CN105940012B - 肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有它的医药组合物 - Google Patents

肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有它的医药组合物 Download PDF

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Abstract

本发明的肽/β－1，3－葡聚糖复合体含有β－1，3－葡聚糖、和将抗原性肽借助共价键与聚核苷酸或其衍生物键合了的肽/聚核苷酸缀合物，肽/聚核苷酸缀合物的聚核苷酸或其衍生物借助氢键与β－1，3－葡聚糖键合，形成具有由聚核苷酸或其衍生物的分子链1根和β－1，3－葡聚糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体，或者β－1，3－葡聚糖的侧链与抗原性肽借助利用炔烃与叠氮衍生物的环加成反应、马来酰亚胺基或乙烯砜基与硫醇基的反应的任意一种反应生成的共价键键合。

Description

肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有它的医药 组合物
技术领域
本发明涉及新型的肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有 它的医药组合物。
背景技术
基于疫苗的预防感染的基本原理是，利用人为的模拟感染，来诱导获 得性免疫，诱导对于特定的病原体的抗体产生和细胞性免疫。已知在获得 性免疫中，担任免疫的“记忆”的T细胞、B细胞起到核心作用，由DNA 的重组带来的抗体的可变区域的多样性使得针对无数的抗原的特异性免 疫反应成为可能。另一方面，白血球、巨噬细胞、树状细胞等吞噬细胞起到核心作用的自然免疫以往是贪食病原体或异物的非特异性过程，被认为 仅起到在获得性免疫成立之前的作为“权宜之计”的作用，然而随着关于 自然免疫的分子机理的研究的进展，显而易见，在自然免疫中，也要进行 自身·非自身的特异性识别，自然免疫对于获得性免疫的成立是必需的。 更具体而言，最近的研究阐明，存在于树状细胞、巨噬细胞、B细胞等抗原提呈细胞中的Toll样受体(TLR)家族与各种病原体反应，诱导细胞因 子(cytokine)的产生，通过促进初始T细胞向Th1细胞的分化、活化杀 伤T细胞等，诱导获得性免疫。
由一连串的TLR家族识别的病原体的构成成分复杂多样，而其中之 一是作为TLR9的配体的、具有CpG序列的DNA(CpG DNA)。CpG 序列是在中心部排列胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的以6个碱基为基本的序列，是哺乳类中很少见、多见于微生物的碱基序列。另外，在哺乳类中， 少量存在的CpG序列的大部分受到甲基化。哺乳类中基本上不存在的非 甲基化CpG序列具有强大的免疫赋活活性(例如参照非专利文献1～3)。 由于内吞作用而被引入细胞内的CpG DNA由存在于吞噬小体样小胞体中的TLR9识别，强烈地诱导Th1反应。Th1反应抑制Th2反应占优势的 过敏反应，并且具有强的抗肿瘤活性。因此，CpG DNA除了有望预防感 染以外，还有望用作对于过敏性疾病、肿瘤性疾病的佐剂(例如参照非专 利文献4)。
但是，在将CpG DNA作为免疫疗法的佐剂使用的情况下，如何在 避免细胞质或血浆中的核酸酶所致的分解、和与蛋白质的非特异性结合的 同时使CpG DNA到达靶细胞的内部成为问题。
本发明人等作为新型的基因载体着眼于具有β－1，3－葡聚糖骨架的 多糖(以下有时简称为“β－1，3－葡聚糖”。)，此前，发现β－1，3－葡 聚糖与以核酸药物(反义DNA、CpGDNA)为首的各种核酸形成新的 类型的复合体(例如参照专利文献1、2、非专利文献5～7)。
发现通过将天然中以3重螺旋存在的β－1，3－葡聚糖溶解于二甲亚 砜(DMSO)等非质子性极性有机溶剂、或0.1N以上的碱溶液中而解离 为单链后，加入单链的核酸，将溶剂恢复为水或中性，可以形成由1个分 子的核酸和2个分子的β－1，3－葡聚糖构成的3重螺旋复合体。可以认 为，该情况下，3重螺旋复合体中的β－1，3－葡聚糖分子与核酸分子主要利用疏水性相互作用与氢键形成分子间键(参照非专利文献8)。
如上所述，通过将核酸与β－1，3－葡聚糖复合化，可以在抑制核酸 酶所致的核酸分子的水解、血浆蛋白质与核酸的非特异性结合等核酸分子 与生物体内蛋白质的不希望的相互作用的同时，使核酸到达细胞的内部。 利用包含β－1，3－葡聚糖与核酸的复合体、以及具有抗原性的蛋白质的 3元复合体，成功实现CpG DNA向细胞内的传递(例如参照专利文献3、 4、非专利文献9～11)。
现有技术文献
专利文献、
专利文献1：国际公开第01/34207号
专利文献2：国际公开第02/072152号
专利文献3：日本特开2010－174107号公报
专利文献4：日本特开2007－70307号公报
非专利文献
非专利文献1:Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to SignalInfectious Danger，H.Wagner，Adv.Immunol.，73，329-368(1999).
非专利文献2:CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects，M.Krieg，Annu.Rev.Immunol.，20， 709-760(2002).
非专利文献3:The discovery of immunostimulatory DNA sequence，S.Yamamoto，T.Yamamoto，and T.Tokunaga， Springer Seminars in Immunopathology，22，11-19(2000).
非专利文献4:《标准免疫学》第2版、医学书院、2002年、333页
非专利文献5:Molecular Recognition of Adenine，Cytosine， and Uracil ina Single-Stranded RNA by a Natural Polysaccharide:Schizophyllan.K.Sakurai andS.Shinkai，J. Am.Chem.Soc.，122，4520-4521(2000).
非专利文献6:Polysaccharide-Polynucleotide Complexes.2. ComplementaryPolynucleotide Mimic Behavior of the Natural Polysaccharide Schizophyllan inthe Macromolecular Complex with Single-Stranded RNA and DNA.K.Sakurai，M.Mizuand S.Shinkai，Biomacromolecules，2，641-650(2001).
非专利文献7:Dectin-1targeting delivery of TNF-αantisense ODNscomplexed withβ-1，3-glucan protects mice from LPS-inducedhepatitis.S.Mochizuki and K.Sakurai，J.Control. Release，151(2011)155-161.
非专利文献8:Structural Analysis of the Curdlan/Poly (cytidylic acid)Complex with Semiempirical Molecular Orbital Calculations.K.Miyoshi，K.Uezu，K.Sakurai and S. Shinkai，Biomacromolecules，6，1540-1546(2005).
非专利文献9:A Polysaccharide Carrier for Immunostimulatory CpG DNAsto Enhance Cytokine Secretion，M.Mizu，K. Koumoto，T.Anada，T.Matsumoto，M.Numata，S.Shinkai，T.Nagasaki and K.Sakurai，J.Am.Chem.Soc.，126， 8372-8373(2004).
非专利文献10:Protection of Polynucleotides against Nuclease-mediatedHydrolysis by Complexation with Schizophyllan， M.Mizu，K.Koumoto，T.Kimura，K.Sakurai and S. Shinkai，Biomaterials，25，15，3109-3116(2004).
非专利文献11:Synthesis and in Vitro Characterization of Antigen-Conjugated Polysaccharide as a CpG DNA Carrier，N. Shimada，K.J.Ishii，Y.Takeda，C.Coban，Y.Torii，S. Shinkai，S.Akira and K.Sakurai，Bioconjugate Chem.，17 1136-1140(2006).
发明内容
技术问题
但是，上述以往的技术具有如下所示的问题。例如，在非专利文献11 记载的具有β－1，3－葡聚糖/抗原性的蛋白质/CpG DNA的3元复合体 的制造方法中，利用高碘酸氧化，在β－1，3－葡聚糖的侧链的葡萄糖残 基上生成甲酰基，利用还原的氨基化反应，使甲酰基与具有抗原性的肽(以 下有时简称为“抗原性肽”。)的氨基反应，形成β－1，3－葡聚糖与抗原 性肽发生共价键合而得的复合体，然而具有收率极低的问题。鉴于该情况，例如，在专利文献4记载的β－1，3－葡聚糖/抗原性蛋白质(抗原性肽) /CpG DNA的3元复合体的制造方法中，在使在侧链中具有甲酰基的β －1，3－葡聚糖与抗原性肽在碱水溶液中反应的同时进行中和，或者在碱水溶液中使之反应而进行逐次中和，由此提高了β－1，3－葡聚糖的侧链 上的甲酰基与抗原性肽的氨基的反应性及收率。但是，由于在肽中存在多 个氨基，因此反应点的控制困难。所以，有可能产生由抗原性肽的反应位 置造成的免疫原性的差别、由与β－1，3－葡聚糖的反应产物变为复杂的 混合物引起的分离提纯的困难性等问题。另外，与利用了借助氢键的复合体形成的β－1，3－葡聚糖与DNA的复合体的形成相比，基于β－1，3 －葡聚糖与抗原性肽的共价键的形成的复合体的形成更烦杂。从这些方面 考虑，专利文献4记载的β－1，3－葡聚糖/抗原性肽/CpG DNA的3元 复合体的制造方法在生产率等方面依然存在有问题。
本发明是鉴于该情况而完成的，其目的在于，提供生产率优异、具有 高免疫赋活活性的肽/β－1，3－葡聚糖复合体及其制造方法以及含有它的 医药组合物。
用于解决问题的方法
依照所述目的的本发明的第一方式提供一种肽/β－1，3－葡聚糖复合 体，其特征在于，含有具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖、和与所述具有 β－1，3－葡聚糖骨架的多糖化学键合了的具有抗原性的肽，由此解决了 上述问题。
本发明中，“化学键”不仅包括属于分子内键的共价键、配位键，还包 括构成分子集团或原子集团的离子键、氢键及范德华键。
本发明的第一方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述具有β－1， 3－葡聚糖骨架的多糖优选为裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶 的任意一种。
本发明的第二方式提供一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于， 含有具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖、和将具有抗原性的肽借助共价键 与聚核苷酸或聚核苷酸衍生物键合而得的肽/聚核苷酸缀合物，所述肽/聚 核苷酸缀合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键与所述具有β－1，3 －葡聚糖骨架的多糖键合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的 分子链1根和所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体，由此解决了上述问题。
本发明的第二方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述具有β－1， 3－葡聚糖骨架的多糖优选为裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶 的任意一种。
本发明的第二方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述聚核苷酸或 聚核苷酸衍生物也可以是聚脱氧腺苷。
本发明的第二方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述聚核苷酸或 聚核苷酸衍生物优选为DNA或RNA的磷酸二酯键的至少一部分由磷酸硫 酯基取代了的聚核苷酸衍生物。
本发明的第二方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，也可以磷酸二酯 键的50％以上由磷酸硫酯基取代。
本发明的第二方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，构成所述肽/聚核 苷酸缀合物的所述具有抗原性的肽与所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物也 可以借助利用炔烃与叠氮衍生物的环加成反应、马来酰亚胺基与硫醇基的 反应、肽C末端的半胱氨酸残基的硫醇基与硫醇修饰核酸的硫醇基的反应 的任意一种生成的共价键键合。
本发明的第三方式提供一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于， 含有具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖、和借助利用炔烃与叠氮衍生物的 环加成反应、马来酰亚胺基或乙烯砜基与硫醇基的反应的任意一种生成的 共价键与所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的主链或侧链上的葡萄糖残基键合的具有抗原性的肽，由此解决了上述问题。
本发明的第三方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述具有β－1， 3－葡聚糖骨架的多糖优选为裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶 的任意一种。
本发明的第四方式提供在本发明的第一～第三方式的肽/β－1，3－葡 聚糖复合体中具有如下特征的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，即，还含有具 备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，所述 聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键与所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的 多糖键合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体，由此解决了上述问题。
本发明的第四方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述聚核苷酸或 聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分优选为聚 脱氧腺苷。
本发明的第四方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，所述聚核苷酸或 聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分优选为 DNA或RNA的磷酸二酯键的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸 衍生物。
本发明的第四方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，在所述聚核苷酸 或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分中，也 可以DNA或RNA的磷酸二酯键的50％以上由磷酸硫酯基取代。
本发明的第五方式提供一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造方法， 是制造如下的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的方法，即，含有具有β－1，3 －葡聚糖骨架的多糖、和将具有抗原性的肽借助利用炔烃与叠氮衍生物的 环加成反应、马来酰亚胺基与硫醇基的反应、肽C末端的半胱氨酸残基的 硫醇基与硫醇修饰核酸的硫醇基的反应的任意一种生成的共价键与聚核 苷酸或聚核苷酸衍生物键合而得的肽/聚核苷酸缀合物，所述肽/聚核苷酸 缀合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键与所述具有β－1，3－葡聚 糖骨架的多糖键合，形成由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根 和所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结 构的复合体，所述方法的特征在于，在螯合剂的存在下进行所述肽/聚核苷 酸缀合物的利用液相色谱的分离，由此解决了上述问题。
本发明的第六方式提供一种医药组合物，其含有具备具有免疫赋活活 性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、和本发明的第一～第三 方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，由此解决了上述问题。
本发明的第六方式的医药组合物中，所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物 也可以借助氢键与具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖键合，形成具有由所 述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有β－1，3－葡聚糖 骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的聚核苷酸/β－1，3－葡聚 糖复合体。
本发明的第六方式的医药组合物中，构成所述聚核苷酸/β－1，3－葡 聚糖复合体的所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖优选为裂裥多糖、香 菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶的任意一种。
本发明的第七方式提供一种医药组合物，其含有本发明的第四方式的 肽/β－1，3－葡聚糖复合体，由此解决了上述问题。
发明效果
根据本发明，可以获得如下所示的有利的效果。
(1)由于可以根据β－1，3－葡聚糖及抗原性肽的种类、分子量、组 合等，从β－1，3－葡聚糖与抗原性肽的共价键、β－1，3－葡聚糖与肽/ 聚核苷酸缀合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物之间的氢键中选择β－1，3 －葡聚糖与抗原性肽的键合样式，因此可以针对广泛的β－1，3－葡聚糖 与抗原性肽的组合，获得肽/β－1，3－葡聚糖复合体。
(2)作为生成β－1，3－葡聚糖与抗原性肽的共价键的反应，使用炔 烃与叠氮衍生物的环加成反应、马来酰亚胺基与硫醇基的反应(迈克尔加 成反应)的任意一种，由此在含有水的极性溶剂中也可以迅速并且高效率 地进行反应。所以，可以在短时间内高收率地获得肽/β－1，3－葡聚糖复 合体，还可以减轻分离提纯所需的工夫。所以，本发明的肽/β－1，3－葡 聚糖复合体的生产率优异，可以低成本地制造。
(3)通过使用本发明的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，与单独使用抗原 性肽的情况相比，可以更加有效地进行对抗原性肽而言为特异性的免疫应 答的诱导。
(4)通过将本发明的肽/β－1，3－葡聚糖复合体与具备具有免疫赋活 活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物组合使用，或使用还含 有具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、 且聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键与β－1，3－葡聚糖键合而形成具 有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和β－1，3－葡聚糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，可以更加有效地进行免疫应答的诱导。
(5)含有本发明的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的医药组合物与单独使 用抗原性肽的情况相比，对于广泛的抗原性肽可以更加有效地诱导特异性 的免疫应答。因此，有望作为疫苗或免疫赋活剂应用。
附图说明
图1是实施例1是dA40(S)(炔烃)和OVA(N3)的化学结构。
图2是表示实施例1的抗原性肽/聚核苷酸缀合物制作的结果的HPLC 色谱图。
图3是表示实施例2的抗原性肽－dA40(S)与SPG的复合化的结果 的凝胶电泳照片。
图4是表示对实施例3的通过将各样品中进行了免疫诱导的小鼠的脾 脏细胞用抗原性肽刺激而产生的抗原性肽特异性IFN－γ的产生量进行定 量而得的结果的曲线图。
图5是表示实施例4的将各样品中进行了免疫诱导的小鼠的脾脏细胞 用抗原性肽刺激并繁殖了的抗原性肽特异性细胞伤害性T细胞的比例的 曲线图。
图6是表示实施例5的肽/CpG/SPG三元复合体的制作的结果的凝胶 电泳照片。
图7是表示对实施例6的通过将各样品中进行了免疫诱导的小鼠的脾 脏细胞用抗原性肽刺激而产生的抗原性肽特异性IFN－γ的产生量进行定 量而得的结果的曲线图。
图8是表示实施例7的将各样品中进行了免疫诱导的小鼠的脾脏细胞 用抗原性肽刺激并繁殖了的抗原性肽特异性细胞伤害性T细胞的比例的 曲线图。
图9是表示对实施例8的通过将各样品中进行了免疫诱导的小鼠的脾 脏细胞用抗原性肽刺激而产生的抗原性肽特异性IFN－γ的产生量进行定 量而得的结果的曲线图。
具体实施方式
以下，对将本发明具体化了的实施方式进行说明，用以理解本发明。
本发明的第一实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体含有具有β－1， 3－葡聚糖骨架的多糖(β－1，3－葡聚糖)、和将具有抗原性的肽(抗原 性肽)借助共价键与聚核苷酸或聚核苷酸衍生物键合而得的肽/聚核苷酸缀合物。肽/聚核苷酸缀合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键与β－1， 3－葡聚糖键合，形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和 所述β－1，3－葡聚糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体。
(1)β－1，3－葡聚糖
β－1，3－葡聚糖只要是可以形成具有由聚核苷酸或聚核苷酸衍生物 的分子链1根和β－1，3－葡聚糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复 合体的葡聚糖，就可以没有特别限制地使用任意的种类、分子量的葡聚糖。 已知具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖具有与poly(C)等核酸近似的螺 旋参数(例如参照高桥、小畠、铃木、Prog.Polym.Phys.Jpn.27卷、767页、及《Conformation of Carbohydrates》、Sharwood academic publisher、1998年)，具有能够与核酸碱基产生氢键的羟基，因此与核酸 发生相互作用，形成具有三重螺旋结构的稳定的复合体。作为β－1，3－ 葡聚糖的具体例，可以举出裂裥多糖、可得然胶、香菇多糖、茯苓聚糖 (pachyman)、灰树花多糖、硬葡聚糖等。它们是主链利用β－键(β－D －键)键合的葡聚糖，是侧链的频度不同的天然的多糖。这些β－1，3－ 葡聚糖可以不进行化学修饰等处理地直接使用，然而也可以使用通常的高碘酸氧化法将其侧链适当地拉开间隔，由此来控制其溶解性。
β－1，3－葡聚糖的分子量可以根据肽/核苷酸缀合物中所含的聚核苷 酸或聚核苷酸衍生物的碱基序列及碱基长度等适当地调节。但是，若分子 量小，则难以体现出所谓的集簇效应(高分子系的协同现象)，因此不优选。通常作为能够与核酸形成复合体的β－1，3－葡聚糖的重均分子量(每 1根分子链)，随着核酸碱基的种类、高次结构而不同，然而优选为2000 以上，更优选为4000以上，进一步优选为6000以上。另外，与聚核苷酸 上的核酸碱基形成氢键的羟基的个数通常为5个以上，优选为8个以上， 进一步优选为10个以上。
而且，β－1，3－葡聚糖的重均分子量可以使用光散射法、沉降速度 法(超离心法)等任意的公知的方法来确定。
β－1，3－葡聚糖一般由菌类、真性细菌产生，因此可以通过在培养 这些微生物后，将菌体均质化，从细胞溶出部分或不溶性残渣等杂质中利 用超离心法等方法分离而得到。一般而言，像这样得到的β－1，3－葡聚 糖以高分子量(重均分子量为数十万左右)取得三重螺旋结构。根据需要 也可以进行低分子化而使用。低分子化是根据β－1，3－葡聚糖的种类、 所期望的分子量，从酶分解、酸水解等中适当地选择合适的方法及条件而 进行。例如，在裂裥多糖的情况下，可以利用借助80％DMSO－硫酸的水 解等，获得具有各种分子量的单链裂裥多糖。
(2)肽/聚核苷酸缀合物
肽/聚核苷酸缀合物是将抗原性肽和聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助 共价键键合而得的复合体。与抗原性肽键合的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物 如上所述，在与β－1，3－葡聚糖之间形成具有三重螺旋结构的复合体， 由此起到使抗原性肽与β－1，3－葡聚糖键合的作用。
作为“具有抗原性的肽”，只要是具有抗原性的肽，即，只要是在生 物体的免疫系统中被识别为异物、引发特异性抗体产生的(诱导免疫应答 的)肽，则可以没有特别限制地使用具有任意的氨基酸序列及氨基酸残基 数的肽。作为本实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造中所用的抗 原性肽，可以举出成为食物过敏等过敏的原因的蛋白质、细菌、病毒等病 原体、以肿瘤细胞等为起源的蛋白质当中的、具有可以作为抗原表位发挥作用的部分氨基酸序列的肽。构成抗原性肽的氨基酸残基数只要是可以作 为抗原表位发挥作用，就没有特别限制，然而在大多数情况下，为5～30 的范围内，大部分处于8～17左右的范围内。
抗原性肽可以使用成为起源的蛋白质的酶分解、肽合成等任意公知的 方法得到。另外，抗原性肽的氨基酸序列可以使用利用了多肽阵列的抗原 表位分析等任意的公知的方法来确定。
与抗原性肽键合的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物如上所述，只要是可以 在与β－1，3－葡聚糖之间形成具有三重螺旋结构的复合体，就可以没有 特别限制地使用具有任意的碱基序列及碱基数的聚核苷酸或其衍生物。作 为聚核苷酸的具体例，可以举出与β－1，3－葡聚糖结合能高的聚多核糖腺苷酸(polyA)、聚多聚胞苷酸(polyC)、聚脱氧腺苷酸(poly(dA))、 聚脱氧胸苷酸(poly(dT))。聚核苷酸的碱基数如上所述，只要是可以 在与β－1，3－葡聚糖之间形成具有三重螺旋结构的复合体，就没有特别限制，然而为了提高复合体形成能力，聚核苷酸优选与具有β－1，3－葡 聚糖结合能高的聚多核糖腺苷酸(polyA)、聚多聚胞苷酸(polyC)、聚脱氧腺苷酸(poly(dA))、聚脱氧胸苷酸(poly(dT))的任意一种的 重复序列。构成优选的重复序列的碱基及核苷酸的种类以及碱基数可以根 据核苷酸部分的长度、所用的β－1，3－葡聚糖的种类及分子量等适当地 确定。例如，在作为β－1，3－葡聚糖使用裂裥多糖的情况下，聚脱氧核 苷酸部分优选作为重复序列具有poly(dA)序列。对于重复序列的长度，若碱基数少，则难以利用与β－1，3－葡聚糖的氢键形成三重螺旋结构，因此碱基数需要为10以上，优选为20～80，更优选为30～80。
聚核苷酸在生物体内容易受到由核酸酶造成的分解，因此为了提高在 生物体内的稳定性，也可以取代聚核苷酸而使用聚核苷酸衍生物。作为聚 核苷酸衍生物的例子，可以举出核糖核苷酸的2’位的羟基的全部或一部分 被氟或甲氧基取代的衍生物、聚核糖核苷酸(RNA)或聚脱氧核糖核苷酸 (DNA)的磷酸二酯基的全部或一部分被磷酸硫酯基取代的衍生物等。在聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸的磷酸二酯基的一部分被磷酸硫酯基 取代的情况下，优选磷酸二酯键的50％以上被磷酸硫酯基取代。被磷酸硫 酯基取代的磷酸二酯基的位置没有特别限制，既可以是连续的多个磷酸二 酯基被取代，也可以是磷酸硫酯基不彼此相邻地被取代。
聚核苷酸或聚核苷酸衍生物可以与抗原性肽的N末端、C末端、或侧 链的任意一个键合。两者可以利用适当的反应性官能团之间的反应直接键 合，也可以借助适当的间臂键合。作为反应性官能团，可以直接使用存在 于抗原性肽及聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的官能团，或者使用将其利用 化学修饰加以活化了的官能团，也可以导入适当的反应性官能团。另外，聚核苷酸或聚核苷酸衍生物可以是5’末端侧与抗原性肽键合，也可以是3’ 末端侧键合。
优选的肽/聚核苷酸缀合物的一例如下述的式(A)中所示，具有在肽 的C末端侧键合有硫代磷酸酯化聚脱氧腺苷酸(polyA的磷酸二酯基被磷 酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物)的5’末端侧的结构。
[抗原性肽]－X－(dA(S))x (A)
而且，式(A)中，dA(S)表示硫代磷酸酯化脱氧腺苷酸，x例如为 20以上80以下的整数。X表示间臂或利用反应性官能团之间的反应形成 的官能团。作为间臂的一例，可以举出烷基、聚乙二醇(PEG)等。作为 反应性官能团的组合的例子，例如可以举出生物体分子向生物芯片表面的固定中所用的反应性官能团的组合，更具体而言，可以举出下述所示的组合。
(a)炔烃与叠氮化合物
炔烃与叠氮化合物(叠氮化物)利用如下所示的环加成反应(Husigen 反应)，形成1，2，3－三唑环。两者是可以导入包含生物体分子的大多 数有机化合物的稳定的官能团，在含有水的溶剂中也会迅速并且大致定量 地反应，基本上不伴随副反应，不生成多余的废弃物，因此被作为所谓的 “点击化学”的核心的反应在生物化学的领域广泛地使用。炔烃衍生物及 叠氮基可以使用任意的公知的方法，导入抗原性肽或聚核苷酸或者聚核苷 酸衍生物中。作为炔烃衍生物，炔丙醇、炔丙胺等具有反应性官能团的衍生物可以容易地获取，可以使它们与羧基、羟基等反应性官能团直接反应， 或者与羰基二咪唑等一起反应，借助生成的酰胺键、酯键、氨基甲酸酯键 等将炔烃衍生物导入。对于叠氮基，也可以使用任意的公知的方法，导入 抗原性肽或聚核苷酸或者聚核苷酸衍生物中。而且，Husigen反应是在铜催化剂的存在下进行，然而由于在抗原性肽及磷酸二酯基被磷酸硫酯基等含硫官能团取代了的聚核苷酸衍生物中，存在有与铜离子配位的硫原子， 因此铜的催化活性有可能降低。为了提高反应率，优选添加过剩量的铜。
[化1]
(b)马来酰亚胺或乙烯砜与硫醇基
具有与吸电子性的羰基或砜基相邻的双键的马来酰亚胺或乙烯砜在 中性附近的pH下，如下所示，利用与硫醇基的加成反应(迈克尔加成反 应)，生成稳定的硫醚衍生物。由于在市场上有具有适当的间臂的马来酰 亚胺及乙烯砜衍生物销售，因此很容易向抗原性肽或聚核苷酸或者聚核苷 酸衍生物中导入这些官能团。在向抗原性肽中导入硫醇基的情况下，在含 有半胱氨酸的抗原性肽的情况下，可以利用半胱氨酸残基侧链的硫醇基。 但是，由于半胱氨酸是存在比低的氨基酸，因此使用向抗原性肽的C末端 侧导入了半胱氨酸的物质。作为含有硫醇基的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物， 使用将这些5’末端的羟基转换为硫醇基的硫醇化聚核苷酸。
[化2]
(c)半胱氨酸侧链的硫醇基与硫醇化聚核苷酸的硫醇基
如上所述，使向C末端侧导入了半胱氨酸的抗原性肽的半胱氨酸残基 侧链的硫醇基与硫醇化聚核苷酸的硫醇基反应，形成二硫基。由于二硫键 在还原剂的存在下被切断，因此与上面两者相比，在稳定性的方面差。
(3)肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造
裂裥多糖等的β－1，3－葡聚糖通常在水中呈三重螺旋结构。所以， 为了与聚核苷酸或聚核苷酸衍生物形成复合体，溶解于DMSO之类的溶 剂中来解开由分子间氢键及疏水性相互作用造成的缔合状态，变为单链。 当向其中逐渐添加含有聚核苷酸的水溶液(或醇等极性溶剂的溶液)时， 随着溶剂的极性增大，聚核苷酸与β－1，3－葡聚糖就会因疏水性相互作 用而缔合，在引入聚核苷酸的分子链的同时在分子内及分子间形成聚核苷 酸与多糖的缔合体。其结果是，形成具有由1个分子的聚核苷酸或聚核苷 酸衍生物与2个分子的β－1，3－葡聚糖分子构成的三重螺旋结构的复合 体。复合体的形成例如可以通过测定CD(圆偏光二色性)光谱，根据对 构象变化的调查来确认。
本发明的第二实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体含有具有β－1， 3－葡聚糖骨架的多糖、和借助利用炔烃与叠氮衍生物的环加成反应、马 来酰亚胺基或乙烯砜基与硫醇基的反应的任意一种反应生成的共价键与 所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的主链或侧链上的葡萄糖残基键合的具有抗原性的肽。
对于本实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造中所用的抗原性 肽、β－1，3－葡聚糖，由于与本发明的第一实施方式的肽/β－1，3－葡聚 糖复合体的制造中所用的物质相同，因此省略详细的说明。β－1，3－葡 聚糖与抗原性肽借助利用炔烃与叠氮衍生物的环加成反应、马来酰亚胺基 或乙烯砜基与硫醇基的反应的任意一种反应生成的共价键键合。抗原性肽 与β－1，3－葡聚糖分子的主链及侧链的葡萄糖残基的哪一个键合都可以，然而若考虑空间位阻，则优选键合于侧链的葡萄糖残基上。另外，抗原性 肽以N末端侧及C末端侧的哪一个键合都可以，或者也可以以侧链键合， 然而若考虑与抗原提呈细胞的接触时的空间位阻，则优选以N末端侧或C 末端侧与β－1，3－葡聚糖键合。对于炔烃衍生物及叠氮基向β－1，3－ 葡聚糖及抗原性肽中的导入，与本发明的第一实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造中的肽/核苷酸缀合物的情况相同，可以使用任意的公知 的方法进行。
本发明的第三实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体是在上述的本发 明的第一或第二实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体中，还含有具备具 有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，聚核苷酸 或聚核苷酸衍生物借助氢键与β－1，3－葡聚糖键合，形成具有由聚核苷 酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和β－1，3－葡聚糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体(含有抗原性肽、β－1，3－葡聚糖、聚核苷酸 或聚核苷酸衍生物的三元复合体)。
对于本实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造中所用的抗原性 肽、β－1，3－葡聚糖、聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的借助氢键与β－1， 3－葡聚糖键合的部分，由于与本发明的第一、第二实施方式的肽/β－1，3 －葡聚糖复合体的制造中所用的物质相同，因此省略详细的说明。
作为聚核苷酸或聚核苷酸衍生物中的、具有免疫赋活活性的部分碱基 序列的具体例，可以举出通过借助TLR9的识别进行自然免疫和获得性免 疫的“交联”而活化免疫的、来自于细菌或病毒的非甲基化CpG DNA、 通过借助TLR3的识别进行自然免疫和获得性免疫的“交联”而活化免疫 的来自于病毒的双链RNA、借助RIG－I样受体(RLR)的识别来活化免疫的病毒基因组RNA或人工RNA等。
上述的具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的RNA或DNA、与具 有借助氢键与β－1，3－葡聚糖键合的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷 酸衍生物的杂合可以使用任意的公知的方法获取或合成。而且，在聚核苷 酸或聚核苷酸衍生物是RNA的5’末端侧与DNA的3’末端侧键合的嵌合 核酸的情况下，RNA与DNA之间的磷酸二酯键特别容易受到分解，因此优选进行将与DNA键合了的RNA的5’末端侧核苷酸中的2’位的羟基用 甲氧基或氟基取代，并且/或者将与DNA键合了的最初的核糖核苷酸的3’ 位与同它相邻的RNA的5’位之间的磷酸二酯基用磷酸硫酯基取代等衍生物化，提高对于水解的耐受性。
本实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体可以利用下述的任意一种方 法制造。
(1)使用与本发明的第一实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制 造方法相同的方法，使上述的β－1，3－葡聚糖、肽/核苷酸缀合物与聚核 苷酸或聚核苷酸衍生物复合化。
(2)使用与本发明的第一实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制 造方法相同的方法，使本发明的第二实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合 体与聚核苷酸或聚核苷酸衍生物复合化。
本发明的第四实施方式的医药组合物(以下简称为“医药组合物”。) 含有具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生 物；通过借助氢键与β－1，3－葡聚糖骨架键合而形成、且具有由聚核苷 酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多 糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的聚核苷酸/β－1，3－葡聚糖复合体； 和本发明的第一或第二实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体、或本发明的第三实施方式的肽/β－1，3－葡聚糖复合体。
聚核苷酸/β－1，3－葡聚糖复合体除了取代肽/核苷酸缀合物而使用核 苷酸或聚核苷酸衍生物以外，使用与本发明的第一实施方式的肽/β－1，3 －葡聚糖复合体相同的方法制造。
在医药组合物的制造时，除了作为有效成分的肽/β－1，3－葡聚糖复 合体及聚核苷酸/β－1，3－葡聚糖复合体以外，可以还使用任意的公知的 成分(医药用途所容许的任意的载体、赋形剂及添加物)及制剂方法。例如，医药组合物可以采取片剂、拴剂、胶囊剂、糖浆剂、纳米凝胶等微胶 囊剂、灭菌液剂、悬浮液剂等注射剂、气雾剂、喷剂等形态。
医药组合物可以对人或恒温动物(小鼠、大鼠、兔子、羊、猪、牛、 马、鸡、猫、狗、猴子等)利用口服及非口服路径的任意一种施用。作为 非口服施用路径，可以举出皮下、皮内及肌肉注射、腹腔内给药、点滴、向鼻粘膜或咽部的喷雾等。
作为活性成分的肽/β－1，3－葡聚糖复合体及聚核苷酸/β－1，3－葡 聚糖复合体的用量根据活性、成为治疗对象的疾病、成为给药对象的动物 的种类、体重、性別、年龄、疾病的严重度、给药方法等而不同。若以体 重60kg的成人为例，在口服给药的情况下，每1天的用量通常为约0.1～ 约100mg，优选为约1.0～约50mg，更优选为约1.0～约20mg，在非口服 给药的情况下，每1天的用量通常为约0.01～约30mg，优选为约0.1～约 20mg，更优选为约0.1～约10mg。在对其他动物给药的情况下，将上述用 量换算为每单位体重的用量后，使用乘以成为给药对象的动物的体重而得 的用量。
医药组合物可以作为用于通过活化免疫而治疗及预防由细菌、病毒等 病原体的感染引起的感染症、癌症等肿瘤的疫苗等使用。
实施例
下面，对为了确认本发明的作用效果而实行的实施例进行说明。
实施例1：抗原性肽/聚核苷酸缀合物的制作
本实施例中，对向具有脱氧缐嘌呤40倍体中的磷酸二酯键全都被硫 代磷酸酯键取代了的结构的聚核苷酸衍生物(以下称作“dA40(S)”。) 的5’侧导入了炔烃的聚核苷酸衍生物(以下称作“dA40(S)(alkyne)”。) (从株式会社GENEDISIGN公司购入)与来自于卵清蛋白(OVA)的抗 原性肽(氨基酸序列：SIINFEKL(序列编号1))的向C末端导入了叠 氮基的抗原性肽(以下称作“OVA(N3)”)(从株式会社GENEDISIGN公司购入)的抗原性肽/聚核苷酸缀合物(以下称作“OVA肽－dA40(S)”) 的制作进行了研究。将化学结构分别表示于图1中。
如下所示地将OVA(N3)(最终浓度：10μM～800μM、溶剂：水+ DMSO)、dA40(S)(alkyne)(最终浓度：10μM、溶剂：水)、硫酸 铜(II)五水合物(最终浓度：1.5mM、溶剂：水)、抗坏血酸钠(最终浓度：3.0mM、溶剂：水)、(三(1－苄基－1H－1，2，3－三唑－4－ 基)甲基)胺(最终浓度：0.6mM、溶剂：DMSO)混合，在室温下进行 了1小时的使用了铜催化剂的点击化学。反应后，用作为螯合剂的pH7.4 的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(最终浓度：20mM以上)将样品溶液稀 释后，进行了HPLC测定。因dA40(S)与HPLC色谱柱的相互作用强大 而难以被溶出，因此通过添加EDTA来减弱该相互作用，使之容易被溶出。
在HPLC测定中，作为色谱柱使用Inertsil ODS－3(GL Science公 司)，作为洗脱液使用0.1M三乙胺－乙酸(TEAA)缓冲液(pH7.0)和 乙腈，作为检测器使用二极管阵列，追踪了260nm下的dA40(S)(alkyne) 的UV吸收变化。将结果表示于图2中。确认因加入肽，dA40(S)(alkyne) 的峰从17分钟附近依赖于肽量地迁移到20分钟附近。在使用了反相色谱 柱的测定中，溶出时间推迟，暗示了分子变得更加疏水。由该结果可知， 生成了OVA肽－dA40(S)。
实施例2：抗原性肽/聚核苷酸缀合物与具有β－1，3－葡聚糖骨架的 多糖的复合化
本实施例中，作为具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖使用的裂裥多糖 (SPG)使用日本特开2010－174107号公报的实施例中记载的方法获得。 将其以给定的方法提纯。利用GPC算出分子量，其结果是，在单链状态 下为15万，在3链时为45万。对该SPG与实施例1中制备的OVA肽－ dA40(S)的复合化进行了研究。
如上所述，SPG等β－1，3－葡聚糖在碱水溶液中解离为单链，而通 过添加磷酸缓冲液，将含有β－1，3－葡聚糖的溶液中和时，3个分子的β －1，3－葡聚糖就会借助氢键缔合，三重螺旋结构得到再生。本发明人发现，此时，若在混合物中存在dA40(S)等聚核苷酸或聚核苷酸衍生物， 1个分子的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物与2个分子的β－1，3－葡聚糖就会借助氢键及疏水性相互作用缔合，生成具有三重螺旋结构的复合体。本 实施例中，对在作为聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的一例的dA40(S)上键合有抗原性肽的抗原性肽－DA40(S)与SPG的组合中，是否也同样地生 成具有三重螺旋结构的复合体进行了验证。
在0.25N NaOH溶液中溶解SPG(15mg/mL)，为了使之完全解离 为单链，使用了放置2天以上的溶液。将OVA肽－dA40(S)的10％二 甲亚砜(DMSO)水溶液(以含有10体积％的DMSO的水作为溶剂的溶 液。以下相同。)、与磷酸缓冲液(330mM NaH2PO4、pH4.5)混合后， 添加上述的SPG溶液并搅拌。而且，以使SPG与OVA肽－dA40(S)的 混合比以摩尔比计为3：1、SPG溶液与磷酸缓冲液的体积比为1：1的方 式，调整了各溶液的浓度。在4℃静置一晩后，进行了搅拌后的反应混合物的丙烯酰胺凝胶电泳。为了比较，对抗原性肽－dA40(S)也进行了丙 烯酰胺电泳。
电泳后，将丙烯酰胺凝胶用SYBR Gold染色，拍摄荧光图像，将所 得的结果表示于图3中。搅拌后的反应混合物的泳道(泳道2：complex (peptide/SPG))中，确认泳道1(peptide－dA40S)中观测的OVA肽－ dA40(S)的条带消失。由该结果可知，OVA肽－dA40(S)与SPG复合 化，生成更高分子量的复合体(OVA肽－dA40(S)/SPG复合体)。
实施例3：抗原性肽与SPG的复合化对小鼠脾细胞的抗原性肽所致的 抗原特异性免疫应答造成的影响的评价
(1)具有来自于卵清蛋白(OVA)的氨基酸序列(序列编号1)的 抗原性肽(OVA肽)(5μg)、(2)OVA肽(5μg)及CpG DNA(碱 基序列：ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(序列编号2))(30μg)、(3) OVA肽－dA40(S)/SPG复合体(参照实施例1、5μg)、(4)OVA肽 －dA40(S)/SPG复合体(实施例1中制备、5μg)及CpG DNA(30μg)、 (5)OVA肽－dA40(S)/SPG复合体(5μg)及弗氏不完全佐剂(IFA)(30μg)的任意一个施用到小鼠(C57BL/6小鼠、雄性、7周龄)皮内(1 次)。从施用起1周后，从小鼠采集脾细胞后，播种到96孔板中(1.0×106细胞/孔)，用OVA肽进行刺激(10μg/mL)，对是否诱导出抗原特异性 干扰素－γ(IFN－γ)进行了研究。
在利用OVA肽对脾细胞的刺激24小时后，使用酶联免疫测定 (ELISA)，对培养基中的IFN－γ量进行了定量。将结果表示于图4中。 对仅施用了OVA肽的情况、同时施用了OVA肽及CpG DNA的情况、 仅施用了OVA肽－dA40(S)/SPG复合体的情况，没有看到对OVA肽 而言特异性的干扰素应答。在将OVA肽－dA40(S)/SPG复合体与作为 市售的佐剂的弗氏不完全佐剂(IFA)同时施用的情况下，其应答也非常小。但是，在将OVA肽－dA40(S)/SPG复合体与CpG DNA同时施 用的情况下，确认可以诱发明显的免疫应答(IFN－γ的产生量的增大)。在仅施用了OVA肽的情况下，被从体内快速地排除掉，然而通过将OVA 肽－dA40(S)与SPG复合化，可以促进向抗原提呈细胞的引入，对此可 以认为是因为，由于向其中加入CpG DNA对TLR9的刺激，从而使得抗原特异性T细胞的比例增加。
实施例4：抗原性肽与SPG的复合化对抗原性肽特异性细胞伤害性T 细胞的诱导能力造成的影响的评价
实施例3中，将从皮内施用了(1)OVA肽、(2)OVA肽及CpG DNA、 (3)OVA肽－dA40(S)/SPG复合体、(4)OVA肽－dA40(S)/SPG 复合体及CpG DNA的任意一个的小鼠采集、并用OVA肽－dA40(S) /SPG复合体刺激了的小鼠脾细胞培养6天，进行抗体染色后，使用流式 细胞仪，评价了对OVA肽而言特异性的细胞伤害性(CD8阳性)T细胞 的比例。
将对脾细胞中的OVA肽而言特异性的CD8阳性T细胞的比例表示于 图5中。可以确认，对于仅施用了OVA肽的情况(peptide)、同时施用 了OVA肽及CpG DNA的情况(peptide+CpG)、仅施用了OVA肽－ dA40(S)/SPG复合体的情况(peptide/SPG)的任意一个情况，对OVA肽而言特异性的CD8阳性T细胞的比例都很少，然而在将OVA肽－dA40 (S)/SPG复合体与CpGDNA同时施用的情况下(peptide/SPG+CpG)， 对OVA肽而言特异性的CD8阳性T细胞的比例明显增加。
实施例5：抗原性肽、具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核 苷酸衍生物及具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的复合化
对SPG与OVA肽－dA40(S)、CpG DNA－dA40(S)的同时复 合化进行了研究。
在0.25N NaOH溶液中溶解SPG(15mg/mL)，为了使之完全地解 离为单链，使用了放置2天以上的溶液。将CpG DNA－dA40(S)(具 有在CpG DNA的3’－末端侧键合了dA40(S)的结构的聚核苷酸衍生 物)的水溶液、OVA肽－dA40(S)的10％DMSO水溶液、和磷酸缓冲 液(330mM NaH2PO4，pH4.5)混合，添加上述的SPG溶液，并进行了 搅拌。而且，SPG与OVA肽－dA40(S)的混合比、SPG与CpG DNA －dA40(S)的混合比都是以摩尔比计为3：1，以使SPG溶液与磷酸缓 冲液的体积比为1：1的方式，调整了各溶液的浓度。
在电泳后，将丙烯酰胺凝胶用SYBR Gold染色，拍摄荧光图像，将 所得的结果表示于图6中。在搅拌后的反应混合物的泳道(泳道3：complex (peptide/CpG/SPG))中，确认泳道1中观测到的OVA肽－dA40(S) 的条带及泳道2中观测到的CpG DNA－dA40(S)的条带都消失。由该结果可知，抗原性肽－dA40(S)及CpG DNA－dA40(S)两者与SPG 复合化，生成了更高分子量的复合体(OVA肽－dA40(S)/CpG DNA －dA40(S)/SPG三元复合体)。本实施例中，以使每1个分子的三元复 合体中含有最大7根dA40(S)的分子链的方式，调节了SPG、OVA肽－dA40(S)及CpG DNA－dA40(S)的摩尔比。另外，由于OVA肽 －dA40(S)与CpG DNA－dA40(S)的摩尔比为1：1，并且认为两者 之间在与SPG的复合体形成能力方面没有差别，因此认为生成了三元复合 体。
作为OVA肽以外的抗原性肽，对具有下述的氨基酸序列的抗原性肽/ 核苷酸缀合物，利用上述的方法制备了三元复合体。
[表1]
实施例6：基于抗原性肽/CpG/SPG三元复合体的肽特异性免疫应答的 评价
将(1)实施例2中制备的OVA肽－dA40(S)/SPG复合体(5μg)、 (2)OVA肽－dA40(S)/SPG复合体(5μg)及CpG DNA(30μg)、 (3)OVA肽－dA40(S)/SPG复合体(5μg)及CpG DNA－dA40(S)/SPG复合体(除了没有使用OVA肽－dA40(S)的10％DMSO水溶液以 外，利用与实施例5相同的方法制备：30μg)、(4)实施例5中制备的 OVA肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体(5μg)的任意一种向小鼠(C57BL/6小鼠、雄性、7周龄)皮内施用(1次)。从 施用起1周后，从小鼠采集脾细胞后，播种到96孔板中(1.0×106细胞/ 孔)，用OVA肽进行刺激(10μg/mL)，对是否诱导出抗原特异性干扰 素－γ(IFN－γ)进行了研究。
在利用OVA肽对脾细胞的刺激24小时后，使用酶联免疫测定 (ELISA)，对培养基中的IFN－γ量进行了定量。将结果表示于图7中。 如实施例3中所示，若仅为OVA肽－dA40(S)/SPG复合体，则无法诱 导对OVA肽而言特异性的干扰素应答，然而若同时施用OVA肽－dA40 (S)/SPG复合体及CpG DNA，则诱导出强的干扰素应答。此外确认，利用OVA肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体的施 用，也可以诱导出与同时施用OVA肽－dA40(S)/SPG复合体及CpG DNA的情况相同程度的干扰素。有趣的情况在于，在同时施用OVA肽－dA40(S)/SPG复合体及CpG DNA－dA40(S)/SPG复合体的情况下， 确认诱导出强的干扰素应答。由这些结果可知，利用OVA肽－dA40(S) /CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体的施用，也可以发挥OVA肽向 抗原提呈细胞的引入及借助基于CpG DNA的TLR9的细胞刺激的各自 的效果。
实施例7：基于抗原性肽/CpG/SPG三元复合体的肽特异性细胞伤害性 T细胞的诱导能力的评价
实施例6中，将从皮内施用了(1)OVA肽、(2)OVA肽及CpG DNA、 (3)OVA肽及CpGDNA－dA40(S)/SPG复合体、(4)实施例5中 制备的OVA肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体的 任意一种的小鼠采集、且用OVA肽－dA40(S)/SPG复合体刺激了的小 鼠脾细胞培养6天，进行抗体染色后，使用流式细胞仪，评价了对OVA 肽而言特异性的细胞伤害性(CD8阳性)T细胞的比例。
将CD8阳性T细胞中的对OVA肽而言特异性的CD8阳性T细胞的 比例表示于图8中。与仅施用OVA肽的情况(peptide)、同时施用OVA 肽及CpG DNA的情况(peptide+CpG)相比，在施用OVA肽－dA40 (S)/SPG复合体及CpG DNA－dA40(S)/SPG复合体的情况下(peptide +CpG/SPG)、或施用OVA肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG 三元复合体的情况下(peptide/CpG/SPG)，可以使对OVA肽而言特异性 的CD8阳性T细胞的比例增大。
实施例8：对来自于黑素瘤细胞特异性抗原蛋白质的肽的免疫应答(基 于抗原性肽/CpG/SPG三元复合体的肽特异性免疫应答的评价)
将(1)使用具有来自于小鼠黑素瘤细胞特异性抗原蛋白质的氨基酸 序列(EGSRNQDWL(序列编号3))的抗原性肽(gp100)依照实施例1、 2同样地制备的gp100肽－dA40(S)/SPG复合体(5μg)及CpG DNA －dA40(S)/SPG复合体(30μg)、(2)依照实施例5同样地制备的gp100肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体(5μg)的任意 一种向小鼠(C57BL/6小鼠、雄性、7周龄)皮内施用(1次)。从施用 起1周后，从小鼠采集脾细胞后，播种到96孔板中(1.0×106细胞/孔)， 用gp100肽进行刺激(10μg/mL)，对是否诱导出抗原特异性的干扰素－γ (IFN－γ)进行了研究。
在利用gp100肽对脾细胞的刺激24小时后，使用酶联免疫测定 (ELISA)，对培养基中的IFN－γ量进行了定量。将结果表示于图9中。 如实施例3中所示，若仅为gp100肽－dA40(S)/SPG复合体，则无法诱 导出对gp100肽而言特异性的干扰素应答(data notshown)。但是，若同时施用gp100肽－dA40(S)/SPG复合体及CpG DNA－dA40(S) /SPG复合体，则诱导出强的干扰素应答。此外确认，利用gp100肽－dA40 (S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体的施用，同样地诱导出干 扰素。由这些结果可知，通过将含有OVA肽以外的抗原性肽的抗原性肽 /CpG/SPG三元复合体向小鼠施用，也可以诱导出肽特异性的免疫应答。
实施例9：利用不同的抗原性肽的免疫应答
使用OVA肽以外的抗原性肽，利用实施例5中记载的方法，制备出 抗原性肽－dA40(S)/CpG DNA－dA40(S)/SPG三元复合体，利用实 施例6中记载的步骤，进行了肽特异性的免疫应答的评价。将所用的抗原 性肽的氨基酸序列及实验结果(有无对抗原性肽而言特异性的IFN－γ的诱导)表示于下述的表2中。而且，No.2中所示的氨基酸序列(序列编号 28)是OVA肽(No.1)的随机序列。表2中的No.1、3、4中，从小鼠采 集后，在播种到孔板中的脾细胞的刺激时使用了三元复合体中所含的抗原 性肽，然而对于No.2，使用了氨基酸组成相同而氨基酸序列不同的OVA 肽。另外，表2的IFN应答的列中，“+”表示观测到IFN－γ的产生，“－” 表示没有观测到IFN－γ的诱导。在用具有与向小鼠施用的三元复合体中 所用的抗原性肽相同的氨基酸序列的肽刺激脾细胞的情况下(No.1、3、4、 5)，观察到抗原性肽特异性的IFN应答，然而在用具有不同的氨基酸序列的肽刺激脾细胞的情况下(No.2)，完全观测不到IFN产生。由这些结 果可知，利用向小鼠施用的三元复合体，诱导出肽特异性的免疫应答。
[表2]
实施例10：利用抗原性肽向SPG的主链或侧链上的葡萄糖残基的导 入的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制备(1)
对利用了炔烃与叠氮化合物的“点击反应”(Husigen反应)的抗原 性肽向SPG的主链或侧链上的葡萄糖残基的导入进行了研究。将反应流程 表示如下。使羰基二咪唑(CDI)和炔丙胺(PA)与存在于SPG的葡萄糖 残基的6－位的伯醇反应，借助生成的氨基甲酸酯键，选择位置地将炔烃导入SPG的主链或侧链葡萄糖残基上(SPG－PA)。导入SPG的炔烃残 基数与葡萄糖残基数的比为10～20％，因此可以认为，由于主链的葡萄糖 残基周围的空间位阻，大部分被导入侧链的葡萄糖残基上。使如此得到的 SPG衍生物在铜催化剂的存在下，与将C末端用叠氮基修饰了的抗原性肽 (peptide(N3)：从GENEDESIGN(株)购入。本实施例中，使用了叠 氮修饰OVA肽。)反应，利用点击反应，制备出肽/β－1，3－葡聚糖复 合体。
[化3]
实施例11：利用借助了共价键的抗原性肽向SPG的主链或侧链上的 葡萄糖残基的导入的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制备(2)
对利用了α，β－不饱和酮与硫醇的迈克尔加成反应的抗原性肽向SPG 的主链或侧链上的葡萄糖残基的导入进行了研究。将反应流程表示如下。 在N，N－二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下，使羰基二咪唑(CDI)和 甲基丙烯酸2－氨基乙酯(AEMA)与存在于SPG的侧链的葡萄糖残基的 6－位的伯醇反应，借助生成的氨基甲酸酯键，导入了甲基丙烯酰基(SPG －AEMA)。其后，使向C末端导入了半胱氨酸的抗原性肽(peptide(－ SH)：从GENEDESIGN(株)购入。)在三(2－羧基乙基)膦盐酸盐 (TCEP)的存在下与SPG－AEMA反应，制备出肽/β－1，3－葡聚糖复 合体。
[化4]
实施例12：基于借助共价键在具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的侧 链上的葡萄糖残基上键合了抗原性肽的、抗原性肽/CpG/SPG三元复合体 的抗原性肽特异性免疫应答的评价
使用与实施例2、5中记载的方法相同的方法，使实施例10、11中制 备的肽/β－1，3－葡聚糖复合体与CpG DNA－dA40(S)复合化，制备 出抗原性肽/CpG/SPG三元复合体。将其向C57BL/6小鼠(雄性、7周龄) 的皮内施用1次(相当于CpG DNA30μg的量)。从施用起1周后，从小鼠采集脾细胞后，播种到96孔板中(1.0×106细胞/孔)，用OVA肽进 行刺激(10μg/mL)，对是否诱导出抗原特异性的干扰素－γ(IFN－γ)进 行了研究。将所用的抗原性肽的氨基酸序列及实验结果(有无对抗原性肽 而言特异性的IFN－γ的诱导)表示于下述的表3中。而且，与实施例9 相同，No.2中所示的氨基酸序列(序列编号28)是OVA肽(No.1)的随 机序列。表3中的No.1、3、4中，在从小鼠采集后，在播种到孔板中的 脾细胞的刺激时，使用了三元复合体中所含的抗原性肽，然而对于No.2， 使用了氨基酸组成相同而氨基酸序列不同的OVA肽。另外，表3的IFN 应答的列中，“+”表示观测到IFN－γ的产生，“－”表示没有观测到 IFN－γ的诱导。与实施例9的结果相同，在用具有与向小鼠施用的三元复 合体中所用的抗原性肽相同的氨基酸序列的肽刺激脾细胞的情况下(No.1、 3、4)，观测到抗原性肽特异性的IFN应答，然而在用具有不同的氨基酸 序列的肽刺激脾细胞的情况下(No.2)，完全观测不到IFN产生。由这些 结果可知，利用向小鼠施用的三元复合体，诱导出肽特异性的免疫应答。
[表3]
而且，本发明可以不脱离本发明的广义的精神和范围地实现各种实施 方式及变形。另外，上述的实施方式是用于说明本发明的实施方式，而不 是限定本发明的范围的实施方式。即，本发明的范围并非由实施方式给出， 而是由技术方案的范围给出。此外，在技术方案的范围内及与之同等的发 明的意义的范围内实施的各种变形被视为本发明的范围内。
本申请是基于2014年2月6日申请的日本专利申请2014－21333号 的申请，包括其说明书、技术方案的范围、附图及摘要。上述日本专利申 请中的公开全都被作为参照包含在本说明书中。

Claims (16)

1.一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，含有：
具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖、和
将具有抗原性的肽借助共价键与聚核苷酸或聚核苷酸衍生物键合了的肽/聚核苷酸缀合物，
所述肽/聚核苷酸缀合物的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键及疏水性相互作用与所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖键合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体。
2.根据权利要求1所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶的任意一种。
3.根据权利要求1所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物是聚脱氧腺苷。
4.根据权利要求1所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物是DNA或RNA的磷酸二酯键的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物。
5.根据权利要求4所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
在所述DNA或RNA的磷酸二酯键中的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物中，磷酸二酯键的50％以上由磷酸硫酯基取代。
6.根据权利要求1所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
构成所述肽/聚核苷酸缀合物的所述具有抗原性的肽与所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助利用炔烃与叠氮衍生物的环加成反应、马来酰亚胺基与硫醇基的反应、肽C末端的半胱氨酸残基的硫醇基与硫醇修饰核酸的硫醇基的反应的任意一种反应生成的共价键键合。
7.根据权利要求6所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶的任意一种。
8.一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体，是权利要求1至7中任一项所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
还含有具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键及疏水性相互作用与所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖键合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的复合体。
9.根据权利要求8所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分是聚脱氧腺苷。
10.根据权利要求8所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分是DNA或RNA的磷酸二酯键的至少一部分由磷酸硫酯基取代了的聚核苷酸衍生物。
11.根据权利要求10所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体，其特征在于，
在所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的、形成所述具有三重螺旋结构的复合体的部分中，DNA或RNA的磷酸二酯键的50％以上由磷酸硫酯基取代。
12.一种肽/β－1，3－葡聚糖复合体的制造方法，是制造权利要求6所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体的方法，其特征在于，
在螯合剂的存在下进行所述肽/聚核苷酸缀合物的利用液相色谱的分离。
13.一种医药组合物，其含有：
具备具有免疫赋活活性的部分碱基序列的聚核苷酸或聚核苷酸衍生物、和
权利要求1至7中任一项所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体。
14.根据权利要求13所述的医药组合物，其特征在于，
所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物借助氢键及疏水性相互作用与具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖键合，形成具有由所述聚核苷酸或聚核苷酸衍生物的分子链1根和所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖的分子链2根构成的三重螺旋结构的聚核苷酸/β－1，3－葡聚糖复合体。
15.根据权利要求14所述的医药组合物，其特征在于，
构成所述聚核苷酸/β－1，3－葡聚糖复合体的所述具有不进行化学修饰的β－1，3－葡聚糖骨架的多糖是裂裥多糖、香菇多糖、硬葡聚糖及可得然胶的任意一种。
16.一种医药组合物，其含有权利要求8所述的肽/β－1，3－葡聚糖复合体。
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