JP2022525924A - 細胞外小胞コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

細胞外小胞コンジュゲート及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、がん及び他の疾患の予防または処置のための薬剤として有用であり得る、マレイミド部分を介して細胞外小胞に共有結合性で連結された生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）に関する。本明細書ではまた、該細胞外小胞を生産するための方法及び該細胞外小胞を使用して疾患または障害を処置するための方法も提供される。本開示は、細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム）であって、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、該細胞外小胞、及びその使用を対象とする。マレイミド部分を介して連結された生物学的に活性な分子を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）は、従来の部分、例えば、コレステロールまたはスクシンイミドと比較してより優れた特性を示す。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
このＰＣＴ出願は、２０１９年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／８２２，０１４号及び２０１９年４月１７日に出願された同第６２／８３５，４３９号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
本願とともに提出された、電子的に提出された配列表（名称：４０００＿０３７ＰＣ０３＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２３５，５０６バイト、及び作成日：２０２０年３月２０日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本開示は、がん及び他の疾患の予防または処置のための薬剤として有用であり得る、マレイミド部分を介して細胞外小胞（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム）を提供する。
多くの生物活性化合物は、治療上の関心対象となる強力な生物学的活性を有する。しかしながら、これらの化合物は、非標的臓器において毒性を表すことが多い。非標的組織への曝露を制限するための１つの方式は、治療用化合物を特定の細胞種に導くことができる、抗体等の親和性に基づく試薬に低分子を化学的にコンジュゲートすることであるが（Ｄｏｓｉｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）３（７）：８４８－８８３（２０１１））、この手法は、抗体に結合させることができる対象となる化合物の分子の数（典型的には１つの抗体当たり２～６つの分子）、及び非標的細胞に結合することなく標的とされる関連性のある病的／エフェクター細胞に特異的に結合する抗体の利用可能性／存在によって制限される。これらの２つの問題は、それぞれ、効力を減少させること及び全身毒性を増加させることによって、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用を制限する。したがって、特定の組織または臓器を選択的に標的としながら、同時に治療用化合物に対する全体的な全身曝露を制限することができる、ＡＤＣよりもペイロードの高い送達系に対する必要性がある。
ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。それらはまた、がん等の多くの疾患の診断及び予後判定における重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、多くの治療分野における新たな治療法として、慣習的な薬物送達方法（例えば、ペプチド免疫化、ＤＮＡワクチン）に勝る多くの利点を提示する。しかしながら、その利点にもかかわらず、多くのＥＶ（例えば、エキソソーム）は、限定された臨床有効性を有してきた。例えば、樹状細胞由来エキソソーム（ＤＥＸ）が、手術不能の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者において第一選択の化学療法後の維持免疫療法として第ＩＩ相臨床試験で調査された。しかしながら、この試験は、主要評価項目（化学療法中止から４ヶ月後に少なくとも５０％の患者が無増悪生存期間（ＰＦＳ）を有する）が達成されなかったため、中止された。Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）。
したがって、ＥＶに基づく技術の治療的使用及び他の用途をより可能なものとするために、新たでより有効な操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）が必要である。
Ｄｏｓｉｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）３（７）：８４８－８８３（２０１１） Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）
本開示は、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）を提供する。一部の態様では、マレイミド部分は、式（Ｉ）を有し、
Figure 2022525924000001
 式中、
Ｒ１が、－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８カルボシクロ）－、－（Ｃ３－８カルボシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８ヘテロシクロ－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－からなる群から選択され、
ｒが、１～１０の整数であり、
＊が、ＥＶ（例えば、エキソソーム）へのマレイミド部分の共有結合部位を示し、
波線が、生物学的に活性な分子へのマレイミド部分の結合部位を示す。
一部の態様では、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｓは、４、５、または６である。一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２）５－である。
Figure 2022525924000002
一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒは、２である。
Figure 2022525924000003
一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基に共有結合性で連結され、該官能基は、スルフヒドリル基である。一部の態様では、スルフヒドリル基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上のタンパク質上にある。一部の態様では、マレイミド部分は、リンカーによって生物学的に活性な分子に連結されている。一部の態様では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。一部の態様では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼによって切断される。一部の態様では、プロテアーゼは、カテプシンである。一部の態様では、リンカーは、還元感受性リンカー、または酸に不安定なリンカーである。
一部の態様では、リンカーは、式（ＩＶ）を有し、
－Ａａ－Ｙｙ－（ＩＶ）、
式中、各－Ａ－が独立して、アミノ酸単位であり、ａが独立して、１～１２の整数であり、－Ｙ－が、スペーサー単位であり、ｙが、０、１、または２である。
一部の態様では、－Ａａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドである。一部の態様では、ａは、２であり、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンからなる群から選択される。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニンまたはバリン－シトルリンである。一部の態様では、ｙは、１である。
一部の態様では、－Ｙ－は、自壊性スペーサーである。一部の態様では、－Ｙｙ－は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2022525924000004
 式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である。
一部の態様では、ｍは、０、１、または２である。一部の態様では、ｍは、０である。一部の態様では、切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。一部の態様では、－Ｙ－は、非自壊性スペーサーである。一部の態様では、非自壊性スペーサーは、－Ｇｌｙ－または－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－である。
一部の態様では、リンカーは、酸に不安定なリンカーである。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、シス－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、生物学的に活性な分子を酸に不安定なリンカーに連結するスペーサー単位を含む。
一部の態様では、スペーサー単位は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2022525924000005
 式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である。
一部の態様では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。一部の態様では、切断不可能なリンカーは、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、切断不可能なリンカーは、生物学的に活性な分子を切断不可能なリンカーに連結するスペーサー単位を含む。一部の態様では、スペーサー単位は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2022525924000006
 式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である。
本開示はまた、生物学的に活性な分子及び切断可能なリンカーを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供し、該切断可能なリンカーは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を生物学的に活性な分子につなげ、また該切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）を切断可能なリンカーに連結する、マレイミド部分をさらに含む。
一部の態様では、マレイミド部分は、式（Ｉ）を有し、
Figure 2022525924000007
 式中、
Ｒ１が、－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８カルボシクロ）－、－（Ｃ３－８カルボシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８ヘテロシクロ－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－からなる群から選択され、
ｒが、１～１０の整数であり、
＊が、ＥＶ（例えば、エキソソーム）へのマレイミド部分の共有結合部位を示し、
波線が、生物学的に活性な分子へのマレイミド部分の結合部位を示す。
一部の態様では、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｓは、４、５、または６である。一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２）５－である。
Figure 2022525924000008
一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒは、２である。
Figure 2022525924000009
一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基に共有結合性で連結されている。一部の態様では、官能基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上のグリカン上にある。一部の態様では、官能基は、スルフヒドリル（チオール）である。一部の態様では、官能基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上のタンパク質上にある。一部の態様では、タンパク質は、足場部分である。一部の態様では、タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、またはその断片である。
本開示はまた、マレイミド部分、切断可能なリンカー、及び生物学的に活性な分子を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供し、該マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を切断可能なリンカーに連結し、該切断可能なリンカーは、マレイミド部分を生物学的に活性な分子につなげる。
一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、化学化合物である。一部の態様では、化学化合物は、低分子である。一部の態様では、低分子は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）である。
一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ヌクレオチドであり、該ヌクレオチドは、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストである。一部の態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
一部の態様では、ＥＶは、式（ＶＩ）もしくは（ＶＩＩ）、
Figure 2022525924000010
Figure 2022525924000011
 を有する（マレイミド部分）－（切断可能なリンカー）－（生物学的に活性な分子）、またはその薬学的塩を含む。
一部の態様では、ＥＶは、式（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、もしくは（ＸＩ）、
Figure 2022525924000012
Figure 2022525924000013
Figure 2022525924000014
 を有する（マレイミド部分）－（切断可能なリンカー）－（生物学的に活性な分子）、またはその薬学的塩を含む。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、マレイミド部分を共有結合性で連結するための官能基を表面上に露出させるように修飾されている。一部の態様では、官能基は、スルフヒドリル基である。一部の態様では、官能基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を還元剤で処理することによって露出させられる。一部の態様では、還元剤は、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、チオール化剤は、トラウト試薬（２－イミノチオラン）を含む。
複数の態様では、本開示のＥＶは、エキソソームを含む。
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
本開示はまた、マレイミド部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結することを含む、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）にコンジュゲートする方法を提供する。一部の態様では、連結することは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を還元剤で処理することを含む。一部の態様では、還元剤は、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、チオール化剤は、トラウト試薬（２－イミノチオラン）を含む。一部の態様では、連結することは、還元されたＥＶ（例えば、エキソソーム）をマレイミド部分に接触させることをさらに含む。一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）への連結前に、生物学的に活性な分子に化学的に連結されている。一部の態様では、マレイミド部分は、マレイミド部分を生物学的に活性な分子につなげるためのリンカーに化学的に連結されている。
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）と、使用説明書とを含む、キットを提供する。また、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）にコンジュゲートするための試薬と、コンジュゲーションを実施し、それによって本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を作製するための説明書とを含む、キットも提供される。
本開示はまた、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を対象に投与することを含む、疾患または障害の処置または予防を必要とする対象において疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。一部の態様では、疾患または障害は、がん、炎症性障害、神経変性障害、中枢神経疾患、または代謝疾患である。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、静脈内、腹腔内、鼻腔、経口、筋肉内、皮下、非経口、髄腔内、眼内、または腫瘍内投与される。
一部の態様では、本開示は、マレイミド部分を介して足場部分に共有結合性で連結された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）を提供する。一部の態様では、マレイミド部分は、二官能性分子である。一部の態様では、マレイミド部分は、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサーを含む。一部の態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。一部の態様では、足場部分は、足場タンパク質または足場脂質である。一部の態様では、足場タンパク質は、足場Ｘタンパク質である。一部の態様では、足場Ｘタンパク質は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、またはその断片である。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ＳＴＩＮＧ、ＡＳＯ、合成抗腫瘍剤（例えば、ＭＭＡＥ）、サイトカイン放出阻害剤（例えば、ＭＣＣ９５０）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、オートタキシン阻害剤（例えば、ＰＡＴ４０９）、ＬＰＡ１アンタゴニスト（例えば、ＡＭ１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、細胞外小胞は、標的化部分、指向性部分、抗食作用シグナル、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。一部の態様では、標的化部分、指向性部分、抗食作用シグナル、またはそれらの組み合わせは、マレイミド部分を介して細胞外小胞に連結されている。
マレイミド化学反応をどのように使用して、例えば、本明細書に記載の足場部分（例えば、足場Ｘタンパク質もしくはその断片または脂質）を介して、生物学的に活性な分子（ＢＡＭ）をＥＶ（例えば、エキソソーム）に化学的に連結することができるかを示す概略図である。図面に図示されるリンカーは、任意選択的なものであり、存在する場合、リンカー（例えば、切断可能なリンカー）またはそれらの組み合わせを含み得る。 ＥＶに連結され得るＳＴＩＮＧアゴニスト化合物の例、すなわち、ＣＰ２２７（Ｖａｌ－Ａｌａがマレイミド部分に連結されている）、ＣＰ２２９（Ｖａｌ－Ｃｉｔがマレイミド部分に連結されている）、ＣＰ２３８（Ｖａｌ－Ａｌａがコレステロールに連結されている）、ＣＰ２４６（Ｖａｌ－Ａｌａがスクシンイミドに連結されている）、ＣＰ２４０（リンカーなし）、ＣＰ２４９（Ｖａｌ－Ａｌａがマレイミド部分に連結されている）、ＣＰ２５０（Ｖａｌ－Ａｌａがマレイミド部分に連結されている）、ＣＰ２６０（Ｖａｌ－Ｃｉｔがマレイミド部分に連結されている）、及びＣＰ２６１（Ｖａｌ－Ｃｉｔがマレイミド部分に連結されている）を示す。 スルフヒドリル反応性またはアミン反応性化合物のＳＴＩＮＧアゴニズム（ＩＦＮ－β）を評価するＰＢＭＣアッセイの結果を示す。遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト化合物（塗りつぶされた円）及びエキソソーム上に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニスト化合物（白抜きの円）の活性を試験した。エキソＣＰ２２７は、マレイミド部分に連結されたＶａｌ－Ａｌａを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２２７であり、エキソ－ＣＰ２２９は、マレイミド部分に連結されたＶａｌ－Ｃｉｔを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２２９であり、エキソ－ＣＰ２３２は、いずれのリンカーも用いずにＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２３２であり、エキソ－ＣＰ２４６は、スクシンイミドに連結されたＶａｌ－Ｃｉｔを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２４６であり、エキソ－ＣＰ２５０は、マレイミド部分に連結されたＶａｌ－Ｃｉｔを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２５０である。５００，０００個のＰＢＭＣ／ウェルをエキソソームとともに一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清中へのインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）の放出を測定した。 ＳＴＩＮＧアゴニストの負荷のためのスルフヒドリル反応性化学反応及び脂質会合化学反応を比較するＰＢＭＣアッセイの結果を示す（中央グラフ）。ＣＰ２２７、及びマレイミド部分に連結されたＶａｌ－Ａｌａを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２２７であるエキソＣＰ２２７のＩＦＮβ放出及びＥＣ５０の比較を示す。 ＳＴＩＮＧアゴニストの負荷のためのスルフヒドリル反応性化学反応及び脂質会合化学反応を比較するＰＢＭＣアッセイの結果を示す（中央グラフ）。ＣＰ２２９、及びマレイミド部分に連結されたＶａｌ－Ｃｉｔを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２２９であるエキソＣＰ２２９のＩＦＮβ放出及びＥＣ５０の比較を示す。 ＳＴＩＮＧアゴニストの負荷のためのスルフヒドリル反応性化学反応及び脂質会合化学反応を比較するＰＢＭＣアッセイの結果を示す（中央グラフ）。ＣＰ２３８、及びコレステロールに連結されたＶａｌ－Ａｌａを介してＥＶにコンジュゲートされたＣＰ２３８であるエキソＣＰ２３８のＩＦＮβ放出及びＥＣ５０の比較を示す。 Ａは、ＰＢＭＣアッセイにおける、ＡＤＵＳ１００と、ＥＶに（内腔中に）封入されたＡＤＵＳ１００であるエキソＡＤＵＳ１００との間のＩＦＮβ放出の比較データを示す。Ｂは、ＰＢＭＣアッセイにおける、ＣＬ６５６と、ＥＶに（内腔中に）封入されたＣＬ６５６であるエキソＣＬ６５６との間のＩＦＮβ放出の比較データを示す。Ｃは、図３Ａ～３Ｃ及び図４のＡ～Ｂに記載される種々のＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソ－ＳＴＩＮＧアゴニストのＥＣ５０を示す。 エキソＣＰ２２７、エキソＣＰ２２９、エキソＣＰ２５０、エキソＣＰ２３８、エキソＣＰ２３２、及びエキソＣＰ２４６のＥＶの負荷効率を示す。ＥＶの構造は上述される。２つの実験についての各ＥＶ上に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストの数が示される。 ＣＰ２２７、エキソ－ＣＰ２２７、ＣＰ２２９、エキソ－ＣＰ２２９、ＣＰ２３８、エキソ－ＣＰ２３８、ＡＤＵＳ１００、エキソＡＤＵＳ１００、ＣＬ６５６、エキソＣＬ６５６、及びエキソＣＰ２５０の種々のＳＴＩＮＧアゴニスト及びＥＶのＥＣ５０の比較を示す。 モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びマレイミド－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（ｖｃ－ＭＭＡＥ）の構造を示す。 ヒトマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７（ＲＡＷ）細胞で評価したＭＭＡＥの細胞傷害性を示す。ＲＡＷ細胞増殖に対するＭＭＡＥの用量反応効果が、顕微鏡写真（上）、ならびに細胞増殖の測定値（左下）、及び集密度の測定値（右下）において示される。 遊離形態のＭＭＡＥ（ＭＭＡＥ）またはマレイミド－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣリンカーを用いたＭＭＡＥ（ｖｃ－ＭＭＡＥ）の効力を比較する集密度のデータを提示する。 遊離ＭＭＡＥとのエキソソームのインキュベーションに次ぐエキソソームクリーンアップ後のＭＭＡＥの効力を測定する集密度のデータを提示する。エキソソームを０．１Ｍ～２Ｍの濃度のグアニジニウム塩酸塩で洗浄した。 Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥとのエキソソームのインキュベーションに次ぐエキソソームクリーンアップ後のＭＭＡＥの効力を測定する集密度のデータを提示する。エキソソームを０．１Ｍ～２Ｍの濃度のグアニジニウム塩酸塩で洗浄した。 還元または非還元条件下でのＶａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥまたは遊離ＭＭＡＥとのエキソソームのインキュベーションに次ぐＭＭＡＥの効力を測定する集密度のデータを提示する。エキソソームを、５ｍＭのＴＣＥＰの存在または不在下でＶａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥまたはＭＭＡＥとともにインキュベートした。 Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥを負荷したエキソソームの効力に対する還元条件（０ｍＭのＴＣＥＰ～５０ｍＭのＴＣＥＰ）、化合物の負荷濃度（１０μＭ～１００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥ）、及びグアニジニウム塩酸塩の存否（０Ｍまたは１Ｍ）の効果を示す。 Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥを負荷したエキソソームの効力に対する還元条件（０ｍＭのＴＣＥＰ～５０ｍＭのＴＣＥＰ）、化合物の負荷濃度（１００μＭ～３００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥ）、及びグアニジニウム塩酸塩の存否（０Ｍまたは１Ｍ）の効果を示す。 ＰＲＯＴＡＣ（タンパク質分解誘導キメラ分子）の概略図を示す。 ＰＲＯＴＡＣの作用機序の概略図を示す。 ＶＨＬ（Ｅ３リガーゼ）結合リガンド部分、リンカー、及びＴＢＫ１（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１）標的化リガンドを含むＰＲＯＴＡＣに対応する式を示す。この式は、ＰＲＯＴＡＣを細胞外小胞（例えば、エキソソーム）に化学的に連結するためのマレイミドリンカーでの誘導体化に感受性がある、ＶＨＬ（Ｅ３リガーゼ）結合リガンド部分上の潜在的な部位（星印により示される）を示す。 ＣＬＩＰＴＡＣの作用機序の概略図である。 ＡＭ１５２（シクロプロパンカルボン酸、１－［４’－［３－メチル－４－［［［（１Ｒ）－１－フェニルエトキシ］カルボニル］アミノ］－５－イソオキサゾリル］［１，１’－ビフェニル］－４－イル］－）、及びＡＭ０９５（１，１’－ビフェニル］－４－酢酸、４’－［３－メチル－４－［［［（１Ｒ）－１－フェニルエトキシ］カルボニル］アミノ］－５－イソオキサゾリル［］－）の化学構造を示す。１及び２と標示される矢印は、マレイミド反応性基を導入するための誘導に好適な位置（カルボン酸及びカルバメート）を示す。ＡＭ１５２において示される対応する部位はまた、ＡＭ０９５にも存在する。 それらの表面上に複数のＬＰＡ１アンタゴニスト分子を含有するエキソソームの集団を生み出すための、エキソソームへのＬＰＡ１アンタゴニスト（ＡＭ１５２）のコンジュゲーションを示す概略図である。 マレイミド反応性基をどのようにＡＭ１５２に、そのカルボン酸基を介して付加することができるかについての実施例を示す。この例は、マレイミド基とカルボン酸反応性クロロメチルベンゼン基との間に介在するＡｌａ－Ｖａｌ切断可能リンカー及びＣ５スペーサーを含む反応性複合体の一部としてマレイミド基を示す。 ＡＭ１５２を誘導体化するために使用することができる２つの例示的な試薬を示す。上の試薬は、（ｉ）ＡＭ１５２のカルボン酸基と反応することができるクロロメチルベンゼン基、及び（ｉｉ）マレイミド基を含む。（ｉ）と（ｉｉ）との間には、切断可能なＣｉｔ－Ｖａｌジペプチド及びＣ５スペーサーが介在する。下の試薬は、（ｉ）ＡＭ１５２のカルボン酸基と反応することができるクロロメチルベンゼン基、及び（ｉｉ）マレイミド基を含み、（ｉ）と（ｉｉ）との間には、切断可能なＡｌａ－Ｖａｌジペプチド及びＣ５スペーサーが介在する。 コンジュゲーション生成物における（例えば、カテプシンＢによる）Ｃｉｔ－ＶａｌまたはＡｌａ－Ｖａｌジペプチドの切断からもたらされる生成物を示す。生成物ＡＭ１５２アニリンエステルは、内因性エステラーゼによってさらにプロセシングされて、遊離酸ＡＭ１５２生成物を生み出すことが可能である。 遊離マレイミド基及び異なるスペーサーの組み合わせを含むいくつかのＡＭ１５２誘導体を示す。 遊離マレイミド基及び異なるスペーサーの組み合わせを含むいくつかのＡＭ１５２誘導体を示す。 カルボン酸基の保護の後、カルボン酸基を誘導体化するために使用した同じ試薬を使用して、ＡＭ１５２をそのカルバメート基において誘導体化することが可能であることを示す。結果として得られる生成物は、その後、遊離カルボン酸基に脱保護されよう。 マレイミド基との複合体がリンカーを介してＡＭ１５２のカルバメート基に化学的に連結されている実施例を示し、例示する。好適なリンカーには、本明細書に開示されるリンカーのうちのいずれも含まれる。 ＡＭ１５２を誘導体化して、その後、反応性マレイミド基を介して足場部分に結合させる代わりに、それを誘導体化された足場部分に化学的に連結することができることを示す。 （ｉ）ＭＣＣ９５０、（ｉｉ）マレイミド反応性基を導入するようにＭＣＣ９５０を誘導体化するために使用することができる二官能性試薬、及び（ｉｉｉ）マレイミド反応性基を含むＭＣＣ９５０誘導体の構造を示す。二官能性試薬のベンゼン基（＊＊）は、ＭＣＣ９５０のカルバメート基（＊）と反応して、図示されるＭＣＣ９５０誘導体を生み出すことができる。
本開示は、細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム）であって、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、該細胞外小胞、及びその使用を対象とする。マレイミド部分を介して連結された生物学的に活性な分子を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）は、従来の部分、例えば、コレステロールまたはスクシンイミドと比較してより優れた特性を示す。種々の態様の非限定的な例が本開示に示される。
本開示をより詳細に記載する前に、本発明が、記載される特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、したがって、当然のことながら、様々であり得ることを理解されたい。本開示を読めば当業者には明らかとなろうが、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のうちのいずれかの特徴から容易に切り離され得るか、またはそれと組み合わされ得る個別的な構成要素及び特徴を有する。いずれの列挙される方法も、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行われ得る。
本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様の限定ではなく、そのような限定は、本明細書を全体として参照することによって定義され得る。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明するためのものに過ぎず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書を全体的に参照することによってより十分に定義される。
Ｉ．定義
本明細書がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、発明を実施するための形態の全体を通して定められる。
「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、１つまたは複数のその実体を指すことに留意されたく、例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。特許請求の範囲がいずれの任意選択的な要素をも除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等のような排他的な専門用語の使用のため、または否定的な制限の使用のための先行詞としての役目を果たすことが意図される。
さらに、本明細書で使用される場合、「及び／または」は、２つの明記される特徴または構成要素の各々が、他方の有無にかかわらず具体的に開示されていると解釈されるべきである。故に、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句において使用される「及び／または」という用語は、以下の態様の各々、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含することが意図される。
態様が「～を含む」という言い回しとともに本明細書に記載される場合はいずれも、「～からなる」及び／または「～から本質的になる」という用語で記載される、その他の点では類似した態様もまた提供されることが理解される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くについての一般辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により承認される形態で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数を含む。ある範囲の値が列挙される場合、その範囲の列挙される上限と下限との間に介在する各整数値、及びそれらの各分数もまた、かかる値の間の各部分範囲とともに具体的に開示されることを理解されたい。任意の範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれることも、その範囲から排除されることも可能であり、いずれかの限界値を含む、いずれの限界値も含まない、または両方の限界値を含む各範囲もまた本開示内に包含される。故に、本明細書に列挙される範囲は、列挙される端点値を含めて、その範囲内の値の全てについての簡略表記であることが理解される。例えば、１～１０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
ある値が明示的に列挙される場合、列挙される値とおよそ同じ数量または量である値もまた本開示の範囲内にあることを理解されたい。ある組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の各部分的組み合わせもまた具体的に開示され、本開示の範囲内にある。逆に、異なる要素または要素の群が個々に開示される場合、それらの組み合わせもまた開示される。本開示の任意の要素が複数の選択肢を有するものとして開示される場合、その開示において各選択肢が単独でまたは他の選択肢との任意の組み合わせで除外される例もまた、これによって開示される。本開示の１つよりも多くの要素がかかる除外を有することができ、かかる除外を有する要素の全ての組み合わせが、これによって開示される。
ヌクレオチドは、広く認められている１文字の略号で言及される。別途指示されない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の向きで左から右に記載される。ヌクレオチドは、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているそれらの公知の１文字の記号によって言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に記載される。アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているそれらの公知の３文字の記号、または１文字の記号のいずれかによって言及される。
「約」という用語は、本明細書で、およそ、大まかに、前後、またはその領域を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは、定められる数値を上回る境界、及び下回る境界を延長させることによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、述べられる値を、例えば上下に１０パーセント（より高いまたはより低い）の変動幅で上回る数値及び下回る数値を修飾することができる。
「投与」、「投与する」という用語、及びそれらの文法的変形は、薬学的に許容される経路を介して本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）等の組成物を対象に導入することを指す。本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）等の組成物の対象への導入は、腫瘍内、経口、肺内、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸内、リンパ管内、髄腔内、眼周囲、または局所を含む、任意の好適な経路によるものである。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図される機能を果たすことを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用されるとき、「アゴニスト」という用語は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生み出す分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストのいずれかによって活性化され得る。内因性アゴニストの非限定的な例としては、ホルモン、神経伝達物質、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。外因性アゴニストの非限定的な例としては、薬物、低分子、及び環状ジヌクレオチドが挙げられる。アゴニストは、完全、部分的、または逆アゴニストであり得る。
「アミノ酸置換」という用語は、親配列または参照配列（例えば、野生型配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置き換えることを指す。アミノ酸は、例えば、化学ペプチド合成を介してまたは当該技術分野で既知の組換え方法により、親配列または参照配列（例えば、野生型ポリペプチド配列）において置換することができる。したがって、「Ｘ位における置換」への言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸の、代替のアミノ酸残基での置換を指す。一部の態様では、置換パターンは、ＡｎＹというスキーマに従って記述することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸に対応する１文字の略号であり、Ｙは、置換するアミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、Ａｎ（ＹＺ）というスキーマに従って記述することができ、ここで、Ａは、ｎ位に天然にまたは元々存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字の略号であり、Ｙ及びＺは、Ａを置き換えることができる代替の置換するアミノ酸残基である。
本明細書で使用されるとき、「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合すると、生物学的応答自体を誘発するよりも、むしろアゴニスト媒介性応答を遮断または抑制する分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することにより、それらの効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例としては、アルファ遮断薬、ベータ遮断薬、及びカルシウムチャネル遮断薬が挙げられる。アンタゴニストは、競合的、非競合的、または不競合的アンタゴニストであり得る。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、天然であるか、または部分的もしくは全体的に合成的に生産されたかにかかわらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片を含むことが意図され、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチド等の、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片をさらに含む。抗体は、それらが所望の生物学的活性または機能を表す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体、またはその抗原結合断片を含む分子である。
「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」という用語は、互換的に使用され、例えば共有結合性で、治療剤（本明細書で薬剤、薬物、または医薬品有効成分と称されることがある）または薬剤に連結された抗体を指す。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、抗体－薬物コンジュゲートである。
本明細書で使用されるとき、対象となる１つまたは複数の値に適用される「およそ」という用語は、述べられる参照値と類似する値を指す。ある特定の態様では、「およそ」という用語は、別途定めのない限りまたは別途文脈から明らかでない限り、述べられる参照値のいずれかの方向で（それより大きいか、またはそれ未満）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満以内に入る値の範囲を指す（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
「アリール」という用語は、炭素環式芳香族基を指す。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。炭素環式芳香族基は、非置換であり得るか、または－Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮを含むがこれらに限定されない１つもしくは複数の基で置換され得、ここで、各Ｒ’は独立して、Ｈ、－Ｃ１－８アルキル、またはアリールである。
「アリーレン」という用語は、２つの共有結合を有し、以下の構造に示されるようにオルト、メタ、またはパラ構成であり得るアリール基を指し、
Figure 2022525924000015
 ここで、フェニル基は、非置換であり得るか、または－Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮを含むがこれらに限定されない最大４つの基で置換され得、ここで、各Ｒ’は独立して、Ｈ、－Ｃ１－８アルキル、またはアリールである。
本明細書で使用される「生物学的に活性な分子」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結され得る、任意の分子を指し、ここで、分子は、治療もしくは予防を必要とする対象において治療効果もしくは予防効果を有し得るか、または診断目的で使用され得る。したがって、例として、生物学的に活性な分子という用語は、タンパク質（例えば、抗体、タンパク質、ポリペプチド、ならびにその誘導体、断片、及びバリアント）、脂質及びその誘導体、炭水化物（例えば、糖タンパク質におけるグリカン部分）、または低分子を含む。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、放射性同位体である。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、検出可能な部分、例えば、放射性核種、蛍光分子、または造影剤である。
本明細書で使用される「Ｃ１－８アルキル」という用語は、１～８個の炭素原子を有する直鎖または分岐状の飽和炭化水素を指す。代表的な「Ｃ１－８アルキル」基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチル、及び２－メチルブチルが含まれるが、これらに限定されない。
「Ｃ１－１０アルキレン」という用語は、式－（ＣＨ２）１－１０－の直鎖飽和炭化水素基を指す。Ｃ１－１０アルキレンの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、及びデカレンが挙げられる。
「Ｃ３－８炭素環」という用語は、３員、４員、５員、６員、７員、または８員の飽和または不飽和非芳香族炭素環式環を指す。代表的なＣ３－８炭素環には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３－シクロヘキサジエニル、１，４－シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、１，３－シクロヘプタジエニル、１，３，５－シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、及び－シクロオクタジエニルが含まれるが、これらに限定されない。Ｃ３－８炭素環基は、非置換であり得るか、または－Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２－、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮを含むがこれらに限定されない１つもしくは複数の基で置換され得、ここで、各Ｒ’は独立して、Ｈ、－Ｃ１－８アルキル、またはアリールである。
「Ｃ３－８カルボシクロ（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｏ）」という用語は、上記で定義されるＣ３－８炭素環基において、炭素環のうちの１個または複数の水素原子が結合と置き換えられているものを指す。
「Ｃ３－８複素環」という用語は、芳香族または非芳香族Ｃ３－８炭素環において、環炭素原子のうちの１～４個が独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮからなる群から選択されるヘテロ原子と置き換えられているものを指す。Ｃ３－８複素環の代表的な例としては、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、クマリニル、イソキノリニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、及びテトラゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ３－８複素環は、非置換であり得るか、または－Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮを含むがこれらに限定されない最大７つの基で置換され得、ここで、各Ｒ’は独立して、Ｈ、－Ｃ１－８アルキル、またはアリールである。
「Ｃ３－８ヘテロシクロ」という用語は、上記で定義されるＣ３－８複素環基において、複素環基の水素原子のうちの１個が結合と置き換えられているものを指す。Ｃ３－８ヘテロシクロは、非置換であり得るか、または－Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、－アリール、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＨ、－ハロゲン、－Ｎ３、－ＮＨ２、－ＮＨ（Ｒ’）、－Ｎ（Ｒ’）２、及び－ＣＮを含むがこれらに限定されない最大６つの基で置換され得、ここで、各Ｒ’は独立して、Ｈ、－Ｃ１－８アルキル、またはアリールである。
「保存的アミノ酸置換」とは、当該アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、これらには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。故に、ポリペプチドにおけるアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸と置き換えられる場合、その置換は保存的と見なされる。別の態様では、あるアミノ酸の連なりが、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した連なりと保存的に置き換えられ得る。
本明細書で使用されるとき、「保存されている」という用語は、比較されている２つ以上の配列の同じ位置で変化せずに存在するものである、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基をそれぞれ指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所で現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連する配列の中で保存されているものである。
一部の態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」または「同一」といわれる。一部の態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、または少なくとも約９５％同一である場合、「高度に保存されている」といわれる。一部の態様では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも約３０％同一、少なくとも約４０％同一、少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、または少なくとも約９５％同一である場合、「保存されている」といわれる。配列の保存は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの長さ全体に適用され得るか、またはその一部分、領域、もしくは特徴に適用され得る。
本明細書で使用されるとき、「従来のＥＶタンパク質」という用語は、ＥＶにおいて濃縮されることが従来より知られているタンパク質を意味する。
本明細書で使用されるとき、「従来のエキソソームタンパク質」という用語は、エキソソームにおいて濃縮されることが従来より知られているタンパク質を意味し、これには、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩタンパク質、ラクトアドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、反応性マレイミド基またはマレイミド基との反応に感受性があるチオール基のいずれかを導入するように化学的に修飾された、ＥＶ（例えば、エキソソーム）構成成分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ等の足場タンパク質、脂質、または炭水化物）または生物学的に活性な分子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、抗体またはその断片、ＰＲＯＴＡＣ等）を指す。例えば、（ｉ）例えば、遊離アミノ基と反応する基と、（ｉｉ）マレイミド基とを含む二官能性試薬で修飾された抗体は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｘタンパク質における遊離チオール基と反応することができる反応性マレイミド基を含む抗体誘導体をもたらすことが可能である。逆に、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｘを、（ｉ）例えば、遊離アミノ基と反応する基と、（ｉｉ）マレイミド基とを含む二官能性試薬で修飾して、生物学的に活性な分子、例えば、抗体における遊離チオール基と反応することができる反応性マレイミド基を含む足場Ｘ誘導体をもたらすことが可能である。
「賦形剤」及び「担体」という用語は、互換的に使用され、化合物の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性物質を指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞外小胞」、「ＥＶ」という用語、及びそれらの文法的変形は、互換的に使用され、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）を含む。一部の態様では、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内で、細胞外小胞の外部表面上に発現されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで、種々の高分子ペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡ等のＤＮＡまたはＲＮＡ）、モルホリノ、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、抗原、ワクチン、ワクチンアジュバント、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。追加のペイロードは、下記に詳述される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、標的化部分、指向性部分、またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。一部の態様では、細胞外小胞またはＥＶという用語は、細胞外小胞（ＥＶ）の集団を指す。
ある特定の態様では、細胞外ビヒクルは、足場部分を含む。例として、かつ限定することなく、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きている生物もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは臓器、原核細胞もしくは真核細胞、及び／または培養細胞に由来し得る。一部の態様では、細胞外小胞は、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。
本明細書で使用されるとき、「エキソソーム」という用語は、２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞を指す。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を取り囲む膜を含み、一部の態様では、直接原形質膜出芽によるか、または後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞（例えば、プロデューサー細胞）から生成され得る。ある特定の態様では、エキソソームは、足場部分を含む。上述したように、エキソソームは、プロデューサー細胞から得ることができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。一部の態様では、本開示のエキソソームは、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。一部の態様では、エキソソームという用語は、エキソソームの集団を指す。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム、例えば、ナノ小胞）は、マレイミド部分を介して、少なくとも１つの生物学的に活性な分子（例えば、抗体もしくはＡＤＣ等のタンパク質、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のＲＮＡもしくはＤＮＡ、低分子薬、毒素、ＰＲＯＴＡＣ、ＡＡＶ、またはモルホリノ）をＥＶ（例えば、エキソソーム、例えば、ナノ小胞）に化学的に連結することによって操作される。一部の態様では、マレイミド部分は、二官能性試薬の一部である。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソームまたはナノ小胞）は、内部空間（すなわち、内腔）内で、ＥＶの外部（外）表面もしくは内部（内腔）表面に発現されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで、種々の高分子ペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、例えば、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片を含む。ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、生きている生物もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは臓器、原核細胞もしくは真核細胞、及び／または培養細胞に由来し得る。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つまたは複数の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。他の態様では、本開示のＥＶは、限定されないが、ナノ小胞、ミクロソーム、微小胞、細胞外小体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）、またはアポトーシス小体である。
本明細書で使用されるとき、タンパク質（例えば、治療タンパク質等の生物学的に活性な分子、あるいは足場Ｘタンパク質もしくはその断片または足場Ｙタンパク質もしくはその断片等の足場タンパク質）の「断片」という用語は、天然に存在する配列よりも短いタンパク質、天然に存在するタンパク質と比較して当該タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端で欠失のある、または当該タンパク質の任意の部分に欠失のあるタンパク質の、アミノ酸配列を指す。
本明細書で使用されるとき、「機能的断片」という用語は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、一部の態様では、足場タンパク質の機能的断片、例えば、足場Ｘタンパク質の断片は、例えば、マレイミド部分を介して、ある部分、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上または外部表面上に連結または結合させる能力を保持する。同様に、ある特定の態様では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、例えば、マレイミド部分を介して、ある部分、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上に結合させる能力を保持する。
断片が機能的断片であるかどうかは、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ解析、及び、例えばＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との断片の融合を含めた、ＥＶ（例えば、エキソソーム）のタンパク質含量を決定するための当該技術分野で既知の任意の方法によって評価することができる。ある特定の態様では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、例えば、マレイミド部分を介して、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔上または外部表面上に結合させる天然に存在する足場Ｘタンパク質の能力の、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。
本明細書で使用されるとき、生物学的に活性な分子を本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面または外部表面に「連結する」または「結合させる」という用語は、（ｉ）例えば、マレイミド部分等の化学リンカーを介して、生物学的に活性な分子を「化学的に連結する」または「コンジュゲートする」こと、及び（ｉｉ）（例えば、ペプチド結合、アミノ酸リンカー、及び／または足場タンパク質を介して）生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）、またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面もしくは外部表面上に位置する足場タンパク質の部分に「非化学的に連結する」（「融合する」、または「融合」とも称される）ことの両方を含む。
本明細書で使用されるとき、例えば、足場タンパク質を介して、生物学的に活性な分子を本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面または外部表面上に「融合する」、「融合した」、「融合」、または「非化学的に連結する」という用語は、それぞれ、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面または外部表面上に位置する足場分子（例えば、タンパク質）の部分に連結することを指す。一部の態様では、生物学的に活性な分子との間の融合は、遺伝子融合（すなわち、キメラ発現）を介して行うことができる。
本明細書で使用されるとき、「化学的に連結する」及び「コンジュゲートする」という用語は、互換的に使用され、各々が、化学部分、例えば、マレイミド部分を使用した２つ以上の部分（各々が、例えば、ＥＶ、足場部分、生物学的に活性な部分、リンカー（単数または複数）、標的化部分及び／または指向性部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む）の共有結合を指す。結果として、第１の部分（例えば、足場Ｘタンパク質等の足場またはコレステロール等の脂質）は、一方の部分に存在するマレイミド基と他方の部分に存在するスルフヒドリル基との間の反応によって形成されるチオエーテル結合を介して、第２の部分、例えば、生物学的に活性な部分に「化学的に連結される」ようになろう。
本明細書で使用されるとき、「細胞外」という用語は、「外部」、「外」、及び「小胞外」という用語と互換的に使用され得、ここで、各用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り囲む膜の外側にある要素を指す。本明細書で使用されるとき、「細胞内」という用語は、「内部」、「内」、及び「小胞内」という用語と互換的に使用され得、ここで、各用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り囲む膜の内側にある要素を指す。「内腔」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り囲む膜の内側の空間を指す。したがって、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔の内側にある要素は、本明細書で「内腔中に位置する」または「内腔の」と称され得る。
本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、重合体分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２つの分子間の進化的関係を含意する。故に、相同である２つの分子は、進化における共通祖先を有することになる。本開示の文脈において、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
一部の態様では、重合体分子は、分子における単量体の少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が同一であるか（全く同じ単量体）、または類似している（保存的置換）場合、互いに「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
本開示の文脈において、置換（それらがアミノ酸置換と称される場合であっても）は、核酸レベルで実施され、すなわち、あるアミノ酸残基の、代替のアミノ酸残基での置換は、第１のアミノ酸をコードするコドンを、第２のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって実施される。
本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、重合体分子間、例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間の全体的な単量体の保存を指す。いずれの追加の修飾語句も伴わない「同一」という用語（例えば、タンパク質Ａは、タンパク質Ｂと同一である）は、配列が１００％同一であること（１００％の配列同一性）を含意する。２つの配列が、例えば「７０％同一」であると説明することは、それらが、例えば「７０％の配列同一性」を有すると説明することと同等である。
例えば、２つのポリペプチド配列の同一性パーセントの算出は、最適な比較を得る目的で２つの配列をアライメントすることによって行うことができる（例えば、最適なアライメントを得るために第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列の一方または両方にギャップを導入することができ、同一でない配列は比較目的で無視することができる）。ある特定の態様では、比較目的でアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置におけるアミノ酸が比較される。
第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸によって占有される場合、それらの分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントを得るために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行することができる。
好適なソフトウェアプログラムが、種々のソースから、タンパク質及びヌクレオチド配列の両方のアライメントのために利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部である、ｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラム集の一部であり、またｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにてＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）からも利用可能な、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
配列アライメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、またはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥ等といった当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域が各々、それらの独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、小数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り下げられる一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることにも留意されたい。
ある特定の態様では、第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する同一性パーセンテージ（ＩＤ％）は、ＩＤ％＝１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、式中、Ｙは、（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによってアライメントされる）第１の配列及び第２の配列のアライメントにおいて同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントよりも高くなろう。
当業者であれば、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの生成が、もっぱら一次配列データによって駆動される配列対配列のバイナリ比較に限定されないことを理解しよう。また、配列アライメントは、配列データを、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、変異の箇所）、または系統発生学的データ等の異種の供給源からのデータと統合することによって生成され得ることも理解されよう。多重配列アライメントを生成するために異種データを統合する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇにて利用可能、また代替として、例えばＥＢＩから利用可能な、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを算出するために使用される最終的アライメントは、自動的にまたは手作業でのいずれかで精選され得ることも理解されよう。
本明細書で使用されるとき、「免疫調節剤」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に接触させられる標的（例えば、標的細胞）に作用し、免疫系を制御する薬剤を指す。ＥＶ（例えば、エキソソーム）及び／またはプロデューサー細胞に導入することができる免疫調節剤の非限定的な例としては、チェックポイント阻害剤の調節剤、チェックポイント阻害剤のリガンド、サイトカイン、その誘導体、またはそれらの任意の組み合わせ等の薬剤が挙げられる。免疫調節剤にはまた、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、抗原結合断片、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはＤＮＡ等のポリヌクレオチド、または低分子も含まれ得る。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、免疫調節剤である。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、外来性作用物質、または異常な（例えば、がん性）細胞に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、そのような応答は、これらの作用物質及びそれらによって引き起こされる疾患に対して生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つもしくは複数の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、または好中球）、及びこれらの細胞または肝臓のうちのいずれかによって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、これにより侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性もしくは他の異常な細胞、または、自己免疫状態もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的標的化、それへの結合、それへの損傷、その破壊、及び／または脊椎動物の身体からのその排除をもたらす。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化もしくは阻害、または免疫系の任意の他の細胞、例えば、ＮＫ細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。したがって、免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞によって媒介される）、または体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を含み得る。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、免疫応答を誘発することができる分子である。
一部の態様では、免疫応答は、「阻害性」免疫応答である。阻害性免疫応答は、刺激物質（例えば、抗原）の効果を遮断または減弱させる免疫応答である。ある特定の態様では、阻害性免疫応答は、刺激物質に対する阻害性抗体の産生を含む。一部の態様では、免疫応答は、「刺激性」免疫応答である。刺激性免疫応答は、標的抗原（例えば、腫瘍抗原またはウイルス）を破壊し、取り除くことができるエフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）の生成をもたらす免疫応答である。
本明細書で使用される「イムノコンジュゲート」という用語は、結合分子（例えば、抗体）と、結合分子に化学的にコンジュゲートされた１つまたは複数の部分、例えば、治療部分または診断部分とを含む化合物を指す。一般に、イムノコンジュゲートは、一般式Ａ－（Ｌ－Ｍ）ｎにより定義され、式中、Ａは、結合分子（例えば、抗体）であり、Ｌは、任意選択的なリンカーであり、Ｍは、例えば治療剤、検出可能な標識等であり得る異種部分であり、ｎは、整数である。一部の態様では、複数の異種部分を、同じ結合分子（例えば、抗体）における異なる結合点に化学的にコンジュゲートすることができる。他の態様では、複数の異種部分を鎖状につなぎ、結合分子（例えば、抗体）における結合点に結合させることができる。一部の態様では、複数の異種部分（同じまたは異なる）を結合分子（例えば、抗体）にコンジュゲートすることができる。
イムノコンジュゲートはまた、逆順序での当該一般式によっても定義され得る。一部の態様では、イムノコンジュゲートは、「抗体－薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」）である。本開示の文脈において、「イムノコンジュゲート」という用語は、分子の化学的または酵素的コンジュゲートに限定されない。本開示で使用される「イムノコンジュゲート」という用語はまた、遺伝子融合体も含む。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、イムノコンジュゲートである。
本明細書で使用されるとき、「単離された」、「精製された」、「抽出された」という用語、及びそれらの文法的変形は、互換的に使用され、所望のＥＶ（例えば、エキソソーム）調製物の１つまたは複数の精製プロセス、例えば、選択または濃縮を経た、所望のＥＶの調製物の状態（例えば、既知または未知の量及び／または濃度の複数のＥＶ）を指す。一部の態様では、本明細書で使用される単離または精製は、プロデューサー細胞を含有する試料からＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り出す、部分的に取り出す（例えば、画分）プロセスである。一部の態様では、単離されたＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物は、検出可能な望まれない活性を有しないか、または、代替として、望まれない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量以下である。他の態様では、単離されたＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶ（例えば、エキソソーム）の量及び／または濃度を有する。他の態様では、単離されたＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、少なくとも約９９．９９％、少なくとも約９９．９９９％、少なくとも約９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。一部の態様では、単離されたＥＶ（例えば、エキソソーム）調製物は、残留する生物由来物質を実質的に含まない。一部の態様では、単離されたＥＶ（例えば、エキソソーム）調製物は、あらゆる混入する生体由来物質を１００％含まないか、少なくとも約９９％含まないか、少なくとも約９８％含まないか、少なくとも約９７％含まないか、少なくとも約９６％含まないか、少なくとも約９５％含まないか、少なくとも約９４％含まないか、少なくとも約９３％含まないか、少なくとも約９２％含まないか、少なくとも約９１％含まないか、または少なくとも約９０％含まない。残留する生物由来物質には、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物が含まれ得る。残留する生物由来物質を実質的に含まないことはまた、ＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有しないこと、及びＥＶ（例えば、エキソソーム）のみが検出可能であることを意味し得る。
本明細書で使用されるとき、「内腔が操作されたＥＶ」という用語は、操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面または内腔が修飾前のＥＶ（例えば、エキソソーム）または天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）のそれとは異なるように、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜の内腔表面または内腔の組成が修飾された、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を指す。
操作は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔及び／または内腔表面が変化するような、内腔（すなわち、ＥＶ内の空隙）中に直接的なもの、またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜、特に、ＥＶの内腔表面におけるものであり得る。例えば、膜は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面が修飾されるように、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物等の組成が修飾される。同様に、内腔中の内容物が修飾され得る。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。一部の態様では、内腔が操作されたＥＶ（例えば、内腔が操作されたエキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面もしくは内腔上に露出させられ得るか、またはある部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面、ＥＶに連結し得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ（例えば、エキソソーム）が天然では発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の態様では、内腔が操作されたＥＶ（例えば、内腔が操作されたエキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔に露出させられ得るか、またはある部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に連結し得る、天然のＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現を含む。
本明細書で使用されるとき、「高分子」という用語は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを指す。
本明細書で使用されるとき、「マレイミド部分」または「ＭＭ」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）をリンカーまたは生物学的に活性な分子に連結する化学部分を指し、また下記のマレイミド基を含み、
Figure 2022525924000016
 ここで、＊は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上の任意のチオール基（例えば、足場Ｘタンパク質に存在する遊離チオール）への結合点を示し、波線は、マレイミド部分の残部への結合部位を示す。
一部の態様では、＊は、抗体、ＰＲＯＴＡＣ、または任意の他の生物学的に活性な分子上の任意のチオール基への結合点を示し、波線は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）（例えば、足場Ｘタンパク質）へのマレイミド部分の残部への結合部位を示す。
本明細書で使用されるとき、「高分子」という用語は、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを指す。
「修飾された」という用語は、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）の文脈で使用される場合、ＥＶ（例えば、エキソソーム）及び／またはそのプロデューサー細胞の改変または操作により、修飾されたＥＶ（例えば、エキソソーム）が天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）とは異なるようになることを指す。一部の態様では、本明細書に記載の修飾されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜と比較してタンパク質、脂質、低分子、炭水化物等の組成が異なる膜を含む。例えば、膜は、より高い密度もしくは数の天然のＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質を含み、及び／または膜は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然では見出されないタンパク質を含む。ある特定の態様では、膜に対するかかる修飾は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面を変化させる（例えば、本明細書に記載の表面が操作されたＥＶ及びエキソソーム）。ある特定の態様では、膜に対するかかる修飾は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面を変化させる（例えば、本明細書に記載の内腔が操作されたＥＶ及びエキソソーム）。
本明細書で使用されるとき、「修飾タンパク質」または「タンパク質修飾」という用語は、当該タンパク質の非変異アミノ酸配列に対して少なくとも約１５％の同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の修飾は、当該タンパク質の断片またはバリアントを含む。タンパク質の修飾は、当該タンパク質の断片またはバリアントに対する化学修飾、または物理的修飾をさらに含み得る。
本明細書で使用されるとき、「調節する」、「修飾する」という用語、及びそれらの文法的変形は一般に、特定の濃度、レベル、発現、機能、または挙動に適用される場合、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用するため等で、その特定の濃度、レベル、発現、機能、または挙動を増加させるかまたは減少させること、例えば、直接的または間接的に促進する／刺激する／上方制御するか、または妨害する／阻害する／下方制御することによって変化させる能力を指す。一部の事例では、調節剤は、対照と比べて、または一般に予想されるであろう平均活性レベルと比べて、または対照の活性レベルと比べて、ある特定の濃度、レベル、活性、または機能を増加及び／または減少させることができる。
本明細書で使用されるとき、「ナノ小胞」という用語は、約２０ｎｍ～約２５０ｎｍ（例えば、約３０～約１５０ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞を指し、直接的操作または間接的操作によって細胞（例えば、プロデューサー細胞）から生成され、これはナノ小胞が操作なしでは細胞によって産生されないようなものである。ナノ小胞を産生させるための細胞の適切な操作には、連続押出し、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一部の態様では、ナノ小胞の産生は、プロデューサー細胞の破壊をもたらし得る。一部の態様では、本明細書に記載のナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームと原形質膜との融合により細胞から生じる小胞を実質的に含まない。ある特定の態様では、ナノ小胞は、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質もしくはその断片及び／または足場Ｙタンパク質もしくはその断片を含む。ナノ小胞は、ひとたびプロデューサー細胞から得られると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
本明細書で使用されるとき、「ペイロード」という用語は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）に接触させられる標的（例えば、標的細胞）に作用する生物学的に活性な分子（例えば、治療剤）を指す。ＥＶ（例えば、エキソソーム）に導入することができるペイロードの非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または翻訳を妨害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び低分子（例えば、低分子薬及び毒素）等の治療剤が挙げられる。ある特定の態様では、ペイロードは、抗原を含む。本明細書で使用されるとき、「抗原」という用語は、対象に導入されると、それ自体に対する免疫応答（細胞性または体液性）を誘発する、任意の薬剤を指す。一部の態様では、抗原は、免疫応答を誘発するために、すなわち、ワクチンとして使用される。他の態様では、ペイロードは、アジュバントを含む。一部の態様では、ペイロード分子は、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結されている。
「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」という用語、及びそれらの文法的変形は、ヒトを含む動物での使用に対して米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、または米国薬局方に列挙されている薬剤のうちのいずれか、ならびに、対象への組成物の投与が禁じられる程度までの望ましくない生理効果の生成を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性及び性質を抑止しない任意の担体または希釈剤を包含する。薬学的組成物を調製するのに有用であり、一般に安全で、無毒、かつ望ましい賦形剤及び担体が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体及び賦形剤等の１つまたは複数の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされた、またはその中に懸濁された、例えば、本開示のエキソソーム等のＥＶ等の、本明細書に記載の化合物のうちの１つまたは複数を指す。薬学的組成物の１つの目的は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の調製物の、それを必要とする対象への投与を容易にすることである。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含めた、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。この用語は、分子の一次構造を指す。故に、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。それはまた、例えばアルキル化によって、及び／またはキャップ付加によって修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされているかスプライシングされていないかにかかわらず、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含めたポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド性（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含有する他の重合体、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノ重合体、ならびに、重合体がＤＮＡ及びＲＮＡに見出されるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有する限り、他の合成配列特異的核酸重合体を含む。本開示の一部の態様では、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に結合している生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは、合成ｍＲＮＡである。一部の態様では、合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の態様では、ある特定のクラスの全ての核酸塩基が、非天然核酸塩基と置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにおける全てのウリジンが、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンと置き換えられ得る）。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ポリヌクレオチドである。
一部の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、マレイミド部分と反応させるために使用され得るチオール基を導入するように修飾され得る。一部の態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、チオール基と反応させるために使用され得るマレイミド部分の基を導入するように修飾され得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で、任意の長さのアミノ酸の重合体を指して互換的に使用される。重合体は、修飾されたアミノ酸を含み得る。これらの用語は、天然に、または介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは標識成分とのコンジュゲーション等の任意の他の操作もしくは修飾によって修飾された、アミノ酸重合体も包含する。また、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄ－アミノ酸、及びクレアチン等の非天然アミノ酸を含む）を含有するポリペプチド、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義内に含まれる。本開示の一部の態様では、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に結合している生物学的に活性な分子は、ポリペプチド、例えば、抗体もしくはＡＤＣ等のその誘導体、ＰＲＯＴＡＣ、毒素、融合タンパク質、または酵素である。
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子生成物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の同等物、バリアント、及び類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一のポリペプチドであり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多重鎖ポリペプチドも含み得る。最も一般的には、ジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見出される。ポリペプチドという用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学類似体である、アミノ酸重合体にも適用され得る。一部の態様では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
一部の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドは、マレイミド部分と反応させるために使用され得るチオール基を導入するように修飾され得る。一部の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドは、チオール基と反応させるために使用され得るマレイミド部分を導入するように修飾され得る。
本明細書で使用される「予防する」、「予防すること」という用語、及びその変形は、疾患、障害、及び／または病態の発現を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または病態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは臨床徴候の発現を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または病態の１つもしくは複数の症状、特徴、もしくは徴候の発現を部分的もしくは完全に遅延させること；特定の疾患、障害、及び／または病態からの進行を部分的もしくは完全に遅延させること；及び／または疾患、障害、及び／または病態に関連する病状を発症するリスクを減少させることを指す。一部の態様では、転帰の予防は、予防的処置により達成される。
本明細書で使用されるとき、「プロデューサー細胞」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の生成に使用される細胞を指す。プロデューサー細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボの細胞であり得る。プロデューサー細胞には、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の生成に有効であることが知られる細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞ではない。一部の態様では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のうちのいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
本明細書で使用されるとき、「予防的」とは、疾患もしくは病態の発現を予防するため、または疾患もしくは病態に関連する症状を予防するかもしくは遅延させるために使用される治療作用または作用過程を指す。
本明細書で使用されるとき、「予防」とは、健康を維持し、出血エピソードの発現を予防するかもしくは遅延させるため、または疾患もしくは病態に関連する症状を予防するかもしくは遅延させるために取られる措置を指す。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術を介して生産されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作された宿主細胞で発現させた組換え生産されたポリペプチド及びタンパク質は、本開示の目的において単離されていると見なされ、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドも同様である。本明細書に開示されるポリペプチドは、当該技術分野で既知の方法を使用して組換え生産することができる。代替として、本明細書に開示されるタンパク質及びペプチドは、化学合成することができる。本開示の一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に存在する足場Ｘタンパク質及び／または足場Ｙタンパク質は、結果として得られるＥＶ（例えば、エキソソーム）における足場タンパク質のレベルが、かかる足場タンパク質を過剰発現していないプロデューサー細胞のＥＶ（例えば、エキソソーム）に存在する足場タンパク質のレベルと比べて顕著に増加するように、プロデューサー細胞において足場タンパク質を過剰発現させることによって組換え生産することができる。
本明細書で使用されるとき、「足場部分」という用語は、ペイロード、例えば、生物学的に活性な分子、または対象となる任意の他の化合物（例えば、ＡＡＶ）を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上（足場Ｙタンパク質等）または外部表面上（足場Ｘタンパク質等）のいずれかで、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結するために使用することができる分子、例えば、タンパク質またはその断片（例えば、その機能的断片）を指す。一部の態様では、足場タンパク質は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然に存在しないポリペプチドである。ある特定の態様では、足場部分は、合成分子を含む。一部の態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、足場部分は、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然に存在する脂質、炭水化物、タンパク質、またはそれらの組み合わせ（例えば、糖タンパク質またはプロテオリピド）を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然に存在するが、基底／天然／野生型レベルと比べてＥＶ（例えば、エキソソーム）中で濃縮された、脂質または炭水化物を含む。一部の態様では、足場部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に天然に存在するが、例えば、プロデューサー細胞における組換え過剰発現によって、基底／天然／野生型レベルと比べてＥＶ（例えば、エキソソーム）中で濃縮された、タンパク質を含む。ある特定の態様では、足場部分は、足場Ｘタンパク質またはその断片である。一部の態様では、足場部分は、足場Ｙタンパク質またはその断片である。さらなる態様では、ＥＶは、足場Ｘタンパク質またはその断片及び足場Ｙタンパク質またはその断片の両方を含む。
本明細書で使用されるとき、「足場Ｘ」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上で特定されたものであり、ＥＶにおいて過剰発現するように操作することができるＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質を指す。例えば、米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。足場Ｘタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（「ＰＴＧＦＲＮ」）；ベイシジン（「ＢＳＧ」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８」）；インテグリンベータ－１（「ＩＴＧＢ１」）；インテグリンアルファ－４（「ＩＴＧＡ４」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１」、「ＡＴＰ１Ａ２」、「ＡＴＰ１Ａ３」、「ＡＴＰ１Ａ４」、「ＡＴＰ１Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ１」、「ＡＴＰ２Ｂ２」、「ＡＴＰ２Ｂ３」、「ＡＴＰ２Ｂ」）、それらの断片、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の態様では、足場Ｘタンパク質は、全タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、別の部分を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面上または内腔表面上で連結することが可能な最小断片）であり得る。一部の態様では、足場Ｘは、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面または内腔に連結することができる。本開示の一部の態様では、生物学的に活性な分子を、マレイミド部分を介して足場Ｘタンパク質またはその断片に化学的に連結することができる。一部の態様では、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上のマレイミド部分を介して足場Ｘタンパク質またはその断片に化学的に連結することができる。本開示とともに使用することができる他の足場部分の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン（膜メタロエンドペプチダーゼ；ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩタンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一部の態様では、足場部分（例えば、米国特許第１０，１９５，２９０号（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるＥＶタンパク質）は、別の分子（すなわち、第２の結合パートナー）を結合するために使用することができる結合パートナー（例えば、抗原結合ドメイン、カプシドタンパク質、Ｆｃ受容体、化学的に誘導された二量体の結合パートナー、またはそれらの任意の組み合わせ）と融合体を形成する。
本明細書で使用されるとき、「結合パートナー」という用語は、互いに相互作用して多量体（例えば、二量体）を形成する少なくとも２つの要素のうちの１つのメンバーを指す。一部の態様では、結合パートナーは、第２の結合パートナーと相互作用する第１の結合パートナーである。一部の態様では、結合パートナーは、第２の結合パートナー及び／または第３の結合パートナーと相互作用する第１の結合パートナーである。本明細書に開示される組成物及び方法において任意の結合パートナーを使用することができる。一部の態様では、結合パートナーは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、低分子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある特定の態様では、結合パートナー（例えば、第１の結合パートナー及び／または第２の結合パートナー）は、化学的に誘導された二量体の第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーから選択される。
本明細書で使用されるとき、「足場Ｙ」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔内で特定されたものであり、ＥＶにおいて過剰発現するように操作することができるＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質を指す。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９号を参照されたく、同出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。足場Ｙタンパク質の非限定的な例としては、ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳ」）；ミリストイル化アラニンリッチタンパク質キナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１」）；及び脳酸可溶性タンパク質（ｂｒａｉｎ ａｃｉｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）１（「ＢＡＳＰ１」）、それらの断片、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。一部の態様では、足場Ｙタンパク質は、全タンパク質またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、ある部分を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に連結することが可能な最小断片）であり得る。一部の態様では、足場Ｙタンパク質またはその断片は、ある部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に連結することができる。本開示の一部の態様では、ある部分、例えば、生物学的に活性な分子を、足場Ｙタンパク質またはその断片に連結、例えば、化学的に連結することができる。一部の態様では、当該部分、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場Ｙタンパク質またはその断片に連結、例えば、化学的に連結することができる。
ある特定の態様では、足場タンパク質は、ＥＶタンパク質の断片を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の断片を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含む。一部の態様では、足場タンパク質は、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）を含み、ここで、Ｃ末端グリシン残基は、ミリストイル化されている。
一部の態様では、足場タンパク質は、膜貫通型タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「膜貫通型タンパク質」とは、細胞外ドメイン（例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜の外部、例えば、小胞外に位置する少なくとも１つのアミノ酸）、膜貫通ドメイン（例えば、ＥＶの膜内、例えば、エキソソームの膜内に位置する少なくとも１つのアミノ酸）、及び細胞内ドメイン（例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜の内部に位置する少なくとも１つのアミノ酸）を含む、任意のタンパク質を指す。一部の態様では、本明細書に記載の足場タンパク質は、Ｉ型膜貫通型タンパク質であり、該膜貫通型タンパク質のＮ末端は、細胞外空間、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り囲む膜の外側、例えば、小胞外に位置する。一部の態様では、本明細書に記載の足場タンパク質は、ＩＩ型膜貫通型タンパク質であり、該膜貫通型タンパク質のＮ末端は、細胞内空間、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を取り囲む膜の内側、例えば、膜の内腔側、例えば、小胞内に位置する。
本明細書で使用される「自壊性スペーサー」という用語は、第１の部分（例えば、切断可能なリンカー）へのその結合が切断される場合に第２の部分（例えば、生物学的に活性な分子）から自発的に分離する、下記で定義されるようなスペーサーを指す。
本明細書で使用されるとき、「類似性」という用語は、重合体分子、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。重合体分子の互いに対する類似性パーセントの算出は、同一性パーセントの算出と同じ様態で行うことができるが、例外として、類似性パーセントの算出では、当該技術分野で理解されるように保存的置換を考慮に入れる。類似性のパーセンテージは、使用される比較尺度、すなわち、アミノ酸が、例えば、それらの進化的近接度、電荷、体積、柔軟性、極性、疎水性度、芳香族性、等電点、抗原性、またはそれらの組み合わせのどれに従って比較されるかに左右されることが理解される。
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、離間した２つの部分（例えば、切断可能なリンカー及び生物学的に活性な分子）を通常安定な異種の（ｄｉｐａｒｔａｔｅ）分子へと共有結合性で一緒に連結することが可能な二官能性化学部分を指す。
別途指示されない限り、１つまたは複数の立体中心を有する化合物への言及は、各立体中心、及びそれらの立体中心の全ての組み合わせを意図する。
「対象」、「患者」、「個体」、及び「宿主」という用語、及びその変形は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望とされる、限定されないがヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）を含めた任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）パーセンテージ濃度に基づいて１０％未満の高分子、例えば、夾雑物を含むことを意味する。一部の画分は未満、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、または約１０％（ｍ／ｖ）未満の高分子を含有し得る。
本明細書で使用されるとき、「表面が操作されたＥＶ」（例えば、足場Ｘが操作されたエキソソーム）という用語は、操作されたＥＶの表面が修飾前のＥＶまたは天然に存在するＥＶのそれとは異なるように、ＥＶの膜または表面の組成が修飾されたＥＶを指す。
本明細書で使用されるとき、「表面が操作されたエキソソーム」（例えば、足場Ｘが操作されたエキソソーム）という用語は、操作されたエキソソームの表面が修飾前のエキソソームまたは天然に存在するエキソソームのそれとは異なるように、エキソソームの膜または表面（外部表面または内腔表面）の組成が修飾されたエキソソームを指す。
操作は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面が変化するような、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜におけるものであり得る。例えば、膜は、例えば、タンパク質、脂質、低分子、炭水化物、またはそれらの組み合わせの組成が修飾され得る。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前にもしくは同時に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作により事前に修飾された細胞から産生させることによって変化させることができる。一部の態様では、表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に露出させられ得るか、またはある部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に連結し得る、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ（例えば、エキソソーム）が天然では発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の態様では、表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に露出させられ得るか、またはある部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に連結し得る、天然のＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質（例えば、足場Ｘタンパク質）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現（例えば、より多数）を含む。具体的な態様では、表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つまたは複数の膜構成成分、例えば、足場Ｘタンパク質等のタンパク質もしくはその断片、脂質、低分子、炭水化物、またはそれらの任意の組み合わせの修飾を含み、該構成成分のうちの少なくとも１つは、例えば、マレイミド部分を介して、生物学的に活性な分子に連結、例えば、化学的に連結されている。
本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、それを必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理及び／または生理効果を生み出すのに十分である、本開示のＥＶまたはエキソソームを含む試薬または薬学的化合物の量である。予防は治療と見なされ得るため、治療上有効量は、「予防上有効量」であり得る。
本明細書で使用される「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、例えば、疾患もしくは病態の重症度の低減；疾患過程の継続期間の低減；疾患もしくは病態に関連する１つもしくは複数の症状の改善または排除；疾患もしくは病態の治癒を必ずしも伴わない、疾患もしくは病態を有する対象への有益な効果の提供；またはそれらの任意の組み合わせを指す。この用語はまた、疾患もしくは病態またはその症状の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）も含む。一態様では、「処置すること」または「処置」という用語は、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面上に抗原（ワクチン抗原）及び任意選択でアジュバントを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を投与することによって、それを必要とする対象において抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。
本明細書で使用されるとき、分子（例えば、機能的分子、抗原、アジュバント、足場Ｘタンパク質もしくは断片及び／または足場Ｙタンパク質もしくはその断片）の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法によって比較した際に、別の分子とある特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、あるタンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト、または再構成を含むことができる。
一部の態様では、足場Ｘまたは誘導体のバリアントには、完全長の成熟ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰトランスポータータンパク質の断片（例えば、機能的断片）に対して少なくとも約７０％の同一性を有する足場Ｘバリアントが含まれる。
一部の態様では、本明細書に開示される足場Ｘタンパク質もしくはその誘導体のバリアントまたはその断片のバリアントは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に特異的に標的化される能力を保持する。一部の態様では、足場Ｘまたは足場Ｘ誘導体は、１つまたは複数の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。
一部の態様では、足場Ｙまたはその誘導体のバリアントは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片に対して少なくとも７０％の同一性を有するバリアントを含む。
一部の態様では、足場Ｙタンパク質もしくはその誘導体のバリアントまたはその断片のバリアントは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に特異的に標的化される能力を保持する。一部の態様では、足場Ｙタンパク質は、１つまたは複数の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。
天然に存在するバリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベル及び／またはポリペプチドレベルのいずれかで様々であり得、本開示に含まれる。代替として、天然に存在しないバリアントは、変異誘発技法によって、または直接的合成によって生み出され得る。
タンパク質操作及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、バリアントを生成して、ポリペプチドの特性を改善または改変することができる。例えば、生物学的機能の実質的な喪失を伴わずに、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を欠失させることができる。Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３））（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、アミノ末端の３個、８個、または２７個のアミノ酸残基を欠失させた後であってもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質について報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０個のアミノ酸残基を欠失させた後に、最大で１０倍高い活性を表した（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）（参照によりその全体が本明細書に援用される））。
その上、バリアントは、天然型タンパク質の生物学的活性と類似した生物学的活性を保持する場合が多いことを十分な証拠が実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に援用される））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの大規模な変異解析を実施した。同研究者らは、ランダム変異誘発を用いて、分子の全長にわたって１つのバリアント当たり平均２．５個のアミノ酸変化をもつ３，５００個を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。可能なアミノ酸位置の各々で複数の変異を検査した。同研究者らは、「分子の［大半］が、［結合活性または生物学的活性］のいずれかに対する影響をほとんど伴わずに改変可能であった」ことを見出した（要約を参照されたい）。実際、検査した３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、２３個の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が顕著に異なるタンパク質をもたらした。
上述したように、バリアントまたは誘導体は、例えば、修飾ポリペプチドを含む。一部の態様では、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖タンパク質のバリアントまたは誘導体は、化学修飾及び／または内因性修飾の結果である。一部の態様では、バリアントまたは誘導体は、インビボ修飾の結果である。一部の態様では、バリアントまたは誘導体は、インビトロ修飾の結果である。なおも他の態様では、バリアントまたは誘導体は、プロデューサー細胞における細胞内修飾の結果である。
バリアント及び誘導体に存在する修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフォチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）の共有結合、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される））、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化が含まれる。
一部の態様では、足場Ｘタンパク質及び／または足場Ｙタンパク質は、任意の好都合な箇所で修飾され得る。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、任意の好都合な箇所で修飾され得る。本開示の特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）構成成分（例えば、足場Ｘタンパク質、足場Ｙタンパク質等のタンパク質、脂質、グリカン、またはそれらの組み合わせ）及び／または生物学的に活性な分子（例えば、抗体もしくはＡＤＣ、ＰＲＯＴＡＣ、環状ジヌクレオチド等の低分子、ＭＭＡＥ等の毒素、ＳＴＩＮＧアゴニスト、寛容化剤（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ワクチン抗原等の抗原、アジュバント、標的化部分、指向性部分、またはそれらの任意の組み合わせ）は、少なくとも１つのマレイミド部分を含む誘導体を生み出すように修飾され得る。
ＩＩ．コンジュゲートされたＥＶ（例えば、エキソソーム）
細胞外小胞（ＥＶ）は典型的には、直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍであり、例えば、小さな細胞外小胞であるエキソソームは典型的には、直径が１００～２００ｎｍである。ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、限定的な脂質二重層ならびに多様なタンパク質及び核酸の組から構成される（Ｍａａｓ，Ｓ．Ｌ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７（３）：１７２－１８８（２０１７））。ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、個別的な細胞種及び組織において優先的な取り込みを表し、標的細胞の表面上の受容体と相互作用するタンパク質をそれらの表面に付加することによってそれらの指向性を導くことができる（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（４）：３４１－３４５（２０１１））。
抗体とは異なり、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つのＥＶ（例えば、エキソソーム）当たりおよそ数千から数万個の分子である、多数の分子をそれらの表面に結合させて受け入れることができる。故に、ＥＶ（例えば、エキソソーム）－薬物コンジュゲートは、高濃度の治療用化合物を個別的な細胞種に送達しながら、同時に化合物への全体的な全身曝露を制限することにより、ひいてはオフターゲット毒性を低減する、プラットフォームを表す。
本開示は、遊離チオール基を含む第１の分子実体を、マレイミド基を含む第２の分子実体と反応させることによって操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供し、該マレイミド部分は、図１Ａに提示されるように、マレイミド部分を介して第１の分子実体（例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）または足場Ｘタンパク質もしくは脂質等のその構成成分）を第２の分子実体（例えば、生物学的に活性な分子）と共有結合性で連結する。
マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に結合させることができる生物学的に活性な分子の非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、モルホリノ、アミノ酸（例えば、検出可能な部分または翻訳を妨害する毒素を含むアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、低分子（例えば、低分子薬及び毒素）、抗原（例えば、ワクチン抗原）、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）等といった薬剤が挙げられる。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つよりも多くの種類の生物学的に活性な分子を含み得る。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、例えば、環状ジヌクレオチド等の低分子、アウリスタチン（例えば、モノエチルアウリスタチンＥ、ＭＭＡＥ）等の毒素、抗体（例えば、裸の抗体または抗体－薬物コンジュゲート）、ＳＴＩＮＧアゴニスト、寛容化剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＲＯＴＡＣ、モルホリノ、リゾホスファチジン酸受容体アンタゴニスト（例えば、ＬＰＡ１アンタゴニスト）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、例えば、ワクチン抗原及び任意選択でワクチンアジュバントを含み得る。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、治療的ペイロード（例えば、ＳＴＩＮＧ、または下記に開示される１つのペイロード）ならびに標的化部分及び／または指向性部分を含み得る。
したがって、本明細書に開示される方法は、図１Ａに提示されるような分子実体をもたらし得、ここで、ＥＶ（例えば、エキソソーム）、またはポリペプチド（例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片）、脂質、リポタンパク質、糖タンパク質、もしくはＥＶ（例えば、エキソソーム）上に位置する天然に存在するもしくは天然に存在しないタンパク質の任意のバリアントもしくは誘導体等のその任意の分子構成成分は、マレイミド部分を介して、生物学的に活性な分子、例えば、治療的ペイロード、標的化部分、指向性部分、またはそれらの任意の組み合わせに化学的に連結され得る。図１Ａに図示されるように、一部の態様では、スルフヒドリル（チオール）基を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）またはその分子構成成分は、生物学的に活性な部分に結合しているマレイミド基と反応することができる。他の態様では、マレイミド基を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）またはその分子構成成分は、生物学的に活性な部分に存在するスルフヒドリル（チオール）基と反応することができる。いずれの場合も、最終生成物は、チオエーテル結合を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に化学的に結合している生物学的に活性な分子である。
ＩＩ．Ａ．マレイミド部分
マレイミド部分は、下記のマレイミド基（例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）をリンカー（例えば、ペプチド）につなげる二官能性化学部分）を含む任意の化学部分であり得、
Figure 2022525924000017
 式中、
（ｉ）＊は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する任意の利用可能なマレイミド反応基、例えば、足場Ｘタンパク質の遊離チオール基への結合点を示し、
（ｉｉ）波線は、マレイミド部分の残部への結合部位を示す。
一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に結合している硫黄原子、例えば、チオール基に天然に存在する硫黄原子または化学修飾を介してもしくは変異を介して導入された硫黄原子に結合する。
一部の態様では、マレイミド部分は、式（Ｉ）を有し、
Figure 2022525924000018
 式中、
（ｉ）Ｒ１は、－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８カルボシクロ）－、－（Ｃ３－８カルボシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８ヘテロシクロ－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－からなる群から選択され、
（ｉｉ）ｒは、例えば、１～１０の整数であり、
（ｉｉｉ）＊は、任意の利用可能な反応性硫黄原子、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在するチオール基における硫黄への結合点を示し、
（ｉｖ）波線は、生物学的に活性な分子へのマレイミド部分の結合部位を示す。
一部の態様では、Ｒ１は、－Ｃ１－８アルキレン－、－Ｃ３－６カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－８アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－８アルキレン－、－Ｃ１－８アルキレン－（Ｃ３－６カルボシクロ）－、－（Ｃ３－６カルボシクロ）－Ｃ１－８アルキレン－、－Ｃ３－６ヘテロシクロ－、－Ｃ１－８アルキレン－（Ｃ３－６ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－６ヘテロシクロ）－Ｃ１－８アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒは、例えば、１～１０の整数である。
一部の態様では、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｓ－、シクロペンチル、シクロヘキシル、－Ｏ－（ＣＨ２）ｓ－、－フェニル－、－ＣＨ２－フェニル－、－フェニル－ＣＨ２－、－ＣＨ２－シクロペンチル－、－シクロペンチル－ＣＨ２－、－ＣＨ２－シクロヘキシル－、－シクロヘキシル－ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒは、例えば、１～６の整数である。
一部の態様では、Ｒ１は、－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｓは、例えば、４、５、または６である。
一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２）５－である。
Figure 2022525924000019
一部の態様では、マレイミド部分は、式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｒ１は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒは、２である。
Figure 2022525924000020
一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基に共有結合性で連結され、該官能基は、スルフヒドリル（チオール）基である。一態様では、スルフヒドリル基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上のタンパク質、例えば、足場Ｘタンパク質、またはその断片もしくはバリアント上にある。例えば、一部の態様では、スルフヒドリル基は、チオール脂質、例えば、コレステロール－ＳＨ、ＤＳＰＥ－ＳＨ、またはその誘導体、例えば、コレステロール－ＰＥＧ－ＳＨまたはＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＳＨ上に存在し得る。
他の態様では、マレイミド部分は、マレイミド部分を提供するように化学的に誘導体化された、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基に共有結合性で連結されている。例えば、一態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在するアミン官能基（例えば、リジンもしくはアルギニンの側鎖上のアミン、またはタンパク質の末端アミン基）が、例えば、スクシンイミド部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬で誘導体化され得る。
他の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在するカルボキシル官能基（例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸の側鎖上のカルボキシル、またはタンパク質の末端カルボキシル基）が、例えば、イソシアネート部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬で誘導体化され得る。なおも他の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在するカルボニル（酸化された炭水化物）が、例えば、ヒドラジン部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬で誘導体化され得る。
一般に、本明細書に開示される方法は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面（外部表面または内腔表面）上に存在する分子（例えば、タンパク質、脂質、糖）と反応すると、分子を共有結合性または非共有結合性で修飾して、少なくとも１つのマレイミド部分を含む修飾された分子を生み出す、任意の試薬、例えば、二官能性または多官能性試薬を使用して実施することができる。ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面（外部表面または内腔表面）上に存在する分子は、天然に存在するものであり得るか、またはそれは天然に存在しないものであり得、すなわち、それは、例えば、化学修飾、天然に存在しない分子を含む組成物とのインキュベーションを介して、もしくは変異を介して（例えば、変異を介して１つまたは複数のシステインアミノ酸をタンパク質に導入することによって）、修飾されている。
マレイミド部分を含む二官能性試薬、すなわち、いくつかのマレイミド含有単位が多量体化し得る試薬、またはマレイミド基を介して官能性部分（例えば、ＰＥＧ）を付加することができるマレイミド含有試薬には、例えば、ヒドラジン部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬、イソシアネート部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬、スクシンイミド部分及びマレイミド部分を含む二官能性試薬、ビオチン－マレイミド、ストレプトアビジン－マレイミド、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｎ－（４－マレイミドブチルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、マレイミド－ＰＥＧ－スクシンイミジルエステル（例えば、マレイミド－ＰＥＧ１２－スクシンイミジルエステル、マレイミド－ＰＥＧ２－スクシンイミジルエステル、マレイミド－ＰＥＧ２０００－スクシンイミジルエステル、マレイミド－ＰＥＧ５０００－スクシンイミジルエステル、またはマレイミド－ＰＥＧｎ－スクシンイミジルエステル（ここで、１＜ｎ＜５０００である））、マレイミド－ＰＥＧ－マレイミド（例えば、例えば、マレイミド－ＰＥＧ１２－マレイミド、マレイミド－ＰＥＧ２－マレイミド、マレイミド－ＰＥＧ２０００－マレイミド、マレイミド－ＰＥＧ５０００－マレイミド、またはマレイミド－ＰＥＧｎ－マレイミド（ここで、１＜ｎ＜５０００である））、マレイミド－ＯＨ、マレイミド－ＰＥＧｎ－ＯＨ（ここで、１＜ｎ＜５０００である）、マレイミド－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ε－カプロラクトン）、（Ｓ）－（－）－Ｎ－（１－フェニルエチル）マレイミド、Ｎ－（４－クロロフェニル）マレイミド、Ｎ－（１－ピレニル）マレイミド、メトキシポリエチレングリコールマレイミド、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルマレイミド、Ｎ－（４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１１，１１，１１－ヘプタデカフルオロウンデシル）マレイミド、デフェロキサミン－マレイミド（すなわち、キレート剤－マレイミド）、マレイミドグリシジルエーテル、二官能性マレイミドＤＴＰＡ、二官能性ＮＯＴＡ－マレイミドキレート剤、ホモ二官能性マレイミド架橋剤（すなわち、各末端にマレイミド基を有するもの）、ビス－マレイミドポリアルキレングリコール、ＤＢＣＯ－マレイミド、ベンゾトリアゾールマレイミド、アルキンマレイミド、マレイミド官能基化脂質、マレイミド官能基化ＰＥＧ脂質、ならびに一般に、少なくとも１つのマレイミド部分、少なくとも１つの追加の反応性部分（例えば、マレイミド基または別の反応性基）及び１つまたは複数の任意選択的なリンカー（例えば、ＰＥＧ、またはポリグリセロール等の別の重合体）を含む任意の分子が含まれる。
ＩＩ．Ｂ．リンカー
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、マレイミド部分を生物学的に活性な分子またはＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結する（すなわち、つなげる）１つまたは複数のリンカーを含み得る。一部の態様では、マレイミド部分は、リンカーによって生物学的に活性な分子に連結されている。リンカーは、例えば、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のマレイミド部分を、例えば、生物学的に活性な分子に連結することができる、任意の化学部分であり得る。一部の態様では、マレイミド部分は、１つまたは複数のリンカーを含み得る。一部の態様では、本明細書に開示されるリンカーまたはそれらの組み合わせを使用して、例えば、マレイミド部分を生物学的に活性な分子に、第１の生物学的に活性な部分を第２の生物学的に活性な部分に、ＥＶ（例えば、膜脂質またはその足場タンパク質）をマレイミド部分に、またはＥＶ（例えば、膜脂質またはその足場タンパク質）を生物学的に活性な部分につなげることができる。
一部の態様では、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーがタンデムで連結され得る。本明細書に開示されるマレイミド部分に複数のリンカーが存在する場合、リンカーの各々は、同じであることも、または異なることもできる。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を阻止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましい場合がある。したがって、一部の態様では、リンカーは、プロテアーゼにより切断可能な１つまたは複数の部位を含むことができ、これらの部位は、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のそれぞれの末端でリンカーに隣接し得る。
一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１７０個、少なくとも約１８０個、少なくとも約１９０個、または少なくとも約２００個のアミノ酸を含み得る。
他の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、または少なくとも約１，０００個のアミノ酸を含み得る。ペプチドリンカーは、１～約５個のアミノ酸、１～約１０個のアミノ酸、１～約２０個のアミノ酸、約１０～約５０個のアミノ酸、約５０～約１００個のアミノ酸、約１００～約２００個のアミノ酸、約２００～約３００個のアミノ酸、約３００～約４００個のアミノ酸、約４００～約５００個のアミノ酸、約５００～約６００個のアミノ酸、約６００～約７００個のアミノ酸、約７００～約８００個のアミノ酸、約８００～約９００個のアミノ酸、または約９００～約１０００個のアミノ酸を含み得る。
一部の態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍによるグリシン／セリンリンカー（配列番号４６）であり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（配列番号４７）によるものであり、式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎ（配列番号４８）を含み、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号４９）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号５０）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。
具体的な態様では、ペプチドリンカーの配列は、ＧＧＧＧ（配列番号３０）である。
一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。
他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３１）を含む。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１７）を含む。これらの事例では、ｎは、１～１００の整数であり得る。他の事例では、ｎは、１～２０の整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。一部の態様では、ｎは、１～１００の整数である。
リンカーの追加の例としては、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２１９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２２１）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２２）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、リンカーは、ポリ－Ｇ配列（ＧＧＧＧ）ｎ（配列番号２２３）であり、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。
一部の態様では、ペプチドリンカーは、合成であり、すなわち、天然に存在しない。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖状配列を、それが自然界で天然には連結または遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然のまたは天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換、または欠失等の変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含み得る。
他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含み得る。なおも他の態様では、ペプチドリンカーは、自然界では存在しない直鎖状配列で存在する、天然に存在するアミノ酸を含み得る。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。
一部の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーを含む。他の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーからなる。一部の態様では、非ペプチドリンカーは、例えば、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、メトキシルポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）等であり得る（例えば、米国特許第７，３７５，０７８号を参照されたい）。
リンカーは、当該技術分野で既知の技法（例えば、化学的コンジュゲーション、組換え技法、またはペプチド合成）を使用して、マレイミド部分に導入することができる。一部の態様では、リンカーは、組換え技法を使用して導入することができる。他の態様では、リンカーは、固相ペプチド合成を使用して導入することができる。ある特定の態様では、本明細書に開示されるマレイミド部分は、当該技術分野で既知の組換え技法を使用して導入された１つまたは複数のリンカー、及び固相ペプチド合成または化学的コンジュゲーション法を使用して導入された１つまたは複数のリンカーを同時に含有し得る。
リンカーは、切断に感受性がある場合があり（「切断可能なリンカー」）、それによって、生物学的に活性な分子の放出を容易にする。故に、一部の態様では、本明細書に開示されるマレイミド部分は、切断可能なリンカーを含み得る。かかる切断可能なリンカーは、生物学的に活性な分子が活性なままである条件下で、例えば、酸誘導性の切断、光誘導性の切断、ペプチダーゼ誘導性の切断、エステラーゼ誘導性の切断、及びジスルフィド結合の切断に感受性がある場合がある。代替として、リンカーは、切断に実質的に耐性であり得る（「切断不可能なリンカー」）。
一部の切断可能なリンカーは、プロテアーゼによって切断される（「プロテアーゼで切断可能なリンカー」）。ある特定のペプチドのみが、細胞の内側または外側で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６－６２９（１９８２）及びＵｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．４３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７－６８４（１９８９）を参照されたい。切断可能なリンカーは、α－アミノ酸単位、及び化学的には１つのアミノ酸のカルボキシレートと第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合から構成される、切断可能な部位を含有し得る。カルボキシレートとリジンのα－アミノ酸基との間の結合等の他のアミド結合は、ペプチド結合ではないと理解され、切断不可能であると見なされる。
一部の態様では、プロテアーゼで切断可能なリンカーは、プロテアーゼ、例えば、ネプリライシン（ＣＡＬＬＡまたはＣＤｌＯ）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、エンドセリン変換酵素、ｓｔｅ２４プロテアーゼ、ノイロリシン、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、間質コラゲナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメリシン、マクロファージエラスターゼ、マトリリシン、ゼラチナーゼ、メプリン、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ－エンドペプチダーゼ、ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴメタロプロテイナーゼ、ミエリン関連メタロプロテイナーゼ、エナメリシン、腫瘍壊死因子α－変換酵素、インスリシン、ナルディライジン、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マグノリシン、ダクチリシン様メタロプロテアーゼ、好中球コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＳＰ２エンドペプチダーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、ウロキナーゼ、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）、トリプシン、キモトリプシン、カルデクリン（ｃａｌｄｅｃｒｉｎ）、膵エラスターゼ、膵エンドペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、白血球エラスターゼ、骨髄芽球、キマーゼ、トリプターゼ、グランザイム、角質層キモトリプシン酵素、アクロシン、カリクレイン、補体成分及び因子、代替経路補体ｃ３／ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ、凝固因子、トロンビン、タンパク質ｃ型、ｕ型、及びｔ型プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンＧ、ヘプシン、プロスタシン、肝細胞増殖因子活性化エンドペプチダーゼ、サブチリシン／ケキシン型プロタンパク質転換酵素、フーリン、プロタンパク質転換酵素、プロリルペプチダーゼ、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジル－グリカミナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｇｌｙｃａｍｉｎａｓｅ）、シグナルペプチダーゼ、ｎ末端求核性アミノヒドロラーゼ、２０ｓプロテアソーム、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼＩａ、ｈｔｒａ２ペプチダーゼ、マトリプターゼ、部位１プロテアーゼ、レグマイン、カテプシン、システインカテプシン、カルパイン、ユビキチンイソペプチダーゼＴ、カスパーゼ、グリコシルホスファチジルイノシトリプロテイントランスアミダーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓａｍｉｄａｓｅ）、がんプロコアグラント、プロホルモンチオールプロテアーゼ、γ－グルタミルヒドロラーゼ、ブレオマイシンヒドロラーゼ、セプラーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＭ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、キモシン、ガストリクシン、レニン、ヤプシン及び／またはマプシン（ｍａｐｓｉｎ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、または一般的な任意のＡｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ、もしくはＡｒｇ－Ｃプロテアーゼに対する切断部位を含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２４）：７０２７－７０３７（２０１７）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の態様では、切断可能なリンカー構成成分は、１～１０個のアミノ酸残基を含むペプチドを含む。これらの態様では、ペプチドは、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、リソソーム酵素等の細胞内プロテアーゼへの曝露時に生物学的に活性な分子の放出を容易にする（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－７８４）。例示的なペプチドには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、及びヘキサペプチドが含まれるが、これらに限定されない。例示的なジペプチドには、バリン－アラニン（ｖａｌ－ａｌａ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、フェニルアラニン－リジン（ｐｈｅ－ｌｙｓ）、Ｎ－メチル－バリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンが含まれるが、これらに限定されない。例示的なトリペプチドには、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が含まれるが、これらに限定されない。
ペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基及び／または非天然アミノ酸残基を含み得る。「天然に存在するアミノ酸」という用語は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを指す。「非天然アミノ酸」（すなわち、アミノ酸が天然に存在しない）には、非限定的な例として、ホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノ－システイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、ベータ－アラニン、Ｌ－またはＤ－ナフトアラニン（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｉｎｅ）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）等が含まれる。ペプチドは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断のために設計及び最適化され得る。
アミノ酸にはまた、天然及び非天然アミノ酸のＤ型も含まれる。「Ｄ－」は、天然に存在する（「Ｌ－」）アミノ酸における配置とは対照的に、「Ｄ」（右旋性の）配置を有するアミノ酸を指定する。天然及び非天然アミノ酸は、商業的に購入することも（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）、または当該技術分野で既知の方法を使用して合成することもできる。
一部のリンカーは、エステラーゼによって切断される（「エステラーゼで切断可能なリンカー」）。ある特定のエステルのみが、細胞の内側または外側に存在するエステラーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸及びアルコールの縮合によって形成される。単純エステルは、単純アルコール、例えば、脂肪族アルコール、ならびに小環状及び小芳香族アルコールにより生成されるエステルである。
一部の態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。一部の態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。一部の態様では、リンカーは、「酸に不安定なリンカー」である。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸に不安定なリンカーにはまた、例えば、シス－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも含まれる。
一部の態様では、リンカーは、切断不可能なリンカー（ｌｉｋｅｒ）を含む。切断不可能なリンカーは、安定な共有結合性の様態でマレイミド部分を生物学的に活性な分子に連結することが可能な任意の化学部分であり、切断可能なリンカーに関して上記に列挙されるカテゴリーに該当しない。故に、切断不可能なリンカーは、酸誘導性の切断、光誘導性の切断、ペプチダーゼ誘導性の切断、エステラーゼ誘導性の切断、及びジスルフィド結合の切断に実質的に耐性である。さらに、切断不可能とは、リンカー内またはリンカーに隣接する化学結合が、環状ジヌクレオチド及び／または抗体がその活性を喪失しない条件下で、酸、光に不安定な切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理学的化合物によって誘導される切断に耐える能力を指す。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、スペーサーを介してリンカーに結合している。一態様では、スペーサーは、自壊性スペーサーである。別の態様では、スペーサーは、非自壊性スペーサーである。
一部の態様では、リンカーは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、切断不可能なリンカーを含む。一部の態様では、切断不可能なリンカーは、生物学的に活性な分子を切断不可能なリンカーに連結するスペーサー単位を含む。一部の態様では、１つまたは複数の切断不可能なリンカーは、一緒に連結されたより小さい単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、Ｃ２～Ｃ１２アルキル等）を含む。一態様では、結合は、エステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）または他の結合である。
ＩＩ．Ｂ．１．エチレングリコール（ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ）リンカー
一部の態様では、リンカーは、切断不可能なリンカーを含み、該切断不可能なリンカーは、式Ｒ３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－またはＲ３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－Ｏ－を特徴とするポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、式中、Ｒ３は、水素、メチル、またはエチルであり、ｎは、２～２００の値を有する。一部の態様では、リンカーは、スペーサーを含み、該スペーサーは、ＰＥＧである。
一部の態様では、ＰＥＧリンカーは、オリゴ－エチレングリコール、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、またはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーである。
一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。
一部の態様では、ｎは、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。
一部の具体的な態様では、ｎは、３～２００、３～２０、１０～３０、または９～４５の値を有する。
一部の態様では、ＰＥＧは、分岐状ＰＥＧである。分岐状ＰＥＧは、中心コア基から発する３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。
ある特定の態様では、ＰＥＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の規定の鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、典型的には、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。ある特定の式では、単分散ＰＥＧ部分は、ｍｄＰＥＧという略語を割り当てられる。
一部の態様では、ＰＥＧは、星状ＰＥＧである。星状ＰＥＧは、中心コア基から発する１０～１００本のＰＥＧ鎖を有する。
一部の態様では、ＰＥＧは、櫛状ＰＥＧである。櫛状ＰＥＧは、通常は重合体骨格にグラフトされている複数のＰＥＧ鎖を有する。
ある特定の態様では、ＰＥＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的にはおよそ１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある特定の態様では、ＰＥＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的にはおよそ４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。
一部の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ７００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ９００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、またはＰＥＧ３０００である。１つの特定の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ４００である。別の特定の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００である。
一部の態様では、本開示のリンカーは、いくつかのＰＥＧリンカー、例えば、ＰＥＧ、ＨＥＧ、またはＴＥＧリンカーが隣接する切断可能なリンカーを含み得る。
一部の態様では、リンカーは、（ＨＥＧ）ｎ及び／または（ＴＥＧ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介してつながっている。
ＩＩ．Ｂ．２．グリセロール及びポリグリセロール（ＰＧ）
一部の態様では、リンカーは、式（（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２Ｏ）ｎ－）によって記述されるグリセロール単位またはポリグリセロール（ＰＧ）を含む、切断不可能なリンカーを含み、式中、Ｒ３は、水素、メチル、またはエチルであり、ｎは、３～２００の値を有する。一部の態様では、ｎは、３～２０の値を有する。一部の態様では、ｎは、１０～３０の値を有する。
一部の態様では、ＰＧリンカーは、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、またはヘキサグリセロール（ＨＧ）リンカーである。
一部の態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。
一部の態様では、ｎは、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。
これらの態様の一部の代替例では、ｎは、９～４５の値を有する。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述される分岐状ポリグリセロールであり、式中、Ｒ５は、水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ３は、水素、メチル、またはエチルである。一部の態様では、異種部分は、式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ５－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述される高分岐状ポリグリセロールであり、式中、Ｒ５は、水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ６－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述されるグリセロール鎖であり、式中、Ｒ６は、水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＲ７－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述されるグリセロール鎖であり、式中、Ｒ７は、水素であるか、または式（Ｒ３－Ｏ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－）によって記述される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ３は、水素、メチル、またはエチルである。高分岐状グリセロール及びその合成のための方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１－５４７９、Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１００ Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４３，１２９－４１、及びその中で引用される参考文献に記載される。
ある特定の態様では、ＰＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、特に１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的にはおよそ１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある特定の態様では、ＰＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、特に３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的にはおよそ４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。
一部の態様では、ＰＧは、ＰＧ１００、ＰＧ２００、ＰＧ３００、ＰＧ４００、ＰＧ５００、ＰＧ６００、ＰＧ７００、ＰＧ８００、ＰＧ９００、ＰＧ１０００、ＰＧ１１００、ＰＧ１２００、ＰＧ１３００、ＰＧ１４００、ＰＧ１５００、ＰＧ１６００、ＰＧ１７００、ＰＧ１８００、ＰＧ１９００、ＰＧ２０００、ＰＧ２１００、ＰＧ２２００、ＰＧ２３００、ＰＧ２４００、ＰＧ２５００、ＰＧ１６００、ＰＧ１７００、ＰＧ１８００、ＰＧ１９００、ＰＧ２０００、ＰＧ２１００、ＰＧ２２００、ＰＧ２３００、ＰＧ２４００、ＰＧ２５００、ＰＧ２６００、ＰＧ２７００、ＰＧ２８００、ＰＧ２９００、またはＰＧ３０００である。１つの特定の態様では、ＰＧは、ＰＧ４００である。別の特定の態様では、ＰＧは、ＰＧ２０００である。
一部の態様では、リンカーは、（グリセロール）ｎ、及び／または（ＨＧ）ｎ、及び／または（ＴＧ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介してつながっている。
ＩＩ．Ｂ．３．脂肪族（アルキル）リンカー
一部の態様では、リンカーは、少なくとも１つの脂肪族（アルキル）リンカー、例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、またはＣ２～Ｃ１０アルキルもしくはＣ２～Ｃ６アルキル等のＣ２～Ｃ１２アルキルを含む。
一部の態様では、リンカーは、アルキル鎖、例えば、非置換アルキルを含む。一部の態様では、リンカーの組み合わせは、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニレイル（ａｌｋｅｎｙｌｅｙｌ）アルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、またはアルケニルヘテロシクリルアルキニルを含む。
任意選択で、これらの構成成分は置換される。置換基には、アルコール、アルコキシ（メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ等）、直鎖もしくは分岐鎖アルキル（Ｃ１～Ｃ１２アルキル等）、アミン、アミノアルキル（アミノＣ１～Ｃ１２アルキル等）、ホスホロアミダイト、ホスフェート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ等）、アミド、アルキルアミド（アミドＣ１～Ｃ１２アルキル等）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、スルホニルハロゲン化物、イミド酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート（ｈａｌｏｆｏｒｍａｔｅ）、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｕｉｍｉｄｅ）付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、アルキルハロゲン化物、スルホン酸アルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（マンノース、ガラクトース、及びグルコース等）、α，β－不飽和カルボニル、アルキル水銀、またはα，β－不飽和スルホンが含まれる。
「アルキル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別途定めのない限り、指定される炭素原子の数を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する（例えば、Ｃ１～Ｃ１０は、１～１０個の炭素原子を意味する）。典型的には、アルキル基は、１～２４個の炭素原子を有する、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個の炭素原子、または１～６個の炭素原子を有することになる。「低級アルキル」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキル基である。「アルキル」という用語は、二価及び多価ラジカルを含む。例えば、「アルキル」という用語は、適切な場合はいつでも、例えば、アルキル基が二価であることを式が示す場合、または置換基が結合して環を形成する場合、「アルキレン」を含む。アルキルラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ならびに、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、及びｎ－オクチルのホモログ及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、二価（ジラジカル）アルキル基を意味し、ここで、アルキルは、本明細書で定義される。「アルキレン」は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－により例示されるが、これらに限定されない。典型的には、「アルキレン」基は、１～２４個の炭素原子を有する、例えば、１０個以下の炭素原子（例えば、１～８個または１～６個の炭素原子）を有することになる。「低級アルキレン」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキレン基である。
「アルケニル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルケニル基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する。一態様では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子または２～６個の炭素原子及び１～３つの二重結合を有する。例示的なアルケニル基には、ビニル、２－プロペニル、１－ブタ－３－エニル、クロチル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、２－イソペンテニル、１－ペント－３－エニル、１－ヘキサ－５－エニル等が含まれる。
「アルキニル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖または分岐鎖の不飽和または多価不飽和炭化水素ラジカルを指す。典型的な「アルキニル」基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。本開示の一態様では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。例示的なアルキニル基には、プロプ－１－イニル、プロプ－２－イニル（すなわち、プロパルギル）、エチニル、及び３－ブチニルが含まれる。
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、及び「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味において使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に結合しているアルキル基を指す。
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、述べられる炭素原子の数（例えば、Ｃ２～Ｃ１０、またはＣ２～Ｃ８）、ならびに、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ、及びＰ（一態様では、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選定される少なくとも１個のヘテロ原子（ここで、窒素、硫黄、及びリン原子は任意選択で酸化され、窒素原子（複数可）は任意選択で四級化される）からなる安定な直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に置かれる。ヘテロアルキル基の例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３及び－ＣＨ２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ３）３等、最大２個のヘテロ原子が連続していることが可能である。
同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する二価ラジカルを意味し、これは、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－により例示されるようなものであるが、これらに限定されない。典型的には、ヘテロアルキル基は、３～２４個の原子（水素を除く、炭素及びヘテロ原子）（３員～２４員のヘテロアルキル）を有することになる。別の例では、ヘテロアルキル基は、総計３～１０個の原子（３員～１０員のヘテロアルキル）または３～８個の原子（３員～８員のヘテロアルキル）を有する。「ヘテロアルキル」という用語は、適切な場合はいつでも、例えば、ヘテロアルキル基が二価であることを式が示す場合、または置換基が結合して環を形成する場合、「ヘテロアルキレン」を含む。
「シクロアルキル」という用語は、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、３～２４個の炭素原子を有する、例えば、３～１２個の炭素原子を有する、飽和または不飽和の非芳香族炭素環式ラジカルを表す（例えば、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルまたはＣ３～Ｃ６シクロアルキル）。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキル」という用語はまた、ノルボルニル、アダマンチル、及びビシクロ［２．２．１］ヘプチル等の、架橋した多環式（例えば、二環式）構造も含む。「シクロアルキル」基は、アリール（例えば、フェニル）環、ヘテロアリール（例えば、ピリジル）環、及び非芳香族（例えば、炭素環式または複素環式）環から選択される少なくとも１つの（例えば、１～３つの）他の環に縮合され得る。「シクロアルキル」基が、縮合アリール、ヘテロアリール、または複素環式環を含む場合、「シクロアルキル」基は、炭素環式環を介して分子の残部に結合している。
「ヘテロシクロアルキル」、「複素環式」、「複素環」、または「ヘテロシクリル」という用語は、それ自体でまたは他の用語と組み合わせて、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ、及びＰ（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選択される少なくとも１個かつ最大５個のヘテロ原子（ここで、窒素、硫黄、及びリン原子は任意選択で酸化され、窒素原子（複数可）は任意選択で四級化される）（例えば、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～４個のヘテロ原子）を含有する炭素環式の非芳香環（例えば、３員～８員環、及び例えば、４員、５員、６員、または７員環）、または当業者に既知の安定な組み合わせで少なくとも１個かつ最大１０個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１～５個のヘテロ原子）を含有する４員～８員環の縮合環系を表す。例示的なヘテロシクロアルキル基には、縮合フェニル環が含まれる。「複素環式」基が、縮合アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキル環を含む場合、「複素環式」基は、複素環を介して分子の残部に結合している。ヘテロ原子は、複素環が分子の残部に結合している位置を占めることができる。
本開示の例示的なヘテロシクロアルキルまたは複素環式基には、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルＳ－オキシド、チオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ホモモルホリニル、ホモチオモルホリニル、ホモチオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニルＳ－オキシド、テトラヒドロチエニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニルＳ－オキシド、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニル等が含まれる。
「アリール」とは、単環（例えば、フェニル）を有するかまたは他の芳香環もしくは非芳香環（例えば、１～３つの他の環）に縮合されている５員、６員、または７員の芳香族炭素環式基を意味する。「アリール」基が、非芳香環（１，２，３，４－テトラヒドロナフチルにおいて等）またはヘテロアリール基を含む場合、「アリール」基は、アリール環（例えば、フェニル環）を介して分子の残部に結合している。アリール基は、任意選択で（例えば、本明細書に記載の１～５つの置換基で）置換される。一例では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する。アリール基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、キノリン、インダニル、インデニル、ジヒドロナフチル、フルオレニル、テトラリニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル、または６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ａ］シクロヘプテニルが挙げられる。一態様では、アリール基は、フェニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル、及びナフチルから選択される。なおも別の態様では、アリール基は、フェニルである。
「アリールアルキル」または「アラルキル」という用語は、アリール基またはヘテロアリール基がアルキル基に結合して、－アルキル－アリール及び－アルキル－ヘテロアリールというラジカルを作り出す、ラジカルを含むことを意図し、ここで、アルキル、アリール及びヘテロアリールは、本明細書で定義される。例示的な「アリールアルキル」または「アラルキル」基には、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等が含まれる。
「アリールオキシ」とは、－Ｏ－アリールという基を意味し、ここで、アリールは、本明細書で定義される通りである。一例では、アリールオキシ基のアリール部分は、フェニルまたはナフチルである。一態様では、アリールオキシ基のアリール部分は、フェニルである。
「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、及びＢ（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１～３個のヘテロ原子等の１～５個のヘテロ原子）（ここで、窒素及び硫黄原子は任意選択で酸化され、窒素原子（複数可）は任意選択で四級化される）を含有する多価不飽和の５員、６員、または７員の芳香族部分を指す。「ヘテロアリール」基は、単環であることも、または他のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキル環（例えば、１～３つの他の環）に縮合されることもできる。「ヘテロアリール」基が、縮合アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環を含む場合、「ヘテロアリール」基は、ヘテロアリール環を介して分子の残部に結合している。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して分子の残部に結合していることが可能である。
一例では、ヘテロアリール基は、４～１０個の炭素原子ならびにＯ、Ｓ、及びＮから選択される１～５個のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、ピリダジニル、ピラジニル、イソインドリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、イソクロマニル、クロマニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソインドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ピリドピリジル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、プリニル、ベンゾジオキソリル、トリアジニル、プテリジニル、ベンゾチアゾリル、イミダゾピリジル、イミダゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソオキサジニル、ベンゾイソオキサジニル、ベンゾオキサジニル、ジヒドロベンゾイソチアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロモニル、クロマノニル、ピリジル－Ｎ－オキシド、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロキノリノニル、ジヒドロイソキノリノニル、ジヒドロクマリニル、ジヒドロイソクマリニル、イソインドリノニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリノニル、ピロリルＮ－オキシド、ピリミジニルＮ－オキシド、ピリダジニルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド、キノリニルＮ－オキシド、インドリルＮ－オキシド、インドリニルＮ－オキシド、イソキノリルＮ－オキシド、キナゾリニルＮ－オキシド、キノキサリニルＮ－オキシド、フタラジニルＮ－オキシド、イミダゾリルＮ－オキシド、イソオキサゾリルＮ－オキシド、オキサゾリルＮ－オキシド、チアゾリルＮ－オキシド、インドリジニルＮ－オキシド、インダゾリルＮ－オキシド、ベンゾチアゾリルＮ－オキシド、ベンズイミダゾリルＮ－オキシド、ピロリルＮ－オキシド、オキサジアゾリルＮ－オキシド、チアジアゾリルＮ－オキシド、トリアゾリルＮ－オキシド、テトラゾリルＮ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシドが挙げられる。例示的なヘテロアリール基には、イミダゾリル、ピラゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、及びピリジルが含まれる。他の例示的なヘテロアリール基には、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、ピリジン－４－イル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンズイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが含まれる。上記のアリール環系及びヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記に記載される許容されるアリール基の置換基の群から選択される。
脂肪族リンカーの例としては、以下の構造、すなわち、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－、－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ１－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－、－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２－、－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ２－ＣＨ２－ＣＯ－、－Ｏ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）２－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ４－、－（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ１ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ１－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２）ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－が挙げられ、ここで、ｎ１は、１～４０（例えば、２～２０、または２～１２）の整数であり、ｎ２は、１～２０（例えば、１～１０、または１～６）の整数であり、ｎ３及びｎ４は、同じであることも、または異なることもでき、１～２０（例えば、１～１０、または１～６）の整数である。
一部の態様では、リンカーは、（Ｃ３）ｎ、（Ｃ４）ｎ、（Ｃ５）ｎ、（Ｃ６）ｎ、（Ｃ７）ｎ、もしくは（Ｃ８）ｎ、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介してつながっている。
ＩＩ．Ｂ．４．切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。切断可能なリンカーという用語は、破断または切断され得る少なくとも１つの結合または化学結合を含むリンカーを指す。本明細書で使用されるとき、切断という用語は、比較的大きな分子における、２つ以上の比較的より小さな分子をもたらす様態での１つまたは複数の化学結合の破断を指す。例えば、切断は、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、もしくはレダクターゼによって、または特定の物理化学的条件、例えば、レドックス環境、ｐＨ、活性酸素種の存在、もしくは特定の光の波長によって媒介され得る。
一部の態様では、本明細書で使用される「切断可能な」という用語は、例えば、ホスホジエステル及びジスルフィド等の、例えば、迅速に分解可能なリンカーを指す一方で、「切断不可能な」という用語は、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート等の、例えば、より安定な結合を指す。一部の態様では、切断可能なリンカーは、ジヌクレオチドもしくはトリヌクレオチドリンカー、ジスルフィド、イミン、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の態様では、切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。
ＩＩ．Ｂ．４．ａ．レドックスで切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、レドックスで切断可能なリンカーを含む。非限定的な例として、切断可能なリンカーの１つの種類は、還元時または酸化時に切断されるレドックスで切断可能な連結基である。一部の態様では、レドックスで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合を含有し、すなわち、それはジスルフィドで切断可能なリンカーである。レドックスで切断可能なリンカーは、例えば、細胞内メルカプタン、オキシダーゼ、またはレダクターゼによって還元され得る。
ＩＩ．Ｂ．４．ｂ．活性酸素種（ＲＯＳ）で切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、例えば、活性化した好中球等の炎症プロセスによって生成される、スーパーオキシド（Ｏ２ －）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等の活性酸素種（ＲＯＳ）によって切断され得る、切断可能なリンカーを含み得る。一部の態様では、ＲＯＳで切断可能なリンカーは、チオケタールで切断可能なリンカーである。例えば、米国特許８，３５４，４５５Ｂ２を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
ＩＩ．Ｂ．４．ｃ．ｐＨ依存性で切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、酸性条件下（ｐＨ＜７）で選択的に切断される連結基である、酸で切断可能な連結基を含む「酸に不安定なリンカー」である。非限定的な例として、酸で切断可能な連結基は、酸性環境、例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ未満で切断される。一部の態様では、ｐＨは、約６．５以下である。一部の態様では、リンカーは、一般酸として作用し得る酵素、例えば、ペプチダーゼ（これは基質特異的であり得る）またはホスファターゼ等の薬剤によって切断される。細胞内で、エンドソーム及びリソソーム等のある特定の低ｐＨオルガネラは、酸で切断可能な連結基に切断環境を提供することができる。ヒト血清のｐＨは７．４であるものの、細胞内の平均ｐＨは、約７．１～７．３の範囲で若干より低い。また、エンドソームは、５．５～６．０の範囲の酸性ｐＨを有し、リソソームは、さらにより酸性ｐＨで約５．０である。したがって、ｐＨ依存性で切断可能なリンカーは、当該技術分野でエンドソームで不安定なリンカーと呼ばれることがある。
酸で切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。別の非限定的な例では、エステル酸素に結合している炭素（アルコキシ基）が、アリール基に結合している場合、例えば、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチル等の三級アルキル基。酸で切断可能な連結基の例としては、アミン、イミン、アミノエステル、安息香酸イミン（ｂｅｎｚｏｉｃ ｉｍｉｎｅ）、ジオルトエステル（ｄｉｏｒｔｈｏ ｅｓｔｅｒ）、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、シス－アコニット酸、ヒドラジド、チオカルバモイル、イミジン、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスクされたエンドソーム分解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）剤、シトラコニル（ｃｉｔｒａｃｏｎｙｌ）基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ジスルフィド結合もまた、ｐＨに感受性がある。
一部の態様では、リンカーは、低ｐＨに不安定なヒドラゾン結合を含む。かかる酸に不安定な結合は、コンジュゲート、例えば、抗体－薬物コンジュゲートの分野で広範囲に使用されてきた。例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２：１４６０－７、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．４：１０２４－３７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．６：８３８－５０、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３２１：４６２－８、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：２２９－３６、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－８４を参照されたく、これらの文献の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ある特定の態様では、リンカーは、以下のもの、すなわち、酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、ジオール及びケトンを形成するケタール；酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、ジオール及びアルデヒドを形成するアセタール；イミンもしくは酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）で不安定で、アミン及びアルデヒドもしくはケトンを形成するイミニウム；酸性条件下で不安定であるケイ素－酸素－炭素結合；ケイ素－窒素（シラザン）結合；ケイ素－炭素結合（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアメート（ｍａｌｅａｍａｔｅ）（無水マイレン酸誘導体及びアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸触媒加水分解を経るように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド））；またはビニルエーテルから選択される、低ｐＨに不安定な結合を含む。
さらなる例は、米国特許第９，７９０，４９４Ｂ２号及び同第８，１３７，６９５Ｂ２号に見出すことができ、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ＩＩ．Ｂ．４．ｄ．酵素で切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、細胞内または細胞外酵素、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼによって切断可能なリンカーを含み得る。リンカーの組み合わせにおいて特定のリンカーを切断することができる酵素の範囲は、リンカーの特定の結合及び化学構造に依存する。したがって、ペプチド性リンカーは、例えば、ペプチダーゼによって切断され得、エステル結合を含有するリンカーは、例えば、エステラーゼによって切断され得、アミド結合を含有するリンカーは、例えば、アミダーゼによって切断され得る、等である。
ＩＩ．Ｂ．４．ｅ．プロテアーゼで切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーは、プロテアーゼで切断可能なリンカー、すなわち、内因性プロテアーゼによって切断され得るリンカーを含む。ある特定のペプチドのみが、細胞の内側または外側で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６２６－６２９、及びＵｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：６７７－６８４を参照されたい。切断可能なリンカーは、α－アミノ酸単位、及び化学的には１つのアミノ酸のカルボキシレートと第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合から構成される、切断可能な部位を含有し得る。カルボキシレートとリジンのα－アミノ酸基との間の結合等の他のアミド結合は、ペプチド結合ではないと理解され、切断不可能であると見なされる。
一部の態様では、プロテアーゼで切断可能なリンカーは、プロテアーゼ、例えば、ネプリライシン（ＣＡＬＬＡまたはＣＤｌＯ）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、エンドセリン変換酵素、ｓｔｅ２４プロテアーゼ、ノイロリシン、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、間質コラゲナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメリシン、マクロファージエラスターゼ、マトリリシン、ゼラチナーゼ、メプリン、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ－エンドペプチダーゼ、ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴメタロプロテイナーゼ、ミエリン関連メタロプロテイナーゼ、エナメリシン、腫瘍壊死因子α－変換酵素、インスリシン、ナルディライジン、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マグノリシン、ダクチリシン様メタロプロテアーゼ、好中球コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＳＰ２エンドペプチダーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、ウロキナーゼ、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）、トリプシン、キモトリプシン、カルデクリン（ｃａｌｄｅｃｒｉｎ）、膵エラスターゼ、膵エンドペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、白血球エラスターゼ、骨髄芽球、キマーゼ、トリプターゼ、グランザイム、角質層キモトリプシン酵素、アクロシン、カリクレイン、補体成分及び因子、代替経路補体ｃ３／ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ、凝固因子、トロンビン、タンパク質ｃ型、ｕ型、及びｔ型プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンＧ、ヘプシン、プロスタシン、肝細胞増殖因子活性化エンドペプチダーゼ、サブチリシン／ケキシン型プロタンパク質転換酵素、フーリン、プロタンパク質転換酵素、プロリルペプチダーゼ、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジル－グリカミナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｇｌｙｃａｍｉｎａｓｅ）、シグナルペプチダーゼ、ｎ末端求核性アミノヒドロラーゼ、２０ｓプロテアソーム、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼＩａ、ｈｔｒａ２ペプチダーゼ、マトリプターゼ、部位１プロテアーゼ、レグマイン、カテプシン、システインカテプシン、カルパイン、ユビキチンイソペプチダーゼＴ、カスパーゼ、グリコシルホスファチジルイノシトリプロテイントランスアミダーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓａｍｉｄａｓｅ）、がんプロコアグラント、プロホルモンチオールプロテアーゼ、γ－グルタミルヒドロラーゼ、ブレオマイシンヒドロラーゼ、セプラーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＭ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、キモシン、ガストリクシン、レニン、ヤプシン及び／またはマプシン（ｍａｐｓｉｎ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、または一般的な任意のＡｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ、もしくはＡｒｇ－Ｃプロテアーゼに対する切断部位を含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２４）：７０２７－７０３７（２０１７）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の態様では、切断可能なリンカー構成成分は、１～１０個のアミノ酸残基を含むペプチドを含む。これらの態様では、ペプチドは、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、リソソーム酵素等の細胞内プロテアーゼへの曝露時に生物学的に活性な分子の放出を容易にする（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－７８４）。例示的なペプチドには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、及びヘキサペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
ペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基及び／または非天然アミノ酸残基を含み得る。「天然に存在するアミノ酸」という用語は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを指す。「非天然アミノ酸」（すなわち、アミノ酸が天然に存在しない）には、非限定的な例として、ホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノ－システイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、ベータ－アラニン、Ｌ－またはＤ－ナフトアラニン（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｉｎｅ）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）等が含まれる。ペプチドは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断のために設計及び最適化され得る。
アミノ酸にはまた、天然及び非天然アミノ酸のＤ型も含まれる。「Ｄ－」は、天然に存在する（「Ｌ－」）アミノ酸における配置とは対照的に、「Ｄ」（右旋性の）配置を有するアミノ酸を指定する。天然及び非天然アミノ酸は、商業的に購入することも（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）、または当該技術分野で既知の方法を使用して合成することもできる。
例示的なジペプチドには、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチル－バリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンが含まれるが、これらに限定されない。例示的なトリペプチドには、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩ．Ｂ．４．ｆ．エステラーゼで切断可能なリンカー
一部のリンカーは、エステラーゼによって切断される（「エステラーゼで切断可能なリンカー」）。ある特定のエステルのみが、細胞の内側または外側に存在するエステラーゼ及びアミダーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸及びアルコールの縮合によって形成される。単純エステルは、単純アルコール、例えば、脂肪族アルコール、ならびに小環状及び小芳香族アルコールにより生成されるエステルである。エステルに基づく切断可能な連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステルで切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。
ＩＩ．Ｂ．４．ｇ．ホスファターゼで切断可能なリンカー
一部の態様では、リンカーの組み合わせは、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される、リン酸に基づく切断可能な連結基を含み得る。細胞内リン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内ホスファターゼ等の酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、または－ＯＰ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－であり、ここで、Ｒｋは、ＮＨ２、ＢＨ３、ＣＨ３、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ６－１０アリール－オキシである。一部の態様では、Ｃ１－６アルキル及びＣ６－１０アリールは、非置換である。さらなる非限定的な例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。
ＩＩ．Ｂ．４．ｈ．光活性化される切断可能なリンカー
一部の態様では、組み合わせは、光活性化される切断可能なリンカー、例えば、ニトロベンジルリンカーまたはニトロベンジル反応性基を含むリンカーを含む。
ＩＩ．Ｃ．自壊性スペーサー
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）における自壊性スペーサーは、プロテアーゼで切断可能なリンカーの酵素的切断後に１，４排除を経る。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）における自壊性スペーサーは、プロテアーゼで切断可能なリンカーの酵素的切断後に１，６排除を経る。一部の態様では、自壊性スペーサーは、例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）、ｐ－アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、ｐ－アミノベンジルカーボネート、またはそれらの組み合わせである。
ある特定の態様では、自壊性スペーサーは、芳香族基を含む。一部の態様では、芳香族基は、ベンジル、シンナミル、ナフチル、及びビフェニルからなる群から選択される。一部の態様では、芳香族基は、複素環式である。他の態様では、芳香族基は、少なくとも１つの置換基を含む。一部の態様では、少なくとも１つの置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ８アルキルハロゲン化物、カルボキシレート、スルフェート、スルファメート、及びスルホネートからなる群から選択される。
他の態様では、芳香族基における少なくとも１つのＣは、Ｎ、Ｏ、またはＣ－Ｒ’’で置換され、ここで、Ｒ’’は独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ３＋、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ１－Ｃ８アルキルハロゲン化物、カルボキシレート、スルフェート、スルファメート、及びスルホネートから選択される。
一部の態様では、自壊性スペーサーは、アミノベンジルカルバメート基、アミノベンジルエーテル基、またはアミノベンジルカーボネート基を含む。一態様では、自壊性スペーサーは、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）である。Ｐ－アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）は、自壊性の部位特異的なプロドラッグ活性化のための最も効率的で最も普及したコネクタ結合である（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９－４８０、ＷＯ １９８１／００１１４５、Ｒａｕｔｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：２５５－２７０、Ｓｉｍｐｌｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １３：５１９－５４７を参照されたく、これらの文献の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。ＰＡＢＣは、プロテアーゼによる切断及び１，６の自発的断片化時に任意のアミン薬物、ペプチド、及びタンパク質の放出を可能にする。
一部の態様では、自壊性スペーサーは、生物学的に活性な分子（例えば、抗体）をプロテアーゼで切断可能な基質につなげる。具体的な態様では、ＰＡＢＣ自壊性スペーサーのカルバメート基が、生物学的に活性な分子（例えば、抗体）のＮ末端につなげられ、ＰＡＢＣ自壊性スペーサーのアミノ基が、プロテアーゼで切断可能な基質につなげられる。
アミノベンジル基の芳香環は、任意選択で、環を形成する４個の非置換炭素のうちの１個にさもなければ結合している水素を置き換える、芳香環上の１つまたは複数の（例えば、Ｒ１及び／またはＲ２）置換基で置換され得る。本明細書で使用されるとき、「Ｒｘ」（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４）という記号は、本明細書に記載されるような置換基を表す一般的略語である。
置換基は、ｐ－アミノベンジル基の自壊性能力を改善し得る。Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：２７５９－２７７０を参照されたく、また、Ｓｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１６０１－１６０８も参照されたい。
自壊性の排除は、例えば、１，４排除、１，６排除（例えば、ＰＡＢＣ）、１，８排除（例えば、ｐ－アミノ－シンナミルアルコール）、β排除、環化排除（例えば、４－アミノブタノールエステル及びエチレンジアミン）、環化／ラクトン化、環化／ラクトン化等を介して起こり得る。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：１８０２－１８２６及びＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４７５－４８７を参照されたい。
一部の態様では、自壊性スペーサーは、例えば、シンナミル、ナフチル、またはビフェニル基を含み得る（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２：７７３－７９０を参照されたい）。一部の態様では、自壊性スペーサーは、複素環式環を含む（例えば、米国特許第７，３７５，０７８号、同第７，７５４，６８１号を参照されたい）。水性条件下及び生理学的条件下の両方で自壊性である、多数のホモ芳香族（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９、Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：２９７５、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：１１９７、Ａｎｄｒｉａｎｏｍｅｎｊａｎａｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２：１９０３を参照されたい）、及びクマリン（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６：５５３を参照されたい）、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール（例えば、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５３３を参照されたい）、ピリジン（例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７：４８２５を参照されたい）、イミダゾン（例えば、Ｎａｉｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．Ｚ：１２６７、Ｈａｙ ａｎｄ Ｄｅｎｎｙ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８：８４２５を参照されたい）、ならびにトリアゾール（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｓｓｏｎ（２００７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７２：３５９６を参照されたい）に基づくヘテロ芳香族基が、当該技術分野で既知である。また、米国特許第７，６９１，９６２号、同第７，０９１，１８６号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２００６／０２６９４８０号、同第ＵＳ２０１０／００９２４９６号、同第ＵＳ２０１０／０１４５０３６号、同第ＵＳ２００３／０１３０１８９号、及び同第ＵＳ２００５／０２５６０３０号も参照されたく、これらの文献の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本明細書に開示されるマレイミド部分は、タンデムで１つよりも多くの自壊性スペーサー、例えば、２つ以上のＰＡＢＣ単位を含む。例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８８１５－８８３０を参照されたい。一部の態様では、本明細書に開示されるマレイミド部分は、蛍光発生プローブに連結された自壊性スペーサー（例えば、ｐ－カルボキシベンゾアルデヒドまたはグリオキシル酸のｐ－アミノベンジルアルコールまたはヘミチオアミナール（ｈｅｍｉｔｈｉｏａｍｉｎａｌ）誘導体）を含み得る（例えば、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７７－１７８０を参照されたい）。
自壊性リンカーにおける置換基が、左から右へ記述される、それらの従来の化学式によって明記される場合、それらは、その構造を右から左へ記述することからもたらされよう化学的に同一の置換基を等しく包含する。例えば、「－ＣＨ２Ｏ－」は、「－ＯＣＨ２－」も列挙することが意図される。
自壊性リンカーにおける置換基、例えば、上記で考察したようなｐ－アミノベンジル自壊性リンカーにおけるＲ１及び／またはＲ２置換基には、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリール等が含まれ得る。本開示の化合物が１つよりも多くの置換基を含む場合、それらの置換基の各々は独立して選定される。
一部の具体的な態様では、リンカーは、式（ＩＶ）を有し、
－Ａａ－Ｙｙ－（ＩＶ）、
式中、各－Ａ－が独立して、アミノ酸単位であり、ａが独立して、１～１２の整数であり、－Ｙ－が、スペーサー単位であり、ｙが、０、１、または２である。一部の態様では、－Ａａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドである。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンからなる群から選択される。一部の態様では、－Ａａ－は、バリン－アラニンまたはバリン－シトルリンである。一部の態様では、ｙは、１である。一部の態様では、－Ｙ－は、自壊性スペーサーである。
一部の態様では、自壊性スペーサー－Ｙｙ－は、式（Ｖ）を有し、
Figure 2022525924000021
 式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である。一部の態様では、ｍは、０、１、または２である。一部の態様では、ｍは、０である。
一部の態様では、式（ＩＶ）の切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。一部の態様では、スペーサー単位－Ｙ－は、例えば－Ｇｌｙ－または－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－等の、非自壊性スペーサーである。
一部の態様では、リンカーは、酸に不安定なリンカーである。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、シス－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、酸に不安定なリンカーは、生物学的に活性な分子を酸に不安定なリンカーに連結するスペーサー単位を含む。好適なスペーサー単位は、－Ｙｙ－に関連して上述されるものである。
一部の態様では、リンカーは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、切断不可能なリンカーである。一部の態様では、切断不可能なリンカーは、生物学的に活性な分子を切断不可能なリンカーに連結するスペーサー単位を含む。
一部の態様では、本開示は、生物学的に活性な分子及び切断可能なリンカーを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供し、該切断可能なリンカーは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を生物学的に活性な分子につなげ、また該切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）を切断可能なリンカーに連結する、マレイミド部分をさらに含む。好適なマレイミド部分は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）のマレイミド部分等の、上述されるものである。一部の態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する官能基に共有結合性で連結され、該官能基は、スルフヒドリル（チオール）であり、該スルフヒドリル基は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面上のタンパク質上にある。
本開示はまた、マレイミド部分、切断可能なリンカー、及び生物学的に活性な分子を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供し、該マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を切断可能なリンカーに連結し、該切断可能なリンカーは、マレイミド部分を生物学的に活性な分子につなげる。
ＩＩ．Ｄ．生物学的に活性な分子
一部の態様では、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ペイロード（例えば、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）に化学的に連結された生物学的に活性な分子）を標的に送達することができる。ペイロードは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に接触させられる標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤である。接触は、インビトロで、または対象において生じることができる。ＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結され得るペイロードの非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、モルホリノ、アミノ酸（例えば、検出可能な部分または翻訳を妨害する毒素を含むアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、低分子（例えば、低分子薬及び毒素）、抗原（例えば、ワクチン抗原）、アジュバント、またはそれらの組み合わせ等の薬剤が挙げられる。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１つよりも多くのペイロード、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔の溶液中の第１のペイロード、及び、例えば、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に連結された、第２のペイロードを含み得る。一部の態様では、ペイロードは、低分子を含む。一部の態様では、ペイロードは、ペプチドを含む。一部の態様では、ペイロードは、抗原、例えば、ワクチン抗原を含む。一部の態様では、ペイロードは、ワクチンアジュバントを含む。
ＩＩ．Ｄ．１．抗原を標的とするペイロード及びワクチン抗原
一部の態様では、ペイロードは、抗原、例えば、腫瘍抗原と相互作用する。一部の態様では、抗原、例えば、腫瘍抗原の生物学的機能は、ペイロードとの相互作用によって調節される（例えば、抗原が受容体である場合、ペイロードは、受容体アゴニストまたは受容体アンタゴニストであり得る）。他の態様では、ペイロードは、免疫反応を誘導することができる抗原（すなわち、ワクチン抗原）を含む。一部の態様では、ペイロードは、免疫反応を誘導することができる抗原（すなわち、ワクチン抗原）及びアジュバント（すなわち、ワクチンアジュバント）を含み得る。一部の態様では、ワクチン抗原及びワクチンアジュバントは、同じＥＶ（例えば、エキソソーム）上にあり得る。他の態様では、ワクチン及びワクチンアジュバントは、異なるＥＶ（例えば、エキソソーム）中にあり得る。
腫瘍抗原の非限定的な例としては、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原（ＣＴＡ）、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
腫瘍抗原と相互作用して、例えば、その生物学的機能を調節する、ペイロードは、例えば、抗体及びその結合断片、アプタマー、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ならびに低分子を含む。
一部の態様では、抗原は、普遍的な腫瘍抗原である。本明細書で使用されるとき、「普遍的な腫瘍抗原」という用語は一般に、非腫瘍細胞におけるよりも腫瘍細胞において高いレベルで発現し、また異なる起源の腫瘍でも発現する、タンパク質等の免疫原性分子を指す。一部の態様では、普遍的な腫瘍抗原は、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、またはそれよりも多くのがん（例えば、ヒトがん）で発現する。一部の態様では、普遍的な腫瘍抗原は、非腫瘍細胞（例えば、正常な細胞）で発現する場合があるが、腫瘍細胞でそれが発現するレベルよりも低い。ある特定の態様では、普遍的な腫瘍抗原の発現レベルは、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で約１倍超、約２倍超、約３倍超、約４倍超、約５倍超、約６倍超、約７倍超、約８倍超、約９倍超、約１０倍超であるか、またはそれよりも高い。ある特定の態様では、普遍的な腫瘍抗原は、正常な細胞では発現せず、腫瘍細胞でのみ発現する。本開示とともに使用することができる普遍的な腫瘍抗原の非限定的な例としては、腫瘍血管系における内皮を裏打ちする抗原、サバイビン、腫瘍タンパク質Ｄ５２（ＴＰＤ５２）、アンドロゲン受容体エピトープ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、サバイビン、マウス二重微小染色体２ホモログ（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、リビン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３またはサイクリン（Ｄ１）が挙げられる。
さらなる態様では、抗原は、新生抗原を含み得る。本明細書で使用されるとき、「新生抗原」という用語は、腫瘍特異的変異遺伝子によってコードされる抗原を指す。
一部の態様では、抗原は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。一部の態様では、抗原は、発がんウイルス（本明細書でがん関連ウイルスとも称される（ＣＡＶ））に由来する。さらなる態様では、抗原は、ヒトガンマヘルペスウイルス４（すなわち、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ））、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ ＣｏＶ）、フィロウイルス（例えば、マールブルグ及びエボラ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ種（例えば、ｖｉｖａｘ及びｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、チクングニアウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＴリンパ好性ウイルス（ＨＴＬＶ１）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ属菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ属菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはそれらの組み合わせを含む群に由来する。
一部の態様では、ＥＢＶに由来する抗原は、ＢＺＬＦ１である。ＢＺＬＦ１（別名ＺｔａまたはＥＢ１）は、がんを誘導し、主としてヒト集団の９５％のＢ細胞に感染する、ＥＢＶの最初期ウイルス遺伝子である。この遺伝子（他の遺伝子とともに）は、他の疾患進行段階において他のＥＢＶ遺伝子の発現をもたらし、潜伏形態から溶解形態へのウイルスの変換に関与する。ＺＥＢＲＡ（ＢａｍＨＩ Ｚエプスタイン・バールウイルス複製活性化因子、別名Ｚｔａ及びＢＺＬＦ１））は、ＢＺＬＦ１によってコードされるＥＢＶの初期溶解タンパク質である。Ｈａｒｔｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３（７）：７８７－９４、及びＲｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：７０３－１２を参照されたく、同文献の両方は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。ＥＢＶ抗原、例えば、ＢＺＬＦ１を含む、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）を使用して、例えば、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を処置することができる。かかるＥＶは、ＥＢＶ陽性移植を受けているＥＢＶ陰性患者に投与することができる。ＢＺＬＦ１は、ＰＴＬＤ患者における恒久的な寛解に関連する優性Ｔ細胞抗原である。ＢＺＬＦ１を含む、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＢＺＬＦ１に対する強力なＣＤ８ Ｔ細胞媒介性免疫を誘発することができる。したがって、粘膜免疫及び組織常在記憶細胞は、ＰＴＬＤＦの発症から患者を保護することができる。非限定的な例示的抗原には、米国特許第８６１７５６４Ｂ２号に開示される抗原が含まれるが、これらに限定されない。
一部の態様では、抗原は、細胞性及び／または体液性免疫応答を誘導するためにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓから得られる。一部の態様では、抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ抗原）の１つまたは複数のエピトープを含む。ＥＳＡＴ－６、ＴＢ１０．４、ＣＦＰ１０、Ｒｖ２０３１（ｈｓｐＸ）、Ｒｖ２６５４ｃ（ＴＢ７．７）、及びＲｖ１０３８ｃ（ＥｓｘＪ）を含む、種々の抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に関連する。例えば、Ｌｉｎｄｅｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（１０）：５０２０－３１（２０１２）を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、ＥＳＡＴ６の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、ＴＢ１０．４の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、ＣＦＰ１０の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、Ｒｖ２０３１（ｈｓｐＸ）の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、Ｒｖ２６５４ｃ（ＴＢ７．７）の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、Ｒｖ１０３８ｃ（ＥｓｘＪ）の１つまたは複数のエピトープを含む。一部の態様では、本開示に有用な抗原は、ＥＳＡＴ６、ＴＢ１０．４（ＥＳＡＴ－６様タンパク質ＥｓｘＨ；ｃｆｐ７）、ＣＦＰ１０、Ｒｖ２０３１（ｈｓｐＸ）、Ｒｖ２６５４ｃ（ＴＢ７．７）、Ｒｖ１０３８ｃ（ＥｓｘＪ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるエピトープを含む。
一部の態様では、ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原の特定のエピトープ、例えば、ＥＳＡＴ６またはＴＢ１０．４の特定のエピトープを含む。一部の態様では、ＥＳＡＴ６抗原は、ＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ（配列番号２３０；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＷＭ９８８６２．１）に定められるようなアミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸を有するエピトープを含む。一部の態様では、ここで、ＴＢ１０．４抗原は、ＭＳＱＩＭＹＮＹＰＡＭＬＧＨＡＧＤＭＡＧＹＡＧＴＬＱＳＬＧＡＥＩＡＶＥＱＡＡＬＱＳＡＷＱＧＤＴＧＩＴＹＱＡＷＱＡＱＷＮＱＡＭＥＤＬＶＲＡＹＨＡＭＳＳＴＨＥＡＮＴＭＡＭＭＡＲＤＰＡＥＡＡＫＷＧＧ（配列番号２３１；ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０５７３０８２３７．１）に定められるようなアミノ酸配列の少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸を有するエピトープを含む。
一部の態様では、抗原は、自己抗原を含む。本明細書で使用されるとき、「自己抗原」という用語は、宿主細胞または組織により発現される抗原を指す。通常の健康な状態では、かかる抗原は、身体によって自己と認識され、免疫応答を誘発しない。しかしながら、ある特定の病的状態では、身体の独自の免疫系が自己抗原を外来性と認識し、それらに対して免疫応答を発動して、自己免疫状態をもたらし得る。ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、自己抗原（すなわち、Ｔ細胞応答が誘導され、自己免疫状態をもたらしている自己（生殖細胞系）タンパク質）を含み得る。かかるＥＶ（例えば、エキソソーム）を使用して、自己反応性Ｔ細胞を標的化し、それらの活性を抑制することができる。自己抗原（関連する疾患または障害を含む）の非限定的な例としては、（ｉ）ベータ細胞タンパク質、インスリン、膵島抗原２（ＩＡ－２）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５）、及び亜鉛トランスポーター８（ＺＮＴ８）（Ｉ型糖尿病）、（ｉｉ）ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及びミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（多発性硬化症）、（ｉｉｉ）シトルリン化抗原及び滑膜タンパク質（関節リウマチ）、（ｉｖ）アクアポリン－４（ＡＱＰ４）（視神経脊髄炎）、（ｖ）ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲｓ）（重症筋無力症）、（ｖｉ）デスモグレイン－１（ＤＳＧ１）及びデスモグレイン－２（ＤＳＧ２）（尋常性天疱瘡）、（ｖ）チロトロピン受容体（グレーブス病）、（ｖｉ）ＩＶ型コラーゲン（グッドパスチャー症候群）、（ｖｉｉ）サイログロブリン、甲状腺ペルオキシターゼ、及び甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）（橋本甲状腺炎）、または（ｖｉｉｉ）それらの組み合わせが挙げられる。
ＩＩ．Ｄ．２．ＰＲＯＴＡＣ
一部の態様では、ペイロードは、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）を含む。ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質に対するリガンド、Ｅ３ユビキチン化リガーゼに対するリガンド、及びこれら２つのリガンドをつなげるリンカーからなる、ヘテロ二官能性分子である。ひとたび、標的：ＰＲＯＴＡＣ：Ｅ３三元複合体が形成されると、Ｅ２ユビキチンコンジュゲート酵素は、ユビキチンを標的タンパク質の表面上のリジン残基に転移させる。一部の態様では、ＰＲＯＴＡＣの標的は、例えば、ＥＲα、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＤ４、ＰＤＥ４、ＥＲＲα、ＲＩＰＫ２、ｃ－ＡＢＬ、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＦＫＢＰ１２、ＴＢＫ１、ＢＲＤ９、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｓｉｒｔ２、ＣＤＫ９、ＦＬＴ３、ＢＴＫ、ＡＬＫ、ＡＲ、ＴＲＩＭ２４、ＳＭＡＤ３、ＲＡＲ、ＰＩ３Ｋ、ＰＣＡＦ、ＭＥＴＡＰ２、ＨＥＲ２、ＨＤＡＣ６、ＧＣＮ５、ＥＲＫ１／２、ＤＨＯＤＨ、ＣＲＡＢＰ－ＩＩ、ＦＬＴ４、またはＣＫ２である。一部の態様では、ＰＲＯＴＡＣの標的リガンドは、例えば、４－ＯＨＴ、ダサチニブ、ＪＱ１、ＰＤＥ４阻害剤、ＪＱ１、クロロアルカン、チアゾリジンジオン（ｔｈｉｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）に基づくリガンド、ＲＩＰＫ２阻害剤、ボスチニブ、ＪＱ１誘導体、ＯＴＸ０１５、造血幹細胞因子、ＴＢＫ１阻害剤、ＢＩ－７２７３、ラパチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、フォレチニブ、Ｓｉｒｔ２阻害剤３ｂ、ＨＪＢ９７、ＳＮＳ－０３２、アミノピラゾール類似体、ＡＣ２２０、ＲＮ－４８６、セリチニブ、ＡＲアンタゴニスト、ＩＡＣＳ－７ｅ、またはイブルチニブ誘導体である。一部の態様では、ＰＲＯＴＡＣのＥ３リガンドは、例えば、ＬＣＬ１６１誘導体、ＶＨＬ１、ヒドロキシプロリン誘導体、ポマリドマイド、サリドマイド、ＨＩＦ－１α由来（Ｒ）－ヒドロキシプロリン、ＶＨＬリガンド２、ＶＨ０３２誘導体、レナリドマイド、サリドマイド誘導体、またはＶＬ－２６９である。一部の態様では、Ｅ３リガーゼは、例えば、ＩＡＰ、ＶＨＬ、またはＣＲＢＮである。例えば、Ａｎ ＆ Ｆｕ（２０１８）ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ３６：５５３－５６２を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書に開示される方法に従って使用することができるＰＲＯＴＡＣ及び関連技術は、例えば、ＷＯ２０１８１０６８７０、ＵＳ２０１８１５５３２２、ＷＯ２０１８０９８２８８、ＷＯ２０１８０９８２８０、ＷＯ２０１８０９８２７５、ＷＯ２０１８０８９７３６、ＷＯ２０１８０８５２４７、ＵＳ２０１８０１２５８２１、ＵＳ２０１８００９９９４０、ＷＯ２０１８０６４５８９、ＷＯ２０１８０５３３５４、ＷＯ２０１７２２３４５２、ＷＯ２０１７２０１４４９、ＷＯ２０１７１９７０５６、ＷＯ２０１７１９７０５１、ＷＯ２０１７１９７０４６、ＷＯ２０１７１８５０３６、ＷＯ２０１７１８５０３４、ＷＯ２０１７１８５０３１、ＷＯ２０１７１８５０２３、ＷＯ２０１７１８２４１８、ＵＳ２０１７０３０５９０１、ＷＯ２０１７１７６７０８、ＵＳ２０１７０２８１７８４、ＷＯ２０１７１１７４７４、ＷＯ２０１７１１７４７３、ＷＯ２０１７０７９７２３、ＵＳ９９３８２６４、ＵＳ２０１７００６５７１９、ＷＯ２０１７０２４３１９、ＷＯ２０１７０２４３１８、ＷＯ２０１７０２４３１７、ＵＳ２０１７００３７００４、ＵＳ２０１７０００８９０４、ＵＳ２０１８０１４７２０２、ＷＯ２０１８０５１１０７、ＷＯ２０１８０３３５５６、ＵＳ２０１６０２７２６３９、ＵＳ２０１７０３２７４６９、ＷＯ２０１７２１２３２９、ＷＯ２０１７２１１９２４、ＵＳ２０１８００８５４６５、ＵＳ２０１６００４５６０７、ＵＳ２０１６００２２６４２、ＷＯ２０１７０４６０３６、ＵＳ２０１６００５８８７２、ＵＳ２０１８０１３４６８８、ＵＳ２０１８０１１８７３３、ＵＳ２０１８００５００２１、ＵＳ９８５５２７３、ＵＳ２０１４０２５５３６１、ＵＳ９１１５１８４、ＵＳ２０１８００９３９９０、ＵＳ２０１５０１１９４３５、ＵＳ２０１４０３５６３２２、ＵＳ２０１４０１１２９２２、ＵＳ９７６５０１９、ＵＳ２０１８０１００００１、ＵＳ７３９０６５６、またはＵＳ７２０８１５７に開示され、これらの文献の全ては参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、いくつかのＰＲＯＴＡＣがＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する場合、かかるＰＲＯＴＡＣは、同じであることもできるし、またはそれらは異なることもできる。一部の態様では、いくつかのＰＲＯＴＡＣが本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する場合、かかるＰＲＯＴＡＣは、同じであることもできるし、またはそれらは異なることもできる。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の２つ以上の集団を含み得、ここで、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の各集団は、異なるＰＲＯＴＡＣまたはそれらの組み合わせを含む。
一部の態様では、ＰＲＯＴＡＣは、少なくとも１つのスルフヒドリル基を含み、マレイミド部分が、ＥＶ（例えば、エキソソーム）をＰＲＯＴＡＣに連結する。一部の態様では、スルフヒドリル基は、ＰＲＯＴＡＣのＥ３リガーゼリガンド部分上に位置する。一部の態様では、スルフヒドリル基は、ＰＲＯＴＡＣの標的タンパク質リガンド部分上に位置する。一部の態様では、スルフヒドリル基は、ＰＲＯＴＡＣのリンカー部分上に位置する。一部の態様では、スルフヒドリル基は、ＰＲＯＴＡＣにおける天然に存在する反応性基である。
他の態様では、マレイミド部分が、例えば、化学的誘導体化を介して、ＰＲＯＴＡＣに導入される。一部の態様では、化学的誘導体化は、ＰＲＯＴＡＣに存在する化学基と反応することができる部分、本明細書に開示されるマレイミド部分と反応することができる部分を含む部分を含む、二官能性リンカー（二官能性試薬）を介して起こる。
一部の態様では、Ｅ３リガーゼリガンドは、切断可能なリンカー、例えば、ＰＡＢＣを介してＰＲＯＴＡＣに結合している。他の態様では、標的リガンドは、切断可能なリンカー、例えば、ＰＡＢＣを介してＰＲＯＴＡＣに結合している。他の態様では、Ｅ３リガーゼリガンド及び標的リガンドの両方が、切断可能なリンカーを介してＰＲＯＴＡＣに結合している。一部の態様では、両方の切断可能なリンカーが、同じ切断可能なリンカーであり得る。他の態様では、両方の切断可能なリンカーが異なる。
ＰＲＯＴＡＣ、例えば、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結されたＰＲＯＴＡＣの官能性は、当該技術分野で既知のインビトロ法及びインビボ法に従って評価することができる。例えば、ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質のユビキチン媒介性分解を誘導することから、ＰＲＯＴＡＣ活性は、標的タンパク質の分解を直接的に測定するアッセイ（例えば、ウェスタンブロット）、または標的タンパク質によって媒介される機能的活性を測定するアッセイ（例えば、標的タンパク質がタンパク質キナーゼである場合は、リン酸化またはリン酸化媒介性細胞シグナル伝達の変化）を使用して決定することができる。
一部の具体的な態様では、ＰＲＯＴＡＣは、ＴＢＫ１標的化リガンド、リンカー、及びＶＨＬ（Ｅ３リガーゼ）結合リガンドを含む（例えば、図１０Ｃを参照されたい）。
他の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＣＬＩＰＴＡＣ（クリックで形成されるＰＲＯＴＡＣ）の形成のための２つの前駆体を含む。したがって、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、マレイミド部分を介してＥＶに連結されたＣＬＩＰＴＡＣ前駆体の２つの集団を含み得る。ＵＶが標的細胞に結合すると、ＣＬＩＰＴＡＣ前駆体は、生体直交型のクリックによる組み合わせによって細胞内で組み合わされて、ヘテロ二官能性ＰＲＯＴＡＣを生み出すことができる。Ｌｅｂｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ Ｃｅｎｔ．Ｓｃｉ．２：９２７－９３４を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一般に、ＰＲＯＴＡＣは、式［ＵＬＭ］－［Ｌ］－［ＰＴＭ］により記述することができ、式中、［ＵＬＭ］は、ユビキチン－Ｌ結合部分（第１のリガンド）であり、［Ｌ］は、リンカーであり、［ＰＴＭ］は、タンパク質標的化部分（第２のリガンド）である。例示的なＰＲＯＴＡＣが以下の表に示される。この表は、［ＵＬＭ］によって標的化されるユビキチン化酵素及びその対応する［ＵＬＭ］リガンド、ならびに［ＰＴＭ］によって標的化されるタンパク質及びその対応する［ＵＬＭ］リガンドを示す。
Figure 2022525924000022
Figure 2022525924000023
Figure 2022525924000024
Figure 2022525924000025
Figure 2022525924000026
Figure 2022525924000027
Figure 2022525924000028
Figure 2022525924000029
Figure 2022525924000030
Figure 2022525924000031
上記の表に開示される全ての他の特許出願及び特許は、参照によりそれらの全体が援用される。
ＰＲＯＴＡＣにおいて使用することができる特定のリンカーは、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１８００５００２１Ａ１、ＵＳ２０１８０１１８７３３Ａ１、ＵＳ２０１８０００９７７９Ａ１、ＵＳ２０１８００８５４６５Ａ１、ＵＳ２０１８０１３４６８４Ａ１、及びＵＳ２０１８０１３４６８８Ａ１、米国特許第ＵＳ９６９４０８４Ｂ２号、同第ＵＳ９８２１０６８Ｂ２号、同第ＵＳ９７７０５１２Ｂ２号、及び同第ＵＳ９７５０８１６Ｂ２号、ならびに国際出願公開ＷＯ２０１８０８５２４７Ａ１に開示され、これらの文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。ＷＯ２０１７２１２３２９Ａ１は、クリック反応を介して生成される、リンカーを含むＰＲＯＴＡＣの形成について開示している。
ＩＩ．Ｄ．３．インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト
一部の態様では、ペイロードは、ヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストである。ＳＴＩＮＧは、典型的には細菌によって産生される環状ジヌクレオチドの細胞質センサーである。活性化されると、それはＩ型インターフェロンの産生をもたらし、免疫応答を開始する。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結された１つまたは複数のＳＴＩＮＧアゴニストを含む。一部の態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
限定されないが、ｃＧＭＰ、環状ジ－ＧＭＰ（ｃ－ジ－ＧＭＰ）、ｃＡＭＰ、環状ジ－ＡＭＰ（ｃ－ジ－ＡＭＰ）、環状－ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ジ－ＩＭＰ（ｃ－ジ－ＩＭＰ）、環状ＡＭＰ－ＩＭＰ（ｃＡＩＭＰ）、及びそれらの任意の類似体等の環状プリンジヌクレオチドは、患者において免疫応答または炎症応答を刺激または強化することが知られている。ＣＤＮは、環状ジヌクレオチドを連結する２’２’、２’３’、２’５’、３’３’、もしくは３’５’結合、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。
環状プリンジヌクレオチドを、標準的な有機化学技法を介して修飾して、プリンジヌクレオチドの類似体を生み出すことができる。好適なプリンジヌクレオチドには、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン、または当該技術分野で既知の任意の他の適切なプリンジヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。環状ジヌクレオチドは、修飾された類似体であり得る。ホスホロチオエート、ビホスホロチオエート（ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、フッ素化、及び二フッ素化修飾を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の好適な修飾を使用することができる。
５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、または当該技術分野で既知の任意の他の非環状ジヌクレオチドアゴニスト等の、非環状ジヌクレオチドアゴニストもまた使用することができる。
任意のＳＴＩＮＧアゴニストが使用され得ることが企図される。ＳＴＩＮＧアゴニストの中には、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト－１、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＭＬ－ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＡＩＭＰ、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＧＡＭＰ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭ（ＰＳ）２、ｃ－ジ－ＧＭＰ、２’３’－ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＩＭＰ、ｃ－ジ－ＵＭＰ、またはそれらの任意の組み合わせがある。具体的な態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、別名３－３ ｃＡＩＭＰｄＦＳＨである。当該技術分野で既知の追加のＳＴＩＮＧアゴニストもまた使用することができる。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下記からなる群から選択される化合物を含む。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000032
 式中、
Ｘ１は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｘ２は、Ｈ、ＯＨ、またはＦであり、
Ｚは、ＯＨ、ＯＲ１、ＳＨ、またはＳＲ１であり、ここで、
Ｒ１は、ＮａもしくはＮＨ４であるか、または
Ｒ１は、ピバロイルオキシメチル等の、インビボでＯＨまたはＳＨをもたらす酵素に不安定な基であり、
Ｂｉ及びＢ２は、下記から選定される塩基であるが、
Figure 2022525924000033
 但し、
－式１において、Ｘ１及びＸ２がＯＨではなく、
－式２において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、かつＢ２がグアニンではなく、かつ
－式３において、Ｘ１及びＸ２がＯＨであるとき、Ｂ１がアデニンではなく、Ｂ２がグアニンではなく、かつＺがＯＨではないことを条件とする。ＷＯ２０１６／０９６１７４を参照されたく、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、
Figure 2022525924000034
Figure 2022525924000035
Figure 2022525924000036
 それらの薬学的に許容される塩を含む。ＷＯ２０１６／０９６１７４Ａ１を参照されたい。
他の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物、
Figure 2022525924000037
Figure 2022525924000038
Figure 2022525924000039
 またはそれらの任意の薬学的に許容される塩を含む。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000040
 式中、各記号は、ＷＯ２０１４／０９３９３６に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000041
 式中、各置換基は、ＷＯ２０１４／１８９８０５に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000042
 式中、各置換基は、ＷＯ２０１５／０７７３５４に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。また、Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １１，１０１８－１０３０（２０１５）も参照されたい。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１３／１８５０５２及びＳｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２８３，２８３ｒａ５２（２０１５）に記載される、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＩＭＰ、ｃ－ＡＭＰ－ＧＭＰ、ｃ－ＡＭＰ－ＩＭＰ、及びｃ－ＧＭＰ－ＩＭＰを含み、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下記から選択される式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000043
 式中、各置換基（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＸ）は、ＷＯ２０１４／１８９８０６に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000044
 式中、各置換基（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｙ１、及びＹ２）は、ＷＯ２０１５／１８５５６５に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式から選択される化合物を含み、
Figure 2022525924000045
 式中、各置換基（すなわち、Ｘ及びＹ）は、ＷＯ２０１４／１７９７６０に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式のうちの１つを有する化合物を含み、
Figure 2022525924000046
Figure 2022525924000047
 式中、各置換基（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｘａ、Ｘａ１、Ｘｂ、Ｘｂ１、Ｘｃ、Ｘｄ、Ｘｅ、及びＸｆ）は、ＷＯ２０１４／１７９３３５に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１５／０１７６５２に記載される、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000048
 同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１６／０９６５７７に記載される、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000049
 同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000050
 式中、各々全ての置換基（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６）は、ＷＯ２０１１／００３０２５に記載され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000051
 式中、各置換基（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６）は、ＷＯ２０１６／１４５１０２に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000052
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１７／０２７６４６に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000053
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１７／０７５４７７に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000054
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１７／０２７６４５に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000055
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１８／１００５５８に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、以下の式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000056
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１７／１７５１４７に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、下記式を有する化合物を含み、
Figure 2022525924000057
 式中、各々全ての置換基は、ＷＯ２０１７／１７５１５６に定義され、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニスト及び／または非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む。一部の態様では、いくつかの環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）上に存在する場合、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは、同じであることもできるし、またはそれらは異なることもできる。一部の態様では、いくつかの非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが存在する場合、かかるＳＴＩＮＧアゴニストは、同じであることもできるし、またはそれらは異なることもできる。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）組成物は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の２つ以上の集団を含み得、ここで、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の各集団は、異なるＳＴＩＮＧアゴニストまたはそれらの組み合わせを含む。
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（ＩＶ）を有する（ＭＭ）－（リンカー）－（生物学的に活性な分子）を含む。
Figure 2022525924000058
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（Ｖ）を有する（ＭＭ）－（リンカー）－（生物学的に活性な分子）を含む。
Figure 2022525924000059
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（ＶＩ）を有する化合物（ＣＰ２４９）を含む。
Figure 2022525924000060
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（ＶＩＩ）を有する化合物（ＣＰ２５０）を含む。
Figure 2022525924000061
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（ＶＩＩＩ）を有する化合物（ＣＰ２６０）を含む。
Figure 2022525924000062
一部の具体的な態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、式（ＩＸ）を有する化合物（ＣＰ２６１）を含む。
Figure 2022525924000063
一部の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２４７、ＣＰ２５０、ＣＰ２６０、ＣＰ２６１、またはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。一部の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２４７またはその薬学的に許容される塩が含まれる。一部の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２５０またはその薬学的に許容される塩が含まれる。一部の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２６０またはその薬学的に許容される塩が含まれる。一部の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２６１またはその薬学的に許容される塩が含まれる。
他の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２２７、ＣＰ２２９、またはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。他の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２２７またはその薬学的に許容される塩が含まれる。他の態様では、本ＥＶコンジュゲートに有用なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＣＰ２２９またはその薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩ．Ｄ．４．ＴＬＲアゴニスト
一部の態様では、ペイロードは、ＴＬＲアゴニストを含む。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例としては、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、リポタイコ酸、非定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ－２及びＭＡＬＰ－４０４、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩ、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ｈｓｐ６０、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質、ヘマグルチニン）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸、β－ディフェンシン２、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＭＧＢ１、スナピン（ｓｎａｐｉｎ）、テネイシンＣ）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ－Ａ、ポリＧ１０、ポリＧ３、レシキモド）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例は、ＷＯ２００８１１５３１９Ａ２、ＵＳ２０１３０２０２７０７Ａ１、ＵＳ２０１２０２１９６１５Ａ１、ＵＳ２０１０００２９５８５Ａ１、ＷＯ２００９０３０９９６Ａ１、ＷＯ２００９０８８４０１Ａ２、及びＷＯ２０１１０４４２４６Ａ１で見出すことができ、これらの文献の各々は参照によりその全体が援用される。
ＩＩ．Ｄ．５．抗体
一部の態様では、ペイロードは、抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、ペイロードは、ＡＤＣを含む。一部の態様では、ペイロードは、合成抗腫瘍剤（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（ベドチン））、サイトカイン放出阻害剤（例えば、ＭＣＣ９５０）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン及びその類似体（ラパログ））、オートタキシン阻害剤（例えば、ＰＡＴ４０９）、リゾホスファチジン酸受容体アンタゴニスト（例えば、ＡＭ１５２、別名ＢＭＳ－９８６０２０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む低分子を含む。
ＩＩ．Ｄ．６．マクロファージを標的とする生物学的に活性な分子
一部の態様では、ペイロードは、マクロファージを標的とする生物学的に活性な分子を含む。他の態様では、ペイロードは、マクロファージ分極化を誘導する生物学的に活性な分子を含む。マクロファージ分極化は、マクロファージがそれらの微小環境からのシグナルに応答して異なる機能的プログラムを採用するプロセスである。この能力は、生物におけるそれらの複数の役割に関連する。つまり、それらは、自然免疫系の強力なエフェクター細胞であるが、細胞破片の除去、胚発生、及び組織修復においても重要である。
単純化された分類によれば、マクロファージの表現型は、Ｍ１（古典的活性化マクロファージ）及びＭ２（代替活性化マクロファージ）の２つの群に分けられている。この大まかな分類は、培養されたマクロファージが、特定の状態へのそれらの表現型のスイッチングを刺激する分子で処理された、インビトロ研究に基づいていた。化学的刺激に加えて、マクロファージを増殖させる基盤となる基質の剛性が、分極化状態、機能的役割、及び遊走モードを導き得ることが示されている。Ｍ１マクロファージは、食作用ならびに炎症促進性サイトカイン及び殺菌分子の分泌等の、病原体に対する宿主防御を導く際に重要な炎症促進性型として説明された。Ｍ２マクロファージは、全く逆の機能、すなわち、炎症の消散段階及び損傷した組織の修復の制御を有すると説明された。後に、より大規模なインビトロ及びエクスビボ研究により、マクロファージ表現型がはるかにより多様であり、遺伝子発現及び機能の点で互いに重複することが示され、これらの多くのハイブリッド状態が、微小環境に依存する活性化状態の連続性を形成することを明らかにしている。その上、インビボでは、組織マクロファージの異なる集団間で遺伝子発現プロファイルの高度な多様性が存在する。故に、マクロファージ活性化スペクトルは、環境からの大量の異なるシグナルに応答するための複雑な制御経路を伴う、より幅広いものと見なされる。マクロファージ表現型の多様性は、インビボで未だに十分に特性評価されていない。
これらのマクロファージの種類の不均衡は、いくつかの免疫関連疾患に関係する。例えば、Ｍ１／Ｍ２比の増加は、マウスにおいて炎症性腸疾患の発症、ならびに肥満と相関があり得る。一方で、インビトロ実験により、組織線維症の主要なメディエーターとしてのＭ２マクロファージの関与が示された。いくつかの研究は、Ｍ２マクロファージの線維化プロファイルを全身性硬化症の病理発生と関連付けている。マクロファージを標的とする生物学的に活性な分子の非限定的な例は、ＰＩ３Ｋγ（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ触媒サブユニットガンマ）、ＲＩＰ１（受容体共役タンパク質（ＲＩＰ）キナーゼ１、ＲＩＰＫ１）、ＨＩＦ－１α（低酸素誘導因子１－アルファ）、ＡＨＲ１（接着及び菌糸制御因子（Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｐｈａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）１）、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ１５５、ＩＲＦ４（インターフェロン制御因子４）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＩＬ－４ＲＡ（インターロイキン－４受容体サブユニットアルファ）、ＴＬＲ８（トル様受容体８）、及びＴＧＦ－β１（トランスフォーミング増殖因子ベータ－１プロタンパク質）である。
一部の態様では、ペイロードは、ＰＩ３Ｋγタンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＰＩ３Ｋγアンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＰＩ３Ｋγアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の態様では、ＰＩ３Ｋγアンタゴニストは、低分子である。一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＩ３Ｋγをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＰＩ３Ｋγ遺伝子の配列は、染色体位置７ｑ２２．３にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００７．１４（１０６８６５２８２．．１０６９０８９８０）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＰＩ３Ｋγタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４８７３６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＲＩＰ１タンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＲＩＰ１アンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＲＩＰ１アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の態様では、ＲＩＰ１アンタゴニストは、低分子である。一部の態様では、ＡＳＯは、ＲＩＰ１をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＲＩＰ１遺伝子の配列は、染色体位置６ｐ２５．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３０６３９６７．．３１１５１８７）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＲＩＰ１タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３５４６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＨＩＦ－１αタンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＨＩＦ－１αアンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＨＩＦ－１αアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の態様では、ＨＩＦ－１αアンタゴニストは、低分子である。一部の態様では、ＡＳＯは、ＨＩＦ－１αをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＨＩＦ－１α遺伝子の配列は、染色体位置１４ｑ２３．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１４．９（６１６９５５１３．．６１７４８２５９）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＨＩＦ－１αタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１６６６５の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の態様では、ＡＳＯは、ＨＩＦ－２αをコードするｍＲＮＡを標的とする。ＨＩＦ－２α遺伝子の配列は、染色体位置２ｐ２１にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００２．１２（４６２９７４０７．．４６３８６６９７）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＨＩＦ－２αタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９８１４の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＡＨＲ１タンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＡＨＲ１アンタゴニスト）を含む。他の態様では、ＡＨＲ１アンタゴニストは、低分子である。
一部の態様では、ペイロードは、ｍｉＲ１４６ａを標的とする生物学的に活性な分子（ｍｉＲ１４６ａアンタゴミル）を含む。一部の態様では、ｍｉＲ１４６ａアンタゴミルは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ＡＳＯは、ｍｉＲ１４６ａ－５ｐ（ｕｇａｇａａｃｕｇａａｕｕｃｃａｕｇｇｇｕｕ）（配列番号２２６）に結合する。一部の態様では、ＡＳＯは、ｍｉＲ１４６ａ－３ｐ（ｃｃｕｃｕｇａａａｕｕｃａｇｕｕｃｕｕｃａｇ）（配列番号２２７）に結合する。
一部の態様では、ペイロードは、ｍｉＲ１５５を模倣する生物学的に活性な分子（ｍｉＲ１５５模倣体）を含む。一部の態様では、ｍｉＲ１５５模倣体は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。一部の態様では、ｍｉＲ１５５模倣体は、ｍｉＲ１５５－５ｐ（ｕｕａａｕｇｃｕａａｕｃｇｕｇａｕａｇｇｇｇｕ）（配列番号２２８）のヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、ｍｉＲ１５５模倣体は、ｍｉＲ１５５－３ｐ（ｃｕｃｃｕａｃａｕａｕｕａｇｃａｕｕａａｃａ）（配列番号２２９）のヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、ペイロードは、ＩＲＦ－４タンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＩＲＦ４アンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＩＲＦ４アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＲＦ－４をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＩＲＦ－４遺伝子の配列は、染色体位置６ｐ２５．３にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３９１７３９．．４１１４４３）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＩＲＦ－４タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１５３０６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＰＰＡＲγタンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＰＰＡＲγアンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＰＰＡＲγアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の態様では、ＰＰＡＲγアンタゴニストは、低分子である。一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＰＡＲγをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＰＰＡＲγ遺伝子の配列は、染色体位置３ｐ２５．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００３．１２（１２２８７４８５．．１２４３４３５６）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＰＰＡＲγタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３７２３１の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＩＬ－４ＲＡタンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＩＬ－４ＲＡアンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＩＬ－４ＲＡアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＬ－４ＲＡをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＩＬ－４ＲＡ遺伝子の配列は、染色体位置１６ｐ１２．１にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１６．１０（２７３１３６６８．．２７３６４７７８）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＩＬ－４ＲＡタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２４３９４の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、トル様受容体８（ＴＬＲ８）のアゴニストである生物学的に活性な分子を含む。ＴＬＲ８は、ＣＤ２８８とも称される。ＴＬＲ８は、自然免疫及び適応免疫の主要な構成成分である。ＴＬＲ（トル様受容体）は、微生物に特有の分子パターンの認識を介して病原体に対する宿主免疫応答を制御する。それはＭＹＤ８８及びＴＲＡＦ６を介して作用して、ＮＦ－カッパ－Ｂ活性化、サイトカイン分泌、及び炎症性応答をもたらす。ヒトＴＬＲ８タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＲ９７の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ペイロードは、ＴＧＦ－β１タンパク質または転写物を標的とする生物学的に活性な分子（ＴＧＦ－β１アンタゴニスト）を含む。一部の態様では、ＴＧＦ－β１アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＴＧＦ－β１をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＴＧＦ－β１遺伝子の配列は、染色体位置１９ｑ１３．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１９．１０（４１３３０３２３．．４１３５３９２２（相補鎖））の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＴＧＦ－β１タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１１３７の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。ＡＳＯは、修飾糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見出されるリボース糖部分と比較したときに糖部分の修飾を有する、１つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。主として親和性及び／またはヌクレアーゼ耐性等のオリゴヌクレオチドのある特定の特性を改善する目標で、リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが作製されてきた。かかる修飾には、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、または典型的にはリボース環上のＣ２’炭素とＣ４’炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、または典型的にはＣ２’炭素及びＣ３’炭素との間の結合を欠いた非連結リボース環（例えば、ＵＮＡ）との置き換えによって、リボース環構造が修飾されるものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合において、糖部分が、糖でない部分と置き換えられているヌクレオシドも含まれる。糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を、ＲＮＡヌクレオシドに天然に見出される水素、または２’－ＯＨ基以外の基に変化させることにより行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、または５’位に導入され得る。修飾糖部分を有するヌクレオシドにはまた、２’置換ヌクレオシド等の２’修飾ヌクレオシドも含まれる。実際、２’置換ヌクレオシドの開発に大きな注力が注がれており、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、強化されたヌクレオシド耐性及び強化された親和性等の有益な特性を有することが判明している。２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位置にＨもしくは－ＯＨ以外の置換基を有するか（２’置換ヌクレオシド）、または２’連結ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドが含まれる。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに強化された結合親和性（例えば、親和性を強化する２’糖修飾ヌクレオシド）及び／または増加したヌクレアーゼ耐性を提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。下記は、一部の２’置換修飾ヌクレオシドの例示説明である。
Figure 2022525924000064
ＬＮＡヌクレオシドは、リボース環の立体構造を制限または固定する、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の（すなわち、２’－４’架橋）リンカー基（ビラジカルまたは架橋と称される）を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称される。リボースの立体構造の固定は、ＬＮＡがオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合の、相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するハイブリダイゼーションの強化された親和性（二重鎖安定化）に関連付けられる。これは、オリゴヌクレオチド／相補鎖二重鎖の融解温度を測定することによって通例のように決定することができる。
非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８に開示される。
一部の態様では、本開示のＡＳＯの修飾ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは、式ＩまたはＩＩの一般構造を有し、
Figure 2022525924000065
 式中、
Ｗは、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒａ）－、－Ｃ（ＲａＲｂ）－から選択され、特に－Ｏ－であり、
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基部分であり、
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アジド、複素環、及びアリールから選択され、
Ｘ、Ｙ、Ｒａ、及びＲｂは、本明細書で定義される通りである。
ＩＩ．Ｄ．７．オリゴヌクレオチド
一部の態様では、ペイロードは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、もしくはペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＩ３Ｋγアンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＩ３Ｋγをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＰＩ３Ｋγ遺伝子の配列は、染色体位置７ｑ２２．３にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００７．１４（１０６８６５２８２．．１０６９０８９８０）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＰＩ３Ｋγタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４８７３６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＲＩＰ１アンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＲＩＰ１をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＲＩＰ１遺伝子の配列は、染色体位置６ｐ２５．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３０６３９６７．．３１１５１８７）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＲＩＰ１タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３５４６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＨＩＦ－１αアンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＨＩＦ－１αをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＨＩＦ－１α遺伝子の配列は、染色体位置１４ｑ２３．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１４．９（６１６９５５１３．．６１７４８２５９）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＨＩＦ－１αタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１６６６５の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の態様では、ＡＳＯは、ＨＩＦ－２αをコードするｍＲＮＡを標的とする。ＨＩＦ－２α遺伝子の配列は、染色体位置２ｐ２１にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００２．１２（４６２９７４０７．．４６３８６６９７）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＨＩＦ－２αタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９８１４の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＲＦ４アンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＲＦ－４をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＩＲＦ－４遺伝子の配列は、染色体位置６ｐ２５．３にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００６．１２（３９１７３９．．４１１４４３）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＩＲＦ－４タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ１５３０６の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＰＡＲγアンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＰＰＡＲγをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＰＰＡＲγ遺伝子の配列は、染色体位置３ｐ２５．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００３．１２（１２２８７４８５．．１２４３４３５６）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＰＰＡＲγタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３７２３１の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＬ－４ＲＡアンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＩＬ－４ＲＡをコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＩＬ－４ＲＡ遺伝子の配列は、染色体位置１６ｐ１２．１にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１６．１０（２７３１３６６８．．２７３６４７７８）の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＩＬ－４ＲＡタンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２４３９４の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＴＧＦ－β１アンタゴニストである。一部の態様では、ＡＳＯは、ＴＧＦ－β１をコードする転写物、例えば、ｍＲＮＡを標的とする。ＴＧＦ－β１遺伝子の配列は、染色体位置１９ｑ１３．２にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１９．１０（４１３３０３２３．．４１３５３９２２（相補鎖））の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が援用される。ヒトＴＧＦ－β１タンパク質の配列は、一般公開されたＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１１３７の下で見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＡＳＯは、ＳＴＡＴ６転写物、ＣＥＢＰ／β転写物、ＳＴＡＴ３転写物、ＫＲＡＳ転写物、ＮＲＡＳ転写物、ＮＬＰＲ３転写物、またはそれらの任意の組み合わせである転写物を標的とする。
ＳＴＡＴ６（ＳＴＡＴ６）は、シグナル伝達兼転写活性化因子６としても知られている。ＳＴＡＴ６／ＳＴＡＴ６の同義語が知られており、これにはＩＬ－４ ＳＴＡＴ；ＳＴＡＴ、インターロイキン４誘導性；転写因子ＩＬ－４ ＳＴＡＴ；ＳＴＡＴ６Ｂ；ＳＴＡＴ６Ｃ；及びＤ１２Ｓ１６４４が含まれる。ヒトＳＴＡＴ６遺伝子の配列は、一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１２．１２：ｃ５７１１１４１３～５７０９５４０４の下で見出すことができる。ヒトＳＴＡＴ６遺伝子は、染色体位置１２ｑ１３．３にて、５７１１１４１３～５７０９５４０４（相補鎖）で見出される。
ＣＥＢＰ／β（ＣＥＢＰ／β）は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質ベータとしても知られている。ＣＥＢＰ／β／ＣＥＢＰ／βの同義語が知られており、これにはＣ／ＥＢＰベータ；肝臓活性化因子タンパク質；ＬＡＰ；肝臓に豊富な阻害性タンパク質（Ｌｉｖｅｒ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）；ＬＩＰ；核因子ＮＦ－ＩＬ６；転写因子５；ＴＣＦ－５；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＢＰｂ；ＣＥＢＰβ；ＣＥＢＰ／Ｂ；及びＴＣＦ５が含まれる。ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子の配列は、一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００２０．１１（５０１９０５８３．．５０１９２６９０）の下で見出すことができる。ヒトＣＥＢＰ／β遺伝子は、染色体位置２０ｑ１３．１３にて、５０１９０５８３～５０１９２６９０で見出される。
ＮＲａｓは、ゴルジ装置と原形質膜との間を行き来する膜タンパク質をコードする発がん遺伝子である。ＮＲａｓコードゲノムＤＮＡは、染色体位置１ｐ１３．２（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７５７２のヌクレオチド５００１～１７４３８）にて見出すことができる。Ｎ－ｒａｓ変異が、黒色腫、甲状腺癌、奇形癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、バーキットリンパ腫、急性前骨髄球性白血病、Ｔ細胞白血病、及び慢性骨髄性白血病において記載されている。発がん性Ｎ－Ｒａｓは、マウスにおいて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）様または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）様疾患を誘導し得る。神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス発がん遺伝子（ＮＲａｓ）は、当該技術分野において種々の名称で知られている。かかる名称には、ＧＴＰａｓｅ ＮＲａｓ、Ｎ－ｒａｓタンパク質パート４、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス（ｖ－ｒａｓ）発がん遺伝子ホモログ、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス発がん遺伝子ホモログ、形質転換タンパク質Ｎ－Ｒａｓ、及びｖ－ｒａｓ神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス発がん遺伝子ホモログが含まれる。
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、細胞表面受容体から核へシグナルを伝達するシグナル伝達兼転写活性化因子である。ＳＴＡＴ３は、多くのヒトがんにおいて過剰活性化されることが頻繁にある。ＳＴＡＴ３コードゲノムＤＮＡは、染色体位置１７ｑ２１．２（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７３７０．１のヌクレオチド５，００１～８０，１７１）で見出すことができる。
ＮＬＲＰ３（ＮＬＲＰ３）は、ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有３としても知られている。ＮＬＲＰ３／ＮＬＲＰ３の同義語が知られており、これにはＮＬＲＰ３；Ｃ１ｏｒｆ７；ＣＩＡＳ１；ＮＡＬＰ３；ＰＹＰＡＦ１；ヌクレオチド結合オリゴマー形成ドメイン、ロイシンリッチリピート及びピリンドメイン含有３；感冒誘導性自己炎症性症候群１タンパク質；クリオピリン；ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ及びＰＹＤドメイン含有タンパク質３；アンジオテンシン／バソプレシン受容体ＡＩＩ／ＡＶＰ様；キャタピラータンパク質１．１；ＣＬＲ１．１；感冒誘導性自己炎症性症候群１タンパク質；ならびにＰＹＲＩＮ含有ＡＰＡＦ１様タンパク質１が含まれる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子の配列は、一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００００１．１１：２４７４１６１５６～２４７４４９１０８の下で見出すことができる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子は、染色体位置１ｑ４４にて、２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８で見出される。
ＫＲＡＳは、当該技術分野において種々の名称で知られている。かかる名称には、ＫＲＡＳがん原遺伝子、ＧＴＰａｓｅ；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫２ウイルス発がん遺伝子ホモログ；ＧＴＰａｓｅ ＫＲａｓ；Ｃ－Ｋｉ－Ｒａｓ；Ｋ－Ｒａｓ ２；ＫＲＡＳ２；ＲＡＳＫ２；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２ Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス発がん遺伝子ホモログ；Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん原遺伝子；細胞形質転換がん原遺伝子；細胞Ｃ－Ｋｉ－Ｒａｓ２がん原遺伝子；形質転換タンパク質Ｐ２１；ＰＲ３１０ Ｃ－Ｋ－Ｒａｓ発がん遺伝子；Ｃ－Ｋｉｒｓｔｅｎ－Ｒａｓタンパク質；Ｋ－Ｒａｓ Ｐ２１タンパク質；及び発がん遺伝子ＫＲＡＳ２が含まれる。ヒトＫＲＡＳ遺伝子の配列は、染色体位置１２ｐ１２．１にて、及び一般公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００１２（２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６）の下で見出すことができる。ヒト野生型ＫＲＡＳ転写物のゲノム配列は、ＮＣ＿００００１２の残基２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６の逆相補鎖に対応する。
ＩＩ．Ｄ．８．輸送ペプチド
一部の態様では、ペイロードは、細胞輸送、細胞透過性、または融合性ペプチドを含む。本明細書で使用されるとき、「輸送ペプチド」という用語は、細胞の細胞膜を横切るカーゴ移動、細胞またはＥＶからのカーゴの分泌、及び細胞またはＥＶからのカーゴの放出、ならびに他の細胞移動手段を容易にすることを含めた、細胞（単数または複数）内の任意の結合したカーゴの移動を容易にする任意のペプチド配列を指す。具体的な、但し非限定的な例では、輸送ペプチドは、細胞透過性ペプチド、非古典的分泌配列、エンドソーム放出ドメイン、受容体結合ドメイン、及び融合性ペプチドに由来する配列であり得る。
本明細書で使用されるとき、「細胞透過性ペプチド」という用語は、細胞の膜またはＥＶの膜等の脂質二重層を横切る任意の結合したカーゴの移動を容易にする任意のペプチド配列を指す。本明細書で使用されるとき、「非古典的分泌配列」という用語は、ＥＲ－ゴルジ非依存性経路を介した細胞からの任意の結合したカーゴの分泌を可能にする任意のタンパク質またはペプチド配列を指す。本明細書で使用されるとき、「エンドソーム放出ドメイン」という用語は、細胞またはＥＶのエンドソームからの任意の結合したカーゴの放出を容易にする任意のペプチド配列を指すことを意図する。本明細書で使用されるとき、「受容体結合ドメイン」という用語は、表面に結合した細胞受容体と相互作用することができる任意のＲＮＡまたはタンパク質ドメインを指すことを意図する。本明細書で使用されるとき、「融合性ペプチド」という用語は、ＥＶまたは細胞からのカーゴ搬出を容易にする任意のペプチド配列を指すことを意図する。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、輸送ペプチド、及び第２のペイロード、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ）等の別の生物学的に活性な分子を含む。
ＩＩ．Ｄ．９．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一部の態様では、ペイロードは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶの内腔表面に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、ＡＡＶは、ＥＶの外部表面に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、ＡＡＶは、足場、例えば、タンパク質Ｘ足場もしくはその断片等のタンパク質足場、または脂質足場（例えば、コレステロール）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶカプシドタンパク質上に存在するマレイミド基と、足場上に存在するスルフヒドリル基（例えば、天然に存在するか、またはリンカーもしくは二官能性試薬を介して導入されるかのいずれか）との間の反応を介して、足場部分に化学的に連結されている。一部の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶカプシドタンパク質上に存在するスルフヒドリル基（例えば、天然に存在するか、またはリンカーもしくは二官能性試薬を介して導入されるかのいずれか）と、足場部分上に存在するマレイミド基との間の反応を介して、足場部分に化学的に連結されている。
一部の態様では、ＡＡＶは、遺伝子カセットを含む。一部の態様では、遺伝子カセットは、分泌タンパク質、受容体、構造的タンパク質、シグナル伝達タンパク質、感覚タンパク質、制御タンパク質、輸送タンパク質、貯蔵タンパク質、防御タンパク質、モータータンパク質、凝固因子、増殖因子、抗酸化物質、サイトカイン、ケモカイン、酵素、腫瘍抑制因子遺伝子、ＤＮＡ修復タンパク質、構造的タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、アルファグルコシダーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の態様では、遺伝子カセットは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質または第ＩＸ因子タンパク質をコードする。一部の態様では、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、野生型第ＶＩＩＩ因子、Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
一部の態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３Ａ型、ＡＡＶ３Ｂ型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、合成ＡＡＶ、それらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ＩＩ．Ｄ．１０．免疫調節剤
一部の態様では、ペイロードは、免疫調節剤を含む。ある特定の態様では、免疫調節剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、免疫調節剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｙタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。さらなる態様では、免疫調節剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔中にある。
一部の態様では、免疫調節剤は、負のチェックポイント制御因子の阻害剤または負のチェックポイント制御因子の結合パートナーの阻害剤を含む。ある特定の態様では、負のチェックポイント制御因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の態様では、免疫調節剤は、正の共刺激性分子の活性化剤または正の共刺激性分子の結合パートナーの活性化剤を含む。ある特定の態様では、正の共刺激性分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲ）である。一部の態様では、正の共刺激性分子の活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２）である。さらなる態様では、正の共刺激性分子は、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激性分子（例えば、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８）である。一部の態様では、正の共刺激性分子の活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
一部の態様では、免疫調節剤は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーを含む。ある特定の態様では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組み合わせを含む。
一部の態様では、免疫調節剤は、胚中心応答に必要とされる細胞内相互作用を支持するタンパク質を含む。ある特定の態様では、胚中心応答に必要とされる細胞内相互作用を支持するタンパク質は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバーまたはＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）を含む。一部の態様では、ＳＬＡＭファミリーメンバーは、ＳＬＡＭファミリーメンバー１、ＣＤ４８、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、Ｌｙ１０８、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２Ｆ－１０、またはそれらの組み合わせを含む。
ＩＩ．Ｄ．１０．リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）阻害剤
一部の態様では、ペイロードは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害剤、例えば、ＬＰＡ－１阻害剤を含む。ある特定の態様では、ＬＰＡ－１阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、ＬＰＡ－１阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｙタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。さらなる態様では、ＬＰＡ－１阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔中にある。
ＬＰＡは、プログラム細胞死から細胞を保護及び救済する非常に強力な内因性脂質メディエーターである。ＬＰＡは、その高親和性のＬＰＡ－１受容体を介して、線維形成の重要なメディエーターである。故に、ＬＰＡ阻害剤は、抗線維化剤として機能することができる。
一部の態様では、ＬＰＡ－１阻害剤は、マウスＬＰＡ－１または組換えヒトＬＰＡ－１に対してそれぞれ０．７３及び０．９８μＭのＩＣ５０値を有する、ＬＰＡ－１の強力かつ経口で生物学的に利用可能なアンタゴニストであるＡＭ０９５を含む。インビトロで、ＡＭ０９５は、０．７８μＭ及び０．２３μＭのＩＣ５０値で、マウスＬＰＡ－１／ＣＨＯ細胞及びヒトＡ２０５８黒色腫細胞の両方のＬＰＡ－１により誘導される走化性を阻害することが示されている。インビボで、ＡＭ０９５は、マウスにおいて８．３ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０値で、ＬＰＡにより誘導されるヒスタミン放出を用量依存的に遮断し得る。さらに、ＡＭ０９５は、肺において１０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０値で、ＢＡＬＦコラーゲン及びタンパク質を著しく低減することが明らかとなっている。ＡＭ０９５はまた、マウスにおいてブレオマイシンによって誘導されるマクロファージ及びリンパ球の両方の浸潤を減少させることも示されている。Ｓｗａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１６：１６０１－１６１３を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
一部の態様では、ＬＰＡ－１阻害剤は、ＡＭ１５２（別名ＢＭＳ－９８６０２０）を含む。ＡＭ１５２は、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ４、及びＭＤＲ３に対してそれぞれ４．８μＭ、６．２μＭ、及び７．５μＭのＩＣ５０で胆汁酸及びリン脂質トランスポーターを阻害する、高親和性のＬＰＡ－１アンタゴニストである。ＡＭ１５２は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の処置に使用することができる。Ｋｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３３３：１７１－７、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ５０：ＰＡ１０３８、及びＰａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｈｅｓｔ １５４：１０６１－１０６９を参照されたく、これらの文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。ＡＭ１５２の第２相試験（Ｐａｌｍｅｒ ２０１８に記載される）は、胆嚢毒性及び肝毒性肝トランスポーターの早期徴候（２つの特異的トランスポーター）のため、早期に中止された。
ＬＰＡ－１阻害剤を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）に関する追加の開示は、本開示の他の箇所で提供される（例えば、実施例５を参照されたい）。
ＩＩ．Ｄ．１１．ＮＬＲＰ３阻害剤
一部の態様では、ペイロードは、インフラマソーム阻害剤、例えば、ＮＬＲＰ３阻害剤を含む。ある特定の態様では、ＮＬＲＰ３阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、ＮＬＲＰ３阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の足場部分、例えば、足場Ｙタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。さらなる態様では、ＮＬＲＰ３阻害剤は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔中にある。
ＮＬＲＰ３、別名ＮＡＬＰ３、ＮＡＣＨＴ、またはクリオピリンは、ヒトにおいてＮＬＲＰ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＮＬＲＰ３は、主としてマクロファージで発現し、インフラマソームの構成成分である。ＮＬＲＰ３は、病原体由来の環境因子及び宿主由来因子を感知し、多くの炎症性疾患に関与する複合体であるインフラマソームの形成を開始する。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、組み立てられるとカスパーゼ－１を活性化し、ＩＬ－１βのプロセシング及び放出を媒介する、自然免疫センサーである。ＮＬＲＰ３インフラマソームの欠失によって、痛風、２型糖尿病、多発性硬化症、アルツハイマー病、及びアテローム性動脈硬化症を含めた、多くの疾患のマウスモデルの改善が生じることが示されている。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、痛風及び神経炎症の発生の病理発生において、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びプリオン病等のタンパク質ミスフォールディング病において、役割を有する。Ｌｉｕ－Ｂｒｙａｎ（２０１０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８：２０－２３、Ｈｅｎｅｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ４９３：６７４－６７８、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １３５：９－１４、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１：２１３－２１５。
一部の態様では、ＮＬＰＲ３阻害剤は、ジアリールスルホニルウレア含有化合物である。一部の態様では、ジアリールスルホニルウレア含有化合物は、ＭＣＣ９５０またはその誘導体である。
ＭＣＣ９５０（Ｎ－［［（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロ－ｓ－インダセン－４－イル）アミノ］カルボニル］－４－（１－ヒドロキシ－１－メチルエチル）－２－フランスルホンアミド）、別名ＣＰ－４５６７７３は、ＮＬＲＰ３（ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）ピリンドメイン含有タンパク質３）インフラマソームの強力かつ選択的な阻害剤である。ＭＣＣ９５０は、インフラマソームアダプタータンパク質ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）のオリゴマー形成を阻止することによって、ＡＴＰ、ＭＳＵ、及びニゲリシン等のＮＬＲＰ３活性化因子によって誘導されるＩＬ－１βの放出を遮断する。Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２１：２４８－２５５。ＭＣＣ９５０は、ＬＰＳでプライミングされ、ＡＴＰまたはニゲリシンで活性化されたマクロファージにおいて、およそ７．５ｎＭのＩＣ５０でＩＬ－１βの放出を遮断する。ＭＣＣ９５０は、ＮＬＲＰ３によって誘導されるＩＬ－１βの放出を遮断するものの、ＭＣＣ９５０は、ＮＬＲＣ４、ＡＩＭ２、またはＮＬＲＰ１インフラマソームを阻害しない。さらに、ＭＣＣ９５０は、ＴＬＲ２のシグナル伝達、またはＮＬＲＰ３のプライミングを阻害しない。
ＭＣＣ９５０は、インビボで活性であり、多発性硬化症のマウスモデルにおいてＩＬ－１βの産生を遮断するとともに、生存率を向上させる。ＭＣＣ９５０はまた、心筋梗塞のモデルにおいてＮＬＲＰ３誘導性のＩＬ－１β産生を阻害する。ｖａｎ Ｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．ｅｈｗ２４７。ＭＣＣ９５０はまた、マックル・ウェルズ症候群を有する個体由来のエクスビボ試料中でも活性である。ＭＣＣ９５０は、自己炎症性疾患及び自己免疫疾患を含めたＮＬＲＰ３関連症候群の処置のための潜在的な治療剤である。
ＩＩ．Ｅ．生体内分布変更剤
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、生体内分布変更剤を含む。本明細書で使用されるとき、「生体内分布変更剤」という用語は、インビボまたはインビトロで（例えば、異なる種類の細胞の混合培養物中で）細胞外小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）の分布を変更することができる薬剤（すなわち、ペイロード）を指す。一部の態様では、「標的化部分」という用語は、生体内分布変更剤という用語と互換的に使用され得る。一部の態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を改変する（「指向性部分」）。本明細書で使用されるとき、「指向性部分」という用語は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上に発現される場合、ＥＶの自然の移動を改変及び／または強化する標的化部分を指す。例えば、一部の態様では、指向性部分は、ＥＶが特定の細胞、組織、または臓器によって取り込まれるのを促進し得る。本開示とともに使用することができる指向性部分の非限定的な例としては、樹状細胞上に特異的に発現するマーカー（例えば、Ｃｌｅｃ９ＡまたはＤＥＣ２０５）またはＴ細胞上に特異的に発現するマーカー（例えば、ＣＤ３）に結合し得るものが挙げられる。別途指示されない限り、本明細書で使用される「標的化部分」という用語は、指向性部分を包含する。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を、標的（例えば、受容体等の標的タンパク質）を含む特定の細胞種または組織に導く、標的化部分、すなわち、生物学的に活性な分子を含み、ここで、別のペイロード（例えば、別の生物学的に活性な分子）が、治療、予防、または診断効果を有し得る。ある特定の態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。
一部の態様では、標的化部分は、例えば、抗体またはその抗原結合部分、すなわち、標的細胞または組織の表面上に存在するタンパク質（例えば、受容体）に特異的に結合するタンパク質またはペプチドである、外因性標的化部分である。
一部の態様では、標的化部分は、樹状細胞のマーカーに特異的に結合する。ある特定の態様では、マーカーは、樹状細胞上にのみ存在する。一部の態様では、樹状細胞は、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）、骨髄系／古典的樹状細胞１（ｃＤＣ１）、骨髄系／古典的樹状細胞２（ｃＤＣ２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様では、樹状細胞は、ｃＤＣ１である。さらなる態様では、マーカーは、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３捕捉非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様では、マーカーは、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質である。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、特定の組織または細胞へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を増加させる組織または細胞特異的リガンド、すなわち、指向性部分を含み得る。故に、一部の態様では、特定の組織または細胞種へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の送達は、細胞種に向けた指向性のための部分（例えば、ある特定の神経細胞種の表面上に存在する抗原を標的とする免疫親和性リガンド）をＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結することによって改善することができる。ある特定の態様では、指向性部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。
指向性は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面への、抗食作用シグナル（例えば、ＣＤ４７及び／またはＣＤ２４）、半減期延長部分（例えば、アルブミンまたはＰＥＧ）、またはそれらの任意の組み合わせの結合によってさらに改善することができる。ある特定の態様では、抗食作用シグナルは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外表面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。
所望の組織または解剖学的位置における薬物動態、生体分布、ならびに特に指向性及び保持はまた、適切な投与経路（例えば、中枢神経系への指向性を改善するための髄腔内投与または眼内投与）を選択することによって遂行することができる。
一部の態様では、中枢神経系への指向性が所望とされる場合、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、特定の中枢神経系組織または細胞へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を増加させる組織または細胞特異的標的リガンドを含み得る。一部の態様では、細胞は、グリア細胞である。一部の態様では、グリア細胞は、乏突起膠細胞、星状細胞、上衣細胞、小グリア細胞、シュワン細胞、サテライトグリア細胞、嗅神経鞘細胞、またはそれらの組み合わせである。一部の態様では、細胞は、神経幹細胞である。一部の態様では、シュワン細胞へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を増加させる細胞特異的標的リガンドは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）、Ｐ７５ＮＴＲ、ＮＣＡＭ、ＰＭＰ２２、及びそれらの任意の組み合わせ等のシュワン細胞表面マーカーに結合する。一部の態様では、細胞特異的指向性部分は、抗体もしくはその抗原結合部分、アプタマー、またはシュワン細胞の表面上に発現する受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。
原則として、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を特定の標的細胞または組織（例えば、末梢神経におけるシュワン細胞）に導くことができる少なくとも１つの指向性部分を含む、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、指向性部分の存在（単独でまたは抗食作用シグナルの存在及び特定の投与経路の使用と組み合わせて）が、所望の標的細胞または組織に対するＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を誘導するであろうことから、当該技術分野で既知の任意の好適な投与方法（例えば、静脈内注射または注入）を使用して投与することができる。
一部の態様では、本明細書に開示される標的化部分及び／または指向性部分は、足場部分（例えば、足場Ｘタンパク質部分もしくはその断片、または脂質部分）を介して本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結することができ、該標的化及び／または指向性部分は、マレイミド部分及び任意選択で１つまたは複数のリンカー（例えば、切断可能なリンカー）を介して、足場部分に化学的に連結されている。
ＩＩ．Ｆ．ＥＶ（例えば、エキソソーム）
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、約２０～約３００ｎｍの直径を有し得る。ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、約２０～約２９０ｎｍ、約２０～約２８０ｎｍ、約２０～約２７０ｎｍ、約２０～約２６０ｎｍ、約２０～約２５０ｎｍ、約２０～約２４０ｎｍ、約２０～約２３０ｎｍ、約２０～約２２０ｎｍ、約２０～約２１０ｎｍ、約２０～約２００ｎｍ、約２０～約１９０ｎｍ、約２０～約１８０ｎｍ、約２０～約１７０ｎｍ、約２０～約１６０ｎｍ、約２０～約１５０ｎｍ、約２０～約１４０ｎｍ、約２０～約１３０ｎｍ、約２０～約１２０ｎｍ、約２０～約１１０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約３０～約３００ｎｍ、約３０～約２９０ｎｍ、約３０～約２８０ｎｍ、約３０～約２７０ｎｍ、約３０～約２６０ｎｍ、約３０～約２５０ｎｍ、約３０～約２４０ｎｍ、約３０～約２３０ｎｍ、約３０～約２２０ｎｍ、約３０～約２１０ｎｍ、約３０～約２００ｎｍ、約３０～約１９０ｎｍ、約３０～約１８０ｎｍ、約３０～約１７０ｎｍ、約３０～約１６０ｎｍ、約３０～約１５０ｎｍ、約３０～約１４０ｎｍ、約３０～約１３０ｎｍ、約３０～約１２０ｎｍ、約３０～約１１０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約４０～約３００ｎｍ、約４０～約２９０ｎｍ、約４０～約２８０ｎｍ、約４０～約２７０ｎｍ、約４０～約２６０ｎｍ、約４０～約２５０ｎｍ、約４０～約２４０ｎｍ、約４０～約２３０ｎｍ、約４０～約２２０ｎｍ、約４０～約２１０ｎｍ、約４０～約２００ｎｍ、約４０～約１９０ｎｍ、約４０～約１８０ｎｍ、約４０～約１７０ｎｍ、約４０～約１６０ｎｍ、約４０～約１５０ｎｍ、約４０～約１４０ｎｍ、約４０～約１３０ｎｍ、約４０～約１２０ｎｍ、約４０～約１１０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約５０～約３００ｎｍ、約５０～約２９０ｎｍ、約５０～約２８０ｎｍ、約５０～約２７０ｎｍ、約５０～約２６０ｎｍ、約５０～約２５０ｎｍ、約５０～約２４０ｎｍ、約５０～約２３０ｎｍ、約５０～約２２０ｎｍ、約５０～約２１０ｎｍ、約５０～約２００ｎｍ、約５０～約１９０ｎｍ、約５０～約１８０ｎｍ、約５０～約１７０ｎｍ、約５０～約１６０ｎｍ、約５０～約１５０ｎｍ、約５０～約１４０ｎｍ、約５０～約１３０ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約５０～約１１０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約６０～約２９０ｎｍ、約６０～約２８０ｎｍ、約６０～約２７０ｎｍ、約６０～約２６０ｎｍ、約６０～約２５０ｎｍ、約６０～約２４０ｎｍ、約６０～約２３０ｎｍ、約６０～約２２０ｎｍ、約６０～約２１０ｎｍ、約６０～約２００ｎｍ、約６０～約１９０ｎｍ、約６０～約１８０ｎｍ、約６０～約１７０ｎｍ、約６０～約１６０ｎｍ、約６０～約１５０ｎｍ、約６０～約１４０ｎｍ、約６０～約１３０ｎｍ、約６０～約１２０ｎｍ、約６０～約１１０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約７０～約３００ｎｍ、約７０～約２９０ｎｍ、約７０～約２８０ｎｍ、約７０～約２７０ｎｍ、約７０～約２６０ｎｍ、約７０～約２５０ｎｍ、約７０～約２４０ｎｍ、約７０～約２３０ｎｍ、約７０～約２２０ｎｍ、約７０～約２１０ｎｍ、約７０～約２００ｎｍ、約７０～約１９０ｎｍ、約７０～約１８０ｎｍ、約７０～約１７０ｎｍ、約７０～約１６０ｎｍ、約７０～約１５０ｎｍ、約７０～約１４０ｎｍ、約７０～約１３０ｎｍ、約７０～約１２０ｎｍ、約７０～約１１０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約８０～約３００ｎｍ、約８０～約２９０ｎｍ、約８０～約２８０ｎｍ、約８０～約２７０ｎｍ、約８０～約２６０ｎｍ、約８０～約２５０ｎｍ、約８０～約２４０ｎｍ、約８０～約２３０ｎｍ、約８０～約２２０ｎｍ、約８０～約２１０ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、約８０～約１９０ｎｍ、約８０～約１８０ｎｍ、約８０～約１７０ｎｍ、約８０～約１６０ｎｍ、約８０～約１５０ｎｍ、約８０～約１４０ｎｍ、約８０～約１３０ｎｍ、約８０～約１２０ｎｍ、約８０～約１１０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約９０～約３００ｎｍ、約９０～約２９０ｎｍ、約９０～約２８０ｎｍ、約９０～約２７０ｎｍ、約９０～約２６０ｎｍ、約９０～約２５０ｎｍ、約９０～約２４０ｎｍ、約９０～約２３０ｎｍ、約９０～約２２０ｎｍ、約９０～約２１０ｎｍ、約９０～約２００ｎｍ、約９０～約１９０ｎｍ、約９０～約１８０ｎｍ、約９０～約１７０ｎｍ、約９０～約１６０ｎｍ、約９０～約１５０ｎｍ、約９０～約１４０ｎｍ、約９０～約１３０ｎｍ、約９０～約１２０ｎｍ、約９０～約１１０ｎｍ、約９０～約１００ｎｍ、約１００～約３００ｎｍ、約１１０～約２９０ｎｍ、約１２０～約２８０ｎｍ、約１３０～約２７０ｎｍ、約１４０～約２６０ｎｍ、約１５０～約２５０ｎｍ、約１６０～約２４０ｎｍ、約１７０～約２３０ｎｍ、約１８０～約２２０ｎｍ、または約１９０～約２１０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）のサイズは、当該技術分野で既知の方法に従って測定することができる。本開示のＥＶは、エキソソーム、微小胞、アポトーシス小体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、本開示のＥＶは、エキソソーム及び／または微小胞の集団を含む。
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、内表面（内腔表面）及び外表面（例えば、細胞外表面）を含む、脂質二重膜（「エキソソーム膜」または「ＥＶ膜」）を含む。内表面は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内部コア、すなわち、ＥＶの内腔に面する。ある特定の態様では、外部表面は、プロデューサー細胞のエンドソーム、多胞体、または膜／細胞質と接触し得る。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）膜は、脂質二重膜、例えば、脂質二重層を含む。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）膜は、脂質及び脂肪酸を含む。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む脂質を含む。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）膜は、内葉及び外葉を含む。内葉及び外葉の組成は、当該技術分野で既知の二重層間（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ）分布アッセイによって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。
一部の態様では、外葉の組成は、およそ７０～９０％がコリンリン脂質、およそ０～１５％が酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％がホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、内葉の組成は、およそ１５～４０％がコリンリン脂質、およそ１０～５０％が酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％がホスファチジルエタノールアミンである。一部の態様では、ＥＶまたはエキソソーム膜は、グリカン等の１つまたは複数の多糖類を含む。ＥＶまたはエキソソームの表面上のグリカンは、マレイミド部分またはグリカン及びマレイミド部分をつなげるリンカーへの結合としての役目を果たし得る。グリカンは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面上の１つもしくは複数のタンパク質、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘ上、またはＥＶ（例えば、エキソソーム）の脂質膜上に存在し得る。グリカンは、マレイミド部分をグリカンに結合させるための官能基としての役目を果たし得るチオフコースを有するように修飾され得る。一部の態様では、足場Ｘは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）上の追加の結合を可能にするために多数のグリカンを発現するように修飾され得る。
ＩＩ．Ｇ．足場部分
一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面または内腔表面に連結されている。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面上または内腔表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、マレイミド部分を介してＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面上または内腔表面上の足場部分（例えば、コレステロール部分）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。
例えば、完全長成熟ＰＴＧＲＮは、１６個のシステインを含み、すなわち、それは１６個のスルフヒドリル基を含有し、これらのうちの１４個がタンパク質の細胞外部分上に位置し、これらのうちの２個がその細胞内部分上に位置する。ＰＴＧＲＮは、全て細胞外にある６つのジスルフィド架橋を有する。したがって、ＰＴＧＲＮは、２つの細胞外スルフヒドリル基及び２つの細胞内スルフヒドリル基を有する。故に、一部の態様では、生物学的に活性な部分は、生物学的に活性な部分上に存在するマレイミド反応性基と、足場Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＲＮまたはその断片）上に存在するスルフヒドリル基のうちの１つとの間の反応によって、マレイミド部分を介して足場Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＲＮまたはその断片）に化学的に連結され得る。逆に、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）等の二官能性試薬と、足場Ｘタンパク質のリジン側鎖との間の反応によって導入されたマレイミド反応性基を含む、足場Ｘタンパク質（例えば、ＰＴＧＲＮまたはその断片）を、生物学的に活性な分子に存在するスルフヒドリル基と反応させることが可能である。
ある特定の態様では、１つまたは複数の部分は、トランスフェクションによってＥＶ（例えば、エキソソーム）に導入することができる。一部の態様では、１つまたは複数の部分は、カチオン性脂質及び重合体等の合成高分子を使用して、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。ある特定の態様では、カルシウムリン酸、シクロデキストリン、またはポリブレン等の化学物質を使用して、１つまたは複数の部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）に導入することができる。
一部の態様では、１つまたは複数の足場部分は、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４９、ＣＤ４０、ＣＤ１３３、ＣＤ５９、グリピカン－１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、インテグリン、セレクチン、レクチン、カドヘリン、当業者に既知の他の類似のポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
他の態様では、１つまたは複数の足場部分は、プロデューサー細胞において足場部分を組換え発現させることによって、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の膜において発現される。プロデューサー細胞から得られたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、マレイミド部分またはリンカーにコンジュゲートされるようにさらに修飾され得る。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、脱グリコシル化されている。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、例えば、同じ条件下で天然に存在する足場Ｘよりも高く、高度にグリコシル化されている。
ＩＩ．Ｇ．１．膜貫通型足場部分（例えば、足場Ｘ）
足場部分の種々の修飾体または断片を本開示の態様に使用することができる。例えば、結合剤に対して強化された親和性を有するように修飾された足場部分は、結合剤を使用して精製され得る、表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）を生成するために使用することができる。ＥＶ（例えば、エキソソーム）及び／または膜により有効に標的化されるように修飾された足場部分を使用することができる。ＥＶ（例えば、エキソソーム）膜への特異的かつ有効な標的化に必要とされる最小限の断片を含むように修飾された足場部分もまた使用することができる。一部の態様では、足場部分は、本明細書に記載されるようなマレイミド部分に連結され得る。他の態様では、足場部分は、マレイミド部分に連結されていない。
足場部分は、例えば、別の分子上のマレイミドと反応することができる別の部分（例えば、タンパク質リンカー、反応性基、例えば、スルフヒドリル基を含むタンパク質配列、またはそれらの組み合わせ）との融合タンパク質、例えば、足場Ｘの融合タンパク質として発現されるように、合成的に操作または組換え操作することができる。例えば、融合タンパク質は、別の部分に連結された本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくはバリアント）を含み得る。融合タンパク質の場合、第２の部分は、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。他の態様では、足場部分は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩタンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、またはＬＡＭＰ２Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本開示とともに使用することができる他の足場部分の非限定的な例としては、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、別名、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
一部の態様では、融合分子は、直接的にまたは中間体（例えば、化学的に誘導可能な二量体、抗原結合ドメイン、または受容体）を介してのいずれかで、生物学的に活性な分子に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結された、本明細書に開示される足場タンパク質（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくはバリアント）を含み得る。一部の態様では、融合分子は、例えば、マレイミド部分を介して標的化部分または指向性部分に化学的に連結され得る。
一部の態様では、本明細書に記載の表面（例えば、足場Ｘ）が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、当該技術分野で既知のＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較してより優れた特性を示す。例えば、表面（例えば、足場Ｘ）操作は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）のそれらの外部表面または内腔表面上に、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）、または従来のＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質を使用して生産されたＥＶ（例えば、エキソソーム）よりも高度に濃縮された修飾タンパク質を含有する。その上、本開示の表面（例えば、足場Ｘ）が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）、または従来のＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質を使用して生産されたＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較して、より高い、より特異的な、またはより制御された生物学的活性を有し得る。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質は、プロスタグランジンＦ２受容体の負の制御因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドはまた、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体制御タンパク質、プロスタグランジンＦ２－アルファ受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５とも称され得る。ヒトＰＴＧＦＲＮポリペプチドの完全長アミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）は、表２で配列番号１として示される。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）を含有する。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含めない配列番号１、すなわち、配列番号１のアミノ酸２６～８７９からなる。一部の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびに（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端に少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１１０個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端に少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、もしくは少なくとも約２５個のアミノ酸、または（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。
一部の態様では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６～８７９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片（配列番号１の６８７位～８７８位に対応する）である配列番号２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号２のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号２のアミノ酸配列、ならびに配列番号２のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６～８７９、配列番号１のアミノ酸８３３～８５３、配列番号２、または配列番号１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１のアミノ酸２６～８７９、配列番号１のアミノ酸８３３～８５３、配列番号２、または配列番号１のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６～８７９、配列番号１のアミノ酸８３３～８５３、配列番号２、または配列番号１のアミノ酸配列、ならびに配列番号１のアミノ酸２６～８７９、配列番号１のアミノ酸８３３～８５３、配列番号２、または配列番号１のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、または１９１のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
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他の実施形態では、足場部分、例えば、足場Ｘは、対応する成熟ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ５タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質、またはＩＧＳＦ２タンパク質（シグナルペプチドを含めない）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ５タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質、またはＩＧＳＦ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＢＳＧタンパク質、ＩＧＳＦ８タンパク質、ＩＧＳＦ３タンパク質、ＩＴＧＢ１タンパク質、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質、ＩＴＧＡ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質、ＡＴＰ１Ａ５タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質、またはＩＧＳＦ２タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０，１９５，２９０Ｂ１号で見出すことができ（同文献は参照によりその全体が援用される）、ＡＴＰトランスポータータンパク質：ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、及びＡＴＰ２Ｂ４）、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩタンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂである。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７としても知られている。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｐ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号３のアミノ酸１～２１である。配列番号３のアミノ酸１３８～３２３は、ＢＳＧの細胞外ドメインであり、配列番号３のアミノ酸３２４～３４４は、膜貫通ドメインであり、配列番号３のアミノ酸３４５～３８５は、細胞質ドメインである。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ヒトＢＳＧタンパク質（配列番号３）のアミノ酸２２～３８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ベイシジンポリペプチドの断片は、ＩｇＶ、例えば、ヒトＢＳＧタンパク質のアミノ酸２２１～３１５等の、１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１９３、１９４、または１９５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１９３、１９４、または１９５のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１９３、１９４、または１９５のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９３、１９４、または１９５のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）を含み、これはＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ－２）、ケラチノサイト関連膜貫通型タンパク質４（ＫＣＴ－４）、ＬＩＲ－Ｄ１、プロスタグランジン制御様タンパク質（ＰＧＲＬ）、またはＣＤ３１６としても知られている。完全長ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて受託番号Ｑ９６９Ｐ０であり、本明細書で配列番号４として示される。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（ヒトＩＧＳＦ８タンパク質、配列番号４のアミノ酸１～２７）、細胞外ドメイン（ヒトＩＧＳＦ８タンパク質、配列番号４のアミノ酸２８～５７９）、膜貫通ドメイン（ヒトＩＧＳＦ８タンパク質、配列番号４のアミノ酸５８０～６００）、及び細胞質ドメイン（ヒトＩＧＳＦ８タンパク質、配列番号４のアミノ酸６０１～６１３）を有する。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ヒトＩＧＳＦ８タンパク質（配列番号４）のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ８タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、ヒトＩＧＳＦ８タンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ヒトＩＧＳＦ８タンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列、ならびにヒトＩＧＳＦ８タンパク質（配列番号４）のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のアミノ酸配列、ならびに配列番号１９７、１９８、１９９、または２００のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
一部の態様では、本開示のための足場部分、例えば、足場Ｘは、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）を含み、これはＧｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ－３）としても知られ、配列番号２０３のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号２０３のＩＧＳＦ３タンパク質のアミノ酸１～１９）、細胞外ドメイン（配列番号２０３のＩＧＳＦ３タンパク質のアミノ酸２０～１１２４）、膜貫通ドメイン（ＩＧＳＦ３タンパク質のアミノ酸１１２５～１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号２０３のＩＧＳＦ３タンパク質のアミノ酸１１４６～１１９４）を有する。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ＩＧＳＦ３タンパク質（配列番号２０３）のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ３タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
一部の態様では、本開示のための足場部分、例えば、足場Ｘは、インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）を含み、これはフィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質ＩＩａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ－４サブユニットベータ、またはＣＤ２９としても知られ、配列番号５のアミノ酸配列として示される。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号５のヒトＩＴＧＢ１タンパク質のアミノ酸１～２０）、細胞外ドメイン（配列番号５のヒトＩＴＧＢ１タンパク質のアミノ酸２１～７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号５のヒトＩＴＧＢ１タンパク質のアミノ酸７２９～７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号５のヒトＩＴＧＢ１タンパク質のアミノ酸７５２～７９８）を有する。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、ヒトＩＴＧＢ１タンパク質（配列番号５）のアミノ酸２１～７９８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＩＴＧＢ１タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチド（配列番号６のヒトＩＴＧＢ１タンパク質のアミノ酸１～３３）を含めない配列番号６のヒトＩＴＧＢ１タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＴＧＡ４タンパク質を含む。一部の態様では、ＩＴＧＡ４タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号７のＳＬＣ３Ａ２タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０４のＡＴＰ１Ａ１タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０５のＡＴＰ１Ａ２タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０６のＡＴＰ１Ａ３タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０７のＡＴＰ１Ａ４タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０８のＡＴＰ１Ｂ３タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２０９のＡＴＰ２Ｂ１タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２１０のＡＴＰ２Ｂ２タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２１１のＡＴＰ２Ｂ３タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めない配列番号２１２のＡＴＰ２Ｂ４タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質を含む。一部の態様では、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘは、シグナルペプチドを含めないＩＧＳＦ２タンパク質（配列番号２０２）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、ＩＧＳＦ２タンパク質を含む。一部の態様では、ＩＧＳＦ２タンパク質は、ＩｇＶ等の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いている。
他の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号で見出すことができ、同文献は参照によりその全体が援用される。
一部の態様では、当該配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場部分の断片をコードする。一部の態様では、当該配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場部分の断片をコードする。一部の態様では、当該配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００、または少なくとも約８００個のアミノ酸を欠いた足場部分の断片をコードする。一部の態様では、当該配列は、天然タンパク質の１つまたは複数の機能的または構造的ドメインを欠いた足場部分の断片をコードする。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、１つまたは複数の異種タンパク質に連結されている。１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端に連結され得る。１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＣ末端に連結され得る。一部の態様では、１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結されている。一部の態様では、異種タンパク質は、哺乳類タンパク質である。一部の態様では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘを使用して、任意の部分をＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面及び外部表面に同時に連結することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用して、１つまたは複数の生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に加えて、内腔表面に、マレイミド部分を介して間接的に、またはその内腔表面へのマレイミド部分もしくはリンカーに直接的に連結することができる。したがって、ある特定の態様では、足場Ｘを二重目的で使用することができる。
他の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較してより多数の足場Ｘタンパク質を含む。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較して少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２１０倍、少なくとも約２２０倍、少なくとも約２３０倍、少なくとも約２４０倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約２６０倍、少なくとも約２７０倍多い数の足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場部分、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘの数は、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１１００個、少なくとも約１２００個、少なくとも約１３００個、少なくとも約１４００個、少なくとも約１５００個、少なくとも約１６００個、少なくとも約１７００個、少なくとも約１８００個、少なくとも約１９００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約２１００個、少なくとも約２２００個、少なくとも約２３００個、少なくとも約２４００個、少なくとも約２５００個、少なくとも約２６００個、少なくとも約２７００個、少なくとも約２８００個、少なくとも約２９００個、少なくとも約３０００個、少なくとも約４０００個、少なくとも約５０００個、少なくとも約６０００個、少なくとも約７０００個、少なくとも約８０００個、少なくとも約９０００個、または少なくとも約１００００個である。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場部分、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘの数は、約１００～約１００，０００個、約２００～約９０００個、約３００～約９０００個、約４００～約９０００個、約５００～約９０００個、約６００～約８０００個、約８００～約８０００個、約９００～約８０００個、約１０００～約８０００個、約１１００～約８０００個、約１２００～約８０００個、約１３００～約８０００個、約１４００～約８０００個、約１５００～約８０００個、約１６００～約８０００個、約１７００～約８０００個、約１８００～約８０００個、約１９００～約８０００個、約２０００～約８０００個、約２１００～約８０００個、約２２００～約８０００個、約２３００～約８０００個、約２４００～約８０００個、約２５００～約８０００個、約２６００個～、約２７００～約８０００個、約２８００～約８０００個、約２９００～約８０００個、約３０００～約８０００個、約４０００～約８０００個、約５０００～約８０００個、約６０００～約８０００個、約７０００～約８０００個、約８０００個～、７０００～約９０００個、または約６０００～約１００００個である。
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場部分、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘの数は、約５０００～約８０００個、例えば、約５０００個、約６０００個、約７０００個、または約８０００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場部分、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘの数は、約６０００～約８０００個、例えば、約６０００個、約７０００個、または約８０００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場部分、例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド等の足場Ｘの数は、約４０００～約９０００個、例えば、約４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、約９０００個である。
ＩＩ．Ｇ．２．内腔足場部分（例えば、足場Ｙ）
一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）の内部空間（すなわち、内腔）とは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の組成が、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）のタンパク質、脂質、またはグリカン含量とは異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含量を有するように変化させられ得る。
一部の態様では、操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、エキソソームの内腔表面の組成または含量を変化させる、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｙ）または足場部分の修飾体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上に発現され得る、ＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質の種々の修飾体または断片を本開示の態様に使用することができる。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面を変化させることができるＥＶ（例えば、エキソソーム）タンパク質には、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質、ＢＡＳＰ１タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａの神経組織濃縮酸性タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）または神経軸索膜タンパク質（ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｘｏｎａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＮＡＰ－２２としても知られている。完全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、表３に示される。選択的スプライシングによって生み出される異性体は、表３におけるＢＡＳＰ１タンパク質（異性体１）からアミノ酸８８～１４１が欠損している。
Figure 2022525924000077
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、それらの任意の機能的断片、バリアント、もしくは誘導体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含む。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、Ｓｒｃタンパク質またはその断片を含む。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、例えば、米国特許第９，６１１，４８１号に開示される配列を含む。
一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６６）は、タンパク質キナーゼＣ基質、８０ｋＤａのタンパク質、軽鎖としても知られている。完全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、長さが３３２アミノ酸であり、アミノ酸残基１５２～１７６にてカルモジュリン結合ドメインを含む。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。
一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ４９００６）、別名ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１、及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質を含む。完全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、長さが１９５アミノ酸である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０にて、脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを含む。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。
一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、ＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８０７２３）、別名２２ｋＤａの神経組織濃縮酸性タンパク質または神経軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２を含む。完全長ヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は、長さが２２７アミノ酸である。選択的スプライシングによって生み出される異性体は、異性体１からアミノ酸８８～１４１が欠損している。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質（すなわち、Ｎ末端メチオニンを含まない）を含む。一部の態様では、本開示の足場部分、例えば、足場Ｙは、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質に由来し、すなわち、それは、成熟ＢＡＳＰ１タンパク質の断片、バリアント、または誘導体であり、したがって、非成熟タンパク質に存在するＮ末端タンパク質を欠いている。成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号１０から最初のＭｅｔが欠損しており、故に、配列番号１０のアミノ酸２～２２７を含有する。
他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号１０のアミノ酸２～２２７、すなわち、ＢＡＳＰ１の成熟形態（すなわち、配列番号１０に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質は、配列番号１０（ＢＡＳＰ１）の成熟形態（すなわち、配列番号１０に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号１０のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号９（ＭＡＲＣＫＳＬ１）の成熟形態（すなわち、配列番号９に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号９（ＭＡＲＣＫＳＬ１）の成熟形態（すなわち、配列番号９に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号９のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号９のアミノ酸配列、ならびに配列番号９のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号８（ＭＡＲＣＫＳ）の成熟形態（すなわち、配列番号８に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号８（ＭＡＲＣＫＳ）の成熟形態（すなわち、配列番号８に存在するＮ末端メチオニンアミノ酸を含まない）の機能的断片と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号８のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、配列番号８のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＮ末端及び／またはＣ末端に１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、もしくは２０個のアミノ酸、またはそれよりも長いアミノ酸を含む。
ある特定の態様では、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９に開示される配列番号１～１０９のうちのいずれかのタンパク質配列が、本開示のための足場Ｙ（例えば、リンカーに連結された足場部分）となるのに十分である。
ある特定の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２４）またはＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２５）を有するペプチドを含み、ここで、Ｘは、アラニンまたは任意の他のアミノ酸である。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）または（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、括弧付きの各位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、位置５は（＋）ではなく、かつ位置６は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。さらなる態様では、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）（例えば、操作されたエキソソーム）は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）または（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、括弧付きの各位置はアミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、位置５は（＋）ではなく、かつ位置６は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。アミノ酸命名法については、Ａａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５１３（２００２）１４１－１４４を参照されたい。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、２０１９年２月５日に発行されたＵＳ１０，１９５，２９０Ｂ１に開示される配列のうちのいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の足場Ｙが操作されたエキソソームは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９に定められる任意の配列（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９からの配列番号４～１０９）で形質転換された細胞から産生され得る。
他の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較してより多数の足場Ｙタンパク質を含む。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、天然に存在するＥＶ（例えば、エキソソーム）と比較して少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１９０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２１０倍、少なくとも約２２０倍、少なくとも約２３０倍、少なくとも約２４０倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約２６０倍、少なくとも約２７０倍多い数の足場Ｙ（例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチド）を含む。本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｙ、例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチドの数は、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１１００個、少なくとも約１２００個、少なくとも約１３００個、少なくとも約１４００個、少なくとも約１５００個、少なくとも約１６００個、少なくとも約１７００個、少なくとも約１８００個、少なくとも約１９００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約２１００個、少なくとも約２２００個、少なくとも約２３００個、少なくとも約２４００個、少なくとも約２５００個、少なくとも約２６００個、少なくとも約２７００個、少なくとも約２８００個、少なくとも約２９００個、少なくとも約３０００個、少なくとも約４０００個、少なくとも約５０００個、少なくとも約６０００個、少なくとも約７０００個、少なくとも約８０００個、少なくとも約９０００個、または少なくとも約１００００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｙ、例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチドの数は、約１００～約１００，０００個、約２００～約９０００個、約３００～約９０００個、約４００～約９０００個、約５００～約９０００個、約６００～約８０００個、約８００～約８０００個、約９００～約８０００個、約１０００～約８０００個、約１１００～約８０００個、約１２００～約８０００個、約１３００～約８０００個、約１４００～約８０００個、約１５００～約８０００個、約１６００～約８０００個、約１７００～約８０００個、約１８００～約８０００個、約１９００～約８０００個、約２０００～約８０００個、約２１００～約８０００個、約２２００～約８０００個、約２３００～約８０００個、約２４００～約８０００個、約２５００～約８０００個、約２６００個～、約２７００～約８０００個、約２８００～約８０００個、約２９００～約８０００個、約３０００～約８０００個、約４０００～約８０００個、約５０００～約８０００個、約６０００～約８０００個、約７０００～約８０００個、約８０００個～、７０００～約９０００個、または約６０００～約１００００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｙ、例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチドの数は、約５０００～約８０００個、例えば、約５０００個、約６０００個、約７０００個、または約８０００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｙ、例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチドの数は、約６０００～約８０００個、例えば、約６０００個、約７０００個、または約８０００個である。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）上の足場Ｙ、例えば、ＢＡＳＰ－１ポリペプチドの数は、約４０００～約９０００個、例えば、約４０００個、約５０００個、約６０００個、約７０００個、約８０００個、約９０００個である。
一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、該ＮＤ及び／または該ＥＤは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に会合している。一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含み、該細胞内ドメインは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、該ＮＤ及び／または該ＥＤは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に会合している。本明細書で使用されるとき、「に会合する」という用語は、膜構成成分への共有結合性の連結を伴わない、本開示の足場タンパク質と、ＥＶ、例えば、及びエキソソームの内腔表面との間の相互作用を指す。例えば、本開示に有用な足場部分は、例えば、脂質（例えば、ミリスチン酸）、及び／または負に帯電した膜リン脂質の頭部と静電的に相互作用する多塩基性ドメインを介して、ＥＶの内腔表面に会合し得る。他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、該ＮＤは、ＥＶの内腔表面に会合しており、該ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶの内腔表面に会合しており、該ＥＤは、連続的に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続した塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を含む。
他の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、該ＮＤは、ＥＶの内腔表面に会合しており、該ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶの内腔表面に会合しており、該ＥＤは、連続的に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
他の態様では、ＥＤは、１つまたは複数の低複雑性領域、例えば、ＰＥＳＴモチーフをさらに含む。ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）が豊富なペプチド配列である。一部の態様では、ＥＤは、負に帯電した残基（例えば、Ｇｌｕ）ならびに一過性のリン酸化を経る多くのＳｅｒ及びＴｈｒをさらに含む（故に、いずれもＥＤからの領域に負電荷を付加する）。
一部の態様では、ＮＤは、脂質化を介して、例えば、ミリストイル化を介して、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に会合している。一部の態様では、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。一部の態様では、Ｎ末端のＧｌｙは、ミリストイル化されている。
一部の態様では、ＥＤは、イオン性相互作用によってＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に会合している。一部の態様では、ＥＤは、静電相互作用、特に引力静電相互作用によってＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面に会合している。
一部の態様では、ＥＤは、ポリペプチド配列内に（ｉ）塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または（ｉｉ）互いに隣り合った２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。一部の態様では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎは、１～１０の整数である。
一部の態様では、ＥＤは、（ｉ）ＥＤ内のリジンリピートまたは（ｉｉ）ＮＤとのリジンリピート、例えば、ＮＤのＣ末端におけるＫ及びＥＤのＮ末端におけるＫを含み、該ＮＤ及び該ＥＤは、直接的に、すなわちペプチド結合によって、連結されている。一部の態様では、異種部分、例えば、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔中に連結することが可能なアミノ酸の最小数は、例えば、約７～約１５個、約７～約１４個、約７～約１３個、約７～約１２個、約７～約１１個、約７～約１０個、約７～約９個、または約７～約８個のアミノ酸断片である。
他の態様では、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端におけるリジンに直接的に連結されている場合、ＥＤは、少なくともリジンを含み、ＮＤは、Ｃ末端にリジンを含み、すなわち、該リジンは、ＥＤのＮ末端にあり、ＮＤのＣ末端におけるリジンに融合されている。他の態様では、ＥＤのＮ末端が、リンカー、例えば、１つまたは複数のアミノ酸によってＮＤのＣ末端に連結されている場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。一部の態様では、ＥＤは、連続的に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
一部の態様では、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、ＥＤは、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に定められるようなアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸を表し、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を表す。一部の態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、該ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６（ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立して、アミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含む）に定められるようなアミノ酸配列を含み、該ＥＤは、ペプチド結合によってＸ６に連結されており、該ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場ＹのＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ，Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す。
一部の態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。
一部の態様では、ＮＤ及びＥＤは、リンカーによって結合している。一部の態様では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。一部の態様では、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）、または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーがタンデムで連結され得る。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を阻止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、ある特定の態様では、かかる切断が望ましい場合がある。したがって、一部の態様では、リンカーは、プロテアーゼにより切断可能な１つまたは複数の部位を含むことができ、これらの部位は、リンカーの配列内に位置し得るか、またはリンカー配列のそれぞれの末端でリンカーに隣接し得る。ＮＤ及びＥＤがリンカーによって結合している場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。ＮＤ及びＥＤを結合するために使用され得るリンカーは、本明細書の他の箇所に開示される。
一部の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、少なくとも約６５個、少なくとも約７０個、少なくとも約７５個、少なくとも約８０個、少なくとも約８５個、少なくとも約９０個、少なくとも約９５個、または少なくとも約１００個のアミノ酸を含み得る。
一部の態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。一部の態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍによるグリシン／セリンリンカー（配列番号４６）であり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（配列番号４７）によるものであり、式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎ（配列番号４８）を含み、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。一部の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号４９）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号５０）を含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。
一部の態様では、ペプチドリンカーは、合成であり、すなわち、天然に存在しない。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直鎖状配列を、それが自然界で天然には連結または遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含む、ペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然のまたは天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換、または欠失等の変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含み得る。
他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在しないアミノ酸を含み得る。なおも他の態様では、ペプチドリンカーは、自然界では存在しない直鎖状配列で存在する、天然に存在するアミノ酸を含み得る。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、ＮＤ－ＥＤを含み、ここで、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６（ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ，Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す）を含み、「－」は、任意選択的なリンカーを表し、ＥＤは、（ｉ）ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸によってＸ６に連結されている少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によってＸ６に直接的に連結されている少なくとも１つのリジンを含む、エフェクタードメインである。
一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、Ｘ４アミノ酸は、ＬｅｕまたはＧｌｕである。一部の態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される。一部の態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、Ｘ３アミノ酸は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ４アミノ酸は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕであり、Ｘ５アミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。一部の態様では、「－」リンカーは、ペプチド結合または１つもしくは複数のアミノ酸を含む。
一部の態様では、足場部分におけるＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１２）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号１３）；ＲＲＲＲＲ（配列番号１４）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１５）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号１６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場ＹにおけるＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号５１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫ（配列番号５２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫ（配列番号５３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫ（配列番号５４）、及び（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、足場タンパク質におけるＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＧ（配列番号５５）、ＫＫＫＧＹ（配列番号５６）、ＫＫＫＧＹＮ（配列番号５７）、ＫＫＫＧＹＮＶ（配列番号５８）、ＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号５９）、ＫＫＫＧＹＳ（配列番号６０）、ＫＫＫＧＹＧ（配列番号６１）、ＫＫＫＧＹＧＧ（配列番号６２）、ＫＫＫＧＳ（配列番号６３）、ＫＫＫＧＳＧ（配列番号６４）、ＫＫＫＧＳＧＳ（配列番号６６）、ＫＫＫＳ（配列番号６７）、ＫＫＫＳＧ（配列番号６８）、ＫＫＫＳＧＧ（配列番号６９）、ＫＫＫＳＧＧＳ（配列番号７０）、ＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号７１）、ＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号７２）、ＫＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号７３）、ＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号２４１）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示に有用な足場Ｙのポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号２１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号２０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙのポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号２２）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号２３）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号２４）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号２５）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号２６）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号２７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号２８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号２９）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。一部の態様では、本開示の足場タンパク質は、連続的に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、長さが少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約４５、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、または少なくとも約３５０アミノ酸である。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、長さが約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、約１９０～約２００、約２００～約２１０、約２１０～約２２０、約２２０～約２３０、約２３０～約２４０、約２４０～約２５０、約２５０～約２６０、約２６０～約２７０、約２７０～約２８０、約２８０～約２９０、約２９０～約３００、約３００～約３１０、約３１０～約３２０、約３２０～約３３０、約３３０～約３４０、または約３４０～約２５０アミノ酸である。
一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）を含む。
一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙのポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３２）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３３）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３５）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３６）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３７）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３８）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４１）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４２）からなる。
本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙの非限定的な例は、下記に列挙される。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、表４に定められるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、表４に定められるアミノ酸配列からなる。
Figure 2022525924000078
Figure 2022525924000079
Figure 2022525924000080
一部の態様では、本開示に有用な足場部分、例えば、足場Ｙは、Ｎ末端のＭｅｔを含有しない。一部の態様では、足場部分、例えば、足場Ｙは、足場タンパク質のＮ末端に、脂質として機能する脂質化アミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。Ｎ末端のＧｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化のための絶対条件である。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、合成である。一部の態様では、足場タンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。
他の態様では、脂質は、当該技術分野で既知の任意の脂質、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。例えば、ミリスチン酸が制限される培養液を使用することによる、特殊な状況下では、短鎖脂肪酸及び不飽和脂肪酸を含む何らかの他の脂肪酸を、Ｎ末端グリシンに結合させることができる。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリステートが、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニンまたはチロシン残基に翻訳後に結合させられることが報告されている。当該技術分野で既知の足場部分として作用し得る膜部分が、以下の表に提示される。
Figure 2022525924000081
ＩＩ．Ｇ．３．足場タンパク質融合構築物
一部の態様では、足場部分は、１つまたは複数の異種タンパク質に連結されている。１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端に連結され得る。１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＣ末端に連結され得る。一部の態様では、１つまたは複数の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結されている。一部の態様では、異種タンパク質は、哺乳類タンパク質である。一部の態様では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
一部の態様では、足場部分を使用して、任意の部分をエキソソームの内腔表面及び／または外部表面に連結することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用して、生物学的に活性な分子を、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に加えて、内腔の内側（例えば、内腔表面上）に連結することができる。したがって、ある特定の態様では、足場部分は、二重目的で、例えば、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の生物学的に活性な分子及び外部表面上の第２の生物学的に活性な分子もしくは他のペイロード、またはエキソソームの外部表面上の生物学的に活性な分子及びＥＶ（例えば、エキソソーム）の内腔表面上の第２の生物学的に活性な分子もしくは他のペイロードのために、使用することができる。
ＩＩ．Ｇ．４．脂質
マレイミド部分による化学的連結を介して、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に連結することが可能な好適な足場部分は、例えば、下記に詳述されるようなステロール（例えば、コレステロール）、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、または脂溶性ビタミンを含む。
一部の態様では、足場部分は、脂質であり得る。脂質足場部分は、当該技術分野で既知の任意の脂質、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。一部の態様では、脂質は、脂肪酸、ホスファチド、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルエタノールアミン）、またはその類似体（例えば、ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、セファリン、もしくはホスファチジルセリン、またはその部分加水分解部分等のそれらの類似体もしくは部分）である。
足場部分は、マレイミド部分を使用して、生物学的に活性な分子に連結、例えば、化学的に連結され得る。かかる結合は、任意の化学的に実行可能な位置で、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）のヌクレオチド配列の、例えば、５’末端及び／または３’末端で、直接的またはリンカーもしくはリンカーの組み合わせを介して間接的であり得る。一態様では、足場部分は、生物学的に活性な分子の３’末端にのみ連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一態様では、足場部分は、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）のヌクレオチド配列の５’末端にのみ連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一態様では、足場部分は、例えば、生物学的に活性な分子（例えば、ＡＳＯ）のヌクレオチド配列の３’末端でも５’末端でもない位置で連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。
一部の態様では、生物学的に活性な分子は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に、例えば、上記に開示される脂質のうちのいずれか（例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸、脂肪酸、ファルネシル、ゲラニル－ゲラニル、またはコレステロール）に連結、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結されている。一部の態様では、足場部分は、本明細書に開示される２種類以上の足場部分を含み得る。例えば、一部の態様では、足場部分は、２つの脂質、例えば、リン脂質及び脂肪酸、または２つのリン脂質、または２つの脂肪酸、または脂質及びビタミン、またはコレステロール及びビタミン等を含み得、これらは一緒にして６～８０個の炭素原子（すなわち、約６～約８０の等価炭素数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）（ＥＣＮ））を有する。
一部の態様では、足場部分の組み合わせ、例えば、脂質（例えば、脂肪酸）の組み合わせは、約６～約８０、約８～約８０、約１０～約８０、約１２～約８０、約１４～約８０、約１６～約８０、約１８～約８０、約２０～約８０、約２２～約８０、約２４～約８０、約２６～約８０、約２８～約８０、約３０～約８０、約４～約７６、約６～約７６、約８～約７６、約１０～約７６、約１２～約７６、約１４～約７６、約１６～約７６、約１８～約７６、約２０～約７６、約２２～約７６、約２４～約７６、約２６～約７６、約２８～約７６、約３０～約７６、約６～約７２、約８～約７２、約１０～約７２、約１２～約７２、約１４～約７２、約１６～約７２、約１８～約７２、約２０～約７２、約２２～約７２、約２４～約７２、約２６～約７２、約２８～約７２、約３０～約７２、約６～約６８、約８～約６８、約１０～約６８、約１２～約６８、約１４～約６８、約１６～約６８、約１８～約６８、約２０～約６８、約２２～約６８、約２４～約６８、約２６～約６８、約２８～約６８、約３０～約６８、約６～約６４、約８～約６４、約１０～約６４、約１２～約６４、約１４～約６４、約１６～約６４、約１８～約６４、約２０～約６４、約２２～約６４、約２４～約６４、約２６～約６４、約２８～約６４、約３０～約６４、約６～約６０、約８～約６０、約１０～約６０、約１２～約５６、約１４～約５６、約１６～約５６、約１８～約５６、約２０～約５６、約２２～約５６、約２４～約５６、約２６～約５６、約２８～約５６、約３０～約５６、約６～約５２、約８～約５２、約１０～約５２、約１２～約５２、約１４～約５２、約１６～約５２、約１８～約５２、約２０～約５２、約２２～約５２、約２４～約５２、約２６～約５２、約２８～約５２、約３０～約５２、約６～約４８、約８～約４８、約１０～約４８、約１２～約４８、約１４～約４８、約１６～約４８、約１８～約４８、約２０～約４８、約２２～約４８、約２４～約４８、約２６～約４８、約２８～約４８、約３０～約４８、約６～約４４、約８～約４４、約１０～約４４、約１２～約４４、約１４～約４４、約１６～約４４、約１８～約４４、約２０～約４４、約２２～約４４、約２４～約４４、約２６～約４４、約２８～約４４、約３０～約４４、約６～約４０、約８～約４０、約１０～約４０、約１２～約４０、約１４～約４０、約１６～約４０、約１８～約４０、約２０～約４０、約２２～約４０、約２４～約４０、約２６～約４０、約２８～約４０、約３０～約４０、約６～約３６、約８～約３６、約１０～約３６、約１２～約３６、約１４～約３６、約１６～約３６、約１８～約３６、約２０～約３６、約２２～約３６、約２４～約３６、約２６～約３６、約２８～約３６、約３０～約３６、約６～約３２、約８～約３２、約１０～約３２、約１２～約３２、約１４～約３２、約１６～約３２、約１８～約３２、約２０～約３２、約２２～約３２、約２４～約３２、約２６～約３２、２８～約３２、または約３０～約３２のＥＣＮを有する。
ＩＩ．Ｇ．３．ａ．コレステロール及び他のステロール
一部の態様では、足場部分は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、または親油性特性を有するそれらの類似体を含む。一部の態様では、足場部分は、植物ステロール、ミコステロール、または動物ステロール等のステロールを含む。例示的な動物ステロールには、コレステロール及び２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールが含まれ、例示的な植物ステロールには、エルゴステロール（ミコステロール）、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが含まれる。一部の態様では、ステロールは、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、またはスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化されたもの（ステロールエステル）、アルキル化されたもの（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化されたもの（硫酸ステロール）、またはそれ自体がアシル化され得る（アシル化ステロールグリコシド）グリコシド部分に連結されたもの（ステリルグリコシド）のいずれかとして見出され得る。
一部の態様では、足場部分は、ステロイドを含む。一部の態様では、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン、プロゲステロン、またはコルチゾールから選択される。
例えば、ステロールは、ステロールの利用可能な－ＯＨ基にて、直接的にまたはリンカーの組み合わせを介して生物学的に活性な分子にコンジュゲートされ得る。例示的なステロールは、下記に示される一般骨格を有する。
Figure 2022525924000082
さらなる例として、エルゴステロールは、下記の構造を有する。
Figure 2022525924000083
コレステロールは、下記の構造を有する。
Figure 2022525924000084
したがって、一部の態様では、ステロールまたはステロイドの遊離－ＯＨ基を使用して、直接的にまたはリンカーの組み合わせを介して生物学的に活性な分子、例えば、ＡＳＯをステロール（例えば、コレステロール）またはステロイドにコンジュゲートする。
ＩＩ．Ｇ．３．ｂ．脂肪酸
一部の態様では、足場部分は、脂肪酸を含む。一部の態様では、脂肪酸は、短鎖、中鎖、または長鎖脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。一部の態様では、脂肪酸は、ω－３（オメガ－３）またはω－６（オメガ－６）脂肪酸等の多価不飽和脂肪酸である。
一部の態様では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ６０鎖を有する。一部の態様では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ２８鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ４０鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ２～Ｃ１２またはＣ４～Ｃ１２鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ４～Ｃ４０鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ４～Ｃ４０、Ｃ２～Ｃ３８、Ｃ２～Ｃ３６、Ｃ２～Ｃ３４、Ｃ２～Ｃ３２、Ｃ２～Ｃ３０、Ｃ４～Ｃ３０、Ｃ２～Ｃ２８、Ｃ４～Ｃ２８、Ｃ２～Ｃ２６、Ｃ４～Ｃ２６、Ｃ２～Ｃ２４、Ｃ４～Ｃ２４、Ｃ６～Ｃ２４、Ｃ８～Ｃ２４、Ｃ１０～Ｃ２４、Ｃ２～Ｃ２２、Ｃ４～Ｃ２２、Ｃ６～Ｃ２２、Ｃ８～Ｃ２２、Ｃ１０～Ｃ２２、Ｃ２～Ｃ２０、Ｃ４～Ｃ２０、Ｃ６～Ｃ２０、Ｃ８～Ｃ２０、Ｃ１０～Ｃ２０、Ｃ２～Ｃ１８、Ｃ４～Ｃ１８、Ｃ６～Ｃ１８、Ｃ８～Ｃ１８、Ｃ１０～Ｃ１８、Ｃ１２～Ｃ１８、Ｃ１４～Ｃ１８、Ｃ１６～Ｃ１８、Ｃ２～Ｃ１６、Ｃ４～Ｃ１６、Ｃ６～Ｃ１６、Ｃ８～Ｃ１６、Ｃ１０～Ｃ１６、Ｃ１２～Ｃ１６、Ｃ１４～Ｃ１６、Ｃ２～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ６～Ｃ１５、Ｃ８～Ｃ１５、Ｃ９～Ｃ１５、Ｃ１０～Ｃ１５、Ｃ１１～Ｃ１５、Ｃ１２～Ｃ１５、Ｃ１３～Ｃ１５、Ｃ２～Ｃ１４、Ｃ４～Ｃ１４、Ｃ６～Ｃ１４、Ｃ８～Ｃ１４、Ｃ９～Ｃ１４、Ｃ１０～Ｃ１４、Ｃ１１～Ｃ１４、Ｃ１２～Ｃ１４、Ｃ２～Ｃ１３、Ｃ４～Ｃ１３、Ｃ６～Ｃ１３、Ｃ７～Ｃ１３、Ｃ８～Ｃ１３、Ｃ９～Ｃ１３、Ｃ１０～Ｃ１３、Ｃ１０～Ｃ１３、Ｃ１１～Ｃ１３、Ｃ２～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ６～Ｃ１２、Ｃ７～Ｃ１２、Ｃ８～Ｃ１２、Ｃ９～Ｃ１２、Ｃ１０～Ｃ１２、Ｃ２～Ｃ１１、Ｃ４～Ｃ１１、Ｃ６～Ｃ１１、Ｃ７～Ｃ１１、Ｃ８～Ｃ１１、Ｃ９～Ｃ１１、Ｃ２～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ２～Ｃ９、Ｃ４～Ｃ９、Ｃ２～Ｃ８、Ｃ２～Ｃ７、Ｃ４～Ｃ７、Ｃ２～Ｃ６、またはＣ４～Ｃ６鎖を有する。一部の態様では、脂肪酸は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２、Ｃ４３、Ｃ４４、Ｃ４５、Ｃ４６、Ｃ４７、Ｃ４８、Ｃ４９、Ｃ５０、Ｃ５１、Ｃ５２、Ｃ５３、Ｃ５４、Ｃ５５、Ｃ５６、Ｃ５７、Ｃ５８、Ｃ５９、またはＣ６０鎖を有する。
一部の態様では、足場部分は、２つの脂肪酸を含み、これらの各々は独立して、上述の範囲または数の炭素原子のうちのいずれか１つを有する鎖を有する脂肪酸から選択される。一部の態様では、脂肪酸のうちの１つは独立して、Ｃ６～Ｃ２１鎖を有する脂肪酸であり、１つは独立して、Ｃ１２～Ｃ３６鎖を有する脂肪酸である。一部の態様では、各脂肪酸は独立して、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、または約１８個の炭素原子の鎖を有する。
好適な脂肪酸には、飽和直鎖脂肪酸、飽和分岐状脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、及びポリカルボン酸が含まれる。一部の態様では、かかる脂肪酸は、最大約３２個の炭素原子を有する。
有用な飽和直鎖脂肪酸の例としては、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸、及びｎ－ドトリアコンタン酸等の偶数の炭素原子を有するもの、ならびにプロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン（ｈｅｎｄｅｃａｎｏｉｃ）酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘンエイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、及びヘプタコサン酸等の奇数の炭素原子を有するものが挙げられる。
好適な飽和分岐状脂肪酸の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルオクタデカン酸、イソアラキン酸、１９－メチル－エイコサン酸、α－エチル－ヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、及びファインオキソコール１８００酸（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．の製品）が挙げられる。好適な飽和奇数炭素分岐状脂肪酸には、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチル－オクタデカン酸、１８－メチル－エイコサン酸、２０－メチル－ドコサン酸、２２－メチル－テトラコサン酸、２４－メチル－ヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸等の、イソブチル基で終端するアンテイソ脂肪酸が含まれる。
好適な不飽和脂肪酸の例としては、４－デセン酸、カプロレイン（ｃａｐｒｏｌｅｉｃ）酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン（ｌａｕｒｏｌｅｉｃ）酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、シス－１１－エイコセン酸、鯨油酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。
好適なヒドロキシ脂肪酸の例としては、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－トランス－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン（ｋａｍｏｌｅｎｉｃ）酸、イプロリン酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸等が挙げられる。
好適なポリカルボン酸の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸等が挙げられる。
一部の態様では、各脂肪酸は独立して、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ）酸、ラッセル（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ）酸、プシリン（ｐｓｙｌｌｉｃ）酸、ゲジン（ｇｅｄｄｉｃ）酸、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ）酸、ヘプタトリアコンタン酸、またはオクタトリアコンタン酸から選択される。
一部の態様では、各脂肪酸は独立して、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ－リノール酸、ジホモ－ガンマ－リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ゴンドイン酸、エルカ（ｅｕｒｃｉｃ）酸、ネルボン酸、ミード酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド（ｏｚｕｂｏｎｄｏ）酸、イワシ酸、ニシン酸、ドコサヘキサエン酸、またはテトラコサノールペンタエン酸、または別の一価不飽和もしくは多価不飽和脂肪酸から選択される。
一部の態様では、脂肪酸の一方または両方が、必須脂肪酸である。ある特定の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮して、かかる脂肪酸を治療剤に含めることによって開示される治療剤負荷エキソソームの治療有益性を増加させることができる。一部の態様では、必須脂肪酸は、リノレン酸、ガンマ－リノレン酸、ジホモ－ガンマ－リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ドコサペンタエンｎ－６酸、アルファ－リノレン酸、ステアリドン酸、２０：４ｎ－３酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエンｎ－３酸、またはドコサヘキサエン酸からなる群から選択されるｎ－６またはｎ－３必須脂肪酸である。
一部の態様では、各脂肪酸は独立して、全シス型－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。他の態様では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。脂肪酸の他の例としては、全シス型－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸（ＡＬＡまたは全シス型－９，１２，１５－オクタデカトリエン酸）、ステアリドン酸（ＳＴＤまたは全シス型－６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥまたは全シス型－１１，１４，１７－エイコサトリエン酸）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡまたは全シス型－８，１１，１４，１７－エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸または全シス型－７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたは全シス型－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸）、テトラコサペンタエン酸（全シス型－９，１２，１５，１８，２１－ドコサヘキサエン酸）、またはテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸または全シス型－６，９，１２，１５，１８，２１－テトラコセン酸）が挙げられる。一部の態様では、脂肪酸は、リポ酸等の中鎖脂肪酸である。
脂肪酸鎖は、それらの鎖の長さが大幅に異なり、鎖長に従って、例えば、短鎖から超長鎖として分類され得る。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、約５個以下の炭素の鎖を有する脂肪酸（例えば、酪酸）である。一部の態様では、脂肪酸は、ＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）には、中鎖トリグリセリドを形成することができる、約６～１２個の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。一部の態様では、脂肪酸は、ＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）には、１３～２１個の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。一部の態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）には、約２２～約６０個、約２２～約５０個、または約２２～約４０個の炭素等の、２２個以上の炭素の鎖を有する脂肪酸が含まれる。一部の態様では、脂肪酸は、ＶＬＣＦＡである。
ＩＩ．Ｇ．３．ｃ．リン脂質
一部の態様では、足場部分は、リン脂質を含む。リン脂質は、全ての細胞膜の主要な構成成分である脂質のクラスである。それらは、それらの両親媒性の特性の故に脂質二重層を形成することができる。リン脂質分子の構造は一般に、２つの疎水性の脂肪酸「尾部」及びリン酸基からなる親水性「頭部」からなる。例えば、リン脂質は、以下の式に従う脂質であり得、
Figure 2022525924000085
 式中、Ｒｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ１及びＲ２は、不飽和を含むまたは含まない脂肪酸部分を表し、これらは同じであることも、または異なることもできる。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、脂質二重層、例えば、エキソソーム膜の脂質二重層への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜の１つまたは複数の負に帯電したリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つまたは複数の要素が膜に結合するかまたは膜を通過することを可能にし得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
本開示で足場部分として使用するリン脂質は、天然または非天然のリン脂質であり得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含めた、非天然のリン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキンで官能基化するか、またはそれに架橋結合させることができる（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合と置き換えられているアルケニル基）。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露された際に銅触媒による環化付加を経ることができる。
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸等のグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される足場部分において使用することができるリン脂質の例としては、
・ホスファチジルエタノールアミン：例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルエタノールアミン、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジエルコイルホスファチジルエタノールアミン；
・ホスファチジルグリセロール：例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルグリセロール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルグリセロール、及びジエルコイルホスファチジルグリセロール；
・ホスファチジルセリン：例えば、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルセリン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルセリン、及びジエルコイルホスファチジルセリン等；
・ホスファチジン酸：例えば、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジン酸、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジン酸、及びジエルコイルホスファチジン酸；ならびに
・ホスファチジルイノシトール：例えば、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルイノシトール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルイノシトール、及びジエルコイルホスファチジルイノシトールが挙げられる。
リン脂質は、対称型または非対称型のものであり得る。本明細書で使用されるとき、「対称型リン脂質」という用語は、可変の脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が同等数の炭素原子を含む、一致した脂肪酸部分及びスフィンゴ脂質を有するグリセロリン脂質を含む。本明細書で使用されるとき、「非対称型リン脂質」という用語は、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子及び／または不飽和（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）を有するグリセロリン脂質、ならびに可変の脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が非類似の数の炭素原子を含む（例えば、可変の脂肪酸部分が、炭化水素鎖よりも少なくとも２個多い炭素原子、または炭化水素鎖よりも少なくとも２個少ない炭素原子を含む）、スフィンゴ脂質を含む。
一部の態様では、足場部分は、少なくとも１つの対称型リン脂質を含む。対称型リン脂質は、下記からなる非限定的な群から選択され得る。
１，２－ジプロピオニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０３：０ ＰＣ）、
１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０４：０ ＰＣ）、
１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０５：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ ＰＣ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ ＰＣ）、
１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ ＰＣ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ ＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ ＰＣ、ＤＵＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ ＰＣ、ＤＭＰＣ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ ＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ ＰＣ、ＤＰＰＣ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（４ＭＥ １６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ ＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）、
１，２－ジノナデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ ＰＣ）、
１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘンアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２１：０ ＰＣ）、
１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２３：０ ＰＣ）、
１，２－ジリグノセロイル（ｄｉｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－シス）ＰＣ）、
１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－シス）ＰＣ）、
１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－シス）ＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－シス）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（シス）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（シス）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、
１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（シス）ＰＣ、ＤＡＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（シス）ＰＣ、ＤＨＡＰＣ）、
１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０６：０ ＰＥ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０８：０ ＰＥ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１０：０ ＰＥ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１２：０ ＰＥ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ ＰＥ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１５：０ ＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ ＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１７：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：１ ＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－シス）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－トランス）ＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：２ ＰＥ、ＤＬＰＥ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：３ ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２０：４ ＰＥ、ＤＡＰＥ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２２：６ ＰＥ、ＤＨＡＰＥ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びそれらの任意の組み合わせ。
一部の態様では、足場部分は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ，ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせからなる非限定的な群から選択される少なくとも１つの対称型リン脂質を含む。
一部の態様では、足場部分は、少なくとも１つの非対称型リン脂質を含む。非対称型リン脂質は、下記からなる非限定的な群から選択され得る。
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０～１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０～１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～０２：０ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０～２０：４ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０～２２：６ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～１８：２ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～２０：４ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０～２２：６ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１～１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０～１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０～１８：２ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０～２０：４ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０～２２：６ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０～１８：１ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０～１８：２ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０～２０：４ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０～２２：６ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせ。
より著しいヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み効率、及びより著しいＲＮＡ干渉効果を提供するために、ホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを足場部分として使用することができる。
脂質（例えば、リン脂質）及びリンカーまたは生物学的に活性な分子、例えば、ＡＳＯの結合部位は、脂質及びリンカーまたは生物学的に活性な分子の種類に従って好適に選択され得る。脂質の疎水性基以外の任意の位置が、化学結合によってリンカーまたは生物学的に活性な分子に連結され得る。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用する場合、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とリンカーまたは生物学的に活性な分子との間でアミド結合等を形成させることによって結合を作り出すことができる。
ホスファチジルグリセロールを使用する場合、グリセロール残基のヒドロキシル基とリンカーまたは生物学的に活性な分子との間でエステル結合、エーテル結合等を形成させることによって結合を作り出すことができる。
ホスファチジルセリンを使用する場合、セリン残基のアミノ基またはカルボキシル基とリンカーまたは生物学的に活性な分子との間でアミド結合またはエステル結合等を形成させることによって結合を作り出すことができる。
ホスファチジン酸を使用する場合、リン酸残基とリンカーまたは生物学的に活性な分子との間でホスホエステル結合等を形成させることによって結合を作り出すことができる。
ホスファチジルイノシトールを使用する場合、イノシトール残基のヒドロキシル基とリンカーまたは生物学的に活性な分子との間でエステル結合、エーテル結合等を形成させることによって結合を作り出すことができる。
ＩＩ．Ｇ．３．ｄ．リゾ脂質（例えば、リゾリン脂質）
一部の態様では、足場部分は、リゾ脂質、例えば、リゾリン脂質を含む。リゾ脂質は、一方または両方の脂肪族アシル鎖が一般に加水分解によって除去された、脂質の誘導体である。リゾリン脂質は、一方または両方の脂肪族アシル鎖が加水分解によって除去された、リン脂質の誘導体である。
一部の態様では、足場部分は、上記に開示されるリン脂質のうちのいずれかにおいて、一方または両方のアシル鎖が加水分解を介して除去され、したがって、結果として得られるリゾリン脂質が１つの脂肪酸アシル鎖を含むかまたはそれを何ら含まないものを含む。
一部の態様では、足場部分は、リゾグリセロリン脂質、リゾスフィンゴ糖脂質（ｌｙｓｏｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｏｐｉｄ）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、またはリゾホスファチジルセリンを含む。
一部の態様では、足場部分は、下記からなる非限定的な群から選択されるリゾ脂質を含む。
１－ヘキサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０リゾＰＣ）、
１－ヘプタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０リゾＰＣ）、
１－オクタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０リゾＰＣ）、
１－ノナノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０リゾＰＣ）、
１－デカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０リゾＰＣ）、
１－ウンデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０リゾＰＣ）、
１－ラウロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０リゾＰＣ）、
１－トリデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０リゾＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０リゾＰＣ）、
１－ペンタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０リゾＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０リゾＰＣ）、
１－ヘプタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０リゾＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０リゾＰＣ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１リゾＰＣ）、
１－ノナデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０リゾＰＣ）、
１－アラキドイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０リゾＰＣ）、
１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０リゾＰＣ）、
１－リグノセロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０リゾＰＣ）、
１－ヘキサコサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２６：０リゾＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０リゾＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０リゾＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０リゾＰＥ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１リゾＰＥ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせ。
ＩＩ．Ｇ．３．ｅ．ビタミン
一部の態様では、足場部分は、親油性ビタミン、例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、またはビタミンＫを含む。
一部の態様では、足場部分は、ビタミンＡを含む。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及びいくつかのプロビタミンＡカロテノイド（とりわけベータ－カロテン）を含む、不飽和の栄養学的有機化合物の群である。一部の態様では、足場部分は、レチノールを含む。一部の態様では、足場部分は、レチノイドを含む。レチノイドは、ビタミンＡのビタマーであるかまたはそれに化学的に関係する化学化合物のクラスである。一部の態様では、足場部分は、第１世代レチノイド（例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレチノイン（ｉｓｏｔｒｅａｔｉｎｏｉｎ）、またはアリトレチノイン）、第２世代レチノイド（例えば、エトレチネートまたはアシトレチン）、第３世代レチノイド（例えば、アダパレン、ベキサロテン、またはタザロテン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
Figure 2022525924000086
一部の態様では、足場部分は、ビタミンＥを含む。トコフェロールは、メチル化フェノールのクラスであり、これらのうちの多くがビタミンＥ活性を有する。故に、一部の態様では、足場部分は、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、またはそれらの組み合わせを含む。
Figure 2022525924000087
トコトリエノールもまた、ビタミンＥ活性を有する。トコトリエノールとトコフェロールとの間の決定的な化学構造の相違は、トコフェロールの飽和側鎖と対比して、トコトリエノールが３つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和イソプレノイド側鎖を有するということである。一部の態様では、足場部分は、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、ガンマ－トコトリエノール、デルタ－トコトリエノール、またはそれらの組み合わせを含む。トコトリエノールは、下記式によって表すことができ、
Figure 2022525924000088
 アルファ（α）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ、
ベータ（β）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅ、
ガンマ（γ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ、
デルタ（δ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅである。
一部の態様では、足場部分は、ビタミンＫを含む。化学的に、ビタミンＫファミリーは、２－メチル－１．４－ナフトキノン（３－）誘導体を含む。ビタミンＫは、ビタミンＫ１及びビタミンＫ２の２つの天然ビタマーを含む。ビタミンＫ１（別名、フィトナジオン、フィロキノン、または（Ｅ）－フィトナジオン）の構造は、フィチル基の存在を特徴とする。ビタミンＫ２（メナキノン）の構造は、６～１３個のイソプレニル単位を含有し得るポリイソプレニル側鎖が分子に存在することを特徴とする。故に、ビタミンＫ２は、イソプレノイドの原子団からなる様々な長さの炭素側鎖を有する、いくつかの関連する化学的サブタイプからなる。ＭＫ－４は、最も一般的な形態のビタミンＫ２である。ＭＫ－７、ＭＫ－８、及びＭＫ－９等の長鎖形態は、発酵食品において優勢的である。ＭＫ－１０～ＭＫ－１３等のより長鎖の形態のビタミンＫ２は、細菌によって合成されるが、それらは吸収が良好でなく、生物学的機能をほとんど有しない。天然形態のビタミンＫに加えて、ビタミンＫ３（メナジオン；２－メチルナフタレン－１，４－ジオン）、ビタミンＫ４、及びビタミンＫ５等のいくつかの合成形態のビタミンＫが存在する。
したがって、一部の態様では、足場部分は、ビタミンＫ１、Ｋ２（例えば、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６、ＭＫ－７、ＭＫ－８、ＭＫ－９、ＭＫ－１０、ＭＫ－１１、ＭＫ－１２、またはＭＫ－１３）、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
Figure 2022525924000089
ＩＩ．Ｇ．５．化学的に誘導された二量体
一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、化学的に誘導された二量体の結合パートナーに連結されている。一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、化学的に誘導された二量体の結合パートナーに連結されており、生物学的に活性な分子は、対応する結合パートナーに連結されている。これらの態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）及び生物学的に活性な分子は、結合パートナーの二量体化を誘導する化学物質の存在下で互いに会合する。一部の態様では、結合パートナーは、足場部分のＮ末端に連結されている。一部の態様では、結合パートナーは、足場部分（例えば、足場タンパク質）のＣ末端に連結されている。一部の態様では、結合パートナーは、足場部分（例えば、足場タンパク質）の内腔ドメインに連結されている。
一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、親和性薬剤に連結されている。一部の態様では、親和性薬剤は、足場部分（例えば、足場タンパク質）のＮ末端に連結されている。一部の態様では、親和性薬剤は、足場部分（例えば、足場タンパク質）のＣ末端に連結されている。一部の態様では、親和性薬剤は、足場部分（例えば、足場タンパク質）の内腔ドメインに連結されている。一部の態様では、親和性薬剤は、生物学的に活性な分子に結合することができるポリペプチドを含む。一部の態様では、親和性薬剤は、受容体を含む。一部の態様では、親和性薬剤は、本明細書に開示されるような抗体または抗原結合ドメインを含む。一部の態様では、親和性薬剤は、１つまたは複数の生物学的に活性な分子に結合する。
一部の態様では、親和性薬剤と生物学的に活性な分子との間の相互作用は、一過性である。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、ある特定の条件下で親和性薬剤から解離する。ある特定の態様では、生物学的に活性な分子に対する親和性薬剤の親和性は、ｐＨに依存する。一部の態様では、生物学的に活性な分子は、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、または少なくとも約１２のｐＨで親和性薬剤から解離する。一部の態様では、生物学的に活性な分子に対する親和性薬剤の親和性は、生物学的に活性な分子及び親和性薬剤を含む溶液中のカルシウム、マグネシウム、硫酸、リン酸、またはそれらの任意の組み合わせの濃度に依存する。一部の態様では、生物学的に活性な分子に対する親和性薬剤の親和性は、生物学的に活性な分子及び親和性薬剤を含む溶液中の塩濃度及び／またはイオン強度に依存する。一部の態様では、生物学的に活性な分子及び親和性薬剤は、還元条件下で解離可能である。
一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、生物学的に活性な分子に結合し得るポリペプチドに連結されている。一部の態様では、結合ポリペプチドは、足場部分（例えば、足場タンパク質）のＮ末端に連結されている。一部の態様では、結合ポリペプチドは、足場部分（例えば、足場タンパク質）のＣ末端に連結されている。一部の態様では、結合ポリペプチドは、足場部分（例えば、足場タンパク質）の内腔ドメインに連結されている。
一部の態様では、結合ポリペプチドは、抗原結合ドメインを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒト、マウス－霊長類、または霊長類－ヒトモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体、サメＩｇＮＡＲ、または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、サメＩｇＮＡＲまたはその抗原結合断片を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の態様では、抗原結合ドメインは、一本鎖抗体を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ’を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ１）２を含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ｄＡｂを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆａｂを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、Ｆｄ断片を含む。
一部の態様では、抗原結合ドメインは、ダイアボディを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、ミニボディを含む。一部の態様では、抗原結合ドメインは、抗体関連ポリペプチドを含む。特定の態様では、抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。
一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、Ｆｃ受容体に連結されており、生物学的に活性な分子は、Ｆｃに連結されている。ある特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲ１）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＩＩＢ、ＦｃγＩＩＩＡ、及びＦｃγＩＩＩＢから選択されるＦｃガンマ受容体であり、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。ある特定の態様では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲ１であり、Ｆｃは、ＩｇＧのＦｃである。一部の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃアルファ受容体Ｉ（ＦｃαＲ１）であり、該Ｆｃは、ＩｇＡのＦｃである。一部の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃイプシロン受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）及びＦｃεＲＩＩから選択されるＦｃイプシロン受容体であり、該Ｆｃは、ＩｇＥのＦｃである。
一部の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、ナノボディに連結されており、生物学的に活性な分子は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）に連結されている。ある特定の態様では、ナノボディは、Ｆｃに特異的に結合する。
ＩＩＩ．作製方法
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的もしくは酵素的断片化、上述したものの組み合わせによって、または任意の他の方法によって生産することができる。一態様では、本開示は、生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）にコンジュゲートする方法を提供する。この方法は、上述したようなマレイミド部分を介して生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結することを含む。
アミン反応性化合物の他に、スルフヒドリル（－ＳＨ）と結合を形成する化学基を有する化合物は、タンパク質及び他のバイオコンジュゲート技法に最も一般的な架橋剤及び修飾試薬である。チオールとも呼ばれるスルフヒドリルは、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）アミノ酸の側鎖のタンパク質中に存在する。システインスルフヒドリル基の対は、多くの場合、三次または四次タンパク質の天然構造の基礎として、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間でジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）によって連結されている。典型的には、［ジスルフィド結合における硫黄原子ではなく］遊離または還元型スルフヒドリル基（－ＳＨ）のみが、チオール反応性化合物との反応に利用可能である。
スルフヒドリル基は、タンパク質のコンジュゲーション及び標識のために有用な標的である。第１に、スルフヒドリルは、ほとんどのタンパク質に存在するが、第一級アミンほど数多くは存在しないため、スルフヒドリル基を介した架橋結合は、より選択的で精度が高い。第２に、タンパク質中のスルフヒドリル基は、多くの場合、ジスルフィド結合に関与するため、これらの部位での架橋結合は典型的には、タンパク質の基礎構造を大幅に変性させたり、結合部位を遮断したりすることがない。第３に、利用可能な（すなわち、遊離）スルフヒドリル基の数を容易に制御または変更することができる。スルフヒドリル基は、天然ジスルフィド結合の還元によって生成することができるか、または２－イミノチオラン（トラウト試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、もしくはＳＡＴ（ＰＥＧ）等のスルフヒドリル付加試薬を使用した第一級アミンとの反応を介して分子に導入することができる。最後に、スルフヒドリル反応性基をアミン反応性基と組み合わせて、ヘテロ二官能性架橋剤を作製することにより、架橋結合手順に対するより高い柔軟性及び制御がもたらされる。例えば、マレイミド基及びＮＨＳエステルを含有する３－マレイミド－プロピオン酸ＮＨＳエステルを使用することで、ＮＨＳエステルを使用して、タンパク質の第一級アミン（－ＮＨ２）、アミン修飾オリゴヌクレオチド、及び他のアミン含有分子を標識することができる。マレイミド基は、チオール基と反応して共有結合を形成し、これにより生体分子とチオールとの接続を可能にする。
マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５～７．５であるときスルフヒドリル基と特異的に反応し、この結果、可逆的でない（すなわち、結合を還元剤で切断することができない）安定なチオエーテル結合が形成される。よりアルカリ性の条件下では（ｐＨ＞８．５）、反応は第一級アミンに有利となり、また、マレイミド基の、非反応性マレアミド酸への加水分解の速度が増加する。マレイミドは、チロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）等のチオール含有化合物は、それらがカップリング部位を競合することになるため、マレイミドとともに使用される反応緩衝液から排除されなければならない。例えば、コンジュゲーションに利用可能なスルフヒドリル基を作製するために、ＤＴＴを使用して、タンパク質中のジスルフィドを還元した場合、マレイミド反応を開始する前に脱塩カラムを使用してＤＴＴを徹底的に除去する必要があろう。興味深いことに、ジスルフィド還元剤ＴＣＥＰは、チオールを含有せず、マレイミド試薬を伴う反応前に除去する必要がない。
過剰なマレイミドは、反応の終わりに遊離チオールを添加することによって反応停止処理することができる。ＥＤＴＡをカップリング緩衝液に含めて、さもなければスルフヒドリル（非反応性）の酸化を促進する浮遊二価金属をキレートすることができる。
一態様では、連結することは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を還元剤で処理することを含む。好適な還元剤には、例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。チオール化剤は、例えば、トラウト試薬（２－イミノチオラン）を含み得る。
還元剤での処理後、連結反応は、還元されたＥＶ（例えば、エキソソーム）をマレイミド部分に接触させることをさらに含む。一態様では、マレイミド部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）に連結する前に生物学的に活性な分子に連結されている。一部の態様では、マレイミド部分は、マレイミド部分を生物学的に活性な分子につなげるためのリンカーにさらに結合している。したがって、一部の態様では、マレイミド部分と生物学的に活性な分子との間に１つまたは複数のリンカーまたはスペーサーが介在する。
ＩＶ．治療的使用
本開示は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、疾患または病態の処置を必要とする対象において疾患または病態を処置する方法を提供する。本開示はまた、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、疾患または病態の症状の予防または改善を必要とする対象において疾患または病態の症状を予防または改善する方法を提供する。また、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む組成物を対象に投与することを含む、疾患または病態の診断を必要とする対象において疾患または病態を診断するための方法も提供される。
一態様では、疾患または障害は、がん、炎症性疾患、神経変性障害、中枢神経疾患、または代謝疾患である。
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）を対象に投与することを含む、疾患または障害の予防及び／または処置を必要とする対象において疾患または障害を予防及び／または処置する方法を提供する。一部の態様では、本方法で処置され得る疾患または障害は、がん、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、感染性疾患、または線維性疾患を含む。一部の態様では、処置は、予防的である。他の態様では、本開示のためのＥＶ（例えば、エキソソーム）は、免疫応答を誘導するために使用される。他の態様では、本開示のためのＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象を免疫化するために使用される。
一部の態様では、疾患または障害は、がんである。がんを有する対象に投与されるとき、ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、免疫応答を上方制御し、対象の免疫系の腫瘍標的化を強化することができる。一部の態様では、処置されているがんは、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の腫瘍微小環境への浸潤、またはいわゆる「熱い腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）」もしくは「炎症性腫瘍」を特徴とする。一部の態様では、処置されているがんは、腫瘍微小環境への低レベルもしくは検出不能なレベルの白血球浸潤、またはいわゆる「冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）」もしくは「非炎症性腫瘍」を特徴とする。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」に変換するのに十分な量及び時間投与され、すなわち、該投与は、白血球（Ｔ細胞等）の腫瘍微小環境への浸潤をもたらす。ある特定の態様では、がんは、膀胱癌、子宮頸癌、腎細胞癌、精巣癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、及び卵巣、リンパ腫、肝臓癌、膠芽腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓癌、またはそれらの組み合わせを含む。他の「遠位腫瘍」または「遠隔腫瘍」という用語は、元の（または原発）腫瘍から遠隔臓器または遠隔組織、例えば、リンパ節に広がった腫瘍を指す。一部の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、転移性で広がった後の腫瘍を処置する。
一部の態様では、疾患または障害は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。一部の態様では、本開示で処置され得る疾患または障害は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患の非限定的な例としては、多発性硬化症、末梢神経炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、脱毛症、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、デビック病（視神経脊髄炎）、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、各種血管炎、強皮症、糖尿病、動脈炎、白斑症、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、乾癬、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
一部の態様では、疾患または障害は、感染性疾患である。ある特定の態様では、疾患または障害は、発がんウイルスである。一部の態様では、本開示で処置され得る感染性疾患には、ヒトガンマヘルペスウイルス４（エプスタイン・バールウイルス）、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、コロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ ＣｏＶ）、フィロウイルス（例えば、マールブルグ及びエボラ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ種（例えば、ｖｉｖａｘ及びｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、チクングニアウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトヘルペスウイルス８、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ２）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｐｒｏｔｅｕｓ属菌、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ属菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属菌、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の循環系に静脈内投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の静脈中に投与される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の循環系に動脈内投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の動脈中に投与される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、髄腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、それが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の１つまたは複数の腫瘍中に腫瘍内投与される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、鼻腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、局所投与または全身投与のいずれかの形態で、鼻を通して吹送され得る。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、点鼻薬として投与される。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、腹腔内投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、好適な液体に注入され、対象の腹膜中に投与される。一部の態様では、腹腔内投与は、リンパ管へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、１つまたは複数のリンパ節へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つまたは複数へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の分布をもたらす。一部の態様では、腹腔内投与は、膵臓へのＥＶ（例えば、エキソソーム）の分布をもたらす。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、眼周囲投与によって対象に投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、眼周囲組織中に注射される。眼周囲薬物投与には、結膜下、前テノン嚢下、後テノン嚢下、及び眼球後投与の経路が含まれる。
一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、眼内投与される。したがって、本開示は、ペイロード（例えば、ＡＶＶ）を含む本開示の細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム）を含む、有効量の組成物を対象に投与することを含み、該組成物の投与が眼内である、眼疾患または眼障害の処置を必要とする対象において眼疾患または眼障害を処置する方法を提供する。
一部の態様では、眼内投与は、硝子体内投与、前房内投与、結膜下投与、網膜下投与、強膜下投与、脈絡膜内投与、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の態様では、眼内投与は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の注射を含む。一部の態様では、眼内投与は、硝子体内注射である。
Ｖ．薬学的組成物及び投与方法
本開示はまた、対象への投与に好適な、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は一般に、対象への投与に好適な形態で、マレイミド部分を介して複数のＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された生物学的に活性な分子を含む、複数のＥＶ（例えば、エキソソーム）と、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与されようとしている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、複数のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照されたい。
薬学的組成物は一般に、滅菌され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。一部の態様では、薬学的組成物は、例えば、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で連結された低分子等の、１つまたは複数の化学化合物を含む。
一部の態様では、薬学的組成物は、１つまたは複数の治療剤と、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）とを含む。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、薬学的に許容される担体中で１つまたは複数の追加の治療剤と共投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
本明細書では、対象への投与に好適な形態で、所望の程度の純度を有する本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物が提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与されようとしている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定することができる。したがって、複数の細胞外小胞を含む薬学的組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。薬学的組成物は一般に、滅菌され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
一部の態様では、薬学的組成物は、１つまたは複数の治療剤と、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）とを含む。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、薬学的に許容される担体中で１つまたは複数の追加の治療剤と共投与される。一部の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与前に投与される。他の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤の投与後に投与される。さらなる態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエント（例えば、動物またはヒト）にとって無毒であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類（例えば、スクロースまたはトレハロース）、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で周知である。いずれかの従来の媒体または化合物が、本明細書に記載の細胞外小胞と不適合性でない限り、組成物中でのそれらの使用が企図される。補助的な治療剤もまた、組成物に組み込まれ得る。典型的には、薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化される。本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路によって、または吸入剤として投与することができる。ある特定の態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、例えば、注射によって、静脈内投与される。ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、任意選択で、ＥＶ（例えば、エキソソーム）が意図される疾患、障害、または病態を処置する上で少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、水、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌化合物、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化合物、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧の調整のための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整され得る。調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアルに封入され得る。
注射用の使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は一般に、滅菌されており、容易なシリンジ注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。所望であれば、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、及び塩化ナトリウムが、組成物に添加され得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
滅菌注射液は、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を、所望に応じて、有効量で、かつ本明細書に列挙される成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含む適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。一般に、分散液は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を、基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加的な所望の成分との粉末がもたらされる。ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の持続放出またはパルス放出を可能にするような様態で製剤化され得る、デポー注射または埋込調製物の形態で投与することができる。
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む組成物の全身投与はまた、経粘膜手段によることができる。経粘膜投与の場合、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤中で使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に既知であり、例えば、経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、点鼻薬の使用により達成され得る。
ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、当該薬学的組成物が有益であろう対象に静脈内投与される。ある特定の他の態様では、組成物は、例えば、リンパ内注射によってリンパ系に、または結節内注射によって（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、または筋肉内注射によって、皮下注射によって、腫瘍内注射によって、胸腺もしくは肝臓への直接注射によって投与される。
ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の態様では、薬学的組成物は、投与後にデポーを形成することができる製剤として投与される。ある特定の好ましい態様では、デポーは、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を循環中に緩徐に放出するか、またはデポー形態のままである。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、夾雑物を含まないように高度に精製され、生体適合性かつ無毒であり、対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は高度に精製され、夾雑物、例えば、内毒素を含まないように処理される。
薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、これらに限定されない。薬学的組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／または防腐剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の薬学的組成物は、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）と、任意選択で薬学的に活性な薬剤または治療剤とを含む。治療剤は、生物学的薬剤、低分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。
本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物を含む剤形が、提供される。一部の態様では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。一部の態様では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の調製物は、複製能のある残留核酸に損傷を与えるために、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝される。
ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の調製物は、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用してガンマ照射に曝される。
ある特定の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）の調製物は、約０．１、約０．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、または約１００００超の照射線量を使用してＸ線照射に曝される。
本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、他の薬物と同時に使用することができる。具体的には、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ホルモン治療剤、化学療法剤、免疫療法剤等の医薬品、細胞増殖因子または細胞増殖因子受容体の作用を阻害する医薬品等と一緒に使用することができる。
ＶＩ．キット
本開示はまた、１つまたは複数の本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）と、任意選択で使用説明書とを含む、キットまたは製造品を提供する。一部の態様では、キットまたは製造品は、本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エキソソーム）と、使用説明書とを含む、本明細書に記載の薬学的組成物を含有する。一部の態様では、キットまたは製造品は、１つまたは複数の容器中に、本開示の少なくとも１つのＥＶ（例えば、エキソソーム）、またはＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物を含む。当業者であれば、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含む薬学的組成物、またはそれらの組み合わせを、当該技術分野で周知である確立されたキット形式のうちの１つに容易に組み込むことができることを容易に認識しよう。
一部の態様では、キットまたは製造品は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）、１つもしくは複数の生物学的に活性な分子、マレイミド部分を介して１つもしくは複数の生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で結合させるための試薬、またはそれらの任意の組み合わせと、マレイミド部分を介して１つもしくは複数の生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）に共有結合性で結合させる反応を実施するための説明書とを含む。
一部の態様では、キットは、マレイミド部分を介して生物学的に活性な分子をＥＶ（例えば、エキソソーム）にコンジュゲートするための試薬と、コンジュゲーションを実施するための説明書とを含む。
本開示の実施は、別途指示されない限り、当業者の技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技法を用いることになる。かかる技法は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）、Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
上記に引用される参考文献の全て、ならびに本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
以下の実施例は、限定するものではなく、例示説明として提供される。
以下の実施例は、例示目的で提供されるにすぎず、本発明の範囲または内容をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の実施は、別途指示されない限り、当業者の技能の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、及び薬理学の従来の方法を用いることになる。かかる技法は、文献において完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ＆ Ｋａｐｌａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ ＆ Ｃａｒｅｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００７）を参照されたい。
実施例１
エキソソーム単離及び負荷
エキソソーム単離：エキソソームを、７～９日間後にＨＥＫ２９３ ＳＦ細胞の高密度懸濁培養物の上清から収集した。細胞培養液を連続的に遠心分離し、以下のように先のスピンの上清を後続のスピン用の投入物として役立てた。細胞培養液を５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を収集するとともにペレットを破棄し、次いで、上清を１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を収集するとともにペレットを破棄し、次いで、上清を１３３，９００×ｇで３時間遠心分離し、結果として得られた上清を破棄するとともにペレットを収集し、１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。再懸濁した１３３，９００×ｇのペレットを以下のようにＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）イオジキサノール勾配中で移動させることによってさらに精製した。３ｍＬのＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）（６０％イオジキサノール）を１ｍＬの再懸濁したペレットと混合して、４ｍＬの４５％イオジキサノールを生成し、次いで、ＳＷ ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬ Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）管中に３ｍＬの３０％イオジキサノール、２ｍＬの２２．５％イオジキサノール、２ｍＬの１７．５％イオジキサノール、及び１ｍＬのＰＢＳを順次に重層することによって、４段の滅菌勾配液を調製した。勾配を１５０，０００×ｇで、４℃で１６時間超遠心分離した。超遠心分離により、エキソソームを含有することが知られている上層画分、中程度の密度の細胞破片を含有する中層画分、ならびに高密度の凝集体及び細胞破片を含有する下層画分が生じた。次いで、エキソソーム層を管の上層約２ｍＬから穏やかに回収した。
エキソソーム画分を３８．５ｍＬ Ｕｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）管中、約３２ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を収集し、１３３，９００×ｇで、４℃で３時間超遠心分離して、精製したエキソソームをペレット状にした。次いで、ペレット状にしたエキソソームを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で貯蔵した。最終精製したエキソソームの濃度を、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を使用して決定した。
エキソソーム負荷：エキソソームにマレイミドコンジュゲートを負荷するために、１～５０ｍＭの濃度のＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を使用してエキソソームを化学的に還元した。場合によっては、還元ステップは、１～２Ｍの塩酸グアニジンでの室温で１時間の処理を含むか、またはそれを還元ステップの前に行う。エキソソームを、ＰＢＳ中１ｍＬに希釈し、１００，０００×ｇで２０分間遠心分離して（ＴＬＡ １２０．２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）、エキソソームをペレット状にし、上清を除去及び破棄し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁することによってＰＢＳ中に交換した。緩衝液交換が確実に完了するようにこれを１回繰り返した。最終的なエキソソームペレットを０．１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、これに、負荷すべき化合物を最大３００μＭの最終濃度になるまで添加した。エキソソームを４℃で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄して、エキソソームにコンジュゲートされていない化合物を除去した（ＰＢＳ中１ｍＬに希釈し、１００，０００×ｇで２０分間遠心分離して（ＴＬＡ １２０．２ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）、エキソソームをペレット状にし、上清を除去及び破棄し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。緩衝液交換が確実に完了するようにこれを１回繰り返した）。
実施例２
遊離ＳＴＩＮＧアゴニスト及びエキソソームに連結されたＳＴＩＮＧアゴニストの有効性
図１Ｂは、ＰＢＭＣアッセイで試験したＳＴＩＮＧアゴニスト化合物を提示する。化合物はＳｙｇｎａｔｕｒｅで合成された。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配を用いた標準プロトコルを使用して、ＰＢＭＣをヘパリン処置したヒト血液から単離した。試験すべき各条件につき、５００，０００個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートのウェルにプレートし、試験試料とともに一晩培養した。翌日、細胞をプレート中で遠沈させ（５００×ｇで１０分間）、上清を収集した。ＥＬＩＳＡを使用して細胞培養上清中へのインターフェロンベータ（ＩＦＮβ）の放出を測定した。図２。
図２は、ＰＢＭＣアッセイによって評価したスルフヒドリル反応性化合物またはアミン反応性化合物のＳＴＩＮＧアゴニズムを示す。３人の異なる健常なヒトドナーに由来するＰＢＭＣを使用して、遊離化合物（塗りつぶされた円）またはエキソソーム上に負荷された化合物（白抜きの円）のいずれかの活性をアッセイした。マレイミド結合化学反応を用いた全ての化合物（ＣＰ２２７、ＣＰ２２９、ＣＰ２５０）が、エキソソームに会合している場合に効力の３～４の対数増加を示した。受動的負荷によるエキソソーム会合（ＣＰ２３２）は、効力のおよそ２の対数増加を示した。注目すべきことに、スクシンイミド結合は、低量の負荷をもたらし、エキソソーム負荷試料においてＩＦＮβ放出の誘導は何ら検出されなかった（ＣＰ２４６）。
図３Ａ～３Ｃは、ＳＴＩＮＧアゴニストの負荷のためのスルフヒドリル反応性化学反応及び脂質会合化学反応の比較を示す。２人の異なる健常なヒトドナーに由来するＰＢＭＣを使用して、ＣＰ２２７、ＣＰ２２９、及びＣＰ２３８の３つの化合物の活性をアッセイした。化合物を遊離形態（青色の円／線）またはエキソソーム上に負荷された形態（緑色の円／線）のいずれかで試験した。スルフヒドリル反応性マレイミド結合化学反応を含有する化合物の両方（ＣＰ２２７及びＣＰ２２９）が、エキソソームに結合している場合に効力の３超の対数増加を示した。対照的に、脂質会合コレステロール化学反応を含有する化合物は、エキソソームに共役している場合に効力の１未満の対数シフトを示した。故に、マレイミド結合は、コレステロールよりも優れていた。
図４Ａ～４Ｃは、ＳＴＩＮＧアゴニストの負荷のための未修飾化学反応及びスルフヒドリル反応性化学反応の比較を示す。環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニスト（ＡＤＵＳ１００及びＣＬ６５６）を受動的に負荷したエキソソームを、マレイミド化学反応によりエキソソームに化学的に結合させたアゴニストと比較した（マレイミド化合物については図２にあるデータと同じデータ、すなわち、試験した化合物はＣＰ２２７、ＣＰ２２９、及びＣＰ２３８であった）。図４に提示される表において、両方の種類の負荷についてのＥＣ５０値を比較した。概して、マレイミドによりコンジュゲートされた化合物は、未修飾化合物と比較したときに、エキソソーム媒介性効力の増加において１０倍超の増加を示した。故に、エキソソームへのマレイミド結合は、受動的負荷よりも優れていた。
図５Ａ及び５Ｂは、異なるＳＴＩＮＧアゴニストの負荷及び活性の比較を示す。異なる結合化学反応を使用してエキソソーム上に負荷されたＳＴＩＮＧアゴニストの量を、質量分析法によって定量した。ヒトＰＢＭＣアッセイから、ＳＴＩＮＧアゴニストのＥＣ５０値を算出した。結果は、ＳＴＩＮＧアゴニスト負荷／活性が方法にわたって様々であることを示す。
実施例３
エキソソームに連結されたＭＭＡＥの有効性
図６は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びマレイミド－ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ（ｖｃ－ＭＭＡＥ）の構造を示す。これらの２つの化合物を使用して、エキソソーム上の細胞傷害性化合物（ＭＭＡＥ）の負荷を試験した。両方の化合物は市販されており、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから注文した。
ＭＭＡＥの細胞傷害性をＲＡＷ２６４．７（ＲＡＷ）細胞で評価した。図７を参照されたい。ＲＡＷ細胞は、ヒトマクロファージ細胞株である。１０，０００個のＲＡＷ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器を使用しておよそ５日間の期間にわたって細胞を撮像して、細胞増殖を監視した。遊離ＭＭＡＥまたはＤＭＳＯ（担体対照）を様々な濃度にわたってＲＡＷ細胞に添加し、１．１ｎＭを上回るＭＭＡＥ濃度において強力な増殖阻害及び細胞死が認められた。ＤＭＳＯ対照は、細胞の生存率または増殖に対して何ら効果を示さなかった。画像は、示される用量のＭＭＡＥまたはＤＭＳＯでの５日間の処理後の細胞を示す。増殖阻害は、ＭＭＡＥでの処理後の細胞数の減少から明白である一方で、細胞死は、細胞の円形化（１０、１００、及び３００ｎＭの画像において明白）によって示される。ＭＭＡＥは、急勾配の用量反応曲線を有する。
マレイミド－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣリンカーを用いたまたは用いないＭＭＡＥの効力の差異が、図８Ａに示される。ＲＡＷ細胞を、示される濃度の未修飾ＭＭＡＥまたはｖｃ－ＭＭＡＥのいずれかで処理した。ｖｃ－ＭＭＡＥは、遊離薬物として細胞に投与した場合の未修飾ＭＭＡＥよりもおよそ１００倍毒性が低いようである。故に、ｖｃリンカーへのＭＭＡＥの結合は、効力の減少をもたらす。
図８Ｂは、ＭＭＡＥとのインキュベーション後のエキソソームクリーンアップを示す。エキソソームをＭＭＡＥとともに４℃で一晩インキュベートし、次いで、超遠心分離によって２回洗浄した（１００，０００×ｇで２０分間の遠心分離によってペレット状にし、ＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、２回目のペレット化を行い、続いて再懸濁した）。試験したいずれの条件下でも、ＭＭＡＥで処理したエキソソームは、ＲＡＷ細胞に添加されたときにいかなる増殖阻害または毒性も誘導することが見出されなかった。これは、遊離ＭＭＡＥがエキソソームに顕著に結合しないこと、及びクリーンアップ手順がエキソソームからＭＭＡＥを除去することを示す。
図８Ｃは、ｖｃ－ＭＭＡＥを負荷したエキソソームが強力な生物学的活性を表すことを示す。エキソソームをＴＣＥＰ（５ｍＭ）及び０．１～２Ｍの範囲の濃度の塩酸グアニジン（Ｇｄｎ）で化学的に還元した。エキソソームを超遠心分離によりクリーンアップし（１００，０００×ｇで２０分間の遠心分離によってペレット状にし、ＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、２回目のペレット化を行い、続いて再懸濁した）、次いで、示されるＭＯＩ（１細胞当たりのエキソソームの数）でＲＡＷ細胞に添加した。５日間の培養後に細胞増殖阻害を測定することによって毒性を評価した。ＲＡＷ細胞は、ｖｃ－ＭＭＡＥ負荷エキソソームでの処理後に増殖の用量依存性の減少を表した。故に、ｖｃ－ＭＭＡＥは、エキソソームに顕著に結合しており、カオトロピック剤及び遠心分離によって洗浄されなかった。さらに、エキソソームに結合したＭＭＡＥは、細胞増殖に対して強力な阻害効果を表した。
図８Ｄは、ｖｃ－ＭＭＡＥ活性のためにエキソソームの化学的還元が必要とされることを示す。エキソソームをＰＢＳ中で維持したか、または５ｍＭのＴＣＥＰを含むＰＢＳで処理し、次いで、ＭＭＡＥまたはｖｃ－ＭＭＡＥのいずれかとともにインキュベートした。試料を超遠心分離によりクリーンアップし、次いで、ＲＡＷ細胞に添加した。細胞増殖は、ｖｃ－ＭＭＡＥとともにインキュベートしたＴＣＥＰ還元エキソソームによってのみ著しく阻害された（暗赤色の三角形）。これは、化学的還元後に、ｖｃ－ＭＭＡＥ化合物上のマレイミド基が、エキソソーム上に作り出されたスルフヒドリル基にコンジュゲートしていることを示していた。
図９Ａは、エキソソームの効力に対する還元条件及び化合物の負荷濃度の効果を示す。エキソソームを様々な還元条件（１Ｍの塩酸グアニジンを含むまたは含まない０～５０ｍＭのＴＣＥＰ）で処理し、超遠心分離によってクリーンアップし、次いで、１０μＭまたは１００μＭのいずれかのｖｃ－ＭＭＡＥとともに４℃で一晩インキュベートした。エキソソームを超遠心分離によってクリーンアップし、次いで、ＲＡＷ細胞に添加して、細胞増殖に対するそれらの効果を試験した。ＴＣＥＰでの処理による化学的還元を行わなかったエキソソームは、細胞増殖に対して何ら効果を示さなかった。還元条件内で比較すると、１００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥでの負荷が、１０μＭのｖｃ－ＭＭＡＥでの負荷と比較して効力の劇的な増加をもたらした。１ＭのＧｄｎの存在下では、低減された効力を示した最も高い濃度のＴＣＥＰ（５０ｍＭ）を除いて、全ての濃度のＴＣＥＰが類似の効力を生み出した。塩酸グアニジンの不在下では、ＴＣＥＰの濃度を１．５から１５ｍＭに増加させることで、効力の増加が生み出された。５０ｍＭのＴＣＥＰはまた、塩酸グアニジンの不在下で低減された効力を示した。
図９Ａと同様に、図９Ｂは、エキソソームの効力に対する還元条件及び化合物の負荷濃度の効果を示すが、但し、ｖｃ－ＭＭＡＥ濃度はより高い。図９Ａに提示した実験で使用した同じ実験条件を使用したが、但し、負荷濃度として１００μＭ及び３００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥを使用した。１０μＭ及び１００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥで観察された結果と同様に、負荷濃度を３００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥに増加させることで、効力がさらに増加した。重要な点として、３００μＭのｖｃ－ＭＭＡＥでは、１５ｍＭのＴＣＥＰで０ＭのＧｄｎ条件と１ＭのＧｄｎ条件との間で同等の効力が観察され、このことは、還元条件及び負荷濃度が最適化されていることを条件として、塩酸グアニジンを用いずに負荷が実施され得ることを示している。
ＭＭＡＥ実験は、ＴＣＥＰ、塩酸グアニジン、及びＶａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＥの濃度の間の複雑な相互作用を例示し、多くの予想外の相互作用を示す（すなわち、１ＭのＧｄｎは２Ｍよりも良好であり（図８Ｂ）、１５ｍＭのＴＣＥＰは５０ｍＭよりも良好であり（図９Ａ及び９Ｂ）、ＴＣＥＰ濃度を１．５ｍＭから１５ｍＭに増加させることで、Ｇｄｎの不在下で効力が増加するが、１ＭのＧｄｎでは差異が生じない（図９Ｂ））。
実施例４
エキソソームに連結されたＰＲＯＴＡＣ
図１０Ｃに従ったＴＢＫ１ ＰＲＯＴＡＣは、上記に開示される方法に従ってエキソソームに結合している。ＰＲＯＴＡＣは、ＴＢＫ１標的化リガンド、リンカー、及びＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができるリガンドを含む。
ＰＲＯＴＡＣは、マレイミド部分を介して（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）、エキソソーム、例えば、エキソソーム膜の外部表面及び／または内腔表面に結合している。ＰＲＯＴＡＣは、マレイミド－ＶＡ－ＰＡＢＣ切断可能リンカーを介してエキソソームに結合させることができる。ＰＲＯＴＡＣは、ＶＨＬ（Ｅ３リガーゼ）結合リガンドを介してエキソソームに結合させることができる。
本開示のエキソソームに結合しているＴＢＫ１ ＰＲＯＴＡＣの官能性は、インビトロ法またはインビボ法を使用して決定することができる。インビトロ法には、ウェスタンブロットにより、（ｉ）細胞株におけるＴＢＫ１分解を直接的に測定すること、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（ポリＩ：Ｃ、ＣＬ６５６、ＬＰＳ等）での刺激後のＩＲＦ３リン酸化の阻害を決定すること、または（ｉｉｉ）ヒト単球におけるＴＢＫ１タンパク質ノックダウンを決定することが含まれる。別のインビトロアッセイは、例えば、Ｂ１６ ＩＲＦレポーター細胞株を使用した、ＳＴＩＮＧアゴニズムの阻害（例えば、エキソソーム－ＰＲＯＴＡＣコンジュゲートで前処理し、ＳＴＩＮＧアゴニストで刺激し、レポーター応答を測定する）、またはヒト単球の阻害（例えば、ＩＦＢベータの放出を測定する）を決定することができる。
本開示のエキソソーム－ＰＲＯＴＡＣコンジュゲートの官能性を決定するためのインビボアッセイには、例えば、（ｉ）腹腔マクロファージにおけるＴＢＫ１タンパク質ノックダウン（例えば、エキソソーム－ＰＲＯＴＡＣコンジュゲートを腹腔内投与し、腹腔マクロファージを収集し、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリーによってノックダウンを測定する）、（ｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニズム誘導性の血清中サイトカインの阻害（例えば、エキソソーム－ＰＲＯＴＡＣコンジュゲートで腹腔内において前処理し、ＳＴＩＮＧアゴニストで腹腔内において刺激し、ある特定の時点で血漿／血清中サイトカインを測定する）、または（ｉｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニズム誘導性のホスホＩＲＦ３の阻害（例えば、ノックダウンが非常に選択的であり、血清中サイトカインの低減が何ら観察されない場合、例えば、抗ｐＩＲＦ抗体及びフローサイトメトリーを使用して、異なる細胞種におけるｐＩＲＦ３レベルを決定することは、選択性を示すのに役立ち得る）を決定するためのアッセイが含まれる。
実施例５
エキソソームに連結されたＬＰＡ１阻害剤－エキソＡＭ１５２
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、プログラム細胞死から細胞を保護及び救済する非常に強力な内因性脂質メディエーターである。ＬＰＡは、その高親和性のＬＰＡ１受容体を介して、線維形成の重要なメディエーターである。
ＡＭ１５２（別名ＢＭＳ－９８６０２０）は、特異的なＬＰＡ１阻害剤である。ＡＭ１５２は、ＢＳＥＰ、ＭＲＰ４、及びＭＤＲ３に対してそれぞれ４．８μＭ、６．２μＭ、及び７．５μＭのＩＣ５０で胆汁酸及びリン脂質トランスポーターを阻害する、高親和性のＬＰＡ１アンタゴニストである。ＬＰＡ１阻害剤ＡＭ１５２及びＡＭ０９５の化学構造が、図１２に示される。この図は、マレイミド含有試薬がＡＭ１５２のカルボン酸及び／またはカルバメート基にコンジュゲートされ得ることを示す。同じ反応性基がＡＭ０９５に存在することから、同じ手法を使用して、ＡＭ０９５を誘導体化することが可能であろう。
本明細書に開示される方法を使用して、ＡＭ０９５及びＡＭ１５２等のＬＰＡ１アンタゴニストをエキソソームの表面に化学的に連結することができる。その結果は、それらの表面の複数のアンタゴニスト分子を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）であろう。図１３を参照されたい。
図１４は、マレイミド反応性基をどのようにＡＭ１５２に、酸基を介して付加することができるかについての実施例を示す。この例は、マレイミド基とカルボン酸反応性クロロメチルベンゼン基との間に介在するａｌａ－ｖａｌ切断可能リンカーを含む複合体の一部としてマレイミド基を示す。図１５は、ＡＭ１５２を誘導体化するために使用することができる２つの例示的な試薬を示す。上の試薬は、（ｉ）ＡＭ１５２のカルボン酸基と反応することができるクロロメチルベンゼン基、及び（ｉｉ）マレイミド基を含み、それらの間には、切断可能なｃｉｔ－ｖａｌジペプチド及びＣ５スペーサーが介在する。下の試薬は、（ｉ）ＡＭ１５２のカルボン酸基と反応することができるクロロメチルベンゼン基、及び（ｉｉ）マレイミド基を含み、それらの間には、切断可能なａｌａ－ｖａｌジペプチド及びＣ５スペーサーが介在する。その後、マレイミド基を使用して、ＡＭ１５２（またはＡＭ０９５）を、例えば、足場部分に、直接的にまたは１つもしくは複数のスペーサーもしくはリンカーを介して間接的に結合することになろう。
図１６は、コンジュゲーション生成物における（例えば、カテプシンＢによる）ｃｉｔ－ｖａｌまたはａｌａ－ｖａｌジペプチドの切断からもたらされよう生成物を示す。生成物ＡＭ１５２アニリンエステルは、内因性エステラーゼによってさらにプロセシングされて、遊離酸ＡＭ１５２生成物を生み出すことが可能である。
図１７は、遊離マレイミド基及び異なるスペーサーの組み合わせを含むいくつかのＡＭ１５２誘導体を示す。追加の誘導体が、図１８に示される。
図１９は、カルボン酸基の保護の後、カルボン酸基を誘導体化するために使用した同じ試薬を使用して、ＡＭ１５２をそのカルバメート基において誘導体化することが可能であることを示す。結果として得られる生成物は、その後、遊離カルボン酸基に脱保護されよう。
図２０は、マレイミド基との複合体がリンカーを介してＡＭ１５２のカルバメート基に結合している実施例を例示する。好適なリンカーには、本明細書に開示されるリンカーのうちのいずれも含まれる。
この実施例に開示されるプロセスは、遊離マレイミド反応性基を含むＡＭ１５２またはＡＭ０９５誘導体の生成に関し、これはその後、直接的にまたは１つもしくは複数のスペーサーもしくはリンカーを介して間接的に、のいずれかで、足場部分と反応することが可能であろう。結果として、ＡＭ１５２またはＡＭ０９５は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に結合させられよう。
しかしながら、本発明はまた、図２１に示されるように、例えば、マレイミドを含む二官能性基により、足場部分を最初に誘導体化し、次いで、例えば、遊離クロロメチルベンゼン基を有する誘導体化された足場部分を、ＡＭ１５２のカルボン酸またはカルバメート基のいずれかと反応させることによっても実施することが可能であろう。
一部の態様では、マレイミド部分を介してＡＭ１５２（またはＡＭ０９５）をＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に化学的に連結することにより、コンジュゲートされていないＡＭ１５２（またはＡＭ０９５）の少なくとも１つの有益な特性が改善され、及び／またはコンジュゲートされていないＡＭ１５２もしくはＡＭ０９５の少なくとも１つの有害な特性（例えば、胆嚢毒性及び／または肝毒性等の毒性）が低減される。一部の態様では、マレイミド部分を介してＡＭ１５２（またはＡＭ０９５）をＥＶ（例えば、エキソソーム）に化学的に連結することにより、線維性疾患、例えば、ＩＰＦ等の肺線維症の処置におけるＡＭ５１２またはＡＭ０９５の有効性が（遊離ＡＭ１５２または遊離ＡＭ０９５と比較して）改善される。
実施例６
エキソソームに連結されたＮＬＲＰ３阻害剤－エキソＭＣＣ９５０
ＭＣＣ９５０（Ｎ－［［（１，２，３，５，６，７－ヘキサヒドロ－ｓ－インダセン－４－イル）アミノ］カルボニル］－４－（１－ヒドロキシ－１－メチルエチル）－２－フランスルホンアミド）は、ＮＬＲＰ３（ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）ピリンドメイン含有タンパク質３）インフラマソームの強力かつ選択的な阻害剤である。ＭＣＣ９５０は、インフラマソームアダプタータンパク質ＡＳＣ（ＣＡＲＤを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質）のオリゴマー形成を阻止することによって、ＡＴＰ、ＭＳＵ、及びニゲリシン等のＮＬＲＰ３活性化因子によって誘導されるＩＬ－１βの放出を遮断する。Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２１：２４８－２５５。ＭＣＣ９５０は、ＬＰＳでプライミングされ、ＡＴＰまたはニゲリシンで活性化されたマクロファージにおいて、およそ７．５ｎＭのＩＣ５０でＩＬ－１βの放出を遮断する。ＭＣＣ９５０は、ＮＬＲＰ３によって誘導されるＩＬ－１βの放出を遮断するものの、ＭＣＣ９５０は、ＮＬＲＣ４、ＡＩＭ２、またはＮＬＲＰ１インフラマソームを阻害しない。さらに、ＭＣＣ９５０は、ＴＬＲ２のシグナル伝達、またはＮＬＲＰ３のプライミングを阻害しない。
ＭＣＣ９５０は、インビボで活性であり、多発性硬化症のマウスモデルにおいてＩＬ－１βの産生を遮断するとともに、生存率を向上させる。ＭＣＣ９５０はまた、心筋梗塞のモデルにおいてＮＬＲＰ３誘導性のＩＬ－１β産生を阻害する。ｖａｎ Ｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．ｅｈｗ２４７。ＭＣＣ９５０はまた、マックル・ウェルズ症候群を有する個体由来のエクスビボ試料中でも活性である。故に、ＭＣＣ９５０は、自己炎症性疾患及び自己免疫疾患を含めたＮＬＲＰ３関連症候群の処置のための潜在的な治療剤である。
図２２は、ＭＣＣ９５０、マレイミド反応性基を導入するようにＭＣＣ９５０を誘導体化するために使用することができる二官能性試薬、及びマレイミド反応性基を含むＭＣＣ９５０誘導体の構造を示す。二官能性試薬のベンゼン基（＊＊）は、ＭＣＣ９５０のカルバメート基（＊）と反応して、図２２に図示されるＭＣＣ９５０誘導体を生み出すことができる。
この実施例に開示されるプロセスは、遊離マレイミド反応性基、及び任意選択でＭＣＣ９５０部分とマレイミド基との間に介在する１つまたは複数のリンカー（例えば、切断可能なリンカー及び／または１つもしくは複数のスペーサー）を含む、ＭＣＣ９５０誘導体の生成に関し、これはその後、直接的にまたは１つもしくは複数のスペーサーもしくはリンカーを介して間接的に、のいずれかで、足場部分と反応することが可能であろう。結果として、ＭＣＣ９５０は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に結合させられよう。
本発明はまた、例えば、マレイミドを含む二官能性基により、足場部分を最初に誘導体化し、次いで、例えば、遊離クロロメチルベンゼン基またはベンゼン基を有する誘導体化された足場部分を、ＭＣＣ９５０のカルバメート基または別の好適な誘導体化可能な基と反応させることによっても実施することが可能であろう。
一部の態様では、マレイミド部分を介してＭＣＣ９５０をＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に化学的に連結することにより、コンジュゲートされていないＭＣＣ９５０の少なくとも１つの有益な特性が改善され、及び／またはコンジュゲートされていないＭＣＣ９５０の少なくとも１つの有害な特性（例えば、胆嚢毒性及び／または肝毒性等の毒性）が低減される。一部の態様では、マレイミド部分を介してＭＣＣ９５０をＥＶ（例えば、エキソソーム）に化学的に連結することにより、多発性硬化症、２型糖尿病、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、神経炎症、パーキンソン、プリオン病、心筋梗塞に起因する心外傷、痛風、ならびに一般に、自己炎症性疾患及び自己免疫疾患を含めた任意のＮＬＲＰ３関連症候群等のＮＬＲＰ３インフラマソーム関連疾患または障害の処置におけるＭＣＣ９５０の有効性が（遊離ＭＣＣ９５０と比較して）改善される。
＊＊＊
特許請求の範囲を解釈するために、発明の概要及び要約書の節ではなく、発明を実施するための形態の節が使用されることが意図されることを理解されたい。発明の概要及び要約書の節は、発明者（ら）によって企図される、本開示の、全てではないが１つまたは複数の例示的な態様を定めることができ、故に、本開示及び添付の特許請求の範囲をいかようにも限定することは意図されない。
本開示は、明記される機能の実装及びそれらの関係を例示する機能的な構成要素の支援により上述された。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書で恣意的に画定されたものである。明記される機能及びそれらの関係が適切に実施される限り、代替の境界が画定され得る。
具体的な態様についての上述の説明は、他者が、過度の実験をすることなく、本開示の一般概念から逸脱することなく、当業者の技能の範囲内の知識を適用することによって、かかる具体的な態様を種々の用途のために容易に変更する及び／または適合させることができるほどに十分に、本開示の一般的性質を明らかにしよう。したがって、かかる適合及び変更は、本明細書に提示される教示及び手引きに基づき、開示される態様の均等物の意味及び範囲の内にあることが意図される。本明細書における語法または専門用語は、限定ではなく説明を目的とするものであり、このため、本明細書の専門用語または語法は、教示及び手引きに照らして当業者により解釈されるべきであることを理解されたい。
本開示の広さ及び範囲は、上述の例示的な態様のうちのいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物に準拠してのみ規定されるべきである。
本出願全体を通して引用され得る、全ての引用参考文献（文献の参考文献、特許、特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、参照によりそれらの全体があらゆる目的で本明細書に明示的に援用され、それらの中で参照される参考文献も同様である。

Claims (84)

  1. 細胞外小胞（ＥＶ）であって、マレイミド部分を介して前記ＥＶに共有結合性で連結された生物学的に活性な分子を含む、前記細胞外小胞。
  2. 前記マレイミド部分が、式（Ｉ）を有し、
    Figure 2022525924000090
     式中、
    Ｒ１が、－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８カルボシクロ）－、－（Ｃ３－８カルボシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８ヘテロシクロ－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－からなる群から選択され、
    ｒが、１～１０の整数であり、
    ＊が、前記ＥＶへの前記マレイミド部分の共有結合部位を示し、
    波線が、前記生物学的に活性な分子への前記マレイミド部分の結合部位を示す、請求項１に記載の細胞外小胞。
  3. Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｓが、４、５、または６である、請求項２に記載の細胞外小胞。
  4. 前記マレイミド部分が、式（ＩＩ）を有し、式中、Ｒ１が、－（ＣＨ２）５－である、請求項２または３に記載の細胞外小胞。
    Figure 2022525924000091
  5. 前記マレイミド部分が、式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｒ１が、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒが２である、請求項２に記載の細胞外小胞。
    Figure 2022525924000092
  6. 前記マレイミド部分が、前記ＥＶ上に存在する官能基に共有結合性で連結され、前記官能基が、スルフヒドリル基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  7. 前記スルフヒドリル基が、前記ＥＶの表面上のタンパク質上にある、請求項６に記載の細胞外小胞。
  8. 前記マレイミド部分が、リンカーによって前記生物学的に活性な分子に連結されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  9. 前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、請求項８に記載の細胞外小胞。
  10. 前記切断可能なリンカーが、プロテアーゼによって切断される、請求項９に記載の細胞外小胞。
  11. 前記プロテアーゼが、カテプシンである、請求項１０に記載の細胞外小胞。
  12. 前記リンカーが、還元感受性リンカー、または酸に不安定なリンカーである、請求項８に記載の細胞外小胞。
  13. 前記リンカーが、式（ＩＶ）を有し、
    －Ａａ－Ｙｙ－（ＩＶ）、
    式中、各－Ａ－が独立して、アミノ酸単位であり、ａが独立して、１～１２の整数であり、－Ｙ－が、スペーサー単位であり、ｙが、０、１、または２である、請求項８～１２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  14. －Ａａ－が、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドである、請求項１３に記載の細胞外小胞。
  15. ａが２であり、－Ａａ－が、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンからなる群から選択される、請求項１４に記載の細胞外小胞。
  16. 前記－Ａａ－が、バリン－アラニンまたはバリン－シトルリンである、請求項１５に記載の細胞外小胞。
  17. ｙが１である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  18. －Ｙ－が、自壊性スペーサーである、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  19. －Ｙｙ－が、式（Ｖ）を有し、
    Figure 2022525924000093
     式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である、請求項１８に記載の細胞外小胞。
  20. ｍが、０、１、または２である、請求項１９に記載の細胞外小胞。
  21. ｍが０である、請求項２０に記載の細胞外小胞。
  22. 前記切断可能なリンカーが、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである、請求項８～２１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  23. －Ｙ－が、非自壊性スペーサーである、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  24. 前記非自壊性スペーサーが、－Ｇｌｙ－または－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－である、請求項２３に記載の細胞外小胞。
  25. 前記リンカーが、酸に不安定なリンカーである、請求項８に記載の細胞外小胞。
  26. 前記酸に不安定なリンカーが、シス－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５に記載の細胞外小胞。
  27. 前記酸に不安定なリンカーが、前記生物学的に活性な分子を前記酸に不安定なリンカーに連結するスペーサー単位を含む、請求項２５または２６に記載の細胞外小胞。
  28. 前記スペーサー単位が、式（Ｖ）を有し、
    Figure 2022525924000094
     式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である、請求項２７に記載の細胞外小胞。
  29. 前記リンカーが、切断不可能なリンカーである、請求項８に記載の細胞外小胞。
  30. 前記切断不可能なリンカーが、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２９に記載の細胞外小胞。
  31. 前記切断不可能なリンカーが、前記生物学的に活性な分子を前記切断不可能なリンカーに連結するスペーサー単位を含む、請求項２９または３０に記載の細胞外小胞。
  32. 前記スペーサー単位が、式（Ｖ）を有し、
    Figure 2022525924000095
     式中、各Ｒ２が独立して、Ｃ１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍが、０～４の整数である、請求項３１に記載の細胞外小胞。
  33. 生物学的に活性な分子及び切断可能なリンカーを含む細胞外小胞であって、前記切断可能なリンカーが、前記ＥＶを前記生物学的に活性な分子につなげる、前記細胞外小胞。
  34. 前記切断可能なリンカーが、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項３３に記載の細胞外小胞。
  35. 前記ＥＶ上に存在する官能基を介して前記ＥＶを前記切断可能なリンカーに連結する、マレイミド部分をさらに含む、請求項３３または３４に記載の細胞外小胞。
  36. 前記マレイミド部分が、式（Ｉ）を有し、
    Figure 2022525924000096
     式中、
    Ｒ１が、－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８カルボシクロ－、－Ｏ－（Ｃ１－８アルキレン）－、－アリーレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－アリーレン－、－アリーレン－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８カルボシクロ）－、－（Ｃ３－８カルボシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－Ｃ３－８ヘテロシクロ－、－Ｃ１－１０アルキレン－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－、－（Ｃ３－８ヘテロシクロ）－Ｃ１－１０アルキレン－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－からなる群から選択され、
    ｒが、１～１０の整数であり、
    ＊が、前記ＥＶへの前記マレイミド部分の共有結合部位を示し、
    波線が、前記生物学的に活性な分子への前記マレイミド部分の結合部位を示す、請求項３５に記載の細胞外小胞。
  37. Ｒ１が、－（ＣＨ２）ｓ－であり、ここで、ｓが、４、５、または６である、請求項３６に記載の細胞外小胞。
  38. 前記マレイミド部分が、式（ＩＩ）を有し、式中、Ｒ１が、－（ＣＨ２）５－である、請求項３６または３７に記載の細胞外小胞。
    Figure 2022525924000097
  39. 前記マレイミド部分が、式（ＩＩＩ）を有し、式中、Ｒ１が、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－ＣＨ２－であり、ここで、ｒが２である、請求項３６に記載の細胞外小胞。
    Figure 2022525924000098
  40. 前記マレイミド部分が、前記ＥＶ上に存在する官能基に共有結合性で連結されている、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  41. 前記官能基が、前記ＥＶ上のグリカン上にある、請求項４０に記載の細胞外小胞。
  42. 前記官能基が、スルフヒドリルである、請求項４０に記載の細胞外小胞。
  43. 前記官能基が、前記ＥＶの表面上のタンパク質上にある、請求項４１または４２に記載の細胞外小胞。
  44. 前記タンパク質が、足場部分である、請求項４３に記載の細胞外小胞。
  45. 前記タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、またはその断片である、請求項４４に記載の細胞外小胞。
  46. マレイミド部分、切断可能なリンカー、及び生物学的に活性な分子を含む細胞外小胞であって、前記マレイミド部分が、前記ＥＶを前記切断可能なリンカーに連結し、前記切断可能なリンカーが、前記マレイミド部分を前記生物学的に活性な分子につなげる、前記細胞外小胞。
  47. 前記生物学的に活性な分子が、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１～４６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  48. 前記生物学的に活性な分子が、化学化合物である、請求項４７に記載の細胞外小胞。
  49. 前記化学化合物が、低分子である、請求項４８に記載の細胞外小胞。
  50. 前記低分子が、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）である、請求項４９に記載の細胞外小胞。
  51. 前記生物学的に活性な分子が、ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチドが、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ）アゴニストである、請求項４７に記載の細胞外小胞。
  52. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む、請求項５１に記載の細胞外小胞。
  53. 式（ＶＩ）もしくは（ＶＩＩ）、
    Figure 2022525924000099
     を有する（マレイミド部分）－（切断可能なリンカー）－（生物学的に活性な分子）、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項５２に記載の細胞外小胞。
  54. 式（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、もしくは（ＸＩ）、
    Figure 2022525924000100
     を有する（マレイミド部分）－（切断可能なリンカー）－（生物学的に活性な分子）、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項５２に記載の細胞外小胞。
  55. 前記ＥＶが、前記マレイミド部分を共有結合性で連結するための官能基を表面上に露出させるように修飾されている、請求項１～５、８～３２、及び３５～４５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  56. 前記官能基が、スルフヒドリル基である、請求項５５に記載の細胞外小胞。
  57. 前記官能基が、前記ＥＶを還元剤で処理することによって露出させられる、請求項５６に記載の細胞外小胞。
  58. 前記還元剤が、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５７に記載の細胞外小胞。
  59. 前記チオール化剤が、トラウト試薬（２－イミノチオラン）を含む、請求項５８に記載の細胞外小胞。
  60. 前記ＥＶがエキソソームである、請求項１～５９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  61. 請求項１～６０のいずれか１項に記載の細胞外小胞と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  62. 生物学的に活性な分子をＥＶにコンジュゲートする方法であって、マレイミド部分を前記ＥＶに連結することを含む、前記方法。
  63. 前記連結することが、前記ＥＶを還元剤で処理することを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記還元剤が、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＢＭＥ（２－メルカプトエタノール）、チオール化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記チオール化剤が、トラウト試薬（２－イミノチオラン）を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記連結することが、前記還元されたＥＶを前記マレイミド部分に接触させることをさらに含む、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記マレイミド部分が、前記ＥＶへの前記連結前に、生物学的に活性な分子に連結される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記マレイミド部分が、前記マレイミド部分を前記生物学的に活性な分子につなげるためのリンカーにさらに結合している、請求項６７に記載の方法。
  69. 請求項１～６０のいずれか１項に記載のＥＶと、使用説明書とを含む、キット。
  70. 生物学的に活性な分子をＥＶにコンジュゲートするための試薬と、前記コンジュゲーションを実施し、それによって請求項１～６０のいずれか１項に記載のＥＶを作製するための説明書とを含む、キット。
  71. 疾患または障害の処置または予防を必要とする対象において前記疾患または障害を処置または予防する方法であって、請求項１～６０のいずれか１項に記載のＥＶを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  72. 前記疾患または障害が、がん、炎症性障害、神経変性障害、中枢神経疾患、または代謝疾患である、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記ＥＶが、静脈内、腹腔内、鼻腔、経口、筋肉内、皮下、非経口、腫瘍内、髄腔内、または眼内投与される、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. マレイミド部分を介して足場部分に共有結合性で連結された少なくとも１つの生物学的に活性な分子を含む、細胞外小胞（ＥＶ）。
  75. 前記マレイミド部分が、二官能性分子である、請求項７４に記載の細胞外小胞。
  76. 前記マレイミド部分が、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサーを含む、請求項７４または７５に記載の細胞外小胞。
  77. 前記リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項７６に記載の細胞外小胞。
  78. 前記足場部分が、足場タンパク質または足場脂質である、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  79. 前記足場タンパク質が、足場Ｘタンパク質である、請求項７８に記載の細胞外小胞。
  80. 前記足場Ｘタンパク質が、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、またはその断片である、請求項７９に記載の細胞外小胞。
  81. 前記生物学的に活性な分子が、ワクチン抗原、ワクチンアジュバント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  82. 前記生物学的に活性な分子が、ＳＴＩＮＧ、ＡＳＯ、合成抗腫瘍剤（例えば、ＭＭＡＥ）、サイトカイン放出阻害剤（例えば、ＭＣＣ９５０）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）、オートタキシン阻害剤（例えば、ＰＡＴ４０９）、ＬＰＡ１アンタゴニスト（例えば、ＡＭ１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  83. 前記細胞外小胞が、標的化部分、指向性部分、抗食作用シグナル、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項７４～８２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  84. 前記標的化部分、指向性部分、抗食作用シグナル、またはそれらの組み合わせが、マレイミド部分を介して前記細胞外小胞に連結されている、請求項８３に記載の細胞外小胞。

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