CN110201155A - 哺乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及哺乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向，具体而言，涉及环‑GMP‑AMP合酶(cGAS)和包括2'3‑cGAMP、2'2‑cGAMP、3'2'‑cGAMP和3'3'‑GAMP的环‑GMP‑AMP(cGAMP)用于药物制剂(包括疫苗佐剂)、药物筛选、疗法和诊断。

Description

哺乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向
本申请是申请号为201380073220.0，申请日为2013年12月16日，发明名称为“哺乳动物的环二核苷酸信号通路的药物靶向”的中国专利申请的分案申请。
本发明在由美国国立卫生研究院(NIH)提供的基金编号ROI AI-093967的政府支持下进行。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
细胞质的DNA诱导I型干扰素和其它的细胞因子，其对于抗微生物防御是重要的，但也可导致自身免疫。此DNA信号通路需要衔接蛋白STING和转录因子IRF3，但DNA传感(DNAsensing)的机制尚不清楚。本文中，本发明人报道了在存在DNA而没有RNA的情况下，哺乳动物细胞质提取物在体外从ATP和GTP合成了环GMP-AMP(cGAMP)。哺乳动物细胞的DNA转染或DNA病毒感染也触发cGAMP的产生。cGAMP结合STING，导致激活IRF3并诱导干扰素β(IFNβ)。因此，cGAMP代表了后生动物中的第一环二核苷酸，并且其作为响应细胞质DNA而触发干扰素产生的内源第二信使起作用。
通过生化分级和定量质谱，本发明人还确定了cGAMP合酶(cGAS)，其属于核苷酸转移酶家族。cGAS的过表达激活转录因子IRF3并以STING-依赖的方式诱导IFNβ。敲除cGAS抑制了经DNA转染或DNA病毒感染的IRF3激活和IFNβ诱导。cGAS在细胞质中结合DNA并催化cGAMP合成。这些结果表明，cGAS是胞质DNA传感器，其通过产生第二信使cGAMP诱导干扰素。
本发明将这些发现应用于涉及环-GMP-AMP合酶(cGAS)和环-GMP-AMP(cGAMP)的新方法和组合物，包括其在制剂(包括疫苗佐剂)、药物筛选、治疗方法和诊断中的用途。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了基于细胞的药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，其包括将细胞或细胞提取物与有效量的外源性cGAS抑制剂相接触，并检测所获得的合酶抑制。在具体的实施方式中，通过环-GMP-AMP诱导的IRF3激活(二聚化或核转位)、干扰素产生或NF-κB激活来推理检测所获得的抑制。
在另一个方面中，本发明提供了治疗方法，这包括抑制cGAS的方法，其包括将确定的有需求的细胞与有效量的外源cGAS抑制剂相接触。在具体的实施方式中，方法包括向确定的有需求且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂，和/或抑制剂是小分子环化酶抑制剂或是cGAS特异性shRNA或siRNA。
在另一个方面中，本发明提供了体外药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，其包括将包含合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了经合酶的ATP和GTP到环-GMP-AMP和无机焦磷酸的催化转化，并检测所获得的合酶抑制。在一个具体的实施方式中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。在其它的实施方式中，cGAS是组成型活性的。
在另一个方面中，本发明提供了体外药物结合测定，这包括抑制cGAS结合到底物或辅因子的方法，其包括将包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA辅因子的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了合酶到底物或辅因子的结合，并检测所获得的结合抑制。
在另一个方面中，本发明提供了制备cGAMP的方法，所述方法包括在条件下形成包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述条件下合酶催化转换ATP和GTP到cGAMP，其中合酶、ATP和GTP是预定义量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。在具体实施方式中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。
在另一个方面中，本发明提供了检测cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变的方法，所述方法包括以下步骤：检测来自人的样品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变，并基于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变将所述的人分配一个自身免疫性疾病度量；和任选地向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治疗方法。
在另一个方面中，本发明提供了包含预定量的cGAMP的组合物，如进一步包含针对靶病原体的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐剂。在具体实施方式中，组合物不含其它的环二核苷酸，和/或另外地，适合于作为佐剂或疫苗，例如无菌的，药学上可接受的，以确定的、预定的量、比率等，并且组合物可以是为单个使用量化的散装或单位剂量。本发明还提供了诱导或促进免疫应答的方法，包括向有需求的哺乳动物施用有效量的此类组合物。在具体实施方式中，给药是粘膜(舌下或鼻内)、肌内或皮下给药。
本发明包括所列具体实施方式的所有组合。进一步的实施方式和本发明的适用性的全部范围将因下文所给出的详细描述而变得显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实施例虽然表示了本发明的优选实施方式，但仅以说明的方式给出，这是因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改因这一详细描述而对于本领域技术人员而言变得显而易见。
具体实施方式
本发明提供了涉及cGAS和cGAMP的方法和组合物，这包括其在制剂(包括疫苗佐剂)、药物筛选、治疗方法和诊断中的用途。
要点：2'3'-cGAMP是哺乳动物细胞所产生的内源性第二信使；2'3'-cGAMP是STING的高亲和配体；2'3'-cGAMP是I型干扰素的强诱导物；2'3'-cGAMP结合诱导了STING的构象变化。
在一个方面中，本发明提供了基于细胞的药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，药物筛选包括将细胞或细胞提取物与有效量的外源性cGAS抑制剂相接触，并检测所获得的合酶抑制。合酶通常地是人或鼠cGAS，并且可以在融合蛋白中被截断、重组，或进行其它修改以适合分析。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候选抑制剂，其可能来自文库、先导化合物优化等。例如通过cGAMP诱导的IRF3激活(二聚化或核转位)、干扰素产生或NF-κB激活直接或推理检测抑制，通过例如质谱、基于抗体的分析(例如，ELISA、ALPHA、荧光偏振等)直接检测cGAMP和其它产物。例如，可以通过q-RT-PCR测量IFN RNA，通过非变性凝胶电泳测量IRF3二聚化。另外的合适的读取包括ATP、GTP和焦磷酸(PPi)的测量。
在另一个方面中，本发明提供了治疗方法，这包括抑制cGAS的方法，治疗方法包括将确定的有需求的细胞与有效量的外源cGAS抑制剂相接触。在具体的实施方式中，方法包括向确定的有需求且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂，和/或抑制剂是小分子环化酶抑制剂，或是cGAS特异性shRNA或siRNA，或其它的RNAi或反义RNA cGAS特异性抑制剂。
本发明人的数据表明，cGAS和cGAS-cGAMP途径对于触发针对自身和外源DNA的炎症反应是重要的，因此cGAS抑制剂可用于降低相关自身免疫性疾病的病原性cGAS活性。类似地，本发明人的数据表明，cGAS对于从正常细胞到癌细胞的转化也是重要的，并且对于癌细胞的生存和转移也是重要的，因此cGAS抑制剂可用于降低相关的肿瘤性(neoplastic)疾病的病原性cGAS活性。
目前用于狼疮和其它自身免疫性疾病的治疗方法涉及大剂量的免疫抑制剂，其具有严重的副作用。虽然一种新的BAFF抗体(Benlysta)已被批准用于治疗狼疮，但其只能勉强有效。用小分子抑制剂(尤其是口服可用的那些)靶向cGAS提供了超过现有治疗方法的显著的优点。cGAS抑制剂靶向于狼疮和其它自身免疫性疾病的根本原因，并为患者提供了治疗益处。此外，在自身免疫性病况如全身性红斑狼疮(SLE)、综合征和Aicardi-Goutières综合征下，细胞溶质的DNA先天免疫途径是异常激活的，并且cGAS抑制为这些疾病和其它自身免疫性疾病提供了一种合理的治疗方法。
在另一个方面中，本发明提供了体外药物筛选，这包括抑制cGAS的方法，药物筛选包括将包含合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了经合酶的ATP和GTP到cGAMP和无机焦磷酸的催化转化，并检测所获得的合酶抑制。在具体的实施方式中，混合物进一步包括DNA且转化是DNA-依赖性的。在其它的实施方式中，cGAS是组成型活性的。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候选抑制剂，其可以来自文库、先导化合物优化等。混合物可以包含于细胞或细胞提取物中，或可以是无细胞的。
在另一个方面中，本发明提供了体外药物结合测定，这包括抑制cGAS结合到底物或辅因子的方法，药物结合测定包括将包含合酶和ATP或GTP的底物或DNA辅因子的混合物与抑制剂在条件下相接触，其中所述条件下抑制剂抑制了合酶到底物或辅因子的结合，并检测所获得的结合抑制。通常，方法是作为筛选分析进行的，其中抑制剂是用于分析的候选抑制剂，并且可以以各种合适的方式(包括固相免疫分析、荧光偏振分析等)来实现。
在另一个方面中，本发明提供了制备cGAMP的方法，所述方法包括在条件下形成包含cGAS、ATP和GTP的混合物，其中所述条件下合酶催化转换ATP和GTP到cGAMP，其中合酶、ATP和GTP是预定义量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。在具体实施方式中，混合物进一步包括DNA并且转化是DNA-依赖性的。
cGAS活性的病原性表达，尤其是作为过表达或突变的结果，与人类自身免疫性疾病相关；因此，本发明还提供了用于检测cGAS水平或突变的方法和分析，尤其是作为用于人类自身免疫性疾病的诊断工具。因此，在另一个方面中，本发明提供了检测cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变的方法，所述方法包括以下步骤：检测来自人的样品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变，并基于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变将所述的人分配一个自身免疫性疾病的度量；和任选地向所述的人施用用于自身免疫性疾病的治疗方法。
在另一个方面中，本发明提供了包含预定量的cGAMP的组合物，如进一步包含针对靶病原体的免疫原的疫苗，其中cGAMP提供了佐剂。在具体实施方式中，组合物基本上或实质上不含其它的环二核苷酸。本发明还提供了诱导或促进免疫应答的方法，所述方法包括向有需求的哺乳动物施用有效量的此类组合物。在具体实施方式中，给药是粘膜(舌下或鼻内)、肌内或皮下给药。
作为I型干扰素的强诱导物，cGAMP提供了合理的免疫佐剂。cGAMP可以用作疫苗佐剂，尤其是粘膜疫苗，并且可以与免疫原配制并形成环-二-GMP和c-二-AMP作为疫苗佐剂进行递送；参见，例如Pedersen等人，PLoS ONE,Nov 2011,6,11,e26973；Ebensen等人，Vaccine 29,2011,5210-5220；Chen等人，Vaccine 28,2010,3080-3085。实际上，cGAMP佐剂往往更有效，这是因为cGAMP比c-二-GMP在诱导干扰素方面更有效。
应当理解的是，本文所描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且考虑到其各种修改或改变都对本领域技术人员有暗示作用，它们均包括于本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。所有本文引用的出版物、专利和专利申请(包括其中引用的)通过引用以其整体出于所有目的并入本文。
实施例
实施例1.环-GMP-AMP在经胞质DNA的天然免疫信号中是内源性第二信使
对抗外源遗传因素的宿主防御是活有机体的最基本的功能之一。真核细胞感知细胞质中存在自身或外源DNA，作为异物侵入的危险信号或标志(1)。DNA可以经细菌或病毒感染、转染或在导致自身免疫性疾病如狼疮的某些病理条件下从核或线粒体中“泄漏”而被引入到细胞质内。在哺乳动物细胞中，胞质DNA触发I型干扰素(IFN)和通过内质网蛋白STING(也称为MITA、MPYS或ERIS)的其它细胞因子的产生(2)。STING招募并激活胞质激酶IKK和TBK1，其分别激活转录因子NF-κB和IRF3。然后NF-κB和IRF3进入细胞核并一起发挥作用以诱导IFN和其它细胞因子。DNA依赖性RNA聚合酶III已被证明是一种传感器，其检测和转录富含AT的DNA如聚[dA：dT]到能够刺激RIG-I途径的RNA配体以诱导IFN(3，4)。然而，大多数DNA序列不激活RNA聚合酶III-RIG-I途径。相反的，胞质DNA以序列独立性方式激活STING-依赖性途径。胞质DNA如何激活STING途径仍然难以理解。
本发明人假设DNA结合并激活假定的胞质DNA传感器，其然后直接或间接地激活STING，导致IRF3和NF-κB的激活。为了测试这一模型，本发明人使用鼠纤维肉瘤细胞系L929(已知其以STING依赖性方式诱导干扰素-β(IFNβ)(5))开发了体外互补分析。本发明人使用稳定表达抗STING的短发夹(sh)RNA的L929细胞系，使得DNA转染仅激活STING的上游因子(包括假定的DNA传感器)。用不同类型的DNA转染L929-shSTING细胞，然后将这些细胞的细胞质提取物与人单核细胞系THP1或鼠巨噬细胞系Raw264.7相混合，将其用产气荚膜梭菌素O(perfringolysin O)(PFO)透化。PFO处理在质膜上打孔(6)，允许细胞质扩散进出细胞，同时在细胞内保留了包括内质网(其包含STING)和高尔基体的细胞器(7)。如果在DNA转染的细胞中产生了STING的上游激活物，则预期包含这种激活子的细胞质在PFO-透化的细胞中激活STING，导致IRF3的磷酸化和二聚化。
转染有已知为干扰素刺激性DNA(ISD)、聚[dA：dT]、富含GC的50个碱基对的dsDNA(G：C50)、聚[dI：dC]或鲱鱼睾丸DNA(HT-DNA)的DNA序列的L929-shSTING细胞的细胞质提取物在透化的THP1细胞中激活IRF3，这表明此活性独立于DNA序列。
为了确定STING激活物是否是一种蛋白质，本发明人在95℃孵育细胞质提取物以变性大多数蛋白质，然后将“热的上清液”与透化的THP1细胞孵育。意外的是，来自于ISD或HT DNA转染的细胞的热的上清液引起了IRF3的二聚化。此活性抵抗Benzonase(其降解DNA和RNA)或蛋白酶K的处理。因此，STING激活物可能不是蛋白质、DNA或RNA。
为了测试DNA是否可以在体外刺激耐热的STING激活物的产生，本发明人将HT DNA与L929-shSTING细胞质提取物(S100)在存在ATP的情况下孵育。将反应混合物加热至95℃使蛋白质变性。引人注目的是，上清液与透化的Raw264.7细胞的孵育导致了IRF3的二聚化。这一活性依赖于添加DNA到细胞质提取物中。其它的DNA(包括聚[dA：dT]、聚[dG：dC]和ISD)也在L929-shSTING细胞质提取物中刺激了STING的产生，而聚[I：C]和单链RNA没有活性。用透化的THP1细胞获得了类似的结果。在透化的THP1细胞中敲降STING去除了经转染到L929细胞的DNA或添加到L929细胞质提取物的DNA所产生的耐热因子的IRF3的激活。对照实验表明，STING的敲降抑制了IRF3的激活以及在HT-DNA转染的THP1细胞中的IFNβ和TNFα的诱导，但经聚[I：C]转染或仙台病毒感染(已知其激活RIG-I途径)的IRF3的激活不受STING敲降的影响。本发明人还测试了数种细胞系的细胞质提取物产生耐热STING激活物的能力。将HT-DNA与来自原代MEF细胞、小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)和L929细胞的提取物孵育，导致产生了激活IRF3的耐热因子。来自THP1而不是HEK293T细胞的人类细胞提取物也能够产生这种STING激活物。这些结果与本发明人先前所发现的原代MEF、BMDM、L929和THP1细胞(而不是HEK293T细胞)具有STING依赖性、RNA聚合酶III非依赖性通路以诱导I型干扰素(3)相一致。
之后，本发明人使用多个层析步骤(包括STING-标签亲和纯化步骤)从L929细胞提取物中纯化耐热的STING激活物。先前的研究已经表明，细菌分子环-二-AMP和环-二-GMP结合到STING并诱导I型干扰素(8，9)。然而，使用微型(nano)液相色谱质谱(微型-LC-MS)，本发明人没有检测到与所预期的c-二-GMP([M+H]+＝691)或c-二-AMP([M+H]+＝659)相一致的MS或MS/MS谱。有趣的是，MS谱的深入研究揭示了具有675.1(z＝1+)和338.1(z＝2+)的质荷比(m/z)的两个离子，其存在于活性部分但不存在于背景谱中。这些m/z值(尽管质谱仪(LTQ)的低质量精度)相当于c-二-GMP和c-二-AMP的计算的平均m/z值(675＝[691+659]/2)。这一观察表明，所检测的离子是c-二-GMP和c-二-AMP的杂合体，即环-GMP-AMP(m/z＝675.107，z＝1+；m/z＝338.057，z＝2+)。这种离子的碰撞诱导解离(CID)碎片(m/z＝338.1，z＝2+)揭示了数个占优势的具有所预期的产物离子c-GMP-AMP(cGAMP)的m/z值的离子。重要的是，使用选择性反应监测(SRM)的定量质谱表明，来自C18柱的级分中代表cGAMP的离子丰度与其IRF3刺激活性很好地相关联。最近已在细菌弧菌(Vibro cholera)中鉴定了cGAMP并显示出在细菌趋化性和定植中发挥作用(10)。然而，尚未报道cGAMP在真核细胞中存在或具有功能。
为了验证耐热STING激活物的身份，本发明人使用了高分辨率高精度质谱仪(QExactive,Thermo)来进行微型-LC-MS分析。细胞衍生的STING激活物具有675.107(z＝1+)和338.057(z＝2+)的m/z，其精确匹配cGAMP的理论值。为了进一步表征cGAMP的结构和功能，本发明人开发了十步的单烧瓶方案以化学合成cGAMP。细胞衍生的STING激活物的MS/MS谱与化学合成的cGAMP的谱相同。这些结果证实L929细胞产生cGAMP。
定量RT-PCR和ELISA分析表明，化学合成的cGAMP在引入到细胞后在L929细胞中诱导IFNβRNA和蛋白质。滴定实验表明，即使浓度低至10nM，cGAMP也强烈地诱导IFNβRNA。实际上，基于ELISA分析，cGAMP在诱导IFNβ方面比c-二-GMP更强。cGAMP还在激活IRF3方面比c-二-GMP和c-二-AMP更强。为了确定L929提取物是否包含可以合成其它类型的能激活IRF3的二-核苷酸或寡核苷酸的酶，本发明人以不同组合测试了所有四种核糖核苷酸。ATP和GTP都是支持IRF3的激活物的合成所必要且充分的，这进一步支持了L929包含从ATP和GTP合成cGAMP的酶。
为了确定DNA病毒感染是否导致细胞中cGAMP的产生，本发明人用缺少ICP 34.5(已知在受感染的细胞中拮抗干扰素产生的病毒蛋白(11))的HSV-1感染L929细胞。如DNA转染一样，HSV-1ΔICP34.5感染导致L929细胞中IRF3的激活。来自转染DNA或感染病毒的细胞的细胞提取物包含可以在透化的Raw264.7细胞中激活IRF3的耐热因子。作为对照，本发明人用水泡性口炎病毒株VSV-ΔM51-GFP(已知通过RIG-I通路引发强干扰素产生的RNA病毒(12，13))感染L929细胞。与HSV-1相比，VSV感染的细胞在相同的体外分析中不包含耐热IRF3激活物，尽管VSV感染确实在L929细胞中诱导IRF3的激活。通过反相HPLC富集并使用SRM通过微型-LC-MS定量HSV-1感染细胞中的耐热因子。DNA转染的或HSV-1感染的细胞(而不是模拟处理的或VSV感染的细胞)产生了升高水平的cGAMP。动力学实验表明，DNA转染到L929细胞后，在IRF3二聚化之前产生cGAMP且可以检测到IFNβ诱导。为了测试DNA病毒是否可以在人细胞中诱导cGAMP产生，本发明人用HSV1或牛痘病毒(VACV)感染THP1细胞。两种病毒都在细胞中诱导了IRF3的二聚化。重要的是，这两种病毒也都引发了激活IRF3的cGAMP的产生。总之，这些结果表明，在人和小鼠细胞中的DNA转染和DNA病毒感染产生了cGAMP，其导致IRF3激活。
为了确定cGAMP是否通过STING激活IRF3，本发明人进行了三组实验。首先，本发明人建立了稳定表达STING的HEK293T细胞系，用cGAMP刺激这些细胞，然后通过定量RT-PCR测量IFNβ的诱导。HEK293T细胞不响应cGAMP，这可能是由于在这些细胞中缺乏STING表达或STING表达水平非常低。HEK293T细胞中STING的表达使得产生经cGAMP的高水平的IFNβ的诱导。然而，DNA未刺激HEK293T/STING细胞以诱导IFNβ，这与HEK293T细胞缺少产生对DNA刺激的响应的cGAMP相一致。相比之下，L929细胞诱导响应经cGAMP或DNA的刺激的IFNβ。HSV-1感染在L929中诱导IRF3二聚化，而HEK293T或HEK29T/STING细胞则没有，这表明cGAMP的产生对HSV-1在细胞中激活IRF3是重要的。实际上，来自HSV-1感染的L929(而不是来自HEK293T或HEK293T/STING细胞)的提取物包含导致在透化的Raw264.7细胞中的IRF3二聚化的cGAMP活性。这些结果表明，在HEK293T细胞中STING的表达赋予细胞响应cGAMP以激活IRF3并诱导IFNβ的能力，但不足以建立对DNA或DNA病毒响应，这是由于HEK293T细胞在合成cGAMP方面存在缺陷。
其次，本发明人测试了L929和L929-shSTING细胞对cGAMP的响应。与ISD和c-二-GMP类似，cGAMP诱导的IRF3二聚化依赖于STING。相比之下，聚[I：C]在不存在STING的情况下仍诱导IRF3的二聚化。这些结果证明，对于cGAMP激活IRF3而言，STING是必要的。
最后，本发明人检查了STING是否直接结合cGAMP。从大肠杆菌中表达并纯化包含残基139-379的重组STING蛋白(已证明其结合c-二-GMP(14))，然后用32P-cGAMP孵育，随后进行UV诱导的交联。当STING和32P-cGAMP都存在时，检测到对应于交联的STING-cGAMP复合体的放射性同位素示踪带。高浓度的ATP或GTP未竞争STING-cGAMP复合体的形成。相比之下，此条带的强度随竞争的冷cGAMP、c-二-GMP或c-二-AMP浓度的增加而下降，这表明STING上的cGAMP结合位点与和c-二-GMP以及c-二-AMP相互作用的结合位点相重叠。实际上，最近表明参与STING到c-二-GMP的结合(14)中的数个残基的突变(包括S161Y、Y240S和N242A)也削弱了STING到cGAMP的结合。总之，这些结果证明，cGAMP是结合并激活STING的配体。
已经显示环二核苷酸的功能为调节多种生理过程(包括细菌运动性和生物膜形成)的细菌第二信使(15)。最近的报告显示，C-二-GMP在原生动物网柄菌(Dictyostelium)中产生，其功能是作为形态发生素以诱导柄细胞的分化(16)。在此实例中，本发明人鉴定了cGAMP是后生动物中的第一环二核苷酸。此外，本发明人示出了cGAMP是I型干扰素的诱导物。cGAMP的作用类似于cAMP(其是研究最多的第二信使(17))的作用。如cAMP一样(当腺苷酸环化酶被上游配体激活时，由腺苷酸环化酶合成)，cGAMP由响应DNA配体刺激的环化酶合成(18)。cAMP结合并激活蛋白激酶A和其它效应物分子。类似地，cGAMP结合并激活STING以引发下游信号级联。作为哺乳动物细胞中的内源性分子，cGAMP可用于免疫治疗方法或作为疫苗佐剂。
参考文献和注释
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实施例2.环GMP-AMP合酶是激活I型干扰素途径的细胞质DNA传感器
在DNA被证明是遗传物质很久之前，已知DNA刺激免疫应答，但DNA作为免疫刺激物的功能的机制仍知之甚少(1)。虽然在树突细胞中DNA可通过结合内涵体中的Toll-样受体9(TLR9)来刺激I型干扰素的产生，但在细胞质中DNA如何诱导IFN仍不清楚。具体而言，在干扰素途径中检测细胞质DNA的传感器仍然难以捉摸(2)。虽然数种蛋白质(包括DAI、RNA聚合酶III、IFI16、DDX41和若干其它的DNA解链酶)已暗示具有作为潜在的诱导IFN的DNA传感器的功能，但还均未得到普遍认可(3)。
环GMP-AMP合酶(cGAS)的纯化和鉴定。本发明人示出，递送DNA到哺乳动物细胞或细胞质提取物引发了环GMP-AMP(cGAMP)的产生，其结合并激活STING，导致IRF3的激活和IFNβ的诱导(4)。为了鉴定cGAMP合酶(cGAS)，本发明人从鼠纤维肉瘤细胞系L929中分离出包含cGAMP合成活性的细胞质提取物(S100)。在存在鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)的情况下，通过将柱级分与ATP和GTP孵育来分析这一活性。用Benzonase消化DNA并95℃加热以变性蛋白之后，将包含cGAMP的耐热上清液与产气荚膜梭菌素O(PFO)-透化的Raw264.7细胞(转化的小鼠巨噬细胞)孵育。通过非变性凝胶电泳分析这些细胞中cGAMP诱导的IRF3二聚化(4)。通过使用这种分析，本发明人进行了三个独立路线的纯化，各个路线由四个步骤的色谱组成，但差别在于所使用的柱或柱的顺序。具体而言，第三路线包括使用生物素化的DNA寡聚物(已知作为免疫刺激DNA或ISD的45-bp DNA)的亲和纯化步骤。本发明人估计发明人获得一系列8000-15000倍的纯化和来自于这些分离路线的活性的2-5％的回收率。然而，在各个纯化路线的最后步骤中，级分的银染并未揭示与cGAS活性共纯化的清晰的蛋白条带，这表明假定的cGAS蛋白的丰度可能在L929细胞质提取物中是非常低的。
本发明人开发了一种定量质谱策略以鉴定各个纯化路线的最后步骤中与cGAS活性共纯化的一系列蛋白。本发明人有理由认为，在所有三个纯化路线中假定的cGAS蛋白必须与其活性共纯化，而大多数“污染”蛋白则不会。因此，从各个纯化路线的最后步骤中，本发明人选择了包含大部分cGAS活性的级分(峰级分)和包含非常弱或没活性的相邻的级分。通过SDS-PAGE分离各个级分中的蛋白质并用微型液相色谱质谱(微型-LC-MS)进行鉴定。通过使用MaxQuant软件的无标记定量来分析数据(5)。值得注意的是，虽然在一个或两个纯化路线中，许多蛋白质与cGAS活性共纯化，但在所有三个路线中仅有三种蛋白质共纯化。这三个都是假定的未鉴定蛋白：E330016A19(登记号#：NP_775562)、具有包含双PH结构域的蛋白2的Arf-GAP(NP_742145)和信号识别颗粒9kDa蛋白(NP_036188)。在这些之中，在E330016A19中鉴定了超过24个独特的多肽，代表了在此507个氨基酸的蛋白中41％的覆盖率。
生物信息学分析驱使本发明人关注E330016A19，其表现出对于寡腺苷酸合酶(OAS1)的催化结构域的结构和序列同源性。具体而言，E330016A19包含保守的[G[G/S]x9-13[E/D]h[E/D]h基序，其中x9-13表示由任意氨基酸组成的9-13个侧翼残基，h表示疏水氨基酸。这一基序被发现于核苷酸转移酶(NTase)家族(6)。除OAS1之外，这一家族包括腺苷酸环化酶、聚[A]聚合酶和DNA聚合酶。E330016A19的C末端包含雄性异常21(Mab21)结构域(其首次在线虫(C.elegans)蛋白Mab21中被鉴定(7))。序列比对揭示了C-末端的NTase和Mab21结构域从斑马鱼到人类都是高度保守的，而N末端序列的保守性小得多(8)。有趣的是，E330016A19的人同源物C6orf150(也被称为MB21D1)最近被鉴定为在筛选其过表达抑制病毒复制的干扰素刺激的基因(ISG)的数个阳性命中之一(9)。为了澄清并基于本文所提出的证据，本发明人提出将小鼠蛋白E330016A19命名为m-cGAS，并且将人同源物C6orf150命名为h-cGAS。定量RT-PCR示出m-cGAS的表达在永生MEF细胞中是低的，但在L929、Raw264.7和骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中是高的。类似地，h-cGAS RNA的表达在HEK293T细胞中是非常低的，但在人单核细胞系THP1中是高的。免疫印迹进一步证实，h-cGAS蛋白在THP1中表达但不在HEK293T细胞中表达。因此，不同细胞系中的m-cGAS和h-cGAS的表达水平与这些细胞响应细胞质DNA产生cGAMP和诱导IFNβ的能力相关(4，10)。
cGAS催化触发I型干扰素的产生。在HEK293T(其缺少STING表达)中的m-cGAS的过表达不诱导IFNβ，而在HEK293T细胞中STING的稳定表达使得这些细胞高度有能力经m-cGAS诱导IFNβ。重要的是，假定的催化残基G198和S199点突变至丙氨酸去除了m-cGAS诱导IFNβ的能力。这些突变以及其它的假定的催化残基E211和D213突变至丙氨酸，也去除了HEK293T-STING细胞中的m-cGAS诱导IRF3二聚化的能力。由c-GAS诱导的IFNβ的幅度与由MAVS(衔接蛋白，其在RNA传感器RIG-I的下游起作用)诱导的相当，且比其它假定的DNA传感器(包括DAI、IFI16和DDX41)诱导的高数个数量级。为了确定cGAS和其它假定的DNA传感器的过表达是否导致细胞中cGAMP的产生，将来自经热处理的细胞提取物的上清液与PFO-透化的Raw264.7细胞进行孵育，然后测量IRF3的二聚化。在HEK293T-STING细胞中表达的所有蛋白质中，仅有cGAS能在细胞中产生cGAMP活性。
为了测试cGAS是否能在体外合成cGAMP，本发明人纯化了野生型(WT)和来自转染的HEK293T细胞的突变体Flag-cGAS蛋白。WT m-cGAS和h-cGAS(而不是cGAS的无催化活性的突变体)能产生cGAMP活性，其在透化的Raw264.7细胞中刺激IRF3二聚化。重要的是，m-cGAS和h-cGAS的体外活性都依赖于HT-DNA的存在。为了测试DNA是否在细胞中增强经cGAS的IFNβ诱导，将带有或不带有HT-DNA的不同数量的cGAS表达质粒转染进HEK293T-STING细胞。经低剂量(10和50ng)的cGAS质粒，HT-DNA显著地增强了IFNβ的诱导，而高剂量(200ng)则没有。相比于cGAS，IFI16和DDX41即使与HT-DNA共转染，也不诱导IFNβ。
IFNβ经DNA转染和DNA病毒感染的诱导需要cGAS。本发明人使用了两对不同的siRNA以在L929细胞中敲降m-cGAS，并且发现两种siRNA寡核苷酸均显著地抑制了经HT-DNA的IFNβ诱导，且抑制的程度与敲降m-cGAS RNA的效率相关。本发明人还建立了两个稳定表达靶向于m-cGAS的不同区域的shRNA序列的L929细胞系。相比于表达对照shRNA(GFP)的另一种细胞系，这些细胞响应HT-DNA以诱导IFNβ能力严重受损。重要的是，在L929-sh-cGAS细胞中cGAS的表达恢复了IFNβ的诱导。在L929-sh-cGAS细胞中STING或MAVS的表达或递送cGAMP至这些细胞也诱导IFNβ。相比之下，在L929-shSTING细胞中cGAS的表达或cGAMP的递送不能诱导IFNβ，而在这些细胞中STING或MAVS的表达恢复了IFNβ的诱导。定量RT-PCR分析证实了在稳定表达相应shRNA的L929细胞系中敲降cGAS和STING的特异性和效率。这些结果表明，cGAS在STING的上游起作用且是IFNβ经细胞质DNA的诱导所需要的。
单纯性疱疹病毒1型(HSV-1)是已知的通过STING和IRF3的激活诱导IFN的DNA病毒。重要的是，抗m-cGAS(而不是GFP)的shRNA在L929细胞中强烈抑制由HSV-1感染诱导的IRF3二聚化。相比之下，cGAS的敲降不影响IRF3经仙台病毒(一种RNA病毒)的激活。为了确定在细胞中cGAMP的产生是否需要cGAS，本发明人将HT-DNA转染进L929-shGFP和L929-sh-cGAS或用HSV-1感染这些细胞，然后制备包含cGAMP的耐热级分，其随后递送到透化的Raw264.7细胞中以测量IRF3的激活。cGAS的敲降在很大程度上去除了由DNA转染或HSV-1感染所产生的cGAMP活性。使用选择性反应监测(SRM)的定量质谱表明，由DNA转染或HSV-1感染诱导的cGAMP的丰度在缺少cGAS的L929细胞中显著地降低。总之，这些结果证实，cGAS对于产生cGAMP并响应DNA转染或HSV-1感染激活IRF3而言是必要的。
为了确定在人类细胞中的DNA传感通路中cGAS是否是重要的，本发明人建立了稳定表达靶向于h-cGAS的shRNA的THP1细胞系。h-cGAS的敲降强烈抑制了经HT-DNA转染的或经牛痘病毒(另一种DNA病毒，而不是仙台病毒)感染的IFNβ诱导。h-cGAS的敲降也在THP1细胞中抑制了由HSV-1感染诱导的IRF3二聚化。这一结果进一步在另一个表达靶向于h-cGAS的不同区域的shRNA的THP1细胞系中得到证实。多个cGAS的shRNA序列在小鼠和人细胞系中抑制DNA诱导的IRF3激活和IFNβ诱导的强且特异性的作用证明了cGAS在STING依赖的DNA传感通路中的关键作用。
重组cGAS蛋白以DNA依赖的方式从ATP和GTP催化合成cGAMP。为了测试cGAS是否足以催化cGAMP的合成，本发明人在HEK293T细胞中表达了Flag标记的h-cGAS并将其纯化至表观同质性。在HT-DNA存在的情况下，纯化的c-GAS蛋白催化产生cGAMP活性，其在透化的Raw264.7细胞中刺激IRF3二聚化。DNase-I处理去除了此活性。通过其它的DNA(包括聚(dA：dT)、聚(dG：dC)和ISD，而没有RNA聚(I：C))也能刺激cGAS活性。经cGAS的cGAMP合成需要ATP和GTP，但不需要CTP或UTP。这些结果表明，纯化的cGAS蛋白质的环化酶活性被DNA刺激，而不是RNA。
本发明人还在大肠杆菌中表达m-cGAS作为SUMO融合蛋白。纯化后，sumo-m-cGAS以DNA依赖的方式产生cGAMP活性。然而，经Sumo蛋白酶去除SUMO标记之后，m-cGAS蛋白以非DNA依赖的方式催化cGAMP的合成。这一缺少DNA依赖性的原因尚不清楚，但可能是由于在sumo去除后的一些构象变化。滴定实验示出，小于1nM的重组cGAS蛋白导致了可检测的IRF3的二聚化，而cGAS的无催化活性的突变体即使在高浓度也不能激活IRF3。为了正式地证明了cGAS催化cGAMP的合成，用SRM通过微型-LC-MS分析反应产物。在包含纯化的cGAS、ATP和GTP的60分钟反应中检测到了cGAMP。cGAMP的身份进一步通过使用碰撞诱导解离(CID)的离子碎裂来确认。由纯化的cGAS合成的cGAMP的片段化方式揭示了m/z值与那些化学合成的cGAMP相匹配的产物离子。总之，这些结果证实，纯化的cGAS催化从ATP和GTP的cGAMP的合成。
cGAS结合DNA。经DNA的cGAS活性的刺激表明c-GAS是DNA传感器。实际上，GST-m-cGAS和GST-h-cGAS(而不是GST-RIG-I的N末端[RIG-I(N)]都被生物素化的ISD所沉淀。相比之下，生物素化的RNA不结合cGAS。缺失分析显示包含残基1-212的h-cGAS的N-末端片段(而不是C-末端片段213-522)结合ISD。包含残基161-522的较长的C端片段结合ISD，这表明序列161-212可能对于DNA的结合是重要的。然而，来自h-cGAS的残基161-212的缺失并未显著地损害ISD的结合，这表明cGAS在N-末端包含另一个DNA结合结构域。实际上，包含残基1-160的N末端片段也结合ISD。因此，cGAS可以在N-末端包含两个单独的DNA结合结构域。然而，清楚地，包含残基1-212的h-cGAS的N-末端是结合DNA所必要且充分的。
在HEK293T-STING细胞中过表达h-cGAS的不同的缺失突变体以确定其激活IRF3和诱导IFNβ和细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)的能力。蛋白片段1-382(其缺乏包括Mab21结构域的大部分残基的C-末端的140个残基)不能诱导IFNβ或TNFα或激活IRF3，这表明完整的Mab21结构域对于cGAS功能是重要的。如所预期的，N-末端212残基(片段213-522)(其包括NTase结构域的一部分)的缺失去除了cGAS活性。催化残基之前的NTase折叠的第一螺旋内的仅仅4个氨基酸(KLKL，Δ171-174)的内部缺失也摧毁了cGAS的活性。有趣的是，N-末端160个残基的缺失并不影响IRF3的激活或经cGAS的细胞因子诱导。体外分析表明，此蛋白片段(161-522)仍以DNA依赖的方式激活IRF3通路。因此，h-cGAS的N-末端160个氨基酸(其一级序列在进化上并非高度保守)似乎对于DNA的结合和经cGAS的催化是高度可有可无的。相比之下，NTase和Mab21结构域对于cGAS活性是重要的。
cGAS主要定位于细胞质中。为了确定cGAS是否是细胞质DNA传感器，本发明人从THP1细胞制备了细胞质和细胞核的提取物并通过免疫印迹分析了内源性h-cGAS的定位。在细胞质提取物中检测到了h-cGAS，而在细胞核提取物中几乎未检测到。将THP1提取物进一步进行差速离心以将各个亚细胞器相互分离并从细胞质中分离。在S100和P100(在100,000×g离心后的沉淀)中检测到相似量的h-cGAS，这表明此蛋白在细胞质中是可溶的，但该蛋白的显著级分与轻(light)囊泡或细胞器相关。在P5(其包含线粒体和ER，分别由存在VDAC和STING证明)中未检测到cGAS蛋白。也未在P20(其主要包含ER和重囊泡)中检测到cGAS。
本发明人还使用稳定表达Flag-m-cGAS的L929细胞通过共聚焦免疫荧光显微镜检查了cGAS的定位。cGAS蛋白分布于整个细胞质中，但也可以在细胞核内或细胞核周围区域观察到。有趣的是，在细胞用Cy3标记的ISD转染2或4小时后，观察到cGAS的点状形式且其与DNA荧光相重叠。在多于50％的所观察的细胞中都观察到了此类cGAS和Cy3-ISD的共定位和表观聚集。这些结果以及cGAS与DNA直接结合的生化证据表明了cGAS在细胞质中结合DNA。
讨论。在此实例中，本发明人开发了一种策略，其结合定量质谱与常规的蛋白纯化以鉴定从粗细胞提取物中部分纯化的生物活性蛋白。这一策略普遍适用于因丰度非常低、活性不稳定或起始物质稀少而难以被纯化至均质的蛋白质。作为原则的证明，本发明人使用这一策略来鉴定小鼠蛋白E330016A19作为合成cGAMP的酶。这一发现导致鉴定出cGAS的一个大家族，其从鱼类至人类中都是保守的，这正式地证明了脊椎动物包含进化保守的合成环二核苷酸的酶，而其之前仅发现于细菌、古细菌和原生动物中(11-13)。霍乱弧菌能通过其环化酶DncV(VC0179)合成cGAMP，其包含NTase结构域，但与哺乳动物cGAS缺少显著的一级序列同源性(12)。
本发明人的结果不仅证明了cGAS是触发I型干扰素通路的细胞质DNA传感器，同时也揭示了一种免疫信号的新机制，其中cGAS产生第二信使cGAMP，其结合并激活STING(4)，从而引发I型干扰素的产生。发现cGAS是细胞质DNA传感器极大地扩展了宿主免疫系统所检测到的微生物库。原则上，所有能携带DNA进入宿主细胞质中的微生物，如DNA病毒、细菌、寄生虫(例如疟疾)和逆转录病毒(例如HIV)都可以触发cGAS-STING通路(14，15)。经cGAS的cGAMP的酶促合成为稳健且灵敏的免疫应答提供了一种信号放大的机制。然而，经cGAS的宿主细胞质中的自身DNA的检测也可导致自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、综合征和Aicardi-Goutières综合征(16-18)。
已报道了数个其它的DNA传感器如DAI、IFI16和DDX41诱导I型干扰素(19-21)。DAI、IFI16或DDX41的过表达并未导致cGAMP的产生。本发明人还发现，经siRNA敲降DDX41和p204(IFI16的小鼠同源物)在HT-DNA转染的L929细胞中并不抑制cGAMP活性的产生。与其它假定的DNA传感器和大多数模式识别受体(例如TLR)不同，cGAS是能接受经小分子化合物抑制的环化酶，其为治疗人类自身免疫性疾病提供了治疗剂。
参考文献和注释
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22.人类和小鼠的cGAS序列的GenBank登录号是KC294566和KC294567。
实施例3.包含混合的磷酸二酯键的环GMP-AMP是STING的内源高亲和性配体
微生物感染的天然免疫传感是由种系编码的模式识别受体所介导的，其包括膜蛋白如Toll样受体(TLR)和细胞质蛋白如NOD样受体(NLR)和RIG-I样受体(RLR)(Iwasaki和Medzhitov,2010；Ronald和Beutler,2010；Takeuchi和Akira,2010)。由于几乎所有的感染性微生物在其生命周期中均包含并需要核酸，天然免疫系统已演化以识别微生物DNA和RNA来作为宿主防御的核心策略。具体地，数个TLR在内涵体膜上定位，以检测内涵体内腔中的RNA或DNA，而RLR负责检测细胞质中的病毒和细菌RNA。
已知DNA是免疫刺激分子已一个多世纪，但至今DNA如何激活宿主免疫系统还未被广泛研究(O'Neill,2013)。通过TLR9检测内涵体中的DNA，其将引发I型干扰素和炎性细胞因子的产生。当微生物或宿主DNA递送到细胞质时，其也可以通过内质网膜蛋白STING(也称为MITA、ERIS或MPYS)诱导I型干扰素(Barber,2011)。STING的功能为募集并激活蛋白激酶IKK和TBK1的衔接蛋白，所述激酶依次又激活转录因子NF-κB和IRF3以诱导干扰素和其它细胞因子。
本发明人最近鉴定了环GMP-AMP合酶(cGAS)为激活STING的DNA传感器(Sun等人，2013；Wu等人，2013)。具体地，本发明人发现cGAS在DNA存在的情况下催化从ATP和GTP到环GMP-AMP(cGAMP)的合成。然后cGAMP发挥结合并激活STING的第二信使的作用。虽然这些研究清楚地证实，cGAMP是哺乳动物细胞中经cGAS产生的内源性第二信使，cGAMP中GMP和AMP之间的内部磷酸二酯键的确切性质部分并未确定，这部分是由于单独的质谱无法在没有所有cGAMP异构体作为标准参考可用的情况下明确地区分开这些键。尽管化学合成的包含同质的3'-5'键的cGAMP能诱导IFNβ，但仍然可能的是，包含其它磷酸二酯键的cGAMP也可能激活STING通路。
在这一研究中，本发明人进一步通过化学和生物物理学技术的组合来研究cGAMP的结构。本发明人发现，由cGAS产生的cGAMP在GMP的2'-OH和AMP的5'-磷酸之间包含磷酸二酯键且在AMP的3'-OH和GMP的5'-磷酸之间包含另一个磷酸二酯键。本发明人进一步发现，这一分子(本文中称为2'3'-cGAMP)在哺乳动物细胞中产生，以响应细胞质中的DNA。此外，本发明人证明了2'3'-cGAMP以高亲和力结合STING并且是干扰素β(IFNβ)的强诱导物。本发明人还解析了结合到cGAS产物的STING的晶体结构并观察到2'3'-cGAMP和STING之间的广泛的相互作用，其为它们的特异性和高亲和结合提供了结构基础。重要的是，STING-cGAMP复合体的结构揭示了在STING激活时，此天然配体诱导了STING中的构象重排。
cGAS的产物是包含混合的磷酸二酯键的环GMP-AMP
已知在核苷酸之间天然存在着2'-5'和3'-5'磷酸二酯键，而2'-5'键则不常见。由cGAS产生的天然cGAMP的内部磷酸二酯键仍有待确定。因此，本发明人化学合成了包含所有四种可能的磷酸二酯键的cGAMP分子(表S1)。使用修改自已出版方法(Gaffney等人,2010；Zhang等人,2006)的方法进行cGAMP同种型的化学合成。简明起见，本发明人按形成磷酸二酯键的GMP的OH位置接AMP的OH位置来命名这些cGAMP分子；例如，2'3'-cGAMP包含在GMP的2'-OH和AMP的5'-磷酸之间的磷酸二酯键和在AMP的3'-OH和GMP的5'-磷酸之间的另一个磷酸二酯键。本发明人还使用纯化的cGAS蛋白在DNA存在的情况下从ATP和GTP酶促合成天然的cGAMP(Sun等人，2013)。通过核磁共振(NMR)谱分析纯化的cGAS产物和合成的cGAMP异构体。引人注意的是，cGAS产物的1H NMR谱与合成的2'3'-cGAMP的1H NMR谱相同，但与其它cGAMP异构体不同。具体而言，异头质子(H1')与具有3'-磷酸的单峰，和具有2'-磷酸的双峰。一致的是，仅有2',3'-cGAMP的磷酸盐具有与天然cGAMP的磷酸盐相同的31P NMR化学位移。本发明人还使用Q-Exactive(具有高分辨率和质量准确度的仪器)进行了天然的和合成的cGAMP的质谱分析。每个单电荷分子的总质量([M+H]+)是675.107，其精确匹配了cGAMP的理论质量。cGAS产物(使用较高能量碰撞解离(HCD)使其片段化)的串联质谱(MS/MS)与合成的2'3'-cGAMP的串联质谱相同，与2'2'-cGAMP和3'3'-cGAMP的串联质谱相似但不相同。3'2'-cGAMP的MS/MS谱似乎与2'3'-cGAMP和cGAS产物的谱最为不同。反相HPLC分析表明，天然cGAMP与2'3'-cGAMP共洗脱，但不与其它cGAMP分子共洗脱。本发明人还通过圆二色谱(CD)确定了cGAS产物的构象，证实了其衍生自D-核糖。天然的cGAMP的CD谱与2'3'-cGAMP的CD谱很好地重叠。近-UV CD谱表明，4个cGAMP采用了显著不同的构象，2'3'-cGAMP和2'2'-cGAMP形成的CD条带图案与3'2'-cGAMP和3'3'-cGAMP所形成的不同。总之，这些结果提供了cGAS在体外合成2'3'-cGAMP的明确证据。
在DNA转染的细胞中产生的内源性cGAMP包含混合的磷酸二酯键
为了测试哺乳动物细胞是否能够产生包含混合的磷酸二酯键的内源性cGAMP，本发明人用鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)转染了小鼠细胞系L929和人单核细胞THP1，然后将细胞裂解物在95℃加热以变性蛋白，并制备上清液以通过质谱分析内源性cGAMP(Wu等人，2013)。来自两种细胞系的内源性分子的MS/MS谱与cGAS产物和2'3'-cGAMP的MS/MS谱相同，这表明内源性第二信使是2'3'-cGAMP。
2'3'-cGAMP是STING的高亲和性配体
本发明人进行了等温滴定量热法实验以测量STING结合到天然的和合成的cGAMP的亲和力(Kd)。在大肠杆菌中表达包含人类STING(其在之前被被证明介导与细菌第二信使环二-GMP的结合(Burdette等人,2011；Huang等人,2012；Ouyang等人,2012；Shang等人,2012；Shu等人,2012；Yin等人,2012))的残基139-379的C端结构域(CTD)并纯化至表观同质性，以用于ITC实验。与之前的报道一致，本发明人发现，c-二-GMP以1.21μM的Kd结合STING。有趣的是，天然的cGAMP和合成的2'3'-cGAMP均以如此高的亲和力结合STING，使得曲线拟合是困难的。此外，与c-二-GMP的结合(其是一个放热过程)不同，天然的cGAMP和2'3'-cGAMP与STING的结合是吸热的，这表明能量可能用于STING的构象变化(见下文)。为了获得天然的和合成的2'3'-cGAMP对STING的Kd，本发明人滴定了不同量的此类化合物，以作为进入STING-c-二-GMP复合体的竞争物。这些测量获得的cGAS产物的Kd为4.59nM，2'3'-cGAMP的Kd为3.79nM。对3'2'-cGAMP也进行了竞争实验，这是由于其与STING的结合产生了小的热量变化。这一化合物以1.61μM的Kd结合STING。将2'2'-cGAMP和3'3'-cGAMP直接滴定至STING并计算Kd值分别为287nM和1.04μM。因此，2'3'-cGAMP的Kd比c-二-GMP、3'2'-cGAMP和3'3'-cGAMP低约300倍，比2'2'-cGAMP低约75倍。
cGAMP是I型干扰素的强诱导物
本发明人递送了不同量的cGAMP异构体以及c-二-GMP进L929细胞并通过q-RT-PCR测量IFNβ的诱导。cGAMP分子诱导IFNβ的EC50的范围是从15nM至42nM，而c-二-GMP具有大于500nM的EC50。因此，似乎不同的环二核苷酸的结合亲和性在基于细胞的分析中不能与其EC50具有很好的相关性。这一点的原因并不明确，但可能的是，不同的化合物在细胞中具有不同的稳定性或分布。无论如何，这些实验提供了直接的证据表明，cGAS产物、2'3'-cGAMP是STING在细胞中的高亲和性配体(Kd：～4nM)且是IFNβ的强诱导物(EC50：～20nM)。
STING-cGAMP复合体的晶体结构揭示了STING的配体诱导的构象重排
本发明人以C2空间群共结晶了STING的C末端结构域(CTD)(残基139-379)与纯化的cGAS产物。使用apo-STING结构(PDB代码：4F9E)作为搜索模型通过分子置换解析复合体的结构并精化(refined)到的分辨率(表M1)。在晶体不对称单位中存在一个STING原聚体，其与另一个以晶体二重对称(crystallographic two-fold symmetry)相关联的原聚体形成蝴蝶状二聚体。结合的cGAMP分子位于二重轴上(详见下文)。STING的有序区域(从Asn152至Glu336)采用了类似于apo-STING的整体结构，其特点在于被4个α螺旋包围着中心扭曲β折叠。然而，与cGAMP复合的STING在单体结构和二聚体排列中显示出与apo-STING具有数个显著的差异。与apo-二聚体相比，复合体结构的二聚体中的2个原聚体相对于cGAMP结合位点实质上进行了向内旋转。这一更紧密的排列在2个原聚体之间产生了更深的口袋以接纳cGAMP。此外，cGAMP结合位点被4股反平行β折叠的盖和由2个原聚体中的每一个的残基219-249所形成的连接环所覆盖。相比之下，apo-结构中的这一区段很大程度上是无序的(Ouyang等人,2012；Yin等人,2012)。β片层的形成不归因于晶体包装(crystallographicpacking)。在盖内的域间相互作用涉及数对极性接触：在Tyr245的侧基和Gly234的主链羰基氧原子之间，在Ser243的侧基和Lys236的主链酰胺氮原子之间以及在Asp237和Lys224的侧基之间。
2'3'-cGAMP和STING之间的广泛的相互作用是其特异性和高亲和性结合的基础
由于晶体二重轴穿过不对称的2'3'-cGAMP分子，cGAMP必须采用与二重对称性相关的两个取向。这与下述事实一致，STING二聚体中的2个原聚体预期具有相同的与鸟苷(guanidine)或腺苷部分相互作用的概率。因此，本发明人为cGAMP和数个周边氨基酸残基分配了2个具有0.5占据(occupancy)的可选构象。精细结构的模拟退火省略图显示了cGAMP的合适(decent)密度。2'3'-cGAMP(而不是其它的亚型)很好地匹配电子密度图。与结合STING的c-二-GMP相比，cGAMP在STING二聚交界之间的缝隙中深了约此外，蝴蝶的两翼在STING：cGAMP结构中相互近了约这是由于2个STING原聚体的排列更接近。cGAMP结合口袋的进一步分析表明cGAMP很好地受广泛的极性和疏水相互作用协调。cGAMP嘌呤碱基的环堆积于4个周围的芳香族残基(2个原聚体中的每一个的Tyr240和Tyr167)。值得注意的是，cGAMP的2个α-磷酸基团从2个原聚体接触Arg238以及从1个原聚体接触Arg232。GMP的游离3'-OH指向来自口袋下部的2个Ser162残基。鸟嘌呤碱基直接与Glu260和Thr263的侧基以及Val239的主链羰基氧相互作用。这些独特的极性接触解释了为什么2'3'-cGAMP是STING的特异性和高亲和性配体。此外，来自β-折叠的残基(Arg232、Arg238、Val239，其参与cGAMP结合)有可能控制盖的形成及STING的进一步激活。
STING的精氨酸232对于细胞质DNA信号通路是重要的
结合环-二-GMP的STING的晶体结构的三个先前的报道中使用了稀有的人类变体(用组氨酸替换Arg232)(Ouyang等人,2012；Shu等人,2012；Yin等人,2012)。来自人类群体的DNA的广泛测序表明，Arg232等位基因是普遍的，因此，应考虑为野生型STING(Jin等人，2011)。STING的H232变体的使用可以解释在这些研究中为什么c-二-GMP不诱导STING的显著构象变化(Ouyang等人，2011；Shu等人，2011；Yin等人，2012)。先前的报道显示，小鼠STING的Arg231(相当于人类STING的Arg232)到丙氨酸的突变去除了经环-二-GMP(而不是DNA)的IFNβ诱导(Burdette等人，2011)。然而，基于本发明人的STING-cGAMP复合体的晶体结构，Arg232到组氨酸的突变预期显著减弱了cGAMP的结合和经STING的下游信号，Arg232到丙氨酸的突变应该更加不利。因此，本发明人在两组实验中研究了STING的Arg232的功能。首先，本发明人通过RNAi敲降了L929细胞中的内源性STING并用人类STING的WT、R232A或R232H将其取代。用HT-DNA转染或用2'3'-cGAMP处理这些稳定的细胞系，然后通过q-RT-PCR测量IFNβ。表达WT STING的细胞能够响应DNA或cGAMP刺激以诱导IFNβ，而那些表达R232A或R232H的则存在缺陷。作为对照，双链RNA类似物聚[I：C]在所有这些细胞系中都刺激IFNβ的表达。其次，本发明人在HEK293T细胞(其检测不到内源性STING和cGAS的表达)(Sun等人，2013)中稳定表达WT STING或突变体STING。然后用人类cGAS表达质粒转染细胞，再测量IFNβ的RNA。WT STING(而不是R232A突变体)能经cGAS支持IFNβ的诱导。R232H突变体是部分缺陷的，这可能是由于带正电荷的组氨酸可能微弱地取代了Arg232的一些功能。MAVS(RIG-I通路的重要衔接蛋白(Seth等人，2005))能够在所有这些细胞系中诱导IFNβ。总之，本发明人的结构和功能数据强烈表明，Arg232在STING的功能中发挥重要作用，并进一步强调了cGAS作为不可或缺的细胞质DNA传感器的作用。
讨论
本发明人以前的研究鉴定cGAS为细胞质DNA传感器和使用ATP和GTP作为底物合成cGAMP的环化酶(Sun等人，2013；Wu等人，2013)。然后，cGAMP作为第二信使起作用以结合并激活STING。本文中，本发明人采用了化学合成和数个生物物理方法来进一步表征cGAS产物的内部磷酸二酯键并确定其是2'3'-cGAMP。随后，Gao等人报道了apo结合形式和DNA结合形式的cGAS的结构，其证实了cGAS确实是DNA激活的环-GMP-AMP合酶，其催化从ATP和GTP到cGAMP的合成(Gao等人，2013)。该巧妙的研究还阐明了DNA结合导致cGAS激活的结构机理。通过使用不同的方法，Gao等人还发现，截短的cGAS蛋白在体外合成2'3'-cGAMP。然而，他们并没有测试2'3'-cGAMP是否具有任何的生物或生化活性，也没有示出在哺乳动物细胞中是否产生了内源性2'3'-cGAMP。在这一报道中，本发明人表明，用DNA刺激小鼠和人类细胞导致了内源性2'3'-cGAMP的产生。此外，本发明人证明了2'3'-cGAMP以比其它cGAMP异构体和c-二-GMP大得多的亲和力结合STING。本发明人进一步示出2'3'-cGAMP和其它cGAMP异构体在诱导细胞中IFNβ方面比c-二-GMP强力的多。
对2'3'-cGAMP的结构和功能的进一步洞察获得自结合这一内源性配体的STINGCTD的晶体结构。这一晶体结构具有的分辨率，其允许详细观察配体结构，包括2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键二者。结构揭示了STING上介导了2'3'-cGAMP的结合的特定残基。此外，将这一结构与先前公布的apo形式的STING CTD结构相比较揭示了经该天然配体诱导的广泛的构象重排。具体地，V形STING二聚体的2个臂移动近了约且在配体结合的STING结构中的cGAMP结合位点上，新的4个β链片层形成盖子。这些特征不存在于先前确定的STING：c-二-GMP结构中(其使用包含R232H突变的STING变体)。在这些结构中，c-二-GMP结合不诱导STING中的任何明显的构象重排(Ouyang等人，2012；Shu等人，2012；Yin等人，2012)。然而，在包含WT STING(Arg232)和c-二-GMP的另外2个结构中，一个显示出与在STING-cGAMP复合体中所观察到的构象变化类似的构象变化(Huang等人，2012)，另一个显示出不同的构象变化，这是由于Arg232的方向不同(Shang等人，2012)。Huang等人所观察到的“关闭的”(closed)构象可能已经捕获经c-二-GMP诱导的STING的活性状态，其能够激活STING，尽管比cGAMP更弱。
在STING和2'3'-cGAMP之间的广泛相互作用为它们的高亲和性结合提供了结构基础。具体而言，Glu260、Thr263和Val239与GMP的鸟嘌呤碱基相互作用且Ser162与GMP的游离3'-OH基团相互作用，这解释了为什么包含在GMP的2'-OH和AMP的5'-磷酸之间的磷酸二酯键的cGAMP是高亲和性配体。此外，2个α磷酸基团与一个原聚体的Arg232和2个原聚体的Arg238相互作用。这一结构分析解释了R232A或R232H突变强烈削弱了STING响应DNA或cGAMP的功能。本发明人的数据突出了在结构和功能研究中使用野生型(Arg232)STING的重要性。
虽然2'3-cGAMP以比包含其它磷酸二酯键的cGAMP异构体高得多的亲和力结合STING，所有4个cGAMP异构体以相似的EC50值诱导IFNβ，其均比c-二-GMP低得多。因此，所有cGAMP亚型都是IFNβ的强诱导物。
总之，本发明人的结果表明：1)哺乳动物细胞中所产生的响应细胞质DNA刺激的内源性第二信使是2'3'-cGAMP；2)2'3'-cGAMP是STING的高亲和性配体；3)2'3'-cGAMP是哺乳动物细胞中IFNβ的强诱导物；4)2'3'-cGAMP诱导可能是其激活基础的STING中的构象重排；和5)在复合体的晶体结构中所观察到的2'3'-cGAMP和STING之间的广泛相互作用解释了它们的特异性和高亲和性结合。
本发明人得出结论：2'3'-cGAMP是由哺乳动物细胞产生的内源性第二信使；2'3'-cGAMP是STING的高亲和性配体；2'3'-cGAMP是I型干扰素的强诱导物；和2'3'-cGAMP结合诱导STING的构象变化。
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结合人类STING CTD结构的2'3'-cGAMP的坐标已保存于RCSB蛋白质数据库(PDB：4KSY)。
参考文献
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表M1.结合STING的cGAMP的数据收集和精化的统计
括号中的数值是最高分辨率的外沿的。R＝Σ|Fobs-Fcalc|/ΣFobs，其中Fcalc是从原子模型所计算的蛋白结构因子(用10％的所选反射计算Rfree)。
表S1.cGAMP的化学合成。(A)构建模块S1-S4的结构。(B)构建模块S1的合成。(C)构建模块S3的合成。(D)2'3'-cGAMP的合成。(E)2'2'-cGAMP的合成。(F)3'2'-cGAMP的合成。(G)3'3'-cGAMP的合成。
实施例4.环GMP-AMP合酶是HIV和其它逆转录病毒的天然免疫传感器
包括HIV的逆转录病毒可激活天然免疫应答，但逆转录病毒的宿主传感器在很大程度上是未知的。本文中，本发明人示出了HIV感染激活了环-GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)以产生cGAMP，其结合并激活衔接蛋白STING以诱导I型干扰素和其它细胞因子。HIV逆转录酶而不是整合酶的抑制剂去除了经病毒的干扰素β的诱导，这表明逆转录的HIV DNA触发了天然免疫应答。在小鼠或人类细胞系中cGAS的敲除或敲降阻止了经HIV、鼠白血病病毒(MLV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)的细胞因子的诱导。这些结果表明，cGAS检测逆转录病毒DNA，并且cGAS是HIV和其它逆转录病毒的天然免疫传感器。
虽然在许多微生物病原体的天然免疫识别的理解上有了巨大的进步(1-3)，但对于逆转录病毒感染的天然免疫应答还相对知之甚少(4)。逆转录病毒被认为引发弱的或没有引发天然免疫应答，其通常通过炎性细胞因子和I型干扰素的产生所测量。然而，最近的研究已经表明，逆转录病毒如HIV能引发天然免疫应答，其通常被病毒或宿主因子所遮掩(5-8)。例如，TREX1是细胞质外切核酸酶，其降解来自HIV或内源性反转录因子的DNA，从而防止会引发天然免疫的细胞质DNA的累积(9，10)。人类中的TREX1的功能突变的缺失已与Aicardi Goutieres综合征(AGS)密切相关，该病是特征在于升高表达的炎性细胞因子和干扰素刺激基因的狼疮样疾病(11)。
本发明人最近鉴定了酶环GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)是触发I型干扰素和其它细胞因子产生的细胞质DNA传感器(12，13)。DNA结合并激活cGAS，其催化从ATP和GTP到独特的cGAMP异构体的合成。此cGAMP异构体(被称为2'3'-cGAMP，包含2'-5'和3'-5'磷酸二酯键)的功能为结合并激活内质网蛋白STING的第二信使(14-17)。然后，STING激活蛋白激酶IKK和TBK1，其依次激活转录因子NF-κB和IRF3以诱导干扰素和其它细胞因子(18)。cGAS的敲降抑制了经DNA病毒如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和牛痘病毒的IFNβ的诱导(13)。由于逆转录病毒通过逆转录从病毒RNA生成互补DNA，本发明人推测cGAS可能检测逆转录病毒的DNA并触发天然免疫应答。
本发明人使用了单轮HIV-1病毒，其包膜蛋白被水泡性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)所替代，使得其能够感染各种人类和小鼠细胞类型(9)。这种病毒也表达GFP，其可以用于监测病毒感染。用HIV-GFP感染人单核细胞系THP1导致IRF3的二聚化(其激活的标志)。在HIV感染后也检测到STAT1在Tyr-701的磷酸化，这表明干扰素信号通路在病毒感染的细胞中被激活(19)。HIV感染导致IFNβ和趋化因子CXCL10的诱导，其伴随着HIV Gag游离型DNA的产生。IFNβ产生的水平与HIV感染的多重性成正比。用DNaseI处理HIV-GFP病毒不损害其诱导IFNβ的能力，而用DNaseI处理鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)抑制了IFNβ的诱导，这表明经HIV-GFP的IFNβ的诱导并不归因于任何污染的DNA。通过用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)处理细胞使得THP1从单核细胞分化至巨噬细胞，这抑制了HIV-GFP的感染或复制并强烈抑制了IFNβ的诱导。因此，除非另外说明，在本发明人的研究中所用的THP1细胞在HIV感染之前未经PMA处理。
为了测试HIV是否需要逆转录以激活天然免疫应答，本发明人用HIV逆转录酶抑制剂(叠氮胸苷(AZT)和奈韦拉平(nevirapine)(NVP))处理THP1细胞。这两种抑制剂都阻断经HIV的IRF3的激活和IFNβ的诱导。相比之下，HIV整合酶抑制剂雷特格韦(raltegravir)(RAL)不影响此通路的激活。AZT和NVP即使在高浓度下也不抑制经HT-DNA的IFNβ的诱导，这表明AZT和NVP的抑制作用是由于其特异性地抑制HIV逆转录。这些结果表明，逆转录的HIVDNA是IRF3激活和IFNβ产生的引发物。
引人注意的是，shRNA介导的THP1细胞中cGAS或STING的敲降强烈地抑制了经HIV-GFP的IFNβ和CXCL10的诱导和IRF3的激活。对照实验表明，抗萤光素酶的shRNA不抑制此通路的激活，且shRNA载体特异性地敲降预定目标。具体而言，cGAS的shRNA敲降cGAS但不会敲降STING，并且在这些细胞中，将cGAMP递送进细胞恢复了IFNβ的诱导，这说明cGAS的shRNA在STING通路中没有脱靶效应。
以前的研究表明，VSV-G假型化的HIV-1在TREX1缺陷小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中强烈诱导了IFNβ，但不能在野生型(WT)MEF中强烈诱导IFNβ(9)。本发明人制备了稳定表达抗cGAS、STING或萤光素酶(作为对照)的shRNA的Trex1-/-MEF细胞系。HIV感染在对照细胞(sh-荧光素酶)中诱导IFNβ和CXCL10RNA，但在cGAS或STING缺失的细胞中则没有。相比之下，cGAS或STING的敲降不影响经双链RNA类似物聚[I：C]的IFNβ或CXCL10的诱导。
为了获得cGAS在细胞质DNA和反转录病毒的天然传感中作用的确切证据，本发明人采用TALEN技术破坏L929细胞中编码cGAS的基因(Mb21d1)，尤其是编码催化结构域的区域(20)。虽然L929细胞包含三个拷贝的具有cGAS基因的9号染色体的，TALEN表达细胞的DNA测序鉴定了在所有三个染色体中都具有缺失的多个克隆；选择这些克隆中的3个以用于进一步的研究。所有的3个克隆都在cGAS基因座包含产生移码突变的缺失(21)。
所有3个cGAS突变细胞系均未能响应HT-DNA转染或单纯性疱疹病毒(HSV-1；双链DNA病毒)感染来激活IRF3。作为对照，这些细胞正常地响应聚[I：C]的转染或仙台病毒(RNA病毒)的感染来激活IRF3。cGAS突变细胞也在响应HT-DNA诱导CXCL10上存在缺陷，但这一缺陷被使用小鼠cGAS表达质粒转染细胞所恢复。
本发明人选择cGAS突变克隆#18和亲本L929细胞来研究cGAS在HIV感染的天然免疫识别中的作用。在稳定表达抗TREX1的shRNA(而不是对照的荧光素酶)的L929细胞中，HIV-GFP感染诱导IRF3的二聚化并产生IFNβ和CXCL10。相比之下，L929cGAS突变细胞未能产生任何可检测的对HIV感染的免疫应答，即使TREX1被消除，这证明了cGAS在抗HIV的免疫应答中发挥了重要作用。cGAS的消除不影响经仙台病毒的IFNβ或CXCL10的诱导。
在之前，本发明人已经表明，HEK293T细胞不表达可检测水平的cGAS和STING，因此不能响应DNA转染或DNA病毒感染来激活IRF3(13)。与cGAS和STING在反转录病毒的检测中的重要作用一致，HIV-GFP感染在THP1中而不在HEK293T细胞中激活IRF3和STAT1。相比之下，仙台病毒在两种细胞系中都激活IRF3和STAT1。为了确定HIV感染是否导致人类细胞中内源性cGAMP的产生，本发明人制备了来自HIV感染的THP1和HEK293T细胞的裂解物，将裂解物于95℃加热以变性大多数蛋白(通过离心去除(12))。将潜在包含cGAMP的上清液递送至已被细菌毒素产气荚膜杆菌溶素-O(PFO)透化的THP1细胞中，然后通过非变性凝胶电泳分析IRF3的二聚化。来自HIV感染的THP1(而不是HEK293T细胞)的耐热上清液包含cGAMP活性，其在受体细胞中刺激IRF3的激活。此外，由AZT、DDI(二脱氧肌苷)或NVP抑制HIV逆转录阻止了cGAMP活性的产生，而HIV整合酶抑制剂RAL则没有影响。L929-shTrex1细胞中的HIV-GFP感染也导致了cGAMP活性的产生，其依赖于cGAS。总之，这些结果表明，HIV感染以依赖于cGAS和HIV RNA逆转录至cDNA的方式诱导内源性cGAMP的产生。
为了测试HIV感染是否在细胞质中产生逆转录病毒cDNA以激活cGAS，本发明人用HIV-GFP感染HEK293T细胞并制备细胞质提取物，其随后在ATP和GTP存在的情况下与纯化的cGAS蛋白孵育。来自HIV感染的细胞(而不是来自未感染的细胞)的细胞质提取物能刺激cGAS以产生在透化的THP1细胞中激活IRF3的cGAMP活性。用AZT处理HEK293T细胞抑制cGAS刺激活性的产生。进一步的分析表明，HIV感染的细胞的细胞质中包含HIV Gag的DNA和GFP蛋白，这两者都被AZT抑制。
使用选择性反应监测(SRM)通过质谱定量测定cGAMP丰度提供了cGAMP产生于HIV感染的(而不是空白处理的)THP1细胞的直接证据。HIV感染的THP1细胞的内源性cGAMP的串联质谱揭示了其与cGAS产物-2'3'-cGAMP相同(15)。
为了检测HIV感染在原代人类免疫细胞中是否会导致cGAMP的产生，本发明人分别用临床HIV-1分离物HIV-BAL和HIV-GFP感染单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)和单核细胞来源的树突细胞(MDDC)。以前的研究已经表明，人类巨噬细胞和树突细胞表达SAMHD1(其是水解dNTP的核酸酶，从而抑制HIV逆转录)。HIV-2和猴免疫缺陷病毒(SIV)包含蛋白Vpx，其靶向于用于泛素介导的蛋白酶体降解的SAMHD1，从而消除了这一宿主制约因素。为了便于在人类MDM和MDDC中进行HIV感染，本发明人在HIV感染之前使用病毒样颗粒(VLP)将SIV Vpx递送到这些细胞中。在存在Vpx的情况下，分别用HIV-BaL和HIV-GFP感染MDM和MDDC导致cGAMP活性的产生。定量质谱分析进一步证实了在表达Vpx的HIV感染的MDDC中产生2'3'-cGAMP。在其它人类供体的MDDC和MDM中一致性地观察到了cGAMP活性，且用HIV感染的细胞中的这一活性高于仅用Vpx处理的细胞。这些结果证明，在允许病毒复制的条件下，人类巨噬细胞和树突细胞中的HIV感染导致产生cGAMP。
最后，本发明人通过用鼠白血病病毒(MLV)和SIV感染L929和L929-cGAS KO细胞系，测试了抗其它的逆转录病毒的天然免疫应答是否需要cGAS。与HIV类似，在去除内源性TREX1的L929细胞中，MLV和SIV诱导IFNβ和CXCL10 RNA，但在cGAS KO细胞中此类诱导被完全消除。进一步支持cGAS-STING通路在逆转录病毒的天然免疫传感中发挥重要作用的是，在Trex1-/-MEF细胞中敲降cGAS或STING强烈抑制了经MLV和SIV的IFNβ的诱导。
本文中，本发明人证明，cGAS对于抗HIV、SIV和MLV的天然免疫应答是必要的，这表明cGAS是逆转录病毒DNA的一般天然免疫传感器。尽管HIV主要感染人类CD4T细胞，其也可以进入巨噬细胞和树突细胞，其通过将病毒核酸隐藏于衣壳中并通过增选(co-opting)宿主因子如TREX1和SAMHD1限制病毒DNA的累积使得其通常不触发明显的天然免疫应答(8)。在树突细胞中缺少针对HIV的严谨的天然免疫应答，这被认为是阻碍生产性T细胞应答和疫苗开发的主要因素(7)。本发明人的发现，即在允许性条件下HIV和其它逆转录病毒可以通过cGAS诱导产生cGAMP，这表明cGAMP可用于绕过抗HIV的天然免疫应答的阻碍。因此，cGAMP提供了有用的用于擅长破坏宿主天然免疫系统的HIV和其它病原体的疫苗佐剂。
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21.克隆#18在所有3个染色体中都具有移码突变。除了移码之外，克隆#36在一条染色体中具有在催化结构域中移除3个氨基酸(215-217)的9-bp的缺失，而克隆#94在一条染色体中具有12-bp的缺失并在另一条染色体中具有18-bp的缺失，其分别在催化结构域中移除4个氨基酸(214-217)和6个氨基酸(212-217)。
实施例5.cGAS-cGAMP信号在抗病毒防御和免疫佐剂效应中的关键作用
微生物DNA侵入动物细胞的细胞质引发宿主的有助于清除感染的免疫反应的级联；然而，细胞质中的自身DNA可引起自身免疫性疾病。生物化学方法鉴定了环GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)为触发天然免疫应答的细胞质DNA传感器。本文中，本发明人表明，包括成纤维细胞、巨噬细胞和树突细胞的来自cGAS缺陷(cGas-/-)小鼠的细胞不能产生响应DNA转染或DNA病毒感染的I型干扰素和其它细胞因子。cGas-/-小鼠比野生型小鼠更易发生单纯性疱疹病毒-1(单纯疱疹病毒)的致死性感染。本发明人还示出，cGAMP是增强抗原特异性T细胞激活和抗体产生的佐剂。
外源DNA入侵的检测是宿主防御的基本机制。在哺乳动物细胞中，在细胞质中存在外来的或自身的DNA是触发宿主天然免疫应答的危险信号(1)。通过生化研究，本发明人最近鉴定了环GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)为触发产生I型干扰素和其它炎性细胞因子的细胞质DNA的天然免疫传感器(2，3)。cGAS结合DNA，而与其序列无关；此结合激活cGAS以催化独特的cGAMP异构体的合成，其包含2'-5'和3'-5'磷酸二酯键(4-7)。这一分子(被称为2'3'cGAMP)的功能为结合并激活衔接蛋白STING的第二信使(3，7)。然后STING激活蛋白激酶IKK和TBK1，其依次激活转录因子NF-κB和IRF3以诱导干扰素和细胞因子(8)。
为了研究cGAS的体内功能，本发明人制备了cGas敲除小鼠品系，其中第一外显子被剪接进LacZ盒中，因此去除了内源基因座的表达(9)。cGas-/-小鼠以孟德尔比率出生，且未表现出任何的明显的发育异常。来自肺成纤维细胞和骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)的RNA的定量逆转录PCR(q-RT-PCR)分析证实了cGas-/-细胞在产生cGas RNA上有缺陷，而cGas+/-细胞产生了中等水平的cGas RNA。
本发明人从WT、cGas+/-和cGas-/-小鼠以及goldenticket(gt/gt)小鼠(其具有一个导致STING表达缺失的点突变)中获得肺成纤维细胞(10)。将不同类型的DNA(包括鲱鱼精巢DNA(HT-DNA)、大肠杆菌DNA和干扰素刺激DNA(ISD；45bp的双链DNA)转染进来自WT和cGas+/-小鼠的肺成纤维细胞中，导致稳定产生IFNβ蛋白(如通过ELISA所测量的)(11)。相比之下，cGas-/-和Stinggt/gt细胞未能产生任何可检测水平的IFNβ。聚[I：C](已知通过RIG-I样受体(RLR)通路诱导IFNβ的双链RNA类似物(12))在缺少cGas或Sting的情况下正常诱导IFNβ。有趣的是，聚[dA：dT](先前表明其通过RNA聚合酶III-RIG-I-MAVS通路诱导I型干扰素(13，14))在cGas-/-和Stinggt/gt细胞中正常诱导IFNβ。q-RT-PCR分析进一步证实了，cGAS对通过不同类型的合成或细菌DNA(除聚[dA：dT]之外)诱导IFNβRNA是必要的。时间过程实验表明在cGas-/-肺成纤维细胞中经ISD的IFNβ的诱导被完全去除，甚至在DNA转染后的早期时间点(2-8小时)时，这表明cGAS对于经细胞质DNA的IFNβ诱导而言是必不可少的。
为了测量WT和cGas-/-细胞中cGAMP的产生，本发明人进行了生物测定，其在来自ISD转染细胞的细胞质提取物中测量cGAMP的活性。将提取物在95℃加热以变性大多数蛋白(通过离心去除)。将可能包含cGAMP的上清液递送到人类单核细胞系THP1(其已被细菌毒素产气荚膜杆菌溶素-O(PFO)透化)。然后用非变性凝胶电泳测量IRF3的二聚化(其激活的标志)。此分析表明，来自WT而不是cGas-/-小鼠的ISD转染的肺成纤维细胞的提取物包含cGAMP活性，这表明cGAS在这些细胞响应细胞质DNA催化cGAMP合成的过程中具有非冗余的作用。
之后，本发明人用DNA病毒单纯性疱疹病毒-1型(HSV1)、牛痘病毒(VACV)和HSV1的突变株(被称为d109，其缺失如已知拮抗免疫应答的ICP0的病毒蛋白(15))感染肺成纤维细胞。经各个病毒的IFNβ诱导在cGas-/-和Stinggt/gt细胞中大部分被去除，在cGas+/-细胞中部分地被抑制。相比之下，经仙台病毒(已知激活RIG-I通路的RNA病毒)的IFNβ诱导并不受cGAS或Sting缺失的影响。将cGAMP递送进细胞质在cGas-/-细胞而不是Stinggt/gt细胞中恢复IFNβ的诱导。类似地，经DNA病毒的趋化因子CXCL10的诱导依赖于cGas和Sting。IRF3二聚化的测量表明，cGas-/-细胞不能响应HT-DNA的转染或WT HSV1或HSV1病毒株7134(其也缺乏干扰素拮抗剂ICP0(16))的感染以激活IRF3。cGas缺陷并不影响经仙台病毒的IRF3的激活。因此，在小鼠肺成纤维细胞中，经DNA病毒而不是RNA病毒的IRF3的激活和细胞因子的诱导需要cGAS。
来自cGas-/-和Stinggt/gt小鼠的BMDM在响应HT-DNA或ISD的转染产生IFNβ方面有缺陷。类似地，经VACV和HSV1病毒株d109和7134的IFNβ的诱导在cGas-/-和Stinggt/gt BMDM中大部分被去除。然而，经WT HSV1的IFNβ的诱导cGas-/-或Stinggt/gt BMDM中被严重地但未彻底地阻断，这表明这些细胞具有另一种通路，其能部分补偿cGAS-STING通路的损失以检测WTHSV1感染。BMDM中cGAS或STING的缺失不影响经仙台病毒的IFNβ诱导。动力学实验表明，在整个刺激时间过程中cGas-/-BMDM中的经ISD和HSV1-d109的IFNβ诱导被去除。与IFNβ类似，经HT-DNA或ISD的TNFα的诱导在cGas-/-或Stinggt/gt BMDM中被去除。q-RT-PCR分析表明，经HT-DNA或ISD的转染或HSV1-d109的感染的IFNβ、白细胞介素-6(IL6)和CXCL10RNA的诱导完全依赖于cGas和Sting。相比之下，经聚[I：C]或仙台病毒诱导的这些细胞因子的RNA水平不受cGas或Sting缺失的影响。
本发明人通过在包含GM-CSF和Flt3配体(Flt3L)的条件培养基中培养骨髓分别获得常规的树突细胞(cDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)。来自cGas-/-和Stinggt/gt小鼠的包含大量cDC的GM-CSF DC不能响应HT-DNA或ISD的转染以诱导IFNα或IFNβ。GM-CSF DC中cGAS或STING的缺失去除了经HSV1-d109和VACV的IFNβ的诱导，部分抑制了经WT HSV1的IFNβ的诱导。相比之下，cGAS或STING的缺陷并不损害经仙台病毒的IFNα或IFNβ的诱导。q-RT-PCR实验进一步证实了，cGAS和STING对于经HT-DNA或ISD的转染或HSV1-d109的感染的IFNβ、IL6和CXCL10RNA的诱导是必要的，而经聚[I：C]或仙台病毒的这些细胞因子的诱导不依赖于cGAS或STING。
已知pDC表达TLR9，其负责经合成的包含硫代磷酸酯键的CpG DNA诱导I型干扰素(17)。当在存在或缺失脂质体(Lipofectamine 2000)的情况下使用CpG DNA刺激包含大量的pDC的Flt3L-DC时，其甚至在cGas-/-和Stinggt/gt细胞中诱导IFNα和IFNβ的稳定产生。相比之下，其它形式的DNA，包括ISD、聚[dA：dT]和来自大肠杆菌和霍乱弧菌的基因组DNA，在Flt3L-DC中仅在脂质体存在的情况下诱导IFNα，且这种经各个DNA的诱导在缺失cGAS或STING的情况下被去除。pDC中经聚[dA：dT]的IFNα的诱导强烈依赖于cGAS和STING，这表明在这些细胞中cGAS-STING通路而不是Pol-III-RIG-I通路在传感DNA方面发挥了主要作用。来自cGas-/-和Stinggt/gt小鼠的Flt3L-DC响应经仙台病毒而非HSV1的感染诱导IFNα和IFNβ。总之，这些结果证明，cGAS在树突细胞中负责检测天然DNA(例如，细菌DNA)和DNA病毒感染。
为了确定cGAS在抗DNA病毒的体内免疫防御中的作用，本发明人用HSV1经静脉内(i.v)途径感染WT和cGas-/-小鼠。ELISA分析表明，WT小鼠的血清中包含升高水平的IFNα和IFNβ，其分别在HSV1感染(1×107pfu/小鼠)后8小时和4小时达到峰值。IFNα和IFNβ的水平在由相同感染剂量的HSV1感染的cGas-/-小鼠中严重降低。在一个独立实验中，其中以1×106pfu/小鼠的感染剂量用HSV1感染后监视小鼠的生存率，五分之四的cGas-/-小鼠在病毒感染后3天发展出共济失调和麻痹，并在这些症状出现后数小时死亡。五分之一的cGas-/-小鼠在感染后第4天死亡。五分之三的WT小鼠在第6天发展出这些症状并在不久后死亡。在感染后第3天提取WT和cGas-/-小鼠的脑部以测量病毒滴度，在所有5只cGas-/-小鼠中都检测出高水平的HSV1，而没有WT小鼠在脑部具有可检测水平的HSV1。在HSV1的感染剂量增加至每只小鼠1×107pfu的独立实验中观察到了类似的存活曲线和类似的脑部的病毒滴度。cGas-/-小鼠对HSV1感染的易感性与Stinggt/gt小鼠相似，Stinggt/gt小鼠也在血清中具有显著降低的IFNα和IFNβ，并且在HSV1感染后3-4天内死亡(18)。
本发明人的结果是，在多种细胞类型(包括抗原呈递细胞)中，cGAS对于经细胞质DNA的I型干扰素的诱导是必要的，这表明cGAS产物(2'3'cGAMP)可用于取代DNA的免疫刺激效应，这包括DNA疫苗的佐剂效应(19)。为了确定2'3'cGAMP的佐剂效应，本发明人通过肌内(i.m)途径在缺失或存在2'3'cGAMP的情况下将模型蛋白抗原卵白蛋白(OVA)注射进WT或Stinggt/gt小鼠中。用相同的抗原制剂在第10天对小鼠进行一次强化。ELISA分析表明，2'3'cGAMP在WT中于第17天强烈增强了OVA特异性抗体的产生，而在Stinggt/gt小鼠中则没有。在I型干扰素受体缺陷小鼠(Ifnar-/-)中也未观察到2'3'cGAMP的这种佐剂效应。为了研究2'3'cGAMP对T细胞激活的影响，将分离自WT小鼠的脾白细胞(其已被OVA或OVA+2'3'cGAMP免疫7天)与OVA肽(已知通过II类MHC分子I-Ab刺激CD4T细胞)或另一种OVA肽(通过I类MHC分子H-2Kb刺激CD8T细胞)培养。用OVA+2'3'cGAMP免疫的(而不是仅用OVA免疫的)小鼠的CD4和CD8T细胞在用同源肽刺激后产生升高水平的IFNγ和IL-2。使用由与H-2Kb复合的OVA肽组成的四聚体的流式细胞分析显示，在用OVA+2'3'cGAMP免疫的小鼠中，四聚体阳性CD8T细胞的百分比显著增加，这表明2'3'cGAMP刺激带有OVA特异性T细胞受体的CD8T细胞的扩增。总之，这些结果表明，2'3'cGAMP的功能为免疫佐剂，以刺激抗原特异性T细胞和B细胞应答。
本文中，本发明人提供了证据，即cGAS对于经DNA转染和DNA病毒感染的I型干扰素和其它炎性细胞因子的诱导是必要的。除聚[dA：dT]和CpG DNA之外，大多数DNA分子，尤其是那些天然存在的(例如，细菌和病毒DNA)，其排他性地通过cGAS-cGAMP-STING通路刺激I型干扰素。在多种细胞类型(包括成纤维细胞、巨噬细胞和树突细胞)中，经牛痘病毒和数株HSV1的I型干扰素的诱导完全依赖于cGAS和STING。然而，值得注意的是，经野生型HSV1的IFNβ的诱导在来自cGas-/-或Stinggt/gt小鼠的BMDM和GM-CSF DC中被严重地但未彻底地去除。其它假定的DNA传感器如IFI16或DDX41，可能也参与经WT HSV1的IFNβ的剩余的诱导(20，21)。在cGAS的情况下，cGas-/-小鼠的表型与Sting-/-小鼠极其相似(此研究和参考文献18)。这些结果以及本发明人的示出了cGAS是由其结合到一般DNA所激活的细胞质酶(2，3)的生化数据正式证明了cGAS是激活STING的非冗余的且常规的细胞质DNA传感器。
本发明人示出了，2'3'cGAMP是增强抗原特异性抗体和T细胞应答的产生的有效佐剂。虽然细菌第二信使环二GMP和环二AMP正被开发为潜在的疫苗佐剂(22)，2'3'cGAMP是与任何的细菌环二核苷酸相比更加强力的STING配体(7)。因此，2'3'cGAMP为下一代预防或治疗人类疾病(包括感染性疾病和癌症)的疫苗提供了有用的佐剂。
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Claims (15)

1.一种包含预定量的环-GMP-AMP(cGAMP)的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中cGAMP是2'3'-cGAMP、2'2-cGAMP、3'2'-cGAMP或3'3'-GAMP。
3.如权利要求1所述的组合物，其中cGAMP是2'3'-cGAMP。
4.权利要求1所述的组合物，其基本上不含其它的环二核苷酸。
5.一种包含权利要求1所述的组合物的佐剂。
6.一种包含预定的抗原和权利要求1所述的组合物的疫苗。
7.如权利要求6所述的疫苗，其中抗原对靶病原体具有选择性。
8.一种诱导或促进免疫应答的方法，其包括向有需要的哺乳动物施用有效量的权利要求1所述的组合物。
9.如权利要求8所述的方法，其中施用是经黏膜(舌下或鼻内)给药、肌肉内给药或皮下给药。
10.一种抑制环-GMP-AMP合酶(cGAS)或抑制cGAS结合到底物或辅助因子的方法，其包括：
(a)用有效量的外源cGAS抑制剂接触细胞或细胞提取物，并检测所获得的合酶的抑制；或
(b)用有效量的外源cGAS抑制剂接触所确定的有需要的细胞；或
(c)在抑制剂抑制了ATP和GTP到环-GMP-AMP和无机焦磷酸的合酶催化转化的条件下将包括合酶、ATP、GTP的混合物与抑制剂接触，并检测所获得的合酶的抑制；或
(d)在抑制剂抑制合酶与底物或辅因子的结合的条件下将包括合酶和ATP或GTP底物或DNA辅因子的混合物与抑制剂接触，并检测所获得的结合的抑制。
11.如权利要求10的(a)、(b)或(c)所述的方法，其中
(i)通过由二聚化或核转位、干扰素产生或NF-κB激活所测量的环-GMP-AMP诱导的IRF3激活来推理性检测所获得的抑制；
(ii)方法包括向确定有需求的且包含所述细胞的哺乳动物施用抑制剂；
(iii)抑制剂是cGAS-特异性shRNA或siRNA；和/或
(iv)混合物进一步包括DNA且转化是DNA-依赖的。
12.一种制备权利要求1所述的环-GMP-AMP(cGAMP)的方法，其包括在合酶催化从ATP和GTP至cGAMP的转化的条件下，形成包括环-GMP-AMP合酶(cGAS)、ATP和GTP的混合物，其中合酶、ATP和GTP是预定量的，或者方法进一步包括分离或检测所获得的cGAMP的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中混合物进一步包含DNA且转化是DNA-依赖的。
14.一种用于检测cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变的方法，其包括以下步骤：
检测来自人的样品中的cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变，并基于cGAMP水平、cGAS水平或cGAS突变向人分配自身免疫性疾病度量；和
任选地，向人施用用于自身免疫性疾病的疗法。
15.如权利要求14所述的方法，其中cGAMP是2’3’-cGAMP。
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