JP2018516595A - Hif2αの遺伝子発現を阻害する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
EPAS1は、HIF(低酸素誘導因子)遺伝子ファミリーの一員である。Hif2アルファ又はHif2αとしても公知のEPAS1は、酸素により調節された遺伝子の誘導に関与し、且つ酸素レベルが低下した際(低酸素症として知られる状態)に誘導される転写因子の半分をコードしている。
Hif2α(EPAS、又はHif2アルファとも称す)の発現を選択的且つ効果的に減少することができる、Hif2α遺伝子−特異的RNA干渉(RNAi)トリガー分子(RNAi剤、RNAiトリガー、又はトリガーとも称す)が、本明細書において記載されている。各RNAiトリガーは、少なくともセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。このセンス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的であることができる。本明細書に記載されたRNAiトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、16〜30ヌクレオチド長であることができる。一部の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して17〜26ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さ又は異なる長さのいずれかであることができる。本明細書に記載されたRNAiトリガーは、Hif2α遺伝子を発現している細胞への送達時に、インビトロ又はインビボにおいてHif2α遺伝子の発現を阻害する。Hif2αRNAiトリガーにおいて使用することができるHif2αRNAiトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の例は、表1−2及び表5に提供されている。
Hif2α遺伝子の発現を阻害するためのRNAiトリガー(本明細書においてHif2αRNAiトリガーと称す)が、本明細書において記載される。各Hif2αRNAiトリガーは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたRNAiトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して16〜30ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたRNAiトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して17〜26ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたRNAiトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して17、18、19、20、21、22、23、24、25、又は26ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであるか、又はこれらは異なる長さであるかのいずれかであることができる。一部の実施態様において、センス鎖は、約19ヌクレオチド長であるが、アンチセンス鎖は、約21ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、センス鎖は、約21ヌクレオチド長であるのに対し、アンチセンス鎖は、約23ヌクレオチド長である。他の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して17〜21ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、各々21〜26ヌクレオチド長である。Hif2αRNAiトリガー分子の形成に使用されるヌクレオチド配列の例は、表1−2及び5に提供されている。
N=2’−OH(修飾されない)リボヌクレオチド(f又はd表示を伴わない大文字)
n=2’−OMe修飾されたヌクレオチド
Nf=2’−フルオロ修飾されたヌクレオチド
dN=2’−デオキシヌクレオチド
NUNA=2’,3’−セコヌクレオチド模倣物(アンロックド核酸塩基アナログ)
NM=2’−メトキシエチルヌクレオチド
(invdN)=逆方向デオキシリボヌクレオチド(3’−3’連結されたヌクレオチド)
(invAb)=逆方向脱塩基ヌクレオチド
s=ホスホロチオエート連結したヌクレオチド
p=リン酸基
vpdN=ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。
一部の実施態様において、本発明者らは、下記式により表される組成物を説明している:
(RNAiトリガー)n−ポリ(Aa-co-(Bb-グラフト-(Cc; Dd))) (式2)
式中:
Aは、疎水基−含有モノマー単位であり、
Bは、第一級アミン−含有モノマー単位であり、
Cは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して、第一級アミン−含有モノマー単位に連結された(すなわちグラフトされた)インテグリン−結合リガンドを含み、
Dは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して、第一級アミン−含有モノマー単位へ連結された(すなわちグラフトされた)立体安定剤を含み、
aは、0を超える整数であり、
bは、2以上の整数であり、
cは、1以上の整数であり、
dは、1以上の整数であり、
c+dの値は、bの値の80%を超えるか、85%を超えるか、90%を超えるか、又は95%を超え、
ポリ(Aa-co-Bb)は、A及びBモノマー単位を有する膜活性ポリアミンコポリマーであり、
RNAiトリガーは、本明細書に記載されたHif2αRNAiトリガーを含み、並びに
nは、0.25(すなわち、4つの送達ポリマー毎にただ1つにコンジュゲートされた)〜5.0の値を有する。
インテグリン−結合化合物は、細胞表面に発現された1又は複数のインテグリンに対し親和性を有する。インテグリンの非限定的例は、αvβ3インテグリンを含む。インテグリン−結合化合物の例は、αvβ3−結合化合物、RGDリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。RGDリガンドは、RGDペプチド−含有化合物及びRGD模倣物−含有化合物を含む。本明細書に使用されるRGDペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチドを含む。RGDペプチドは、立体的に拘束され得る。RGDペプチドは、RGDアミノ酸配列に連結された非ペプチド成分を有する。
本明細書に使用される立体安定剤は、立体安定剤を含まないポリマーに比べ、それが付着したポリマーの分子内又は分子間の相互作用を防止又は阻害する、非イオン性親水性ポリマー(天然、合成、又は非−天然のいずれか)である。立体安定剤は、それが付着したポリマーが、静電気的相互作用に関与することを妨げる。静電気的相互作用は、正電荷と負電荷の間の引力による、2種以上の物質の非共有的会合である。立体安定剤は、血液成分との相互作用を阻害することができ、従ってオプソニン化、ファゴサイトーシス、及び細網内皮系における取込みを阻害することができる。立体安定剤は結果的に、それらが付着した分子の循環時間を増大する。立体安定剤はまた、ポリマーの凝集も阻害することができる。一部の実施態様において、立体安定剤は、ポリエチレングリコール(PEG)又はPEG誘導体である。一部の実施態様において、PEGは、約1〜500エチレンモノマー又は単位を有することができる。一部の実施態様において、PEGは、2〜25エチレン単位を含む。一部の実施態様において、PEGは、4〜30エチレン単位を含む。一部の実施態様において、PEGは、5〜24エチレン単位を含む。一部の実施態様において、PEGは、平均分子量約85〜20,000ダルトン(Da)を有する。一部の実施態様において、PEGは、分子量約85〜1000Daを有する。本明細書に使用される立体安定剤は、水溶液中に立体安定剤を含まないポリマーに比べ、それが付着したポリマーの分子内又は分子間の相互作用を防止又は阻害する。
膜活性ポリアミンは、可逆的に修飾されてよい。可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの第一級アミンへの修飾剤の可逆性の付着により達成され得る。
R5−A4−A3−A2−A1−R6
を含み、ここで
R5は、標的化基(M1)又は立体安定剤(M2)を含み、
A4は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性Lアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖(R−基)の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、pH7での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は、41以上であり、
A3は、非荷電親水性Lアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖(R−基)の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、pH7での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は、−28以下であり、
A2は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性Lアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖(R−基)の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、pH7での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は41以上であり、
A1は、L−プロリン、L−ロイシン、又はL−N−メチルアラニンであり、並びに
R6は、Pであり、ここでPは式1の膜活性ポリアミンである。
R5は、標的化基(M1)又は立体安定剤(M2)を含み、
R4は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性アミノ酸の側鎖であり、
R3は、非荷電親水性アミノ酸、好ましくはシトルリンの側鎖であり、
R2は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンの側鎖であり、
X及びYは
a)各々、(CH2)2(CH3)2及びHであるか(テトラペプチドA1はロイシンである)、
b)各々、CH3−及びCH3−であるか(テトラペプチドA1はN−メチルアラニンである)、又は
c)各々、CH2−及びCH2−CH2−であり(テトラペプチドA1はプロリンであり);並びに、
R’は、
R−A1A2−アミドベンジル−炭酸塩
を有するジペプチド修飾剤(ジペプチド−PABC−PNP修飾剤)により、修飾されており、ここで、Rは、立体安定剤又は標的化基を含み、A1は、疎水性アミノ酸であり、及びA2は、親水性非荷電アミノ酸である。修飾剤炭酸塩のポリマーアミンとの反応は、カルバメートリンケージを生じる。一部の実施態様において、アミドベンジル基は、p−アミドベンジル基である。一部の実施態様において、炭酸塩は、活性化されたアミン反応性炭酸塩である。一部の実施態様において、ジペプチド−PABC切断可能なリンカーは、以下に表された一般構造を有し:
一部の実施態様において、少なくとも一種の記載されたHif2αRNAiトリガーが、Hif2α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう対象の治療のための医薬組成物(すなわち医薬品)の調製において使用される。これらの医薬組成物は、細胞、組織、又は臓器におけるHif2α遺伝子の発現の阻害において有用である。一部の実施態様において、記載された医薬組成物は、Hif2α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象を治療するために使用される。
一部の実施態様において、本明細書に記載されたHif2αRNAiトリガーを使用し、Hif2α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象を治療する。一部の実施態様において、記載されたHif2αRNAiトリガーを使用し、Hif2α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象において少なくとも1つの症状を治療又は予防する。対象には、治療的有効量の記載されたRNAiトリガーのいずれか1又は複数が投与され、これによりその症状を治療する。
(実施例1. RNAiトリガーの合成)
A)合成 RNAiトリガー分子は、オリゴヌクレオチド合成において使用される固相ホスホロアミダイト法に従い合成した。規模に応じて、MerMade96E(Bioautomation社)又はMerMade12(Bioautomation社)のいずれかを使用した。合成は、制御された細孔のあるガラス(CPG、500Å又は600Å、Prime Synthesis社、アストン、PA、米国から入手)で製造された、固体支持体上で行った。全てのDNA、2’−修飾されたRNA、及びUNAホスホロアミダイトは、Thermo Fisher Scientific社(ミルウォーキー、WI、米国)から購入した。具体的には、以下の2’−O−メチルホスホロアミダイトを使用した:(5’−O−ジメトキシトリチル−N6−(ベンゾイル)−2’−O−メチル−アデノシン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ)ホスホロアミダイト、5’−O−ジメトキシ−トリチル−N4−(アセチル)−2’−O−メチル−シチジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−アミノ)ホスホロアミダイト、(5’−O−ジメトキシトリチル−N2−(イソブチリル)−2’−O−メチル−グアノシン−3’−O−(2−シアノ−エチル−N,N−ジイソプロピルアミノ)ホスホロアミダイト、及び5’−O−ジメトキシ−トリチル−2’−O−メチル−ウリジン−3’−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルアミノ)ホスホロアミダイト。2’−デオキシ−2’−フルオロ−ホスホロアミダイトは、2’−O−メチルRNAアミダイトと同じ保護基を保有する。以下のUNAホスホロアミダイトを使用した:5’−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N−ベンゾイル−2’,3’−セコ−アデノシン、2’−ベンゾイル−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロ−アミダイト、5’−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N−アセチル−2’,3’−セコ−シトシン、2’−ベンゾイル−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、5’−(4,4’−ジメトキシトリチル)−N−イソブチリル−2’,3’−セコ−グアノシン、2’−ベンゾイル−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト、及び5’−(4,4’−ジメトキシ−トリチル)−2’,3’−セコ−ウリジン、2’−ベンゾイル−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−ホスホロアミダイト。全てのアミダイトは、無水アセトニトリル(50mM)中に溶解し、且つ分子篩(3Å)を加えた。これらのオリゴマーの5’−末端にTEG−コレステロールを導入するために、Glen Research社(スターリング、VA、米国)の1−ジメトキシトリチルオキシ−3−O−(N−コレステリル−3−アミノプロピル)−トリエチレングリコール−グリセリル−2−O−(2−シアノエチル)−(N,N,−ジイソプロピル)−ホスホロアミダイトを用いた。この5’−修飾は、合成サイクルを何ら変更せずに、導入した。5−ベンジルチオ−1H−テトラゾール(BTT、アセトニトリル中250mM)を、アクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は、10分(RNA)、180秒(コレステロール)、90秒(2’OMe及びUNA)、並びに60秒(2’F及びDNA)であった。ホスホロチオエートリンケージを導入するために、無水アセトニトリル中の3−フェニル 1,2,4−ジチアゾリン−5−オン(POS、PolyOrg社、レオミンスター、MA、米国から入手)の100mM溶液を利用した。具体的配列については、表1−2及び5を参照されたい。
ポリマー100A:1H−NMRによる組成:56%N−Boc−エトキシエチルアミンアクリレート及び44%アクリル酸プロピル。MALSによるMW:65,150、PDI 1.122。
ポリマー064:1H−NMRによる組成:54%N−Boc−エトキシエチルアミンアクリレート及び46%アクリル酸プロピル。MALSにより決定された064のMW:57,957g/mol、多分散度(PDI)1.07。
ポリマー100A:1H−NMRにより決定された組成は、56%N−Boc−エトキシエチルアミンアクリレート及び44%アクリル酸プロピルであった。MALSにより決定されたMwは、64,430g/molで、PDIは1.217であった。
ポリマー064:1H−NMRにより決定された組成は、54%N−Boc−エトキシエチルアミンアクリレート及び46%アクリル酸プロピルであった。MALSにより決定されたMwは、65,170で、PDIは1.05であった。
(i)MALS分析 コポリマーのおよそ10mgを、75%ジクロロメタン、20%テトラヒドロフラン、及び5%アセトニトリルの0.5mL中に溶解した。分子量及び多分散度(PDI)を、Jordi 5μm 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを使用するShimadzu Prominence HPLCに装着されたWyatt Heleos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。脱保護前の分子量(ポリマー006):60,330(PDI 1.05)。
コンジュゲート形成後、すなわちRGD及びPEG修飾剤の付加並びにRNAiトリガーの付着によるポリマーの修飾(下記実施例9参照)後、コンジュゲート溶液(2mg/mL、10mL)を、接線流濾過システム(KrosFlo Research)を装着したmPES 30kD 20cm2フィルターモジュールを使用し、10等量容積の10mMリン酸−クエン酸緩衝液(pH5)と交換した。pH値5.1を記録した。
(i)コンジュゲーションを通じたポリマー濃度。G(iii)節と同じ方法を、コンジュゲートの集成を通じて使用し、ポリマー濃度をモニタリングした。
A. ジペプチドRGD−ジペプチド及びPEG−ジペプチド修飾剤は、US−2012−0172412−A1(WO2012/092373)及びUS2015−0045573A1(WO2015/021092)に記載されたように製造した(これらは両方共引用により本明細書中に組み込まれている)。図3〜7。
A)テトラペプチド合成 全てのテトラペプチドは、標準固相Fmoc手順を使用する同じ様式で合成した。一部のペプチドは、プロリン、ロイシン、又はアラニンのいずれかを含む、商業的に入手可能な2−Cl−Trt樹脂(EMD Millipore社、ビレリカ、MA)から合成した。他のペプチドに関して、2−Cl−Trt樹脂は、アミノ酸又はPEG(1当量)及びDIEA(2当量)を含有するDMFの溶液を2−Cl−Trt樹脂に16時間添加することにより、FMOC−PEGn−CO2H又はFMOC−N−メチル−Ala−CO2Hのいずれかを負荷した。完了時に、樹脂を、MeOHでキャッピングした。カップリングのために、PYBOP(4当量)、アミノ酸(4当量)、及びDIEA(8当量)を、並びにFmoc脱保護のために、DMF中の20%ピペリジンを用いて、段階的添加を行った。
1)プロトコール1 指定したポリマーを、SMPTと、重量比1:0.015(ポリマー:SMPT)で、5mM HEPES(pH8.0)緩衝液中、RTで1時間反応させた。次にSMPT−修飾されたポリマーを、アルデヒド−PEG−ジペプチド修飾剤(アルデヒド−PEG12−FCit又はアルデヒド−PEG24−ACit)と、所望の比で、RTで1時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、PEG12−ジペプチド修飾剤(PEG12−FCit、PEG12−ACit又はPEG24−ACit)と、重量比1:2(ポリマー:PEG)で、100mM HEPES(pH9.0)緩衝液中、RTで1時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、SATA−RNAiトリガーと、重量比1:0.2(ポリマー:SATA−RNAiトリガー)で、100mM HEPES(pH9.0)緩衝液中、RTで一晩反応させ、RNAiトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なPEG(PEG12−FCit又はPEG12−ACit又はPEG24−ACit)と、重量比1:6(ポリマー:PEG)で、100mM HEPES(pH9.0)緩衝液中、RTで1時間反応させた。得られたコンジュゲートを、セファデックスG−50スピンカラムを用い、精製した。
候補配列を、インシリコ解析により同定し、且つインビトロにおいて化学的に修飾された基準の(canonical)siRNAとしてスクリーニングした。スクリーニング目的で、ヒトEPAS1(Hif2α)cDNA配列(寄託番号#NM_001430)を、合成し、且つ、市販のレポーターベースのスクリーニングプラスミドであるpsiCHECK2(Promega社、マジソン、WI)へクローニングし(DNA 2.0、メンローパーク、CA)、Renillaルシフェラーゼ/EPAS1融合mRNAを作製した。これはRNAiトリガー有効性評価のために、ヒト肝細胞癌株であるHep3B細胞を、96ウェルフォーマットにおいて、1ウェル当たり〜10,000個細胞を播種した。2つのサブセットにおいて、187種のEPAS1 RNAiトリガーの各々は、2種の濃度1nM及び0.1nMで、1ウェル当たり25ng EPAS1−psiCHECK2プラスミドDNA、及び1ウェル当たり0.2μLリポフェクタミン2000(Life Technologies社)と、同時トランスフェクションした。遺伝子のノックダウンを、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ(Promega社、マジソン、WI)を使用し、同じくpsiCHECK−2プラスミドに存在する、構成的に発現されたホタルルシフェラーゼのレベルに対し規準化された、Renillaルシフェラーゼレベルを測定することにより決定した。表5。
8つの最良の基準の配列を、EC50濃度を決定することにより、更に評価した。各トリガーを、前述のものと同じ条件及びアッセイ下であるが、0.00051nM〜10nMの範囲の10種の異なる濃度でのノックダウンについて評価した。EC50は、GraphPad Prismソフトウェアを使用し決定した。上位5つの基準の配列の各々は、6位及び7位にUNAを含むように、修飾した。これらのトリガーは、それらの親の基準の配列と共に、前述のものと同じ条件及びアッセイを用い、EC50濃度決定について、並行して評価した。表6。
CMVプロモーター下でアルカリホスファターゼ分泌(SEAP)レポーター遺伝子を発現しているpCR3.1発現ベクターを、Clontech社pSEAP2−基本ベクターからPCR増幅されたSEAPコーディング配列の方向性のあるクローニングにより調製した。都合の良い制限部位を使用したプライマー上に追加し、pCR3.1ベクター(Invitrogen社)へのクローニングのためのSEAPコーディング配列を増幅した。生じた構築体pCR3−SEAPを使用し、SEAPを発現しているA498 ccRCC細胞株を作製した。簡単に述べると、pCR3−SEAPプラスミドを、製造業者の推奨に従い、電気穿孔法により、A498 ccRCC細胞へトランスフェクションした。安定したトランスフェクタントを、G418耐性により選択した。選択されたA498−SEAPクローンを、SEAP発現及び組込み安定性について評価した。
雌の無胸腺ヌードマウスに、〜3%イソフルランにより麻酔をかけ、右側臥位位置に置いた。左脇腹に小さい0.5〜1cmの縦方向の腹部切開を行った。湿った綿スワブを使用し、左腎臓を、腹膜から持ち上げ、且つ優しく固定した。注射直前に、1.0mlシリンジに、細胞/Matrigel混合物を充填し、27ゲージ針カテーテルを、シリンジ先端に取り付けた。その後充填したシリンジを、シリンジポンプ(Harvard Apparatus社、モデルPHD2000)に取付け、且つ空気の除去を開始した。シリンジに取付けた27ゲージ針カテーテルの先端を、尾極近傍の腎被膜の真下に挿入し、次に針の先端を、被膜に沿って3〜4mm頭側に慎重に進めた。約300,000個細胞を含む2:1(容積:容積)細胞/マトリゲル混合物の10μlアリコートを、シリンジポンプを使用し、腎実質へ、ゆっくり注入した。針を、腎臓内に15〜20秒間放置し、注入が完了したことを確実にした。その後針を腎臓から取りだし、綿スワブを注射部位の上に30秒間放置し、細胞の漏出又は出血を防いだ。腎臓をその後、腹部へ優しく戻し、腹壁を閉じた。血清を、移植後7〜14日毎に採取し、市販のSEAPアッセイキットを用い、腫瘍成長をモニタリングした。ほとんどの試験に関して、腫瘍マウスは、移植後5〜6週間使用し、その時点での腫瘍の測定値は、典型的にはおよそ4〜8mmであった。
RGD標的化されたHiF2α−RNAiトリガー送達コンジュゲート。送達ポリマーを、RGD−PEG−HyNic、RGD−PEG−ACit−PNP、又はRDG−PEG−FCitFP−TFP、及びPEG−ジペプチド修飾剤を用いて、修飾した。指定された量のポリマー126又は100Aポリマーを、8×PEG12−ACit−PABC−PNP/0.5×アルデヒド−PEG24−FCit−PABC−PNP(プロトコール#1を使用し、RGD模倣物#1−PEG−HyNicによる)、並びに指定された量の指定されたHif2αRNAiトリガーにより、修飾した。ポリマー064は、プロトコール7に従い修飾した。腎臓RCC腫瘍を有するマウスを、記載したように作製し、且つ等張グルコース(G1)又は指定されたHif2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの単回尾静脈注射により処置した。マウスを、注射後指定された時点で安楽死させ、総RNAを、Trizol試薬を製造業者の推奨に従い使用し、腎臓腫瘍から調製した。相対HiF2αmRNAレベルを、以下に記載したようにRT−qPCRにより決定し、且つ送達緩衝液(等張グルコース)のみで処置したマウスと比較した。
Hif2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを、プロトコール#1を使用し、RNAiトリガー二本鎖ID AD01031及びポリマーAnt 126により、調製した。次にこのコンジュゲートを、TFF精製し、ポリマー濃度、RNAiトリガー、RGD及び修飾コンジュゲーション有効性を、先に記載した様に決定した。400μg(ポリマー重量)又は280μg(ポリマー重量)のいずれかを含むHif2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの毎週の投与量を、腫瘍を有するマウスの2つの異なる群へ、静脈内投与した。等張グルコース(IG)を受ける腫瘍を有するマウスを、処置対照として使用した。合計3回の毎週投与量を、試験期間中、投与した。腫瘍成長速度を、処置期間中5〜7日間隔で採取した血清SEAPにより評価した。腫瘍重量及び容積を、剖検時に決定した。腫瘍の肉眼形態及びH&E組織病理を、評価した。
RGD標的化されたHiF2α−RNAiトリガー送達ポリマーコンジュゲートを、ポリマー126、100A、又は006を用いて形成した。RNAiトリガーのμgは、ポリマーと反応させたトリガーの量を示す。ポリマーは、先に記載したように指定したRGD模倣物及びPEG修飾剤により、修飾した。腎臓RCC腫瘍を有するマウスは、記載したように作製し、等張グルコース(G1)又は指定されたHif2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの単回尾静脈注射により処置した。マウスを、注射後72時間(4日目)に安楽死させ、総RNAを、腎臓腫瘍から、Trizol試薬を製造業者の推奨に従い用い、調製した。相対HiF2αmRNAレベルを、記載したようにRT−qPCRにより決定し、送達緩衝液(等張グルコース)のみで処置したマウスと比較した(表11)。
HiF2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲート(125μgポリマー)を、プロトコール7の二本鎖ID No. AD1884及びポリマー064を用いて調製した。HiF2αRNAiトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを、4週間毎に、iv注射により、合計4投与量投与した。LC laboratories社から得たスニチニブ(リンゴ酸塩)を、Ora−plus/Ora sweet(50:50、容積:容積)中に懸濁した。初回HiF2αRNAiトリガー投与後2週目に開始するスニチニブ処置を、投与した。マウスには、5日/週で2週間強制経口投与し、その後2週間休薬し、合計3サイクル行った。
Claims (35)
- Hif2α遺伝子の発現を阻害するためのRNA干渉(RNAi)トリガーを含む組成物であって、RNAiトリガーが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、表1、表2又は表5のいずれかのアンチセンス鎖のヌクレオチド2−19の塩基配列を含む、組成物。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号:4(UUCAUGAAAUCGUUACGUUG)又は配列番号:38(GUAAAACAAUUGUGUACUUU)のヌクレオチド2−21のヌクレオチド塩基配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- a)前記アンチセンス鎖が、配列番号:4(UUCAUGAAAUCGUUACGUUG)のヌクレオチド2−21のヌクレオチド塩基配列を含み、かつ、前記センス鎖が、配列番号:53(ACGUAACGAUUUCAUGAAU)のヌクレオチド塩基配列を含むか、又は
b)前記アンチセンス鎖が、配列番号:38(GUAAAACAAUUGUGUACUUU)のヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列を含み、かつ、前記センス鎖が、配列番号:56(AGUACACAAUUGUUUUACA)のヌクレオチド1−19のヌクレオチド塩基配列を含む、請求項2に記載の組成物。 - 前記センス鎖及び/又はアンチセンス鎖が、長さが1〜6ヌクレオチドの3′及び/又は5’伸長を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖の3’伸長が、uAu、uGu、udTsdT、usdTsdT、UfAu、Aua、Afsusa、UAU、uAfu、uau、udAu、uscu、usgu、uscsu、cAu、aUa、aua、u(invdA)u、cag、agu、gcg、caa、usasu、uAMTM、又はusTMsAMを含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖の5’伸長が、dA、dT、pdT、vpdT、又はuを含む、請求項4〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記センス鎖の3’伸長が、Af、invdA、invdT、A(invdT)、Af(invdT)、U(invdT)、Uf(invdT)、AfAbuAu、dTdT、又はdTsdTを含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記センス鎖の5’伸長が、uAuAus、uAuAu、UAUUAGfs、UfaUfaA、uauaA、AUAUU、AfuAfuU、auauU、uaUfau、uAuA(UUNA)、uauau、udAudAu、uuAga、uuAuu、uuGAu、uuaga、uAuga、aUaGas、uauaus、uAuaas、udAuau、adTaga、auaga、u(invdA)uau、gacau、ugaau、gcgau、uauga、uugga、又はauagaを含む、請求項4〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 標的化基が、前記RNAiトリガーにコンジュゲートされている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的化基が、以下:インテグリン−結合化合物、αvβ3インテグリン−結合、RGDリガンド、RGDペプチド、及びRGD模倣物、からなる群から選択される化合物を含む、請求項9に記載の組成物。
- 送達ポリマーが、前記RNAiトリガーにコンジュゲートされている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 連結基が、前記RNAiトリガーにコンジュゲートされている、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記センス鎖及び/又はアンチセンス鎖が、独立して、1又は複数の修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記修飾されたヌクレオチドが、以下:2’−O−メチル修飾されたヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾されたヌクレオチド、2’−デオキシ−修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド(locked nucleotides)、脱塩基(abasic)ヌクレオチド、デオキシチミジン、逆方向デオキシチミジン、2’−アミノ−修飾されたヌクレオチド、2’−アルキル−修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、及び、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、からなる群から選択される、請求項13に記載の組成物。
- 前記センス鎖が、3’末端から11、12、及び/又は13の位置に1、2又は3個の2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項14に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖が、5’末端から2の位置に2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項14〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖が、5’末端から14の位置に2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖が、5’末端から4、6、8、10、及び12の位置に1、2、3又は4個の2’−Fヌクレオチドを含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記RNAiトリガーが、1又は複数のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記センス鎖が、1又は2個のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アンチセンス鎖が、1、2、3又は4個のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項19〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 1又は複数の追加の治療薬又は治療を更に含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、キット、容器、パック、ディスペンサー、予め充填された注射器、又はバイアル内に包装されている、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。
- (RNAiトリガー)n−ポリ(Aa-co-(Bb-グラフト-(Cc; Dd)))を含む組成物であって、ここで、
Aは、疎水性基−含有モノマーであり、
Bは、第一級アミン−含有モノマーであり、
Cは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して第一級アミン−含有モノマーに連結されたインテグリン−結合リガンドを含み、
Dは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して第一級アミン−含有モノマーに連結された立体安定剤を含み、
aは、0を超える整数であり、
bは、2以上の整数であり、
cは、1以上の整数であり、
dは、1以上の整数であり、
c+dの値は、bの値の80%よりも大きく、
ポリ(Aa-co-Bb)は、膜活性ポリアミンであり、
RNAiトリガーは、請求項1〜8及び12〜21のいずれか一項に記載のHif2αRNAiトリガーを含み、並びに
nは、0.25〜5.0の値を有する、組成物。 - Cが、RGD−PEGx−FCitFProを含み、ここでxは、1〜50である、請求項25に記載の組成物。
- Dが、PEGy−ACit−PABCを含み、ここでyが、4〜30である、請求項25〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記値c+dが、bの値の90%よりも大きい、請求項25〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- 比a:bが、40:60〜60:40である、請求項25〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤を更に含有する、請求項25〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞、組織、又は対象におけるHif2α発現を阻害するための方法であって、該対象に、請求項1〜23及び25〜30のいずれか一項に記載のRNA干渉トリガーの治療的有効量を投与することを含む、方法。
- 前記組成物が、非経口投与される、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞又は組織が、腎細胞癌である、請求項31に記載の方法。
- 医薬品を製造するための、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- Hif2α遺伝子の発現を阻害することが可能な(RNAi)トリガーであって、該RNAiトリガーが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、表1、表2、又は表5のアンチセンス配列のいずれかを含む、RNAiトリガー。
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