TW202146037A - 含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物 - Google Patents

含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物 Download PDF

Info

Publication number
TW202146037A
TW202146037A TW110111020A TW110111020A TW202146037A TW 202146037 A TW202146037 A TW 202146037A TW 110111020 A TW110111020 A TW 110111020A TW 110111020 A TW110111020 A TW 110111020A TW 202146037 A TW202146037 A TW 202146037A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
polynucleotide
peptide
immunity
inducing agent
mhc
Prior art date
Application number
TW110111020A
Other languages
English (en)
Inventor
望月慎一
小泉誠
森田浩司
Original Assignee
公立大學法人北九州市立大學
日商第一三共股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大學法人北九州市立大學, 日商第一三共股份有限公司 filed Critical 公立大學法人北九州市立大學
Publication of TW202146037A publication Critical patent/TW202146037A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本發明提供一種免疫誘導劑等，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑，前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子；前述肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。

Description

含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物
本發明係關於含有多核苷酸-肽結合物作為有效成分的免疫誘導劑、含其之醫藥組成物等。
已知存在於樹突細胞、巨噬細胞、B細胞等之抗原呈現細胞的類Toll受體(TLR)家族，其透過與各種病原體進行反應、誘導細胞激素的產生、促進初始T細胞往Th1細胞的分化、殺手T細胞的活化等，而誘導後天免疫。由一連串TLR家族所辨識之病原體的構成成分雖為各式各樣，但於其中之一有為TLR9的配體之具有CpG模體的DNA(CpG DNA)。CpG模體為在哺乳類中少見，而在微生物中常見的鹼基序列，其以胞嘧啶(C)與鳥糞嘌呤(G)排列在中心部，在前後各排列二個嘌呤鹼基及嘧啶鹼基之6個鹼基為基礎，為以-PuPu-CG-PyPy-(Pu表示嘌呤鹼基，Py表示嘧啶鹼基)所表示的序列(在人類之情形，已知GTCGTT亦具有對於TLR9的配體活性)。又，在哺乳類中，少數存在的CpG模體幾乎皆受到甲基化。在哺乳類中幾乎不存在的非甲基化CpG模體具有強大的免疫賦活活性(例如，參照非專利文獻1～3)。藉由胞吞作用而被捕獲進入細胞內的CpG DNA係藉由存在於類吞噬體的內質網之TLR9而被辨識，造成干擾素-γ(IFN-γ)、介白素-2(IL-2)等Th1細胞激素產生，並強力誘導Th1反應。Th1反應係於抑制Th2反應優先的過敏反應的同時，將巨噬細胞或細胞毒性T細胞(CTL)活化而具有細胞性免疫所致的強抗腫瘤活性。
CpG DNA係於感染預防以外，亦被期待作為對過敏疾病、腫瘤性疾病的輔助手段。關於使CpG DNA與抗原共價鍵結而得的結合物，例如有以下之報告。 非專利文獻4中已記載藉由CpG DNA與源自卵白蛋白(OVA)抗原的18～24mer的肽的結合物，而促進向樹突細胞的攝入及抗原呈現。 非專利文獻5及6中已記載藉由CpG DNA與OVA抗原蛋白質的結合物，而T細胞活化於活體外被誘導。又，非專利文獻5中已記載抗原特異的細胞毒性於活體內被誘導。 非專利文獻7中已記載製作CpG寡核苷酸與腫瘤關聯的蛋白質或細胞的結合物的方法。 專利文獻1中已揭示一種免疫誘導劑，其包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物與具有抗原性的肽之結合物作為有效成分，顯示具有抗原特異性的高免疫誘導活性。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]PCT/JP2019/038090 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger. H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368(1999). [非專利文獻2]CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects. M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760(2002). [非專利文獻3]The discovery of immunostimulatory DNA sequence. S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19(2000). [非專利文獻4]Distinct Uptake Mechanisms but Similar Intracellular Processing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates in Dendritic Cells. Khan S. et al., J. Biol. Chem. 282, 21145-21159(2007). [非專利文獻5]Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-Antigen Conjugate Enhances Anti-tumor Immunity. Kramer K. et al., Mol. Ther. 25, 62-70(2017). [非專利文獻6]Comparative Study of 5’- and 3’-Linked CpG-Antigen Conjugates for the Induction of Cellular Immune Responses. Kramer K. et al., ACS Omega 2(1), 227-235(2017) [非專利文獻7]TLR-9 agonist immunostimulatory sequence adjuvants linked to cancer antigens, Shirota H. and Klinman D. M., Methods Mol. Biol. 1139, 337-344(2014)
[發明欲解決之課題]
於專利文獻1中，本發明人等藉由使用源自OVA之具有抗原性的肽的研究，顯示CpG DNA-肽結合物具有高細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力。另一方面，清楚明白了對於其它之抗原肽而製作相同的CpG DNA-肽結合物的情形，有無法獲得充分CTL誘導能力的情形。本發明之目的在於提供對於更廣範圍的抗原肽，能夠誘導CTL活性的免疫誘導劑等。 [用以解決課題之手段]
本發明人等，對於若作成CpG DNA-肽結合物則無法獲得充分的CTL誘導能力的肽進行研究的結果，發現了若為了結合(conjugate)化而於肽之N末端附加半胱胺酸等之胺基酸，則原本對MHC分子有結合性的肽(MHC結合肽)會變成無法與MHC分子結合。再者，發現了藉由不是使用於MHC結合肽之N末端直接附加半胱胺酸等之胺基酸的肽，而是使用將不包含錨殘基之N末端的1或複數個連續的胺基酸取代為半胱胺酸等之胺基酸的肽，而可製作具有高CTL誘導能力的CpG DNA-肽結合物。本發明人等進一步潛心研究，而完成本發明。
即，本發明包含以下之發明。 [1]一種免疫誘導劑，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子(spacer)， 前述肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。 [2]如[1]記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵。 [3]如[1]或[2]記載之免疫誘導劑，其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述MHC結合肽為MHC-1結合肽。 [6]如[5]記載之免疫誘導劑，其中前述MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽。 [7]如[5]或[6]記載之免疫誘導劑，其中前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下。 [8]如[1]至[4]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述MHC結合肽為MHC-2結合肽。 [9]如[1]至[8]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。 [10]如[1]至[9]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為15以上40以下。 [11]如[10]記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下。 [12]如[1]至[11]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵取代的多核苷酸衍生物。 [13]如[12]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [14]如[13]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [15]如[1]至[14]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子包含下述之式所表示的重複單元，
Figure 02_image001
於上述之式中， X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)， R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH及(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)， n表示10以下之自然數。 [16]如[1]至[15]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image003
。 [17]如[1]至[14]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。 [18]一種免疫誘導劑，其係含有如[1]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 其中前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [19]一種免疫誘導劑，其係含有如[1]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物， 前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵， 前述MHC結合肽為MHC-1結合肽， 前述MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽， 前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下， 於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代， 前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。 [20]如[1]至[19]中任一項記載之免疫誘導劑，其進一步含有具有免疫賦活活性的物質作為佐劑。 [21]一種醫藥組成物，其包含如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑。 [22]如[21]記載之醫藥組成物，其為用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防。 [23]如[21]記載之醫藥組成物，其為用於腫瘤之治療或預防。 [24]一種感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防方法，其包含對患者投予如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑。 [25]一種腫瘤之治療或預防方法，其包含對患者投予如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑。 [26]如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑，其用於使用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防。 [27]如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑，其用於使用於腫瘤之治療或預防。 [28]一種如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑之用途，其係用於製造感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防用醫藥。 [29]一種如[1]至[20]中任一項記載之免疫誘導劑之用途，其係用於製造腫瘤之治療或預防用醫藥。 [30]一種多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽， 前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子， 前述肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。 [31]如[30]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中 前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [32]如[30]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中 具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物， 前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵， 前述MHC結合肽為MHC-1結合肽， 前述MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽， 前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下， 於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代， 前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。
又本發明提供以下之[A1]～[A19]。 [A1]一種多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽， 前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子， 前述肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。 [A2]如[A1]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者為於活體環境中可切斷的共價鍵。 [A3]如A1或A2記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其之類似物。 [A4]如A1至A3中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵。 [A5]如A1至A4中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述MHC結合肽為MHC-1結合肽。 [A6]如A5記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述如MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽。 [A7]如A5或A6記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下。 [A8]如A1至A4中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述MHC結合肽為MHC-2結合肽。 [A9]如A1～A8中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。 [A10]如A1至A9中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為15以上40以下。 [A11]如A10記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下。 [A12]如A1至A11中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [A13]如A12記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [A14]如A13記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [A15]如A1至A14中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述間隔子包含下述之式所表示的重複單元，
Figure 02_image001
於上述之式中， X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)， R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH及(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)， n表示10以下之自然數。 [A16]如A1至A15中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image003
。 [A17]如A1至A14中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。 [A18]如[A1]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中 前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [A19]如[A1]記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽， 其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物， 前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵， 前述MHC結合肽為MHC-1結合肽， 前述MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽， 前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下， 於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代， 前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。
又本發明提供以下之[A20]及[A21]。 [A20]一種方法，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑之製造方法，其包含： (1)調製含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物， (2)調製MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，此處前述1或複數個連續的胺基酸不包含錨殘基，及 (3)使(1)之多核苷酸或多核苷酸衍生物與(2)之肽經由間隔子而連結，此處前述間隔子於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結，且於另一端側與前述肽共價鍵結。 [A21]如[A20]記載之方法，其中免疫誘導劑為如[1]～[20]、[26]、及[27]中任一項記載之免疫誘導劑。
又本發明提供以下之[A22]及[A23]。 [A22]一種方法，其係多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽之製造方法，其包含： (1)調製含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物， (2)調製MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，此處前述1或複數個連續的胺基酸不包含錨殘基，及 (3)使(1)之多核苷酸或多核苷酸衍生物與(2)之肽經由間隔子而連結，此處前述間隔子於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結，且於另一端側與前述肽共價鍵結。 [A23]如[A22]記載之方法，其中多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽為如[A1]～[A19]中任一項記載之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽。
又本發明提供以下之[a1]～[a19]。 [a1]一種免疫誘導劑，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子， 前述肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。 [a2]如[a1]記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵。 [a3]如[a1]或[a2]記載之免疫誘導劑，其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其之類似物。 [a4]如[a1]至[a3]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵。 [a5]如[a1]至[a4]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述MHC結合肽為MHC-1結合肽。 [a6]如[a5]記載之免疫誘導劑，其中前述MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽。 [a7]如[a5]或[a6]記載之免疫誘導劑，其中前述MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下。 [a8]如[a1]至[a4]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述MHC結合肽為MHC-2結合肽。 [a9]如[a1]～[a8]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。 [a10]如[a1]至[a9]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為15以上40以下。 [a11]如[a10]記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下。 [a12]如[a1]至[a11]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [a13]如[a12]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [a14]如[a13]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [a15]如[a1]至[a14]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子包含下述之式所表示的重複單元，
Figure 02_image001
於上述之式中， X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)， R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH及(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)， n表示10以下之自然數。 [a16]如[a1]至[a15]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image003
。 [a17]如[a1]至[a16]中任一項記載之免疫誘導劑，其進一步包含具有免疫賦活活性的物質作為佐劑。 [a18]一種醫藥組成物，其包含如[a1]至[a17]中任一項記載之免疫誘導劑。 [a19]如[a18]記載之醫藥組成物，其係用於腫瘤治療。 [發明之效果]
若依據本發明，則於可誘導CTL活性的免疫誘導劑之製作中可使用廣泛的抗原肽。
[用以實施發明的形態]
本發明提供一種含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑(以下，亦稱為本發明之免疫誘導劑)。
本發明之免疫誘導劑中的多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子。
「含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物」只要是包含1或複數個(較佳為複數個，例如2、3、4、5或6)之CpG模體之情形，則可無特別限制地使用具有任意之鹼基序列及鹼基數的多核苷酸或其衍生物。就CpG模體之具體例而言，可列舉AGCGTT、GACGTT、GACGTC、GTCGTT等。亦可含有複數個不同的序列之CpG模體。多核苷酸中所含的CpG模體的數目未特別限制，但較佳為包含1至6個CpG模體，更佳為包含2至4個CpG模體。前述多核苷酸或多核苷酸衍生物較佳為包含2個以上CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或經硫代磷酸酯修飾的DNA衍生物，但於一部分可包含RNA或RNA衍生物。有包含RNA或RNA衍生物的情形，彼等之含量，以鹼基數之比率計，較佳為20%以下(具體而言，20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%以下)。
多核苷酸或多核苷酸衍生物中所含的鹼基數，較佳為15～40(具體而言，15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)，更佳為20～30(具體而言，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)。就較佳多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基序列的具體例而言，可列舉下述表1中所示者。表1中，下底線的序列表示CpG模體。
[表1-1]
含CpG模體的DNA(5’→3’) 序列識別號
K3 ATCGACTCTCGAGCGTT CTC 1
K3-20(b) GAGCGTT CTCGAGCGTT CTC 2
K3-21 CGAGCGTT CTCGAGCGTT CTC 3
K3-24 TCTCGAGCGTT CTCGAGCGTT CTC 4
K3-27 GACTCTCGAGCGTT CTCGAGCGTT CTC 5
K3-30(a) GAGCGTT CTCATCGACTCTCGAGCGTT CTC 6
K3-30(b) ATCGACTCTCGAGCGTT CTCGAGCGTT CTC 7
K3-40 ATCGACTCTCGAGCGTT CTCATCGACTCTCGAGCGTT CTC 8
K3-30(c) CTCAGCGTT CTCAGCGTT CTCAGCGTT CTC 9
K3-30(d) TTTAGCGTT TTTAGCGTT TTTAGCGTT TTT 10
K3-30(e) TTAGCGTT TAGCGTT TAGCGTT TAGCGTT T 11
K3-30(f) TTAGCGTT CAGCGTT CAGCGTT CAGCGTT T 12
K3-26(a) TCAGCGTT TCAGCGTT TCAGCGTT TC 13
K3-26(b) TTAGCGTT TTAGCGTT TTAGCGTT TT 14
ODN1668 TCCATGACGTT CCTGATGCT 15
ODN1668-30 TGACGTT CCTTCCATGACGTT CCTGATGCT 16
ODN1668-40 TCCATGACGTT CCTGATGCTTCCATGACGTT CCTGATGCT 17
ODN1826 TCCATGACGTT CCTGACGTT 18
ODN1826-30 TGACGTT CCTTCCATGACGTT CCTGACGTT 19
ODN1826-40 TCCATGACGTT CCTGACGTT TCCATGACGTT CCTGACGTT 20
ODN2006 TCGTCGTT TTGTCGTT TTGTCGTT 21
ODN2006-30 GTCGTT TCGTCGTT TTGTCGTT TTGTCGTT 22
ODN2006-40 TCGTCGTT TTGTCGTT TCGTCGTT TTGTCGTT TTGTCGTT 23
ODN684 TCGACGTT CGTCGTT CGTCGTT C 24
ODN684-30 TCGTCGT TCGACGTT CGTCGTT CGTCGTT C 25
ODN684-40 GTTCGTCGTT TCGTCGTT CGACGTT CGTCGTT CGTCGTT C 26
ODN D-SL01 TCGCGACGTT CGCCCGACGTT CGGTA 27
ODN D-SL01-35 TCGCGACGTT CGCGACGTT CGCCCGACGTT CGGTA 28
C-CpG_1 TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGA AT 29
[表1-2]
含CpG模體的DNA(5’→3’) 序列識別號
1018ISS TGACTGTGAACGTT CGAGATGA 43
1018ISS_30 TGAACGTT CGACTGTGAACGTT CGAGATGA 44
1018ISS_40 TGAACGTT CGTGAACGTT CGACTGTGAACGTT CGAGATGA 45
多核苷酸於活體內易受到核酸酶的分解，故為了使於活體內的安定性提升，亦可使用多核苷酸衍生物取代多核苷酸。多核苷酸衍生物可為作為用以使核酸酶耐性增加而提高於活體內的安定性之修飾，而包含所屬技術領域中已知的任意之修飾者。就多核苷酸衍生物之例而言，可列舉核糖核苷酸之2’位之羥基之全部或一部分經氟或甲氧基取代者、多核糖核苷酸(RNA)或聚去氧核糖核苷酸(DNA)之磷酸二酯鍵之全部或一部經硫代磷酸酯鍵取代者等。多核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸之磷酸二酯鍵之一部經硫代磷酸酯鍵取代的情形，較佳為磷酸二酯鍵之50%以上(具體而言，50、60、70、80或90%以上)經硫代磷酸酯鍵取代，更佳為90%以上(具體而言，90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%以上)經硫代磷酸酯鍵取代，實質上可全部經硫代磷酸酯鍵取代。磷酸二酯鍵可全部經硫代磷酸酯鍵取代。經硫代磷酸酯鍵取代的磷酸二酯鍵之位置未被特別限制，可為連續的複數個磷酸二酯鍵被取代，或者亦可被取代為硫代磷酸酯鍵彼此未鄰接的方式。
多核苷酸或多核苷酸衍生物與間隔子結合的位置未被特別限定，例如，可為於5’末端或3’末端。於多核苷酸或多核苷酸衍生物與間隔子之共價鍵，可直接利用存在於多核苷酸或多核苷酸衍生物的官能基，或者利用藉由化學修飾而活化者。多核苷酸或多核苷酸衍生物，係較佳為在其5’末端或3’末端的羥基的氧原子上與間隔子結合。
多核苷酸或多核苷酸衍生物可使用已知的化學合成法(例如磷酸三酯法、亞磷醯胺(phosphoramidite)法、H-膦酸酯法等)而合成。可使用市售之核酸合成機，使用於市售之DNA/RNA合成所使用的試藥而合成。
本發明之免疫誘導劑中的「肽」，係MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，此處前述1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。
於本發明中「MHC結合肽」係指無需修剪(trimming)等之追加的加工，而可與MHC分子(即主要組織相容性複合體)結合且作為抗原被提示給T細胞的肽。MHC分子中包含MHC-1分子(亦稱為第I型MHC分子)及MHC-2分子(亦稱為第II型MHC分子)。又，人類中的MHC-1分子被稱為HLA分子，且存在許多等位基因。MHC結合肽係較佳為藉由MHC-1分子而抗原被呈現的肽(即MHC-1結合肽)及藉由MHC-2分子而抗原被呈現的肽(即MHC-2結合肽)之任一者，更佳為MHC-1結合肽，進一步較佳為藉由HLA-A分子而抗原被呈現的肽(即HLA-A結合肽)或藉由HLA-B分子而抗原被呈現的肽(即HLA-B結合肽)。
MHC結合肽可為源自成為食物過敏等之過敏原因的蛋白質、細菌、病毒等之病原體、以腫瘤細胞等作為起源之蛋白質者。就MHC結合肽而言，可列舉例如，列於公開的資料庫SYFPEITHI(參照http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm；Immunogenetics (1999) 50:213-219)的肽、記載於Immunogenetics(1995) 41:178-228之表中的肽，但未限定於此等。 就MHC-1結合肽之具體例而言，可列舉OVA肽1(卵白蛋白(OVA；GenBank登錄號：CAA23716.1)之258～265號之胺基酸序列而成的肽、SIINFEKL(序列識別號41))、TRP2-9(mTRP2(GenBank登錄號：CAA44951.1)之180～188號之胺基酸序列而成的肽)、hGP100-9(hGP100(GenBank登錄號：AAC60634.1)之25～33號之胺基酸序列而成的肽)等。 就MHC-2結合肽之具體例而言，可列舉OVA肽2(OVA之324～340號之胺基酸序列而成的肽、ISQAVHAAHAEINEAGR(序列識別號42))等。
於MHC分子，係有會於肽收容溝內與MHC結合肽直接相互作用之被稱為袋的部位。於MHC結合肽中，與特定之袋相互作用的殘基被稱為錨殘基或錨胺基酸，位置係於所結合的MHC分子之每一型可為不同。MHC分子之每一型之錨殘基的位置及共通模體，係例如可藉由公開的資料庫MHC Motif Viewer(參照http://www.cbs.dtu.dk/biotools/MHCMotifViewer/Home.html；Immunogenetics(2008) 60:759-765)而確認。例如，於為人類之MHC-1的HLA-A、HLA-B，已知自N末端側第2號及9號之胺基酸為錨殘基。
於MHC結合肽，除了如上述之可天然存在的肽(野生型肽)之外，亦包含例如包含非天然型之胺基酸的非天然存在的肽。就此種肽而言，可列舉例如，為了提高與MHC分子的結合性而錨部位被其它胺基酸(亦包含非天然胺基酸)取代的改質肽(稱為異偏態肽(heteroclitic peptide))(參照Front. Immunol. 6:377(2015)及J Immunol. 174(8):4812-4820(2005))。
MHC結合肽之胺基酸長度未被特別限定，可依MHC分子的類型而不同，例如可為5以上30以下。與MHC-1分子結合的肽的長度被某程度固定，通常為8～11個胺基酸長度。因此，於本發明中，MHC結合肽為MHC-1結合肽的情形，其胺基酸長度較佳為8以上11以下，更佳為8、9或10，進一步較佳為9或10。
本發明人等發現，若為了結合化而於MHC結合肽之N末端附加半胱胺酸等之胺基酸，則會有變得無法與MHC分子結合的情形(實施例3)。於利用MHC-1分子的抗原肽之呈現，已知有內質網胺肽酶(ERAP)參與，而抗原肽前驅物通常受到利用ERAP之自N末端的修剪而成為適合與MHC-1結合的長度。然而，由多核苷酸-肽結合物產生的肽，被認為未適當進行此種修剪，有無法成為具有向MHC分子之肽收容溝的結合性的原本之肽的構造的可能性。相對於此，一面殘存錨殘基，且一面將MHC結合肽之N末端之1或複數個連續的胺基酸取代為具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸的肽，係可與MHC-1分子結合。又使用該肽而製作的多核苷酸-肽結合物具有充分的CTL誘導能力。
被具有反應性官能基的胺基酸取代的MHC結合肽之N末端之胺基酸的數目，係只要不包含用於MHC結合的錨殘基即可，則未特別限定，可因應MHC分子之類型而適當設定。例如，MHC-1分子的情形，經取代的胺基酸之數目可為4個以下(4個、3個、2個、或1個)，較佳為1個。於一實施形態，MHC結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽的情形，錨殘基存在於自N末端第2號之位置，因而經取代的胺基酸之數可為1個。
「具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸」係具有可與間隔子形成酯鍵、醯胺鍵、磷酸酯鍵等之共價鍵的反應性官能基的胺基酸，可為天然之胺基酸及非天然之胺基酸之任一者。與間隔子之共價鍵較佳為於活體內環境中可切斷的共價鍵。就此種共價鍵而言，可列舉例如雙硫鍵等之於細胞內之還原的環境中被切斷的鍵結。又，亦可列舉以酯酶、肽酶(例如，組織蛋白酶(cathepsin)等)、核酸酶等之細胞內酵素而特異性被切斷之酯鍵、醯胺鍵(例如，與組織蛋白酶感受性肽之醯胺鍵合等)、磷酸二酯鍵等為例。作為更佳的實施形態，共價鍵可為雙硫鍵，反應性官能基可為硫醇基。此情形，「具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸」可為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物。具有硫醇基的半胱胺酸類似物係於側鏈具有硫醇基的胺基酸，側鏈之構造並未特別限定。就具有硫醇基的半胱胺酸類似物而言，可列舉例如升半胱胺酸(CAS No: 6027-13-0)、青黴胺(penicillamine)(β,β-二甲基半胱胺酸；CAS No: 1113-41-3)、β-甲基半胱胺酸(CAS No: 29768-80-7)、及4-巰基-正白胺酸(CAS No: 2351397-00-5)。
本發明之免疫誘導劑中的肽，可使用肽合成等之任意之周知方法而製作。
本發明之免疫誘導劑中的「間隔子」，若為能與包含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物及肽共價鍵結的構造即可，可列舉例如，伸烷基、聚乙二醇(PEG)等。間隔子可包含含有下述之式所表示的磷酸二酯構造或硫代磷酸酯構造的重複單元。
Figure 02_image001
於上述之式中，X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)，R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH、(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)、n表示10以下之自然數。
此等之重複單元因不會被核酸酶水解，故即使X為氧原子，活體內之安定性亦不會大幅降低。例如，R為(CH2 )3 O的情形，重複單元的大小幾乎與核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸的大小相等，因而可期待將多核苷酸或多核苷酸衍生物之一部分以此間隔子進行取代所致的生產成本的降低。就間隔子之具體例而言，可列舉下述者。
Figure 02_image016
Figure 02_image018
Figure 02_image020
Figure 02_image022
Figure 02_image024
Figure 02_image026
Figure 02_image028
Figure 02_image030
就間隔子之更佳例而言，可列舉具有下述之任一者之構造者。
Figure 02_image003
於另外的態樣中，就間隔子之更佳例而言，可列舉具有下述之任一者之構造者。
Figure 02_image005
就用於間隔子與多核苷酸或多核苷酸衍生物之鍵結形成、及間隔子與肽之鍵結形成的反應性官能基之組合之例而言，除了形成酯鍵、醯胺鍵、磷酸酯鍵等的反應性官能基之組合外，可列舉例如，用於對生物晶片表面的活體分子之固定的反應性官能基之組合，更具體而言，可列舉下述所示者。
(a)炔與疊氮化合物 炔與疊氮化合物(疊氮化物)係藉由如下述所示的加成環化反應(Huisgen反應)，而形成1,2,3-三唑環。兩者為於包含活體分子的許多有機化合物中可導入的安定的官能基，即使於包含水的溶媒中亦可迅速且幾乎定量地反應，幾乎沒有副反應，不生成多餘廢棄物，因而作為所謂的「點擊化學(Click chemistry)」之中心的反應，被廣泛使用於生化學領域。炔衍生物及疊氮基，可使用任意之周知方法，導入至具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物。就炔衍生物而言，炔丙醇、炔丙胺等之具有反應性官能基者可容易取得，使此等與羧基、羥基等之反應性官能基直接反應，或者使與羰基二咪唑等一起反應，可藉由生成的醯胺鍵、酯鍵、胺甲酸酯鍵等而導入炔衍生物。對於疊氮基，亦可使用任意之周知方法，導入至具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物。又，Huisgen反應係於銅觸媒的存在下進行，但於具有抗原性的肽及磷酸二酯鍵為硫代磷酸酯鍵等之以含硫官能基取代的多核苷酸衍生物，存有與銅離子配位的硫原子，因而有降低銅之觸媒活性之虞。為了提升反應率，較加添加過量的銅。
Figure 02_image034
(b)順丁烯二醯亞胺或乙烯碸與硫醇基 具有與拉電子性之羰基或碸基鄰接的雙鍵的順丁烯二醯亞胺或乙烯碸，於中性附近的pH下，如下述所示，藉由與硫醇基的加成反應(麥可加成反應(Michael Addition))，生成安定的硫醚衍生物。已有市售具有適當的間隔子的順丁烯二醯亞胺及乙烯碸衍生物，因而於具有抗原性的肽或多核苷酸或多核苷酸衍生物中導入此等之官能基為容易的。於具有抗原性的肽中導入硫醇基的情形，在具有包含半胱胺酸的抗原性的肽的情形，係可利用半胱胺酸殘基側鏈之硫醇基。惟，半胱胺酸為存在比低的胺基酸，因而使用於具有抗原性的肽之N末端側導入半胱胺酸者。就含有硫醇基的多核苷酸或多核苷酸衍生物而言，係使用將此等之5’末端的羥基變更為硫醇基的硫醇化多核苷酸。
Figure 02_image036
(X:COR’或SO2 R’)
(c)肽之硫醇基與硫醇化多核苷酸之硫醇基 如上述，使導入於肽之N末端的硫醇基、與硫醇化多核苷酸之硫醇基反應，而形成雙硫基。雙硫鍵因於還原劑之存在下被切斷，而與上兩者相比於安定性的點為較差，但有於活體內之還原的環境下會被切斷的有利點。硫醇基向多核苷酸或多核苷酸衍生物的導入，可使用任意之周知方法進行，但就具體例而言，可列舉如下式所示之胺基化多核苷酸或多核苷酸衍生物、與ω-(2-吡啶二硫基)脂肪酸之N-琥珀醯亞胺基酯的反應。
Figure 02_image038
前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵，至少前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為於活體環境中可切斷的共價鍵者為較佳。因此，上述(a)～(c)之中，由活體內可容易被切斷的肽之硫醇基與硫醇化多核苷酸之硫醇基的組合所致的雙硫鍵為較佳。於此情形，雙硫鍵為間隔子與肽之間的共價鍵。
就本發明之免疫誘導劑中的多核苷酸-肽結合物之具體例而言，可列舉下述實施例1記載之CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)、CpG20(S)a-mTRP2pep9(化合物2)、及CpG30(S)a-hGP100pep9(化合物3)、以及下述之化合物。又，下述式中，鹼基序列所表示的部分，表示磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代的DNA衍生物。
Figure 02_image040
又就本發明之免疫誘導劑中的多核苷酸-肽結合物之具體例而言，可列舉下述實施例5記載之ISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、及ODN1826-mTRP2pep9、實施例6記載之CpG30(S)a2-OVApep8及CpG30(S)a2-mTRP2pep9、實施例9記載之CpG30(S)a2-OVA2-15。
於一態樣中，本發明之免疫誘導劑中所含的1個之多核苷酸或多核苷酸衍生物係可與2個以上之肽結合。即，於本發明之免疫誘導劑，可包含1個之多核苷酸或多核苷酸衍生物與2個以上之肽。 多核苷酸或多核苷酸衍生物與2個以上之肽若經由間隔子結合即可。多核苷酸或多核苷酸衍生物，例如，可各自經由分別的間隔子與2個以上之肽結合。多核苷酸或多核苷酸衍生物亦可經由經分枝的1個之間隔子而與2個以上之肽結合。1個之多核苷酸或多核苷酸衍生物，依彼等之結合樣式的組合，可與3個以上之肽結合。多核苷酸或多核苷酸衍生物部分與間隔子的結合位置未被特別限定，例如，可選自5’末端及3’末端。 2個以上之肽係可為相同肽亦可為不同肽，但全部為相同者為較佳。與1個之多核苷酸或多核苷酸衍生物結合的肽的數未被特別限定，例如，可為2個、3個、4個、5個、或其以上。
於一態樣中，本發明之免疫誘導劑可於其多核苷酸或多核苷酸衍生物部分中，與具有與該部分所含的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸或多核苷酸衍生物(以下，亦稱為互補鏈多核苷酸或多核苷酸衍生物)形成雙股鏈。 互補鏈多核苷酸或多核苷酸衍生物係可藉由與本發明之免疫誘導劑中的多核苷酸或多核苷酸衍生物部分相同的方法而合成。互補鏈多核苷酸或多核苷酸衍生物，為了改善於活體內的安定性、毒性、體內動態等之特性，可經修飾。就該修飾而言，可列舉例如，脂質修飾(參照WO2017/057540)。於5’或3’末端之一者或兩者具有脂質修飾的化合物，可利用實施例8記載之方法而合成。 本發明之免疫誘導劑的多核苷酸或多核苷酸衍生物部分及互補鏈多核苷酸或多核苷酸衍生物之雙股鏈形成，可按照一般的降溫貼合(annealing)方法進行。例如，可藉由將多核苷酸-肽結合物及互補鏈多核苷酸或多核苷酸衍生物混合，加溫成一股鏈狀態後，使自然冷卻至室溫為止，而使雙股鏈形成。
就作為本發明之免疫誘導劑的有效成分所使用的多核苷酸-肽結合物之醫藥上可容許的鹽而言，可列舉例如，鹼金屬(鉀、鈉、鋰等)之鹽、鹼土類金屬(鈣、鎂等)之鹽、銨鹽(包含四甲銨鹽、四丁銨鹽等)、有機胺(三乙胺、甲胺、二甲胺、環戊胺、苄胺、苯乙胺、哌啶、單乙醇胺、二乙醇胺、參(羥甲基)甲胺、離胺酸、精胺酸、N-甲基-D-還原葡糖胺等)之鹽、酸加成物鹽(包含鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽等之無機酸鹽；及乙酸鹽、三氟乙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、甲烷磺酸(甲磺酸(mesylic acid))鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、2-羥乙磺酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、葡萄糖酸鹽等有機酸鹽)。
作為本發明之免疫誘導劑的有效成分所使用的多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，亦可以溶媒合物(包含水合物)存在。就溶媒合物而言，只要為醫藥上可容許者即可，未特別限定，但可列舉例如，水合物、乙醇合物等。
本發明之免疫誘導劑可進一步包含具有免疫賦活活性的物質作為佐劑。佐劑雖未被限定，但為活化先天免疫的物質。佐劑較佳為先天免疫受體之促效劑。就先天免疫受體促效劑而言，例示TLR促效劑(例如，TLR2促效劑、TLR3促效劑、TLR4促效劑、TLR7促效劑、TLR8促效劑、TLR9促效劑)、RLR(類視網酸誘導基因I受體(retinoic acid-inducible gene I(RIG-1)-like receptors))促效劑、STING(干擾素基因刺激物(stimulator of Interferon genes))促效劑、NLR(類核苷酸結合寡聚化域受體(nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors))促效劑、CLR(C-型凝集素受體(C-type lectin receptors))促效劑等。就TLR促效劑而言，可列舉例如，脂肽、Poly IC RNA、咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫德(resiquimod)、單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid(MPL))、CpG-ODN等。就RLR促效劑而言，可列舉pppRNA、Poly IC RNA等，就STING促效劑而言，可列舉cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP等，就NLR促效劑而言，可列舉iE-DAP、FK565、MDP、莫拉丁酯(murabutide)等，就CLR促效劑而言，可列舉β‐葡聚醣、繭蜜糖6,6’-二黴菌酸酯(trehalose 6,6’-dimycolate)等。佐劑較佳為TLR促效劑，更佳為TLR4促效劑、TLR7促效劑或TLR9促效劑，進一步更佳為咪喹莫特、瑞喹莫德、MPL或CpG-ODN。於某態樣中，佐劑為咪喹莫特、MPL或CpG-ODN。就佐劑而言，因應導入至多核苷酸-肽結合物的肽等可適當選擇，例如，可為CpG DNA等，亦可為國際公開第2015/118789號記載之多核苷酸/β-1,3-葡聚糖複合體。
本發明之免疫誘導劑係可藉由包含下列的方法而製造： (1)調製含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物， (2)調製MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，此處前述1或複數個連續的胺基酸不包含錨殘基，及 (3)使(1)之多核苷酸或多核苷酸衍生物與(2)之肽經由間隔子而連結，此處前述間隔子於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結，且於另一端側與前述肽共價鍵結。 因此，於一態樣中，本發明提供包含上述步驟(1)～(3)的本發明之免疫誘導劑之製造方法。本態樣中的各用語係基於本說明書中記載的用語之説明而被解釋。可藉由本方法，而使用廣泛的抗原肽，來製造能誘導CTL活性的免疫誘導劑。
又本發明提供多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽。本態樣中的各用語係基於本說明書中記載的用語之説明而被解釋。該多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽可被使用作為本發明之免疫誘導劑中的有效成分。 又該多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽係可藉由包含上述本發明之免疫誘導劑之製造方法中的步驟(1)～(3)的方法而製造。因此，於一態樣中，本發明提供包含上述步驟(1)～(3)的多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽之製造方法。本態樣中的各用語係基於本說明書中記載的用語之説明而被解釋。藉由本方法，使用廣泛的抗原肽，可製造能成為可能誘導CTL活性的免疫誘導劑之有效成分的多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽。
又本發明提供包含本發明之免疫誘導劑的醫藥組成物(以下，亦稱為本發明之醫藥組成物)。於本發明之醫藥組成物之製造，除了作為有效成分的多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，還可使用任意周知的成分(醫藥用途所容許之任意載體、賦形劑及添加物)及製劑方法。作為製劑用之物質，可列舉以下者，但不限於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸類；抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等抗氧化劑；磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tris -鹽酸(Tris-HCl)溶液等緩衝劑；甘露醇或甘胺酸等填充劑；乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑；咖啡因、聚乙烯吡咯啶(polyvinylpyrrolidine)、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等錯化劑；葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑；單醣類、雙醣類等其它碳水化合物；著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等親水聚合物；低分子量多肽；鹽形成對離子；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、柳酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等防腐劑；甘油、伸丙基二醇或聚乙二醇等溶劑；甘露醇或山梨醇等糖醇；懸浮液、山梨醇酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯；曲拉通(triton)、三木甲胺(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等界面活性劑；蔗糖或山梨醇等穩定化增強劑；氯化鈉、氯化鉀或甘露醇、山梨醇等彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上的佐劑。若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可因應適用疾病、適用投予路徑等而適當決定適合的醫藥組成物的組成。
本發明之醫藥組成物係以適於經口或非經口投予的劑型而提供。例如，能使用注射劑、栓劑等，注射劑可包含靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等劑型。此種注射劑可按照周知的方法而調製。就注射劑之調製方法而言，例如，可藉由將上述本發明之免疫誘導劑溶解或懸浮於通常注射劑所使用之無菌的水性溶劑而調製。就注射用之水性溶媒而言，可使用例如，蒸餾水、生理食鹽水、磷酸緩衝液、碳酸緩衝液、Tris緩衝液、乙酸緩衝液等之緩衝液等。此種水性溶媒之pH可列舉5～10，較佳為6～8。經調製的注射液較佳被填充至適當安瓿。注射劑可作成冷凍乾燥製劑。除了注射劑之外，可作成經皮或黏膜吸收用的劑型(液劑噴霧、軟膏、凝膠、乳液、貼片)、皮下局部緩釋用的劑型(包含奈米凝膠或生物分解性微米/奈米膠囊等的懸浮液、溫度反應性凝膠)、裝入皮膚滲透用經皮裝置的製劑(離子電滲法、微針)、粉末劑、錠劑、膠囊劑、糖漿劑、噴霧劑或乾粉等之吸入劑等之形態。
本發明之醫藥組成物能藉由經口及非經口路徑之任一者而對人類或溫血動物(小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、馬、雞、貓、狗、猴等)投予。作為非經口投予路徑，可列舉皮下、皮內及肌肉內注射、腹腔內投予、點滴、靜脈內投予、向口腔黏膜的投予、向鼻黏膜或咽頭部的噴霧等。
為本發明之醫藥組成物的有效成分的多核苷酸-肽結合物之用量係因應活性、成為治療對象的疾病、成為投予對象的動物之種類、體重、性別、年齡、疾病的種類、投予方法等而不同。以體重60kg的成人為例時，於經口投予的情形，每1日之用量通常為約0.1～約100mg，較佳為約1.0～約50mg，更佳為約1.0～約20mg，於非經口投予的情形，每1日的用量通常為約0.01～約30mg，較佳為約0.1～約20mg，更佳為約0.1～約10mg。於對其它動物投予的情形，係使用將上述用量換算成每單位體重的用量後，乘以成為投予對象的動物的體重而得的用量。
又，本發明之醫藥組成物投予至對象的頻率，考慮成為投予對象的動物之種類、體重、性別、年齡、疾病的種類、投予方法等，所屬技術領域中具通常知識者可容易地決定。例如，將本發明之組成物作為疫苗投予的情形，與通常之疫苗製劑同樣地，通常，以1～數次/日，可僅1日或於1～數週間之間隔進行數次投予。投予較佳為一邊觀察經過一邊進行，例如，可歷經至少約1週的間隔而進行追加免疫。藉由進行追加免疫，期待有獲得補強效果，可發揮較高的感染防禦等之效果。
藉由將本發明之醫藥組成物投予至有病原體感染症、癌之患者、有罹患癌或病原體感染症的可能性的某對象，使接受該投予的對象中之細胞毒性T細胞(CTL)或輔助T細胞抗原特異性地活化，誘導溫血動物(較佳為人類)之防禦免疫反應，可預防・治療該感染症或癌。又，藉由將本發明之醫藥組成物投予至過敏性疾病的患者，成為抑制對成為疾病原因的過敏抗原的過度免疫反應的抗原特異的免疫療法。即，本發明之醫藥組成物係有用於作為上述感染症、癌、過敏性疾病等之疾病的預防或治療用的疫苗。於本發明中，用語「腫瘤」及「癌」可交換使用。又，於本發明中，有時將腫瘤、惡性腫瘤、癌、惡性新生物、癌腫、肉瘤等統稱而表現為「腫瘤」或「癌」。又，用語「腫瘤」及「癌」中亦包含骨髓增生異常症候群等，依據情形亦包含被區分在前癌階段的病態。
成為治療對象的腫瘤的種類，只要為確認對本發明的醫藥組成物具感受性的腫瘤即可，未被特別限定，但可列舉乳癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌(包含小細胞肺癌、非小細胞肺癌等)、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、子宮體癌、腎癌、肝細胞癌、甲狀腺癌、食道癌、骨肉瘤、皮膚癌(包含黑色素瘤等)、神經膠母細胞瘤(glioblastoma)、神經胚細胞瘤、卵巢癌、頭頸部癌、睪丸腫瘤、大腸癌、血癌(包含白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤等)、視網膜胚細胞瘤、胰臟癌等。
本發明之醫藥組成物亦可與其它抗腫瘤劑組合使用。可列舉例如，抗腫瘤抗生素、抗腫瘤性植物成分、BRM(Biological Response Modifier：生物學的反應性控制物質)、荷爾蒙、維生素、抗腫瘤性抗體、分子標靶藥物、烷化劑、代謝拮抗劑、其它抗腫瘤劑等。
更具體而言，作為抗腫瘤抗生素，可列舉例如，絲裂黴素C(mitomycin C)、博萊黴素(bleomycin)、培洛黴素(peplomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、阿克拉黴素(aclarubicin)、阿黴素(doxorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、畢拉魯比辛(pirarubicin)、THP-阿德力黴素(THP-adriamycin)、4’-表阿黴素(4’-epidoxorubicin)或者泛艾黴素(epirubicin)、色黴素(chromomycin)A3或放線菌素D(actinomycin D)等。
作為抗腫瘤性植物成分及彼等之衍生物，可列舉例如，長春地辛(vindesine)、長春新鹼(vincristine)或者長春鹼(vinblastine)等長春花生物鹼(vinca alkaloid)類、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、卡巴他賽(cabazitaxel)等紫杉烷(taxane)類、或依托泊(etoposide)或者替尼泊甙(teniposide)等鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)類。
作為BRM，可列舉例如，腫瘤壞死因子或吲哚美辛(indomethacin)等。
作為荷爾蒙，可列舉例如，氫化可體松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、去氫皮質醇(prednisolone)、去氫異雄甾酮(prasterone)、貝他美沙松(betamethasone)、曲安西隆(triamcinolone)、羥甲睪丸素(oxymetholone)、諾隆(nandrolone)、美替諾隆(metenolone)、磷雌酚(fosfestrol)、乙炔雌二醇(ethynyl estradiol)、氯地孕酮(chlormadinone)、美雄酮(mepitiostane)或甲羥助孕酮(medroxyprogesterone)等。
作為維生素，可列舉例如，維生素C或維生素A等。
作為抗腫瘤性抗體及分子標靶藥物，可列舉曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、地諾單抗(denosumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、伊匹單抗(ipilimumab)、納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、達沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼 (sunitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、達拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib) 、考比替尼(cobimetinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、帕博西尼(palbociclib)、帕比司他(panobinostat)、索拉非尼(sorafenib)、克唑替尼(crizotinib)、維羅非尼(vemurafenib)、奎軋替尼(quizartinib)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、伊克昔佐米(ixazomib)、米哚妥林(midostaurin)、吉列替尼(gilteritinib)等。
作為烷化劑，可列舉例如，氮芥類(nitrogen mustard)、氮芥類N-氧化物、苯達莫司汀(bendamustine)或者氯芥苯丁酸(chlorambucil)等烷化劑、卡巴醌(carboquone)或者塞替派(thiotepa)等吖
Figure 110111020-A0101-12-0022-1
系烷化劑、二溴甘露醇(dibromomannitol)或者二溴半乳糖醇(dibromodulcitol)等環氧化物系烷化劑、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鹽酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、鏈佐黴素(streptozotocin)、氯脲黴素(chlorozotocin)或者雷莫司汀(ranimustine)等亞硝基脲系烷化劑、硫酸布他卡因(busulfan)、英丙舒凡甲苯磺酸鹽(improsulfan tosilate)、替莫唑胺(temozolomide)或達卡巴仁(dacarbazine)等。
作為代謝拮抗劑，可列舉例如，6-巰基嘌呤、6-硫鳥糞嘌呤或者硫肌苷(thioinosine)等嘌呤代謝拮抗劑、氟尿嘧啶、替加氟(tegafur)、替加氟‧尿嘧啶、卡莫氟(carmofur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、溴尿苷、阿糖胞苷(cytarabine)或者伊洛胞苷(enocitabin)等嘧啶代謝拮抗劑、胺甲喋呤(methotrexate)或者三甲曲沙(trimetrexate)等葉酸代謝拮抗劑等。
作為其它之抗腫瘤劑，可列舉例如，順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、它莫西芬(tamoxifen)、來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(arastrozole)、依西美坦(exemestane)、枸櫞酸托瑞米芬(toremifene citrate)、氟維司群(fulvestrant)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、密妥坦(mitotane)、亮丙瑞林(leuprorelin)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、喜樹鹼(camptothecin)、依弗醯胺(ifosfamide)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、黴法蘭(melphalan)、L-天冬醯胺酸酶、醋葡醛內酯(aceglatone)、西佐喃(sizofiran)、必醫你舒(picibanil)、丙卡巴肼(procarbazine)、哌泊溴烷(pipobroma)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、羥基脲、烏苯美司(ubenimex)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、艾日布林(eribulin)、視網酸或雲芝多糖(krestin)等。
作為成為治療或預防之對象的感染症之種類，例示有病毒、真菌、細菌等之病原體所致的感染症。作為病毒，例示有流行性感冒病毒、肝炎病毒、人類免疫不全病毒(HIV)、RS病毒、風疹病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、疱疹病毒、小兒麻痺病毒、輪狀病毒、日本腦炎病毒、水痘病毒、腺病毒(Adenoviridae)、狂犬病病毒、黃熱病病毒等。作為細菌，可列舉白喉桿菌、破傷風菌、百日咳菌、流行性感冒桿菌、結核桿菌、肺炎球菌、幽門螺旋桿菌(Helicobacter Pylori)、炭疽桿菌、傷寒沙門桿菌、腦膜炎雙球菌、痢疾桿菌(dysentery bacillus)、霍亂弧菌等。作為真菌，例示有念珠菌真菌、組織漿菌真菌、隱球菌真菌、麴菌真菌等。本發明之醫藥組成物可與此等感染症的既存治療藥物組合而使用。
作為成為治療或預防的對象的過敏性疾病之種類，例示有支氣管炎性氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、蕁麻疹、食物過敏、動物過敏、重度過敏等。
本發明之醫藥組成物與佐劑或其它醫藥組合而投予之情形，意指在某一定期間中，被投予對象將兩藥劑攝取進其體內。可投予兩藥劑被包含在單一製劑中而成的製劑，又亦可個別進行製劑化並分別投予。在個別進行製劑化之情形，其投予的時期並未被特別限定，可同時投予，亦可相隔一段時間而在不同時間或不同日投予。在分別不同時間或日投予之情形，其投予的順序並未被特別限定。通常，個別的製劑係按照個別的投予方法進行投予，因此其等的投予有時為相同次數，亦有時成為不同次數。又，分別被個別製劑化之情形，各製劑的投予方法(投予路徑)可相同，亦可利用不同投予方法(投予路徑)進行投予。又，不需要兩藥劑同時存在於體內，只要在某一定期間(例如1個月，較佳為1週，進一步較佳為數日，進一步更佳為1日)之間被攝取進體內即可，可在投予任一者時另一有效成分已自體內消失。
又於一態樣中，本發明提供一種疾病之治療或預防方法，包含將本發明之醫藥組成物之治療或預防有效量，投予至其為必要的對象。作為疾病，可列舉例如，病原體感染症、腫瘤、及過敏性疾病，較佳為腫瘤。
本發明中的「治療或預防有效量」係意指對於特定之疾病或症狀、投予形態及投予路徑發揮治療或預防效果的量，因應對象的種類、疾病或症狀之種類、症狀、性別、年齡、慢性病、其它要素而適當決定。
本案亦提供以下之發明。 [B1]一種免疫誘導劑，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 前述多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與前述肽共價鍵結的間隔子， 前述肽為MHC-2結合肽之N末端及/或C末端的1或複數個連續的胺基酸被刪除，且有附加具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸的肽，其中前述1或複數個連續的胺基酸不包含有用以結合MHC-2的錨殘基。 [B2]如[B1]記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及前述間隔子與前述肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵。 [B3]如[B1]或[B2]記載之免疫誘導劑，其中具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其之類似物。 [B4]如[B1]至[B3]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子與前述肽之間的共價鍵為雙硫鍵。 [B5]如[B1]至[B4]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。 [B6]如[B1]至[B5]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為15以上40以下。 [B7]如[B6]記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下。 [B8]如[B1]至[B7]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。 [B9]如[B8]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [B10]如[B9]記載之免疫誘導劑，其中於前述磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代。 [B11]如[B1]至[B10]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子包含下述之式所表示的重複單元：
Figure 02_image001
於上述之式中， X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)， R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH及(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)， n表示10以下之自然數。 [B12]如[B1]至[B11]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image003
。 [B13]如[B1]至[B10]中任一項記載之免疫誘導劑，其中前述間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
Figure 02_image005
。 [B14]如[B1]至[B13]中任一項記載之免疫誘導劑，其進一步包含具有免疫賦活活性的物質作為佐劑。 [B15]一種醫藥組成物，其包含如[B1]至[B14]中任一項記載之免疫誘導劑。 [B16]如[B15]記載之醫藥組成物，其為感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防用。 [B17]一種感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防方法，其包含對患者投予如[B1]至[B14]中任一項記載之免疫誘導劑。 [B18]一種用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防中使用的如[B1]至[B14]中任一項記載之免疫誘導劑。 [B19]一種如[B1]至[B14]中任一項記載之免疫誘導劑之用途，其係用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防用醫藥組成物之製造。
於以下之説明，將上述之[B1]至[B19]之發明稱為本發明B。本發明B中的各用語，只要與使用MHC-2結合肽的發明不矛盾，基於本說明書中記載的用語之説明而被解釋。
於本發明B中，多核苷酸-肽結合物中所含的肽為MHC-2結合肽之N末端及/或C末端的1或複數個連續的胺基酸被刪除且附加具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸的肽。經刪除的胺基酸之數目只要不包含用以結合MHC-2的錨殘基則未特別限定，可因應成為基礎的MHC-2結合肽的長度及錨殘基的位置而適當設定。具有用以使與前述間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸可被附加於N末端或C末端。
於本發明B中，多核苷酸-肽結合物中所含的肽之胺基酸長度未特別限定，例如可為8以上30以下。
就本發明B中的免疫誘導劑之具體例而言，可列舉例如，下述實施例9記載之CpG30(S)a2-OVA2-15。
依據本發明B，因為可使用較短的肽而製作多核苷酸-肽結合物，而可提供物性及/或經濟性更優異的醫藥組成物。 [實施例]
接著，說明關於用以確認本發明之作用效果所進行的實施例。又，於本實施例中，「CpG DNA(S)」表示具有包含CpG模體的鹼基序列，且磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代的DNA衍生物(多核苷酸衍生物之一例)。於實施例中，多核苷酸衍生物標記成一文字鹼基序列標記及左側成為5’末端側(右側為3’末端側)，肽標記成一文字標記及左側成為N末端側(右側為C末端側)。於一文字鹼基序列標記的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵皆被硫代磷酸酯鍵取代，又，末端構造於與間隔子結合的情形，意指到末端核苷之5’或3’羥基的氧原子為止，於未與間隔子結合的情形，則意指末端核苷之5’或3’羥基(包含至氫原子)。又，本實施例中的CpG DNA(S)-肽結合物係作為有三乙基胺及乙酸加成的鹽而調製。
實施例1：CpG DNA(S)-肽結合物之調製 (1)CpG DNA(S)衍生物之合成 CpG DNA(S)之合成使用亞磷醯胺法(例如，Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984))而進行。具有胺基修飾的CpG DNA(S)之合成係使用ssH Amino Linker(Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949(2008))而進行。此等之合成利用受託合成服務(GeneDesign Inc.)。 以下呈示經合成的CpG DNA(S)之鹼基序列。 CpG30a：5’-GAGCGTTCTCATCGACTCTCGAG CGTTCTC-3’(表1之K3-30(a)；序列識別號6) CpG20a：5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’(表1之K3；序列識別號1)
獲得的胺基修飾CpG DNA(S)係於5’末端具有下述之式所表示的構造。以下，於5’末端具有下述之式所表示的構造的CpG DNA(S)衍生物中，將具有序列識別號6之序列者稱為「CpG30(S)a」，將具有序列識別號1之序列者稱為「CpG20(S)a」。
Figure 02_image045
再者，將胺基修飾CpG DNA(S)、琥珀醯亞胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺基]己酸酯(LC-SPDP)以1：30莫耳比，於磷酸緩衝液(pH8.0)中混合，於40℃靜置3小時後，使用NAP-5管柱，而純化SPDP修飾CpG DNA(S)。 又，將下述之式所表示的構造，於以下稱為「ssH胺基連接子(linker)」。
Figure 02_image047
(2)N末端修飾肽之合成 肽係利用委託合成服務(GeneDesign Inc.)而合成。 於以下呈示合成的肽之胺基酸序列。 C-OVA8：CSIINFEKL(序列識別號30) C-TRP2-9：CSVYDFFVWL(序列識別號31) C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列識別號32) C-gp100-9：CKVPRNQDWL(序列識別號33) C-gp100-8：CVPRNQDWL(序列識別號34) CM-TRP2-9：CMSVYDFFVWL(序列識別號35) C-TRP2-13：CFANASVYDFFVWL(序列識別號36) C-TRP2-11：CNASVYDFFVWL(序列識別號37)
C-OVA8為於由卵白蛋白(OVA；GenBank登錄號：CAA23716.1)之258～265號而成的胺基酸序列的肽(以下，亦稱為OVA肽1)之N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-TRP2-9為於由已知為黑色素瘤關連抗原的mTRP2(mouse Tyrosinase-related protein 2；GenBank登錄號：CAA44951.1)之180～188號之胺基酸序列而成的肽(以下，亦稱為TRP2-9)之N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-TRP2-8為由於mTRP2之181～188號之胺基酸序列的N末端附加有半胱胺酸的序列而成的肽。 C-gp100-9為於由已知作為黑色素瘤關連抗原的hGP100(human glycoprotein 100；GenBank登錄號：AAC60634.1)之25～33號之胺基酸序列而成的肽(以下，亦稱為hGP100-9)之N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-gp100-8為於由hGP100之26～33號之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。 CM-TRP2-9為於由mTRP2之180～188號之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸及甲硫胺酸的肽。 C-TRP2-13為於由mTRP2之176～188號之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-TRP2-11為於由mTRP2之178～188號之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。
(3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 將(1)所合成的SPDP修飾CpG DNA(S)1mol、及(2)所合成的肽25mol，於30%N,N-二甲基甲醯胺(DMF)水溶液中進行混合，於40℃靜置3小時後，以利用下述(A)～(C)之任一者之條件的HPLC分取CpG DNA(S)-肽結合物。將各結合物之分取所使用的HPLC條件及保持時間示於表2。 ＜HPLC條件(A)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M六氟異丙醇、8mM三乙胺(TEA)，將B液設為甲醇，管柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6＊ 75mm(Waters Corporation)，以管柱溫度60℃、流速1mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘     A：95% B：5% ～20分鐘 A：70% B：30% ＜HPLC條件(B)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M六氟異丙醇、8mM三乙胺(TEA)，將B液設為甲醇，管柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6＊ 75mm(Waters Corporation)，以管柱溫度60℃、流速1mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘     A：95% B：5% ～25分鐘 A：60% B：40% ＜HPLC條件(C)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M乙酸三乙銨(TEAA；pH 7.0)，將B液設為乙腈，管柱使用ZORBAX Eclipse Plus C18(Agilent Technologies)，以管柱溫度40℃、流速1mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘     A：90% B：10% ～25分鐘 A：70% B：30% ～30分鐘 A：0%   B：100% ＜HPLC條件(D)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M六氟異丙醇、8mM三乙胺(TEA)，將B液設為甲醇，管柱使用X-Bridge C18 2.5μm 4.6＊ 75mm(Waters Corporation)，以管柱溫度60℃、流速1mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘     A：95% B：5% ～25分鐘 A：50% B：50%
於使用HPLC的SPDP修飾CpG DNA(S)與肽之反應後的溶液的分取中，檢測係藉由監測260nm的吸收而進行。分取後之CpG DNA(S)-肽結合物的溶出時間係確認到比SPDP修飾CpG DNA(S)慢。此被認為係因為因與疏水性的肽結合而溶出時間變慢。又，分取後的層析圖中未見到未反應的SPDP修飾CpG DNA(S)之波峰，僅檢測到CpG DNA(S)-肽結合物的波峰，由此確認純度高地獲得目的之CpG DNA(S)-肽結合物。作為HPLC分析之結果的一例，於圖1中呈示CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)之上述條件(B)中的層析圖。
於以下呈示獲得的CpG DNA(S)-肽結合物之構造。式中，「CpG DNA」表示CpG30(S)a或CpG20(S)a之鹼基序列部分，「petide」表示經除去上述(2)所合成的肽之N末端的半胱胺酸而成的部分。
Figure 02_image049
合成的CpG DNA(S)-肽結合物係如以下所示。
[表2]
名稱 CpG DNA (下述構造之 鹼基序列部分) 肽(經除去下述肽之N末端的半胱胺酸而成的部分) HPLC 條件 保持時間 (分鐘) 質量分析 (MALDI-TOF) [M-H]- 備註
CpG30(S)a-OVApep9 CpG30(S)a C-OVA8 (A) 16.1 11118.3 亦稱為化合物4。
CpG30(S)a-mTRP2pep10 CpG30(S)a C-TRP2-9 (B) 14.0 11331.6    亦稱為化合物5。
CpG30(S)a-hGP100pep10 CpG30(S)a C-gp100-9 (C) 16.1 未測定 亦稱為化合物6。
CpG30(S)a-mTRP2pep9 CpG30(S)a C-TRP2-8 (B) 14.2 11248.3 亦稱為化合物1。
CpG20(S)a-mTRP2pep9 CpG20(S)a C-TRP2-8 (D) 12.9 8009.5 亦稱為化合物2。
CpG30(S)a-hGP100pep9 CpG30(S)a C-gp100-8 (C) 16.3 未測定 亦稱為化合物3。
CpG30(S)a-CMTRP2-9 CpG30(S)a CM-TRP2-9 (B) 15.2 11464.2   
CpG30(S)a-mTRP2-14 CpG30(S)a C-TRP2-13 (D) 12.6 11739.3   
CpG30(S)a-mTRP2-12 CpG30(S)a C-TRP2-11 (B) 14.2 11524.5   
又，圖2中作為質量分析之結果的一例，而呈示CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)之質譜圖(MALDI-TOF)。檢測到11248.28(1價之陰性離子)及5622.53(2價之陰性離子)之波峰，並確認獲得相當CpG30(S)a-mTRP2pep9(理論分子量(C369 H480 N116 O174 P30 S31 理論上最豐富的質量)11246.56)的質譜圖。
實施例2：利用CpG DNA(S)-肽結合物的細胞毒性T細胞誘導之評價(使用mTRP2抗原的評價) (1)細胞毒性T細胞誘導之評價方法 將CpG DNA(S)-肽結合物作為抗原，而對小鼠(C57BL/6小鼠(♂，7週齡))進行皮內投予。CpG DNA(S)-肽結合物之投予量設為每1尾以肽換算計為50、200或1000 ng(其情形，以CpG30(S)換算為約0.4、1.7或8.5μg)。自投予1週後，於相同系統之小鼠中，自未進行投予的個體取出脾細胞，將其各分成2.0×107 細胞/ml之2個群組，於一者，作為抗原而添加肽使其成為10μg/mL，靜置90分鐘，藉此而製作抗原保持脾細胞，將未添加肽的脾細胞作為抗原未保持脾細胞。使用5,6-羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(5,6-Carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE))，將抗原保持脾細胞及抗原未保持脾細胞二者進行螢光修飾。此時，藉由改變CFSE的濃度，抗原保持脾細胞(CFSE：1μM)者，螢光強度變成高於抗原未保持脾細胞(CFSE： 0.1μM)。將投予抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞分別同數量混合，對投予CpG DNA(S)-肽結合物作為抗原的小鼠個體，自投予起1週後以3.0×106 的細胞數進行尾靜脈投予。 自上述之尾靜脈投予經過24小時後，自小鼠取出脾細胞，以流式細胞分析技術定量抗原保持脾細胞與抗原未保持脾細胞的比率，並評價抗原保持脾細胞的減少量，藉此而評價經誘導的抗原特異的細胞毒性T細胞的活性。為了比較，而使用投予PBS(磷酸緩衝生理食鹽水)取代CpG DNA(S)-肽結合物的小鼠個體作為對照組，以同樣的條件進行測定。
(2)CpG30(S)a-mTRP2pep10之細胞毒性T細胞誘導能力評價 於前案(PCT/JP2019/038090)中，藉由使用具有源自OVA之抗原性的肽的試驗，顯示CpG DNA(S)-肽結合物具有高細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力。另一方面，對於其它抗原肽製作同樣之CpG DNA(S)-肽結合物的情形，得知有無法獲得充分的CTL誘導能力的情形(圖3)。 具體而言，使用由已知為具有抗原性的肽的卵白蛋白(OVA)之258～265號之胺基酸序列而成的肽(OVA肽1)，來評價CpG30(S)a-OVApep9之CTL誘導能力的結果，以每1尾以肽換算計為20ng的投予量而觀察到抗原保持脾細胞的消失，確認強的CTL活性被誘導。相對於此，使用已知的包含mTRP2之180～188號之胺基酸序列(9胺基酸)的肽(TRP2-9)作為黑色素瘤關連抗原，評價CpG30(S)a-mTRP2pep10(使用於TRP2-9之N末端附加有半胱胺酸的肽而調製的結合物)之CTL誘導能力的結果，即使以每1尾以肽換算計為200ng的投予量亦未觀察到CTL活性。
(3)CpG30(S)a-mTRP2pep9之細胞毒性T細胞誘導能力評價 CpG DNA(S)-肽結合物為了誘導CTL活性，被攝入抗原呈現細胞後，肽部分有必要與多核苷酸部分及間隔子部分脫離，而與MHC分子結合。由上述結果認為，CpG30(S)a-mTRP2pep10之調製所使用的C-TRP2-9(10胺基酸)，因於原本具有抗原性的肽之N末端附加有1個胺基酸，而有無法與MHC分子結合，或者即使結合亦不能辨識T細胞受體的可能性。 因此，使用在除去由9個胺基酸而成的TRP2-9之N末端的1個殘基(絲胺酸)後附加有半胱胺酸的肽(C-TRP2-8)，調製CpG DNA(S)-肽結合物CpG30(S)a-mTRP2pep9，而評價細胞毒性T細胞誘導能力。使用TRP2-9作為用以調製抗原保持脾細胞的抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖4。於CpG30(S)a-mTRP2pep9，以每1尾以肽換算計為200ng的投予量，而觀察到抗原保持脾細胞的顯著減少，確認誘導高CTL活性。相對於此，於CpG30(S)a-mTRP2pep10，幾乎未觀察到抗原保持脾細胞的減少。
(4)用量依存性 將CpG30(S)a-mTRP2pep9之投予量設為每1尾以肽換算計為50、200或1000 ng，而評價細胞毒性T細胞誘導能力。使用TRP2-9作為用以調製抗原保持脾細胞的抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖5。於CpG30(S)a-mTRP2pep9之CTL誘導能力觀察認可有用量依存性。以200 ng之用量，顯示可能有強CTL活性之誘導。
(5)CpG DNA之鹼基長度依存性 調製將CpG30(S)a-mTRP2pep9之多核苷酸部分取代為20鹼基長度之CpG20(S)a的CpG DNA(S)-肽結合物CpG20(S)a-mTRP2pep9，評價細胞毒性T細胞誘導能力。使用TRP2-9作為用以調製抗原保持脾細胞的抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖6。CpG20(S)a-mTRP2pep9與CpG30(S)a-mTRP2pep9同樣地顯示具有高CTL誘導能力。
實施例3：本發明之CpG-肽結合物中使用的肽之MHC-1結合性的評價(與DC2.4細胞中的OVA肽1的MHC-1結合競合抑制評價) 自培養皿剝離小鼠樹突細胞株DC2.4細胞後，於1.5mL管中以1.5×105 細胞/200mL PBS而懸浮，於其中添加OVA肽1使成為0.25μg/mL，又添加源自TRP2的肽(TRP2-9、C-TRP2-9、或C-TRP2-8)使以肽換算計成為2.5μg/mL，於冰浴上培育此管30分鐘。接著，添加對OVA肽1與MHC-1之分子複合體特異性的抗體(以藻紅素(PE)螢光標識：PE-labeled anti-mouse OVA257−264 (SIINFEKL) peptide bound to H-2Kb antibody(ThermoFisher SCIENTIFIC))(以下，稱為「經PE標記的H-2Kb/FIINFEKL」)，以流式細胞分析技術，定量DC2.4細胞上之有前述抗體結合的OVA肽1-MHC-1複合體，並評價源自TRP2的肽所致的MHC-1結合競合抑制活性。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖7。於添加TRP2-9的情形，螢光強度之平均値降低38%，TRP2-9對OVA肽1向MHC第I型分子之結合具有抑制效果，即顯示可與MHC第I型分子結合。又，於添加與TRP2-9於N末端的胺基酸不同但相同胺基酸長度的C-TRP2-8的情形，螢光強度之平均値亦降低23%，確認對OVA肽1之向MHC第I型分子的結合的抑制效果。另一方面，於較TRP2-9長1個胺基酸的C-TRP2-9，未看到抑制效果。 據此，暗示於C-TRP2-9，失去對MHC-1的結合性，於C-TRP2-8，維持對MHC-1的結合性。
實施例4：CpG DNA(S)-肽結合物所致的細胞毒性T細胞誘導之評價(使用hGP100的評價) 使用CpG30(S)a-hGP100pep10或CpG30(S)a-hGP100pep9，與實施例2同樣地評價細胞毒性T細胞誘導能力。使用已知與黑色素瘤關連抗原的hGP100之25～33號之胺基酸序列(9胺基酸)而成的肽(hGP100-9)，作為用以調製抗原保持脾細胞的抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖8及9。與使用mTRP2而評價的情形同樣地，於CpG30(S)a-hGP100pep9，以每1尾以肽換算計為200ng的投予量而觀察到抗原保持脾細胞之減少，確認CTL活性被誘導，相對於此，於CpG30(S)a-hGP100pep10，幾乎未觀察到抗原保持脾細胞的減少(圖8)。又於CpG30(S)a-hGP100pep9之CTL誘導能力，認可有用量依存性，顯示於200 ng之用量可能會有強CTL活性之誘導(圖9)。
參考例1：CpG30(S)a-CMTRP2-9所致的細胞毒性T細胞誘導之評價 於MHC-1所致的抗原肽之呈現，有內質網胺肽酶(ERAP)參與。抗原肽前驅物係受到由於ERAP自N末端的修剪而成為適合對MHC-1的結合的長度。關於此過程，已有報告於N末端具有半胱胺酸的抗原肽前驅物中，於半胱胺酸之C末端側插入丙胺酸、白胺酸、或甲硫胺酸時，變得容易受到由於ERAP的修剪(WO2014/157704)。由圖3所示結果認為，於CpG30(S)a-mTRP2pep10，亦藉由於C-TRP2-9之N末端的半胱胺酸之C末端側插入丙胺酸、白胺酸、或甲硫胺酸而變得容易受到由於ERAP的修剪，而有改善CTL誘導能力的可能性。 因此，使用於C-TRP2-9之N末端的半胱胺酸之C末端側插入甲硫胺酸的CM-TRP2-9，調製CpG DNA(S)-肽結合物CpG30(S)a-CMTRP2-9，而評價其CTL誘導能力。使用TRP2-9作為用以調製抗原保持脾細胞用的抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖10。即使以每1尾以肽換算計為1000ng的投予量亦未觀察到充分的抗原保持脾細胞的減少，以200ng之投予量則幾乎未減少。於使用肽(CM-TRP2-9)的活體外評價，雖亦獲得暗示ERAP所致的切斷變容易的結果，但於活體內則暗示無法使CTL誘導能力充分提升。
參考例2：CpG30(S)a-mTRP2-14及CpG30(S)a-mTRP2-12所致的細胞毒性T細胞誘導之評價 受到ERAP所致的修剪得容易度係依肽的鏈長而變化，已有報告9～16胺基酸長度的肽為ERAP之較佳基質(Proc Natl Acad Sci U S A. 102(47):17107-12(2005))。 因此，使用較C-TRP2-9中的源自TRP2的序列於N末端側更長2或4個胺基酸的序列C-TRP2-11及C-TRP2-13，而調製CpG DNA(S)-肽結合物CpG30(S)a-TRP2-12及CpG30(S)a-TRP2-14，評價彼等之CTL誘導能力。使用TRP2-9作為用以調製抗原保持脾細胞之抗原。 將流式細胞分析技術之測定結果示於圖11。任一CpG DNA(S)-肽結合物皆未觀察到抗原保持脾細胞的減少。於使用肽(C-TRP2-11或C-TRP2-13)的活體外評價，雖亦獲得暗示由ERAP的切斷更容易的結果，但於使用結合物的活體內評價，暗示無法充分提升CTL誘導能力。
實施例5：包含源自K3之CpG模體以外的CpG模體的CpG DNA(S)-肽結合物之合成及其細胞毒性T細胞誘導能力的評價 (1)合成法 藉由與實施例1同樣之方法，合成包含源自K3之CpG模體以外的CpG模體的CpG DNA(S)-肽結合物。將合成的化合物示於下述式及表3。又，作為N末端修飾肽，使用C-TRP2-8(參照實施例1(2))。
Figure 02_image051
[表3]
名稱 CpG DNA 肽(經除去下述肽之N末端的 半胱胺酸而成的部分) HPLC條件 保持時間 (分鐘) 質量分析 (MALDI-TOF)
[M-H]-
ISS1018-mTRP2pep9 ISS1018 C-TRP2-8 B 15.1 8808.2
ODN2006-mTRP2pep9 ODN2006 C-TRP2-8 B 15.0 9358.6
ODN1826-mTRP2pep9 ODN1826 C-TRP2-8 B 15.5 8024.8
(2)試驗方法 藉由與實施例2同樣之方法，評價ISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、及ODN1826-mTRP2pep9所致的細胞毒性T細胞誘導能力。投予量設為每1尾以肽換算計為200 ng。作為對照，使用CpG30(S)a-mTRP2pep9(包含源自K3之CpG模體的結合物；參照實施例1)。 將結果示於圖12。於(1)所合成的任一化合物皆與包含源自K3之CpG模體的結合物同樣地，顯示具有細胞毒性T細胞誘導能力。
實施例6：具有磷酸基被取代為硫代磷酸基的ssH胺基連接子部分的結合物之合成及其細胞毒性T細胞誘導能之評價 (1)合成法 藉由以下之方法，合成具有磷酸基被取代為硫代磷酸基的ssH胺基連接子部分的結合物。將合成的化合物示於下述式及表4。
Figure 02_image053
[表4]
名稱 CpG DNA (下述構造之 鹼基序列部分) 肽(經除去 下述肽之N末端的半胱胺酸而成的部分) HPLC條件 保持時間 (分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
CpG30(S)a2-OVApep8 CpG30(S)a2 C-OVA7 (E) 8.0 C353 H476 N116 O172 P30 S32 [M-11H]11- : 計算值1003.58465(最豐富的量)， 實測值1003.58665
CpG30(S)a2-mTRP2pep9 CpG30(S)a2 C-TRP2-8 (E) 9.1 C369 H480 N116 O173 P30 S32 [M-11H]11- : 計算值1022.86182(最豐富的量)， 實測值1022.86031
(1-1)CpG DNA(S)衍生物之合成 CpG DNA(S)之合成使用亞磷醯胺法(例如，Nucleic Acids Research, 12, 4539(1984))進行。具有胺基修飾的CpG DNA(S)之合成使用ssH Amino Linker(Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949(2008))之磷酸基被取代為硫代磷酸基者而進行。於此等之合成中利用受託合成服務(GeneDesign Inc.)。 合成的CpG DNA(S)之鹼基序列與實施例1(1)記載之CpG30a相同。 獲得的胺基修飾CpG DNA(S)係於5’末端具有下述之式所表示的構造。以下，於5’末端具有下述之式所表示的構造的CpG DNA(S)衍生物之中，將具有序列識別號6之序列者稱為「CpG30(S)a2」。
Figure 02_image055
再者，將胺基修飾CpG DNA(S)1mol、及琥珀醯亞胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(LC-SPDP)30mol於磷酸緩衝液(pH8.0)中混合，於40℃靜置3小時後，使用NAP-5管柱而純化SPDP修飾CpG DNA(S)。 又，獲得的SPDP修飾CpG DNA(S)具有下述之式所表示的構造。
Figure 02_image057
(1-2)N末端修飾肽之合成 肽係利用受託合成服務(GeneDesign Inc.)而合成。 於以下呈示合成的肽的胺基酸序列。 C-OVA7：CIINFEKL(序列識別號46) C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列識別號32)
C-OVA7係於由卵白蛋白(OVA；GenBank登錄號：CAA23716.1)之259～265號之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。C-OVA7係刪除MHC-1結合肽的OVA肽1(序列識別號41之胺基酸序列而成的肽)之N末端1個殘基，並於N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-TRP2-8係如實施例1記載，為刪除MHC-1結合肽的TRP2-9之N末端1個殘基，並於N末端附加有半胱胺酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 相對於(1-1)所合成的SPDP修飾CpG DNA(S)，將5至10莫耳等量之於(1-2)所合成的肽，於50%二甲亞碸(DMSO)水溶液中混合，使於40℃反應2小時。反應後，以利用下述之條件的HPLC純化，分離CpG DNA(S)-肽結合物。 ＜HPLC條件(E)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M六氟異丙醇(HFIP)、8mM三乙胺(TEA)，將B液設為甲醇，管柱使用XBridge BEH C18(4.6×75 mm Column XP)(Waters Corporation)，以管柱溫度40℃、流速1mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘     A：80% B： 20% ～10分鐘 A：50% B： 50% 各結合物之分離所使用的HPLC條件及保持時間示於表4。
(2)試驗方法 藉由與實施例2同樣之方法，評價CpG30(S)a2-OVApep8及CpG30(S)a2-mTRP2pep9之細胞毒性T細胞誘導能力。CpG30(S)a2-OVApep8之投予量設為每1尾以肽換算計為20 ng。CpG30(S)a2-mTRP2pep9之投予量設為每1尾以肽換算計為200 ng。2個結合物之間的投予量的差異係反映原本肽本身的抗原性的強度的差異。 將結果示於圖13。於(1)所合成的CpG30(S)a2-OVApep8及CpG30(S)a2-mTRP2pep9之任一者皆顯示具有高細胞毒性T細胞誘導能力。
實施例7：CpG DNA(S)-肽結合物所致的細胞毒性T細胞誘導之評價(進行2次投予的活性) 藉由與實施例2同樣之方法，而評價2次投予CpG30(S)a-mTRP2pep9的情形之細胞毒性T細胞誘導能力。第2次之投予係於第1次的投予之10日後進行。投予量係任一者皆設為每1尾以肽換算計為200 ng。 將結果示於圖14。暗示藉由2次投予CpG DNA(S)-肽結合物，而CTL活性較單次投予的情形更為提升。
實施例8：雙股鏈CpG DNA(S)-肽結合物之合成 藉由使CpG DNA(S)-肽結合物(CpG30(S)a-mTRP2pep9；參照實施例1)、及具有與其CpG DNA(S)部分之鹼基序列互補的序列的DNA衍生物降溫貼合，而調製雙股鏈複合體(雙股鏈CpG DNA(S)-肽結合物)。 (1)CpG互補鏈DNA衍生物之合成 與CpG互補的DNA之合成係與CpG DNA(S)同樣地使用亞磷醯胺法進行。於5’末端具有脂質修飾的互補鏈DNA之合成係藉由將下述之式所表示的脂質化亞磷醯胺(藉由與文獻(WO2017/057540)中之M22-12亞磷醯胺同樣的方法而合成)於互補鏈DNA之序列合成的最後偶合所使用者而進行。
Figure 02_image059
於3’-末端具有脂質修飾的互補鏈DNA之合成係如以下進行。 於通用固相撐體(Glen UnySupport 500 (GlenResearch, 20-5040))上，使用Asymmetric Doubler(Lev) Phosphoramidite(GlenResearch, 10-1981)而進行最初的偶合後，合成互補鏈DNA之序列。接著，於固相撐體上進行脱三苯甲基化及乙醯基保護後，利用製造商指定的方法將戊酮酸單元脱保護。藉由使生成的羥基，與上述之脂質化亞磷醯胺反應，而合成目的之化合物。
於3’及5’-末端具有脂質修飾的互補鏈DNA之合成係如以下進行。 於通用固相撐體(Glen UnySupport 500 (GlenResearch, 20-5040))上，使用Asymmetric Doubler(Lev) Phosphoramidite(GlenResearch, 10-1981)而進行最初的偶合後，合成互補鏈DNA之序列。接著，於固相撐體上進行脱三苯甲基化及乙醯基保護後，利用製造商指定的方法將戊酮酸單元脱保護。藉由使生成的3’及5’-末端之羥基與上述之脂質化亞磷醯胺反應，合成目的之化合物。
於以下呈示與合成的CpG互補的DNA衍生物之構造。又，下述衍生物中之DNA序列(compK3：序列識別號47)為與K3之鹼基序列(序列識別號1)互補的序列。 5’-Lipo-compK3：5’-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAG A^G^T-3’ 3’-Lipo-compK3：5’-G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^ Lipo-3’ 5’,3’-di-Lipo-compK3：5’-Lipo^G^A^G^AACGCTCG AGA^G^T^Lipo-3’
上述構造中，「^」表示核苷間之硫代磷酸酯鍵。又，「Lipo^G」及「T^Lipo」表示下述之構造。
Figure 02_image061
藉由利用下述條件的HPLC，分離與CpG互補的DNA衍生物。將結果示於表5。 ＜HPLC條件(F)＞ 以下列之梯度條件，將A液設為0.1M六氟異丙醇(HFIP)、8mM三乙胺(TEA)，將B液設為甲醇，管柱使用Clarity(登録商標) 2.6μm Oligo-MS 100A(LC-Column 50 x 2.1mm)(Phenomenex Inc)，以管柱溫度60℃、流速0.5mL/分鐘，進行HPLC。 0分鐘        A：90%  B： 10% ～7分鐘    A：10%  B： 90%
[表5]
名稱 CpG DNA HPLC條件 (分析) 保持時間 (分鐘) 分子式 質量分析 (MALDI-TOF)
5’-Lipo-compK3 compK3 (F) 2.95 C195 H269 N71 O92 P16 S6 計算值5764.2679，實測值5764.2680
3’-Lipo-compK3 compK3 (F) 2.99 C198 H276 N71 O96 P17 S7 計算值5934.2482，實測值5934.2234
5’,3’-di-Lipo-compK3 compK3 (F) 3.86 C236 H350 N74 O102 P18 S8 計算值6665.7518，實測值6665.7147
(2)與CpG DNA(S)-肽結合物之雙股鏈複合體形成 將CpG30(S)a-mTRP2pep9之PBS溶液與上述(1)所合成的脂質修飾compK3之PBS溶液，於1.5 mL管內混合使其各自成為終濃度3.4μM。藉由將其置入90℃的熱水浴而加熱後，放置一晩而緩緩回到室溫(於此冷卻過程中使雙股鏈形成)。若對小鼠投予此溶液50μL，則成為施予相當於肽200 ng。 獲得下述表6記載之組合之5種類的雙股鏈複合體。雙股鏈複合體之形成可藉由使用聚丙烯醯胺膠體等的電泳、尺寸排除層析等之液體層析、使用紫外分光法的熔解溫度測定、利用靜態光散射法測定的締合體分子量測定等而確認。
[表6]
CpG DNA(S)-肽結合物 互補鏈DNA衍生物
1 CpG30(S)a-mTRP2pep9 5’-Lipo-compK3
2 CpG30(S)a-mTRP2pep9 3’-Lipo-compK3
3 CpG30(S)a-mTRP2pep9 5’,3’-di-Lipo-compK3
4 CpG20(S)a-mTRP2pep9 5’-Lipo-compK3
5 CpG20(S)a-mTRP2pep9 3’-Lipo-compK3
實施例9：使用MHC-2結合肽的CpG DNA(S)-肽結合物之合成及其所致的CD4＋ T細胞活化之評價 (1)合成法 藉由以下之方法，合成具有源自MHC-2結合肽的CpG DNA(S)部分的2種類之結合物CpG30(S)a2-OVA2-15及CpG30(S)a2-OVA2-17。將合成的化合物示於下述式及表7。
Figure 02_image063
Figure 02_image065
[表7]
名稱 CpG DNA (下述構造之 鹼基序列部分) 肽(經除去 下述肽之N 末端或C末端的半胱胺酸而成的部分) HPLC條件 保持時間(分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
CpG30(S)a2-OVA2-15 CpG30(S)a C-OVA2-14 (E) 6.7 C371 H501 N127 O183 P30 S32 [M-11H]11- : 計算值1055.51157(最豐富的量)， 實測值1055.51068
CpG30(S)a2-OVA2-17 CpG30(S)a2 C-OVA2-16 (E) 7.2 C379 H516 N132 O185 P30 S32 [M-12H]12- : 計算值985.22856(最豐富的量)， 實測值985.22872
(1-1)CpG DNA(S)衍生物之合成 藉由與實施例6同樣之方法，而合成CpG30(S)a2及其SPDP修飾體。 (1-2)N末端修飾肽之合成 N末端半胱胺酸修飾肽係以一般的Fmoc固相肽合成法而合成。於以下呈示合成的肽之胺基酸序列。 於以下呈示合成的肽之胺基酸序列。 C-OVA2-14：CSQAVHAAHAEINEA(序列識別號48) C-OVA2-16：CSQAVHAAHAEINEAGR(序列識別號51)
C-OVA2-14係於由卵白蛋白(OVA；GenBank登錄號：CAA23716.1)之325～338之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。C-OVA2-14係刪除OVA肽2(由包含小鼠I-Ab/I-Ad結合性序列的序列識別號42之胺基酸序列而成的肽)之N末端1個殘基及C末端2個殘基，並於N末端附加有半胱胺酸的肽。 C-OVA2-16係於由前述卵白蛋白之325-340之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。C-OVA2-16係刪除前述OVA肽2之N末端1個殘基，並於N末端附加有半胱胺酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 使用於(1-1)所合成的SPDP修飾CpG DNA(S)及於(1-2)所合成的肽，藉由與實施例6之(1-3)同樣之方法，而合成CpG DNA(S)-肽結合物。
(2)試驗方法(利用IFN-γ分泌活性測定之CpG-MHC2肽結合物的一次免疫所致的CD4＋ T細胞活化之評價) 將CpG DNA(S)-肽結合物作為抗原，而對小鼠(C57BL/6小鼠(♂、7週齡))進行皮內投予。CpG DNA(S)-肽結合物之投予量設為每1尾以肽換算計為1000 ng。於自投予1週後取出脾細胞，於96孔培養皿中以1.0×106 個細胞/100μL接種(培養基；RPMI1640)，添加源自OVA的MHC-2結合性之抗原肽(OVA324-340 ：ISQAVHAAHAEINEAGR(序列識別號42))使成為10μg/mL。於24小時後將培養基中之干擾素γ(IFN-γ)使用IFN gamma Mouse ELISA Kit(Invitrogen, IFN gamma ‘Femto-HS’ High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit)進行定量。於藉由CpG DNA(S)-肽結合物之投予而小鼠被免疫化的情形，藉由對培養基中添加抗原肽所致的刺激，而脾細胞中之抗原特異的CD4＋ T細胞活化，並分泌IFN-γ。
將結果示於圖15及圖17。 於經各自投予CpG30(S)a2-OVA2-15及CpG30(S)a2-OVA2-17的小鼠之脾細胞，均可見到高的IFN-γ分泌活性(圖15及17；關於CpG30(S)a2-OVA2-18，參照參考例3)。於使用MHC-2結合肽而製作結合物的情形，係顯示可刪除C末端之肽。
參考例3：使用MHC-2結合肽的CpG DNA(S)-肽結合物之合成及其所致的CD4＋ T細胞活化之評價 (1)合成法 藉由以下之方法，合成具有源自MHC-2結合肽的CpG DNA(S)部分的2種類之結合物CpG30(S)a2-OVA2-18及CpG30(S)a2-OVA2-18c。將合成的化合物呈示於下述式及表8。
Figure 02_image067
[表8]
名稱 CpG DNA (下述構造之 鹼基序列部分) 肽(經除去 下述肽之N 末端或C末端的半胱胺酸而成的部分) HPLC條件 保持時間(分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
CpG30(S)a2-OVA2-18 CpG30(S)a C-OVA2-17 (E) 8.2 C385 H527 N133 O186 P30 S32 [M-12H]12- : 計算值994.73570(最豐富的量)， 實測值994.73459
CpG30(S)a2-OVA2-18c CpG30(S)a OVA2-17-C (E) 7.6 C385 H527 N133 O186 P30 S32 [M-12H]14- : 計算值852.48663(最豐富的量)， 實測值852.48585
(1-1)CpG DNA(S)衍生物之合成 藉由與實施例6同樣之方法，合成CpG30(S)a2及其SPDP修飾體。 (1-2)N末端修飾肽及C末端修飾肽之合成 N末端半胱胺酸修飾肽及C末端半胱胺酸修飾肽係以一般的Fmoc固相肽合成法而合成。 將合成的肽之胺基酸序列示於以下。 C-OVA2-17：CISQAVHAAHAEINEAGR(序列識別號49) OVA2-17-C：ISQAVHAAHAEINEAGRC(序列識別號50)
C-OVA2-17係於由卵白蛋白之324～340之胺基酸序列而成的肽之N末端附加有半胱胺酸的肽。C-OVA2-17係於前述OVA肽2之N末端附加有半胱胺酸的肽。 OVA2-17-C係於由卵白蛋白之324～340之胺基酸序列而成的肽之C末端附加有半胱胺酸的肽。C-OVA2-17係於前述OVA肽2之C末端附加有半胱胺酸的肽。
(1-3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 使用於(1-1)所合成的SPDP修飾CpG DNA(S)及於(1-2)所合成的肽，藉由與實施例6之(1-3)同樣之方法，而合成CpG DNA(S)-肽結合物。
(2)試驗方法(利用IFN-γ分泌活性測定之CpG-MHC2肽結合物的一次免疫所致的CD4＋ T細胞活化之評價) 將CpG DNA(S)-肽結合物作為抗原，而對小鼠(C57BL/6小鼠(♂、7週齡))進行皮內投予。CpG DNA(S)-肽結合物之投予量設為每1尾以肽換算計為1000 ng。自投予1週後，取出脾細胞，於96孔培養皿中以1.0×106 個細胞/100μL接種(培養基；RPMI1640)，添加源自OVA的MHC-2結合性之抗原肽(OVA324-340 ：ISQAVHAAHAEINEAGR(序列識別號42))使成為10μg/mL。24小時後將培養基中之干擾素γ(IFN-γ)使用IFN gamma Mouse ELISA Kit(Invitrogen, IFN gamma ‘Femto-HS’ High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit)進行定量。於藉由CpG DNA(S)-肽結合物之投予而小鼠被免疫化的情形，藉由對培養基中添加抗原肽所致的刺激，而脾細胞中之抗原特異的CD4＋ T細胞活化，並分泌IFN-γ。
將結果示於圖15及16。 於投予CpG30(S)a2-OVA2-18的小鼠之脾細胞，均可見到高IFN-γ分泌活性(圖15及16)。 又，於投予CpG30(S)a2-OVA2-18c的小鼠之脾細胞中，可見到與投予CpG30(S)a2-OVA2-18的情形同等或較其高的活性(圖16)。於使用MHC-2結合肽而製作結合物的情形，係顯示可使CpG DNA(S)結合於C末端側。
實施例10：CpG DNA(S)-肽結合物之調製(2)及其細胞毒性T細胞誘導能力之評價 (1)合成法 (1-1)CpG DNA(S)衍生物之合成 於5’末端具有6-巰基己基的CpG DNA(S)之合成，係於使用亞磷醯胺法而合成CpG DNA(S)之序列後，使5’-thiol-modifier C6((S-三苯甲基-6-巰基己基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺)(S-Trityl-6-mercaptohexyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite))反應而進行。於此等之合成，係利用受託合成服務(GeneDesign Inc.)。 獲得的6-巰基己基修飾CpG DNA(S)係於5’末端具有下述之式所表示的構造。以下，於5’末端具有下述之式所表示的構造的CpG DNA(S)衍生物之中，將具有序列識別號6之序列者稱為「CpG30(S)a3」。
Figure 02_image069
又，於5’末端具有下述之式所表示的構造的CpG DNA(S)衍生物之合成，係使實施例6之(1-1)所合成的胺基修飾CpG DNA(S)、與PPC-NHS酯(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基 3-(吡啶-2-基二氫硫基)丁酸酯)(2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3-(pyridin-2-yldisulfanyl) butanoate))以1：30莫耳比，於磷酸緩衝液(pH8.0)中於40℃進行反應3小時後，以NAP-5管柱純化而進行。
Figure 02_image071
(1-2)N末端修飾肽之合成 與實施例1同樣地，合成C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列識別號32)。
(1-3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 相對於(1-1)所合成的CpG30(S)a3，將30莫耳等量之Npys-OMe(CAS: 68118-08-1)於33%二甲亞碸(DMSO)水溶液中混合，使反應一晩。接著，將於(1-2)合成的肽以5莫耳等量，於50%二甲亞碸(DMSO)水溶液中混合，於40℃使反應2小時。反應後，以HPLC純化而分離CpG DNA(S)-肽結合物，獲得CpG30(S)a3-mTRP2pep9。 又，相對於(1-1)所合成的PPC-NHS酯修飾CpG DNA(S)，將(1-2)所合成的肽以5莫耳等量，於50%二甲亞碸(DMSO)水溶液中混合，於40℃使反應2小時。反應後，以HPLC純化而分離CpG DNA(S)-肽結合物，獲得CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9。
將合成的化合物示於下述式及表9。 CpG30(S)a3-mTRP2pep9
Figure 02_image073
CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9
Figure 02_image075
[表9]
名稱 CpG DNA (下述構造 之鹼基序列部分) 肽(經除去 下述肽之N 末端的半胱 胺酸而成的 部分) HPLC條件 保持時間(分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
CpG30(S)a3-mTRP2pep9 CpG30(S)a2 C-TRP2-8 (E) 9.2 C357 H459 N113 O169 P30 S32 [M-10H]10- : 計算值1098.13337(最豐富的量)， 實測值1098.13178
CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9 CpG30(S)a2 C-TRP2-8 (E) 9.1 C364 H471 N115 O172 P30 S32 [M-10H]10- : 計算值1115.34187(最豐富的量)， 實測值1115.34148
(2)試驗方法 藉由與實施例2同樣之方法，評價CpG30(S)a3-mTRP2pep9所致的細胞毒性T細胞誘導能力。投予量設為每1尾以肽換算計為200 ng。作為對照，使用CpG30(S)a2-mTRP2pep9(包含源自K3之CpG模體的結合物；參照實施例6)。 將結果示於圖18。CpG30(S)a3-mTRP2pep9係與間隔子構造之相異的CpG30(S)a2-mTRP2pep9同樣地，顯示具有細胞毒性T細胞誘導能力。
實施例11：含半胱胺酸類似物的CpG DNA(S)-肽結合物之合成 (1)合成法 使用N末端經以半胱胺酸類似物取代半胱胺酸而修飾的肽，藉由與實施例1同樣之方法，合成CpG DNA(S)-肽結合物。將合成的化合物示於下述式及表10。又，作為N末端修飾肽，使用N末端之胺基酸為非天然胺基酸的下述之合成肽。 dC-mTRP2pep8: D-cysteine-VYDFFVWL(序列識別號52) homoC-mTRP2pep8: L-升半胱胺酸-VYDFFVWL(序列識別號53) Pen-mTRP2pep8: L-青黴胺-VYDFFVWL(序列識別號54)
CpG30(S)a2-dC-mTRP2pep8
Figure 02_image077
CpG30(S)a2-homoC-mTRP2pep8
Figure 02_image079
CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8
Figure 02_image081
[表10]
名稱 CpG DNA (下述構造之鹼基序列 部分) 肽(經除去下述肽之N末端半胱胺酸類似物而成的部分) HPLC條件 保持時間(分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
CpG30(S)a2-dC-mTRP2pep8 CpG30(S)a2 dC-mTRP2pep8 (E) 9.5 C369 H480 N116 O173 P30 S32 [M-11H]11- : 計算值1022.86182(最豐富的量)， 實測值1022.86122
CpG30(S)a2-homoC-mTRP2pep8 CpG30(S)a2 homoC-mTRP2pep8 (E) 9.1 C370 H482 N116 O173 P30 S32 [M-11H]11- : 計算值1024.13597(最豐富的量)， 實測值1024.13461
CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8 CpG30(S)a2 Pen-mTRP2pep8 (E) 9.5 C371 H484 N116 O173 P30 S32 [M-10H]10- : 計算值1128.05186(最豐富的量)， 實測值1128.05021
(2)試驗方法 藉由與實施例2同樣之方法，評價CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8所致的細胞毒性T細胞誘導能力。投予量設為每1尾以肽換算計為200 ng。作為對照，使用CpG30(S)a2-mTRP2pep9(包含源自K3之CpG模體的結合物；參照實施例6)。 將結果示於圖18。包含半胱胺酸類似物的CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8係與CpG30(S)a2-mTRP2pep9同樣地，顯示具有細胞毒性T細胞誘導能力。
實施例12：於CpG DNA之5’及3’兩末端具有肽的CpG DNA(S)-肽結合物之合成 (1)合成法 使用以下之(1-1)～(1-3)之方法，合成於CpG DNA之兩末端具有肽的CpG DNA(S)-肽結合物。將合成的化合物示於下述式及表11。又，作為N末端修飾肽，使用C-TRP2-8(參照實施例1(2))。
K3CpG30(S)a4-bis(mTRP2pep9)
Figure 02_image083
[表11]
名稱 CpG DNA (下述構造之鹼基序列 部分) 肽(經除去 下述肽之N末端或C末端的半胱胺酸而成的 部分) HPLC條件 保持時間(分鐘) 分子式 質量分析 (ESI)
K3CpG30(S)a4-bis(SS-mTRP2pep9) CpG30(S)a4 C-TRP2-8 (E) 11.6 C445 H585 N128 O190 P31 S35 [M-11H]11- : 計算值1167.01309(最豐富的量)， 實測值1167.01147
(1-1)CpG DNA(S)衍生物之合成 於5’及3’兩末端使胺基連接子(Amino Linker)結合的CpG DNA(S)之合成，係使用亞磷醯胺法，使用3’-Amino-Modifier C6-dC CPG(Link Technologies Ltd.)而合成CpG序列後，於5’末端使與ssH胺基連接子反應而進行。於此等之合成，利用受託合成服務(GeneDesign Inc.)。 合成的CpG DNA(S)之鹼基序列係與實施例1(1)記載之CpG30a相同。 獲得的胺基修飾CpG DNA(S)係於5’末端具有下述之式所表示的構造，
Figure 02_image055
於3’末端具有下述之式所表示的構造。
Figure 02_image086
以下，於3’及5’末端具有上述式所表示的構造的CpG DNA(S)衍生物之中，將具有序列識別號6之序列者稱為「CpG30(S)a4」。 再者，將CpG30(S)a4、及琥珀醯亞胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(LC-SPDP)，以1：30莫耳比，於磷酸緩衝液(pH8.0)中混合，於40℃靜置3小時後，使用NAP-5管柱，純化SPDP修飾CpG DNA(S)a4。
(1-2)N末端修飾肽之合成 與實施例1同樣地，合成C-TRP2-8：CVYDFFVWL(序列識別號32)。
(1-3)CpG DNA(S)-肽結合物之合成 相對於(1-1)所合成的SPDP修飾CpG DNA(S)a4，將(1-2)所合成的肽以5至10莫耳等量，於50%二甲亞碸(DMSO)水溶液中混合，使於40℃下反應2小時。反應後，以HPLC純化而分離CpG DNA(S)-肽結合物。將於分離所使用的HPLC條件及保持時間示於表11。
[產業上利用之可能性]
依據本發明，可提供對於廣泛的抗原肽，能誘導CTL活性的免疫誘導劑、及含其之醫藥組成物。 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1：K3 序列識別號2：K3-20(b) 序列識別號3：K3-21 序列識別號4：K3-24 序列識別號5：K3-27 序列識別號6：K3-30(a) 序列識別號7：K3-30(b) 序列識別號8：K3-40 序列識別號9：K3-30(c) 序列識別號10：K3-30(d) 序列識別號11：K3-30(e) 序列識別號12：K3-30(f) 序列識別號13：K3-26(a) 序列識別號14：K3-26(b) 序列識別號15：ODN1668 序列識別號16：ODN1668-30 序列識別號17：ODN1668-40 序列識別號18：ODN1826 序列識別號19：ODN1826-30 序列識別號20：ODN1826-40 序列識別號21：ODN2006 序列識別號22：ODN2006-30 序列識別號23：ODN2006-40 序列識別號24：ODN684 序列識別號25：ODN684-30 序列識別號26：ODN684-40 序列識別號27：ODN D-SL01 序列識別號28：ODN D-SL01-35 序列識別號29：C-CpG_1 序列識別號30：C-OVA8 序列識別號31：C-TRP2-9 序列識別號32：C-TRP2-8 序列識別號33：C-gp100-9 序列識別號34：C-gp100-8 序列識別號35：CM-TRP2-9 序列識別號36：C-TRP2-13 序列識別號37：C-TRP2-11 序列識別號38：C-OVA2-17 序列識別號39：C-OVA2-14 序列識別號40：C-OVA2-11 序列識別號41：OVA肽1 序列識別號42：OVA肽2 序列識別號43：1018ISS 序列識別號44：1018ISS_30 序列識別號45：1018ISS_40 序列識別號46：C-OVA7 序列識別號47：compK3 序列識別號48：C-OVA2-14 序列識別號49：C-OVA2-17 序列識別號50：OVA2-17-C 序列識別號51：C-OVA2-16 序列識別號52：dC-mTRP2pep8；1號之胺基酸為D-半胱胺酸。 序列識別號53：homoC-mTRP2pep8；1號之胺基酸為L-升半胱胺酸。 序列識別號54：Pen-mTRP2pep8；1號之胺基酸為L-青黴胺。
無。
圖1為呈示實施例1中的CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)之HPLC分析中的層析圖的圖。 圖2為呈示實施例1中的CpG30(S)a-mTRP2pep9(化合物1)之質量分析中的質譜圖的圖。 圖3為呈示實施例2(2)中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖4為呈示實施例2(3)中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖5為呈示實施例2(4)中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖6為呈示實施例2(5)中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖7為呈示實施例3中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖8為呈示實施例4中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖9為呈示實施例4中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖10為呈示參考例1中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖11為呈示參考例2中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖12為呈示實施例5中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖13為呈示實施例6中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖14為呈示實施例7中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖15為呈示實施例9及參考例3中的CD4＋ T細胞所致的IFN-γ分泌之測定結果的圖。 圖16為呈示參考例3中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。 圖17為呈示實施例9及參考例3中的CD4＋ T細胞所致的IFN-γ分泌之測定結果的圖。 圖18為呈示實施例10中的流式細胞分析技術之測定結果的圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
無。

Claims (32)

  1. 一種免疫誘導劑，其係含有多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 該多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與該多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與該肽共價鍵結的間隔子(spacer)， 該肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與該間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中該1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。
  2. 如請求項1之免疫誘導劑，其中該間隔子與該多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及該間隔子與該肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵。
  3. 如請求項1或2之免疫誘導劑，其中具有用以使與該間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其之類似物。
  4. 如請求項1至3中任一項之免疫誘導劑，其中該間隔子與該肽之間的共價鍵為雙硫鍵。
  5. 如請求項1至4中任一項之免疫誘導劑，其中該MHC結合肽為MHC-1結合肽。
  6. 如請求項5之免疫誘導劑，其中該MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽。
  7. 如請求項5或6之免疫誘導劑，其中該MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下。
  8. 如請求項1至4中任一項之免疫誘導劑，其中該MHC結合肽為MHC-2結合肽。
  9. 如請求項1至8中任一項之免疫誘導劑，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物。
  10. 如請求項1至9中任一項之免疫誘導劑，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為15以上40以下。
  11. 如請求項10之免疫誘導劑，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下。
  12. 如請求項1至11中任一項之免疫誘導劑，其中該多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。
  13. 如請求項12之免疫誘導劑，其中於該磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之50%以上經硫代磷酸酯鍵取代。
  14. 如請求項13之免疫誘導劑，其中於該磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代。
  15. 如請求項1至14中任一項之免疫誘導劑，其中該間隔子包含下述之式所表示的重複單元，
    Figure 03_image001
    於上述之式中， X表示氧原子或硫原子(其中各X可為相同亦可為相異)， R表示(CH2 )p O、(CH2 )q NH及(CH2 CH2 O)m 之任一者(m、p及q各自獨立表示10以下之自然數)， n表示10以下之自然數。
  16. 如請求項1至15中任一項之免疫誘導劑，其中該間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
    Figure 03_image003
    。
  17. 如請求項1至14中任一項之免疫誘導劑，其中該間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
    Figure 03_image005
    。
  18. 一種免疫誘導劑，其係含有如請求項1之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 其中該間隔子與該多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及該間隔子與該肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。
  19. 一種免疫誘導劑，其係含有如請求項1之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽作為有效成分的免疫誘導劑， 其中具有用以使與該間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物， 該間隔子與該肽之間的共價鍵為雙硫鍵， 該MHC結合肽為MHC-1結合肽， 該MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽， 該MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下， 於該磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代， 該間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
    Figure 03_image005
    。
  20. 如請求項1至19中任一項之免疫誘導劑，其進一步包含具有免疫賦活活性的物質作為佐劑。
  21. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑。
  22. 如請求項21之醫藥組成物，其為用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防用。
  23. 如請求項21之醫藥組成物，其為用於腫瘤之治療或預防用。
  24. 腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防方法，其包含對患者投予如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑。
  25. 一種腫瘤之治療或預防方法，其包含對患者投予如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑。
  26. 如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑，其用於使用於感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防。
  27. 如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑，其用於使用於腫瘤之治療或預防。
  28. 一種如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑之用途，其係用於製造感染症、腫瘤、或過敏性疾病之治療或預防用醫藥。
  29. 一種如請求項1至20中任一項之免疫誘導劑之用途，其係用於製造腫瘤之治療或預防用醫藥。
  30. 一種多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽， 該多核苷酸-肽結合物包含含CpG模體的單股多核苷酸或多核苷酸衍生物、肽、及於一端側與該多核苷酸或多核苷酸衍生物共價鍵結且於另一端側與該肽共價鍵結的間隔子， 該肽為MHC結合肽之N末端的1或複數個連續的胺基酸被具有用以使與該間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸所取代的肽，其中該1或複數個連續的胺基酸不包含用以結合MHC的錨殘基。
  31. 如請求項30之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中 該間隔子與該多核苷酸或多核苷酸衍生物之間的共價鍵及該間隔子與該肽之間的共價鍵之一者或兩者，為於活體環境中可切斷的共價鍵， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物。
  32. 如請求項30之多核苷酸-肽結合物或其醫藥上可容許的鹽，其中 具有用以使與該間隔子之共價鍵形成的反應性官能基的胺基酸為半胱胺酸或具有硫醇基的其類似物， 該間隔子與該肽之間的共價鍵為雙硫鍵， 該MHC結合肽為MHC-1結合肽， 該MHC-1結合肽為HLA-A結合肽或HLA-B結合肽， 該MHC-1結合肽之胺基酸長度為8以上11以下， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物為包含2個以上之CpG模體的聚去氧核糖核苷酸(DNA)或DNA衍生物， 該多核苷酸或多核苷酸衍生物之鹼基長度為20以上30以下， 於該磷酸二酯鍵之至少一部分經硫代磷酸酯鍵取代的多核苷酸衍生物中，磷酸二酯鍵之90%以上經硫代磷酸酯鍵取代， 該間隔子具有下述之任一式所表示的構造：
    Figure 03_image005
    。
TW110111020A 2020-03-27 2021-03-26 含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物 TW202146037A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020057249 2020-03-27
JP2020-057249 2020-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202146037A true TW202146037A (zh) 2021-12-16

Family

ID=77890353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110111020A TW202146037A (zh) 2020-03-27 2021-03-26 含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230144876A1 (zh)
EP (1) EP4129344A1 (zh)
JP (1) JPWO2021193900A1 (zh)
KR (1) KR20220160036A (zh)
CN (1) CN115427079A (zh)
AU (1) AU2021241229A1 (zh)
BR (1) BR112022018361A2 (zh)
CA (1) CA3175889A1 (zh)
TW (1) TW202146037A (zh)
WO (1) WO2021193900A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005213460A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-25 Mayo Foundation For Medical Education And Research Complexed polypeptide and adjuvant for improved vaccines
EP2702999A4 (en) * 2011-04-28 2014-09-17 Univ Nagoya Nat Univ Corp FUNCTIONAL NUCLEIC ACID TARGETING THE BRAIN AND USE THEREOF
EP2980097A4 (en) 2013-03-29 2017-03-08 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Conjugate vaccine using trimming function of erap1
WO2015089114A1 (en) * 2013-12-09 2015-06-18 Bullet Biotechnology, Inc. Specific virus-like particle-cpg oligonucleotide vaccines and uses thereof
CN105940012A (zh) 2014-02-06 2016-09-14 独立行政法人科学技术振兴机构 肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有它的医药组合物
RU2730871C1 (ru) 2015-09-30 2020-08-26 Сионоги Энд Ко., Лтд. Производное нуклеиновой кислоты, обладающее иммуностимулирующей активностью
DE102017214776A1 (de) 2017-08-23 2018-04-26 Continental Automotive Gmbh Verfahren zum Fertigen eines Rotors für eine elektrische Maschine mit berührungslosem Leistungsübertragungssystem sowie Rotor, elektrische Maschine und Kraftfahrzeug

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021193900A1 (zh) 2021-09-30
WO2021193900A1 (ja) 2021-09-30
CA3175889A1 (en) 2021-09-30
US20230144876A1 (en) 2023-05-11
CN115427079A (zh) 2022-12-02
AU2021241229A1 (en) 2022-10-13
BR112022018361A2 (pt) 2022-11-08
KR20220160036A (ko) 2022-12-05
EP4129344A1 (en) 2023-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL2007536C2 (en) Adjuvant compound.
KR20030043993A (ko) 백신 조성물
JP7471600B2 (ja) 抗原ペプチド－アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物
JP6383740B2 (ja) ペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びそれを含む医薬組成物
AU2004238139B2 (en) Immunostimulating Agents
WO2016152767A1 (ja) 免疫賦活活性を有するＣｐＧスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
WO2019122050A1 (en) Methods of immunization
US20240075132A1 (en) Immunity-inducing agent and pharmaceutical composition containing same
TW202146037A (zh) 含有多核苷酸-肽結合物的免疫誘導劑及含其之醫藥組成物
US20220387461A1 (en) Cancer vaccine
US20190175728A1 (en) Nucleic acid-antigen peptide conjugate
NL2018803B1 (en) Adjuvant compounds
NZ623869B2 (en) Improved pam3cys-like lipopeptide adjuvant compound