KR20220160036A - 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 면역 유도제 및 그것을 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 면역 유도제 및 그것을 포함하는 의약 조성물 Download PDF

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신이치 모치즈키
마코토 고이즈미
고지 모리타
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더 유니버시티 오브 키타큐슈
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서, 상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고, 상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 면역 유도제 등을 제공한다.

Description

폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 면역 유도제 및 그것을 포함하는 의약 조성물
본 발명은, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제, 그것을 포함하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.
수상 세포, 매크로파지, B 세포 등의 항원 제시 세포에 존재하는 Toll 형 수용체 (TLR) 패밀리는, 다양한 병원체와 반응하여, 사이토카인의 산생을 유도하고, 나이브 T 세포의 Th1 세포로의 분화의 촉진, 킬러 T 세포의 활성화 등을 통하여, 획득 면역을 유도하는 것이 알려져 있다. 일련의 TLR 패밀리에 의해 인식되는 병원체의 구성 성분은 다방면에 걸치는데, 그 중 하나로 TLR9 의 리간드인, CpG 모티프를 갖는 DNA (CpG DNA) 가 있다. CpG 모티프는, 중심부에 사이토신 (C) 과 구아닌 (G) 이 나열되고, 전후에 푸린 염기 및 피리미딘 염기가 2 개씩 나열된 6 개의 염기를 기본으로 하고, -PuPu-CG-PyPy- (Pu 는 푸린 염기를, Py 는 피리미딘 염기를 나타낸다.) 로 나타내는 서열로 (인간인 경우에는, GTCGTT 도 TLR9 에 대한 리간드 활성을 갖고 있는 것이 알려져 있다.), 포유류에는 적게, 미생물에는 많이 보이는 염기 서열이다. 또, 포유류에 있어서는, 소수 존재하는 CpG 모티프의 대부분이 메틸화를 받고 있다. 포유류 중에 거의 존재하지 않는 비메틸화 CpG 모티프는, 강력한 면역 부활 활성을 갖고 있다 (예를 들어, 비특허문헌 1 ∼ 3 참조). 엔도사이토시스에 의해 세포 내에 도입된 CpG DNA 는, 파고솜형 소포체에 존재하는 TLR9 에 의해 인식되고, 인터페론-γ (IFN-γ) 나 인터류킨-2 (IL-2) 와 같은 Th1 사이토카인 산생을 가져와, Th1 반응을 강하게 유도한다. Th1 반응은, Th2 반응이 우위인 알레르기 반응을 억제함과 함께, 매크로파지나 세포 장해성 T 세포 (CTL) 를 활성화하여 세포성 면역에 의한 강한 항종양 활성을 갖는다.
CpG DNA 는, 감염 예방에 더하여, 알레르기 질환, 종양성 질환에 대한 아쥬반트로서도 기대되고 있다. CpG DNA 를 항원과 공유 결합시킨 컨쥬게이트에 대해서는, 예를 들어 이하의 보고가 있다.
비특허문헌 4 에는, CpG DNA 와 오브알부민 (OVA) 항원 유래의 18 ∼ 24 mer 의 펩티드의 컨쥬게이트에 의해, 수상 세포로의 도입 및 항원 제시가 촉진된 것이 기재되어 있다.
비특허문헌 5 및 6 에는, CpG DNA 와 OVA 항원 단백질의 컨쥬게이트에 의해, in vitro 에 있어서 T 세포 활성화가 유도되는 것이 기재되어 있다. 또 비특허문헌 5 에는, in vivo 에 있어서 항원 특이적 세포 상해 활성이 유도된 것이 기재되어 있다.
비특허문헌 7 에는, CpG 올리고뉴클레오티드와 종양 관련 단백질 또는 세포의 컨쥬게이트를 제조하는 방법이 기재되어 있다.
특허문헌 1 에는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 항원성을 갖는 펩티드의 컨쥬게이트를 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제가 개시되어 있고, 항원 특이적인 높은 면역 유도 활성을 갖는 것이 나타나 있다.
PCT/JP2019/038090
Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger. H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999). CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects. M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002). The discovery of immunostimulatory DNA sequence. S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000). Distinct Uptake Mechanisms but Similar Intracellular Processing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates in Dendritic Cells. Khan S. et al., J. Biol. Chem. 282, 21145-21159 (2007). Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-Antigen Conjugate Enhances Anti-tumor Immunity. Kramer K. et al., Mol. Ther. 25, 62-70 (2017). Comparative Study of 5'- and 3'-Linked CpG-Antigen Conjugates for the Induction of Cellular Immune Responses. Kramer K. et al., ACS Omega 2 (1), 227-235 (2017) TLR-9 agonist immunostimulatory sequence adjuvants linked to cancer antigens, Shirota H. and Kli㎚an D. M., Methods Mol. Biol. 1139, 337-344 (2014)
특허문헌 1 에 있어서, 본 발명자들은, OVA 유래의 항원성을 갖는 펩티드를 사용한 연구에 의해, CpG DNA-펩티드 컨쥬게이트가 높은 세포 상해성 T 세포 (CTL) 유도능을 갖는 것을 나타냈다. 그 한편, 다른 항원 펩티드에 대해 동일한 CpG DNA-펩티드 컨쥬게이트를 제조한 경우, 충분한 CTL 유도능이 얻어지지 않는 경우가 있는 것이 판명되었다. 본 발명의 목적은, 보다 광범위한 항원 펩티드에 대해, CTL 활성의 유도가 가능한 면역 유도제 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, CpG DNA-펩티드 컨쥬게이트로 하면 충분한 CTL 유도능이 얻어지지 않는 펩티드에 대해 연구한 결과, 컨쥬게이트화를 위해 펩티드의 N 말단에 시스테인 등의 아미노산을 부가하면, 본래 MHC 분자에 결합성이었던 펩티드 (MHC 결합 펩티드) 가 MHC 분자에 결합할 수 없게 되는 것을 알아냈다. 또한, MHC 결합 펩티드의 N 말단에 그대로 시스테인 등의 아미노산을 부가한 펩티드가 아니라, 앵커 잔기를 포함하지 않는 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산을 시스테인 등의 아미노산으로 치환한 펩티드를 사용함으로써, 높은 CTL 유도능을 갖는 CpG DNA-펩티드 컨쥬게이트를 제조할 수 있는 것을 알아냈다. 본 발명자들은, 더욱 예의 연구하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.
[1] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 면역 유도제.
[2] 상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인, [1] 에 기재된 면역 유도제.
[3] 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체 (類緣體) 인, [1] 또는 [2] 에 기재된 면역 유도제.
[4] 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합인, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[5] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[6] 상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드인, [5] 에 기재된 면역 유도제.
[7] 상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하인, [5] 또는 [6] 에 기재된 면역 유도제.
[8] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-2 결합 펩티드인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[9] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체인, [1] ∼ [8] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[10] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 15 이상 40 이하인, [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[11] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하인, [10] 에 기재된 면역 유도제.
[12] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인, [1] 내지 [11] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[13] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [12] 에 기재된 면역 유도제.
[14] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [13] 에 기재된 면역 유도제.
[15] 상기 스페이서가, 하기의 식으로 나타내는 반복 단위를 포함하는, [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기의 식에 있어서,
X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다),
R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH 및 (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.),
n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
[16] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, [1] 내지 [15] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[화학식 2]
Figure pct00002
[17] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[화학식 3]
Figure pct00003
[18] [1] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인,
상기 면역 유도제.
[19] [1] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체이고,
상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합이고,
상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하이고,
상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고,
상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는,
상기 면역 유도제.
[화학식 4]
Figure pct00004
[20] 아쥬반트로서, 면역 부활 활성을 갖는 물질을 추가로 포함하는, [1] 내지 [19] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 포함하는 의약 조성물.
[22] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용인, [21] 에 기재된 의약 조성물.
[23] 종양의 치료 또는 예방용인, [21] 에 기재된 의약 조성물.
[24] 환자에 대해 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하는, 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법.
[25] 환자에 대해 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료 또는 예방 방법.
[26] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[27] 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제.
[28] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제의 사용.
[29] 종양의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제의 사용.
[30] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[31] [30] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[32] [30] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체이고,
상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합이고,
상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하이고,
상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고,
상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[화학식 5]
Figure pct00005
또 본 발명은, 이하의 [A1] ∼ [A19] 를 제공하는 것이다.
[A1] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A2] 상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인, [A1] 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A3] 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체인, A1 또는 A2 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A4] 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합인, A1 내지 A3 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A5] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드인, A1 내지 A4 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A6] 상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드인, A5 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A7] 상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하인, A5 또는 A6 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A8] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-2 결합 펩티드인, A1 내지 A4 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A9] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체인, A1 ∼ A8 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A10] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 15 이상 40 이하인, A1 내지 A9 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A11] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하인, A10 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A12] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인, A1 내지 A11 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A13] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, A12 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A14] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, A13 에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A15] 상기 스페이서가, 하기의 식으로 나타내는 반복 단위를 포함하는, A1 내지 A14 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[화학식 6]
Figure pct00006
상기의 식에 있어서,
X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다),
R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH 및 (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.),
n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
[A16] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, A1 내지 A15 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[화학식 7]
Figure pct00007
[A17] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, A1 내지 A14 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[화학식 8]
Figure pct00008
[A18] [A1] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[A19] [A1] 에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체이고,
상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합이고,
상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드이고,
상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하이고,
상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고,
상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
[화학식 9]
Figure pct00009
또 본 발명은, 이하의 [A20] 및 [A21] 을 제공하는 것이다.
[A20] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제의 제조 방법으로서,
(1) CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체를 조제하는 것,
(2) MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드를 조제하는 것, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, 앵커 잔기를 포함하지 않는다, 및
(3) (1) 의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 (2) 의 펩티드를 스페이서를 개재하여 연결시키는 것, 여기서 상기 스페이서는, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고, 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한다,
을 포함하는, 방법.
[A21] 면역 유도제가, [1] ∼ [20], [26], 및 [27] 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제인, [A20] 에 기재된 방법.
또 본 발명은, 이하의 [A22] 및 [A23] 을 제공하는 것이다.
[A22] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염의 제조 방법으로서,
(1) CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체를 조제하는 것,
(2) MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드를 조제하는 것, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, 앵커 잔기를 포함하지 않는다, 및
(3) (1) 의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 (2) 의 펩티드를 스페이서를 개재하여 연결시키는 것, 여기서 상기 스페이서는, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고, 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한다,
을 포함하는, 방법.
[A23] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염이, [A1] ∼ [A19] 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염인, [A22] 에 기재된 방법.
또 본 발명은, 이하의 [a1] ∼ [a19] 를 제공하는 것이다.
[a1] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 면역 유도제.
[a2] 상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인, [a1] 에 기재된 면역 유도제.
[a3] 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체인, [a1] 또는 [a2] 에 기재된 면역 유도제.
[a4] 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합인, [a1] 내지 [a3] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a5] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드인, [a1] 내지 [a4] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a6] 상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드인, [a5] 에 기재된 면역 유도제.
[a7] 상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하인, [a5] 또는 [a6] 에 기재된 면역 유도제.
[a8] 상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-2 결합 펩티드인, [a1] 내지 [a4] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a9] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체인, [a1] ∼ [a8] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a10] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 15 이상 40 이하인, [a1] 내지 [a9] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a11] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하인, [a10] 에 기재된 면역 유도제.
[a12] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인, [a1] 내지 [a11] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a13] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [a12] 에 기재된 면역 유도제.
[a14] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [a13] 에 기재된 면역 유도제.
[a15] 상기 스페이서가, 하기의 식으로 나타내는 반복 단위를 포함하는, [a1] 내지 [a14] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[화학식 10]
Figure pct00010
상기의 식에 있어서,
X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다),
R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH 및 (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.),
n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
[a16] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, [a1] 내지 [a15] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[화학식 11]
Figure pct00011
[a17] 아쥬반트로서, 면역 부활 활성을 갖는 물질을 추가로 포함하는, [a1] 내지 [a16] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[a18] [a1] 내지 [a17] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제를 포함하는 의약 조성물.
[a19] 종양 치료용인, [a18] 에 기재된 의약 조성물.
본 발명에 의하면, CTL 활성의 유도가 가능한 면역 유도제의 제조에 광범위한 항원 펩티드를 사용할 수 있다.
도 1 은, 실시예 1 에 있어서의 CpG30(S)a-mTRP2pep9 (화합물 1) 의 HPLC 분석에 있어서의 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도 2 는, 실시예 1 에 있어서의 CpG30(S)a-mTRP2pep9 (화합물 1) 의 질량 분석에 있어서의 매스 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 3 은, 실시예 2 (2) 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는, 실시예 2 (3) 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는, 실시예 2 (4) 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은, 실시예 2 (5) 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은, 실시예 3 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은, 실시예 4 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는, 실시예 4 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은, 참고예 1 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은, 참고예 2 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 12 는, 실시예 5 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은, 실시예 6 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는, 실시예 7 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는, 실시예 9 및 참고예 3 에 있어서의 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 은, 참고예 3 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 17 은, 실시예 9 및 참고예 3 에 있어서의 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 18 은, 실시예 10 에 있어서의 플로 사이토메트리의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제 (이하, 본 발명의 면역 유도제라고도 칭한다.) 를 제공한다.
본 발명의 면역 유도제에 있어서의 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어진다.
「CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체」는, 1 또는 복수 (바람직하게는 복수, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6) 의 CpG 모티프를 포함하는 한에 있어서, 임의의 염기 서열 및 염기수를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 유도체를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. CpG 모티프의 구체예로는, AGCGTT, GACGTT, GACGTC, GTCGTT 등을 들 수 있다. 상이한 서열의 CpG 모티프가 복수 포함되어 있어도 된다. 폴리뉴클레오티드에 포함되는 CpG 모티프의 수는 특별히 제한되지 않지만, 1 내지 6 의 CpG 모티프를 포함하고 있는 것이 바람직하고, 2 내지 4 의 CpG 모티프를 포함하고 있는 것이 더욱 바람직하다. 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 포스포로티오에이트 수식된 DNA 유도체인 것이 바람직하지만, 일부에 RNA 또는 RNA 유도체가 포함되어 있어도 된다. RNA 또는 RNA 유도체가 포함되는 경우, 그들의 함량이, 염기수의 비율로 20 ％ 이하 (구체적으로는, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ％ 이하) 인 것이 바람직하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체에 포함되는 염기수는, 15 ∼ 40 (구체적으로는, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40) 인 것이 바람직하고, 20 ∼ 30 (구체적으로는, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30) 인 것이 보다 바람직하다. 바람직한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 서열의 구체예로는, 하기 표 1 에 나타내는 것을 들 수 있다. 표 1 중, 밑줄의 서열은 CpG 모티프를 나타낸다.
[표 1-1]
Figure pct00012
[표 1-2]
Figure pct00013
폴리뉴클레오티드는, 생체 내에서 뉴클레아제에 의한 분해를 받기 쉬우므로, 생체 내에서의 안정성을 향상시키기 위해, 폴리뉴클레오티드 대신에 폴리뉴클레오티드 유도체를 사용해도 된다. 폴리뉴클레오티드 유도체는, 뉴클레아제 내성을 증가시켜 생체 내에서의 안정성을 높이기 위한 수식으로서 당 기술 분야에 있어서 알려져 있는, 임의의 수식을 포함하는 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 유도체의 예로는, 리보뉴클레오티드의 2' 위치의 하이드록실기의 전부 또는 일부가 불소 또는 메톡시기로 치환되어 있는 것, 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 의 인산디에스테르 결합의 전부 또는 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 것 등을 들 수 있다. 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 인산디에스테르 결합의 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 경우, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상 (구체적으로는, 50, 60, 70, 80 또는 90 ％ 이상) 이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 것이 바람직하고, 90 ％ 이상 (구체적으로는, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 ％ 이상) 이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는 것이 보다 바람직하고, 실질적으로 전부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있어도 된다. 인산디에스테르 결합은, 전부 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있어도 된다. 포스포로티오에이트 결합으로 치환되는 인산디에스테르 결합의 위치는 특별히 제한되지 않고, 연속된 복수의 인산디에스테르 결합이 치환되어 있어도 되고, 혹은 포스포로티오에이트 결합이 이웃하지 않도록 치환되어 있어도 된다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가 스페이서와 결합하는 위치는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 스페이서의 공유 결합에는, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체에 존재하는 관능기를 그대로, 혹은 화학 수식에 의해 활성화한 것을 이용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 그 5' 말단 또는 3' 말단의 수산기의 산소 원자 상에서, 스페이서와 결합되어 있는 것이 바람직하다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 이미 알려진 화학 합성법 (예를 들어 인산트리에스테르법, 포스포르아미다이트법, H-포스포네이트법 등) 을 사용하여 합성할 수 있다. 시판되는 핵산 합성기를 사용하여, 시판되는 DNA/RNA 합성에 사용되는 시약을 사용하여 합성해도 된다.
본 발명의 면역 유도제에 있어서의「펩티드」는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는다.
본 발명에 있어서「MHC 결합 펩티드」란, 트리밍 등의 추가 프로세싱 없이, MHC 분자 (즉 주요 조직 적합 유전자 복합체) 에 결합하여, T 세포에 항원으로서 제시될 수 있는 펩티드를 말한다. MHC 분자에는, MHC-1 분자 (MHC 클래스 I 분자라고도 한다.) 및 MHC-2 분자 (MHC 클래스 II 분자라고도 한다.) 가 포함된다. 또 인간에 있어서의 MHC-1 분자는, HLA 분자라고 불리며, 많은 알레르가 존재한다. MHC 결합 펩티드는, MHC-1 분자에 의해 항원 제시되는 펩티드 (즉 MHC-1 결합 펩티드) 및 MHC-2 분자에 의해 항원 제시되는 펩티드 (즉 MHC-2 결합 펩티드) 중 어느 것인 것이 바람직하고, MHC-1 결합 펩티드인 것이 보다 바람직하고, HLA-A 분자에 의해 항원 제시되는 펩티드 (즉 HLA-A 결합 펩티드) 또는 HLA-B 분자에 의해 항원 제시되는 펩티드 (즉 HLA-B 결합 펩티드) 인 것이 보다 더욱 바람직하다.
MHC 결합 펩티드는, 음식물 알레르기 등의 알레르기의 원인이 되는 단백질, 세균, 바이러스 등의 병원체, 종양 세포 등을 기원으로 하는 단백질에서 유래하는 것일 수 있다. MHC 결합 펩티드로는, 예를 들어, 퍼블릭 데이터베이스 SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm ; Immunogenetics (1999) 50 : 213-219 참조) 에 수재되어 있는 펩티드, Immunogenetics (1995) 41 : 178-228 의 표에 기재되어 있는 펩티드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
MHC-1 결합 펩티드의 구체예로는, OVA 펩티드 1 (오브알부민 (OVA ; GenBank 액세션 번호 : CAA23716.1) 의 258 ∼ 265 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, SIINFEKL (서열 번호 41)), TRP2-9 (mTRP2 (GenBank 액세션 번호 : CAA44951.1) 의 180 ∼ 188 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드), hGP100-9 (hGP100 (GenBank 액세션 번호 : AAC60634.1) 의 25 ∼ 33 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드) 등을 들 수 있다.
MHC-2 결합 펩티드의 구체예로는, OVA 펩티드 2 (OVA 의 324 ∼ 340 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 42)) 등을 들 수 있다.
MHC 분자에는, 펩티드 수용구 내에 MHC 결합 펩티드와 직접 상호 작용하는 포켓이라고 불리는 부위가 있다. MHC 결합 펩티드에 있어서, 특정한 포켓과 상호 작용하는 잔기는, 앵커 잔기 또는 앵커 아미노산이라고 불리며, 결합하는 MHC 분자의 타입별로 위치가 상이할 수 있다. MHC 분자의 타입별 앵커 잔기의 위치 및 공통 모티프는, 예를 들어, 퍼블릭 데이터베이스 MHC Motif Viewer (http://www.cbs.dtu.dk/biotools/MHCMotifViewer/Home.html ; Immunogenetics (2008) 60 : 759-765 참조) 에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간의 MHC-1 인 HLA-A 나 HLA-B 에서는, N 말단측으로부터 2 번째 및 9 번째의 아미노산이 앵커 잔기인 것이 알려져 있다.
MHC 결합 펩티드에는, 상기와 같은 천연으로 존재할 수 있는 펩티드 (야생형 펩티드) 에 더하여, 예를 들어 비천연형의 아미노산을 포함하는, 천연으로 존재하지 않는 펩티드도 포함된다. 그와 같은 펩티드로는, 예를 들어, MHC 분자와의 결합성을 높이기 위해 앵커 부위가 다른 아미노산 (비천연 아미노산도 포함한다.) 으로 치환된 개변 펩티드 (헤테로클리틱 펩티드라고 불린다.) 를 들 수 있다 (Front. Immunol. 6 : 377 (2015) 및 J Immunol. 174 (8) : 4812-4820 (2005) 참조).
MHC 결합 펩티드의 아미노산 길이는, 특별히 한정되지 않고, MHC 분자의 타입에 따라 상이할 수 있지만, 예를 들어 5 이상 30 이하일 수 있다. MHC-1 분자에 결합하는 펩티드의 길이는 어느 정도 고정되어 있으며, 통상적으로 8 ∼ 11 아미노산 길이이다. 따라서, 본 발명에 있어서, MHC 결합 펩티드가 MHC-1 결합 펩티드인 경우에는, 그 아미노산 길이는 8 이상 11 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 8, 9 또는 10 이고, 더욱 바람직하게는 9 또는 10 이다.
본 발명자들은, 컨쥬게이트화를 위해 MHC 결합 펩티드의 N 말단에 시스테인 등의 아미노산을 부가하면, MHC 분자에 결합할 수 없게 되는 경우가 있는 것을 알아냈다 (실시예 3). MHC-1 분자에 의한 항원 펩티드의 제시에는, 소포체 아미노펩티다아제 (ERAP) 가 관여하는 것이 알려져 있으며, 항원 펩티드 전구체는, 통상적으로, ERAP 에 의한 N 말단으로부터의 트리밍을 받아 MHC-1 에 대한 결합에 적합한 길이가 된다. 그러나, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트로부터 생성된 펩티드에서는, 이와 같은 트리밍이 적절하게 이루어지지 않아, MHC 분자의 펩티드 수용구에 대한 결합성을 갖는 본래의 펩티드의 구조가 될 수 없을 가능성이 생각된다. 그에 대해, 앵커 잔기를 남기면서, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산을, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환한 펩티드는, MHC-1 분자에 결합할 수 있다. 또 당해 펩티드를 사용하여 제조한 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, 충분한 CTL 유도능을 갖는다.
반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환되는 MHC 결합 펩티드의 N 말단의 아미노산의 수는, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는 한 특별히 한정되지 않고, MHC 분자의 타입에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, MHC-1 분자의 경우, 치환되는 아미노산의 수는, 4 개 이하 (4 개, 3 개, 2 개, 또는 1 개) 일 수 있고, 1 개인 것이 바람직하다. 일 실시형태에 있어서, MHC 결합 펩티드가 HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드인 경우, 앵커 잔기가 N 말단으로부터 2 번째의 위치에 존재하는 점에서, 치환되는 아미노산의 수는 1 개일 수 있다.
「상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산」이란, 스페이서와 에스테르 결합, 아미드 결합, 인산에스테르 결합 등의 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 관능기를 갖는 아미노산이며, 천연의 아미노산 및 비천연의 아미노산 중 어느 것이어도 된다. 스페이서와의 공유 결합은, 생체 내 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인 것이 바람직하다. 그와 같은 공유 결합으로는, 예를 들어 디술파이드 결합 등의, 세포 내의 환원적인 환경에 있어서 절단되는 결합을 들 수 있다. 또, 에스테라아제, 펩티다아제 (예를 들어, 카텝신 등), 뉴클레아제 등의 세포 내 효소로 특이적으로 절단되는, 에스테르 결합, 아미드 결합 (예를 들어, 카텝신 감수성 펩티드와의 아미드 결합 등), 인산디에스테르 결합 등도 예로서 들 수 있다. 보다 바람직한 실시형태로서, 공유 결합은 디술파이드 결합이고, 반응성 관능기는 티올기일 수 있다. 이 경우,「상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산」은, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체일 수 있다. 티올기를 갖는 시스테인 유연체란, 측사슬에 티올을 갖는 아미노산이고, 측사슬의 구조는 특별히 한정되지 않는다. 티올기를 갖는 시스테인 유연체로는, 예를 들어 호모시스테인 (CAS No : 6027-13-0), 페니실라민 (β,β-디메틸시스테인 ; CAS No : 1113-41-3), β-메틸시스테인 (CAS No : 29768-80-7), 및 4-메르캅토-노르발린 (CAS No : 2351397-00-5) 을 들 수 있다.
본 발명의 면역 유도제에 있어서의 펩티드는, 펩티드 합성 등의 임의의 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 면역 유도제에 있어서의「스페이서」는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 및 펩티드와 공유 결합할 수 있는 구조이면 되고, 예를 들어, 알킬렌기, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등을 들 수 있다. 스페이서는, 하기의 식으로 나타내는 인산디에스테르 구조 또는 포스포로티오에이트 구조를 포함하는 반복 단위를 포함하고 있어도 된다.
[화학식 12]
Figure pct00014
상기의 식에 있어서, X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다), R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH, (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.), n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
이들 반복 단위는, 뉴클레아제에 의한 가수 분해를 받지 않기 때문에, X 가 산소 원자여도 생체 내에서의 안정성이 크게 저하되는 경우는 없다. 예를 들어, R 이 (CH2)3O 인 경우, 반복 단위의 사이즈가 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 사이즈와 거의 동등해지기 때문에, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 일부를 이 스페이서로 치환하는 것에 의한 생산 코스트의 저감을 기대할 수 있다. 스페이서의 구체예로는, 하기의 것을 들 수 있다.
[화학식 13]
Figure pct00015
[화학식 14]
Figure pct00016
[화학식 15]
Figure pct00017
[화학식 16]
Figure pct00018
[화학식 17]
Figure pct00019
[화학식 18]
Figure pct00020
[화학식 19]
Figure pct00021
[화학식 20]
Figure pct00022
스페이서의 보다 바람직한 예로는, 하기 중 어느 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
[화학식 21]
Figure pct00023
다른 양태에 있어서, 스페이서의 보다 바람직한 예로는, 하기 중 어느 구조를 갖는 것을 들 수 있다.
[화학식 22]
Figure pct00024
스페이서와 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 결합 형성, 및 스페이서와 펩티드의 결합 형성에 사용되는 반응성 관능기의 조합의 예로는, 에스테르 결합, 아미드 결합, 인산에스테르 결합 등을 형성하는 반응성 관능기의 조합에 더하여, 예를 들어, 바이오칩 표면에 대한 생체 분자의 고정에 사용되는 반응성 관능기의 조합을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 하기에 나타내는 것을 들 수 있다.
(a) 알킨과 아지드 화합물
알킨과 아지드 화합물 (아지화물) 은, 하기에 나타내는 바와 같은 부가 고리화 반응 (위스헨 반응) 에 의해, 1,2,3-트리아졸 고리를 형성한다. 양자는, 생체 분자를 포함하는 많은 유기 화합물에 도입 가능한 안정적인 관능기이고, 물을 포함하는 용매 중에서도 신속하게 또한 거의 정량적으로 반응하여, 대부분 부반응을 수반하지 않고, 여분의 폐기물을 생성하지 않기 때문에, 이른바「클릭 케미스트리」의 중심적인 반응으로서, 생화학의 분야에서 널리 사용되고 있다. 알킨 유도체 및 아지드기는, 임의의 공지된 방법을 사용하여, 항원성을 갖는 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리뉴클레오티드 유도체에 도입할 수 있다. 알킨 유도체로는, 프로파르길알코올, 프로파르길아민 등의 반응성 관능기를 갖는 것을 용이하게 입수할 수 있으며, 이들을 카르복실기나 하이드록실기 등의 반응성 관능기와 직접 반응시키거나, 혹은 카르보닐디이미다졸 등과 함께 반응시켜, 생성되는 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합 등을 개재하여 알킨 유도체를 도입할 수 있다. 아지드기에 대해서도, 임의의 공지된 방법을 사용하여, 항원성을 갖는 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리뉴클레오티드 유도체에 도입할 수 있다. 또한, 위스헨 반응은 구리 촉매의 존재하에서 실시되는데, 항원성을 갖는 펩티드 및 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합 등의 함황 관능기로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에는, 구리 이온에 배위되는 황 원자가 존재하기 때문에, 구리의 촉매 활성이 저하될 우려가 있다. 반응률을 향상시키기 위해 과잉량의 구리를 첨가하는 것이 바람직하다.
[화학식 23]
Figure pct00025
(b) 말레이미드 또는 비닐술폰과 티올기
전자 구인성의 카르보닐기 또는 술폰기에 인접하는 이중 결합을 갖는 말레이미드 또는 비닐술폰은, 중성 부근의 pH 에서, 하기에 나타내는 바와 같이, 티올기와의 부가 반응 (마이클 부가 반응) 에 의해, 안정적인 티오에테르 유도체를 생성한다. 적당한 스페이서를 갖는 말레이미드 및 비닐술폰 유도체가 시판되고 있기 때문에, 항원성을 갖는 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리뉴클레오티드 유도체에 이들 관능기를 도입하는 것은 용이하다. 항원성을 갖는 펩티드에 티올기를 도입하는 경우, 시스테인을 포함하는 항원성을 갖는 펩티드의 경우에는, 시스테인 잔기 측사슬의 티올기를 이용할 수 있다. 단, 시스테인은, 존재비가 낮은 아미노산이기 때문에, 항원성을 갖는 펩티드의 N 말단측에 시스테인을 도입한 것을 사용한다. 티올기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체로는, 이들 5' 말단의 하이드록실기를 티올기로 변환한 티올화 폴리뉴클레오티드가 사용된다.
[화학식 24]
Figure pct00026
(c) 펩티드의 티올기와 티올화 폴리뉴클레오티드의 티올기
상기 서술한 바와 같이, 펩티드의 N 말단에 도입한 티올기와, 티올화 폴리뉴클레오티드의 티올기를 반응시켜, 디술파이드기를 형성시킨다. 디술파이드 결합은, 환원제의 존재하에서 절단되기 때문에, 상기 양자에 비해 안정성의 점에서 떨어지지만, 생체 내의 환원적 환경하에서 절단된다는 이점이 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체에 대한 티올기의 도입은, 임의의 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있지만, 구체예로는, 하기 식에 나타내는 바와 같은, 아미노화 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, ω-(2-피리딜디티오) 지방산의 N-숙시이미딜에스테르의 반응을 들 수 있다.
[화학식 25]
Figure pct00027
상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고, 적어도 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인 것이 바람직하다. 따라서, 상기 (a) ∼ (c) 중, 생체 내에서 용이하게 절단 가능한 펩티드의 티올기와 티올화 폴리뉴클레오티드의 티올기의 조합에 의한 디술파이드 결합이 바람직하다. 이 경우, 디술파이드 결합은, 스페이서와 펩티드 사이의 공유 결합이다.
본 발명의 면역 유도제에 있어서의 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트의 구체예로는, 하기 실시예 1 에 기재된 CpG30(S)a-mTRP2pep9 (화합물 1), CpG20(S)a-mTRP2pep9 (화합물 2), 및 CpG30(S)a-hGP100pep9 (화합물 3), 그리고 하기의 화합물을 들 수 있다. 또한, 하기 식 중, 염기 서열로 나타낸 부분은, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 DNA 유도체를 나타낸다.
[화학식 26]
Figure pct00028
또 본 발명의 면역 유도제에 있어서의 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트의 구체예로는, 하기 실시예 5 에 기재된 ISS1018-mTRP2pep9, ODN2006-mTRP2pep9, 및 ODN1826-mTRP2pep9, 실시예 6 에 기재된 CpG30(S)a2-OVApep8 및 CpG30(S)a2-mTRP2pep9, 실시예 9 에 기재된 CpG30(S)a2-OVA2-15 를 들 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 유도제에 포함되는 1 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 2 개 이상의 펩티드와 결합되어 있어도 된다. 즉, 본 발명의 면역 유도제에는, 1 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 2 개 이상의 펩티드를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 2 개 이상의 펩티드는, 스페이서를 개재하여 결합되어 있으면 된다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 예를 들어, 각각 별개의 스페이서를 개재하여 2 개 이상의 펩티드와 결합할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 분기된 1 개의 스페이서를 개재하여 2 개 이상의 펩티드와 결합되어 있어도 된다. 1 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 이들 결합 양식의 조합에 의해, 3 개 이상의 펩티드와 결합되어 있어도 된다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 부분이 스페이서와 결합하는 위치는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 5' 말단 및 3' 말단에서 선택될 수 있다.
2 개 이상의 펩티드는, 동일한 펩티드여도 되고 상이한 펩티드여도 되지만, 전부 동일한 것이 바람직하다. 1 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체에 결합하는 펩티드의 수는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 그 이상일 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 면역 유도제는, 그 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 부분에 있어서, 당해 부분에 포함되는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 (이하, 상보 사슬 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체라고도 한다.) 와 2 본쇄를 형성하고 있어도 된다.
상보 사슬 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 본 발명의 면역 유도제에 있어서의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 부분과 동일한 방법에 의해 합성할 수 있다. 상보 사슬 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체는, 생체 내에서의 안정성, 독성, 체내 동태 등의 특성의 개선을 위해, 수식되어 있어도 된다. 그와 같은 수식으로는, 예를 들어, 지질 수식을 들 수 있다 (WO2017/057540 참조). 5' 또는 3' 말단의 일방 또는 양방에 지질 수식을 갖는 화합물은, 실시예 8 에 기재된 방법에 의해 합성할 수 있다.
본 발명의 면역 유도제의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 부분과 상보 사슬 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 2 본쇄 형성은, 일반적인 어닐링의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트와 상보 사슬 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체를 혼합하고, 1 본쇄 상태가 되도록 가온한 후, 실온까지 자연 냉각시킴으로써, 2 본쇄를 형성시킬 수 있다.
본 발명의 면역 유도제의 유효 성분으로서 사용되는 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트의 의약상 허용되는 염으로는, 예를 들어, 알칼리 금속 (칼륨, 나트륨, 리튬 등) 의 염, 알칼리 토금속 (칼슘, 마그네슘 등) 의 염, 암모늄염 (테트라메틸암모늄염, 테트라부틸암모늄염 등을 포함한다), 유기 아민 (트리에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 시클로펜틸아민, 벤질아민, 페네틸아민, 피페리딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 리신, 아르기닌, N-메틸-D-글루카민 등) 의 염, 산 부가물염 (염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 인산염, 질산염 등의 무기산염 ; 및, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 락트산염, 타르타르산염, 옥살산염, 푸마르산염, 말레산염, 벤조산염, 시트르산염, 메탄술폰산 (메실산) 염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 이세티온산염, 글루쿠론산염, 글루콘산염 등의 유기산염을 포함한다) 을 들 수 있다.
본 발명의 면역 유도제의 유효 성분으로서 사용되는 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염은, 용매화물 (수화물을 포함한다) 로서 존재할 수도 있다. 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 수화물, 에탄올화물 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역 유도제는, 아쥬반트로서 면역 부활 활성을 갖는 물질을 추가로 포함하고 있어도 된다. 아쥬반트는, 한정은 되지 않지만, 자연 면역을 활성화하는 물질이다. 아쥬반트는, 바람직하게는 자연 면역 리셉터의 아고니스트이다. 자연 면역 리셉터 아고니스트로는, TLR 아고니스트 (예를 들어, TLR2 아고니스트, TLR3 아고니스트, TLR4 아고니스트, TLR7 아고니스트, TLR8 아고니스트, TLR9 아고니스트), RLR (retinoic acid-inducible gene I (RIG-1)-like receptors) 아고니스트, STING (stimulator of Interferon genes) 아고니스트, NLR (nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors) 아고니스트, CLR (C-type lectin receptors) 아고니스트 등이 예시된다. TLR 아고니스트로는, 예를 들어, 리포펩티드, Poly IC RNA, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 모노포스포릴 리피드 A (MPL), CpG-ODN 등을 들 수 있다. RLR 아고니스트로는, pppRNA, Poly IC RNA 등, STING 아고니스트로는 cGAMP, c-di-AMP, c-di-GMP 등, NLR 아고니스트로는 iE-DAP, FK565, MDP, 무라부티드 등, CLR 아고니스트로는 베타글루칸, 트레할로오스6,6'-디미콜레이트 등을 들 수 있다. 아쥬반트는, 바람직하게는 TLR 아고니스트이고, 보다 바람직하게는 TLR4 아고니스트, TLR7 아고니스트 또는 TLR9 아고니스트이고, 보다 더욱 바람직하게는 이미퀴모드, 레시퀴모드, MPL 또는 CpG-ODN 이다. 어느 양태에 있어서, 아쥬반트는, 이미퀴모드, MPL 또는 CpG-ODN 이다. 아쥬반트로는, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트에 도입된 펩티드 등에 따라 적절히 선택될 수 있지만, 예를 들어, CpG DNA 등이어도 되고, 국제 공개 제2015/118789호에 기재된 폴리뉴클레오티드/β-1,3-글루칸 복합체여도 된다.
본 발명의 면역 유도제는,
(1) CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체를 조제하는 것,
(2) MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드를 조제하는 것, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, 앵커 잔기를 포함하지 않는다, 및
(3) (1) 의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 (2) 의 펩티드를 스페이서를 개재하여 연결시키는 것, 여기서 상기 스페이서는, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고, 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한다,
을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은, 상기 공정 (1) ∼ (3) 을 포함하는, 본 발명의 면역 유도제의 제조 방법을 제공한다. 본 양태에 있어서의 각 용어는, 본 명세서 중에 기재된 용어의 설명에 기초하여 해석된다. 본 방법에 의해, 광범위한 항원 펩티드를 사용하여, CTL 활성의 유도가 가능한 면역 유도제를 제조할 수 있다.
또 본 발명은, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 제공한다. 본 양태에 있어서의 각 용어는, 본 명세서 중에 기재된 용어의 설명에 기초하여 해석된다. 당해 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염은, 본 발명의 면역 유도제에 있어서의 유효 성분으로서 사용될 수 있다.
또 당해 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염은, 상기 본 발명의 면역 유도제의 제조 방법에 있어서의 공정 (1) ∼ (3) 을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 일 양태에 있어서, 본 발명은, 상기 공정 (1) ∼ (3) 을 포함하는, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염의 제조 방법을 제공한다. 본 양태에 있어서의 각 용어는, 본 명세서 중에 기재된 용어의 설명에 기초하여 해석된다. 본 방법에 의해, 광범위한 항원 펩티드를 사용하여, CTL 활성의 유도가 가능한 면역 유도제의 유효 성분이 될 수 있는 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 면역 유도제를 포함하는 의약 조성물을 제공한다 (이하, 본 발명의 의약 조성물이라고도 한다.). 본 발명의 의약 조성물의 제조에는, 유효 성분으로서의 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염에 더하여, 임의의 공지된 성분 (의약 용도에 허용되는 임의의 담체, 부형제 및 첨가물) 및 제제 방법을 사용할 수 있다. 제제용의 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨, 소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 당업자라면, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 응해 바람직한 의약 조성물의 조성을 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제형으로서 제공된다. 예를 들어, 주사제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함할 수 있다. 이와 같은 주사제는, 공지된 방법에 따라 조제할 수 있다. 주사제의 조제 방법으로는, 예를 들어, 상기 본 발명의 면역 유도제를, 통상적으로 주사제에 사용되는 무균의 수성 용매에 용해 또는 현탁시킴으로써 조제할 수 있다. 주사용의 수성 용매로는, 예를 들어, 증류수, 생리적 식염수, 인산 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액, 아세트산 완충액 등의 완충액 등을 사용할 수 있다. 이와 같은 수성 용매의 pH 는 5 ∼ 10 을 들 수 있고, 바람직하게는 6 ∼ 8 이다. 조제된 주사액은, 적당한 앰플에 충전되는 것이 바람직하다. 주사제는, 동결 건조 제제로 해도 된다. 주사제 외에는, 경피나 점막 흡수용의 제형 (액제 스프레이, 연고, 겔, 로션, 패치), 피하 국소 서방용의 제형 (나노겔이나 생분해성 마이크로/나노 캡슐 등을 포함하는 현탁액, 온도 응답성 겔), 피부 투과용 경피 디바이스가 포함된 제제 (이온토포레시스, 마이크로니들), 분말제, 정제, 캡슐제, 시럽제, 에어졸이나 드라이 파우더 등의 흡입제 등의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 인간 또는 온혈 동물 (마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 닭, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대해, 경구 및 비경구 경로 중 어느 것에 의해서도 투여 가능하다. 비경구 투여 경로로는, 피하, 피내 및 근육내 주사, 복강내 투여, 점적, 정맥내 투여, 구강 점막으로의 투여, 비점막이나 인두부로의 분무 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효 성분인 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트의 용량은, 활성, 치료 대상이 되는 질환, 투여 대상이 되는 동물의 종류, 체중, 성별, 연령, 질환의 종류, 투여 방법 등에 따라 상이하다. 체중 60 ㎏ 의 성인을 예로 들면, 경구 투여의 경우, 1 일당의 용량은 통상적으로 약 0.1 ∼ 약 100 mg, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 약 50 mg, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 약 20 mg 이고, 비경구 투여의 경우, 1 일당의 용량은 통상적으로 약 0.01 ∼ 약 30 mg, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 약 20 mg, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 약 10 mg 이다. 다른 동물에게 투여하는 경우에는, 상기 용량을 단위 체중당의 용량으로 환산 후, 투여 대상이 되는 동물의 체중을 곱하여 얻어진 용량을 사용한다.
또, 본 발명의 의약 조성물을 대상에게 투여하는 빈도는, 투여 대상이 되는 동물의 종류, 체중, 성별, 연령, 질환의 종류, 투여 방법 등을 고려하여, 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 백신으로서 투여하는 경우, 통상적인 백신 제제와 동일하게, 통상적으로, 1 ∼ 수회/일이고, 1 일만 또는 1 ∼ 수주간의 간격으로 수회 투여할 수 있다. 투여는, 경과를 보면서 실시하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 적어도 약 1 주간의 간격을 두고 추가 면역을 실시할 수 있다. 추가 면역을 실시함으로써, 부스터 효과가 얻어지는 것이 기대되어, 보다 높은 감염 방어 등의 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을, 병원체 감염증이나 암의 환자, 암이나 병원체 감염증으로 이환될 가능성이 있는 대상에게 투여함으로써, 그 투여를 받은 대상 중의 세포 상해성 T 세포 (CTL) 나 헬퍼 T 세포를 항원 특이적으로 활성화시켜, 온혈 동물 (바람직하게는 인간) 의 방어 면역 반응을 유도함으로써, 그 감염증이나 암을 예방·치료할 수 있다. 또, 본 발명의 의약 조성물을 알레르기성 질환의 환자에게 투여함으로써, 질환의 원인이 되는 알레르기 항원에 대한 과잉의 면역 응답을 억제하는 항원 특이적 면역요법이 된다. 즉, 본 발명의 의약 조성물은, 상기 감염증, 암, 알레르기성 질환 등의 질환의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 유용하다. 본 발명에 있어서, 용어「종양」및「암」은 교환 가능하게 사용된다. 또, 본 발명에 있어서, 종양, 악성 종양, 암, 악성 신생물, 암종, 육종 등을 총칭하여,「종양」또는「암」이라고 표현하는 경우가 있다. 또, 용어「종양」및「암」에는, 골수 이형성 증후군 등, 경우에 따라서는 전암 단계로 구분되는 병태도 포함된다.
치료 또는 예방의 대상이 되는 종양의 종류는 본 발명의 의약 조성물에 감수성이 확인되는 종양이면 특별히 한정되지 않지만, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 (소세포폐암, 비소세포폐암 등을 포함한다), 위암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁체암, 신장암, 간세포암, 갑상선암, 식도암, 골육종, 피부암 (멜라노마 등을 포함한다), 교아세포종, 신경아세포종, 난소암, 두경부암, 고환 종양, 대장암, 혈액암 (백혈병, 악성 림프종, 다발성 골수종 등을 포함한다), 망막아세포종, 췌장암 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 다른 항종양제와 조합하여 사용해도 된다. 예를 들어, 항종양 항생 물질, 항종양성 식물 성분, BRM (Biological Response Modifier : 생물학적 응답성 제어 물질), 호르몬, 비타민, 항종양성 항체, 분자 표적약, 알킬화제, 대사 길항제, 기타 항종양제 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 항종양성 항생 물질로는, 예를 들어, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 페플로마이신, 다우노루비신, 아클라루비신, 독소루비신, 이다루비신, 피라루비신, THP-아드리아마이신, 4'-에피독소루비신 혹은 에피루비신, 크로모마이신 A3 또는 악티노마이신 D 등을 들 수 있다.
항종양성 식물 성분 및 그들의 유도체로는, 예를 들어, 빈데신, 빈크리스틴 혹은 빈블라스틴 등의 빈카알카로이드류, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카바지탁셀 등의 탁산류, 또는 에토포시드 혹은 테니포시드 등의 에피포도필로톡신류를 들 수 있다.
BRM 으로는, 예를 들어, 종양 괴사 인자 또는 인도메타신 등을 들 수 있다.
호르몬으로는, 예를 들어, 히드로코르티손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프라스테론, 베타메타손, 트리암시놀론, 옥시메톨론, 난드롤론, 메테놀론, 포스페스트롤, 에티닐에스트라디올, 클로르마디논, 메피티오스탄 또는 메드록시프로게스테론 등을 들 수 있다.
비타민으로는, 예를 들어, 비타민 C 또는 비타민 A 등을 들 수 있다.
항종양성 항체 및 분자 표적약으로는, 트라스트주맙, 리툭시맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙, 데노수맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙, 피딜리주맙, 아테졸리주맙, 라무시루맙, 메실산이매티닙, 다사티닙, 수니티닙, 라파티닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 코비메티닙, 파조파닙, 팔보시클립, 파노비노스탓, 소라페닙, 크리조티닙, 베무라페닙, 퀴자르티닙, 보르테조밉, 카르필조밉, 익사조밉, 미도스타우린, 길테리티닙 등을 들 수 있다.
알킬화제로는, 예를 들어, 나이트로젠 머스타드, 나이트로젠 머스타드 N-옥사이드, 벤다무스틴 혹은 클로람부실 등의 알킬화제, 카르보쿠온 혹은 티오테파 등의 아지리딘계 알킬화제, 디브로모만니톨 혹은 디브로모둘시톨 등의 에폭시드계 알킬화제, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 니무스틴하이드로클로라이드, 스트렙토조신, 클로로조토신 혹은 라니무스틴 등의 니트로소우레아계 알킬화제, 부술판, 토실산임프로술판, 테모졸로미드 또는 다카르바진 등을 들 수 있다.
대사 길항제로는, 예를 들어, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌 혹은 티오이노신 등의 푸린 대사 길항제, 플루오로우라실, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 카르모푸르, 독시플루리딘, 브록스우리딘, 시타라빈 혹은 에노시타빈 등의 피리미딘 대사 길항제, 메토트렉세이트 혹은 트리메트렉세이트 등의 엽산 대사 길항제 등을 들 수 있다.
기타 항종양제로는, 예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 타목시펜, 레트로졸, 아나스트로졸, 엑스메스탄, 토레미펜시트르산염, 풀베스트란트, 비칼루타미드, 플루타미드, 미토탄, 류프로렐린, 고세렐린아세트산염, 캠프토테신, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 멜팔란, L-아스파라기나아제, 아세글라톤, 시조피란, 피시바닐, 프로카바진, 피포브로만, 네오카르지노스타틴, 하이드록시우레아, 우베니멕스, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 포말리도마이드, 에리불린, 트레티노인 또는 크레스틴 등을 들 수 있다.
치료 또는 예방의 대상이 되는 감염증의 종류로는, 바이러스, 진균, 세균 등의 병원체에 의한 감염증이 예시된다. 바이러스로는, 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, 인간 면역 부전 바이러스 (HIV), RS 바이러스, 풍진 바이러스, 마진 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폴리오 바이러스, 로타 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 수두 바이러스, 아데노 바이러스, 광견병 바이러스, 황열병 바이러스 등이 예시된다. 세균으로는, 디프테리아균, 파상풍균, 백일해균, 인플루엔자균, 결핵균, 폐렴구균, 헬리코박터·파일로리, 탄저균, 장티푸스균, 수막염균, 적리균, 콜레라균 등을 들 수 있다. 진균으로는, 칸디다 진균, 히스토플라즈마 진균, 크립토코커스 진균, 아스페르길루스 진균 등이 예시된다. 본 발명의 의약 조성물은, 이들 감염증의 기존의 치료약과 조합하여 사용해도 된다.
치료 또는 예방의 대상이 되는 알레르기성 질환의 종류로는, 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 심마진, 음식물 알레르기, 동물 알레르기, 아나필락시 등이 예시된다.
본 발명의 의약 조성물이, 아쥬반트나 다른 의약과 조합하여 투여되는 경우, 어느 일정 기간에 있어서, 피투여 대상이, 양 약제를 그 체내에 도입하는 것을 의미한다. 양 약제가 단일 제제 중에 포함된 제제가 투여되어도 되고, 또 각각이 별개로 제제화되고, 별개로 투여되어도 된다. 별개로 제제화되는 경우, 그 투여의 시기는 특별히 한정되지 않고, 동시에 투여되어도 되고, 시간을 두고 상이한 시간에, 또는, 상이한 날에 투여되어도 된다. 각각 상이한 시간 또는 날에 투여되는 경우, 그 투여의 순번은 특별히 한정되지 않는다. 통상적으로, 각각의 제제는, 각각의 투여 방법에 따라 투여되기 때문에, 그들의 투여는, 동일 횟수가 되는 경우도 있고, 상이한 횟수가 되는 경우도 있다. 또, 각각이 별개로 제제화되는 경우, 각 제제의 투여 방법 (투여 경로) 은 동일해도 되고, 상이한 투여 방법 (투여 경로) 으로 투여되어도 된다. 또, 양 약제가 동시에 체내에 존재할 필요는 없으며, 어느 일정 기간 (예를 들어 1 개월간, 바람직하게는 1 주간, 더욱 바람직하게는 수일간, 보다 더욱 바람직하게는 1 일간) 동안에 체내에 도입되어 있으면 되고, 어느 것의 투여시에 다른 일방의 유효 성분이 체내로부터 소실되어 있어도 된다.
또 일 양태에 있어서, 본 발명은, 본 발명의 의약 조성물의 치료 또는 예방 유효량을, 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 질환으로는, 예를 들어, 병원체 감염증, 종양, 및 알레르기성 질환을 들 수 있고, 바람직하게는 종양이다.
본 발명에 있어서의「치료 또는 예방 유효량」이란, 특정한 질환 또는 증상, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미하고, 대상의 종, 질환 또는 증상의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 기타 요소에 따라 적절히 결정된다.
본원은, 이하의 발명도 제공한다.
[B1] 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
상기 펩티드는, MHC-2 결합 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이 삭제되어 있고, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산이 부가된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC-2 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 면역 유도제.
[B2] 상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인, [B1] 에 기재된 면역 유도제.
[B3] 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체인, [B1] 또는 [B2] 에 기재된 면역 유도제.
[B4] 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합인, [B1] 내지 [B3] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B5] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체인, [B1] 내지 [B4] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B6] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 15 이상 40 이하인, [B1] 내지 [B5] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B7] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하인, [B6] 에 기재된 면역 유도제.
[B8] 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인, [B1] 내지 [B7] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B9] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [B8] 에 기재된 면역 유도제.
[B10] 상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, [B9] 에 기재된 면역 유도제.
[B11] 상기 스페이서가, 하기의 식으로 나타내는 반복 단위를 포함하는, [B1] 내지 [B10] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[화학식 27]
Figure pct00029
상기의 식에 있어서,
X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다),
R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH 및 (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.),
n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
[B12] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, [B1] 내지 [B11] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[화학식 28]
Figure pct00030
[B13] 상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, [B1] 내지 [B10] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[화학식 29]
Figure pct00031
[B14] 아쥬반트로서, 면역 부활 활성을 갖는 물질을 추가로 포함하는, [B1] 내지 [B13] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B15] [B1] 내지 [B14] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제를 포함하는 의약 조성물.
[B16] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용인, [B15] 에 기재된 의약 조성물.
[B17] 환자에 대해 [B1] 내지 [B14] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하는, 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법.
[B18] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 [B1] 내지 [B14] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제.
[B19] 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물의 제조를 위한, [B1] 내지 [B14] 중 어느 하나에 기재된 면역 유도제의 사용.
이하의 설명에 있어서, 상기의 [B1] 내지 [B19] 의 발명을, 본 발명 B 라고 부른다. 본 발명 B 에 있어서의 각 용어는, MHC-2 결합 펩티드를 사용하는 발명으로서 모순되지 않는 한, 본 명세서 중에 기재된 용어의 설명에 기초하여 해석된다.
본 발명 B 에 있어서, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트에 포함되는 펩티드는, MHC-2 결합 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이 삭제되어 있고, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산이 부가된 펩티드이다. 삭제되는 아미노산의 수는, MHC-2 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는 한 특별히 한정되지 않고, 기초가 되는 MHC-2 결합 펩티드의 길이 및 앵커 잔기의 위치에 따라 적절히 설정할 수 있다. 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산은, N 말단 또는 C 말단에 부가될 수 있다.
본 발명 B 에 있어서, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트에 포함되는 펩티드의 아미노산 길이는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 8 이상 30 이하일 수 있다.
본 발명 B 에 있어서의 면역 유도제의 구체예로는, 예를 들어, 하기 실시예 9 에 기재된 CpG30(S)a2-OVA2-15 를 들 수 있다.
본 발명 B 에 의하면, 보다 짧은 펩티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 제조할 수 있기 때문에, 보다 물성 및/또는 경제성이 우수한 의약 조성물을 제공할 수 있다.
실시예
다음으로, 본 발명의 작용 효과를 확인하기 위해 실시한 실시예에 대해 설명한다. 또한, 본 실시예에 있어서,「CpG DNA(S)」는, CpG 모티프를 포함하는 염기 서열을 갖고, 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 DNA 유도체 (폴리뉴클레오티드 유도체의 일례) 를 나타낸다. 실시예에 있어서, 폴리뉴클레오티드 유도체는, 1 문자 염기 서열 표기 및 좌측이 5' 말단측 (우측이 3' 말단측) 이 되도록 표기하고, 펩티드는 1 문자 표기 및 좌측이 N 말단측 (우측이 C 말단측) 이 되도록 표기되어 있다. 1 문자 염기 서열 표기한 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합은 전부 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고, 또 말단 구조는, 스페이서와 결합되어 있는 경우에는 말단 뉴클레오시드의 5' 또는 3' 수산기의 산소 원자까지를, 스페이서와 결합되어 있지 않는 경우에는 말단 뉴클레오시드의 5' 또는 3' 수산기 (수소 원자까지 포함한다) 를 의미한다. 또, 본 실시예에 있어서의 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트는, 트리에틸아민 및 아세트산이 부가된 염으로서 조제된다.
실시예 1 : CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 조제
(1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
CpG DNA(S) 의 합성은, 포스포르아미다이트법 (예를 들어, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 을 사용하여 실시하였다. 아미노기 수식을 갖는 CpG DNA(S) 의 합성은, ssH Amino Linker (Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949 (2008)) 를 사용하여 실시하였다. 이들 합성에는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하였다.
합성한 CpG DNA(S) 의 염기 서열을 이하에 나타낸다.
CpG30a : 5'-GAGCGTTCTCATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3' (표 1 의 K3-30(a) ; 서열 번호 6)
CpG20a : 5'-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3' (표 1 의 K3 ; 서열 번호 1)
얻어진 아미노기 수식 CpG DNA(S) 는, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는다. 이하, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는 CpG DNA(S) 유도체 중, 서열 번호 6 의 서열을 갖는 것을「CpG30(S)a」라고 칭하고, 서열 번호 1 의 서열을 갖는 것을「CpG20(S)a」라고 칭한다.
[화학식 30]
Figure pct00032
또한, 아미노기 수식 CpG DNA(S) 와, 숙시이미딜6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트 (LC-SPDP) 를 1 : 30 몰비로 인산 완충액 (pH 8.0) 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 3 시간 정치 (靜置) 한 후, NAP-5 칼럼을 사용하여 SPDP 수식 CpG DNA(S) 를 정제하였다.
또한, 하기의 식으로 나타내는 구조를, 이하「ssH 아미노 링커」라고 칭한다.
[화학식 31]
Figure pct00033
(2) N 말단 수식 펩티드의 합성
펩티드는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하여 합성하였다.
합성한 펩티드의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
C-OVA8 : CSIINFEKL (서열 번호 30)
C-TRP2-9 : CSVYDFFVWL (서열 번호 31)
C-TRP2-8 : CVYDFFVWL (서열 번호 32)
C-gp100-9 : CKVPRNQDWL (서열 번호 33)
C-gp100-8 : CVPRNQDWL (서열 번호 34)
CM-TRP2-9 : CMSVYDFFVWL (서열 번호 35)
C-TRP2-13 : CFANASVYDFFVWL (서열 번호 36)
C-TRP2-11 : CNASVYDFFVWL (서열 번호 37)
C-OVA8 은, 오브알부민 (OVA ; GenBank 액세션 번호 : CAA23716.1) 의 258 ∼ 265 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (이하, OVA 펩티드 1 이라고도 한다.) 의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-TRP2-9 는, 멜라노마 관련 항원으로서 알려져 있는 mTRP2 (mouse Tyrosinase-related protein 2 ; GenBank 액세션 번호 : CAA44951.1) 의 180 ∼ 188 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (이하, TRP2-9 라고도 한다.) 의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-TRP2-8 은, mTRP2 의 181 ∼ 188 번째의 아미노산 서열의 N 말단에 시스테인을 부가한 서열로 이루어지는 펩티드이다.
C-gp100-9 는, 멜라노마 관련 항원으로서 알려져 있는 hGP100 (human glycoprotein 100 ; GenBank 액세션 번호 : AAC60634.1) 의 25 ∼ 33 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (이하, hGP100-9 라고도 한다.) 의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-gp100-8 은, hGP100 의 26 ∼ 33 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
CM-TRP2-9 는, mTRP2 의 180 ∼ 188 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인 및 메티오닌을 부가한 펩티드이다.
C-TRP2-13 은, mTRP2 의 176 ∼ 188 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-TRP2-11 은, mTRP2 의 178 ∼ 188 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
(3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1) 에서 합성한 SPDP 수식 CpG DNA(S) 1 mol 과, (2) 에서 합성한 펩티드 25 mol 을, 30 ％ N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 수용액 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 3 시간 정치한 후, 하기 (A) ∼ (C) 중 어느 조건에 의한 HPLC 로 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 분취하였다. 각 컨쥬게이트의 분취에 사용한 HPLC 조건 및 유지 시간을 표 2 에 나타낸다.
＜HPLC 조건 (A)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 헥사플루오로이소프로판올, 8 mM 트리에틸아민 (TEA), B 액을 메탄올로 하고, 칼럼은 X-Bridge C18 2.5 ㎛ 4.6×75 ㎜ (Waters Corporation) 를 사용하고, 칼럼 온도 60 ℃, 유속 1 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 95 ％ B : 5 ％
∼ 20 분 A : 70 ％ B : 30 ％
＜HPLC 조건 (B)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 헥사플루오로이소프로판올, 8 mM 트리에틸아민 (TEA), B 액을 메탄올로 하고, 칼럼은 X-Bridge C18 2.5 ㎛ 4.6×75 ㎜ (Waters Corporation) 를 사용하고, 칼럼 온도 60 ℃, 유속 1 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 95 ％ B : 5 ％
∼ 25 분 A : 60 ％ B : 40 ％
＜HPLC 조건 (C)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 아세트산트리에틸암모늄 (TEAA ; pH 7.0), B 액을 아세토니트릴로 하고, 칼럼은 ZORBAX Eclipse Plus C18 (Agilent Technologies) 을 사용하고, 칼럼 온도 40 ℃, 유속 1 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 90 ％ B : 10 ％
∼ 25 분 A : 70 ％ B : 30 ％
∼ 30 분 A : 0 ％ B : 100 ％
＜HPLC 조건 (D)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 헥사플루오로이소프로판올, 8 mM 트리에틸아민 (TEA), B 액을 메탄올로 하고, 칼럼은 X-Bridge C18 2.5 ㎛ 4.6×75 ㎜ (Waters Corporation) 를 사용하고, 칼럼 온도 60 ℃, 유속 1 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 95 ％ B : 5 ％
∼ 25 분 A : 50 ％ B : 50 ％
HPLC 를 사용한 SPDP 수식 CpG DNA(S) 와 펩티드의 반응 후의 용액의 분취에 있어서, 검출은 260 ㎚ 의 흡수를 모니터함으로써 실시하였다. 분취 후의 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 용출 시간은, SPDP 수식 CpG DNA(S) 보다 늦어지는 것이 확인되었다. 이것은, 소수성의 펩티드와 결합함으로써 용출 시간이 느려졌기 때문인 것으로 생각된다. 또, 분취 후의 크로마토그램에는 미반응의 SPDP 수식 CpG DNA(S) 의 피크는 보이지 않고, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트만의 피크가 검출된 점에서, 목적으로 하는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트가 순도 높게 얻어진 것이 확인되었다. HPLC 분석의 결과의 일례로서, 도 1 에, CpG30(S)a-mTRP2pep9 (화합물 1) 의 상기 조건 (B) 에 있어서의 크로마토그램을 나타낸다.
얻어진 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 구조를 이하에 나타낸다. 식 중,「CpG DNA」는, CpG30(S)a 또는 CpG20(S)a 의 염기 서열 부분을 나타내고,「peptide」는, 상기 (2) 에서 합성한 펩티드의 N 말단의 시스테인을 제외한 부분을 나타낸다.
[화학식 32]
Figure pct00034
합성한 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트는 이하와 같다.
[표 2]
Figure pct00035
또 도 2 에, 질량 분석의 결과의 일례로서, CpG30(S)a-mTRP2pep9 (화합물 1) 의 매스 스펙트럼 (MALDI-TOF) 을 나타낸다. 11248.28 (1 가의 마이너스 이온) 및 5622.53 (2 가의 마이너스 이온) 의 피크가 검출되고, CpG30(S)a-mTRP2pep9 (이론 분자량 (theoretical most abundant mass for C369H480N116O174P30S31) 11246.56) 상당의 매스 스펙트럼이 얻어진 것을 확인하였다.
실시예 2 : CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트에 의한 세포 상해성 T 세포 유도의 평가 (mTRP2 항원을 사용한 평가)
(1) 세포 상해성 T 세포 유도의 평가 방법
항원으로서 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를, 마우스 (C57BL/6 마우스 (♂, 7 주령)) 에 피내 투여하였다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 50, 200 또는 1000 ng 으로 하였다 (이 경우, CpG30(S) 환산으로는 약 0.4, 1.7 또는 8.5 μg 이다). 투여로부터 1 주일 후, 동 계통의 마우스 중, 투여를 실시하지 않은 개체로부터 비장 세포를 취출하고, 이것을 2.0 × 107 세포/ml 씩 2 개의 군으로 나누고, 일방에, 항원으로서 펩티드를 10 μg/mL 가 되도록 첨가하고, 90 분 정치함으로써 항원 유지 비장 세포를 제조하고, 펩티드를 첨가하지 않은 비장 세포를 항원 미유지 비장 세포로 하였다. 5,6-카르복시플루오레세인숙시이미딜에스테르 (CFSE) 를 사용하여, 항원 유지 비장 세포 및 항원 미유지 비장 세포의 양자를 형광 수식하였다. 이 때, CFSE 의 농도를 바꿈으로써, 항원 유지 비장 세포 (CFSE : 1 μM) 쪽이, 항원 미유지 비장 세포 (CFSE : 0.1 μM) 보다 형광 강도가 높아지도록 하였다. 투여 항원 유지 비장 세포, 항원 미유지 비장 세포를 각각 동수 혼합하고, 항원으로서 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 투여한 마우스 개체에, 투여로부터 1 주일 후에 3.0 × 106 의 세포수로 미정맥 투여하였다.
상기의 미정맥 투여로부터 24 시간 경과 후에, 마우스로부터 비장 세포를 취출하고, 항원 유지 비장 세포와 항원 미유지 비장 세포의 비율을 플로 사이토메트리로 정량하여, 항원 유지 비장 세포의 감소량을 평가함으로써, 유도된 항원 특이적 세포 상해성 T 세포의 활성을 평가하였다. 비교를 위해, 대조군으로서, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 대신에 PBS (인산 완충 생리 식염수) 를 투여한 마우스 개체를 사용하여 동일한 조건에서 측정을 실시하였다.
(2) CpG30(S)a-mTRP2pep10 의 세포 상해성 T 세포 유도능 평가
선원 (PCT/JP2019/038090) 에 있어서는, OVA 유래의 항원성을 갖는 펩티드를 사용한 시험에 의해, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트가 높은 세포 상해성 T 세포 (CTL) 유도능을 갖는 것을 나타냈다. 그 한편, 다른 항원 펩티드에 대해 동일한 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 제조한 경우, 충분한 CTL 유도능이 얻어지지 않는 경우가 있는 것이 판명되었다 (도 3).
구체적으로는, 항원성을 갖는 펩티드로서 알려져 있는 오브알부민 (OVA) 의 258 ∼ 265 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (OVA 펩티드 1) 를 사용하여, CpG30(S)a-OVApep9 의 CTL 유도능을 평가한 결과, 1 마리당 펩티드 환산으로 20 ng 의 투여량으로 항원 유지 비장 세포의 소실이 관찰되어, 강한 CTL 활성이 유도된 것이 확인되었다. 그에 반해, 멜라노마 관련 항원으로서 알려져 있는 mTRP2 의 180 ∼ 188 번째의 아미노산 서열 (9 아미노산) 로 이루어지는 펩티드 (TRP2-9) 를 사용하여, CpG30(S)a-mTRP2pep10 (TRP2-9 의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드를 사용하여 조제한 컨쥬게이트) 의 CTL 유도능을 평가한 결과, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 의 투여량으로도 CTL 활성은 보이지 않았다.
(3) CpG30(S)a-mTRP2pep9 의 세포 상해성 T 세포 유도능 평가
CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트가 CTL 활성을 유도하기 위해서는, 항원 제시 세포에 도입된 후, 펩티드 부분이 폴리뉴클레오티드 부분 및 스페이서 부분으로부터 벗어나, MHC 분자에 결합할 필요가 있다. 상기 결과로부터, CpG30(S)a-mTRP2pep10 의 조제에 사용한 C-TRP2-9 (10 아미노산) 는, 본래의 항원성을 갖는 펩티드의 N 말단에 1 아미노산이 부가되어 있기 때문에, MHC 분자에 결합할 수 없거나, 혹은 결합해도 T 세포 수용체에 인식되지 않을 가능성이 생각되었다.
그래서, 9 아미노산으로 이루어지는 TRP2-9 의 N 말단의 1 잔기 (세린) 를 줄인 후에 시스테인을 부가한 펩티드 (C-TRP2-8) 를 사용하여, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 CpG30(S)a-mTRP2pep9 를 조제하고, 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서 TRP2-9 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 4 에 나타낸다. CpG30(S)a-mTRP2pep9 에서는, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 의 투여량으로 항원 유지 비장 세포의 현저한 감소가 관찰되어, 높은 CTL 활성이 유도된 것이 확인되었다. 그에 반해 CpG30(S)a-mTRP2pep10 에서는, 항원 유지 비장 세포의 감소는 거의 관찰되지 않았다.
(4) 용량 의존성
CpG30(S)a-mTRP2pep9 의 투여량을 1 마리당 펩티드 환산으로 50, 200 또는 1000 ng 으로 하여, 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서 TRP2-9 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 5 에 나타낸다. CpG30(S)a-mTRP2pep9 의 CTL 유도능에는 용량 의존성이 확인되었다. 200 ng 의 용량으로 강한 CTL 활성의 유도가 가능한 것이 나타났다.
(5) CpG DNA 의 염기 길이 의존성
CpG30(S)a-mTRP2pep9 의 폴리뉴클레오티드 부분을, 20 염기 길이의 CpG20(S)a 로 치환한 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 CpG20(S)a-mTRP2pep9 를 조제하고, 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서 TRP2-9 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 6 에 나타낸다. CpG20(S)a-mTRP2pep9 는, CpG30(S)a-mTRP2pep9 와 동일하게 높은 CTL 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실시예 3 : 본 발명의 CpG-펩티드 컨쥬게이트에 사용한 펩티드의 MHC-1 결합성의 평가 (DC2.4 세포에 있어서의 OVA 펩티드 1 과의 MHC-1 결합 경합 저해 평가)
마우스 수상 세포주 DC2.4 세포를 디시로부터 박리 후, 1.5 mL 튜브에 1.5 × 105 세포/200 mL PBS 로 현탁시키고, 거기에 OVA 펩티드 1 을 0.25 μg/mL 가 되도록, 또 TRP2 유래의 펩티드 (TRP2-9, C-TRP2-9, 또는 C-TRP2-8) 를 펩티드 환산 2.5 μg/mL 가 되도록 첨가하고, 튜브를 빙욕 상에서 30 분간 인큐베이트하였다. 다음으로, OVA 펩티드 1 과 MHC-1 의 분자 복합체에 특이적인 항체 (피코에리트린 (PE) 으로 형광 표지 : PE-labeled anti-mouse OVA257-264 (SIINFEKL) peptide bound to H-2Kb antibody (ThermoFisher SCIENTIFIC)) (이하,「PE labelled H-2Kb/FIINFEKL」이라고 칭한다.) 를 첨가하고, 플로 사이토메트리로, DC2.4 세포 상의 상기 항체가 결합한 OVA 펩티드 1-MHC-1 복합체를 정량하여, TRP2 유래의 펩티드에 의한 MHC-1 결합 경합 저해 활성을 평가하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 7 에 나타낸다. TRP2-9 를 첨가한 경우, 형광 강도의 평균값이 38 ％ 저하되어, TRP2-9 가 OVA 펩티드 1 의 MHC 클래스 I 분자에 대한 결합에 대해 저해 효과를 갖는 것, 즉 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있는 것이 나타났다. 또, TRP2-9 와 N 말단의 아미노산은 상이하지만 동일한 아미노산 길이인 C-TRP2-8 을 첨가한 경우에도, 형광 강도의 평균값이 23 ％ 저하되어, OVA 펩티드 1 의 MHC 클래스 I 분자에 대한 결합에 대한 저해 효과가 확인되었다. 한편, TRP2-9 보다 1 아미노산 긴 C-TRP2-9 에서는, 저해 효과는 보이지 않았다.
따라서, C-TRP2-9 에서는 MHC-1 에 대한 결합성이 소실되고, C-TRP2-8 에서는 MHC-1 에 대한 결합성이 유지되는 것이 시사되었다.
실시예 4 : CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트에 의한 세포 상해성 T 세포 유도의 평가 (hGP100 을 사용한 평가)
CpG30(S)a-hGP100pep10 또는 CpG30(S)a-hGP100pep9 를 사용하여, 실시예 2 와 동일하게 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서, 멜라노마 관련 항원으로서 알려져 있는 hGP100 의 25 ∼ 33 번째의 아미노산 서열 (9 아미노산) 로 이루어지는 펩티드 (hGP100-9) 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 8 및 9 에 나타낸다. mTRP2 를 사용하여 평가한 경우와 마찬가지로, CpG30(S)a-hGP100pep9 에서는, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 의 투여량으로 항원 유지 비장 세포의 감소가 관찰되어, CTL 활성이 유도된 것이 확인된 반면, CpG30(S)a-hGP100pep10 에서는, 항원 유지 비장 세포의 감소는 거의 관찰되지 않았다 (도 8). 또 CpG30(S)a-hGP100pep9 의 CTL 유도능에는 용량 의존성이 확인되어, 200 ng 의 용량으로 강한 CTL 활성의 유도가 가능한 것이 나타났다 (도 9).
참고예 1 : CpG30(S)a-CMTRP2-9 에 의한 세포 상해성 T 세포 유도의 평가
MHC-1 에 의한 항원 펩티드의 제시에는, 소포체 아미노펩티다아제 (ERAP) 가 관여한다. 항원 펩티드 전구체는, ERAP 에 의한 N 말단으로부터의 트리밍을 받아 MHC-1 에 대한 결합에 적합한 길이가 된다. 이 프로세스에 관하여, N 말단에 시스테인을 갖는 항원 펩티드 전구체에 있어서, 시스테인의 C 말단측에 알라닌, 류신, 또는 메티오닌을 삽입하면, ERAP 에 의한 트리밍을 받기 쉬워지는 것이 보고되어 있다 (WO2014/157704). 도 3 에 나타낸 결과로부터, CpG30(S)a-mTRP2pep10 에 대해서도, C-TRP2-9 의 N 말단의 시스테인의 C 말단측에 알라닌, 류신, 또는 메티오닌을 삽입함으로써 ERAP 에 의한 트리밍을 받기 쉬워져, CTL 유도능이 개선될 가능성이 생각되었다.
그래서, C-TRP2-9 의 N 말단의 시스테인의 C 말단측에 메티오닌을 삽입한 CM-TRP2-9 를 사용하여, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 CpG30(S)a-CMTRP2-9 를 조제하고, 그 CTL 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서 TRP2-9 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 10 에 나타낸다. 1 마리당 펩티드 환산으로 1000 ng 의 투여량으로도 충분한 항원 유지 비장 세포의 감소는 관찰되지 않고, 200 ng 의 투여량으로는 거의 감소하지 않았다. 펩티드 (CM-TRP2-9) 를 사용한 in vitro 평가에서는 ERAP 에 의해 절단되기 쉬워진 것이 시사되는 결과도 얻어졌지만, in vivo 에서는 CTL 유도능을 충분히 향상시킬 수 없는 것이 시사되었다.
참고예 2 : CpG30(S)a-mTRP2-14 및 CpG30(S)a-mTRP2-12 에 의한 세포 상해성 T 세포 유도의 평가
ERAP 에 의한 트리밍을 받기 쉬운 것은, 펩티드의 사슬 길이에 따라 바뀌고, 9 ∼ 16 아미노산 길이의 펩티드가 ERAP 의 바람직한 기질인 것이 보고되어 있다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (47) : 17107-12 (2005)).
그래서, C-TRP2-9 에 있어서의 TRP2 유래의 서열보다 N 말단측이 더욱 2 또는 4 아미노산 긴 서열 C-TRP2-11 및 C-TRP2-13 을 사용하여, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 CpG30(S)a-TRP2-12 및 CpG30(S)a-TRP2-14 를 조제하고, 그들의 CTL 유도능을 평가하였다. 항원 유지 비장 세포를 조제하기 위한 항원으로서 TRP2-9 를 사용하였다.
플로 사이토메트리의 측정 결과를 도 11 에 나타낸다. 어느 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트도, 항원 유지 비장 세포의 감소는 관찰되지 않았다. 펩티드 (C-TRP2-11 또는 C-TRP2-13) 를 사용한 in vitro 평가에서는 ERAP 에 의해 절단되기 쉬워진 것이 시사되는 결과도 얻어졌지만, 컨쥬게이트를 사용한 in vivo 평가에서는 CTL 유도능을 충분히 향상시킬 수 없는 것이 시사되었다.
실시예 5 : K3 유래의 CpG 모티프 이외의 CpG 모티프를 포함하는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성 및 그 세포 상해성 T 세포 유도능의 평가
(1) 합성법
실시예 1 과 동일한 방법에 의해, K3 유래의 CpG 모티프 이외의 CpG 모티프를 포함하는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 3 에 나타낸다. 또한, N 말단 수식 펩티드로서, C-TRP2-8 을 사용하였다 (실시예 1 (2) 참조).
[화학식 33]
Figure pct00036
[표 3]
Figure pct00037
(2) 시험 방법
실시예 2 와 동일한 방법에 의해, ISS1018-mTRP2pep9, ODN2006-mTRP2pep9, 및 ODN1826-mTRP2pep9 에 의한 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 으로 하였다. 대조로서, CpG30(S)a-mTRP2pep9 (K3 유래의 CpG 모티프를 포함하는 컨쥬게이트 ; 실시예 1 참조) 를 사용하였다.
결과를 도 12 에 나타낸다. (1) 에서 합성한 어느 화합물도, K3 유래의 CpG 모티프를 포함하는 컨쥬게이트와 마찬가지로, 세포 상해성 T 세포 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실시예 6 : 인산기가 티오인산기로 치환된 ssH 아미노 링커 부분을 갖는 컨쥬게이트의 합성 및 그 세포 상해성 T 세포 유도능의 평가
(1) 합성법
이하의 방법에 의해, 인산기가 티오인산기로 치환된 ssH 아미노 링커 부분을 갖는 컨쥬게이트를 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 4 에 나타낸다.
[화학식 34]
Figure pct00038
[표 4]
Figure pct00039
(1-1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
CpG DNA(S) 의 합성은, 포스포르아미다이트법 (예를 들어, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)) 을 사용하여 실시하였다. 아미노기 수식을 갖는 CpG DNA(S) 의 합성은, ssH Amino Linker (Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949 (2008)) 의 인산기가 티오인산기로 치환된 것을 사용하여 실시하였다. 이들 합성에는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하였다.
합성한 CpG DNA(S) 의 염기 서열은, 실시예 1 (1) 에 기재된 CpG30a 와 동일하다.
얻어진 아미노기 수식 CpG DNA(S) 는, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는다. 이하, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는 CpG DNA(S) 유도체 중, 서열 번호 6 의 서열을 갖는 것을「CpG30(S)a2」라고 칭한다.
[화학식 35]
Figure pct00040
또한, 아미노기 수식 CpG DNA(S) 1 mol 과, 숙시이미딜6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트 (LC-SPDP) 30 mol 을 인산 완충액 (pH 8.0) 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 3 시간 정치한 후, NAP-5 칼럼을 사용하여 SPDP 수식 CpG DNA(S) 를 정제하였다.
또한, 얻어진 SPDP 수식 CpG DNA(S) 는, 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는다.
[화학식 36]
Figure pct00041
(1-2) N 말단 수식 펩티드의 합성
펩티드는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하여 합성하였다.
합성한 펩티드의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
C-OVA7 : CIINFEKL (서열 번호 46)
C-TRP2-8 : CVYDFFVWL (서열 번호 32)
C-OVA7 은, 오브알부민 (OVA ; GenBank 액세션 번호 : CAA23716.1) 의 259 ∼ 265 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다. C-OVA7 은, MHC-1 결합 펩티드인 OVA 펩티드 1 (서열 번호 41 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드) 의 N 말단 1 잔기를 삭제하고, N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-TRP2-8 은, 실시예 1 에 기재한 바와 같고, MHC-1 결합 펩티드인 TRP2-9 의 N 말단 1 잔기를 삭제하고, N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
(1-3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1-1) 에서 합성한 SPDP 수식 CpG DNA(S) 에 대해, (1-2) 에서 합성한 펩티드를 5 내지 10 몰 등량, 50 ％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 수용액 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후, 하기의 조건에 의한 HPLC 정제로 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 분취하였다.
＜HPLC 조건 (E)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 (TEA), B 액을 메탄올로 하고, 칼럼은 XBridge BEH C18 (4.6×75 ㎜ Column XP) (Waters Corporation) 을 사용하고, 칼럼 온도 40 ℃, 유속 1 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 80 ％ B : 20 ％
∼ 10 분 A : 50 ％ B : 50 ％
각 컨쥬게이트의 분취에 사용한 HPLC 조건 및 유지 시간을 표 4 에 나타낸다.
(2) 시험 방법
실시예 2 와 동일한 방법에 의해, CpG30(S)a2-OVApep8 및 CpG30(S)a2-mTRP2pep9 의 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. CpG30(S)a2-OVApep8 의 투여량은 1 마리당 펩티드 환산으로 20 ng 으로 하였다. CpG30(S)a2-mTRP2pep9 의 투여량은 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 으로 하였다. 2 개의 컨쥬게이트 사이의 투여량의 차이는, 원래의 펩티드 자체의 항원성의 강도의 차이를 반영하고 있다.
결과를 도 13 에 나타낸다. (1) 에서 합성한 CpG30(S)a2-OVApep8 및 CpG30(S)a2-mTRP2pep9 중 어느 것도, 높은 세포 상해성 T 세포 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실시예 7 : CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트에 의한 세포 상해성 T 세포 유도의 평가 (2 회 투여에서의 활성)
CpG30(S)a-mTRP2pep9 를 2 회 투여한 경우의 세포 상해성 T 세포 유도능을, 실시예 2 와 동일한 방법에 의해 평가하였다. 2 회째의 투여는, 1 회째의 투여의 10 일 후에 실시하였다. 투여량은, 모두 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 으로 하였다.
결과를 도 14 에 나타낸다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 2 회 투여함으로써, 단회 투여인 경우보다 CTL 활성이 향상되는 것이 시사되었다.
실시예 8 : 2 본쇄 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트 (CpG30(S)a-mTRP2pep9 ; 실시예 1 참조) 와, 그 CpG DNA(S) 부분의 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 DNA 유도체를 어닐링시킴으로써, 2 본쇄 복합체 (2 본쇄 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트) 를 조제하였다.
(1) CpG 상보 사슬 DNA 유도체의 합성
CpG 에 상보적인 DNA 의 합성은, CpG DNA(S) 와 마찬가지로 포스포르아미다이트법을 사용하여 실시하였다. 5' 말단에 지질 수식을 갖는 상보 사슬 DNA 의 합성은, 하기의 식으로 나타내는 지질화 포스포르아미다이트 (문헌 (WO2017/057540) 중의 M22-12 포스포르아미다이트와 동일한 방법에 의해 합성) 를 상보 사슬 DNA 의 서열 합성의 최후의 커플링에 사용함으로써 실시하였다.
[화학식 37]
Figure pct00042
3'-말단에 지질 수식을 갖는 상보 사슬 DNA 의 합성은 이하와 같이 실시하였다.
유니버설 고상 담체 (Glen UnySupport 500 (GlenResearch, 20-5040)) 상에서, Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite (GlenResearch, 10-1981) 를 사용하여 최초의 커플링을 실시한 후에, 상보 사슬 DNA 의 서열을 합성하였다. 이어서, 고상 담체 상에서 탈트리틸화 및 아세틸 보호를 실시한 후에, 메이커 소정의 방법에 의해 레불린산 유닛을 탈보호하였다. 생성된 수산기에 대해, 상기의 지질화 포스포르아미다이트를 반응시킴으로써, 목적으로 하는 화합물을 합성하였다.
3' 및 5'-말단에 지질 수식을 갖는 상보 사슬 DNA 의 합성은 이하와 같이 실시하였다.
유니버설 고상 담체 (Glen UnySupport 500 (GlenResearch, 20-5040)) 상에서, Asymmetric Doubler (Lev) Phosphoramidite (GlenResearch, 10-1981) 를 사용하여 최초의 커플링을 실시한 후에, 상보 사슬 DNA 의 서열을 합성하였다. 이어서, 고상 담체 상에서 탈트리틸화를 실시한 후에, 메이커 소정의 방법에 의해 레불린산 유닛을 탈보호하였다. 생성된 3' 및 5'-말단의 수산기에 대해, 상기의 지질화 포스포르아미다이트를 반응시킴으로써, 목적으로 하는 화합물을 합성하였다.
합성한 CpG 에 상보적인 DNA 유도체의 구조를 이하에 나타낸다. 또한, 하기 유도체 중의 DNA 서열 (compK3 : 서열 번호 47) 은, K3 의 염기 서열 (서열 번호 1) 에 상보적인 서열이다.
5'-Lipo-compK3 : 5'-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T-3'
3'-Lipo-compK3 : 5'-G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3'
5',3'-di-Lipo-compK3 : 5'-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3'
상기 구조 중,「^」은, 뉴클레오시드 사이의 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다. 또,「Lipo^G」및「T^Lipo」는, 하기의 구조를 나타낸다.
[화학식 38]
Figure pct00043
하기 조건에 의한 HPLC 에 의해, CpG 에 상보적인 DNA 유도체를 분취하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
＜HPLC 조건 (F)＞
이하의 그레이디언트 조건에서, A 액을 0.1 M 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 8 mM 트리에틸아민 (TEA), B 액을 메탄올로 하고, 칼럼은 Clarity (등록상표) 2.6 ㎛ Oligo-MS 100A (LC-Column 50 x 2.1 ㎜) (Phenomenex Inc) 를 사용하고, 칼럼 온도 60 ℃, 유속 0.5 mL/분으로, HPLC 를 실시하였다.
0 분 A : 90 ％ B : 10 ％
∼ 7 분 A : 10 ％ B : 90 ％
[표 5]
Figure pct00044
(2) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트와의 2 본쇄 복합체 형성
CpG30(S)a-mTRP2pep9 의 PBS 용액과 상기 (1) 에서 합성한 지질 수식 compK3 의 PBS 용액을, 각각 종농도가 3.4 μM 이 되도록 1.5 mL 튜브 내에서 혼합하였다. 이것을 90 ℃ 의 탕욕에 넣음으로써 가온한 후, 하룻밤 방치함으로써 서서히 실온으로 되돌렸다 (이 냉각 과정에서 2 본쇄가 형성된다). 이 용액 50 μL 를 마우스에 투여하면, 펩티드 200 ng 상당을 투여하게 된다.
하기 표 6 에 기재된 조합의 5 종류의 2 본쇄 복합체를 얻었다. 2 본쇄 복합체의 형성은, 폴리아크릴아미드 겔 등을 사용한 전기 영동, 사이즈 배제 크로마토그래피 등의 액체 크로마토그래피, 자외 분광법을 사용한 융해 온도 측정, 정적 광 산란법 측정에 의한 회합체 분자량 측정 등으로 확인할 수 있다.
[표 6]
Figure pct00045
실시예 9 : MHC-2 결합 펩티드를 사용한 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성 및 그것에 의한 CD4+ T 세포 활성화의 평가
(1) 합성법
이하의 방법에 의해, MHC-2 결합 펩티드 유래의 CpG DNA(S) 부분을 갖는 2 종류의 컨쥬게이트 CpG30(S)a2-OVA2-15, 및 CpG30(S)a2-OVA2-17 을 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 7 에 나타낸다.
[화학식 39]
Figure pct00046
[표 7]
Figure pct00047
(1-1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
실시예 6 과 동일한 방법에 의해, CpG30(S)a2 및 그 SPDP 수식체를 합성하였다.
(1-2) N 말단 수식 펩티드의 합성
N 말단 시스테인 수식 펩티드는, 일반적인 Fmoc 고상 펩티드 합성법으로 합성하였다. 합성한 펩티드의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
C-OVA2-14 : CSQAVHAAHAEINEA (서열 번호 48)
C-OVA2-16 : CSQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 51)
C-OVA2-14 는, 오브알부민 (OVA ; GenBank 액세션 번호 : CAA23716.1) 의 325 ∼ 338 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다. C-OVA2-14 는, OVA 펩티드 2 (마우스 I-Ab/I-Ad 결합성 서열을 포함하는 서열 번호 42 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드) 의 N 말단 1 잔기 및 C 말단 2 잔기를 삭제하고, N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
C-OVA2-16 은, 상기 오브알부민의 325-340 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다. C-OVA2-16 은, 상기 OVA 펩티드 2 의 N 말단 1 잔기를 삭제하고, N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
(1-3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1-1) 에서 합성한 SPDP 수식 CpG DNA(S) 와 (1-2) 에서 합성한 펩티드를 사용하여, 실시예 6 의 (1-3) 과 동일한 방법에 의해, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 합성하였다.
(2) 시험 방법 (IFN-γ 분비 활성 측정에 의한, CpG-MHC2 펩티드 컨쥬게이트의 1 회 면역에 의한 CD4+ T 세포 활성화의 평가)
항원으로서 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를, 마우스 (C57BL/6 마우스 (♂, 7 주령)) 에 피내 투여하였다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 1000 ng 으로 하였다. 투여로부터 1 주일 후에 비장 세포를 취출하고, 96 웰 디시에 1.0 × 106 세포/100 μL 로 파종하고 (배지 ; RPMI1640), OVA 유래의 MHC-2 결합성의 항원 펩티드 (OVA324-340 : ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 42)) 를 10 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 24 시간 후에 배지 중의 인터페론 γ (IFN-γ) 를 IFN gamma Mouse ELISA Kit (Invitrogen, IFN gamma 'Femto-HS' High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit) 를 사용하여 정량하였다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 투여에 의해 마우스가 면역화된 경우, 배지 중에 대한 항원 펩티드의 첨가에 의한 자극에 의해, 비장 세포 중의 항원 특이적 CD4+ T 세포가 활성화되어, IFN-γ 를 분비한다.
결과를 도 15 및 도 17 에 나타낸다.
CpG30(S)a2-OVA2-15, 및 CpG30(S)a2-OVA2-17 을 각각 투여한 마우스의 비장 세포에서는, 모두 높은 IFN-γ 분비 활성이 보였다 (도 15 및 17 ; CpG30(S)a2-OVA2-18 에 대해서는 참고예 3 참조.). MHC-2 결합 펩티드를 사용하여 컨쥬게이트를 제조하는 경우에는, C 말단의 펩티드를 삭제해도 되는 것이 나타났다.
참고예 3 : MHC-2 결합 펩티드를 사용한 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성 및 그것에 의한 CD4+ T 세포 활성화의 평가
(1) 합성법
이하의 방법에 의해, MHC-2 결합 펩티드 유래의 CpG DNA(S) 부분을 갖는 2 종류의 컨쥬게이트 CpG30(S)a2-OVA2-18 및 CpG30(S)a2-OVA2-18c 를 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 8 에 나타낸다.
[화학식 40]
Figure pct00048
[표 8]
Figure pct00049
(1-1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
실시예 6 과 동일한 방법에 의해, CpG30(S)a2 및 그 SPDP 수식체를 합성하였다.
(1-2) N 말단 수식 펩티드 및 C 말단 수식 펩티드의 합성
N 말단 시스테인 수식 펩티드 및 C 말단 시스테인 수식 펩티드는, 일반적인 Fmoc 고상 펩티드 합성법으로 합성하였다.
합성한 펩티드의 아미노산 서열을 이하에 나타낸다.
C-OVA2-17 : CISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 49)
OVA2-17-C : ISQAVHAAHAEINEAGRC (서열 번호 50)
C-OVA2-17 은, 오브알부민의 324 ∼ 340 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다. C-OVA2-17 은, 상기 OVA 펩티드 2 의 N 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
OVA2-17-C 는, 오브알부민의 324 ∼ 340 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 C 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다. C-OVA2-17 은, 상기 OVA 펩티드 2 의 C 말단에 시스테인을 부가한 펩티드이다.
(1-3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1-1) 에서 합성한 SPDP 수식 CpG DNA(S) 와 (1-2) 에서 합성한 펩티드를 사용하여, 실시예 6 의 (1-3) 과 동일한 방법에 의해, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 합성하였다.
(2) 시험 방법 (IFN-γ 분비 활성 측정에 의한, CpG-MHC2 펩티드 컨쥬게이트의 1 회 면역에 의한 CD4+ T 세포 활성화의 평가)
항원으로서 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를, 마우스 (C57BL/6 마우스 (♂, 7 주령)) 에 피내 투여하였다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 1000 ng 으로 하였다. 투여로부터 1 주일 후에 비장 세포를 취출하고, 96 웰 디시에 1.0 × 106 세포/100 μL 로 파종하고 (배지 ; RPMI1640), OVA 유래의 항원 펩티드 (OVA324-340 : ISQAVHAAHAEINEAGR (서열 번호 42)) 를 10 μg/mL 가 되도록 첨가하였다. 24 시간 후에 배지 중의 인터페론 γ (IFN-γ) 를 IFN gamma Mouse ELISA Kit (Invitrogen, IFN gamma 'Femto-HS' High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit) 를 사용하여 정량하였다. CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 투여에 의해 마우스가 면역화된 경우, 배지 중에 대한 항원 펩티드의 첨가에 의한 자극에 의해, 비장 세포 중의 항원 특이적 CD4+ T 세포가 활성화되어, IFN-γ 를 분비한다.
결과를 도 15 및 16 에 나타낸다.
CpG30(S)a2-OVA2-18 을 투여한 마우스의 비장 세포에서는, 높은 IFN-γ 분비 활성이 보였다 (도 15 및 16).
또 CpG30(S)a2-OVA2-18 을 투여한 경우와 동등 또는 그보다 높은 활성이, CpG30(S)a2-OVA2-18c 를 투여한 마우스의 비장 세포에서 보였다 (도 16). MHC-2 결합 펩티드를 사용하여 컨쥬게이트를 제조하는 경우에는, C 말단측에 CpG DNA(S) 를 컨쥬게이트시켜도 되는 것이 나타났다.
실시예 10 : CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 조제 (2) 및 그 세포 상해성 T 세포 유도능의 평가
(1) 합성법
(1-1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
5' 말단에 6-메르캅토헥실기를 갖는 CpG DNA(S) 의 합성은, 포스포르아미다이트법을 사용하여 CpG DNA(S) 의 서열을 합성한 후에, 5'-thiol-modifier C6 (S-Trityl-6-mercaptohexyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite) 을 반응시킴으로써 실시하였다. 이들 합성에는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하였다.
얻어진 6-메르캅토헥실 수식 CpG DNA(S) 는, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는다. 이하, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는 CpG DNA(S) 유도체 중, 서열 번호 6 의 서열을 갖는 것을「CpG30(S)a3」이라고 칭한다.
[화학식 41]
Figure pct00050
또, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는 CpG DNA(S) 유도체의 합성은, 실시예 6 의 (1-1) 에서 합성한 아미노기 수식 CpG DNA(S) 와, PPC-NHS ester (2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate) 를 1 : 30 몰비로 인산 완충액 (pH 8.0) 중에서 40 ℃ 에서 3 시간 반응시킨 후, NAP-5 칼럼으로 정제함으로써 실시하였다.
[화학식 42]
Figure pct00051
(1-2) N 말단 수식 펩티드의 합성
실시예 1 과 동일하게, C-TRP2-8 : CVYDFFVWL (서열 번호 32) 을 합성하였다.
(1-3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1-1) 에서 합성한 CpG30(S)a3 에 대해, 30 몰 등량의 Npys-OMe (CAS : 68118-08-1) 를 33 ％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 수용액 중에서 혼합하고, 하룻밤 반응시켰다. 다음으로 (1-2) 에서 합성한 펩티드를 5 몰 등량, 50 ％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 수용액 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후, HPLC 정제로 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 분취하여, CpG30(S)a3-mTRP2pep9 를 얻었다.
또, (1-1) 에서 합성한 PPC-NHS ester 수식 CpG DNA(S) 에 대해, (1-2) 에서 합성한 펩티드를 5 몰 등량, 50 ％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 수용액 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후, HPLC 정제로 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 분취하여, CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9 를 얻었다.
합성한 화합물을 하기 식 및 표 9 에 나타낸다.
[화학식 43]
Figure pct00052
[표 9]
Figure pct00053
(2) 시험 방법
실시예 2 와 동일한 방법에 의해, CpG30(S)a3-mTRP2pep9 에 의한 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 으로 하였다. 대조로서, CpG30(S)a2-mTRP2pep9 (K3 유래의 CpG 모티프를 포함하는 컨쥬게이트 ; 실시예 6 참조) 를 사용하였다.
결과를 도 18 에 나타낸다. CpG30(S)a3-mTRP2pep9 는, 스페이서 구조가 상이한 CpG30(S)a2-mTRP2pep9 와 마찬가지로, 세포 상해성 T 세포 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실시예 11 : 시스테인 유연체를 포함하는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1) 합성법
시스테인 대신에 시스테인 유연체에 의해 N 말단이 수식된 펩티드를 사용하여, 실시예 1 과 동일한 방법에 의해, CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 10 에 나타낸다. 또한, N 말단 수식 펩티드로서, N 말단의 아미노산이 비천연 아미노산인 하기의 합성 펩티드를 사용하였다.
dC-mTRP2pep8 : D-cysteine-VYDFFVWL (서열 번호 52)
homoC-mTRP2pep8 : L-homocysteine-VYDFFVWL (서열 번호 53)
Pen-mTRP2pep8 : L-penicillamine-VYDFFVWL (서열 번호 54)
[화학식 44]
Figure pct00054
[표 10]
Figure pct00055
(2) 시험 방법
실시예 2 와 동일한 방법에 의해, CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8 에 의한 세포 상해성 T 세포 유도능을 평가하였다. 투여량은, 1 마리당 펩티드 환산으로 200 ng 으로 하였다. 대조로서, CpG30(S)a2-mTRP2pep9 (K3 유래의 CpG 모티프를 포함하는 컨쥬게이트 ; 실시예 6 참조) 를 사용하였다.
결과를 도 18 에 나타낸다. 시스테인 유연체를 포함하는 CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8 은, CpG30(S)a2-mTRP2pep9 와 마찬가지로, 세포 상해성 T 세포 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실시예 12 : CpG DNA 의 5' 및 3' 양 말단에 펩티드를 갖는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1) 합성법
이하의 (1-1) ∼ (1-3) 의 방법을 사용하여, CpG DNA 의 양 말단에 펩티드를 갖는 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 합성하였다. 합성한 화합물을 하기 식 및 표 11 에 나타낸다. 또한, N 말단 수식 펩티드로서, C-TRP2-8 을 사용하였다 (실시예 1 (2) 참조).
[화학식 45]
Figure pct00056
[표 11]
Figure pct00057
(1-1) CpG DNA(S) 유도체의 합성
5' 및 3' 양 말단에 Amino Linker 를 결합시킨 CpG DNA(S) 의 합성은, 포스포르아미다이트법을 사용하여, 3'-Amino-Modifier C6-dC CPG (Link Technologies Ltd.) 를 사용하여 CpG 서열을 합성한 후, 5' 말단에 ssH Amino Linker 를 반응시킴으로써 실시하였다. 이들 합성에는, 수탁 합성 서비스 (주식회사 진 디자인) 를 이용하였다.
합성한 CpG DNA(S) 의 염기 서열은, 실시예 1 (1) 에 기재된 CpG30a 와 동일하다.
얻어진 아미노기 수식 CpG DNA(S) 는, 5' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖고
[화학식 46]
Figure pct00058
3' 말단에 하기의 식으로 나타내는 구조를 갖는다.
[화학식 47]
Figure pct00059
이하, 3' 및 5' 말단에 상기 식으로 나타내는 구조를 갖는 CpG DNA(S) 유도체 중, 서열 번호 6 의 서열을 갖는 것을「CpG30(S)a4」라고 칭한다.
또한, CpG30(S)a4 와, 숙시이미딜6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트 (LC-SPDP) 를 1 : 30 몰비로 인산 완충액 (pH 8.0) 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 3 시간 정치한 후, NAP-5 칼럼을 사용하여 SPDP 수식 CpG DNA(S)a4 를 정제하였다.
(1-2) N 말단 수식 펩티드의 합성
실시예 1 과 동일하게, C-TRP2-8 : CVYDFFVWL (서열 번호 32) 을 합성하였다.
(1-3) CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트의 합성
(1-1) 에서 합성한 SPDP 수식 CpG DNA(S)a4 에 대해, (1-2) 에서 합성한 펩티드를 5 내지 10 몰 등량, 50 ％ 디메틸술폭시드 (DMSO) 수용액 중에서 혼합하고, 40 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후, HPLC 정제로 CpG DNA(S)-펩티드 컨쥬게이트를 분취하였다. 분취에 사용한 HPLC 조건 및 유지 시간을 표 11 에 나타낸다.
본 발명에 의하면, 광범위한 항원 펩티드에 대해, CTL 활성의 유도가 가능한 면역 유도제, 및 그것을 포함하는 의약 조성물을 제공할 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1 : K3
서열 번호 2 : K3-20(b)
서열 번호 3 : K3-21
서열 번호 4 : K3-24
서열 번호 5 : K3-27
서열 번호 6 : K3-30(a)
서열 번호 7 : K3-30(b)
서열 번호 8 : K3-40
서열 번호 9 : K3-30(c)
서열 번호 10 : K3-30(d)
서열 번호 11 : K3-30(e)
서열 번호 12 : K3-30(f)
서열 번호 13 : K3-26(a)
서열 번호 14 : K3-26(b)
서열 번호 15 : ODN1668
서열 번호 16 : ODN1668-30
서열 번호 17 : ODN1668-40
서열 번호 18 : ODN1826
서열 번호 19 : ODN1826-30
서열 번호 20 : ODN1826-40
서열 번호 21 : ODN2006
서열 번호 22 : ODN2006-30
서열 번호 23 : ODN2006-40
서열 번호 24 : ODN684
서열 번호 25 : ODN684-30
서열 번호 26 : ODN684-40
서열 번호 27 : ODN D-SL01
서열 번호 28 : ODN D-SL01-35
서열 번호 29 : C-CpG#1
서열 번호 30 : C-OVA8
서열 번호 31 : C-TRP2-9
서열 번호 32 : C-TRP2-8
서열 번호 33 : C-gp100-9
서열 번호 34 : C-gp100-8
서열 번호 35 : CM-TRP2-9
서열 번호 36 : C-TRP2-13
서열 번호 37 : C-TRP2-11
서열 번호 38 : C-OVA2-17
서열 번호 39 : C-OVA2-14
서열 번호 40 : C-OVA2-11
서열 번호 41 : OVA 펩티드 1
서열 번호 42 : OVA 펩티드 2
서열 번호 43 : 1018ISS
서열 번호 44 : 1018ISS#30
서열 번호 45 : 1018ISS#40
서열 번호 46 : C-OVA7
서열 번호 47 : compK3
서열 번호 48 : C-OVA2-14
서열 번호 49 : C-OVA2-17
서열 번호 50 : OVA2-17-C
서열 번호 51 : C-OVA2-16
서열 번호 52 : dC-mTRP2pep8 ; 1 번째의 아미노산은 D-시스테인이다.
서열 번호 53 : homoC-mTRP2pep8 ; 1 번째의 아미노산은 L-호모시스테인이다.
서열 번호 54 : Pen-mTRP2pep8 ; 1 번째의 아미노산은 L-페니실라민이다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF KITAKYUSHU DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> IMMUNE INDUCER CONTAINING POLYNUCLEOTIDE-PEPTIDE CONJUGATE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME <130> FA1511-20313 <150> JP 2020-057249 <151> 2020-03-27 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3 <400> 1 atcgactctc gagcgttctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-20(b) <400> 2 gagcgttctc gagcgttctc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-21 <400> 3 cgagcgttct cgagcgttct c 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-24 <400> 4 tctcgagcgt tctcgagcgt tctc 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-27 <400> 5 gactctcgag cgttctcgag cgttctc 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(a) <400> 6 gagcgttctc atcgactctc gagcgttctc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(b) <400> 7 atcgactctc gagcgttctc gagcgttctc 30 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-40 <400> 8 atcgactctc gagcgttctc atcgactctc gagcgttctc 40 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(c) <400> 9 ctcagcgttc tcagcgttct cagcgttctc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(d) <400> 10 tttagcgttt ttagcgtttt tagcgttttt 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(e) <400> 11 ttagcgttta gcgtttagcg tttagcgttt 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-30(f) <400> 12 ttagcgttca gcgttcagcg ttcagcgttt 30 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-26(a) <400> 13 tcagcgtttc agcgtttcag cgtttc 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3-26(b) <400> 14 ttagcgtttt agcgttttag cgtttt 26 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1668 <400> 15 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1668-30 <400> 16 tgacgttcct tccatgacgt tcctgatgct 30 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1668-40 <400> 17 tccatgacgt tcctgatgct tccatgacgt tcctgatgct 40 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1826 <400> 18 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1826-30 <400> 19 tgacgttcct tccatgacgt tcctgacgtt 30 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN1826-40 <400> 20 tccatgacgt tcctgacgtt tccatgacgt tcctgacgtt 40 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN2006 <400> 21 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN2006-30 <400> 22 gtcgtttcgt cgttttgtcg ttttgtcgtt 30 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN2006-40 <400> 23 tcgtcgtttt gtcgtttcgt cgttttgtcg ttttgtcgtt 40 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN684 <400> 24 tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN684-30 <400> 25 tcgtcgttcg acgttcgtcg ttcgtcgttc 30 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN684-40 <400> 26 gttcgtcgtt tcgtcgttcg acgttcgtcg ttcgtcgttc 40 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN D-SL01 <400> 27 tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ODN D-SL01-35 <400> 28 tcgcgacgtt cgcgacgttc gcccgacgtt cggta 35 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-CpG_1 <400> 29 tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA8 <400> 30 Cys Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-TRP2-9 <400> 31 Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-TRP2-8 <400> 32 Cys Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-gp100-9 <400> 33 Cys Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-gp100-8 <400> 34 Cys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CM-TRP2-9 <400> 35 Cys Met Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-TRP2-13 <400> 36 Cys Phe Ala Asn Ala Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-TRP2-11 <400> 37 Cys Asn Ala Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-17 <400> 38 Cys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 Gly Arg <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-14 <400> 39 Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-11 <400> 40 Cys Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu 1 5 10 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA peptide 1 <400> 41 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA peptide 2 <400> 42 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1018ISS <400> 43 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1018ISS_30 <400> 44 tgaacgttcg actgtgaacg ttcgagatga 30 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1018ISS_40 <400> 45 tgaacgttcg tgaacgttcg actgtgaacg ttcgagatga 40 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA7 <400> 46 Cys Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 47 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> compK3 <400> 47 gagaacgctc gagagt 16 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-14 <400> 48 Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-17 <400> 49 Cys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5 10 15 Gly Arg <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA2-17-C <400> 50 Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg Cys <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-OVA2-16 <400> 51 Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly 1 5 10 15 Arg <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dC-mTRP2pep8 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> D-cysteine <400> 52 Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> homoC-mTRP2pep8 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> L-homocysteine <400> 53 Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pen-mTRP2pep8 <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> L-penicillamine <400> 54 Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5

Claims (32)

  1. 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
    상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
    상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 면역 유도제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합인, 면역 유도제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체인, 면역 유도제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합인, 면역 유도제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드인, 면역 유도제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드인, 면역 유도제.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하인, 면역 유도제.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-2 결합 펩티드인, 면역 유도제.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체인, 면역 유도제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 15 이상 40 이하인, 면역 유도제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하인, 면역 유도제.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인, 면역 유도제.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 50 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, 면역 유도제.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있는, 면역 유도제.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서가, 하기의 식으로 나타내는 반복 단위를 포함하는, 면역 유도제.
    Figure pct00060

    상기의 식에 있어서,
    X 는, 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고 (여기서 각 X 는 동일해도 되고 상이해도 된다),
    R 은, (CH2)pO, (CH2)qNH 및 (CH2CH2O)m 중 어느 것을 나타내고 (m, p 및 q 는, 각각 독립적으로 10 이하의 자연수를 나타낸다.),
    n 은, 10 이하의 자연수를 나타낸다.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, 면역 유도제.
    Figure pct00061
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는, 면역 유도제.
    Figure pct00062
  18. 제 1 항에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
    상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인,
    상기 면역 유도제.
  19. 제 1 항에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는 면역 유도제로서,
    상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체이고,
    상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합이고,
    상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드이고,
    상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드이고,
    상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하이고,
    상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고,
    상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는,
    상기 면역 유도제.
    Figure pct00063
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아쥬반트로서, 면역 부활 활성을 갖는 물질을 추가로 포함하는, 면역 유도제.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 포함하는 의약 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용인, 의약 조성물.
  23. 제 21 항에 있어서,
    종양의 치료 또는 예방용인, 의약 조성물.
  24. 환자에 대해 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하는, 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  25. 환자에 대해 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제를 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 면역 유도제.
  27. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 면역 유도제.
  28. 감염증, 종양, 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제의 사용.
  29. 종양의 치료 또는 예방용 의약의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 면역 유도제의 사용.
  30. 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
    상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트는, CpG 모티프를 포함하는 1 본쇄 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와, 펩티드와, 일단측에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체와 공유 결합하고 타단측에서 상기 펩티드와 공유 결합한 스페이서로 이루어지고,
    상기 펩티드는, MHC 결합 펩티드의 N 말단의 1 또는 복수의 연속되는 아미노산이, 상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 아미노산으로 치환된 펩티드이고, 여기서 상기 1 또는 복수의 연속되는 아미노산은, MHC 결합을 위한 앵커 잔기를 포함하지 않는, 상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
  31. 제 30 항에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
    상기 스페이서와 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체 사이의 공유 결합 및 상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합의 일방 또는 양방이, 생체 환경 중에서 절단 가능한 공유 결합이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체인,
    상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
  32. 제 30 항에 기재된, 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염으로서,
    상기 스페이서와의 공유 결합을 형성시키기 위해 반응성 관능기를 갖는 아미노산이, 시스테인 또는 티올기를 갖는 그 유연체이고,
    상기 스페이서와 상기 펩티드 사이의 공유 결합이, 디술파이드 결합이고,
    상기 MHC 결합 펩티드가, MHC-1 결합 펩티드이고,
    상기 MHC-1 결합 펩티드가, HLA-A 결합 펩티드 또는 HLA-B 결합 펩티드이고,
    상기 MHC-1 결합 펩티드의 아미노산 길이가, 8 이상 11 이하이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체가, 2 이상의 CpG 모티프를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 DNA 유도체이고,
    상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 염기 길이가, 20 이상 30 이하이고,
    상기 인산디에스테르 결합의 적어도 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 폴리뉴클레오티드 유도체에 있어서, 인산디에스테르 결합의 90 ％ 이상이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되어 있고,
    상기 스페이서가, 하기 중 어느 식으로 나타내는 구조를 갖는,
    상기 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트 또는 그 의약상 허용되는 염.
    Figure pct00064
KR1020227036681A 2020-03-27 2021-03-26 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 면역 유도제 및 그것을 포함하는 의약 조성물 KR20220160036A (ko)

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