CN115427079A - 包含多核苷酸-肽缀合物的免疫诱导剂及包含其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸‑肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，上述多核苷酸‑肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，上述肽为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。

Description

包含多核苷酸-肽缀合物的免疫诱导剂及包含其的药物组 合物
技术领域
本发明涉及包含多核苷酸-肽缀合物作为有效成分的免疫诱导剂、包含其的药物组合物等。
背景技术
已知存在于树突细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原呈递细胞的Toll样受体(TLR)家族与各种病原体反应，诱导细胞因子的产生，并通过促进初始T细胞分化为Th1细胞、活化杀伤性T细胞等而诱导获得性免疫。一系列的TLR家族所识别的病原体的构成成分非常多样化，作为其中之一，有作为TLR9的配体且具有CpG基序的DNA(CpG DNA)。CpG基序以在中心部排列有胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)且在其前后分别排列有2个嘌呤碱基和嘧啶碱基的6个碱基为基础，为以-PuPu-CG-PyPy-(Pu表示嘌呤碱基，Py表示嘧啶碱基。)表示的序列(已知在人类情况下，GTCGTT也对TLR9具有配体活性。)，是在哺乳类中少见、在微生物中常见的碱基序列。另外，哺乳类中少量存在的CpG基序大部分已甲基化。在哺乳类中几乎不存在的非甲基化CpG基序具有很强的免疫激活活性(例如，参照非专利文献1～3)。通过包吞作用而被摄入细胞内的CpG DNA可被存在于吞噬体样内质网的TLR9识别，引起干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)之类的Th1细胞因子的产生，强烈诱导Th1反应。Th1反应抑制Th2反应所主导的变态反应，并且还活化巨噬细胞、细胞杀伤性T细胞(CTL)而具有基于细胞免疫的强抗肿瘤活性。
CpG DNA除了可期待预防感染，还可期待作为针对变态反应疾病、肿瘤性疾病的佐剂。关于使CpG DNA与抗原共价键合而成的缀合物，例如有以下报道。
非专利文献4中记载了：利用CpG DNA与来自卵清蛋白(OVA)抗原的18～24mer的肽的缀合物促进了树突细胞的摄取和抗原呈递。
非专利文献5和6中记载了：利用CpG DNA与OVA抗原蛋白的缀合物，在体外诱导了T细胞活化。另外，非专利文献5记载了在体外诱导了抗原特异性细胞杀伤活性。
非专利文献7中记载了制备CpG寡核苷酸与肿瘤相关蛋白或细胞的缀合物的方法。
专利文献1公开了一种免疫诱导剂，其包含含有CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物与具有抗原性的肽的缀合物作为有效成分，并且公开了具有抗原特异性高的免疫诱导活性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：PCT/JP2019/038090
非专利文献
非专利文献1：Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to SignalInfectious Danger.H.Wagner,Adv.Immunol.,73,329-368(1999).
非专利文献2：CpG Motifs in Bacterial DNA and Their ImmuneEffects.M.Krieg,Annu.Rev.Immunol.,20,709-760(2002).
非专利文献3：The discovery of immunostimulatory DNAsequence.S.Yamamoto,T.Yamamoto,and T.Tokunaga,Springer Seminars inImmunopathology,22,11-19(2000).
非专利文献4：Distinct Uptake Mechanisms but Similar IntracellularProcessing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates inDendritic Cells.Khan S.et al.,J.Biol.Chem.282,21145-21159(2007).
非专利文献5：Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-AntigenConjugate Enhances Anti-tumor Immunity.Kramer K.et al.,Mol.Ther.25,62-70(2017).
非专利文献6：Comparative Study of 5’-and 3’-Linked CpG-AntigenConjugates for the Induction of Cellular Immune Responses.Kramer K.et al.,ACSOmega 2(1),227-235(2017)
非专利文献7：TLR-9agonist immunostimulatory sequence adjuvants linkedto cancer antigens,Shirota H.and Klinman D.M.,Methods Mol.Biol.1139,337-344(2014)
发明内容
发明要解决的问题
在专利文献1中，本发明人们通过使用OVA来源的具有抗原性的肽的研究示出了CpG DNA-肽缀合物具有高的细胞杀伤性T细胞(CTL)诱导能力。另一方面，获知在对其它抗原肽制备同样的CpG DNA-肽缀合物时有时得不到充分的CTL诱导能力。本发明的目的在于，关于更广泛的抗原肽，提供能够诱导CTL活性的免疫诱导剂等。
用于解决问题的方案
本发明人们对制成CpG DNA-肽缀合物时未得到充分的CTL诱导能力的肽进行了研究，结果发现，若为了缀合物化而在肽的N末端添加半胱氨酸等氨基酸，则本来与MHC分子有结合性的肽(MHC结合肽)会变得无法与MHC分子结合。还发现，通过使用将不包括锚残基(anchor residues)在内的N末端的1个或多个连续氨基酸置换为半胱氨酸等氨基酸而成的肽、而不是使用在MHC结合肽的N末端直接添加了半胱氨酸等氨基酸的肽，能够制备具有高的CTL诱导能力的CpG DNA-肽缀合物。本发明人们进一步进行了深入研究，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下发明。
[1]一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
上述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，
上述肽是MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
[2]根据[1]所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键。
[3]根据[1]或[2]所述的免疫诱导剂，其中，具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC结合肽为MHC-1结合肽。
[6]根据[5]所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽。
[7]根据[5]或[6]所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下。
[8]根据[1]至[4]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC结合肽为MHC-2结合肽。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。
[11]根据[10]所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物是磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[13]根据[12]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键置换。
[14]根据[13]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换。
[15]根据[1]至[14]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基包含下式所示的重复单元。
Figure BDA0003865786450000051
上述式中，
X表示氧原子或硫原子(这里，各X任选相同或不同)，
R表示(CH2)pO、(CH2)qNH和(CH2CH2O)m中的任意者(m、p和q分别独立地表示10以下的自然数。)，
n表示10以下的自然数。
[16]根据[1]至[15]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000061
[17]根据[1]至[14]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000071
[18]一种免疫诱导剂，其包含[1]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[19]一种免疫诱导剂，其包含[1]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物，
上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键，
上述MHC结合肽为MHC-1结合肽，
上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽，
上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下，
在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换，
上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000081
[20]根据[1]至[19]中任一项所述的免疫诱导剂，其还包含具有免疫激活活性的物质作为佐剂。
[21]一种药物组合物，其包含[1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂。
[22]根据[21]所述的药物组合物，其用于治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病。
[23]根据[21]所述的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤。
[24]一种治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的方法，其包括对患者给药[1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂的步骤。
[25]一种治疗或预防肿瘤的方法，其包括对患者给药[1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂的步骤。
[26]根据[1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂，其用于在治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病中使用。
[27]根据[1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂，其用于在治疗或预防肿瘤中使用。
[28][1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂在制造用于治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的药物中的应用。
[29][1]至[20]中任一项所述的免疫诱导剂在制造用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
[30]一种多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，
上述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，
上述肽为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
[31]根据[30]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[32]根据[30]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物，
上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键，
上述MHC结合肽为MHC-1结合肽，
上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽，
上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下，
在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换，
上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000101
另外，本发明提供以下的[A1]～[A19]。
[A1]一种多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，
上述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，
上述肽为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
[A2]根据[A1]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键。
[A3]根据A1或A2所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。
[A4]根据A1至A3中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键。
[A5]根据A1至A4中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述MHC结合肽为MHC-1结合肽。
[A6]根据A5所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽。
[A7]根据A5或A6所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下。
[A8]根据A1至A4中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述MHC结合肽为MHC-2结合肽。
[A9]根据A1～A8中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
[A10]根据A1至A9中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。
[A11]根据A10所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。
[A12]根据A1至A11中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[A13]根据A12所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键置换。
[A14]根据A13所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换。
[A15]根据A1至A14中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述间隔基包含下式所示的重复单元。
Figure BDA0003865786450000121
上述式中，
X表示氧原子或硫原子(这里，各X任选相同或不同)，
R表示(CH2)pO、(CH2)qNH和(CH2CH2O)m中的任意者(m、p和q分别独立地表示10以下的自然数。)，
n表示10以下的自然数。
[A16]根据A1至A15中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000131
[A17]根据A1至A14中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000132
[A18]根据[A1]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[A19]根据[A1]所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物，
上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键，
上述MHC结合肽为MHC-1结合肽，
上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽，
上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下，
在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换，
上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000151
另外，本发明提供以下的[A20]和[A21]。
[A20]一种包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的免疫诱导剂的制造方法，其包括下述步骤：
(1)制备包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物；
(2)制备MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括锚残基；和
(3)借助间隔基将(1)的多核苷酸或多核苷酸衍生物与(2)的肽连接，这里，上述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合。
[A21]根据[A20]所述的方法，其中，免疫诱导剂为[1]～[20]、[26]和[27]中任一项所述的免疫诱导剂。
另外，本发明提供以下的[A22]和[A23]。
[A22]一种多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐的制造方法，其包括下述步骤：
(1)制备包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物；
(2)制备MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括锚残基；和
(3)借助间隔基将(1)的多核苷酸或多核苷酸衍生物与(2)的肽连接，这里，上述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合。
[A23]根据[A22]所述的方法，其中，多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐为[A1]～[A19]中任一项所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐。
另外，本发明提供以下的[a1]～[a19]。
[a1]一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
上述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，
上述肽为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
[a2]根据[a1]所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键。
[a3]根据[a1]或[a2]所述的免疫诱导剂，其中，具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。
[a4]根据[a1]至[a3]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键。
[a5]根据[a1]至[a4]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC结合肽为MHC-1结合肽。
[a6]根据[a5]所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽。
[a7]根据[a5]或[a6]所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下。
[a8]根据[a1]至[a4]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述MHC结合肽为MHC-2结合肽。
[a9]根据[a1]～[a8]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
[a10]根据[a1]至[a9]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。
[a11]根据[a10]所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。
[a12]根据[a1]至[a11]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[a13]根据[a12]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键置换。
[a14]根据[a13]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换。
[a15]根据[a1]至[a14]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基包含下式所示的重复单元。
Figure BDA0003865786450000181
上述式中，
X表示氧原子或硫原子(这里，各X任选相同或不同)，
R表示(CH2)pO、(CH2)qNH和(CH2CH2O)m中的任意者(m、p和q分别独立地表示10以下的自然数。)，
n表示10以下的自然数。
[a16]根据[a1]至[a15]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000182
[a17]根据[a1]至[a16]中任一项所述的免疫诱导剂，其还包含具有免疫激活活性的物质作为佐剂。
[a18]一种药物组合物，其包含[a1]至[a17]中任一项所述的免疫诱导剂。
[a19]根据[a18]所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。
发明的效果
根据本发明，在制备能够诱导CTL活性的免疫诱导剂时可以使用广泛的抗原肽。
附图说明
图1为示出实施例1中的CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)在HPLC分析中的色谱图的图。
图2为示出实施例1中的CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)在质谱分析中的质谱的图。
图3为示出实施例2(2)中的流式细胞术测定结果的图。
图4为示出实施例2(3)中的流式细胞术测定结果的图。
图5为示出实施例2(4)中的流式细胞术测定结果的图。
图6为示出实施例2(5)中的流式细胞术测定结果的图。
图7为示出实施例3中的流式细胞术测定结果的图。
图8为示出实施例4中的流式细胞术测定结果的图。
图9为示出实施例4中的流式细胞术测定结果的图。
图10为示出参考例1中的流式细胞术测定结果的图。
图11为示出参考例2中的流式细胞术测定结果的图。
图12为示出实施例5中的流式细胞术测定结果的图。
图13为示出实施例6中的流式细胞术测定结果的图。
图14为示出实施例7中的流式细胞术测定结果的图。
图15为示出实施例9和参考例3中的CD4+T细胞的IFN-γ分泌的测定结果的图。
图16为示出参考例3中的流式细胞术测定结果的图。
图17为示出实施例9和参考例3中的CD4+T细胞的IFN-γ分泌的测定结果的图。
图18为示出实施例10中的流式细胞术测定结果的图。
具体实施方式
本发明提供包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的免疫诱导剂(以下也称为本发明的免疫诱导剂。)。
本发明的免疫诱导剂中的多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合。
“包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物”只要包含1个或多个(优选为多个，例如2、3、4、5或6个)CpG基序，则可以没有特别限制地使用具有任意的碱基序列和碱基数的多核苷酸或其衍生物。作为CpG基序的具体例，可列举AGCGTT、GACGTT、GACGTC、GTCGTT等。可以包含多个序列不同的CpG基序。多核苷酸中所含的CpG基序的数量没有特别限制，优选包含1至6个CpG基序，进一步优选包含2至4个CpG基序。上述多核苷酸或多核苷酸衍生物优选为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或经硫代磷酸酯修饰的DNA衍生物，局部也可以包含RNA或RNA衍生物。在包含RNA或RNA衍生物时，它们的含量以碱基数比例计优选为20％以下(具体为20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％以下)。
多核苷酸或多核苷酸衍生物中所含的碱基数优选为15～40(具体为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)，更优选为20～30(具体为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)。作为优选的多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基序列的具体例，可列举下述表1所示的序列。表1中，下划线的序列表示CpG基序。
[表1-1]
Figure BDA0003865786450000211
[表1-2]
包含CpG基序的DNA(5’→3’) 序列号
1018ISS TGACTGTGAACGTTCGAGATGA 43
1018ISS_30 TGAACGTTCGACTGTG<u>AACGTT</u>CGAGATGA 44
1018ISS_40 TG<u>AACGTT</u>CGTG<u>AACGTT</u>CGACTGTG<u>AACGTT</u>CGAGATGA 45
多核苷酸在生物体内容易被核酸酶降解，因此为了提高在生物体内的稳定性，可以使用多核苷酸衍生物来代替多核苷酸。多核苷酸衍生物可以是包含本技术领域中已知的、作为用于增加核酸酶抗性而提高生物体内稳定性的修饰的任意修饰的物质。作为多核苷酸衍生物的例子，可列举核糖核苷酸的2’位的羟基的全部或一部分被氟或甲氧基置换的多核苷酸、多核糖核苷酸(RNA)或多脱氧核糖核苷酸(DNA)的磷酸二酯键的全部或一部分被硫代磷酸酯键置换的多核苷酸等。多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸的磷酸二酯键的一部分被硫代磷酸酯键置换时，优选磷酸二酯键的50％以上(具体为50、60、70、80或90％以上)被硫代磷酸酯键置换，更优选90％以上(具体为90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％以上)被硫代磷酸酯键置换，可以实质上全部被硫代磷酸酯键置换。磷酸二酯键可以全部被硫代磷酸酯键置换。被硫代磷酸酯键置换的磷酸二酯键的位置没有特别限制，可以是连续的多个磷酸二酯键被置换，或者也可以以硫代磷酸酯键彼此不相邻的方式被置换。
多核苷酸或多核苷酸衍生物的与间隔基键合的位置没有特别限定，例如可以为5’末端或3’末端。多核苷酸或多核苷酸衍生物与间隔基的共价键合中，可以直接利用多核苷酸或多核苷酸衍生物中存在的官能团或利用通过化学修饰而活化的官能团。多核苷酸或多核苷酸衍生物优选在其5’末端或3’末端的羟基的氧原子上与间隔基进行键合。
多核苷酸或多核苷酸衍生物可以使用已知的化学合成法(例如磷酸三酯法、亚磷酰胺法、H-膦酸酯法等)来合成。也可以使用市售的核酸合成机、并且使用市售的用于DNA/RNA合成的试剂来合成。
本发明的免疫诱导剂中的“肽”为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
本发明中，“MHC结合肽”是指无需进行修剪等额外加工即可与MHC分子(即，主要组织相容性基因复合体)结合、并作为抗原呈递于T细胞的肽。MHC分子包括MHC-1分子(也称为MHC I类分子。)和MHC-2分子(也称为MHC II类分子。)。另外，人类的MHC-1分子被称为HLA分子，存在多种等位基因。MHC结合肽优选为由MHC-1分子进行抗原呈递的肽(即，MHC-1结合肽)和由MHC-2分子进行抗原呈递的肽(即，MHC-2结合肽)中的任意者，更优选为MHC-1结合肽，进而更优选为由HLA-A分子进行抗原呈递的肽(即，HLA-A结合肽)或由HLA-B分子进行抗原呈递的肽(即，HLA-B结合肽)。
MHC结合肽可以是成为食物变态反应等变态反应的原因的蛋白质、细菌、病毒等病原体、源自起源为肿瘤细胞等的蛋白的物质。作为MHC结合肽，可列举例如公共数据库SYFPEITHI(参照http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm；Immunogenetics(1999)50:213-219)中收录的肽、Immunogenetics(1995)41:178-228的表格中记载的肽，但是不限于这些。
作为MHC-1结合肽的具体例，可列举OVA肽1(卵清蛋白(OVA；GenBank登录号：CAA23716.1)的第258～265位的氨基酸序列所构成的肽、SIINFEKL(序列号41))、TRP2-9(mTRP2(GenBank登录号：CAA44951.1)的第180～188位的氨基酸序列所构成的肽)、hGP100-9(hGP100(GenBank登录号：AAC60634.1)的第25～33位的氨基酸序列所构成的肽)等。
作为MHC-2结合肽的具体例，可列举OVA肽2(OVA的第324～340位的氨基酸序列所构成的肽、ISQAVHAAHAEINEAGR(序列号42))等。
MHC分子中，在肽结合沟内存在与MHC结合肽直接进行相互作用的被称为口袋的部位。MHC结合肽中的、特定的与口袋进行相互作用的残基被称为锚残基或锚氨基酸，其位置可根据所结合的MHC分子的每种类型而不同。MHC分子的每种类型的锚残基位置和通用基序例如可以通过公共数据库MHC Motif Viewer(参照http://www.cbs.dtu.dk/biotools/MHCMotifViewer/Home.html；Immunogenetics(2008)60:759-765)来确认。例如，已知在人类MHC-1、即HLA-A、HLA-B的情况下N末端侧起第2位和第9位的氨基酸为锚残基。
MHC结合肽除了包括上述那样的可天然存在的肽(野生型肽)以外，例如还包括含有非天然型氨基酸的非天然存在的肽。作为这样的肽，可列举例如为了提高与MHC分子的结合性而将锚部位置换成其它氨基酸(也包括非天然氨基酸。)的改变肽(称为异变肽(heteroclitic peptides)。)(参照Front.Immunol.6:377(2015)和J Immunol.174(8):4812-4820(2005))。
MHC结合肽的氨基酸长度没有特别限定，可根据MHC分子的类型而不同，例如可以为5以上且30以下。与MHC-1分子结合的肽的长度在一定程度上是固定的，通常为8～11氨基酸长度。因此，在本发明中，在MHC结合肽为MHC-1结合肽时，其氨基酸长度优选为8以上且11以下，更优选为8、9或10，进一步优选为9或10。
本发明人们发现，若为了缀合物化而在MHC结合肽的N末端添加半胱氨酸等氨基酸，有时会变得不能与MHC分子结合(实施例3)。已知内质网氨肽酶(ERAP)参与MHC-1分子的抗原肽呈递，抗原肽前体通常被ERAP从N末端起进行修剪，从而成为适合于与MHC-1结合的长度。但是，认为由多核苷酸-肽缀合物生成的肽不适合进行这种修剪，可能无法形成与MHC分子的肽结合沟具有结合性的原本的肽结构。与此相对地，保留了锚残基且MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽则能够与MHC-1分子结合。另外，使用该肽制备的多核苷酸-肽缀合物具有充分的CTL诱导能力。
与具有反应性官能团的氨基酸进行置换的、MHC结合肽的N末端的氨基酸的数量没有特别限定，只有不包括用于结合MHC的锚残基即可，可根据MHC分子的类型适当设定。例如，在MHC-1分子的情况下，进行置换的氨基酸的数量可为4个以下(4个、3个、2个或1个)，优选为1个。一实施方式中，在MHC结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽时，锚残基存在于N末端起第2位的位置，因此进行置换的氨基酸的数量可以为1个。
“具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸”是指：具有能够与间隔基形成酯键、酰胺键、磷酸酯键等共价键的反应性官能团的氨基酸，可以为天然氨基酸和非天然氨基酸中的任意者。间隔基的共价键优选为生物体内环境中能断裂的共价键。作为这样的共价键，可列举例如二硫键等可在细胞内的还原环境下被断裂的键。另外，作为例子，还可列举可被酯酶、肽酶(例如组织蛋白酶等)、核酸酶等细胞内酶特异性断裂的酯键、酰胺键(例如与组织蛋白酶敏感性肽的酰胺键等)、磷酸二酯键等。作为更优选的实施方式，可以是共价键为二硫键、反应性官能团为硫醇基。这种情况下，“具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸”可以是半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。具有硫醇基的半胱氨酸类似物是指侧链具有硫醇的氨基酸，侧链的结构没有特别限定。作为具有硫醇基的半胱氨酸类似物，可列举例如高半胱氨酸(CAS No:6027-13-0)、青霉胺(β,β-二甲基半胱氨酸；CAS No:1113-41-3)、β-甲基半胱氨酸(CAS No:29768-80-7)、和4-巯基-正缬氨酸(CAS No:2351397-00-5)。
本发明的免疫诱导剂中的肽可以使用肽合成等任意的公知的方法来制备。
本发明的免疫诱导剂中的“间隔基”只要是能够与包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物以及肽共价键合的结构即可，可列举例如亚烷基、聚乙二醇(PEG)等。间隔基可以包含含有下式所示的磷酸二酯结构或硫代磷酸酯结构的重复单元。
Figure BDA0003865786450000251
上述式中，X表示氧原子或硫原子(这里，各X任选相同或不同)，R表示(CH2)pO、(CH2)qNH、(CH2CH2O)m中的任意者(m、p和q分别独立地表示10以下的自然数。)，n表示10以下的自然数。
这些重复单元不会被核酸酶水解，因此X即使为氧原子，在生物体内的稳定性也不会大幅降低。例如，R为(CH2)3O时，重复单元的尺寸几乎与核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的尺寸相等，因此通过用该间隔基替换多核苷酸或多核苷酸衍生物的一部分，可以期待生产成本的降低。作为间隔基的具体例子，可列举下述例子。
Figure BDA0003865786450000261
Figure BDA0003865786450000271
Figure BDA0003865786450000281
Figure BDA0003865786450000291
Figure BDA0003865786450000301
Figure BDA0003865786450000311
Figure BDA0003865786450000321
Figure BDA0003865786450000331
作为间隔基的更优选的例子，可列举具有下述任意结构的间隔基。
Figure BDA0003865786450000341
另一方式中，作为间隔基的更优选的例子，可列举具有下述任意结构的间隔基。
Figure BDA0003865786450000342
作为间隔基与多核苷酸或多核苷酸衍生物成键、以及间隔基与肽成键时使用的反应性官能团的组合的例子，除了可列举形成酯键、酰胺键、磷酸酯键等的反应性官能团的组合以外，还可以列举例如用于将生物分子固定于生物芯片表面的反应性官能团的组合，更具体而言，可列举下述所示的组合。
(a)炔烃与叠氮化合物
炔烃与叠氮化合物(叠氮化物)通过下述所示的加成环化反应(Huisgen反应)而形成1,2,3-三唑环。两者是能导入包括生物分子在内的众多有机化合物中的稳定的官能团，在包含水的溶剂中也迅速且几乎定量地反应，几乎不伴有副反应，不会产生多余的废弃物，因此作为所谓的“点击化学”的核心反应，被广泛用于生物化学领域中。炔烃衍生物和叠氮基可以利用任意公知的方法导入具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物中。作为炔烃衍生物，可以容易地获得丙炔醇、丙炔胺等具有反应性官能团的炔烃衍生物，可以通过将这些直接与羧基、羟基等反应性官能团反应、或者与羰基二咪唑等一起反应，通过所生成的酰胺键、酯键、氨酯键等而导入炔烃衍生物。对于叠氮基，也可以利用任意公知的方法，导入具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物中。需要说明的是，Huisgen反应在铜催化剂的存在下进行，但在具有抗原性的肽和磷酸二酯键被硫代磷酸酯键等含硫官能团替换的多核苷酸衍生物中，由于存在与铜离子配位的硫原子，因此有铜的催化活性降低的担心。为了提高反应率，优选添加过量的铜。
Figure BDA0003865786450000351
(b)马来酰亚胺或乙烯基砜与硫醇基
如下述所示，具有与吸电子性的羰基或砜基相邻的双键的马来酰亚胺或乙烯基砜在中性附近的pH下通过与硫醇基的加成反应(迈克尔加成反应)而生成稳定的硫醚衍生物。具有适当的间隔基的马来酰亚胺和乙烯基砜衍生物已有市售，因此容易将这些官能团导入具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物中。将硫醇基导入具有抗原性的肽中时，包含半胱氨酸的具有抗原性的肽的情况下可以利用半胱氨酸残基侧链的硫醇基。其中，由于半胱氨酸是存在比低的氨基酸，因此使用将半胱氨酸导入具有抗原性的肽的N末端侧的肽。作为包含硫醇基的多核苷酸或多核苷酸衍生物，可使用将这些的5’末端的羟基转化为硫醇基的硫醇基化多核苷酸。
Figure BDA0003865786450000361
(c)肽的硫醇基与硫醇化多核苷酸的硫醇基
如上所述，使导入到肽的N末端的硫醇基与硫醇化多核苷酸的硫醇基反应，形成二硫键(disulfide group)。二硫键在还原剂的存在下断裂，因此与上两者相比在稳定性方面差，但是具有在生物体内的还原性环境下断裂的优点。将硫醇基导入多核苷酸或多核苷酸衍生物时，可以利用任意公知的方法来进行，作为具体例子，可列举下式所示的氨基化多核苷酸或多核苷酸衍生物与ω-(2-吡啶基二硫基)脂肪酸的N-琥珀酰亚胺酯的反应。
Figure BDA0003865786450000362
上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，优选至少上述间隔基与上述肽之间的共价键为可在生物体环境中断裂的共价键。因此，在上述(a)～(c)中，优选在生物体内可容易断裂的、基于肽的硫醇基与硫醇化多核苷酸的硫醇基的组合的二硫键。这种情况下，二硫键为间隔基与肽之间的共价键。
作为本发明的免疫诱导剂中的多核苷酸-肽缀合物的具体例，可列举下述实施例1中记载的CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)、CpG20(S)a-mTRP2pep9(化合物2)和CpG30(S)a-hGP100pep9(化合物3)、以及下述化合物。需要说明的是，下述式中用碱基序列表示的部分表示磷酸二酯键被置换成硫代磷酸酯键的DNA衍生物。
Figure BDA0003865786450000371
另外，作为本发明的免疫诱导剂中的多核苷酸-肽缀合物的具体例，可列举下述实施例5中记载的ISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、和ODN1826-mTRP2pep9、实施例6中记载的CpG30(S)a2-OVApep8和CpG30(S)a2-mTRP2pep9、实施例9中记载的CpG30(S)a2-OVA2-15。
一方式中，本发明的免疫诱导剂中所含的1个多核苷酸或多核苷酸衍生物可以与2个以上的肽进行键合。即，本发明的免疫诱导剂可包含1个多核苷酸或多核苷酸衍生物和2个以上的肽。
多核苷酸或多核苷酸衍生物与2个以上的肽借助间隔基键合即可。多核苷酸或多核苷酸衍生物例如可以分别借助不同的间隔基与2个以上的肽进行键合。多核苷酸或多核苷酸衍生物可以借助枝化的1个间隔基与2个以上的肽进行键合。1个多核苷酸或多核苷酸衍生物可以通过这些键合方式的组合与3个以上的肽进行键合。多核苷酸或多核苷酸衍生物部分的、与间隔基键合的位置没有特别限定，例如可以从5’末端和3’末端中选择。
2个以上的肽可以是相同的肽，也可以是不同的肽，优选全部相同。1个多核苷酸或多核苷酸衍生物上所键合的肽的数量没有特别限定，可以为例如2个、3个、4个、5个或更多个。
一方式中，本发明的免疫诱导剂可以在其多核苷酸或多核苷酸衍生物部分处，与具有该部分所含的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸或多核苷酸衍生物(以下也称为互补链多核苷酸或多核苷酸衍生物。)形成双链。
互补链多核苷酸或多核苷酸衍生物可以通过与本发明的免疫诱导剂中的多核苷酸或多核苷酸衍生物部分相同的方法来合成。互补链多核苷酸或多核苷酸衍生物可以经过修饰，以改善生物体内稳定性、毒性、体内动力学等特性。作为这样的修饰，可列举例如脂质修饰(参照WO2017/057540)。在5’或3’末端中的一端或两端具有脂质修饰的化合物可通过实施例8中记载的方法来合成。
可以按照常规的退火方法使本发明的免疫诱导剂的多核苷酸或多核苷酸衍生物部分与互补链多核苷酸或多核苷酸衍生物形成双链。例如，可以将多核苷酸-肽缀合物和互补链多核苷酸或多核苷酸衍生物混合，在进行升温而使其形成单链状态后自然冷却到室温，从而形成双链。
作为用作本发明的免疫诱导剂的有效成分的多核苷酸-肽缀合物的药学上可接受的盐，可列举例如碱金属(钾、钠、锂等)盐、碱土金属(钙、镁等)盐、铵盐(包括四甲基铵盐、四丁基铵盐等)、有机胺(三乙胺、甲胺、二甲胺、环戊胺、苄胺、苯乙胺、哌啶、单乙醇胺、二乙醇胺、三(羟基甲基)甲胺、赖氨酸、精氨酸、N-甲基-D-葡糖胺等)盐、酸加成盐(包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等无机酸盐；和乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、草酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸(mesylate)盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、羟乙磺酸盐、葡萄糖醛酸盐、葡萄糖酸盐等有机酸盐)。
用作本发明的免疫诱导剂的有效成分的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐可以以溶剂化物(包括水合物)形式存在。作为溶剂化物，只要是药学上可接受的者就没有特别限定，可列举例如水合物、乙醇化物等。
本发明的免疫诱导剂可以包含具有免疫激活活性的物质作为佐剂。佐剂没有限定，是激活天然免疫的物质。佐剂优选为天然免疫受体的激动剂。作为天然免疫受体激动剂，可示例出TLR激动剂(例如，TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂)、视黄酸诱导基因-I样受体(RLR：retinoic acid-inducible gene I(RIG-1)-like receptors)激动剂、干扰素基因刺激因子(STING：stimulator ofInterferon genes)激动剂、核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR：nucleotide-bindingoligomerization domain(NOD)-like receptors)激动剂、C型凝集素受体(CLR：C-typelectin receptors)激动剂等。作为TLR激动剂，例如可列举脂肽、Poly IC RNA、咪喹莫特、雷西莫特、单磷酰脂质A(MPL)、CpG-ODN等。作为RLR激动剂，可列举pppRNA、Poly IC RNA等，作为STING激动剂，可列举cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP等，作为NLR激动剂，可列举iE-DAP、FK565、MDP、莫拉丁酯等，作为CLR激动剂，可列举β-葡聚糖、海藻糖二霉菌酸酯等。佐剂优选为TLR激动剂，更优选为TLR4激动剂、TLR7激动剂或TLR9激动剂，进而更优选为咪喹莫特、雷西莫特、MPL或CpG-ODN。在一方式中，佐剂为咪喹莫特、MPL或CpG-ODN。作为佐剂，可根据多核苷酸-肽缀合物中所导入的肽等适当选择，例如可以为CpG DNA等，也可以为国际公开第2015/118789号中记载的多核苷酸/β-1,3-葡聚糖复合体。
本发明的免疫诱导剂可通过下述方法制造，所述方法包括下述步骤：
(1)制备包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物；
(2)制备MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括锚残基；和
(3)借助间隔基将(1)的多核苷酸或多核苷酸衍生物与(2)的肽连接，这里，上述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合。
因此，一方式中，本发明提供包括上述工序(1)～(3)的、本发明的免疫诱导剂的制造方法。本方式中的各术语基于本说明书中记载的术语说明来解释。利用本方法，可以使用广泛的抗原肽来制造能够诱导CTL活性的免疫诱导剂。
另外，本发明提供多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐。本方式中的各术语基于本说明书中记载的术语说明来解释。该多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐可作为本发明的免疫诱导剂中的有效成分来使用。
另外，该多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐可通过包含上述本发明的免疫诱导剂的制造方法中的工序(1)～(3)的方法来制造。因此，一方式中，本发明提供包括上述工序(1)～(3)的、多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐的制造方法。本方式中的各术语基于本说明书中记载的术语说明来解释。利用本方法，可以使用广泛的抗原肽来制造可成为能够诱导CTL活性的免疫诱导剂的有效成分的、多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐。
本发明另外提供包含本发明的免疫诱导剂的药物组合物(以下也称为本发明的药物组合物。)。本发明的药物组合物的制造中，除了作为有效成分的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐以外，可以使用任意的公知的成分(药物用途中可接受的任意的载体、赋形剂和添加物)和制剂方法。作为制剂用的物质，可以列举出以下的物质，但不限定于这些：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸类、抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠等抗氧化剂、磷酸、柠檬酸、硼酸缓冲剂、碳酸氢钠、Tris-盐酸(Tris-HCl)溶液等缓冲剂、甘露糖醇、甘氨酸等填充剂、乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂、咖啡因、聚乙烯基吡咯烷酮、β-环糊精、羟基丙基-β-环糊精等络合剂、葡萄糖、甘露糖或糊精等增量剂、单糖类、二糖类等其它碳水化合物、着色剂、香味剂、稀释剂、乳化剂、聚乙烯基吡咯烷酮等亲水聚合物、低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢等防腐剂、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶剂、甘露糖醇或山梨醇等糖醇、悬浮剂、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或胆固醇等表面活性剂、蔗糖、山梨醇等稳定化增强剂、氯化钠、氯化钾、甘露糖醇、山梨醇等弹性增强剂、输送剂、赋形剂和/或药学上的辅助剂。本领域技术人员可根据适用疾病、使用给药途径等适当确定合适的药物组合物的组成。
本发明的药物组合物可以以适于经口或非经口给药的剂型的形式提供。例如，可使用注射剂、栓剂等，注射剂可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂型。这样的注射剂可以依据公知的方法来制备。作为注射剂的制备方法，例如，可以通过将上述本发明的免疫诱导剂溶解或悬浮于通常注射剂中使用的无菌的水性溶剂中来制备。作为注射用的水性溶剂，例如可以使用蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、Tris缓冲液、乙酸缓冲液等缓冲液等。这样的水性溶剂的pH可列举5～10，优选为6～8。已制得的注射液优选填充于适当的安瓿中。注射剂也可以制成冷冻干燥制剂。除了注射剂之外，可以采用经皮、粘膜吸收用的剂型(液剂喷雾、软膏、凝胶、洗剂、贴片)、皮下局部缓释用的剂型(包含纳米凝胶、生物降解性微/纳米胶囊等的悬浮液、温度响应性凝胶)、皮肤渗透用透皮装置的制剂(离子导入、微针)、粉末剂、片剂、胶囊剂、糖浆剂、气溶胶、干粉等吸入剂等形态。
本发明的药物组合物可以通过经口和非经口途径中的任意方式对人或温血动物(小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、鸡、猫、狗、猴子等)进行给药。作为非经口给药途径，可列举出皮下、皮内和肌肉内注射、腹腔内给药、点滴、静脉内给药、向口腔粘膜给药、向鼻粘膜或咽部喷雾等。
作为本发明的药物组合物的有效成分的多核苷酸-肽缀合物的用量根据活性、成为治疗对象的疾病、成为给药对象的动物的种类、体重、性别、年龄、疾病的种类、给药方法等而不同。以体重60kg的成人为例时，经口给药的情况，每一天的用量通常为约0.1～约100mg、优选为约1.0～约50mg、更优选为约1.0～约20mg，非经口给药的情况，每一天的用量通常为约0.01～约30mg、优选为约0.1～约20mg、更优选为约0.1～约10mg。对其它动物进行给药时，将上述用量换算为每单位体重的用量后，乘以成为给药对象的动物的体重，并使用由此而得到的用量。
另外，向对象给予本发明的药物组合物的频率可以由本领域技术人员考虑成为给药对象的动物的种类、体重、性别、年龄、疾病的种类、给药方法等而容易地确定。例如，以疫苗形式给药本发明的组合物时，可以与通常的疫苗制剂同样地通常以1～数次/天仅给予1天或以1～数周的间隔多次给药。优选边观察进展情况边进行给药，例如，可以间隔至少约一周的时间而进行加强免疫。通过进行加强免疫，预期可获得增强效果，可以发挥更高的感染防御等效果。
通过将本发明的药物组合物向病原体感染症、癌症患者、可能患有癌症/病原体感染症的对象给药，使接受了该给药的对象中的细胞毒性T细胞(CTL)和辅助T细胞被抗原特异性激活，诱导温血动物(优选为人)的防御免疫反应，从而能够预防/治疗该感染症、癌症。另外，通过将本发明的药物组合物给药于变态反应疾病患者，则成为抑制针对疾病原因即变应原的过度免疫应答的抗原特异性免疫疗法。即，本发明的药物组合物作为用于上述感染症、癌症、变态反应疾病等疾病的预防或治疗的疫苗有用。本发明中，术语“肿瘤”和“癌症”可以互换使用。另外，本发明中，有时将肿瘤、恶性肿瘤、癌症、恶性新生物、癌瘤、肉瘤等统称为“肿瘤”或“癌症”。另外，术语“肿瘤”和“癌症”中，还包括骨髓增生异常综合征等根据情况分类为癌前阶段的病情。
成为治疗或预防的对象的肿瘤的种类只要是确认对本发明的药物组合物敏感的肿瘤就没有特别限定，可列举出乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌等)、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫体癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、食道癌、骨肉瘤、皮肤癌(包括黑色素瘤等)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、头颈癌、睾丸癌、大肠癌、血液癌症(包括白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髄瘤等)、视网膜母细胞瘤、胰腺癌等。
本发明的药物组合物可以与其它抗肿瘤剂组合来使用。例如可列举出抗肿瘤抗生素、抗肿瘤性植物成分、生物应答调节剂(BRM，Biological Response Modifier：生物学的应答性控制物质)、激素、维生素、抗肿瘤性抗体、分子靶向药、烷基化剂、代谢拮抗剂之类的抗肿瘤剂等。
更具体而言，作为抗肿瘤性抗生素，例如可列举出丝裂霉素C、博来霉素、派来霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、阿霉素、伊达比星、吡柔比星、THP-多柔比星、4’-表阿霉素或者表柔比星、色霉素A3或放线菌素D等。
作为抗肿瘤性植物成分和它们的衍生物，例如可列举出长春地辛、长春新碱或者长春碱等长春花生物碱类、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛等紫杉烷类、或依托泊苷或者替尼泊苷等鬼臼毒素类。
作为BRM，例如可列举出肿瘤坏死因子或吲哚美辛等。
作为激素，例如可列举出氢化可的松、地塞米松、甲基强的松龙、脱氢皮质醇、普拉睾酮、倍他米松、曲安奈德、羟甲烯龙、诺龙、美替诺龙、磷雌酚、乙炔雌二醇、氯地孕酮、美雄烷或甲羟孕酮等。
作为维生素，例如可列举出维生素C或维生素A等。
作为抗肿瘤性抗体和分子靶向药，可列举出曲妥单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、地诺单抗、贝伐单抗、英夫利昔、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿维单抗、匹地利珠单抗、阿特朱单抗、雷莫芦单抗、甲磺酸伊马替尼、达沙替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、达拉菲尼、曲美替尼、考比替尼、帕唑帕尼、帕博西尼、帕比司他、索拉非尼、克唑替尼、维罗非尼、奎扎替尼、硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、米哚妥林、吉列替尼等。
作为烷基化剂，例如可列举出氮芥、氮芥N-氧化物、苯达莫司汀或者苯丁酸氮芥等烷基化剂、卡巴醌或者塞替派等氮丙啶系烷基化剂、二溴甘露醇或者二溴卫矛醇等环氧化物系烷基化剂、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、盐酸尼莫司汀、链脲霉素(streptozocin)、氯脲霉素或者雷莫司汀等亚硝基脲系烷基化剂、白消安、英丙舒凡甲苯磺酸盐、替莫唑胺或达卡巴嗪等。
作为代谢拮抗剂，例如可列举出6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤或者硫肌苷等嘌呤代谢拮抗剂、氟尿嘧啶、替加氟、替加氟/尿嘧啶、卡莫氟、脱氧氟尿苷、溴尿苷、阿糖胞苷或依诺他滨等嘧啶代谢拮抗剂、甲氨蝶呤或者三甲曲沙等叶酸代谢拮抗剂等。
作为其它抗肿瘤剂，例如可列举出顺铂、卡铂、奥沙利铂、他莫昔芬、来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、枸橼酸托瑞米芬、氟维司群、比卡米特、氟他米特、米托坦、亮丙瑞林、戈舍瑞林乙酸盐、喜树碱、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、裂褶菌多糖、沙培林、丙卡巴肼、哌泊溴烷、新制癌菌素、羟基脲、乌苯美司、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、艾日布林、维甲酸或云芝胞内多糖等。
作为成为治疗或预防的对象的感染症的种类，可示例出由病毒、真菌、细菌等病原体所致的感染症。作为病毒，可示例出流感病毒、肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、RS病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、日本脑炎病毒、水痘病毒、腺病毒、狂犬病病毒、黄热病病毒等。作为细菌，可列举出白喉杆菌、破伤风梭菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、结核杆菌、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌等。作为真菌，可示例出念珠菌真菌、组织胞浆菌真菌、隐球菌真菌、曲霉真菌等。本发明的药物组合物也可以与这些感染症的现有治疗药组合而使用。
作为成为治疗或预防的对象的变态反应疾病的种类，可列举支气管哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、荨麻疹、食物变态反应、动物变态反应、过敏性休克等。
将本发明的药物组合物与佐剂、其它药物组合进行给药时，意味着在一定期间内，被给药对象将两种药物摄取到其体内。可以给予单一制剂中包含了两种药物的制剂，另外，也可以分别进行制剂化，分别进行给药。分别进行制剂化时，其给药的时期没有特别限定，可以同时给药，也可以隔开时间在不同时间或者不同日进行给药。分别在不同时间或日进行给药时，其给药的顺序没有特别限定。通常各自的制剂依据各自的给药方法进行给药，因此它们的给药也可以是相同次数或不同次数。另外，分别进行制剂化时，各制剂的给药方法(给药途径)可以相同，也可以以不同的给药方法(给药途径)进行给药。另外，两种药物无需同时存在于体内，只要在一定期间(例如1个月、优选为1周、进一步优选为数天、进而更优选为1天)内被摄取体内即可，在进行任意的给药时，另一种有效成分也可能已从体内消失。
另外，一方式中，本发明提供一种疾病的治疗或预防方法，其包括将治疗或预防上的有效量的本发明的药物组合物给药于需要其的对象的步骤。作为疾病，可列举例如病原体感染症、肿瘤、和变态反应疾病，优选为肿瘤。
本发明中的“治疗或预防上的有效量”是指：对于特定的疾病或症状、给药方式和给药途径发挥治疗效果或预防效果的量，可根据对象的种属、疾病或症状的种类、症状、性别、年龄、病史、其它要素适当决定。
本申请还提供以下的发明。
[B1]一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
上述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与上述肽共价键合，
上述肽为去除了MHC-2结合肽的N末端和/或C末端的1个或多个连续氨基酸、且添加了具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，上述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC-2的锚残基。
[B2]根据[B1]所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及上述间隔基与上述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键。
[B3]根据[B1]或[B2]所述的免疫诱导剂，其中，具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。
[B4]根据[B1]至[B3]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基与上述肽之间的共价键为二硫键。
[B5]根据[B1]至[B4]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
[B6]根据[B1]至[B5]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。
[B7]根据[B6]所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。
[B8]根据[B1]至[B7]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
[B9]根据[B8]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键置换。
[B10]根据[B9]所述的免疫诱导剂，其中，在上述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换。
[B11]根据[B1]至[B10]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基包含下式所示的重复单元。
Figure BDA0003865786450000471
上述式中，
X表示氧原子或硫原子(这里，各X任选相同或不同)，
R表示(CH2)pO、(CH2)qNH和(CH2CH2O)m中的任意者(m、p和q分别独立地表示10以下的自然数。)，
n表示10以下的自然数。
[B12]根据[B1]至[B11]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000472
[B13]根据[B1]至[B10]中任一项所述的免疫诱导剂，其中，上述间隔基具有下述任意式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000481
[B14]根据[B1]至[B13]中任一项所述的免疫诱导剂，其还包含具有免疫激活活性的物质作为佐剂。
[B15]一种药物组合物，其包含[B1]至[B14]中任一项所述的免疫诱导剂。
[B16]根据[B15]所述的药物组合物，其用于治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病。
[B17]一种治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的方法，其包括对患者给药[B1]至[B14]中任一项所述的免疫诱导剂的步骤。
[B18]根据[B1]至[B14]中任一项所述的免疫诱导剂，其用于在治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病中使用。
[B19][B1]至[B14]中任一项所述的免疫诱导剂在制备治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的药物组合物中的应用。
在以下的说明中，将上述[B1]至[B19]的发明称为本发明B。本发明B中的各术语只要与使用MHC-2结合肽的发明不矛盾则基于本说明书中记载的术语说明来解释。
本发明B中，多核苷酸-肽缀合物中所含的肽是去除了MHC-2结合肽的N末端和/或C末端的1个或多个连续氨基酸、且添加了具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽。被去除的氨基酸的数量只要不包含用于结合MHC-2的锚残基就没有特别限定，可根据作为基础的MHC-2结合肽的长度和锚残基的位置适当设定。具有用于与上述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸可添加于N末端或C末端。
本发明B中，多核苷酸-肽缀合物中所含的肽的氨基酸长度没有特别限定，例如可以为8以上且30以下。
作为本发明B的免疫诱导剂的具体例，可列举例如下述实施例9中记载的CpG30(S)a2-OVA2-15。
根据本发明B，可以使用更短的肽制备多核苷酸-肽缀合物，因此可以提供物性和/或经济性更优异的药物组合物。
实施例
然后说明为了确认本发明的作用效果而进行的实施例。需要说明的是，本实施例中，“CpG DNA(S)”表示具有包含CpG基序的碱基序列且磷酸二酯键被置换成硫代磷酸酯键的DNA衍生物(多核苷酸衍生物的一例)。实施例中，多核苷酸衍生物以单字母碱基序列表示方式和左侧为5’末端侧(右侧为3’末端侧)的方式来表述，肽以单字母表示方式和左侧为N末端侧(右侧为C末端侧)的方式来表述。在单字母碱基序列表示方式的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键全部被硫代磷酸酯键置换，另外在键合有间隔基的情况下，末端结构表示至末端核苷的5’或3’羟基的氧原子为止，在未键合间隔基的情况下，末端结构表示末端核苷的5’或3’羟基(至氢原子为止均包含)。另外，本实施例中的CpG DNA(S)-肽缀合物以加成三乙胺和乙酸的盐形式来制备。
实施例1：CpG DNA(S)-肽缀合物的制备
(1)CpG DNA(S)衍生物的合成
CpG DNA(S)的合成使用亚磷酰胺法(例如Nucleic Acids Research,12,4539(1984))来进行。具有氨基修饰的CpG DNA(S)的合成使用ssH Amino Linker(Bioorg.Med.Chem.,16,941-949(2008))来进行。这些的合成利用了委托合成服务(GeneDesign Inc.)。
将合成的CpG DNA(S)的碱基序列示于以下。
CpG30a：5’-GAGCGTTCTCATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’(表1的K3-30(a)；序列号6)
CpG20a：5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’(表1的K3；序列号1)
得到的氨基修饰CpG DNA(S)在5’末端具有下式所示的结构。以下，将5’末端具有下式所示的结构的CpG DNA(S)衍生物中的、具有序列号6的序列者称为“CpG30(S)a”，具有序列号1的序列者称为“CpG20(S)a”。
Figure BDA0003865786450000501
进而，将氨基修饰CpG DNA(S)与琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP)以1：30摩尔比在磷酸缓冲液(pH8.0)中混合，在40℃下静置3小时后，使用NAP-5柱纯化SPDP修饰CpG DNA(S)。
需要说明的是，以下将下式所示的结构称为“ssH氨基接头”。
Figure BDA0003865786450000502
(2)N末端修饰肽的合成
肽利用委托合成服务(GeneDesign Inc.)来合成。
将合成的肽的氨基酸序列示于以下。
C-OVA8：CSIINFEKL(序列号30)
C-TRP2-9：CSVYDFFVWL(序列号31)
C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列号32)
C-gp100-9：CKVPRNQDWL(序列号33)
C-gp100-8：CVPRNQDWL(序列号34)
CM-TRP2-9：CMSVYDFFVWL(序列号35)
C-TRP2-13：CFANASVYDFFVWL(序列号36)
C-TRP2-11：CNASVYDFFVWL(序列号37)
C-OVA8是在卵清蛋白(OVA；GenBank登录号：CAA23716.1)的第258～265位的氨基酸序列所构成的肽(以下也称为OVA肽1。)的N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-TRP2-9是在作为黑素瘤相关抗原而已知的mTRP2(小鼠酪氨酸酶相关蛋白2；GenBank登录号：CAA44951.1)的第180～188位的氨基酸序列所构成的肽(以下也称为TRP2-9。)的N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-TRP2-8是在mTRP2的第181～188位的氨基酸序列的N末端添加有半胱氨酸的序列所构成的肽。
C-gp100-9是在作为黑素瘤相关抗原而已知的hGP100(人糖蛋白100；GenBank登录号：AAC60634.1)的第25～33位的氨基酸序列所构成的肽(以下也称为hGP100-9。)的N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-gp100-8是在hGP100的第26～33位的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。
CM-TRP2-9是在mTRP2的第180～188位的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸和甲硫氨酸的肽。
C-TRP2-13是在mTRP2的第176～188位的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-TRP2-11是在mTRP2的第178～188位的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。
(3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
将(1)中合成的SPDP修饰CpG DNA(S)1mol和(2)中合成的肽25mol在30％N,N-二甲基甲酰胺(DMF)水溶液中混合，在40℃下静置3小时后，通过利用下述(A)～(C)中任意条件的HPLC分取CpG DNA(S)-肽缀合物。将各缀合物的分取中使用的HPLC条件和保留时间示于表2。
＜HPLC条件(A)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M六氟异丙醇、8mM三乙胺(TEA)，将B液设为甲醇，色谱柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6*75mm(Waters Corporation)，在柱温度60℃、流速1mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：95％ B：5％
～20分钟 A：70％ B：30％
＜HPLC条件(B)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M六氟异丙醇、8mM三乙胺(TEA)，将B液设为甲醇，色谱柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6*75mm(Waters Corporation)，在柱温度60℃、流速1mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：95％ B：5％
～25分钟 A：60％ B：40％
＜HPLC条件(C)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M三乙基乙酸铵(TEAA；pH 7.0)，将B液设为乙腈，色谱柱使用ZORBAX Eclipse Plus C18(Agilent Technologies)，在柱温度40℃、流速1mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：90％ B：10％
～25分钟 A：70％ B：30％
～30分钟 A：0％ B：100％
＜HPLC条件(D)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M六氟异丙醇、8mM三乙胺(TEA)，将B液设为甲醇，色谱柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6*75mm(Waters Corporation)，在柱温度60℃、流速1mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：95％ B：5％
～25分钟 A：50％ B：50％
在使用HPLC的SPDP修饰CpG DNA(S)与肽的反应后的溶液的分取中，检测通过检测260nm的吸收来进行。确认到分取后的CpG DNA(S)-肽缀合物的洗脱时间比SPDP修饰CpGDNA(S)晚。认为这是由于通过与疏水性的肽结合而使洗脱时间变慢。另外，分取后的色谱图中未发现未反应的SPDP修饰CpG DNA(S)的峰，仅检测到CpG DNA(S)-肽缀合物的峰，由此确认以高纯度得到目标CpG DNA(S)-肽缀合物。作为HPLC分析结果的一例，图1示出了CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)在上述条件(B)下的色谱图。
将得到的CpG DNA(S)-肽缀合物的结构示于以下。式中，“CpG DNA”表示CpG30(S)a或CpG20(S)a的碱基序列部分，“petide”表示上述(2)中合成的肽的除N末端的半胱氨酸以外的部分。
Figure BDA0003865786450000531
合成的CpG DNA(S)-肽缀合物如下所示。
[表2]
Figure BDA0003865786450000541
另外，图2示出作为质谱分析结果的一例的、CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)的质谱(MALDI-TOF)。检测到11248.28(1价的负离子)和5622.53(2价的负离子)的峰，确认得到了与CpG30(S)a-mTRP2pep9(理论分子量(theoretical most abundant mass forC369H480N116O174P30S31)11246.56)相当的质谱。
实施例2：利用CpG DNA(S)-肽缀合物的细胞杀伤性T细胞诱导的评价(使用mTRP2抗原的评价)
(1)细胞杀伤性T细胞诱导的评价方法
将作为抗原的CpG DNA(S)-肽缀合物皮内给药于小鼠(C57BL/6小鼠(♂、7周龄))。CpG DNA(S)-肽缀合物的给药量为每只小鼠以肽换算计50、200或1000ng(此时，以CpG30(S)换算为约0.4、1.7或8.5μg)。给药起1周后，从同品系小鼠中未进行给药的个体取出脾细胞，将其分成2.0×107个细胞/ml的2个组，对于一组以10μg/mL添加作为抗原的肽并静置90分钟，由此制备抗原保持脾细胞，将未添加肽的脾细胞作为抗原未保持脾细胞。用5,6-羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)对抗原保持脾细胞和抗原未保持脾细胞的两者进行荧光修饰。此时，通过改变CFSE浓度使抗原保持脾细胞(CFSE：1μM)的荧光强度高于抗原未保持脾细胞(CFSE：0.1μM)。分别将数量相等的给药抗原保持脾细胞、抗原未保持脾细胞混合，对于给药了作为抗原的CpG DNA(S)-肽缀合物的小鼠个体，在给药起1周后以3.0×106的细胞数进行尾静脉给药。
上述尾静脉给药起经过24小时后，从小鼠取出脾细胞，通过流式细胞术定量抗原保持脾细胞和抗原未保持脾细胞的比例而评价抗原保持脾细胞的减少量，由此评价所诱导的抗原特异性细胞杀伤性T细胞的活性。为了比较，作为对照组，使用给药了PBS(磷酸缓冲生理食盐水)代替CpG DNA(S)-肽缀合物的小鼠个体在同样的条件下进行了测定。
(2)CpG30(S)a-mTRP2pep10的细胞杀伤性T细胞诱导能力评价
在在先申请(PCT/JP2019/038090)中，使用OVA来源的具有抗原性的肽的试验表明CpG DNA(S)-肽缀合物具有高的细胞杀伤性T细胞(CTL)诱导能力。另一方面，获知在对于其它抗原肽制备同样的CpG DNA(S)-肽缀合物时，有时无法得到充分的CTL诱导能力(图3)。
具体而言，使用作为具有抗原性的肽而已知的卵清蛋白(OVA)的第258～265位的氨基酸序列所构成的肽(OVA肽1)评价CpG30(S)a-OVApep9的CTL诱导能力，结果在每只以肽换算为20ng的给药量下观察到抗原保持脾细胞消失，确认诱导了强CTL活性。与此相对地，使用作为黑素瘤相关抗原而已知的mTRP2的第180～188位的氨基酸序列(9个氨基酸)所构成的肽(TRP2-9)评价CpG30(S)a-mTRP2pep10(使用在TRP2-9的N末端添加有半胱氨酸的肽制备的缀合物)的CTL诱导能力，结果在每只以肽换算为200ng的给药量下也未观察到CTL活性。
(3)CpG30(S)a-mTRP2pep9的细胞杀伤性T细胞诱导能力评价
CpG DNA(S)-肽缀合物为了诱导CTL活性，在被抗原呈递细胞摄取后，肽部分需要从多核苷酸部分和间隔基部分解离下来并与MHC分子结合。根据上述结果可认为，CpG30(S)a-mTRP2pep10的制备中使用的C-TRP2-9(10个氨基酸)是在本来的具有抗原性的肽的N末端添加1个氨基酸而成的，因此可能不能与MHC分子结合或即使结合也无法被T细胞受体识别。
因此，使用9个氨基酸所构成的TRP2-9的N末端的1个残基(丝氨酸)被去除且添加半胱氨酸而成的肽(C-TRP2-8)制备CpG DNA(S)-肽缀合物CpG30(S)a-mTRP2pep9，评价细胞杀伤性T细胞诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用TRP2-9。
将流式细胞术的测定结果示于图4。CpG30(S)a-mTRP2pep9的情况下，在每只以肽换算为200ng的给药量下可观察到抗原保持脾细胞的显著减少，确认诱导了高CTL活性。与此相对地，CpG30(S)a-mTRP2pep10的情况下未观察到抗原保持脾细胞的减少。
(4)用量依赖性
将CpG30(S)a-mTRP2pep9的给药量设为每只以肽换算为50、200或1000ng，评价细胞杀伤性T细胞诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用TRP2-9。
将流式细胞术的测定结果示于图5。CpG30(S)a-mTRP2pep9的CTL诱导能力未观察到用量依赖性。示出在200ng的用量下能够诱导强CTL活性。
(5)CpG DNA的碱基长度依赖性
制备将CpG30(S)a-mTRP2pep9的多核苷酸部分置换为20碱基长的CpG20(S)a的CpGDNA(S)-肽缀合物CpG20(S)a-mTRP2pep9，评价细胞杀伤性T细胞诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用TRP2-9。
将流式细胞术的测定结果示于图6。示出CpG20(S)a-mTRP2pep9与CpG30(S)a-mTRP2pep9同样地具有高CTL诱导能力。
实施例3：本发明的CpG-肽缀合物所用的肽的MHC-1结合性评价(DC2.4细胞中与OVA肽1的MHC-1结合竞争抑制评价)
将小鼠树突细胞株DC2.4细胞从培养皿剥离后，以1.5×105个细胞/200mL PBS悬浮于1.5mL管，向其中以0.25μg/mL的方式添加OVA肽1，另外以肽换算2.5μg/mL的方式添加TRP2来源的肽(TRP2-9、C-TRP2-9或C-TRP2-8)，将管在冰浴上孵育30分钟。然后，添加对OVA肽1与MHC-1的分子复合体特异性的抗体(用藻红蛋白(PE)进行荧光标记：PE-labeledanti-mouse OVA257-264(SIINFEKL)peptide bound to H-2Kb antibody(ThermoFisherSCIENTIFIC))(以下称为“PE labelled H-2Kb/FIINFEKL”。)，通过流式细胞术定量DC2.4细胞上的结合有上述抗体的OVA肽1-MHC-1复合体，评价TRP2来源的肽所引起的MHC-1结合竞争抑制活性。
将流式细胞术的测定结果示于图7。添加TRP2-9的情况下，荧光强度的平均值下降了38％，表明TRP2-9对于OVA肽1与MHC I类分子的结合具有抑制效果，即，能够与MHC I类分子结合。另外，添加与TRP2-9的N末端氨基酸不同、但是氨基酸长度相同的C-TRP2-8时，荧光强度的平均值下降了23％，确认了对OVA肽1与MHC I类分子的结合的抑制效果。另一方面，比TRP2-9多1个氨基酸的C-TRP2-9的情况下，未观察到抑制效果。
由此表明，C-TRP2-9失去了与MHC-1的结合性，C-TRP2-8则维持了与MHC-1的结合性。
实施例4：利用CpG DNA(S)-肽缀合物的、细胞杀伤性T细胞诱导的评价(使用hGP100的评价)
使用CpG30(S)a-hGP100pep10或CpG30(S)a-hGP100pep9，与实施例2同样地评价细胞杀伤性T细胞诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用作为黑素瘤相关抗原而已知的hGP100的第25～33位的氨基酸序列(9个氨基酸)所构成的肽(hGP100-9)。
将流式细胞术的测定结果示于图8和9。与使用mTRP2进行评价时同样地，CpG30(S)a-hGP100pep9的情况下，在每只以肽换算为200ng的给药量下观察到抗原保持脾细胞的减少，确认诱导了CTL活性，而CpG30(S)a-hGP100pep10的情况下几乎观察不到抗原保持脾细胞的减少(图8)。另外，在CpG30(S)a-hGP100pep9的CTL诱导能力方面，观察到用量依赖性，显示在200ng的用量下能够诱导强CTL活性(图9)。
参考例1：利用CpG30(S)a-CMTRP2-9的细胞杀伤性T细胞诱导的评价
在MHC-1呈递抗原肽时，内质网氨肽酶(ERAP)也参与其中。抗原肽前体被ERAP从N末端起进行修剪，从而成为适合于与MHC-1结合的长度。关于该过程，有报道指出：在N末端具有半胱氨酸的抗原肽前体中，若在半胱氨酸的C末端侧插入丙氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸则更容易受到ERAP的修剪(WO2014/157704)。根据图3所示的结果，认为对于CpG30(S)a-mTRP2pep10而言在C-TRP2-9的N末端的半胱氨酸的C末端侧插入丙氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸也会变得容易受到ERAP的修剪，有可能改善CTL诱导能力。
因此，使用在C-TRP2-9的N末端的半胱氨酸的C末端侧插入有甲硫氨酸的CM-TRP2-9制备CpG DNA(S)-肽缀合物CpG30(S)a-CMTRP2-9，并评价其CTL诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用TRP2-9。
将流式细胞术的测定结果示于图10。在每只以肽换算为1000ng的给药量下也未观察到抗原保持脾细胞的充分的减少，在200ng的给药量下几乎没有减少。显示出：虽然在使用肽(CM-TRP2-9)的体外评价中也得到了容易被ERAP切割的结果，但是在体内不能充分提高CTL诱导能力。
参考例2：利用CpG30(S)a-mTRP2-14和CpG30(S)a-mTRP2-12的、细胞杀伤性T细胞诱导的评价
据报道受到ERAP的修剪的容易性根据肽链长度而改变，9～16个氨基酸长度的肽为ERAP的优选底物(Proc Natl Acad Sci U S A.102(47):17107-12(2005))。
因此，使用N末端侧比C-TRP2-9中的TRP2来源序列多2或4个氨基酸的序列C-TRP2-11和C-TRP2-13制备CpG DNA(S)-肽缀合物CpG30(S)a-TRP2-12和CpG30(S)a-TRP2-14，评价它们的CTL诱导能力。作为用于制备抗原保持脾细胞的抗原，使用TRP2-9。
将流式细胞术的测定结果示于图11。任一CpG DNA(S)-肽缀合物均未观察到抗原保持脾细胞的减少。虽然在使用肽(C-TRP2-11或C-TRP2-13)的体外评价中得到了显示出容易被ERAP切割的结果，但是在使用缀合物的体内评价表明不能充分提高CTL诱导能力。
实施例5：包含K3来源的CpG基序以外的CpG基序的CpG DNA(S)-肽缀合物的合成和其细胞杀伤性T细胞诱导能力的评价
(1)合成法
通过与实施例1同样的方法合成了包含K3来源的CpG基序以外的CpG基序的CpGDNA(S)-肽缀合物。将合成的化合物示于下式和表3。需要说明的是，作为N末端修饰肽，使用C-TRP2-8(参照实施例1的(2))。
Figure BDA0003865786450000591
[表3]
Figure BDA0003865786450000601
(2)试验方法
通过与实施例2同样的方法评价ISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、和ODN1826-mTRP2pep9的细胞杀伤性T细胞诱导能力。给药量设为每只以肽换算为200ng。作为对照，使用CpG30(S)a-mTRP2pep9(包含K3来源的CpG基序的缀合物；参照实施例1)。
将结果示于图12。表明(1)中合成的任一化合物均具有与包含K3来源的CpG基序的缀合物同样的细胞杀伤性T细胞诱导能力。
实施例6：具有磷酸基被置换成硫代磷酸基的ssH氨基接头部分的缀合物的合成和其细胞杀伤性T细胞诱导能力的评价
(1)合成法
通过以下方法合成了具有磷酸基被置换成硫代磷酸基的ssH氨基接头部分的缀合物。将合成的化合物示于下式和表4。
Figure BDA0003865786450000611
[表4]
Figure BDA0003865786450000621
(1-1)CpG DNA(S)衍生物的合成
CpG DNA(S)的合成使用亚磷酰胺法(例如Nucleic Acids Research,12,4539(1984))来进行。具有氨基修饰的CpG DNA(S)的合成使用ssH Amino Linker(Bioorg.Med.Chem.,16,941-949(2008))的磷酸基被置换成硫代磷酸基者来进行。这些合成利用了委托合成服务(GeneDesign Inc.)。
合成的CpG DNA(S)的碱基序列与实施例1(1)中记载的CpG30a相同。
得到的氨基修饰CpG DNA(S)在5’末端具有下式所示的结构。以下将5’末端具有下式所示的结构的CpG DNA(S)衍生物中的、具有序列号6的序列者称为“CpG30(S)a2”。
Figure BDA0003865786450000631
进而，将氨基修饰CpG DNA(S)1mol和琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP)30mol在磷酸缓冲液(pH8.0)中混合，在40℃下静置3小时后，使用NAP-5柱纯化SPDP修饰CpG DNA(S)。
需要说明的是，得到的SPDP修饰CpG DNA(S)具有下式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000632
(1-2)N末端修饰肽的合成
肽利用委托合成服务(GeneDesign Inc.)来合成。
将合成的肽的氨基酸序列示于以下。
C-OVA7：CIINFEKL(序列号46)
C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列号32)
C-OVA7是在卵清蛋白(OVA；GenBank登录号：CAA23716.1)的第259～265位的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。C-OVA7是在作为MHC-1结合肽的OVA肽1(序列号41的氨基酸序列所构成的肽)的N末端去除1个残基并在N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-TRP2-8如实施例1记载，是在作为MHC-1结合肽的TRP2-9的N末端去除了1个残基且在N末端添加有半胱氨酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
对于(1-1)中合成的SPDP修饰CpG DNA(S)，在50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液中混合5至10摩尔当量的(1-2)中合成的肽，在40℃下反应2小时。反应后，通过利用下述条件的HPLC纯化分取CpG DNA(S)-肽缀合物。
＜HPLC条件(E)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M六氟异丙醇(HFIP)、8mM三乙胺(TEA)，将B液设为甲醇，色谱柱使用XBridge BEH C18(4.6×75mm Column XP)(Waters Corporation)，在柱温度40℃、流速1mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：80％ B：20％
～10分钟 A：50％ B：50％
将各缀合物的分取中使用的HPLC条件和保留时间示于表4。
(2)试验方法
通过与实施例2同样的方法评价了CpG30(S)a2-OVApep8和CpG30(S)a2-mTRP2pep9的细胞杀伤性T细胞诱导能力。CpG30(S)a2-OVApep8的给药量设为每只以肽换算为20ng。CpG30(S)a2-mTRP2pep9的给药量设为每只以肽换算为200ng。2种缀合物之间的给药量差异反映了原肽本身的抗原性长度的差异。
将结果示于图13。表明(1)中合成的CpG30(S)a2-OVApep8和CpG30(S)a2-mTRP2pep9均具有高的细胞杀伤性T细胞诱导能力。
实施例7：利用CpG DNA(S)-肽缀合物的、细胞杀伤性T细胞诱导的评价(2次给药时的活性)
通过与实施例2同样的方法评价了将CpG30(S)a-mTRP2pep9给药2次时的细胞杀伤性T细胞诱导能力。第2次给药在第1次给药的10天后进行。给药量均设为每只以肽换算为200ng。
将结果示于图14。表明：通过将CpG DNA(S)-肽缀合物给药2次，与单次给药时相比CTL活性提高。
实施例8：双链CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
使CpG DNA(S)-肽缀合物(CpG30(S)a-mTRP2pep9；参照实施例1)与具有和其CpGDNA(S)部分的碱基序列互补的序列的DNA衍生物退火，从而制备双链复合体(双链CpG DNA(S)-肽缀合物)。
(1)CpG互补链DNA衍生物的合成
与CpG互补的DNA的合成与CpG DNA(S)同样地使用亚磷酰胺法来进行。5’末端具有脂质修饰的互补链DNA的合成通过在互补链DNA序列合成的最后的偶联中使用下式所示的脂质化亚磷酰胺(通过与文献(WO2017/057540)中的M22-12亚磷酰胺同样的方法合成)来进行。
Figure BDA0003865786450000651
3’-末端具有脂质修饰的互补链DNA的合成如下述那样进行。
在通用固相载体(Glen UnySupport 500(GlenResearch,20-5040))上，使用Asymmetric Doubler(Lev)Phosphoramidite(GlenResearch,10-1981)进行首次偶联后，合成互补链DNA的序列。接着，在固相载体上进行脱三苯甲基化和乙酰基保护后，按照厂家规定的方法对乙酰丙酸单元进行脱保护。使上述脂质化亚磷酰胺与生成的羟基反应，从而合成目标化合物。
3’和5’-末端具有脂质修饰的互补链DNA的合成如下进行。
在通用固相载体(Glen UnySupport 500(GlenResearch,20-5040))上，使用Asymmetric Doubler(Lev)Phosphoramidite(GlenResearch,10-1981)进行首次偶联后，合成互补链DNA的序列。接着，在固相载体上进行脱三苯甲基化后，按照厂家规定的方法对乙酰丙酸单元进行脱保护。使上述脂质化亚磷酰胺与生成的3’和5’-末端的羟基反应，从而生成目标化合物。
将合成的与CpG互补的DNA衍生物的结构示于以下。需要说明的是，下述衍生物中的DNA序列(compK3：序列号47)为与K3的碱基序列(序列号1)互补的序列。
5’-Lipo-compK3：5’-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T-3’
3’-Lipo-compK3：5’-G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3’
5’,3’-di-Lipo-compK3：5’-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3’
上述结构中，“^”表示核苷间的硫代磷酸酯键。另外，“Lipo^G”和“T^Lipo”表示下述结构。
Figure BDA0003865786450000661
通过利用下述条件的HPLC分取与CpG互补的DNA衍生物。将结果示于表5。
＜HPLC条件(F)＞
按照以下的梯度条件，将A液设为0.1M六氟异丙醇(HFIP)、8mM三乙胺(TEA)，将B液设为甲醇，色谱柱使用Clarity(登録商標)2.6μm Oligo-MS 100A(LC-Column 50×2.1mm)(Phenomenex Inc)，在柱温度60℃、流速0.5mL/分钟之下进行HPLC。
0分钟 A：90％ B：10％
～7分钟 A：10％ B：90％
[表5]
Figure BDA0003865786450000671
(2)与CpG DNA(S)-肽缀合物形成双链复合体
将CpG30(S)a-mTRP2pep9的PBS溶液和上述(1)中合成的脂质修饰compK3的PBS溶液分别以终浓度为3.4μM的方式在1.5mL管内混合。将其放入90℃的热水浴升温后放置一晚，使其逐渐恢复到室温(在该冷却过程中形成双链)。将该溶液50μL给药于小鼠，相当于给药了200ng肽。
得到了下述表6中记载的组合的5种双链复合体。双链复合体的形成可以通过使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳、尺寸排阻层析等液相色谱、使用紫外分光法的熔解温度测定、利用静态光散射法测定的缔合体分子量测定等来进行确认。
[表6]
CpG DNA(S)-肽缀合物 互补链DNA衍生物
1 CpG30(S)a-mTRP2pep9 5’-Lipo-compK3
2 CpG30(S)a-mTRP2pep9 3’-Lipo-compK3
3 CpG30(S)a-mTRP2pep9 5’，3’-di-Lipo-compK3
4 CpG20(S)a-mTRP2pep9 5’-Lipo-compK3
5 CpG20(S)a-mTRP2pep9 3’-Lipo-compK3
实施例9：使用MHC-2结合肽的CpG DNA(S)-肽缀合物的合成和利用其的CD4+T细胞活化的评价
(1)合成法
通过以下方法合成了具有MHC-2结合肽来源的CpG DNA(S)部分的2种缀合物CpG30(S)a2-OVA2-15和CpG30(S)a2-OVA2-17。将合成的化合物示于下述式和表7。
Figure BDA0003865786450000691
[表7]
Figure BDA0003865786450000701
(1-1)CpG DNA(S)衍生物的合成
通过与实施例6同样的方法合成了CpG30(S)a2和其SPDP修饰体。
(1-2)N末端修饰肽的合成
N末端半胱氨酸修饰肽通过常规的Fmoc固相肽合成法来合成。将合成的肽的氨基酸序列示于以下。
将合成的肽的氨基酸序列示于以下。
C-OVA2-14：CSQAVHAAHAEINEA(序列号48)
C-OVA2-16：CSQAVHAAHAEINEAGR(序列号51)
C-OVA2-14是在卵清蛋白(OVA；GenBank登录号：CAA23716.1)的第325～338的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。C-OVA2-14是在OVA肽2(包含小鼠I-Ab/I-Ad结合性序列的序列号42的氨基酸序列所构成的肽)的N末端去除1个残基且在C末端去除2个残基、在N末端添加有半胱氨酸的肽。
C-OVA2-16是在上述卵清蛋白的325-340的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。C-OVA2-16是上述OVA肽2的N末端去除1个残基、在N末端添加有半胱氨酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
使用(1-1)中合成的SPDP修饰CpG DNA(S)和(1-2)中合成的肽，通过与实施例6的(1-3)同样的方法合成了CpG DNA(S)-肽缀合物。
(2)试验方法(通过IFN-γ分泌活性测定进行的、CpG-MHC2肽缀合物的一次免疫的CD4+T细胞活化的评价)
将作为抗原的CpG DNA(S)-肽缀合物皮内给药于小鼠(C57BL/6小鼠(♂、7周龄))。CpG DNA(S)-肽缀合物的给药量设为每只以肽换算为1000ng。给药起1周后取出脾细胞，以1.0×106个细胞/100μL接种在96孔培养皿中(培养基；RPMI1640)，以10μg/mL添加OVA来源的MHC-2结合性的抗原肽(OVA 324-340：ISQAVHAAHAEINEAGR(序列号42))。24小时后，使用IFNgamma Mouse ELISA Kit(Invitrogen,IFN gamma’Femto-HS’High Sensitivity MouseUncoated ELISA Kit)定量培养基中的干扰素γ(IFN-γ)。在通过给药CpG DNA(S)-肽缀合物而小鼠被免疫的情况下，在添加于培养基中的抗原肽所带来的刺激下，脾细胞中的抗原特异性CD4+T细胞被活化并分泌IFN-γ。
将结果示于图15和图17。
在分别给药了CpG30(S)a2-OVA2-15和CpG30(S)a2-OVA2-17的小鼠脾细胞的情况下，均可见高的IFN-γ分泌活性(图15和17；关于CpG30(S)a2-OVA2-18，参照参考例3。)。表明在使用MHC-2结合肽制备缀合物的情况下C末端的肽可以被去除。
参考例3：使用MHC-2结合肽的CpG DNA(S)-肽缀合物的合成和利用其的CD4+T细胞活化的评价
(1)合成法
通过以下方法合成了具有MHC-2结合肽来源的CpG DNA(S)部分的2种缀合物CpG30(S)a2-OVA2-18和CpG30(S)a2-OVA2-18c。将合成的化合物示于下式和表8。
Figure BDA0003865786450000721
[表8]
Figure BDA0003865786450000731
(1-1)CpG DNA(S)衍生物的合成
通过与实施例6同样的方法合成了CpG30(S)a2和其SPDP修饰体。
(1-2)N末端修饰肽和C末端修饰肽的合成
N末端半胱氨酸修饰肽和C末端半胱氨酸修饰肽通过常规Fmoc固相肽合成法来合成。
将合成的肽的氨基酸序列示于以下。
C-OVA2-17：CISQAVHAAHAEINEAGR(序列号49)
OVA2-17-C：ISQAVHAAHAEINEAGRC(序列号50)
C-OVA2-17是在卵清蛋白的324～340的氨基酸序列所构成的肽的N末端添加有半胱氨酸的肽。C-OVA2-17是在上述OVA肽2的N末端添加有半胱氨酸的肽。
OVA2-17-C是在卵清蛋白的324～340的氨基酸序列所构成的肽的C末端添加有半胱氨酸的肽。C-OVA2-17是在上述OVA肽2的C末端添加有半胱氨酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
使用(1-1)中合成的SPDP修饰CpG DNA(S)和(1-2)中合成的肽，通过与实施例6的(1-3)同样的方法合成了CpG DNA(S)-肽缀合物。
(2)试验方法(通过IFN-γ分泌活性测定进行的、CpG-MHC2肽缀合物的一次免疫的CD4+T细胞活化的评价)
将作为抗原的CpG DNA(S)-肽缀合物皮内给药于小鼠(C57BL/6小鼠(♂、7周龄))。CpG DNA(S)-肽缀合物的给药量设为每只以肽换算为1000ng。给药起1周后取出脾细胞，以1.0×106个细胞/100μL接种于96孔培养皿(培养基；RPMI1640)，以10μg/mL的方式添加OVA来源的抗原肽(OVA 324-340：ISQAVHAAHAEINEAGR(序列号42))。24小时后，使用IFN gammaMouse ELISA Kit(Invitrogen,IFN gamma’Femto-HS’High Sensitivity Mouse UncoatedELISA Kit)定量培养基中的干扰素γ(IFN-γ)。在通过给药CpG DNA(S)-肽缀合物而小鼠被免疫的情况下，在添加于培养基中的抗原肽所带来的刺激下，脾细胞中的抗原特异性CD4+T细胞被活化并分泌IFN-γ。
将结果示于图15和16。
给药了CpG30(S)a2-OVA2-18的小鼠的脾细胞中，可观察到高的IFN-γ分泌活性(图15和16)。
另外，在给药CpG30(S)a2-OVA2-18c的小鼠的脾细胞中，观察到与给药了CpG30(S)a2-OVA2-18时同等或更高的活性(图16)。表明：使用MHC-2结合肽制备缀合物时，可以在C末端侧缀合CpG DNA(S)。
实施例10：CpG DNA(S)-肽缀合物的制备(2)和其细胞杀伤性T细胞诱导能力的评价
(1)合成法
(1-1)CpG DNA(S)衍生物的合成
5’末端具有6-巯基己基的CpG DNA(S)的合成如下进行：在使用亚磷酰胺法合成CpG DNA(S)的序列后，与5’-thiol-modifier C6(S-三苯甲基-6-巯基己基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)反应，从而进行。这些合成利用了委托合成服务(GeneDesign Inc.)。
得到的6-巯基己基修饰CpG DNA(S)在5’末端具有下式所示的结构。以下，将5’末端具有下式所示的结构的CpG DNA(S)衍生物中的、具有序列号6的序列者称为“CpG30(S)a3”。
Figure BDA0003865786450000751
另外，5’末端具有下式所示的结构的CpG DNA(S)衍生物的合成通过使实施例6的(1-1)中合成的氨基修饰CpG DNA(S)和PPC-NHS酯(2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(吡啶-2-基二硫基)丁酸酯)以1：30摩尔比在磷酸缓冲液(pH8.0)中在40℃下反应3小时后用NAP-5柱进行纯化而进行。
Figure BDA0003865786450000761
(1-2)N末端修饰肽的合成
与实施例1同样地合成了C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列号32)。
(1-3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
相对于(1-1)中合成的CpG30(S)a3，在33％二甲基亚砜(DMSO)水溶液中混合30摩尔当量的Npys-OMe(CAS:68118-08-1)并反应一晚。接着，将在50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液中混合5摩尔当量的(1-2)中合成的肽，在40℃下反应2小时。反应后，用HPLC纯化而分取CpG DNA(S)-肽缀合物，得到CpG30(S)a3-mTRP2pep9。
另外，对于(1-1)中合成的PPC-NHS ester修饰CpG DNA(S)，在50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液中混合5摩尔当量的(1-2)中合成的肽，在40℃下反应2小时。反应后，用HPLC纯化而分取CpG DNA(S)-肽缀合物，得到CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9。
将合成的化合物示于下述式和表9。
Figure BDA0003865786450000762
[表9]
Figure BDA0003865786450000771
(2)试验方法
通过与实施例2同样的方法评价CpG30(S)a3-mTRP2pep9的细胞杀伤性T细胞诱导能力。给药量设为每只以肽换算为200ng。作为对照，使用CpG30(S)a2-mTRP2pep9(包含来自K3的CpG基序的缀合物；参照实施例6)。
将结果示于图18。表明CpG30(S)a3-mTRP2pep9具有与间隔基结构不同的CpG30(S)a2-mTRP2pep9同样的细胞杀伤性T细胞诱导能力。
实施例11：包含半胱氨酸类似物的CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
(1)合成法
使用利用半胱氨酸类似物修饰了N末端的肽来代替半胱氨酸，通过与实施例1同样的方法合成CpG DNA(S)-肽缀合物。将合成的化合物示于下述式和表10。需要说明的是，作为N末端修饰肽，使用N末端的氨基酸为非天然氨基酸的下述合成肽。
dC-mTRP2pep8:D-cysteine(半胱氨酸)-VYDFFVWL(序列号52)
homoC-mTRP2pep8:L-homocysteine(高半胱氨酸)-VYDFFVWL(序列号53)
Pen-mTRP2pep8:L-penicillamine(青霉胺)-VYDFFVWL(序列号54)
Figure BDA0003865786450000791
[表10]
Figure BDA0003865786450000801
(2)试验方法
通过与实施例2同样的方法评价CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8的细胞杀伤性T细胞诱导能力。给药量设为每只以肽换算为200ng。作为对照，使用CpG30(S)a2-mTRP2pep9(包含来自K3的CpG基序的缀合物；参照实施例6)。
将结果示于图18。表明包含半胱氨酸类似物的CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8具有与CpG30(S)a2-mTRP2pep9同样的细胞杀伤性T细胞诱导能力。
实施例12：在CpG DNA的5’和3’两末端具有肽的CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
(1)合成法
使用以下的(1-1)～(1-3)的方法合成了在CpG DNA的两末端具有肽的CpG DNA(S)-肽缀合物。将合成的化合物示于下述式和表11。需要说明的是，作为N末端修饰肽，使用C-TRP2-8(参照实施例1的(2))。
Figure BDA0003865786450000811
[表11]
Figure BDA0003865786450000821
(1-1)CpG DNA(S)衍生物的合成
在5’和3’两末端键合有氨基接头的CpG DNA(S)的合成如下进行：使用亚磷酰胺法，用3’-Amino-Modifier C6-dC CPG(Link Technologies Ltd.)合成CpG序列后，使ssH氨基接头与5’末端反应。这些合成利用了委托合成服务(GeneDesign Inc.)。
合成的CpG DNA(S)的碱基序列与实施例1的(1)中记载的CpG30a相同。
得到的氨基修饰CpG DNA(S)在5’末端具有下式所示的结构，
Figure BDA0003865786450000831
在3’末端具有下式所示的结构。
Figure BDA0003865786450000832
以下，将在3’和5’末端具有上述式所示的结构的CpG DNA(S)衍生物中的、具有序列号6的序列者称为“CpG30(S)a4”。
进而，将CpG30(S)a4和琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺]己酸酯(LC-SPDP)以1：30摩尔比在磷酸缓冲液(pH8.0)中混合，在40℃下静置3小时后，使用NAP-5柱纯化SPDP修饰CpG DNA(S)a4。
(1-2)N末端修饰肽的合成
与实施例1同样地合成了C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列号32)。
(1-3)CpG DNA(S)-肽缀合物的合成
对于(1-1)中合成的SPDP修饰CpG DNA(S)a4，在50％二甲基亚砜(DMSO)水溶液中混合5至10摩尔当量的(1-2)中合成的肽，在40℃下反应2小时。反应后，通过HPLC纯化而分取CpG DNA(S)-肽缀合物。将分取中使用的HPLC条件和保留时间示于表11。
产业上的可利用性
根据本发明，能够对于广泛的抗原肽提供能够诱导CTL活性的免疫诱导剂和包含其的药物组合物。
序列表自由文本
序列号1：K3
序列号2：K3-20(b)
序列号3：K3-21
序列号4：K3-24
序列号5：K3-27
序列号6：K3-30(a)
序列号7：K3-30(b)
序列号8：K3-40
序列号9：K3-30(c)
序列号10：K3-30(d)
序列号11：K3-30(e)
序列号12：K3-30(f)
序列号13：K3-26(a)
序列号14：K3-26(b)
序列号15：ODN1668
序列号16：ODN1668-30
序列号17：ODN1668-40
序列号18：ODN1826
序列号19：ODN1826-30
序列号20：ODN1826-40
序列号21：ODN2006
序列号22：ODN2006-30
序列号23：ODN2006-40
序列号24：ODN684
序列号25：ODN684-30
序列号26：ODN684-40
序列号27：ODN D-SL01
序列号28：ODN D-SL01-35
序列号29：C-CpG#1
序列号30：C-OVA8
序列号31：C-TRP2-9
序列号32：C-TRP2-8
序列号33：C-gp100-9
序列号34：C-gp100-8
序列号35：CM-TRP2-9
序列号36：C-TRP2-13
序列号37：C-TRP2-11
序列号38：C-OVA2-17
序列号39：C-OVA2-14
序列号40：C-OVA2-11
序列号41：OVA肽1
序列号42：OVA肽2
序列号43：1018ISS
序列号44：1018ISS#30
序列号45：1018ISS#40
序列号46：C-OVA7
序列号47：compK3
序列号48：C-OVA2-14
序列号49：C-OVA2-17
序列号50：OVA2-17-C
序列号51：C-OVA2-16
序列号52：dC-mTRP2pep8；第1位的氨基酸为D-半胱氨酸。
序列号53：homoC-mTRP2pep8；第1位的氨基酸为L-高半胱氨酸。
序列号54：Pen-mTRP2pep8；第1位的氨基酸为L-青霉胺。
序列表
<110> 公立大学法人北九州市立大学（THE UNIVERSITY OF KITAKYUSHU）
第一三共株式会社（DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED）
<120> 包含多核苷酸-肽缀合物的免疫诱导剂及包含其的药物组合物
<130> FA1511-20313
<150> JP 2020-057249
<151> 2020-03-27
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3
<400> 1
atcgactctc gagcgttctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-20(b)
<400> 2
gagcgttctc gagcgttctc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-21
<400> 3
cgagcgttct cgagcgttct c 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-24
<400> 4
tctcgagcgt tctcgagcgt tctc 24
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-27
<400> 5
gactctcgag cgttctcgag cgttctc 27
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(a)
<400> 6
gagcgttctc atcgactctc gagcgttctc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(b)
<400> 7
atcgactctc gagcgttctc gagcgttctc 30
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-40
<400> 8
atcgactctc gagcgttctc atcgactctc gagcgttctc 40
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(c)
<400> 9
ctcagcgttc tcagcgttct cagcgttctc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(d)
<400> 10
tttagcgttt ttagcgtttt tagcgttttt 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(e)
<400> 11
ttagcgttta gcgtttagcg tttagcgttt 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-30(f)
<400> 12
ttagcgttca gcgttcagcg ttcagcgttt 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-26(a)
<400> 13
tcagcgtttc agcgtttcag cgtttc 26
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> K3-26(b)
<400> 14
ttagcgtttt agcgttttag cgtttt 26
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1668
<400> 15
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1668-30
<400> 16
tgacgttcct tccatgacgt tcctgatgct 30
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1668-40
<400> 17
tccatgacgt tcctgatgct tccatgacgt tcctgatgct 40
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1826
<400> 18
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1826-30
<400> 19
tgacgttcct tccatgacgt tcctgacgtt 30
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN1826-40
<400> 20
tccatgacgt tcctgacgtt tccatgacgt tcctgacgtt 40
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN2006
<400> 21
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN2006-30
<400> 22
gtcgtttcgt cgttttgtcg ttttgtcgtt 30
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN2006-40
<400> 23
tcgtcgtttt gtcgtttcgt cgttttgtcg ttttgtcgtt 40
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN684
<400> 24
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN684-30
<400> 25
tcgtcgttcg acgttcgtcg ttcgtcgttc 30
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN684-40
<400> 26
gttcgtcgtt tcgtcgttcg acgttcgtcg ttcgtcgttc 40
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN D-SL01
<400> 27
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ODN D-SL01-35
<400> 28
tcgcgacgtt cgcgacgttc gcccgacgtt cggta 35
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-CpG_1
<400> 29
tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA8
<400> 30
Cys Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-TRP2-9
<400> 31
Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-TRP2-8
<400> 32
Cys Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-gp100-9
<400> 33
Cys Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-gp100-8
<400> 34
Cys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CM-TRP2-9
<400> 35
Cys Met Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-TRP2-13
<400> 36
Cys Phe Ala Asn Ala Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-TRP2-11
<400> 37
Cys Asn Ala Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5 10
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-17
<400> 38
Cys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-14
<400> 39
Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-11
<400> 40
Cys Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu
1 5 10
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OVA 肽 1
<400> 41
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OVA 肽 2
<400> 42
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1018ISS
<400> 43
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1018ISS_30
<400> 44
tgaacgttcg actgtgaacg ttcgagatga 30
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 1018ISS_40
<400> 45
tgaacgttcg tgaacgttcg actgtgaacg ttcgagatga 40
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA7
<400> 46
Cys Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> compK3
<400> 47
gagaacgctc gagagt 16
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-14
<400> 48
Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
<210> 49
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-17
<400> 49
Cys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OVA2-17-C
<400> 50
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg Cys
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C-OVA2-16
<400> 51
Cys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> dC-mTRP2pep8
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> D-半胱氨酸
<400> 52
Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> homoC-mTRP2pep8
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> L-高半胱氨酸
<400> 53
Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Pen-mTRP2pep8
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> L-青霉胺
<400> 54
Xaa Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5

Claims (32)

1.一种免疫诱导剂，其包含多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
所述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与所述肽共价键合，
所述肽是MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与所述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，所述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
2.根据权利要求1所述的免疫诱导剂，其中，所述间隔基与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及所述间隔基与所述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键。
3.根据权利要求1或2所述的免疫诱导剂，其中，具有用于与所述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述间隔基与所述肽之间的共价键为二硫键。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述MHC结合肽为MHC-1结合肽。
6.根据权利要求5所述的免疫诱导剂，其中，所述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽。
7.根据权利要求5或6所述的免疫诱导剂，其中，所述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述MHC结合肽为MHC-2结合肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为15以上且40以下。
11.根据权利要求10所述的免疫诱导剂，其中，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述多核苷酸或多核苷酸衍生物是磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
13.根据权利要求12所述的免疫诱导剂，其中，在所述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上被硫代磷酸酯键置换。
14.根据权利要求13所述的免疫诱导剂，其中，在所述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述间隔基包含下式所示的重复单元，
Figure FDA0003865786440000021
所述式中，
X表示氧原子或硫原子，这里，各X任选相同或不同，
R表示(CH2)pO、(CH2)qNH和(CH2CH2O)m中的任意者，m、p和q分别独立地表示10以下的自然数，
n表示10以下的自然数。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述间隔基具有下述任意式所示的结构，
Figure FDA0003865786440000031
17.根据权利要求1至14中任一项所述的免疫诱导剂，其中，所述间隔基具有下述任意式所示的结构，
Figure FDA0003865786440000032
18.一种免疫诱导剂，其包含权利要求1所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
所述间隔基与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及所述间隔基与所述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
19.一种免疫诱导剂，其包含权利要求1所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐作为有效成分，
具有用于与所述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物，
所述间隔基与所述肽之间的共价键为二硫键，
所述MHC结合肽为MHC-1结合肽，
所述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽，
所述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下，
在所述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换，
所述间隔基具有下述任意式所示的结构，
Figure FDA0003865786440000051
20.根据权利要求1至19中任一项所述的免疫诱导剂，其还包含具有免疫激活活性的物质作为佐剂。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其用于治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤。
24.一种治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的方法，其包括对患者给药权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂的步骤。
25.一种治疗或预防肿瘤的方法，其包括对患者给药权要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂的步骤。
26.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂，其用于在治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病中使用。
27.根据权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂，其用于在治疗或预防肿瘤中使用。
28.权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂在制造用于治疗或预防感染症、肿瘤或变态反应疾病的药物中的应用。
29.权利要求1至20中任一项所述的免疫诱导剂在制造用于治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
30.一种多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，
所述多核苷酸-肽缀合物由包含CpG基序的单链多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽和间隔基构成，所述间隔基以一端侧与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物共价键合且以另一端侧与所述肽共价键合，
所述肽为MHC结合肽的N末端的1个或多个连续氨基酸被置换成具有用于与所述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸的肽，这里，所述1个或多个连续氨基酸不包括用于结合MHC的锚残基。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
所述间隔基与所述多核苷酸或多核苷酸衍生物之间的共价键以及所述间隔基与所述肽之间的共价键中的一者或两者为可在生物体环境中断裂的共价键，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物。
32.根据权利要求30所述的多核苷酸-肽缀合物或其药学上可接受的盐，其中，
具有用于与所述间隔基形成共价键的反应性官能团的氨基酸为半胱氨酸或具有硫醇基的半胱氨酸类似物，
所述间隔基与所述肽之间的共价键为二硫键，
所述MHC结合肽为MHC-1结合肽，
所述MHC-1结合肽为HLA-A结合肽或HLA-B结合肽，
所述MHC-1结合肽的氨基酸长度为8以上且11以下，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物为包含2个以上CpG基序的多脱氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物，
所述多核苷酸或多核苷酸衍生物的碱基长度为20以上且30以下，
在所述磷酸二酯键的至少一部分被置换成硫代磷酸酯键的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的90％以上被硫代磷酸酯键置换，
所述间隔基具有下述任意式所示的结构，
Figure FDA0003865786440000071
CN202180024931.3A 2020-03-27 2021-03-26 包含多核苷酸-肽缀合物的免疫诱导剂及包含其的药物组合物 Pending CN115427079A (zh)

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JP2020057249 2020-03-27
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