CN103501794A - 脑靶向性功能性核酸及其利用 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供新型阿尔茨海默病治疗药及其用途为课题。本发明提供一种以脑靶向性和稳定性得到提高的CpG寡聚脱氧核苷酸结构体或其盐为有效成分的阿尔茨海默病治疗药。

Description

脑靶向性功能性核酸及其利用
技术领域
本发明涉及功能性核酸的对阿尔茨海默病治疗中的应用。更详细而言，本发明涉及利用具有CpG模体的功能性核酸的阿尔茨海默病治疗药及其用途。本申请主张基于2011年4月28日提出申请的日本专利申请第2011-100278号的优先权，通过参照而援引该专利申请的全部内容。
背景技术
伴随老龄化社会的发展，阿尔茨海默病的患者数量呈现增加，现在，日本国内认可的治疗药仅有乙酰胆碱分解酶抑制药。虽然一直以被认为是阿尔茨海默病的病因蛋白的Aβ为靶标，在开发β以及γ分泌酶抑制剂、Aβ疫苗等着眼于Aβ产生抑制或Aβ分解促进的新型治疗药，但是尚未确立有效的治疗方法。虽然一直认为Aβ的神经毒性在于作为不溶性的淀粉样蛋白纤维在脑内沉淀的凝集Aβ（fAβ），但是近年发现可溶性的Aβ低聚物(oAβ)具有更强的神经伤害作用。其神经障碍作用被认为是由树突可塑性的障碍、活性氧引起的氧化应激、海马中胰岛素受体功能障碍等引起的。因此，这提示了控制Aβ低聚物在阿尔茨海默病的治疗策略中的重要性。
已知脑内的免疫细胞小胶质细胞与阿尔茨海默病的疾病状态相关。小胶质细胞聚集于老年斑，其不仅能够处理凝集Aβ，也能够处理Aβ低聚物，另一方面，其具有作为炎症性细胞的侧面，其过多的活化具有产生炎症性细胞因子、活性氧、谷氨酸等神经伤害因子等相反的作用。小胶质细胞的Aβ处理与属于自然免疫的活化相关受体的Toll样受体（Toll like receptor：TLR）的信号相关。
本发明人等的研究组着眼于与自然免疫的活化相关的Toll样受体9（TLR9）进行研究，发现作为其配体的功能性核酸CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）能够增强脑内的免疫细胞小胶质细胞对Aβ的处理能力，诱导抗氧化酶血红素加氧酶1（HO-1），从而在神经细胞·小胶质细胞的共同培养中抑制低聚物Aβ的神经毒性，进一步通过CpG-ODN的脑室内给药，可改善阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能障碍以及其病理表现（非专利文献1）。关于阿尔茨海默病中TLR信号的重要性，其他的研究组也进行了研究，作为其成果之一，报告了由末梢几个月给药CpG-ODN时的有用性（非专利文献2）。但是，存在由末梢给药容易活化其他免疫细胞而产生副反应，CpG-ODN变得容易分解，不易向脑内转移等各种各样的问题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:The American Journal of Pathology.175:2121-2131,2009
非专利文献2:The Journal of Neuroscience.29:1846-1854,2009
发明内容
对于属于TLR9配体的功能性核酸CpG-ODN，可期待其作为阿尔茨海默病治疗药的应用·临床应用。但是，如前文所述，以往报告的CpG-ODN不具有脑靶向性，不能用于实际的治疗。另外，考虑到向生体给药时受核酸分解酶的攻击等，特别是对稳定性等进行改善的余地大。
鉴于以上的课题，在以临床应用作为最终目标的基础上，尝试将功能性核酸CpG-ODN最适化的同时，为了使由末梢给药成为可能，尝试了提高CpG-ODN的脑靶向性。经反复试验后，对新设计的序列实施硫代磷酸化修饰的同时，通过与源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽连结，成功合成了稳定性高且显示良好的脑靶向性的新型分子（称为RVG-CpG）。确认了该分子能够保持Aβ处理能力、抗氧化酶HO-1诱导能力，在神经细胞·小胶质细胞的共同培养中抑制低聚物Aβ的神经毒性。而且，阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能障碍显著得到了改善。因此，证明该分子对阿尔茨海默病非常有效，同时，表示该分子的合成时采用的方法（为了稳定化的硫代磷酸化修饰以及为了赋予脑靶向性的RVG肽的连结）对功能性CpG-ODN的临床应用是有效的。
以下示出的本发明主要是基于以上的成果。
[1].一种阿尔茨海默病治疗药，其特征在于，含有：寡聚脱氧核苷酸与源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽连结的结构体或其药理学上可接受的盐，所述寡聚脱氧核苷酸包含CpG模体且被硫代磷酸化修饰。
[2].根据[1]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述结构体显示增强小胶质细胞的神经保护作用的作用。
[3].根据[1]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述作用是小胶质细胞特异性的。
[4].根据[1]～[3]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是CpG B类。
[5].根据[1]～[4]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述CpG模体由gacgtt构成。
[6].根据[1]～[5]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸具有在CpG模体的两侧分别连结有一个～多个的核苷酸的结构。
[7].根据[6]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是10～20核苷酸长。
[8].根据[6]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是10～14核苷酸长。
[9].根据[6]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸由序列号1的序列构成。
[10].根据[1]～[9]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚核苷酸中，构成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修饰。
[11].根据[1]～[10]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸与所述RVG肽在所述RVG肽中的半胱氨酸残基位置介由二硫键连结。
[12].根据[1]～[11]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸的5′末端与所述RVG肽连结。
[13].根据[1]～[12]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在该半胱氨酸位置也连结有所述寡聚脱氧核苷酸。
[14].根据[13]所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，2分子的所述寡聚脱氧核苷酸与1分子的所述RVG肽相连结。
[15].根据[1]～[14]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述RVG肽由序列号3的序列构成。
[16].权利要求[1]～[15]中任一项定义的结构体的用于制造阿尔茨海默病治疗药的使用。
[17].一种阿尔茨海默病的治疗方法，其特征在于，含有如下工序：将[1]～[15]中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药以治疗上有效的量给药阿尔茨海默病患者。
[18].一种结构体，是由序列号1的序列构成的硫代磷酸化修饰的寡聚脱氧核苷酸与由序列号3的序列构成的源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽在该RVG肽中的半胱氨酸残基的位置介由二硫键连结而成的。
[19].根据[18]所述的结构体，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在该半胱氨酸位置也连结有所述寡聚脱氧核苷酸。
[20].根据[18]或[19]所述的结构体，其中，所述寡聚核苷酸中，构成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修饰。
附图说明
图1是说明硫代磷酸化修饰的模式图。
图2是CpG-ODN与源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽的连结状态。该例子中，CpG-ODN和RVG肽介由直链状碳链（C6）和二硫键连结。
图3是比较所制作的各种CpG-ODN的小胶质细胞活化作用的坐标图（MTS测定的结果）。＊表示与对照组（-：未添加）之间有显著差异。
图4是比较所制作的各种CpG-ODN的Aβ低聚物减少效果的坐标图。oAβ：Aβ低聚物
图5是比较所制作的各种CpG-ODN的神经保护作用的坐标图。将添加各CpG-ODN时的神经细胞的生存率与未添加的情形（左数第2个）进行了比较。＊表示与对照组（未添加）之间有显著差异。oAβ：Aβ低聚物
图6是CpG-ODN与RVG肽连结的结构体的结构。CpG-ODN与在C末端加成有半胱氨酸的RVG肽（RVG-Cys肽）连结。连结部位是RVG-Cys肽的中央部的半胱氨酸位置和在C末端加成有半胱氨酸的位置这两处，成为2分子的CpG-ODN与1分子的RVG-Cys肽连结的结构体（RVG-CpG）。关于CpG-ODN仅示出连结部（5′末端），省略了其他部分。
图7是使用阿尔茨海默病模型小鼠在条件性恐惧学习试验的结果。对阿尔茨海默病模型小鼠（APP/PS1转基因小鼠）腹腔内给药RVG-Cys-127-5，考察认知功能障碍的改善程度。对照组给药PBS。＊表示与对照组（PBS）之间有显著差异。WT：同系的野生型小鼠。APP/PS1：APP/PS1转基因小鼠。
图8是表示RVG-Cys-127-5的Aβ低聚物减少效果的坐标图。＊表示与对照组（oAβ：RVG-Cys-127-5未添加）之间有显著差异。oAβ：Aβ低聚物
图9是表示RVG-Cys-127-5的神经保护作用的坐标图。比较了添加RVG-Cys-127-5时的神经细胞的生存率（右）和未添加的情形（中央）。＊表示与对照组（cont：RVG-Cys-127-5未添加）之间有显著差异。cont：对照组、oAβ：Aβ低聚物
图10是表示RVG-Cys-127-5的抗氧化酶HO-1产生效果的坐标图。＊表示与对照组（oAβ：RVG-Cys-127-5未添加）之间有显著差异。oAβ：Aβ低聚物
具体实施方式
本发明的第1方面涉及阿尔茨海默病治疗药。本说明书中的用语“治疗药”是指，对作为目标疾病或病态的阿尔茨海默病具有治疗或预防的效果的医药。治疗的效果包括缓解阿尔茨海默病的特征性症状或伴随症状（轻症化），阻止或延迟症状的恶化等。关于后者，在预防重症化这一点上，可以视为预防的效果之一。因此，由于治疗的效果与预防的效果是部分重叠的概念，将其明确进行区分是困难的，另外这样做也没有多大实际意义。此外，预防的效果的典型例子是阻止或延迟阿尔茨海默病的特征性症状的复发。此外，只要对阿尔茨海默病显示任何治疗的效果或预防效果或者这两者，即属于阿尔茨海默病治疗药。
本发明的有效成分是含有CpG模体且被硫代磷酸化修饰的寡聚脱氧核苷酸与源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽连结的结构体或其药理学上可接受的盐。即，本发明以特定的寡聚脱氧核苷酸与RVG肽连结的结构的分子为有效成分。本发明的有效成分对小胶质细胞显示特征性的作用，即，增强小胶质细胞的神经保护作用的作用。更具体而言，本发明的有效成分不诱导神经伤害因子谷氨酸、一氧化氮以及TNF-α的产生就能够提高小胶质细胞的Aβ低聚物处理能力。该作用是典型的小胶质细胞特异性的。此处的用语“小胶质细胞特异性的”是指作用于小胶质细胞，另一方面，对其他细胞（特别是存在于末梢的单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞）实质上没有作用或者即使产生作用其作用程度也显著低。
另一方面，本发明的有效成分能作用于小胶质细胞，促进抗氧化酶血红素加氧酶1（HO-1）的产生。该作用对于因Aβ低聚物引起的活性氧（ROS）的产生的抑制是有效的。
（1）CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）
本发明的寡聚脱氧核苷酸含有CpG模体。此处的用语“模体”是指具有特定功能的特征性共有序列。“CpG模体”是由特定的6碱基（5′-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3′）构成的低聚DNA。本发明的一个实施方式中作为CpG模体部分的序列包含gacgtt。
含有CpG模体的寡聚脱氧核苷酸，依照其结构上的特征分类为3个类、即，A类、B类以及C类。A类的CpG-ODN中，CpG模体部分使用磷酸二酯键。A类的CpG-ODN强烈诱导浆细胞样树突状细胞（pDC）的IFN-α分泌。另一方面，浆细胞样树突状细胞的成熟化作用没有这样强，并且，对B细胞的作用低。B类的CpG-ODN是直线状的，且具有硫代磷酸化骨格。典型的是全部被硫代磷酸化修饰。B类的CpG-ODN通常强烈诱导B细胞的增殖以及浆细胞样树突状细胞（pDC）的成熟化，另一方面，其基本不诱导浆细胞样树突状细胞的IFN-α分泌。C类的3′末端侧具有回文结构，形成双链。C类的CpG-ODN活化B细胞以及NK细胞，诱导IFN-γ。
优选，出于显示特别强的神经保护作用的事实（参照后述的实施例以及The American Journal of Pathology.175:2121-2131，2009），本发明中使用B类的CpG-ODN。硫代磷酸化修饰的位置以及程度（即，硫代磷酯键的引入位置以及引入数量）没有限制。由于硫代磷酸化修饰的部位稳定化，对核酸酶的分解抵抗性提高，因此硫代磷酸化修饰的程度越大越好。特别优选使用构成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修饰的B类的CpG-ODN。
优选，本发明中CpG-ODN具有在CpG模体的两侧分别连结有1～多个核苷酸的结构。换而言之，CpG模体不位于末端。CpG模体的5′侧或3′侧连结的核苷酸数量无特别限制，但是考虑到脑靶向性，分子量最好不大。CpG模体的5′侧连结的核苷酸的数量优选为1～8个，更优选为2～6个，进一步优选为2～4个。CpG模体的3′侧连结的寡聚核苷酸的数量也相同。
如上所述，考虑到脑靶向性，CpG-ODN的分子量最好不大。因此，CpG-ODN的整体长度优选为10～25核苷酸长，更优选为10～20核苷酸长，进一步优选为10～14核苷酸长。本发明中优选的CpG-ODN的具体例子如下所示。此外，序列中的S表示硫代磷酯键（参照图1）。
cSaStSgSaScSgStStScScSt（序列号1）
tcSgtcSgttttgtcSgttttgtcSgtt（序列号2）
关于前者的CpG-ODN（序列号1），不仅在使用培养细胞实验中，在使用阿尔茨海默病模型动物的实验中也确认了其有效性，特别优选CpG-ODN。
被硫代磷酸化修饰的CpG-ODN，可通过利用固相氰乙基亚磷酰胺法的方法等常规方法进行合成（例如，参照Journal of the AmericanChemical Society112:1253,1990）。合成的CpG-ODN的分离·精制，例如，可利用反相高效液相色谱进行。
（2）源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽
向脑内的移动被血脑屏障严密地控制。本发明中为了赋予脑靶向性，使用源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽。RVG肽的序列如下所示。本说明书中按照惯用的标记方法，将左端成为氨基末端（N末端）、右端成为羧基末端（C末端）的方式对肽进行标记。此外，利用源自狂犬病病毒糖蛋白的肽的运输体系已有报告（例如，参照Nature448:39-43，2007；Nature Biotechnology29:341-345，2011）。
YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG（序列号3）
在不损害本发明中要求的特性（即、赋予脑靶向性）的范围内，允许RVG肽的构成氨基酸的部分改变或修饰。此处的“部分改变”是指由1～多个（上限例如是3个、5个、7个）的氨基酸的缺失、置换或者通过1～多个（上限例如是3个、5个、7个）的氨基酸的添加、插入或这些的组合而在氨基酸序列中产生突变（变化）。另外，“修饰”是指，通过基本结构（典型的是由序列号3的序列构成的肽）的部分置换或其他分子的加成等而提高其稳定化，赋予新的功能。作为本领域技术人员，能够利用公知或惯用的手段设计置换体等修饰体。另外，基于该设计，利用公知或惯用的手段调制目的修饰体，考察其性质、作用，对于本领域技术人员也是容易的。
作为肽修饰体的例子，可例举出构成氨基酸残基内的官能团由适当的保护基（酰基、烷基、单糖、低聚糖、多糖等）保护的肽修饰体、添加糖链的肽修饰体、N末端或C末端通过由其他原子等置换而被分类为烷基胺、烷基酰胺、亚磺酰、砜酰胺、卤化物、酰胺、氨基醇、酯、氨基醛等的各种肽衍生物、标识化肽（例如，N末端由生物素标识或FITC标识的肽、由荧光色素标识化的肽等）。此外，保护基可根据与保护基结合的肽的部位、使用的保护基的种类等，通过酰胺键、酯键、氨酯键、尿素键等进行连结。
本发明中的肽（RVG肽或其改变体、修饰体），可利用公知的肽合成法（例如固相合成法、液相合成法）进行制造。此外，也可通过从生体材料提取·精制、调制本发明中的肽。
本发明中肽也可通过基因工程学的方法进行调制。即，将编码本发明中的肽的核酸引入适当的宿主细胞，通过回收转化体内表达的肽，从而也能够调制本发明中的肽。根据需要对回收的肽进行精制。将回收的肽提供于适当的置换反应，也能将其变换为所需的改变体。
本发明的有效成分结构体中CpG-ODN与RVG肽连结。连结可利用适用于核酸和肽连结的各种方法。在一个方式中，RVG肽中的半胱氨酸位置介由二硫键与CpG-ODN连结。这样的连结可利用John J.Turner等开发的方法（例如，参照Nucleic Acids Research,33:27-42,2005）。该方法中，例如使用巯基化修饰剂，其结果是通过介由碳链的二硫键，CpG-ODN的5′末端侧与RVG肽进行连结（参照图2）。通过使用的修饰剂可改变碳链的种类（直链或支链、长度）。碳链的碳原子数例如是C3～C10。但是，考虑到脑靶向性，优先将结构体低分子化，因此，可将碳链的长度设置为C3～C7的程度。
本发明的一个方式中，在RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸。将该半胱氨酸利用于CpG-ODN的连结。即，该方式中RVG肽中的半胱氨酸残基位置之外，在末端半胱氨酸位置也连结CpG-ODN。即，将2分子的CpG-ODN与1分子的RVG肽连结的结构体作为有效成分使用。这种情况下，2分子的CpG-ODN的结构没有必要相同。但是，典型的是由使用相同结构的2分子CpG-ODN形成该结构体。此外，在C末端加成有半胱氨酸的RVG肽的序列如下所示。
YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC（序列号4）
在N末端侧或C末端侧也可进一步加成1～多个的半胱氨酸。通过这种追加而加成的半胱氨酸的数量无特别限制，例如是1～10个。加成的半胱氨酸的一部分或全部用于与CpG-ODN的结合。由此，可形成相对于RVG肽的分子数，CPG-ODN的分子数的比率增大的结构体（例如1分子的RVG肽与3～10分子的CPG-ODN连结的结构体）。此外，也可以在RVG肽的N末端侧或C末端侧不直接加成半胱氨酸，而是以隔着其他氨基酸的状态加成半胱氨酸。通过追加二个以上的半胱氨酸而进行加成的情形下也可以在各半胱氨酸残基之间隔着其他氨基酸。
作为本发明的治疗药的有效成分也可使用所述结构体的药理学上接受的盐。“药理学上接受的盐”是指，例如酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐或氨基酸加成盐。作为酸加成盐的例子可例举出三氟乙酸盐盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐等无机酸盐，乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、苹果酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐等有机酸盐。作为金属盐的例子可例举出钠盐、钾盐、锂盐等碱金属盐，镁盐、钙盐等碱土类金属盐，铝盐，锌盐等。作为铵盐的例子可例举出铵、四甲基铵等盐。作为有机胺加成盐的例子可例举出吗啉加成盐、哌啶加成盐。作为氨基酸加成盐的例子可例举出甘氨酸加成盐、苯丙氨酸加成盐、赖氨酸加成盐、天冬氨酸加成盐、谷氨酸加成盐。这些盐的调制可通过惯用手段进行。
本发明的治疗药的制剂化可按照常规方法进行。制剂化时，可含有制剂上接受的其他成分（例如，缓冲剂、赋形剂、崩解剂、乳化剂、混悬剂、舒缓剂、稳定剂、保藏剂、防腐剂、生理食盐水、载体等）。作为缓冲剂可使用磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。作为赋形剂可使用乳糖、淀粉、山梨醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂可使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂可使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂可使用阿拉伯胶、精氨酸钠、黄蓍胶等。作为混悬剂可使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为舒缓剂可使用苄醇、氯丁醇、山梨醇等。作为稳定剂可使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保藏剂可使用苯酚、氯化苯扎、苄醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作为防腐剂可使用氯化苯扎、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
制剂化时的剂型也无特别限制。剂型的例子是注射剂、片剂、散剂、微粒剂、颗粒剂、胶囊剂以及糖浆剂。
本发明的治疗药中，为了达到期待的治疗效果（或预防效果）含有必要量（即治疗上有效的量）的有效成分。本发明的治疗药中的有效成分量通常因剂型不同而不同，为了达到期望的给药量，例如将有效成分量设定在约0.001重量％～约95重量％的范围内。
本发明的治疗药根据其剂型通过口服给药或非口服给药（静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜等）应用于对象。这些给药途径相互间不是排斥的，也可任意选择两种以上联合使用（例如，口服给药的同时或经过一定时间后进行静脉注射等）。此处的“对象”无特别限制，包括人以及人以外的哺乳动物（包括宠物动物、家畜、实验动物。具体而言，例如小鼠、大树、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等）。优选的一个方式中本发明的治疗药应用于人。
本发明的治疗药的给药量，以达到期待的治疗效果来进行设定。在治疗上有效的给药量的设定中，通常考虑患者的症状、年龄、性别以及体重等。此处，作为本领域技术人员能够考虑到这些事项而设定适当的给药量。例如，将成人（体重约60kg）作为对象，以每日的有效成分量为约10μg～约100μg、优选为约20μg～约50μg的方式来设定给药量。作为给药方案，例如可采用1日1次～数次、2日1次或3日1次等。制定给药方案可考虑患者的症状、有效成分的效果持续时间等。
由于本发明的有效成分结构体能增强小胶质细胞的神经保护作用，隐含着应用于阿尔茨海默病以外的神经变性疾病（例如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病）的可能性，其自身具有有用的且高的价值。另外，将该结构体作为对以阿尔茨海默病为首的神经变性疾病的医药·药剂的开发的种子化合物也是有用的。
实施例
本发明着眼于属于Toll样受体9（TLR9）的配体的CpG-ODN的有用性，以开发新型阿尔茨海默病治疗方法为目标。
1.CpG-ODN的最适化
以对阿尔茨海默病显示有效性的CpG-ODN（CpG Subtype B：5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’（序列号5））为基础，设计具有直线结构的ODN。另外，为了阻止因核酸分解酶导致的分解，实施了修饰。
2.制作的CpG-ODN的有效性的研究
关于制作的CpG-ODN，按照以下方法评价有效性。首先，通过MTS测定，选择活化培养小胶质细胞的CpG-ODN。另一方面，在神经元、小胶质细胞共同培养下，给药制作的CpG-ODN(1，10，100nM)后，添加5μM的Aβ低聚物，检测·评价24小时后的神经细胞的死亡。通过免疫染色选择显示70%以上的生存率的CpG-ODN。接下来，对培养的小胶质细胞，添加选择后的CpG-ODN后，加入5μM的Aβ低聚物，选择24小时后在ELISA法的定量中Aβ低聚物减少40%以上的CpG-ODN。
MTS测定考察的结果如图3所示。比较了6种CpG-ODN（127-1、127-2、127-3、127-4、127-5、2006）的结果。127-1、127-2、127-5显示高的活化能力。特别是判断为有效性高的127-5，其全部被硫代磷酸化修饰。127-2中，一部分也实施了硫代磷酸化修饰。这两个CpG-ODN的序列如下所示。其中，序列中的S表示硫代磷酯键。
127-5：cSaStSgSaScSgStStScScSt（序列号1）
127-2：tcSgtcSgttttgtcSgttttgtcSgtt（序列号2）
各CpG-ODN的Aβ低聚物减少效果（ELISA法的结果）如图4所示。另外，对神经细胞死亡的效果（通过免疫染色的生存率的评价）如图5所示。由此可知，127-1、127-2以及127-5能有效减少Aβ低聚物，显示出神经保护作用。
3.脑靶向性CpG-ODN的制成（脑靶向性肽的加成）
通过向确认了有效性的CpG-ODN（127-1、127-2、127-4、127-5）加成源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽（YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG（序列号3））赋予脑靶向性。首先，准备在RVG肽的C末端加成有半胱氨酸（Cys）的脑靶向性RVG-Cys肽（YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC（序列号4））。然后，将RVG-Cys肽的半胱氨酸残基吡啶化之后，在适当的浓度条件下与5′巯基化CpG-ODN混合进行置换反应。将得到的反应物由反向HPCL法进行精制。
通过以上操作，得到在RVG-Cys肽中的2个半胱氨酸位置上，CpG-ODN介由碳链以及二硫键连结的结构体（RVG-CpG）（图6）。
4.脑靶向性CpG-ODN（RVG-CpG）的有效性的验证（通过阿尔茨海默病模型小鼠的研究）
考察了使用通过2.的考察而判断为有效性最高的127-5来制作的脑靶向性CpG-ODN（RVG-Cys-127-5）的治疗效果。考察采用使用阿尔茨海默病模型小鼠（APP/PS1转基因小鼠（Jackson Laboratory））的条件性恐惧学习试验（配对联结式学习）。简单说明试验方法则对阿尔茨海默病模型小鼠以每次1μg的给药量隔日、腹腔内给药RVG-Cys-127-5（总计3次）。全部给药结束第2天将小鼠放入试验箱，仅实施电刺激或者实施电刺激和声音刺激，进行条件施加。次日，对仅放入箱中的情形和进一步加入声音刺激的情形的不动状态(Freezing),进行评价并定量化。阿尔茨海默病模型小鼠不动状态减少，而RVG-Cys-127-5给药组不动状态显著增加，可知认知功能得到改善。另一方面，还根据2.中的评价方法进行了使用培养细胞的考察。另外，还按照以下方法考察了在Aβ低聚物存在下的氧化酶HO-1的产生的促进作用。在Aβ低聚物存在下，对培养小胶质细胞给药RVG-Cys-127-5，24小时后，破碎细胞，使用HO-1ELISA试剂盒对HO-1蛋白进行了定量。
条件性恐惧学习试验的结果如图7所示。通过RVG-Cys-127-5的给药，认知功能障碍得到显著改善。使用培养细胞的实验中，RVG-Cys-127-5显著减少Aβ低聚物的量（图8）、神经细胞的生存率显著提高（图9），而且促进作用于神经保护的HO-1的产生（图10）。以上结果显示RVG-Cys-127-5对阿尔茨海默病是有效的。
5．结论
本申请成功合成了脑靶向性及稳定性优异的新型分子，即功能性核酸（RVG-CpG）。该分子显示神经保护作用，通过末梢给药，显著改善了阿尔茨海默病模型动物的认知能力。这一事实显示该分子对阿尔茨海默病是有效的。另外，其强烈提示适用于其他神经变性疾病的可能性。基于该分子，以进一步提高药效为目标的新型药剂的开发也受到期待。
另一方面，以上的实验结果也证明在新型分子的合成时采用的方法（为了稳定化的硫代磷酸化修饰以及为了赋予脑靶向性的RVG肽的连结）的有效性。作为RVG肽的应用，在RVG肽中加成9个赖氨酸，与siRNA进行电结合而给药的Kumar等的例子（Nature448:39-43,2007）非常有名。与此对照，本次成功合成的新型分子中是利用S-S键将肽与核酸连结，其稳定性高，合成成本低。在实用化方面这些特征也非常重要。
工业上的利用可能性
作为本发明的有效成分的新型RVG-CpG结构体的脑靶向性及稳定性优异，通过增强小胶质细胞的神经保护作用发挥药效。不局限于阿尔茨海默病的应用，可期待将其应用于其他神经变性疾病（例如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿病）。作为对以阿尔茨海默病为首的神经变性疾病的医药·药剂的开发的种子化合物来利用该结构体也是可预想的。
本发明不受前述本发明的实施方式以及实施例的说明的任何局限。在不脱离权利要求书的记载的情况下，本领域技术人员容易想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明的范围内。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容，将其全部内容通过援引而引用。
序列号1：人工序列的说明：CpG寡聚脱氧核苷酸
序列号2：人工序列的说明：CpG寡聚脱氧核苷酸
序列号5：人工序列的说明：CpG寡聚脱氧核苷酸
Figure IDA0000400581750000011

Claims (20)

1.一种阿尔茨海默病治疗药，其特征在于，含有：寡聚脱氧核苷酸与源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽连结的结构体或其药理学上可接受的盐，所述寡聚脱氧核苷酸包含CpG模体且被硫代磷酸化修饰。
2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述结构体显示增强小胶质细胞的神经保护作用的作用。
3.根据权利要求2所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述作用是小胶质细胞特异性的。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是CpG B类。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述CpG模体由gacgtt构成。
6.权利要求1～5中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸具有在CpG模体的两侧分别连结有一个～多个核苷酸的结构。
7.根据权利要求6所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是10～20核苷酸长。
8.根据权利要求6所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸是10～14核苷酸长。
9.根据权利要求6所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸由序列号1的序列构成。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚核苷酸中，构成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修饰。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸与所述RVG肽在所述RVG肽中的半胱氨酸残基位置介由二硫键连结。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述寡聚脱氧核苷酸的5′末端与所述RVG肽连结。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在该半胱氨酸位置也连结有所述寡聚脱氧核苷酸。
14.根据权利要求13所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，2分子的所述寡聚脱氧核苷酸与1分子的所述RVG肽相连结。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药，其中，所述RVG肽由序列号3的序列构成。
16.权利要求1～15中任一项定义的结构体的用于制造阿尔茨海默病治疗药的应用。
17.一种阿尔茨海默病的治疗方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～15中任一项所述的阿尔茨海默病治疗药以治疗上有效的量向阿尔茨海默病患者给药。
18.一种结构体，是由序列号1的序列构成的被硫代磷酸化修饰的寡聚脱氧核苷酸与由序列号3的序列构成的源自狂犬病病毒糖蛋白的RVG肽在该RVG肽中的半胱氨酸残基的位置介由二硫键连结而成的。
19.根据权利要求18所述的结构体，其中，在所述RVG肽的N末端或C末端加成有半胱氨酸，在该半胱氨酸位置也连结有所述寡聚脱氧核苷酸。
20.根据权利要求18或19所述的结构体，其中，所述寡聚核苷酸中，构成其的全部核苷酸被硫代磷酸化修饰。
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