少なくとも２５％サイレンシングしてよい、前記ｓｅｑＭｉＲ。
  11. 前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて２〜８位または２〜７位ヌクレオシドからなるシード領域を含む、請求項１０に記載のｓｅｑＭｉＲ。
  12. 請求項１０に記載のｓｅｑＭｉＲを含む二本鎖ビヒクルであって、
    前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて２〜８位または２〜７位ヌクレオシドからなるシード配列を含み、
    前記シード配列は、目的のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに相補的であり、
    前記シード配列は、内因性ｍｉＲＮＡに対応し、または新規シード配列であり、かつ、
    ｉ）標的外効果を最小限に抑え、
    ｉｉ）ＲＩＳＣ積み込みを促進し、および
    ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の保持を高める、
    べく修飾される、前記二本鎖ビヒクル。
  13. 請求項１２に記載の二本鎖ビヒクルであって、
    修飾されるべき前記鎖が、内因性ｍｉＲＮＡ二本鎖、従来のｓｉＲＮＡ化合物、およびｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ陰性対照になるべく目的の対象種のために確立されている二本鎖からなる群から選択される、
    前記二本鎖ビヒクル。
  14. 癌、虚血再潅流損傷、糖尿病、線維症、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞から選択される疾患を治療する対象内の目的の細胞における少なくとも１つのｍＲＮＡの発現をサイレンシングする薬剤を調製するための、請求項１０に記載のｓｅｑＭｉＲの使用であって、
    ａ）対象に前記第１の鎖を投与すること、
    ｂ）前記第１の鎖の細胞内取り込みが生じるために少なくとも１時間を与えること、
    ｃ）前記対象に前記第２の鎖を投与すること、
    を含み、
    前記第１の鎖および前記第２の鎖は、前記標的ｍＲＮＡの発現を下方調節するのに効果的であり、および／または、前記鎖は、前記標的遺伝子によって製造されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的である、
    前記使用。
  15. 請求項１４に記載の使用であって、
    ｉ）目的の細胞における少なくとも１つの標的リボ核酸を抑制し、前記対象に治療的有益性をもたらすための；および／または
    ｉｉ）機能的ゲノムアッセイにおいて少なくとも１つの標的を抑制する効果を評価するための；および／または
    ｉｉｉ）表８に記載された状態を治療するための
    前記使用。
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