ES2678194T3 - Determinación farmacéutica de una vía de señalización de dinucleótido cíclico de mamífero - Google Patents

Determinación farmacéutica de una vía de señalización de dinucleótido cíclico de mamífero Download PDF

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Abstract

Un método para preparar 2'3'-GMP-AMP cíclico (2'3'-GAMPc), que comprende formar una mezcla que comprende la sintasa GMP-AMP cíclica de mamífero (GASc), ATP y GTP, en condiciones en las que la sintasa convierte catalíticamente el ATP y el GTP en 2'3'-GAMPc, en donde la sintasa, el ATP y el GTP están en cantidades predefinidas, comprendiendo el método además la etapa de aislar o detectar el 2'3'- GAMPc resultante, en donde la mezcla comprende además ADN y la conversión es dependiente de ADN.

Description

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DESCRIPCION
Determinacion farmaceutica de una via de senalizacion de dinucleotido ciclico de mamlfero Introduccion
El ADN citosolico induce interferones de tipo I y otras citocinas que son importantes para la defensa antimicrobiana, pero tambien puede dar como resultado la autoinmunidad. Esta via de senalizacion de ADN requiere la protelna adaptadora STING y el factor de transcripcion IRF3, pero el mecanismo de deteccion del ADN no esta claro. En este caso los investigadores indican que los extractos citosolicos de mamlferos sintetizaron GMP-AMP ciclico (GAMPc) in vitro a partir de ATP y GTP en presencia de ADN pero no de ARN. La transfeccion del ADN o la infeccion por el virus de ADN de celulas de mamlferos tambien desencadeno la produccion de GAMPc. GAMPc unido a STING, que conduce a la activacion de IRF3 y la induccion de interferon-p (IFNp). Por tanto, GAMPc representa el primer dinucleotido ciclico en los metazoos y funciona como un segundo mensajero endogeno que desencadena la produccion de interferon en respuesta al ADN citosolico. El documento US 2008/286296 se refiere a nuevos adyuvantes y a los usos en composiciones farmaceuticas, como en vacunas, adyuvantes y/o inmunomoduladores para la vacunacion profilactica y/o terapeutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, tumores, alergias, asi como para el control de la fertilidad en poblaciones humanas o animales.
El documento US 2006/040887 divulga que di-GMP ciclico, o un analogo de dinucleotido ciclico del mismo que tiene el mismo efecto que di-GMP ciclico, estimula o potencia la respuesta inmunologica o inflamatoria en un paciente o potencia la respuesta inmunologica a una vacuna al servir como un adyuvante.
El documento WO 2013/185052 proporciona una terapia de combinacion que se basa en un estimulador inmunologico de molecula pequena dinucleotido ciclico (CDN) - que activa las celulas dendriticas (DC) a traves de un receptor citoplasmico recientemente descubierto conocido como STING (estimulador de genes de interferon) formulado con lineas celulares alogenicas de tumor humano obtenidas por ingenieria para secretar grandes cantidades de GM-CSF. Kranzusch y col., 2013, 30; 3 (5): 1362-8 divulga que el reconocimiento inmunologico innato de acidos nucleicos extranos induce respuestas de interferon protectoras, y que la deteccion de ADN citosolico desencadena la senalizacion inmunologica aguas abajo a traves de la activacion de la GMP-AMP sintasa ciclica (GASc). Los autores tambien indicaron la estructura cristalina de GASc humano.
El documento WO 2014/179335 se refiere a composiciones, metodos, kits y ensayos relacionados con el uso y/o la explotacion de isomeros de GAMPc, asi como la estructura de la enzima GASc.
A traves del fraccionamiento bioquimico y la espectrometria de masas cuantitativa, los investigadores tambien identificaron una GAMPc sintasa (GASc), que pertenece a la familia nucleotidiltransferasa. La sobreexpresion de GASc activo el factor de transcripcion IRF3 e indujo IFNp de una manera dependiente de STING. La caida de GASc inhibio la activacion de IRF3 y la induccion de IFNp por transfeccion de aDn o infeccion por virus de ADN. GASc unido al ADN en el citoplasma y la sintesis catalizada de GAMPc. Estos resultados indican que GASc es un sensor de ADN citosolico que induce interferones al producir el segundo mensajero GAMPc.
La divulgacion aplica estos hallazgos a novedosos metodos y composiciones relacionadas con la GMP-AMP sintasa ciclica (GASc) y la GMP-AMP ciclica (GAMPc), incluido su uso en formulaciones (que incluyen adyuvantes de vacunas), filtros de farmacos, terapias y diagnosticos.
Sumario de la invencion
La divulgacion proporciona exploraciones de farmacos basadas en celulas que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una celula o un extracto de celula con una cantidad eficaz de un inhibidor de GASc exogeno, y detectar una inhibicion resultante de la sintasa. La inhibicion resultante puede detectarse inferencialmente por activacion de IRF3 inducida por GMP-AMP ciclico (dimerizacion o translocacion nuclear), produccion de interferon o activacion de NF-kB.
La divulgacion proporciona terapias que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una celula que se determina que lo necesita con una cantidad eficaz de un inhibidor de GASc exogeno. El metodo comprende administrar el inhibidor a un mamlfero que se determina que lo necesita y que comprende la celula, y/o el inhibidor puede ser un inhibidor de ciclasa de molecula pequena o puede ser un ARNsh o ARNip especifico de GASc.
La divulgacion proporciona exploraciones de farmacos in vitro que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una mezcla que comprende la sintasa, ATP, GTP y un inhibidor, en condiciones en las que el inhibidor inhibe la conversion catalitica por la sintasa del ATP y GTP a GMP-AMP ciclico y pirofosfato inorganico, y detectar una inhibicion resultante de la sintasa. La mezcla comprende adicionalmente ADN y la conversion puede ser dependiente de ADN. Ademas, el GASc puede ser constitutivamente activo.
La divulgacion proporciona ensayos de union a farmacos in vitro que incluyen metodos para inhibir la union de GASc a un sustrato o cofactor, que comprende poner en contacto una mezcla que comprende la sintasa y un sustrato ATP
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o GTP o un cofactor de ADN y un inhibidor, en condiciones en las que el inhibidor inhibe la union de la sintasa al sustrato o al cofactor, y detectar una inhibicion resultante de la union.
La divulgacion proporciona metodos para preparar GAMPc que comprende formar una mezcla que comprende GASc, ATP y GTP, en condiciones en las que la sintasa catalltica convierte el ATP y el GTP en GAMPc, en el que la sintasa, el ATP y el GTP estan en cantidades predefinidas o el metodo comprende ademas la etapa de aislar o detectar el GAMPc resultante. En particular, la mezcla comprende adicionalmente ADN y la conversion puede ser dependiente de ADN. En un primer aspecto, la invencion proporciona un metodo para preparar 2'3'-GMP-AMP clclico (2'3'-GAMPc), que comprende formar una mezcla que comprende la sintasa GMP-AMP clclica (GASc) de mamlfero, ATP y GTP, en condiciones en las que la sintasa convierte catallticamente el ATP y el GTP en 2'3'- GAMPc, en el que la sintasa, el ATP y el GTP estan en cantidades predefinidas, comprendiendo el metodo ademas la etapa de aislar o detectar el 2'3'-GAMPc resultante, en el que la mezcla comprende adicionalmente ADN y la conversion es dependiente de ADN.
En un segundo aspecto, la invencion proporciona un 2'3'-GAMPc aislado obtenido a partir del metodo del primer aspecto de la invencion.
En un tercer aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad predeterminada del 2'3'-GMP-AMP clclico (2'3'-GAMPc) como se define en el segundo aspecto de la invencion.
En un cuarto aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende una cantidad predeterminada de 2'3'-GAMPc.
En un quinto aspecto, la invencion proporciona un adyuvante que comprende la composicion de acuerdo con el tercer o el cuarto aspecto de la invencion.
En un sexto aspecto, la invencion proporciona una vacuna que comprende un inmunogeno predeterminado y la composicion de acuerdo con el tercer o el cuarto aspecto de la invencion.
En un septimo aspecto, la invencion proporciona una composicion de acuerdo con el tercer o el cuarto aspecto de la invencion para uso en un metodo para inducir o promover una respuesta inmune, comprendiendo el metodo administrar a un mamlfero que lo necesita una cantidad eficaz de la composicion.
La divulgacion proporciona metodos para detectar niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones de GASc que comprenden la etapa de: detectar en una muestra de una persona los niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones de GASc y asignar a la persona una metrica de enfermedad autoinmunitarias basada en los niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones GASc; y opcionalmente administrar a la persona una terapia para la enfermedad autoinmunitaria.
La divulgacion proporciona composiciones que comprenden una cantidad predeterminada de GAMPc, tal como una vacuna que comprende ademas un inmunogeno para un patogeno objetivo, en la que el GAMPc proporciona un adyuvante. En particular, la composicion puede estar libre de otros di-nucleotidos clclicos, y/o ser adecuada de otra manera como adyuvante o vacuna, p. ej., esteriles farmaceuticamente aceptables, en cantidades, relaciones etc., predeterminadas definidas, y las composiciones pueden estar a granel o en dosificaciones unitarias, cuantificadas para uso individual. La divulgacion tambien proporciona metodos para inducir o promover una respuesta inmunitaria que comprende administrar a un mamlfero que lo necesita una cantidad eficaz de dichas composiciones. En particular, la administracion puede ser mucosal (sublingual o intranasal), intramuscular o subcutanea.
La invencion incluye todas las combinaciones de las realizaciones particulares enumeradas.
Descripcion de las realizaciones particulares de la invencion
La divulgacion propociona metodos y composiciones relacionados con GASc y GAMPc, incluido su uso en formulaciones (que incluyen adyuvantes de vacunas), filtros de farmacos, terapias y diagnosticos.
Aspectos destacados: 2'3'-GAMPc es un segundo mensajero endogeno producido por celulas de mamlfero; 2'3'- GAMPc es un ligando de alta afinidad para STING; 2'3'-GAMPc es un potente inductor de interferones de tipo I; La union de 2'3'-GAMPc induce cambios conformacionales de STING.
La divulgacion proporciona exploraciones de farmacos basadas en celulas que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una celula o un extracto de celula con una cantidad eficaz de un inhibidor de GASc exogeno, y detectar una inhibicion resultante de la sintasa. La sintasa puede ser normalmente GASc humano o murino, y puede truncarse, recombinarse en protelna de fusion, o modificarse de otra manera para adaptarse al ensayo. Normalmente, el metodo puede practicarse como un ensayo de seleccion en el que el inhibidor puede ser un inhibidor candidato para el analisis, que puede ser de una biblioteca, optimizacion de avance, etc. La inhibicion puede detectarse directa o inferencialmente, tal como mediante activacion de IRF3 inducida por GAMPc. (dimerizacion o translocacion nuclear), produccion de interferon o activacion de NF-kB, detection directa de GAMPc y otros productos mediante, por ejemplo, espectrometrla de masas, ensayos basados en anticuerpos (p. ej., ELISA, ALPHA, polarization fluorescente, etc,). Por ejemplo, el ARN de IFN se puede medir mediante RT-PCRc y la dimerizacion de IRF3 mediante electroforesis nativa en gel. Las lecturas adecuadas adicionales incluyen mediciones de ATP, GTP y pirofosfato (PPi).
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La divulgacion proporciona terapias que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una celula que se determina que lo necesita con una cantidad eficaz de un inhibidor de GASc exogeno. En particular, el metodo comprende administrar el inhibidor a un mamlfero que se determina que lo necesita y que comprende la celula, y/o el inhibidor puede ser un inhibidor de ciclasa de molecula pequena, o puede ser un ARNhc o ARNip especlfico de GASc, u otro ARNi o inhibidor especlfico de ARNGASc antisentido.
Los datos de los invesatigadores indican que GASc y la via GASc-GAMPc son importantes para desencadenar respuestas inflamatorias al ADN propio y extrano, y por lo tanto, los inhibidores de GASc pueden usarse para reducir la actividad GASc patogena de enfermedades autoinmunitarias asociadas. De forma similar, los datos de los investigadores indican que GASc tambien es importante para la transformacion de celulas normales a cancerosas y tambien para la supervivencia y metastasis de celulas cancerosas, y por lo tanto, los inhibidores de GASc pueden usarse para reducir la actividad GASc patogena de enfermedades neoplasicas asociadas.
La terapia actual para el lupus y otras enfermedades autoinmunitarias implica dosis masivas de agentes inmunosupresores, que tienen efectos secundarios graves. Aunque un nuevo anticuerpo BAFF (Benlysta) ha sido aprobado para el tratamiento del lupus, solo tiene una efectividad marginal. Dirigir GASc con inhibidores de molecula pequena, particularmente los disponibles por via oral, proporciona ventajas significativas sobre las terapias existentes. Los inhibidores de GASc se dirigen a la causa ralz del lupus y otras enfermedades autoinmunitarias y proporcionan beneficios terapeuticos a los pacientes. Ademas, la via de inmunidad innata del ADN citosolico se activa de manera aberrante en condiciones autoinmunes como el lupus eritematoso sistemico (SLE), el slndrome de Sjogren y el slndrome de Aicardi-Goutieres, y la inhibicion de GASc proporciona un tratamiento racional de estas y otras enfermedades autoinmunitarias.
La divulgacion proporciona exploraciones de farmacos in vitro que incluyen metodos para inhibir GASc, que comprenden poner en contacto una mezcla que comprende la sintasa, ATP, GTP y un inhibidor, en condiciones en las que el inhibidor inhibe la conversion catalltica por la sintasa del ATP y GTP a GAMPc y pirofosfato inorganico, y detectar una inhibicion resultante de la sintasa. En particular, la mezcla comprende adicionalmente ADN y la conversion puede ser dependiente de ADN. Ademas, el GASc puede ser constitutivamente activo. Normalmente, el metodo puede practicarse como un ensayo de seleccion en el que el inhibidor puede ser un inhibidor candidato para el analisis, que puede ser de una biblioteca, optimizacion de avance, etc. La mezcla puede estar contenida en una celula o un extracto de celula, o puede ser acelular.
La divulgacion proporciona ensayos de union a farmacos in vitro que incluyen metodos para inhibir la union de GASc a un sustrato o cofactor, que comprende poner en contacto una mezcla que comprende la sintasa y un sustrato ATP o GTP o un cofactor de ADN y un inhibidor, en condiciones en las que el inhibidor inhibe la union de la sintasa al sustrato o al cofactor, y detectar una inhibicion resultante de la union. Normalmente, el metodo se puede practicar como un ensayo de seleccion en el que el inhibidor puede ser un inhibidor candidato para el analisis, y se puede implementar en diversos formatos adecuados que incluyen ensayos inmunologicos en fase solida, ensayos de polarizacion fluorescente, etc.
La divulgacion proporciona metodos para preparar GAMPc que comprende formar una mezcla que comprende GASc, ATP y GTP, en condiciones en las que la sintasa catalltica convierte el ATP y el GTP en GAMPc, en el que la sintasa, el ATP y el GTP pueden estar en cantidades predefinidas, o el metodo comprende ademas la etapa de aislar o detectar el GAMPc resultante. En particular, la mezcla comprende adicionalmente ADN y la conversion puede ser dependiente de ADN.
La expresion patogena de la actividad de GASc, particularmente como resultado de la sobreexpresion o la mutacion, esta asociada con enfermedades autoinmunitarias humanas; por lo tanto, la divulgacion tambien proporciona metodos y ensayos para detectar niveles o mutaciones de GASc, particularmente como una herramienta de diagnostico para enfermedades autoinmunitarias humanas. Por consiguiente, la divulgacion proporciona metodos para detectar niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones de GASc que comprenden la etapa de: detectar en una muestra de una persona los niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones de GASc y asignar a la persona una metrica de enfermedad autoinmunitarias basada en los niveles de GAMPc, niveles de GASc o mutaciones GASc; y opcionalmente administrar a la persona una terapia para la enfermedad autoinmune.
La divulgacion proporciona composiciones que comprenden una cantidad predeterminada de GAMPc, tal como una vacuna que comprende ademas un inmunogeno para un patogeno objetivo, en la que el GAMPc proporciona un adyuvante. En particular, la composicion puede estar sustancialmente o esencialmente libre de otros di-nucleotidos clclicos. La divulgacion tambien proporciona metodos para inducir o promover una respuesta inmunitaria que comprende administrar a un mamlfero que lo necesita una cantidad eficaz de dichas composiciones. En particular, la administracion puede ser mucosal (sublingual o intranasal), intramuscular o subcutanea.
Como un potente inductor de interferones de tipo I, GAMPc proporciona un adyuvante inmunitario racional. GAMPc se puede usar como adyuvantes de vacuna, particularmente con vacunas de mucosa, y se puede formular con inmunogenos y entregar como son di-GMP clclico y di-AMPc como adyuvantes de vacuna; vease, p. ej., Pedersen, y col., PLoS ONE, noviembre de 2011, 6, 11, e26973; Ebensen y col., Vaccine 29, 2011, 5210-5220; Chen y col.,
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Vaccine 28, 2010, 3080-3085. De hecho, el adyuvante GAMPc a menudo es mas eficaz porque GAMPc es mas potente que di-GMPc para inducir interfere nes.
Ejemplos
Ejemplo 1. El GMP-AMP cfclico es un segundo mensajero endogeno en la senalizacion inmunitaria innata mediante ADN citosolico
La defensa del huesped contra elementos geneticos extranos es una de las funciones mas fundamentales de un organismo vivo. La presencia de ADN propio o extrano en el citoplasma es detectado por las celulas eucariotas como una senal de peligro o un signo de invasion extrana (1). El ADN se puede introducir en el citoplasma mediante infeccion bacteriana o viral, transfeccion o "fuga" del nucleo o mitocondrias en algunas condiciones patologicas que causan enfermedades autoinmunitarias como el lupus. En las celulas de mamlferos, el ADN citosolico desencadena la produccion de interferones de tipo I (IFN) y otras citocinas a traves de la protelna STING del retlculo endoplasmico (tambien conocida como MITA, MPYS o ERIS) (2). STING recluta y activa las cinasas citosolicas IKK y TBK1, que activan los factores de transcripcion NF-kB e IRF3, respectivamente. NF-kB e IRF3 luego ingresan al nucleo y funcionan juntos para inducir IFN y otras citocinas. Se ha demostrado que la ARN polimerasa III dependiente de ADN es un sensor que detecta y transcribe ADN rico en AT tal como poli[dA:dT] en un ligando de ARN capaz de estimular la via de RIG-I para inducir IFN^, 4). Sin embargo, la mayorla de las secuencias de ADN no activan la via de la ARN polimerasa III-RIG-I. En cambio, el ADN citosolico activa la via dependiente de STING de una manera independiente de la secuencia. Como el ADN citosolico activa la via STING sigue siendo elusivo.
La hipotesis de los investigadores es que el ADN se une y activa un supuesto sensor de ADN citosolico, que luego directa o indirectamente activa STING, lo que conduce a la activacion de IRF3 y NF-kB. Para probar este modelo, los investigadores desarrollaron un ensayo de complementacion in vitro usando la llnea celular de fibrosarcoma murino L929, que se sabe que induce interferon-p (IFNp) de una manera dependiente de STING (5). Los investigadores usaron una llnea celular L929 que expresaba de forma estable un ARN(hc) horquillado corto contra STING de modo que la transfeccion de ADN activarla solamente factores aguas arriba de STING, incluido el sensor de ADN supuesto. Las celulas L929-STINGhc se transfectaron con diferentes tipos de ADN y luego los extractos citoplasmaticos de estas celulas se mezclaron con la llnea celular monocltica humana THP1 o la llnea celular de macrofagos murinos Raw264.7, que se permeabilizo con perfringolisina O (PFO). El tratamiento PFO atraviesa agujeros en la membrana plasmatica (6),permitiendo que el citoplasma se difunda dentro y fuera de las celulas, mientras conserva organulos, incluido el retlculo endoplasmico (que contiene STING) y el aparato de Golgi dentro de las celulas (7). Si se genera un activador aguas arriba de STING en las celulas transfectadas con ADN, se espera que el citoplasma que contiene dicho activador active STING en las celulas permeabilizadas con PFO, conduciendo a la fosforilacion y dimerizacion de IRF3.
Los extractos citoplasmicos de celulas L929-STINGhc transfectadas con una secuencia de ADN conocida como ADN estimulante del interferon (ISD), poli[dA:dT], un ADNdc de 50 pares de bases rico en GC (G:C50), poli[dI:dC] o el ADN de testlculo de arenque (ADN-TA) activo IRF3 en celulas THP1 permeabilizadas, lo que indica que esta actividad era independiente de la secuencia de ADN.
Para determinar si el activador de STING es una protelna, los investigadores incubaron los extractos citoplasmaticos a 95 °C para desnaturalizar la mayorla de las protelnas y luego incubaron el "sobrenadante de calor" con celulas THP1 permeabilizadas. Sorprendentemente, el sobrenadante de calor de las celulas transfectadas con ISD o ADN- TA causo la dimerizacion de IRF3. Esta actividad era resistente al tratamiento con Benzonase, que degrada el ADN y el ARN, o la proteinasa K. Por tanto, el activador de STING probablemente no sea una protelna, ADN o ARN.
Para probar si el ADN podrla estimular la generacion del activador de STING resistente al calor in vitro, los investigadores incubaron el ADN-TA con extractos citoplasmaticos L929-STINGhc (S100) en presencia de ATP. La mezcla de reaccion se calento a 95 °C para desnaturalizar las protelnas. De manera destacable, la incubacion del sobrenadante con celulas Raw264.7 permeabilizadas condujo a la dimerizacion de IRF3. Esta actividad dependio de la adicion de ADN a los extractos citoplasmicos. Otro ADN, incluyendo poli[dA:dT], poli [dG:dC] e ISD, tambien estimulo la generacion del activador de STING en extractos citoplasmaticos L929-STINGhc, mientras que el poli[I:C] y el ARN monocatenario no tuvieron actividad. Se obtuvieron resultados similares con celulas tHP1 permeabilizadas. La calda de STING en las celulas THP1 permeabilizadas suprimio la activacion de IRF3 por el factor resistente al calor generado por ADN transfectado en celulas L929 o ADN anadido a extractos citosolicos de L929. Los experimentos de control mostraron que la calda de STING inhibio la activacion de IRF3 y la induccion de IFNp y TNFa en celulas THP1 mediante transfeccion de DNA-TA, pero la activacion de IRF3 mediante transfeccion poli[I:C] o infeccion por el virus Sendai, que se sabe que activa la via de RIG-I, no se vio afectada por la calda de STING. Los investigadores tambien probaron extractos citoplasmicos de varias llneas celulares por su capacidad para producir el activador de STING resistente al calor. La incubacion de DNA-TA con extractos de celulas MEF primarias, macrofagos procedentes de medula osea de raton (BMDM) y celulas L929 condujo a la generacion del factor resistente al calor que activo el IRF3. Los extractos de celulas humanas de THP1, pero no HEK293T, tambien fueron capaces de producir este activador STING. Estos resultados estan de acuerdo con el hallazgo anterior de los investigadores de que las celulas MEF, BMDM, L929 y THP1, pero no de celulas HEK293T, poselan la via
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dependiente de STING, dependiente de la ARN polimerasa III, para inducir interferones tipo I (3).
A continuacion los investigadores purificaron el activador de STING resistente al calor a partir de extractos de celulas L929 usando varias etapas cromatograficas que incluyen una etapa de purification por afinidad STING-Flag. Las investigaciones anteriores han demostrado que las moleculas bacterianas di-AMP clclicas y di-GMP clclicas se unen a STING e inducen interferones de tipo I (8, 9). Sin embargo, usando espectrometrla de masa de cromatografla nanollquida (nano-LC-MS), los investigadores no detectaron espectros MS o MS/MS consistentes con los esperados de di-GMPc ([M+H]+=691) o di-AMPc ([M+H]+=659). Curiosamente, el examen en profundidad del espectro MS revelo dos iones con relaciones de masa a carga (m/z) de 675,1 (z=1+) y 338,1 (z=2+), que estaban presentes en las fracciones activas pero ausentes en los espectros de fondo. Estos valores m/z, a pesar de la baja precision de masa del espectrometro de masas (LTQ), fueron equivalentes a los valores m/z medios calculados de di-GMPc y di-AMPc (675 = [691 + 659]/2). Esta observation indico que el ion detectado era un hlbrido de di-GMPc y di-AMPc, es decir, GMP-AMP clclico (m/z = 675,107, z=1+; m/z 338,057, z=2+). La fragmentation de disociacion inducida por colision (CID) de este ion (m/z = 338,1, z=2+) revelo varios iones prominentes con valores m/z esperados de los iones producto de GMP-AMPc (GAMPc). Curiosamente, la espectrometrla de masas cuantitativa que usa el monitoreo de reaction selectiva (SRM) mostro que la abundancia de los iones que representan GAMPc en las fracciones de una columna C18 se correlaciona muy bien con sus actividades estimulantes de IRF3. Recientemente se ha identificado GAMPc en la bacteria Vibro cholera y se ha demostrado que desempena un papel en la quimiotaxis bacteriana y la colonization (10). Sin embargo, no se ha indicado que GAMPc exista o funcione en celulas eucarioticas.
Para verificar la identidad del activador de STING resistente al calor, los investigadores usaron un espectrometro de masas de alta precision de alta resolution (Q Exactivo, Thermo) para realizar analisis de nano-LC-MS. El activador de STING procedente de celulas tenia m/z de 675,107 (z=1+) y 338,057 (z=2+), que coincidla exactamente con los valores teoricos de GAMPc. Para caracterizar aun mas la estructura y funcion de GAMPc, los investigadores desarrollaron un protocolo de un solo matraz de diez etapas para sintetizar qulmicamente GAMPc. Los espectros MS/MS del activador de STING procedente de celulas fueron identicos a los del GAMPc qulmicamente sintetizado. Estos resultados demuestran que las celulas L929 produjeron GAMPc.
Los ensayos cuantitativos de RT-PCR y ELISA mostraron que el GAMPc qulmicamente sintetizado indujo ARN y proteina de IFNp en celulas L929 despues de la introduction en las celulas. Los experimentos de titulacion mostraron que GAMPc indujo ARN de IFNp de manera robusta incluso a concentraciones tan bajas como 10 nM. De hecho, GAMPc fue mucho mas potente que di-GMPc para inducir IFNp basandose en ensayos ELISA. GAMPc tambien fue mas potente que di-GMPc y di-AMPc en la activation de IRF3. Para determinar si los extractos de L929 contenian enzimas que podian sintetizar otros tipos de di-nucleotidos u oligonucleotidos capaces de activar IRF3, los investigadores probaron los cuatro ribonucleotidos en diversas combinaciones. El ATP y el GTP eran necesarios y suficientes para apoyar la sintesis de un activador de IRF3, lo que apoya aun mas que L929 contenia una enzima que sintetiza GAMPc a partir de ATP y GTP.
Para determinar si la infection por el virus del ADN conduce a la production de GAMPC en las celulas, los investigadores infectaron las celulas L929 con HSV-1 que carece de ICP34.5, una proteina viral que se sabe que antagoniza la produccion de interferon en las celulas infectadas (11). Al igual que la transfection de ADN, la infeccion por HSV-1AICP34.5 condujo a la activacion de IRF3 en celulas L929. Los extractos celulares de las celulas transfectadas con ADN o infectadas con virus contenian un factor resistente al calor que podia activar IRF3 en celulas Raw264.7 permeabilizadas. Como control, los investigadores infectaron celulas L929 con una cepa del virus de la estomatitis vesicular, VSV-AM51-GFP, un virus de ARN que desencadena una fuerte produccion de interferon a traves de la via RIG-I (12, 13). A diferencia de HSV-1, las celulas infectadas con VSV no contenian el activador de IRF3 resistente al calor en el mismo ensayo in vitro, aunque la infeccion por VSV indujo la activacion de IRF3 en celulas L929. El factor resistente al calor en celulas infectadas con HSV-1 se enriquecio mediante HPLC de fase inversa y se cuantifico mediante nano-LC-MS usando SRM. Las celulas transfectadas con ADN o infectadas con HSV-1, pero no las celulas tratadas de manera simulada o infectadas con VSV, produjeron niveles elevados de GAMPc. Los experimentos cineticos mostraron que, despues de transfectar el ADN en celulas L929, se producia GAMPc antes de la dimerization de IRF3 y se podia detectar la induction de IFNp. Para probar si los virus de ADN podian inducir la produccion de GAMPc en celulas humanas, los investigadores infectaron las celulas THP1 con virus HSV1 o Vaccinia (VACV). Ambos virus indujeron la dimerizacion de IRF3 en las celulas. Curiosamente, ambos virus tambien desencadenaron la produccion de GAMPc que activo IRF3. En conjunto, estos resultados indicaron que la transfeccion de ADN y las infecciones con virus de ADN en celulas humanas y de raton producian GAMPc, que condujo a la activacion de IRF3.
Para determinar si GAMPc activa IRF3 a traves de STING, los investigadores llevaron a cabo tres conjuntos de experimentos. En primer lugar, los investigadores establecieron una linea celular HEK293T que expresa de forma estable STING, estimularon estas celulas con GAMPc y luego midieron la induccion de IFNp mediante RT-PCR cuantitativa. Las celulas HEK293T no respondieron a GAMPc, probablemente debido a la falta o al nivel muy bajo de expresion de STING en estas celulas. La expresion de STING en celulas HEK293T presento un alto nivel de induccion de IFNp por GAMPc. Sin embargo, el ADN no estimula las celulas HEK293T/sTiNG para inducir IFNp, lo que concuerda con un defecto de las celulas HEK293T en la produccion de GAMPc en respuesta a la estimulacion del ADN. A diferencia, las celulas L929 indujeron IFNp en respuesta a estimulacion por GAMPc o ADN. La infeccion
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por HSV-1 indujo la dimerizacion de IRF3 en L929, pero no en las celulas HEK293T o HEK29T STING, lo que indica que la produccion de GAMPc es importante para que HSV-1 active IRF3 en las celulas. De hecho, los extractos de L929 infectadas con HSV1, pero no de las celulas HEK293T o HEK293T/STING, contenlan la actividad de GAMPc que conducla a la dimerizacion de IRF3 en las celulas Raw264.7 permeabilizadas. Estos resultados indican que la expresion de STING en celulas HEK293T instalo la capacidad de las celulas para activar IRF3 e inducir IFNp en respuesta a GAMPc, pero fue insuficiente para instalar la respuesta al ADN o virus de ADN debido a un defecto de celulas HEK293T en la slntesis de GAMPc.
En segundo lugar, los investigadores probaron la respuesta de las celulas L929 y L929-STINGhc a GAMPc. Analogo a ISD y di-GMPc, la dimerizacion de IRF3 inducida por GAMPc dependla de STING. A diferencia, poli[I:C] aun inducla la dimerizacion de IRF3 en ausencia de STING. Estos resultados demuestran que STING es necesario para que GAMPc active IRF3.
Finalmente, los investigadores examinaron si STING se une directamente a GAMPc. La protelna STING recombinante que contienen restos 139-379, que se ha demostrado que se unen a di-GMPc (14), se expreso y se purifico a partir de E. coli y luego se incubo con 32P-GAMPc seguido de reticulacion inducida por UV. Se detecto una banda radiomarcada correspondiente al complejo STING-GAMPc reticulado cuando STING y 32P-GAMPc estaban presentes. Las altas concentraciones de ATP o GTP no competlan con la formacion del complejo STING-GAMPc. Por el contrario, la intensidad de esta banda disminuyo a medida que aumentaban las concentraciones de GAMPc frla competidora, di-GMPc o di-AMPc, lo que indica que los sitios de union de GAMPc en STING se solapan con aquellos que interactuan con di-GMPc y di-AMPc. De hecho, las mutaciones de varios restos que recientemente se ha demostrado que participan en la union de STING a di-GMPc (14), que incluyen S161Y, Y240s y N242A, tambien alteraron la union de STING a GAMPc. En conjunto, estos resultados demuestran que GAMPc es un ligando que se une y activa STING.
Se ha demostrado que los di-nucleotidos clclicos funcionan como segundos mensajeros bacterianos que regulan diversos procesos fisiologicos, incluida la motilidad bacteriana y la formacion de biopellculas (15). Un informe reciente mostro que di-GMPc se produce en el protozoo Dictyostelium y funciona como un morfogeno para inducir la diferenciacion de celulas del tallo (16). En este ejemplo, los investigadores identificaron GAMPc como el primer di- nucleotido clclico en metazoos. Ademas, los investigadores demostraron que GAMPc es un potente inductor de interferones tipo I. El papel de GAMPc es analogo al de AMPc, el segundo mensajero mejor estudiado (17). Al igual que el AMPc, que se sintetiza mediante la adenilato ciclasa tras su activacion por ligandos aguas arriba, GAMPc se sintetiza mediante una ciclasa en respuesta a la estimulacion por un ligando de ADN (18). El AMPc se une y activa la protelna quinasa A y otras moleculas efectoras. De forma similar, GAMPc se une y activa STING para desencadenar las cascadas de senalizacion aguas abajo. Como molecula endogena en celulas de mamlfero, GAMPc puede usarse en terapia inmunologica o como un adyuvante de vacunas.
Referencias y notas
1. R. Barbalat, SE Ewald, ML Mouchess, GM Barton, Reconocimiento de Acido Nucleico por el Sistema Inmunitario Innato. Annu Rev Immunol, (5 de abril ).
2. GN Barber, vlas inmunitarias innatas del ADN citoplasmico. Immunological reviews 243, 99 (septiembre de 2011).
3. YH Chiu, JB Macmillan, ZJ Chen, La ARN polimerasa III detecta ADN citosolico e induce interferones tipo I a traves de la via RIG-I. Cell 138, 576 (7 de agosto de 2009).
4. A. Ablasser y col., Deteccion dependiente de RIG-I de poli(dA:dT) a traves de la induccion de un intermedio de ARN transcrito con ARN polimerasa III. Nat Immunol, (16 de julio de 2009).
5. Y. Tanaka, ZJ Chen, STING especifica la fosforilacion de IRF3 por TBK1 en la via de senalizacion de ADN citosolico. Sci Signal 5, ra20 (2012).
6. J. Rossjohn y col., Estructuras del perfringolisina O sugieren una via para la activacion de las citolisinas dependientes del colesterol. Journal of molecular biology 367, 1227 (13 de abril de 2007).
7. T. Saitoh y col., Atg9a controla la translocacion dinamica conducida por ADNdc de STING y la respuesta inmunologica innata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 20842 (8 de diciembre de 2009).
8. JJ Woodward, AT Iavarone, DA Portnoy, di-AMPc secretada por Listeria monocytogenes intracelular activa una respuesta de interferon tipo I del huesped. Science 328, 1703 (25 de junio de 2010).
9. DL Burdette y col., STING es un sensor inmunitario innato directo de di-GMP clclico. Nature 478, 515 (27 de octubre de 2011).
10. BW Davies, RW Bogard, TS Young, JJ Mekalanos, La regulacion coordinada de los elementos geneticos accesorios produce di nucleotidos clclicos para la virulencia de V. cholerae. Cell 149, 358 (13 de abril de 2012).
11. KL Mossman, JR Smiley, Virus del herpes simple ICP0 e ICP34.5 contrarrestan distintas barreras inducidas por el interferon para la replicacion del virus. Journal of virology 76, 1995 (febrero de 2002).
12. DF Stojdl y col., Las cepas de VSV con defectos en su capacidad para detener la inmunidad innata son potentes agentes sistemicos aanticancerosos. Cancer Cell 4, 263 (octubre de 2003).
13. Q. Sun y col., El papel especlfico y esencial de MAVS en respuestas inmunologicas innatas antivirales. Immunity 24, 633 (mayo de 2006).
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14. Q. Yin y col., Deteccion di-GMP ciclica a traves de la protelna de senalizacion inmunologica innata STING. Molecular Cell 46, 735 (29 de junio de 2012).
15. C. Pesavento, R. Hengge, Segundos mensajeros a base de en nucleotidos bacterianos. Curr Opin Microbiol 12, 170 (abril de 2009).
16. ZH Chen, P. Schaap, El mensajero procariota di-GMPc desencadena la diferenciacion de celulas de tallo en Dictyostelium. Nature 488, 680 (30 de agosto de 2012).
17. SA Blumenthal, Earl Sutherland (1915-1975) y el descubrimiento del AMP clclico. Perspect Biol Med 55, 236 (2012).
18. L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, ZJ Chen, La GMP-AMP sintasa ciclica es un sensor de ADN citosolico que activa la via del interferon de tipo I. Science, (2012).
Ejemplo 2. La GMP-AMP sintasa ciclica es un sensor de ADN citosolico que activa la via del interferon de tipo I
Se sabla que el ADN estimulaba la respuesta inmunologica mucho antes de que se demostrara que era un material genetico, pero el mecanismo por el cual el ADN funciona como un inmunoestimulante sigue siendo poco entendido (1). Aunque el ADN puede estimular la produccion de interferones tipo I en celulas dendrlticas mediante la union al receptor tipo Toll 9 (TLR9) en el endosoma, todavla no esta claro como el ADN en el citosol induce el IFN. En particular, el sensor que detecta el ADN citosolico en la via del interferon sigue siendo elusivo (2). Aunque se ha sugerido que varias protelnas, incluyendo DAI, ARN polimerasa III, IFI16, DDX41 y varias otras ADN helicasas, funcionan como los potenciales sensores de ADN que inducen IFN, ninguna se ha encontrado con aceptacion universal (3).
Purificacion e identificacion de GMP-AMP sintasa ciclica (GASc). Los investigadores mostraron que la entrega de ADN a celulas de mamlfero o extractos citosolicos desencadeno la produccion de GMP-AMP clclico (GAMPc), que se unio a STING y lo activo, lo que condujo a la activacion de IRF3 y a la induccion de IFNp (4). Para identificar la GAMPc sintasa (GASc), los investigadores fraccionaron extractos citosolicos (S100) de la llnea celular de fibrosarcoma murino L929, que contiene la actividad de slntesis de GAMPc. Esta actividad se ensayo incubando las fracciones de columna con ATP y GTP en presencia de ADN de testlculo de arenque (ADN-TA). Despues de digerir el ADN con Benzonase y calentar a 95 °C para desnaturalizar protelnas, los sobrenadantes resistentes al calor que contenlan GAMPc se incubaron con celulas Raw264.7 permeabilizadas con Perfringolisina O (PFO) (macrofagos de raton transformados). La dimerizacion de IRF3 inducida por GAMPc en estas celulas se analizo mediante electroforesis nativa en gel (4). Usando este ensayo, los investigadores llevaron a cabo tres vlas de purificacion independientes, consistiendo cada una en cuatro etapas de cromatografla, pero que diferlan en las columnas o en el orden de las columnas que se usaron. En particular, la tercera via inclula una etapa de purificacion por afinidad usando un oligo de ADN biotinilado (un ADN de 45 pb conocido como ADN estimulante inmunologico o ISD). Los investigadores estimaron que alcanzaron un intervalo de 8000-15.000 veces de purificacion y 2-5 % de recuperacion de la actividad de estas vlas de fraccionamiento. Sin embargo, en la ultima etapa de cada una de estas vlas de purificacion, la tincion con plata de las fracciones no revelo bandas de protelnas transparentes que se purificaron conjuntamente con la actividad GASc, lo que sugiere que la abundancia de la protelna GASc supuesta podrla ser muy baja en extractos citosolicos L929.
Los investigadores desarrollaron una estrategia de espectrometrla de masas cuantitativa para identificar una lista de protelnas que se purificaron conjuntamente con la actividad de GASc en la ultima etapa de cada via de purificacion. Los investigadores razonaron que la supuesta protelna GASc debe purificarse conjuntamente con su actividad en las tres vlas de purificacion, mientras que la mayorla de las protelnas "contaminantes" no lo harlan. Por tanto, desde la ultima etapa de cada via de purificacion, los investigadores eligen las fracciones que contenlan la mayor parte de la actividad de GASc (fracciones maximas) y las fracciones adyacentes que contenlan muy poca actividad o ninguna. Las protelnas en cada fraccion se separaron mediante SDS-PAGE y se identificaron mediante espectrometrla de masas por cromatografla nano llquida (nano-LC-MS). Los datos se analizaron mediante cuantificacion sin etiquetas usando el software MaxQuant (5). De manera destacable, aunque muchas protelnas se purificaron conjuntamente con la actividad de GASc en una o dos vlas de purificacion, solo tres protelnas se purificaron conjuntamente en las tres vlas. Las tres fueron supuestas protelnas no caracterizadas: E330016A19 (n° de acceso: NP_775562), Arf-GAP con protelna 2 que contiene un dominio de PH doble (NP_742145) y una protelna de 9 kDa de partlculas de reconocimiento de senal (NP_036188). Entre estas, se identificaron mas de 24 peptidos exclusivos en E330016A19, que representan un 41 % de cobertura en esta protelna de 507 aminoacidos.
El analisis bioinformatico llamo la atencion de los investigadores sobre E330016A19, que mostro homologla estructural y de secuencia con el dominio catalltico de la oligoadenilato sintasa (OAS1). En particular, E330016A19 contiene un motivo G[G/S]x9-i3[E/D]h[E/D]h conservado, en el que xg-i3 indica 9-13 restos flanqueantes que consisten en cualquier aminoacido y h indica un aminoacido hidrofobico. Este motivo se encuentra en la familia nucleotidiltransferasa (NTasa) (6). Ademas de OAS1, esta familia incluye adenilato ciclasa, poli[A] polimerasa y ADN polimerasas. El extremo C de E330016A19 contenla un dominio 21 anormal masculino (Mab21), que se identifico por primera vez en la protelna C. elegans Mab21 (7). La alineacion de secuencias revelo que los dominios C- terminal NTasa y Mab21 estan altamente conservados desde el pez cebra hasta el ser humano, mientras que las secuencias N-terminal estan mucho menos conservadas (8). Curiosamente, el homologo humano de E330016A19,
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C6orf150 (tambien conocido como MB21D1) fue identificado recientemente como uno de varios exitos positivos en una pantalla para genes estimulados con interferon (ISG) cuya sobreexpresion inhibio la replicacion viral (9). Para mayor claridad y sobre la base de la prueba presentada en este documento, los investigadores proponen nombrar la protelna de raton E330016A19 como GAScr y el homologo humano C6orf150 como GASch. La RT-PCR cuantitativa mostro que la expresion de GAScr era baja en celulas MEF inmortalizadas pero alta en L929, Raw264.7 y macrofagos procedentes de medula osea (BMDM). De forma similar, la expresion del ARN GASch fue muy baja en celulas HEK293T pero alta en la llnea celular monocltica humana THP1. La inmunotransferencia confirmo ademas que la protelna GASch se expreso en celulas THP1 pero no en celulas HEK293T. Por tanto, los niveles de expresion de GAScr y GASch en diferentes llneas celulares se correlacionan con la capacidad de estas celulas para producir GAMPc e inducir IFNp en respuesta al ADN citosolico (4, 10).
La catalisis por GASc desencadena la produccion de interferon de tipo I. La sobreexpresion de GAScr en HEK293T, que carece de expresion de STING, no indujo IFNp, mientras que la expresion estable de STING en celulas HEK293T produjo que estas celulas fueran altamente competentes en la induccion de IFNp por GAScr. Curiosamente, las mutaciones puntuales de los restos catallticos supuestos G198 y S199 a alanina suprimieron la capacidad de GAScr para inducir IFNp. Estas mutaciones, as! como las mutaciones de los otros supuestos restos catallticos E211 y D213 a alanina, tambien anularon la capacidad de GAScr para inducir la dimerizacion de IRF3 en celulas HEK293T-STING. La magnitud de la induccion de IFNp por GASc fue comparable a la inducida por MAVS (una protelna adaptadora que funciona aguas abajo del sensor de ARN RIG-I) y fue varias ordenes mas altas que las inducidas por otros sensores de ADN supuestos, incluyendo DAI, IFI16 y DDX41. Para determinar si la sobreexpresion de GASc y otros supuestos sensores de ADN conduclan a la produccion de GAMPc en las celulas, los sobrenadantes de los extractos celulares tratados termicamente se incubaron con celulas Raw264.7permeabilizadas con PFO, seguido de la medicion de la dimerizacion de IRF3. Entre todas las protelnas expresadas en celulas HEK293T-STING, solo el GASc fue capaz de producir la actividad de GAMPc en las celulas.
Para probar si GASc podia sintetizar GAMPc in vitro, los investigadores purificaron las proteinas Flag-GASc de tipo silvestre (WT) y mutantes de celulas HEK293T transfectadas. GAScr WT y GASch, pero no los mutantes cataliticamente inactivos de GASc, fueron capaces de producir la actividad de GAMPc, que estimulo la dimerizacion de IRF3 en celulas Raw264.7 permeabilizadas. Curiosamente, las actividades in vitro de GAScr y GASch dependian de la presencia de ADN-TA. Para probar si el ADN potencia la induccion de IFNp por GASc en celulas, se transfectaron diferentes cantidades de plasmido de expresion de GASc con o sin ADN TA en celulas HEK293T- STING. ADN-TA potencio significativamente la induccion de IFNp mediante dosis bajas (10 y 50 ng) pero no altas (200 ng) de plasmido GASc. A diferencia de GASc, IFI16 y DDX41 no indujeron IFNp incluso cuando ADN-TA se transfecto conjuntamente.
Se requiere GASc para la induccion de IFNp por transfeccion de ADN e infeccion por el virus de ADN. Los
investigadores usaron dos pares diferentes de ARNip para destruir GAScr en celulas L929, y descubrieron que los dos ARNip oligos inhibian significativamente la induccion de IFNp por ADN-TA, y que el grado de inhibition se correlacionaba con la eficiencia para destruir GAScr ARN. Los investigadores tambien establecieron dos lineas celulares L929 que expresan de forma estable secuencias de ARNhc dirigidas a distintas regiones de GAScr. La capacidad de estas celulas para inducir IFNp en respuesta a ADN-TA se vio gravemente comprometida en comparacion con otra linea celular que expresa un ARNhc de control (GFP). Curiosamente, la expresion de GASc en las celulas L929-GASchc restauro la induccion de IFNp. La expresion de STING o MAVS en celulas L929-GASchc o la entrega de GAMPc a estas celulas tambien indujo IFNp. A diferencia, la expresion de GASc o la entrega de GAMPc no indujo IFNp en celulas L929-STINGhc, mientras que la expresion de STING o MAVS restablecio la induccion de IFNp en estas celulas. Los analisis cuantitativos de RT-PCR confirmaron la especificidad y la eficiencia de destruir GASc y STING en las lineas celulares L929 que expresan de forma estable los ARNhc correspondientes. Estos resultados indican que GASc funciona aguas arriba de STING y se requiere para la induccion de IFNp por ADN citosolico.
El virus del herpes simple 1 (HSV-1) es un virus de ADN que se sabe que induce IFN a traves de la activation de STING e IRF3 (3). Curiosamente, el RNAhc contra GAScr, pero no gFp, en celulas L929 inhibio fuertemente la dimerizacion de IRF3 inducida por la infeccion por HSV-1. A diferencia, la elimination de GASc no afecto la activacion de IRF3 por el virus Sendai, un virus ARN. Para determinar si se requiere GASc para la generation de GAMPc en celulas, los investigadores transfectaron ADN-TA en L929-GFPhc y L929-GAShcc o infectaron estas celulas con HSV-1, luego prepararon fracciones resistentes al calor que contenian GAMPc, que fue posteriormente entregado a las celulas Raw264.7 permeabilizadas para medir la activacion de IRF3. La caida de GASc suprimio en gran parte la actividad de GAMPc generada por transfeccion de ADN o infeccion por HSV-1. La espectrometria de masas cuantitativa usando monitorizacion de reaction selectiva (SRM) mostro que la abundancia de GAMPc inducida por transfeccion de ADN o infeccion por HSV-1 se reducia notablemente en celulas L929 agotadas de GASc. En conjunto, estos resultados demuestran que GASc es esencial en la produccion de GAMPc y la activacion de IRF3 en respuesta a la transfeccion de ADN o infeccion por HSV-1.
Para determinar si GASc es importante en la via de detection de ADN en celulas humanas, los investigadores establecieron una linea celular THP1 que expresa de forma estable un ARNhc dirigido a GASch. La caida de GASch inhibio fuertemente la induccion de IFNp por transfeccion de ADN-TA o infeccion por virus vaccinia, otro virus de
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DNA, pero no virus Sendai. La calda de GASch tambien inhibio la dimerizacion de IRF3 inducida por la infeccion por HSV-1 en celulas THP1. Este resultado se confirmo adicionalmente en otra llnea celular THP1 que expresa un ARNhc dirigido a una region diferente de GASch. Los efectos fuertes y especlficos de multiples secuencias de ARNhc de GASc en la inhibicion de la activacion de IRF3 inducida por aDn y la induction de IFNp en llneas celulares de raton y humanas demuestran un papel clave de GASc en la via de detection de ADN dependiente de STING.
La protefna GASc recombinante cataliza la sfntesis de GAMPc a partir de ATP y GTP de una manera dependiente del ADN. Para probar si GASc es suficiente para catalizar la slntesis de GAMPc, los investigadores expresaron GASch etiquetada con FLAG en celulas HEK293T y la purificaron a homogeneidad aparente. En presencia de ADN-TA, la protelna GASc purificada catalizo la production de actividad de GAMPc, que estimulo la dimerizacion de IRF3 en celulas Raw264.7 permeabilizadas. El tratamiento con DNasa-I suprimio esta actividad. La actividad de GASc tambien fue estimulada por otro ADN, incluyendo poli(dA:dT), poli(dG:dC) e ISD, pero no el ARN poli(I:C). La slntesis de GAMPc por GASc requerla ATP y GTP, pero no CTP o uTp. Estos resultados indican que la actividad ciclasa de la protelna GASc purificada fue estimulada por ADN pero no por ARN.
Los investigadores tambien expresaron GAScr en E. coli como una protelna de fusion SUMO. Despues de la purification, la Sumo-GAScr genero la actividad de GAMPc de una manera dependiente de ADN. Sin embargo, despues de que la etiqueta SUMO fue eliminada por una proteasa de Sumo, la protelna GAScr catalizo la slntesis de GAMPc de una manera independiente del ADN. La razon de esta perdida de dependencia del ADN no esta clara, pero podrla deberse a algunos cambios conformacionales despues de la elimination de sumo. Los experimentos de valoracion mostraron que menos de 1 nM de la protelna GASc recombinante condujo a la dimerizacion de IRF3 detectable, mientras que el mutante catallticamente inactivo de GASc no logro activar IRF3 incluso a altas concentraciones. Para probar formalmente que el GASc cataliza la slntesis de GAMPc, los productos de reaction se analizaron mediante nano-LC-MS usando SRM. Se detecto GAMPc en una reaccion de 60 minutos que contenla GASs, ATP y GTP purificados. La identidad de GAMPc se confirmo adicionalmente mediante fragmentation ionica usando disociacion inducida por colision (CID). El patron de fragmentacion de GAMPc sintetizado por GASc purificado revelo iones de producto cuyos valores m/z coincidlan con los de GAMPc qulmicamente sintetizado. En conjunto, estos resultados demuestran que el GASc purificado cataliza la slntesis de GAMPc a partir de ATP y GTP.
GASc se une al ADN. La estimulacion de la actividad de GASc por ADN indica que GASc es un sensor de ADN. De hecho, GST-GAScr y GST-GASch, pero no GST-extremo N de RIG-I [RIG-I(N)], se precipitaron mediante ISD biotinilado. A diferencia, el ARN biotinilado no se unio a GASc. Los analisis de deletion mostraron que el fragmento GASch N-terminal que contiene los restos 1-212, pero no el fragmento C-terminal 213-522, se unio a ISD. Un fragmento C-terminal mas largo que contiene los restos 161-522 se unio a ISD, lo que indica que la secuencia 161212 puede ser importante para la union al ADN. Sin embargo, la delecion de los restos 161-212 de GASch no altero significativamente la union a ISD, lo que indica que GASc contiene otro dominio de union a ADN en el extremo N. De hecho, el fragmento N-terminal que contiene los restos 1-160 tambien se une a ISD. Por tanto, GASc puede contener dos dominios de union al ADN separados en el extremo N. No obstante, esta claro que el extremo N de GASch que contiene los restos 1-212 es necesario y suficiente para unirse al ADN.
Diferentes mutantes de delecion de GASch se sobreexpresaron en celulas HEK293T-STING para determinar su capacidad para activar IRF3 e inducir IFNp y el factor de necrosis tumoral citoquina a (TNFa). El fragmento de protelna 1-382, que carece de los 140 restos C-terminales que incluyen gran parte del dominio Mab21, no indujo IFNp o TNFa o activo IRF3, lo que indica que un dominio Mab21 intacto es importante para la funcion de GASc. Tal como se esperaba, la delecion de los 212 restos N-terminales (fragmento 213-522), que incluyen parte del dominio NTasa, suprimio la actividad de GASc. Una delecion interna de solo cuatro aminoacidos (KLKL, A171-174) dentro de la primera helice del pliegue de NTasa que precede a los restos catallticos tambien destruyo la actividad de GASc. Curiosamente, la delecion de los 160 restos N-terminales no afecto la activacion de IRF3 o la induccion de citoquinas por GASc. El ensayo In vitro mostro que este fragmento de protelna (161-522) todavla activaba la via de IRF3 de una manera dependiente de ADN. Por tanto, los 160 aminoacidos N-terminales de GASch, cuya secuencia primaria no esta altamente conservada evolutivamente, parece ser en gran medida prescindible para la union al ADN y la catalisis por GASc. A diferencia, los dominios NTasa y Mab21 son importantes para la actividad de GASc.
El GASc se localiza predominantemente en el citosol. Para determinar si GASc es un sensor de ADN citosolico, los investigadores prepararon extractos citosolicos y nucleares de celulas THP1 y analizaron la localization de GASch endogeno mediante inmunotransferencia. Se detecto GASch en los extractos citosolicos, pero apenas detectable en los extractos nucleares. Los extractos de THP1 se sometieron adicionalmente a centrifugation diferencial para separar los organulos subcelulares entre si y del citosol. Se detectaron cantidades similares de GASch en S100 y P100 (sedimento despues de una centrifugacion de 100.000 xg), lo que indica que esta protelna es soluble en el citoplasma, pero una fraction significativa de la protelna esta asociada con veslculas u organulos ligeros. La protelna GASc no se detecto en P5, que contenla mitocondrias y ER como se prueba por la presencia de VDAC y STING, respectivamente. GASc tampoco fue detectable en P20, que contenla predominantemente ER y veslculas pesadas.
Los investigadores tambien examinaron la localizacion de GASc mediante microscopla de inmunofluorescencia
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confocal usando celulas L929 que expresan de forma estable Flag-GAScr. La protelna GASc se distribuyo por todo el citoplasma, pero tambien se pudo observar en la region nuclear o peri-nuclear. Curiosamente, despues de que las celulas se transfectaron con ISD etiquetado con Cy3 durante 2 o 4 horas, se observaron formas punteadas de GASc y se solaparon con la fluorescencia del ADN. Dicha co-localizacion y aparente agregacion de GASc y Cy3-ISD se observo en mas del 50 % de las celulas bajo observacion. Estos resultados, junto con la prueba bioqulmica de union directa de GASc con ADN, indican que GASc se une al ADN en el citoplasma.
Analisis. En este ejemplo, los investigadores desarrollaron una estrategia que combinaba la espectrometrla de masas cuantitativa con la purificacion de protelnas convencional para identificar protelnas biologicamente activas que se purificaron parcialmente a partir de extractos de celulas brutas. Esta estrategia es generalmente aplicable a protelnas que son diflciles de purificar a homogeneidad debido a muy poca abundancia, actividad labil o materiales de partida escasos. Como prueba de principio, los investigadores usaron esta estrategia para identificar la protelna E330016A19 de raton como la enzima que sintetiza GAMPc. Este descubrimiento condujo a la identificacion de una gran familia de GASc que se conserva de peces a humanos, lo que demuestra formalmente que los animales vertebrados contienen enzimas evolutivamente conservadas que sintetizan dinucleotidos clclicos, que se encontraban previamente solo en bacterias, arqueas y protozoos (11-13). Vibrio cholera puede sintetizar GAMPc a traves de su ciclasa DncV (VC0179), que contiene un dominio de NTasa, pero carece de una homologla de secuencia primaria significativa con el GASc de mamlfero (12).
Los resultados de los investigadores no solo demuestran que el GASc es un sensor de ADN citosolico que desencadena la via del interferon tipo I, sino que tambien revela un novedoso mecanismo de senalizacion inmunitaria en el que el GASc genera el segundo mensajero GAMPc, que se une y activa STING (4), desencadenando as! la produccion de interferon tipo I. El despliegue de GASc como un sensor de ADN citosolico amplla enormemente el repertorio de microorganismos detectados por el sistema inmunitario del huesped. En principio, todos los microorganismos que pueden transportar ADN al citoplasma del huesped, como virus ADN, bacterias, parasitos (p. ej., malaria) y retrovirus (p. ej., VIH), podrlan desencadenar la via GASc-STING (14, 15). La slntesis enzimatica de GAMPc por GASc proporciona un mecanismo de amplificacion de senal para una respuesta inmunologica robusta y sensible. Sin embargo, la deteccion de ADN propio en el citoplasma del huesped por GASc tambien puede conducir a enfermedades autoinmunologicas, como el lupus eritematoso sistemico, el slndrome de Sjogren y el slndrome de Aicardi-Goutieres (16-18).
Se ha indicado que varios sensores mas de ADN, como DAI, IFI16 y DDX41, inducen interferones de tipo I (19-21). La sobreexpresion de DAI, IFI16 o DDX41 no condujo a la produccion de GAMPc. Los investigadores tambien encontraron que la calda de DDX41 y p204 (un homologo de raton de IFI16) por ARNip no inhibla la generacion de actividad de GAMPc en celulas L929 transfectadas con ADN-TA. A diferencia de otros sensores de ADN supuestos y la mayorla de los receptores de reconocimiento de patrones (p. ej., TLR), GASc es una ciclasa que es responsable de la inhibition por compuestos de moleculas pequenas, que proporcionan agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunologicas humanas.
Referencias y notas
1. LA O'Neill, el ADN hace que el ARN produzca inmunidad innata. Cell 138, 428 (7 de agosto de 2009).
2. GN Barber, vlas inmunitarias innatas del ADN citoplasmico. Immunological reviews 243, 99 (septiembre de 2011).
3. SE Keating, M. Baran, AG Bowie, Sensores de ADN citosolico que regulan la induction de interferon tipo I. Trends in immunology 32, 574 (diciembre de 2011 ).
4. J. Wu y col., GMP-AMP clclico es un segundo mensajero endogeno en la senalizacion inmunologica innata por ADN citosolico. Science, (2012).
5. J. Cox, M. Mann, MaxQuant permite altas velocidades de identificacion de peptidos, precisiones de masa de intervalo ppb individualizado y cuantificacion proteica de protelnas de amplio proteoma. Nat Biotecnol (26) 1367 (diciembre de 2008).
6. K. Kuchta, L. Knizewski, LS Wyrwicz, L. Rychlewski, K. Ginalski, Clasificacion global de las protelnas plegadas de nucleotidiltransferasa: identificacion de familias novedosas y sus representantes en seres humanos. Nucleic Acids Res 37, 7701 (diciembre de 2009 ).
7. KL Chow, DH Hall, SW Emmons, El gen mab-21 de Caenorhabditis eleganscodifica una novedosa protelna requerida para la election de destinos celulares alternativos. Development 121, 3615 (noviembre de 1995).
8. J. Pei, BH Kim, NV Grishin, PROMALS3D: una herramienta para multiples secuencias de protelnas y alineamientos de estructura. Nucleic Acids Res 36, 2295 (abril de 2008).
9. JW Schoggins y col., Una gama diversa de productos genicos son efectores de la respuesta antiviral de interferon tipo I. Nature 472, 481 (28 de abril de 2011).
10. YH Chiu, JB Macmillan, ZJ Chen, La ARN polimerasa III detecta ADN citosolico e induce interferones tipo I a traves de la via RIG-I. Cell 138, 576 (7 de agosto de 2009).
11. C. Pesavento, R. Hengge, Segundos mensajeros a base de en nucleotidos bacterianos. Curr Opin Microbiol
12. 170 (abril de 2009).
12. BW Davies, RW Bogard, TS Young, JJ Mekalanos, La regulation coordinada de los elementos geneticos accesorios produce di nucleotidos clclicos para la virulencia de V.cholerae. Cell 149, 358 (13 de abril de 2012).
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13. ZH Chen, P. Schaap, El mensajero procariota di-GMPc desencadena la diferenciacion de celulas de tallo en Dictyostelium. Nature 488, 680 (30 de agosto de 2012).
14. S. Sharma y col., Reconocimiento inmunologico innato de un motivo de ADN de bucle de tallo rico en AT en el genoma de Plasmodium falciparum. Immunity 35, 194 (26 de agosto de 2011).
15. N. Yan, ZJ Chen, Inmunidad antiviral intrlnseca. Nat Immunol 13, 214 (2012).
16. V. Pascual, L. Farkas, J. Banchereau, Lupus eritematoso sistemico: todos los caminos conducen a interferones tipo I. Current opinion in immunology 18, 676 (diciembre de 2006).
17. Y. Yao, Z. Liu, B. Jallal, N. Shen, L. Ronnblom, Interferones Tipo I en el Slndrome de Sjogren. Autoimmunity reviews, (29 de noviembre de 2012).
18. RE Rigby, A. Leitch, AP Jackson, Enfermedades inflamatorias mediadas por acidos nucleicos. Bioessays 30, 833 (septiembre de 2008).
19. A. Takaoka y col., DAI (DLM-1 / ZBP1) es un sensor de ADN citosolico y un activador de la respuesta inmunologica innata. Nature 448, 501 (26 de julio de 2007).
20. L. Unterholzner y col., IFI16 es un sensor inmunologico innato para el ADN intracelular. Nature immunology 11, 997 (noviembre de 2010).
21. Z. Zhang y col., La helicasa DDX41 detecta el ADN intracelular mediado por el adaptador STING en celulas dendrlticas. Nature immunology 12, 959 (octubre de 2011).
22. Los numeros de acceso de GenBank para secuencias GASc humanas y de raton son KC294566 y KC294567.
Ejemplo 3. GMP-AMP cfclico que contiene enlaces mixtos de fosfodiester es un ligando endogeno de afinidad alta para STING
La detection inmunologica innata de infecciones microbianas esta mediada por receptores de reconocimiento de patrones codificados en llnea germinal que incluyen protelnas de membrana tales como receptores de tipo Toll (TLR) y protelnas citosolicas tales como receptores tipo NOD (NLR) y receptores tipo RIG-I (RLR) ( Iwasaki y Medzhitov, 2010; Ronald y Beutler, 2010; Takeuchi y Akira, 2010). Como practicamente todos los microorganismos infecciosos contienen y necesitan acidos nucleicos en sus ciclos de vida, el sistema inmunitario innato ha evolucionado para reconocer el ADN y el ARN microbianos como una estrategia central de defensa del huesped. Especlficamente, varios TLR estan localizados en la membrana endosomal para detectar ARN o ADN en el lumen de los endosomas, mientras que los RLR son responsables de detectar el ARN viral y bacteriano en el citoplasma.
Se sabe que el ADN es una molecula inmunoestimuladora durante mas de un siglo, pero hasta hace poco no se habla investigado exhaustivamente como el ADN activa el sistema inmunitario del huesped (O'Neill, 2013). El ADN en el endosoma es detectado por TLR9, que luego desencadena la production de interferones de tipo I y citoquinas inflamatorias. Cuando el ADN microbiano o del huesped se entrega al citoplasma, tambien puede inducir interferones de tipo I a traves de la protelna de membrana STING del retlculo endoplasmico (tambien conocida como MITA, ERIS o MPYS) (Barber, 2011). STING funciona como una protelna adaptadora que recluta y activa las protelnas quinasas IKK y TBK1, que a su vez activan los factores de transcription NF-kB e IRF3 para inducir interferones y otras citoquinas.
Recientemente los investigadores identificaron la GMP-AMP sintasa clclica (GASs) como un sensor de ADN que activa STING (Sun y col., 2013; Wu y col., 2013). Especlficamente, los investigadores encontraron que el GASs cataliza la slntesis de GMP-AMP cfclico (GAMPc) a partir de ATP y GTP en presencia de ADN. GAMPc luego funciona como un segundo mensajero que se une y activa STING. Si bien estos estudios demuestran claramente que GAMPc es un segundo mensajero endogeno producido por GASc en celulas de mamlferos, la naturaleza exacta de los enlaces fosfodiester internos entre GMP y AMP en GAMPc no se determino en parte porque la espectrometrla de masas sola no podia distinguir inequivocamente estos enlaces sin la disponibilidad de todos los isomeros de GAMPc como referencia convencional. Aunque el GAMPc quimicamente sintetizado que contiene enlaces 3'-5' homogeneos es capaz de inducir IFNp, sigue siendo posible que GAMPc que contiene otros enlaces fosfodiester tambien pueda activar la via de STING.
En este estudio, los investigadores investigaron aun mas la estructura de GAMPc a traves de una combination de tecnicas quimicas y biofisicas. Los investigadores encontraron que GAMPc producido por GASc contiene un enlace fosfodiester entre 2'-OH de GMP y 5'-fosfato de AMP y otro entre 3'-OH de AMP y 5'-fosfato de GMP. Ademas, los investigadores demostraron que esta molecula, denominada en el presente documento 2'3'-GAMPc, se produjo en celulas de mamifero en respuesta a ADN en el citoplasma. Ademas, los investigadores demostraron que 2'3'-GAMPc se une a STING con una alta afinidad y es un potente inductor de interferon-p (IFNp). Los investigadores tambien resolvieron la estructura cristalina de STING unido al producto GASc y observaron interacciones extensas entre 2'3'- GAMPc y STING, que proporcionan la base estructural para su union especifica y de alta afinidad. Curiosamente, la estructura del complejo STING-GAMPc revelo que este ligando natural induce reordenamientos conformacionales en STING subyacentes a su activation.
El producto de GASc es GMP-AMP cfclico que contiene enlaces fosfodiester mezclados
Se sabe que los enlaces 2'-5' y 3'-5' fosfodiester entre los nucleotidos existen en la naturaleza, mientras que el
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enlace 2'-5' es menos comun. Los enlaces fosfodiester interno del GAMPc natural producido por GASc aun no se han determinado. Por lo tanto, los investigadores sintetizaron qulmicamente moleculas de GAMPc que contienen los cuatro posibles enlaces fosfodiester (Tabla S1). La slntesis qulmica de las isoformas de GAMPc se realizo usando procedimientos modificados a partir de los metodos publicados (Gaffney y col., ej., 2010; Zhang y col., 2006). Por simplicidad, denominaron a estas moleculas de GAMPc de acuerdo con la posicion OH de gMp seguida de la posicion OH de AMP que forman los enlaces fosfodiester; por ejemplo, 2'3'-GAMPc contiene un enlace fosfodiester entre 2'-OH de GMP y 5'-fosfato de AMP y otro entre 3'-OH de AMP y 5'-fosfato de GMP. Tambien usaron la protelna GASc purificada para sintetizar enzimaticamente el GAMPc natural a partir de ATP y GTP en presencia de ADN (Sun y col., 2013). El producto de GAPc purificado y los isomeros de GAMPc sinteticos se analizaron por espectroscopla de resonancia magnetica nuclear (NMR). Sorprendentemente, el espectro de NMR 1H del producto GASc fue identico al del 2'3'-GAMPc sintetico, pero distinto de los de otros isomeros de GAMPc. En particular, el proton anomerico (H1') era un singlete con un 3'-fosfato y un doblete con 2'-fosfato. Sistematicamente, solo los fosfatos de 2',3'-GAMPc tenlan los mismos cambios qulmicos de RMN 31P que los de GAMPc natural. Los investigadores tambien realizaron analisis de espectrometrla de masas del GAMPc natural y sintetico usando Q- Exact, un instrumento con alta resolucion y precision de masa. La masa total de cada una de estas moleculas cargadas individualmente ([M+H]+) fue de 675,107, que coincidla exactamente con la masa teorica de GAMPc. Los espectros de masa en tandem (MS/MS) del producto GASc, que se fragmento usando una disociacion por colision de energla mas alta (HCD), fueron identicos a los del 2'3'-GAMPc sintetico, y similares pero no identicos a los de 2'2'-GAMPc y 3'3'-gAmPc. Los espectros de MS/MS de 3'2'-GAMPc pareclan ser mas distintos de los de 2'3'- GAMPc y el producto GASc. El analisis de HPLC de fase inversa mostro que GAMPc natural eluyo conjuntamente con 2'3'-GAMPc, pero no con otras moleculas de GAMPc. Los investigadores tambien determinaron la configuracion del producto GASc por dicrolsmo circular (CD), lo que confirma que procede de D-ribosa. El espectro CD del GAMPc natural se superpone bien con el de 2'3'-GAMPc. Los espectros de CD cerca de UV indican que los cuatro GAMPc adoptan conformaciones significativamente diferentes, con 2'3 'y 2'2'-GAMPc formando un patron de banda de CD distinto de los de 3'2'- y 3'3'-GAMPc. En conjunto, estos resultados proporcionan la prueba definitiva de que GASc sintetiza 2'3'-GAMPc in vitro.
El GAMPc endogeno producido en celulas transfectadas con ADN contiene enlaces fosfodiester mezclados
Para probar si las celulas de mamlferos podlan producir GAMPc endogeno que contiene los enlaces fosfodiester mezclados, los investigadores transfectaron la llnea celular de raton L929 y monocitos humanos THP1 con ADN de testlculo de arenque (ADN-TA), luego los lisados celulares se calentaron a 95 °C para desnaturalizar protelnas y los sobrenadantes se prepararon para el analisis de GAMPc endogeno por espectrometrla de masas (Wu y col., 2013). Los espectros MS/MS de la molecula endogena de ambas llneas celulares fueron identicos a los del producto GASc y 2'3'-GAMPc, lo que indica que el segundo mensajero endogeno es 2'3'-GAMPc.
2'3'GAMPc es un ligando de alta afinidad para STING
Los investigadores realizaron experimentos de calorimetrla de titulacion isotermica para medir la afinidad (Kd) de la union de STING a GAMPc sintetico. Un dominio C terminal (CTD) que abarca los restos 139-379 de STING humano, que se mostro previamente que actua como mediador en la union al di-GMP clclico del segundo mensajero bacteriano (Burdette y col., 2011; Huang y col., 2012; Ouyang y col., 2012; Shang y col., 2012; Shu y col., 2012; Yin y col., 2012), se expreso en E. coli y se purifico a homogeneidad aparente para el experimento ITC. Consecuente con informes previos, los investigadores encontraron que di-GMPc se unla a STING con una Kd de 1,21 uM. Curiosamente, el GAMPc natural y el 2'3'-GAMPc sintetico se unieron a STING con una afinidad tan alta que el ajuste de la curva fue diflcil. Ademas, a diferencia de la union de di-GMPc, que es un proceso exotermico, la union de 2'3'-GAMPc natural a STING fue endotermica, lo que sugiere que la energla puede usarse para el cambio conformacional de STING (vease mas adelante). Para obtener la Kd de 2'3'-GAMPc natural y sintetico para STING, los investigadores titularon diferentes cantidades de estos compuestos como competidores en el complejo STING-di- GMPc. Estas mediciones produjeron una Kd de 4,59 nM para el producto GASc y 3,79 nM para 2'3'-GAMPc. El experimento de competicion tambien se realizo para 3'2'-GAMPc, debido a que su union a STING genero poco cambio de calor. Este compuesto se une a STING con una Kd de 1,61 uM. 2'2' y 3'3'-GAMPc se titularon directamente a STING y los valores de Kd que se calcularon fueron de 287 nM y 1,04 uM, respectivamente. Por tanto, la Kd de 2'3'GaMpc fue ~300 veces menor que las de di-GMPc, 3'2'-GaMpc y 3'3'-GaMpc, y ~75 veces menor que la de 2'2'-GAMPc.
Los GAMPc son potente inductores de interferones de tipo I
Los investigadores entregaron diferentes cantidades de los isomeros de GAMPc, as! como di-GMPc en celulas L929 y midieron la induccion de IFNp por RT-PCRc. Las moleculas GAMPc indujeron IFNp con una EC50 que oscilaba entre 15 nM y 42 nM, mientras que di-GMPc tenia una EC50 de mas de 500 nM. Por tanto, parecia que la afinidad de union de diferentes dinucleotidos ciclicos no se correlacionaba bien con su EC50 en los ensayos basados en celulas. La razon de esto no esta clara, pero es posible que diferentes compuestos tengan una estabilidad o distribucion diferente en las celulas. No obstante, estos experimentos proporcionan la prueba directa de que el producto GASc, 2'3'-GAMPc, es un ligando de alta afinidad para STING (Kd: ~4 nM) y un potente inductor de IFNp en celulas (EC50: ~20 nM).
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La estructura cristalina del complejo STING-GAMPc revela reordenamientos conformacionales inducidos por ligando de STING
Los investigadores cristalizaron conjuntamente el dominio STING C-terminal (CTD) (restos 139-379) con el producto GASc purificado en el grupo espacial C2. La estructura del complejo se resolvio mediante reemplazo molecular usando una estructura apo-STING (codigo PDB: 4F9E) como modelo de busqueda y se refino a una resolucion de 1,88 A (Tabla M1). Hay un protomero STING en la unidad asimetrica cristalografica, que forma un dlmero en forma de mariposa con otro protomero que se relaciona mediante la simetrla cristalografica doble. La molecula de GAMPc unida se encuentra en el eje doble (vease los detalles a continuacion). La region ordenada de STING (de Asn152 a Glu336) adopta una estructura gelobal similar a la apo-STING, caracterizada por una lamina p trenzada central rodeada por cuatro helices a. Sin embargo, STING en el complejo con GAMPc muestra varias diferencias sorprendentes de apo-STING tanto en la estructura del monomero como en la disposition del dlmero. En comparacion con el apo-dlmero, los dos protomeros en el dlmero de la estructura compleja experimentan rotaciones sustanciales hacia adentro en relation con el sitio de union a GAMPc. Esta disposicion mas cerrada crea un bolsillo mas profundo entre los dos protomeros para abarcar GAMPc. Ademas, el sitio de union a GAMPc esta cubierto por una tapa de lamina p antiparalela de cuatro cadenas y los bucles de conexion formados por los restos 219-249 de cada uno de los dos protomeros. A diferencia, este segmento en la estructura apo esta en gran parte desordenado (Ouyang y col., 2012; Yin y col., 2012). La formation de la lamina p no se debe a un empaquetamiento cristalografico. Las interacciones entre dominios dentro de la tapa involucran varios pares de contactos polares, entre el grupo lateral de Tyr245 y el atomo de oxlgeno del carbonilo de la cadena principal de Gly234, el grupo lateral de Ser243 y el atomo de nitrogeno de la amida de la cadena principal de Lys236, as! como los grupos laterales de Asp237 y Lys224.
Las interacciones extensas entre 2'3'-GAMPc y STING subyacen en su union especffica y de alta afinidad
Dado que el eje doble cristalografico pasa a traves de la molecula asimetrica 2'3'-GAMPc, GAMPc debe adoptar dos orientaciones relacionadas por la simetrla doble. Esto es consecuente con el hecho de que se espera que los dos protomeros en el dlmero STING tengan las mismas probabilidades de interactuar con la guanidina o el resto adenosina. Por lo tanto los investigadores asignaron dos conformaciones alternativas con la ocupacion de 0,5 para GAMPc y varios restos de aminoacidos circundantes. El mapa omit de recocido simulado de la estructura refinada muestra una densidad decente para GAMPc. 2'3'-GAMPc, pero no otras isoformas, y se ajusta bien al mapa de densidad electronica. En comparacion con di-GMPc unido a STING, GAMPc se encuentra ~2,5 A mas profundo en la grieta entre la interfaz dlmerica STING. Ademas, las dos alas de la mariposa estan ~20 A mas cerca la una de la otra en el STING: estructura GAMPc debido a la disposicion mas cerrada de los dos protomeros STING. Los analisis adicionales del bolsillo de union a GAMPc muestran que GAMPc esta bien coordinado por interacciones extensas polares e hidrofobicas. Los anillos de grupos de base de purina GAMPc se apilan contra cuatro restos aromaticos de alrededor, Tyr 240 y Tyr167 de cada uno de los dos protomeros. De forma destacable, los dos grupos a-fosfato de GAMPc ponen en contacto Arg238 de los dos protomeros y Arg232 de un protomero. El 3'-OH libre de GMP apunta a dos restos de Ser162 de la parte inferior del bolsillo. La base de guanina interactua directamente con los grupos laterales de Glu260 y Thr263, as! como tambien con el oxlgeno del carbonilo de la cadena principal de Va1239. Estos contactos polares particulares explican por que 2'3'-GAMPc es un ligando especlfico y de alta afinidad para STING. Ademas, es probable que los restos de la lamina p (Arg232, Arg238, Va1239)m que estan involucrados en la union a GAMPc, controlen la formacion de la tapa y la activaciona dicional de STING.
La arginina 232 de STING es importante para la via de senalizacion de ADN citosolico
Tres informes previos de las estructuras cristalinas de STING unidas a di-GMP clclico usaron una variante humana rara que sustituye Arg232 por una histidina (Ouyang y col., 2012; Shu y col., 2012; Yin y col., 2012). La secuenciacion extensa de aDn de poblaciones humanas ha demostrado que el alelo Arg232 es prevalente y, por tanto, debe considerarse STING de tipo salvaje (Jin y col., 2011). El uso de la variante H232 de STING puede explicar por que di-GMPc no indujo un cambio conformacional significativo de STING en estos estudios (Ouyang y col., 2012; Shu y col., 2012; Yin y col., 2012). Un informe anterior mostro que una mutation de Arg231 de STING de raton (equivalente a Arg232 en STING humano) a alanina suprimio la induction de IFNp por di-GMP clclica, pero no del ADN (Burdette y col., 2011). Sin embargo, basandose en la estructura cristalina del complejo STING-GAMPc de los investigadores, se espera que una mutacion de Arg232 a histidina debilite significativamente la union de GAMPc y la senalizacion aguas abajo por STING, y una mutacion de Arg232 a alanina deberla ser aun mas perjudicial. Por lo tanto, los investigadores investigaron la funcion de Arg232 de STING en dos grupos de experimentos. En primer lugar, los investigadores destruyeron STING endogeno por RNAi en celulas L929 y lo reemplazaron por WT, R232A o R232H de STING humano. Estas llneas celulares estables se transfectaron con ADN-TA o se trataron con 2'3'- GAMPc, seguido de la medicion de IFNp por RT-PCRc. Las celulas que expresaban STING WT fueron capaces de inducir IFNp en respuesta a la estimulacion de ADN o GAMPc, mientras que las que expresaban R232A o R232H eran defectuosas. Como control, el analogo de ARN bicatenario poli[I:C] estimulo la expresion de IFNp en todas estas llneas celulares. En segundo lugar, los investigadores expresaron de forma estable STING WT o mutante en celulas HEK293T, que tienen expresion indetectable de STING endogeno y GASc (Sun y col., 2013). Las celulas se transfectaron luego con el plasmido de expresion de GASc humano seguido de medicion de ARN de IFNp. STING WT, pero no el mutante R232A, pudo soportar la induccion de IFNp por GASc. El mutante R232H fue parcialmente
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defectuoso, posiblemente porque la histidina cargada positivamente puede sustituir debilmente algunas de las funciones de Arg232. MAVS, una proteina adaptadora esencial de la via RIG-I (Seth y col., 2005), feu capaz de inducir IFNp en todas estas lineas celulares. En conjunto, los datos estructurales y funcionales de los investigadores indican fuertemente un papel importante de Arg232 en las funciones de STING y subrayan aun mas el papel del GASc como un sensor de ADN citosolico indispensable.
ANALISIS
Los estudios previos de los investigadores identificaron GASc como un sensor de ADN citosolico y una ciclasa que sintetiza GAMPc usando ATP y GTP como sustratos (Sun y col.,, 2013; Wu y col., 2013). GAMPc luego funciona como un segundo mensajero que se une y activa STING. En este caso los investigadores emplean la sintesis quimica y varios enfoques biofisicos para caracterizar aun mas los enlaces fosfodiester internos del producto GASc y determinaron que es 2'3'-GAMPc. Posteriormente, Gao y col indicaron las estructuras de GASc en sus formas apo-y unidas al ADN, lo que confirmo que el GASc es en efecto una sintasa ciclica-GMP-AMP activada por ADN que cataliza la sintesis de GAMPc a partir de ATP y GTP (Gao y col., 2013). Este elegante estudio tambien dilucido el mecanismo estructural mediante el cual la union al ADN conduce a la activacion de GASc. Usando un enfoque diferente, Gao y col., tambien encontraron que la proteina GASc truncada sintetiza 2'3'-GAMPc in vitro. Sin embargo, no probaron si 2'3'-GAMPc tiene alguna actividad biologica o bioquimica, ni tampoco demostraron si se produce 2'3- GAMPc endogeno en celulas de mamifero. En este informe, los investigadores mostraron que la estimulacion de celulas de raton y humanas con ADN conduce a la produccion de 2'3'-GAMPc endogeno. Ademas, los investigadores demostraron que 2'3'-GAMPc se une a STING con una afinidad mucho mayor que otros isomeros de GAMPc y di-GMPc. Ademas, los investigadores mostraron que 2'3'-GAMPc y otros isomeros de GAMPc son mucho mas potentes que di-GMPc para inducir IFNp en las celulas.
Se obtienen nuevos conocimientos sobre la estructura y la funcion de 2'3'-GAMPc a partir de la estructura cristalina del STING CTD unido a este ligando endogeno. Esta estructura cristalina tiene una resolucion de 1,88A, lo que permite una vista detallada de la estructura del ligando, que incluye los enlaces 2'-5' y 3'-5' fosfodiester. La estructura revela restos especificos en STING que actuan como mediadores de la union de 2'3'-GAMPc. Ademas, una comparacion de esta estructura con las estructuras STING CTD publicadas previamente en su forma apo revela extensos reordenamientos conformacionales inducidos por el ligando natural. Especificamente, los dos brazos del dimero STING en forma de V se mueven mas cerca de aproximadamente 20 A y una nueva lamina de cuatro cadenas p forma una tapa por encima del sitio de union de GAMPc en la estructura de STING unida a ligando. Estas caracteristicas estan ausentes en las estructuras STING: di-GMPc previamente determinadas, que usaban una variante STING que contenia la mutacion R232H. En estas estructuras, la union de di-GMPc no induce ningun reordenamiento conformacional obvio en STING (Ouyang y col., 2012; Shu y col., 2012; Yin y col., 2012). Sin embargo, en otras dos estructuras que contienen el STING WT (Arg232) y di-GMPc, uno muestra cambios conformacionales similares a los observados en el complejo STING-GAMPc (Huang y col., 2012), y el otro muestra un cambio conformacional distinto en el que Arg232 esta orientado de forma diferente (Shang y col., 2012). La conformacion "cerrada" observada por Huang y col., puede haber capturado el estado activo de STING inducido por di-GMPc, que es capaz de activar STING, aunque de forma mas debil que GAMPc.
Las interacciones extensas entre STING y 2'3'-GAMPc proporcionan la base estructural para su union de alta afinidad. En particular, Glu260, Thr263 y Va1239 interactuan con la base de guanina de gMp y Ser162 interactua con el grupo 3'-OH libre de GMP, lo que explica por que GAMPc que contiene un enlace fosfodiester entre 2'-OH de GMP y 5'-fosfato de AMP es un ligando de alta afinidad. Ademas, los dos grupos a-fosfato interactuan con Arg232 de un protomero y Arg238 de ambos protomeros. Este analisis estructural explica que las mutaciones R232A o R232H alteran fuertemente la funcion de STING en respuesta a ADN o GAMPc. Los datos de los investigadores destacan la importancia de usar STING de tipo salvaje (Arg232) en estudios estructurales y funcionales.
Aunque 2'3-GAMPc se une a STING con una afinidad mucho mas alta que los isomeros GAMPc que contienen otros enlaces fosfodiester, los cuatro isomeros GAMPc indujeron IFNp con similares valores de EC50, que eran mucho mas bajos que los de di-GMPc. Por tanto, todas las isoformas de GAMPc son potentes inductores de IFNp.
En resumen, los resultados de los investigadores demuestran que 1) el segundo mensajero endogeno producido en celulas de mamifero en respuesta a la estimulacion del ADN citosolico es 2'3'-GAMPc; 2) 2'3'-GAMPc es un ligando de alta afinidad para STInG; 3) 2'3'-GAMPc es un potente inductor de IFNp en celulas de mamifero; 4) 2'3'-GAMPc induce reordenamientos conformacionales en STING que pueden ser la base de su activacion; y 5) las interacciones extensas entre 2'3'-GAMPc y STING observadas en la estructura cristalina del complejo explican su union especifica y de alta afinidadad.
Los investigadores concluyen: 2'3'-GAMPc es un segundo mensajero endogeno producido por celulas de mamifero; 2'3'-GAMPc es un ligando de alta afinidad para STING; 2'3'-GAMpc es un potente inductor de interferones de tipo I; y la union de 2'3'-GAMPc induce cambios conformacionales de STING.
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NUMERO DE ACCESO
Las coordenadas de la estructura STINGCTD humana unida a 2'3'-GAMPc se han depositado en el banco de datos de protema RCSB (PDB: 4KSY).
REFERENCIAS
GUSSI. en la World Wide Web http: // biophysicsswmededu/MBR/softwarehtml.
Adams, PD, Afonine, PV, Bunkoczi, G., Chen, VB, Davis, IW, Echols, N., Headd, JJ, Hung, LW, Kapral, GJ, Grosse-Kunstleve, RW, y col., (2010). PHENIX: un sistema global basado en Python para la solucion de estructura macromolecular. Acta crystallographica 66, 213-221.
Barber, GN (2011). vias inmunitarias innatas del ADN citoplasmico. Immunological reviews 243, 99-108.
Burdette, DL, Monroe, KM, Sotelo-Troha, K., Iwig, JS, Eckert, B., Hyodo, M., Hayakawa, Y., y Vance, RE (2011). STING es un sensor inmunitario innato directo de di-GMP ciclico. Nature 478, 515-518.
DeLano, WL (2002). El sistema de graficos moleculares PyMOL. en la World Wide Web http: // wwwpymolorg. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG y Cowtan, K. (2010). Caracteristicas y desarrollo de Coot. Acta crystallographica 66, 486-501.
Gaffney, BL, Veliath, E., Zhao, J. y Jones, RA (2010). Sintesis de un matraz de di-GMPc y los analogos de [Rp, Rp] y [Rp, Sp] tiofosfato. Org Lett 12, 3269-3271.
Gao, P., Ascano, M., Wu, Y., Barchet, W., Gaffney, BL, Zillinger, T., Serganov, AA, Liu, Y., Jones, RA, Hartmann, G., y col., (2013). [G(2',5')pA(3',5')p] ciclico es el segundo mensajero metazoico producido por la sintasa GMP- AmP ciclica activada por AdN. Cell.
Houtman, JC, Brown, PH, Bowden, B., Yamaguchi, H., Appella, E., Samelson, LE, y Schuck, P. (2007). Estudio de las interacciones multisitio binarias y ternarias de la proteina mediante el analisis global de los datos de calorimetria de titulacion isotermica en SEDPHAT: aplicacion a los complejos proteicos del adaptador en la senalizacion celular. Protein Sci 16, 30-42.
Huang, YH, Liu, Liu, XY, Du, XX, Jiang, ZF y Su, XD (2012). La base estructural para la deteccion y union de di- GMP ciclico por STING. Naturaleza estructural y biologia molecular 19, 728-730.
Iwasaki, A., y Medzhitov, R. (2010). Regulacion de la inmunidad adaptativa por el sistema inmune innato. Science 327, 291-295.
Jin, L., Xu, LG, Yang, IV, Davidson, EJ, Schwartz, DA, Wurfel, MM y Cambier, JC (2011). Identificacion y caracterizacion de una variante MPYS humana con perdida de funcion. Genes and immunity 12, 263-269.
Keller, S., Vargas, C., Zhao, H., Piszczek, G., Brautigam, CA, y Schuck, P. (2012). Calorimetria de titulacion isotermica de alta precision con analisis automatico en forma de pico. Analytical chemistry 84, 5066-5073.
Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., y Chruszcz, M. (2006). HKL-3000: la integracion de la reduccion de datos y la solucion de la estructura, desde imagenes de difraccion hasta un modelo inicial en minutos. Acta crystallographica 62, 859-866.
O'Neill, LA (2013). Inmunologia. La deteccion del lado oscuro del ADN. Science 339, 763-764.
Ouyang, S., Song, X., Wang, Y., Ru, H., Shaw, N., Jiang, Y., Niu, F., Zhu, Y., Qiu, W., Parvatiyar, K., y col., (2012). El analisis estructural de la proteina adaptadora STING revela una interfaz de dimero hidrofobo y un modo de union di-GMP ciclica. Immunity 36, 1073-1086.
Ronald, PC y Beutler, B. (2010). Sensores vegetales y animales de firmas microbianas conservadas. Science 330, 1061-1064.
Seth, RB, Sun, L., Ea, CK y Chen, ZJ (2005). Identificacion y caracterizacion de MAVS, una proteina de senalizacion antiviral mitocondrial que activa NF-kappaB e IRF 3. Cell 122, 669-682.
Shang, G., Zhu, D., Fi, N., Zhang, J., Zhu, C., Lu, D., Liu, C., Yu, Q., Zhao, Y., Xu, S., y col., (2012). Las estructuras cristalinas de la proteina STING revelan una base para el reconocimiento de di-GMP ciclico. Nature structural & molecular biology 19, 725-727.
Shu, C., Yi, G., Watts, T., Kao, CC y Li, P. (2012). La estructura de STING unido a di-GMP ciclico revela el mecanismo del reconocimiento de dinucleotidos ciclicos por el sistema inmunologico. Nature structural & molecular biology 19, 722-724.
Sun, L., Wu, J., Du, F., Chen, X. y Chen, ZJ (2013). La GMP-AMP sintasa ciclica es un sensor de ADN citosolico que activa la via del interferon de tipo I. Science 339, 786-791.
Takeuchi, O., y Akira, S. (2010). Receptores de reconocimiento de patrones e inflamacion. Cell 140, 805-820.
Wu, J., Sun, L., Chen, X., Du, F., Shi, H., Chen, C. y Chen, Zj (2013). GMP-AMP ciclico es un segundo mensajero endogeno en la senalizacion inmunologica innata por ADN citosolico. Science 339, 826-830.
Yin Q., Tian, Y., Kabaleeswaran, V., Jiang, X., Tu, D., Eck, MJ, Chen, ZJ y Wu, H. (2012). Deteccion di-GMP ciclica a traves de la proteina de senalizacion inmunologica innata STING. Molecular cell 46, 735-745.
Zhang, Z., Kim, S., Gaffney, BL y Jones, RA (2006). Polimorfismo de la molecula de senalizacion di-GMPc J Am Chem Soc 128, 7015-7024.
Tabla M1. Estadlsticas de recopilacion de datos y refinamiento de GAMPc unido a STING
Datos
Grupo espacial Celda unidad (A,°)
Numero de moleculas en ASU Longitud de onda (A)
Resolucion (A)
Rfusion (%)
I/O
Completitud (%)
Numero de reflexiones medidas Numero de reflexiones particulares
Redundancia Factor B de Wilson (A2)
Factor R (%)
Rlibre (%)
Numero de atomos
Macromoleculas
Ligando
Agua
Todos los atomos Valor B medio (A2)
Macromoleculas
Ligando
disolvente
Todos los atomos
Desviaciones de Rms de los valores
ideales
Enlaces (A)
Angulo (°)
Estadlsticas del diagrama de Ramachandran (%)
Favorecido
Permitido
Valores atlpicos
GAMPc unido a STING
C2
89,525 77,927 35,974 90 96,98 90 1
0,97918
50-1,88 (1,91-1,88)
7,8 (65,0)
17,82 (2,20)
99,4 (98,6)
99.635
19.800
5.0 (4,8)
30,80
16,07 (23,09)
18,15 (30,83)
1483
45
72
1600
46,20
23,10
50.00 45,70
0,007
1,213
97,22
2,78
0
Los valores entre parentesis son para pantalla de alta definicion. R=I|F0te-Fca/c|/£Fobs, en la que Fcalc es el factor de 5 estructura de protelna calculado a partir del modelo atomico (Rlibre se calculo con el 10 % de las reflexiones seleccionadas).
imagen1
Tabla S1. Slntesis qufmica de los GAMPc. (A) Estructura de los bloques de construccion S1-S4. (B) Slntesis del bloque de construccion S1. (C) Slntesis del bloque de construccion S3. (C) Slntesis de 2'3'-GAMPc. (E) Slntesis de 5 2'2'-GAMPc. (F) Slntesis de 3'2'-GAMPc. (G) Slntesis de 3'3'-GAMPc.
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Ejemplo 4. La GMP-AMP sintetasa cfclica es un sensor inmunologico innato del VIH y otros retrovirus
Los retrovirus, incluido el VIH, pueden activar respuestas inmunologicas innatas, pero los sensores del huesped para los retrovirus son en gran parte desconocidos. En este caso los investigadores muestran que la infeccion por VIH activa la sintasa GMP-AMP cfclica (GAMPc) (GASc) para producir GAMPc, que se une y activa la protelna adaptadora STING para inducir interferones tipo I y otras citoquinas. Los inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH, pero no de la integrasa, anularon la induccion de interferon-p por el virus, lo que indica que el ADN del VIH transcrito de forma inversa desencadena la respuesta inmunologica innata. La desactivacion o calda de GASc en llneas celulares de raton o humanas bloquearon la induccion de citoquina por VIH, el virus de la leucemia murina (MLV) y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV). Estos resultados indican que el GASc detecta el ADN retroviral y que el GASc es un sensor inmunologico innato del VIH y otros retrovirus.
Aunque se han logrado avances enormes en la comprension del reconocimiento inmunologico innato de muchos patogenos microbianos (1-3), se sabe relativamente poco sobre las respuestas inmunologicas innatas contra las infecciones retrovirales (4). Se pensaba que los retrovirus desencadenaban respuesta inmunologicas innatas debiles o inexistentes. que normalmente se median a traves de la produccion de citocinas inflamatorias e interferones de tipo I. Sin embargo, las investigaciones recientes han demostrado que los retrovirus como el VIH pueden desencadenar respuestas inmunologicas innatas, que normalmente estan enmascaradas por factores virales o del huesped (5-8). Por ejemplo, TREX1 es una exonucleasa citosolica que degrada el ADN procedente del VIH o retroelementos endogenos, evitando as! la acumulacion de ADN citosolico que de otro modo desencadenarla la inmunidad innata (9, 10). La perdida de mutaciones funcionales de TREX1 en seres humanos se ha relacionado estrechamente con el slndrome de Aicardi Goutieres (SAG), una enfermedad similar al lupus caracterizada por la expresion elevada de citoquinas inflamatorias y genes estimulados por interferon (11).
Recientemente los investigadores han identificado la enzima GMP-AMP cfclica (GAMPc) sintasa (GASc) como un sensor de ADN citosolico que desencadena la produccion de interferones tipo I y otras citocinas (12, 13). El ADN se une y activa el GASc, que cataliza la slntesis de un isomero particular de GAMPc de ATP y GTP. Este isomero de GAMPc, denominado 2'3'-GAMPc, que contiene enlaces fosfodiester 2'-5 'y 3'-5', funciona como un segundo mensajero que se une y activa la protelna STING del retlculo endoplasmico (14-17). STING luego activa las protelnas quinasas IKK y TBK1, que a su vez activan los factores de transcripcion NF-kB e IRF3 para inducir interferones y otras citoquinas (18). La calda de GASc inhibe la induccion de IFNp por virus de ADN tales como el virus de herpes simple-1 (VHS-1) y virus vaccinia (13). Debido a que los retrovirus generan ADN complementario a partir del aRn viral mediante transcripcion inversa, los investigadores hipotetizaron que el GASc podrla detectar el ADN retroviral y desencadenar respuestas inmunologicas innatas.
Los investigadores usaron un virus VIH-1 de una sola ronda en el cual su protelna de envoltura fue reemplazada por la glicoprotelna del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G), lo que le permite infectar una gran diversidad de tipos de celulas humanas y de raton (9). Este virus tambien expresa GfP, que se puede usar para controlar la infeccion viral. La infeccion de la llnea celular monocltica humana THP1 con VIH-GFP condujo a la dimerizacion de IRF3, una evidencia de su activacion. La fosforilacion de STAT1 en Tyr-701 tambien se detecto despues de la infeccion por VIH, lo que indica que la via de senalizacion del interferon se activo en las celulas infectadas por el virus (19). La infeccion por VIH condujo a la induccion de IFNp y la quimiocina CXCL10, conjunta con la generacion del ADN episomal de VIH Gag. Los niveles de produccion de IFNp fueron proporcionales a la multiplicidad de infeccion por VIH. El tratamiento del virus VIH-GFP con DNasa I no altero su capacidad de inducir IFNp, mientras que el tratamiento del ADN de testlculo de arenque (ADN-TA) con DNasa I inhibio la induccion de IFNp, lo que indica que la induccion de IFNp por VIH-GFP no se debio a ningun ADN contaminante. La diferenciacion de THP1 de monocitos a macrofagos mediante el tratamiento de celulas con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inhibio la infeccion o replicacion de VIH-GFP e inhibio fuertemente la induccion de IFNp. Por tanto, a menos que se indique lo contrario, las celulas THP1 usadas en el estudio de los investigadores no fueron tratadas con PMA antes de la infeccion por VIH.
Para probar si se requiere la transcripcion inversa para que el VIH active la respuesta inmunologica innata, los investigadores trataron las celulas THP1 con los inhibidores de la transcriptasa inversa del VIH, la azidotimidina (AZT) y la nevirapina (NVP). Ambos inhibidores bloquearon la activacion de IRF3 y la induccion de IFNp por VIH. A diferencia, el inhibidor de la integrasa del VIH raltegravir (RAL) no afecto la activacion de esta via. aZt y NVP, incluso en altas concentraciones, no inhibieron la induccion de IFNp por ADN TA, lo que indica que los efectos inhibidores de AZT y NVP se debieron a su inhibicion especlfica de la transcripcion inversa de VIH. Estos resultados indican que el ADN del VIH transcrito inverso es el desencadenante de la activacion de IRF3 y la produccion de IFNp.
Sorprendentemente, la calda mediada por ARNhc de GASc o STING en celulas THP1 inhibio fuertemente la induccion de IFNp y CXCL10 y la activacion de IRF3 por VIH-GFP. Los experimentos de control mostraron que el ARNhc contra la luciferasa no inhibla la activacion de la via, y que los vectores ARNhc destrulan especlficamente a los objetivos pretendidos. En particular, el ARNhc GASs destruyo GASc pero no STING, y la induccion de IFNp en estas celulas se rescato entregando GAMPc en las celulas, lo que indica que el ARNhc GASc no tenia efectos fuera de objetivo en la via STING.
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Los estudios previos han demostrado que VSV-G pseudotipado VIH-1 induce fuertemente IFNp en fibroblastos embrionarios de raton deficientes en TREX1 (MEF), pero no en el tipo salvaje (WT) FER (9). Los investigadores generaron lineas celulares TrexlMEF que expresan de forma estable ARNhc contra GASc, STING o luciferasa (como control). La infeccion por VIH indujo ARN de IFNp y CXCL10 en las celulas de control (luciferasahc) pero no en celulas agotadas con GASc o STING. A diferencia, la caldade GASc o STING no afecto la induccion de IFNp o CXCL10 por el analogo de ARN bicatenario poli[I:C].
Para obtener la prueba definitiva del papel de GASc en la deteccion innata de ADN citosolico y retrovirus, los investigadores emplearon la tecnologla tAlEN para alterar el gen que codifica GASc (Mb21d1), especlficamente la region que codifica el dominio catalltico, en celulas L929 (20). Aunque las celulas L929 contienen tres copias del cromosoma 9 que alberga el gen GASc, la secuenciacion del ADN de las celulas que expresan TALEN identifico multiples clones que tenlan deleciones en los tres cromosomas; tres de estos clones fueron elegidos para estudios posteriores. Los tres clones contenlan deleciones en el locus GASc que generaron mutaciones de cambio de marco (21).
Las tres lineas celulares mutantes de GASc no pudieron activar IRF3 en respuesta a la transfeccion de ADN-TA o la infeccion por virus de herpes simple (HSV-1: un virus de ADN bicatenario). Como controles, estas celulas activaron IRF3 normalmente en respuesta a la transfeccion con poli[I:C] o la infeccion con el virus Sendai, un virus ARN. Las celulas mutantes de GASc tambien eran defectuosas para inducir CXCL10 en respuesta a ADN-TA, pero este defecto se rescato transfectando las celulas con el plasmido de expresion de GASc de raton.
Los investigadores eligieron el clon mutante GASc n.° 18 y las celulas parentales L929 para investigar el papel de GASc en el reconocimiento inmunologico innato de la infeccion por VIH. En celulas L929 que expresan de forma estable un ARNhc contra TREX1, pero no la luciferasa de control, la infeccion por VIH-GFP indujo la dimerizacion de IRF3 y la production de IFNp y CXCL10. A diferencia, las celulas mutantes de L929 GASc no pudieron establecer ninguna respuesta inmunologica detectable a la infeccion por VIH, incluso cuando TREX1 se agoto, lo que demuestra el papel esencial de GASc en las respuestas inmunologicas contra el VIH. El agotamiento de GASc no afecto la induccion de IFNp o CXCL10 por el virus Sendai.
Los investigadores han demostrado previamente que las celulas HEK293T no expresan niveles detectables de GASc y STING y por tanto no pueden activar IRF3 en respuesta a la transfeccion del ADN o la infeccion por el virus de ADN (13). Consecuente con un papel importante de GASc y STING en la deteccion de retrovirus, la infeccion por VIH-GFP activo IRF3 y STAT1 en celulas THP1 pero no en HEK293T. A diferencia, el virus Sendai activo IRF3 y STAT1 en ambas lineas celulares. Para determinar si la infeccion por VIH conduce a la produccion de GAMPc endogeno en celulas humanas, los investigadores prepararon lisados de celulas infectadas con VIH THP1 y HEK293T, calentaron los lisados a 95 °C para desnaturalizar la mayorla de las protelnas, que se eliminaron por centrifugation (12). El sobrenadante que potencialmente contenla GAMPc se entrego a celulas THP1 que se hablan permeabilizado con la toxina bacteriana perfringolisina-O (PFO), y luego se ensayo la dimerizacion de IRF3 mediante electroforesis nativa en gel. El sobrenadante resistente al calor de THP1 infectado con VIH, pero no de celulas HEK293T, contenla la actividad de GAMPc que estimulaba la activation de IRF3 en las celulas receptoras. Ademas, la inhibition de la transcription inversa del VIH por AZT, DDI (didanosina) o NVP bloqueo la generation de la actividad de GAMPc, mientras que el inhibidor de la integrasa del VIH RAL no tuvo efecto. La infeccion por VIH- GFP en celulas L929Trex1hc tambien condujo a la generacion de la actividad de GAMPc, que dependla de GASc. En conjunto, estos resultados indican que la infeccion por VIH induce la produccion de GAMPc endogeno de una forma que depende de GASc y la trascripcion inversa de ARN de VIH a ADNc.
Para probar si la infeccion por VIH produce ADNc retroviral en el citoplasma para activar GASc, los investigadores infectaron celulas HEK293T con VIH-GFP y prepararon extractos citosolicos que luego se incubaron con protelna GASc purificada en presencia de ATP y gTp. Los extractos citosolicos de celulas infectadas con VIH, pero no de celulas no infectadas, fueron capaces de estimular GASc para producir la actividad GAMPc que activaba IRF3 en celulas THP1 permeabilizadas. El tratamiento de las celulas HEK293T con AZT inhibio la generacion de la actividad estimulante de GASc. Los analisis adicionales mostraron que el citoplasma de las celulas infectadas con VIH contenla el ADN Gag del VIH y la protelna GFP, ambos inhibidos por el AZT.
La medicion cuantitativa de la abundancia de GAMPc por espectrometrla de masas usando monitorizacion de reaction selectiva (SRM) proporciono la prueba directa de que GAMP se produjo en celulas THP1 infectadas con VIH pero no tratadas de manera simulada. La espectrometrla de masas en tandem del GAMPc endogeno de celulas THP1 infectadas con VIH revelo que era identico al producto GASc, 2'3'-GAMPc (15).
Para probar si la infeccion por VIH en celulas inmunologicas humanas primarias conduce a la produccion de GAMPc, los investigadores infectaron macrofagos procedentes de monocitos (MDM) y celulas dendrlticas procedentes de monocitos (MDDC) con el aislado VIH-1 cllnico VIH-BaL y VIH-GFP, respectivamente. Las investigaciones previas han demostrado que los macrofagos humanos y las celulas dendrlticas expresan SAMHD1, una nucleasa que hidroliza el NTPd, inhibiendo as! la transcripcion inversa del VIH. El VIH-2 y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) contienen la protelna Vpx, que se dirige a SAMHD1 para la degradation proteasomal mediada por ubiquitina, eliminando por tanto este factor de restriction del huesped. Para facilitar las infecciones por VIH en MDM y MDDC
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humanos, los investigadores entregaron VIS Vpx en estas celulas usando una partlcuia tipo virus (VLP) antes de la infeccion por VIH. En presencia de Vpx, la infeccion de MDM y MDDC con VIH-BaL y VIH-GFP, respectivamente, condujo a la generacion de actividad GAMPc. El analisis de espectrometrla de masas cuantitativa confirmo ademas la produccion de 2'3'-GAMPc en MDDC infectados por VIH que expresaban Vpx. La actividad de GAMPc se observo sistematicamente en MDDC y MDM de donantes humanos adicionales, y esta actividad fue mayor en las celulas infectadas con VIH que las tratadas con Vpx solo. Estos resultados demuestran que la infeccion por VIH en macrofagos humanos y celulas dendrlticas conduce a la generacion de GAMPc en condiciones que son permisivas para la replication viral.
Finalmente, los investigadores probaron si se requiere GASc para las respuestas inmunologicas innatas contra otros retrovirus infectando las llneas celulares L929 y L929-GASc KO con el virus de la leucemia murina (MLV) y SIV. Analogo al VIH, MLV y SIV indujeron ARN de IFNp y CXCL10 en celulas L929 agotadas de TREX1 endogeno, pero dicha induction fue completamente suprimida en las celulas GASc KO. En apoyo adicional de un papel esencial de la via GASc-STING en la detection inmunologica innata de retrovirus, la calda de GASc o STING en celulas Trexl~/~ MEF inhibio fuertemente la induccion de IFNp por VLM y VIS.
En el presente documento los investigadores demostraron que GASc es esencial para la respuesta inmunologica innata contra VIH, SIV y MLV, lo que indica que GASc es un sensor inmunologico innato general del ADN retroviral. Aunque el VIH infecta principalmente las celulas T CD4 humanas, tambien puede entrar en los macrofagos y las celulas dendrlticas, normalmente sin desencadenar una respuesta inmunologica innata manifiesta al ocultar los acidos nucleicos virales dentro de la capside y al limitar la acumulacion de ADN viral mediante la cooptation de factores del huesped tales como TREX1 y SAMHDI(S). Se cree que la ausencia de una respuesta inmunologica innata rigurosa al VIH en las celulas dendrlticas es un factor importante que dificulta las respuestas productivas de las celulas T y el desarrollo de vacunas (7). El descubrimiento de los investigadores de que el VIH y otros retrovirus pueden inducir la produccion de GAMPc a traves de GASc en condiciones permisivas indica que el GAMcP puede usarse para evitar el bloqueo de las respuestas inmunologicas innatas contra el VIH. Como tal, GAMPc proporciona un adyuvante de vacuna util para el VIH y otros patogenos que son expertos en subvertir el sistema inmunologico innato del huesped.
Referencias y notas
1. A. Iwasaki, R. Medzhitov, Regulation de la inmunidad adaptativa por el sistema inmune innato. Science 327, 291 (15 de enero de 2010).
2. O. Takeuchi, S. Akira, Receptores de reconocimiento de patrones e inflamacion. Cell 140, 805, (19 de marzo de 2010).
3. PC Ronald, B. Beutler, Sensores vegetales y animales de firmas microbianas conservadas. Science 330, 1061 (19 de noviembre de 2010).
4. R. Medzhitov, D. Littman, La inmunologla del VIH necesita una nueva direction. Nature 455, 591 (2 de octubre de 2008).
5. N. Manel, DR Littman, Escondiendose al descubierto: como el VIH elude las respuestas inmunologicas innatas. Cell 147, 271 (14 de octubre de 2011).
6. N. Manel y col., Un sensor crlptico para VIH-1 activa la inmunidad innata antiviral en celulas dendrlticas. Nature 467, 214 (9 de septiembre de 2010).
7. J. Luban, Deteccion inmunologica innata de VIH-1 por las celulas dendrlticas. Cell host & microbe 12, 408 (18 de octubre de 2012 ).
8. N. Yan, ZJ Chen, Inmunidad antiviral intrlnseca. Nat Immunol 13, 214 (2012).
9. N. Yan, AD Regalado-Magdos, B. Stiggelbout, MA Lee-Kirsch, J. Lieberman, La exonucleasa citosolica TREX1 inhibe la respuesta inmunologica innata al virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. Nature immunology 11, 1005 (noviembre de 2010).
10. DB Stetson, JS Ko, T. Heidmann, R. Medzhitov, Trex1 evita el inicio intrlnseco celular de la autoinmunidad. Cell 134, 587 (22 de agosto de 2008).
11. YJ Crow y col., Mutaciones en el gen que codifica la 3'-5' ADN exonucleasa 'TREX1 causan el slndrome de Aicardi-Goutieres en el locus AGS1. Nature genetics 38, 917 (agosto de 2006).
12. J. Wu y col., GMP-AMP clclico es un segundo mensajero endogeno en la serialization inmunologica innata por ADN citosolico. Science 339, 826 (15 de febrero de 2013).
13. L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, ZJ Chen, La GMP-AMP sintasa clclica es un sensor de ADN citosolico que activa la via del interferon de tipo I. Science 339, 786 (15 de febrero de 2013).
14. P. Gao y col., [G(2',5')pA(3',5')p] clclico es el segundo mensajero metazoico producido por la sintasa GMP- AMP clclica activada por AdN. Cell 153, 1094 (23 de mayo de 2013).
15. X. Zhang y col., GMP-AMP clclico que contiene enlaces mixtos de fosfodiester es un ligando de afinidad alta endogeno para STING. Molecular Cell, (3 de junio de 2013).
16. EJ Diner y col., El sensor de ADN inmunologico innato GASc produce un dinucleotido clclico no canonico que activa la STiNg humana. Cell Rep 3, 1355 (30 de mayo de 2013).
17. A. Ablasser y col., GASc produce un segundo mensajero de dinucleotido clclico enlazado en 2'-5' que activa STING. Nature 498, 380 (20 de junio de 2013).
18. GN Barber, vlas inmunitarias innatas del ADN citoplasmico. Immunological reviews 243, 99 (septiembre de
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2011).
19. DE Levy, JE Darnell, Jr., Estadldticas: control transcripcional e impacto biologico. Nature reviews. Molecular cell biology 3, 651 (septiembre de 2002).
20. T. Cermak y col., Diseno y ensamblaje eficientes de construcciones TALEN personalizadas y otras construcciones basadas en efectores para la direccion de ADN. Nucleic Acids Res 39, e82 (julio de 2011).
21. El clon n.° 18 tiene mutaciones de cambio de marco en los tres cromosomas. Ademas de los cambios de marco, el clon n.° 36 albergaba una delecion de 9 pb en un cromosoma que eliminaba 3 aminoacidos (215-217) en el dominio catalltico, mientras que el clon n. ° 94 tenia una delecion de 12 pb en un cromosoma y una delecion de 18 pb en otro que elimino 4 (214-217) y 6 (212-217) aminoacidos en el dominio catalltico, respectivamente.
Ejemplo 5. Papeles pivotantes de la senalizacion de GASc-GAMPc en la defensa antiviral y los efectos adyuvantes inmunologicos
La invasion de ADN microbiano en el citoplasma de las celulas animales desencadena una cascada de reacciones inmunologicas del huesped que ayudan a eliminar la infeccion; sin embargo, el propio ADN en el citoplasma puede causar enfermedades autoinmunologicas. Los enfoques bioqulmicos condujeron a la identificacion de GMP-AMP (GAMPc) sintasa clclica (GASc) como un sensor de ADN citosolico que desencadena respuestas inmunologicas innatas. En este caso los investigadores muestran que las celulas de ratones deficientes en GASc (cGas-/-), incluyendo fibroblastos, macrofagos y celulas dendrlticas, no pudieron producir interferones de tipo I y otras citoquinas en respuesta a la transfeccion de ADN o la infeccion por el virus de ADN. Los ratones cGas-- fueron mas susceptibles a la infeccion letal con el virus del herpes simple-1 (HSV1) que los ratones de tipo salvaje. Los investigadores tambien demostraron que GAMPc es un adyuvante que potencia la activacion de las celulas T especlficas de antlgeno y la produccion de anticuerpos.
La deteccion de invasion de ADN extrano es un mecanismo fundamental de defensa del huesped. En las celulas de mamlferos, la presencia de ADN extrano o propio en el citoplasma es una senal de peligro que desencadena la respuesta inmunologica innata del huesped (1). A traves de estudios bioqulmicos, los investigadores han identificado recientemente GMP-AMP ciclico (GAMPc) sintasa (GASc) como un sensor inmunologico innato de ADN citosolico que desencadena la produccion de interferones tipo I y otras citoquinas inflamatorias (2,3). GASc se une al ADN independientemente de su secuencia; esta union activa GASc para catalizar la sintesis de un isomero GAMPc particular, que contiene enlaces fosfodiester 2'-5' y 3'-5' (4-7). Esta molecula, denominada 2'3'GAMPc, funciona como un segundo mensajero que se une y activa la proteina adaptadora STING (3,7). STING luego activa las proteinas quinasas IKK y TBK1, que a su vez activan los factores de transcripcion NF-kB e IRF3 para inducir interferones y otras citoquinas (8).
Para investigar la funcion de GASc in vivo, los investigadores generaron una cepa de raton Gacs inactivado, en la que el primer exon se empalma en un casete LacZ, anulando asi la expresion del locus endogeno (9). Los ratones Gas-/-c nacieron en la relacion mendeliana, y no mostraron ninguna anormalidad de desarrollo manifiesta. Los analisis cuantitativos de PCR de transcripcion inversa (RT-PCRc) de ARN de fibroblastos pulmonares y macrofagos procedentes de medula osea (BMDM) confirmaron que las celulas Gas-' c eran defectuosas para producir ARN de Gasc, mientras que las celulas Gas+-c producian niveles intermedios de ARN de Gasc.
Los investigadores obtuvieron fibroblastos pulmonares de ratones WT, Gas+/-c y GAS-/-c, asi como el raton goldenticket (gt/gt), que tiene una mutacion puntual que da como resultado la perdida de la expresion de STING (10). La transfeccion de diferentes tipos de ADN, incluyendo ADN de testiculo de arenque (ADN-TA), ADN de E. coli y ADN estimulante de interferon (ISD, ADN bicatenario de 45 pb) (11), en los fibroblastos pulmonares de ratones WT y Gas+-c condujeron a la produccion robusta de proteina IFNp, medida por ELISA. A diferencia, las celulas Gas-/-c y Stinggt/gt no produjeron ningun nivel detectable de IFNp. Poli[I:C], un analogo de ARN bicatenario conocido por inducir IFNp a traves de la via del receptor tipo RIG-I (RTR) (12), indujo IFNp normalmente en ausencia de Gasc o Sting. Curiosamente, poli[dA:dT], que previamente se demostro que induce interferones de tipo I a traves de la via de ARN polimerasa III-RIG-I-MAVS (13, 14), indujo IFNp normalmente en las celulas Gas-/-c y Stinggt/gt. Los analisis RT-PCRc confirmaron ademas que el GASc es esencial para la induccion de ARN de IFNp por diferentes tipos de ADN sintetico o bacteriano, excepto poli[dA:dT]. Los experimentos de curso de tiempo muestran que la induccion de IFNp por ISD fue completamente surpimida en los fibroblastos pulmonares de Gas-/- incluso en puntos de tiempo tempranos (2-8 h) despues de la transfeccion de ADN, lo que indica que GASc es indispensable para la induccion de IFNp por aDn citosolico.
Para medir la produccion de GAMPc en celulas WT y Gas-/-c, los investigadores realizaron un bioensayo que mide la actividad de GAMPc en extractos citoplasmicos de celulas transfectadas con ISD. Los extractos se calentaron a 95 °C para desnaturalizar la mayorla de las proteinas, que se eliminaron por centrifugacion. Los sobrenadantes que podrian contener GAMPc se entregaron a la linea celular monocitica humana THP1, que se habia permeabilizado con la toxina bacteriana perfringolisina-O (PFO). La dimerizacion de IRF3, una evidencia de su activacion, luego se midio mediante electroforesis nativa en gel. Este ensayo mostro que los extractos de fibroblastos pulmonares transfectados con ISD de ratones WT pero no de Gas-/-c contenian la actividad de GAMPc, lo que demuestra que GASc tiene un papel no redundante para catalizar la sintesis de GAMPc en estas celulas en respuesta al ADN
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A continuacion, los investigadores infectaron los fibroblastos pulmonares con los virus de ADN virus del herpes simple-1 (HSV1), virus vaccinia (VACV) y una cepa mutante de HSV1 llamada d109, que tiene una delecion de protelnas virales como ICP0 que se sabe que antagoniza respuestas inmunologicas (15). La induccion de IFNp por cada uno de estos virus fue suprimida en gran parte en celulas Gas-/~c y Sting3t/3t, y se inhibio parcialmente en celulas Gas+ c. A diferencia, la induccion de IFNp por el virus Sendai, un virus ARN conocido por activar la via RIG- 1, no se vio afectado por la deficiencia en Gasc o Sting. La administracion de GAMPc en el citoplasma rescato la induccion de IFNp en celulas Gas-- c pero no en celulas Stinggtgt. De forma similar, la induccion de la quimioquina CXCL10 por los virus de ADN dependla de Gasc y Sting. La medicion de la dimerizacion de IRF3 mostro que las celulas Gas-/-c no activaron IRF3 en respuesta a la transfeccion de ADN-TA o la infeccion por HSV-1 WT o la cepa HSV1 7134, que tambien carece del interferon antagonista ICP0 (16). La deficiencia de Gasc no altero la activacion de IRF3 por el virus Sendai. Por tanto, se requiere GASc para la activacion de IRF3 y la induccion de citocinas por virus de ADN pero no virus de ARN en fibroblastos pulmonares de raton.
BMDM de ratones Gas-/~c y Stinggtgt fueron defectuosos para producir IFNp en respuesta a la transfeccion con ADN- TA o ISD. De forma similar, la induccion de IFNp por VACV y las cepas HSV1 d109 y 7134 fue suprimida en gran parte en Gas-/~c y Stinggt/gt BMDM. Sin embargo, la induccion de IFNp por WT HSV1 se bloqueoi grave pero no completamente bien en Gas-/~c o en StinggVgt BMDM, lo que indica que estas celulas poseen otra via que podia compensar parcialmente la perdida de la via GASc-STING para detectar la infeccion por HSV1 WT. La perdida de GASc o STING en BMDM no afecto la induccion de IFNp por el virus Sendai. Los experimentos cineticos muestran que la induccion de IFNp por ISD y HSV1-d109 fue suprimida en Gas-/~c BMDM a lo largo del curso temporal de la estimulacion. De forma analoga a IFNp, la induccion de TNFa por ADN-TA o ISD fue surpimida en Gas-/-c o Stinggtgt BMDM. Los analisis de RT-PCR c mostraron que la induccion de IFNp, interleucina-6 (IL6) y ARN de CXCL10 por transfeccion de ADN-TA o ISD o infeccion con HSV1-d109 era completamente dependiente de Gasc y Sting. A diferencia, los niveles de ARN de estas citocinas inducidas por poli[I:C] o el virus Sendai no se vieron afectados por la deficiencia en Gasc o Sting.
Los investigadores obtuvieron celulas dendrlticas convencionales (DCc) y DC plasmocitoides (DCp) cultivando medulas oseas en medios condicionados que contienen GM-CSF y ligando de Flt3 (Flt3L), respectivamente. Los DC GM-CSF, que contienen en gran parte DCc, de ratones Gas--c y Stinggt/gt no indujeron IFNa o IFNp en respuesta a la transfeccion de ADN-TA o ISD. La perdida de GASc o STING en DC de GM-CSF suprimio la induccion de IFNp por HSV1-d109 y VACV, e inhibio parcialmente la induccion de IFNp por HSV1 WT. A diferencia, la deficiencia en GASc o STING no altero la induccion de IFNa o IFNp por el virus Sendai. Los experimentos de RT-PCRc confirmaron ademas que GASc y STING eran esenciales para la induccion de ARN de IFNp, IL6 y CXCL10 por transfeccion con ADN-TA o ISD o infeccion con HSV1-d109, mientras que la induccion de estas citoquinas por poli[I:C] o el virus Sendaiera independiente de GASc o STING.
Se sabe que los DCp expresan TLR9 que es responsable de la induccion de los interferones de tipo I por los enlaces de CpG sintetico que contienen fosforotioato (17). Cuando el ADN de CpG se uso para estimular las DC de Flt3L, que contiene en gran parte CDp, en presencia o ausencia de liposoma (lipofectamina 2000), indujo la produccion robusta de IFNa y IFNp incluso en las celulas Gas-/~c y Stinggt/gt. A diferencia, otras formas de ADN, incluido ISD, poli[dA:dT] y ADN genomico de E. coli y Vibrio cholerae, indujeron IFNa en Flt3L-DC solo en presencia de liposomas, y esta induccion por cada ADN fue suprimida en ausencia de GASc o STING. La fuerte dependencia de la induccion de IFNa por poli[dA:dT] en GASc y sTiNG en DCp indica que la via GASc-STING, pero no la via Pol-III- RIG-I, juega un papel importante en la deteccion del ADN en estas celulas. El Flt3L-DC de ratones Gas-/-c y Stinggtgt indujeron FNa y IFNp en respuesta a la infeccion por el virus Sendai, pero no HSV1. En conjunto, estos resultados demuestran que GASc es responsable de detectar ADN natural (p. ej., ADN bacteriano) e infecciones por virus ADN en celulas dendrlticas.
Para determinar el papel de GASc en la defensa inmunologica contra virus ADN in vivo, los investigadores infectaron ratones WT y Gas-/-c con HSV1 por via intravenosa (vi). El analisis de ELISA mostro que los sueros de ratones WT contenla niveles elevados de iFNa e IFNI3, que alcanzo su punto maximo a las 8 y 4 horas, respectivamente, despues de la infeccion por HSV1 (1x107 ufp/raton). Los niveles de IFNa e IFNp se atenuaron intensamente en los ratones Gas-/-c infectados con la misma dosis infecciosa de HSV1. En un experimento independiente en el que los ratones fueron controlados para su supervivencia despues de la infeccion con HSV1 a la dosis infecciosa de 1x106 upf/raton, cuatro de los cinco ratones Gas-/-c desarrollaron ataxia y paralisis en 3 dlas despues de la infeccion del virus y murieron unas horas despues de que aparecieron estos slntomas. El quinto raton Gas-/-c murio el dla 4 despues de la infeccion. Tres de los cinco ratones WT desarrollaron estos slntomas el dia 6 y murieron poco despues. Cuando se extrajeron los cerebros de los ratones WT y Gas-/-c para medir los titulos virales el dia 3 despues de la infeccion, se detectaron altos niveles de HSV1 en los cinco ratones Gas-/~c, mientras que ninguno de los ratones WT tenia niveles detectables de HSV1 en los cerebros. Se observaron las curvas de supervivencia similares y se detectaron titulos virales similares en los cerebros en experimentos independientes en los que la dosis infecciosa de HSV1 se aumento a 1 x 107 upf por raton. La susceptibilidad de los ratones Gas-/-c a la infeccion por HSV1 fue similar a la de los ratones Stinggt/gt, que tambien tenian una notable reduccion de IFNa e IFNp en los sueros, y murieron dentro de los 3-4 dlas despues de la infeccion por HSV1 (18).
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Los resultados de los investigadores de que el GASc es esencial para la induccion de interferones de tipo I por ADN citosolico en multiples tipos de celulas, incluidas las celulas que presentan antlgenos, indican que el producto GASc, 2'3'GAMPc, se puede usar para sustituir el efecto inmunoestimulador de ADN, incluido el efecto adyuvante de las vacunas de ADN (19). Para determinar el efecto adyuvante de 2'3'GAMPc, los investigadores inyectaron el modelo de antlgeno de protelna ovoalbumina (OVA) in ausencia o presencia de 2'3'GAMPc en ratones WT o Stinggt/gt por via intramuscular. Los ratones se reforzaron una vez en el dla 10 con la misma formulacion de antlgeno. Los analisis ELISA mostraron que 2'3'GAMPc potenciaba fuertemente la produccion de anticuerpos especlficos de OVA el dla 17 en los ratones WT, pero no en Sting9t/gt Este efecto adyuvante de 2'3'GAMPc tampoco se observo en ratones deficientes de receptores de interferon tipo I (Ifnar-/-). Para investigar el efecto de 2'3'GAMPc en la activacion de celulas T, los leucocitos esplenicos aislados de los ratones WT, que se hablan inmunizado con OVA u OVA + 2'3'GAMPc durante 7 dlas, se cultivaron con un peptido OVA conocido para estimular celulas T CD4 a traves de la molecula MHC de clase II I-Ab u otro peptido OVA que estimula las celulas T CD8 a traves de la molecula MHC de clase I H-2Kb. Tanto las celulas T CD4 como CD8 de los ratones inmunizados con OVA + 2'3'GAMPc, pero no con OVA solo, produjeron niveles elevados de IFNy e IL-2 despues de la estimulacion con los peptidos afines. El analisis de citometrla de flujo usando un tetramero compuesto por un peptido OVA en el complejo con H-2Kb mostro un notable aumento en el porcentaje de las celulas T CD8 tetramero-positivas en los ratones inmunizados con OVA + 2'3'GAMPc, lo que indica que 2'3'GAMPc estimulo la expansion de las celulas T CD8 que portan el receptor de celulas T especlfico de OVA. En conjunto, estos resultados indican que 2'3'GAMPc funciona como un adyuvante inmunologico para estimular respuestas de celulas T y celulas B especlficas de antlgeno.
En el presente documento los investigadores proporcionan la prueba de que GASc es esencial para la induccion de interferones de tipo I y otras citoquinas inflamatorias por transfeccion de ADN e infeccion por virus de ADN. Con la excepcion de poli[dA:dT] y ADN CpG, la mayorla de moleculas de ADN, especialmente las que se encuentran en la naturaleza (p. ej. ADN bacteriano y viral), estimulan los interferones tipo I exclusivamente a traves de la via GASc- GAMPc-STING. En multiples tipos de celulas, incluyendo fibroblastos, macrofagos y celulas dendrlticas, la induccion de interferones de tipo I por virus vaccinia y varias cepas de HSV1 es completamente dependiente de GASc y STING. De forma destacable, sin embargo, la induccion de IFNp por HSV1 de tipo salvaje se suprime de forma grave pero no completamente en las DC de BMDM y GM-CSF de ratones Cas-/-c o Stinggt/gt. Otros supuestos sensores de ADN, tales como IFI16 o DDX41, tambien pueden estar involucrados en esta induccion residual de IFNp por HSV1 WT(20, 21). En el caso de GASc, los fenotipos de Cas-/-c son sorprendentemente similares a los de ratones Sting-- (este estudio y ref. 18). Estos resultados, junto con los datos bioqulmicos de los investigadores que muestran que GASc es una enzima citosolica activada por su union al ADN generico (2,3), demuestran formalmente que el GASc es un sensor de ADN citosolico no redundante y general que activa STING.
Los investigadores mostraron que 2'3'GAMPc es un adyuvante eficaz que refuerza la produccion de anticuerpos especlficos de antlgeno y las respuestas de celulas T. Aunque los segundos mensajeros bacterianos di-GMP clclico y di-AMP clclico se estan desarrollando como posibles coadyuvantes de vacunas (22), 2'3'GAMPc es un ligando mucho mas potente de STING que cualquiera de los dinucleotidos clclicos bacterianos (7). Por tanto, 2'3'GAMPc proporciona un adyuvante util para las vacunas de la proxima generacion para evitar o tratar enfermedades humanas, incluidas las enfermedades infecciosas y el cancer.
Referencias y notas
1. LA O'Neill, Inmunologla. La deteccion del lado oscuro del ADN. Science 339, 763 (15 de febrero de 2013).
2. L. Sun, J. Wu, F. Du, X. Chen, ZJ Chen, La GMP-AMP sintasa clclica es un sensor de ADN citosolico que activa la via del interferon de tipo I. Science 339, 786 (15 de febrero de 2013).
3. J. Wu y col., GMP-AMP clclico es un segundo mensajero endogeno en la senalizacion inmunologica innata por ADN citosolico. Science 339, 826 (15 de febrero de 2013).
4. A. Ablasser y col., GASc produce un segundo mensajero de dinucleotido clclico enlazado en 2'-5' que activa STING. Nature 498, 380 (20 de junio de 2013).
5. EJ Diner y col., El sensor de ADN inmunologico innato GASc produce un dinucleotido clclico no canonico que activa la STING humana. Cell Rep 3, 1355 (30 de mayo de 2013).
6. P. Gao y col., [G(2',5')pA(3',5')p] clclico es el segundo mensajero metazoico producido por la sintasa GMP- AMP clclica activada por AdN. Cell 153, 1094 (23 de mayo de 2013).
7. X. Zhang y col., GMP-AMP clclico que contiene enlaces mixtos de fosfodiester es un ligando de afinidad alta endogeno para STING. Molecular Cell, (3 de junio de 2013).
8. H. Ishikawa, GN Barber, La via STING y la regulation de la senalizacion inmunologica innata en respuesta a los patogenos del ADN. Cellular and molecular life sciences: CMLS 68, 1157 (abril de 2011).
9. Se generaron ratones Gas-/-c mediante fertilization in vitro usando espermatozoides que albergaban una insertion dirigida en el locus Gasc/Mb21d1.
10. JD Sauer y col., El mutante de raton Goldenticket inducido por N-etil-N-nitrosourea revela una funcion esencial de Sting en la respuesta de interferon in vivo a Listenia monocytogenes y dinucleotidos clclicos. Infect Immun 79, 688 (febrero de 2011).
11. DB Stetson, R. Medzhitov, El reconocimiento de ADN citosolico activa una respuesta inmunologica innata dependiente de IRF3. Immunity 24, 93 (enero de 2006).
12. M. Yoneyama y col., El aRn helicasa RIG-I tiene una funcion esencial en las respuestas antivirales innatas
inducidas por ARN bicatenario. Nat Immunol 5, 730 (julio de 2004).
13. A. Ablasser y col., La deteccion dependiente de RIG-I de poli(dA:dT) a traves de la induccion de un ARN intermedio transcrito con ARN polimerasa III. Nat Immunol, (16 de julio de 2009).
14. YH Chiu, JB Macmillan, ZJ Chen, La ARN polimerasa III detecta ADN citosolico e induce interferones tipo I a 5 traves de la via RIG-I. Cell 138, 576 (7 de agosto de 2009).
15. LA Samaniego, L. Neiderhiser, NA DeLuca, La persistencia y expresion del genoma del virus del herpes simple en ausencia de protelnas inmediatas/tempranas. Journal of virology 72, 3307 (abril de 1998).
16. GT Melroe, NA DeLuca, DM Knipe, El virus del herpes simple 1 tiene multiples mecanismos para bloquear la produccion de interferon inducida por virus. Journal of virology 78, 8411 (agosto de 2004).
10 17. O. Takeuchi, S. Akira, Los receptores de reconocimiento de patrones e inflamacion. Cell 140, 805, (19 de
marzo de 2010).
18. H. Ishikawa, Z. Ma, GN Barber, STING regula la inmunidad innata dependiente de interferon tipo I mediada por ADN intracelular. Nature 461, 788 (8 de octubre de 2009).
19. CJ Desmet, KJ Ishii, La deteccion de acidos nucleicos en la interfaz entre inmunidad innata y adaptativa en la 15 vacunacion. Nature reviews. Immunology 12, 479 (julio de 2012).
20. Z. Zhang y col., La helicasa DDX41 detecta el ADN intracelular mediado por el adaptador STING en celulas dendrlticas. Nature immunology 12, 959 (octubre de 2011).
21. L. Unterholzner y col., IFI16 es un sensor inmunologico innato para el ADN intracelular. Nature immunology 11, 997 (noviembre de 2010).
20 22. W. Chen, R. Kuolee, H. Yan, El potencial de 3',5'-acido diguanllico clclico (di-GMPc) como un adyuvante de
vacuna eficaz. Vaccine 28, 3080 (19 de abril de 2010).

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES:
    1. Un metodo para preparar 2'3'-GMP-AMP ciclico (2'3'-GAMPc), que comprende formar una mezcla que comprende la sintasa GMP-AMp clclica de mamlfero (GASc), ATP y GTP, en condiciones en las que la sintasa convierte catallticamente el ATP y el GTP en 2'3'-GAMPc, en donde la sintasa, el ATP y el GTP estan en cantidades predefinidas, comprendiendo el metodo ademas la etapa de aislar o detectar el 2'3'- GAMPc resultante, en donde la mezcla comprende ademas ADN y la conversion es dependiente de ADN.
  2. 2. Un 2'3'-GAMPc aislado obtenido a partir del metodo de la reivindicacion 1.
  3. 3. Una composicion que comprende una cantidad predeterminada del 2'3'- GMP-AMP ciclico (2'3'-GAMPc) como se define en la reivindicacion 2.
  4. 4. Una composicion que comprende una cantidad predeterminada de 2'3'-GAMPc.
  5. 5. La composicion de las reivindicaciones 3 o 4 esencialmente libre de otros di-nucleotidos clclicos.
  6. 6. Un adyuvante que comprende la composicion de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4.
  7. 7. Una vacuna que comprende un inmunogeno predeterminado y la composicion de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4.
  8. 8. La vacuna de la reivindicacion 7, en la que el inmunogeno es selectivo para un patogeno objetivo.
  9. 9. La composicion de las reivindicaciones 3 o 4 para su uso en un metodo para inducir o promover una respuesta inmunologica, comprendiendo el metodo administrar a un mamlfero que lo necesita una cantidad eficaz de la composicion.
  10. 10. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde la composicion se administra por via mucosal (sublingual o intranasal), intramuscular o subcutanea.
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Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013185052A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Aduro Biotech Compostions and methods for cancer immunotherapy
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
CA2895175C (en) 2012-12-19 2021-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
BR112015027327B1 (pt) 2013-04-29 2022-08-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Composto, modulador de cgas, composição farmacêutica compreendendo o referido composto ou modulador
CN105377867B (zh) * 2013-05-03 2019-11-12 加利福尼亚大学董事会 I型干扰素的环状二核苷酸诱导
JP6453855B2 (ja) 2013-05-18 2019-01-16 アドゥロ バイオテック，インク． 「インターフェロン遺伝子の刺激因子」依存性シグナル伝達を活性化するための組成物及び方法
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
WO2015017652A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators
JP6462006B2 (ja) 2014-06-04 2019-01-30 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｔｉｎｇのモジュレーターとしての環式ジヌクレオチド
US10010607B2 (en) 2014-09-16 2018-07-03 Institut Curie Method for preparing viral particles with cyclic dinucleotide and use of said particles for inducing immune response
EP3233882B1 (en) 2014-12-16 2019-10-30 Kayla Therapeutics Fluorinated cyclic dinucleotides for cytokine induction
US20180344758A1 (en) * 2014-12-17 2018-12-06 Lipogen Llc Method of Treating Cancer with cGAMP or cGAsMP
GB201501462D0 (en) 2015-01-29 2015-03-18 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compounds
AU2016277149A1 (en) * 2015-06-11 2018-02-01 University Of Miami Cancer treatment and diagnosis
CN106309484A (zh) * 2015-07-02 2017-01-11 聊城市奥润生物医药科技有限公司 硫(硒)代磷酸环二核苷酸cGAMP在治疗肿瘤联合用药中的应用
CN106318997A (zh) * 2015-07-03 2017-01-11 聊城市奥润生物医药科技有限公司 硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP的高效制备、纯化方法
GEP20207182B (en) 2015-08-13 2020-11-25 Merck Sharp & Dohme Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
US11453697B1 (en) 2015-08-13 2022-09-27 Merck Sharp & Dohme Llc Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
CN106540255A (zh) * 2015-09-18 2017-03-29 聊城市奥润生物医药科技有限公司 环二核苷酸cGAMP联合贝伐珠单抗在抗肿瘤中的应用
MA52157A (fr) 2015-12-03 2021-02-17 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Dinucléotides cycliques de purine utilisés comme modulateurs de sting
US10969389B2 (en) 2016-02-18 2021-04-06 Institut Curie Method to monitor and quantify interphase nuclear envelope rupture events
JP6724156B2 (ja) 2016-03-16 2020-07-15 アンスティテュ・クリー 環状ジヌクレオチドを含むウイルス粒子を調製する方法及びがんを治療するための前記粒子の使用
IL280430B2 (en) 2016-03-18 2023-11-01 Univ Texas Cyclic dinucleotide compounds and methods of use
JP7116422B2 (ja) 2016-04-05 2022-08-10 イミューン センサー リミテッド ライアビリティ カンパニー ｃＧＡＳアンタゴニスト化合物
US10696985B1 (en) 2016-06-06 2020-06-30 Vanderbilt University Reversibly crosslinked endosomolytic polymer vesicles for cytosolic drug delivery
EP3481402A4 (en) * 2016-07-06 2020-01-22 Sperovie Biosciences, Inc. CONNECTIONS, COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING A DISEASE
EP3506884B1 (en) 2016-08-30 2021-05-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Drug delivery compositions and uses thereof
WO2018045369A1 (en) * 2016-09-05 2018-03-08 BellBrook Labs High-throughput screening assay
US10537590B2 (en) 2016-09-30 2020-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
RS62410B1 (sr) 2016-10-04 2021-10-29 Merck Sharp & Dohme Benzo[b]tiofenska jedinjenja kao agonisti sting
JOP20170188A1 (ar) * 2016-11-25 2019-01-30 Janssen Biotech Inc ثنائي النوكليوتيدات الحلقية كمنبهات ستينغ (sting)
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي
JPWO2018124293A1 (ja) * 2016-12-28 2019-12-12 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 トランスクリプトームによる医薬成分の特徴分析法および分類
JOP20190218A1 (ar) 2017-03-22 2019-09-22 Boehringer Ingelheim Int مركبات ثنائية النيوكليوتيدات حلقية معدلة
US20200078455A1 (en) * 2017-04-24 2020-03-12 Sri International Mesothelin vaccine for ovarian cancer prevention
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
US11466047B2 (en) 2017-05-12 2022-10-11 Merck Sharp & Dohme Llc Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
EP3652349A1 (en) 2017-07-10 2020-05-20 Cornell University Targeting chromosomal instability and downstream cytosolic dna signaling for cancer treatment
MA49772A (fr) 2017-08-04 2021-04-21 Merck Sharp & Dohme Agonistes benzo[b]thiophène de sting pour le traitement du cancer
AU2018311965A1 (en) 2017-08-04 2020-02-13 Merck Sharp & Dohme Llc Combinations of PD-1 antagonists and benzo[b]thiophene sting antagonists for cancer treatment
CN107619438B (zh) * 2017-10-11 2021-12-03 广州云启科技有限公司 新型环二核苷酸受体及其激动剂或抑制剂筛选的方法和试剂盒
US11542293B2 (en) 2017-11-10 2023-01-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sting modulator compounds, and methods of making and using
EP3727401A4 (en) 2017-12-20 2022-04-06 Merck Sharp & Dohme Corp. CYCLIC DINUCLEOTIDE COMPOUNDS USED AS STING AGONISTS
TWI818943B (zh) * 2018-01-04 2023-10-21 中央研究院 用於增加療效之可與細胞結合的免疫佐劑
CN111989338A (zh) 2018-03-27 2020-11-24 勃林格殷格翰国际有限公司 修饰的环二核苷酸化合物
EP3774834A1 (en) 2018-03-27 2021-02-17 Boehringer Ingelheim International GmbH Cyclic dinucleotide compounds containing 2-aza-hypoxanthine or 6h-pytazolo[1,5-d][1,2,4]triazin-7-one as sting agonists
CA3095646A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Benzothiophenes and related compounds as sting agonists
WO2019195063A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Aza-benzothiophene compounds as sting agonists
CN109536492B (zh) * 2018-05-09 2019-08-20 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 人cGAS基因启动子区转录调控元件及其应用
WO2020006038A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Structure of the human cgas-dna complex and uses thereof
WO2020023361A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Enhancing anti-tumor response in melanoma cells with defective sting signaling
CN112041325B (zh) * 2018-08-16 2023-10-24 卫材R&D管理有限公司 化合物的盐及其晶体
AU2019337051B2 (en) 2018-09-06 2023-11-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof
WO2020092633A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Vanderbilt University Graft copolymers, methods of forming graft copolymers, and methods of use thereof
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
US20220251135A1 (en) * 2019-07-25 2022-08-11 Beigene, Ltd. Cyclic dinucleotides as sting agonists
EP3785719A1 (en) * 2019-08-28 2021-03-03 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH New use of cyclic dinucleotides
WO2021077018A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating innate immune signaling pathways
IL296124A (en) 2020-03-06 2022-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a drug including a novel cyclic dinucleotide derivative
US11897888B1 (en) 2020-04-30 2024-02-13 Stinginn Llc Small molecular inhibitors of sting signaling compositions and methods of use
CN111956797B (zh) * 2020-07-10 2022-05-13 清华大学 新型疫苗佐剂及其在新冠肺炎疫苗和其他疫苗中的应用
JPWO2022050300A1 (es) 2020-09-02 2022-03-10
MX2023005381A (es) 2020-11-09 2023-05-23 Takeda Pharmaceuticals Co Conjugados de anticuerpo y farmaco.
CN117980487A (zh) * 2021-07-23 2024-05-03 斯帕克治疗公司 用于非病毒dna递送的方法和组合物
WO2023183275A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Ventus Therapeutics U.S., Inc. Hexahydropyrido[4,3-b]indolyl ketone derivatives useful as cgas modulators
CN114948955A (zh) * 2022-06-06 2022-08-30 中国科学技术大学 靶向环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的小分子共价抑制剂及其用途

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7680324B2 (en) 2000-11-06 2010-03-16 Evryx Technologies, Inc. Use of image-derived information as search criteria for internet and other search engines
EP1651242A2 (en) 2003-07-28 2006-05-03 David K. R. Karaolis Method for attenuating virulence of microbial pathogens and for inhibiting microbial biofilm formation
US7709458B2 (en) 2004-03-15 2010-05-04 David K. R. Karaolis Method for inhibiting cancer cell proliferation or increasing cancer cell apoptosis
EP1782826A1 (en) 2005-11-08 2007-05-09 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH PQS and c-diGMP and its conjugates as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
EP2324044A4 (en) 2008-08-04 2012-04-25 Univ Miami STING (INTERFERON GENE STIMULATOR), A REGULATOR OF INDIAN IMMUNE RESPONSES
US9061048B2 (en) 2010-12-15 2015-06-23 The Regents Of The University Of California Cyclic di-AMP induction of type I interferon
JP5650780B2 (ja) 2012-04-04 2015-01-07 日東電工株式会社 ワクチン組成物
CA2907616A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Glen N. Barber Modulating immune responses
WO2013185052A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Aduro Biotech Compostions and methods for cancer immunotherapy
WO2014093936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Aduro Biotech, Inc. Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use
CA2895175C (en) * 2012-12-19 2021-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
BR112015027327B1 (pt) * 2013-04-29 2022-08-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Composto, modulador de cgas, composição farmacêutica compreendendo o referido composto ou modulador
CN105377867B (zh) 2013-05-03 2019-11-12 加利福尼亚大学董事会 I型干扰素的环状二核苷酸诱导
US9549944B2 (en) 2013-05-18 2017-01-24 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting “stimulator of interferon gene”—dependent signalling
WO2015017652A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Sting crystals and modulators

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