WO2021193900A1 - ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2021193900A1
WO2021193900A1 PCT/JP2021/012787 JP2021012787W WO2021193900A1 WO 2021193900 A1 WO2021193900 A1 WO 2021193900A1 JP 2021012787 W JP2021012787 W JP 2021012787W WO 2021193900 A1 WO2021193900 A1 WO 2021193900A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polynucleotide
peptide
derivative
bond
mhc
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/012787
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
慎一 望月
小泉　誠
森田　浩司
Original Assignee
公立大学法人北九州市立大学
第一三共株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人北九州市立大学, 第一三共株式会社 filed Critical 公立大学法人北九州市立大学
Priority to CA3175889A priority Critical patent/CA3175889A1/en
Priority to BR112022018361A priority patent/BR112022018361A2/pt
Priority to CN202180024931.3A priority patent/CN115427079A/zh
Priority to EP21776683.1A priority patent/EP4129344A1/en
Priority to KR1020227036681A priority patent/KR20220160036A/ko
Priority to JP2022510723A priority patent/JPWO2021193900A1/ja
Priority to AU2021241229A priority patent/AU2021241229A1/en
Priority to US17/907,531 priority patent/US20230144876A1/en
Publication of WO2021193900A1 publication Critical patent/WO2021193900A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/876—Skin, melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

本発明は、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記免疫誘導剤等を提供する。

Description

ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物
　本発明は、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤、それを含む医薬組成物などに関する。
　樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーは、様々な病原体と反応し、サイトカインの産生を誘導し、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進、キラーＴ細胞の活性化等を通して、獲得免疫を誘導することが知られている。一連のＴＬＲファミリーにより認識される病原体の構成成分は多岐にわたるが、その中の１つに、ＴＬＲ９のリガンドである、ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡ（ＣｐＧ　ＤＮＡ）がある。ＣｐＧモチーフは、中心部にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が並び、前後にプリン塩基およびピリミジン塩基が２つずつ並んだ６個の塩基を基本とし、-ＰｕＰｕ-ＣＧ-ＰｙＰｙ-（Ｐｕはプリン塩基を、Ｐｙはピリミジン塩基を表す。）で表される配列で（ヒトの場合には、ＧＴＣＧＴＴもＴＬＲ９に対するリガンド活性を有していることが知られている。）、ほ乳類には少なく、微生物には多く見られる塩基配列である。また、ほ乳類においては、少数存在するＣｐＧモチーフのほとんどがメチル化を受けている。ほ乳類中にほとんど存在しない非メチル化ＣｐＧモチーフは、強力な免疫賦活活性を有している（例えば、非特許文献１～３参照）。エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたＣｐＧ　ＤＮＡは、ファゴソーム様小胞体に存在するＴＬＲ９により認識され、インターフェロン-γ（ＩＦＮ－γ）やインターロイキン－２（ＩＬ－２）といったＴｈ１サイトカイン産生をもたらし、Ｔｈ１反応を強く誘導する。Ｔｈ１反応は、Ｔｈ２反応が優位なアレルギー反応を抑制すると共に、マクロファージや細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化して細胞性免疫による強い抗腫瘍活性を有する。
　ＣｐＧ　ＤＮＡは、感染予防に加え、アレルギー疾患、腫瘍性疾患に対するアジュバントとしても期待されている。ＣｐＧ　ＤＮＡを抗原と共有結合させたコンジュゲートについては、例えば以下の報告がある。
　非特許文献４には、ＣｐＧ　ＤＮＡとオボアルブミン（ＯＶＡ）抗原由来の１８～２４ｍｅｒのペプチドとのコンジュゲートにより、樹状細胞への取り込みおよび抗原提示が促進されたことが記載されている。
　非特許文献５および６には、ＣｐＧ　ＤＮＡとＯＶＡ抗原タンパク質とのコンジュゲートにより、in vitroにおいてＴ細胞活性化が誘導されることが記載されている。また非特許文献５には、in vivoにおいて抗原特異的細胞傷害活性が誘導されたことが記載されている。
　非特許文献７には、ＣｐＧオリゴヌクレオチドと腫瘍関連タンパク質または細胞とのコンジュゲートを作製する方法が記載されている。
　特許文献１には、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と抗原性を有するペプチドとのコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤が開示されており、抗原特異的な高い免疫誘導活性を有することが示されている。
ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３８０９０
Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger. H. Wagner, Adv. Immunol., 73, 329-368 (1999). CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects. M. Krieg, Annu. Rev. Immunol., 20, 709-760 (2002). The discovery of immunostimulatory DNA sequence. S. Yamamoto, T. Yamamoto, and T. Tokunaga, Springer Seminars in Immunopathology, 22, 11-19 (2000). Distinct Uptake Mechanisms but Similar Intracellular Processing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates in Dendritic Cells. Khan S. et al., J. Biol. Chem. 282, 21145-21159 (2007). Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-Antigen Conjugate Enhances Anti-tumor Immunity. Kramer K. et al., Mol. Ther. 25, 62-70 (2017). Comparative Study of 5'- and 3'-Linked CpG-Antigen Conjugates for the Induction of Cellular Immune Responses. Kramer K. et al., ACS Omega 2(1), 227-235 (2017) TLR-9 agonist immunostimulatory sequence adjuvants linked to cancer antigens, Shirota H. and Klinman D. M., Methods Mol. Biol. 1139, 337-344 (2014)
　特許文献１において、本発明者らは、ＯＶＡ由来の抗原性を有するペプチドを用いた研究により、ＣｐＧ　ＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートが高い細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能を有することを示した。その一方、他の抗原ペプチドについて同様のＣｐＧ　ＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートを作製した場合、十分なＣＴＬ誘導能が得られない場合があることが判明した。本発明の目的は、より広範な抗原ペプチドについて、ＣＴＬ活性の誘導が可能な免疫誘導剤等を提供することにある。
　本発明者らは、ＣｐＧ　ＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートにすると十分なＣＴＬ誘導能が得られないペプチドについて研究した結果、コンジュゲート化のためにペプチドのＮ末端にシステイン等のアミノ酸を付加すると、本来ＭＨＣ分子に結合性であったペプチド（ＭＨＣ結合ペプチド）がＭＨＣ分子に結合できなくなることを見出した。さらに、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端にそのままシステイン等のアミノ酸を付加したペプチドではなく、アンカー残基を含まないＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸をシステイン等のアミノ酸と置換したペプチドを用いることにより、高いＣＴＬ誘導能を有するＣｐＧ　ＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートを作製することができることを見出した。本発明者らは、さらに鋭意研究し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記免疫誘導剤。
［２］前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合である、［１］に記載の免疫誘導剤。
［３］前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体である、［１］または［２］に記載の免疫誘導剤。
［４］前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合である、［１］から［３］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［５］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドである、［１］から［４］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［６］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドである、［５］に記載の免疫誘導剤。
［７］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下である、［５］または［６］に記載の免疫誘導剤。
［８］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－２結合ペプチドである、［１］から［４］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［９］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体である、［１］～［８］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［１０］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、１５以上４０以下である、［１］から［９］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［１１］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下である、［１０］に記載の免疫誘導剤。
［１２］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［１３］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［１２］に記載の免疫誘導剤。
［１４］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［１３］に記載の免疫誘導剤。
［１５］前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含む、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　上記の式において、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
　Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
　ｎは、１０以下の自然数を表す。
［１６］前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、［１］から［１５］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［１７］記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、［１］から［１４］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［１８］［１］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、
前記免疫誘導剤。
［１９］［１］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり、
　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合であり、
　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下であり、
　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されており、
　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、
前記免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［２０］アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含む、［１］から［１９］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［２１］［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
［２２］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用である、［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］腫瘍の治療または予防用である、［２１］に記載の医薬組成物。
［２４］患者に対して［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を投与することを含む、感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防方法。
［２５］患者に対して［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を投与することを含む、腫瘍の治療または予防方法。
［２６］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防に使用するための［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［２７］腫瘍の治療または予防に使用するための［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
［２８］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用医薬の製造のための、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤の使用。
［２９］腫瘍の治療または予防用医薬の製造のための、［１］から［２０］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤の使用。
［３０］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［３１］［３０］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、
前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［３２］［３０］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり、
　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合であり、
　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下であり、
　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されており、
　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、
前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　また本発明は、以下の［Ａ１］～［Ａ１９］を提供するものである。
［Ａ１］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ２］前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合である、［Ａ１］に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ３］前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体である、Ａ１またはＡ２に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ４］前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合である、Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ５］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドである、Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ６］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドである、Ａ５に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ７］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下である、Ａ５またはＡ６に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ８］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－２結合ペプチドである、Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ９］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体である、Ａ１～Ａ８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１０］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、１５以上４０以下である、Ａ１からＡ９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１１］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下である、Ａ１０に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１２］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１３］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、Ａ１２に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１４］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、Ａ１３に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１５］前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含む、Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　上記の式において、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
　Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
　ｎは、１０以下の自然数を表す。
［Ａ１６］前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、Ａ１からＡ１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［Ａ１７］前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［Ａ１８］［Ａ１］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、
前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
［Ａ１９］［Ａ１］に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり、
　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合であり、
　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドであり、
　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下であり、
　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されており、
　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、
前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　また本発明は、以下の［Ａ２０］および［Ａ２１］を提供するものである。
［Ａ２０］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤の製造方法であって、
（１）ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体を調製すること、
（２）ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドを調製すること、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、アンカー残基を含まない、および
（３）（１）のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と（２）のペプチドとをスペーサーを介して連結させること、ここで前記スペーサーは、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し、他端側で前記ペプチドと共有結合する、
を含む、方法。
［Ａ２１］免疫誘導剤が、［１］～［２０］、［２６］、および［２７］のいずれか一項に記載の免疫誘導剤である、［Ａ２０］に記載の方法。
　また本発明は、以下の［Ａ２２］および［Ａ２３］を提供するものである。
［Ａ２２］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩の製造方法であって、
（１）ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体を調製すること、
（２）ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドを調製すること、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、アンカー残基を含まない、および
（３）（１）のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と（２）のペプチドとをスペーサーを介して連結させること、ここで前記スペーサーは、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し、他端側で前記ペプチドと共有結合する、
を含む、方法。
［Ａ２３］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩が、［Ａ１］～［Ａ１９］のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩である、［Ａ２２］に記載の方法。
　また本発明は、以下の［ａ１］～［ａ１９］を提供するものである。
［ａ１］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記免疫誘導剤。
［ａ２］前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合である、［ａ１］に記載の免疫誘導剤。
［ａ３］前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体である、［ａ１］または［ａ２］に記載の免疫誘導剤。
［ａ４］前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合である、［ａ１］から［ａ３］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ５］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドである、［ａ１］から［ａ４］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ６］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドである、［ａ５］に記載の免疫誘導剤。
［ａ７］前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下である、［ａ５］または［ａ６］に記載の免疫誘導剤。
［ａ８］前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－２結合ペプチドである、［ａ１］から［ａ４］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ９］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体である、［ａ１］～［ａ８］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ１０］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、１５以上４０以下である、［ａ１］から［ａ９］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ１１］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下である、［ａ１０］に記載の免疫誘導剤。
［ａ１２］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、［ａ１］から［ａ１１］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ１３］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［ａ１２］に記載の免疫誘導剤。
［ａ１４］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［ａ１３］に記載の免疫誘導剤。
［ａ１５］前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含む、［ａ１］から［ａ１４］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　上記の式において、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
　Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
　ｎは、１０以下の自然数を表す。
［ａ１６］前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、［ａ１］から［ａ１５］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［ａ１７］アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含む、［ａ１］から［ａ１６］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［ａ１８］［ａ１］から［ａ１７］のいずれかに記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
［ａ１９］腫瘍治療用である、［ａ１８］に記載の医薬組成物。
　本発明によれば、ＣＴＬ活性の誘導が可能な免疫誘導剤の作製に広範な抗原ペプチドを用いることができる。
実施例１におけるCpG30(S)a-mTRP2pep9（化合物１）のＨＰＬＣ分析におけるクロマトグラムを示す図である。 実施例１におけるCpG30(S)a-mTRP2pep9（化合物１）の質量分析におけるマススペクトルを示す図である。 実施例２（２）におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例２（３）におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例２（４）におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例２（５）におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例３におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例４におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例４におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 参考例１におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 参考例２におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例５におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例６におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例７におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例９および参考例３におけるＣＤ４+　Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の測定結果を示す図である。 参考例３におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。 実施例９および参考例３におけるＣＤ４+　Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の測定結果を示す図である。 実施例１０におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
　本発明は、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤（以下、本発明の免疫誘導剤とも称する。）を提供する。
　本発明の免疫誘導剤におけるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなる。
　「ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体」は、１または複数（好ましくは複数、例えば２、３、４、５または６）のＣｐＧモチーフを含む限りにおいて、任意の塩基配列および塩基数を有するポリヌクレオチドまたはその誘導体を特に制限なく用いることができる。ＣｐＧモチーフの具体例としては、ＡＧＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴ等が挙げられる。異なる配列のＣｐＧモチーフが複数含まれていてもよい。ポリヌクレオチドに含まれるＣｐＧモチーフの数は特に制限されないが、１から６のＣｐＧモチーフを含んでいることが好ましく、２から４のＣｐＧモチーフを含んでいることがさらに好ましい。前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはホスホロチオエート修飾されたＤＮＡ誘導体であることが好ましいが、一部にＲＮＡまたはＲＮＡ誘導体が含まれていてもよい。ＲＮＡまたはＲＮＡ誘導体が含まれる場合、それらの含量が、塩基数の割合で２０％以下（具体的には、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％以下）であることが好ましい。
　ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体に含まれる塩基数は、１５～４０（具体的には、１５、１６，１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０）であることが好ましく、２０～３０（具体的には、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０）であることがより好ましい。好ましいポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基配列の具体例としては、下記表１に示されるものが挙げられる。表１中、下線の配列はＣｐＧモチーフを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　ポリヌクレオチドは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、生体内での安定性を向上させるために、ポリヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド誘導体を用いてもよい。ポリヌクレオチド誘導体は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ生体内での安定性を高めるための修飾として当技術分野において知られている、任意の修飾を含むものであり得る。ポリヌクレオチド誘導体の例としては、リボヌクレオチドの２’位のヒドロキシル基の全部または一部がフッ素またはメトキシ基で置換されているもの、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のリン酸ジエステル結合の全部または一部がホスホロチオエート結合で置換されているもの等が挙げられる。ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部がホスホロチオエート結合で置換されている場合、リン酸ジエステル結合の５０％以上（具体的には、５０、６０、７０、８０または９０％以上）がホスホロチオエート結合で置換されていることが好ましく、９０％以上（具体的には、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上）がホスホロチオエート結合で置換されていることがより好ましく、実質的にすべてがホスホロチオエート結合で置換されていてもよい。リン酸ジエステル結合は、すべてホスホロチオエート結合で置換されていてもよい。ホスホロチオエート結合で置換されるリン酸ジエステル結合の位置は特に制限されず、連続した複数のリン酸ジエステル結合が置換されていてもよく、或いはホスホロチオエート結合が互いに隣り合わないように置換されていてもよい。
　ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体がスペーサーと結合する位置は特に限定されず、例えば、５'末端または３’末端であり得る。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体とスペーサーとの共有結合には、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体に存在する官能基をそのまま、或いは化学修飾により活性化したものを利用することができる。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、その５'末端または３'末端の水酸基の酸素原子上で、スペーサーと結合していることが好ましい。
　ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、既知の化学合成法（例えばリン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、Ｈ－ホスホネート法など）を用いて合成することができる。市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成してもよい。
　本発明の免疫誘導剤における「ペプチド」は、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない。
　本発明において「ＭＨＣ結合ペプチド」とは、トリミングなどの追加のプロセシングなしで、ＭＨＣ分子（すなわち主要組織適合遺伝子複合体）に結合し、Ｔ細胞に抗原として提示され得るペプチドをいう。ＭＨＣ分子には、ＭＨＣ－１分子（ＭＨＣクラスＩ分子ともいう。）およびＭＨＣ－２分子（ＭＨＣクラスＩＩ分子ともいう。）が含まれる。またヒトにおけるＭＨＣ－１分子は、ＨＬＡ分子と呼ばれ、多くのアレルが存在する。ＭＨＣ結合ペプチドは、ＭＨＣ－１分子によって抗原提示されるペプチド（すなわちＭＨＣ－１結合ペプチド）およびＭＨＣ－２分子によって抗原提示されるペプチド（すなわちＭＨＣ－２結合ペプチド）のいずかであることが好ましく、ＭＨＣ－１結合ペプチドであることがより好ましく、ＨＬＡ－Ａ分子によって抗原提示されるペプチド（すなわちＨＬＡ－Ａ結合ペプチド）またはＨＬＡ－Ｂ分子によって抗原提示されるペプチド（すなわちＨＬＡ－Ｂ結合ペプチド）であることがさらにより好ましい。
　ＭＨＣ結合ペプチドは、食物アレルギー等のアレルギーの原因となるタンパク質、細菌、ウイルス等の病原体、腫瘍細胞等を起源とするタンパク質に由来するものであり得る。ＭＨＣ結合ペプチドとしては、例えば、パブリックデータベースSYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm；Immunogenetics (1999) 50:213-219参照）に収載されているペプチド、Immunogenetics (1995) 41:178-228の表に記載されているペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
　ＭＨＣ－１結合ペプチドの具体例としては、ＯＶＡペプチド１（オボアルブミン（ＯＶＡ；GenBankアクセッション番号：CAA23716.1）の２５８～２６５番目のアミノ酸配列からなるペプチド、SIINFEKL（配列番号４１））、ＴＲＰ２－９（ｍＴＲＰ２（GenBankアクセッション番号：CAA44951.1）の１８０～１８８番目のアミノ酸配列からなるペプチド）、ｈＧＰ１００－９（ｈＧＰ１００（GenBankアクセッション番号：AAC60634.1）の２５～３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド）などが挙げられる。
　ＭＨＣ－２結合ペプチドの具体例としては、ＯＶＡペプチド２（ＯＶＡの３２４～３４０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、ISQAVHAAHAEINEAGR（配列番号４２））などが挙げられる。
　ＭＨＣ分子には、ペプチド収容溝内にＭＨＣ結合ペプチドと直接相互作用するポケットと呼ばれる部位がある。ＭＨＣ結合ペプチドにおいて、特定のポケットと相互作用する残基は、アンカー残基またはアンカーアミノ酸と呼ばれ、結合するＭＨＣ分子のタイプ毎に位置が異なり得る。ＭＨＣ分子のタイプ毎のアンカー残基の位置および共通モチーフは、例えば、パブリックデータベースMHC Motif Viewer（http://www.cbs.dtu.dk/biotools/MHCMotifViewer/Home.html；Immunogenetics (2008) 60:759-765参照）により確認することができる。例えば、ヒトのＭＨＣ－１であるＨＬＡ－ＡやＨＬＡ－Ｂでは、Ｎ末端側から２番目および９番目のアミノ酸がアンカー残基であることが知られている。
　ＭＨＣ結合ペプチドには、上記のような天然に存在し得るペプチド（野生型ペプチド）に加えて、例えば非天然型のアミノ酸を含む、天然に存在しないペプチドも含まれる。そのようなペプチドとしては、例えば、ＭＨＣ分子との結合性を高めるためにアンカー部位が他のアミノ酸（非天然アミノ酸も含む。）に置換された改変ペプチド（ヘテロクリティックペプチドと呼ばれる。）が挙げられる（Front. Immunol. 6:377 (2015)およびJ Immunol. 174(8):4812-4820 (2005)参照）。
　ＭＨＣ結合ペプチドのアミノ酸長は、特に限定されず、ＭＨＣ分子のタイプによって異なり得るが、例えば５以上３０以下であり得る。ＭＨＣ－１分子に結合するペプチドの長さはある程度固定されており、通常８～１１アミノ酸長である。したがって、本発明において、ＭＨＣ結合ペプチドがＭＨＣ－１結合ペプチドである場合には、そのアミノ酸長は８以上１１以下であることが好ましく、より好ましくは８、９または１０であり、さらに好ましくは９または１０である。
　本発明者らは、コンジュゲート化のためにＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端にシステインなどのアミノ酸を付加すると、ＭＨＣ分子に結合できなくなる場合があることを見出した（実施例３）。ＭＨＣ－１分子による抗原ペプチドの提示には、小胞体アミノペプチダーゼ（ＥＲＡＰ）が関与することが知られており、抗原ペプチド前駆体は、通常、ＥＲＡＰによるＮ末端からのトリミングを受けてＭＨＣ－１への結合に適した長さとなる。しかし、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートから生じたペプチドでは、このようなトリミングが適切になされず、ＭＨＣ分子のペプチド収容溝への結合性を有する本来のペプチドの構造となることができない可能性が考えられる。それに対して、アンカー残基を残しながら、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸を、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換したペプチドは、ＭＨＣ－１分子に結合することができる。また当該ペプチドを用いて作製したポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、十分なＣＴＬ誘導能を有する。
　反応性官能基を有するアミノ酸と置換されるＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端のアミノ酸の数は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない限り特に限定されず、ＭＨＣ分子のタイプに応じて適宜設定することができる。例えば、ＭＨＣ－１分子の場合、置換されるアミノ酸の数は、４つ以下（４つ、３つ、２つ、または１つ）であり得、１つであることが好ましい。一実施形態において、ＭＨＣ結合ペプチドがＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドである場合、アンカー残基がＮ末端から２番目の位置に存在することから、置換されるアミノ酸の数は１つであり得る。
　「前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸」とは、スペーサーとエステル結合、アミド結合、リン酸エステル結合などの共有結合を形成し得る反応性官能基を有するアミノ酸であり、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸のいずれであってもよい。スペーサーとの共有結合は、生体内環境中で切断可能な共有結合であることが好ましい。そのような共有結合としては、例えばジスルフィド結合などの、細胞内の還元的な環境において切断される結合が挙げられる。また、エステラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、カテプシン等）、ヌクレアーゼなどの細胞内酵素で特異的に切断される、エステル結合、アミド結合（例えば、カテプシン感受性ペプチドとのアミド結合等）、リン酸ジエステル結合なども例として挙げられる。より好ましい実施形態として、共有結合はジスルフィド結合であり、反応性官能基はチオール基であり得る。この場合、「前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸」は、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり得る。チオール基を有するシステイン類縁体とは、側鎖にチオールを有するアミノ酸であり、側鎖の構造は特に限定されない。チオール基を有するシステイン類縁体としては、例えばホモシステイン（CAS No: 6027-13-0）、ペニシラミン（β,β－ジメチルシステイン; CAS No: 1113-41-3）、β－メチルシステイン（CAS No: 29768-80-7）、および４－メルカプト－ノルバリン（CAS No: 2351397-00-5）が挙げられる。
　本発明の免疫誘導剤におけるペプチドは、ペプチド合成等の任意の公知の方法を用いて作製することができる。
　本発明の免疫誘導剤における「スペーサー」は、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体およびペプチドと共有結合し得る構造であればよく、例えば、アルキレン基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。スペーサーは、下記の式で表されるリン酸ジエステル構造またはホスホロチオエート構造を含む繰り返し単位を含んでいてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記の式において、Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨ、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、ｎは、１０以下の自然数を表す。
　これらの繰り返し単位は、ヌクレアーゼによる加水分解を受けないため、Ｘが酸素原子であっても生体内での安定性が大きく低下することはない。例えば、Ｒが（ＣＨ2）3Ｏである場合、繰り返し単位のサイズがリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのサイズとほぼ等しくなるため、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の一部をこのスペーサーで置換することによる生産コストの低減が期待できる。スペーサーの具体例としては、下記のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　スペーサーのより好ましい例としては、下記のいずれかの構造を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　別の態様において、スペーサーのより好ましい例としては、下記のいずれかの構造を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　スペーサーとポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との結合形成、およびスペーサーとペプチドとの結合形成に使用される反応性官能基の組み合わせの例としては、エステル結合、アミド結合、リン酸エステル結合等を形成する反応性官能基の組み合わせに加え、例えば、バイオチップ表面への生体分子の固定に用いられる反応性官能基の組み合わせが挙げられ、より具体的には、下記に示すものが挙げられる。
（ａ）アルキンとアジド化合物
　アルキンとアジド化合物（アジ化物）は、下記に示すような付加環化反応（フイスゲン反応）により、１，２，３－トリアゾール環を形成する。両者は、生体分子を含む多くの有機化合物に導入可能な安定な官能基であり、水を含む溶媒中でも迅速かつほぼ定量的に反応し、殆ど副反応を伴わず、余分な廃棄物を生成しないため、いわゆる「クリックケミストリー」の中心的な反応として、生化学の分野で広く用いられている。アルキン誘導体およびアジド基は、任意の公知の方法を用いて、抗原性を有するペプチドまたはポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。アルキン誘導体としては、プロパルギルアルコール、プロパルギルアミン等の反応性官能基を有するものが容易に入手でき、これらをカルボキシル基やヒドロキシル基等の反応性官能基と直接反応させ、或いはカルボニルジイミダゾール等と共に反応させ、生成するアミド結合、エステル結合、ウレタン結合等を介してアルキン誘導体を導入することができる。アジド基についても、任意の公知の方法を用いて、抗原性を有するペプチドまたはポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。なお、フイスゲン反応は銅触媒の存在下で行われるが、抗原性を有するペプチドおよびリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合等の含硫黄官能基で置換されたポリヌクレオチド誘導体には、銅イオンに配位する硫黄原子が存在するため、銅の触媒活性が低下するおそれがある。反応率を向上させるために過剰量の銅を添加することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（ｂ）マレイミドまたはビニルスルホンとチオール基
　電子求引性のカルボニル基またはスルホン基に隣接する二重結合を有するマレイミドまたはビニルスルホンは、中性付近のｐＨで、下記に示すように、チオール基との付加反応（マイケル付加反応）により、安定なチオエーテル誘導体を生成する。適当なスペーサーを有するマレイミドおよびビニルスルホン誘導体が市販されているため、抗原性を有するペプチドまたはポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体にこれらの官能基を導入することは容易である。抗原性を有するペプチドにチオール基を導入する場合、システインを含む抗原性を有するペプチドの場合には、システイン残基側鎖のチオール基を利用できる。ただし、システインは、存在比が低いアミノ酸であるため、抗原性を有するペプチドのＮ末端側にシステインを導入したものを用いる。チオール基を含むポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体としては、これらの５'末端のヒドロキシル基をチオール基に変換したチオール化ポリヌクレオチドが用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（ｃ）ペプチドのチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基
　上述のとおり、ペプチドのＮ末端に導入したチオール基と、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基とを反応させ、ジスルフィド基を形成させる。ジスルフィド結合は、還元剤の存在下で切断されるため、上両者に比べ、安定性の点で劣るが、生体内の還元的環境下で切断されるという利点がある。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体へのチオール基の導入は、任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、下式に示すような、アミノ化ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ω－（２－ピリジルジチオ）脂肪酸のＮ－スクシイミジルエステルとの反応が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、少なくとも前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が生体環境中で切断可能な共有結合であることが好ましい。したがって、上記（ａ）～（ｃ）のうち、生体内で容易に切断可能なペプチドのチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基との組み合わせによるジスルフィド結合が好ましい。この場合、ジスルフィド結合は、スペーサーとペプチドとの間の共有結合である。
　本発明の免疫誘導剤におけるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの具体例としては、下記実施例１に記載のCpG30(S)a-mTRP2pep9（化合物1）、CpG20(S)a-mTRP2pep9（化合物2）、およびCpG30(S)a-hGP100pep9（化合物3）、ならびに下記の化合物が挙げられる。なお、下記式中、塩基配列で表された部分は、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されたＤＮＡ誘導体を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　また本発明の免疫誘導剤におけるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの具体例としては、下記実施例５に記載のISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、およびODN1826-mTRP2pep9、実施例６に記載のCpG30(S)a2-OVApep8およびCpG30(S)a2-mTRP2pep9、実施例９に記載のCpG30(S)a2-OVA2-15が挙げられる。
　一態様において、本発明の免疫誘導剤に含まれる１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、２つ以上のペプチドと結合していてもよい。すなわち、本発明の免疫誘導剤には、１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と２つ以上のペプチドとを含み得る。
　ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と２つ以上のペプチドとは、スペーサーを介して結合していればよい。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、例えば、それぞれ別々のスペーサーを介して２つ以上のペプチドと結合することができる。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、枝分かれした１つのスペーサーを介して２つ以上のペプチドと結合していてもよい。１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、これらの結合様式の組み合わせにより、３つ以上のペプチドと結合していてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体部分がスペーサーと結合する位置は特に限定されず、例えば、５'末端および３’末端から選択され得る。
　２つ以上のペプチドは、同じペプチドであっても異なるペプチドであってもよいが、全て同じであることが好ましい。１つのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体に結合するペプチドの数は特に限定されず、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上であり得る。
　一態様において、本発明の免疫誘導剤は、そのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体部分において、当該部分に含まれる塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体（以下、相補鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体とも言う。）と二本鎖を形成していてもよい。
　相補鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、本発明の免疫誘導剤におけるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体部分と同様の方法により合成することができる。相補鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体は、生体内での安定性、毒性、体内動態等の特性の改善のために、修飾されていてもよい。そのような修飾としては、例えば、脂質修飾が挙げられる（WO2017/057540参照）。５’または３’末端の一方または両方に脂質修飾を有する化合物は、実施例８に記載の方法により合成することができる。
　本発明の免疫誘導剤のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体部分と相補鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との二本鎖形成は、一般的なアニーリングの方法に従って行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートと相補鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体とを混合し、一本鎖状態となるように加温したのち、室温まで自然冷却させることにより、二本鎖を形成させることができる。
　本発明の免疫誘導剤の有効成分として用いられるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの医薬上許容される塩としては、例えば、アルカリ金属（カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等を含む）、有機アミン（トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン等）の塩、酸付加物塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；および、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸（メシル酸）塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸塩を含む）が挙げられる。
　本発明の免疫誘導剤の有効成分として用いられるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩は、溶媒和物（水和物を含む）として存在することもできる。溶媒和物としては、医薬的に許容し得るものであれば特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール和物等が挙げられる。
　本発明の免疫誘導剤は、アジュバントとして免疫賦活活性を有する物質を更に含んでいてもよい。アジュバントは、限定はされないが、自然免疫を活性化する物質である。アジュバントは、好ましくは自然免疫レセプターのアゴニストである。自然免疫レセプターアゴニストとしては、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト）、ＲＬＲ（retinoic acid-inducible gene I (RIG-1)-like receptors）アゴニスト、ＳＴＩＮＧ（stimulator of Interferon genes）アゴニスト、ＮＬＲ（nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors）アゴニスト、ＣＬＲ（C-type lectin receptors）アゴニストなどが例示される。ＴＬＲアゴニストとしては、例えば、リポペプチド、Ｐｏｌｙ　ＩＣ　ＲＮＡ、イミキモド、レシキモド、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＣｐＧ－ＯＤＮなどが挙げられる。ＲＬＲアゴニストとしては、ｐｐｐＲＮＡ、Ｐｏｌｙ　ＩＣ　ＲＮＡなど、ＳＴＩＮＧアゴニストとしてはｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰなど、ＮＬＲアゴニストとしてはｉＥ－ＤＡＰ、ＦＫ５６５、ＭＤＰ、ムラブチドなど、ＣＬＲアゴニストとしてはベータグルカン、トレハロース６、６'－ジミコレートなどが挙げられる。アジュバントは、好ましくはＴＬＲアゴニストであり、より好ましくはＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニストまたはＴＬＲ９アゴニストであり、さらにより好ましくはイミキモド、レシキモド、ＭＰＬまたはＣｐＧ－ＯＤＮである。ある態様において、アジュバントは、イミキモド、ＭＰＬまたはＣｐＧ－ＯＤＮである。アジュバントとしては、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートに導入されたペプチド等に応じて適宜選択され得るが、例えば、ＣｐＧ　ＤＮＡ等であってもよく、国際公開第２０１５／１１８７８９号に記載のポリヌクレオチド／β－１，３－グルカン複合体であってもよい。
　本発明の免疫誘導剤は、
（１）ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体を調製すること、
（２）ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドを調製すること、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、アンカー残基を含まない、および
（３）（１）のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と（２）のペプチドとをスペーサーを介して連結させること、ここで前記スペーサーは、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し、他端側で前記ペプチドと共有結合する、
を含む方法により、製造され得る。したがって、一態様において、本発明は、上記工程（１）～（３）を含む、本発明の免疫誘導剤の製造方法を提供する。本態様における各用語は、本明細書中に記載された用語の説明に基づいて解釈される。本方法により、広範な抗原ペプチドを用いて、ＣＴＬ活性の誘導が可能な免疫誘導剤を製造することができる。
　また本発明は、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を提供する。本態様における各用語は、本明細書中に記載された用語の説明に基づいて解釈される。当該ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩は、本発明の免疫誘導剤における有効成分として使用され得る。
　また当該ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩は、上記本発明の免疫誘導剤の製造方法における工程（１）～（３）を含む方法により製造され得る。したがって、一態様において、本発明は、上記工程（１）～（３）を含む、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩の製造方法を提供する。本態様における各用語は、本明細書中に記載された用語の説明に基づいて解釈される。本方法により、広範な抗原ペプチドを用いて、ＣＴＬ活性の誘導が可能な免疫誘導剤の有効成分となり得るポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を製造することができる。
　本発明はまた、本発明の免疫誘導剤を含む医薬組成物を提供する（以下、本発明の医薬組成物ともいう。）。本発明の医薬組成物の製造には、有効成分としてのポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩に加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤および添加物）および製剤方法を用いることができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン等のアミノ酸類、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノースまたはデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸または過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコールまたはポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチンまたはコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール、ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、および／または薬学上の補助剤。当業者であれば、適用疾患、適用投与経路などに応じて好適な医薬組成物の組成を適宜決定することができる。
　本発明の医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含し得る。このような注射剤は、公知の方法に従って調製することができる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の免疫誘導剤を、通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解または懸濁することによって調製することができる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等を使用することができる。このような水性溶媒のｐＨは５～１０が挙げられ、好ましくは６～８である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。注射剤は、凍結乾燥製剤としてもよい。注射剤の他には、経皮や粘膜吸収用の剤形（液剤スプレー、軟膏、ゲル、ローション、パッチ）、皮下局所徐放用の剤形（ナノゲルや生分解性マイクロ／ナノカプセルなどを含む懸濁液、温度応答性ゲル）、皮膚透過用経皮デバイス込みの製剤（イオントフォレシス、マイクロニードル）、粉末剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、エアゾールやドライパウダー等の吸入剤、等の形態をとることができる。
　本発明の医薬組成物は、ヒトまたは温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口および非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下、皮内および筋肉内注射、腹腔内投与、点滴、静脈内投与、口腔粘膜への投与、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の有効成分であるポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の種類、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１～約１００ｍｇ、好ましくは約１．０～約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０～約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１～約３０ｍｇ、好ましくは約０．１～約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１～約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。
　また、本発明の医薬組成物を対象に投与する頻度は、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の種類、投与方法等を考慮して、当業者が容易に決定することができる。例えば、本発明の組成物をワクチンとして投与する場合、通常のワクチン製剤と同様、通常、１～数回／日で、１日のみまたは１～数週間の間隔で数回投与することができる。投与は、経過を見ながら行うことが好ましく、例えば、少なくとも約１週間の間隔をあけて追加免疫を行うことができる。追加免疫を行うことによって、ブースター効果が得られることが期待され、より高い感染防御などの効果を奏することができる。
　本発明の医薬組成物を、病原体感染症や癌の患者、癌や病原体感染症に罹患する可能性のある対象に投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やヘルパーＴ細胞を抗原特異的に活性化させ、温血動物（好ましくは、ヒト）の防御免疫反応を誘導することにより、該感染症や癌を予防・治療することが出来る。また、本発明の医薬組成物をアレルギー性疾患の患者に投与することにより、疾患の原因となるアレルギー抗原に対する過剰な免疫応答を抑制する抗原特異的免疫療法となる。即ち、本発明の医薬組成物は、上記感染症、癌、アレルギー性疾患等の疾患の予防または治療のためのワクチンとして有用である。本発明において、用語「腫瘍」および「癌」は交換可能に使用される。また、本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、癌、悪性新生物、癌腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「癌」と表現する場合がある。また、用語「腫瘍」および「癌」には、骨髄異型性症候群等、場合によっては前癌段階に区分される病態も含まれる。
　治療または予防の対象となる腫瘍の種類は本発明の医薬組成物に感受性が確認される腫瘍であれば特に限定されないが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌等を含む）、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮体癌、腎癌、肝細胞癌、甲状腺癌、食道癌、骨肉腫、皮膚癌（メラノーマ等を含む）、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、頭頚部癌、睾丸腫瘍、大腸癌、血液癌（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等を含む）、網膜芽細胞腫、膵臓癌等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、他の抗腫瘍剤と組み合わせて用いてもよい。例えば、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（Biological Response Modifier：生物学的応答性制御物質）、ホルモン、ビタミン、抗腫瘍性抗体、分子標的薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤その他の抗腫瘍剤等が挙げられる。
　より具体的に、抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ－アドリアマイシン、４' －エピドキソルビシンもしくはエピルビシン、クロモマイシンＡ３またはアクチノマイシンＤ等が挙げられる。
　抗腫瘍性植物成分およびそれらの誘導体としては、例えば、ビンデシン、ビンクリスチンもしくはビンブラスチン等のビンカアルカロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル等のタキサン類、またはエトポシドもしくはテニポシド等のエピポドフィロトキシン類が挙げられる。
　ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子またはインドメタシン等が挙げられる。
　ホルモンとしては、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メペチオスタンまたはメドロキシプロゲステロン等が挙げられる。
　ビタミンとしては、例えば、ビタミンＣまたはビタミンＡ等が挙げられる。
　抗腫瘍性抗体および分子標的薬としては、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマム、ニモツズマブ、デノスマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、ラムシルマブ、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、コビメチニブ、パゾパニブ、パルボシクリブ、パノビノスタット、ソラフェニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、キザルチニブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イクサゾミブ、ミドスタウリン、ギルテリチニブ等が挙げられる。
　アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ－オキシド、ベンダムスチンもしくはクロラムブチル等のアルキル化剤、カルボコンもしくはチオテパ等のアジリジン系アルキル化剤、ディブロモマンニトールもしくはディブロモダルシトール等のエポキシド系アルキル化剤、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、ストレプトゾシン、クロロゾトシンもしくはラニムスチン等のニトロソウレア系アルキル化剤、ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、テモゾロミドまたはダカルバジン等が挙げられる。
　代謝拮抗剤としては、例えば、６－メルカプトプリン、６－チオグアニンもしくはチオイノシン等のプリン代謝拮抗剤、フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン若しくはエノシタビン等のピリミジン代謝拮抗剤、メトトレキサートもしくはトリメトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤等が挙げられる。
　その他の抗腫瘍剤としては、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、トレミフェンクエン酸塩、フルベストラント、ビカルタミド、フルタミド、ミトタン、リュープロレリン、ゴセレリン酢酸塩、カンプトテシン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、Ｌ－アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィラン、ピシバニール、プロカルバジン、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレア、ウベニメクス、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、エリブリン、トレチノインまたはクレスチン等が挙げられる。
　治療または予防の対象となる感染症の種類としては、ウイルス、真菌、細菌などの病原体による感染症が例示される。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＲＳウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、日本脳炎ウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱病ウイルスなどが例示される。細菌としては、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、インフルエンザ菌、結核菌、肺炎球菌、ヘリコバクター・ピロリ、炭疽菌、腸チフス菌、髄膜炎菌、赤痢菌、コレラ菌などが挙げられる。真菌としては、カンジダ真菌、ヒストプラズマ真菌、クリプトコッカス真菌、アスペルギルス真菌などが例示される。本発明の医薬組成物は、これらの感染症の既存の治療薬と組み合わせて用いてもよい。
　治療または予防の対象となるアレルギー性疾患の種類としては、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、食物アレルギー、動物アレルギー、アナフィラキシー等が例示される。
　本発明の医薬組成物が、アジュバントや他の医薬と組み合わせて投与される場合、ある一定期間において、被投与対象が、両薬剤をその体内に取り込むことを意味する。両薬剤が単一製剤中に含まれた製剤が投与されてもよく、またそれぞれが別々に製剤化され、別々に投与されても良い。別々に製剤化される場合、その投与の時期は特に限定されず、同時に投与されてもよく、時間を置いて異なる時間に、または、異なる日に、投与されても良い。それぞれ異なる時間または日に投与される場合、その投与の順番は特に限定されない。通常、それぞれの製剤は、それぞれの投与方法に従って投与されるため、それらの投与は、同一回数となる場合もあり、異なる回数となる場合もある。また、それぞれが別々に製剤化される場合、各製剤の投与方法（投与経路）は同じであってもよく、異なる投与方法（投与経路）で投与されてもよい。また、両薬剤が同時に体内に存在する必要は無く、ある一定期間（例えば１ヶ月間、好ましくは１週間、さらに好ましくは数日間、さらにより好ましくは１日間）の間に体内に取り込まれていればよく、いずれかの投与時にもう一方の有効成分が体内から消失していてもよい。
　また一態様において、本発明は、本発明の医薬組成物の治療または予防有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。疾患としては、例えば、病原体感染症、腫瘍、およびアレルギー性疾患が挙げられ、好ましくは腫瘍である。
　本発明における「治療または予防有効量」とは、特定の疾患または症状、投与形態および投与径路につき治療または予防効果を奏する量を意味し、対象の種、疾患または症状の種類、症状、性別、年齢、持病、その他の要素に応じて適宜決定される。
　本願は、以下の発明も提供する。
［Ｂ１］ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
　前記ペプチドは、ＭＨＣ－２結合ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の１または複数の連続するアミノ酸が削除されており、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸が付加されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ－２結合のためのアンカー残基を含まない、前記免疫誘導剤。
［Ｂ２］前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合である、［Ｂ１］に記載の免疫誘導剤。
［Ｂ３］前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体である、［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の免疫誘導剤。
［Ｂ４］前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合である、［Ｂ１］から［Ｂ３］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ５］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体である、［Ｂ１］から［Ｂ４］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ６］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、１５以上４０以下である、［Ｂ１］から［Ｂ５］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ７］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下である、［Ｂ６］に記載の免疫誘導剤。
［Ｂ８］前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、［Ｂ１］から［Ｂ７］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ９］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［Ｂ８］に記載の免疫誘導剤。
［Ｂ１０］前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、［Ｂ９］に記載の免疫誘導剤。
［Ｂ１１］前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含む、［Ｂ１］から［Ｂ１０］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　上記の式において、
　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
　Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
　ｎは、１０以下の自然数を表す。
［Ｂ１２］前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、［Ｂ１］から［Ｂ１１］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 ［Ｂ１３］
　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、［Ｂ１］から［Ｂ１０］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 ［Ｂ１４］アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含む、［Ｂ１］から［Ｂ１３］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ１５］［Ｂ１］から［Ｂ１４］のいずれかに記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
［Ｂ１６］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用である、［Ｂ１５］に記載の医薬組成物。
［Ｂ１７］患者に対して［Ｂ１］から［Ｂ１４］のいずれかに記載の免疫誘導剤を投与することを含む、感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防方法。
［Ｂ１８］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防に使用するための［Ｂ１］から［Ｂ１４］のいずれかに記載の免疫誘導剤。
［Ｂ１９］感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用医薬組成物の製造のための、［Ｂ１］から［Ｂ１４］のいずれかに記載の免疫誘導剤の使用。
　以下の説明において、上記の[Ｂ１]から[Ｂ１９]の発明を、本発明Ｂと呼ぶ。本発明Ｂにおける各用語は、ＭＨＣ－２結合ペプチドを用いる発明として矛盾しない限り、本明細書中に記載された用語の説明に基づいて解釈される。
　本発明Ｂにおいて、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートに含まれるペプチドは、ＭＨＣ－２結合ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の１または複数の連続するアミノ酸が削除されており、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸が付加されたペプチドである。削除されるアミノ酸の数は、ＭＨＣ－２結合のためのアンカー残基を含まない限り特に限定されず、元となるＭＨＣ－２結合ペプチドの長さおよびアンカー残基の位置に応じて、適宜設定することができる。前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端に付加され得る。
　本発明Ｂにおいて、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートに含まれるペプチドのアミノ酸長は、特に限定されず、例えば８以上３０以下であり得る。
　本発明Ｂにおける免疫誘導剤の具体例としては、例えば、下記実施例９に記載のCpG30(S)a2-OVA2-15が挙げられる。
　本発明Ｂによれば、より短いペプチドを用いてポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを作製できるため、より物性および／又は経済性に優れた医薬組成物を提供できる。
　次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。なお、本実施例において、「ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）」は、ＣｐＧモチーフを含む塩基配列を有し、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合で置換されたＤＮＡ誘導体（ポリヌクレオチド誘導体の一例）を示す。実施例において、ポリヌクレオチド誘導体は、一文字塩基配列表記および左側が５'末端側（右側が３'末端側）となるよう表記し、ペプチドは一文字表記および左側がＮ末端側（右側がＣ末端側）となるよう表記されている。一文字塩基配列表記したポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合はすべてホスホロチオエート結合で置換されており、また末端構造は、スペーサーと結合している場合は末端ヌクレオシドの５'または３'水酸基の酸素原子までを、スペーサーと結合していない場合は末端ヌクレオシドの５'または３'水酸基（水素原子まで含む）を意味する。また、本実施例におけるＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートは、トリエチルアミンおよび酢酸が付加した塩として調製される。
実施例１：ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの調製
（１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ホスホロアミダイト法（例えば、Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)）を用いて行った。アミノ基修飾を持つＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ssH Amino Linker (Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949 (2008))を用いて行った。これらの合成には、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用した。
　合成したＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の塩基配列を以下に示す。
　ＣｐＧ３０ａ：５’－ＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ－３’（表１のK3-30(a)；配列番号６）
　ＣｐＧ２０ａ：５’－ＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ－３’（表１のK3；配列番号１）
　得られたアミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）は、５'末端に下記の式で表される構造を有する。以下、５'末端に下記の式で表される構造を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体のうち、配列番号６の配列を有するものを「ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ」と称し、配列番号１の配列を有するものを「ＣｐＧ２０（Ｓ）ａ」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　さらに、アミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）と、スクシイミジル６－［３'－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）とを１：３０モル比でリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合し、４０℃で３時間静置した後、ＮＡＰ－５カラムを用いてＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）を精製した。
　なお、下記の式で表される構造を、以下「ｓｓＨアミノリンカー」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
（２）Ｎ末端修飾ペプチドの合成
　ペプチドは、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用して合成した。
　合成したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　Ｃ－ＯＶＡ８：ＣＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３０）
　Ｃ－ＴＲＰ２－９：ＣＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３１）
　Ｃ－ＴＲＰ２－８：ＣＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３２）
　Ｃ－ｇｐ１００－９：ＣＫＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号３３）
　Ｃ－ｇｐ１００－８：ＣＶＰＲＮＱＤＷＬ（配列番号３４）
　ＣＭ－ＴＲＰ２－９：ＣＭＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３５）
　Ｃ－ＴＲＰ２－１３：ＣＦＡＮＡＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３６）
　Ｃ－ＴＲＰ２－１１：ＣＮＡＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３７）
　Ｃ－ＯＶＡ８は、オボアルブミン（ＯＶＡ；GenBankアクセッション番号：CAA23716.1）の２５８～２６５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＯＶＡペプチド１ともいう。）のＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＴＲＰ２－９は、メラノーマ関連抗原として知られているｍＴＲＰ２（ｍｏｕｓｅ　Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２；GenBankアクセッション番号：CAA44951.1）の１８０～１８８番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＴＲＰ２－９ともいう。）のＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＴＲＰ２－８は、ｍＴＲＰ２の１８１～１８８番目のアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加した配列からなるペプチドである。
　Ｃ－ｇｐ１００－９は、メラノーマ関連抗原として知られているｈＧＰ１００（ｈｕｍａｎ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　１００；GenBankアクセッション番号：AAC60634.1）の２５～３３番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ｈＧＰ１００－９ともいう。）のＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ｇｐ１００－８は、ｈＧＰ１００の２６～３３番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　ＣＭ－ＴＲＰ２－９は、ｍＴＲＰ２の１８０～１８８番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインおよびメチオニンを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＴＲＰ２－１３は、ｍＴＲＰ２の１７６～１８８番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＴＲＰ２－１１は、ｍＴＲＰ２の１７８～１８８番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
（３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１）で合成したＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）１ｍｏｌと、（２）で合成したペプチド２５ｍｏｌとを、３０％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）水溶液中で混合し、４０℃で３時間静置した後、下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかの条件によるＨＰＬＣでＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを分取した。各コンジュゲートの分取に使用したＨＰＬＣ条件および保持時間を表２に示す。
＜ＨＰＬＣ条件（Ａ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール、８ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ液をメタノールとし、カラムはＸ－Ｂｒｉｄｇｅ　Ｃ１８　２．５μｍ　４．６*７５ｍｍ（Waters Corporation）を用い、カラム温度６０℃、流速１ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：９５％　　Ｂ：　　５％
　　～２０分　　　　Ａ：７０％　　Ｂ：　３０％
＜ＨＰＬＣ条件（Ｂ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール、８ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ液をメタノールとし、カラムはＸ－Ｂｒｉｄｇｅ　Ｃ１８　２．５μｍ　４．６*７５ｍｍ（Waters Corporation）を用い、カラム温度６０℃、流速１ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：９５％　　Ｂ：　　５％
　　～２５分　　　　Ａ：６０％　　Ｂ：　４０％
＜ＨＰＬＣ条件（Ｃ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ；ｐＨ　７．０）、Ｂ液をアセトニトリルとし、カラムはＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｐｌｕｓ　Ｃ１８（Agilent Technologies）を用い、カラム温度４０℃、流速１ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：９０％　　Ｂ：　１０％
　　～２５分　　　　Ａ：７０％　　Ｂ：　３０％
　　～３０分　　　　Ａ：　０％　　Ｂ：１００％
＜ＨＰＬＣ条件（Ｄ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール、８ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ液をメタノールとし、カラムはＸ－Ｂｒｉｄｇｅ　Ｃ１８　２．５μｍ　４．６*７５ｍｍ（Waters Corporation）を用い、カラム温度６０℃、流速１ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：９５％　　Ｂ：　　５％
　　～２５分　　　　Ａ：５０％　　Ｂ：　５０％
　ＨＰＬＣを用いたＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）とペプチドとの反応後の溶液の分取において、検出は２６０ｎｍの吸収をモニタすることにより行った。分取後のＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの溶出時間は、ＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）よりも遅れることが確認された。これは、疎水性のペプチドと結合することで溶出時間が遅くなったためと考えられる。また、分取後のクロマトグラムには未反応のＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）のピークは見られず、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートのみのピークが検出されたことより、目的のＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートが純度高く得られたことが確認された。ＨＰＬＣ分析の結果の一例として、図１に、CpG30(S)a-mTRP2pep9（化合物１）の上記条件（Ｂ）におけるクロマトグラムを示す。
　得られたＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの構造を以下に示す。式中、「ＣｐＧ　ＤＮＡ」は、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａまたはＣｐＧ２０（Ｓ）ａの塩基配列部分を表し、「ｐｅｔｉｄｅ」は、上記（２）で合成したペプチドのＮ末端のシステインを除いた部分を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　合成したＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートは以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　また図２に、質量分析の結果の一例として、CpG30(S)a-mTRP2pep9（化合物１）のマススペクトル（MALDI-TOF）を示す。11248.28（１価のマイナスイオン）および5622.53（２価のマイナスイオン）のピークが検出され、CpG30(S)a-mTRP2pep9（理論分子量（theoretical most abundant mass for C369H480N116O174P30S31）11246.56）相当のマススペクトルが得られたことを確認した。
実施例２：ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートによる細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価（ｍＴＲＰ２抗原を用いた評価）
（１）細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価方法
　抗原としてＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♂、７週齢））に皮内投与した。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの投与量は、１尾あたりペプチド換算で50、200または1000 ngとした（この場合、ＣｐＧ３０（Ｓ）換算では約0.4、1.7または8.5μｇである）。投与から１週間後、同系統のマウスのうち、投与を行っていない個体より脾細胞を取り出し、これを2.0×107 cells/mlずつ２つの群に分け、一方に、抗原としてペプチドを10μg/mLになるように添加し、９０分静置することにより抗原保持脾細胞を作製し、ペプチドを添加していない脾細胞を抗原未保持脾細胞とした。５，６－カルボキシフルオレセインスクシイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて、抗原保持脾細胞および抗原未保持脾細胞の両者を蛍光修飾した。このとき、ＣＦＳＥの濃度を変えることにより、抗原保持脾細胞（ＣＦＳＥ：1μM）の方が、抗原未保持脾細胞（ＣＦＳＥ： 0.1μM）よりも蛍光強度が高くなるようにした。投与抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞をそれぞれ同数混合し、抗原としてＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを投与したマウス個体に、投与から１週間後に3.0×106の細胞数にて尾静脈投与した。
　上記の尾静脈投与から２４時間経過後に、マウスから脾細胞を取り出し、抗原保持脾細胞と抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量し、抗原保持脾細胞の減少量を評価することにより、誘導された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性を評価した。比較のために、対照群として、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの代わりにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与したマウス個体を用いて同様の条件で測定を行った。
（２）ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ１０の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能評価
　先願（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３８０９０）においては、ＯＶＡ由来の抗原性を有するペプチドを用いた試験により、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートが高い細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能を有することを示した。その一方、他の抗原ペプチドについて同様のＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを作製した場合、十分なＣＴＬ誘導能が得られない場合があることが判明した（図３）。
　具体的には、抗原性を有するペプチドとして知られているオボアルブミン（ＯＶＡ）の２５８～２６５番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ＯＶＡペプチド１）を用いて、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ＯＶＡｐｅｐ９のＣＴＬ誘導能を評価したところ、１尾あたりペプチド換算で２０ｎｇの投与量で抗原保持脾細胞の消失が観察され、強いＣＴＬ活性が誘導されたことが確認された。それに対し、メラノーマ関連抗原として知られているｍＴＲＰ２の１８０～１８８番目のアミノ酸配列（９アミノ酸）からなるペプチド（ＴＲＰ２－９）を用いて、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ１０（ＴＲＰ２－９のＮ末端にシステインを付加したペプチドを用いて調製したコンジュゲート）のＣＴＬ誘導能を評価したところ、１尾あたりペプチド換算で２００ｎｇの投与量でもＣＴＬ活性は見られなかった。
（３）ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能評価
　ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートがＣＴＬ活性を誘導するためには、抗原提示細胞に取り込まれたのち、ペプチド部分がポリヌクレオチド部分およびスペーサー部分から外れ、ＭＨＣ分子に結合する必要がある。上記結果から、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ１０の調製に用いたＣ－ＴＲＰ２－９（１０アミノ酸）は、本来の抗原性を有するペプチドのＮ末端に１アミノ酸が付加されているため、ＭＨＣ分子に結合できないか、もしくは結合してもＴ細胞受容体に認識されない可能性が考えられた。
　そこで、９アミノ酸からなるＴＲＰ２－９のＮ末端の１残基（セリン）を削った上でシステインを付加したペプチド（Ｃ－ＴＲＰ２－８）を用いて、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９を調製し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原としてＴＲＰ２－９を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図４に示す。ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９では、１尾あたりペプチド換算で２００ｎｇの投与量で抗原保持脾細胞の顕著な減少が観察され、高いＣＴＬ活性が誘導されたことが確認された。それに対してＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ１０では、抗原保持脾細胞の減少はほとんど観察されなかった。
（４）用量依存性
　ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９の投与量を１尾あたりペプチド換算で50、200または1000 ngとして、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原としてＴＲＰ２－９を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図５に示す。ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９のＣＴＬ誘導能には用量依存性が認められた。200 ngの用量で強いＣＴＬ活性の誘導が可能であることが示された。
（５）ＣｐＧ　ＤＮＡの塩基長依存性
　ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９のポリヌクレオチド部分を、２０塩基長のＣｐＧ２０（Ｓ）ａに置換したＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートＣｐＧ２０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９を調製し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原としてＴＲＰ２－９を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図６に示す。ＣｐＧ２０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９は、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ９と同様に高いＣＴＬ誘導能を有することが示された。
実施例３：本発明のＣｐＧ－ペプチドコンジュゲートに用いたペプチドのＭＨＣ－１結合性の評価（ＤＣ２．４細胞におけるＯＶＡペプチド１とのＭＨＣ－１結合競合阻害評価）
　マウス樹状細胞株ＤＣ２．４細胞をディッシュより剥離後、１．５ｍＬチューブに１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／２００ｍＬ　ＰＢＳで懸濁させ、そこにＯＶＡペプチド１を０．２５μｇ／ｍＬになるように、またＴＲＰ２由来のペプチド（ＴＲＰ２－９、Ｃ－ＴＲＰ２－９、またはＣ－ＴＲＰ２－８）をペプチド換算２.５μｇ／ｍＬになるように添加し、チューブを氷浴上で３０分間インキュベートした。次に、ＯＶＡペプチド１とＭＨＣ-1との分子複合体に特異的な抗体（フィコエリスリン（ＰＥ）で蛍光標識：PE-labeled anti-mouse OVA257-264 (SIINFEKL) peptide bound
to H-2Kb antibody (ThermoFisher SCIENTIFIC)）（以下、「PE labelled H-2Kb/FIINFEKL」と称する。）を添加し、フローサイトメトリーで、ＤＣ２．４細胞上の前記抗体が結合したＯＶＡペプチド１－ＭＨＣ－１複合体を定量し、ＴＲＰ２由来のペプチドによるＭＨＣ－１結合競合阻害活性を評価した。
　フローサイトメトリーの測定結果を図７に示す。ＴＲＰ２－９を添加した場合、蛍光強度の平均値が３８％低下し、ＴＲＰ２－９がＯＶＡペプチド１のＭＨＣクラスＩ分子への結合に対して阻害効果を有すること、すなわちＭＨＣクラスＩ分子に結合し得ることが示された。また、ＴＲＰ２－９とＮ末端のアミノ酸は異なるが同じアミノ酸長であるＣ－ＴＲＰ２－８を添加した場合にも、蛍光強度の平均値が２３％低下し、ＯＶＡペプチド１のＭＨＣクラスＩ分子への結合に対する阻害効果が確認された。一方、ＴＲＰ２－９よりも１アミノ酸長いＣ－ＴＲＰ２－９では、阻害効果はみられなかった。
　したがって、Ｃ－ＴＲＰ２－９ではＭＨＣ－１への結合性が失われ、Ｃ－ＴＲＰ２－８ではＭＨＣ－１への結合性が維持されることが示唆された。
実施例４：ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートによる細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価（ｈＧＰ１００を用いた評価）
　ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｈＧＰ１００ｐｅｐ１０またはＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｈＧＰ１００ｐｅｐ９を用いて、実施例２と同様に細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原として、メラノーマ関連抗原として知られているｈＧＰ１００の２５～３３番目のアミノ酸配列（９アミノ酸）からなるペプチド（ｈＧＰ１００－９）を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図８および９に示す。ｍＴＲＰ２を用いて評価した場合と同様、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｈＧＰ１００ｐｅｐ９では、１尾あたりペプチド換算で２００ｎｇの投与量で抗原保持脾細胞の減少が観察され、ＣＴＬ活性が誘導されたことが確認されたのに対して、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｈＧＰ１００ｐｅｐ１０では、抗原保持脾細胞の減少はほとんど観察されなかった（図８）。またＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｈＧＰ１００ｐｅｐ９のＣＴＬ誘導能には用量依存性が認められ、200 ngの用量で強いＣＴＬ活性の誘導が可能であることが示された（図９）。
参考例１：ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ＣＭＴＲＰ２－９による細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価
　ＭＨＣ－１による抗原ペプチドの提示には、小胞体アミノペプチダーゼ（ＥＲＡＰ）が関与する。抗原ペプチド前駆体は、ＥＲＡＰによるＮ末端からのトリミングを受けてＭＨＣ－１への結合に適した長さとなる。このプロセスに関し、Ｎ末端にシステインを有する抗原ペプチド前駆体において、システインのＣ末端側にアラニン、ロイシン、またはメチオニンを挿入すると、ＥＲＡＰによるトリミングを受けやすくなることが報告されている（ＷＯ２０１４／１５７７０４）。図３に示した結果から、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２ｐｅｐ１０についても、Ｃ－ＴＲＰ２－９のＮ末端のシステインのＣ末端側にアラニン、ロイシン、またはメチオニンを挿入することによりＥＲＡＰによるトリミングを受けやすくなり、ＣＴＬ誘導能が改善される可能性が考えられた。
　そこで、Ｃ－ＴＲＰ２－９のＮ末端のシステインのＣ末端側にメチオニンを挿入したＣＭ－ＴＲＰ２－９を用いて、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ＣＭＴＲＰ２－９を調製し、そのＣＴＬ誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原としてＴＲＰ２－９を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図１０に示す。１尾あたりペプチド換算で１０００ｎｇの投与量でも十分な抗原保持脾細胞の減少は観察されず、２００ｎｇの投与量ではほとんど減少しなかった。ペプチド（ＣＭ－ＴＲＰ２－９）を用いたin vitro評価ではＥＲＡＰにより切断されやすくなったことが示唆される結果も得られたが、in vivoではＣＴＬ誘導能を十分に向上させることはできないことが示唆された。
参考例２：ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２－１４およびＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ｍＴＲＰ２－１２による細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価
　ＥＲＡＰによるトリミングの受けやすさは、ペプチドの鎖長によって変わり、９～１６アミノ酸長のペプチドがＥＲＡＰの好ましい基質であることが報告されている（Proc Natl Acad Sci U S A. 102(47):17107-12 (2005)）。
　そこで、Ｃ－ＴＲＰ２－９におけるＴＲＰ２由来の配列よりもＮ末端側がさらに２または４アミノ酸長い配列Ｃ－ＴＲＰ２－１１およびＣ－ＴＲＰ２－１３を用いて、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ＴＲＰ２－１２およびＣｐＧ３０（Ｓ）ａ－ＴＲＰ２－１４を調製し、それらのＣＴＬ誘導能を評価した。抗原保持脾細胞を調製するための抗原としてＴＲＰ２－９を用いた。
　フローサイトメトリーの測定結果を図１１に示す。いずれのＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートも、抗原保持脾細胞の減少は観察されなかった。ペプチド（Ｃ－ＴＲＰ２－１１またはＣ－ＴＲＰ２－１３）を用いたin vitro評価ではＥＲＡＰにより切断されやすくなったことが示唆される結果も得られたが、コンジュゲートを用いたin vivo評価ではＣＴＬ誘導能を十分に向上させることができないことが示唆された。
実施例５：Ｋ３由来のＣｐＧモチーフ以外のＣｐＧモチーフを含むＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成およびその細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の評価
（１）合成法
　実施例１と同様の方法により、Ｋ３由来のＣｐＧモチーフ以外のＣｐＧモチーフを含むＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを合成した。合成した化合物を下記式および表３に示す。なお、Ｎ末端修飾ペプチドとして、Ｃ－ＴＲＰ２－８を用いた（実施例１（２）参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
（２）試験方法
　実施例２と同様の方法により、ISS1018-mTRP2pep9、ODN2006-mTRP2pep9、およびODN1826-mTRP2pep9による細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。投与量は、１尾あたりペプチド換算で200 ngとした。対照として、CpG30(S)a-mTRP2pep9（Ｋ３由来のＣｐＧモチーフを含むコンジュゲート；実施例１参照）を用いた。
　結果を図１２に示す。（１）で合成したいずれの化合物も、Ｋ３由来のＣｐＧモチーフを含むコンジュゲートと同様に、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有することが示された。
実施例６：リン酸基がチオリン酸基に置換されたｓｓＨアミノリンカー部分を有するコンジュゲートの合成およびその細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の評価
（１）合成法
　以下の方法により、リン酸基がチオリン酸基に置換されたｓｓＨアミノリンカー部分を有するコンジュゲートを合成した。合成した化合物を下記式および表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
（１－１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ホスホロアミダイト法（例えば、Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)）を用いて行った。アミノ基修飾を持つＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ssH Amino Linker (Bioorg. Med. Chem., 16, 941-949 (2008))のリン酸基がチオリン酸基に置換されたものを用いて行った。これらの合成には、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用した。
　合成したＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の塩基配列は、実施例１（１）に記載のＣｐＧ３０ａと同じである。
　得られたアミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）は、５’末端に下記の式で表される構造を有する。以下、５’末端に下記の式で表される構造を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体のうち、配列番号６の配列を有するものを「ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　さらに、アミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）１ｍｏｌと、スクシイミジル６－［３'－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）３０ｍｏｌとをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合し、４０℃で３時間静置した後、ＮＡＰ－５カラムを用いてＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）を精製した。
　なお、得られたＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）は、下記の式で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
（１－２）Ｎ末端修飾ペプチドの合成
　ペプチドは、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用して合成した。
　合成したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　Ｃ－ＯＶＡ７：ＣＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４６）
　Ｃ－ＴＲＰ２－８：ＣＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３２）
　Ｃ－ＯＶＡ７は、オボアルブミン（ＯＶＡ；GenBankアクセッション番号：CAA23716.1）の２５９～２６５番目のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。Ｃ－ＯＶＡ７は、ＭＨＣ－１結合ペプチドであるＯＶＡペプチド１(配列番号４１のアミノ酸配列からなるペプチド）のＮ末端１残基を削除し、Ｎ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＴＲＰ２－８は、実施例１に記載したとおりであり、ＭＨＣ－１結合ペプチドであるＴＲＰ２－９のＮ末端１残基を削除し、Ｎ末端にシステインを付加したペプチドである。
（１－３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１－１）で合成したＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）に対して、（１－２）で合成したペプチドを５乃至１０モル等量、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液中で混合し、４０℃で２時間反応させた。反応後、下記の条件によるＨＰＬＣ精製でＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを分取した。
＜ＨＰＬＣ条件（Ｅ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ液をメタノールとし、カラムはXBridge BEH C18 (4.6×75 mm Column XP)（Waters Corporation）を用い、カラム温度４０℃、流速１ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：８０％　　Ｂ：　２０％
　　～１０分　　　　Ａ：５０％　　Ｂ：　５０％
　各コンジュゲートの分取に使用したＨＰＬＣ条件および保持時間を表４に示す。
（２）試験方法
　実施例２と同様の方法により、CpG30(S)a2-OVApep8およびCpG30(S)a2-mTRP2pep9の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。CpG30(S)a2-OVApep8の投与量は１尾あたりペプチド換算で20 ngとした。CpG30(S)a2-mTRP2pep9の投与量は１尾あたりペプチド換算で200 ngとした。２つのコンジュゲートの間の投与量の違いは、元々のペプチド自体の抗原性の強さの違いを反映している。
　結果を図１３に示す。（１）で合成したCpG30(S)a2-OVApep8およびCpG30(S)a2-mTRP2pep9のいずれも、高い細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有することが示された。
実施例７：ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートによる細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価（２回投与での活性）
　CpG30(S)a-mTRP2pep9を２回投与した場合の細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を、実施例２と同様の方法により評価した。２回目の投与は、１回目の投与の１０日後に行った。投与量は、いずれも１尾あたりペプチド換算で200 ngとした。
　結果を図１４に示す。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを２回投与することにより、単回投与の場合よりもＣＴＬ活性が向上することが示唆された。
実施例８：二本鎖ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲート（CpG30(S)a-mTRP2pep9；実施例１参照）と、そのＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）部分の塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡ誘導体とをアニーリングさせることにより、二本鎖複合体（二本鎖ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲート）を調製した。
（１）ＣｐＧ相補鎖ＤＮＡ誘導体の合成
　ＣｐＧに相補的なＤＮＡの合成は、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）と同様にホスホロアミダイト法を用いて行った。５'末端に脂質修飾を持つ相補鎖ＤＮＡの合成は、下記の式で表される脂質化ホスホロアミダイト（文献（WO2017/057540）中のM22-12ホスホロアミダイトと同様の方法により合成）を相補鎖ＤＮＡの配列合成の最後のカップリングに用いることで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　３’－末端に脂質修飾を持つ相補鎖ＤＮＡの合成は以下のとおりに行った。
　ユニバーサル固相担体（Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ　５００ (ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ, ２０－５０４０)）上で、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｄｏｕｂｌｅｒ(Ｌｅｖ) Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ (ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ, １０－１９８１)を用いて最初のカップリングを行った後に、相補鎖ＤＮＡの配列を合成した。次いで、固相担体上で脱トリチル化およびアセチル保護を行った後に、メーカー所定の方法によりレブリン酸ユニットを脱保護した。生じた水酸基に対して、上記の脂質化ホスホロアミダイトを反応させることにより、目的の化合物を合成した。
　３’および５’－末端に脂質修飾を持つ相補鎖ＤＮＡの合成は以下のとおりに行った。
　ユニバーサル固相担体（Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ　５００ (ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ, ２０－５０４０)）上で、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｄｏｕｂｌｅｒ(Ｌｅｖ) Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ (ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ, １０－１９８１)を用いて最初のカップリングを行った後に、相補鎖ＤＮＡの配列を合成した。次いで、固相担体上で脱トリチル化を行った後に、メーカー所定の方法によりレブリン酸ユニットを脱保護した。生じた３’および５’－末端の水酸基に対して、上記の脂質化ホスホロアミダイトを反応させることにより、目的の化合物を合成した。
　合成したＣｐＧに相補的なＤＮＡ誘導体の構造を以下に示す。なお、下記誘導体中のＤＮＡ配列（compK3：配列番号４７）は、K3の塩基配列（配列番号１）に相補的な配列である。
5'-Lipo-compK3：5'-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T-3'
3'-Lipo-compK3：5'-G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3'
5',3'-di-Lipo-compK3：5'-Lipo^G^A^G^AACGCTCGAGA^G^T^Lipo-3'
　上記構造中、「^」は、ヌクレオシド間のホスホロチオエート結合を示す。また、「Lipo^G」および「T^Lipo」は、下記の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　下記条件によるＨＰＬＣにより、ＣｐＧに相補的なＤＮＡ誘導体を分取した。結果を表５に示す。
＜ＨＰＬＣ条件（Ｆ）＞
　以下のグラジェント条件で、Ａ液を０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、Ｂ液をメタノールとし、カラムはClarity(登録商標) 2.6μm Oligo-MS 100A (LC-Column 50 x 2.1mm)（Phenomenex Inc）を用い、カラム温度６０℃、流速０．５ｍＬ／分で、ＨＰＬＣを行った。
　　０分　　　　　　Ａ：９０％　　Ｂ：　１０％
　　～７分　　　　　Ａ：１０％　　Ｂ：　９０％
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
（２）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートとの二本鎖複合体形成
　CpG30(S)a-mTRP2pep9のPBS溶液と上記（１）で合成した脂質修飾compK3のPBS溶液を、それぞれ終濃度が3.4μMになるように1.5 mLチューブ内にて混合した。これを90℃の湯浴に入れることにより加温した後、一晩放置することで徐々に室温に戻した（この冷却過程で二本鎖が形成される）。この溶液50μLをマウスに投与すると、ペプチド200 ng相当を投与することとなる。
　下記表６に記載の組み合わせの5種類の二本鎖複合体を得た。二本鎖複合体の形成は、ポリアクリルアミドゲル等を用いた電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィー、紫外分光法を用いた融解温度測定、静的光散乱法測定による会合体分子量測定、等で確認することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
実施例９：ＭＨＣ－２結合ペプチドを用いたＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成およびそれによるＣＤ４+　Ｔ細胞活性化の評価
（１）合成法
　以下の方法により、ＭＨＣ－２結合ペプチド由来のＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）部分を有する２種類のコンジュゲートＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１５および、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１７を合成した。合成した化合物を下記式および表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
（１－１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　実施例６と同様の方法により、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２およびそのＳＰＤＰ修飾体を合成した。
（１－２）Ｎ末端修飾ペプチドの合成
　Ｎ末端システイン修飾ペプチドは、一般的なFmoc固相ペプチド合成法にて合成した。合成したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　合成したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　Ｃ－ＯＶＡ２－１４：ＣＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡ（配列番号４８）
 Ｃ－ＯＶＡ２－１６：ＣＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号５１）
　Ｃ－ＯＶＡ２－１４は、オボアルブミン（ＯＶＡ；GenBankアクセッション番号：CAA23716.1）の３２５～３３８のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。Ｃ－ＯＶＡ２－１４は、ＯＶＡペプチド２（マウスＩ－Ａｂ／Ｉ－Ａｄ結合性配列を含む配列番号４２のアミノ酸配列からなるペプチド）のＮ末端１残基およびＣ末端２残基を削除し、Ｎ末端にシステインを付加したペプチドである。
　Ｃ－ＯＶＡ２－１６は、前記オボアルブミンの３２５－３４０のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。Ｃ－ＯＶＡ２－１６は、前記ＯＶＡペプチド２のＮ末端１残基を削除し、Ｎ末端にシステインを付加したペプチドである。
（１－３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１－１）で合成したＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）と（１－２）で合成したペプチドとを用いて、実施例６の（１－３）と同様の方法により、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを合成した。
（２）試験方法（ＩＦＮ－γ分泌活性測定による、ＣｐＧ－ＭＨＣ２ペプチドコンジュゲートの一回免疫によるＣＤ４+　Ｔ細胞活性化の評価）
　抗原としてＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♂、７週齢））に皮内投与した。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの投与量は、１尾あたりペプチド換算で１０００ ngとした。投与から１週間後に脾細胞を取り出し、９６ウェルディッシュに１．０×１０6 cells／１００μLで播種し（培地；ＲＰＭＩ１６４０）、ＯＶＡ由来のＭＨＣ－２結合性の抗原ペプチド（ＯＶＡ324-340：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号４２））を１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。２４時間後に培地中のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）をIFN gamma Mouse ELISA Kit (Invitrogen, IFN gamma 'Femto-HS' High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit)を用いて定量した。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの投与によりマウスが免疫化された場合、培地中への抗原ペプチドの添加による刺激により、脾細胞中の抗原特異的ＣＤ４+　Ｔ細胞が活性化し、ＩＦＮ－γを分泌する。
　結果を図１５および図１７に示す。
　ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１５および、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１７をそれぞれ投与したマウスの脾細胞では、ともに高いＩＦＮ－γ分泌活性が見られた（図１５および１７；ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８については参考例３参照。）。ＭＨＣ－２結合ペプチドを用いてコンジュゲートを作製する場合には、Ｃ末端のペプチドを削除してもよいことが示された。
参考例３：ＭＨＣ－２結合ペプチドを用いたＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成およびそれによるＣＤ４+　Ｔ細胞活性化の評価
（１）合成法
　以下の方法により、ＭＨＣ－２結合ペプチド由来のＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）部分を有する２種類のコンジュゲートＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８およびＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８ｃを合成した。合成した化合物を下記式および表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
（１－１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　実施例６と同様の方法により、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２およびそのＳＰＤＰ修飾体を合成した。
（１－２）Ｎ末端修飾ペプチドおよびＣ末端修飾ペプチドの合成
　Ｎ末端システイン修飾ペプチドおよびC末端システイン修飾ペプチドは、一般的なFmoc固相ペプチド合成法にて合成した。
　合成したペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
　Ｃ－ＯＶＡ２－１７：ＣＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号４９）
　ＯＶＡ２－１７－Ｃ：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＣ（配列番号５０）
　Ｃ－ＯＶＡ２－１７は、オボアルブミンの３２４～３４０のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチドである。Ｃ－ＯＶＡ２－１７は、前記ＯＶＡペプチド２のＮ末端にシステインを付加したペプチドである。
　ＯＶＡ２－１７－Ｃは、オボアルブミンの３２４～３４０のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端にシステインを付加したペプチドである。Ｃ－ＯＶＡ２－１７は、前記ＯＶＡペプチド２のＣ末端にシステインを付加したペプチドである。
（１－３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１－１）で合成したＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）と（１－２）で合成したペプチドとを用いて、実施例６の（１－３）と同様の方法により、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを合成した。
（２）試験方法（ＩＦＮ－γ分泌活性測定による、ＣｐＧ－ＭＨＣ２ペプチドコンジュゲートの一回免疫によるＣＤ４+　Ｔ細胞活性化の評価）
　抗原としてＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♂、７週齢））に皮内投与した。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの投与量は、１尾あたりペプチド換算で１０００ ngとした。投与から１週間後に脾細胞を取り出し、９６ウェルディッシュに１．０×１０6 cells／１００μLで播種し（培地；ＲＰＭＩ１６４０）、ＯＶＡ由来の抗原ペプチド（ＯＶＡ324-340：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（配列番号４２））を１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。２４時間後に培地中のインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）をIFN gamma Mouse ELISA Kit (Invitrogen, IFN gamma 'Femto-HS' High Sensitivity Mouse Uncoated ELISA Kit)を用いて定量した。ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの投与によりマウスが免疫化された場合、培地中への抗原ペプチドの添加による刺激により、脾細胞中の抗原特異的ＣＤ４+　Ｔ細胞が活性化し、ＩＦＮ－γを分泌する。
　結果を図１５および１６に示す。
　ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８を投与したマウスの脾細胞では、高いＩＦＮ－γ分泌活性が見られた（図１５および１６）。
　またＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８を投与した場合と同等またはそれより高い活性が、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ２－ＯＶＡ２－１８ｃを投与したマウスの脾細胞で見られた（図１６）。ＭＨＣ－２結合ペプチドを用いてコンジュゲートを作製する場合には、Ｃ末端側にＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）をコンジュゲートさせてもよいことが示された。
実施例１０：ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの調製（２）およびその細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の評価
（１）合成法
　（１－１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　5'末端に6-メルカプトヘキシル基を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ホスホロアミダイト法を用いてＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の配列を合成した後に、5'-thiol-modifier C6（S-Trityl-6-mercaptohexyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite）を反応させることで行った。これらの合成には、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用した。
　得られた6-メルカプトヘキシル修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）は、５'末端に下記の式で表される構造を有する。以下、５'末端に下記の式で表される構造を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体のうち、配列番号６の配列を有するものを「ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ３」と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　また、５'末端に下記の式で表される構造を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成は、実施例６の（１－１）で合成したアミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）と、PPC-NHS ester (2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate)とを１：３０モル比でリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で４０℃で３時間反応させた後、ＮＡＰ－５カラムで精製することで行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
（１－２）Ｎ末端修飾ペプチドの合成
　実施例１と同様に、Ｃ－ＴＲＰ２－８：ＣＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３２）を合成した。
（１－３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１－１）で合成したＣｐＧ３０（Ｓ）ａ３に対して、３０モル等量のNpys-OMe (CAS: 68118-08-1)を３３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液中で混合し、一晩反応させた。次に（１－２）で合成したペプチドを５モル等量、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液中で混合し、４０℃で２時間反応させた。反応後、ＨＰＬＣ精製でＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを分取し、CpG30(S)a3-mTRP2pep9を得た。
　また、（１－１）で合成したPPC-NHS ester修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）に対して、（１－２）で合成したペプチドを５モル等量、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液中で混合し、４０℃で２時間反応させた。反応後、ＨＰＬＣ精製でＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを分取し、CpG30(S)a2-MeS-mTRP2pep9を得た。
　合成した化合物を下記式および表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
（２）試験方法
　実施例２と同様の方法により、CpG30(S)a3-mTRP2pep9による細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。投与量は、１尾あたりペプチド換算で200 ngとした。対照として、CpG30(S)a2-mTRP2pep9（Ｋ３由来のＣｐＧモチーフを含むコンジュゲート；実施例６参照）を用いた。
　結果を図１８に示す。CpG30(S)a3-mTRP2pep9は、スペーサー構造の異なるCpG30(S)a2-mTRP2pep9と同様に、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有することが示された。
実施例１１：システイン類縁体を含むＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
（１）合成法
　システインの代わりにシステイン類縁体によってN末端が修飾されたペプチドを用いて、実施例１と同様の方法により、ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを合成した。合成した化合物を下記式および表１０に示す。なお、Ｎ末端修飾ペプチドとして、Ｎ末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸である下記の合成ペプチドを用いた。
dC-mTRP2pep8: D-cysteine-ＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号５２）
homoC-mTRP2pep8: L-homocysteine-ＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号５３）
Pen-mTRP2pep8: L-penicillamine-ＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号５４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
（２）試験方法
　実施例２と同様の方法により、CpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8による細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を評価した。投与量は、１尾あたりペプチド換算で200 ngとした。対照として、CpG30(S)a2-mTRP2pep9（Ｋ３由来のＣｐＧモチーフを含むコンジュゲート；実施例６参照）を用いた。
　結果を図１８に示す。システイン類縁体を含むCpG30(S)a2-Pen-mTRP2pep8は、CpG30(S)a2-mTRP2pep9と同様に、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有することが示された。
実施例１２：ＣｐＧ　ＤＮＡの5'および3'両末端にペプチドを有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
（１）合成法
　以下の（１－１）～（１－３）の方法を用いて、ＣｐＧ　ＤＮＡの両末端にペプチドを有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを合成した。合成した化合物を下記式および表１１に示す。なお、Ｎ末端修飾ペプチドとして、Ｃ－ＴＲＰ２－８を用いた（実施例１（２）参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
（１－１）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体の合成
　5'および3'両末端にAmino Linkerを結合させたＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の合成は、ホスホロアミダイト法を用いて、3'-Amino-Modifier C6-dC CPG（Link Technologies Ltd.）を用いてCpG配列を合成した後、5'末端にssH Amino Linkerを反応させることで行った。これらの合成には、受託合成サービス（株式会社ジーンデザイン）を利用した。
　合成したＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）の塩基配列は、実施例１（１）に記載のＣｐＧ３０ａと同じである。
　得られたアミノ基修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）は、５’末端に下記の式で表される構造を有し
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 ３’末端に下記の式で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　以下、３’および５’末端に上記式で表される構造を有するＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）誘導体のうち、配列番号６の配列を有するものを「ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ４」と称する。
　さらに、ＣｐＧ３０（Ｓ）ａ４と、スクシイミジル６－［３'－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）とを１：３０モル比でリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合し、４０℃で３時間静置した後、ＮＡＰ－５カラムを用いてＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）ａ４を精製した。
（１－２）Ｎ末端修飾ペプチドの合成
実施例１と同様に、Ｃ－ＴＲＰ２－８：ＣＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３２）を合成した。
（１－３）ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートの合成
　（１－１）で合成したＳＰＤＰ修飾ＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）ａ４に対して、（１－２）で合成したペプチドを５乃至１０モル等量、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）水溶液中で混合し、４０℃で２時間反応させた。反応後、ＨＰＬＣ精製でＣｐＧ　ＤＮＡ（Ｓ）－ペプチドコンジュゲートを分取した。分取に使用したＨＰＬＣ条件および保持時間を表１１に示す。
　本発明によれば、広範な抗原ペプチドについて、ＣＴＬ活性の誘導が可能な免疫誘導剤、およびそれを含む医薬組成物を提供することができる。
　配列番号１：K3
　配列番号２：K3-20(b)
　配列番号３：K3-21
　配列番号４：K3-24
　配列番号５：K3-27
　配列番号６：K3-30(a)
　配列番号７：K3-30(b)
　配列番号８：K3-40
　配列番号９：K3-30(c)
　配列番号１０：K3-30(d)
　配列番号１１：K3-30(e)
　配列番号１２：K3-30(f)
　配列番号１３：K3-26(a)
　配列番号１４：K3-26(b)
　配列番号１５：ODN1668
　配列番号１６：ODN1668-30
　配列番号１７：ODN1668-40
　配列番号１８：ODN1826
　配列番号１９：ODN1826-30
　配列番号２０：ODN1826-40
　配列番号２１：ODN2006
　配列番号２２：ODN2006-30
　配列番号２３：ODN2006-40
　配列番号２４：ODN684
　配列番号２５：ODN684-30
　配列番号２６：ODN684-40
　配列番号２７：ODN D-SL01
　配列番号２８：ODN D-SL01-35
　配列番号２９：C-CpG#1
　配列番号３０：C-OVA8
　配列番号３１：C-TRP2-9
　配列番号３２：C-TRP2-8
　配列番号３３：C-gp100-9
　配列番号３４：C-gp100-8
　配列番号３５：CM-TRP2-9
　配列番号３６：C-TRP2-13
　配列番号３７：C-TRP2-11
　配列番号３８：C-OVA2-17
　配列番号３９：C-OVA2-14
　配列番号４０：C-OVA2-11
　配列番号４１：OVAペプチド1
　配列番号４２：OVAペプチド2
　配列番号４３：1018ISS
　配列番号４４：1018ISS#30
　配列番号４５：1018ISS#40
　配列番号４６：C-OVA7
　配列番号４７：compK3
　配列番号４８：C-OVA2-14
　配列番号４９：C-OVA2-17
　配列番号５０：OVA2-17-C
　配列番号５１：C-OVA2-16
　配列番号５２：dC-mTRP2pep8；１番目のアミノ酸はＤ－システインである。
　配列番号５３：homoC-mTRP2pep8；１番目のアミノ酸はＬ－ホモシステインである。
　配列番号５４：Pen-mTRP2pep8；１番目のアミノ酸はＬ－ペニシラミンである。

Claims (32)

  1. 　ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
    　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
    　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記免疫誘導剤。
  2. 　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合である、請求項１に記載の免疫誘導剤。
  3. 　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体である、請求項１または２に記載の免疫誘導剤。
  4. 　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  5. 　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  6. 　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドである、請求項５に記載の免疫誘導剤。
  7. 　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下である、請求項５または６に記載の免疫誘導剤。
  8. 　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－２結合ペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  9. 　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  10. 　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、１５以上４０以下である、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  11. 　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下である、請求項１０に記載の免疫誘導剤。
  12. 　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  13. 　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、請求項１２に記載の免疫誘導剤。
  14. 　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されている、請求項１３に記載の免疫誘導剤。
  15. 　前記スペーサーが、下記の式で表される繰り返し単位を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　上記の式において、
    　Ｘは、酸素原子または硫黄原子を表し（ここで各Ｘは同じであっても異なっていてもよい）、
    　Ｒは、（ＣＨ2）pＯ、（ＣＨ2）qＮＨおよび（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）mのいずれかを表し（ｍ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して１０以下の自然数を表す。）、
    　ｎは、１０以下の自然数を表す。
  16. 　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  17. 　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  18. 　請求項１に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
    　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、
    前記免疫誘導剤。
  19. 　請求項１に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩を有効成分として含む免疫誘導剤であって、
    　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり、
    　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合であり、
    　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドであり、
    　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドであり、
    　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下であり、
    　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されており、
    　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、
    前記免疫誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  20. 　アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  21. 　請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
  22. 　感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用である、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 　腫瘍の治療または予防用である、請求項２１に記載の医薬組成物。
  24. 　患者に対して請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を投与することを含む、感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防方法。
  25. 　患者に対して請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤を投与することを含む、腫瘍の治療または予防方法。
  26. 　感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防に使用するための請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  27. 　腫瘍の治療または予防に使用するための請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
  28. 　感染症、腫瘍、またはアレルギー性疾患の治療または予防用医薬の製造のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤の使用。
  29. 　腫瘍の治療または予防用医薬の製造のための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫誘導剤の使用。
  30. 　ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
    　前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートは、ＣｐＧモチーフを含む１本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と、ペプチドと、一端側で前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体と共有結合し他端側で前記ペプチドと共有結合したスペーサーとからなり、
    　前記ペプチドは、ＭＨＣ結合ペプチドのＮ末端の１または複数の連続するアミノ酸が、前記スペーサーとの共有結合を形成させるための反応性官能基を有するアミノ酸に置換されたペプチドであり、ここで前記１または複数の連続するアミノ酸は、ＭＨＣ結合のためのアンカー残基を含まない、前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
  31. 　請求項３０に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
    　前記スペーサーと前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体との間の共有結合および前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合の一方または両方が、生体環境中で切断可能な共有結合であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体である、
    前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
  32. 　請求項３０に記載された、ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩であって、
    　前記スペーサーとの共有結合を形成させるため反応性官能基を有するアミノ酸が、システインまたはチオール基を有するその類縁体であり、
    　前記スペーサーと前記ペプチドとの間の共有結合が、ジスルフィド結合であり、
    　前記ＭＨＣ結合ペプチドが、ＭＨＣ－１結合ペプチドであり、
    　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ結合ペプチドまたはＨＬＡ－Ｂ結合ペプチドであり、
    　前記ＭＨＣ－１結合ペプチドのアミノ酸長が、８以上１１以下であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体が、２以上のＣｐＧモチーフを含むポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはＤＮＡ誘導体であり、
    　前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の塩基長が、２０以上３０以下であり、
    　前記リン酸ジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート結合で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、リン酸ジエステル結合の９０％以上がホスホロチオエート結合で置換されており、
    　前記スペーサーが、下記のいずれかの式で表される構造を有する、
    前記ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲート又はその医薬上許容される塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
PCT/JP2021/012787 2020-03-27 2021-03-26 ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物 WO2021193900A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3175889A CA3175889A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 Immune inducer containing polynucleotide-peptide conjugate and pharmaceutical composition containing same
BR112022018361A BR112022018361A2 (pt) 2020-03-27 2021-03-26 Indutor imune contendo conjugado polinucleotídeo-peptídeo e composição farmacêutica contendo o mesmo
CN202180024931.3A CN115427079A (zh) 2020-03-27 2021-03-26 包含多核苷酸-肽缀合物的免疫诱导剂及包含其的药物组合物
EP21776683.1A EP4129344A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 Immune inducer containing polynucleotide-peptide conjugate and pharmaceutical composition containing same
KR1020227036681A KR20220160036A (ko) 2020-03-27 2021-03-26 폴리뉴클레오티드-펩티드 컨쥬게이트를 포함하는 면역 유도제 및 그것을 포함하는 의약 조성물
JP2022510723A JPWO2021193900A1 (ja) 2020-03-27 2021-03-26
AU2021241229A AU2021241229A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 Immune inducer containing polynucleotide-peptide conjugate and pharmaceutical composition containing same
US17/907,531 US20230144876A1 (en) 2020-03-27 2021-03-26 Immune inducer containing polynucleotide-peptide conjugate and pharmaceutical composition containing same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020057249 2020-03-27
JP2020-057249 2020-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021193900A1 true WO2021193900A1 (ja) 2021-09-30

Family

ID=77890353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/012787 WO2021193900A1 (ja) 2020-03-27 2021-03-26 ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230144876A1 (ja)
EP (1) EP4129344A1 (ja)
JP (1) JPWO2021193900A1 (ja)
KR (1) KR20220160036A (ja)
CN (1) CN115427079A (ja)
AU (1) AU2021241229A1 (ja)
BR (1) BR112022018361A2 (ja)
CA (1) CA3175889A1 (ja)
TW (1) TW202146037A (ja)
WO (1) WO2021193900A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008509072A (ja) * 2004-02-06 2008-03-27 マヨ ファウンデーション フォー メディカル エデュケーション アンド リサーチ 改良型ワクチン用のポリペプチド‐アジュバント複合体
WO2012147805A1 (ja) * 2011-04-28 2012-11-01 国立大学法人名古屋大学 脳移行性機能性核酸及びその利用
WO2014157704A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン
WO2015118789A1 (ja) 2014-02-06 2015-08-13 独立行政法人科学技術振興機構 ペプチド／β－１，３－グルカン複合体及びその製造方法並びにそれを含む医薬組成物
JP2017500313A (ja) * 2013-12-09 2017-01-05 ブレット バイオテクノロジー， インコーポレーテッドＢｕｌｌｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． 特異的ウイルス様粒子−ＣｐＧオリゴヌクレオチドワクチンおよびその使用
WO2017057540A1 (ja) 2015-09-30 2017-04-06 塩野義製薬株式会社 免疫賦活活性を有する核酸誘導体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017214776A1 (de) 2017-08-23 2018-04-26 Continental Automotive Gmbh Verfahren zum Fertigen eines Rotors für eine elektrische Maschine mit berührungslosem Leistungsübertragungssystem sowie Rotor, elektrische Maschine und Kraftfahrzeug

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008509072A (ja) * 2004-02-06 2008-03-27 マヨ ファウンデーション フォー メディカル エデュケーション アンド リサーチ 改良型ワクチン用のポリペプチド‐アジュバント複合体
WO2012147805A1 (ja) * 2011-04-28 2012-11-01 国立大学法人名古屋大学 脳移行性機能性核酸及びその利用
WO2014157704A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｅｒａｐ１によるトリミング機能をきっかけとしたコンジュゲートワクチン
JP2017500313A (ja) * 2013-12-09 2017-01-05 ブレット バイオテクノロジー， インコーポレーテッドＢｕｌｌｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． 特異的ウイルス様粒子−ＣｐＧオリゴヌクレオチドワクチンおよびその使用
WO2015118789A1 (ja) 2014-02-06 2015-08-13 独立行政法人科学技術振興機構 ペプチド／β－１，３－グルカン複合体及びその製造方法並びにそれを含む医薬組成物
WO2017057540A1 (ja) 2015-09-30 2017-04-06 塩野義製薬株式会社 免疫賦活活性を有する核酸誘導体

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. AAC60634.1
BIOORG. MED. CHEM., vol. 16, pages 941 - 949
CAS , no. 29768-80-7
CAS, no. 2351397-00-5
FRONT. IMMUNOL., vol. 6, 2015, pages 377
H. WAGNER: "Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infectious Danger", ADV. IMMUNOL., vol. 73, 1999, pages 329 - 368
IMMUNOGENETICS, vol. 41, 1995, pages 178 - 228
IMMUNOGENETICS, vol. 50, 1999, pages 213 - 219
IMMUNOGENETICS, vol. 60, 2008, pages 759 - 765
J. IMMUNOL., vol. 174, no. 8, 2005, pages 4812 - 4820
KHAN S. ET AL.: "Distinct Uptake Mechanisms but Similar Intracellular Processing of Two Different Toll-like Receptor Ligand-Peptide Conjugates in Dendritic Cells", J. BIOL. CHEM., vol. 282, 2007, pages 21145 - 21159, XP055613005, DOI: 10.1074/jbc.M701705200
KRAMER K. ET AL.: "Comparative Study of 5'- and 3'-Linked CpG-Antigen Conjugates for the Induction of Cellular Immune Responses", ACS OMEGA, vol. 2, no. 1, 2017, pages 227 - 235, XP055617506, DOI: 10.1021/acsomega.6b00368
KRAMER K. ET AL.: "Intracellular Cleavable CpG Oligodeoxynucleotide-Antigen Conjugate Enhances Anti-tumor Immunity", MOL. THER., vol. 25, 2017, pages 62 - 70, XP055613007, DOI: 10.1016/j.ymthe.2016.10.001
KUPIHAR, ZOLTAN ET AL.: "Synthesis and Application of a Novel, Crystalline Phosphoramidite Monomer with Thiol Terminus, Suitable for the Synthesis of DNA Conjugates", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 9, 2001, pages 1241 - 1247, XP055045403, DOI: 10.1016/S0968-0896(00)00339-4 *
M. KRIEG: "CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects", ANNU. REV. IMMUNOL., vol. 20, 2002, pages 709 - 760, XP009016455, DOI: 10.1146/annurev.immunol.20.100301.064842
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 4539
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 102, no. 47, 2005, pages 17107 - 12
RAPIN, NICOLAS ET AL.: "MHC motif viewer", IMMUNOGENETICS, vol. 60, no. 12, 2008, pages 759 - 765, XP019654076, DOI: 10.1007/s00251-008-0330-2 *
S. YAMAMOTOT. YAMAMOTOT. TOKUNAGA: "The discovery of immunostimulatory DNA sequence", SPRINGER SEMINARS IN IMMUNOPATHOLOGY, vol. 22, 2000, pages 11 - 19
SHIROTA H.KLINMAN D. M.: "TLR-9 Agonist Immunostimulatory Sequence Adjuvants Linked to Cancer Antigens", METHODS MOL. BIOL., vol. 1139, 2014, pages 337 - 344, XP055700123, DOI: 10.1007/978-1-4939-0345-0_27

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021241229A1 (en) 2022-10-13
CN115427079A (zh) 2022-12-02
TW202146037A (zh) 2021-12-16
US20230144876A1 (en) 2023-05-11
JPWO2021193900A1 (ja) 2021-09-30
BR112022018361A2 (pt) 2022-11-08
EP4129344A1 (en) 2023-02-08
CA3175889A1 (en) 2021-09-30
KR20220160036A (ko) 2022-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2003203079B8 (en) Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides
AU2013287630B2 (en) Chiral nucleic acid adjuvant
US10144933B2 (en) Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
TW201639866A (zh) 活化「干擾素基因刺激因子」依賴性訊息傳導之組合物及方法
TW201929866A (zh) 活化sting轉接蛋白之具有膦酸酯鍵之3’3’環二核苷酸
JP6383740B2 (ja) ペプチド／β−１，３−グルカン複合体及びそれを含む医薬組成物
AU2004238139B2 (en) Immunostimulating Agents
JP7471600B2 (ja) 抗原ペプチド－アジュバントヌクレオチドコンジュゲート体を含む免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物
WO2019122050A1 (en) Methods of immunization
WO2021193900A1 (ja) ポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートを含む免疫誘導剤およびそれを含む医薬組成物
NL2018803B1 (en) Adjuvant compounds
WO2018180819A1 (ja) 免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物
WO2021132528A1 (ja) ポリデオキシアデニル酸が連結した短鎖ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド、該オリゴデオキシヌクレオチドを含有する複合体、及びその用途
WO2022094102A1 (en) Immunostimulatory oligonucleotides for the prevention and treatment of covid-19

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21776683

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022510723

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3175889

Country of ref document: CA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112022018361

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021241229

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20210326

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20227036681

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2021776683

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021776683

Country of ref document: EP

Effective date: 20221027

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112022018361

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20220914