CN106539813B - 干扰素刺激基因(sting)激活剂在抗炎症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为干扰素刺激基因（STING）激活剂包括：环二核苷酸cGAMP、c‑di‑AMP等在治疗炎症中的应用。本发明研究表明，STING激活剂可以抑制炎症，调节炎症因子表达，因此，STING激活剂可用于制备抗炎症药物。

Description

干扰素刺激基因(STING)激活剂在抗炎症中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及STING激活剂包括多种环二核苷酸在抗炎中以及在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

炎症，是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，是常见而又重要的基本病理过程，体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病都属于炎症性疾病。其中，血管反应是炎症过程的中心环节，其表现为红、肿、热、痛等。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自身的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。在炎症过程中，一方面损伤因子直接或间接造成组织和细胞的破坏，另一方面通过炎症充血和渗出反应，以稀释、杀伤和包围损伤因子。同时通过实质和间质细胞的再生使受损的组织得以修复和愈合。因此可以说炎症是损伤和抗损伤的统一过程。

炎症根据持续时间不同分为急性和慢性。急性炎症以发红、肿胀、疼痛等为主要征候，即以血管系统的反应为主所构成的炎症。局部血管扩张，血液缓慢，血浆及中性白细胞等血液成分渗出到组织内，渗出主要是以静脉为中心，但象蛋白质等高分子物质的渗出仅仅用血管内外的压差和胶体渗透压的压差是不能予以说明的，这里能够增强血管透性的种种物质的作用受到重视。这种物质主要有：(1)组织胺、5-羟色胺等胺类物质可导致炎症刺激后所出现的即时反应。(2)以舒缓激肽、赖氨酰舒缓激肽、甲硫氨酰-赖氨酰-舒缓激肽为代表的多肽类。其共同的特征是可使血管透性亢进、平滑肌收缩、血管扩张，促进白细胞游走。舒缓激肽和赖氨酰舒缓激肽的结构已被确定。(3)血纤维溶解酶、激肽释放酶、球蛋白透性因子等蛋白酶，其本身并不能成为血管透性的作用物质。但可使激肽原变为激肽而发挥作用。然而上述这些物质作用于血管的那个部位以及作用机制多属不明。在组织学上可以看到发生急性炎症时出现的血管渗出反应和修复过程混杂在一起的反应，并可见有巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞的浸润和成纤维细胞的增生。

炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。任何能够引起组织损伤的因素都可成为炎症的原因，即致炎因子。致炎因子可归纳为以下几类：1.生物性因子，包括：细菌、病毒、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和寄生虫等。由生物病原体引起的炎症又称感染。细菌产生的外毒素和内毒素可以直接损伤组织；病毒在被感染的细胞内复制导致细胞坏死；某些具有抗原性的病原体感染后通过诱发的免疫反应而损伤组织，如寄生虫感染和结核。2.物理性因子：高温、低温、放射性物质及紫外线等和机械损伤。3.化学性因子：外源性化学物质如强酸、强碱及松节油、芥子气等。内源性毒性物质如坏死组织的分解产物及在某些病理条件下堆积于体内的代谢产物如尿素等。4.异物：通过各种途径进入人体的异物，如各种金属、木材碎屑、尘埃颗粒、及手术缝线等，由于其抗原性不同，可引起不同程度的炎症反应。5.坏死组织：缺血或缺氧等原因可引起组织坏死，组织坏死是潜在的致炎因子。在新鲜梗死灶边缘所出现的充血出血带和炎性细胞的浸润都是炎症的表现。6.变态反应：当机体免疫反应状态异常时，可引起不适当或过度的免疫反应，造成组织和细胞损伤而导致炎症。免疫反应所造成的组织损伤最常见于各种类型的超敏反应：I型变态反应如过敏性鼻炎、荨麻疹，II型变态反应如抗基底膜性肾小球肾炎，III型变态反应如免疫复合物沉着所致的肾小球肾炎，IV型变态反应如结核、伤寒等；另外，还有许多自身免疫性疾病如淋巴细胞性甲状腺炎、溃疡性结肠炎等。

炎症的基本病理变化炎症的基本病理变化通常概括为局部组织的变质、渗出和增生。炎症局部组织所发生的变性和坏死称为变质。变质是致炎因子引起的损伤过程，是局部细胞和组织代谢、理化性质改变的形态所见。变质既可发生在实质细胞，也可见于间质细胞。实质细胞发生的变质常表现为细胞水肿、脂肪变性、细胞凝固性坏死及液化性坏死等。间质发生的变质常表现为黏液样变性，结缔组织玻璃样变性及纤维样坏死等。变质是由致炎因子直接作用，或由炎症过程中发生的局部血液循环障碍和免疫机制介导，以及炎症反应产物简介作用的结果。变质的轻重取决于致炎因子的性质、强度和机体的反应性两个方面。组织、细胞变性坏死后释放的水解酶使受损组织和细胞溶解、液化，并进一步引起周围组织、细胞发生变质，出现器官的功能障碍。炎症局部组织血管内的液体和细胞成分通过血管壁进入组织间质、体腔、粘膜表面和体表的过程称为渗出。所渗出的液体和细胞总称为渗出物或渗出液。炎症时渗出物内含有较高的蛋白质和较多的细胞成分以及他们的崩解产物，这些渗出的成分在炎症反应中具有重要的防御作用，对消除并病原因子和有害物质起着积极作用。以血管反应为中心的渗出病变是炎症最具特征性的变化。此过程中血管反应主要表现为流血动力学改变、血管通透性增加、液体渗出和细胞渗出。炎症能导致：流血动力学改变，即流血量和血管口径的改变；血管通透性增加；局部液体和蛋白质渗出；细胞渗出；白细胞增多；单核吞噬细胞系统细胞增生；实质器官的病变炎症过程中，既有损伤又有抗损伤。致炎因子引起的损伤与机体抗损伤反应决定着炎症的发生、发展和结局。如损伤过程占优势，则炎症加重，并向全身扩散；如抗损伤反应占优势，则炎症逐渐趋向痊愈。若损伤因子持续存在，或机体的抵抗力较弱，则炎症转变为慢性。在病人抵抗力低下，或病原微生物毒力强、数量多的情况下，病原微生物可不断繁殖并直接沿组织间隙向周围组织、器官蔓延，或向全身播散，并导致严重的其他疾病。

天然免疫，指个体出生时即具备，作用范围广，不针对特定抗原的免疫能力，在机体防御机制中具有重要作用，是抵抗病原微生物感染的第一道防线。在感染的哺乳动物细胞中，存在天然免疫信号通路，抵御外界如微生物或病毒的入侵。天然免疫通路能识别微生物和病毒DNA，通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网(ER)受体蛋白(STING)是对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bpdsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。除了cGAMP，包括其它环二核苷酸如c-di-AMP均能够激活STING，诱导干扰素表达。

发明内容

本发明的目的在于提供STING激活剂在抗炎症中的应用。

本发明的目的还在于提出STING激活剂在制备抗炎症药物中的应用，以制备减低炎症反应的抗炎症药物。

本发明实验研究表明，STING激活剂可以显著消除炎症，调节炎症相关细胞因子表达，因此可用于制备抗炎症药物。

本文提及STING激活剂包括但不限于：3’3’-cGAMP、2’3’-cGAMP、2’2’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP以及各自的硫取代物。

本文提及的炎症反应，包括急性炎症、慢性炎症。

本文提及的STING激活剂，如不加特殊说明，是指一种能结合STING蛋白质，能够激活STING产生相应的生物学效应，如诱导I型干扰素表达。

本文提及二核苷酸cGAMP，包括：2’3’-cGAMP、3’3’-cGAMP、2’2’-cGAMP。

本文提及二核苷酸2’3’-cGAMP，如不加特殊说明，CAS号为1441190-66-4。

本文提及二核苷酸3’3’-cGAMP，如不加特殊说明，CAS号为849214-04-6。

本文提及二核苷酸c-di-AMP，如不加特殊说明，CAS号54447-84-6。

本文提及二核苷酸c-di-GMP，如不加特殊说明，CAS号61093-23-0。

本文提及STING，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及NCBI数据库、欧洲基因数据库一致。其GENE名为：TMEM173；GENEID为：340061；STING公开的其它命名包括：TransmembraneProtein173，ERIS，MITA，MPYS，NET23，SAVI，STING，hMITA，hSTING。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：STING激活剂制备

2’3’-cGAMP的制备：2’3’-cGAMP(环化-GMP-AMP)按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)催化合成。纯度在98％以上。(PingweiLi，etal.,Immunity,2013,39(6),1019-1031.)

2’2’-cGAMP、3’3’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、购自INVIVOGENE公司。

硫代cGAMP、硫代c-di-AMP、、硫代c-di-GMP均购自Sigma公司。

实施例2：STING激活剂活性与检测

动物种属、品系、性别、体重、来源、合格证：BALB/c小鼠，雌性，体重16-18g，4-6周龄，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005]。STING激活剂使用尾静脉注射小鼠，设置剂量组：20mg/kg。受试药物名称：2’2’-cGAMP、3’3’-cGAMP、2’3’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、硫代cGAMP、硫代c-di-AMP、硫代c-di-GMP。性状：白色粉末

溶媒：生理盐水。配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。

给药次数：每天1次，连续3天。每组动物数：10只

实验主要步骤：尾静脉注射受试药物。连续注射3天，三天结束后，取小鼠血清，用ELISA试剂盒测试干扰素-beta的量。注射生理盐水的小鼠组作为阴性对照。实验结果：受试药品均为STING激活剂，且均能够在小鼠体内激活STING，诱导干扰素beta表达。具体结果见表1。

表1 STING激活剂诱导小鼠体内表达I型干扰素(干扰素beta)表达结果

注：*P<0.05vs阴性对照组；**P<0.01vs阴性对照组。

实施例3：炎症模型建立与药物治疗

小鼠饲养、药品给药方式与剂量参见实施例2。取地塞米松作为阳性对照，给药剂量为10mg/kg，腹腔注射给药。

实验方法：在两组小鼠右耳上均匀滴加20μl二甲苯，左耳作为对照30min后，取血后，处死小鼠，将小鼠双耳重合，用冲子冲下直径为8mm的圆片，称重，通过左右耳重量差计算肿胀数和肿胀率。

统计分析：数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验比较各组差异的显著性，显著性水平a＝0.05。肿胀数＝右耳重量-左耳重量、肿胀率＝(右耳重量-左耳重量)/左耳重量实验结果：STING激活剂能够显著抑制小鼠耳朵肿胀(P<0.05，P<0.01)，表明通过激活STING，能够具有抗炎症作用。具体结果见表2。

表2 STING激活剂对小鼠耳朵肿胀程度的治疗效果结果

注：*P<0.05vs阴性对照组；**P<0.01vs阴性对照组。

实施例4：炎症模型建立、药物治疗与炎症因子测定

小鼠饲养、药品给药参见实施例3。取小鼠血清，用ELISA定量试剂盒(购自R&D公司)测定IL-8，TNF-α和IL-6的表达量。

实验结果：STING激活剂能够显著降低血液中IL-8，TNF-α和IL-6的表达(P<0.05，P<0.01)，表明通过激活STING，能够抑制炎症因子表达，具有抗炎症作用。具体结果见表3。

表3 STING激活剂对小鼠体内炎症因子的表达的抑制结果

注：*P<0.05vs阴性对照组；**P<0.01vs阴性对照组。

Claims (1)

1.硫代2’3’-cGAMP在制备抗二甲苯致耳肿胀炎症药物中的应用。