MX2012004095A - Uso del receptor tipo toll y agonista para tratar el cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a métodos y agentes utilizados para tratar el cáncer o padecimientos infecciosos proporcionando receptores tipo toll tales como el receptor 5 tipo toll (TLR-5) en combinación con la provisión de agonistas del receptor tipo toll tales como la flagelina que dan como resultado un efecto cis e in-trans que reclutan células involucradas en la respuesta inmune tanto innata (efecto cis) como adaptativa (efecto trans) para específicamente acabar células cancerígenas y células infectadas con un patógeno a través de la vía de apoptosis NF-kB.

Description

USO DEL RECEPTOR TIPO TOLL Y AGONISTA PARA TRATAR EL CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para tratar el cáncer y padecimientos infecciosos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los receptores tipo toll (familia de proteínas transmembrana de tipo I que forman parte del sistema inmunitario innato) son responsables del reconocimiento de los patrones más comunes de patógenos bacterianos y virales. Su activación da como resultado el reclutamiento de la respuesta inmune innata y subsecuentemente adaptiva. Las células receptoras del sistema inmune al sitio de presencia de antígenos es la etapa clave en la respuesta inmune efectiva. Esa es la razón por la que la inmunización involucra el uso de diferentes tipos de adyuvantes. Aunque la mayoría de tumores expresan antígenos de tumores específicos, los mismos utilizan una serie de mecanismos que permiten entonces evadir el reconocimiento inmune. Recientemente se demostró en modelos de ratón que la activación del TLR5 mediante su ligando y agonista, la flagelina bacteriana, da como resultado la inducción del efecto antitumoral contra aquellos tumores que expresan el TLR5 funcional. Esto abre una oportunidad general para considerar los agonistas del TLR5 para inmunoterapia contra el cáncer. Existen dos principales obstáculos en el camino para practicar la reducción de esta idea. El primero es la rara incidencia de tumores que expresan el TLR5 funcional que limita la aplicabilidad de esta metodología a solamente un pequeño subconjunto de tumores. El segundo, la administración sistémica del agonista TLR5 lleva a la activación de la señalización del TLR5 en todas las células que tienen un receptor funcional que crea una respuesta no enfocada y no específica para un tumor. De acuerdo con esto, existe la necesidad en la técnica de un mecanismo o método para la activación autocrina de la señalización receptora del TLR en células infectadas o tumorales con un mínimo efecto sistémico permitiendo así atraer la respuesta inmune innata específicamente a la célula infectada o tumor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención puede dirigirse a un vector que comprende un primero y segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico codifica un receptor tipo toll y el segundo ácido nucleico codifica un agonista del receptor tipo toll. El primer ácido nucleico puede codificar una forma secretada de un receptor tipo toll. El segundo ácido nucleico puede ser una forma secretada de flagelina. El agonista del receptor tipo toll puede ser la flagelina. El vector puede ser un vector de expresión de mamífero. El vector puede expresarse a partir de un adenovirus, un lentivirus o un liposoma. La forma secretada de la flagelina puede ser la CBLB502S. El receptor tipo toll puede ser el TLR-5.

La presente invención puede dirigirse a un método para tratar el cáncer en un mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo un agente que comprende el vector que comprende un primer y segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico codifica un receptor tipo toll y el segundo ácido nucleico codifica un agonista del receptor tipo toll. El cáncer puede ser un tumor. El tumor puede derivarse del grupo que consiste de la próstata, pecho, colon, esófago, estómago, pulmón, pancreático, renal, tiroideo, ovarios, garganta, o el cérvix. El tumor puede derivarse del grupo que consiste de sarcomas, melanomas, leucemias, y linfornas. El agente puede administrase in trans o fuera del tumor del mamífero. El agente puede administrarse directamente en un tumor del mamífero. El agente puede administrarse en combinación con un inmunoestimulante . El inmunoestimulante puede seleccionarse del grupo que consiste de la hormona del crecimiento, prolactina y vitamina D. La hormona del crecimiento puede ser somatotrofina . El agente puede administrarse en combinación con una citocina. La citocina puede ser un factor de células madre.

La presente invención también está dirigida a un método para tratar una infección en un mamífero que comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo el agente, el agente que comprende el vector que comprende un primer y segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico codifica un receptor tipo toll y el segundo ácido nucleico codifica un agonista del receptor tipo toll. El cáncer puede ser un tumor. La infección puede derivarse del grupo que consiste de virus, bacterias, parásitos protozoarios y hongos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A-1C representa mapas esquemáticos de vectores adenovirales que expresan el TLR5, CBLB502S y su combinación (TLR5 + CBLB502S) .

La Figura 2 representa los resultados de la proporción del volumen de tumor en ratones sobre un número de días en células tumorales (A549) transducidas con un vector de control (sin TLR5) o vector que expresa el TLR5 en donde los ratones son tratados tres días con ya sea CBLB502S ó PBS.

La Figura 3 representa la supresión del crecimiento tumoral mediante la inyección del adenovirus que comprende el vector que co-expresa el CBLB502S y receptor tipo toll en donde el adenovirus se inyecta en el tumor del carcinoma de colon de ratones singenéicos CT26 y el estudio de los efectos in-cis e in-trans de los constructos del vector adenoviral.

La Figura 4 muestra la estructura del dominio de la flagelina bacteriana. El resto de la estructura de Ca, distribución del núcleo hidrófobo e información estructural del F41. Cuatro núcleos hidrófobos distintos que definen los dominios DI, D2a, D2b y D3. Todos los átomos de cadenas laterales hidrófobas se muestran con la estructura de Ca. Los átomos de la cadena lateral se codifican por color: Ala, amarillo; Leu, lie, o Val, naranja; Phe y Tyr, púrpura (átomos de carbono) y rojo (átomos de oxigeno) , c, Posición y región de varios aspectos estructurales en la secuencia de aminoácidos de la flagelina. Se muestran, de la parte superior a la parte inferior: el fragmento F41 en azul; tres pliegues de lámina b en café; la distribución de estructura secundaria con la hélice a en amarillo, estructura b en verde, y vuelta b en púrpura; marca tic cada 50o residuo en azul; dominios DO, DI, D2 y D3; la región de contacto de la subunidad axial dentro del proto-elemento en cian; la secuencia de aminoácidos bien conservada en rojo y la región variable en violeta; mutaciones puntuales en F41 que producen los elementos de diferentes súper-hélices . Las letras en la parte inferior indican la morfología de elementos mutantes: L (D107E, R124A, R124S, G426A), línea recta tipo L; R (A449V) , línea recta tipo R; C (D313Y, A414V, A427V, N433D) , curly3.

La Figura 5 muestra una representación esquemática de dominios de flagelina de Salmonella, sus fragmentos, y su interacción con TLR5. Las barras oscuras denotan regiones del gen de flagelina utilizadas para construir fragmentos que comprenden A, B, C, A' y B' .

La Figura 6 representa derivados de flagelina. La estructura del dominio y delimitaciones aproximadas (coordenadas de aminoácidos) de derivados de flagelina seleccionados (listados a la derecha) . La flagelina FliC de Salmonella dublin se codifica dentro de 505 aminoácidos (aa) .

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos para las siguientes variantes de flagelina: AA' (SEQ ID NO: 7-8), AB ' (SEQ ID NO: 9-10), BA' (SEQ ID NO: 11-12), BB ' (SEQ ID NO: 13-14), CA' (SEQ ID NO: 15-16), CB' (SEQ ID NO: 17-18), A (SEQ ID NO: 19-20), B (SEQ ID NO: 21-22), C (SEQ ID NO: 23-24), GST-A ' (SEQ ID NO: 25-26), GST-B ' (SEQ ID NO: 27-28), AA'nl-170 (SEQ ID NO: 29-30), AA'nl-163 (SEQ ID NO: 33-34), AA'n54-170 (SEQ ID NO: 31-32), AA'n54-163 (SEQ ID NO: 335-36), AB'nl-170 (SEQ ID NO: 37-38), AB'nl-163 (SEQ ID NO: 39-40), AA'nl-129 (SEQ ID NO: 41-42), AA'n54-129 (SEQ ID NO: 43-44), AB'nl-129 (SEQ ID NO: 45-46), AB'n54-129 (SEQ ID NO: 47-48), AA'nl-100 (SEQ ID NO: 49-50), AB'nl-100 (SEQ ID NO: 51-52), AA'nl-70 (SEQ ID NO: 53-54) y AB'nl-70 (SEQ ID NO: 55-56) . La secuencia lider pRSETb se muestra en cursivas (la secuencia lider incluye Met, el cual también es el aminoácido 1 de FliC) . El dominio constante N-terminal está subrayado.

La secuencia de enlace de aminoácidos está en negritas.

El dominio constante C-terminal está subrayado. GST, si está presente, está resaltado.

Las Figuras 8A y 8B muestran una comparación de las secuencias de aminoácidos del amino conservado (Fig. 8A) y carboxi (Fig. 8B) terminal de 21 especies de bacterias. Los 13 aminoácidos conservados importantes para la actividad TLR5 se muestran con sombreado. Las secuencias de aminoácidos se identifican por sus números de acceso de TrEMBL (primera letra = Q) o Swiss-Prot (primera letra = P) .

La Figura 9 muestra la secuencia ácido nucleico y aminoácidos para la proteína del receptor 5 tipo Toll humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que la provisión de un receptor tipo toll, tal como receptor 5 tipo toll (TLR-5) , en combinación con un agonista del receptor tipo toll, tal como la flagelina, da como resultado un efecto cis e in-trans que recluta las células involucradas en la respuesta inmune tanto innata (efecto cis) como adaptiva (efecto trans) para acabar específicamente células cancerígenas y células infectadas con un patógeno a través de la vía de apoptosis NF- ?. Aunque en teoría no se limita, la idea implementada en esta invención fue (i) superar la dependencia de las estrategias de inmunización mediadas por TLR en la expresión del TLR pre-existente en un tumor transduciendo el tumor con un constructo que manipula la expresión del TLR; y (ii) dirigir la respuesta inmune al tumor creando un depósito local de agonista del TLR. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas que comprenden TLR simultáneamente inducen la expresión y activan el TLR, exponiendo en consecuencia las células tumorales al sistema inmune hospedero imitando la situación de penetración bacteriana masiva a través de la pared intestinal.

Al proporcionar un TLR tal como TLR5, y un agonista del TLR tal como la flagelina, para interactuar y activar el sistema inmune tanto innato como adaptivo, el método se puede utilizar para tratar tumores derivados del cáncer de próstata, seno, colón, esófago, estómago, pulmón, pancreático, renal, tiroides, ovarios, garganta, o el cérvix asi como para tratar sarcomas, melanomas, leucemias, y linfomas. Las aplicaciones de este método no se limitan a tratamientos contra el cáncer, puesto que este método también se puede utilizar para tratar infecciones derivadas de virus, bacterias, parásitos protozoarios y hongos.

Las variaciones de la provisión del TLR y agonista del TLR pueden incluir vectores, que co-expresan el receptor TLR y una forma secretable de la flagelina que activa la actividad del TLR en la misma célula mamifera comprometida. El método de la presente invención también puede incluir constructos de vector que expresan el receptor TLR en una célula mamífera y el agonista del TLR se administra in trans a la célula. Por ejemplo, un vector adenoviral puede requerir la modificación de la flagelina para alcanzar su síntesis efectiva y secreción por parte de las células mamíferas. 1. Definiciones.

La terminología utilizada en la presente es con el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se pretende que sea limitativa. Cuando se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "un y una", y "el y la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario .

Para la enumeración de rangos numéricos en la presente, se contempla explícitamente cada número intermedio que hay entre el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el rango de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además del 6 y 9, y para el rango 6.0-7.0, se contemplan explícitamente los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, y 7.0.

"Administrar" puede significar una dosis única o dosis múltiples de un agente o agente.

"Análogo" puede significar, en el contexto de un péptido o polipéptido, un péptido o polipéptido que comprenda uno o más aminoácidos no estándar u otras variaciones estructurales del conjunto convencional de aminoácidos.

"Anticuerpo" puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos, o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de una cadena única, diacuerpos, anticuerpos biespecificos , anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo de afinidad purificada, o mezclas de los mismos los cuales exhiben suficiente especificidad de enlace a un epitope deseado o una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede derivarse mediante la adhesión de una o más porciones químicas, de péptido, o polipéptido, conocidas en la técnica. El anticuerpo puede conjugarse con una porción química.

Un "derivado" puede significar un péptido o polipéptido diferente en estructura primaria (aminoácidos y análogos de aminoácido) . Los derivados pueden diferir al glicosilarse, una forma de modificación post-transcripcional . Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden exhibir patrones de glicosilación debido a la expresión en sistemas heterólogos. Si al menos se mantiene una actividad biológica, entonces estos péptidos o polipéptidos son derivados de acuerdo a la invención. Otros derivados pueden incluir péptidos de fusión o polipéptidos de fusión que tienen un N- o C-terminal covalentemente modificado, péptidos o polipéptidos PEGilados, péptidos o polipéptidos asociados con porciones de lipidos, péptidos o polipéptidos alquilados, péptidos o polipéptidos enlazados a través de un grupo funcional de cadena lateral de aminoácidos a otros péptidos, polipéptidos o químicos, y modificaciones adicionales que pudieran conocerse en la técnica .

Un "fragmento" puede significar una porción de un péptido o polipéptido de referencia.

Un "homólogo" puede significar un péptido o polipéptido que comparta un ancestro evolutivo común.

Una "secuencia líder" puede ser un ácido nucleico que codifica cualquier secuencia de péptidos que se enlace y traduzca con un péptido o polipéptido de interés para permitir al péptido o polipéptido de interés encaminarse apropiadamente a través de un retículo endoplásmico de células eucariotas y complejos de Golgi para la secreción extracelular propuesta de la membrana celular. La secuencia de péptidos líder puede derivarse de fosfatasa alcalina. La secuencia líder puede tener una secuencia de ADN que comprende atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctct ccctgggc .

Un "liposoma" puede significar una burbuja diminuta (vesícula) hecha del mismo material que una membrana celular.

Un liposoma se rellena con fármacos y se utiliza para suministrar fármacos para el cáncer y otros padecimientos. Un liposoma puede rellenarse con un vector. Una membrana de liposomas puede hacerse de fosfolipidos, los cuales son moléculas que tienen un grupo delantero y un grupo posterior. La parte delantera del liposoma puede ser atraída al agua, y la parte posterior, la cual está hecha de una larga · cadena de hidrocarburos, es repelida por el agua. Las partes posteriores pueden ser repelidas por el agua, y alinearse para formar una superficie alejada del agua. Los lípidos en la membrana de plasma pueden ser mayormente fosfolípidos como la fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina . Los liposomas pueden estar compuestos de fosfolípidos naturalmente derivados con cadenas de lípidos mixtas (por ejemplo fosfatidiletanolamina de huevo) , o de componentes de surfactantes puros como la DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina) .

Un "péptido" o "polipéptido" puede significar una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintético, o una modificación o combinación de natural y sintético .

"Sustancialmente idéntico" puede significar que una primera y segunda secuencia de aminoácidos son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% sobre una región de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 aminoácidos.

"Que trata", "tratamiento", o "tratar" cada uno puede significar aliviar, suprimir, contener, eliminar, prevenir o retardar la aparición de síntomas, señales clínicas, o patología subyacente de una condición o padecimiento en una base temporal o permanente. Prevenir una condición o padecimiento involucra administrar un agente de la presente invención a un sujeto antes de la aparición del padecimiento. Suprimir una condición o padecimiento involucra administrar un agente de la presente invención a un sujeto después de la inducción de la condición o padecimiento pero antes de su aparición clínica. Contener la condición o padecimiento involucra administrar un agente de la presente invención a un sujeto después de la aparición clínica del padecimiento.

Una "variante" puede significar un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos mediante la inserción, eliminación, o sustitución conservativa de aminoácidos, aunque conserve al menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un receptor tipo toll y de unirse mediante un anticuerpo específico. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que sustancialmente es idéntica a una proteína referenciada con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, remplazar un aminoácido con un diferente aminoácido de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de regiones cargadas) es reconocida en la técnica puesto que típicamente involucra un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, tal como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Es sabido en la técnica que los aminoácidos de índices hidropoáticos similares se pueden sustituir y todavía mantener su función proteínica. En un aspecto, se sustituyen los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de +2. La hidrofilicidad de aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que pudieran dar como resultado proteínas que mantengan su función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la hidrofilicidad promedio local más grande de ese péptido, una medida útil que ha se ha reportado se correlaciona adecuadamente con la antigenicidad e inmunogenicidad. La Patente Norteamericana No. 4,554,101, se incorpora completamente en la presente como referencia. La sustitución de los aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similares puede dar como resultado péptidos que mantienen su actividad biológica, por ejemplo, la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ±2 entre si. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos son influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. Consistente con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de esos aminoácidos, como se revela por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y otras propiedades.

Un "vector" puede significar una secuencia ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un plásmido, una levadura o un cromosoma artificial mamífero. Un vector puede ser un vector de ARN o ADN. Un vector puede ser ya sea un vector extracromosomal auto-replicante o un vector el cual se integra en un genoma hospedero. 2. Receptor Tipo Toll En la presente se proporciona un receptor tipo toll (TLR) , el cual puede ser un tipo de receptor de reconocimiento de patrones (PRR) . El TLR puede reconocer moléculas que son productos moleculares conservados derivados de patógenos que incluyen bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas , hongos, y virus, aunque sean distinguibles de moléculas hospederas, conjuntamente referidas como patrones moleculares asociados con patógenos (PAMPs) . El TLR también puede reconocer moléculas endógenas liberadas de células dañadas o agonizantes, conjuntamente referidas como un patrón molecular asociado con daños (DA Ps) . Un PAMP o DAMP puede ser un agonista del TLR como se describe adicionalmente más adelante. El TLR puede ser un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado que recluta moléculas adaptadoras dentro del citoplasma de células a fin de propagar una señal. El TLR puede ser de un humano u otra especie mamifera tal como el macaco rhesus, ratón, o rata. El TLR puede ser al menos 30-99% idéntico a un TLR que recluta moléculas adaptadoras dentro del citoplasma de células a fin de propagar una señal.

El TLR puede ser uno de entre diez y quince tipos de TLR que se estiman existen en la mayoría de especies de mamíferos. El TLR puede ser uno de los 13 TLR (denominados simplemente TLR1 a TLR13) que han sido identificados en humanos y ratones conjuntamente, o pueden ser una forma equivalente que ha sido encontrada en otras especies de mamíferos. El TLR puede ser uno de los 11 miembros (TLR1-TLR11) que han sido identificados en humanos .

El TLR puede ser expresado por diferentes tipos de células inmunes, y puede ubicarse en la superficie celular o en el citoplasma celular. El TLR puede expresarse en células cancerígenas. El TLR puede expresarse por células epiteliales normales en el sistema digestivo, queratinocitos normales en la piel, células epiteliales alveolares y bronquiales, y células epiteliales del tracto reproductivo femenino. Estas células que recubren un órgano pueden ser la primera línea de defensa contra la invasión de microrganismos, y los TLRs expresados en las células epiteliales pueden tener un rol crucial en la regulación de la proliferación y apoptosis.

La célula cancerígena que expresa el TLR puede seleccionarse de la siguiente tabla: Tabla 1 Expresión del TLR en Células Cancerígenas Humanas El TLR expresado en células cancerígenas puede regular por incremento la cascada NF-?? y producir proteínas anti-apoptóticas que contribuyen a la carcinogénesis y proliferación de células cancerígenas.

Se sabe que cuatro moléculas adaptadoras de TLRs están involucradas en la señalización. Estas proteínas son conocidas como el factor 88 de diferenciación mieloide (MyD88), Tirap (también denominado Mal) , Trif, y Tram. Los adaptadores activan otras moléculas dentro de la célula, incluyendo ciertas proteínas cinasas (IRAKl, IRAK4, TBK1 , e IKKi) que amplifica la señal, y por último llevan a la inducción o supresión de genes que orquestan la respuesta inflamatoria. Las vías de señalización TLR durante el reconocimiento de patógenos puede inducir reacciones inmunes a través de las vías extracelulares e intracelulares mediados por MyD88, potenciador de cadena ligera kappa del factor nuclear de células B activadas (NF- ?) , y proteína cinasa asociada con mitógenos (MAPK) . En total, miles de genes son activados mediante la señalización TLR, y conjuntamente, el TLR constituye uno de la mayoría de entradas pleótropas, incluso herméticamente reguladas para modulación genética.

Los TLRs junto con los receptores de Interleucina-1 forman una súperfamilia de receptores, conocida como la "Súperfamilia del Receptor de Interleucina-l/Receptor Tipo Toll". Todos los miembros de esta familia tienen en común un asi llamado dominio TIR (receptor Toll-IL-1) . Pueden existir tres subgrupos de dominios TIR. Las proteínas con dominios TIR del subgrupo I son receptores de interleucinas que son producidas por macrófagos, monocitos y células dendríticas y todas tienen dominios de Inmunoglobulina (Ig) extracelülares . Las proteínas con dominios TIR del subgrupo II son TLRs clásicos, y se enlazan directa o indirectamente a moléculas de origen microbiano. Un tercer subgrupo de proteínas que contienen dominios TIR (III) consiste de proteínas adaptadoras que exclusivamente son citosólicas y que median la señalización de las proteínas de los subgrupos 1 y 2. El TLR puede ser un fragmento, variante, análogo, homólogo o derivado que mantiene ya sea un dominio TIR del subgrupo I, dominio TIR del subgrupo II, o dominio TIR del subgrupo III.

El TLR puede funcionar como un dímero. Por ejemplo, aunque la mayoría de TLRs parecen funcionar como homodímeros, el TLR2 forma heterodímeros con TLR1 ó TLR6, cada dímero tiene una diferente especificidad de ligandos. El TLR también puede depender de otros co-receptores de sensibilidad de ligandos completa, tal como en el caso de reconocimiento de TLR4 de LPS, el cual requiere MD-2. El CD14 y Proteína de Enlace LPS (LBP) son conocidos por facilitar la presentación de LPS a MD-2. a. TLR1 El TLR puede ser el TLR1, el cual reconoce los PAMPs, con una especificidad para bacterias gram-positivas . El TLR1 también se ha designado como CD281. b. TLR5 El TLR puede ser un receptor 5 tipo Toll. La proteína codificada por el TLR-5 puede jugar un rol fundamental en el reconocimiento de patógenos y activación de inmunidad innata. El TLR-5 puede reconocer los PAMPs que son expresados en agentes infecciosos, y mediar la producción de citocinas necesarias para el desarrollo de inmunidad efectiva. El TLR-5 puede reconocer la flagelina bacteriana, un componente principal del flagelo bacteriano y un factor de virulencia. La activación del TLR puede movilizar el factor nuclear NF- ? y estimular la producción del factor alfa de necrosis tumoral. 3. Agonista del Receptor Tipo Toll También se proporciona en la presente un agonista del TLR. El agonista del TLR puede ser un PAMP, el cual puede ser un producto molecular conservado derivado de un patógeno. El patógeno puede ser una bacteria Gram-positiva, bacteria Gram-negativa, hongo, o virus. El agonista del TLR puede ser un ligando del patrón molecular asociado con daños (DAMP), el cual puede ser una molécula endógena liberada de células dañadas o agonizantes. Un DAMP o PAMP puede iniciar una respuesta inmune a través de las señales TLR y reclutar moléculas adaptadoras dentro del citoplasma de células a fin de propagar una señal. El agonista TLR puede ser un agonista del TLR, el cual puede ser un ligando de los siguientes en la Tabla 2: Tabla 2 TLRs y Ligandos El agonista TLR puede ser un fragmento, variante, análogo, homología o derivado de un PAMP o DAMP que enlaza un TLR e induce la actividad mediada por TLR, tal como la activación de la actividad NF- ?. El fragmento del agonista del TLR, variante, análogo, homólogo, o derivado puede ser al menos 30-99% idéntico a aminoácidos de un agonista del TLR e inducir la actividad mediada por TLR.

El agonista TLR puede focalizar un TLR tal como el TLR-5. El agonista TLR puede ser un agonista de TLR-5 y estimular la actividad del TLR-5. El agonista del TLR puede ser un anticuerpo anti-TLR5 u otra molécula pequeña. El agonista del TLR puede ser la flagelina.

La flagelina también puede ser una flagelina o polipéptido relacionado con la flagelina. La flagelina puede ser de cualquier fuente, incluyendo una variedad de especies de bacterias Gram-positiva y Gram-negativa. La flagelina puede ser un polipéptido de cualquier especie de bacteria Gram-positiva o Gram-negativa que incluye, pero no está limitada a, un polipéptido de flagelina descrito en la Pub. de Patente Norteamericana No. 2003/000044429, el contenido de la cual se incorpora completamente en la presente como referencia. Por ejemplo, la flagelina puede tener una secuencia de aminoácidos de una especie bacteriana representada en la Figura 7 de la Publicación de Patente Norteamericana No. 2003/000044429. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de flagelina listados en la Figura 7 de la U.S. 2003/000044429 están disponibles públicamente en fuentes que incluyen la base de datos NCBI Genbank. La flagelina también puede ser un péptido de flagelina correspondiente a un Número de acceso listado en los resultados de BLAST mostrados en la Fig. 25 de la Pub. de Patente Norteamericana No. 2003/000044429, o una variante de la misma. La flagelina también puede ser un polipéptido de flagelina que se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2009/0011982, el contenido de la cual se incorpora completamente en la presente. La flagelina puede ser cualquiera de un polipéptido de flagelina que se describa en las Figuras 6 y 7 de la presente.

La flagelina puede ser un fragmento, variante, análogo, homología o derivado de una flagelina que enlace el TLR5 e induzca la actividad mediada por TLR5, tal como la activación de la actividad NF-??. Un fragmento, variante, análogo, homólogo, o derivado de flagelina puede ser al menos 30-99% idéntico a los aminoácidos de una flagelina que enlaza el TLR e induce la actividad mediada por TLR5.

La flagelina puede ser de una especie de Salmonella, un ejemplo representativo del cual es S. dublin (codificada por el Acceso GenBank Número M84972). El polipéptido relacionado con la flagelina puede ser un fragmento, variante, análogo, homólogo, o derivado de M84972, o combinación de los mismos, que se enlaza al TLR5 e induce la actividad mediada por el TLR5, tal como la activación de la actividad NF-??. Un fragmento, variante, análogo, homólogo, o derivado de flagelina puede obtenerse mediante un diseño a base de fundamentos basado en la estructura de dominio de la FLAGELINA y la estructura conservada reconocida por el TLR5.

La flagelina puede comprender al menos 10, 11, 12, ó 13 de los 13 aminoácidos conservados mostrados en la Fig. 5 (posiciones 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 y 452) . La flagelina puede ser al menos 30-99% idéntica a los aminoácidos 1174 y 418 505 de M84972. La Fig. 26 de la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2009/0011982, el contenido de la cual se incorpora completamente en la presente, lista la identidad de porcentaje del amino- y carboxi-terminal de la flagelina con actividad estimulante del TLR-5 conocida, en comparación con el M84972.

La flagelina puede ser el principal componente del flagelo bacteriano. La flagelina puede estar compuesta de tres dominios (Fig. 4). El dominio 1 (DI) y el dominio 2 (D2) pueden ser discontinuos y pueden formarse cuando los residuos en el amino terminal y carboxi terminal se yuxtaponen por la formación de una estructura de horquilla. El amino- y carboxi-terminal comprenden los dominios DI y D2 pueden estar más conservados, mientras que el dominio hiper-variable medio (D3) puede ser altamente variable. Los estudios con una proteina recombinante que contiene el amino DI y D2 y carboxilo DI y D2 separados por una bisagra de Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) indican que el DI y D2 pueden ser bioactivos cuando se acoplan a un elemento ECH. Esta quimera, aunque no la bisagra sola, puede inducir la degradación IkBa, activación NF-??, y producción de NO e IL-8 en dos lineas de células epiteliales intestinales. El dominio D3 no conservado puede estar sobre la superficie del filamento flagelar y puede contener los principales epitopes antigénicos. La potente actividad pro-inflamatoria de la flagelina puede residir en las regiones DI y D2 de N y C altamente conservadas (Ver la Figura 4) .

La flagelina puede inducir la actividad NF- B enlazándola al receptor 5 tipo Toll (TLR5) . El TLR puede reconocer una estructura conservada que es particular para la flagelina. La estructura conservada puede estar compuesta de un grupo grande de residuos que son un algo permisivos de la variación en el contenido de aminoácidos. Smith et al., Nat Immunol. 4:1247-53 (2003), el contenido de la cual se incorpora en la presente como referencia, ha identificado 13 aminoácidos conservados en la flagelina que son parte de la estructura conservada reconocida por el TLR5. Los 13 aminoácidos conservados de la flagelina que pueden ser importantes para la actividad TLR5, se muestran en la Fig. 5.

Se han hecho numerosos mutantes de eliminación de la flagelina para mantener al menos algo de la actividad estimulante del TLR5. La flagelina puede ser tal mutante de eliminación, y puede ser un mutante de eliminación descrito en los Ejemplos de la presente. La flagelina puede comprender una secuencia traducida del Acceso de GenBank número D13689 que carece de los aminoácidos 185-306 ó 444-492, o del Acceso de GenBank número M84973 que carece de los aminoácidos 179-415, o una variante de los mismos.

La flagelina puede comprender inserciones de transposón y cambios al dominio D3 variable. El domino D3 puede sustituirse en parte, o en su totalidad, con un polipéptido de bisagra o de enlace que permite plegar apropiadamente los dominios DI y D2 de tal manera que la variante estimule la actividad del TLR5. Los elementos de bisagra variantes pueden encontrarse en la proteina MukB de E. coli y puede tener una secuencia que se establece en las SEQ ID NOS: 3 y 4, o una variante de la misma.

La flagelina como se describe anteriormente puede comprender además una secuencia líder. La flagelina además comprende una secuencia líder que puede ser CBLB502S.

. Agente Esta invención también se refiere a un agente que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un TLR y agonista del TLR. El agente puede suministrar el TLR por separado del agonista del TLR. El agente puede ser un vector. El vector puede comprender un primer ácido nucleico que codifica el TLR y segundo ácido nucleico que comprende el agonista TLR. El vector puede ser capaz de transducir células de mamíferos. El vector puede estar apto para la expresión bis-cistrónica del TLR y/o agonista del TLR utilizando promotores fuertes. El vector puede comprender solamente un gen que codifica el TLR, el cual puede controlarse mediante un promotor fuerte. El vector puede suministrarse en una célula mamífera mediante un sistema de vector relacionado con virus o liposomas. El sistema de vector de virus puede ser un adenovirus o un citomegalovirus .

El agente puede ser un liposoma que hospede el vector. El liposoma puede ser capaz de transducir células mamíferas y suministrar el vector para su expresión.

El agente puede ser una formulación farmacéutica que simultáneamente induzca la expresión y active el TLR, exponiendo en consecuencia un tumor o células infectadas al sistema inmune hospedero imitando la situación de una penetración masiva a través de la pared intestinal. El agente puede ser una formulación farmacéutica que exprese el TLR en combinación con el agonista del TLR, y puede suministrarse sistemáticamente en solución para su administración tal como intramuscularmente . El agente puede ser una formulación farmacéutica que exprese el TLR en combinación con el agonista del TLR, el cual puede expresarse a partir del mismo vector, tal como un sistema de vector de adenovirus o citomegalovirus. El agente puede ser una formulación farmacéutica que exprese el TLR en combinación con el agonista del TLR expresado en la forma de una nano-particula, la cual puede portar un agonista funcional a la superficie celular de una célula mamífera.

El agente puede ser un agente farmacéutico que comprenda la formulación farmacéutica descrita anteriormente, la cual puede producirse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El agente también puede comprender un coagente.

El vector puede comprender un primer ácido nucleico que codifica el TLR5 y un segundo ácido nucleico que comprende la flagelina. El vector puede ser capaz de expresar el TLR5 y/o flagelina utilizando un promotor fuerte. El vector de expresión puede comprender además una secuencia lider clonada corriente arriba del gen que codifica el TLR o TLR5 y/o flagelina. El vector de expresión puede ser un sistema de vector a base de pCD515. El vector de expresión puede ser el pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502 como se describe en la Figura 1A. El vector de expresión puede ser pCD515-CMV-hTLR5 que se describe en la Figura IB. El vector de expresión puede ser pCD515-CMV-Sseap-502 que se describe en la Figura 1C.

El agente puede ser una formulación farmacéutica que simultáneamente induce la expresión y activa un TLR exponiendo en consecuencia un tumor o células infectadas al sistema inmune hospedero imitando la situación de una penetración masiva a través de la pared intestinal. La formulación farmacéutica puede estar en la forma de un sistema de expresión viral que albergue el vector. La formulación farmacéutica puede ser un TLR5 humano funcional de expresión adenoviral en combinación con: el agonista del TLR, suministrado sistemáticamente en solución para su administración, tal como intramuscularmente; el agonista del TLR, expresado del mismo vector adenoviral que el TLR; o el agonista del TLR, expresado en la forma dé nano-partículas que portan un agonista del TLR funcional, tal como la flagelina, la cual puede derivarse de CBLB502, en su superficie. La nano-partícula puede ser la base de un bacteriófago T7, o completamente formado para mantener su actividad biológica. La nano-formulación puede proporcionar la activación del reportero que responde al NF-?? dependiente de la dosis, y puede dar como resultado una internalización celular mediante endocitosis para una metodología de inmunización efectiva (Mobian AP-A) . a. Administración La administración de los agentes utilizando el método descrito en la presente puede ser administración oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, trans-mucosas, tópica, a través de inhalación, vía bucal, o combinaciones de las mismas. La administración parenteral incluye, pero no está limitada a, intravenosa, intra-arterial, intra-peritoneal, subcutánea, intramuscular, intra-tecal, e intra-articular . Para uso veterinario, el agente puede administrarse como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria usual. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y vía de administración que sea más apropiado para un animal en particular. Los agentes pueden administrarse a un paciente humano, gato, perro, animal grande, o un ave.

El agente puede administrarse de manera simultánea o metronómica con otros tratamientos. El término "simultáneo" o "simultáneamente" que se utiliza en la presente, significa que el agente y otro tratamiento se administran dentro de 48 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente 12 horas, incluso más preferiblemente 6 horas, y más preferiblemente 3 horas o menos, entre si. El término "de manera metronómica" que se utiliza en la presente significa la administración del agente en momentos diferentes al otro tratamiento y a una cierta frecuencia relativa para repetir la administración.

El agente puede administrarse en cualquier momento previo a otro tratamiento incluyendo aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50 hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins., 50 mins . , 45 mins., 40 mins., 35 mins., 30 mins., 25 mins., 20 mins., 15 mins, 10 mins, 9 mins, 8 mins, 7 mins., 6 mins., 5 mins., 4 mins., 3 mins, 2 mins, y 1 mins. El agente puede administrarse en cualquier momento previo a un segundo tratamiento del agente que incluye aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50 hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins., 50 mins., 45 mins., 40 mins., 35 mins., 30 mins., 25 mins., 20 mins., 15 mins., 10 mins., 9 mins., 8 mins., 7 mins., 6 mins., 5 mins., 4 mins., 3 mins,' 2 mins, y 1 mins.

El agente puede administrarse en cualquier momento después de otro tratamiento incluyendo aproximadamente 1 min., 2 mins., 3 mins., 4 mins., 5 mins., 6 mins., 7 mins., 8 mins., 9 mins., 10 mins., 15 mins., 20 mins., 25 mins., 30 mins., 35 mins., 40 mins., 45 mins., 50 mins., 55 mins., 1 hr, 2 hr, 3 hr, 4 hr, 6 hr, 8 hr, 10 hr, 12 hr, 14 hr, 16 hr, 18 hr, 20 hr, 22 hr, 24 hr, 26 hr, 28 hr, 30 hr, 32 hr, 34 hr, 36 hr, 38 hr, 40 hr, 42 hr, 44 hr, 46 hr, 48 hr, 50 hr, 52 hr, 54 hr, 56 hr, 58 hr, 60 hr, 62 hr, 64 hr, 66 hr, 68 hr, 70 hr, 72 hr, 74 hr, 76 hr, 78 hr, 80 hr, 82 hr, 84 hr, 86 hr, 88 hr, 90 hr, 92 hr, 94 hr, 96 hr, 98 hr, 100 hr, 102 hr, 104 hr, 106 hr, 108 hr, 110 hr, 112 hr, 114 hr, 116 hr, 118 hr, y 120 hr. El agente puede administrarse en cualquier momento previo después de un segundo tratamiento del agente incluyendo aproximadamente 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50 hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr, 55 mins . , 50 mins . , 45 mins . , 40 mins . , 35 mins . , 30 mins., 25 mins., 20 mins., 15 mins., 10 mins., 9 mins., 8 mins., 7 mins., 6 mins., 5 mins., 4 mins., 3 mins, 2 mins, y 1 mins. b. Formulación El método puede comprender administrar el agente. Los agentes provistos en la presente pueden estar en la forma de tabletas o grageas formuladas de manera convencional. Por ejemplo, las tabletas y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales que pueden ser agentes aglutinantes, agentes de relleno, lubricantes, desintegradores y agentes humectantes. Los agentes aglutinantes incluyen, per no se limitan a, jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilago de almidón y polivinilpirrolidona . Los agentes de relleno pueden ser lactosa, azúcar, celulosa Microcristalina , almidón de maíz, fosfato de calcio, y sorbitol. Los lubricantes incluyen, pero no están limitados a, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol, y sílice. Los desintegradores pueden ser fécula de papa y glicolato de almidón sódico. Los agentes humectantes pueden ser lauril-sulfato de sodio. Las tabletas pueden revestirse de acuerdo a los métodos bien conocidos en la técnica.

Los agentes provistos en la presente también pueden ser formulaciones líquidas tales como suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, jarabes, y elixires. Los agentes también pueden formularse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos tales como agentes de suspensión, agentes de emulsión, vehículos no acuosos y conservantes. El agente de suspensión puede ser jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio, y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsionantes pueden ser lecitina, monooleato de sorbitano. Los vehículos no acuosos pueden ser aceites comestibles, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, ésteres aceitosos, propilenglicol , y alcohol etílico. Los conservantes pueden ser p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico.

Los agentes provistos en la presente también pueden formularse como supositorios, los cuales puede contener bases de supositorios tales como manteca de cacao o glicéridos. Los agentes provistos en la presente también pueden formularse para inhalación, los cuales pueden estar en una forma tal como una solución, suspensión, o emulsión que puede administrarse como un polvo seco o en la forma de un aerosol utilizando un propulsor, tal como diclorodifluorometano o triclorofluoro-metano. Los agentes provistos en la presente también pueden formularse como formulaciones transdérmicas que comprenden vehículos acuosos o no acuosos tales como cremas, ungüentos, lociones, pastas, fomento medicinal, parche, o membrana.

Los agentes provistos en la presente también pueden formularse para administración parenteral tal como mediante inyección, inyección intra-tumoral o infusión continúa. Las formulaciones para inyección pueden estar en la forma de suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación que incluyen, pero no están limitados a, agentes de suspensión, estabilización y dispersión. El agente también puede proveerse en una forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado que incluye, pero no limitado a, agua estéril libre de pirógenos.

Los agentes provistos en la presente también pueden formularse como una preparación de efecto prolongado, la cual puede administrarse mediante implantación o mediante inyección intramuscular. Los agentes pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite aceptable, por ejemplo), resinas de intercambio iónico, o como derivados bastante solubles (como una sal bastante soluble, por ejemplo) . c. Dosificación El método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del agente a un paciente en necesidad del mismo. La cantidad terapéuticamente efectiva requerida para usarse en terapia varía con la naturaleza de la condición que se trata, la duración deseada para activar la actividad del TLR, y la edad/condición del paciente. En general, sin embargo, las dosis empleadas para el tratamiento de humanos adultos, típicamente están en el rango de 0.001 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg por día. La dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día. La dosis deseada puede administrarse convenientemente en una sola dosis, o como dosis múltiples administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por dia. Pueden desearse o requerirse dosis múltiples.

La dosificación puede ser a cualquier dosificación tal como aproximadamente 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 225 mg/kg, 250 mg/kg, 275 mg/kg, 300 mg/kg, 325 mg/kg, 350 mg/kg, 375 mg/kg, 400 mg/kg, 425 mg/kg, 450 mg/kg, 475 mg/kg, 500 mg/kg, 525 mg/kg, 550 mg/kg, 575 mg/kg, 600 mg/kg, 625 mg/kg, 650 mg/kg, 675 mg/kg, 700 mg/kg, 725 mg/kg, 750 mg/kg, 775 mg/kg, 800 mg/kg, 825 mg/kg, 850 mg/kg, 875 mg/kg, 900 mg/kg, 925 mg/kg, 950 mg/kg, 975 mg/kg ó 1 mg/kg. 5. Método para Tratar el Cáncer Se proporciona en la presente un método para tratar el cáncer administrando el agente a un mamífero en necesidad del mismo. El método proporciona inmunoterapia contra el cáncer mediante la conversión de células tumorales en°un estado que reacciona al agonista del TLR con estimulación intra-tumoral dirigida del TLR, enfocando en consecuencia una respuesta inmune en el tumor. El método puede utilizarse para tratar tumores primarios antes de la remoción quirúrgica a fin de reducir el riesgo de desarrollo de metástasis, asi como para tratar otros nodulos tumorales. El método puede comprender inyección intra-tumoral . El método puede tener la etapa de inyectar el agente en un tumor primario antes de la remoción quirúrgica para reducir el riesgo de desarrollo de metástasis, asi como para tratar otros nodulos tumorales. El método puede utilizarse para tratar cualquier tumor que sea accesible para la inyección intra-tumoral del adenovirus.

Una variedad de cánceres pueden tratarse de acuerdo a esta invención, incluyendo carcinoma, de vejiga (incluyendo cáncer de vejiga acelerado y metastático) , seno, colon (incluyendo cáncer colorectal), riñon, hígado, pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas y no-pequeñas y adenocarcinoma de pulmón) , ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrino) , esófago, estómago, vesícula biliar, cérvix, tiroides, y piel (incluyendo carcinoma de células escamosas) ; tumores hematopoyéticos del revestimiento linfoide incluyendo la leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma de no Hodgkins, linfoma por tricoleucitos, linfoma histiocítico, y linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome de mielodisplasia, leucemia mieloide, y leucemia promielocitica; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwanomas o neurofribomas ; tumores de origen mesenquimatoso incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y otros tumores incluyendo melanoma, xerodermia pigmentosa, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo, teratocarcinoma, y cánceres del tracto gastrointestinal o la cavidad abdomino-pélvica .

El método puede combinarse con otros métodos para tratar el cáncer, incluyendo el uso de un inmunoestimulante, citocina, o quimioterapéutico . El inmunoestimulante puede ser una hormona del crecimiento, prolactina o vitamina D. 6. Tratamiento de Células Infectadas Se proporciona en la presente un método para tratar un padecimiento infeccioso mediante el suministro simultáneo de células transducidas mediante el agente. El método puede utilizarse para tratar una infección viral, bacteriana, por parásitos protozoarios o fúngica. El método puede utilizarse para tratar cualquier padecimiento infeccioso utilizando inyección intracelular que da como resultado la activación autocrina de la señalización del TLR de células infectadas con un efecto sistémico mínimo y permitiendo por lo tanto atraer una respuesta inmune innata específica a las células infectadas. El método puede combinarse con otras terapias para tratar infecciones virales, bacterianas, por parásitos protozoarios o fúngicas.

El método puede comprender administrar el agente. El método puede comprender la administración de una vacuna que comprenda el agente, y puede utilizarse en combinación con cualquier otra vacuna, la cual puede comprender un constructo que exprese un antígeno preferido.

Ejemplo 1 Síntesis del vector de TLR5/flagelina de la expresión bis- cistrónica y Tratamiento de Células Tumorales Se crearon constructores de vectores para expresar el receptor 5 tipo toll (TLR-5) y la flagelina CBLB502. El vector pCD515 se utilizó como una estructura para estos constructos. La secuencia de ADNc del TLR-5 humano y el ADN que codifica la CBLB502 del agonista del receptor tipo toll se fusionaron individualmente con el péptido líder derivado de la fosfatasa alcalina que permite encaminar la proteína expresada a través del retículo endoplásmico (ER) y Golgi hacia la secreción extracelular .

El constructo del vector pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s expresó la forma secretada de la flagelina CBLB502 (CBLB502S) y el receptor 5 tipo toll (TLR5) en la superficie celular.

Este vector adenoviral requirió la modificación del CBLB502 para alcanzar su síntesis efectiva y secreción mediante células mamíferas. El constructo del adenovirus comprende la secuencia de ácido nucleico líder (Atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc) derivada de la fosfatasa alcalina y se clonó corriente arriba del gen de la flagelina de Salmonella truncada (fliC) (ver Burdelya et al., Science 320:226-230 (2008) para codificar una forma secretable de flagelina (es decir, CBLB502S) . Un promotor EF1 (factor la de elongación) se clonó corriente arriba de este cásete que codifica el CBLB502S. El gen TLR5 se derivó de humanos y tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 9. Un promotor CMV se clonó corriente arriba del gen de TLR5. Este constructo co-expresa el TLR5 y CBLB502S. Este constructo se muestra en la Figura 1A.

El vector de expresión pCD515-CMV-hTLR5 se construyó para expresar la forma del TLR-5 humano (ver la Figura 9) . El constructo del adenovirus comprende un promotor CMV fuerte clonado corriente arriba del cásete hTLR5. Este constructo se muestra en la Figura IB.

El vector de expresión pCD515-CMV-Sseap-502 se construyó para expresar la flagelina secretada CBLB502 y tipo toll. El constructo de adenovirus comprende un promotor CMV fuerte clonado corriente arriba de la secuencia líder del gen de flagelina SEAP 502 (fliC) . Este constructo se muestra en la Figura 1C. [Información de clonación necesaria] Ejemplo 2 Síntesis del Vector de TLR5/flagelina de expresión bis- cistrónica y Tratamiento de Células Tumorales Dos lineas de células mamiferas reporteras, que expresan el GFP que responde al NF-kB y que difieren en su estado de TLR5, se sometieron a transducción con los constructos de vector pCD515, pCD515-C V-hTLR5-EFl-502s , pCD515-CMV-hTLR5- 502, pCD515-C V-hTLR5, y pCD515-CMV-Sseap-502 (ver la Tabla 3 Tabla 3 Actividad de constructos adenovirales como activadores de señalización de TLR5 El vector que co-expresa el CBLB502S del TLR5 y agonista del TLR5 fue suficiente para inducir la expresión del reportero NF-kB en células 293-nulas que no expresan ninguno de los TLRs conocidos y los cuales no se pueden activar mediante el agonista TLR5 solo. Este experimento demuestra que el TLR5 y flagelina CBLB502S puede trabajar in trans o in cis para activar la señalización del TLR5.

Ejemplo 3 Para analizar los efectos anti-tumorales del adenovirus bi-cistrónico que tiene (pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s ) , 10 mi de la suspensión adenoviral (1012-1011 IU/ml) se inyectaron en uno de los dos tumores singenéicos en crecimiento s.c. en ratones Balb/c que se originan a partir de células del carcinoma de colon del ratón CT26 cuando los tumores alcanzaron 3-5 mm de diámetro y el tamaño del tumor se monitoreó hasta que los tumores no inyectados alcanzaron el limite de tamaño que se requiere para la terminación del experimento. Los ratones de control se inyectaron (de nuevo, un tumor de dos por ratón) con el vector adenoviral que expresa la proteina fluorescente roja (RFP) . Los resultados de un experimento representativo se muestran en la Figura 4. La falta casi completa de crecimiento de tumores inyectados con (pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s) fue acompañada con un crecimiento reducido del tumor no inyectado dentro del mismo animal en comparación con los tumores en animales de control inyectados con el adenovirus que expresa el RFP. Este resultado indica un efecto (i) in-cis poderoso y (ii) in-trans visible de pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s indicativo del reclutamiento de la respuesta inmune tanto innata (efecto cis) como adaptiva (efecto trans) . Ninguno de los otros virus de control listados en la Tabla 1 (es decir, AD5 (control) y Ad5 (TLR5) ) inyectados solos tuvo efectos supresores del crecimiento en los tumores.

Por consiguiente, la expresión ectópica forzada del TLR5 crea tipos de células tumorales, los cuales originalmente carecían del TLR5, que responde altamente a la estimulación del TLR5 dando como resultado la ruptura de la inmuno-tolerancia tumoral, la potente atracción de la respuesta inmune innata que promueve el desarrollo efectivo de la respuesta inmune adaptiva con el subsecuente efecto anti-tumoral general.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1.- Un vector caracterizado porque comprende un primer y segundo ácido nucleico, caracterizado porque el primer ácido nucleico codifica un receptor tipo toll y el segundo ácido nucleico codifica un agonista del receptor tipo toll.

2. - El vector de la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista del receptor tipo toll es la flagelina.

3. - El vector de la reivindicación 1, caracterizado porque el vector es un vector de expresión.

4. - El vector de la reivindicación 3, caracterizado porque el vector es un vector de expresión en mamíferos.

5.- El vector de la reivindicación 3, caracterizado porque el vector se expresa a partir de un adenovirus, un lentivirus o un liposoma.

6. - El vector de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer ácido nucleico es una forma secretada de un receptor tipo toll.

7.- El vector de la reivindicación 2, caracterizado porque la flagelina es una forma secretada de flagelina.

8. - El vector de la reivindicación 7, caracterizado porque la forma secretada de la flagelina comprende los trece aminoácidos conservados de flagelina que pueden ser importantes para la actividad TLR5 se muestran en la Fig. 5.

9.- El vector de la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor tipo toll es el TLR-5.

10. - El vector de la reivindicación 1, caracterizado porque el primer ácido nucleico comprende una secuencia que se muestra en la Figura 7 y el segundo ácido nucleico comprende una secuencia que se muestra en la Figura 9.

11. - Un método para tratar el cáncer en un mamífero caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo un agente que comprende el vector de la reivindicación 1.

12.- El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el cáncer es un tumor.

13. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el tumor se deriva del grupo que consiste de la próstata, seno, colón, esófago, estómago, pulmón, pancreático, renal, tiroides, ovarios, garganta, o el cérvix.

14. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el tumor se deriva del grupo que consiste de sarcomas, melanomas, leucemias, y linfomas.

15. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el agente se administra in trans del tumor del mamífero .

16. - El método de la reivindicación 12, caracterizado porque el agente se administra directamente en un tumor del mamífero .

17. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el agente se administra en combinación con un inmunoestimulante .

18. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste de la hormona del crecimiento, prolactina y vitamina D.

19. - El método de la reivindicación 18, caracterizado porque la hormona del crecimiento es somatotrofina .

20. - El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el agente se administra en combinación con una citocina .

21. - El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la citocina es un factor de células madre.

22. - Un método para tratar una infección en un mamífero caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad del mismo un agente que comprende el vector de la reivindicación 1.

23. - El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la infección es mediante un organismo seleccionado del grupo que consiste de un virus, una bacteria, un parásito protozoario, y un hongo.